MX2012012686A - Anticuerpos anti-c5a y metodos para usar los anticuerpos. - Google Patents

Anticuerpos anti-c5a y metodos para usar los anticuerpos.

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Abstract

La presente descripción se refiere a, entre otras cosas, anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a C5a y al uso de los anticuerpos en métodos para tratar o evitar trastornos asociados con complemento tales como, pero no limitándose a, síndrome urémico hemolítico atípico, degeneración macular relacionada con la edad, artritis reumatoide, sepsis, quemaduras severas, síndrome antifosfolípidos, asma, nefritis lúpica, síndrome de Goodpasture, y enfermedad pulmonar obstructiva crónica.

Description

ANTICUERPOS ANTI-C5A Y MÉTODOS PARA USAR LOS ANTICUERPOS Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama la prioridad y el beneficio de las solicitudes de patente provisional Norteamericana Nos. 61/330,260, presentada el 30 de abril de 2010, y 61/471,465, presentada el 4 de abril del 2011, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.
Campo de la Invención El campo de la presente invención es medicina, inmunología, biología molecular, y química de proteínas.
Antecedentes de la Invención El sistema complemento actúa junto con otros sistemas inmunológicos del cuerpo, para defender contra intrusión de patógenos celulares y virales. Existen al menos 25 proteínas de complemento, las cuales se encuentran como una recolección compleja de proteínas de plasma y cofactores de membrana. Las proteínas de plasma abarcan aproximadamente el 10% de las globulinas en suero de vertebrado. Los componentes de complemento logran sus funciones defensoras inmune, interactuando en una serie de eventos de enlace de membrana y disociación enzimática intrincados, aunque precisos. La cascada de complemento resultante conduce a la producción de productos con funciones opsónicas, inmunoreguladoras y líticas. Se proporciona una síntesis concisa de las actividades biológicas asociadas con activación del complemento, por ejemplo en la Publicación de The Merck Manual, Edición 16.
La cascada de complemento progresa a través de la trayectoria clásica, la trayectoria alternativa y la trayectoria de lectina. Estas trayectorias comparten muchos componentes, y aunque difieren en sus pasos iniciales, convergen y comparten los mismos componentes de "complemento terminal" (C5 a C9) responsables de la activación y destrucción de las células objetivo. La trayectoria clásica (CP) normalmente es iniciada por el reconocimiento de anticuerpos de, y el enlace al sitio antigénico en una célula objetivo. La trayectoria alternativa (AP) puede ser independiente del anticuerpo, y puede ser iniciada a través de ciertas moléculas en superficies de patógenos. Además, la trayectoria de lectina normalmente se inicia con el enlace de lectina de enlace-mañosa (MBL) a substratos con alto contenido de mañosa. Estas trayectorias convergen en el punto en donde el componente de complemento C3 es disociado por una proteasa activa para producir C3a y C3b. Otras trayectorias que activan el ataque de complemento, pueden actuar posteriormente en la secuencia de eventos que conducen a diversos aspectos de la función de complemento.
C3a es una anafilatoxina. C3b enlaza a bacterias y otras células, así como a ciertos virus y complejos inmune, y las etiqueta para la eliminación de la circulación. (C3b en este desempeño es conocida como opsonina). La función opsónica de C3b generalmente se considera como la acción antiinfecciosa más importante del sistema de complemento. Los pacientes con lesiones genéticas que bloquean la función C3b, están propensos a infección por una amplia variedad de organismos patógenos, aunque los pacientes con lesiones posteriores en la secuencia de la cascada de complemento, es decir, paciente con lesiones que bloquean las funciones con C5, se encuentran más propensos únicamente a infección por Neisseria, y un poco más propensos.
C3b también forma un complejo con otros componentes únicos para que cada trayectoria forme la convertasa C5 clásica o alternativa, que disocia C5 en C5a y C5b. Por lo tanto C3 se considera como la proteína central en la secuencia de reacción de complemento, ya que es esencial para las trayectorias tanto alternativas como clásicas. Esta propiedad de C3b es regulada por el Factor I de proteasa en suero, que actúa en C3b para producir iC3b. Aunque aún funcional como opsonin, iC3b no puede formar una convertasa C5 activa.
C5 es una beta globulina de 190 kDa encontrada en suero normal en una concentración de aproximadamente 75 pg/mL (0.4 µ?). C5 está glucosilada, con aproximadamente de 1.5 a 3 por ciento de su masa atribuida a carbohidrato. C5 madura es un heterodímero de una cadena alfa de 115 kDa de 999 aminoácidos que está enlazada por disulfuro a una cadena beta de 75 kDa de 655 aminoácidos. C5 está sintetizada como un producto de proteína precursora de cadena simple de un gen de una sola copia (Haviland y asociados, (1991) J Immunol 146:362-368). La secuencia de cADN de la transcripción de este gen anticipa un precursor pro-C5 secretado de 1658 aminoácidos junto con una secuencia líder de 18 aminoácidos (ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,355,245).
El precursor pro-C5 está disociado después de los aminoácidos 655 y 659, para producir la cadena beta como un fragmento terminal amino (residuos de aminoácidos +1 a 655 de la secuencia anterior) y la cadena alfa como un fragmento de terminal carboxilo (los residuos de aminoácidos 660 a 1658 de la secuencia anterior), con cuatro aminoácidos (residuos de aminoácidos 656-659 de la secuencia anterior) eliminados entre los dos.
C5a se disocia de la cadena alfa de C5 ya sea por una convertasa C5 alternativa o clásica como un fragmento de terminal amino que comprende los primeros 74 aminoácidos de la cadena alfa (es decir, los residuos de aminoácido 660-733 de la secuencia anterior).
Aproximadamente el 20 por ciento de la masa 11 kDa de C5a es atribuida a carbohidratos.
El sitio de disociación para la acción de convertasa está en, o inmediatamente adyacente al residuo de aminoácido 733 de la secuencia anterior. Un compuesto que podría enlazar a, o estar adyacente a este sitio de disociación puede tener el potencial de bloquear el acceso de las enzimas de convertasa C5, al sitio de disociación, y de esta forma actuar como un inhibidor de complemento.
C5 también se puede activar por medio de otra actividad de convertasa C5. La digestión de tripsina limitada (ver por ejemplo, las Publicaciones de Minta y Man (1997) J immunol 119: 1597-1602 y Wetsel y Kolb (1982) J Immunol 128:2209-2216). La trombina, y el tratamiento con ácido (Yamamoto y Gewurz (1978) J Immunol 120:2008 y Damerau y asociados, (1989) Molec Immunol 26:1133-1142) también puede disociar C5 y producir C5b activa.
La disociación de C5 libera C5a una anafilatoxina potente y factor quimiotáctico, y C5b el cual, a través de una serie de interacciones de proteína conduce a la formación del complejo de complemento terminal lítico, C5b-9. C5a y C5b-9 también tienen propiedades de activación de célula pleiotrópica , amplificando la liberación de factores inflamatorios de corriente descendente, tal como enzimas hidrolíticas, especies de oxígeno reactivo, metabolitos de ácido araquidónico y diversas citocinas.
C5b se combina con C6, C7, y C8 para formar el complejo C5b-8 en la superficie de la célula objetivo. Al momento del enlace de diversas moléculas C9, se forma el complejo de ataque de membrana (MAC, C5b-9, complejo de complemento terminal -- TCC). Cuando se insertan números suficientes de MACs en las membranas de célula objetivo, las aberturas que crean (poros MAC) transmiten la lisis osmótica rápida de las células objetivo. Las concentraciones no líticas, inferiores de MACs pueden producir otros efectos. En particular, la inserción de membrana de pequeños números de complejos C5b-9 en células endoteliales y plaquetas, puede originar activación celular perjudicial. En algunos casos, la activación puede preceder la lisis celular.
Tal como se mencionó anteriormente, C3a y C5a son anafilatoxinas. Estos componentes de complementos activados pueden activar la desgranulación de mastocitos, que libera histamina de basófilos y mastocitos, y otros transmisores de inflamación, dando como resultado una contracción de músculo liso, permeabilidad vascular incrementada, activación de leucocitos y otros fenómenos inflamatorios incluyendo proliferación celular que da como resultado hipercelularidad. C5a también funciona como un péptido quimiotáctico que sirve para atraer granulocitos pro-inflamatorios al sitio de activación de complemento.
Los receptores C5a se encuentran en las superficies de las células epiteliales bronquiales y alveolares y en las células de músculo liso bronquiales. Los receptores C5a también se han encontrado eosinófilos, mastocitos, monocitos, neutrófilos y Mnfocitos activados.
Breve Descripción de la Invención La presente descripción se refiere, entre otras cosas, a la generación, por parte de los inventores, de una serie de anticuerpos monoclonales humanizados que enlazan específicamente a una proteína C5a libre (esto es, C5a que ha sido disociado en forma proteolíticamente de la proteína C5), pero no a fragmentos de proteína para logos libres de C4a o libres de C3a [los anticuerpos con frecuencia son, referidos en la presente invención como anticuerpos anti-C5a o anticuerpos anti-C5a de neoepítope]. Tal como se describe en la presente invención y se ejemplifican los ejemplos de operación, los anticuerpos anti-C5a generados exhiben una alta afinidad para C5a libre. Por ejemplo, todos los anticuerpos anti-C5a humanizados aquí descritos se enlazan a C5a libre con una KD que es menor a 1.25 nanomolar. Muchos de los anticuerpos enlazan a C5a libre (por ejemplo, C5a humana libre) con una KD que es menor a 300 picomolar; varios de los anticuerpos enlazan a C5a libre con una KD que es menor a 100 picomolar. Además, los anticuerpos anti-C5a humanizados aquí descritos también inhiben la señalización transmitida por C5a. Las propiedades funcionales y estructurales adicionales de los anticuerpos aquí descritos, son elaboradas más adelante y ejemplificadas en los ejemplos de operación.
Los inventores han demostrado que utilizan un modelo animal de artritis reumatoide (RA) y un anticuerpo C5a antiratón sustituto con propiedades similares a las contrapartes de anticuerpo humanizados, eficacia de los anticuerpos anti-C5a para tratar RA. También se muestran en los ejemplos de operación, experimentos que demuestran los efectos terapéuticos positivos de un anticuerpo anti-C5a humanizado en un modelo animal de neutropenia inducida por C5a humana.
Por consiguiente, los inventores consideran que los anticuerpos anti-C5a, o los fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, aquí descritos, son útiles en un huésped de métodos de diagnóstico y terapéuticos relacionados con trastornos en los cuales la señalización transmitida por C5a contribuye a la patogénesis. Por ejemplo, los inventores confirmaron que los anticuerpos anti-C5a humanizados aquí descritos son útiles para tratar o prevenir RA y otros trastornos asociados con complemento incluyendo, pero sin limitarse a: síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), degeneración macular relacionada con la edad (AMD), sepsis, quemadura (por ejemplo, quemadura severa), síndrome antifosfolípido (APS), síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), dolor relacionado con inflamación, asma, nefritis por lupus, restricción de crecimiento intrauterino (IUGR), síndrome de HELLP (anemia hemolítica, enzimas en hígado elevadas y bajo conteo de plaquetas) síndrome de Goodpasture y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD). Los trastornos adicionales que son particularmente adaptables para tratamiento con anticuerpo anti-C5a humanizado, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, son conocidos en la técnica, y se mencionan en la presente descripción.
Los anticuerpo anti-C5a humanizados aquí descritos presentan un número de ventajas, por ejemplo, con respecto a agentes que enlazan e inhiben la disociación de C5 madura o de longitud completa. Igual que dichos agentes, los anticuerpos anti-C5a (y los fragmentos de enlace de antígenos de los mismos) aquí descritos, tienen la capacidad de inhibir los efectos de corriente descendente anafilotóxicos de la activación C5, conforme son transmitidos a través del fragmento C5a de C5. Esto es, los anticuerpos anti-C5a aquí descritos pueden inhibir la respuesta inflamatoria transmitida por C5a, la cual es conocida por desempeñar una parte integral en la patogénesis de trastornos asociados con complemento tales como, pero sin limitarse a sepsis, RA, y asma. Sin embargo, ya que la concentración de C5 en suero humano es de aproximadamente 0.37 µ? (Rawal y Pangburn (2001 ) J Immunol 166(41:2635-2642), con frecuencia es necesario el uso de altas concentraciones y/o administración frecuente de anticuerpos anti-C5 para inhibir en forma efectiva C5, y de esta forma inhibir la respuesta inflamatoria transmitida por C5a en un humano. A diferencia de C5, C5a está presente en la sangre en concentraciones muchos menores, y con frecuencia está restringida a áreas específicas de la activación de complemento local tal como, los pulmones en pacientes con asma, las articulaciones de pacientes RA, o las drusas en los ojos de pacientes con AMD. Por lo tanto, los anticuerpos anti-C5a aquí descritos pueden ser administrados (por ejemplo, en forma local administrados a sitios de la activación de complemento) a un humano en una dosis mucho menor y/o en forma menos frecuente que, por ejemplo, un anticuerpo anti-C5, y proporcionar de manera efectiva la misma inhibición o una mayor de C5a en un humano. La capacidad de administrar una menor dosis del anticuerpo anti-C5a, en comparación con la dosis requerida de un anticuerpo anti-C5, también permite rutas de suministro adicionales tales, por ejemplo, administración subcutánea, administración intramuscular, suministro intrapulmonar y administración a través del uso de microesferas biológicamente degradables. Una concentración menor de antígeno C5a versus C5, también favorece una vida media más larga del anticuerpo anti-C5a, en comparación por ejemplo, con la vida media de un anticuerpo terapéutico que dirige el complemento terminal, debido a una contribución reducida del despeje de anticuerpo transmitido por antígeno.
Además, los anticuerpos anti-C5a aquí descritos también se pueden distinguir de los agentes terapéuticos que inhiben el complemento terminal (tal como inhibidores C5) por su perfil de seguridad. Una consecuencia notable de inhibir los componentes de complemento terminales tales como C5, C5b, C6, C7, C8, o C9 es la protección disminuida por parte del sistema inmune huésped, contra la bacteria encapsulada que el complemento terminal lisa de manera ordinaria-por ejemplo, Neisseria meningitides y Neisseria gonorrhoeae. Ver por ejemplo las Publicaciones de Haeney y asociados, (1980) Clin Exp Immunol 40: 16-24 y Brodsky (2009) Blood 113(261:6522-6527. Ya que los anticuerpos anti-C5a inhiben la respuesta inflamatoria transmitida por C5a, pero no evitan la formación del complejo de complemento terminal que lisa las bacterias encapsuladas, los pacientes que reciben un anticuerpo anti-C5a terapéutico aquí descrito, pueden no requerir una vacunación protectora, por ejemplo, una vacunación contra Neisseria meningitides y Neisseria gonorrhoeae .
Por consiguiente, en un aspecto, la descripción presenta un anticuerpo aislado o un fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza el C5a libre. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a C5a humana libre (hC5a; por ejemplo, una proteína C5a humana que comprende, o consiste en la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID NO: 1). En algunas modalidades, el anticuerpo puede enlazar a una forma desarginada de C5a libre, por ejemplo, la forma desarginada de C5a humana que comprende, o consiste en la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID NO:2. El anticuerpo puede enlazar a un neoepítope de C5a libre, en donde el epítope no está presente en C5 no disociada, o está presente únicamente en una fracción menor de una C5 no disociada total.
Aunque la descripción no está limitada en forma alguna a teoría o mecanismo de acción en particular, en algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5a o el fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a C5a libre (por ejemplo, hC5a libre) y también puede enlazar a una subpoblación de C5 procesada, no disociada (por ejemplo, C5 de plasma) que constituye menos del 10 (por ejemplo, menos del 9.5, 9, 8.5, 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, o menos del 0.1) % de la población total de la C5 de longitud total en una muestra (por ejemplo, una muestra de sangre o plasma o una muestra que comprende una C5 de longitud total recombinante), en donde las subpoblaciones, en su totalidad o en parte, desnaturalizada de modo que un neoepítope C5a de otra forma ocluido, al cual enlaza el anticuerpo anti-C5a o fragmento, se ha expuesto. Por lo tanto, un anticuerpo anti-C5a o un fragmento de enlace de antígenos del mismo aquí descrito, en algunas modalidades, puede enlazar a C5a libre, pero no a la proteína C5 no disociada del 90% o más de la población C5 nativa, no disociada. En algunas modalidades, la subpoblación de C5 completamente o parcialmente desnaturalizada está inactiva o tiene actividad reducida (por ejemplo, menos de 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5% de la actividad de la proteína C5 de longitud total, completamente funcional), o cualquier número de ensayos adecuados útiles para probar la actividad C5, por ejemplo, un ensayo hemolítico o un ensayo CH50eq (ver más adelante). En algunas modalidades, los métodos adecuados para probar la actividad de la subpoblación menor a la cual puede enlazar un anticuerpo anti-C5a aquí descrito, son conocidos en la técnica y se describen en la presente especificación.
En algunas modalidades, cualesquiera anticuerpos anti- C5a o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos aquí descritos, no inhiben la actividad C5 en un ensayo de hemolisis in vitro o un ensayo CH50eq in vitro incluso en la presencia de al menos, o igual, o mayor a 5 (por ejemplo, 5.6, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ó 200) veces en exceso del anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígenos del mismo a C5 no disociado (por ejemplo, C5 nativo, no disociado). En algunas modalidades, cualesquiera de los anticuerpos anti-C5a o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos aquí descritos, no inhiben la actividad de C5 en un ensayo de hemolisis in vitro o un ensayo CH50eq in vitro incluso en la presencia de entre aproximadamente 5 veces hasta 200 veces (por ejemplo, entre aproximadamente 5 veces y 100 veces, entre aproximadamente 10 veces y 100 veces, entre aproximadamente 20 veces y 100 veces, o entre aproximadamente 10 veces y 150 veces) el exceso del anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antigeno del mismo a la C5 nativa, no disociada. La inhibición, por ejemplo, ya que pertenece a la actividad C5, incluye al menos un 5 (por ejemplo, al menos un 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, o 60) % de disminución en la actividad de C5 nativa, no disociada, por ejemplo en un ensayo hemolítico o ensayo CH50eq en comparación con el efecto de un anticuerpo de control (o fragmento de enlace de antigeno del mismo) bajo condiciones similares y en una concentración equimolar. La inhibición sustancial, tal como aquí se utiliza, se refiere a la inhibición de una actividad determinada (por ejemplo, actividad C5) de al menos 40 (por ejemplo, al menos 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, o 95 o más) %. En algunas modalidades, la C5 se obtiene de plasma (por ejemplo, se purifica de o está presente en plasma, por ejemplo, plasma humano).
En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a una proteína C5a (por ejemplo, una proteína C5a humana) con una KD que es menor a 2 nM. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a una proteína C5a con una KD que es menor a 1 nM [también referida en la presente invención como "afinidad subnanomolar"].
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígenos del mismo enlaza a C5a libre con una afinidad subnanomolar [por ejemplo, una KD menor o igual a 9.9 x 10"10(por ejemplo, menor o igual a 9 x 10"10, 8 x 10"10, 7 x 10"10, 6 x 10-10, 5 x 1CT10, 4 x 1CT10, 3 x 10"10, 2.5 x 10" 10, 2 x 10-10, 1 x 1CT10, 8.0 x 10 7.0 x 10 1, 6.0 x 101 , 5.0 x 10"11, 4.0 x 10"11, o 3.0 x 10"11) M] en la presencia de un exceso molar de C5 nativa no disociada (por ejemplo, C5 purificada y/o recombinante). En algunas modalidades, cualesquiera de los anticuerpos anti-C5a o fragmentos de enlace de antigenos de los mismos aquí descritos, tienen al menos el 100 (por ejemplo, al menos 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, o 10000) veces mayor afinidad (por ejemplo, representada por su KD) para C5a libre que para la proteína C5 nativa, no disociada.
Por lo tanto, en otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que (a) enlaza a C5a libre (por ejemplo, hC5a) con una afinidad subnanomolar y (b) enlaza a C5a libre con una afinidad que es al menos 100 (por ejemplo, al menos 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, o 10000) veces mayor a su afinidad correspondiente para la proteína C5 nativa no disociada. Por ejemplo, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito puede, en algunas modalidades, enlazar a hC5a libre con una KD de 100 nM y al menos a una subpoblación de proteína C5 humana no disociada con una KD que es al menos 100 veces mayor (por ejemplo, al menos 10 nM).
En otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo aislado o un fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza a un polipéptido C5a humano libre que tiene la secuencia de aminoácido ¡lustrada en SEQ ID NO: 1, en donde el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza al polipéptido C5a humano con una KD que es menor a 1.25 x 10"9 M en la presencia de un exceso molar (por ejemplo, a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, o 500 veces de exceso molar) de la C5 humana nativa, no disociada con respecto a C5a humana (hC5a). En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza al polipéptido hC5a libre con una afinidad subnanomolar (por ejemplo, cualesquiera de las KD subnanomolares aquí mencionadas) en la presencia de al menos, o mayor a, 2 veces exceso molar, pero no mayor o menor a 500 (por ejemplo, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, ó 15) veces de exceso molar de C5 nativa, no disociada, con respecto a hC5a libre. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza al polipéptido hC5a libre con una afinidad subnanomolar (por ejemplo, cualesquiera de las KD subnanomolares aquí mencionadas) en la presencia de entre 2 veces y 20 veces de exceso molar de la C5 nativa, no disociada con respecto a hC5a libre. En algunas modalidades, un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, enlaza a un polipéptido hC5a libre con una afinidad subnanomolar (por ejemplo, cualesquiera de las KD subnanomolares aquí mencionadas) en la presencia de entre 10 veces y 20 veces del exceso molar de la C5 nativa, no disociada con respecto a hC5a libre. En algunas modalidades, el anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza al polipéptido hC5a libre con una afinidad subnanomolar (por ejemplo, cualesquiera de las KD subnanomolares aquí mencionadas), en la presencia de entre 5 veces y 15 veces de exceso molar de la C5 nativa, no disociada con respecto a hC5a libre. En algunas modalidades, un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a un polipéptido hC5a libre con una afinidad subnanomolar (por ejemplo, cualesquiera de las KD subnanomolares aquí mencionadas) en la presencia de al menos 2 veces, pero no más de 20 veces de exceso molar de la C5 nativa no disociada con respecto a hC5a libre. Dichas medidas pueden ser medidas in vitro utilizando, por ejemplo, técnicas de determinación de afinidad estándar, muchas de las cuales se mencionan y/o describen en la presente invención.
En otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza a un polípéptido C5a humano que tiene la secuencia de aminoácido ¡lustrada en SEQ ID NO: 1, en donde el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza al polípéptido C5a humano con a KD que es menor a 1.25 x 10"9 M y en donde el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo no inhibe sustancialmente, en comparación con una cantidad equimolar de un anticuerpo de control o fragmento de enlace de antígeno del mismo, la actividad C5 incluso en la presencia de menos de menos de, o igual a un exceso molar de 10 veces del anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo a la C5 nativa no disociada.
En algunas modalidades de cualesquiera de las anticuerpos anti-C5a o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos aquí descritos, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a C5a humana libre, y es reactiva en forma cruzada con C5a libre de al menos una especie de mamífero no humana. Por ejemplo, en algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a (o un fragmento de enlace de antígeno del mismo) enlaza a C5a libre de humano (por ejemplo, con afinidad subnanomolar) y también enlaza a C5a libre de un primate no humano (por ejemplo, macaco cinomolgo, macaco Rhesus, chango, babuino, chimpancé, orangután o gorila), un roedor (por ejemplo, ratón, rata, hámster, cerdo de Guinea, o conejo), vaca, cabra, burro, cerdo, perro, gato o caballo. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antigeno del mismo aquí descrito enlaza a hC5a libre con una KD menor o a igual 9.9 x 10"10 (por ejemplo, menor o igual a 9 x 10-10, 8 x 10-10, 7 x 10"10, 6 x 1(G10, 5 x 1(G10, 4 x 1(G10, 3 x 10" 10, 2.5 x 10"10, 2 x 10-10, 1 x 10"10, 8.0 x 10"11. 7.0 x 1(G1\ 6.0 x 10"11, 5.0 x 10"11, 4.0 x 10"11, o 3.0 x 10"11) M y también enlaza a C5a libre de macaco cinomolgo (u otra especie de primate no humano), en donde la afinidad (por ejemplo, representado por su KD) para C5a humana es mayor a 500 (por ejemplo, no mayor a 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, o 475) veces mayor a la afinidad del macaco cinomolgo (u otra especie de primate no humano) C5a. Por ejemplo, en algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5a enlaza un hC5a libre con una afinidad que es no mayor a 50 veces más que la afinidad correspondiente del anticuerpo para C5a de primate no humano (por ejemplo, una Ko para hC5a libre de 100 nM y una KD para C5a de primate no humano no mayor a 5 nM). En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito, enlaza hC5a libre con una KD menor o igual a 9.9 x 10"10 (por ejemplo, menor o igual a 9 x 10"10, 8 x 10"10, 7 x 10"10, 6 x 10"10, 5 x 10"10, 4 x 10"10, 3 x 10"10, 2.5 x 10"10, 2 x 10"10, 1 x 10'10, 8.0 x 10'11, 7.0 x 10"11, 6.0 x 10"11, 5.0 x 10"11, 4.0 x 10"11, o 3.0 x 10 " 1) M y también enlaza a C5a de un roedor (por ejemplo, ratón, rata, o conejo), en donde la afinidad (por ejemplo, representada por su KD) para C5a humana es no mayor a 1000 (por ejemplo, no mayor a 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, o 975) veces mayor la afinidad para C5a de roedor. En algunas modalidades, cualesquiera de los anticuerpos anti-C5a o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos aquí descritos, enlazan con afinidad subnanomolar tanto a C5a humana como a C5a de un mamífero no humano (por ejemplo, un roedor o primate no humano tal como un macaco cinomolgo). Un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, en algunas modalidades, puede enlazar a C5a humano y a C5a de primate no humano con afinidad igual (por ejemplo, una KD equivalente).
Por ejemplo, la descripción presenta un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza a C5a humana libre con afinidad subnanomolar [por ejemplo, una KD menor o igual a 9.9 x 10"10 (por ejemplo, menor o igual a 9 x 10' 0, 8 x 10-10, 7 x 10"10, 6 x 10"10, 5 x 10"10, 4 x 10"10, 3 x 10"10, 2.5 x 10"10, 2 x 10'10, 1 x 1010, 8.0 x 10"11, 7.0 x 10"11, 6.0 x 10" 11, 5.0 x 10"11, 4.0 x 10"11, o 3.0 x 10"11) M] y reacciona en forma cruzada con C5a libre de macaco cinomolgo (u otro primate no humano), el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a C5a de macaco cinomolgo (u otro primate no humano) con una KD menor a 10 x 10"9, 9 x 10"9, 8 x 10"9, 7 x 10"9, 6 x 10"9, 5 x 10'9, 4 x 10"9, 3 x 10"9, 2 x10 1 x 10"9, 9.9 x 1010 (por ejemplo, meno a 9 x 1CT10, 8 x 1010, 7 x 1(T10, 6 x 10'10, 5 x 10"10, 4 x 10"10, 3 x 10'10, 2.5 x 10'10, 2 x 10" 10, 1 x 1(r10, o 8.0 x 10-11) M], en donde la afinidad de C5a humana es no mayor a 500 (por ejemplo, no mayor a 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, o 475) veces que la afinidad para C5a de macaco cinomolgo (o primate no humano) (por ejemplo, KD para C5a humana de 100 nM y una KD para C5a de primate no humano no mayor a 50 nM). Los métodos adecuados para determinar la afinidad de un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo para un antígeno determinado son conocidos en la técnica y se describen y ejemplifican en la presente especificación .
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5a de reactividad cruzada o el fragmento de enlace de antígeno del mismo inhibe funcionalmente tanto la hC5a libre como la C5a de mamífero no humana a la cual enlaza. Por ejemplo, un anticuerpo inhibe al menos el 70 (por ejemplo, al menos el 75, 80, 85, 90, o 95 o mayor) % de la activación de neutrófilo humano dependiente de C5a humana en una proporción molar de 1:1 (sitio de enlace de antígeno:C5a) e inhibe en al menos el 70 (por ejemplo, al menos 75, 80, 85, 90, o 95 o más) % la activación de neutrófilo dependiente de C5a de mamífero no humano (por ejemplo, los neutrófilos proceden de la misma especie que la C5a de mamífero no humana a la cual enlaza el anticuerpo) en una proporción molar de 1:1 (sitio de enlace de antígeno:C5a).
En otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza al polipéptido hC5a libre que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID NO: a, en donde el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza al polipéptido C5a humano con una KD que es menor a 1.25 x 10"9M y en donde el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza tanto hC5a como a C5a de una especie de mamífero no humano. La especie de mamífero no humano puede ser, por ejemplo, un primate no humano tal como macaco cinomolgo, macaco rhesus, o babuino. En algunas modalidades, la especie de mamífero no humano es un roedor tal como un ratón, rata, conejo, cerdo de Guinea, jerbo, o hámster. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a hC5a con una afinidad no mayor a 100 veces más que la afinidad correspondiente para C5a de la especie de mamífero no humano. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno inhibe al menos el 50% de la activación de neutrófilo humano dependiente de C5a humana en una proporción molar de 1:1 (sitio de enlace de antígeno: C5a).
En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a C5a libre de un primate no humano (por ejemplo, un macaco cinomolgo o macaco rhesus), la proteína C5a libre que tiene una secuencia de aminoácido que comprende, o consiste en la secuencia de aminoácido ilustrada en SEQ ID NO: 179 o SEQ ID NO: 180.
Tal como se describe en los ejemplos de operación, los inventores han descubierto un anticuerpo anti-C5a bivalente, BNJ383, que enlaza a C5a libre (en este caso C5a humana) con alta afinidad, y con una afinidad mucho menor, a C5 humana no disociada (hC5), en donde, en una composición (por ejemplo, una solución acuosa) bajo condiciones fisiológicas en equilibrio, y en la presencia de un exceso molar de C5 humana no disociada, en comparación con la cantidad molar de los sitios de enlace de antígeno de los anticuerpos, al menos el 95% de la pluralidad de los anticuerpos, enlazan cada uno a no más de una molécula hC5. El segundo sitio de enlace de antígeno de al menos 95% de la pluralidad de los anticuerpos, permanece disponible (por ejemplo, sustancialmente disponible) para enlazar a C5a libre. Aunque la descripción no está limitada a teoría o mecanismo de acción en particular, los inventores consideran que el anticuerpo anti-C5a bivalente enlaza a C5 no disociada en forma tal (por ejemplo, en dicho epítope) que la hidranza estérica excluye, o al menos inhibe sustancialmente el enlace del segundo sitio de enlace de antígeno del anticuerpo anti-C5a a una segunda proteína C5, disociada, aunque el anticuerpo puede acomodar fácilmente el enlace a dos moléculas hC5a. Por lo tanto, el anticuerpo, incluso en un exceso molar de C5 no disociada, retiene la capacidad de enlazar a C5a libre con alta afinidad y de esta forma retiene, incluso en dicho exceso molar, la capacidad de inhibir la actividad pro-inflamatoria de C5a.
Un experto en la técnica puede apreciar fácil y rápidamente la miríada de beneficios terapéuticos de dicho anticuerpo anti-C5a. Por ejemplo, tal como se observó anteriormente, la concentración de C5 en la circulación en suero humano, es muy alta. Por lo tanto, cuando se introduce en un mamífero, un anticuerpo anti-C5a que tiene la capacidad de enlazar en forma simultánea a dos moléculas C5 no disociadas, puede desactivarse rápidamente en el exceso molar de C5, y puede posteriormente ya no tener la capacidad de enlazar a C5a libre en el caso de activación de complemento. Y, como con los anticuerpos anti-C5, el uso de altas concentraciones y/o administración frecuente de este tipo de anticuerpo anti-C5a, puede ser necesario inhibir en forma efectiva C5a, en el caso en que se produzca. En contraste, el anticuerpo anti-C5a aquí descrito que retiene la capacidad de enlazar a C5a libre, incluso en un exceso molar de C5 disociada, por lo tanto puede administrarse a un humano en una dosis mucho menor y/o en forma menos frecuente, por ejemplo que un anticuerpo anti-C5, y proporcionar en forma efectiva la misma inhibición o una inhibición mayor de C5a en el hümano.
Por consiguiente, aún en otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo aislado que comprende dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada sitio de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a C5a humana libre (hC5a) o a C5 humana disociada (hC5), en donde, en una solución acuosa que comprende: (i) una pluralidad de anticuerpos y (ii) un exceso molar de hC5 en comparación con la cantidad molar de los sitios de enlace de antígeno, en equilibrio y bajo condiciones fisiológicas, al menos el 95 (por ejemplo, al menos 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, o 97.7) % de la pluralidad de anticuerpos enlazan a no más de una molécula hC5, es decir, no más del 5% de los anticuerpos enlazan dos moléculas de hC5 en equilibrio.
En otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo aislado que comprende dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada sitio de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a C5a humana libre (hC5a) o a C5 humana disociada (hC5), en donde, en equilibrio y bajo condiciones fisiológicas, en una solución acuosa que comprende: (i) una pluralidad de los anticuerpos y (ii) un exceso molar de hC5 en comparación con la cantidad molar de los sitios de enlace de antígeno (o anticuerpos), al menos el 95% de la pluralidad de anticuerpos retienen al menos un sitio de enlace de antígeno disponible para enlazar a hC5a libre.
En otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo aislado que comprende dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada sitio de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a C5a humana libre (hC5a) o a C5 humana no disociada (hC5), en donde, en equilibrio y bajo condiciones fisiológicas, en una solución acuosa comprende: (i) una pluralidad de los anticuerpos y (ii) un exceso molar de hC5 en comparación con la cantidad molar de los sitios de enlace de antígeno (o anticuerpos), cada sitio de enlace de antígenos de no más del 5% de la pluralidad de anticuerpos enlazan a una molécula hC5.
En algunas modalidades de cualesquiera de los anticuerpos aislados aquí descritos, el exceso molar es de al menos dos veces (por ejemplo, al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, o incluso 10 veces) de exceso molar.
En algunas modalidades de cualesquiera de los anticuerpos aislados aquí descritos, la condición fisiológica es 3.9 mM NaH2P04, 6.1 mM Na2HP04, y 150 mM NaCI, en pH7.0.
En algunas modalidades de cualesquiera de los anticuerpos aislados aquí descritos, cada sitio de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a hC5a libre con un KD que es menor a 1.25 x 1 O"9 M. En algunas modalidades, cada sitio de enlace de antígenos puede enlazar independientemente a hC5a con una afinidad subnanomolar (ver anteriormente).
En algunas modalidades de cualesquiera de los anticuerpos aislados antes descritos, el anticuerpo aislado comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEQ ID NO:42 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEQ ID NO:45.
En algunas modalidades de cualesquiera de los anticuerpos aislados aquí descritos, el anticuerpo aislado comprende: (i) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEQ ID NO:20; (¡i) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEQ ID NO:21; (iii) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEQ ID NO:22; (iv) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEQ ID NO:28; (v) una de CDR2 cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEQ ID NO:46; y (vi) una CDR3 cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEQ ID NO:47.
En algunas modalidades, el anticuerpo aislado puede comprender cualesquiera de los conjuntos de CDR de cadena ligera aquí descritos, cualesquiera de las regiones variables de cadena ligera aquí descritas (por ejemplo, cualesquiera de las regiones variables de cadena ligera humanizadas), o cualesquiera de los conjuntos CDR de cadena pesada aquí descritos, o cualesquiera de las regiones variables de cadena pesada aquí descritas (por ejemplo, cualesquiera de las regiones variables de cadena pesada humanizadas), o cualquier combinación adecuada de las mismas. Ver por ejemplo las tablas 1 ó 2.
En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar un humano que padece de un trastorno asociado por complemento C5a), en donde el método incluye administrar a un humano cualesquiera de los anticuerpos aislados aquí descritos en una cantidad suficiente para tratar el trastorno asociado con complemento.
En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar a un humano que padece de un trastorno de complemento asociado con C5a, en donde el método comprende administrar a un humanos al menos 0.6 (por ejemplo, al menos 0.7, 0.8, 0.9, o 1) mg de cualesquiera de los anticuerpos aislados aquí descritos por kg de peso corporal del humano, para enlazar de esta forma de manera parcial o total y secuestrar niveles de nanogramos del C5a libre durante más de, igual a o al menos 12 (por ejemplo, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25) días.
En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar a un humano que padece de un trastorno de complemento asociado-C5a, en donde el método comprende administrar al humano al menos 10 mg de cualesquiera de los anticuerpos aislados aquí descritos por kilogramo de peso corporal del humano, para enlazar de esta forma de manera parcial o total y secuestrar niveles de nanogramos de C5a libre durante al menos 24 días.
En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar a un humano que padece de un trastorno de complemento asociado con C5a, en donde el método comprende administrar al humano cualesquiera de los anticuerpos aislados aquí descritos (o por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende cualesquiera de los anticuerpos aislados aquí descritos) en una cantidad suficiente para (a) lograr valores Cmax molares iguales o menores a la concentración molar fisiológica de hC5 no disociada y (b), enlazar en forma parcial o total y secuestrar niveles patofisiológicos de C5a libre.
En algunas modalidades de cualesquiera de los métodos aquí descritos, un anticuerpo se administra a un sujeto (por ejemplo, un humano) en una cantidad suficiente para lograr un valor Cmax molar que es sustancialmente inferior a la concentración molar fisiológica de C5 no disociada (por ejemplo, hC5).
En algunas modalidades de cualesquiera de las métodos aquí descritos, el valor Cmax es no mayor a 80 nM (o aproximadamente 0.6 mg/kg). En algunas modalidades, los niveles Cmax no son mayores a 70 (por ejemplo, 60, 50, 40, 30, o 20) nM. En algunas modalidades, el valor Cmax es no mayor a aproximadamente 100 nM. En algunas modalidades, el valor Cmax es no mayor a 200 nM. En algunas modalidades de cualesquiera de las métodos aquí descritos, el valor Cmax es no mayor a 400 nM (o aproximadamente 3 mg/kg). En algunas modalidades, el valor Cmax es no mayor a 400 (por ejemplo, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10) nM.
En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar a un humano que padece de un trastorno de complemento asociado-C5a, en donde el método comprende administrar al humano cualesquiera de los anticuerpos aislados aquí descritos (o por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende cualesquiera de los anticuerpos aislados aquí descritos) en una cantidad suficiente para (a) lograr valores Cmax molares iguales a, menores a o sustancialmente inferiores a la concentración fisiológica molar de hC5 no disociada y (b) enlazar en forma parcial o completa y secuestrar niveles de nanogramo de C5a libre durante al menos 12 días (por ejemplo, al menos 24 días). Los valores Cmax adecuados se describieron anteriormente.
En algunas modalidades de cualesquiera de las métodos aquí descritos, el trastorno de complemento asociado-C5a , puede ser, por ejemplo, uno seleccionado del grupo que consiste en sepsis, síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), choque séptico, síndrome anti-fosfolípido, síndrome anti-fosfolípido catastrófico, coagulación intravascular diseminada, nefritis por lupus, síndrome de Goodpasture, quemadura o quemadura severa, asma, síndrome de HELLP (anemia hemolítica, enzimas elevadas en hígado y bajo conteo de plaquetas), dolor inducido por inflamación, neutropenia transmitida por C5a, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), enfermedad pulmonar obstructiva crónica y artritis reumatoide.
Aún en otro aspecto, la descripción presenta una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos aislados, comprendiendo cada anticuerpo de la pluralidad dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada sitio de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a C5a humana libre (hC5a) o a C5 humana no disociada (hC5), y en donde, en la presencia de C5 humana (hC5) y bajo condiciones fisiológicas, no más del 5% de los anticuerpos de la pluralidad en equilibrio, comprende dos sitios de enlace enlazados en forma simultánea a hC5 no disociada.
En algunas modalidades de cualesquiera de las composiciones aquí descritas, el porcentaje de la pluralidad de cualquier configuración de enlace particular puede evaluarse utilizando cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC). En algunas modalidades, las condiciones fisiológicas en las cuales se evalúan los anticuerpos comprenden las siguientes condiciones: incubación de hC5 (por ejemplo, un exceso molar (por ejemplo, exceso molar de 2 veces) de hC5) con la pluralidad de anticuerpos a una temperatura de 4°C durante 84 horas en una solución acuosa que comprende 3.9 mM NaH2P04, 6.1 mM de Na2HP04, y 150 mM de NaCI, en pH7.0. Para los propósitos de la presente descripción, la solución obtenida a las 84 horas a una temperatura de 4°C se considera que está en equilibrio.
En algunas modalidades de cualesquiera de las composiciones aquí descritas, no más del 5% de los anticuerpos de la pluralidad comprende dos sitios de enlace de antígenos enlazados en forma simultánea a hC5 no disociada, bajo condiciones fisiológicas y en la presencia de al menos 2 veces de exceso molar de hC5 para el anticuerpo.
En algunas modalidades de cualesquiera de las composiciones aquí descritas, no más del 5% de los anticuerpos de la pluralidad, comprende dos sitios de enlace de antígenos en forma simultánea, enlazados a moléculas hC5 no disociadas, tal como se evalúa utilizando HPLC después de la incubación de la pluralidad de anticuerpos con hC5 a una temperatura de 4°C durante 84 horas en una solución acuosa que comprende 3.9 mM de NaH2P04, 6.1 mM de Na2HP04, y 150 mM de NaCI, en pH7.0.
En otro aspecto, la descripción presenta una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos aislados, comprendiendo cada anticuerpo de la pluralidad dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada sitio de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a C5a humana libre (hC5a) o C5 humana no disociada (hC5), y en donde no más del 5% de los anticuerpos de la pluralidad comprende dos sitios de enlace de antígenos enlazados en forma simultánea a hC5 no disociada, tal como se evalúa (por ejemplo, utilizando HPLC) después de la incubación de la pluralidad de anticuerpos con hC5 a una temperatura de 4°C durante 84 horas en una solución acuosa que comprende 3.9 mM NaH2P04, 6.1 mM Na2HP04, y 150 mM NaCI, en pH7.0.
Aún en otro aspecto, la descripción presenta una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos aislados, comprendiendo cada anticuerpo de la pluralidad un primer sitio de enlace de antígeno y un segundo sitio de enlace de antígeno, en donde cada sitio de enlace de antígenos puede enlazar independientemente a C5a humana libre (hC5a) o C5 humana no disociada (hC5), en donde cada sitio de enlace de antígenos puede enlazar independientemente al polipéptido hC5a libre con una KD que es menor a 1.25 x 10"9 M, y en donde en la presencia C5 humana (hC5) y tal como se evalúa (por ejemplo, utilizando cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC)) bajo condiciones fisiológicas, los dos sitios de enlace de antígeno de al menos 95% de la pluralidad de los anticuerpos están ocupados por hC5 no disociada en las siguientes configuraciones: (i) el primer sitio de enlace de antígenos enlaza hC5 no disociada, y el segundo sitio de enlace de antígeno está no enlazado; o (ii) el primer sitio de enlace de antígenos está no enlazado, y el segundo sitio de enlace de antígeno enlaza a hC5 no disociada.
Aún en otro aspecto, la descripción presenta una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos aislados, cada anticuerpo de la pluralidad comprende dos sitios de enlace de antígenos, en donde cada sitios de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a C5a humana libre (hC5a) o a C5 humana no disociada (hC5), y en donde, en la presencia de C5 humana (hC5) y tal como se evalúa (por ejemplo, utilizando cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC)) bajo condiciones fisiológicas, al menos el 95% de los anticuerpos de la pluralidad comprende al menos un sitio de enlace de antígeno con la capacidad de enlazar a hC5a libre.
En algunas modalidades de cualesquiera de las composiciones aquí descritas, la pluralidad de anticuerpos se evalúa en la presencia de al menos 2 veces de exceso molar del anticuerpo hC5: en algunas modalidades de cualesquiera de las composiciones aquí descritas, la pluralidad de anticuerpos se evalúa en la presencia de al menos 2 veces de exceso molar de hC5: sitios de enlace de antígeno.
Aún en otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo aislado que comprende dos sitios de enlace de antígeno, en donde el anticuerpo enlaza a C5a libre o C5 no disociada, y en donde uno de los sitios de enlace de antígeno del anticuerpo permanece disponible para enlazar C5a libre en la presencia de un exceso molar (por ejemplo, al menos o mayor a 2 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, o incluso 20 veces de exceso molar) C5 no disociada.
En algunas modalidades, los sitios de enlace de antígeno tienen la misma especificidad (por ejemplo, las CDRs de cada de los dos sitios de enlace de antígeno comparte en secuencias de aminoácido). En algunas modalidades, la C5a libre es C5a humano. En algunas modalidades, el anticuerpo reacciona en forma cruzada entre C5a humana y C5a de una especie de mamífero no humana. El anticuerpo, en algunas modalidades, puede enlazar a C5a libre con una afinidad subnanomolar. En algunas modalidades, el anticuerpo tiene afinidad para C5a que es al menos 100 veces mayor que su afinidad correspondiente para C5 no disociada.
En otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo aislado que comprende dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada sitio de enlace de antígeno enlaza en forma independiente a C5a humana libre (hC5a) o a C5 humana no disociada (hC5), y en donde, en cualquier concentración de hC5 no disociada (por ejemplo, en un exceso molar de hC5 no disociada con respecto a hC5a), al menos uno de los sitios de enlace de antígeno del anticuerpo permanece disponible para enlazar a hC5a libre (por ejemplo, bajo condiciones fisiológicas humanas, por ejemplo, en sangre o suero humano).
En otro aspecto, la descripción presenta una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos aislados, en donde cada anticuerpo de la pluralidad comprende dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada uno de los sitios de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a C5a humana libre (hC5a) o a C5 humana no disociada (hC5), y en donde en una proporción molar de 1:1 (anticuerpo:hC5), no más, o menos del, 5 (por ejemplo, no más o menos del 4.9, 4.8, 4.7, 4.6, 4.5, 4.4, 4.3, 4.2, 4.1, 4.0, 3.9, 3.8, 3.7, 3.6, 3.5, 3.4, 3.3, 3.2, 3.1, 3.0, 2.9, 2.8, 2.7, 2.6, 2.5, 2.4, 2.3, 2.2, 2.1, 2.0, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, o 1) % de los anticuerpos de la pluralidad comprende dos sitios de enlace de antígeno enlazados en forma simultánea a hC5 no disociada. En algunas modalidades, cada sitio de enlace de antígenos puede enlazar independientemente hC5a libre con una KD que es menor a 1.25 x 10"9 M (o, por ejemplo, con afinidad subnanomolar).
En otro aspecto, la descripción presenta una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos aislados, en donde cada anticuerpo de la pluralidad comprende dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada uno de los sitios de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a C5a humana libre (hC5a) o a C5 humana no disociada (hC5), y en donde en la presencia de niveles fisiológicos de hC5 no disociada, los anticuerpos de la pluralidad enlazan parcial o completamente y secuestran los niveles de nanogramo de C5a libre durante más de, igual a o al menos 12 (por ejemplo, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25) días cuando se administra a un humano en dosis de 1 mg/kg o mayores.
En otro aspecto, la descripción presenta una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos aislados, en donde cada anticuerpo de la pluralidad comprende dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada uno de los sitios de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a C5a humana libre (hC5a) o a C5 humana no disociada (hC5), y en donde, en la presencia de niveles fisiológicos de hC5 no disociada, los anticuerpos de la pluralidad enlazan parcial y completamente y secuestran niveles de nanogramo de C5a libre durante más de, o igual a, o al menos 12 (por ejemplo, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25) días, cuando se administra a un humano en dosis de 10 mg/kg o mayor.
En otro aspecto, la descripción presenta una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos aislados, en donde cada anticuerpo de la pluralidad comprende dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada uno de los sitios de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a C5a humana libre (hC5a) o a C5 humana no disociada (hC5), y en donde en la presencia de niveles fisiológicos de hC5no disociada, los anticuerpos de la pluralidad enlazan parcial o completamente y secuestran niveles de nanogramo de C5a libre durante más de, igual a, o al menos 12 (por ejemplo, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25) días, cuando se administra en dosis que logran valores Cmax molares, sustancialmente inferiores a la concentración fisiológica molar de hC5 no disociada.
En otro aspecto, la descripción presenta una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos aislados, en donde cada anticuerpo de la pluralidad comprende dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada uno de los sitios de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a C5a humana libre (hC5a) o a C5 humana no disociada (hC5), y en donde, en la presencia de niveles fisiológicos de hC5 no disociada, los anticuerpos de la pluralidad enlazan parcial o completamente y secuestran niveles patofisiológicos de C5a libre, cuando se administran en dosis que logran valores Cmax molares sustancialmente inferiores a la concentración fisiológica molar de hC5 no disociada.
En otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo aislado que comprende un primer sitio de enlace de antígenos y un segundo sitio de enlace de antígenos, en donde cada sitio de enlace de antígenos puede enlazar independientemente a C5a humana libre (hC5a) o a C5 humana no disociada (hC5), y en donde, cuando ambos sitios de enlace de antígeno están completamente ocupados (y, por ejemplo, bajo condiciones fisiológicas humanas, por ejemplo, en sangre o suero humano), son posibles las siguientes configuraciones de enlace: (i) el primer sitio de enlace de antígeno enlaza hC5a libre y el segundo sitio de enlace de antígeno enlaza a hC5 no disociada; (ii) el primer sitio de enlace de antígeno enlaza a hC5a libre y el segundo sitio de enlace de antígenos enlaza hC5a libre; o (iii) el primer sitio de enlace de antígeno enlaza a hC5 no disociada y el segundo sitio de enlace de antigeno enlaza a hC5a libre.
Aún en otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo aislado que comprende un primer sitio de enlace de antígeno y un segundo sitio de enlace de antígenos, en donde cada sitio de enlace de antígenos puede enlazar independientemente a C5a humana libre (hC5a) o C5 humana no disociada (hC5), en donde cada sitio de enlace de antígenos puede enlazar independientemente a hC5a libre con una KD que es menor a 1.25 x 10~9 M (o, por ejemplo, con afinidad subnanomolar), y en donde, en una solución fisiológica que contiene una pluralidad de los anticuerpos, al menos el 95% de los anticuerpos están en las siguientes configuraciones: (i) el primer sitio de enlace de antígenos enlaza a hC5a libre y el segundo sitio de enlace de antígenos enlaza a hC5 no disociada; (ii) el primer sitio de enlace de antígenos enlaza a hC5a libre y el segundo sitio de enlace de antígeno enlaza a hC5a libre; (iii) el primer sitio de enlace de antígenos enlaza a hC5 no disociada y el segundo sitio de enlace de antígenos enlaza a hC5a libre; (iv) el primer sitio de enlace de antígenos enlaza a hC5 no disociada y el segundo sitio de enlace de antígenos no está enlazado; (v) el primer sitio de enlace de antígenos enlaza hC5a y el segundo sitio de enlace de antígenos está no enlazado; (vi) el primer sitio de enlace de antígeno está no enlazado y el segundo sitio de enlace de antígeno enlaza hC5 no disociado; (vii) el primer sitio de enlace de antígeno está no enlazado y el segundo sitio de enlace de antígeno enlaza a hC5a; y (viii) el primer sitio de enlace de antígenos está no enlazado y el segundo sitio de enlace de antígeno está no enlazado.
En otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo aislado que comprende dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada sitio de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a C5a humana libre (hC5a) o C5 humana no disociada (hC5), y en donde, en un exceso molar de hC5 no disociada con respecto a hC5a, el anticuerpo inhibe al menos el 50% de la activación de neutrófilo humano dependiente de hC5a en una proporción molar de 1:1 (sitio de enlace de antígeno: hC5a).
En algunas modalidades de cualesquiera de los anticuerpos aquí descritos, son posibles configuraciones bajo condiciones fisiológicas humanas con proteínas C5a y C5 humanas, nativas, completamente dobladas.
En algunas modalidades de cualesquiera de los anticuerpos aquí descritos, el anticuerpo enlaza a hC5a libre con una KD que es menor a 1.25 x 10"9 M (o, por ejemplo, con afinidad subnanomolar).
Aún en otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo que (a) enlaza a C5a libre (por ejemplo, hC5a) con una afinidad subnanomolar y (b) enlaza a C5a libre con una afinidad que es al menos 100 (por ejemplo, al menos 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, o 10000) veces mayor que su afinidad correspondiente para la proteína C5 no disociada. En una composición fisiológica que comprende una pluralidad de los anticuerpos, para al menos el 95% de los anticuerpos, únicamente un sitio de enlace de antígeno del anticuerpo enlaza a la proteína C5 no disociada, mientras que el segundo sitio de enlace de antígenos permanece disponible para enlazar a C5a libre. (La hC5a puede tener la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID O: 1).
En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar a un humano que padece de trastorno de complemento asociado con C5a, en donde el método que comprende administrar al humano una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos aislados, en donde cada anticuerpo de la pluralidad comprende dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada sitio de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a C5a humana libre (hC5a) o C5 huimana no disociada (hC5), en donde al menos 1 mg de los anticuerpos por kilogramo del peso corporal del humano, se administran al humano y en donde la administración de los anticuerpos es efectiva para enlazar parcial o completamente y secuestrar niveles de nanogramo de C5a libre durante al menos 12 días.
En otro aspecto, la presente descripción presenta un método para tratar a un humano que padece de un trastorno asociado con complemento (por ejemplo, un trastorno de complemento asociado con C5a), en donde el método comprende administrar al humano una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos aislados, en donde cada anticuerpo de la pluralidad comprende dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada uno de los sitios de enlace de antígeno pueden enlazar independientemente a C5a humana (hC5a) libre o a C5 humana (hC5) no disociada, en donde al menos 10 mg de los anticuerpos por kg de peso corporal del humano, se administran al humano, y en donde la administración de los anticuerpos es efectiva para enlazar parcial o completamente y secuestrar niveles de nanogramo de C5a libre durante al menos 24 días.
En otro aspecto, la presente descripción presenta un método para tratar a un humano que padece de un trastorno asociado con complemento (por ejemplo, un trastorno de complemento asociado con C5a), en donde el método comprende administrar al humano una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos aislados, en donde cada anticuerpo de la pluralidad comprende dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada uno de los sitios de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a C5a humana (hC5a) libre o C5 humana (hC5) no disociada, en donde los anticuerpos se administran en una dosis suficiente para: (a) lograr valores Cmax molares substancialmente menores a la concentración fisiológica molar de hC5 no disociada y (b) enlazada parcial o completamente y secuestrar niveles de nanogramo de C5a libre durante al menos 12 días.
En otro aspecto, la presente descripción presenta un método para tratar a un humano que padece de un trastorno asociado con complemento (por ejemplo, un trastorno de complemento asociado con C5a), en donde el método comprende administrar al humano una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos aislados, en donde cada anticuerpo de la pluralidad comprende dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada uno de los sitios de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a C5a humana (hC5a) libre o C5 humana (hC5) no disociada, en donde los anticuerpos se administran en una dosis suficiente para: (a) lograr valores Cmax molares substancialmente menores a la concentración fisiológica molar de hC5 no disociada y (b) enlazada parcial o completamente y secuestrar niveles de nanogramo de C5a libre durante al menos 24 días.
En otro aspecto, la presente descripción presenta un método para tratar a un humano que padece de un trastorno asociado con complemento (por ejemplo, un trastorno de complemento asociado con C5a), en donde el método comprende administrar al humano una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos aislados, en donde cada anticuerpo de la pluralidad comprende dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada uno de los sitios de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a C5a humana (hC5a) libre o C5 humana (hC5) no disociada, en donde los anticuerpos se administran en una dosis suficiente para: (a) lograr valores Cmax molares substancialmente menores a la concentración fisiológica molar de hC5 no disociada y (b) enlazada parcial o completamente y secuestrar niveles de patofisiológicos de C5a libre.
Quedará entendido que cualesquiera de las composiciones (por ejemplo, que comprenden una pluralidad de anticuerpos) o anticuerpos aislados (por ejemplo, que retienen, en la presencia de C5 o un exceso molar de C5, un brazo Fab libre con la capacidad de enlazar a C5a libre) aquí descritos pueden ser: (a) formulados como composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente descripción, (b) incluidos en los equipos terapéuticos (aquí descritos), o (c) incluidos en las jeringas llenadas previamente aquí descritas.
Tal como se describe en los ejemplos de operación aquí proporcionados, los inventores también han descubierto un anticuerpo, BNJ383 (ver más adelante), que no únicamente enlaza con alta afinidad (afinidad subnanomolar) a hC5a libre, sino que en concentraciones en exceso de C5 no disociada, también inhibe la formación del complejo de complemento terminal (TCC) en una forma dependiente de la dosis. Incluso en concentraciones del anticuerpo anti-C5a mayores a 6.5 veces en exceso de C5, sin embargo, no es completa la inhibición de TCC. Aunque la presente descripción no está limitada a teoría o mecanismo de acción alguno en particular, el anticuerpo puede inhibir la formación de TCC enlazando al menos a una fracción de C5 no disociada y previniendo su disociación y/o previniendo de otra forma la asociación exitosa de C5 con componentes TCC adicionales. Los inventores apreciaron que dicho anticuerpo es útil para tratar trastornos asociado con complemento, por ejemplo, en donde C5a desempeña un papel significativo, y el TCC que contiene C5b puede desempeñar un papel menos substancial. Dichos trastornos pueden incluir, por ejemplo, sepsis, síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), choque séptico, síndrome anti-fosfolípido, síndrome anti-fosfol ípido catastrófico, coagulación intravascular diseminada, nefritis por lupus, Síndrome de Goodpasture, quemadura o quemadura severa, asma, síndrome de HELLP (Anemia hemolítica, Enzimas de hígado elevadas y bajo conteo de Plaquetas), dolor inducido por inflamación, neutropenia transmitida por C5a, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y artritis reumatoide.
Los inventores también apreciaron que e! uso de dicho anticuerpo anti-C5a para tratar estas condiciones, entre otras, puede proporcionar un perfil de seguridad incluso más benéfico en comparación con el uso de fármacos inhibidores de complemento terminal. Tal como se observó anteriormente, una consecuencia notable de inhibir los componentes de complemento terminal, tales como C5, C5b, C6, C7, C8, o C9, es la protección disminuida por parte del sistema inmune del huésped contra la bacteria encapsulada que normalmente lisa el complemento terminal - por ejemplo, Neisseria meningitides y Neisseria gonorrhoeae. Ya que los anticuerpos anti-C5a descritos en esta sección inhiben la respuesta inflamatoria transmitida por C5a, pero no inhiben completamente la formación del complejo de complemento terminal que lisa las bacterias encapsuladas, los pacientes que reciben el anticuerpo anti-C5a terapéutico aquí descrito pueden no requerir una vacunación protectora, por ejemplo, vacunación contra Neisseria meningitides y Neisseria gonorrhoeae. La inhibición parcial del TCC, aunque sin eliminar completamente la respuesta anti-microbiana del complemento terminal, puede de hecho reducir la inflamación inducida por TCC como lesión de tejido. La inhibición de TCC parcial, en combinación con la inhibición de C5a, se considera que hace al anticuerpo anti-C5a un compuesto anti-inflamatorio incluso más potente.
Por consiguiente, en otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza a C5a libre, en donde C5a libre es C5a humana que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 1, en donde el anticuerpo inhibe el enlace de C5a al receptor C5a, y en donde el anticuerpo inhibe parcialmente la formación del complejo de complemento terminal (TCC). La inhibición parcial a través de un anticuerpo anti-C5a o un fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito, puede ser, por ejemplo, una actividad de complemento que es, en la presencia del anticuerpo, hasta, o no mayor al 80 (por ejemplo, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, ó 25) % de la actividad de complemento en la ausencia del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a C5a libre (por ejemplo, hC5a libre) con una afinidad subnanomolar. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tiene una afinidad para C5a libre que es menor a 100 veces más que la afinidad correspondiente del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno para C5 no disociada. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo inhibe en al menos el 50% la formación de TCC en concentraciones que exceden 200 (por ejemplo, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, ó 400 o más) Mg/mL, tal como se mide utilizando un ensayo CH50eq. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo inhibe en al menos el 50% la activación de la trayectoria de complemento clásica en concentraciones que exceden 200 (por ejemplo, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, ó 400 o más) pg/mL tal como se mide utilizando el Equipo de Complemento de Trayectoria Clásica Wieslab® tal como se describe en los ejemplos de operación .
En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar a un humano que padece de un trastorno asociado con complemento (por ejemplo, un trastorno de complemento asociado con C5a o un trastorno inflamatorio asociado con complemento). El método incluye administrar al humano una cantidad efectiva de un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que inhibe el enlace de C5a al receptor C5a, y en donde el anticuerpo inhibe parcialmente la formación del complejo de complemento terminal (TCC). Ver anteriormente. El trastorno puede ser cualesquiera de los conocidos en la técnica, o los aquí descritos.
En otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza a un polipéptido C5a humano que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 1, pero que no enlaza a la cadena alfa de C5 nativa, no disociada, en donde el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza al polipéptido C5a humano con una KD que es menor a 1.25 x 1CT9 M.
En otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza a un polipéptido C5a humano que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 1, pero que no enlaza a la cadena alfa de C5 nativa, no disociada, en donde el anticuerpo inhibe en al menos el 50% la activación de neutrófilo humano dependiente de C5a humana en una proporción molar de 1:1 (sitio de enlace de antígeno:C5a). En algunas modalidades, el anticuerpo inhibe en al menos el 50% la migración de neutrófilo humano dependiente de C5a humana en un ensayo en el cual el 0.4 nM del anticuerpo se utiljiza para inhibir la actividad de la activación de neutrófilo de 2 nM de C5a humana tal como se describe en el Ejemplo 5. En algunas modalidades, el anticuerpo no comprende el emparejamiento 3 de CDR de ejemplo, ilustrado en la Tabla 1. En algunas modalidades, el anticuerpo no es BNJ371.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito, enlaza a un polipéptido C5a humano que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 2.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito, comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende: una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 20; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 21; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 22.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende: una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 20; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 38; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 22.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende: una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 28; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 29; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 30.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende: una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 28; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 67; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 30.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende: una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 28; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 46; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 47.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 37 o SEQ ID No: 36.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 27 o SEQ ID No: 33.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 37 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 27.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 36 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 33.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 19 o SEQ ID No: 17.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 27 o SEQ ID No: 25.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 19 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 27.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 17 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 25.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 42 o SEQ ID No: 40.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 27 o SEQ ID No: 33.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 42 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 27.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 40 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 33.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 17 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 33.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en cualesquiera de las SEQ ID No: 45, SEQ ID No: 44, o SEQ ID No: 49.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 19 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 45.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 17 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 44.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 17 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 49.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 37 o SEQ ID No: 36.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 45 o SEQ ID No: 49.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 37 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 45.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 36 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 49.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 42 o SEQ ID No: 40.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 45 o SEQ ID No: 49.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 42 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 45.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 40 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 49.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito enlaza a hC5a con una KD que es menor a 7 x 10"10 M.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito enlaza a hC5a con una KD que es menor a 5 x 10"10 M.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito enlaza a hC5a con una KD que es menor a 3 x 10"10 M.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito enlaza a hC5a con una KD que es menor a 2.5 x 10"10 M .
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito enlaza a hC5a con una KD que es menor a 1.5 x 10"10 M.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito enlaza a hC5a con una KD que es menor a 1.0 x 10"10 M.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito enlaza a hC5a con una KD que es menor a 8.0 x 10"11 M.
En algunas modalidades, un anticuerpo inhibe en al menos el 70 (por ejemplo, al menos 75, 80, 85, 90, ó 95 o más) % la activación de neutrófilo humano dependiente de C5a humana en una proporción molar de 1:1 (sitio de enlace de antígeno:C5a). En algunas modalidades, el anticuerpo no comprende un emparejamiento 3 de CDR de ejemplo ilustrado en la Tabla 1. En algunas modalidades, el anticuerpo no es BNJ371.
Aún en otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo que comprende un conjunto CDR de cadena ligera establecida en la Tabla 3 o Tabla 7. Por ejemplo, el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo puede comprender un polipéptido de cadena ligera que comprende: (i) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 140; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 96; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 142; (ii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 156; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 157; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 158; (iii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 164; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 165; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 166; (iv) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 172; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 173; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 174; (v) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 84; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 85; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 86; (vi) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 92; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 89; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 93; (vii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 88; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 89; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 90; (viii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 95; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 96; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 97; (ix) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 99; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 100; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 101; (x) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 84; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 85; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 103; (xi) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 105; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 106; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 107; (xii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 92; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 89; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 108; (xiii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 20; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 110; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 111; o (xiv) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 20; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 21; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 113. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que comprende el conjunto CDR de cadena ligera, también comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende cualesquiera de los conjuntos CDR de cadena pesada tal como se establece en la Tabla 8.
En otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo que comprende un conjunto CDR de cadena pesada tal como se establece en la Tabla 3 o Tabla 8. Por ejemplo, en algunas modalidades un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende: (i) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 144; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (ii) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 28; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 67; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 30; (iii) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 160; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 161; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 162; (iv) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 168; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 169; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 170; (v) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 176; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 177; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 178; (vi) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 116; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (vii) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 119; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 120; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 121; (viii) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 123; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (ix) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 124; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (x) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 119; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 126; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 127; (xi) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 129; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (xii) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 131; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 132; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 133; (xiii) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 28; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 46; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 47; o (xiv) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 136; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 137; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 138. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que comprende el conjunto CDR de cadena pesada, también comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende cualesquiera de los conjuntos CDR de cadena ligera tal como se establecen en la Tabla 7.
En otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo que comprende un conjunto CDR de cadena ligera de la Tabla 7, y su conjunto CDR de cadena pesada cognato, tal como se establece en la Tabla 8. En otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo que comprende un conjunto CDR de cadena pesada y cadena ligera en par, tal como se establece en la Tabla 3 o Tabla 9. Por ejemplo, en algunas modalidades un anticuerpo aislado, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, aquí descrito comprende: (i) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 140; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 96; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 142; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 144; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 117; (ii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 20; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 21; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 22; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 28; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 67; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 30; (iii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 156; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 157; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 158; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 160; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 161; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 162; (iv) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 164; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 165; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 166; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 168; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de amünoácido ilustrada en la SEQ ID No: 169; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 170; (v) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 172; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 173; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de amünoácido ilustrada en la SEQ ID No: 174; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 176; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 177; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 178; (vi) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 88; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 89; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 90; una GDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 119; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 120; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 121; (vii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 105; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 106; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 107; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 124; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (viii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 84; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 85; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 86; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 116; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (ix) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 20; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 110; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 111; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 136; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 137; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 138; (x) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 20; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 21; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 113; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 28; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 46; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 47; (xi) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 99; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 100; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 101; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 119; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 126; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 127; (xii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 95; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 96; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 97; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 144; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (xiii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 140; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 96; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 142; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 123; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (xiv) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 105; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 106; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 107; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 123; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (xv) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 92; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 89; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 108; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 144; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (xvi) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 92; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 89; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 93; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 123; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (xvii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 92; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 89; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 93; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 144; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (xviii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 84; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 85; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 103; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 129; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (xix) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 95; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 96; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 97; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 123; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (xx) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 84; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 85; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 103; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 144; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de amünoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; o (xxi) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 20; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 21; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secueincia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 113; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 131; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 132; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 133.
En algunas modalidades, un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un conjunto CDR de cadena ligera y un conjunto CDR de cadena pesada emparejados tal como se establece en la Tabla 3. En algunas modalidades, un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un conjunto CDR de cadena ligera y un conjunto CDR de cadena pesada emparejados tal como se establece en la Tabla 2. Por ejemplo, la descripción presenta un anticuerpo que comprende: (i) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 20; (ii) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 21; y (iü) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 22; (iv) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 28; (v) una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 46; y (vi) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 47.
En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende una región variable de cadena ligera establecida en la Tabla 2, en donde la cadena ligera se empareja con cualesquiera regiones variables de cadena pesada establecidas en la Tabla 2. Por ejemplo, la descripción presenta un anticuerpo (o un fragmento de enlace de antígeno del mismo) que comprende: (a) una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácido que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 42 y (b) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácido que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 45.
En algunas modalidades, un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende: (i) una región de estructura 1 de la región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 68 o SEQ ID No: 69; (ii) una región de estructura 2 de la región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 70 o SEQ ID No: 71; y una región de estructura 3 de la región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en cualesquiera de las SEQ ID Nos: de la 72 a la 74. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende una región de estructura 4 de la región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 75. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende una reglón variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en cualesquiera de las SEQ ID Nos: de la 76 a la 80. La cadena pesada de anticuerpo puede comprender cualesquiera de los conjuntos CDR de cadena pesada aquí descritos. La región variable de cadena pesada puede ser, en algunas modalidades, emparejada con el polipéptido de región variable que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 16.
En algunas modalidades, un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a una proteína C5a no humana. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo puede enlazar a C5a de ratón y/o una proteína C5a de ratón desarginada. En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo puede enlazar a C5a de ratón (y/o C5a de ratón desarginada) y comprende: (i) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 54; (ii) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 55; (iii) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 56; (iv) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 62; (v) una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 63; y (vi) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 64. En algunas modalidades, el anticuerpo C5a anti-ratón puede comprender un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 59; y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 66.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito inhibe la interacción entre C5a y un receptor C5a. El receptor C5a puede ser, por ejemplo, C5aR1 o C5L2.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito no inhibe substancialmente la hemolisis transmitida por complemento de células de glóbulos rojos in vitro y/o in vivo.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado (y por consiguiente, cualquier fragmento de enlace de antígeno del mismo) es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo completamente humano.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo recombinante, un anticuerpo de cadena simple, un diacuerpo, un intracuerpo, un anticuerpo quimerizado o quimérico, un anticuerpo humano desinmunizado, un fragmento Fv, un fragmento Fd, un fragmento Fab, un fragmento Fab', y un fragmento F(ab')2.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito es multiespecífico (por ejemplo, biespecífico) ya que el anticuerpo o fragmento enlaza al menos a dos epítopes diferentes. Los dos epítopes diferentes pueden ser, por ejemplo, dos epítopes diferentes de la misma proteína (por ejemplo, C5a) o el anticuerpo puede enlazar a un primer epítope de una primera proteína (por ejemplo, C5a) y un segundo epítope de una segunda proteína.
En algunas modalidades, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito comprende una porción heteróloga. La porción heteróloga puede ser, por ejemplo, un azúcar. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo puede ser glucosilado. La porción heteróloga puede ser, por ejemplo, una etiqueta detectable tal como, pero sin limitarse a, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, una etiqueta de metal pesado, una etiqueta radioactiva, o una etiqueta enzimática.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito es modificado con una porción que mejora la estabilización y/o retención del anticuerpo en la circulación. Por ejemplo, la modificación puede ser PEGilación o hesilación. Én otra modalidad, el anticuerpo anti-C5a puede contener una región constante alterada que tiene función efectora reducida (o no tiene), en comparación con la función efectora de su región constante no alterada correspondiente. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5a contiene una región constante alterada que tiene entre aproximadamente 0 hasta aproximadamente 20% de la función efectora de la región constante no alterada. Las modalidades de ejemplo dé dichos anticuerpos de función efectora disminuida, se describen en la presente invención.
En otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo que bloquea en forma cruzada el enlace de cualesquiera de los anticuerpos anteriores.
Aún en otro aspecto, la descripción presenta una composición farmacéutica que comprende uno o más de cualesquiera de los anticuerpos aislados o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos aquí descritos y un transportador, diluyente, y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la descripción presenta: (i) un ácido nucleico que codifica uno o más de cualesquiera de los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos aquí descritos; (¡i) un vector que comprende un ácido nucleico; (iii) un vector de expresión que comprende el ácido nucleico; y/o (¡v) una célula que comprende el vector o el vector de expresión. En otro aspecto, la descripción presenta un método para producir un polipéptido (tal como cualesquiera de los anticuerpos o fragmentos de enlace de antigeno de los mismos aquí descritos). El método comprende cultivar la célula antes mencionada (que comprende el vector de expresión) bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la expresión por parte de la célula del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno codificado por el ácido nucleico en el vector. El método también puede incluir aislar el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno de la célula, o del medio en el cual se cultiva la célula.
En otro aspecto, la descripción presenta un ácido nucleico aislado que codifica cualesquiera de las secuencias de aminoácido aquí descritas, o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que comprende, o consiste en, cualesquiera de las secuencias de aminoácido aquí establecidas. El ácido nucleico puede estar incluido en un vector, por ejemplo, un vector de expresión, y/o puede estar presente en una célula.
Aún en otro aspecto, la descripción presenta un equipo terapéutico que comprende: (i) uno o más de los anticuerpos aislados o fragmentos de enlace de antígeno aquí descritos (por ejemplo, uno o más de cualesquiera de los anticuerpos humanizados o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos aquí descritos); y (¡i) medios para el suministro del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno a un sujeto. Los medios pueden ser adecuados, por ejemplo, para suministro subcutáneo, suministro infraocular, o suministro intra-articular del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo al sujeto. El medio puede ser, por ejemplo, una jeringa, una jeringa de barril doble, o dos jeringas separadas incorporadas para utilizarse en la administración de un anticuerpo terapéutico o fragmento de enlace de antígeno del mismo, mientras se extrae fluido de la rodilla (por ejemplo, para análisis) en una modalidad de empujar-jalar. En algunas modalidades, el medio es para suministro ocular y comprende un parche trans-escleral o un lente de contacto, cada uno de los cuales comprende el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo. En algunas modalidades, el medio es adecuado para suministro intrapulmonar. Por ejemplo, el medio puede ser un inhalador o un nebulizador. En algunas modalidades, el medio es una jeringa llena previamente tal como un dispositivo de pluma. La jeringa llena previamente puede contener, por ejemplo, al menos una forma de dosificación unitaria farmacéutica de uno o más de los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos aquí proporcionados.
En algunas modalidades, los equipos terapéuticos aquí descritos pueden contener al menos un agente activo adicional para utilizarse en el tratamiento de un trastorno asociado con complemento en un sujeto. El agente activo adicional puede ser, por ejemplo, cualesquiera de los agentes adicionales aquí descritos.
Aún en otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar o prevenir un trastorno asociado con complemento. El método incluye administrar al humano que necesita del mismo un anticuerpo terapéutico o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito en una cantidad suficiente para tratar un trastorno asociado con complemento que afecta al humano. El método también puede incluir identificar al sujeto como teniendo un trastorno asociado con complemento. El trastorno asociado con complemento puede ser, por ejemplo, un trastorno inflamatorio asociado con complemento, síndrome urémico hemolítico atípico, degeneración macular relacionada con la edad, artritis reumatoide, sepsis, o síndrome antifosfolípido. En algunas modalidades, el trastorno asociado con complemento es un trastorno pulmonar asociado con complemento. Por ejemplo, el trastorno pulmonar asociado con complemento puede ser, por ejemplo, asma o enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Otros trastornos asociados con complemento adecuados para tratamiento o prevención, tal como se establece en el método, se describen en la presente invención. El modo de administración, el cual puede variar dependiendo del tipo de trastorno asociado con complemento que será tratado, puede ser, por ejemplo, administración intravenosa, administración intrapulmonar, administración intraocular, administración subcutánea, o administración intra-articular.
En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo se administra al humano en una cantidad y con una frecuencia suficiente para mantener un nivel reducido de actividad C5a sistémica durante la duración del tratamiento. En algunas modalidades, los métodos pueden incluir después de la administración, monitorear al humano con respecto a una mejoría en uno o más síntomas del trastorno asociado con complemento.
En algunas modalidades, los métodos pueden incluir administrar al humano uno o más agentes terapéuticos adicionales.
Aún en otro aspecto, la descripción presenta un artículo de fabricación, que comprende: (i) un contenedor con una etiqueta y (ii) una composición que comprende un anticuerpo o fragjTiento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito. La etiqueta puede indicar que la composición será administrada a un humano que tiene, se sospecha que tiene, o está en riesgo de desarrollar, un trastorno asociado con complemento. El artículo de fabricación también puede incluir uno o más agentes activos adicionales.
Tal como se utiliza a lo largo de la presente descripción, el término "anticuerpo" se refiere a una molécula de anticuerpo completo o intacto (por ejemplo, IgM, IgG, IgA, IgD, o I g E ) que se genera a través de cualquiera de una variedad de métodos que son conocidos en la técnica y se describen en la presente invención. El término "anticuerpo" incluye un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimerizado o quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano desinmunizado, y un anticuerpo completamente humano. El anticuerpo puede ser elaborado en, o derivado de cualquiera de una variedad de especies, por ejemplo, mamíferos tales como humanos, primates no humanos (por ejemplo, monos, baboons, o chimpancés), caballos, ganado, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos, conejos, cerdos de guinea, jerbos, hámsters, ratas y ratones. El anticuerpo puede ser un anticuerpo purificado o recombinante.
Tal como se utiliza en la presente invención, el término "fragmento de anticuerpo", "fragmento de enlace de antígeno", o términos similares se refieren a un fragmento de un anticuerpo que retiene la capacidad de enlazar a un antígeno (por ejemplo, un epítope presente en C5a, pero no en la cadena alfa de la proteína C5 nativa, no disociada), por ejemplo, un anticuerpo de cadena simple (scFv), un fragmento Fd, un fragmento Fab, un fragmento Fab', o un fragmento F(ab')2- Un scFv es una cadena de polipéptido simple que incluye regiones variables tanto de cadena pesada como ligera del anticuerpo de las cuales se deriva scFv. Además, los diacuerpos (Poljak (1994) Structure 2Í12): 1121-1123; Hudson y asociados (1999) J Immunol Methods 23(1 -2): 177-189, cuyas descripciones de ambas están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia), minicuerpos, triacuerpos (Schoonooghe y asociados (2009) BMC Biotechnol 9: 70), anticuerpos de dominio (también conocidos como "inmunoglobulinas de cadena pesada" o camélidos; Holt y asociados. (2003) Trends Biotechnol 21(11): 484-490): e intracuerpos (Huston y asociados. (2001) Hum Antibodies 10(3-4J.: 127-142; Wheeler y asociados. (2003) Mol Ther 8(3): 355-366; Stocks (2004) Drug Discov Today 9(22): 960-966, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia) están incluidas en la definición de fragmentos de anticuerpo y se pueden incorporar en las composiciones, y utilizarse en los métodos, aquí descritos.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos aquí utilizados tienen el mismo significado al comúnmente comprendido por un experto en la técnica a la cual pertenece la presente invención. En caso de conflicto, el presente documento, incluyendo las definiciones, tomarán el control. Los métodos y materiales preferidos se describen más adelante, aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos también se pueden utilizar en la práctica o pruebas de los métodos y composiciones aquí descritos. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias aquí mencionadas están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.
Otras características y ventajas de la presente descripción, por ejemplo, métodos para tratar trastornos asociados con complemento en un sujeto, serán apreciadas a partir de la siguiente descripción, los ejemplos, y de las reivindicaciones adjuntas.
Breve Descripción de las Figuras La figura 1, es un diagrama Venn que ilustra el grado de traslape de los epítopes en la C5a humana enlazada por un conjunto selecto de anticuerpos C5a anti-humano de múrido: 5an101ME, 5an180ME, 5an048ME, 5an179ME, y 5an178ME.
La figura 2, es una gráfica de líneas que ilustra el antagonismo de la señalización transmitida por C5a in vitro utilizando un ensayo de activación de neutrófilo. El eje-Y representa la medida de densidad óptica (OD) del substrato cromogénico como una función de la liberación de mieloperoxidasa mediante neutrófilos humanos aislados recientemente. El eje-X representa la concentración del anticuerpo incubado con las células. Los anticuerpos humanizados probados - BNJ367, BNJ369, BNJ371, BNJ378, BNJ381, BNJ383, y un anticuerpo anti-C5 humanizado - se identifican en la leyenda insertada.
La figura 3, es una gráfica de líneas que ilustra el efecto de diversos anticuerpos terapéuticos en la inflamación de articulaciones en un modelo de ratón de artritis reumatoide. El eje-Y representa el grosor de la articulación de la rodilla inflamada inicialmente en milímetros. El eje-X representa los días después de la generación de la enfermedad. Los anticuerpos terapéuticos probados - 5an195ME (un anticuerpo C5a anti-ratón de ratón) y un anticuerpo de control con la misma región Fe que el anticuerpo anti-C5a - se identifican en la leyenda insertada.
La figura 4, es una gráfica de líneas que ilustra el efecto de diversos anticuerpos terapéuticos en la severidad general de la enfermedad en un modelo de ratón de artritis reumatoide. El eje-Y representa el índice de artritis. El eje-X representa los días después de la generación de la enfermedad. Los anticuerpos terapéuticos probados - 5an195ME (un anticuerpo C5a anti-ratón de ratón) y un anticuerpo de control con la misma región Fe que el anticuerpo anti-C5a - se identifican en la leyenda insertada.
La figura 5, establece una serie de secuencias de región variable de cadena pesada humanizadas. En orden del superior al inferior: la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-C5a humanizado BNJ345 (SEQ ID No: 76); la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-C5a humanizado BNJ346 (SEQ ID No: 77); la región variable de cadena pesada del anticuerpo ant¡-C5a humanizado BNJ347 (SEQ ID No: 78); la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-C5a humanizado BNJ354 (SEQ ID No: 79); y la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-C5a humanizado BNJ350 (SEQ ID No: 80). Los expertos en la técnica apreciarán que el delineado entre las regiones de estructura de cadena pesada 1, 2, 3, y 4 y las CDRs 1, 2, y 3 de cadena pesada. Dichos delineados, tal como lo define Kabat y asociados (infra), se muestran en la figura. "HC FR1" se refiere a la región de estructura 1 de la región variable de cadena pesada, "HC FR2" se refiere a la región de estructura 2 de la región variable de cadena pesada, "HC FR3" se refiere a la región de estructura 3 de la región variable de cadena pesada, y "HC FR4" se refiere a la región de estructura 4 de la región variable de cadena pesada. "HC CDR1" se refiere a la región de determinación de complementariedad (CDR) 1 de la región variable de cadena pesada, "HC CDR2" se refiere a la CDR2 de región variable de cadena pesada, y "HC CDR3" se refiere a la CDR3 de la región variable de cadena pesada.
La figura 6, es una gráfica de líneas que ilustra el porcentaje de neutrófilos en la circulación en la sangre de ratones después de la administración de hC5a a los ratones. En el eje-Y, los conteos de neutrófilos se expresan como un porcentaje de "línea de base", que es el conteo de neutrófilos en el tiempo 0 (o 100% de neutrófilos). El eje-X representa el tiempo en minutos. A los cohortes de ratón se les administró en forma intravenosa un anticuerpo de control [antígeno 63 protector anti-ántrax, isotipo lgG2/G4] ("control"; cinco ratones) o el anticuerpo C5a anti-humano BNJ383 en una de las siguientes dosis: 24 mg/kg (cinco ratones); 12 mg/kg (cinco ratones); 6 mg/kg (cinco ratones); y 3 mg/kg (cinco ratones) y posteriormente se administró hC5a. Ver el Ejemplo 13. A seis ratones, "simulados", no se les administró C5a humana.
La figura 7, es una gráfica de barras que ilustra el nivel de mieloperoxidasa (MPO) en el plasma de ratones antes y después de la administración de C5a humana a los ratones. El eje-Y representa la concentración (ng/mL) de MPO en plasma de ratón. El eje-X representa el tiempo en minutos. A los cohortes de ratón se les administró en forma intravenosa un anticuerpo de control [antígeno 63 protector anti-ántrax, isotipo lgG2/G4] ("control"; ocho ratones) o el anticuerpo C5a antihumano BNJ383 en una de las siguientes dosis: 24 mg/kg (cinco ratones); 12 mg/kg (cinco ratones); 6 mg/kg (cinco ratones); y 3 mg/kg (cinco ratones) y posteriormente se administró hC5a. A cuatro ratones, "simulados", no se les administró C5a humana.
La figura 8, es una gráfica de líneas que ilustra el cambio en el nivel C5a humano en plasma de ratones (C5a humana administrada) en la presencia o ausencia de diferentes concentraciones de un anticuerpo anti-hC5a (BNJ383). El eje-Y representa la concentración (ng/mL) de hC5a en plasma de ratón. El eje-X representa el tiempo en minutos. A los cohortes de ratón se les administró en forma intravenosa un anticuerpo de control [antígeno 63 protector anti-ántrax, isotipo lgG2/G4] ("control"; seis ratones) o el anticuerpo C5a anti-humano BNJ383 en una de las siguientes dosis: 24 mg/kg (tres ratones); 12 mg/kg (tres ratones); 6 mg/kg (tres ratones); y 3 mg/kg (tres ratones) y posteriormente se administró hC5a. A cuatro ratones, "simulados", no se les administró C5a humana.
La figura 9, es una gráfica de líneas que ilustra la competición para enlazar a C5a humana in vitro. Se incubaron 250 pM de anticuerpo anti-C5a (BNJ383) etiquetado con rutenio con hC5a biotinilado 1 nM, junto con diversas concentraciones (por ejemplo, 400, 133, 44.4, 14.8, 4.9, 1.6, y 0.5 nM) de uno de los siguientes: (a) proteína desarginada C5a humana en solución salina amortiguada por fosfato, (b) plasma humano, (c) plasma de macaco cinomolgo, (d) plasma de Balb/C (ratón), o (e) plasma de DBA/2J (ratón). Con respecto a los componentes de plasma (b), (c), (d), y (e), la concentración se refiere a la concentración final aproximada del antígeno C5 en la mezcla de incubación. El eje-Y representa las unidades de fluorescencia arbitrarias como una función de la cantidad de anticuerpo anti-C5a etiquetado con rutenio detectado. El eje-X representa la concentración (nM) del competidor de antígeno.
La figura 10, es una gráfica de líneas que ¡lustra el efecto de diversas proteínas inhibidoras de complemento de la trayectoria alternativa (AP) del complemento. El eje-Y representa el porcentaje de la actividad de complemento AP en comparación con la línea de base (BL; el nivel de actividad en la ausencia del inhibidor de complemento). El eje-X representa la concentración de un inhibidor de complemento determinado (µ?). Los efectos del anticuerpo anti-hC5a, BNJ383, junto con un anticuerpo anti-C5 en la actividad AP fueron evaluados cada uno.
La figura 11, es una gráfica de líneas que ilustra el efecto de diversas proteínas inhibidoras de complemento en la trayectoria clásica (CP) del complemento. El eje-Y representa el porcentaje de la actividad de complemento CP en comparación con la línea de base (BL; el nivel de actividad en la ausencia de un inhibidor de complemento). El eje-X representa la concentración de un inhibidor de complemento determinado (µ?). Los efectos del anticuerpo anti-hC5a, BNJ383, junto con un anticuerpo anti-C5 en la actividad CP, fueron evaluados cada uno.
Las figuras 12A, 12B, 12C, y 12D, son una serie de cromatografías que ilustran los tiempos de retención del anticuerpo anti-C5a (BNJ383) y un anticuerpo anti-hC5 en la presencia o ausencia de proteína hC5. Para todos los paneles, el eje-X representa el tiempo de retención en minutos, y el eje-Y representa las unidades de absorbancia en 214 nm de longitud de onda. En cada panel, el subpanel incrustado ilustra una vista mejorada de los picos presentados.
La figura 12A, ilustra el tiempo de retención para BNJ383 en la ausencia de proteína hC5.
La figura 12B, ilustra el tiempo de retención para el anticuerpo anti-C5 en la ausencia de proteína hC5.
La figura 12C, ilustra el tiempo de retención para BNJ383 en la presencia de hC5 (2.1 veces de exceso molar de hC5 con respecto a BNJ383). De derecha a izquierda, los picos enumerados representan: (a) BNJ383 o hC5 no en complejo; (b) BNJ383 con un sitio de enlace de antígeno enlazado a hC5 no disociada; y (c) una fracción menor consistente con la ocupación doble de BNJ383 con hC5 no disociada.
La figura 12D, ilustra el tiempo de retención para el anticuerpo anti-C5 en la presencia de una cantidad equimolar de hC5. De derecha a izquierda, los picos enumerados representan: (a) el anticuerpo anti-C5 no en complejo o hC5; (b) el anticuerpo anti-C5 con un sitio de enlace de antígeno enlazado a hC5 disociado; y (c) el anticuerpo anti-C5 enlazado a dos moléculas C5 no disociadas.
La figura 13, es una gráfica de líneas que ilustra el enlace del anticuerpo anti-C5a BNJ383 a hC5a desarginada en la presencia de hC5 utilizando un ELISA. El eje-X representa la concentración (ng/mL) del anticuerpo. El eje-Y representa la densidad óptica en 450 nm de longitud de onda.
La figura 14, es un trazo de dispersión que ilustra la concentración de C5a/C5a desarginada libre presente en el plasma de macacos cinomolgos como una función de la concentración de plasma del anticuerpo anti-C5a (BNJ383). El eje-Y ilustra la concentración (pg/mL) de C5a/C5a desarginada detectada en muestras de plasma de macacos cinomolgos en puntos de tiempo que fluctúan de 1 día a 30 días después de una administración intravenosa de dosis simple de BNJ383 en 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, 250 mg/kg, o 400 mg/kg de peso corporal de los animales. El eje-X representa la concentración del BNJ383 (pg/mL) en cada una de las muestras.
La figura 15A, es un trazo de dispersión que ilustra el porcentaje de la actividad hemolítica en muestras de suero relativas a los valores de línea de base (eje-Y) iniciada a través de la trayectoria clásica como una función de la concentración del anticuerpo anti-C5a (BNJ383) en la circulación (eje-X).
La figura 15B, es un trazo de dispersión que ilustra el porcentaje de la formación del complejo de complemento terminal iniciado a través de la trayectoria clásica en muestras de suero medidas a través de un ensayo CH50eq relativo a los valores de línea de base (eje-Y) como una función de la concentración del anticuerpo anti-C5a (BNJ383) en la circulación (eje-X).
La figura 15C, es un trazo de dispersión que ilustra el porcentaje de la formación del complejo de complemento terminal iniciado a través de la trayectoria clásica en muestras de suero medidas a través de un ensayo CCP relativo a los valores de línea de base (eje-Y) como una función de la concentración del anticuerpo anti-C5a (BNJ383) en la circulación (eje-X).
Descripción Detallada de la Invención La presente descripción proporciona anticuerpos y fragmentos de enlace de antígeno de los mismos que enlazan a C5a libre (por ejemplo, C5a humana libre), composiciones que contienen los anticuerpos y sus fragmentos, y métodos para utilizar cualesquiera de los anteriores para tratar o prevenir los trastornos asociados con complemento tales como, pero sin limitarse a, aHUS, degeneración macular (por ejemplo, AMD), RA, sepsis, síndrome antifosfolípido, quemadura (por ejemplo, quemadura severa), síndrome de Goodpasture, nefritis por lupus, o un trastorno pulmonar asociado con complemento tal como asma o enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD). La descripción también proporciona anticuerpos anti-C5a (y fragmentos de los mismos) que reaccionan en forma cruzada entre C5a libre de C5a humana y libre de una especie de mamífero no humano, tal como un primate no humano (por ejemplo, macaco cinomolgo o macaco resus). Aunque no se pretende limitarse en forma alguna, los anticuerpos de ejemplo (y los fragmentos de enlace de antígeno), las composiciones (por ejemplo, composiciones y formulaciones farmacéuticas), y los métodos para utilizar las composiciones se elaboran más adelante y se ejemplifican en los Ejemplos de operación.
Anticuerpos Anti-C5a v Fragmentos de Enlace de Antíqeno de los Mismos La descripción proporciona anticuerpos que enlazan a C5a componente cde complemento. Tal como se describió anteriormente, la proforma de C5, una proteína precursora de 1676 residuos de aminoácido, se procesa a través de una serie de eventos de disociación proteol ítica . Los primeros 18 péptidos (numerados de -18 a -1) constituyen un péptido de señal que está disociado de la proteína precursora. La proteína de los 1658 aminoácidos restantes se disocia en dos lugares para formar las cadenas alfa y beta. El primer evento de disociación ocurre entre los residuos de aminoácido 655 y 656. La segunda disociación ocurre entre los residuos de aminoácido 659 y 660. Los dos eventos de disociación dan como resultado la formación de tres distintos fragmentos de polipéptido: (i) un fragmento que comprende los aminoácidos 1 a 655, lo cual es referido como la cadena beta; (¡i) un fragmento que comprende los aminoácidos 660 a 1658, lo cual es referido como la cadena alfa; y (iíi) un fragmento de tetrapéptido que consiste en los aminoácidos 656 a 659. Los fragmentos de polipéptido de cadena beta y cadena alfa están conectados entre si mediante un enlace de disulfuro y constituyen la proteína C5 madura. La convertasa C5 CP o AP activa, madura C5 disociando la cadena alfa entre los residuos 733 y 734, lo cual da como resultado la liberación del fragmento C5a (aminoácidos 660 a 733). La porción restante de C5 madura es el fragmento C5b, que contienen los residuos 734 a 1658 del disulfuro de cadena alfa enlazado a la cadena beta.
In vivo, C5a es metabolizado rápidamente a través de una enzima de suero, carboxipeptidasa B, a una forma de 73 aminoácidos denominada "C5a desarginada", que ha perdido el residuo de arginina carboxiterminal. Por consiguiente, en algunas modalidades, un anticuerpo que enlaza a C5a libre también enlaza a C5a desarginada. En algunas modalidades, un anticuerpo que enlaza a C5a no enlaza a C5a desarginada.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5a enlaza a un neoepítope presente en C5a, es decir, un epítope que queda expuesto al momento de la liberación de C5a del fragmento de cadena alfa de C5 madura. Esto es, en algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito enlaza a C5a y/o C5a desarginada, pero no a C5 nativa, no disociada (completamente doblada).
Tal como se describió anteriormente, en algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo puede enlazar a una subpoblación de C5 procesada, no disociada (por ejemplo, C5 en plasma) que constituye menos de 10 (por ejemplo, menos de 9.5, 9, 8.5, 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, o menos de 0.1) % de la población total de C5 de longitud total en una muestra (por ejemplo, una muestra de sangre o plasma o una muestra que comprende C5 de longitud total recombinante), en donde la subpoblación está desnaturalizada en su totalidad, o en parte, de modo que se exponga de otra manera al neoepítope C5a ocluido. Por lo tanto, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito puede, en algunas modalidades, enlazar a C5a libre, pero no a C5 del 90% o más de la población C5 nativa, no disociada. En algunas modalidades, la subpoblación completa o parcialmente desnaturalizada está inactiva o tiene actividad reducida (por ejemplo, menos de 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5% de la actividad de la proteína C5 de longitud completa, completamente funcional) en cualquier número de ensayos adecuados útiles para probar la actividad de C5, por ejemplo, un ensayo hemolítico o un ensayo CH50eq. Los métodos adecuados para probar la actividad de la subpoblación menor a la cual el anticuerpo anti-C5a aquí descrito, en algunas modalidades, puede enlazar, son conocidos en la técnica y se describen en la presente invención.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5a enlaza a una proteína C5a de mamífero (por ejemplo, humana). Por ejemplo, el anticuerpo anti-C5a puede enlazar a una proteína C5a humana que tiene la siguiente secuencia de aminoácido: TLQKKI EEI AAKYKHS VVKKCCYDGACVN NDETCEQRAARISLGPR CIKAFTECCVVASQLRAN ISHKDMQLGR (SEQ ID No: 1). En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a puede enlazar a una proteína C5a humana desarginada que tiene la siguiente secuencia de aminoácido: TLQKKI EEIAAKYKHS VVKKCCYDGACVNN DETCEQRAARISLGPR Cl KAFTECC VVASQLRAN ISHKDMQLG (SEQ ID No: 2). Un anticuerpo anti-C5a aquí descrito puede enlazar tanto a C5a humana de longitud total como a C5a humana desarginada.
En algunas modalidades, el anticuerpo puede enlazar a C5a humana en un epítope dentro o que traslapa con un fragmento estructural de la proteína que tiene la secuencia de aminoácido: TLQKKI EEIAAKYK (SEQ ID No: 3); HSVVKKCCYDGAC (SEQ ID No: 4); VNNDE (SEQ ID No: 5); TCEQRAAR (SEQ ID No: 6); ISLG (SEQ ID No: 7); PRC I KAFTECC VVASQLRAN IS (SEQ ID No: 8); HKDMQLG (SEQ ID No: 9); o HKDMQLGR (SEQ ID No: 10). Ver, por ejemplo, la publicación de Cook y asociados (2010) Acta Cryst D66: 190-197. En algunas modalidades, el anticuerpo puede enlazar a C5a en un epítope dentro, o que traslapa con la secuencia de aminoácido de un fragmento de péptido de C5a que comprende al menos dos residuos de cisteína emparejados. Por ejemplo, un anticuerpo anti-C5a puede enlazar al fragmento que comprende, o consiste en, la secuencia de aminoácido: CCYDGACVNNDETC (SEQ ID No: 11); CYDGACVNNDETCEQRAARISLGPRCIKAFTEC (SEQ ID No: 12; y CEQRAARISLGPRCIKAFTECC (SEQ ID No: 13), en donde, en cada uno de los fragmentos de péptido, el primero de los residuos de cisteína y los finales son emparejados mediante enlaces de disulfuro. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito puede enlazar a una proteina C5a humana en un epítope dentro, o que traslapa con, la secuencia de aminoácido: YDGACVNNDETCEQRAAR (SEQ ID No: 14) o CYDGACVNNDETCEQRAA (SEQ ID No: 15). En algunas modalidades, un anticuerpo puede enlazar a una proteína C5a humana o un fragmento de la misma que contiene una secuencia de aminoácido que contiene, o consiste en, al menos cuatro (por ejemplo, al menos cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ó 17 o más) aminoácidos consecutivos ilustrados en cualesquiera de las SEQ ID Nos: de la 1 a la 15. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito enlaza a un epítope ternario que comprende dos o más (por ejemplo, al menos dos, tres, o cuatro) regiones de péptido discontinuas de la proteína C5a, por ejemplo, dos o más regiones de péptido C5a discontinuas unidas juntas por medio de una ligadura de disulfuro.
Los métodos para identificar el epítope al cual enlaza un anticuerpo particular (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5a) son conocidos en la técnica. Por ejemplo, el epítope de enlace dentro de C5a (o C5a desarginada) al cual enlaza un anticuerpo anti-C5a puede ser identificado midiendo el enlace del anticuerpo a diversos (por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 15, 20, ó 30 o más) fragmentos de péptido de traslape de una proteína C5a componente de complemento (por ejemplo, varios fragmentos de traslape de una proteína C5a humana que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 1 o SEQ ID No: 2). Cada uno de los diferentes péptidos de traslape es enlazado posteriormente a una dirección única en un soporte sólido, por ejemplo, depósitos separados de una placa de ensayo de depósitos múltiples. Posteriormente, el anticuerpo anti-C5a es interrogado contactándolo con cada uno de los péptidos en la placa de ensayo durante una cantidad de tiempo, y bajo condiciones que permiten que el anticuerpo enlace a su epítope. El anticuerpo anti-C5a no enlazado es eliminado lavando cada uno de los depósitos. Posteriormente, un anticuerpo secundario etiquetado en forma detectable que enlaza al anticuerpo anti-C5a, si está presente en un depósito de la placa, se contacta con cada uno de los depósitos, y el anticuerpo secundario no enlazado es eliminado mediante pasos de lavado. La presencia o cantidad de la señal detectable producida por el anticuerpo secundario etiquetado en forma detectable en un depósito, es una indicación de que el anticuerpo anti-C5a enlaza al fragmento de péptido particular asociado con el depósito. Ver, por ejemplo, la publicación de Harlow y Lañe (supra), Benny K. C. Lo {supra), y la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 20060153836, cuya descripción está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia. Un epítope particular al cual enlaza un anticuerpo, también puede ser identificado utilizando técnicas cromatografías BIAcore (ver, por ejemplo, la publicación de Pharmacia BIAtechnology Handbook, "Mapeo de Epítope", Sección 6.3.2 (Mayo 1994); y Johne y asociados. (1993) J Immunol Methods 160: 20191-8).
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito contiene un conjunto específico de regiones de determinación de complementariedad de cadena ligera (CDRs) y/o un conjunto específico de CDRs de cadena pesada. Por ejemplo, en algunas modalidades, un anticuerpo antí-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito, puede comprender un conjunto de CDR de cadena ligera obtenido de un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en cualesquiera de las SEQ ID Nos: 19, 37, ó 42. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito puede comprender un conjunto de CDR de cadena pesada obtenido de un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 27 ó 45. Los conjuntos CDR de cadena ligera y de cadena pesada de ejemplo obtenidos de las regiones variables de cadena ligera y regiones variables de cadena pesada antes mencionados, se describen con mayor detalle más adelante (ver Tabla 1).
Los límites exactos de las CDRs, y las regiones de estructura, han sido definidos de manera diferente de acuerdo con diferentes métodos. En algunas modalidades, las posiciones de las CDRs o regiones de estructura dentro de un dominio variable de cadena ligera o pesada puede ser tal como se define en la publicación de Kabat y asociados [(1991) "Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico" (Sequences of Proteins of Immunological Interest). Publicación NIH No. 91-3242, "Departamento de Servicios Humanos y de la Salud de los Estados Unidos" (U.S. Department of Health and Human Services), Bethesda, MD]. En dichos casos, las CDRs pueden ser referidas como "CDRs de Kabat" (por ejemplo, "LCDR2 de Kabat" o "HCDR1 de Kabat"). En algunas modalidades, las posiciones de las CDRs de una región variable de cadena pesada o ligera pueden ser tal como lo definen Chothia y asociados (1989) Nature 342: 877-883. Por consiguiente, estas regiones pueden ser referidas como "CDRs de Chothia" (por ejemplo, "LCDR2 de Chothia" o "HCDR3 de Chothia"). En algunas modalidades, las posiciones de las CDRs de las regiones variables de cadena ligera y pesada pueden ser tal como se define en la definición combinada de Kabat-Chothia. En dichas modalidades, estas regiones pueden ser referidas como "CDRs de Kabat-Chothia combinadas". En algunas modalidades, las posiciones de las CDRs y/o regiones de estructura dentro de un dominio variable de cadena ligera o pesada pueden ser tal como lo define Honnegger y Pluckthun (2001) J Mol Biol 309: 657-670. La identificación de las CDRs dentro de la región variable de la cadena ligera o cadena pesada utilizando las definiciones antes mencionadas, es conocida en la técnica de la construcción mediante ingeniería de anticuerpos. Por ejemplo, Thomas y asociados [(1996) Mol Immunol 33(17/18): 1389-1401] ejemplifica la identificación del límite CDR de cadena ligera y cadena pesada de acuerdo con las definiciones de Kabat y Chothia.
Por consiguiente, en algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito puede comprender un conjunto CDR de cadena ligera definido por Kabat, definido por Chothia, o definido por Kabat-Chothia combinado, obtenido de un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en cualesquiera de las SEQ ID Nos: 19, 37, ó 42. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito puede comprender un conjunto CDR de cadena pesada definido por Kabat, definido por Chothia, o definido por Kabat-Chothia combinado, obtenido de un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 27 ó 45.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito comprende una región variable de cadena ligera que contiene uno o más de: una CDR1 de cadena ligera que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: RASESVDSYGNSF H (SEQ ID No: 20); una CDR2 de cadena ligera que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: RASNLES (SEQ ID No: 21); y una CDR3 de cadena ligera que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: QQSNEDPYT (SEQ ID No: 22). En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito comprende una región variable de cadena ligera que contiene cada una de las CDR1 de cadena ligera que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID No: 20); una CDR2 de cadena ligera que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: RASNLES (SEQ ID No: 21); y una CDR3 de cadena ligera que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: QQSNEDPYT (SEQ ID No: 22). Los anticuerpos anti-C5a de ejemplo que comprenden dicho dominio variable de cadena ligera incluyen, por ejemplo, los anticuerpos anti-C5a BNJ364, BNJ367, BNJ378, BNJ366, BNJ369, y BNJ383 aquí descritos (vide infra; Tabla 2).
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito comprende una región variable de cadena ligera que contiene uno o más de: una CDR1 de cadena ligera que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID No: 20); una CDR2 de cadena ligera que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: WASTRES (SEQ ID No: 38); y una CDR3 de cadena ligera que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: QQSNEDPYT (SEQ ID No: 22). En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito comprende una región variable de cadena ligera que contiene cada una de las CDR1 de cadena ligera que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID No: 20); una CDR2 de cadena ligera que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: WASTRES (SEQ ID No: 38); y una CDR3 de cadena ligera que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: QQSNEDPYT (SEQ ID No: 22). Los anticuerpos anti-C5a de ejemplo que comprenden dicho dominio variable de cadena ligera incluyen, por ejemplo, los anticuerpos anti-C5a BNJ371 y BNJ381 aquí descritos (vi de infra; Tabla 2).
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito comprende una región variable de cadena pesada que contiene uno o más de: una CDR1 de cadena pesada que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: DYSMD (SEQ ID No: 28); una CDR2 de cadena pesada que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: AINPNSGGTNYNQKFKD (SEQ ID No: 29); y una CDR3 de cadena pesada que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: SGSYDGYYAM DY (SEQ ID No: 30).
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito comprende una región variable de cadena pesada que contiene cada una de las CDR1 de cadena pesada que comprende o consiste de la siguiente secuencia de aminoácido: DYSMD (SEQ ID No: 28); una CDR2 de cadena pesada que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: AINPNSGGTNYNQKFKD (SEQ ID No: 29); y una CDR3 de cadena pesada que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: SGSYDGYYAM D Y (SEQ ID No: 30). Los anticuerpos anti-C5a que comprenden dicho dominio variable de cadena pesada incluyen, por ejemplo, los anticuerpos anti-C5a BNJ364, BNJ367, BNJ371, y BNJ378 aquí descritos (vide infra; Tabla 2).
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito comprende una región variable de cadena pesada que contiene uno o más de: una CDR1 de cadena pesada que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: DYSMD (SEQ ID No: 28); una CDR2 de cadena pesada que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: AIHLNTGYTNYNQKFKG (SEQ ID No: 46); y una CDR3 de cadena pesada que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: GFYDGYSPMDY (SEQ ID No: 47). En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito comprende una región variable de cadena pesada que contiene cada una de las CDR1 de cadena pesada que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: DYSMD (SEQ ID No: 28); una CDR2 de cadena pesada que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: AIHLNTGYTNYNQKFKG (SEQ ID No: 46); y una CDR3 de cadena pesada que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: GFYDGYSPMDY (SEQ ID No: 47). Los anticuerpos anti-C5a de ejemplo que comprenden dicho dominio variable de cadena pesada incluyen, por ejemplo, los anticuerpos anti-C5a BNJ366, BNJ369, BNJ381, y BNJ383 aquí descritos (vide infra; Tabla 2).
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito, puede contener una región CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido: AINPNSGGTNYSQKFKD (SEQ ID No: 67). Por ejemplo, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito puede comprender una región variable de cadena pesada que contiene uno o más de: una CDR1 de cadena pesada que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: DYSMD (SEQ ID No: 28); una CDR2 de cadena pesada que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: AINPNSGGTNYSQKFKD (SEQ ID No: 67); y una CDR3 de cadena pesada que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: SGSYDGYYAMDY (SEQ ID No: 30). En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito comprende una región variable de cadena pesada que contiene cada una de las CDR1 de cadena pesada que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: DYSMD (SEQ ID No: 28); una CDR2 de cadena pesada que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: AINPNSGGTNYSQKFKD (SEQ ID No: 67); y una CDR3 de cadena pesada que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: SGSYDGYYAMDY (SEQ ID No: 30). Un ejemplo de un anticuerpo anti-C5a aquí descrito, que contiene dicho polipéptido de cadena pesada y que enlaza C5a humana con un KD que es menor a 1 nM, es el anticuerpo 5an101ME que se describe más adelante.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito contiene uno de los conjuntos CDR de cadena ligera y conjunto CDR de cadena pesada de ejemplo en pares del 1 al 4 ilustrados en la Tabla 1.
Tabla 1. Emparejamientos CDR de Cadena Pesada v Ligera de Ejemplo "SIN" se refiere a "SEQ ID No." Las secuencias de aminoácido representadas mediante SEQ ID Nos en la Tabla 1 se establecen en la Tabla 2.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5a no comprende el emparejamiento 3 de CDR de ejemplo. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5a no es BNJ371.
En algunas modalidades, el polipéptido de cadena ligera de un anticuerpo anti-C5a aquí descrito puede ser un polipéptido de cadena ligera ? (por ejemplo, un polipéptido de cadena ligera ? humanizado o completamente humano). En algunas modalidades, el polipéptido de cadena ligera de un anticuerpo anti-C5a aquí descrito es un polipéptido de cadena ligera ? (por ejemplo, un polipéptido de cadena ligera ? humanizado o completamente humano). Las secuencias de aminoácido de numerosos polipéptidos de cadena ligera (por ejemplo, numerosos polipéptidos de cadena ligera humana) son bien conocidas en la técnica y se establece, por ejemplo, en la publicación de Kabat y asociados. (1991), supra. Las secuencias de aminoácido de polipéptido de cadena ligera ? de ejemplo se establecen en la Tabla 2.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito puede comprender una región constante de cadena ligera. Por ejemplo, la región constante de cadena ligera puede ser una región constante de polipéptido de cadena ligera ?, o una región constante de cadena ligera ?. La secuencia de aminoácido para un número de regiones constantes de cadena ligera ? y ? humanas, son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la publicación de Kabat y asociados (1991), supra. Las secuencias de aminoácido de polipéptido de cadena ligera ? se establecen en la Tabla 2.
El polipéptido de cadena pesada puede comprender una región constante (por ejemplo, una región constante de cadena pesada 1 (CH1), una región constante de cadena pesada 2 (CH2), una región constante de cadena pesada 3 (CH3), una región constante de cadena pesada 4 (CH4), o una combinación de cualesquiera de las anteriores). El polipéptido de cadena pesada puede comprender una porción Fe de una molécula de inmunoglobulina. La región Fe puede ser, por ejemplo, una región Fe de una molécula de inmunoglobulina lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, o IgD o una combinación de porciones de cada una de las mismas. Quedará claro, que los anticuerpos anti-C5a aquí descritos pueden ser, por ejemplo, del isotipo lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, o IgD. Las secuencias de aminoácido para un número de regiones constantes de cadena pesada humana son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la publicación de Kabat y asociados (1991), supra.
En algunas modalidades, el polipéptido de cadena pesada puede comprender una región constante híbrida, o una porción de la misma, tal como una región constante híbrida G2/G4 (ver por ejemplo, las publicaciones de Burton y asociados (1992) Adv Immun 5_1_: 1-18; Canfield y asociados (1991) J Exp Med 173: 1483-1491; y Mueller y asociados (1997) Mol Immunol 34(6): 441-452). Por ejemplo, (y de acuerdo con la numeración de Kabat), las regiones constantes I g G 1 y lgG4 comprenden residuos G249G250, en tanto que la región constante lgG2 no comprende el residuo 249, pero comprende G2so- En una región constante híbrida G2/G4, en donde la región 249-250 viene de la secuencia G2, la región constante puede ser modificada en forma adicional para introducir un residuo de glicina en la posición 249 para producir una fusión G2/G4 que tiene G249 G250- Otros híbridos de dominio constante que comprenden G249 G250 también pueden ser parte de los anticuerpos construidos mediante ingeniería de acuerdo con la descripción. Las secuencias de aminoácido del polipéptido de cadena pesada de ejemplo, se establecen en la Tabla 2.
El anticuerpo anti-C5a puede ser, por ejemplo, uno de los anticuerpos específicos ejemplificados en los ejemplos de operación: BNJ364, BNJ367, BNJ378, BNJ366, BNJ369, BNJ383, BNJ371, o BNJ381. Las secuencias de aminoácido para estos anticuerpos anti-C5a ejemplificados, que se pueden utilizar junto con cualquiera de los métodos aquí descritos, se establecen en la Tabla 2. n oí OI Tabla 2. Secuencias de Aminoácidos para Anticuerpos Anti-C5a Humanizados Seleccionados OI I Oí OI OI OI OI en en Ol en en en en en n en en en oí 01 en en en n en en XI OI n Oí Oí OI ? Oí OI en CJ1 a? a? n en a? en n en en en en en oí en en en en en en en > O "SIN" se refiere a SEQ ID No: "Ab" en la Tabla 2 se refiere a la designación alfanumérica asignada a un anticuerpo determinado. Cada uno de los anticuerpos se ejemplifica en los ejemplos de operación.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito comprende un conjunto CDR de cadena ligera definido por Chothia o un conjunto CDR de cadena ligera definido por Kabat-Chothia combinado de cualesquiera de las regiones variables de cadena ligera descritas en las Tablas 2 ó 3. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, aquí descrito comprende un conjunto CDR de cadena pesada definido por Chothia o un conjunto CDR de cadena pesada definido por Kabat-Chothia combinado de cualesquiera de las regiones variables de cadena pesada descritas en las Tablas 2 ó 3.
En modalidades preferidas, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito enlaza a C5a, pero no a C5 de longitud total, nativa. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a enlaza a C5a, pero no enlaza a la cadena alfa de la C5 nativa, no disociada Tal como se utiliza en la presente invención, "C5 no disociada" se refiere a una proteína C5 que no ha sido disociada en fragmentos C5a y C5b a través de una convertasa C5 AP o CP. Una secuencia de aminoácido de ejemplo para una cadena alfa C5 humana se establece en la publicación de Haviland y asociados (1991), supra, cuya secuencia se incorpora en su totalidad a la presente invención como referencia.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito no enlaza a parálogos de C5 humana, tal como C3a humana o C4a humana.
La descripción también presenta anticuerpos que bloquean en forma cruzada el enlace de un anticuerpo anti-C5a aquí descrito (por ejemplo, bloquea en forma cruzada cualesquiera de los BNJ364, BNJ367, BNJ378, BNJ366, BNJ369, BNJ371, BNJ381, o BNJ383). Tal como se utiliza en la presente invención, el término "anticuerpo de bloqueo cruzado" se refiere a un anticuerpo que disminuye la cantidad de enlace (o evita el enlace) de un anticuerpo anti-C5a a un epítope en una proteína C5a componente de complemento relativa a la cantidad de enlace del anticuerpo anti-C5a al epítope en la ausencia del anticuerpo de bloqueo cruzado. Los métodos adecuados para determinar si un primer anticuerpo bloquea en forma cruzada el enlace de un segundo anticuerpo a un epítope, son conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden identificar anticuerpos de bloqueo cruzado comparando el enlace del anticuerpo anti-C5a monoclonai BNJ364 en la presencia y ausencia de un anticuerpo de prueba. El enlace disminuido del anticuerpo BNJ364 en la presencia del anticuerpo de prueba, tal como se compara con el enlace del anticuerpo BNJ364 en la ausencia del anticuerpo de prueba, indica que el anticuerpo de prueba es un anticuerpo de bloqueo cruzado.
En algunas modalidades, el enlace de un anticuerpo a C5a puede inhibir la actividad biológica de C5a. Los métodos para medir la actividad C5a incluyen, por ejemplo, ensayos de quimiotaxis, radioinmunoensayos (RIAs) o ensayos inmunoespecíficos enlazados por enzimas (ELISA) (ver por ejemplo, las Publicaciones de Ward y Zvaifier (1971) J Clin Invest 50(3V.606-16 y Wurzner y asociados (1991) Complement Inflamm 8:328-340). En algunas modalidades, el enlace de un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo a C5a puede inhibir la activación de neutrófilo transmitida por a C5a in vitro. Dichos métodos adecuados para determinar si un anticuerpo anti-C5a inhibe la activación de neutrófilo transmitida por C5a in vitro, o el grado en el cual el anticuerpo inhibe la activación, son conocidos en la técnica y se ejemplifican en los ejemplos de operación que se encuentran más adelante. Por ejemplo, los neutrófilos humanos obtenidos de donadores saludables pueden ser aislados y contactados con C5a humano aislado en la presencia o ausencia de un anticuerpo anti-C5a de prueba. La activación dependiente de C5a de neutrófilos humanos se puede medir como una función de la liberación de mieloperoxidasa (MPO) de las células en la presencia de C5a. Una inhibición de la cantidad de MPO liberada de las células en la presencia de C5a y el anticuerpo de prueba, en comparación con la cantidad de MPO liberada de células en la presencia de C5a y un anticuerpo de control, indica que el anticuerpo de prueba inhibe la activación de neutrófilo transmitida por C5a.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo, no inhibe (o sustancialmente no inhibe) la actividad de C5 componente de complemento, en comparación con el nivel de inhibición (si existe) observado por un anticuerpo de control correspondiente o fragmento de enlace de antígeno del mismo (por ejemplo, un anticuerpo que no enlaza a C5a o C5 libre). La actividad C5 puede ser medida como una función de su capacidad de lisar células en los fluidos corporales de un sujeto. La capacidad de lisar células, o una reducción de la misma, de C5 se puede medir a través de métodos conocidos en la técnica tales como por ejemplo, a través de ensayo hemolítico convencional, tal como el ensayo de hemolisis descrito por Kabat y Mayer (eds), "Inmunohistoquímica Experimental, 2o Edición" 135-240, Springfield, IL, CC Thomas (1961), páginas 135-139, o una variación convencional de dicho ensayo, tal como el método de hemolisis de eritrocito de pollo tal como se describe por ejemplo en la Publicación de Hillmen y asociados (2004) N EngI J Med 350(6):552.
En algunas modalidades, la actividad C5, o una inhibición de la misma se cuantifica utilizando un ensayo CH50eq. El ensayo CH50eq es un método para medir la actividad de complemento clásica total en suero. Esta prueba es un ensayo lítico, que utiliza eritrocitos sensibilizados por anticuerpo como el activador de la trayectoria de complemento clásica, y diversas diluciones del suero de prueba para determinar la cantidad requerida para proporcionar 50% de lisis (CH50). El porcentaje de hemolisis se puede determinar, por ejemplo, utilizando un espectrofotómetro. El ensayo CH50eq proporciona una medida indirecta de la formación de complejo de complemento terminal (TCC), ya que TCC por sí mismo es directamente responsable de la hemolisis que se mide.
El ensayo es bien conocido y se practica comúnmente por los expertos en la técnica. En síntesis, para activar la trayectoria de complemento clásica, se agregaron muestras de suero no diluidas (por ejemplo, muestras de suero humano) a depósitos de microensayo que contienen los eritrocitos sensibilizados por anticuerpo para generar de esta forma TCC. Posteriormente, los sueros activados son diluidos en depósitos de microensayo, los cuales se recubren con un reactivo de captura (por ejemplo, un anticuerpo que enlaza a uno o más de los componentes de TCC). El TCC presente en las muestras activadas enlaza a los anticuerpos monoclonales que recubren la superficie de los depósitos de microensayo. Los depósitos son lavados y, a cada depósito se le agrega un reactivo de detección que está etiquetado en forma detectable y reconoce el TCC enlazado. La etiqueta detectable puede ser por ejemplo una etiqueta fluorescente o una etiqueta enzimática. Los resultados del ensayo se expresan en equivalentes de unidad CH50 por mililitro (CH50 U Eq/mL).
Los métodos adicionales para detectar y/o medir la actividad de C5 in vitro se establecen y ejemplifican en los ejemplos de operación.
En algunas modalidades, el enlace de un anticuerpo a C5 puede inhibir la interacción entre C5a y C5aR1. Los métodos adecuados para detectar y/o medir la interacción entre C5a y C5aR1 (en la presencia y ausencia de un anticuerpo) son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en las Publicaciones de Mary y Boulay (1993) Eur J Haematol 51 (5):282-287; Kaneko y asociados (1995) Immunology 86(1 ): 149-154; Giannini y asociados (1995) J Biol Chem 270(32): 19166-19172; y en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 20060160726. Por ejemplo, el enlace del C5a etiquetado en forma detectable (por ejemplo, etiquetado en forma radioactiva) a células monon ucleares de sangre periférica que expresan C5aR1 se puede evaluar en la presencia y ausencia de un anticuerpo. Una disminución en la cantidad de C5a etiquetado en forma detectable que enlaza a C5aR1 en la presencia del anticuerpo, en comparación con la cantidad de enlace en la ausencia del anticuerpo, es una indicación de que el anticuerpo inhibe la interacción entre C5a y C5aR1.
En algunas modalidades, el enlace de un anticuerpo a C5a puede inhibir la interacción entre C5a y C5L2. Los métodos para detectar y/o medir la interacción entre C5a y C5L2 son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en las Publicaciones de Ward (2009) J Mol Med 87(4):375-378 y Chen y asociados (2007) Nature 446(7132):203-207. Los métodos adicionales para evaluar el efecto biológico de un anticuerpo anti-C5a aquí descrito, son ejemplificados en los ejemplos de operación que se encuentran más adelante.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5a enlaza específicamente a una proteína C5a componente de complemento humano (por ejemplo, proteína C5a humana que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO: 1 o SEC ID NO:2). Los términos "enlace específico", "enlaza en forma específica", y términos gramaticales similares, tal como se utilizan en la presente invención, se refieren a dos moléculas que forman un complejo (por ejemplo, un complejo entre un anticuerpo y una proteína C5a componente de complemento) que es relativamente estable bajo condiciones fisiológicas. Normalmente, el enlace se considera específico cuando la constante de asociación (ka) es mayor a 106 M"1s"1. Por lo tanto, un anticuerpo puede enlazar específicamente a una proteína C5a con una ka de al menos (o mayor a) 106 (por ejemplo, al menos o mayor a 107, 10a, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, o 1015 o mayor) de M" s-1. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito tiene una constante de disociación (kd) menor o igual a 103 (por ejemplo, 8 x 10"4, 5 x 10~4, 2 x 10~4, 10"4, o 10"5) s"1.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito tiene una KD menor a 10"8, 10"9, 10~10, 10~11 o 10~12 M. La constante de equilibrio KD es la proporción de las constantes de rango cinético-kd/ka. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5 aquí descrito tiene una KD menor a 1.25 x 10"9 M. Los ejemplos de anticuerpos anti-C5a que enlazan a C5a con una Ko que es menor a 1.25 x 10~9 M, incluyen por ejemplo, anticuerpos anti-C5a BNJ364, BNJ367, BNJ371, BNJ378, BNJ366, BNJ369, BNJ381 y BNJ383.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito tiene una KD menor a 1 x 10"9 M. Los ejemplos de anticuerpos anti-C5a que enlazan a C5a con una KD que es menor a 10"9 M incluyen, por ejemplo los anticuerpos anti-C5a BNJ364, BNJ367, BNJ378, BNJ366, BNJ369, BNJ381 y BNJ383.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito tiene una KD menor a 5 x 10"10 M. Los ejemplos de anticuerpos anti-C5a que enlazan a C5a con una KD que es menor a 5 x 10 10 M, incluyen por ejemplo, los anticuerpos anti-C5a BNJ367, BNJ378, BNJ366, BNJ369, BNJ381 y BNJ383.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito tiene una KD menor a 2 x 10~10 M. Los ejemplos de anticuerpos anti-C5a que enlazan a C5a con una KD que es menor a 2 x 10~10 M incluyen por ejemplo, los anti-C5a BNJ367, BNJ366, BNJ369, BNJ381 y BNJ383.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito tiene una KD menor a 1 x 10~10 M. Los ejemplos de anticuerpos anti-C5a que enlazan a C5a con una KD que es menor a 1 x 10"10 M, incluyen por ejemplo, los anticuerpos anti- C5a BNJ369, BNJ381 y BNJ383.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito tiene una KD menor a 7.5 x 10"11 M. Los ejemplos de anticuerpos anti-C5a que enlazan a C5a con una KD que es menor a 7.5 x 10"11 M incluyen, por ejemplo, los anticuerpos anti-C5a BNJ369 y BNJ383.
Los métodos para determinar la afinidad de un anticuerpo para un antígeno de proteína son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la afinidad de un anticuerpo para un antígeno de proteína puede cuantificarse utilizando una variedad de técnicas, tales como pero sin limitarse a manchado Western, manchado de punto, I nterferometría de Biocapa, Método de Resonancia de Plasmón de Superficie (SPR) (por ejemplo, el sistema BIAcore; Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.), o los ensayos inmunoespecíficos enlazados por enzima (ELISA). Ver, por ejemplo las Publicaciones de Harlow y Lañe (1988) "Anticuerpos: Manual de Laboratorio" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Benny K. C. Lo (2004) "Construcción Mediante Ingeniería de Anticuerpos: Métodos y Protocolos" Humana Press (ISBN: 1588290921); Borrebaek (1992) "Construcción Mediante Ingeniería de Anticuerpos, Guía Práctica", W.H. Freeman and Co., NY; Borrebaek (1995) "Construcción Mediante Ingeniería de Anticuerpo" 2° Edición, Oxford University Press, NY, Oxford; Johne y asociados (1993) J Immunol Meth 160: 191-198; Jonsson y asociados (1993) Ann Biol Clin 5J_: 19-26; y Jonsson y asociados (1991) Biotechniques 1 :620-627.
Cualesquiera de los conjuntos CDR de cadena ligera o las regiones variables de cadena ligera aquí descritas, se pueden emparejar con cualesquiera de los conjuntos CDR de cadena pesada o las regiones variables de cadena pesada aquí descritas. Está dentro del alcance de los expertos en la técnica, confirmar (probar) por ejemplo, que un anticuerpo anti-C5a generado a través de dicho emparejamiento posee la afinidad o actividad deseada. Los métodos adecuados para confirmar la actividad y/o afinidad de un anticuerpo anti-C5a se describen en la presente invención.
En algunas modalidades, los anticuerpos anti-C5a aquí descritos enlazan tanto a C5a humana (hC5a) como a C5a de un mamífero no humano, tal como un primate no humano (por ejemplo, macaco cinomolgo). En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito, no enlaza a los parálogos de C5a humana tal como C3a o C4a de una misma especie de mamífero no humano.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito enlaza a hC5a libre y a una proteína C5a de macaco cinomolgo que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: MLQEKI EEI AAKYKHLVVK CCYDGVRINH DETCEQRAAR ISVGPRCVKA FTECCVVASQLRANNSHKDLQLGR (SEC ID NO: 179) . En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito, enlaza a hC5a libre y a una proteína C5a de macaco rhesus que comprende, o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO: 179.
En algunas modalidades, el anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, puede enlazar a una forma desarginada de proteína C5a de una especie de mamífero no humano (por ejemplo, una especie de primate no humano). Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo puede enlazar a una proteína C5a-desarg de macaco cinomolgo o macaco rhesus, en donde la proteína comprende o consiste, en la siguiente secuencia de aminoácido: MLQEKIEEIAAKYKHLVVKK CCYDGVRINH DETCEQRAAR ISVGPRCVKA FTECCVVASQLRA NSHKDLQLG (SEC ID NO: 180) .
En algunas modalidades, los anticuerpos anti-C5a aquí descritos se enlazan a C5a de ratón (por ejemplo, la C5a libre de ratón). En algunas modalidades, los anticuerpos anti-C5a aquí descritos se enlazan a C5a de ratón, pero no a C5a humana. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito no enlaza a C5 de ratón nativa, no disociada (completamente doblada). En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito no enlaza a los parálogos de C5a de ratón tales como C3a de ratón o C4a de ratón.
Un anticuerpo anti-ratón C5a, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, puede enlazar a una proteína C5a de ratón que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: LRQKI EEQAAKYKHS PKKCCYDGARVNFYETCEERVARVTIGPLC IRAFNECCT IANKIRKESPHKPVQLGR (SEC ID NO:51). Ver también por ejemplo la Publicación de Wetsel y asociados (1987) Biochem 26.:737-743. En algunas modalidades, un anticuerpo C5a anti-ratón, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, puede enlazar a una forma desarginada de la proteína C5a de ratón que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácidos: LRQKI EEQAAKYKHSVPKCCYDGARVNFYETCEERVARVTIGPLCI RAFNECCT IANKIRKESPHKPVQLG (SEC ID NO:52). En algunas modalidades, el anticuerpo C5a anti-ratón enlaza tanto a la proteína C5a de ratón de longitud total como a la forma desarginada de la proteína C5a de ratón.
Un anticuerpo C5a anti-ratón aquí descrito puede, por ejemplo, contener un conjunto de CDR de cadena ligera de un polipéptido de región variable de cadena ligera que comprende la siguiente secuencia de aminoácido: EIVLTQSPAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYIYWYQQKSDASPKLW I YYTSNLAP GVPARFSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQQFTSSPLTFGVG TKLELKR (SEC ID NO:53). Por ejemplo, un anticuerpo C5a antiratón puede contener: (i) una CDR1 de cadena ligera definida por Kabat que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácidos: RASSSVNYIY (SEC ID NO:54); (ii) una CDR2 de cadena ligera definida por Kabat que comprende o consiste en la siguiente secuencia de: YTSNLAP (SEC ID NO:55); y/o (iii) una CDR3 de cadena ligera definida por Kabat que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido. QQFTSSPLT (SEC ID NO:56).
El anticuerpo C5a anti-ratón puede contener una región constante de cadena ligera, por ejemplo, la región constante de cadena ligera kappa de ratón que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácidos: ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNFYPKDINVKWKIDGSER QNGVLNSW TDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPI VKSF NRNEC (SEC ID NO:57).
En algunas modalidades, un anticuerpo C5a anti-ratón aquí descrito puede contener un péptido de señal de terminal amino, por ejemplo, un péptido de señal que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: MGWSCI ILFLVATATGVHS (SEC ID NO:58).
En algunas modalidades, un anticuerpo C5a anti-ratón aquí descrito puede contener un polipéptido de cadena ligera que comprende o consiste en la siguiente secuencia de: REI VLTQSPAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYIYWYQQKSDASPKL WIYYTSNLA PGVPARFSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQQFTSSPLTFGV GTKLELKRAD AAPTVSI FPPSSEQLTSGGASVVCFLNFYPKDI N VKWKIDGSERQN GVLNSWTD QDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPI VKSFNR NEC (SEC ID NO:59) o MGWSCI ILFLVATATGVHSREI VLTQSPAI SASLGEKVTMSCRASS SVNYIYWY QQKSDASPKLWIYYTSNLAPGVPARFSGSGSGNSYSLTISSMEGE DAATYYCQQF TS S PLTFGVGTKLELK RA D AAPTVSI FPPSSEQLTSGGASVVCFLN FYPKDINVK WKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSY TCEATHKTS TSPIVKSFNRNEC (SEC ID NO.60). En algunas modalidades, un anticuerpo C5a anti-ratón aquí descrito contiene un polipéptido de cadena ligera que comprende los aminoácidos 2 a 214 de SEC ID NO:59. En algunas modalidades, un anticuerpo C5a anti-ratón aquí descrito contiene un polipéptido de cadena ligera que comprende los aminoácidos 1 a 19 y 21 a 233 de SEC ID NO:60.
Un anticuerpo C5a anti-ratón aquí descrito, por ejemplo, puede contener un conjunto CDR de cadena pesada obtenido de un polipéptido de región variable de cadena pesada que comprende la siguiente secuencia: LEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYYI WVKQSHGK SLEWIGYIYP NDGDTN YNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAR PYYSDYGM DYWGQGTSVTVSS (SEC ID NO:61). Por ejemplo, un anticuerpo C5a anti-ratón puede contener: (i) una CDR1 de cadena pesada definida por Kabat que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácidos: DYYYIN (SEC ID NO:62); (ii) una CDR2 de cadena pesada definida por Kabat que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácidos: YIYPNDGDTNYNQKFKG (SEC ID NO:63), y/o (iii) (i) una CDR3 de cadena pesada definida por Kabat que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácidos: PYYSDYGM DY (SEC ID NO:64).
El anticuerpo C5a anti-ratón puede contener una región constante de cadena pesada. En algunas modalidades, un anticuerpo C5a anti-ratón aquí descrito puede contener un péptido de señal de terminal amino, por ejemplo, un péptido de señal que comprende o consiste en la siguiente secuencia de: GWSCI ILFLVATATGVHS (SEC ID NO:65).
En algunas modalidades, un anticuerpo C5a anti-ratón aquí descrito puede contener un polipéptido de cadena pesada que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: LEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTD YYYI WVKQSHGK SLEWIGYIYP NDGDTN YNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAR PYYSDYGM DYWGQGTSVTVSS (SEC ID NO:66) o GWSCI ILFLVATATGVHSLEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASG YTFTDYYYI NWVKQSHGKSLEWIG Yl YPNDGDTN YNQKFKGKATLTVDKSSSTA YMELRSLT SEDSAVYYCAR PYYSDYGM DYWGQGTSVTVSS (SEC ID NO:67). En algunas modalidades, un anticuerpo C5a anti-ratón aquí descrito contiene un polipéptido de cadena pesada que comprende los aminoácidos 2 a 121 de SEC ID NO:66. En algunas modalidades, un anticuerpo C5a anti-ratón aquí descrito contiene un polipéptido de cadena pesada que comprende los aminoácidos 1 a 19 y 21 a 140 de SEC ID NO: 67. En algunas modalidades, un anticuerpo C5a anti-ratón aquí descrito contiene un polipéptido de región constante de cadena pesada que comprenda una o más sustituciones de aminoácido de la secuencia antes descrita.
En algunas modalidades, un anticuerpo C5a anti-ratón aquí descrito contiene un polipéptido de cadena ligera que comprende: (i) una CDR1 de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO:54; (ii) una CDR2 de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO:55; y (iii) una CDR3 de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO:56; (iv) una CDR1 de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO:62; (v) una CDR2 de cadena pesada que comprende, o consiste en la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO:63; y/o (vi) una CDR3 de cadena pesada que comprende, o consiste en la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO: 64.
En algunas modalidades, un anticuerpo C5a anti-ratón aquí descrito contiene un polipéptido de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO:59 y un polipéptido de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO: 66.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito puede enlazar a C5a humana y a C5a de ratón.
Métodos para Producir los Anticuerpos Anti-C5a y Fragmentos de Enlace de Antíqeno de los Mismos La descripción también presenta métodos para producir cualesquiera de los anticuerpos anti-C5a o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos aquí descrito. En algunas modalidades, los métodos para preparar un anticuerpo aquí descrito pueden incluir inmunizar a un sujeto (por ejemplo, un mamífero no humano) con un inmunogen adecuado. Los inmunogenes adecuados para generar cualesquiera de los anticuerpos aquí descritos se establecen en la presente invención. Por ejemplo, para generar un anticuerpo que enlaza a C5a, un experto en la técnica puede inmunizar a un sujeto adecuado (por ejemplo, un mamífero no humano tal como una rata, un ratón, un jerbo, un hámster, un perro, un gato, un cerdo, una cabra, un caballo o un primate no humano) con un polipéptido C5a de longitud total tal como un C5a polipéptido de longitud total polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO: 1 o la forma desarginada de C5a (por ejemplo, la C5a desarginada humana que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO:2). En algunas modalidades, el mamífero no humano tiene deficiencia de C5, por ejemplo, un ratón con deficiencia de C5 descrito por ejemplo en las Publicaciones de Levy y Ladda (1971) Nat New Biol 229(2 ): 51 -52 : Crocker y asociados (1974) J Clin Pathol 27(2): 122-124; Wetsel y asociados (1990) J Biol Chem 265:2435-2440: y Jungi y Pepys (1981) Immunology 43(2):271-279. La C5a humana se puede purificar de suero humano tal como se describe por ejemplo en las Publicaciones de McCarthy y Henson (1979) J Immunol 123(61:2511-2517 y anderino y asociados (1982) J Immunol Methods 53(1 ):41 -50. Ver también los ejemplos de operación. C5a humana también se puede generar in vitro tal como se describe por ejemplo en la Publicación de Vallota y Müller-Eberhard (1973) J Exp Med 137: 1109. C5a humana purificada también está comercialmente disponible por ejemplo en Complement Technology, Inc. (número de catálogo A144; Tyler, Texas). C5a recom!binante también puede ser generada por un experto en la técnica tal como se describe por ejemplo en la Publicación de Tothe y asociados (1994) Prot Se i 3:1159-1 68.
Un sujeto adecuado (por ejemplo, un mamífero no humano) puede ser inmunizado con el antígeno adecuado junto con inmunizaciones de refuerzo subsecuentes un número de veces, suficientes para desarrollar la producción de un anticuerpo por parte del mamífero. El inmunogen puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, un mamífero no humano) con un adyuvante. Los adyuvantes útiles para producir un anticuerpo en un sujeto incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes de proteína; adyuvantes bacterianos, por ejemplo bacteria completa (BCG, Corynebacterium parvum o Salmonella minnesota) y componentes bacterianos que incluyen esqueleto de pared celular, dímicolato de trehalosa, lípido de monofosforilo A, residuo extractable de metanol (MER) de tubérculo bacillus, adyuvante de Freund completo o incompleto; adyuvantes virales; adyuvantes químicos, por ejemplo, hidróxido de aluminio, y yodoacetato y hemisuccinato de colesterilo. Otros adyuvantes que pueden ser utilizados en los métodos para inducir una respuesta inmune incluyen por ejemplo proteínas de toxina de cólera y parapoxvirus. Ver también la Publicación de Bieg y asociados (1999) Autoimmuniiy 31 (1 ):15-24. Ver también las Publicaciones, por ejemplo de Lodmell y asociados (2000) Vaccine 18.: 1059-1066; Johnson y asociados (1999) J Med Chem 42:4640-4649; Baldridge y asociados (1999) Methods 19:103-107; y Gupta y asociados (1995) Vaccine 13(1 1: 1263-1276.
En algunas modalidades, los métodos incluyen preparar una línea de célula de hibridoma que secreta un anticuerpo monoclonal que enlaza al inmunogen. Por ejemplo, un mamífero adecuado, tal como un ratón de laboratorio se inmuniza con un polipéptido C5a tal como se describe anteriormente. Las células que producen anticuerpo (por ejemplo, células B del bazo) del mamífero inmunizado, se pueden aislar de dos a cuatro días después de al menos una inmunización de refuerzo del inmunogen y posteriormente crecerse brevemente en cultivo antes de la posición con las células de una línea de célula de mieloma adecuada. Las células se pueden fusionar en la presencia de un promotor de fusión tal como, por ejemplo, un virus de vacuna o un polietilenglicol. Las células híbridas obtenidas en la fusión se clonan, y los clones celulares que secretan los anticuerpos deseados son seleccionados. Por ejemplo, las células de bazo de ratones Balb/c inmunizados con un inmunogen adecuado pueden fusionarse con células de la línea de célula de mieloma PAI o la línea de célula de mieloma Sp2/0-Ag 14. Después de la fusión, las células son expandidas en un medio de cultivo adecuado, el cual se suplementa con un medio de selección, por ejemplo un medio HAT, en intervalos regulares con el objeto de evitar que las células de mieloma normales sobrecrezcan las células de hibridoma deseadas. Las células híbridas obtenidas posteriormente se clasifican para la secreción de anticuerpos deseados, por ejemplo, un anticuerpo que enlaza a C5a e inhibe la interacción entre C5a y un receptor C5a (por ejemplo, C5aR1).
En algunas modalidades, un experto en la técnica puede identificar un anticuerpo anti-C5a de una biblioteca polarizada no inmune tal como se describe por ejemplo en la Patente Norteamericana no. 6,300,064 (de Knappik et al; Morphosys AG) y Schoonbroodt y asociados (2005) Nucleic Acids Res 33(9):e81.
En algunas modalidades, los métodos aquí descritos pueden implicar, o ser utilizados junto con, por ejemplo, tecnologías de despliegue de fago, despliegue bacteriano, despliegue de superficie de levadura, despliegue viral eucariótico, despliegue de células de mamífero y técnicas de clasificación de anticuerpo libres de células (por ejemplo, despliegue ribosomal) (ver por ejemplo las Publicaciones de Etz y asociados (2001 ), J Bacterio! 183:6924-6935; Cornells (2000) Curr Opin Biotechnol 1J_: 450-454; Klemm y asociados (2000) Microbiology 146:3025-3032; Kieke y asociados (1997) Protein Eng 1_0:1303- 310; Yeung y asociados (2002) Biotechnol Prog 18:212-220; Boder y asociados (2000) Methods Enzymology 328:430-444; Grabherr y asociados (2001 ) Comb Chem High Throughput Screen 4: 185-192; Michael y asociados (1995) Gene Ther 2:660-668; Pereboev y asociados (2001 ) J Virol 75_:7107-7113; Schaffitzel y asociados (1999) J Immunol Methods 231 : 119-135; y Hanes y asociados (2000) Nat Biotechnol 18.: 1287-1292).
Los métodos para identificar anticuerpos utilizando varios métodos de despliegue de fago son conocidos en la técnica. En métodos de despliegue de fago, los dominios del anticuerpo funcional son desplegados en la superficie de partículas de fago que llevan las secuencias de polinucleótido que las codifican. Dicho fago puede ser utilizado para desplegar dominios de enlace de antígeno de los anticuerpos, tal como Fab, Fv, o fragmentos de anticuerpo Fv estabilizados con enlace de disulfuro, expresados de una biblioteca de anticuerpo de repertorio o de combinación (por ejemplo, humano o múrido). El fago utilizado en estos métodos normalmente es un fago filamentoso tal como fd ó M13. Los dominios de enlace de antígeno se expresan como una proteína fusionada en forma recombinante para cualesquiera de las proteínas recubiertas con fago plll, pVIII o pIX. Ver por ejemplo la Publicación de Shi y asociados (2010) JMB 397:385-396. Los ejemplos de métodos de despliegue de fagos que se pueden utilizar para elaborar las inmunoglobulinas, o fragmentos de las mismas aquí descritos incluyen las descritas en las Publicaciones de Brinkman y asociados (1995) J Immunol Methods 182:41-50; Ames y asociados (1995) J Immunol Methods 184: 177-186; Kettieborough y asociados (1994) Eur J Immunol 24:952-958; Persic y asociados (1997) Gene 187:9-18; Burton y asociados (1994) Advances in Immunology 57:191-280; y en las Publicaciones PCT nos. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982 y WO 95/20401. Los métodos adecuados también se describen por ejemplo en las Patentes Norteamericanas nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108.
En algunas modalidades, las bibliotecas de anticuerpo de despliegue de fago se pueden generar utilizando mARN recolectado de células B de los mamíferos inmunizados. Por ejemplo, una muestra de célula esplénica que comprende células B, puede ser aislada de ratones inmunizados con polipéptido C5a tal como se describió anteriormente. El mARN puede ser aislado de las células y convertirse a cADN utilizando técnicas de biología molecular estándar. Ver por ejemplo la Publicación de Sambrook y asociados (1989) "Clonación Molecular: Manual de Laboratorio, 2° Edición" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.; Hárlow y Lañe (1988), supra; Benny K. C. Lo (2004), supra; y Borrebaek (1995), supra. El cADN que codifica las regiones variables de los polipéptidos de cadena pesada y cadena ligera de las inmunoglobulinas se utilizan para construir la biblioteca de despliegue de fago. Los métodos para generar dicha biblioteca se describen por ejemplo en las Publicaciones de Merz y asociados (1995) J Neurosci Methods 62Í -2): 2 3-9; Di Niro y asociados (2005) Biochem J 388(Pt 3) 889-894; y Engberg y asociados (1995) Methods Mol Biol 51:355-376.
En algunas modalidades, una combinación de selección y clasificación puede ser empleada para identificar un anticuerpo de interés de, por ejemplo, una población de anticuerpos derivados de hibridoma o una biblioteca de anticuerpo de despliegue de fago. Los métodos adecuados son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en las Publicaciones de Hoogenboom (1997) Trends in Biotechnology 5:62-70; Brinkman y asociados (1995), supra; Ames y asociados (1995), supra; Kettleborough y asociados (1994), supra; Persic y asociados (1997), supra; y Burton y asociados (1994), supra. Por ejemplo, una pluralidad de vectores de fagémido, que codifica cada uno una proteína de fusión de una proteína de recubrimiento de bacteriófago (por ejemplo, plll, pVIII o pIX de fago M13) y una región de combinación de antígeno diferente se producen utilizando técnicas de biología molecular estándar y posteriormente se introducen en una población de bacterias (por ejemplo, E. coli). La expresión de bacteriófago en la bacteria en algunas modalidades, puede requerir el uso de un fago auxiliar. En algunas modalidades, no se requiere fago auxiliar (ver por ejemplo la Publicación de Chasteen y asociados (2006) Nucleic Acids Res 34(21 ):e145). El fago producido de bacteria se recupera y posteriormente contacta con, por ejemplo, un antígeno objetivo enlazado a un soporte sólido (inmovilizado). El fago también puede ser contactado con el antígeno en solución, y el complejo se enlaza subsecuente a un soporte sólido.
En algunas modalidades, el fago inmovilizado es el fago de interés. Por consiguiente, el fago no enlazado es eliminado mediante lavado del soporte. Después del paso de lavado, el fago enlazado se eluye del soporte sólido, por ejemplo, utilizando un amortiguador de pH bajo o un competidor de antígeno objetivo libre, y se recupera mediante infección con bacterias. En algunas modalidades, el fago que no se inmoviliza es el fago de interés. En dichas modalidades, la población de fagos puede ser contactada con el antígeno dos o más veces para eliminar de la población cualquier fago que enlace al soporte. El fago no enlazado posteriormente se recolecta y utiliza para pasos de clasificación subsecuentes.
Para enriquecer la población de fagos con partículas de fago que contienen anticuerpos que tienen mayor afinidad para el antígeno objetivo (reduciendo al mismo tiempo la proporción de fagos que pueden enlazar en forma no específica al antígeno), el fago eluido (descrito anteriormente) se puede utilizar para volver a infectar una población de células huésped bacterianas. El fago expresado posteriormente se aisla de la bacteria y nuevamente se pone en contacto con un antígeno objetivo. La concentración de antigeno, pH, temperatura e inclusión de detergentes y adyuvantes durante el contacto se puede modular para enriquecer los fragmentos de anticuerpo de mayor afinidad. El fago no enlazado se elimina lavando el soporte sólido. El número de ciclos, duración, pH, temperatura e inclusión de detergentes y adyuvantes durante el lavado, también se puede modular para enriquecer los fragmentos de anticuerpo de afinidad mayor. Después del paso de lavado, el fago enlazado se eluye de soporte sólido. Cualquiera de uno a seis ciclos interactivos de lavado con batea, se pueden utilizar para enriquecer anticuerpos que contienen fago que tienen mayor afinidad para el antígeno objetivo. En algunas modalidades, también se puede llevar a cabo un paso de desselección junto con cualesquiera métodos de lavado con batea aquí descritos.
El fago individual de la población se puede aislar infectando bacterias y posteriormente revistiéndolas en una densidad para permitir la formación de anticuerpos monoclonales.
Por ejemplo, para identificar un anticuerpo que enlaza a C5a pero no a C5 utilizando técnicas de despliegue de fago, se puede emplear el siguiente método de lavado con batea. La población puede ser contactada primero con una superficie que contiene C5 humana de longitud total, nativa enlazada. El procedo puede ser repetido dos o más veces, recolectando cada vez el fago no enlazado. La población también puede contactarse con un soporte sólido que contiene proteínas C4 y/o C3 enlazas por superficie. El fago no enlazado de los pasos anteriores se contactan posteriormente con una superficie que contiene C5a enlazada o C5a desarginada. El fago que enlaza a C5a, se eluye de la superficie y se recupera infectando con bacterias. Se pueden llevar a cabo vueltas interactivas de selección de fago. Después de una seis vueltas de selección, se puede clasificar el fagémido recuperado individual para expresión de fragmentos de anticuerpo con la especificidad y afinidad deseada.
Una subpoblación de anticuerpos clasificados utilizando los métodos anteriores, se puede caracterizar con respecto a su especificidad y afinidad de enlace para un inmunogen particular (por ejemplo, C5a), utilizando cualesquiera métodos de base inmunológica o bioquímica conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede determinar el enlace específico de un anticuerpo a C5a en comparación con C5 de longitud total, nativa, utilizando métodos de base inmunológica o bioquímica tales como, pero sin limitarse a, un ensayo ELISA, ensayos SPR, un ensayo de inmunoprecipitación, cromatografía por afinidad y diálisis de equilibrio tal como se describió anteriormente. Los inmunoensayos que se pueden utilizar para analizar el enlace específico y reactividad cruzada de los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos utilizando técnicas tales como manchados Western, RIA, ELISA (ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzima), inmunoensayos de "emparedado", ensayos de inmunoprecipitación , ensayos de inmunodifusión , ensayos de aglutinación, ensayos de fijación de complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteína. Dichos ensayos son de rutina y son bien conocidos en la técnica.
Los anticuerpos también pueden ser ensayados utilizando ensayos a base de SPR, conocidos en la técnica por caracterizar los parámetros cinéticos de la interacción del anticuerpo con C5a. Cualquier instrumento SPR comercialmente disponible, incluyendo pero sin limitarse a, BIAcore Instruments (Biacore AB; Uppsala, Suecia); lAsys instruments (Affinity Sensors; Franklin, Massachussetts); el sistema IBIS (Windsor Scientific Limited; Berks, UK), sistemas SPR-CELLIA (Nippon Láser and Electronics Lab; Hokkaido, Japón), y SPR Detector Spreeta (Texas Instruments; Dallas, Texas) se pueden utilizar en los métodos aquí descritos. Ver por ejemplo las Publicaciones de Mullett y asociados (2000) Methods 22.: 77-91; Dong y asociados (2002) Reviews in Mol Biotech 82: 303-323; Fivash y asociados (1998) Curr Opin Biotechnol 9: 97-101; y Rich y asociados (2000) Curr Opin Biotechnol 1J_: 54-61.
Quedará entendido que los métodos anteriores también se pueden utilizar para determinar, por ejemplo, si un anticuerpo anti-C5a no enlaza a proteínas C5, C3 y/o C4 nativas de longitud total. Los métodos anteriores también se pueden utilizar para determinar si un anticuerpo que enlaza a C5a también inhibe la interacción entre C5a y un receptor C5a. Los métodos anteriores también se pueden utilizar para determinar si un anticuerpo que enlaza a C5a también inhibe la actividad de C5a.
Tal como se describe en las referencias anteriores, después de la selección de fago, las regiones que codifican el anticuerpo procedentes del fago, pueden ser aisladas y utilizadas para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos o cualquier fragmento deseado, y expresarse en un huésped deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células de plantas, levadura y bacterias, por ejemplo, tal como se describe con detalle más adelante. Por ejemplo, también se pueden emplear técnicas para producir en forma recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2, utilizando métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en la Publicación PCT no. WO 92/22324; en las Publicaciones Mullinax y asociados (1992) BioTechniques 12(6): 864-869; y Sawai y asociados (1995) Am J Repr Immunol 34:26-34; y Better y asociados (1988) Science 240: 1041-1043. Los ejemplos de técnicas que se pueden utilizar para producir Fvs y anticuerpos de cadena simple, incluye los descritos en las Patentes Norteamericanas nos. 4,946,778 y 5,258,498; Huston y asociados (1991 ) Methods in Enzymology 203:46-88: Shu y asociados (1993) Proc Nat Acad Sci USA 90/.7995-7999; y en las Publicaciones de Skerra y asociados (1988) Science 240: 1038-1040.
También se puede utilizar tecnología de despliegue de fago, por ejemplo, para incrementar la afinidad de un anticuerpo o para su antígeno cognato. La tecnología, referida como maduración por afinidad, puede emplear mutagénesis o CDR y re-selección para identificar anticuerpos que enlazan con mayor afinidad a un antígeno, en comparación con el anticuerpo inicial o de origen. Ver por ejemplo la Publicación de Glaser y asociados (1992) J Immunol 149:3903-3913. Las bibliotecas que se pueden construir consisten en un conjunto de clones variantes, cada uno difiriendo por una o más sustituciones de aminoácido. Las mutaciones con afinidad de enlace incrementada para el antígeno se pueden seleccionar, contactando los mutantes inmovilizados con el antígeno etiquetado o cualquier combinación de los métodos descritos anteriormente. Cualquier método de clasificación conocido en la técnica se puede utilizar para identificar anticuerpos mutantes con afinidad incrementada para el antígeno (por ejemplo, técnicas SPR o ELISA).
En algunas modalidades, se puede utilizar mapeo de epítope para identificar, por ejemplo, la región de C5a que interactúa con un anticuerpo, por ejemplo, una región de C5a que enlaza a C5aR1. Los métodos para identificar el epítope al cual un anticuerpo particular enlaza, son conocidos en la técnica y se describen anteriormente.
Los anticuerpos y fragmentos de los mismos aquí identificados, pueden ser, o pueden hacerse "quiméricos". Los anticuerpos quiméricos y los fragmentos de enlace de antígeno de los mismos comprenden porciones de dos o más especies diferentes (por ejemplo, ratón y humano). Los anticuerpos quiméricos pueden ser producidos con regiones variables de ratón de especificidad deseada fusionados a dominios constantes humanos (por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4,816,567). En esta forma, los anticuerpos no humanos pueden ser modificados para ser los más adecuados para aplicación clínica humana (por ejemplo, métodos para tratar o prevenir un trastorno transmitido por complemento en un sujeto).
Los anticuerpos monoclonales de la presente descripción incluyen formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, ratón). Los mAbs humanizados o injertados-CDR son particularmente útiles como agentes terapéuticos para humanos, debido a que no se despejan de la circulación tan rápido como los anticuerpos de ratón, y normalmente no provocan una reacción inmune adversa. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en el mismo de una fuente no humana. Estos residuos de aminoácido no humanos con frecuencia son referidos como residuos de "importación", los cuales normalmente se toman de un dominio variable de "importación". Los métodos para preparar anticuerpos humanizados generalmente son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la humanización se puede llevar a cabo esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (ver por ejemplo, las Publicaciones de Jones y asociados (1986) Nature 321.522-525: Riechmann y asociados (1988) Nature 332:323-327: y Verhoeyen y asociados (1988) Science 239: 1534-1536), sustituyendo estructuras de roedor o secuencias CDR de las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Ver también por ejemplo la Publicación de Staelens y asociados (2006) Mol Immunol 43: 1243-1257. En algunas modalidades, las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, ratón) son anticuerpos humanos (anticuerpo receptor) en donde los residuos de aminoácido de la región CDR del anticuerpo no humano (por ejemplo, anticuerpo de ratón, rata, conejo o primate no humano) que tiene la afinidad, afinidad y capacidad de enlace deseada se injertan en el andamio de estructura de un anticuerpo humano. Los métodos de humanización adicional se describen más adelante en los ejemplos de operación.
Los métodos para injertar secuencias CDR de un anticuerpo donador (por ejemplo, un anticuerpo no humano) a las regiones de estructura de un anticuerpo aceptor (por ejemplo, anticuerpo humano) son bien conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en las Publicaciones de Jones y asociados (1986) Nature 321 :522-525; Verhoeyen y asociados (1988) Science 239(4847): 1534-1536; Riechmann y asociados (1988) Nature 332:323-327; Queen y asociados (1989) Proc Nati Acad Sci USA 86: 10029-10033; Publicación PCT no. WO 93/011237; Kettleborough y asociados (1991) Protein Engineering, Design and Selection 4:773-783; Benny K. C. Lo (2004) "Construcción Mediante Ingeniería de Anticuerpo: Métodos y Protocolos" Humana Press (ISBN: 1588290921 ); Borrebaek (1992) "Construcción Mediante Anticuerpo, Guía Práctica" W.H. Freeman y Co., NY; y Borrebaek (1995) "Construcción Mediante Ingeniería de Anticuerpo", 2° Edición, Oxford University Press, NY, Oxford. Por ejemplo, las CDRs de un anticuerpo donador se pueden injertar en regiones de estructura de un anticuerpo aceptor utilizando técnicas de reacción de cadena de polimerasa (PCR) de extensión de traslape tal como se describe por ejemplo en las Publicaciones de Daugherty y asociados (1991) Nucleic Acids Res 19(9):2471 -2476; Roguska y asociados (1996) Protein Engineering 9(10):895-904; y Yazaki y asociados (2004) Protein Engineering, Design & Selection 17(5):481-489.
En modalidades en donde las secuencias de aminoácido CDR seleccionadas son secuencias cortas (por ejemplo, menos de 10 a 15 aminoácidos de longitud), los ácidos nucleicos que codifican las CDRs se pueden sintetizar en forma química tal como se describe por ejemplo en la Publicación de Shiraishi y asociados (2007) Nucleic Acids Symposium Series 51(1): 29-130 y en la Patente Norteamericana No. 6,995,259. Para una secuencia de ácido nucleico determinada que codifica un anticuerpo aceptor, la región de la secuencia de ácido nucleico que codifica las CDRs se puede reemplazar con los ácidos nucleicos sintetizados químicamente utilizando técnicas de biología molecular estándar. Los extremos 5' y 3' de los ácidos nucleicos sintetizados químicamente, se pueden sintetizar para comprender sitios de enzimas de restricción de extremo pegajoso para utilizarse en clonación de ácidos nucleicos en el ácido nucleico que codifica la región variable del anticuerpo donador.
En algunos casos, uno o más residuos de aminoácido de la región de estructura de la inmunoglobulina humana, se reemplazan por residuos de aminoácido correspondientes del anticuerpo no humano (llamado "retro mutaciones"). Además, las bibliotecas de despliegue de fago se pueden utilizar para variar aminoácidos en posiciones elegidas dentro de la secuencia de anticuerpo. Las propiedades de un anticuerpo humano también son afectadas por la elección de la estructura humana. Además, los anticuerpos humanizados y quimerizados se pueden modificar para comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador, con el objeto de mejorar en forma adicional las propiedades del anticuerpo, tal como por ejemplo, afinidad o función efectora.
Los anticuerpos completamente humanos también se proporcionan en la descripción. El término "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes (si están presentes) derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana, preferentemente secuencias de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo). Sin embargo, el término "anticuerpo humano" no incluye anticuerpos en los cuales las secuencias CDR derivadas de otras especies de mamífero, tal como un ratón, han sido injertadas en las secuencias de estructura humana (por ejemplo, anticuerpos humanizados). Los anticuerpos humanos o completamente humanos pueden ser derivados de ratones transgénicos que llevan los genes de anticuerpo humano (que llevan exones variables (V), de diversidad (D), de unión (J) y constantes (C)) o de células humanas. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que tienen la capacidad, al momento de la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Ver por ejemplo las Publicaciones de Jakobovits y asociados (1993) Proc Nati Acad Sci USA 90.:2551; Jakobovits y asociados (1993) Nature 362:255-258; Bruggemann y asociados (1993) Year in Immunol. 7 33; y Duchosal y asociados (1992) Nature 355:258. Las cepas de ratón transgénico se pueden construir mediante ingeniería para contener secuencias de gen de genes de inmunoglobulina humana no ajustados. Un ejemplo de este ratón es el ratón HuMAb Mouse® (Medarex, Inc.), el cual contiene miniloci de transgen de inmunoglobulina humana que codifica las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada µ y cadena ligera ? humana no reajustadas, junto con mutaciones dirigidas que desactivan el loci de cadena µ y ? endógena. Ver por ejemplo, la Publicación de Lonberg, y asociados (1994) Nature 368(6474) :856-859. La preparación y uso de ratones Hu ab, y las modificaciones genómicas llevadas por dichos ratones, se describen en forma adicional en las Publicaciones de Taylor y asociados (1992) Nucleic Acids Res 20.:6287-6295; Chen, J. y asociados (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon y asociados (1993) Proc Nati Acad Sci USA 90:3720-3724; Choi y asociados (1993) Nature Genetics 4:1 17-123; Tuaillon y asociados (1994) J Immunol 152: 2912-2920; Taylor y asociados (1994) International Immunology 6:579-591; y Fishwild y asociados (1996) Nature Biotechnol 14:845-851. Un sistema de ratón transgénico alternativo para expresión de genes de inmunoglobulina humana es referido como el Xenomouse (Abgenix, Inc.) y se describe por ejemplo en las Patentes Norteamericanas nos. 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584; y 6,162,963. Igual que el sistema HuMAb Mouse®, el sistema Xenomouse implica la interrupción de los genes de cadena pesada y ligera de ratón endógeno y la inserción en el genoma de transgenes de ratón que llevan el loci de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera humana no reajustada que contiene secuencias de región constante y variable humana. Otros sistemas conocidos en la técnica para expresar genes de inmunoglobulina humana incluyen el sistema KM Mouse®, descrito con detalle en la Publicación PCT WO 02/43478 y el sistema de ratón TC descrito en la Publicación de Tomizuka y asociados (2000) Proc Nati Acad Sci USA 9_7:722-727.
Las secuencias humanas pueden codificar tanto para cadenas pesadas como ligeras de anticuerpos humanos, y podrían funcionar correctamente en los ratones, que pasan por reajuste para proporcionar un amplio repertorio de anticuerpo similar al que se encuentra en los humanos. Los ratones transgénicos pueden ser inmunizados con el inmunogen de proteína objetivo para crear una formación diversa de anticuerpos específicos y su ARN de codificación. Los ácidos nucleicos que codifican los componentes de la cadena de anticuerpo de dichos anticuerpos, posteriormente pueden ser clonados del animal en un vector de despliegue. Normalmente, se clonan poblaciones separadas de ácidos nucleicos que codifican secuencias de cadena pesada y ligera, y las poblaciones separadas posteriormente son recombinadas en la inserción en el vector, de modo que cualquier copia de vector recibe una combinación aleatoria de una cadena pesada y una ligera. El vector se diseña para expresar cadenas de anticuerpo de modo que pueden ensamblarse y desplegarse en la superficie externa del paquete de despliegue que contiene el vector. Por ejemplo, las cadenas de anticuerpo pueden ser expresadas como proteínas de fusión con una proteína de recubrimiento de fago de la superficie externa del fago. Posteriormente, los paquetes de despliegue pueden ser seleccionados y clasificados para despliegue de anticuerpos que enlazan a un objetivo.
Además, las bibliotecas de despliegue de fago clasificadas anteriormente pueden incluir anticuerpos humanos (Hoogenboom y asociados (1992) J Mol Biol 227:38 ; Marks y asociados (1991) J Mol Biol 222:581-597; y Vaughan y asociados (1996) Nature Biotech 1_4:309). Se pueden crear bibliotecas de fago sintético que utilizan combinaciones aleatorias de regiones-V de anticuerpo humano sintético. Mediante la selección en el antígeno, los anticuerpos completamente humanos pueden ser elaborados en donde las regiones-V tienen una naturaleza muy parecida a la de humanos. Ver por ejemplo las Patentes Norteamericanas Nos. 6,794, 132; 6,680,209; 4,634,666; y la Publicación de Ostberg y asociados (1983) Hybridoma 2_:361-367, cuyos contenidos totales están incorporados a la presente invención como referencia.
Para la generación de anticuerpos humanos, ver también las Publicaciones de Méndez y asociados (1998) Nature Genetics 1_5: 146-156 y Green y Jakobovits (1998) J Exp Med 188:483-495, cuyas descripciones están incorporadas cada una en su totalidad a la presente invención como referencia. Los anticuerpos humanos posteriormente se describen y delinean en las Patentes Norteamericanas Nos.: 5,939,598; 6,673,986; 6,114,598; 6,075,181; 6,162,963; 6,150,584; 6,713,610; y 6,657,103 asi como en las Publicaciones de Patente Norteamericana Nos. 20030229905 A1, 20040010810 A1, 20040093622 A1 , 20060040363 A1, 20050054055 A1 , 20050076395 A1 y 20050287630 A1. Ver también las Publicaciones Internacionales Nos. WO 94/02602, WO 96/34096, y WO 98/24893, y la Patente Europea No. EP 0 463 151 B1. Las descripciones de cada una de las patentes, solicitudes y referencias antes mencionadas están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.
En un método alternativo, otros, incluyendo GenPharm International, Inc., han utilizado un método de "minilocus". En el método de minilocus, un locus Ig exógeno es mimetizado a través de la inclusión de piezas (genes individuales) del locus Ig. Por lo tanto, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante my, y una segunda región constante (preferentemente una región constante gamma) se forma en una construcción para inserción en un animal. Este método se describe por ejemplo en las Patentes Norteamericanas Nos.: 5,545,807; 5,545,806; 5,625,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; 5,770,429; 5,789,650; y 5,814,318; 5,591,669; 5,612,205; 5,721,367; 5,789,215; 5,643,763; 5,569,825; 5,877,397; 6,300,129; 5,874,299; 6,255,458; y 7,041,871, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. Ver también la Patente Europea No. 0 546 073 B1, las Publicaciones de Patente Internacional Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 y WO 98/24884, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. Ver además las Publicaciones de Taylor y asociados (1992) Nucleic Acids Res 20: 6287; Chen y asociados (1993) Int Immunol 5: 647; Tuaillon y asociados (1993) Proc Nati Acad Sci USA 90: 3720-4; Choi y asociados (1993) Nature Genetics 4: 117; Lonberg y asociados (1994) Nature 368: 856-859; Taylor y asociados (1994) International Immunology 6: 579-591; Tuaillon y asociados (1995) J. Immunol 154: 6453-65; Fishwild y asociados (1996) Nature Biotechnology 14.: 845; y Tuaillon y asociados (2000) Eur J Immunol. 1_0: 2998-3005, cuyas descripciones están incorporadas cada una en su totalidad a la presente invención como referencia.
En ciertas modalidades, las formas desinmunizadas de los anticuerpos, o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos se proporcionan en la presente invención. Los anticuerpos desinmunizados o los fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, son anticuerpos que han sido modificados para convertirlos en el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo no inmunogénico, o menos inmunogénico, para una especie determinada. Se puede lograr la desinmunización modificando el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo utilizando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas para los expertos en el arte (ver por ejemplo, las Publicaciones PCT Nos. WO 04/108158 y WO 00/34317). Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo puede ser desinmunizado identificando epítopes de célula T y/o epítopes de célula B potenciales dentro de la secuencia de aminoácido del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo y eliminando uno o más de los epítopes de célula T y/o epítopes de célula B potenciales del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, por ejemplo, utilizando técnicas recombinantes. El anticuerpo modificado o fragmento de enlace de antígeno del mismo puede ser producido y probado opcionalmente para identificar anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos que han retenido una o más actividades biológicas deseadas, tales como, por ejemplo, afinidad de enlace, pero que tienen inmunogenicidad reducida. Los métodos para identificar los epítopes de célula T y/o epítopes de célula B potenciales pueden llevarse a cabo utilizando técnicas conocidas en el arte, tal como por ejemplo, métodos de cómputo (ver por ejemplo, la Publicación PCT No. WO 02/069232), técnicas in vitro o in silico, y ensayos biológicos y métodos físicos (tal como, por ejemplo, determinación del enlace de péptidos a moléculas MHC, determinación del enlace de péptido: complejos MHC a los receptores de célula T de las especies para recibir el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, probando las partes de proteína o péptido de las mismas utilizando animales transgénicos o moléculas MHC de las especies para recibir el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, o probando con animales transgénicos reconstituidos con células del sistema inmune de la especie para recibir el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, etc.). En varias modalidades, los anticuerpos desinmunizados aquí descritos incluyen los fragmentos de enlace de antígeno desinmunizados, Fab, Fv, scFv, Fab' y F(ab')2, anticuerpos monoclonales, anticuerpos de múrido, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos construidos por ingeniería (tal como, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, de cadena simple, con injerto-CDR, humanizados y seleccionados en forma artificial), anticuerpos sintéticos y anticuerpos semi-sintéticos.
En las modalidades terapéuticas de la presente descripción, los anticuerpos biespecíficos están contemplados. Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales, preferentemente anticuerpos humanos o humanizados que tienen especificidades de enlace para al menos dos diferentes antígenos. En este caso, una de las especificidades de enlace es para C5a, la otra es una para cualquier otro antígeno. Los métodos para elaborar anticuerpos biespecíficos están dentro del alcance de los expertos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de los anticuerpos biespecíficos está basada en la coexpresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en donde los dos pares de cadena pesada/cadena ligera tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello (1983) Nature 305:537-539). Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios que combinan anticuerpos-antígeno) se pueden fusionar a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión de la región variable de cadena pesada está preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo al menos parte de las regiones de articulación, CH2 y CH3. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina, y si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y posteriormente se transfectan en conjunto en un organismo huésped adecuado. Para detalles adicionales de los métodos actualmente conocidos ilustrativos para generar anticuerpos biespecíficos, ver por ejemplo las Publicaciones de Suresh y asociados (1986) Methods in Enzymology 121:210; Publicación PCT No. WO 96/27011; Brennan y asociados (1985) Science 229:81; Shalaby et al, J Exp Med (1992) 1_75: 217-225 ; Kostelny y asociados (1992) J Immunol 148(5): 1547-1553; Hollinger y asociados (1993) Proc Nati Acad Sci USA 90.: 6444-6448 ; Gruber y asociados (1994) J Immunol 152:5368; y Tutt y asociados (1991) J Immunol 147:60. Los anticuerpos biespecíficos también incluyen anticuerpos reticulados o heteroconjugados. Los anticuerpos heteroconjugados pueden ser elaborados utilizando cualesquiera métodos de reticulación convenientes. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica, y se describen en la Patente Norteamericana No. 4,676,980, junto con un número de técnicas de reticulación.
Varias técnicas para elaborar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivo de célula recombinante también han sido descritas. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos han sido producidos utilizando cierres de leucina. Ver por ejemplo la Publicación de Kostelny y asociados (1992) J Immunol 148(5): 1547-1553. Los péptidos de cierre de leucina de las proteínas Fos y Jun se pueden enlazar a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos mediante fusión de gen. Los homodímeros de anticuerpo pueden ser reducidos en la región de articulación para formar monómeros y posteriormente reoxidarse para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede ser utilizado para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger y asociados (1993) Proc Nati Acad Sci USA 90:6444-6448, ha proporcionado un mecanismo alternativo para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) a través de un enlazador el cual es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se forzan a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, para formar de esta manera dos sitios de enlace de antígeno. Otra estrategia para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecífico a través de uso de dímeros Fv de cadena simple (scFv) también ha sido reportada. Ver por ejemplo la Publicación de Gruber y asociados (1994) J Immunol 152:5368. Como alternativa, los anticuerpos pueden ser "anticuerpos lineales" tal como se describe por ejemplo en la Publicación de Zapata y asociados (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062. En síntesis, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd tándem (VH-CH 1 -VH-CH 1 ) que forman un par de regiones de enlace de antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíf icos o monoespecíficos.
Los anticuerpos con más de dos valencias (por ejemplo, anticuerpos triespecíficos) están contemplados y se describen por ejemplo en la Publicación de Tutt y asociados (1991) J Immunol 147:60.
La descripción también abarca formas variantes de anticuerpos multiespecificos tales como moléculas de inmunoglobulina de dominio variable dual (DVD-lg) descritas en la Publicación de Wu y asociados (2007) Nat Biotechnoi 25(11): 1290-1297. Las moléculas DVD-lg están diseñadas de modo que se enlazan en tándem dos diferentes dominios variables de cadena ligera (VL) de dos diferentes anticuerpos de origen, directamente o a través de un enlazador corto mediante técnicas de ADN recombinante, seguido del dominio constante de cadena ligera. En forma similar, la cadena pesada comprende dos diferentes dominios variables de cadena pesada (VH) enlazados en tándem, seguido de la región CHi y Fe de cadena constante. Los métodos para elaborar moléculas DVD-lg de dos anticuerpos de origen, se describen en forma adicional por ejemplo en las Publicaciones PCT Nos. WO 08/024188 y WO 07/024715.
La descripción también proporciona anticuerpos de camélido o dromedario (por ejemplo, anticuerpos derivados de Camelus bactrianus, Calelus dromaderius o lama páceos). Dichos anticuerpos, a diferencia de los anticuerpos típicos de dos cadenas (fragmento) o cuatro cadenas (anticuerpo completo) de la mayor parte de los mamíferos, generalmente carecen de cadenas ligeras. Ver también la Patente Norteamericana no. 5,759,808; y las Publicaciones de Stijlemans y asociados (2004) J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin y asociados (2003) Nature 424:783-788; y Pleschberger y asociados (2003) Bioconjugate Chem 14:440-448. Las bibliotecas construidas por ingeniería de anticuerpos de camélido y fragmentos de anticuerpo están comercialmente disponibles por ejemplo en Ablynx (Ghent, Bélgica). Como con otros anticuerpos de origen no humano, una secuencia de aminoácido de un anticuerpo de camélido puede ser alterada en forma recombinante para obtener una secuencia que se asemeja en forma más cercana a una secuencia humana, por ejemplo, el nanocuerpo puede ser "humanizado" para reducir de esta manera en forma adicional la inmunogenicidad potencial del anticuerpo.
En algunas modalidades, los anticuerpos anti-C5a aquí descritos comprenden una región constante de cadena pesada alterada que tiene función efectora reducida (o no tiene) relativa a su región constante no alterada correspondiente. Las funciones efectoras que implican la región constante del anticuerpo anti-C5a pueden ser moduladas alterando las propiedades de la región Fe o constante. Las funciones efectoras alteradas incluyen, por ejemplo, una modulación en una o más de las siguientes actividades: citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), apoptosis, enlace a uno o más receptores-Fc y respuestas pro-inflamatorias. La modulación se refiere a un incremento, disminución o eliminación de una actividad de función efectora exhibida por un anticuerpo del sujeto que contiene una región constante alterada en comparación con la actividad de la forma no alterada de la región constante. En modalidades particulares, la modulación incluye situaciones en las cuales una actividad es eliminada o está completamente ausente.
Una región constante alterada con afinidad de enlace FcR alterada y/o actividad ADCC y/o actividad CDC alterada, es un polipéptido que tiene ya sea una actividad de enlace FcR aumentada o disminuida y/o actividad ADCC y/o actividad CDC en comparación con la forma no alterada de la región constante. Una región constante alterada que despliega enlace incrementado a una FcR, enlaza al menos a una FcR con mayor afinidad que el polipéptido no alterado. Una región constante alterada que despliega enlace disminuido a una FcR, enlaza al menos a una FcR con menor afinidad que la forma no alterada de la región constante. Dichas variantes que despliegan enlace disminuido a una FcR, pueden poseer poco o ningún enlace apreciable a una FcR, por ejemplo, 0 a 50% (por ejemplo, menos del 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1%) del enlace a la FcR en comparación con el nivel de enlace de una región Fe o constante de inmunoglobulina de secuencia nativa a la FcR. En forma similar, una región constante alterada que despliega actividad ADCC y/o actividad CDC modulada, puede exhibir ya sea actividad ADCC y/o CDC incrementada o reducida en comparación con la región constante no alterada. Por ejemplo, en algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5a que comprende una región constante alterada puede exhibir de aproximadamente 0 a 50% (por ejemplo, menos de 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1%) de la actividad ADCC y/o CDC de la forma no alterada de la región constante. Un anticuerpo anti-C5a aquí descrito, que comprende una región constante alterada que despliega ADCC y/o CDC reducida, puede exhibir actividad ADCC y/o CDC reducida o ninguna actividad de ADCC y/o CDC, tal como se ejemplifica en la presente invención.
En ciertas modalidades, la región constante alterada tiene al menos una sustitución, inserción y/o eliminación de aminoácido, en comparación con una región constante de secuencia nativa o con la región constante no alterada, por ejemplo, de aproximadamente una hasta aproximadamente cien sustituciones, inserciones, y/o eliminaciones de aminoácido en una región constante de secuencia nativa, o en la región constante del polipéptido de origen. En algunas modalidades, la región constante alterada de la presente invención poseerá al menos el 70% de homología (similitud) o identidad con la región constante no alterada, y en algunos casos al menos el aproximadamente 75%, y en otros casos al menos aproximadamente el 80% de homología o identidad, y en otras modalidades al menos aproximadamente el 85%, 90% ó 95% de homología o identidad. La región constante alterada también puede contener una o más eliminaciones o inserciones de aminoácido. Además, la región constante alterada puede contener una o más sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácido que da como resultado las modificaciones post-traducción alteradas, incluyendo, por ejemplo, un patrón de glucosilación alterado (por ejemplo, la adición de uno o más componentes de azúcar, la pérdida de uno o más componentes de azúcar, o un cambio en la composición de uno o más componentes de azúcar en forma relativa a la región constante no alterada).
Los anticuerpos con funciones efectoras alteradas o sin funciones efectoras pueden ser generados construyendo mediante ingeniería o produciendo anticuerpos con regiones constantes, Fe, o de cadena pesada variantes; se puede utilizar tecnología de ADN y/o cultivo celular y condiciones de expresión para producir anticuerpos con función y/o actividad alterada. Por ejemplo, la tecnología de ADN recombinante se puede utilizar para construir mediante ingeniería una o más sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácido en regiones (tales como por ejemplo, regiones Fe o constantes) que afectan la función del anticuerpo, incluyendo las funciones efectoras. Como alternativa, los cambios en las modificaciones post-traducción, tal como, por ejemplo, patrones de glucosilación , se pueden lograr manipulando las condiciones de cultivo celular y expresión a través de las cuales se produce el anticuerpo. Los métodos adecuados para introducir una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones en una región Fe de un anticuerpo son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, técnicas de mutagénesis de ADN estándar tal como se describen por ejemplo en las Publicaciones de Sambrook y asociados (1989) "Clonación Molecular: Manual de Laboratorio, 2° Edición", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Harlow y Lañe (1988), supra, Borrebaek (1992), supra; Johne y asociados (1993), supra; Publicación PCT no. WO 06/53301; y Patente Norteamericana no. 7,704,497.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito exhibe función efectora reducida o no exhibe función efectora. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a comprende una región constante híbrida, o una porción de la misma, tal como una región constante híbrida G2/G4 (ver por ejemplo las Publicaciones de Burton y asociados (1992) Adv Immun 51_:1-18; Canfield y asociados (1991) J Exp Med 73: 1483-1491; y Mueller y asociados (1997) Mo Immunol 34(6):441 -452). Ver anteriormente.
Además de utilizar una construcción G2/G4 tal como se describe anteriormente, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito que tiene función efectora reducida, puede ser producida introduciendo otros tipos de cambios en la secuencia de aminoácido de ciertas regiones del anticuerpo. Dichos cambios de la secuencia de aminoácido se incluyen pero no se limitan a la mutación Ala-Ala descrita por ejemplo en las Publicaciones PCT nos. WO 94/28027 y WO 98/47531; y Xu y asociados (2000) Cell Immunol 200: 16-26. Por lo tanto, en algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a con una o más mutaciones dentro de la región constante que incluyen la mutación Ala-Ala, tiene función efectora reducida o no tiene función efectora. De acuerdo con estas modalidades, la región constante del anticuerpo puede comprender una sustitución a una alanina en la posición 234, o una mutación a una alanina en la posición 235. Además, la región constante alterada puede contener una mutación doble: mutación a una alanina en la posición 234 y una segunda mutación a una alanina en la posición 235. En una modalidad, un anticuerpo anti-C5a comprende una región lgG4, en donde la mutación Ala-Ala puede describir una mutación (s) de fenilalanina a alanina en la posición 234 y/o una mutación de leucina a alanina en la posición 235. En otra modalidad, el anticuerpo anti-C5a comprende una estructura lgG1, en donde la mutación Ala-Ala puede describir una mutación(s) de leucina a alanina en la posición 234 y/o una mutación de leucina a alanina en la posición 235. Un anticuerpo anti-C5a puede llevar otras mutaciones en forma alternativa o adicional, incluyendo la mutación de punta K322A en el dominio CH2 (Hezareh y asociados (2001 ) J Virol 75: 12161-12168). Un anticuerpo con la mutación(s) en la región constante puede además ser un anticuerpo de bloqueo o no bloqueo.
Las sustituciones adicionales, que cuando se introducen en una región constante de cadena pesada, dan como resultado una función efectora disminuida, se establecen por ejemplo en la Publicación de Shields y asociados (2001) J Biol Chem 276191:6591-6604. Ver particularmente la tabla 1 ("enlace de variantes lgG1 humana a FcRn y FcyR humana) de Shields y asociados, cuya descripción está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia. Al clasificar una biblioteca de anticuerpos anti-lgE, cada anticuerpo de la biblioteca difiere por una o más sustituciones en la región constante de cadena pesada, para enlace a un panel de receptores Fe (incluyendo FcRn, FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIIA), los autores identificaron un número de sustituciones que modulan las interacciones de receptor Fc-Fc específicas. Por ejemplo, una región constante de cadena pesada lgG2a variante en la cual el dominio CH2 contiene una sustitución D265A (numeración de aminoácido de cadena pesada de acuerdo con Kabat y asociados (supra)), da como resultado una pérdida de interacción completa entre la región constante variante y los receptores IgG Fe FcyRIIB, FcyRIII, FcyRI y FcyRIV. Shields y asociados (2001 ) en la página 6595, tabla 1. Ver también la Publicación de Baudino y asociados (2008) J Immunol 181 :6664-6669 (supra).
Los cambios dentro de la región de articulación también afectan las funciones efectoras. Por ejemplo, la eliminación de la región de articulación puede reducir la afinidad para los receptores Fe y puede reducir la activación de complemento (Klein y asociados (1981) Proc Nati Acad Sc¡ USA 78.: 524-528). La presente descripción por lo tanto se refiere a anticuerpos con alteraciones en la región de articulación.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a puede contener una región constante alterada que exhibe citotoxicidad dependiente de complemento aumentada o reducida (CDC). La actividad CDC modulada puede lograrse introduciendo una o más sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácido en una región Fe del anticuerpo. Ver por ejemplo la Patente Norteamericana no. 6,194,551. Como alternativa o en forma adicional, el residuo(s) de cisteina puede ser introducido en una región Fe, para permitir de esta forma la formación de un enlace de disulfuro de intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta forma puede tener capacidad de internalización mejorada o reducida y/o aniquilación de célula transmitida por complemento incrementada o disminuida. Ver por ejemplo, las Publicaciones de Carón y asociados (1992) J Exp Med 176: 1191-1195 y Shopes (1992) Immunol 148:2918-2922; publicaciones PCT nos. WO 99/51642 y WO 94/29351; Duncan y Winter (1988) Nature 322:738-40; y Patentes Norteamericanas Nos. 5,648,260 y 5,624,821.
Otro medio potencial para modular la función efectora de los anticuerpos, incluye cambios en glucosilación, que se resumen por ejemplo en la Publicación de Raju (2003) BioProcess International 1 (4):44-53. De acuerdo con la Publicación de Wright y Morrison, la microheterogeneidad de los oligosacáridos IgG humanos puede afectar las funciones biológicas tales como CDC y ADCC, enlazando a varios receptores Fe, y enlazando a la proteína Clq. (1997) TIBTECH 1_5_:26-32. Los patrones de glucosilación de los anticuerpos pueden diferir dependiendo de la producción de células y las condiciones de cultivo celular (Raju, supra). Dichas diferencias pueden conducir a cambios tanto en la función efectora como en las farmacocinéticas. Ver por ejemplo las Publicaciones de Israel y asociados (1996) Immunology 89(4): 573-578; Newkirk y asociados (1996) Clin Exp Immunol 106(2):259-264. Las diferencias en la función efectora pueden estar relacionadas con la capacidad del IgG para enlazar a los receptores Fcy (FcyRs) en las células efectoras. Shields y asociados, ha mostrado que IgG, con alteraciones en la secuencia de aminoácido que han mejorado el enlace a FcyR, pueden exhibir hasta el 100% de ADCC mejorada utilizando células efectoras humanas. (2001 ) J Biol Chem 276(9):6591 -6604. Aunque estas alteraciones incluyen cambios en los aminoácidos no encontrados en la interfase de enlace, tanto la naturaleza del componente de azúcar, como su patrón estructural puede contribuir también a las diferencias observadas. Además, la presencia o ausencia de fucosa en el componente de oligosacárido de un IgG, puede mejorar el enlace y ADCC. Ver por ejemplo la Publicación de Shields y asociados (2002) J Biol Chem 277(30): 26733-26740. Una IgG que carece de un carbohidrato fucosilado enlazado a Asn297, exhibió un enlace de receptor normal para el receptor FcyRI. En contraste, el enlace al receptor FcyRIIIA fue mejorado 50 veces, y estuvo acompañado por una ADCC mejorada, especialmente en concentraciones de anticuerpo inferiores.
Shinkawa y asociados, demostró que un anticuerpo para receptor IL-5 humano producido en un hibridoma de rata, mostró más del 50% de ADCC cuando se comparó con el anticuerpo producido en células de ovario de hámster Chino (CHO) (Shinkawa y asociados (2003) J Biol Chem 278(5 .3466-73). La composición de monosacárido y el perfilado de oligosacárido mostró que el IgG producido por hibridoma de rata tuvo un contenido de fucosa inferior, que la proteína producida mediante CHO. Los autores concluyeron que la carencia de fucosilación de un lgG1 tiene un papel importante en el aumento de la actividad ADCC.
Umana y asociados llevó a cabo un método diferente, quien cambió el patrón de glucosilación de chCE7, un anticuerpo anti-neuroblastoma lgG1 quimérico. (1999) Nat Biotechnol 17(2): 176-180). Utilizando tetraciclina, regularon la actividad de una enzima de glucosiltransferasa (GnTHI), que bisecciona ol igosacáridos que han estado implicados en la actividad ADCC. La actividad ADCC del anticuerpo de origen, tuvo un nivel de fondo muy superior. La medida de la actividad ADCC del chCE7 producida en diferentes niveles de tetraciclina, mostró un rango óptimo de expresión GnTIII para chCE7 máxima en actividad ADCC ¡n vitro. Esta actividad se correlacionó con el nivel de oligosacárido de complejo biseccionado, asociado con región constante. Las variantes recientemente optimizadas exhibieron actividad ADCC sustancial. En forma similar, Wright y Morrison produjeron anticuerpos en una línea de célula CHO con deficiencia en glucosilación, y mostraron que los anticuerpos producidos en esta línea celular no tuvieron la capacidad de citolisis transmitida por complemento (1994) J Exp Med 180: 1087-1096. Por lo tanto, ya que las alteraciones conocidas que afectan la función efectora incluyen modificaciones en el patrón de glucosilación o un cambio en el número de residuos glucosilados, la presente descripción se refiere a un anticuerpo anti-C5a, en donde la glucosilación se altera ya sea para aumentar o disminuir la función(s) efectora incluyendo ADCC y CDC. La glucosilación alterada incluye una disminución o incremento en el número de residuos glucosilados, así como un cambio en el patrón u ubicación de residuos glucosilados.
Existen aún otros métodos para alterar la función efectora de los anticuerpos. Por ejemplo, las células que producen anticuerpo pueden ser hipermutagénicas, para generar de esta forma anticuerpos con residuos de polipéptido alterados en forma aleatoria a lo largo de toda la molécula de anticuerpo. Ver por ejemplo la Publicación PCT no. WO 05/011735. Las células huésped hipermutagénicas incluyen células con deficiencia en la reparación de desacoplamiento de ADN. Los anticuerpos producidos en esta forma pueden ser menos antigénicos y/o tener propiedades farmacocinéticas benéficas. Además, dichos anticuerpos pueden ser seleccionados para propiedades tales como función(s) efectora aumentada o disminuida. Los detalles adicionales de técnicas de biología molecular útiles para preparar un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito, se establecen más adelante.
Expresión y purificación de anticuerpo recombinante Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos aquí descritos, pueden producirse utilizando una variedad de técnicas conocidas en el arte de la biología molecular y la química de proteínas. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica uno o ambos de los polipéptidos de cadena pesada y ligera de un anticuerpo, se puede insertar en un vector de expresión que contiene secuencias reguladoras de transcripción y traducción, que incluyen, por ejemplo, secuencias promotoras, sitios de enlace ribosomal, secuencias de inicio y detención de transcripción, secuencias de inicio y detención de traducción, señales terminadoras de transcripción, señales de poliadenilación y secuencias aumentadoras o activadoras. Las secuencias reguladoras incluyen secuencias de inicio y detención promotoras y de transcripción. Además, el vector de expresión puede incluir más de un sistema de réplica, de modo que se pueda mantener en dos diferentes organismos, por ejemplo, en células de mamífero o insecto para expresión y en un huésped procariótico para clonación y amplificación.
Están disponibles diversos sistemas de vector posibles para la expresión de polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada clonados de ácidos nucleicos en células de mamífero.
Una clase de vectores depende de la integración de las secuencias de gen deseada en el genoma de célula huésped. Las células que tienen ADN integrado en forma estable, pueden ser seleccionados introduciendo en forma simultánea genes con resistencia a fármacos tales como E. coli gpt (Mulligan y Berg (1981) Proc Nati Acad Sci USA 7_8:2072) o Tn5 neo (Southern y Berg (1982) Mol Appl Genet 1:327). El gen marcador seleccionable puede estar ya sea enlazado a las secuencias de gen de ADN para ser expresado, o introducirse en la misma célula mediante co-transfección (Wigler y asociados (1979) Cell 1_6:77). Una segunda clase de vectores utiliza elementos de ADN que confieren capacidades de réplica autónoma para un plásmido extracromosomal. Estos vectores pueden ser derivados de virus de animal, tal como papilomavirus de bovino (Sarver y asociados (1982) Proc Nati Acad Sci USA, 79:7147), citomega lovirus, virus de polioma (Deans y asociados (1984) Proc Nati Acad Sci USA 8J_: 1292), o virus SV40 (Lusky y Botchan (1981) Nature 293:79).
Los vectores de expresión pueden ser introducidos en células en una forma adecuada para la expresión subsecuente de ácido nucleico. El método de introducción está dictado en gran parte por el tipo de célula dirigida, como se describe más adelante. Los métodos de ejemplo incluyen precipitación de CaP04, fusión de liposoma, liposomas catiónicos, electroporación, infección viral, transfección transmitida por dextrano, transfección transmitida por polibreno, fusión de protoplasto y microinyección directa.
Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos incluyen célula de levadura, bacteria, insecto, planta y mamíferos. De interés particular son bacterias tales como E. coli, hongos tales como Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris, células de insecto tale como SF9, líneas de célula de mamífero (por ejemplo, líneas de célula humana), así como líneas de célula primaria.
En algunas modalidades, un anticuerpo o fragmento del mismo puede expresarse en, y purificarse de animales transgénicos (por ejemplo, mamíferos transgénicos). Por ejemplo, un anticuerpo puede ser producido en mamíferos no humanos transgénicos (por ejemplo, roedores) y aislados de leche tal como se describe por ejemplo en las Publicaciones de Houdebine (2002) Curr Opin Biotechnol 13(6):625-629; van Kuik-Romeijn y asociados (2000) Transgenic Res 9(2): 155-159; y Pollock y asociados (1999) J Immunol Methods 231 (1-2)147-157.
Los anticuerpos y fragmentos de los mismos se pueden producir a partir de células, cultivando una célula huésped transformada con el vector de expresión que contiene el ácido nucleico que codifica los anticuerpos o fragmentos, bajo condiciones y durante una cantidad de tiempo suficiente para permitir la expresión de las proteínas. Dichas condiciones para expresión de proteína variarán con la elección del vector de expresión y la célula huésped, y serán fácilmente confirmadas por un experto en la técnica a través de experimentación de rutina. Por ejemplo, los anticuerpos expresados en E. coli pueden ser redoblados de cuerpos de inclusión (ver por ejemplo, la Publicación de Hou y asociados (1998) Cytokine 1_0:319-30). Los sistemas de expresión bacteriana y los métodos para su uso son conocidos en la técnica (ver la Publicación de Protocolos Actuales en Biología Molecular, Wiley & Sons, y Clonación Molecular—Manual de Laboratorio 3o Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (2001 )). La elección de codones, vectores de expresión adecuados y células huésped adecuadas variará dependiendo de un número de factores, y pueden ser fácilmente optimizados, según sea necesario. Un anticuerpo (o fragmento del mismo) aquí descrito puede ser expresado en células de mamífero o en otros sistemas de expresión incluyendo pero sin limitarse a levadura, baculovirus y sistemas de expresión in vitro (ver por ejemplo, la Publicación de Kaszubska y asociados (2000) Protein Expression and Purification 18:2 3-220).
Después de la expresión, los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden ser aislados. El término "purificado" o "aislado" tal como aplica para cualesquiera de las proteínas (anticuerpos o fragmentos) aquí descritos, se refiere a un polipéptido que ha sido separado o purificado de componentes (por ejemplo, proteínas u otras moléculas orgánicas o biológicas que ocurren naturalmente), los cuales las acompañan naturalmente, por ejemplo, otras proteínas, lípidos y ácido nucleico en procariotos que expresan las proteínas. Normalmente, un polipéptido es purificado cuando constituye al menos el 60 (por ejemplo, al menos el 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, o 99) % en peso de la proteína total en una muestra.
Un anticuerpo o fragmento del mismo puede ser aislado o purificado de una variedad de formas conocidas para los expertos en la técnica, dependiendo de que otros componentes están presentes en la muestra. Los métodos de purificación estándar incluyen técnicas electroforéticas moleculares inmunológícas y cromatográficas, incluyendo cromatografía de intercambio de iones, hidrofóbica, de afinidad y HPLC de fase inversa. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser purificado utilizando una columna de anticuerpo estándar (por ejemplo, una columna de proteína-A o proteína-G). También son útiles técnicas de ultrafiltración y díafiltración, junto con concentración de proteína. Ver por ejemplo la Publicación de Scopes (1994) "Purificación de Proteína, 3o edición" "Springer-Verlag, Ciudad de Nueva York, Nueva York". El grado de purificación necesario, variará dependiendo del uso deseado. En algunos casos, no será necesaria purificación del anticuerpo expresado o fragmentos del mismo.
Los métodos para determinar el rendimiento o pureza de un anticuerpo purificado o fragmento del mismo, son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo ensayo de Bradford, espectroscopia UV, ensayo de proteína de Biuret, ensayo de proteína de Lowry, ensayo de proteína negra amido, cromatografía líquida de alta presión (HPLC), espectrometría de masa (MS) y métodos electroforéticos de gel (por ejemplo, utilizando un manchado de proteína tal como Coomassie Blue o manchado de plata coloidal).
En algunas modalidades, la endotoxina puede ser eliminada de los anticuerpos o fragmentos. Los métodos para eliminar la endotoxina de una muestra de proteína son conocidos en la técnica y se ejemplifican en los ejemplos de operación. Por ejemplo, la endotoxina puede ser eliminada de una muestra de proteína utilizando una variedad de reactivos comercialmente disponibles incluyendo sin limitación los Equipos de Eliminación de Endotoxina ProteoSpin™ (Norgen Biotek Corporation), Gel de Eliminación de Endotoxina Detoxi-Gel (Thermo Scientific; Pierce Protein Research Products), Equipo de Eliminación de Endotoxina MiraCLEAN® (Mirus), o Membrana Acrodisc™ - Mustang® E (Pall Corporation).
Los métodos para detectar y/o medir la cantidad de endotoxina presente en una muestra (tanto antes como después de la purificación) son conocidos en la técnica y están disponibles equipos comerciales. Por ejemplo, la concentración de endotoxina en una muestra de proteína puede determinarse utilizando el equipo Cromogénico QCL-1000 (BioWhittaker), los equipos a base de lisado de amebocito limulus (LAL) tal como los equipos Pyrotell®, Pyrotell®-T, Pyrochrome®, Chromo-LAL y CSE disponibles en Associates of Cape Cod Incorporated.
Sin pretender quedar limitados, los métodos de éjemplo para eliminar los anticuerpos aquí descritos se establecen en los Ejemplos de operación.
Modificación de los Anticuerpos o Fragmentos de Enlace de Antíqeno de los Mismos Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos pueden ser modificados después de su expresión y purificación. Las modificaciones pueden ser modificaciones covalentes o no covalentes. Dichas modificaciones pueden introducirse en los anticuerpos o fragmentos mediante, por ejemplo, la reacción de residuos de aminoácido dirigidos del polipéptido con un agente de derivación orgánica que tiene la capacidad de reaccionar con cadenas laterales o residuos terminales seleccionados. Los > sitios adecuados para modificación pueden elegirse utilizando cualquiera de una variedad de criterios incluyendo, por ejemplo, análisis estructural o análisis de secuencia de aminoácido de los anticuerpos o fragmentos.
En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos se pueden conjugar a una porción heteróloga. La porción heteróloga puede ser, por ejemplo, un polipéptido heterólogo, un agente terapéutico (por ejemplo, una toxina o un fármaco) o una etiqueta detectable tal como pero sin limitarse a, una etiqueta radioactiva, una etiqueta enzimática, una etiqueta fluorescente, una etiqueta de metal pesado, una etiqueta luminiscente, o una etiqueta de afinidad tal como biotina o estreptavidina. Los polipéptidos heterólogos adecuados incluyen, por ejemplo, una etiqueta antigénica (por ejemplo, FLAG (DYKDDDDK (SEC ID NO:50)), polihistidina (6-His; HHHHHH (SEC ID NO:81), hemaglutinina (HA; YPYDVPDYA (SEC ID NO:82)), glutationa-S-transferasa (GST), o proteína de enlace-maltosa (MBP)) para utilizarse en la purificación de los anticuerpos o fragmentos. Los polipéptidos heterólogos también incluyen polipéptidos (por ejemplo, enzimas) que son útiles como marcadores de diagnóstico detectables, por ejemplo, luciferasa, una proteína fluorescente (por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP)), o acetil transferasa de cloranfenicol (CAT). Las etiquetas radiactivas adecuadas por ejemplo 32P, 33P, 4C, 125l, 131l, 35S y 3H. Las etiquetas fluorescentes adecuadas incluyen, sin limitación fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), proteína fluorescente verde (GFP), DyLight™ 488, picoeritrina (PE), yoduro de propidio (Pl), PerCP, PE-Alexa Fluor® 700, Cy5, alopicocianina y Cy7. Las etiquetas luminiscentes incluyen por ejemplo cualquiera de una variedad de quelatos de lantanida luminiscente (por ejemplo, europio o terbio). Por ejemplo, los quelatos de uropio adecuados incluyen el quelato de europio de ácido dietileno triamina pentaacético (DTPA) o ácido tetraazaciclododecano-1 ,4,7, 10-tetraacético (DOTA). Las etiquetas enzimáticas incluyen por ejemplo, fosfatasa alcalina, CAT, luciferasa y peroxidasa de rábano.
Dos proteínas (por ejemplo, un anticuerpo y una porción heteróloga) pueden ser reticulados utilizando cualquiera de un número de reticuladores químicos conocidos. Los ejemplos de dichos reticuladores son los que enlazan dos residuos de aminoácido a través de una ligadura que incluye un enlace de disulfuro "obstaculizada". En estas ligaduras, un enlace de disulfuro dentro de la unidad de reticulación está protegido (por ejemplo obstaculizados grupos en cualquier lado de enlace de disulfuro) contra la reducción por la acción, por ejemplo, de glutationa reducida o la reductasa de disulfuro de la enzima. Un reactivo adecuado, tolueno de 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a (2-pi rid i Id itio) (SMPT), forma dicha ligadura entre dos proteínas utilizando una Usina terminal en una de las proteínas, y una cisteína terminal en la otra. También se pueden utilizar reactivos heterobifuncionales que reticulan a través de una diferente porción de acoplamiento en cada proteína. Otros reticuladores útiles incluyen, sin limitación, reactivos que enlazan dos grupos amino (por ejemplo, N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida), dos grupos sulfhidrilo (por ejemplo, 1 ,4-bis-maleimidobutano), un grupo amino y un grupo sulfhidrilo (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida), un grupo amino y un grupo carboxilo (por ejemplo, 4-[p-azidosalicilamido]butilam¡na), un grupo amino y un grupo guanidinio que está presente en la cadena lateral de arginina (por ejemplo, monohidrato de glioxal de p-azidofenilo).
En algunas modalidades, una etiqueta radioactiva puede ser conjugada directamente al esqueleto del aminoácido del anticuerpo. Como alternativa, la etiqueta radioactiva puede estar incluida como parte de una molécula mayor (por ejemplo, 125l en meta-[ 25l]yodofenil-N-hidroxisuccinimida ([125l]mlPNHS) que enlaza a grupos amino libres para formar derivados de meta-yodofenilo (mlP) de proteínas relevantes (ver por ejemplo, la Publicación de Rogers y asociados (1997) J Nucí Med 38. 1221-1229) o quelato (por ejemplo, para DOTA o DTPA) que a su vez se enlaza al esqueleto de proteína. Los métodos para conjugar las etiquetas radioactivas o moléculas/q uelatos más grandes que los contienen para los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno aquí descritos, son conocidos en la técnica. Dichos métodos implicar incubar las proteínas con la etiqueta radioactiva bajo condiciones (por ejemplo, pH, concentración de sal y/o temperatura) que facilitan el enlace de la etiqueta radioactiva o quelato a la proteína (ver, por ejemplo la Patente Norteamericana No. 6,001,329).
Los métodos para conjugar una etiqueta fluorescente (algunas veces referidas como un "fluoroforo") para una proteína (por ejemplo, un anticuerpo) son conocidos en la técnica de la química de proteínas. Por ejemplo, los fluoroforos pueden ser conjugados a grupos amino libres (por ejemplo, de Usinas) o grupos sulfhidrilo (por ejemplo, cisternas) de proteínas utilizando éster de succinimidilo (NHS) o porciones de éster de tetrafluorofenilo (TFP) adheridas a los fluoroforos. En algunas modalidades, los fluoroforos pueden ser conjugados para una porción reticuladora heterobifuncional, tal como sulfo-SMCC. Los métodos de conjugación adecuados implican incubar una proteína de anticuerpo, o fragmento de la misma, con un fluoroforo bajo condiciones que facilitan el enlace del fluoroforo a la proteína. Ver por ejemplo la Publicación de Welch y Redvanly (2003) "Manual de Radio farmacéuticas: Radioquímica y Aplicaciones", John Wiley y Sons (ISBN 0471495603).
En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos pueden ser modificados, por ejemplo, con una porción que mejora la estabilización y/o retención de los anticuerpos en la circulación, por ejemplo, en sangre, suero u otros tejidos. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento puede ser PEGilado tal como se describe por ejemplo en las Publicaciones de Lee y asociados (1999) Bioconjug Chem 10(6): 973-8; Kínstler y asociados (2002) Advanced Drug Deliveries Reviews 54:477-485; y Roberts y asociados (2002) Advanced Drug Delivery Reviews 5_4:459-476 o HESylated (Fresenius Kabi, Alemania; ver por ejemplo, la Publicación de Pavisic y asociados (2010) Int J Pharm 387(1 -2): 110-119). La porción de estabilización puede mejorar la estabilidad o retención del anticuerpo (o fragmento) en al menos 1.5 (por ejemplo, al menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 ó 50 o more) veces.
En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos aquí descritos pueden ser glucosilados. En algunas modalidades, un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito puede ser sometido a tratamiento enzimático o químico, o producirse de una célula, de modo que el anticuerpo o fragmento tenga glucosilación reducida o no tenga g I ucosi I ación . Los métodos para producir anticuerpos con glucosilación reducida son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en la Patente Norteamericana no. 6,933,368; Wright y asociados (1991) EMBO J 10( 10 2717-2723: y en las Publicaciones de Co y asociados (1993) Mol Immunol 30: 361.
Composiciones farmacéuticas Las composiciones que contienen un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito se pueden formular como un composición farmacéutica, por ejemplo, para administración a un sujeto para el tratamiento o prevención de un trastorno asociado con complemento. Las composiciones farmacéuticas generalmente incluirán un transportador farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en la presente invención, un "transportador farmacéuticamente aceptable" se refiere a, e incluye cualesquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de retraso de absorción e isotónicos y similares que sean fisiológicamente compatibles. Las composiciones pueden incluir una sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo una sal de adición de ácido o sal de adición base (ver por ejemplo la Publicación de Berge y asociados (1977) J Pharm Sci 66.: 1-19).
Las composiciones se pueden formular de acuerdo con métodos estándar. La formulación farmacéutica es una técnica bien establecida, y se describe en forma adicional por ejemplo en la Publicación de Gennaro (2000) "Remington: Ciencia y Práctica de Farmacia", edición 20, Lippincott, Williams & Wilkins (ISBN: 0683306472); Ansel y asociados (1999) "Formas de Dosificación Farmacéutica y Sistemas de Suministro de Fármaco", 7° Edición, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (ISBN: 0683305727); y Kibbe (2000) "Manual de la Asociación Farmacéutica Americana de Excipientes Farmacéuticos" 3o Edición (ISBN: 091733096X). En algunas modalidades, se puede formular una composición, por ejemplo, como una solución amortiguada en una concentración adecuada y adecuada para almacenarse a una temperatura de 2 a 8°C (por ejemplo, 4°C). En algunas modalidades, una composición puede ser formulada para almacenamiento a una temperatura de bajo de 0° (por ejemplo, -20°C o -80°C). En algunas modalidades, la composición puede ser formulada para almacenamiento durante hasta 2 años (por ejemplo, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses, 10 meses, 11 meses, 1 año, año y medio, o 2 años) a una temperatura de 2 a 8°C (por ejemplo, 4°C). Por lo tanto, en algunas modalidades, las composiciones aquí descritas son estables en almacenamiento durante al menos 1 año a una temperatura de 2 a 8°C (por ejemplo, 4°C).
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en una variedad de formas. Estas formas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquida, semi-sólida y sólida, tal como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende, en parte, del modo de administración proyectado y la aplicación terapéutica. Por ejemplo, las composiciones que contienen un anticuerpo o fragmento proyectado para suministro sistémico o local puede estar en la forma de soluciones inyectables o infusibles. Por consiguiente, las composiciones se pueden formular para administración a través de un modo parenteral (por ejemplo, inyección intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, o intramuscular). La frase "administración parenteral", "administrado en forma parenteral" y otras frases gramaticalmente equivalentes, tal como se utiliza en la presente invención, se refieren a modos de administración además de administración entérica o tópica, normalmente mediante inyección, e incluyen sin limitación inyección e infusión intravenosa, intranasal, intraocular, intramuscular, intraarterial , intratecal, intracapsular, i ntraorbital , i ntracard íaca , intradérmica, intraperitoneal , transtraqueal , subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural, intracerebral, intracraneal, intracarótida e i ntraesternal .
Las composiciones se pueden formular como una solución, microemulsion, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para almacenamiento estable en una alta concentración. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) aquí descrito en la cantidad requerida en un solvente adecuado con una o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente tal como se requiera seguir de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando un anticuerpo o fragmento aquí descrito en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación incluyen secado al vacío y secado por congelación que produce un polvo de un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se describe en forma adicional, más cualquier ingrediente deseado adicional (ver más adelante) de una solución filtrada estéril previamente del mismo. La fluidez adecuada de una solución se puede mantener, por ejemplo, a través del uso de un recubrimiento tal como lecitina, a través del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y a través del uso de tensoactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede proporcionarse incluyendo en la composición, un reactivo que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Los anticuerpos anti-C5a, o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, aquí descritos, también se pueden formular en composiciones de inmunoliposoma. Los liposomas que contienen el anticuerpo se pueden preparar a través de métodos conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, los métodos descritos en las Publicaciones de Epstein y asociados (1985) Proc Nati Acad Sci USA 8_2.:3688; Hwang y asociados (1980) Proc Nati Acad Sci USA 77.:4030; y en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,485,045 y 4,544,545. Los liposomas con el tiempo de circulación mejorado se describen por ejemplo en la Patente Norteamericana No. 5,013,556.
En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo se puede preparar con un transportador que protegerá el compuesto contra liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulado. Se pueden utilizar polímeros biodegradables o biocompatibles, tal como acetato de vinil etileno, polianhídridos, ácido poliglucólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones son conocidos en la técnica. Ver por ejemplo la Publicación de J.R. Robinson (1978) "Sistemas de Suministro de Fármaco de Liberación Sostenida y Controlada" Marcel Dekker, Inc., Nueva York.
En algunas modalidades, un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno aquí descrito se puede formular en una composición adecuada para administración intrapulmonar (por ejemplo, para administración mediante nebulizador, ver más adelante) a un mamífero, tal como un humano. Los métodos para preparar dichas composiciones son bien conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana no. 20080202513; las Patentes Norteamericanas nos. 7,112,341 y 6,019,968; y en las Publicaciones de Solicitud PCT nos. WO 00/061178 y WO 06/122257, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. Las formulaciones de inhalador de polvo seco y los sistemas adecuados para administración de las formulaciones se describen por ejemplo en la Publicación de Solicitud Patente Norteamericana no. 20070235029, la Publicación PCT No. WO 00/69887; y en la Patente Norteamericana no. 5,997,848.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito, se puede formular en una composición adecuada para suministro a los ojos. En algunas modalidades, uno o más de los anticuerpos anti-C5a (o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos) aquí descritos se puede administrar en forma local, por ejemplo por medio de aplicación tópica o inyección intra vitrea. Por ejemplo, en algunas modalidades, los anticuerpos anti-C5a se pueden formular para administración por medio de una gota para los ojos.
La preparación terapéutica para tratar los ojos puede contener uno o más de los anticuerpos anti-C5a en una concentración de aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 1% en peso, preferentemente de aproximadamente 0.05 hasta aproximadamente 0.5% en una solución, suspensión o ungüento farmacéuticamente aceptable. La preparación estará preferentemente en la forma de una solución acuosa estéril que contiene por ejemplo, ingredientes adicionales, tales como, pero son limitarse a conservadores, amortiguadores, agentes de tonicidad, antioxidantes y estabilizadores, agentes de humectación o clarificación no iónicos, y agentes que incrementan la viscosidad.
Los conservadores adecuados para utilizarse en dicha solución incluyen cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, clorobutanol, timerosal y similares. Los amortiguadores adecuados incluyen, por ejemplo, ácido borónico, bicarbonato de sodio y potasio, boratos de sodio y potasio, carbonato de sodio y potasio, acetato de sodio y bifosfato de sodio en cantidades suficientes para mantener el pH entre aproximadamente pH 6 y pH 8, y preferentemente, entre aproximadamente pH 7 y pH 7.5. Los agentes de tonicidad adecuados son dextrano 40, dextrano 70, dextrosa, glicerina, cloruro de potasio, propilenglicol, y cloruro de sodio.
Los antioxidantes y estabilizadores adecuados incluyen bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, tiosulfito de sodio, y tiourea. Los agentes de humectación y clarificación adecuados incluyen polisorbato 80, polisorbato 20, poloxamer 282 y tiloxapol. Los agentes de incremento de viscosidad adecuados incluyen dextrano 40, dextrano 70, gelatina, glicerina, hidroxietilcelulosa, hidroxmetilpropilcelulosa, lanolina, metilcelulosa, petrolato, polietilenglicol, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, y carboximetilcelulosa. La preparación se puede administrar en forma tópica a los ojos del sujeto que necesita del tratamiento (por ejemplo, un sujeto que padece de AMD) a través de métodos convencionales, por ejemplo, en la forma de gotas, o bañando el ojo en una solución terapéutica que contiene uno o más anticuerpos anti-C5a.
Además, se han desarrollado una variedad de dispositivos para introducir fármacos en la cavidad vitrea del ojo. Por ejemplo, la Publicación de solicitud de Patente Norteamericana No. 20020026176 describe un tapón que contiene un farmacéutico que se puede insertar a través de la esclera, de modo que proteja la cavidad vitrea para el suministro de agente farmacéutico en la cavidad vitrea. En otro ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,443,505 describe un dispositivo implantable para la introducción en un espacio supracoroidal o una región avascular para la liberación sostenida de fármaco en la parte interior del ojo. Las Patentes Norteamericanas Nos.. 5,773, 019 y 6,001,386 cada una describen un dispositivo de suministro de fármaco implantable adherible a la superficie escleral de un ojo, el dispositivo comprende un centro interno que contiene una cantidad efectiva de un agente de baja solubilidad cubierto por un polímero no bioerosionable que es permeable para el agente de baja solubilidad. Durante operación, el agente de baja solubilidad permea la cubierta del polímero bioerosionable durante la liberación sostenida del dispositivo. Se describen métodos y dispositivos adicionales (por ejemplo, un parche transesclaral y el suministro por medio del lente de contactos) para el suministro de un agente terapéutico a los ojos, por ejemplo en las Publicaciones de Ambati y Adamis (2002) Prog Retin Eye Res 21(2): 145-151; Ranta y Urtti (2006) Adv Drug Delivery Rev 58(11 ): 1164-1181; Barocas y Balachandran (2008) Expert Opin Drug Delivery 5(1 ): 1-10(10); Guisen y Chauhan (2004) Invest Optalmol Vis Sci 45:2342-2347; Kim y asociados, (2007) Ophtalmic Res 39:244-254; y Publicación PCT No. WO 04/073551, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.
Los ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo (o un fragmento de enlace de antígeno del mismo) se pueden incorporar en una construcción que será utilizada como una parte de un protocolo de terapia de gen para suministrar ácidos nucleicos que se pueden utilizar para expresar y producir agentes dentro de células (ver más adelante). Se pueden administrar construcciones de expresión de dichos componentes en cualquier transportador terapéuticamente efectivo, por ejemplo, cualquier formulación o composición con la capacidad de suministrar en forma efectiva el gen componente a las células in vivo. Los métodos incluyen inserción del gen del sujeto en vectores virales que incluyen retroviruses recombinantes, adenovirus, virus asociado-adeno, lentivirus, y virus de herpes simple-1 (HSV-1), o plásmidos bacterianos o eucarióticos recombinantes. Los vectores virales pueden transfectar células directamente; se puede suministrar ADN de plásmido con la ayuda, por ejemplo de liposomas catiónicos (lipofectina) o derivados (por ejemplo, conjugado por anticuerpo), conjugados por polilisina, gramicidina S, envolturas virales artificiales u otros transportadores intracelulares, así como inyección directa de la construcción de gen o precipitación CaP04 (ver, por ejemplo, WO04/060407) que se lleva a cabo in vivo. (Ver también "Métodos Ex Vivo", que se encuentra más adelante). Los ejemplos de retroviruses adecuados incluyen pLJ, pZIP, pWE y pEM que son conocidos para los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, las Publicaciones de Eglitis y asociados, (1985) Science 230: 1395-1398; Danos y Mulligan (1988) Proc Nati Acad Sci USA 85:6460-6464; Wilson y asociados, (1988) Proc Nati Acad Sci USA 85_:3014-3018; Armentano y asociados, (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber y asociados, (1991) Proc Nati Acad Sci USA 88.: 8039-8043 ; Ferry y asociados, (1991) Proc Nati Acad Sci USA 88:8377-8381; Chowdhury y asociados, (1991) Science 254: 1802-1805; van Beusechem y asociados, (1992) Proc Nati Acad Sci USA 89:7640-7644; Kay y asociados, (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai y asociados, (1992) Proc Nati Acad Sci USA 89_: 10892-10895; Hwu y asociados, (1993) J Immunol.150:4104-4115: Patentes Norteamericanas Nos. 4,868,116 y 4,980,286; Publicaciones PCT Nos. WO89/07136, WO89/02468, WO89/05345, y WO92/07573). Otro sistema de suministro de gen viral utiliza vectores derivados de adenovirus (ver, por ejemplo, las Publicaciones de Berkner y asociados, (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld y asociados, (1991) Science 252:431 -434; y Rosenfeld y asociados, (1992) Cell 6_8:143-155). Los vectores adenovirales adecuados derivados de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 d1324 u otras cepas de adenovirus (por ejemplo, Ad2, Ad3, Ad7, etc) son conocidas para los expertos en la técnica. Otro sistema de vector viral útil para el suministro del gen de sujeto es el virus asociado-adeno (AAV). Ver, por ejemplo, las Publicaciones de Flotte y asociados, (1992) Am J Respir Cell Mol Biol 7:349-356; Samulski y asociados, (1989) J Virol 63:3822-3828; y McLaughlin y asociados, (1989) J Virol 62: 1963-1973.
En algunas modalidades, un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, aquí descritos se puede formular con uno o más agentes activos adicionales útiles para tratar o prevenir un trastorno asociado con complemento en un sujeto. Los agentes adicionales para tratar un trastorno asociado con complemento en un sujeto variarán dependiendo del trastorno particular que este siendo tratado, pero puede incluir sin limitación, un anti-hipertensión (por ejemplo, un inhibidor de enzimas de conversión de angiotensina) , un anticoagulante, un corticoesteroide (por ejemplo, prednisona), o un agente inmunosupresor (por ejemplo, vincristina o ciclosporina A), los ejemplos de anticoagulantes incluyen, por ejemplo, warfarina (Coumadin), heparina, fenindiona, fondaparinux, idraparinux, e inhibidores de trombina (por ejemplo, argatroban, lepirudin, bivalirudin, o dabigatran). Un anticuerpo o fragmento del mismo aquí descrito también se puede formular como un agente fibronolítico (por ejemplo, ancrod, ácido e-aminocaproico acid, antiplasm¡n-ai , prostaciclina, y def ibrotida) para el tratamiento de un trastorno transmitido por complemento. En algunas modalidades, se puede formular un anticuerpo con un agente que disminuye los lípidos tal como un inhibidor de reductasa de hidroximetilglutarilo CoA. En algunas modalidades, se puede formular un anticuerpo con, o para utilizarse con un agente anti-CD20 tal como rituximab (Rituxan™; Biogen Idee, Cambridge, MA). En algunas modalidades, por ejemplo, para el tratamiento de RA, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo se puede formular con uno o ambos de infliximab (Remicade®; Centocor, Inc.) y metotrexato (Rheumatrex®, Trexall®). En algunas modalidades, un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito se puede formular con un fármaco anti-inflamatorio no esteroidal (NSAID). Están disponibles muchos diferentes NSAIDS, algunos incluyendo ibuprofeno (Advilo ®, Motrin®, Nuprin ®) y naproxeno (Alleve®) y muchos otros que están disponibles mediante prescripción incluyendo meloxicam (Mobic®), etodolac (Lodine®), nabumetona (Relafen®), sulindac (Clinoril®), tolementin (Tolectin®), salicilato de magnesio de colina (Trilasate®) , diclofenaco (Cataflam®, Voltaren®, Artrotec®), Diflusinal (Dolobid®), indometicina (Indocin®), Ketoprofeno (Orudis®, Oruvail®), oxaprozina (Dayprd®), y piroxicam (Feldene®).' En algunas modalidades un anticuerpo o un fragmento del mismo se puede formular para utilizarse con un agente anti-hipertensión , un agente anti-mareos (por ejemplo, sulfato de magnesio), o un agente anti-trombótico. Los anti-hipertensores incluyen, por ejemplo, labetalol, hidralazina, nifedipina, antagonistas del canal de calcio, nitroglicerina, o nitroprusiato de sodio. Ver por ejemplo, la Publicación de Mihu y asociados, (2007) J Gasrointestin Liver Dis 16(4) :419-424. Los agentes anti-trombóticos incluyen, por ejemplo, heparina, antitrombina, prostaciclina, o aspirina de dosis baja.
En algunas modalidades, un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo se puede formular para administración a un sujeto con terapia de inmunoglobulina gamma intravenosa (IVIG), plasmaferesis, o intercambio de plasma. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo se puede formular para utilizarse antes, durante o después de trasplante de riñon.
Cuando un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo se utilizará en combinación con un segundo agente activo, los agentes se pueden formular por separado o juntos. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas respectivas se pueden mezclar, por ejemplo, justo antes de la administración, y administrarse juntas o se pueden administrar por separado, por ejemplo, al mismo tiempo o en tiempos diferentes (ver más adelante) .
Tal como se describió anteriormente, se puede formular una composición de modo que incluya una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-C5a o un fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito. En algunas modalidades, una composición se puede formular para incluir una cantidad sub-terapéutica del anticuerpo (o fragmento) y a una cantidad-sub-terapéutica de uno o más agentes activos adicionales de modo que los componentes en total sean terapéuticamente efectivos para tratar o prevenir un trastorno asociado con complemento. Los métodos para determinar una dosis terapéuticamente efectiva de un agente tal como un anticuerpo terapéutico son conocidos en la técnica y se describen en la presente invención.
Aplicaciones Los anticuerpos, fragmentos de enlace de antígenos de los mismos, conjugados y composiciones de cualesquiera de los anteriores, se pueden utilizar en una cantidad de aplicaciones de diagnostico y terapéuticas. Por ejemplo, los anticuerpos anti-C5a etiquetados en forma detectable (por ejemplo, anticuerpos C5a anti-humano o anticuerpos C5a anti-ratón) se pueden utilizar en ensayos para detectar la presencia o cantidad de C5a presente en una muestra biológica. La determinación de la cantidad de C5a en una muestra, por ejemplo, una muestra de sangre del paciente, puede ser útil para evaluar el nivel de activación de complemento en la muestra. Los métodos adecuados para utilizar los anticuerpos en ensayos de diagnóstico son conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, ELISA, aplicaciones de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, manchado Western o técnicas de manchado de punto. Ver por ejemplo las Publicaciones de Sambrook y asociados, supra y Ausubel y asociados, supra.
En algunas modalidades, los anticuerpos y fragmentos enlace de antígeno aquí descritos, se pueden utilizar como controles positivos en ensayos diseñados para identificar compuestos novedosos adicionales para tratar trastornos transmitidos por complemento. Por ejemplo, un anticuerpo anti-C5a que inhibe la actividad C5a se puede utilizar como un control positivo en un ensayo para identificar compuestos adicionales (por ejemplo, moléculas pequeñas, aptámeros, o anticuerpos) que inhiben C5a o una señalización de receptor C5a dependiente de C5a.
En algunas modalidades, los anticuerpos anti-C5a de reacción cruzada o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos (por ejemplo, reaccionan en forma cruzada con C5a humana y, por ejemplo, C5a de macaco cinomolgo) aquí descritos, se pueden utilizar para pruebas pre-clínicas en mamíferos no humanos, por ejemplo, estudios farmacocinéticos o farmacodinámicos en primates no humanos. Por consiguiente, un investigador que desee evaluar la eficacia de un anticuerpo anti-C5a para tratar un trastorno asociado con complemento de interés (por ejemplo, RA o sepsis), puede utilizar un anticuerpo anti-C5a de reacción cruzada aquí descrito en un modelo de primate no humano adecuado de la enfermedad. Si el investigador, por ejemplo, establece la eficacia del anticuerpo en modelo de primate humano, estos resultados pueden proporcionar un soporte a prueba del concepto suficiente para la aprobación reguladora para el uso del anticuerpo en el tratamiento de humanos. Como alternativa o en forma adicional, un investigador puede administrar el anticuerpo de reacción cruzada a un primate no humano para estudio, por ejemplo, propiedades de despeje de anticuerpo y/o farmacodinámicas. Con base en dichos estudios que utilizan el anticuerpo de reacción cruzada, el investigador puede aproximar de mejor manera la dosis requerida para tratar la enfermedad del humano.
En algunas modalidades, los anticuerpos C5 anti-ratón o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos aquí descritos, así como los anticuerpos que reaccionan en forma cruzada con C5a de humano y ratón, se pueden utilizar como un anticuerpo sustituto en modelos de ratón para enfermedad humana. Esto puede ser especialmente útil cuando un anticuerpo C5a anti-humano humanizado no reacciona en forma cruzada con C5a de ratón y/o es probable que origine una respuesta de anticuerpo anti-humano en un ratón al cual se administra al anticuerpo humanizado. Por consiguiente, un investigador que desee estudiar el efecto de un anticuerpo anti- C5a para tratar una enfermedad (por ejemplo, lesión de reperfusión-isquemia) puede utilizar un anticuerpo C5a antiratón aquí descrito en un modelo de ratón adecuado de la enfermedad. Si el investigador puede establecer la eficacia en el modelo de ratón en la enfermedad utilizando el anticuerpo C5a anti-ratón, los resultados pueden establecer la prueba del concepto para el uso de un anticuerpo C5a anti-humano para tratar la enfermedad en humanos. Los ejemplos de operación descritos en el estudio de ejemplo utilizando un sustituto de anticuerpo C5a anti-ratón en un modelo de ratón de RA que establece la prueba del concepto para el uso de un anticuerpo C5a anti-humano para tratar RA en el hombre.
Los anticuerpos anti-C5a aquí descritos también se pueden utilizar en métodos para purificar C5a de una muestra (por ejemplo, una muestra biológica). En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a se puede inmovilizar en un soporte de fase sólida utilizando métodos bien conocidos en la técnica.
Una muestra que contiene el antígeno que está purificado, en este caso C5a, se contacta con el anticuerpo en el soporte sólido bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir al antígeno enlazar al anticuerpo. Posteriormente el soporte sólido se lava una o más veces con un amortiguador adecuado para eliminar el material no enlazado. Posteriormente el soporte sólido puede contactarse con un segundo amortiguador que da como resultado la liberación del antígeno del anticuerpo. El antígeno liberado posteriormente se recolecta y caracteriza (por ejemplo, para pureza y actividad, utilizando métodos bien conocidos en la técnica.
Los anticuerpos anti-C5a y los fragmentos de enlace de antígenos de los mismos aquí descritos, también se pueden utilizar en métodos terapéuticos tal como se elabora más adelante.
Métodos de tratamiento Las composiciones antes descritas son útiles, entre otras cosas, en métodos para tratar o prevenir una variedad de trastornos asociados con complemento en un sujeto. Las composiciones se pueden administrar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano que utilizando una variedad de métodos que depende en parte de la ruta de administración. La ruta puede ser por ejemplo, inyección o infusión intravenosa (IV), inyección subcutánea (SC), inyección intraperitoneal (IP), o inyección intramuscular (IM) .
La administración se puede lograr, por ejemplo, mediante infusión local, inyección o por medio de un implante. El implante puede ser de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas tales como membranas sialásticas o fibras. El implante puede estar configurado para liberación sostenida o periódica de la composición al sujeto. Ver por ejemplo la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 20080241223; Patentes Norteamericanas Nos. 5,501,856; 4,863,457; y 3,710,795; EP488401; y EP 430539, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. La composición se puede suministrar al sujeto por medio de un dispositivo implantable, basado, por ejemplo, en sistemas de difusión, erosionables o convectivos, por ejemplo, bombas osmóticas, implantes, biodegradables, sistemas de electrodifusión, sistemas de electroósmosis, bombas de vapor de erosión, bombas electrolíticas, bombas efervescentes, bombas piezoeléctricas, sistemas a base de erosión y sistemas electromecánicos.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo se suministra en forma terapéutica a un sujeto por medio de administración local. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "administración local" o "suministro local" se refiere al suministro que no depende del transporte de la composición o agente a su tejido o sitio objetivo proyectado a través del sistema vascular. Por ejemplo, la composición se puede suministrar mediante inyección o implante de la composición o agente, o mediante inyección o implante de un dispositivo que contiene la composición o agente. Después de la administración local en los alrededores de un tejido o sitio objetivo, la composición o agente, o uno o más componentes de los mismos, pueden difundirse al tejido o sitio objetivo proyectado.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo se puede administrar en forma local a una articulación (por ejemplo, una unión articulada). Por ejemplo, en modalidades en dónde el trastorno asociado con complemento es artritis, el inhibidor de complemento se puede administrar directamente a una articulación (por ejemplo, en un espacio de articulación) o en los alrededores de una articulación. Los ejemplos de uniones intraarticulares a las cuales un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo se pueden administrar en forma local, incluyen, por ejemplo, cadera, rodilla, codo, cintura, esternoclavicu lar, temperomandibular, carpal, tarsal, talón y cualquier otra articulación de un sujeto para condiciones artríticas. Un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo también se puede administrar a la bursa, tal como por ejemplo, bursa, acromial, bici pitoradial , cubitoradial, deltoide, infrapatelar, isquial, y cualquier otra bursa conocida en la técnica de la medicina.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo se puede administrar en forma local a los ojos. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "ojo" se refiere a cualesquiera y todos los tejidos y estructuras anatómicas asociadas con un ojo. El ojo tiene una pared distinta de tres diferentes capas: la esclera exterior, la capa coloidal media y la retina interna. La cámara detrás del lente se llena con un fluido gelatinoso referido como el humor vitreo. En la parte trasera del ojo se encuentra la retina, que detecta la luz. La córnea es un tejido ópticamente transparente que transporta imágenes a la parte trasera del ojo. La córnea incluye una trayectoria para la permeación de fármacos dentro del ojo. Otras estructuras de tejido anatómicas asociadas con el ojo incluyen el sistema de drenaje lagrimal, que incluye un sistema de secreción, un sistema de distribución y un sistema de excreción. El sistema de excreción comprende secretores que son estimulados mediante el parpadeo, y cambio de temperatura debido a la evaporación de lágrimas y secretores de reflejo que tienen un suministro de nervio parasimpático eferente y secretan lagrimas en respuesta a estimulación física y emocional. El sistema de distribución incluye los parpados de los ojos y los meniscos de lagrimas alrededor de los bordes del párpado del un ojo abierto, en los cuales dispersan lagrimas sobre la superficie ocular mediante el parpadeo, reduciendo de esta forma que se desarrollen áreas secas.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo se administra a la cámara posterior del ojo. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo se administra en forma intra vitrea. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo se administra en forma trans-escleral.
En algunas modalidades, por ejemplo, en modalidades para el tratamiento o prevención de un trastorno pulmonar asociado con complemento, tal como COPD o asma, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito también se puede administrar a un sujeto por medio de los pulmones. El suministro de fármaco pulmonar puede lograrse mediante inhalación y la administración mediante inhalación en la presente invención, puede ser oral y/o nasal. Los ejemplos de dispositivos farmacéuticos incluyen inhaladores de dosis medida, inhaladores de polvo seco (DPIs) y nebulizadores. Por ejemplo, un anticuerpo anti-C5a o un fragmento de enlace de antígeno del mismo se pueden administrar a pulmones de un sujeto por medio de un inhalador de polvo seco. Estos inhaladores son dispositivos libres de propulsor que suministran formulaciones en polvo seco, dispersibles y estables a los pulmones. Los inhaladores de polvo seco son bien conocidos en la técnica y a la medicina e incluyen, sin limitación: el TurboHaler® (AstraZeneca; Londres, Inglaterra) el inhalador AIR® (Alkermes®; Cambridge, Massachusetts) ; Rotahaler® (GlaxoSmitKline; Londres, Inglaterra); y Eclipse™ (Sanofi-Aventis; París, Francia). Ver también por ejemplo, las Publicaciones PCT Nos. WO 04/026380, WO 04/024156, y WO 01/78693. Los dispositivos DPI han sido utilizados para administración pulmonar de polipéptidos tales como insulina, y hormona de crecimiento. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o un fragmento de enlace de antígeno del mismo se puede administrar en forma intrapulmonar por medio de un inhalador de dosis medida. Estos inhaladores dependen de un propulsor para suministrar una dosis independiente de un compuesto a los pulmones. Los ejemplos de compuestos administrados mediante inhalador de dosis medida incluyen, por ejemplo Astovent® (Boehringer-Ingelheim; Ridgefield, Connecticut) y Flovent® (GlaxoSmitKline) . Ver también por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 6,170,717; 5,447,150; y 6,095,141.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo se pueden administrar a los pulmones de un sujeto por medio de un nebulizador. Los nebulizadores utilizan aire comprimido para suministrar un compuesto como un aerosol o nebulización licuada. Un nebulizador puede ser por ejemplo, un nebulizador de chorro (por ejemplo, nebulizadores de aire o de chorro de líquido) o un nebulizador ultrasónico. Los dispositivos adicionales y los métodos de administración intrapulmonar se establecen por ejemplo en las Publicaciones de Solicitud de Patente Norteamericana Nos. 20050271660 y 20090110679, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.
En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos aquí proporcionados están presentes en una forma de dosificación unitaria, la cual puede ser particularmente adecuada para auto-administración. Un producto formulado de la presente descripción se puede incluir dentro de un contenedor, normalmente, por ejemplo un frasco, cartucho, jeringa llena, o pluma desechable. También se puede utilizar un dosificador tal como un dispositivo dosificador descrito en la Patente Norteamericana No. 6,302,855, por ejemplo, con un sistema de inyección de la presente descripción.
Un sistema de inyección de la presente descripción puede emplear una pluma de suministro tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,308,341. Los dispositivos de pluma, en su mayoría utilizados comúnmente como auto-suministro de insulina en pacientes con diabetes, son bien conocidos en la técnica. Dichos dispositivos pueden comprender al menos en una hoja de inyección (por ejemplo una hoja calibre 31 de aproximadamente 5 a 8 mm de longitud), normalmente están llenas previamente con una o más dosis unitarias terapéuticas en una solución terapéutica, y son útiles para el suministro rápido de la solución a un sujeto con el menor dolor posible.
Una pluma de suministro de medicamento incluye un sujetador de frasco en el cual, se puede encontrar un frasco de insulina u otro medicamento. El sujetador de frasco es una estructura tubular generalmente alargada con extremos próximos y distales. El extremo distal del sujetador de frasco incluye medios de montaje para encajar una cánula de aguja de extremo doble. El extremo próximo también incluye medios de montaje para encajar un cuerpo de la pluma, que incluye un transmisor y un aparato de preparación de dosis. Un frasco desechable que contiene medicamento (por ejemplo, una solución con alta concentración de un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo) para utilizarse con el sujetador de la técnica anterior, incluye un extremo distal que tiene un septo elastomérico permeable que puede ser perforado por un extremo de una cánula de aguja de extremo doble. El extremo próximo de este frasco, incluye un tope colocado en forma deslizable en un encaje hermético con la pared cilindrica del frasco. Esta pluma de suministro y medicamento se utiliza insertando el frasco de medicamento en el sujetador de frasco. Posteriormente se conecta un cuerpo de la pluma al extremo próximo del sujetador del frasco. El cuerpo de la pluma incluye un aparato de preparación de dosis para diseñar una dosis de medicamento que será suministrada por la pluma, y un aparato de transmisión para impulsar el tapón del frasco en forma distal a una distancia que corresponde a la dosis seleccionada. El usuario de la pluma monta una cánula de aguja de extremo doble en el extremo distal del sujetador de frasco, de modo que el punto próximo de la cánula de la aguja perfore el septo en el frasco. Posteriormente el paciente selecciona una dosis y opera la pluma para impulsar en forma distal el tapón para suministrar la dosis seleccionada. El aparato que selecciona la dosis regresa a cero al momento de la inyección de la dosis seleccionada. Posteriormente, el paciente elimina y desecha la cánula de la aguja, y mantiene la pluma de suministro de medicamento en una ubicación conveniente para la siguiente administración de medicamento requerida. El medicamento en el frasco se agotará después de diversas de dichas administraciones de medicamento. Posteriormente el paciente separa el sujetador del frasco del cuerpo de la pluma. Posteriormente el frasco vacío puede ser eliminado y desechado. Se puede insertar un frasco nuevo en el sujetador del frasco, y el sujetador del frasco y el cuerpo de la pluma se pueden reensamblar y utilizar tal como se explicó anteriormente. Por consiguiente, una pluma de suministro de medicamento generalmente tiene un mecanismo de transmisión para la dosificación precisa y facilidad de uso.
Un mecanismo de dosificación, tal como un botón que se puede rotar permite al usuario ajustar en forma precisa la cantidad de medicamento que será inyectada por la pluma desde un frasco de medicamento empacado previamente. Para inyectar la dosis de medicamento, el usuario inserta la guja bajo la piel y oprime el botón una vez tanto como pueda ser oprimido. La pluma puede ser un dispositivo completamente mecánico, o puede ser combinado con circuitos electrónicos para ajustar y/o indicar en forma precisa la dosificación de medicamento que se inyecta en el usuario. Ver la Patente Norteamericana No. 6,192,891.
En algunas modalidades, la aguja del dispositivo de la pluma es desechable y los equipos incluyen una o más agujas de reemplazo desechable. Los dispositivos de la pluma adecuada para el suministro de cualesquiera de los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos aquí presentados, también se describen por ejemplo en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,277,099; 6,200,296; y 6,146,361, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. Un dispositivo de pluma a base de microagujas, se describe por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 7,556,615, cuya descripción está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia. Ver también el Dispositivo Precisión Pen Injector (PPI), Molly™, fabricado por Scandinavian Healt Ltd.
La presente descripción también presenta formulaciones de liberación prolongada o liberación controlada adecuadas para auto-administración y/o administración crónica de un medicamento, tal como un anticuerpo anti-C5a o un fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito. Las diversas formulaciones se pueden administrar a un paciente que necesita de tratamiento con el medicamento en la forma de un bolo o mediante infusión continua o durante un período de tiempo.
En algunas modalidades, se formula un anticuerpo anti-C5a de alta concentración (o fragmento de enlace de antígeno del mismo) aquí descrito para administración de liberación sostenida, liberación prolongada, liberación programada, liberación controlada o liberación continua. En algunas modalidades, se utilizan formulaciones de depósito para administración el anticuerpo al sujeto que necesita del mismo. En este método, el anticuerpo se formula con uno o más transportadores que proporcionan la liberación gradual del agente activo durante un período de un número de horas o días. Dichas formulaciones con frecuencia están basadas en una matriz de degradación, que se dispersa gradualmente en el cuerpo para liberar el agente activo.
En algunas modalidades, un fragmento de enlace C5a (por ejemplo, un anticuerpo de cadena simple, un diacuerpo o un fragmento Fab') de un anticuerpo anti-C5a aquí descrito, se administra por medio de administración intrapulmonar al sujeto que necesita del mismo. Por ejemplo, un forma de anticuerpo de cadena simple de cualesquiera de los anticuerpos anti-C5a aquí descritos, se puede suministrar por medio de un nebulizador o un inhalador a un sujeto (por ejemplo, un humano) que padece de un trastorno pulmonar asociado con complemento, tai como asma o COPD.
Una dosis adecuada de un anticuerpo o fragmento del mismo aquí descrita, en donde la dosis tiene la capacidad de tratar o prevenir un trastorno asociado con complemento en un sujeto, puede depender de una variedad de factores que incluyen por ejemplo, la edad, sexo y peso del sujeto que será tratado y el compuesto inhibidor particular utilizado. Por ejemplo, se puede requerir una dosis diferente de un anticuerpo anti-C5a completo para tratar a un sujeto con RA en comparación con la dosis de un fragmento de anticuerpo Fab' de enlace C5a el cual ha sido requerido para tratar al sujeto. Otros factores que incluyen afectan la dosis administrada al sujeto incluyen, por ejemplo, el tipo o severidad del trastorno transmitido por complemento. Por ejemplo, un sujeto que tiene RA puede requerir la administración de una diferente dosificación de un anticuerpo anti-C5a a la de un sujeto con AMD. Otros factores pueden incluir, por ejemplo, otros trastornos médicos que afectan en forma concurrente o previo al sujeto, la salud general del sujeto, la disposición genética del sujeto, la dieta, el tiempo de administración, rango de excreción, la combinación de fármacos y cualesquiera otros terapéuticos adicionales que se administran al sujeto. Deberá quedar entendido que una dosificación específica y régimen de tratamiento terapéutico particular también dependerá del juicio del prácticamente médico tratante (por ejemplo, doctor o enfermera) .
Un anticuerpo aquí descrito puede ser administrado como una dosis fija o en una dosis de miligramo por kilogramo (mg/kg). En algunas modalidades, la dosis también puede elegirse para reducir o evitar la producción de anticuerpos u otras respuestas inmune de huésped contra uno o más de los anticuerpos activos en la composición. Aunque no se pretende limitar en forma alguna, las dosificaciones de ejemplo de un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti-C5a, incluyen por ejemplo 1-1000 pg/kg, 1-100 pg/kg, 0.5-50 pg/kg, 0.1-100 pg/kg, 0.5-25 pg/kg, 1-20 pg/kg, y 1-10 pg/kg, 1-100 mg/kg, 0.5-50 mg/kg, 0.1-100 mg/kg, 0.5-25 mg/kg, 1-20 mg/kg, 0.100 mg/kg a 1 mg/kg, y 1-10 mg/kg. Las dosificaciones de ejemplo de un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descritos incluyen sin limitación 0.1 pg/kg, 0.5 pg/kg, 1.0 pg/kg, 2.0 pg/kg, 4 pg/kg, y 8 pg/kg, 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4 mg/kg, 8 mg/kg, y 20 mg/kg.
Una composición farmacéutica puede incluir una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito. Dichas cantidades efectivas pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la técnica con base, en parte, del efecto del anticuerpo administrado o el efecto de combinación del anticuerpo y uno o más agentes activos adicionales, si se utiliza más de un agente. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente o fragmento del mismo aquí descrito, también puede variar de acuerdo de factores tales como, el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad del anticuerpo (y uno o más agentes activos adicionales) de desarrollar una respuesta deseada en el individuo, por ejemplo, disminución de al menos un parámetro de la condición, por ejemplo, disminución de al menos un síntoma del trastorno transmitido por complemento. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-C5a puede inhibir (disminuir la severidad de, o eliminar el surgimiento de) y/o prevenir un trastorno particular y/o cualesquiera de los síntomas del trastorno particular conocidos en la técnica o aquí descritos. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual cualesquiera efectos tóxicos o perjudiciales de la composición, son sobrepasados por los efectos terapéuticamente benéficos.
Las dosis humanas adecuadas de cualesquiera de los anticuerpos o fragmentos de los mismos aquí descritos en la presente invención, pueden ser evaluadas en forma adicional, por ejemplo en estudios de escala de dosis Fase I. Ver por ejemplo, las Publicaciones de van Gurp y asociados, (2008) Am J Transplantation 8(8):1711-1718; Hanouska y asociados, (2007) Clin Cáncer Res 13(2. parte 1 ):523-531 ; y Heterington y asociados, (2006) Antimicrobial Agents y Chemoterapy 50( 0): 3499-3500.
Los términos "cantidad terapéuticamente efectiva" o "dosis terapéuticamente efectiva" o términos similares aquí utilizados, están proyectados para significar una cantidad de un agente (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5a o un fragmento de enlace de antígeno del mismo) que desarrollará la respuesta biológica médica deseada (por ejemplo, una mejoría en uno o más síntomas de un trastorno asociado con complemento). En algunas modalidades, una composición aquí descrita contiene una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que enlaza específicamente a un neo-epítope presente en C5a. En algunas modalidades, la composición contiene cualesquiera de los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos aquí descritos y uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, u 11 o más) agentes terapéuticos adicionales, de modo que la composición, como una totalidad, sea terapéuticamente efectiva. Por ejemplo, una composición puede contener un anticuerpo anti-C5a aquí descrito y un agente inmunosupresor, en donde el anticuerpo y el agente cada uno están en una concentración que cuando se combinan son terapéuticamente efectivos para tratar o prevenir un trastorno asociado con complemento (por ejemplo, un trastorno inflamatorio asociado con complemento, tal como COPD, asma, sepsis, o RA) en un sujeto.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de dichas composiciones se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos conocidos en cultivos celulares o animales experimentales (por ejemplo modelos animales de cualesquiera de los trastornos transmitidos por complemento aquí descritos). El uso de un anticuerpo anti-C5a en un modelo animal de RA se ejemplifica en los ejemplos de operación. Estos procedimientos se pueden utilizar, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y el ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos, es el índice terapéutico y se puede expresar como la proporción LD5o/ED50. Un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que exhibe un alto índice terapéutico es el preferido. Aunque las composiciones que exhiben efectos secundarios tóxicos pueden ser utilizadas, se deben tener cuidado en diseñar un sistema de suministro que dirija dichos compuestos al sitio del tejido afectado, y minimice el daño potencial a las células normales, y por lo tanto, reduzca los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden utilizar en la formulación de un rango de dosis para uso en humanos. La dosis de dichos anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos, está generalmente dentro de un rango de concentraciones en la circulación de los anticuerpos o fragmentos que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. Para un anticuerpo anti-C5a aquí descrito, la dosis terapéuticamente efectiva puede ser estimada inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis puede ser formulada en modelos animales para lograr un rango de concentración en plasma en la circulación que incluye IC50 (es decir, la concentración del anticuerpo que logra una inhibición media máxima de los síntomas), tal como se determina en el cultivo celular. Dicha información se puede utilizar para determinar de manera más precisa dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden ser medidos, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto desempeño. En algunas modalidades, por ejemplo, en donde se desea la administración local (por ejemplo, al ojo o a una articulación), se puede utilizar modelado animal o cultivo celular para determinar una dosis requerida para lograr una concentración terapéuticamente efectiva dentro del sitio local.
En algunas modalidades, los métodos pueden llevarse a cabo junto con otras terapias para trastornos asociados con complemento. Por ejemplo, la composición puede administrarse sujeto al mismo tiempo, antes o después de la plasma feresis, terapia IVIG, o intercambio de plasma. Ver por ejemplo, la Publicación de Appel y asociados, (2005) J Am Soc Nephrol 16: 1392-1404. En algunas modalidades, la composición se puede administrar al sujeto al mismo tiempo, antes o después de trasplante de riñon.
Un "sujeto" tal como se utiliza en la presente invención puede ser cualquier mamífero. Por ejemplo, un sujeto puede ser un humano, un primate no humano (por ejemplo, mono, baboon, o chimpancé), un caballo, una vaca, un cerdo, una oveja, una cabra, un perro, un gato, un conejo, un cerdo de guinea, un jerbo, un hámster, a rata, o un ratón. En algunas modalidades, el sujeto es un infante (por ejemplo, un infante humano).
Tal como se utiliza en la presente invención, un sujeto "que necesita de prevención", "que necesita de tratamiento", "que necesita de los mismos", se refiere a uno, quien a juicio de un practicante médico adecuado (por ejemplo, un doctor, una enfermera o un practicante de enfermera en el caso de humanos; un veterinario en el caso de mamíferos no humanos) puede beneficiarse en forma razonable de un tratámiento determinado (tal como tratamiento con una composición que comprende en anticuerpo anti-C5a).
El término "prevenir" es reconocido en la técnica, y cuando se utiliza en relación a una condición, es bien comprendido en la técnica, e incluye la administración de una composición que reduce la frecuencia de, retrasa el desarrollo de los síntomas de una condición médica en un sujeto en forma relativa al sujeto que no recibe la composición. Por lo tanto, la prevención de un trastorno asociado con complemento tal como asma, incluye por ejemplo, reducir el grado o frecuencia de tos, ronquido o dolor de pecho en pacientes que reciben un tratamiento profiláctico relativo a una población de control no tratada y/o retardan el surgimiento de tos o ronquido en una población tratada versus una población de control no tratada por ejemplo, por una cantidad estadística y/o clínicamente significativa.
Tal como se describió anteriormente, los anticuerpos y fragmentos biológicamente activos aquí descritos se pueden utilizar para tratar una variedad de trastornos asociados con complemento tales como, pero sin limitarse a: artritis reumatoide (RA); nefritis por lupus; lesión de isquemia-reperfusión; síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS); síndrome urémico hemolítico típico o infeccioso (tHUS); enfermedad de depósito denso (DDD); hemoglobinuria nocturna paroxismal (PNH); esclerosis múltiple (MS); degeneración macular (por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad (AMD)); síndrome de hemolisis, enzimas elevadas en hígado, y bajo conteo de plaquetas (HELLP); sepsis; dermatomiositis; retinopatía diabética; púrpura trom bocitopénica trombótica (TTP); pérdida fetal espontánea; vasculitis inmune-Pauci; bulosa epidermolisis; pérdida feta recurrente; esclerosis múltiple (MS); y lesión traumática en cerebro. Ver por ejemplo, las Publicaciones de Holers (2008) Immunological Reviews 223:300-316 y Holers y Thurman (2004) Molecular Immunology 4J_:147-152. En algunas modalidades, el trastorno transmitido por complemento es un trastorno vascular transmitido por complemento tal como, por ejemplo, pero sin limitarse a un trastorno cardiovascular, miocarditis, trastorno cerebrovascular, trastorno vascular periférico (por ejemplo, musculoesquelético) trastorno renovascular, trastorno vascular entérico/mesentérico, revascularización para trasplantes y/o replantes, vasculitis, nefritis púrpura de Henoch-Schonlein, vasculitis asociada con lupus eritomatoso sistémico, vasculitis asociada con artritis reumatoide, vasculitis de complejo inmune, enfermedad de Takayasu, síndrome de filtración capilar, cardiomiopatía dilatada, angiopatía diabética, aneurisma aórtica abdominal-toxica, enfermedad de Kawasaki (arteritis), embolo de gas venoso (VGE), y restenosis después de colocación de stent, aterectomía rotacional, y angioplastía coronaria transluminal percutánea (PTCA). (Ver, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 20070172483). En algunas modalidades, el trastorno asociado con complemento es miastenia grave, enfermedad de aglutinina-f ría (CAD), hemoglobinuria fría paroxismal (PCH), dermatomiositis, escleroderma, anemia hemolítica autoinmune caliente, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, diabetes tipo I, psoriasis, pénfigo, anemia hemolítica autoinmune (AIHA), púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), síndrome de Goodpasture, síndrome de antifosfolípido (APS), enfermedad de Degos, y APS catastrófica (CAPS).
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito, sólo o en combinación con un segundo agente anti-inflamatorio, se puede utilizar para tratar un trastorno inflamatorio, tal como, pero sin limitarse a RA (anterior), enfermedad inflamatoria de intestino, sepsis (anterior), choque séptico, lesión pulmonar aguda, coagulación intravascular diseminada (DIC), o enfermedad de Crohn. En algunas modalidades, el segundo agente anti-inflamatorio puede ser uno seleccionado del grupo que consiste en NSAIDs, corticoesteroides, metotrexato, hidroxicloroquina, y agentes anti-TNF tales como etanercept y infliximab, un agente de agotamiento de célula B tal como rituximab, un antagonista de interleucina-1 , o un agente de bloqueo co-estimulador de célula T tal como abatacept.
En algunas modalidades, el trastorno asociado con complemento son trastornos neurológicos asociados con complemento tal como, pero sin limitarse a esclerosis lateral amiotrófica (ALS), lesión de cerebro, enfermedad de Alzheimer, y neuropatía diesmielinante inflamatoria crónica.
Los trastornos asociados con complemento también incluyen trastornos pulmonares asociados con complejo tales como, pero sin limitarse a asma, bronquitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, (COPD), enfermedad de pulmón intersticial, deficiencia a-1, enfisema, bronquiectasis, bronquiolitis obliterans, alveolitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, y trastornos vasculares de colágeno.
En el caso de trastornos hemolíticos asociados con complemento tales como PNH, CAD, y PCH, un practicante médico apreciará que el C5b de fragmento C5 (por medio del complejo de terminal) contribuye significativamente a la patogénesis de estos trastornos. Ver por ejemplo las Publicaciones de Kaplan (2002) Curr Opin Investig Drugs 3(7) : 1017-23; Hill (2005) Clin Adv Hematol Oncol 3(111:849-50; y Roter y asociados, (2007) Nature Biotechnology 25(11 ):1256-1488. Por consiguiente un practicante medico puede elegir administrar uno o más de los anticuerpos anti-C5a aquí descritos junto con una o más terapias adicionales para el trastorno hemolítico, tal como un inhibidor de complemento que previene la formación del complejo de complemento terminal C5b-9. En algunas modalidades de los métodos aquí descritos, el trastorno asociado con complemento no es un trastorno hemolítico asociado con complemento. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o un fragmento de enlace de antígeno del mismo se administra a un sujeto para tratar, prevenir o disminuir al menos un síntoma de una respuesta inflamatoria asociada con complemento (por ejemplo, el aspecto de la respuesta inflamatoria asociada con complemento de un trastorno asociado con complemento) en un sujeto. Por ejemplo, un anticuerpo anti-C5a aquí descrito puede ser utilizado para tratar, prevenir y/o disminuir uno o más síntomas asociados con una respuesta inflamatoria asociada con complemento tal como enfermedad de rechazo de injerto/injerto-versus-receptor (GVHD), lesiones de reperfusión (por ejemplo, después de derivación cardiopulmonar o un trasplante de tejido), y daño al tejido después de otras formas de lesión traumática tal como una quemadura (por ejemplo, una quemadura severa), traumatismo contundente, lesión espinal o picadura de sapo. Ver, por ejemplo, las Publicaciones de Park y asociados, (1999) Anest Analg 99111:42-48; Tofukuji y asociados, (1998) J Thorac Cardiovasc Surg 116(6): 1060-1068; Schmid y asociados, (1997) Shock 8(2): 119-124; y Bless y asociados, (1999) Am J Physiol 2761H: L57-L63.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a o un fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito se pueden administrar a un sujeto como una monoterapia. Como alternativa, tal como se describió anteriormente, el anticuerpo o fragmento del mismo se puede administrar a un sujeto como una terapia de combinación con otro tratamiento, por ejemplo, otro tratamiento para un trastorno asociado con complemento o una respuesta inflamatoria asociada con complemento. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir administrar al sujeto (por ejemplo, un paciente humano) uno o más agentes adicionales (por ejemplo, anti-coagulantes, anti-hipertensivos, o fármacos anti-i nf lamatorios (por ejemplo, esferoides)) que proporciona un beneficio terapéutico a un sujeto quien tiene, o está en riesgo de desarrollar sepsis. En otro ejemplo, la terapia de combinación puede incluir administrar al sujeto uno o más agentes adicionales (por ejemplo, un anticuerpo anti-lgE, un anticuerpo anti-IL-4, un anticuerpo anti-IL-5, o una anti-histamina) que proporciona beneficio terapéutico a un sujeto que tiene, está en riesgo de desarrollar o se sospecha que tiene un trastorno pulmonar asociado con complemento tal como COPD o asma. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5a y el uno o más agentes activos adicionales se administran al mismo tiempo. En otras modalidades, el anticuerpo anti-C5a se administra primero, y el uno o más agentes activos adicionales se administran en segundo lugar. En algunas modalidades, el uno o más agentes activos adicionales se administran en primer lugar, y el anticuerpo anti-C5a se administra en segundo lugar.
Un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito puede reemplazar o aumentar una terapia administrada previamente o actualmente. Por ejemplo, al momento del tratamiento con un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo, la administración de uno o más agentes activos adicionales puede terminar o disminuirse, por ejemplo, se puede administrar en dosis menores. En algunas modalidades, la administración de la terapia previa puede ser mantenida. En algunas modalidades, se mantendrá una terapia previa hasta que el nivel de anticuerpo anti-C5a alcance es un nivel suficiente para proporcionar un efecto terapéutico. Las dos terapias se pueden administrar en combinación.
El monitoreo de un sujeto (por ejemplo, un paciente humano) con respecto a una mejoría en el trastorno asociado con complemento (por ejemplo, sepsis, quemadura severa, RA, nefritis por lupus, síndrome de Goodpasture, o asma), tal como aquí se define, significa evaluar al sujeto para un cambio en un parámetro en la enfermedad, por ejemplo, mejoría en uno o más síntomas de un trastorno determinado. Los síntomas de trastornos asociados con complemento son bien conocidos en la técnica de la medicina. En algunas modalidades, se lleva a cabo la evaluación al menos una (1) hora, por ejemplo, al menos 2, 4, 6, 8, 12, 24, o 48 horas, o al menos 1 día, 2 días, 4 días, 10 días, 13 días, 20 días o más, o al menos 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 10 semanas, 13 semanas, 20 semanas o más después de la administración. El sujeto puede ser evaluado en uno o más de los siguientes períodos: antes de comenzar el tratamiento; durante tratamiento; o después de que se han administrado uno o más elementos del tratamiento. La evaluación puede incluir evaluar la necesidad del tratamiento adicional, por ejemplo, evaluar si se debe alterar una dosificación, frecuencia de administración o duración del tratamiento. También puede incluir evaluar la necesidad de agregar o eliminar una modalidad terapéutica seleccionada, por ejemplo, agregar o eliminar cualesquiera de los tratamientos para un trastorno asociado con complementos aquí descrito. Equipo Terapéuticos v de Diagnóstico La descripción también presenta equipos terapéuticos y de diagnóstico que contienen, entre otras cosas uno o más de los anticuerpos anti-C5a, y/o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos, aquí descritos. Los equipos terapéuticos pueden contener, por ejemplo, un medio adecuado para el suministro de un anticuerpo o fragmento enlace de antígeno a un sujeto. En algunas modalidades, el medio es adecuado para suministro subcutáneo del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo al sujeto. El medio puede ser, por ejemplo, una jeringa o una bomba osmótica. Esto es, un equipo terapéutico aquí descrito puede contener una jeringa llena previamente con un anticuerpo anti-C5a o un fragmento de enlace de antígeno del mismo (por ejemplo, un dispositivo de pluma que contiene el anticuerpo o fragmento) aquí descrito o el equipo puede contener una bomba (por ejemplo, una bomba osmótica) y uno o más cartuchos desechables configurados para utilizarse con la bomba los cartuchos llenos previamente con un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito (por ejemplo, llenos previamente con una solución acuosa que contiene el anticuerpo anti-C5a o un fragmento de enlace de antígeno del mismo). En otro ejemplo, el equipo puede contener un dispositivo de suministro transescleral o implantable (por ejemplo, un tapón) que está lleno previamente con (o contiene de otra manera) una solución que contiene un anticuerpo anti-C5a o un fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito.
En algunas modalidades, el medio para suministrar un anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo es un dispositivo de pluma para suministro de fármacos.
En algunas modalidades, el medio es adecuado para el suministro intrapulmonar del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo a un sujeto, por ejemplo, para utilizarse en tratamiento o prevención de un trastorno pulmonar asociado con un complemento tal como, pero sin limitarse a COPD o asma. Por consiguiente, el medio puede ser por ejemplo, un inhalador oral o nasal (ver anteriormente).
El inhalador puede ser, por ejemplo, un inhalador de dosis medida (MDI), un inhalador de polvo seco (DPI), o un nebulizador. Dicho equipo también puede incluir opcionalmente instrucciones para administrar (por ejemplo, la autoadministración) el anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo a un sujeto.
Los equipos terapéuticos pueden incluir por ejemplo uno o más agentes activos adicionales para tratar o prevenir un trastorno asociado con complemento y/o disminuir un síntoma del mismo. Por ejemplo, los equipos terapéuticos diseñados para utilizarse en el tratamiento o prevención de un trastorno pulmonar asociado con complemento pueden incluir uno o más agentes activos adicionales que incluyen pero no se limitan a otro terapéutico de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-I g E , un anticuerpo anti-IL-4, o un anticuerpo anti-IL<-5) , un inhibidor anti-lgE de molécula pequeña (por ejemplo, sodio de montelukast) , un simpatomimético (por ejemplo, albuterol), un antibiótico (por ejemplo, tobramicina) , una desoxiribonucleasa (por ejemplo, pulmozima), un fármaco anticolinérgico (por ejemplo, bromuro de ipratropio), un corticoestéroide (por ejemplo, dexametasona) , un agonista de ß-adrenoreceptor, un inhibidor de leucotrieno (por ejemplo, zileuton), un inhibidor de 5-lipoxigenasa, un inhibidor de fosfodiesterasa (PDE), un antagonista CD23, un antagonista IL-13, un inhibidor de liberación de citocina, un antagonista de receptor de histamina H1, una anti-histamina, un agente anti-inflamatorio (por ejemplo, sodio de cromolina o cualquier otro agente antiinfamatorio conocido en la técnica o aquí descrito) o un inhibidor de liberación de histamina.
En algunas modalidades, el medio puede ser adecuado para la administración intraocular de un anticuerpo anti-C5a, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, aquí descrito a un sujeto que necesita del mismo, por ejemplo, un sujeto que padece de AMD o cualquier otro trastorno ocular asociado con complemento. El medio puede ser por ejemplo una jeringa, un parche trans-escleral o incluso un lente de contacto que contiene el anticuerpo o fragmento. El medio, en algunas modalidades puede ser un gotero para ojos, en donde el anticuerpo anti-C5a o el fragmento de enlace de antígeno del mismo se formula para dicha administración. Dichos equipos terapéuticos también pueden incluir por ejemplo, uno o más agentes terapéuticos adicionales para utilizarse en un trastorno asociado con el ojo con el complemento. Los agentes terapéuticos pueden ser por ejemplo, bevacizumab o el fragmento Fab de bevacizumab, ranibizimab, ambos vendidos por Roche Pharmaceuticals, Inc., o sodio de pegaptanib (Mucogen®; Pfizer, Inc). Dicho equipo también opcionalmente puede incluir instrucciones para administrar el anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo a un sujeto.
En algunas modalidades, el medio puede ser adecuado para administración intraarticular de un anticuerpo anti-C5a, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, aquí descrito a un sujeto que necesita del mismo, por ejemplo, un sujeto que padece de RA. Los medios pueden ser, por ejemplo, una jeringa o una jeringa de barril doble. Ver por ejemplo las Patentes Norteamericanas Nos. 6,065,645 y 6,698,622. Una jeringa de barril doble es útil para administrar a una articulación de dos diferentes composiciones únicamente con una inyección. Se pueden incorporar dos jeringas separadas para utilizarse en la administración del terapéutico, mientras se extrae fluido de la rodilla para análisis (punción) en un modo de empujar-jalar. Los agentes terapéuticos adicionales que se pueden administrar con los anticuerpos anti-C5a o fragmentos junto con la jeringa de barril doble, o que de otra manera pueden estar incluidos de manera general en los equipos terapéuticos aquí descritos, incluyen, por ejemplo NSAIDs, corticoesteroides, metotrexato, hidroxicloroquina, agentes anti-TNF tales como etanercept e infliximab, un agente de agotamiento de célula B tal como rituximab, un antagonista de i nterleuci na- 1 , o un agente de bloqueo de co-estimuladores de célula T tal como abatacept. Dicho equipo también puede incluir opcionalmente instrucciones para administrar el anticuerpo anti-C5a o fragmento de enlace de antígeno del mismo a un sujeto. Se podrá apreciar que la descripción abarca equipos que comprenden uno o más de los anticuerpos anti-C5a aquí descritos y uno o más agentes antiinflamatorios seleccionados del grupo que consiste en NSAIDs, corticoesteroides, metotrexato, hidroxicloroquina, agentes anti-TNF tales como etanercept y infliximab, un agente de agotamiento de célula B tal como rituximab, un antagonista de interleucina- 1 o un agente de bloqueo co-estimulador de célula T tal como abatacept. Los anticuerpos y agentes pueden ser por ejemplo, formulados por separado o juntos. Los equipos se pueden utilizar para tratar una condición inflamatoria tal como, RA, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria de intestino o cualquier enfermedad inflamatoria conocida en la técnica o aquí mencionada.
También se presentan equipos de diagnóstico que contienen los anticuerpos anti-C5a o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos aquí descritos. Por ejemplo, los equipos pueden contener una forma etiquetada en forma detectable de un anticuerpo anti-C5a (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5a o un anticuerpo C5a anti-ratón) aquí descrito para utilizarse para detectar o cuantificar la cantidad de C5a en una muestra biológica. En algunas modalidades, los equipos pueden contener proteína C5a aislada (por ejemplo, una o ambas de las proteínas C5a de humano y ratón) y/o una muestra de control que comprende una o ambas de la proteína C5a humana y de ratón. En algunas modalidades, el equipo contiene una placa de depósitos múltiples recubierta con un primer anticuerpo anti-C5a que tiene una primera especificidad. El equipo también contiene un segundo anticuerpo anti-C5a (por ejemplo, un segundo anticuerpo anti-C5a etiquetado en forma detectable) que tiene una segunda especificidad. Dicho equipo está diseñado para utilizarse para capturar, con el primer anticuerpo enlazado a la placa, proteína C5a (por ejemplo, proteína C5a humana) en una muestra (por ejemplo, una muestra biológica) contactada con la placa y posteriormente detectar la proteína C5a capturada utilizando el segundo anticuerpo. En algunas modalidades, los equipos de diagnóstico incluyen tanto un anticuerpo C5a anti-ratón como un anticuerpo C5a anti-humano aquí descrito. En algunas modalidades, los equipos de diagnóstico incluyen un anticuerpo anti-C5a que enlaza tanto a C5a de ratón como a C5a de humano.
Los siguientes ejemplos están proyectados para ¡lustrar, no limita la presente invención.
Ejemplos Ejemplo 1. Métodos de inmunización Los anticuerpos anti-C5a aquí descritos son formas humanizadas de anticuerpos de múrido generados bajo el siguiente protocolo de inmunización. La inmunización para elevar los anticuerpos contra C5a desarginada humana, se llevaron a cabo en cuatro ratones incluyendo dos ratones de la cepa DBA/2J y dos ratones de la cepa A/J. Estas cepas fueron seleccionadas debido a que llevan el alelo Hc°, que las hace deficientes de C5 endógena. Todas las inmunizaciones se repitieron en intervalos de 14 días para un total de tres inmunizaciones. Todos los animales recibieron una inmunización de refuerzo subcutánea de aproximadamente 50 pg de C5a purificada en 200 de una emulsión adyuvante aproximadamente 14 días después de la última inmunización, y de 5 a 7 días antes de la recolección. La titulación del suero de los ratones inmunizados utilizando un ensayo ELISA, mostró que los ratones exhibieron una fuerte respuesta de anticuerpo contra el inmunogen C5a desarginado humano.
Ejemplo 2. Determinación de la especificidad de los anticuerpos de ratón para C5a humana Un subconjunto de cinco Fabs C5a anti humano de ratón que fueron representativos de Fabs selectivos de neopéptido fueron convertidos a anticuerpos lgG2a de ratón de longitud total designados como 5an048ME, 5an101ME, 5an178ME, 5an179ME, y 5an180ME. Estos anticuerpos fueron evaluados para especificidad utilizando Biolayer Interferometry en un Octet (ForteBio Inc.). (Las secuencias de aminoácidos de los conjuntos de CDR cadena ligera y cadena pesada de cada anticuerpo, tal como lo define Kabat, se establecen en la tabla 3). En síntesis, se conjugaron C5a humana, C5a Arg humana, C5 de longitud total, o parálogos C5a de C3a humana y C4a humana para biotina en una estequiometria de < 1(biotina): 1 (anticuerpo) a través de grupos amina y se inmovilizaron en una punta de estreptavidina. Posteriormente las puntas cargadas fueron expuestas a una solución que contiene 20 nM de anticuerpo anti-C5a IgG. Cada uno de los anticuerpos enlazó a C5a y C5a desarginada. Ninguno de los anticuerpos anti-C5a IgG enlazaron a C3a o C4a. Sin embargo, 5an178ME y 5an179ME cada uno enlazaron a C5 humana de longitud total. Se observó una pequeña cantidad de enlace entre 5an048ME y C5 humana de longitud total. Sin embargo, el enlace de 5an048ME a C5 fue mucho menor que el enlace observado a C5a.
Estos resultados confirmaron que los anticuerpos C5a anti-humano de ratón - 5an048ME, 5an101ME, y 5an180ME -enlazaron a un neoepítope en C5a que fue ocluido en C5 de longitud total, nativa o generados después de la disociación de C5 en fragmentos C5a y C5b. los resultados también indicaron que los tres anticuerpos fueron selectivos para C5a humana en comparación con los parálogos C3a o C4a.
Tabla 3. Secuencias de Aminoácido de Cinco Anticuerpos C5a Anti-humano de Ratón "SIN" en la tabla se refiere a "SEC ID NO." * Secuencia de aminoácido CDR definida de acuerdo con Kabat y asociados (supra).
Se llevó a cabo una serie de emparedados mediante Octet en el subconjunto seleccionado de anticuerpos C5a lgG2a antihumano de ratón, para determinar el grado de traslape de los epítopes C5a para cada uno de los cinco anticuerpos lgG2a representativos. En síntesis, un primer anticuerpo fue biotinilado e inmovilizado en una punta recubierta con estreptavidina en la plataforma Octet. Posteriormente, la C5a humana fue capturada de una solución 20 nM en el anticuerpo inmovilizado. La punta que lleva el complejo de anticuerpo-C5a fue expuesta posteriormente a una solución que contiene 20 nM de un segundo anticuerpo IgG anti-C5a es etiquetado. La generación de un perfil de asociación adicional en el sensograma, puede indicar que los dos anticuerpos enlazaron a C5a en forma simultánea en un complejo ternario, y que el enlace de epítopes a dos anticuerpos fueron sin traslape. Una falla al obtener un segundo perfil de asociación al momento de la adición de un segundo anticuerpo puede indicar que los dos anticuerpos enlazaron a C5a en una forma competitiva, es decir, el epítope C5a al cual el segundo anticuerpo enlazó, fue ocluido después del enlace por el primer anticuerpo. En contraste con el enlace no competitivo, el enlace competitivo no necesariamente indica que el primer y segundo anticuerpos reconocieron los mismos, o incluso traslaparon los epítopes en C5a humana. Utilizando este método los sitios de enlace de los cincos anticuerpos anti-C5a representativos fueron asignados a 4 distintos epítopes en C5a humana (figura 1). Los anticuerpos 5an048ME, 5an180ME, y 5an101ME compitieron entre sí. Aunque 5an048 y 5an180 también compitieron con el 5an179ME selectivo no-neoepítope, 5an101ME no lo hizo, lo cual indicó que 5an048ME y San180ME reconocen un neoepítope que es diferente al epítope reconocido por San101ME. Además, aunque el anticuerpo selectivo no-neoepítope 5an178ME compitió con el 5an179ME selectivo no-neoepítope, únicamente el ultimo compitió con San180ME y 5an048ME, mostrando que 5an179ME y 5an178ME enlazan diferentes epítopes que están accesibles tanto en C5 como en C5a. Los resultados también indican que algunas combinaciones de los anticuerpos pueden ser utilizadas en ensayos a base de emparedado para detectar y/o cuantificar la cantidad de C5a en una muestra.
Ejemplo 3. Humanización de los anticuerpos C5a anti-humano de ratón seleccionados Las regiones variables de dos anticuerpos C5a antihumano de ratón relacionados -5a101ME y 5an185ME - fueron seleccionados para humanización como anticuerpos IgG de longitud total. La humanización de regiones variables de cadena ligera y pesada estuvo basada en la identificación de regiones de estructura individuales de anticuerpos humanos (con una preferencia determinada para los genes-v de línea germinal) con un alto grado de identidad de secuencia con el anticuerpo de origen de múrido original. Los métodos para identificar regiones de estructura candidatas adecuadas se describen en la Patente Norteamericana No. 7,393,648 de Rother y Wu. Las definiciones de la estructura (FW) y de las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) se llevaron a cabo de acuerdo con los métodos descritos por Kabat, Chothia y IMGT® (International ImmunoGenetics Information System; Francia). En síntesis, las consultas en las bases de datos fueron llevadas a cabo en forma independiente tanto para las regiones variables de cadena ligera como pesada con una variedad de fragmentos de anticuerpo que incluyen: región variable de múrido intacta de FW1 a FW4, regiones variables de múrido intactas que excluyen CDRs y todos los posibles fragmentos de regiones variables de múrido que incluyen una, dos o tres estructuras con o sin sus CDRs de flanqueo. Las estructuras humanas fueron seleccionadas de su conjunto candidato con base en su identidad de secuencia general para los anticuerpos de múrido originales y los fragmentos de los mismos. Se emplearon métodos biológicos moleculares de rutina para ensamblar bibliotecas de combinación pequeñas de menos de 103 miembros, en donde cada conjunto de CDRs de múrido fue flanqueado por todas las posibles combinaciones de estructuras humanas seleccionadas. Estos anticuerpos humanizados fueron expresados como Fabs soluble y se evaluaron para enlace a C5a desarginada utilizando ELISA. Los Fabs que enlazaron a C5a posteriormente fueron sometidos a análisis de secuencia de ADN.
De estos enlazadores, se reformateo un subconjunto de seis Fabs humanizados como IgGs de longitud total (lgG2 humano o lgG2/G4 humano). Se llevó a cabo humanización adicional en dos anticuerpos (BNJ371 y BNJ381) reemplazando residuos de múrido en CDR2 de la cadena ligera con sus aminoácidos de línea germinal humana correspondientes. Las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos anti-C5a humanizados - BNJ364, BNJ367, BNJ371 , BNJ378, BNJ366, BNJ369, BNJ381, y BNJ383 - se establecen en la tabla 2 anterior.
Ejemplo 4. Determinación de la afinidad de los anticuerpos C5a anti-humano humanizados para C5a Los anticuerpos humanizados fueron sometidos a análisis BIAcore para cuantificar sus afinidades respectivas para C5a humana. Ver por ejemplo la Publicación de Karlsson y Larsson (2004) Methods Mol Biol 248:389-415. En síntesis, cada uno de los anticuerpos humanizados fueron seleccionados con 3 a 4 concentraciones humanas de C5a (antígeno) utilizando una técnica de captura. Los anticuerpos fueron capturados por un Anti-Fc (humano) directamente inmovilizado en un chip de sensor CM5 con diversas concentraciones dentro del rango de 0.6 nM a 5.9 nM de C5a humana pasado sobre la superficie de chip de sensor. La superficie fue regenerada con 20 mM HCI, 0.02% P20 después de cada ciclo para eliminar el anticuerpo y antígeno enlazado. Los datos fueron evaluados utilizando el software Biacore Bl Aevaíuation utilizando el Ajuste de Modelo Langmuir 1 :1 (Rmax:Global Fit; RLLocal Fit). La información de cinéticas tales como (ka: constante de Rango de Asociación), (ka: constante de Rango de Disociación) y KD (constante de Disociación en Equilibrio) se obtuvo del ajuste. Los resultados de los análisis se muestran en la tabla 4. Estos experimentos fueron con propósitos de clasificación con un número mínimo de concentraciones de material para análisis (3 a 4) con 1 duplicado. Por consiguiente, los valores de cinética aproximados se reportan en la tabla 4.
Tabla 4. Medidas de Afinidad para Seleccionar Anticuerpos Anti-C5a Humanizados Todos los anticuerpos humanizados enlazaron específicamente a C5a humana con una KD menor a 1.20 nanomolar. Todos los anticuerpos con excepción de BNJ371 enlazaron a C5a con una KD menor a 1 nanomolar. Tres de los anticuerpos, BNJ369, BNJ381 , y BNJ383 se enlazaron a C5a humana con una KD menor a 100 picomolar.
Ejemplo 5. Anticuerpos anti-C5a inhiben la señalización transmitida por C5a in vitro Se utilizó un ensayo de activación de neutrófilo in vitro para evaluar la actividad de los anticuerpos humanizados. El ensayo se describe de manera general por ejemplo en la Publicación de Paczkowski y asociados (1999) Br J Pharmacol 128(7) : 1461 -1466 y sirve para cuantificar la cantidad de mieloperoxidasa (MPO) producida por neutrófilos como una medida de neutrófilo. En síntesis, las células polimorfonucleares, la mayoría de las cuales son neutrófilos, fueron aisladas utilizando centrifugación de densidad (medio de mono-poliresolución número de catálogo: 91698049; MP Biochemicals; Solón, Ohio) de sangre completa de un donador saludable. Las células se lavaron una vez con solución salina amortiguada por fosfato (PBS) y los glóbulos rojos (RBC) se eliminaron de la población celular mediante lisis en una solución hipotónica (amortiguador de lisis ACK número de catálogo 10-548E; Lonza). Después de dos lavados más con PBS, las células libres de RBC se resuspendieron en una concentración de 4 x 10 células/mL en una Solución de Sal Equilibrada de Hank (HBSS; Mediatech, número de catálogo: 21-023-CV), la cual fue suplementada con calcio y magnesio y suplementada en forma adicional con 0.1% de gelatina (Sigma Aldrich; St. Louis, Missouri) [en lo sucesivo el amortiguador de ensayo].
Se agregó citocalasina B (Sigma Aldrich) a la suspensión celular en una cantidad suficiente para alcanzar una concentración de 10 pg/mL. La suspensión se incubó posteriormente durante 10 minutos a una temperatura de 37°C. Se agregaron 100 µ?_ de las células a depósitos de placas de 96 depósitos con fondo U. Los depósitos de la placa se agruparon en diferentes conjuntos. Cada uno de los diferentes conjuntos de depósitos contienen un anticuerpo anti-C5a: cada depósito del conjunto 1, contiene un anticuerpo humanizado que enlaza a C5 nativa, no disociada pero no a C5a libre; cada depósito del conjunto 2, contiene el anticuerpo anti-C5a humanizado BNJ367; cada depósito del conjunto 3, contiene el anticuerpo anti-C5a humanizado BNJ369; cada depósito del conjunto 4, contiene el anticuerpo anti-C5a humanizado BNJ371; cada depósito del conjunto 5, contiene el anticuerpo anti-C5a humanizado BNJ378; cada depósito del conjunto 6, contiene el anticuerpo anti-C5a humanizado BNJ381; y cada depósito del conjunto 7, contiene el anticuerpo anti-C5a humanizado BNJ383. Cada depósito de un octavo conjunto de depósitos, no contenía anticuerpo. Se evalúo un rango de concentraciones de anticuerpo en cada conjunto de depósitos, incluyendo el rango 0.08 nM, 0.4 nM, 2 nM, y 10 nM de anticuerpo.
Se evaluó C5a (obtenida de Complement Technologies, Inc.) en una concentración de 2 nM. Se preparó una concentración de operación 10X de 20 nM en el amortiguador de ensayo antes mencionado, y se agregaron 20 pl_ a cada depósito. Después de la adición de C5a a los depósitos, una placa se incubó durante 10 minutos a una temperatura de 37°C. Después de la incubación, se agregaron 60 pl_ de PBS a cada depósito de la placa. Las placas se sometieron a centrifugación en 1200 rpm (aproximadamente 335 x g) durante 10 minutos a temperatura ambiente. 100 µ?_ del sobrenadante de cada deposito el cual es transferido al depósito correspondiente de una segunda placa. Se agregaron 25 pL del substrato (Sigma Aldrich número de catálogo T0440) a cada deposito de la segunda placa, y la reacción de peroxidasa se dejó desarrollar durante aproximadamente de dos a cinco minutos. La reacción se terminó mediante la adición de 25 pL de 1N HCI. Se registró el OD en 450 nM.
Tal como se muestra en la figura 2, todos los anticuerpos anti-C5a humanizados inhibieron la activación de neutrófilo in vitro. Estos resultados indican que los anticuerpos anti-C5a humanizados aquí descritos son inhibidores potentes de la señalización in vitro transmitida por C5a y soportan la conclusión por parte de los inventores, de que los anticuerpos son útiles para tratar una variedad de trastornos asociados con complemento (por ejemplo, trastornos inflamatorios asociados con complemento) en humanos.
Ejemplo 6. Caracterización de un anticuerpo C5a anti-ratón. de ratón sustituto Se llevó a cabo una serie de ensayos de emparedado en un anticuerpo IgG anti-ratón de ratón seleccionado de C5a -5an195ME - para determinar la especificidad del anticuerpo para C5a. En síntesis, los depósitos de una placa de ensayo fueron recubiertos con el anticuerpo 5an195ME. La placa se lavó completamente para eliminar el anticuerpo no enlazado. Posteriormente, se contactaron los anticuerpos que contienen 5an195ME con C5a de ratón durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que el antígeno enlace al anticuerpo. Se eliminó la proteína no enlazada con lavado. Después del paso de lavado, los depósitos se contactaron en forma adicional con una solución que contiene un segundo anticuerpo anti-C5a biotinilado. Los depósitos se lavaron nuevamente para eliminar cualquier segundo anticuerpo no enlazado. La cantidad de enlace del segundo anticuerpo al depósito fue cuantificado utilizando peroxidasa de rábano conjugado con estreptavidina (HRP). La cantidad de enlace del segundo anticuerpo fue una función del enlace de C5a a 5an195ME.
En un experimento paralelo, se incubó un conjunto de depósitos recubiertos con 5an195ME con proteína C5 de ratón de longitud total, en lugar C5a. Después del paso de lavado, los depósitos se contactaron con una solución que contiene un segundo anticuerpo: un anticuerpo C5 anti-ratón biotinilado. La cantidad de enlace del segundo anticuerpo, como una función de la cantidad de C5 enlazado por 5an195ME, fue cuantificada utilizando la construcción HRP conjugada con estreptavidina. Una carencia de enlace del segundo anticuerpo indica que 5an195ME no enlaza a C5 de ratón de longitud total.
Aunque 5an195ME enlazó a C5a en una forma dependiente de la dosis, no se detectó enlace entre el anticuerpo y C5 de ratón de longitud total utilizando este ensayo. Estos resultados indican que 5an195ME enlaza al neo-epítope presente en C5a.
La afinidad de enlace relativa de 5an195ME para C5a de ratón, fue cuantificada en forma adicional utilizando BIAcore. Las cinéticas de un 5an195ME se midieron utilizando una técnica de captura. El anticuerpo se capturó mediante Anti-Fc (ratón) inmovilizado directamente en un chip de sensor CM5 con diversas concentraciones entre e incluyen de 0.4 nM y 25 nM de ratón C5a, pasado sobre la superficie del chip de sensor. Los duplicados de cada concentración también fueron corridos. La superficie del chip fue regenerada con 10 mM de glicina HCl pH 1.7 después de cada ciclo para eliminar el anticuerpo y el antígeno enlazado. Los datos se evaluaron utilizando el software Biacore BIAevaluation, utilizando un Ajuste de Modelo 1:1 Langmuir (Rmax:Global Fit; RLLocal Fit). La información de cinética es tal como ka (constante de Rango de Asociación), ka (constante de Rango de Disociación) y KD (constante de Disociación en Equilibrio) fue obtenida a partir del ajuste. Los resultados de los análisis cinéticos se muestran en la tabla 5. Tabla 5. Cinéticas Medidas de 5an195ME para C5a de Ratón Estos resultados indican que el anticuerpo C5a anti-ratón de ratón no es únicamente específico para C5a, en comparación con C5 de ratón de longitud total, sino que también el anticuerpo enlaza con alta afinidad a C5a de ratón.
Ejemplo 7. Uso del anticuerpo C5a anti-ratón sustituto 5an195ME en un modelo animal de RA Se evaluó el anticuerpo C5a anti-ratón con 5an195ME en un modelo de ratón con artritis inducida por colágeno. Se inmunizaron ratones DBA/ILacJ macho (9 a 12 semanas de edad) mediante inyección intradérmica en la base de la cola con 300 µg de colágeno de bovino tipo II emulsificado con volúmenes iguales de adyuvante completo de Freund. El procedimiento se repitió dos semanas después de la primera inmunización. Los ratones se inspeccionaron diariamente para identificar inflamación en un punto inicial de la rodilla. Una vez que se identificó la inflamación inicial, a los ratones se les administró en forma intraperitoneal tres veces/semana el anticuerpo C5a anti-ratón 5an195ME (40 mg/kg) o un anticuerpo de control (40 mg/kg). El grosor de la articulación inicialmente inflamada (en mm) se midió diariamente hasta el día 12.
Tal como se muestra en la figura 3, 5an195ME redujo el grosor de la articulación de la rodilla en comparación con el anticuerpo de control. 5an195ME pareció proporcionar el beneficio de mantener un grosor de articulación de la rodilla debajo de 4.5 mm. Además de evaluar la capacidad de un anticuerpo 5an195ME para reducir la hinchazón de la articulación de la rodilla inicialmente inflamada, también se evaluó la capacidad que tiene el anticuerpo anti-C5a 5an195ME para prevenir la migración de inflamación a nuevas articulaciones. El número de uniones recientemente reclutadas fue medido diariamente del día 1 al día 12. Los resultados del experimento se establecen en la Tabla 6.
Tabla 6. Eficacia de 5an195ME en Modelo RA Tal como se muestra en la Tabla 6, los ratones tratados con 5an195ME tuvieron marcadamente menos articulaciones inflamadas recientemente, en comparación con animales tratados con Ab de control en el día 12. Los ratones tratados con 5an195ME también tuvieron un promedio marcadamente menor de articulaciones inflamadas recientemente.
La artritis en los ratones también fue monitoreada y definida utilizando un índice de calificación/artritis clínica. Cada extremidad fue graduada diariamente de acuerdo con un sistema de calificación establecido (0, articulación normal; 1, eritema visible leve/moderado e hinchazón; 2, eritema severo e hinchazón que afecta toda la pata o articulación; 3, pata o articulación deformada con anquilosis), con una calificación máxima de veinticuatro por animal. Ver por ejemplo, la Publicación de Wang y asociados (2000) Jlmmunol 164:4340-4347. Tal como se muestra en la figura 4, los ratones tratados con anticuerpo C5a anti-ratón anticuerpo 5an195ME exhibieron una marcada reducción en la calificación clínica (calificación promedio menor a 1) en comparación con los ratones tratados con el anticuerpo de control (calificación promedio arriba de 6) durante el curso del estudio.
En síntesis, estos resultados indican que C5a anti-ratón sustituto es efectivo para tratar RA - tanto en una articulación inicial como en la migración de inflamación a articulaciones secundarias - en el modelo de enfermedad de ratón. Los resultados también sugieren fuertemente que un anticuerpo C5a anti-humano terapéutico, tal como cualquiera de los anticuerpos anti-C5a humanizados aquí descritos, es útil para tratar humanos con RA.
Ejemplo 8. Uso de un anticuerpo anti-C5a para tratar artritis reumatoide Se identificó un paciente humano a través de un practicante médico como teniendo artritis reumatoide en una articulación articulada simple. Al paciente se le administró en corto en forma intraarticular o intraperitoneal, una composición que contiene el anticuerpo anti-C5a humanizado aquí descrito en una cantidad suficiente para reducir localmente la señalización C5aR1 transmitida por C5a dentro del espacio de articulación. El paciente y el practicante médico observaron una mejoría sustancial en al menos dos síntomas conocidos de artritis reumatoide después del tratamiento. El paciente recibe "dosis de mantenimiento" administradas en forma intravenosa del anticuerpo cada mes para evitar el resurgimiento de los síntomas, para evitar el progreso de RA en la articulación simple o para prevenir la migración de síntomas RA a una segunda articulación.
Ejemplo 9. Uso de un anticuerpo anti-C5a para tratar sepsis Un paciente humano fue identificado por un practicante médico como teniendo sepsis. Al paciente se le administró posteriormente en corto una composición que contiene un anticuerpo anti-C5a humanizado aquí descrito en una dosis de aproximadamente 600 a 900 mg por medio de infusión intravenosa. El paciente y el practicante médico observaron una mejoría sustancial en al menos dos síntomas conocidos de sepsis durante el tratamiento. El paciente recibe "dosis de mantenimiento" administradas en forma intravenosa del anticuerpo cada dos semanas hasta que el paciente abandonó el hospital.
Ejemplo 10. Uso de un anticuerpo anti-C5a para tratar trastornos inflamatorios pulmonares asociados con complemento Un paciente humano fue identificado por un practicante médico como teniendo una forma severa de COPD. Una vez cada dos semanas durante cuatro semanas, al paciente se le administró una composición que contiene un anticuerpo anti-C5a humanizado en una dosis de aproximadamente 600 mg a 900 mg mediante infusión intravenosa. El paciente y el practicante médico observaron una mejoría sustancial en al menos dos síntomas conocidos de COPD durante el tratamiento inicial. Por ejemplo, el paciente que recibe el anticuerpo anti-C5a tiene una frecuencia y/o severidad reducida de exacerbaciones relacionadas con COPD. El paciente continúa recibiendo "dosis de mantenimiento" administradas en forma intravenosa del anticuerpo cada dos semanas, para mantener la frecuencia y/o severidad reducida de las exacerbaciones relacionadas con COPD.
Un paciente humano fue identificado por un practicante médico como teniendo una forma severa de asma. Al paciente se le prescribió un anticuerpo anti-C5a humanizado, terapéutico que será administrado por medio de un inhalador. Durante el siguiente ataque de broncoespasmo, el paciente se auto-administró el anticuerpo anti-C5a en una cantidad suficiente para reducir la respuesta inflamatoria transmitida por C5a en los pulmones del paciente. El paciente continúa utilizando el inhalador según sea necesario para evitar o disminuir la severidad de los ataques de asma.
Ejemplo 11. Anticuerpos anti-C5a adicionales identificados de los ratones inmunizados Se obtuvieron diversos anticuerpos adicionales de los ratones inmunizados (ver Ejemplo 1) y se identificaron en forma adicional mediante ELISA como con la capacidad de enlazar a C5a humana. Los anticuerpos adicionales incluyen 15 conjuntos CDR de cadena ligera únicos (establecidos en la tabla 7) y 14 conjuntos CDR de cadena pesada únicos tal como se establece en la Tabla 8).
Tabla 7. Secuencias de Aminoácido de Diversas Secuencias CDR de Cadena Ligera Definidas por Kabat v V¡_ únicas de Anticuerpos C5a Anti-humano de Múrido Adicionales "SIN" en la tabla se refiere a "SEC ID NO." *Las secuencias de aminoácido CDR se definen de acuerdo con Kabat y asociados (supra).
Tabla 8. Secuencias de Aminoácido de Diversas Secuencias CDR de Cadena Pesada Definidas por Kabath y VH únicas de Anticuerpos C5a Anti-humano de Múrido Adicionales "SIN" en la tabla se refiere a "SEC ID NO".
*Las secuencias de aminoácido CDR se definen de acuerdo con Kabat y asociados {supra).
Los emparejamientos VL y VH que dan surgimiento a los anticuerpos 5an177ME, 5an054ME, 5an110ME, 5an 88ME, 5an185ME, y 5an107ME son evidentes a partir de las tablas 7 y 8. Los emparejamientos de ejemplo adicionales de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera y/o los conjuntos CDR se establecen en la Tabla 9 que se encuentra a continuación.
Tabla 9: Secuencias de Aminoácido de Conjunto CDR de Anticuerpos C5a Anti-humano de Ratón Adicionales "SIN" en la tabla se refiere a "SEC ID NO".
*Las secuencias de aminoácido CDR se definen de acuerdo con Kabat y asociados (supra).
Ejemplo 12. Anticuerpos C5a anti-humano humanizados adicionales Se generaron diversas regiones variables de cadena pesada de anticuerpo anti-C5a humanizada adicionales, las cuales todas cuando se emparejaron con una región variable ligera común (teniendo la cadena ligera una secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO: 16) enlazaron a C5a humano con una KD menor a 1 nM tal como se determina mediante análisis Biacore (ver anteriormente para metodología).
Todos estos anticuerpos humanizados adicionales se enlazaron específicamente a C5a humano, pero no a C5, C4a, o C3a humano completamente doblado, nativo tal como se determina mediante análisis Octet (ver anteriormente para metodología). Los anticuerpos humanizados adicionales contenían: (i) una región de estructura de región variable 1 de cadena pesada que contiene una de las siguientes secuencias de aminoácido: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG YTFT (SEC ID NO:68) o QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEC ID NO:69); (ii) una región de estructura de región variable 2 de cadena pesada que contiene una de las siguientes secuencias de aminoácido: WVRQAPGQGLEWMG (SEC ID NO:70) o WVRQASGKGLEWVG (SEC ID NO:71); (iii) una región de estructura de región variable 3 de cadena pesada que contiene las siguientes secuencias de aminoácido: RVTITRDTSASTAYM ELSSL SEDTAVYYCAR (SEC ID NO:72); RVTITAD ESTSTAYM ELSSLRSEDTAVYYCAR (SEC ID NO:73); o RVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCAR (SEC ID NO:74); y una región de estructura de región variable 4 de cadena pesada que contiene la siguiente secuencia: WGQGTTVTVSS (SEC ID NO:75). Las regiones variables de cadena pesada humanizadas adicionales de ejemplo que comprenden uno o más de los conjuntos de estructura humanizados adicionales descritos en esta sección, se establecen en la figura 5.
Ejemplo 13. Uso de un anticuerpo C5a anti-humano en un modelo de neutropenia de ratón Se utilizó un modelo de múrido de neutropenia-C5a para evaluar la eficacia in vivo de un anticuerpo C5a libre anti-humano. Para inducir neutropenia, se administró C5a humana (hC5a) nativa, purificada por medio de inyección intravenosa en la vena de la cola a ratones Balb/c. El número de neutrófilos en la circulación fue evaluado hasta 5 minutos después de la administración de hC5a.
Se descubrió que la administración de 300 g/kg de hC5a induce de manera consistente la activación de neutrófilos tal como se mide mediante ensayo de liberación de mieloperoxidasa (MPO) (ver Ejemplo 5 para utilizarse con suero en comparación con sobrenadante de cultivo celular; supra) y neutropenia (una reducción en el número de neutrófilos en la circulación). Además, los niveles en plasma de hC5a y del anticuerpo anti-C5a humano BNJ383 (cuando se administra a ratones, infra) también se midió para establecer la respuesta farmacodinámica (ver más adelante).
Se revisaron los conteos de neutrófilo de sangre periférica antes del estímulo con hC5a o control de vehículo. En comparación con los ratones de control tratados en forma simulada (1.37 ± 0.09 x 106 /ml_), los conteos de neutrófilo en ratones tratados con anticuerpo C5a libre anti-humano (1.32 ± 0.13 x 106 por mL de 24 mg/kg; P > 0.05) o mAb de control de isotipo (1.31 ± 0.10 x 106 por ml_ de 24 mg/kg; P>0.05) permanecieron igual. Estos resultados indicaron que el anticuerpo solo no induce cambios en los conteos de neutrofilo en la circulación.
Para evaluar la eficacia de un anticuerpo anti-C5a para inhibir neutropenia inducida por hC5a en ratones, se administraron diferentes dosis (24 mg/kg, 12 mg/kg, 6 mg/kg, y 3 mg/kg) del anticuerpo C5a anti-humano BNJ383 a ratones Balb/c 24 horas antes de la inyección hC5a. La administración del anticuerpo anti-C5a 24 horas antes de hC5a, permitió que las propiedades farmacodinámicas del anticuerpo fueran estudiadas durante la fase-p de la eliminación del anticuerpo de los ratones.
Tal como se muestra en la figura 6, los conteos de neutrofilo después de tratamiento se expresaron como un porcentaje de "línea de base" (en donde el conteo en el tiempo 0 es igual al 100%). En ratones de control tratados en forma simulada, los conteos de neutrofilo fueron 79.02 ± 5.71%, 67.42 ± 3.23%, y 59.54 ± 2.11% de línea de base y 1, 3 y 5 minutos posteriores a la administración hC5a, respectivamente. Los ratones tratados con anticuerpo de control de isotipo demostraron una significativa reducción (P<0.01) en el conteo de neutrofilo 6.76 ± 0.81% en 1 minuto, 6.68 ± 0.81% en 3 minutos, y 8.29 ± 0.79% en 5 minutos después de la inyección intravenosa de hC5a. El anticuerpo anti-C5a exhibió un efecto dependiente de la dosis en la neutropenia inducida por hC5a. En la dosis más alta, 24 mg/kg, el anticuerpo anti-C5a bloqueo completamente la neutropenia. Los conteos de neutrófilo fueron 70.35 ± 8.64% en 1 minuto, 63.35 ± 6.08% en 3 minutos, y 59.65 ± 6.51% en 5 minutos, lo cual fue comparable con los niveles de neutrófilo en animales de control tratados en forma simulada en los mismos puntos de tiempo. Las dosis menores a 12 mg/kg o 6 mg/kg del anticuerpo anti-C5a también inhibieron en forma significativa el agotamiento de neutrófilo (12 mg/kg: 42.61 ± 5.12% en 1 minuto, 45.33 ± 8.29% en 3 minutos, y 41.02 ± 7.08% en 5 minutos, P<0.01¡ 6 mg/kg: 18.00 ± 3.8 en 1 minuto, 26.20 ± 4.44% en 3 minutos, y 28.03 ± 4.51% en 5 minutos, P<0.05) después de la administración de hC5a, en comparación con el grupo de anticuerpo de control de isotipo (6.76 ± 0.81% en 1 minuto, 6.68 ± 0.81% en 3 minutos, y 8.29 ± 0.79% en 5 minutos). El anticuerpo de control de isotipos es un anticuerpo que enlaza al antígeno 63 de protección contra ántrax y contiene una región Fe de isotipo lgG2/4 humana. La administración de la dosis más baja del anticuerpo anti-C5a (3 mg/kg), no redujo en forma significativa la neutropenia (6.28 ± 0.88% en 1 minuto, 6.71 ± 2.14% en 3 minutos, y 8.75 ± 2.98% en 5 minutos, P>0.05). Ver figura 6.
El anticuerpo C5a anti-h umano inhibe la liberación in vivo de MPO inducida por hC5A Tal como se describió anteriormente, C5a humano activa los neutrófilos a través del enlace de reacción cruzada en el receptor C5a de ratón. La liberación de mieloperoxidasa (MPO) es una consecuencia de la activación de neutrófilo a través de C5a que enlaza a C5aR. Ver la Publicación de Barren y asociados (2004) Mol Pharm 65(4):868-879. La inyección intravenosa de C5a humano recombinante en el ratón, puede inducir neutropenia y activar los neutrófilos en la circulación. La capacidad del anticuerpo C5a libre anti-humano de inhibir la liberación de MPO debido a la activación de neutrófilo in vivo, fue evaluada utilizando el anticuerpo anti-C5a para enlazar a hC5a libre, y evitar el enlace a C5aR de múrido.
Se llevó a cabo tal como se describió anteriormente un experimento in vivo (en donde C5a humano se administró a los ratones). El nivel de MPO en plasma en el tiempo 0 fue de 79.25 ± 22.88 ng/mL en el grupo de control tratado en forma simulada. Cinco minutos después de la inyección intravenosa de amortiguador de vehículo, los niveles de MPO no cambiaron significativamente (77.46 ± 21.21 ng/mL, P>0.05). Antes de la inyección intravenosa hC5a, los niveles MPO en los animales tratados con control de isotipo (75.17 ± 14.66 ng/mL) o tratados con anticuerpo anti-C5a (87.57 ± 14.86 ng/mL) fueron comparables con los niveles observados en los animales de control tratados en forma simulada. Después de la inyección intravenosa de hC5a, los niveles MPO en todas las dosis de C5a, fueron elevados y permanecieron en niveles significativamente mayores a los 5 minutos (figura 7).
Cuando se comparó con animales tratados con anticuerpo de control de isotipo (221.00 ± 51.02 ng/mL), los animales tratados con anticuerpo anti-hC5a mostraron una reducción en los niveles MPO dependiente de la dosis (114.83 ± 23.26 ng/mL, P<0.05, en 24 mg/kg de cohorte; 104.80 ± 29.83 ng/mL, P<0.05, en 12 mg/kg de cohorte; y 126.90 ± 36.40 ng/mL, P = 0.08, en 6 mg/kg cohorte). Los niveles MPO de animales tratados con anticuerpo anti-C5a en baja dosis (3 mg/kg) (176.55 ± 23.05 ng/mL) no fueron significativamente diferentes de los animales tratados con anticuerpo de control de isotipo (P>0.05).
Un anticuerpo anti-C5a reduce los niveles de hC5a en la circulación en ratones Tal como se observó anteriormente C5a es un péptido inflamatorio potente con diversas funciones biológicas. Estos estudios anteriores demostraron que C5a humano reacciona en forma cruzada con C5aR de múrido en neutrófilos ya que la inyección intravenosa de C5a humana recombinante puede inducir neutropenia. Aunque la presente descripción no está limitada en forma alguna por teoría o mecanismo de acción en particular, el anticuerpo anti-C5a puede inhibir la neutropenia inducida por C5a humana formando complejos con hC5a y evitando que hC5a enlace a C5aR de múrido expresada en la superficie celular. Se midieron los niveles de hC5a en el plasma de ratones antes de 1, 3, y 5 minutos después de la administración intravenosa de hC5a para confirmar que los efectos del anticuerpo anti-hC5a in vivo, fueron debido a su inhibición de hC5a dependiente del enlace.
Se llevó a cabo un experimento tal como se describió anteriormente utilizando el modelo de neutropenia inducida por hC5a de ratón. hC5a no fue detectado en plasma en algún grupo de ratones antes de la administración de hC5a en el tiempo 0, utilizando un ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas (ELISA). El nivel de hC5a en plasma, sin embargo, incrementa un pico de 1 minuto (7783.50 ± 327.73 ng/mL), posteriormente se redujo a 4788.38 ± 260.51 ng/mL en 3 minutos, y posteriormente a 3855.75 ± 298.99 ng/mL en 5 minutos seguido de inyección intravenosa de hC5a (un ratón tratado con mAb de control de isotipo). En comparación con los ratones tratados con anticuerpo de control, el nivel de hC5a en los ratones tratados con 24 mg/kg del anticuerpo anti-C5a exhibieron 43, 30 y 23 veces de disminución en 1 minuto (178.4 ± 14.14 ng/mL), 3 minutos (158.4 ± 10.43 ng/mL), y 5 minutos (167.2 ± 15.61 ng/mL), respectivamente. El nivel de hC5a en plasma de los cohortes de 12 mg/kg y 6 mg/kg fue de 235.00 ± 22.33 y 609.20 ± 78.75 ng/mL en 1 minuto, 210.80 ± 19.59 y 527.60 ± 52.25 ng/mL en 3 minutos, 192.20 ± 7.40 y 505.00 ± 45.96 ng/mL en 5 minutos, respectivamente. Los ratones tratados con anti-C5a exhibieron niveles de hC5a significativamente reducidos en una forma dependiente de la dosis durante la neutropenia, después de inyección intravenosa de hC5a (P <0.001). Aunque los ratones recibieron la dosis más baja del anticuerpo anti-C5a (3 mg/kg), no se salvaron de la neutropenia inducida por hC5a, sin embargo los ratones tuvieron una reducción significativa en hC5a de plasma (3130.40 ± 433.58 ng/mL en 1 minuto; 1932.00 ± 268.92 ng/mL en 3 minutos; 1593.00 ± 169.68 ng/mL en 5 minutos) en comparación con los niveles de hC5a en plasma encontrados en los ratones tratados con anticuerpo de control de isotipo (P <0.05). Ver la figura 8. Estos datos indicaron que la administración del anticuerpo anti-C5a a los ratones, disminuye en forma significativa la concentración de hC5a libre en plasma, dando como resultado neutropenia inducida por hC5a disminuida en gran parte.
Tomados juntos, estos resultados presentados én esta sección, indicaron que un anticuerpo C5a anti-humano aquí descrito puede inhibir el efecto biológico de C5a humano en una preparación de enfermedad in vivo y proporcionan una fuerte evidencia de que los anticuerpos (y los fragmentos de enlace de antígeno de los mismos son útiles, entre otras cosas, para tratar y prevenir los trastornos asociados con complemento, tal como los aquí mencionados.
Ejemplo 14. El anticuerpo C5a anti-humano reacciona en forma cruzada con C5a de primates no humanos Se probaron diversos anticuerpos anti-hC5a humanizados con respecto a su capacidad de reaccionar en forma cruzada con C5a de una o más especies de mamífero no humano. Tal como se observó anteriormente, los beneficios de dicho anticuerpo anti-C5a son numerosos, por ejemplo, la capacidad de que un practicante médico o investigador modele la eficacia de un anticuerpo anti-C5a terapéutico en un modelo de enfermedad no humana antes de administrar el anticuerpo a humanos. Las pruebas en mamíferos no humanos, también pueden permitir la determinación o aproximación de la dosificación adecuada del anticuerpo anti-C5a requerida para eficacia en humanos.
En síntesis, BNJ369, BNJ366, BNJ364 y BNJ383 (descritos anteriormente) se evaluaron para determinar si pueden co-inmunoprecipitar la proteína C5a en el suero activado de diversos primates no humanos incluyendo babuino, macaco rhesus y macaco cinomolgo. El suero fue activado mediante la adición de zimosan. Después de incubación durante la noche de cada anticuerpo con suero activado, los anticuerpos se separaron de la fase de solución utilizando las cuentas de agarosa conjugadas con proteína. Las cuentas se lavaron profundamente y posteriormente se hirvieron en un amortiguador de muestra de electroforesis de gel de poliacrilamida-sulfato dodecilo de sodio (SDS-PAGE) que contiene ß-mercaptoetanol. Las muestras hervidas posteriormente se sometieron a SDS-PAGE. Se detectó C5a de primate no humano mediante manchado Western utilizando el anticuerpo de neoepítope anti-C5a comercialmente disponible #2942 (Abcam, Cambridge, MA). Cada uno de los anticuerpos probados tuvo la capacidad de inmunoprecipitar C5a (o C5a desarginada) de babuino, macaco rhesus y macaco cinomolgo, lo que indica que el anticuerpo reacciona en forma cruzada con C5a de estas especies así como con C5a humana.
La determinación de los parámetros de afinidad de enlace a C5a de macaco cinomolgo, se determinó tal como se indicó anteriormente. En síntesis, el anticuerpo BNJ383 fue clasificado contra 3 a 4 concentraciones de C5a de macaco cinomolgo recombinante (antígeno) utilizando una técnica de captura tal como se describió anteriormente. El anticuerpo fue capturado por un Anti-Fc (humano) directamente inmovilizado en un chip de sensor CM5 con diversas concentraciones dentro del rango de 0.6 nM a 5.9 nM de C5a de cinomolgo, pasado sobre la superficie del chip de sensor. La superficie se regeneró con 20 mM HCI, 0.02% de tensoactivo P20 (Biacore) después de cada ciclo para eliminar el anticuerpo y el antígeno enlazados. Los datos se evaluaron utilizando el software Biacore BIAevaluation utilizando un Ajuste de Modelo Langmuir 1:1 (Rmax:Global Fit; RhLocal Fit). Estos experimentos fueron con propósitos de clasificación con un número mínimo de concentraciones de material para análisis (3 a 4) con un duplicado. La KD aproximada del anticuerpo para macaco cinomolgo C5a es de 3.3 nM. Ver Tabla 10.
Tabla 10. Determinación de Afinidad para Proteína C5a no Humana * Esto es únicamente una aproximación de la KD basada en la calidad del ajuste de la curva.
El anticuerpo BNJ383 también fue clasificado contra 3 a 4 concentraciones de C5a de ratón recombinante (antígeno) utilizando una técnica de captura tal como se déscribió anteriormente para determinar su afinidad para proteína de ratón. El anticuerpo se capturó, tal como se déscribió anteriormente, a través de un anti-Fc (humano) directamente inmovilizado en un chip de sensor CM5 con diversas concentraciones dentro del rango de 0.6 nM a 5.9 nM de C5a de ratón, pasado sobre la superficie de chip de sensor. La superficie se regeneró con 20 mM HCI, 0.02% P20 después de cada ciclo para eliminar el anticuerpo y antígeno enlazados. Los datos se evaluaron utilizando el software Biacore Bl Aevaluation utilizando el Ajuste de Modelo Langmuir 1:1 (Rmax:Global Fit; RhLocal Fit).
Los resultados anteriores indicaron que diversos de los anticuerpo anti-hC5a humanizados aquí descritos reaccionan en forma cruzada con C5a de diversas especies de primate no humano incluyendo macaco cinomolgo, macaco rhesus y babuino. El anticuerpo BNJ383, por ejemplo, también reacciona en forma cruzada, además, los resultados descritos en esta sección indican que un anticuerpo C5a anti-humano, tal como BNJ383, es útil no únicamente en aplicaciones clínicas para tratar trastornos asociados con complemento, sino también en una variedad de aplicaciones pre-clínicas en mamíferos no humanos, los cuales son necesarios para, o para el soporte de la aprobación de uso clínico en humanos.
Ejemplo 15. Competición para enlace a C5a Se llevó a cabo un experimento para evaluar el enlace de un anticuerpo anti-C5a aquí descrito, BNJ383, en la presencia de antígenos potencialmente competitivos. En síntesis, se incubó BNJ383 etiquetado con rutenio (250 pM) durante dos horas a temperatura ambiente con 1 n de C5a biotiinilada, junto con diversas concentraciones (por ejemplo, 400, 133, 44.4, 14.8, 4.9, 1.6 y 0.5 nM) de uno de los siguientes: (a) proteína de C5a desarginada humana en solución salina amortiguada con fosfato, (b) plasma humana, (c) plasma de macaco cinomolgo, (d) plasma de Balb/C (ratón), o (e) plasma de DBA/2J (ratón). Con respecto a los componentes de plasma (b), (c), (d) y (e), la concentración se refiere a la concentración final aproximada del antígeno C5 en la mezcla de incubación.
Después del período de incubación, las muestras se contactaron con depósitos individuales respectivos de una placa de ensayo recubierta con estreptavidina bajo condiciones que permiten el enlace de C5a biotinilada a estreptavidina en los depósitos de la placa. Los depósitos se lavaron completamente hasta eliminar el material no enlazado. La cantidad de enlace de BNJ383 a C5a en la presencia de competidor, fue determinada detectando la cantidad de señal producida de la etiqueta de rutenio detectable. Los resultados se muestran en la figura 9.
Mientras que C5a desarginada humana fue un competidor efectivo, virtualmente no hubo competición observada en la presencia de suero de ratón (17% de reducción en la señal detectable observada en aproximadamente una proporción de 400:1 de C5 derivada de plasma de ratón Balb/c a C5a humana biotinilada, y el 25% de reducción en la señal observada en aproximadamente una proporción de 400:1 de C5 derivada de plasma DBA2/J a C5a humana biotinilada). No se observó cambio en el nivel de enlace de BNJ383 a C5a humana biotinilada hasta en una proporción de aproximadamente 15:1 de C5 derivada de plasma de humano o macaco cinomolgo a C5a humana biotinilada.
Tal como se observó anteriormente, aunque la presente descripción no está limitada en forma alguna a teoría o mecanismo de acción particular, los inventores de la presente invención hipotetizan que el anticuerpo anti-C5a puede enlazar a una subpoblación de C5 procesada, no disociada (por ejemplo, C5 en plasma) que constituye menos del 10% de la población total de C5 de longitud total en una muestra (por ejemplo, una muestra en plasma) en donde la subpoblación está desnaturalizada en su totalidad o en parte, de modo que se expone un neoepítope C5a ocluido de otra manera, al cual enlaza el anticuerpo o fragmento anti-C5a. Por lo tanto, se considera que el anticuerpo no enlaza a una especie de C5 completamente funcional y/o completamente funcional y por lo tanto no enlaza realmente a C5 nativa, no disociada. El plasma humano es un competidor al menos aproximadamente de 30 a 100 veces más débil para enlazar a C5a biotinilado que C5a desarginada humana.
No obstante estas consideraciones, estos resultados indican en forma adicional que los anticuerpos C5a anti-humano aquí descritos, tales como BNJ383, enlazan preferentemente a C5a humana libre, incluso en la presencia de hasta aproximadamente un exceso de 20 veces de proteína C5 humana derivada de plasma no disociada, pero no necesariamente completamente nativa.
Ejemplo 16. Efecto de anticuerpo anti-C5a en actividad AP v CP in vitro Se llevó a cabo un experimento para evaluar el efecto de un anticuerpo anti-C5a aquí descrito (BNJ383) en la actividad de complemento de la trayectoria alternativa (AP) in vitro, utilizando suero de humano normal recolectado (PNHS). El experimento utilizó el Equipo de Complemento de Trayectoria Alternativa Wieslab® (Wieslab® COMPL AP330, Euro-Diagnostica, Suecia) y se siguió el protocolo asociado únicamente con optimización de rutina que está dentro del alcance de un experto en la técnica. En síntesis las alícuotas de PNHS se incubaron en depósitos de una placa recubierta con lipopolisacárido durante una hora (a una temperatura de 37°C) junto con varias concentraciones (0.778, 0.389, 0.194, 0.097, 0.049, 0.024, 0.012, 0.006, 0.003 y 0.002 µ?) de un anticuerpo anti-hC5 o un anticuerpo anti-hC5a (BNJ383). El anticuerpo anti-C5 inhibe la disociación de C5 humana en fragmentos C5a y C5b. Como un control negativo, se incubaron diversos depósitos con PNHS bajo las mismas condiciones, pero en la ausencia de anticuerpo anti-hC5 o anticuerpo anti-hC5a.
Después de la incubación, los depósitos se lavaron completamente con el amortiguador de lavado 1X suministrado en el equipo. El nivel de activación de complemento de trayectoria alternativa se midió mediante absorbancia en 405 nm, después del contacto de cada depósito con el conjugado de enzima suministrado en el equipo (un anticuerpo anti-C5b-9 conjugado a fosfatasa alcalina) y substrato fluorogénico (el cual es operado por la enzima) y la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los resultados se muestran en la figura 10.
Aunque el anticuerpo anti-C5 inhibió completamente la actividad de complemento de trayectoria alternativa en concentraciones mayores a 0.1 µ?, el anticuerpo anti-hC5a no inhibe significativamente la actividad de complemento incluso en la más alta concentración probada.
Se llevó a cabo un experimento para evaluar el efecto de un anticuerpo anti-C5a aquí descrito (BNJ383) en la actividad de complemento de trayectoria clásica (CP) in vitro utilizando PNHS. El experimento utilizó el Equipo de Complemento de Trayectoria Clásica Wieslab® (Wieslab® COMPL CP310, Euro-Diagnostica, Suecia) y se siguió el protocolo asociado únicamente con un depósito de optimización de rutina dentro del alcance de los expertos en la técnica. Se incubaron alícuotas de PNHS en los depósitos de una placa recubierta con anticuerpo IgM humano durante una hora (a una temperatura de 37°C) junto con diversas concentraciones (7.2, 3.6, 1.8, 0.9, 0.45, 0.2, 0.1, 0.05, 0.02 ó 0.01 µ?) de un anticuerpo anti-hC5 o un anticuerpo anti-hC5a (BNJ383). El anticuerpo anti-C5 inhibe la disociación de C5 humana en los fragmentos C5a y C5b. Como control, se incubaron diversos depósitos con PNHS bajo las mismas condiciones, pero en la ausencia del anticuerpo anti-hC5 o anticuerpo anti-hC5a.
Después de la incubación, los depósitos se lavaron completamente con un amortiguador de lavado 1X suministrado en el equipo. El nivel de activación de complemento de trayectoria alternativa se midió mediante absorbancia en 405 nm, después del contacto de cada depósito con un conjugado de enzima suministrado en el equipo (un anticuerpo anti-C5b-9 conjugado para fosfatase alcalina) y substrato fluorogénico (el cual es operado en el momento por la enzima) e incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los resultados se muestran en la figura 11.
Aunque el anticuerpo anti-C5 inhibió completamente la actividad de complemento de la trayectoria clásica en concentraciones mayores a 0.1 µ?, el anticuerpo anti-hC5a no inhibe en forma significativa la actividad de complemento, incluso en la más alta concentración probada.
Tomados juntos, estos resultados indican que, in vitro, el anticuerpo anti-hC5a, BNJ383, no afectó en forma significativa la generación de C5b-9 (activación de complemento terminal) operada ya sea por la trayectoria de complemento clásica o alternativa, proporcionando de esta forma una evidencia adicional de que los anticuerpos anti-hC5a aquí descritos dirigen específicamente el brazo de anafilotoxina C5a libre de la activación de complemento.
Ejemplo 17. El anticuerpo anti-C5a retiene un sitio de enlace de antíqeno no ocupado disponibles para enlace a C5a. incluso en la presencia de un exceso molar de hC5 El anticuerpo anti-C5a BNJ383 (establecido anteriormente) se incubó a una temperatura de 4°C durante 84 horas en la presencia de un exceso molar de 2.1 veces de C5 humana (hC5) para permitir la formación completa de complejo de anticuerpo: C5. Se llevó a cabo un experimento paralelo utilizando un anticuerpo que enlaza a C5 humana en una estequiometria de 2:1 (en lo sucesivo el anticuerpo anti-C5). Los complejos de anticuerpo: C5 fueron resueltos en una columna de exclusión por tamaño TSK™ G4000 SW (Tosoh, Tokio) utilizando el sistema HPLC Waters™ 2690/5 con un detector de longitud de onda dual Waters™ W2487 para determinar la ocupación de los sitios de enlace. Se monitorearon los picos en una longitud de onda de 214 nm. La fase móvil para el análisis HPLC contenía la siguiente composición de amortiguación: 3.9 mM NáH2P0 , 6.1 mM Na2HP04 y 150 mM NaCI, en pH7.0. El rango de flujo fue de 1.0 mi por minuto y el tiempo de corrida fue de 20 minutos. Los datos fueron adquiridos y analizados con un software de cromatografía Waters Empower™ 2.
Tal como se ilustra en la figura 12, BNJ383 solo (figura 12A) y hC5 solo (figura 12B), cada uno se resuelven como un pico simple centrado alrededor de 10.2 minutos y >95% de los complejos de anticuerpo anti-C5a:hC5 se resuelven como un pico centrado alrededor de 9.2 minutos (figura 12C). En contraste, los complejos de hC5 y el anticuerpo anti-C5 se resuelven en dos picos centrados en 8.6 minutos (39%) y 9.2 minutos (61%) (figura 12D). Por lo tanto, incluso en un exceso molar de hC5, el 95.2% de BNJ383 tiene un brazo de Fab libre que puede tener la capacidad de enlazar a C5a humana.
Estas muestras fueron regresadas en forma adicional para determinar si el anticuerpo BNJ383 retuvo la capacidad de enlazar a C5a en la presencia de concentraciones de saturación de C5. El anticuerpo libre o los complejos de anticuerpo: C5 fueron titulados de 500 a 0.5 ng/mL en una placa recubierta con estreptavidina en la cual se inmovilizó el hC5a conjugado con biotina. El anticuerpo capturado fue detectado con un anticuerpo Fe anti-humano conjugado para peroxidasa de rábano. Los resultados ilustrados en la figura 13 demuestran que incluso BNJ383 en complejo con hC5, tiene la capacidad de enlazar C5a, y que la concentración del anticuerpo disponible para enlazar a C5a no se disminuye en forma detectable en la presencia de C5 de saturación. Por lo tanto, los resultados aquí descritos indican que el anticuerpo, incluso en la presencia de un exceso molar de C5 no disociada, retiene la capacidad de enlazar a C5a libre con alta afinidad, y de esta forma retiene, incluso en dicho exceso molar, la capacidad de inhibir la actividad pro-inflamatoria de C5a.
Ejemplo 18. BNJ383 es un potente agonista de C5a. pero es un antagonista incompleto/parcial de la formación de complejo de complemento terminal in vivo A macacos cinomolgos se les administró en forma intravenosa una dosis simple del anticuerpo anti-C5a BNJ383 en 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg 250 mg/kg o 400 mg/kg. Se recolectaron muestras de plasma de los macacos en los puntos de tiempo que fluctúan de 1 día a 30 días después de la administración del anticuerpo. Los niveles de C5a/C5a desarginada en plasma fueron determinados a través de un ensayo electroquimioluminiscente (ECL) en el cual se capturó un C5a/C5a desarginado libre en una placa de microtitulación recubierta con un anticuerpo específico para un neoepítope en C5a/C5a desarginada, y se detectaron con un anticuerpo C5a no competitivo conjugado para una porción ECL que contiene rutenato y se leyeron en un lector de placa SECTOR 2400™ (MesoScale Discovery). Se determinaron las concentraciones de anticuerpo en la circulación mediante ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzima (ELISA) en el cual, el anticuerpo libre (BNJ383) fue capturado en una placa de microtitulación recubierta con C5a desarginada humana, y se detectaron con un anticuerpo anti-humano de ratón conjugado para peroxidasa de rábano (HRP).
Tal como se muestra en la figura 14, igual que los resultados descritos en el ejemplo 13, las concentraciones en la circulación de BNJ383 tan bajas como de 10 g/mL, agotan los niveles de C5a/C5a desarginada en plasma a debajo de límites detectables en monos cinomolgo. Estos resultados también subrayan que el anticuerpo, incluso en la presencia de un exceso molar de C5 no disociada, retiene la capacidad de enlazar a C5a libre con alta afinidad y de esta forma retiene, incluso en dicho exceso molar, la capacidad de inhibir la actividad pro-inflamatoria de C5a.
Para determinar si BNJ383 tuvo un efecto en la actividad hemolítica de suero de macaco, el anticuerpo fue evaluado en un ensayo de hemolisis de glóbulo rojo in vitro.
El ensayo de hemolisis de glóbulo rojo generalmente se describe con detalle por ejemplo en la Publicación de Rinder y asociados (1995) J Clin Invest 96.: 1564-1572. En síntesis, las muestras de suero obtenidas de macacos a los que se les administró BNJ383 (tal como se describió anteriormente), fueron agregadas a depósitos múltiples de una placa de ensayo de 96 depósitos, de modo que la concentración del suero en cada depósito fuera de aproximadamente el 10%. Las muestras de suero, en virtud de los puntos de tiempo en los cuales se obtuvieron, contenían varias concentraciones del anticuerpo BNJ383. La actividad hemolítica de suero de macacos que no reciben BNJ383, sirvió como un control negativo y como el nivel de actividad hemolítica de línea de base.
Se lavaron eritrocitos de pollo (Lampire Biological Laboratories, Piperville, PA) y se resuspendieron en amortiguador en una concentración final de 5 x 107 células/mL. Los eritrocitos fueron sensibilizados para lisis incubando las células con una composición de anticuerpo policlonal de glóbulo rojo anti-pollo. Se agregaron los eritrocitos sensibilizados a los depósitos de una placa de 96 depósitos, y la placa se incubó a una temperatura de 37°C durante 30 minutos. Se midió la liberación de hemoglobina mediante absorbancia aparente en 415 nm, utilizando un lector de microplaca.
Tal como se muestra en la figura 15A, incluso altas concentraciones de BNJ383 no inhibieron sustancialmente la hemolisis de eritrocito bajo estas condiciones experimentales de ensayo hemolitico ex vivo.
El anticuerpo BNJ383 también fue evaluado para determinar si tuvo un efecto en la activación de complemento de suero de macaco utilizando el ensayo CH50eq ex vivo. El ensayo CH50eq es un método para medir la actividad de complemento clásico total en suero. Esta prueba es un ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas, el cual utiliza gammaglobulinas humanas y anticuerpos monoclonales de ratón como el activador de la trayectoria de complemento clásica, y captura el complejo de complemento terminal (TCC) generado en un depósito de microtitulación recubierto con un anticuerpo específico de neoepítope TCC. El TCC capturado se detecta con un anticuerpo anti-TCC de cabra conjugado para peroxidasa de rábano. El ensayo CH50eq proporciona una medida directa de la formación de complejo de complemento terminal (TCC).
Tal como se muestra en la figura 15B, altas concentraciones de BNJ383 presentes en el suero de macaco tuvieron la capacidad de inhibir sustancialmente la formación de TCC bajo estas condiciones ex vivo. Estos resultados indican que el anticuerpo BNJ383 no es únicamente capaz de enlazar a, y secuestrar C5a libre, sino también tiene la capacidad de, como una función de la concentración, inhibir parcial o sustancialmente la formación de TCC.
También se llevó a cabo un experimento ex vivo para evaluar el efecto de BNJ383 en la actividad de complemento de trayectoria clásica (CP) utilizando las muestras de suero de macaco descritas anteriormente. El experimento utilizó el Equipo de Complemento de Trayectoria Clásica Wieslab®, (Wieslab® COMPL CP310, Euro-Diagnostica, Suecia) y se siguió el protocolo asociado únicamente con el depósito de optimización de rutina que está dentro de los alcances de los expertos en la técnica. En síntesis, se incubaron alícuotas de las muestras de suero de macaco en depósito de una placa recubierta con anticuerpo IgM humano durante una hora. Como control, se incubaron varios depósitos bajo las mismas condiciones con suero de macacos a los que no se les administró el anticuerpo BNJ383.
Después de la incubación, los depósitos fueron lavados completamente con amortiguador de lavado 1X suministrado en el equipo. El nivel de activación de complemento de la trayectoria alternativa se midió mediante absorbencia en 405 nm, después del contacto de cada depósito con un conjugado de enzima suministrado en el equipo (un anticuerpo anti-C5b-9 conjugado para fosfatasa alcalina) y el substrato fluorogénico (el cual es operado en el momento por la enzima) e incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los resultados se muestran en la figura 15C.
El anticuerpo anti-hC5a no inhibió significativamente, pero sí de manera total, la actividad de complemento en una forma dependiente de la dosis. Tomados juntos, los resultados aquí descritos indican que BNJ383 no es únicamente un potente antagonista de C5a, sino también un antagonista incompleto/parcial de la formación in vivo del complejo de complemento terminal. Por lo tanto, el anticuerpo y los anticuerpos que comparten sus propiedades, son útiles para tratar una variedad de trastornos asociados con complemento en los cuales la inflamación transmitida por C5a, es el contribuyente primario para efectos patológicos perjudiciales y TCC, puede desempeñar un papel menos significativo, o incluso benéfico en la patología.
Aunque la presente descripción ha sido descrita con referencia a las modalidades específicas de la misma, deberá quedar entendido para los expertos en la técnica que se pueden elaborar diversos cambios y que los equivalentes puedan ser sustituidos sin apartarse del espíritu y alcance real de la presente descripción. Además, se pueden elaborar muchas modificaciones para adaptar una situación, material, composición de materia, proceso, paso o pasos del proceso particulares al objetivo, espíritu y alcance de la presente descripción. Todas de dichas modificaciones están proyectadas para estar dentro del alcance de la presente descripción.

Claims (140)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado o un fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza a un polipéptido C5a libre, en donde el C5a libre es un polipéptido humano (hC5a) que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:1, y en donde el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza al polipéptido hC5a libre in vitro con una KD que es menor a 1.25 x 10"9 en la presencia de un exceso molar de C5 humano nativa, no disociada.
2. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración de C5 humano nativa, no disociada es entre 2 veces y 20 veces mayor que la concentración de hC5a libre.
3. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la concentración de C5 humano no disociado es entre 2 veces y 15 veces mayor que la concentración de hC5a libre.
4. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizado porque C5 humano nativo, no disociado procede de plasma humana.
5. Un anticuerpo aislado o un fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza a un polipéptido C5a libre, en donde el polipéptido C5a libre es un polipéptido humano (hC5a) que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:1, en donde el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza al polipéptido C5a humano con una KD que es menor a 1.25 x 10'9 M, en donde el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza al polipéptido hC5a libre, con una afinidad que es al menos 100 veces más que su afinidad correspondiente para C5 humano no disociado.
6. Un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza al polipéptido C5a libre, en donde el polipéptido C5a libre es un polipéptido humano (hC5a) que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:1, en donde el anticuerpo inhibe en al menos el 50%, la activación in vitro del neutrófilo humano dependiente de hC5a, en una proporción molar de 1:1 (sitio de enlace de antígeno: hC5a).
7. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a C5a libre de una especie de mamífero no humano.
8. Un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza a un polipéptido C5a libre, en donde el polipéptido C5a libre es un polipéptido humano (hC5a) o un polipéptido C5a de especie de mamífero no humano, y en donde el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza al polipéptido hC5a libre con una KD que es menor a 1.25 x 1 O"9 M.
9. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque la especie de mamífero no humano es un primate no humano.
10. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 9, caracterizado porque el primate no humano es un macaco cinomolgo, macaco rhesus o babuino.
11. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 7 a la 10, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a hC5a libre con una afinidad no mayor a 100 veces su afinidad correspondiente para C5a libre de la especie de mamífero no humano.
12. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 7 a la 11, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a C5a humano con una afinidad no mayor a 50 veces su afinidad correspondiente para C5a de la especie de mamífero no humano.
13. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5 u 8 a 12, caracterizado porque el anticuerpo inhibe en al menos el 50% la activación de neutrófilo humano dependiente de hC5a en una proporción molar de 1:1 (sitio de enlace de antígeno: hC5a).
14. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 13, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza al polipéptido hC5a libre que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:2.
15. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 14, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende: una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:20; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:21; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en SEC ID NO:22.
16. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 14, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende: una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:20; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en SEC ID NO:38; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:22.
17. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 16, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende: una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:28; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:29; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:30.
18. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 16, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende: una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:28; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en SEC ID NO:46; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:47.
19. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antigeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, 14, o 16, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:37 o SEC ID NO:36.
20. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, 14, 16, o 19, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO:27 o SEC ID NO:33.
21. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 19 ó 20, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:37 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en SEC ID NO:27.
22. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 19 ó 20, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:36 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en SEC ID NO:33.
23. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO: 19 o SEC ID NO: 17.
24. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15 ó 23, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:27 o SEC ID NO:25.
25. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 23 ó 24, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en SEC ID NO: 19 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:27.
26. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 23 ó 24, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO: 17 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:25.
27. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:42 o SEC ID NO:40.
28. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15 ó 27, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:27 o SEC ID NO:33.
29. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 27 ó 28, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:42 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en SEC ID NO:27.
30. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 27 ó 28, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:40 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:33.
31. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO: 17 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:33.
32. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en cualesquiera de las SEC ID NO:45, SEC ID NO:44, o SEC ID NO:49.
33. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 32, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO: 19, y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:45.
34. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 32, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO: 17 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:44.
35. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 32, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en SEC ID NO: 17 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO:49.
36. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 14 ó 16, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 37 o SEQ ID No: 36.
37. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 14, 16, ó 36, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 45 o SEQ ID No: 49.
38. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 36 ó 37, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 37 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 45.
39. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 36 ó 37, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 36 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 49.
40. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 42 o SEQ ID No: 40.
41. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, ó 40, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 45 o SEQ ID No: 49.
42. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 40 ó 41, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 42 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 45.
43. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 40 ó 41, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 40 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 49.
44. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 18 o de la 23 a la 43, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a hC5a con una KD que es menor a 7 x 10"10 M.
45. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 18 o de la 27 a la 43, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a hC5a con una KD que es menor a 5 x 10"10 M.
46. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 18 o de la 31 a la 43, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a hC5a con una KD que es menor a 2.5 x 10~10 M .
47. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 16, 32, 33, o de la 36 a la 43, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a hC5a con una KD que es menor a 1.5 x 1 O"10 M.
48. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 16, 32, 33, 35, o de la 40 a la 43, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a hC5a con una KD que es menor a 8.0 x 10"11 M.
49. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 16, 32, 33, o de la 35 a la 43, caracterizado porque el anticuerpo inhibe en la menos el 70% la activación de neutrófilo humano dependiente de C5a humana en una proporción molar de 1:1 (sitio de enlace de antígeno:: C5a).
50. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 16, 32, 33, o de la 35 a la 39, caracterizado porque el anticuerpo inhibe en al menos el 90% la activación de neutrófilo humano dependiente de C5a humana en una proporción molar de 1:1 (sitio de enlace de antígeno: C5a).
51. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 50, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo inhibe la interacción entre C5a y un receptor de C5a.
52. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 51, caracterizado porque el receptor C5a es C5aR1.
53. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 51, caracterizado porque el receptor C5a es C5L2.
54. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 53, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo no inhibe substancialmente la hemolisis transmitida por complemento de las células de glóbulos rojos in vitro.
55. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 54, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
56. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 55, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
57. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 56, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano.
58. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 57, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo recombinante, un anticuerpo de cadena simple, un diacuerpo, un intracuerpo, un anticuerpo quimerizado o quimérico, un anticuerpo humano desinmunizado, un fragmento Fv, un fragmento Fd, un fragmento Fab, un fragmento Fab', y un fragmento F(ab')2.
59. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 57, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.
60. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 59, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento comprende una porción heteróloga.
61. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno tal como se describe en la reivindicación 60, caracterizado porque la porción heteróloga es un azúcar.
62. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno tal como se describe en la reivindicación 61, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento es gíucosilado.
63. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno tal como se describe en la reivindicación 60, caracterizado porque la porción heteróloga es una etiqueta detectable.
64. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno tal como se describe en la reivindicación 63, caracterizado porque la etiqueta detectable es una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, una etiqueta de metal pesado, una etiqueta radioactiva, o una etiqueta enzimática.
65. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 64, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo se modifica con una porción que mejora uno o ambos de: (a) la estabilización del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo en la circulación y (b) la retención del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo en la circulación.
66. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 65, caracterizado porque la modificación es una PEGilación.
67. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 66, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada alterada que tiene función efectora reducida en comparación con la función efectora de la forma no alterada de la región constante de cadena pesada.
68. El anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 67, caracterizado porque la función efectora se selecciona del grupo que consiste en: (a) citotoxicidad transmitida por célula dependiente de anticuerpo (ADCC); (b) citotoxicidad dependiente de complemento (CDC); y (c) enlace a uno o más receptores Fe.
69. El anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 67 ó 68, caracterizado porque la región constante alterada es una forma alterada de una región constante seleccionada del grupo que consiste en lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1, lgA2, IgA, IgD, e IgE.
70. El anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 67 a la 69, caracterizado porque la región constante alterada comprende al menos una substitución, una inserción, o una eliminación de aminoácido relativa a la región constante no alterada.
71. El anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 67 a la 70, caracterizado porque la región constante alterada comprende una glucosilación alterada que comprende uno o más de los siguientes: (i) un cambio en uno o más componentes de azúcar; (ii) la presencia de uno o más componentes de azúcar adicionales; o (¡ii) la ausencia de uno o más componentes de azúcar.
72. Un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que bloquea en forma cruzada el enlace del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 71.
73. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 72, y un transportador farmacéuticamente aceptable.
74. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 72.
75. Un vector que comprende el ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 74.
76. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 74.
77. Una célula que comprende el vector de expresión tal como se describe en la reivindicación 76.
78. Un método para producir un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, en donde el método comprende cultivar la célula tal como se describe en la reivindicación 77 bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la expresión por parte de la célula del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno codificado por el ácido nucleico.
79. El método tal como se describe en la reivindicación 78, caracterizado porque comprende además aislar el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo.
80. Un equipo terapéutico que comprende: (i) el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 72; y (ii) medios para suministrar el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno a un sujeto.
81. El equipo terapéutico tal como se describe en la reivindicación 80, caracterizado porque el medio es adecuado para el suministro subcutáneo del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo al sujeto.
82. El equipo terapéutico tal como se describe en la reivindicación 80, caracterizado porque el medio es adecuado para suministro intraocular del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo al sujeto.
83. El equipo terapéutico tal como se describe en la reivindicación 80, caracterizado porque el medio es adecuado para suministro intra-articular del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo al sujeto.
84. El equipo terapéutico tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 80 a la 83, caracterizado porque el medio es una jeringa.
85. El equipo terapéutico tal como se describe en la reivindicación 84, caracterizado porque la jeringa es una jeringa de barril doble.
86. El equipo terapéutico tal como se describe en la reivindicación 82, caracterizado porque el medio es un parche trans-escleral o un lente de contacto que comprende el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo.
87. El equipo terapéutico tal como se describe en la reivindicación 80, caracterizado porque el medio es adecuado para administración intrapulmonar del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno al sujeto.
88. El equipo terapéutico tal como se describe en la reivindicación 87, caracterizado porque el medio es un inhalador o un nebulizador.
89. El equipo terapéutico tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 80 a la 88, caracterizado porque comprende además al menos un agente activo adicional para utilizarse en el tratamiento de un trastorno asociado con complemento en un sujeto.
90. Un método para tratar un trastorno asociado con complemento, en donde el método comprende administrar a un humano que necesita del mismo, un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 72, en una cantidad suficiente para tratar un trastorno asociado con complemento que padece el humano.
91. El método tal como se describe en la reivindicación 90, caracterizado porque el trastorno asociado con complemento es un trastorno inflamatorio asociado con complemento.
92. El método tal como se describe en la reivindicación 91, caracterizado porque el trastorno inflamatorio asociado con complemento se selecciona del grupo que consiste en síndrome urémico hemolítico atípico, degeneración macular relacionada con la edad, quemadura severa, artritis reumatoide, sepsis, nefritis por lupus, y síndrome antifosfolípido.
93. El método tal como se describe en la reivindicación 90, caracterizado porque el trastorno asociado con complemento es un trastorno pulmonar asociado con complemento.
94. El método tal como se describe en la reivindicación 93, caracterizado porque el trastorno pulmonar asociado con complemento es asma o enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
95. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 90 a la 94, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo se administra al humano en una cantidad y con una frecuencia efectiva para mantener un nivel reducido de actividad C5a sistémica durante la duración del tratamiento.
96. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 90 a la 95, caracterizado porque comprende además, después de la administración, monitorear al humano con respecto a una mejoría en uno o más síntomas del trastorno asociado con complemento.
97. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 90 a la 96, caracterizado porque comprende además administrar al humano uno o más agentes terapéuticos adicionales.
98. El método tal como se describe en la reivindicación 90, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo se suministra al sujeto por medio de administración intravenosa, administración intrapulmonar, administración intraocular, administración subcutánea, o administración intra-articular.
99. Un artículo de fabricación que comprende: un contenedor que comprende una etiqueta; y una composición que comprende el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 72, en donde la etiqueta indica que la composición será administrada a un humano que tiene, se sospecha que tiene, o está en riesgo de desarrollar, un trastorno asociado con complemento.
100. El artículo de fabricación tal como se describe en la reivindicación 99, caracterizado porque comprende además uno o más agentes activos adicionales.
101. Un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza a C5a de ratón, en donde el anticuerpo comprende: (i) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 54; (ii) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 55; y (iii) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 56; (iv) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 62; (v) una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 63; y (vi) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 64.
102. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 101, caracterizado porque el anticuerpo comprende: un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 59; y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 66.
103. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 100 ó 101, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a la forma desarginada de C5a de ratón.
104. El anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 100 a la 103, caracterizado porque el fragmento de enlace de antígeno se selecciona del grupo que consiste en un diacuerpo, un anticuerpo de cadena simple, un fragmento Fv, un fragmento Fd, un fragmento Fab, un fragmento Fab', y un fragmento F(ab')2.
105. Un anticuerpo aislado, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, caracterizado porque comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende: (i) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 140; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 96; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 142; (ii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 156; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 157; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 158; (iii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 164; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 165; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 166; (iv) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 172; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 173; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 174; (v) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 84; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 85; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 86; (vi) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 92; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 89; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 93; (vii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 88; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 89; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 90; (viii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 95; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 96; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 97; (ix) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 99; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 100; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 101; (x) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 84; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 85; y una CÜR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 103; (xi) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 105; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 106; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 107; (x¡¡) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 92; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 89; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 108; (xiii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 20; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 110; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 111; o (xiv) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 20; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 21; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 113.
106. Un anticuerpo aislado, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, caracterizado porque comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende: (i) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 144; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (ii) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 28; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 67; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 30; (iii) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 160; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 161; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 162; (iv) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 168; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 169; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 170; (v) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 176; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 177; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 178; (vi) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 116; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (vii) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 119; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 120; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 121; (viii) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 123; y una COR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (ix) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 124; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (x) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 119; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 126; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 127; (xi) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 129; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (xli) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 131; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 132; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 133; (xiü) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 28; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 46; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 47; o (xiv) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 136; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 137; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 138.
107. Un anticuerpo aislado, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, caracterizado porque comprende un conjunto emparejado de secuencias CDR de cadena ligera y secuencias CDR de cadena pesada tal como se emparejan en la Tabla 3 o Tabla 9.
108. Un anticuerpo aislado, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, caracterizado porque comprende: (i) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 140; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 96; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 142; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 144; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (ii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 20; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 21; y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 22; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 28; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 67; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 30; (iii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 156; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 157; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 158; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 160; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 161; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 162; (iv) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 164; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 165; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 166; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 168; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 169; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 170; (v) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 172; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 173; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 174; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 176; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 177; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 178; (vi) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 88; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 89; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 90; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 119; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 120; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 121; (vii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 105; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 106; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 107; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 124; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (vüi) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 84; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 85; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 86; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 116; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (ix) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 20; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 110; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 111; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 136; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 137; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 138; (x) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 20; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 21; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 113; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 28; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 46; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 47; (xi) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 99; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 100; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 101; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 119; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 126; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 127; (xii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 95; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 96; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 97; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 144; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (xiii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 140; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 96; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 142; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 123; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (xiv) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 105; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 106; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 107; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 123; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (xv) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 92; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 89; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 108; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 144; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (xvi) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 92; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 89; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 93; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 123; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (xvii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 92; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 89; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 93; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 144; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (xviii) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 84; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 85; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 103; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 129; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (xix) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 95; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 96; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 97; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 123; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; (xx) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 84; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 85; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 103; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 115; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 144; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 117; o (xxi) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 20; una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 21; una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 113; una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 131; una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 132; y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 133.
109. Un anticuerpo aislado, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, caracterizado porque comprende: una región de estructura de región variable 1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 68 o SEQ ID No: 69; (ii) una región de estructura de región variable 2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 70 o SEQ ID No: 71; y una región de estructura de región variable 3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en cualesquiera de las SEQ ID Nos: de la 72 a la 74.
110. El anticuerpo aislado o fragmento de énlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 109, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende una región de estructura de región variable 4 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 75.
111. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 109 ó 110, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ¡lustrada en cualesquiera de las SEQ ID Nos: de la 76 a la 80.
112. Una jeringa llena previamente que comprende el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 72.
113. La jeringa llena previamente tal como se describe en la reivindicación 112, caracterizada porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo se formula para administración intraocular, intravítrea, o intra-articular.
114. La jeringa llena previamente tal como se describe en la reivindicación 112, caracterizada porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo se formula para administración intramuscular o subcutánea.
115. La jeringa llena previamente tal como se describe en la reivindicación 112, caracterizada porque la jeringa comprende al menos una forma de dosificación unitaria farmacéutica del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo.
116. La jeringa llena previamente tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 112 a la 115, caracterizada porque la jeringa comprende entre 0.05 mg a 10 mg del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo.
117. La jeringa llena previamente tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 112 a la 115, caracterizada porque la jeringa comprende entre aproximadamente 1 mg y 100 mg del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo.
118. La jeringa llena previamente tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 115 a la 117, caracterizada porque cada forma de dosificación unitaria farmacéutica tiene un volumen de entre 0.02 ml_ a 1 mL, inclusive.
119. La jeringa llena previamente tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 115 a la 117, caracterizada porque la forma de dosificación unitaria farmacéutica tiene un volumen no mayor a 0.05 mL.
120. Un anticuerpo aislado que comprende dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada sitio de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a C5a humana (hC5a) libre o a C5 humana (hC5) no disociada, y en donde, en una solución acuosa que comprende: (i) una pluralidad de los anticuerpos, y (ii) un exceso molar de hC5 en comparación con la cantidad molar de los sitios de enlace de antígeno, en equilibrio y bajo condiciones fisiológicas, al menos el 95% de la pluralidad de los anticuerpos enlazan a no más de una molécula hC5.
121. Un anticuerpo aislado que comprende dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada sitio de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a C5a humana (hC5a) libre o a C5 humana (hC5) no disociada, y en donde, en una solución acuosa que comprende: (i) una pluralidad de los anticuerpos, y (ii) un exceso molar de hC5 en comparación con la cantidad molar de los sitios de enlace de antígeno, en equilibrio y bajo condiciones fisiológicas, en al menos el 95% de la pluralidad de los anticuerpos que retienen al menso un sitio de enlace de antígeno disponible para enlazar a hC5a libre.
122. Un anticuerpo aislado que comprende dos sitios de enlace de antígeno, en donde cada sitio de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a C5a humana (hC5a) libre o a C5 humana (hC5) no disociada, y en donde, en una solución acuosa que comprende: (i) una pluralidad de los anticuerpos, y (ii) un exceso molar de hC5 en comparación con la cantidad molar de los sitios de enlace de antígeno, en equilibrio y bajo condiciones fisiológicas, los dos sitios de enlace de antígeno de no más del 5% de la pluralidad de anticuerpos están completamente ocupados por las moléculas hC5.
123. El anticuerpo aislado tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 120 a la 122, caracterizado porque el exceso molar es un exceso molar del doble.
124. El anticuerpo aislado tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 120 a la 123, caracterizado porque la condición fisiológica es 3.9 mM de NaH2P04, 6.1 mM de Na2HP04, y 150 mM de NaCI, en pH 7.0.
125. El anticuerpo aislado tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 120 a la 124, caracterizado porque cada sitio de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a hC5a libre con una KD que es menor a 1.25 x 1 O"9 M .
126. El anticuerpo aislado tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 120 a la 125, caracterizado porque cada sitio de enlace de antígeno puede enlazar independientemente a hC5a libre con una afinidad subnanomolar.
127. El anticuerpo aislado tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 120 a la 126, caracterizado porque el anticuerpo aislado comprende: (i) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 20; (ii) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 21; y (¡ii) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 22; (iv) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 28; (v) una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 46; y (vi) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 47.
128. El anticuerpo aislado tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 120 a la 127, caracterizado porque el anticuerpo aislado comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 42 y un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 45.
129. Un método para tratar a un humano que padece de un trastorno asociado con complemento, en donde el método comprende administrar al humano el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antigeno tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 72, o el anticuerpo aislado tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 120 a la 128, en una cantidad suficiente para tratar el trastorno asociado con complemento.
130. El método tal como se describe en la reivindicación 129, caracterizado porque el trastorno asociado con complemento es un trastorno de complemento asociado-C5a .
131. Un método para tratar a un humano que padece de un trastorno de complemento asociado-C5a, en donde el método comprende administrar al humano al menos 1 mg del anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 120 a la 128 por kg de peso corporal del humano, para enlazar de esta manera parcial o completamente y secuestrar niveles de nanogramo de C5a libre durante al menos 12 días.
132. Un método para tratar a un humano que padece de un trastorno de complemento asociado-C5a, en donde el método comprende administrar al humano al menos 10 mg del anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 120 a la 128 por kg de peso corporal del humano, para enlazar de esta manera parcial o completamente y secuestrar niveles de nanogramo de C5a libre durante al menos 24 días.
133. Un método para tratar a un humano que padece de un trastorno de complemento asociado-C5a , en donde el método comprende administrar al humano un anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 120 a la 128, en una cantidad suficiente para (a) lograr valores Cmax molares substancialmente inferiores a la concentración fisiológica molar de hC5 no disociada y (b) enlazar parcial o completamente y secuestrar los niveles patofisiológicos de C5a libre.
134. Un método para tratar a un humano que padece de un trastorno de complemento asociado-C5a, en donde el método comprende administrar al humano un anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 120 a la 128, en una cantidad suficiente para (a) lograr valores Cmax molares substancialmente inferiores a la concentración fisiológica molar de hC5 no disociada y (b) enlazar parcial o completamente y secuestrar niveles de nanogramo de C5a libre durante al menos 12 días.
135. El método tal como se describe en la reivindicación 134, caracterizado porque el valor Cmax para el anticuerpo no es mayor a 100 nM.
136. El método tal como se describe en la reivindicación 134, caracterizado porque el valor Cmax para el anticuerpo no es mayor a 80 nM.
137. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 130 a la 136, caracterizado porque el trastorno de complemento asociado-C5a se selecciona del grupo que consiste en sepsis, síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), choque séptico, síndrome anti-fosfolípido, síndrome anti-fosfol ípido catastrófico, coagulación intravascular diseminada h, nefritis por lupus, Síndrome de Goodpasture, quemadura o quemadura severa, asma, síndrome de HELLP (Anemia hemolítica, Enzimas elevadas en hígado, y Bajo conteo de plaquetas), dolor inducido por inflamación, neutropenia transmitida por C5a, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y artritis reumatoide.
138. Una jeringa llena previamente que comprende el anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 120 a la 128.
139. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 120 a la 128, y un transportador farmacéuticamente aceptable.
140. Un equipo terapéutico que comprende el anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 120 a la 128, y un medio para suministrar el anticuerpo a un sujeto que padece de un trastorno asociado con complemento. R E S U M E N La presente descripción se refiere a, entre otras cosas, anticuerpos, o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, que enlazan a C5a, y al uso de los anticuerpos en métodos para tratar o prevenir trastornos asociados con complemento, tales como, pero sin limitarse a, síndrome urémico hemolítico atípico, degeneración macular relacionada con la edad, artritis reumatoide, sepsis, quemadura severa, síndrome antifosfolípido, asma, nefritis por lupus, síndrome de Goodpasture y enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
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