MX2012006347A - Polipeptidos hibridos y quimericos del factor viii-fc, y metodos de uso de los mismos. - Google Patents

Polipeptidos hibridos y quimericos del factor viii-fc, y metodos de uso de los mismos.

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Abstract

La presente invención proporciona métodos para administrar el Factor VIII; métodos para administrar polipéptidos quiméricos e híbridos que comprenden el Factor VIII; polipéptidos quiméricos e híbridos que comprenden el Factor VIII; polinucleótidos que codifican tales polipéptidos quiméricos e híbridos; células que comprenden tales polipéptidos; y métodos para producir tales polipéptidos quiméricos e híbridos que usan tales células.

Description

POLIPEPTIDOS HIBRIDOS Y QUIMERICOS DEL FACTOR VIII-FC, Y METODOS DE USO DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona en general con el campo de la terapéutica para los trastornos hemostáticos .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hemofilia A es un trastorno de la coagulación ligado al cromosoma X causado por mutaciones y/o supresiones en el gen del Factor VIII (FVIII) lo que resulta en una deficiencia de la actividad del FVIII (Peyvandi y otros, 2006) . La enfermedad se caracteriza por hemorragias espontáneas y el sangrado excesivo después de un trauma. Con el tiempo, la hemorragia reiterada en los músculos y las articulaciones, la cual a menudo comienza en la niñez temprana, resulta en la artropatía hemofílica y el daño articular irreversible. Este daño es progresivo y puede conducir a una movilidad de las articulaciones severamente limitada, la atrofia muscular y el dolor crónico (Rodríguez -Merchán, E.C., Semin. Thromb. Hemost. 29:87-96 (2003), la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) .
El dominio ' A2 es necesario para la actividad procoagulante de la molécula del Factor VIII. Los estudios muestran que el Factor VIII porcino tiene una actividad procoagulante seis veces mayor que el Factor VIII humano Ref.:231092 (Lollar, P., y E. T . Parker y otros, J. Biol. Chem. 266:12481-12486 (1991)), y que la diferencia en la actividad coagulante entre el Factor VIII humano y el porcino parece basarse en una diferencia en la secuencia de aminoácidos entre uno o más residuos en los dominios A2 humano y porcino (Lollar, P. , y otros, J. Biol. Chem. 267:23652-23657 (1992)), la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad .
El tratamiento de la hemofilia A es por terapia de sustitución dirigida a la restauración de la actividad del FVIII a 1 a 5% de los niveles normales para prevenir la hemorragia espontánea (Manucci, P.M. , y otros, N. Engl . J. Med. 344:1773-1779 (2001), la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . Hay productos del FVIII derivados del plasma y recombinantes disponibles para el tratamiento de episodios hemorrágicos a-demanda o para prevenir que se produzcan episodios de sangrado por tratamiento profiláctico. En base a la vida media de estos productos los regímenes de tratamiento requieren la administración intravenosa frecuente. Tal administración frecuente es dolorosa e incómoda.
La reducción de la mortalidad, la prevención del daño articular y la mejoría en la calidad de vida son logros importantes debidos al desarrollo del FVIII derivado del plasma y recombinante . La protección prolongada de sangrado representaría otro avance clave en el tratamiento de pacientes con hemofilia A. Sin embargo, hasta la fecha, no se desarrollaron productos que permitan una protección prolongada. Por lo tanto, existe la necesidad de métodos mejorados de tratamiento de la hemofilia, debido a la deficiencia de Factor VIII que sean más tolerables y más efectivos que las terapias actuales.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos de administración del Factor VIII; métodos de administración de polipéptidos quiméricos que comprenden el Factor VIII e híbridos de estos polipéptidos quiméricos; polipéptidos quiméricos que comprenden el Factor VIII e híbridos de estos polipéptidos quiméricos; los polinucleótidos que codifican tales polipéptidos quiméricos e híbridos, las células que comprende tales polinucleótidos; y los métodos para producir tales polipéptidos quiméricos e híbridos por medio del uso las células.
La presente invención proporciona un método de administración del Factor VIII a un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una dosis terapéutica de un polipéptido quimérico del Factor VIII, por ejemplo, un polipéptido quimérico Factor VIII-Fc, en un intervalo de dosificación de al menos aproximadamente una y media veces mayor que el intervalo de dosificación requerido para una cantidad equivalente de el Factor VIII sin la porción no-Factor VIII (un polipéptido que consiste de la porción del Factor VIII), por ejemplo, sin la porción Fe.
El intervalo de dosificación puede ser al menos aproximadamente de una y media a seis veces mayor, de una y media a cinco veces mayor, de una y media a cuatro veces mayor, de una y media a tres veces mayor, o de una y media a dos veces mayor, que el intervalo de dosificación requerido para una cantidad equivalente de el Factor VIII sin la porción no-Factor VIII (un polipéptido que consiste de la porción Factor VIII), por ejemplo, la porción Fe. El intervalo de dosificación puede ser al menos aproximadamente una y media, dos, dos y media, tres, tres y un media, cuatro, cuatro y media, cinco, cinco y media o seis veces más largo que el intervalo de dosificación requerido para una cantidad equivalente de el Factor VIII sin la porción no-Factor VIII (un polipéptido que consiste de la porción Factor VIII) , por ejemplo, la porción Fe. El intervalo de dosificación puede ser aproximadamente cada cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce días o más.
El intervalo de dosificación puede ser al menos aproximadamente de uno y medio a 5, uno y medio, 2, 3, 4, o 5 días o más .
La presente invención también proporciona un método de administración dél Factor VIII a un sujeto con necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una dosis terapéutica de un polipéptido del Factor VIII quimérico, por ejemplo, un polipéptido quimérico Factor VIII-Fc, para obtener un área bajo la curva (AUC, por sus siglas en inglés) de la concentración de plasma contra el tiempo de al menos aproximadamente una y un cuarto veces mayor que el AUC que se obtiene por una cantidad equivalente de el Factor VIII sin la porción no-Factor VIII (un polipéptido que consiste de la porción Factor VIII), por ejemplo, sin la porción Fe.
La presente invención también proporciona un método de administración del Factor VIII a un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una dosis terapéutica de un polipéptido que comprende un Factor VIII y un Fe en un intervalo de dosificación de aproximadamente cada cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce días o más .
Los métodos de la invención se pueden practicar en un sujeto que necesita tratamiento profiláctico o tratamiento a- demanda .
El tratamiento a-demanda incluye el tratamiento para un episodio de sangrado, hemartrosis, sangrado muscular, • sangrado bucal, hemorragia, hemorragia en los músculos, hemorragia oral, trauma, trauma por capitis (trauma en la cabeza), sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal , hemorragia intratorácica , fractura ósea, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal , o sangrado en la vaina illiopsoas. El sujeto puede necesitar profilaxis quirúrgica, intervenciones peri-quirúrgicas, o tratamiento de cirugía. Las cirugías de este tipo incluyen, por ejemplo, cirugía menor, cirugía mayor, extracción dental, la amigdalectomía, herniotomía inguinal, sinovectomía, reemplazo total de rodilla, craneotomía, osteosíntesis , cirugía por trauma, cirugía iintracraneal , cirugía intra-abdominal , cirugía intratorácica , o cirugía de reemplazo articular.
Para el tratamiento a-demanda, el intervalo de dosificación de el polipéptido quimérico es de aproximadamente una vez cada 24-36, 24-48, 24-72, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, o 72 horas o más.
Las dosis terapéuticas que pueden usarse en los métodos de la invención son aproximadamente 10 a aproximadamente 100 Ul/kg, más específicamente, aproximadamente 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, o 90-100 Ul/kg, y más específicamente, aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 Ul/kg.
Las dosis terapéuticas que pueden usarse en los métodos de la invención son aproximadamente 10 a aproximadamente 150 Ul/kg, más específicamente, aproximadamente 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150 Ul/kg, y más específicamente, aproximadamente 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, o 150 Ul/kg.
El sujeto en los métodos de la invención puede ser un sujeto humano o puede ser un mamífero no humano. Los mamíferos no humanos incluyen, por ejemplo, ratones, perros, primates, monos, gatos, caballos, vacas, cerdos y otros animales domésticos y animales pequeños. La determinación del intervalo de dosificación y el AUC puede llevarse a cabo en un solo sujeto o en una población de sujetos.
El Factor VIII (o la porción del Factor VIII de un polipéptido quimérico) puede ser un Factor VIII humano, o un Factor VIII no humano, tal como el Factor VIII porcino, de ratón o Factor Vcanino. El Factor VIII (o la porción del Factor VIII de un polipéptido quimérico) puede tener una supresión total o parcial del dominio B.
El Factor VIII (or la porción del Factor VIII de un polipéptido quimérico) puede ser al menos 90% o 95% idéntico a una secuencia de aminoácidos del Factorfctor VIII mostrada en la Tabla 2 sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1438 de la sec. con núm. de ident.:2; aminoácidos 1 a 2332 de la sec . con núm. de ident.:6; aminoácidos 1 a 740 de la sec. con núm. de ident.:8; aminoácidos 1 a 745 de la sec. con núm. de ident. :10; o aminoácidos 1 a 684 de la sec . con núm. de ident.:12). El Factor VIII (o la porción del Factor VIII de un polipéptido quimérico) puede ser idéntica a una secuencia de aminoácidos del Factor VIII mostrada en la Tabla 2 sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1438 de la sec. con núm. de ident. :2; aminoácidos 1 a 2332 de la sec. con núm. de ident. :6; aminoácidos 1 a 740 de la sec. con núm. de ident. : 8 ; aminoácidos 1 a 745 de la sec. con núm. de ident. :10; o aminoácidos 1 a 684 de la sec. con núm. de ident. :12) .
El Factor VIII (o la porción del Factor VIII de un polipéptido quimérico) puede ser al menos 90% o 95% idéntico a una secuencia de aminoácidos del Factor VIII mostrada en la Tabla 2 con una secuencia señal (aminoácidos -19 a 1438 de la sec. con núm. de ident. :2; aminoácidos -19 a 2332 de la sec. con núm. de ident. :6; aminoácidos -19 a 740 de la sec. con núm. de ident. : 8 ; aminoácidos. -19 a 745 de la sec. con núm. de ident. :10; o aminoácidos -20 a 684 de la sec. con núm. de ident.: 12). El Factor VIII (o la porción del Factor VIII de un polipéptido quimérico) puede ser idéntico a una secuencia de aminoácidos del Factor VIII mostrada en la Tabla 2 con una secuencia señal (aminoácidos -19 a 1438 de la sec. con núm. de ident. :2; aminoácidos -19 a 2332 de la sec. con núm. de ident . : 6 ; aminoácidos -19 a 740 de la sec. con núm. de ident. :8; aminoácidos -19 a 745 de la sec. con núm. de ident . :10; o aminoácidos -20 a 684 de la sec . con núm. de ident . : 12) .
La porción Fe (o la porción Fe de un polipéptido quimérico) puede ser al menos 90% o 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos del Fe mostrada en la Tabla 2 (aminoácidos 1439 a 1665 de la sec. con núm. de ident . : 2 ; aminoácidos 2333 a 2559 de la sec. con núm. de ident . : 6 ; aminoácidos 741 a 967 de la sec. con núm. de ident. :8; aminoácidos 746 a 972 de la sec. con núm. de ident. :10; aminoácidos 685 a 924 de la sec. con núm. de ident. :12) . La porción Fe (o la porción Fe de un polipéptido quimérico) puede ser idéntica a la secuencia de aminoácidos del Fe mostrada en la Tabla 2 (aminoácidos 1439 a 1665 de la sec. con núm. de ident. :2; aminoácidos 2333 a 2559 de la sec. con núm. de ident. :6; aminoácidos 741 a 967 de la sec. con núm. de ident. : 8 ; aminoácidos 746 a 972 de la sec. con núm. de ident..-10; aminoácidos 685 a 924 de la sec. con núm. de ident . : 12 ) .
El polipéptido quimérico puede comprender una secuencia al menos 90% o 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos del Fe y del Factor VIII mostrada en la Tabla 2A (i) sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1665 de la sec. con núm. de ident. :2) o al menos 90% o 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos del Fe y del Factor VIII mostrada en la Tabla 2A (i) con una secuencia señal (aminoácidos -19 a 1665 de la sec . con núm. de ident. :2) . El polipéptido quimérico puede comprender una secuencia idéntica a la secuencia de aminoácidos del Fe y del Factor VIII mostrada en la Tabla 2A (i) sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1665 de la sec. con núm. de ident. :2) o idéntica a la secuencia de aminoácidos del Fe y del Factor VIII mostrada en la Tabla 2A (i) con una secuencia señal (aminoácidos -19 a 1665 de la sec. con núm. de ident . -. 2 ) .
El polipéptido quimérico puede ser en forma de un híbrido que comprende un segundo polipéptido en asociación con el polipéptido quimérico, en el cual el segundo polipéptido comprende o consiste esencialmente de un Fe.
El segundo polipéptido puede comprender o consistir esencialmente de una secuencia al menos 90% o 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2A (ii) sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 227 de la sec. con núm. de ident. :4) o al menos 90% o 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2A (ii) con una secuencia señal (aminoácidos -20 á 227 de la sec. con núm. de ident. :4) . El segundo polipéptido puede comprender o consistir esencialmente de una secuencia idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2A (ii) sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 227 de la sec. con núm. de ident. : 4) o idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2A (ii) con una. secuencia señal (aminoácidos -20 a 227 de la sec. con núm. de ident . :4) .
El polipéptido quimérico o híbrido puede administrarse como parte de una composición farmacéutica que comprende al menos un- excipiente .
La invención también . proporciona los polipéptidos quiméricos e híbridos descritos anteriormente, los polinucleótidos que los codifican, un cultivo de células embrionarias humanas que comprende los polinucleótidos, y los métodos para producir tales polipéptidos quiméricos e híbridos, y los polipéptidos producidos por tales métodos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Representación esquemática del monómero rFVIIIFc.
Figura 2. WBCT del rFVIIIFc en comparación con el ® ReFacto en ratones con hemofilia A después de una dosis intravenosa de 50 Ul/kg (n = 6 ratones por grupo) .
Figura 3. Actividad cromogénica en el plasma de ratones con la hemofilia A después de una sola dosis intravenosa de 50 Ul/kg del rFVIIIFc, el ReFacto® y el Advate®.
Figuras 4A-4B. WBCT del rFVIIIFc y el ReFacto® en perros con hemofilia A rFVIIIFc (Figura 4A) . En la Figura 4B El ReFacto° seguido por el rFVIIIFc en un estudio cruzado.
Figura 5. Farmacocinética del rFVIIIIFc y el ReFacto*8 intravenosos en perros con hemofilia A (medida por ELISA) .
Figura 6. Actividad del rFVIII y el ReFacto® después de una única dosis intravenosa en perros con hemofilia A (medida por un ensayo de actividad cromogénico específico para el FVIII) .
Figura 7. Media grupal de la concentración plasmática del rFVIIIFc y el Xyntha en el tiempo después de una dosis única por vía intravenosa (125 Ul/kg) en monos cinomolgos (n 6, media ± SD) . Las concentraciones plasmáticas se determinaron por ELISA.
Figuras 8A-8B. Curvas de la concentración plasmática individual del rFVIIIFc y el Xyntha en función del tiempo después de una dosis úni a por vía intravenosa (125 Ul/kg) en monos cinomolgos (n = 6, media + SD) . Las concentraciones plasmáticas se determinaron por ELISA. En la Figura 8A el rFVIIIFc por ELISA. En la Figura 8B el Xyntha por ELISA.
Figura 9. Media grupal de la actividad cromogénica plasmática después de una dosis única por vía intravenosa (125 Ul/kg) de' rFVIIIFc y Xyntha en monos cinomolgos (n = 6, media + SD) . La actividad del FVIII se midió por medio del uso de un ensayo de actividad cromogénica específico de FVIII.
Figuras 10A-10B. Curvas de actividad cromogénica plasmática en función del tiempo después de una dosis única por vía intravenosa (125 Ul/kg) de rFVIIIFc y Xyntha en monos cinomolgus (n = 6, media ± SD) . La actividad del FVIII se midió por medio del uso de un ensayo de actividad cromogénica específico de FVIII. En la Figura 10A actividad cromogénica del rFVIIIFc. En la Figura 10B actividad cromogénica del Xyntha .
Figura 11. Caracterización bioquímica del rFVIII-Fc: La activación del Factor X como una función de la concentración del Factor X.
Figura 12. Caracterización bioquímica del rFVIII-Fc : La activación del Factor X como una función de la concentración del Factor IXa .
Figuras 13A-13D. Media grupal de la actividad de FVIII observada (± SE) (ensayo de una etapa, 25 Ul/kg en la Figura 13A o 65 Ul/kg en la Figura 13B; y el ensayo cromogénico, 25 Ul/kg en la Figura 13C o 65 Ul/kg En la Figura 13D) en función del tiempo.
Figuras 14A-14B. Media grupal de la actividad del FVIII observada (± SE) (un ensayo de una etapa en la Figura 14A o ensayo cromogénico en la Figura 14B) contra el tiempo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para tratar la hemofilia A con el Factor VIII por medio del uso de un intervalo de dosificación más largo y/o mayor AUC que el que es posible con los productos del Factor VIII que se conocen actualmente. La presente invención proporciona también mejores polipéptidos quiméricos del Factor VIII, polinucleótidos quiméricos del Factor VIII y métodos de producción.
El tratamiento de la hemofilia A es por terapia de sustitución dirigida a la restauración de la actividad del FVIII a 1 a 5% de los niveles normales para prevenir la hemorragia espontánea (Manucci, P.M., y otros, N. Engl . J. Med. 344:1773-9 (2001), que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . Hay productos del FVIII derivados del plasma y recombinantes disponibles para el tratamiento de episodios hemorrágicos a-demanda o para prevenir que se produzcan episodios de sangrado por tratamiento profiláctico. En base a la vida media de estos productos (10-12 h) (Whita G.C., y otros, Thromb. Haemost . 77:660-7 (1997); Morfini, M. , Hemofilia 9 (suppl 1): 94-99; discusión 100 (2003)), los regímenes de tratamiento requieren la administración intravenosa frecuente, comúnmente de dos a tres veces por semana para la profilaxis y de uno a tres veces al día para el tratamiento a-demanda (Manco-Johnson, M.J., y otros, N. Engl. J. Med. 357:535-544 (2007)), cada uno de los cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Tal administración frecuente es dolorosa e incómoda .
La presente invención proporciona un método de administración del Factor VIII a un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una dosis terapéutica de un polipéptido quimérico del Factor VIII, por ejemplo, un polipéptido quimérico Factor VIII-Fc, o un híbrido de tal polipéptido en un intervalo de dosificación de al menos aproximadamente una y media veces mayor que el intervalo de dosificación requerido para una cantidad equivalente de el Factor VIII sin la porción no-Factor VIII (un polipéptido que consiste de la porción Factor VIII), por ejemplo, sin la porción Fe.
El intervalo de dosificación puede ser al menos aproximadamente de una vez y media a seis veces más largo, de una y media a cinco veces más largo, de una y media a cuatro veces más largo, de una y media a tres veces más largo , o de una y media a dos veces más largo, que el intervalo de dosificación requerido para una cantidad equivalente de el Factor VIII sin la porción no-Factor VIII (un polipéptido que consiste de la porción Factor VIII), por ejemplo, sin la porción Fe. El intervalo de dosificación puede ser por lo menos aproximadamente de una y media, dos, dos y media, tres, tres y media, cuatro, cuatro y media, cinco, cinco y un media, o seis veces más largo que el intervalo de dosificación requerido para una cantidad equivalente de el Factor VIII sin la porción no-Factor VIII (un polipéptido que consiste de- la porción Factor VIII) , por ejemplo, sin la porción Fe. El intervalo de dosificación puede ser de aproximadamente cada cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce días o más.
El intervalo de dosificación puede ser al menos aproximadamente de uno y medio a 5, uno y medio, 2, 3, 4, o 5 días o más.
La presente invención también proporciona un método de administración del Factor VIII a un sujeto con necesidad de e-llo, que comprende .administrar al sujeto una dosis terapéutica de un polipéptido quimérico del Factor VIII, por ejemplo, un polipéptido quimérico Factor VIII -Fe, o un híbrido de tal polipéptido para obtener un área bajo la curva de concentración de plasma contra tiempo (AUC) de al menos aproximadamente una y un cuarto veces mayor que la AUC que se obtuvo para una cantidad equivalente de el Factor VIII sin la porción no-Factor VIII (un polipéptido que consiste en la porción Factor VIII) , por ejemplo, sin la porción Fe.
La presente invención también proporciona un método de administración del Factor VIII a un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una dosis terapéutica de un polipéptido que comprende un Factor VIII y un Fe o un híbrido de tal polipéptido a un intervalo de dosificación de aproximadamente cada cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce días o más.
Los métodos de · la invención se pueden practicar en un sujeto que necesita tratamiento profiláctico o tratamiento a-demanda .
"Administración", como se usa en la presente, significa dar un polipéptido del Factor VIII farmacéuticamente aceptable de la invención a un sujeto a través de una ruta farmacéuticamente aceptable. Las vías preferidas de administración son la intravenosa, por ejemplo, inyección, intravenosa e infusión intravenosa. Las rutas adicionales de administración incluyen, por ejemplo, subcutánea, intramuscular, oral, nasal, y la administración pulmonar. Se pueden administrar polipéptidos quiméricos y proteínas híbridas como parte de una composición farmacéutica que comprende al menos un excipiente. "Área bajo la curva de la concentración plasmática contra tiempo (AUC) , " como se usa en la presente, es el mismo que el término de la materia en farmacología, y se basa en la velocidad y la magnitud de la absorción del Factor VIII, •después de la administración. El AUC se determina en un período de tiempo determinado, tal como 12, 18, 24, 36, 48 ó 72 horas, o para el infinito por medio del uso de la extrapolación basada en la pendiente de la curva. A menos que se especifique lo contrario en la presente, el AUC se determina para el infinito. La determinación del AUC puede llevarse a cabo en un solo sujeto, o en una población de sujetos para los cuales se calcula la media.
"Dominio B" del Factor VIII, como se usa en la presente, es el mismo que el dominio B conocido en la materia que se define por la identidad de la secuencia de aminoácidos interna y los sitios de escisión proteolítica por la trombina, por ejemplo, los residuos Ser741-Argl648 del Factor VIII humano de longitud total. Los otros dominios de Factor VIII humano se definen por los residuos de aminoácido siguientes: Al, residuos Alal-Arg372; A2 , residuos Ser373-Arg740; A3 , residuos Serl690-Ile2032 ; Cl, residuos Arg2033-Asn2172; C2 , residuos Ser2173 -Tyr2332. La secuencia A3-C1-C2 incluye los residuos Serl690-Tyr2332. La secuencia restante, los residuos Glul649-Argl689, se refiere generalmente como el péptido de activación de la cadena ligera del Factor VIII. Las ubicaciones de los límites para todos los dominios, que incluyen los dominios B, para el Factor VIII porcino, de ratón y canino también se conocen en la materia. Preferentemente, el dominio B del Factor VIII se suprime ("Factor VIII con dominio B suprimido" o "BDD FVIII"). Un ejemplo de un BDD FVIII es el Refacto (BDD FVIII recombinante) , que tiene la misma secuencia que la porción del Factor VIII de la secuencia en la Tabla 2A (i) (aminoácidos -19 a 1438 ó 1 al 1438 de la sec . con núm de ident . : 2 ) .
Un "Factor VIII con dominio B suprimido" puede tener las supresiones parciales o totales que se describen en las patentes de los Estados Unidos núms . 6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502, 5,610,278, 5,171,844, 5,112,950, 4,868,112, y 6,458,563, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. En algunas modalidades, una secuencia del Factor VIII con dominio B suprimido de la presente invención comprende cualquiera de las supresiones que se describen en la col. 4, línea 4 a la col. 5, línea 28 y los Ejemplos 1-5 de la patente de los Estados Unidos núm. 6,316,226 (también en 6,346,513). En algunas modalidades, un Factor VIII con dominio B suprimido de la presente invención tiene una supresión descrita en la col. 2, líneas 26-51 y los Ejemplos 5-8 de la patente de los Estados Unidos núm. 5,789,203 (también 6,060,447, 5,595,886, y 6,228,620). En algunas modalidades, un Factor VIII con dominio B suprimido tiene una supresión descrita en la col. 1, línea 25 a col. 2, línea 40 de la patente de los Estados Unidos núm. 5,972,885; col. 6, líneas 1-22 y el Ejemplo 1 de la patente de los Estados Unidos núm. 6,048,720, col. 2, líneas 17-46 de la patente de los Estados Unidos núm. 5,543,502; col. 4, línea 22 a col. 5, línea 36 de patente de los Estados Unidos núm. 5,171,844, col. 2, líneas 55-68, figura 2, y el ejemplo 1 de la patente de los Estados Unidos núm. 5,112,950; col. 2, línea 2 de la col. 19, línea 21 y la tabla 2 de la patente de los Estados Unidos núm. 4,868,112, col. 2, línea 1 a la col. 3, línea 19, col. 3, línea 40 a col. 4, línea 67, col. 7, línea 43 a col. 8, línea 26, y col. 11 de la línea 5 de la col. 13, línea 39 de la patente de los Estados Unidos núm. 7,041,635, o la col. 4, líneas 25-53, de la patente de los Estados Unidos núm. 6,458,563. En algunas modalidades, un Factor VIII con dominio B suprimido tiene una supresión de la mayor parte del dominio B, pero todavía . contiene secuencias amino-terminales del dominio B que son esenciales para el procesamiento proteolítico in vivo del producto de traducción primario en dos cadenas polipeptídicas , como se describe en WO 91/09122, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. En algunas modalidades, un Factor VIII con dominio B suprimido se construye con una supresión de los aminoácidos 747-1638, es decir, virtualmente una supresión completa del dominio B. Hoeben R.C., y otros, J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990) , que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Un Factor VIII con dominio B suprimido puede contener también una supresión de los aminoácidos 771-1666 o de los aminoácidos 868-1562 del Factor VIII. Meulien P., y otros Protein Ing. 2 (4): 301-6 (1988), incorporada en la presente como referencia en su totalidad. Las supresiones adicionales del dominio B que forman parte de la invención incluyen, por ejemplo: la supresión de los aminoácidos 982 al 1562 o del 760 al 1639 (Toóle y otros, Proc. Nati. Acad Sci. Estados Unidos (1986) 83, 5939-5942)), del 797 al 1562 (Eaton y otros, Biochemestry (1986) 25:8343-8347)), del 741 al 1646 (Kaufman (solicitud PCT publicada núm. WO 87/04187)), del 747 a 1560 (Sarver y otros, DNA (1987) 6:553-564)), del 741 al 1648 (Pasek (solicitud PCT núm. 88/00831)), del 816 al 1598 o del 741 al 1689 (Lagner (Behring Inst . Mitt (1988) núm.82: 16-25, EP 295597)), cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Cada una de las supresiones anteriores pueden realizarse en cualquier secuencia del Factor VIII.
"Polipéptido quimérico", como se usa en la presente, significa un polipéptido que incluye dentro de él al menos dos polipéptidos (o subsecuencias o péptidos) procedentes de fuentes diferentes. Los polipéptidos quiméricos pueden incluir, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más polipéptidos de diferentes fuentes, tales como genes diferentes, diferentes ADNc, o diferentes animales u otras especies. Los polipéptidos quiméricos pueden incluir, por e emplo, uno o más conectores que unen las subsecuencias diferentes. Así, las subsecuencias pueden unirse directamente o pueden unirse indirectamente, a través de enlazadores, o ambos, dentro de un polipéptido quimérico único. Los polipéptidos quiméricos pueden incluir, por ejemplo, péptidos adicionales, tales como secuencias de señal y secuencias tales como la 6His y la FLAG que ayudan en la purificación o detección de proteínas. Además, los polipéptidos quiméricos pueden tener adiciones de aminoácido o péptido a los N-terminal y/o C-terminal.
En algunas modalidades, el polipéptido quimérico comprende una porción del Factor VIII y una porción no-Factor VIII. Los Ejemplos de porciones no-Factor VIII incluyen, por ejemplo, Fe, XTEN, y albúmina. Los ejemplos de los polipéptidos quiméricos de la invención incluyen, por ejemplo, polipéptidos quiméricos Factor VIII-Fc, polipéptidos quiméricos Factor VIII -XTEN, y polipéptidos quiméricos Factor VlII-albúmina .
Los ejemplos de polipéptidos quiméricos Factor VIII-Fc incluyen, por ejemplo, las secs. con núms . de ident : 2, 6, 8, 10 y 12 (Tabla 2) , con o sin sus secuencias señal y el polipéptido quimérico Fe de la sec. con núm. de ident: 4 (Tabla 2) .
El polipéptido quimérico puede comprender una secuencia al menos 90% o 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos del Fe y el Factor VIII mostrada en la Tabla 2A (i) sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1665 de la sec. con núm. de ident. :2) o al menos 90% o 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos del Fe y el Factor VIII mostrada en la Tabla 2A (i) con una secuencia señal (aminoácidos -19 a 1665 de la sec. con núm. de ident. :2) . El polipéptido quimérico puede comprender una secuencia idéntica a la secuencia de aminoácidos del Fe y el Factor VIII mostrada en la Tabla 2A(i) sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1665 de la sec. con núm. de ident. :2) o idéntica a la secuencia de aminoácidos del Fe y el Factor VIII mostrada en la Tabla 2A (i) con una secuencia señal (aminoácidos -19 a 1665 de la sec . con núm. de ident.:2).
Como se discutió anteriormente, los ejemplos de polipéptidos quiméricos incluyen el Factor VIII que se fusiona a uno o más polipéptidos XTEN. Schellenburger y otros, Nat . Biotech. 27:1186-90 (2009), que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. El Factor VIII se puede fusionar ya sea al extremo N-terminal del polipéptido XTEN o al extremo C-terminal del polipéptido XTEN, siempre que el componente del Factor VIII de la proteína de fusión Factor VIII-XTEN pueda procesarse por una proteasa para rendir un polipéptido que contiene el Factor VIII procesado. Un sitio de proteasa se puede incluir entre la porción XTEN y la porción del Factor VIH para permitir tal tratamiento. Los polipéptidos XTEN incluyen, por ejemplo, los que se describen en WO 2009/023270, WO 2010/091122, WO 2007/103515, US 2010/0189682, y US 2009/0092582, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
Como se discutió anteriormente, los ejemplos de polipéptidos quiméricos también incluyen el Factor VIII que se fusiona a uno o más polipéptidos de albúmina. Preferiblemente, la albúmina es albúmina humana. El Factor VIII se puede fusionar ya sea al extremo N-terminal de la albúmina o al extremo C-terminal de la albúmina, siempre que el componente Factor VIII de la proteína de fusión Factor VIII -albúmina se pueda procesar por una proproteína convertasa enzimáticamente activa para producir un polipéptido procesado que contiene el Factor VIII. Ejemplos de albúmina, por ejemplo, fragmentos de la misma, que se pueden usar en la presente invención son conocidos. Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm 7,592,010; la patente de los Estados Unidos núm 6,686,179; y Schulte, Thrombosis Res. 124 supl . 2: S6-S8 (2009), cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
En algunas modalidades, un polipéptido quimérico que comprende una porción de Factor VIII tiene una mayor vida media (tl/2) que un polipéptido que consiste en la misma porción del Factor VIII sin la porción no Factor VIII. Un polipéptido quimérico del Factor VIII con un aumento de la tl/2 se puede denominar en la presente como un Factor VIII de acción prolongada. Los polipéptidos quiméricos del Factor VIII de acción prolongada incluyen, por ejemplo, el Factor VIII que se fusiona a Fe (lo que incluye, por ejemplo, polipéptidos quiméricos del Factor VIII en forma de un híbrido tal como un híbrido monómero dímero del FVIIIFc; ver el Ejemplo 1, la Figura. 1, y la Tabla 2A. y las patentes de los Estados Unidos núms . 7,404,956 y 7,348,004), el Factor VIII que se fusiona a XTEN, y el Factor VIII que se fusiona a la albúmina.
"Cultivo", "cultivar" y "se cultiva", como se usan en la presente, significa incubar las células bajo condiciones in vitro que permitan el crecimiento celular o la división, o mantener las células vivas. "Las células cultivadas," como se usa en la presente, significa que las células se propagan in vitro.
"Factor VIII," como se usa en la presente, significa el polipéptido del Factor VIII funcional en su papel normal en la coagulación, a menos que se especifique lo contrario. Así, el término Factor VIII incluye los polipéptidos variantes que son funcionales. Las proteínas preferidas del Factor VIII son las proteínas del Factor VIII humano, porcino, canino, y murino. Como se describe en la sección de Antecedentes de la materia, las secuencias completas de polipéptido y polinucleótido se conocen, como lo son muchos fragmentos funcionales, mutantes y versiones modificadas. Los ejemplos de secuencias del Factor VIII humano se muestran como subsecuencias en las sec . con núms . de ident . : 2, 6, 8, 10 y 12 (Tabla 2) . Los polipéptidos del Factor VIII incluyen, por ejemplo, el Factor VIII de longitud completa, el Factor VIII de longitud completa menos la Met en el extremo N-terminal, el Factor VIII maduro (menos la secuencia señal) , el Factor VIII maduro con una Met adicional en el extremo N- terminal, y/o el Factor VIII con una supresión total o parcial del dominio B. Las variantes preferidas del Factor VIII incluyen la eliminación del dominio B, ya sean supresiones parciales o totales .
Se conocen un gran número de variantes funcionales del Factor VIII, como se discute arriba y abajo. Además, cientos de mutaciones no funcionales en el Factor VIII se identificaron en pacientes con hemofilia, y se determinó que el efecto de estas mutaciones en la función del Factor VIII se debe más a donde se encuentran dentro de la estructura tridimensional de Factor VIII que a la naturaleza de la sustitución (Cutler y otros, Hum. Mutat. 19:274-8 (2002)), incorporada en la presente como referencia en su totalidad. Además, las comparaciones entre el Factor VIII humano y otras especies identificaron residuos conservados que es probable que se requieran para la función (Cameron y otros, Thromb Haemost. 79:317-22 (1998); US 6,251,632), que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
El gen del Factor VIII humano se aisló y se expresó en células de mamífero (Toóle, J. J. , y otros, Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J.( y otros Nature 312:326-330 (1984); Wood, W. I., y otros, Nature 312 : 330-337 (1984); Vehar, G. A., y otros, Nature 312:337-342 (1984); O 87/04187, WO 88/08035, WO 88/03558; la patente de los Estados Unidos núm. 4,757,006), cada uno' de los cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad, y la secuencia de aminoácidos se dedujo a partir del ADNc . Capón y otros, la patente de los Estados Unidos núm. 4,965,199, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad, describen un método de ADN recombinante para la producción de Factor VIII en células hospederas de mamífero y la purificación del Factor VIII humano. Se informó la expresión del Factor VIII humano en las células CHO (ovario de hámster chino) y las células BHKC (células de riñon de hámster bebé) . El Factor VIII humano se modificó para eliminar parte o la totalidad del dominio B (las patentes de los Estados Unidos núms . 4,994,371 y 4,868,112, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) , y se realizó la sustitución del dominio B del Factor VIII humano por el dominio B del Factor V humano (la patente de los Estados Unidos núm' 5,004,803, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . La secuencia de ADNc que codifica para el Factor VIII humano y la secuencia prela de aminoácidos se muestran en las secs . con núms. de ident.: 1 y 2, respectivamente, de la publicación de la solicitud de los Estados Unidos núm. 2005/0100990, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
La patente de los Estados Unidos núm. 5,859,204, Lollar, J. S., que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad, informa mutantes funcionales de Factor VIII que tienen antigenicidad reducida e inmunoreactividad reducida. La patente de los Estados Unidos núm. 6,376,463, Lollar, J. S., que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad, también informa mutantes del Factor VIII que tienen una inmunoreactividad reducida. La publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2005/0100990, Saenko y otros, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad, informa mutaciones funcionales en el dominio A2 del Factor VIII.
Un número de moléculas funcionales del Factor VIII, que incluyen supresiones del dominio B, se describen en las siguientes patentes de los Estados Unidos núms .6 , 316 , 226 y 6,346,513, ambas asignadas a Baxter, 7,041,635 asignada a In2Gen, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, y 6,228,620 asignadas a Chiron; 5,972,885 y 6,048,720 asignadas a Biovitrum, 5,543,502 y 5,610,278 asignadas a Novo Nordisk; 5,171,844 asignada a Immuno Ag; 5,112,950 asignada a Transgene SA 4,868,112 asignada a Genetics Institute, cada una de ellas se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
La secuencia del Factor VIII porcino se publicó, (Toóle, J. J., y otros, Proc . Nati. Acad Sci. Estados Unidos 83:5939-5942 (1986)), se incorpora en la presente como referencia en su totalidad, y se informó la secuencia de ADNc porcina completa que se obtuvo a partir de la amplificación por PCR de las secuencias del Factor VIII a partir de una biblioteca de ADNc de bazo porcino (Healey, J. F., y otros, Blood 88:4209-4214 (1996), que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . Se describió un Factor VIII híbrido humano/porcino que tiene sustituciones de todos los dominios, subunidades, y todas las secuencias de aminoácidos específicas se describieron en la patente de los Estados Unidos núm. 5,364,771 por Lollar y Runge, y en el documento O 93/20093, que se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Más recientemente, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos ácido correspondientes de los dominios Al y A2 del Factor VIII porcino y un Factor VIII quimérico con los dominios Al y / o dominios A2 porcinos sustituidos por los dominios humanos correspondientes se informó en el documento WO 94/11503, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. La patente de los Estados Unidos núm. 5,859,204, Lollar, J. S., también da a conocer las secuencias de aminoácidos del ADNc y la secuencia de aminoácidos que se deduce. La patente 6,458,563, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad, asignada a Emory describe un Factor VIII porcino con el dominio B suprimido.
El Factor VIII (o la porción del Factor VIII de un polipéptido quimérico) puede ser al menos 90% o 95% idéntico a una secuencia de aminoácidos del Factor VIII mostrada en la Tabla 2 sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1438 de la sec . con núm. de ident . : 2 ; aminoácidos 1 a 2332 de la sec . con núm. de ident. : 6 ; aminoácidos 1 a 740 de la sec. con núm. de ident.: 8; aminoácidos 1 a 745 de la sec. con núm. de ident. :10; o aminoácidos 1 a 684 de la sec. con núm. de ident. :12). El Factor VIII (o la porción del Factor VIII de un polipéptido quimérico) puede ser idéntico a una secuencia de aminoácidos del Factor VIII mostrada en la Tabla 2 sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1438 de la sec. con núm. de ident. :2; aminoácidos 1 a 2332 de la sec. con núm. de ident. :6; aminoácidos 1 a 740 de la sec. con núm. de ident. :8; aminoácidos 1 a 745 de la sec. con núm. de ident. :10; o aminoácidos 1 a 684 de la sec. con núm. de ident . : 12) .
El Factor VIII (o la porción del Factor VIII de un polipéptido quimérico) puede ser al menos 90% o 95% idéntico a una secuencia de aminoácidos del Factor VIII mostrada en la Tabla 2 con una secuencia señal (aminoácidos -19 a 1438 de la sec. con núm. de ident. :2; aminoácidos -19 a 2332 de la sec. con núm. de ident. : 6 ; aminoácidos -19 a 740 de la sec. con núm. de ident. : 8 ; aminoácidos -19 a 745 de la sec. con núm. de ident. :10; o aminoácidos -20 a 684 de la sec. con núm. de ident. :12). El Factor VIII (o la porción del Factor VIII de un polipéptido quimérico) puede ser idéntico a una secuencia de aminoácidos del Factor VIII mostrada en la Tabla 2 con una secuencia séñal (aminoácidos -19 a 1438 de la sec. con núm. de ident . : 2 ; aminoácidos -19 a 2332 de la sec. con núm. de ident. : 6 ; aminoácidos -19 a 740 de la sec. con núm. de ident. :8; aminoácidos -19 a 745 de la sec. con núm. de ident. :10; o aminoácidos -20 a 684 de la sec. con núm. de ident . : 12 ) .
"Cantidad equivalente", como se usa en la presente, significa la misma cantidad de actividad del Factor VIII expresada. en Unidades Internacionales, la cual es independiente del peso molecular del polipéptido en cuestión. Una Unidad Internacional (UI) de actividad del Factor VIII corresponde aproximadamente a la cantidad de Factor VIII en un mililitro de plasma humano normal. Varios ensayos están disponibles para medir la actividad del Factor VIII, que incluye el ensayo de sustrato cromogénico de la Farmacopea Europea y un ensayo de coagulación de una etapa.
"Fe", como se usa en la presente, significa parejas de unión al receptor Fe neonatal (FcRn) funcional, a menos que se especifique lo contrario. Una pareja de unión al FcRn es cualquier molécula que puede unirse específicamente al receptor FcRn con el consecuente transporte activo por parte del receptor FcRn de la pareja de unión al FcRn. Así, el término Fe incluye las variantes de Fe de IgG que son funcionales. La región de la porción Fe de la IgG que se une al receptor FcRn se describió sobre la base de la cristalografía de rayos X (Burmeister y otros 1994, Nature 372:379, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . El área de contacto mayor del Fe con el FcRn es cerca de la unión de los dominios CH2 y CH3. Los contactos Fe-FcRn están todos dentro de una sola cadena pesada de Ig. Las parejas de unión FcRn incluyen, por ejemplo, toda la IgG, el fragmento Fe de la IgG, y otros fragmentos de IgG que incluyen la región de unión del FcRn completa. Los sitios de contacto principales incluyen los residuos de aminoácidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 y 314 del dominio CH2 y los residuos de aminoácidos 385-387, 428 y 433-436 del dominio CH3. Las referencias a la numeración de aminoácidos de las inmunoglobulinas o fragmentos de inmunoglobulinas, o regiones, se basan en Kabat y otros, 1991, Sequence of Proteins of Immunological Interest, U S Department of Public Health, Bethesda; MD, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. El receptor FcRn se aisló de varias especies de mamíferos, lo que incluyó seres humanos. (Las secuencias del FcRn humano, FcRn de rata y de ratón FcRn se conocen (Story y otros, 1994, J. Ex . Med. 180:2377), se incorporan en la presente como referencia en su totalidad.) Un Fe puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una inmunoglobulina con o sin la región bisagra de la inmunoglobulina. Los ejemplos de variantes de Fe se proporcionan en* WO 2004/101740 y O 2006/074199, que se incorporan en la presente como referencia en su totalidad.
El Fe (o la porción Fe de un polipéptido quimérico) puede contener una o más mutaciones, y combinaciones de mutaciones.
El Fe (o la porción Fe de un polipéptido quimérico) puede contener mutaciones que le confieren mayor vida media como M252Y, S254T, T256E, y combinaciones de las mismas, como se describe en Oganesyan y otros, Mol. Immunol . 46:1750 (2009) , que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad; H433K, N434F, y combinaciones de las mismas, como se describe en Vaccaro y otros Nat . Biotechnol. 23:1283 (2005) , que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad; los mutantes descritos en las páginas 1-2, párrafo
[0012] , y los Ejemplos 9 y 10 de US 2009/0264627 Al, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad, y los mutantes descritos en la página 2, párrafos
[0014] a
[0021] de US 20090163699 Al, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
El Fe (o la porción Fe de un polipéptido quimérico) también puede incluir, por ejemplo, las mutaciones siguientes: La región Fe de la IgG se puede modificar de acuerdo con procedimientos bien reconocidos, tales como la mutagénesis dirigida y similares para rendir IgG o fragmentos Fe o partes de los mismos modificados que se unirán al FcRn.
Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, modificaciones alejadas de los sitios de contacto del FcRn así como modificaciones dentro de los sitios de contacto que preservan o incluso mejoran la unión al FcRn. Por ejemplo los siguientes residuos simples de amino ácido en el IgGl Fe humano (Fcyl) se pueden sustituir sin pérdida significativa de la afinidad de unión al Fe por el FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, A330S, P331A, P331S, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, y K447A, donde por ej emplo P238A representa la prolina salvaje sustituida por alanina en la posición número 238. Además de la alanina otros aminoácidos se pueden sustituir por los aminoácidos salvajes en las posiciones que se especificaron arriba. Las mutaciones se pueden introducir por separado en el Fe lo que da lugar a más de cien parejas de unión al FcRn distintos del nativo. Además, las combinaciones de dos, tres, o más de estas mutaciones individuales pueden introducirse juntas, lo que da lugar a cientos de parejas más de unión al FcRn. Algunas de estas mutaciones pueden conferir una nueva funcionalidad a la pareja de unión al FcRn. Por ejemplo, una modalidad incorpora N297A, por la eliminación de un sitio de N-glicosilación muy conservado. El efecto de esta .mutación es reducir la inmunogenicidad, lo que aumenta la vida media circulante de la pareja de unión al FcRn, y rinde una pareja de unión al FcRn incapaz de unirse a FcyRI , FcyRIIA, FcyRIIB, y FcyRIIIA, sin comprometer la afinidad por el FcRn (Routledge y otros, 1995, Transplantation 60:847, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad; Friend y otros, 1999, Transplantation 68:1632, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad; Shields y otros, 1995, J. Biol. Chem. 276:6591, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . Además, por lo menos tres receptores Fe gamma humanos parecen reconocer un sitio de unión a IgG dentro de la región bisagra inferior, generalmente los aminoácidos 234-237. Por lo tanto, otro ejemplo de una nueva funcionalidad y de la disminución potencial de la inmunogenicidad puede surgir a partir de mutaciones en esta región, como por ejemplo mediante la sustitución de los aminoácidos 233-236 de la IgGl humana "ELLG" por la secuencia correspondiente de IgG2 "PVA" (con la supresión de un aminoácido) . Se demostró que el FcyRI , FcyRII, y FcyRIII que median diversas funciones efectoras no se unen a la IgGl cuando se introducen tales mutaciones (Ward y Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad, y Armour y otrosl999., Eur. J. Immunol . 29:2613, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . Como un ejemplo adicional de la nueva funcionalidad que surge de las mutaciones que se describieron anteriormente, la afinidad por el FcRn puede aumentarse más allá que la del tipo salvaje en algunos casos. Esta mayor afinidad puede reflejar un aumento en la velocidad de "asociación", una disminución de la velocidad de "disociación" o tanto un aumento en la velocidad de "asociación" como una disminución en la velocidad de "disociación" . Las mutaciones que se cree que aumentan la afinidad por el FcRn incluyen, por ejemplo, T256A, T307A, E380A, y N434A (Shields y otros, 2001, J. Biol . Chem. 276:6591, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) .
El Fe (o la porción Fe de un polipéptido quimérico) puede ser al menos 90% o 95% idéntico a la secuencia de aminoácidos del Fe mostrada en la Tabla 2- (aminoácidos 1439 a 1665 de la sec . con núm. de ident. :2; aminoácidos 2333 a 2559 de la sec. con núm. de ident . : 6 ; aminoácidos 741 a 967 de la sec . con núm. de ident . : 8 ; aminoácidos 746 a 972. de la sec . con núm. de ident. :10; aminoácidos 685 a 924 de la sec. con núm. de ident. -.12) . El Fe (o la porción Fe de un polipéptido quimérico) puede ser idéntico a la secuencia de aminoácidos del Fe mostrada en la Tabla 2 (aminoácidos 1439 a 1665 de la sec. con núm. de ident . : 2 ; aminoácidos 2333 a 2559 de la sec. con núm. de ident. :-6; aminoácidos 741 a 967 de la sec. con núm. de ident. : 8 ; aminoácidos 746 a 972 de la sec. con núm. de ident. :10; aminoácidos 685 a 924 de la sec. con núm. de ident . : 12) .
Los polipéptidos y las proteínas "híbridos", tal como se usa en la presente, significan una combinación de un polipéptido quimérico con un segundo polipéptido. El polipéptido quimérico y el segundo polipéptido en un híbrido pueden asociarse uno al otro a través de interacciones proteína-proteína, tales como carga-carga o interacciones hidrofóbicas . El polipéptido quimérico y el segundo polipéptido en un híbrido pueden asociarse uno con el otro a través de enlaces disulfuro o covalente(s) . Los híbridos se describen en el documento WO 2004/101740 y WO 2006/074199, cada uno de ellos se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Ver también las patentes de los Estados Unidos núms . 7,404,956 y 7,348,004, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. El segundo polipéptido puede ser una segunda copia del mismo polipéptido quimérico o puede ser un polipéptido quimérico no idéntico. Ver, por ejemplo, la Figura 1, el Ejemplo l,.y la Tabla 2. En las modalidades preferidas, el segundo polipéptido es un polipéptido que comprende un Fe. En las modalidades preferidas, el polipéptido quimérico es un polipéptido quimérico Factor VIII-Fc y el segundo polipéptido consiste esencialmente en un Fe, por ejemplo, el polipéptido híbrido del Ejemplo 1, que es una proteína de fusión recombinante rFVIIIFc que consiste de una sola molécula de FVIII humano recombinante con el dominio B suprimido (BDD-rFVIII) fusionada al dominio Fe dimérico de la IgGl humana, sin la intervención de una secuencia de unión. Este polipéptido híbrido se denomina en la presente como proteína de fusión monomérica FVIIIFc Fe, híbrido FVIIIFc monomérico, híbrido FVIIIIFc monomérico, y monómero-dímero FVIIIFc. Ver el Ejemplo 1, la Figura 1, y la Tabla 2A. Los ejemplos proporcionan datos preclínicos y clínicos para este polipéptido híbrido.
El segundo polipéptido en un híbrido puede comprender o consistir esencialmente de una secuencia al menos 90% o 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2A (ii) sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 227 de la sec . con núm. de ident..:4) o al menos 90% o 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2A (ii) con una secuencia señal (aminoácidos -20 a 227 de la sec. con núm. de ident. :4) . El segundo polipéptido puede comprender o consistir esencialmente de una secuencia idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2A (ii) sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 227 de la sec . con núm. de ident.: 4) o idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2A (ii) con una secuencia señal (aminoácidos -20 a 227 de la sec. con núm. de ident. :4) .
La Figura 1 es un esquema que muestra la estructura del polipéptido quimérico Factor VIII con el dominio B suprimido-Fe, y su asociación con un segundo polipéptido que es un polipéptido Fe. Para obtener este híbrido, la secuencia de codificación del Factor VIII con el dominio B suprimido humano recombinante se obtuvo por reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) a partir de ARN poli A de hígado humano (Clontech) por medio del uso de cebadores específicos para FVIII. La' secuencia de FVIII incluye la secuencia señal nativa para FVIII. La supresión del dominio B fue desde la serina 743 (S743, 2287 pb) hasta la glutamina 1638 (Q1638, 4969 pb)- para una supresión total de 2682 pares de bases. Después, la secuencia de codificación del Fe humano recombinante se obtuvo por RT-PCR a partir de una genoteca de ADNc de leucocitos, humanos (Clontech) por medio del uso de cebadores específicos de Fe. Los cebadores se diseñaron de tal manera que la secuencia del FVIII con el dominio B suprimido se fusionara directamente a la secuencia N-terminal del Fe sin intervenir enlazador. La secuencia de ADN de FVIIIFc se clonó en el vector de doble expresión de mamíferos pBUDCE4.1 (Invitrogen) , bajo el control del promotor CMV. Una segunda secuencia idéntica de Fe que incluye la secuencia señal de ratón Igk se obtuvo por RT-PCR y se clonó aguas abajo del segundo promotor, EFla, en el vector de expresión pBUDCE .1.
El vector de expresión rFVIIIFc se transfectó en las células 293 de riñon embrionario humano (HEK293H; Invitrogen) , por medio del uso del reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen) . Se generaron líneas celulares estable clónales por selección con Zeocin (Invitrogen) . Una línea celular clonal, 3C4-22 se usó para generar FVIIIFc para la caracterización in vivo. El FVIIIFc recombinante se produjo y se purificó (McCue y otros, 2009) en Biogen Idee (Cambridge, MA) . Se esperaba que la estrategia de transfección que se describió anteriormente rindiera tres productos, es decir, los híbridos rFVIIIFc monoméricos, los híbridos rFVIIIFc diméricos y el Fe dimérico. Sin embargo, no se detectó esencialmente ningún rFVIIIFc dimérico en el medio condicionado de estas células. Más bien, el medio condicionado contenía Fe y rFVIIIFc monoméricos. Es posible que el tamaño del rFVIIIFc dimérico fuera demasiado grande e impidió la secreción eficiente - por la célula. Este resultado fue beneficioso ya que dio lugar a una purificación del monómero menos complicada que si las tres proteínas estuvieran presentes. El material que se usó en estos estudios tenía una actividad específica de aproximadamente 9000 Ul/mg.
"Intervalo de dosificación", como se usa en la presente, significa la cantidad de tiempo que transcurre entre múltiples dosis que se administran a un sujeto. La comparación del intervalo de dosificación puede llevarse a cabo en un solo sujeto o en una población de sujetos y luego puede calcularse el promedio obtenido en la población.
El intervalo de dosificación cuando se administra un polipéptido quimérico del Factor VIII, por ejemplo, un polipéptido quimérico Factor VIII-Fc (un polipéptido que comprende un Factor VIII o un híbrido) de la invención puede ser al menos aproximadamente una vez y media más largo que el intervalo de dosificación requerido para una cantidad equivalente de el Factor VIII sin la porción no-Factor VIII, por ejemplo, sin la porción Fe (un polipéptido que consiste de el Factor VIII) . El intervalo de dosificación puede ser al menos aproximadamente una vez y media a seis veces más largo, de una y media a cinco veces más largo, de una y media a cuatro veces más largo, de una y media a tres veces más largo, o de una y media a dos veces más largo, que el intervalo de dosificación requerido para una cantidad equivalente de el Factor VIII sin la porción no-Factor VIII, 2 por ejemplo, sin la porción Fe (un polipéptido que consiste de el Factor VIII) . El intervalo de dosificación puede ser al menos aproximadamente de una y media, dos, dos y media, tres, tres y media, cuatro, cuatro y media, cinco, cinco y media o seis veces más largo que el intervalo de dosificación requerido para una cantidad equivalente de el Factor VIII sin la porción no-Factor VIII, por ejemplo, sin la porción Fe (un polipéptido que véconsiste de el Factor VIII) .El intervalo de dosificación puede ser de aproximadamente cada cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce días o más. El intervalo de dosificación puede ser al menos aproximadamente de uno y medio a 5, uno y medio, 2, 3, 4, o 5 días o más. para el tratamiento a-demanda, el intervalo de dosificación de el polipéptido quimérico o híbrido es aproximadamente una vez cada 24-36, 24-48, 24-72, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, o 72 horas o más .
Preferentemente, la dosis efectiva es 25-65 Ul/kg (25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 62, 64, o 65 Ul/kg) y el intervalo de dosificación es una vez cada 3-5, 3-6, 3-7, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 o más días, o tres veces por semana, o no más de tres veces por semana. Preferentemente, la dosis efectiva es 65. Ul/kg y el intervalo de dosificación es una vez por semana, o una vez cada 6-7 días.
El "Factor VIII de acción prolongada" es un Factor VIII que tiene una mayor vida media (también denominada en la presente como tl/2, tl/2 beta, vida media de eliminación y HL) con respecto a un Factor VIII de referencia. El aumento de la vida media de un Factor VIII de acción prolongada puede deberse a la fusión con uno o más polipéptidos no Factor VIII tales como, por ejemplo, Fe, XTEN o albúmina. El aumento de la vida media puede deberse a una o más modificaciones, tales como, por, ejemplo, la pegilación. Los ejemplos de polipéptidos de Factor VIII de acción prolongada incluyen, por ejemplo, polipéptidos quiméricos del Factor VIII que comprenden Fe, polipéptidos quiméricos del Factor . VIII que comprenden XTEN y polipéptidos quiméricos del Factor VIII que comprenden la albúmina. Los polipéptidos del Factor VIII de acción prolongada ejemplares adicionales incluyen, por ejemplo, el Factor VIII pegilado.
Un polipéptido de "referencia", en el caso de un polipéptido quimérico del Factor VIII de acción prolongada, es un polipéptido que consiste esencialmente en la porción Factor VIII del polipéptido quimérico, por ejemplo, la misma porción del Factor VIII sin la porción Fe, sin la porción XTEN, o sin la porción de la albúmina. Asimismo, el polipéptido de referencia en el caso de un Factor VIII modificado es el mismo Factor VIII sin la modificación, por ejemplo, un Factor VIII sin la pegilación.
En algunas modalidades, el Factor VIII de acción prolongada tiene una o más de las siguientes propiedades cuando se administra a un sujeto: un tiempo medio de residencia (MTR) (actividad) en el sujeto de unas 14-41.3 horas; un aclaramiento (CL) (actividad) en el sujeto de aproximadamente 1.22-5.19 ml/hora/kg o menos; una tl/2 beta (actividad) en el sujeto de unas 11-26.4 horas ; una recuperación incremental (valor K) (actividad, observada) en el sujeto de aproximadamente 1.38 a 2.88 UI / di por Ul/kg; un Vss (actividad) en el sujeto de aproximadamente 37.7-79.4 ml/kg, y una AUC/dosis de el sujeto de aproximadamente 19.2-81.7 UI*h/dl por Ul/kg.
En algunas modalidades, el Factor VIII de acción prolongada tiene una o más de las siguientes propiedades cuando se administra a una población de pacientes : una recuperación media incremental (valor K) (actividad, observada) mayor que 1.38 Ul/dl por Ul/kg; una recuperación media incremental (valor K) (actividad; observada) de al menos aproximadamente 1.5, al menos aproximadamente 1.85, o al menos aproximadamente 2.46 Ul/dl por Ul/kg. depuración media (CL) (actividad) en la población de pacientes de aproximadamente 2.33 ± 1.08 ml/hora/kg o menos; un promedio de aclaramiento (CL) (actividad) en la población de pacientes de aproximadamentel .8-2.69 ml/hor /kg; un promedio de aclaramiento (CL) (actividad) en la población de pacientes que es aproximadamente el 65% del aclaramiento de un polipéptido que comprende el Factor VIII sin modificaciones; un tiempo medio de residencia (MRT, por sus siglas en inglés) (actividad) en la población de pacientes de al menos aproximadamente 26.3 ± 8.33 horas; un MRT medio (actividad) en la población de pacientes de aproximadamente 25.9 - 26.5 horas un MRT medio (actividad) en la población de pacientes que es aproximadamente 1.5 veces más largo que el MRT medio de un polipéptido que comprende el Factor VIII sin modificaciones; un tl/2beta medio (actividad) en la población de pacientes de aproximadamente 18.3 ± 5.79 horas; un tl/2beta medio (actividad) en la población de pacientes que es de unos 18 - 18.4 horas; un tl/2beta medio (actividad) en la población de pacientes que es aproximadamente 1.5 veces más largo que el tl/2beta medio de un polipéptido que comprende el Factor VIII sin modificaciones; una recuperación media incremental (Valor K) (actividad; observada) en la población de pacientes de aproximadamente 2.01 ± 0.44 Ul/dl per Ul/kg; una recuperación media incremental (valor K) (actividad, observada) en la población de pacientes de aproximadamente 1.85 a 2.46 Ul/dl por Ul/kg; una recuperación media incremental (valor K) (actividad; observada) en la población de pacientes que es aproximadamente el 90% de la recuperación media incremental de un polipéptidoque comprende el Factor VIII sin modificaciones ; un Vss media (actividad) en la población de pacientes de aproximadamente 55.1 + 12.3 ml/kg; un Vss media (actividad) en la población de pacientes de aproximadamente 45.3 a 56.1 ml/kg; una AUC/dosis media (actividad) en la población de pacientes de aproximadamente 49.9 ± 18.2 UI*h/dl por Ul/kg; una AUC/dosis promedio (actividad) en la población de paciente de aproximadamente 44.8 a 57.6UI*h/dl por Ul/kg.
"Tratamiento a-demanda", como se usa en la presente, significa un tratamiento que se pretende que tenga lugar en un curso corto de tiempo y en respuesta a una condición existente, como un episodio de sangrado, o se percibe una necesidad tal como una cirugía prevista. Las condiciones que pueden requerir tratamiento a-demanda incluyen, por ejemplo, un episodio de sangrado, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado bucal, hemorragia, hemorragia en. los músculos, hemorragia oral, trauma, trauma por capitis, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intra abdominal, hemorragia rntratorácica , fractura de huesos, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal , o sangrado en la vaina illiopsoas. El sujeto puede necesitar profilaxis quirúrgica, intervenciones peri-quirúrgicas, o tratamiento de cirugía. Las cirugías de este tipo incluyen, por ejemplo, cirugía menor, cirugía mayor, la extracción dental, la amigdalectomía , herniotomía inguinal, sinovectomía , el reemplazo total de rodilla, craneotomía, osteosíntesis , cirugía por trauma, cirugía intracraneal, cirugía intra-abdominal , cirugía intratorácica, o cirugía de reemplazo articular.
Preferentemente, el tratamiento a-demanda resuelve más que 80% (más que 80%, más que 81%, más que 8.2%, más que 83%, más que 84%, más que 85%, más que 86%, más que 87%, más que 88%, más que 89%, más que 90%, más que 91%, más que 92%, más que 93%, más que 94%, más que 95%, más que 96%, más que 97%, más que 98%, más que 99%, o 100%) o 80-100%, 80-90%, 85-90%, 90-100%, 90-95%, o 95-100% de los sangrados (por ejemplo, sangrados espontáneos) en uns única dosis. Preferentemente, más que 80% (más que 81%, más que 82%, más que 83%, más que 84%, más que 85%, más que 86%, más que 87%, más que 88%, más que 89%, más que 90%, más que 91%, más que 92%, más que 93%, más que 94%, más que 95%, más que 96%, más que 97%, más que 98%, o 100%) o 80-100%, 80-90%, 85-90%, 90-100%, 90-95%, o 95-100% de los episodios de sangrados se califican excelente o buenos por los médicos después del tratamiento a-demanda. Preferentemente, más que 5%, (más que 6%, más que 7%, más que 8%, más que 9%, más que 10%, más que 11%, más que 12%, más que 13%, más que 14%, más que 15%, más que 16%, más que 17%, más que 18%, más que 19%, más que 20%), o 5-20%, 5-15%, 5-10%, 10-20%, o 10-15% de los episodios de sangrado se califican aceptables por los médicos después del tratamiento -demanda .
" Polipéptido" , "péptido" y "proteína" se usan indistintamente y se refieren a un compuesto polimérico compuesto de residuos de aminoácidos unidos covalentemente.
"Polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan indistintamente y se refieren a un compuesto polimérico compuesto de residuos de nucleótidos unidos covalentemente. Los polinucleótidos pueden ser ADN, ADNc, ARN monocatenario, o de hebra doble, vectores, plásmidos, fagos, o virus. Los polinucleótidos incluyen, por ejemplo, los de la Tabla 1, que codifican los polipéptidos de la Tabla 2 (ver Tabla 1) . Los polinucleótidos también incluyen, por ejemplo, los fragmentos de los polinucleótidos de la Tabla 1, por ejemplo, aquellos que codifican fragmentos de los polipéptidos de la Tabla 2, tales como el Factor VIII, Fe, la secuencia señal, los fragmentos 6His y otros de los polipéptidos de la Tabla 2.
"Tratamiento profiláctico", como se usa en la presente, significa la administración de un polipéptido del Factor VIII en dosis múltiples a un sujeto durante un curso de tiempo para aumentar el nivel de actividad del Factor VIII en el plasma del sujeto. Preferentemente, el aumento del nivel es suficiente como para disminuir la incidencia del sangrado espontáneo o para evitar el sangrado, por ejemplo, en el caso de una lesión imprevista. Preferentemente, durante el tratamiento profiláctico, el nivel de proteína de plasma en el sujeto no cae por debajo del nivel básico para ese sujeto, o por debajo del nivel de Factor VIII que caracteriza la hemofilia severa (<1 Ul/dl [1¾] ) .
Preferentemente, el régimen de profilaxis se adapta para el paciente individual, preferentemente mediante la determinación de los datos de PK para cada paciente y por la administración del Factor VIII de la invención en un intervalo de dosificación que mantiene un nivel de 1-3% la actividad del FVIII. Se pueden hacer ajustes cuando un .sujeto experimenta episodios de sangrado inaceptables definidos como = 2 episodios de sangrado espontáneos en un período continuo de dos meses. En este caso, el ajuste se dirigirá a niveles de 3-5%. Preferentemente, el tratamiento profiláctico resulta en la prevención y el control del sangrado, el control sostenido del sangrado, la protección sostenida del sangrado y/o un beneficio sostenido. La profilaxis, por ejemplo, la protección sostenida se puede demostrar por un aumento de las AUC en el último punto de tiempo medido (AUC-LAST) y una disminución del aclaramiento, lo que resulta en un mayor tl/2 terminal en comparación con el Factor VIII de acción corta . Preferentemente, la profilaxis se demuestra por una mejor Cmáx, un mejor Tmáx, y/o mayor tiempo de residencia medio en comparación con el FVIII de acción corta. Preferentemente, la profilaxis no resulta en episodios de sangrado espontáneos dentro de aproximadamente 24, 36, 48, 72, o 96 horas (por ejemplo, 25, 26, 21, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 96, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, o 96 horas, preferentemente dentro de 72 horas) , después de la inyección (por ejemplo, la última inyección) . Preferentemente, la profilaxis resulta en una reducción promedio de más que 30% (por ejemplo, más que 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 96, 87, 88, 89, o 90%, preferentemente mayor que 50%) , en los episodios de sangrado anuales con una dosificación de una vez a la semana (por ejemplo, a 65 Ul/kg) .
"Sujeto" como se usa en la presente, significa un humano o un mamífero no humano. Los mamíferos no humanos incluyen, por ejemplo, ratones, perros, primates, monos, gatos, caballos, vacas, cerdos y otros animales domésticos y animales pequeños .
"Dosis terapéutica", tal como se usa en la presente, significa una dosis que alcanza un objetivo terapéutico, como se describe en la presente. El cálculo de la dosis necesaria del Factor VIII se basa en el hallazgo empírico de que, en promedio, 1 UI de Factor VIII por kg de peso corporal incrementa la actividad del Factor VIII plasmático en aproximadamente 2 Ul/dl. La dosis requerida se determina mediante la siguiente fórmula: Unidades requeridas = peso corporal (kg) x aumento deseado del Factor VIII (Ul/dl o % de lo normal) x 0.5 (Ul/kg por Ul/dl) Las dosis terapéuticas que pueden usarse en los métodos de la invención son aproximadamente 10-100 Ul/kg, más específicamente, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, o 90-100 Ul/kg, y más específicamente, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 Ul/kg.
Las dosis terapéuticas adicionales que pueden usarse en los métodos de la invención son de aproximadamente 10 a aproximadamente 150 Ul/kg, más específicamente, aproximadamente 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150 Ul/kg, y más específicamente, aproximadamente 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, o 150 Ul/kg.
"Variante", como se usa en la presente, se refiere a un polinucleótido o polipéptido diferente del polinucleótido o polipéptido original, pero que conserva las propiedades esenciales de los mismos, por ejemplo, la actividad coagulante del Factor VIII o la actividad del Fe (unión al FcRn) . Generalmente, las variantes son en general muy similares, y, en muchas regiones, idénticas al polinucleótido o polipéptido original. Las variantes incluyen, por ejemplo, los fragmentos de los polipéptidos y polinucleótidos , las supresiones, las inserciones, y las versiones modificadas de los polipéptidos originales.
Las variantes de polinucleótidos pueden comprender, o alternativamente consistir en, una secuencia de nucleótidos que es al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifican las sec . con núms . de ident : 1, 3, 5, 7, 9, o 11 (la porción del Factor VIII, la porción Fe, individualmente o en conjunto) o la cadena complementaria a la misma, una secuencia de de codificación de nucleótidos de mutantes y recombinantes del Factor VIII o el Fe conocidos, tales como los descritos en las publicaciones y patentes citadas en la presente o la cadena complementaria de las mismas, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de sec . con núm. de ident: 2, 4, 6, 8, 10, ó 12 (la porción del Factor VIII, la porción Fe, individualmente o en conjunto) , y/o fragmentos de polinucleótidos de cualquiera de estas moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, aquellos fragmentos descritos en la presente) . Los polinucleótidos que hibridizan con estas moléculas de ácidos nucleicos bajo condiciones rigurosas de hibridación o condiciones menos rigurosas también se incluyen como variantes, como son polipéptidos codificados por estos polinucleótidos, siempre y cuando sean funcionales.
Las variantes de polipéptidos pueden comprender, o alternativamente consistir en, una secuencia de aminoácidos que es al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idéntica a, por ejemplo, la secuencia del polipéptido que se muestra en la sec. con núm. de ident: 2, 4, 6, 8, 10, ó 12 (la porción del Factor VIII, la porción Fe, individualmente o en conjunto) , y/o fragmentos de polipéptidos de cualquiera de estos polipéptidos (por ejemplo, aquellos fragmentos que se describen en la presente) .
Por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia, se pretende que la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia de nucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia se pueden eliminar o sustituir con otro nucleótido, o un número de nucleótidos hasta el 5% de los · nucleótidos totales en la secuencia de referencia se pueden insertar en la secuencia de referencia. La secuencia de consulta puede ser, por ejemplo, toda la secuencia que se muestra en la sec . con núm. de ident: 1 o 3, el marco de lectura abierto (ORF, por sus siglas en inglés) , o cualquier fragmento especificado como se describe en la presente.
Como una cuestión práctica, puede determinarse convencionalmente si cualquier molécula de ácido nucleico o polipéptido particular es al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a una secuencia de nucleótidos o polipéptido de la presente invención por medio del uso de programas de ordenador conocidos. Un método preferido para determinar la mejor coincidencia general entre una secuencia de consulta (referencia o la secuencia original) y una secuencia sujeto, también referida como una secuencia de alineación global, se puede determinar por medio del uso el programa de ordenador FASTDB que se basa en el algoritmo de Brutlag y otros, (Comp. App . Biosci . (1990) 6:237-245), que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. En una alineación de secuencias las secuencias de consulta y sujetos son ambas secuencias de ADN. Se puede comparar una secuencia de ARN mediante la conversión de U a T. El resultado de la alineación global de secuencias es en porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos que se usan en una alineación FASTDB de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad son: matriz=unitaria , k-tupla=4, penalización por discordancia=l , penalización por unión=30, longitud de grupo de aleatorización=0 , puntación de corte=l, penalización de brecha=5, penalización por talla de brecha 0.05, tamaño de ventana=500 o la longitud de la secuencia sujeto de nucleótidos, la que sea más corta.
Si la secuencia sujeto es más corta que la secuencia de consulta debido a supresiones 5.' o 31 , no debido a supresiones internas, debe realizarse una corrección manual a los resultados. Esto es porque el programa FASTDB no considera los truncamientos 5' y 3' de la secuencia del sujeto al calcular el porcentaje de identidad. Para las secuencias del sujeto truncadas en los extremos 5 'o 3', en relación con la secuencia de consulta, el porcentaje de identidad se corrige mediante el cálculo del número de bases de la secuencia de consulta que están a 5 ' y 31 de la secuencia del sujeto, que no coinciden/alinean, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia de consulta. Si un nucleótido coincide/alinea se determina por los resultados de la alineación de secuencias FASTDB . Este porcentaje se resta del porcentaje de identidad, que se calculó por el programa FASTDB anteriormente, por medio del uso de los parámetros especificados, para llegar a una puntuación de porcentaje de identidad final. Esta puntuación corregida es la que se usa para los fines de la presente invención. Sólo las bases fuera de las bases 5 'y 3' de la secuencia sujeto, como se muestra por la alineación FASTDB, que no coinciden/alinean con la secuencia de consulta, se calculan con el fin de ajustar manualmente la puntuación de porcentaje de identidad.
Por ejemplo, una secuencia sujeto de 90 bases se alinea con una secuencia de consulta de 100 bases para determinar el porcentaje de identidad. Las supresiones se producen en el extremo 5' de la secuencia sujeto y, por tanto, la alineación FASTDB no muestra una coincidencia/alineación de las primeras 10 bases en el extremo 5 ' . Las 10 bases desapareadas representan el 10% de la secuencia (número de bases en los extremos 51 y 3 ' que no coinciden/con el número total de bases en la secuencia de consulta) así que el 10% se substrae de la puntuación de porcentaje de identidad que se calculó por el programa FASTDB . Si el resto de las 90 bases coinciden perfectamente el porcentaje de identidad final sería del 90%. En otro ejemplo, una secuencia sujeto de 90 bases se compara con una secuencia de consulta de 100 bases. Esta vez las supresiones son supresiones internas de modo que no hay bases en el extremo 5' o 3' de la secuencia sujeto que no coinciden/alinean con la consulta. En este caso, el porcentaje de identidad que se calculó por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez más, sólo las bases en 5 'y 3' de la secuencia sujeto que no se coinciden/alinean con la secuencia de consulta se corrigen manualmente. No se realizan otras correcciones manuales para los fines de la presente invención .
Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de aminoácidos de consulta de la presente invención, se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sujeto sea idéntica a la secuencia de consulta, excepto que la secuencia del polipéptido sujeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la consulta. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de consulta, hasta un 5% de los residuos de aminoácidos en la secuencia sujeto pueden insertarse, eliminarse (indeles) o sustituirse con otro aminoácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones amino o carboxilo terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, ya sea individualmente intercaladas entre los residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Como una cuestión práctica, si cualquier polipéptido particular es al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de la sec . con núm. de ident.: 2 (la porción del Factor VIII, la porción Fe, individualmente o juntas) o 4, o una secuencia polipeptídica conocida del Factor VIII o el Fe, se puede determinar convencionalmente por medio del uso de programas de ordenador conocidos. Un método preferido para determinar la mejor coincidencia general entre una secuencia de consulta, (referencia o la secuencia original) y una secuencia sujeto, que también se refiere como una secuencia de alineación global, se puede determinar por medio del uso del programa de ordenador FASTDB que se basa en él algoritmo de Brutlag y otros, Comp. App . Biosci . 6:237-245 (1990), que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. En una alineación de secuencias las secuencias de consulta y sujeto son o bien ambas secuencias de nucleótidos o ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de la alineación global de secuencias es en porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos que se usan en una alineación de aminoácidos FASTDB son: matrix=PAM 0, k-tupla=2, penalización de no coincidencia=l , penalización de unión=20, longitud del grupo de aleatorización=0 , puntuación de corte=l, tamaño de ventana=longitud de la secuencia, penalización de brecha=5, penalización de tamaño de brecha=0.05, tamaño de ventana=500 o la longitud de la secuencia de aminoácidos sujeto, lo que sea más corta.
Si la secuencia sujeto es más corta que la secuencia de consulta debido a supresiones en N-terminal o C-terminal, no por supresiones internas, debe introducirse una corrección manual en los resultados. Esto es porque el programa FASTDB no tiene en cuenta los truncamientos N-terminal y C-terminal de la secuencia sujeto al calcular el porcentaje de identidad global. Para las secuencias sujeto truncadas en el extremo N-y C-terminales , en relación con la secuencia de consulta, el porcentaje de identidad se corrige mediante el cálculo del número de residuos de la secuencia de consulta que son N- y C-terminales de la secuencia sujeto, que no coinciden/alinean con el correspondiente residuo sujeto, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia de consulta. Si un residuo coincide/alinea se determina por los resultados de la secuencia de alineación FASTDB. Este porcentaje se resta del porcentaje de identidad, que se calculó por el programa FASTDB anteriormente, por medio del uso de los parámetros especificados, 'para llegar a una puntuación de porcentaje de identidad final. Esta puntuación final de porcentaje de identidad es lo que se usa para los fines de la presente invención. Sólo los residuos N- y C-terminales de la secuencia sujeto, que no coinciden/ alinean con la secuencia de consulta, se consideran para el propósito de ajustar manualmente la puntuación de porcentaje de identidad. Esto es, sólo las posiciones de los residuos de consulta fuera de los residuos más lejanos N- y C-terminales de la secuencia sujeto.
Por ejemplo, una secuencia sujeto de 90 residuos de aminoácidos se alinea con una secuencia de consulta de 100 residuos para determinar el porcentaje de identidad. La supresión se produce en el extremo N-terminal de la secuencia sujeto y, por tanto, la alineación FASTDB no muestra una coincidencia/alineación de los primeros 10 residuos en el extremo N-terminal . Los 10 residuos no pareados representan el 10% de la secuencia (número de residuos en los N- y extermínales que no coinciden/número total de los residuos en la secuencia de consulta) de forma que el 10% se sustrae de la puntuación del porcentaje de identidad que se calculó por el programa FASTDB . Si los restantes 90 residuos se combinan perfectamente el porcentaje de identidad final sería del 90%. En otro ejemplo, una secuencia de 90 residuos se compara con una secuencia consulta de 100 residuos. Esta vez, las supresiones son supresiones internas para que no haya residuos en los N-terminal o C-terminal de la secuencia sujeto que no coinciden/alinean con la consulta. En este caso, el porcentaje de identidad que se calculó por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez más, sólo las posiciones de los residuos fuera de los N- y C-terminales de los extremos de la secuencia sujeto, como se muestra en la alineación FASTDB, que no coinciden/alinean con la secuencia de consulta se corrigen manualmente. No se realizan otras correcciones manuales para los fines de la presente invención.
Las variantes de polinucleótidos pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, en las regiones no codificantes, o en ambas. Se prefieren especialmente las variantes de polinucleótidos que contienen alteraciones que producen sustituciones silenciosas, adiciones o supresiones, pero que no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. Las variantes de nucleótidos que se producen por sustituciones silenciosas debido a la degeneración del código genético son las preferidas. Además, también se prefieren variantes en las cuales 5-10, 1-5, 1-2 aminoácidos se sustituyen, se suprimen o se añaden en cualquier combinación. Las variantes de polinucleótidos se pueden producir por una variedad de razones, por ejemplo, para optimizar la expresión de un codón para un hospedero particular (cambiar codones en el ARNm humano por aquellos preferidos por un hospedero bacteriano tal como E. coli) .
Las variantes que ocurren naturalmente de denominan "variantes alélicas," y se refieren a una de las varias formas alternativas de un gen que ocupan un determinado lugar en un cromosoma de un organismo (Genes II, Lewin, B., ed. , John Wiley & Sons, Nueva York (1985)) . Estas variantes alélicas pueden variar ya sea a nivel del polinucleótido y/o del polipéptido y se incluyen en la presente invención. Alternativamente, variantes que no se producen naturalmente se pueden producir por técnicas de mutagénesis o por síntesis directa .
Por medio del uso de métodos conocidos de la ingeniería de proteínas y de la tecnología del ADN recombinante , se pueden generar variantes para mejorar o alterar las características de los polipéptidos . Por ejemplo, se pueden eliminar uno o más aminoácidos del N-terminal o C-terminal de la proteína secretada sin pérdida sustancial de la función biológica. Los autores de Ron y otros, J. Biol . Chem. 268: 2984-2988 (1993), que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad, informaron acerca de proteínas variantes de KGF que tienen actividad de unión a heparina incluso después de eliminar 3, 8, o 27 residuos de aminoácidos amino-terminales . De manera similar, el interferón gamma exhibió hasta diez veces mayor actividad después de eliminar los residuos de aminoácidos 8-10 del terminal carboxilo de esta proteína. (Dobeli y otros, J. Biotechnology 7:199-216 (1988), que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.) Además, una amplia evidencia demuestra que las variantes a menudo retienen una actividad biológica similar a la de la proteína natural. Por ejemplo, Gayle y otross (J. Biol. Chem. 268:22105-22111 (1993), que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) llevaron a cabo un extenso análisis mutacional de la citocina humana IL-la. Ellos usaron la mutagénesis al azar para generar más de 3.500 mutantes individuales de IL-la que promediaron 2.5 cambios de aminoácidos por variante en toda la longitud de la molécula. Las mutaciones múltiples se examinaron en cada posición posible de aminoácido. Los investigadores descubrieron que "la mayoría de la molécula se puede alterar con poco efecto tanto en la actividad de unión como biológica" . (Ver resumen). De hecho, sólo 23 secuencias únicas de aminoácidos, de las más de 3.500 secuencias de nucleótidos analizados, produjeron una proteína que se diferenció significativamente en su actividad de la de tipo salvaje.
Como se indicó anteriormente, las variantes de polipéptidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos modificados. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, acetilación, acilación, ADP ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un grupo hemo, unión covalente de un derivado de nucleótido o nucleótidos, unión covalente de un lípido o un derivado de lípidos, unión covalente de fosfatidilinositol , reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de enlaces cruzados covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glicosilación, formación de anclaje GPI , hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación (Mei y otros, Blood 116:270-79 (2010), que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) , procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, la adición de aminoácidos a proteínas mediada por A M de transferencia tales como arginilación, y ubiquitinación . En algunas modalidades, el Factor VIII se modifica, por ejemplo, se pegila, en cualquier lugar conveniente. En algunas modalidades, el Factor VIII se pegila en un aminoácido del Factor VIII expuesto en la ¦superficie, preferentemente una cisteína expuesta en la superficie, que puede ser una cisteína modificada por ingeniería. Mei y otros (2010) . En algunas modalidades, el Factor VIII modificado, por ejemplo, el Factor VIII pegilado, es un Factor VIII de acción prolongada.
"El volumen de distribución en estado estacionario (Vss) , " como se usa en la presente, tiene el mismo significado que el término que se usa en farmacología, que es el espacio aparente (volumen) en el que un fármaco se distribuye. Vss = a la cantidad de fármaco en el cuerpo dividida por la concentración en plasma en estado estacionario .
"Aproximadamente", como se usa en la presente para un intervalo, modifica ambos extremos del intervalo. Así, "aproximadamente de 10-20" significa "aproximadamente 10 a aproximadamente 20".
Después de describir la presente invención en detalle, la misma se entenderá más claramente por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen a continuación a efectos de ilustración solamente y no se pretende que sean limitativos a la invención. Todas las patentes y publicaciones que se refieren en la presente se incorporan expresamente como referencia.
Ejemplo 1 Resumen Una proteína de fusión recombinante Factor VIII con el dominio B suprimido-Fc (rFVIIIFc) se creó para extender la vida media del FVIII. El rFVIIIFc se estudió en modelos de ratón y perro con hemofilia A severa, y en comparación con el Factor VIII recombinante (ReFacto*) . El tiempo de coagulación de la sangre total (WBCT, por sus siglas en inglés) en ratones con hemofilia A se corrigió a aproximadamente dos a tres veces más largo y la vida media de eliminación en el plasma fue de casi el doble de tiempo para el rFVIIIFc en comparación con el ReFacto®. En los perros con hemofilia A, una dosis intravenosa del rFVIIIFc (125 Ul/kg) corrigió el WBCT a la normalidad. El WBCT se mantuvo por debajo de 20 minutos, el tiempo consistente con FVIII: C>1%, hasta aproximadamente 96 horas, en comparación con 48 horas para ® los perros tratados con el ReFacto . La vida media de eliminación del rFVIIIFc en el plasma del perro, cuando se midió por medio del uso de ELISA o ensayos de actividad cromogénicos fue de 15.7 ± 1.7 h, y 15.4 + 0.3 h, respectivamente. El ReFacto corrigió el WBCT por aproximadamente la mitad del largo que el rFVIIIFc y la vida media en plasma fue de 7.0 h. Por lo tanto, la fusión de FVIII a Fe produce una molécula con una mayor vida media en el plasma y la capacidad para proporcionar una protección de sangrado prolongada .
Introducción La reducción de la mortalidad, la prevención del daño articular y la mejoría en la calidad de vida son logros importantes debidos al desarrollo del FVIII que se deriva del plasma y los recombinantes . La protección prolongada de sangrado representaría otro avance clave en el tratamiento de pacientes con hemofilia A. Los inventores crearon una proteína quimérica recombinante e híbrida Factor VIII-Fe (rFVIIIFc) como un enfoque para entender la vida media del FVIII.
El rFVIIIFc es una proteína heterodimérica híbrida compuesta por el FVIII con dominio B suprimido que se fusiona recombinantemente al dominio Fe de la inmunoglobulina Gl (IgGl) humana (la Figura 1, sec . con núm de ident : 2, Tabla 2A) (Esta proteína también se refiere en la presente como la proteína de fusión de Fe monomérica FVIIIFc, el FVIIIFc monómero híbrido, el híbrido FVIIIIFc monomérico, y el FVIIIFc monómero-dímero .) . El Fe permite la unión al receptor Fe neonatal (FcRn) , que es responsable de la protección de la IgG de la degradación y confiere a la IgG las tres semanas de vida media observadas en los humanos (Ghetie V., y Ward ES. Annu. Rev. Immunol . 2000; 18:739-766; Roopenian DC, y Akilesh S., Nature Rev. Immunol 2007; 7:715-725, cada uno de ellos se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) .
El dominio Fe de la IgGl se fusiona con factores de crecimiento, citocinas, enzimas y las regiones de receptores de unión al ligando (Ashkanazi A, y otros Int. Rev. Immunol. 1993:10:219-27; Chamow SM, y Ashkanazi A, Trends Biotechnol 1996:14:52-60; Fisher y otros N. Engl. J. Med. 1996:334 (26):1697-702, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . Varias de ellos se han convertido en importantes moléculas terapéuticas (por ejemplo, etanercept, alefacept, abatacept) . En estas proteínas de fusión, dos moléculas efectoras están conectadas a dos moléculas de Fe. En este ejemplo, el rFVIIIFc se construyó como una proteína de fusión Fe monomérica (una copia de un polipéptido que consiste de la secuencia en la Tabla 2A (i) (sec. con núm de ident. : 2) con o sin la secuencia señal y una copia de un polipéptido que consiste de la secuencia en la Tabla 2A (ii) (sec. con núm de ident.: 4) con o sin la secuencia señal) , es decir, con sólo una copia de la molécula efectora (ver Figura 1) , y los estudios que se presentan en la presente comparan la farmacodinámica y farmacocinética de esta nueva proteína de Factor VIII recombinante en modelos de la hemofilia A en ratón y perro. La secuencia señal se escinde durante la secreción. Esta construcción de proteína se denomina en la presente como la proteína de fusión monomérica Fe FVIIIFc, el FVIIIFc monómero híbrido, el híbrido FVIIIIFc monomérico, y el FVIIIFc monómero-dímero. Ver el Ejemplo 1, la Figura 1, la Tabla 2A, y las patentes de los Estados Unidos núms. 7,404,956 y 7,348,004, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad, para la estructura y la producción de esta proteína Métodos y Materiales Preparaciones del FVIII FVIIIFc recombinante La secuencia de codificación del FVIII con el dominio B suprimido recombinante humano se obtuvo por la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) a partir de ARN poli A de hígado humano (Clontech) por medio del uso de cebadores específicos para el FVIII. La secuencia del FVIII incluye la secuencia señal nativa para el FVIII. La supresión del dominio B fue desde la serina 743 (S743; 2287 pb) hasta la glutamina 1638 (Q1638; 4969 pb) para una supresión total de 2682 pb Ver el Ejemplo 1, la Figura 1, la Tabla 2A, y las patentes de los Estados Unidos núms 7,404,956 y 7,348,004, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad, para la estructura y la producción de esta proteína.
La secuencia de codificación para el Fe humano recombinante se obtuvo por RT-PCR a partir de una genoteca de ADNc de leucocitos humanos (Clontech) por medio del uso de cebadores específicos para Fe. Los cebadores se diseñaron de tal manera que la secuencia del FVIII con el dominio B suprimido se fusionara directamente a la secuencia N-terminal del Fe sin intervenir enlazador. La secuencia de ADN del FVIIIFc se clonó en el vector de doble expresión de mamíferos pBUDCE4.1 (Invitrogen) , bajo el control del promotor CMV. Una segunda secuencia idéntica al Fe que incluye la secuencia señal Igk del ratón se obtuvo por RT-PCR y se clonó aguas abajo del segundo promotor, EFloc, en el vector de expresión pBUDCE4.1.
El vector de expresión del rFVIIIFc se transfectó en las células 293 de riñon embrionario humano (HEK293H; Invitrogen) , por medio del uso del reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen) . Se generaron líneas celulares estable clónales por selección con Zeocin (Invitrogen) . Una línea celular clonal, 3C4-22 se usó para generar el FVIIIFc para la caracterización in vivo. El FVIIIFc recombinante se produjo y purificó (McCue JT , y otros J. Chromatogr. A 2009; 7824-7830, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) en Biogen Idee (Cambridge, MA) . La estrategia de transfección que se describió anteriormente se esperaba que rindiera tres productos, es decir, el híbrido rFVIIIFc monomérico, el híbrido rFVIIIFc dimérico y el Fe dimérico. Sin embargo, no se detectó esencialmente ningún rFVIIIFc dimérico en el. medio condicionado de estas células. Más bien, el medio condicionado contenía Fe y rFVIIIFc monoméricos. Es posible que el tamaño del rFVIIIFc dimérico fue demasiado grande e impidió la secreción eficiente por la célula. Este resultado fue beneficioso ya que rinde una purificación del monómero menos complicada que si las tres proteínas estuvieran presentes. El material que se usó en estos estudios tenía una actividad específica de aproximadamente 9000 Ul/mg. Además, estas células humanas produjeron mayores niveles de proteína que otras células que se intentaron en este experimento.
El FVIII recombinante El FVIII recombinante con el dominio B suprimido (ReFacto ) se adquirió de Novis Pharmaceuticals y se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ReFacto" (FVIII recombinante con el dominio B suprimido) tiene la misma secuencia de aminoácidos que los aminoácidos 1 a 1438 de la sec. con núm. de ident . : 2.
Animales con hemofilia A Los ratones con la hemofilia A están noqueados para el exón 16 FVIII en un fondo 129 x B6 que se obtuvieron del Dr. Kazazian en la Universidad de Pennsylvania (Bi L, y otros Nat. Genet. 1995; 10 (1):119-121, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) y se criaron en Syntonix. Estos ratones presentan prolongados tiempos de coagulación de sangre total (> 60 min) , y son por tanto un buen modelo de hemofilia A severa.
Los perros con la hemofilia A fueron de una colonia congénita mantenida en el Laboratorio de Investigación de la Sangre Francis Owen de la Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill (Graham, JB, y otros J. Ex . Med. 1949; 90:97-111, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . Estos perros tienen un fenotipo hemofílico grave comparable a la forma grave de la enfermedad humana (Graham, JB,y otros J. Exp. Med. 1949; 90:97-111; Lozier, JN, y otros Proc. Nati. Acad Sci . 2002;99:12991-12996, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) .
Diseño de los estudios Estudios en ratones con la hemofilia A El efecto del rFVIIIFc y el ReFacto8 en el tiempo de coagulación de sangre total (WBCT) se estudió en ratones con deficiencia del Factor VIII. Cada proteína se administró por vía intravenosa a 50 Ul/kg y se recogió sangre de la vena de la cola de cada ratón pre-dosis y diversos puntos después de la dosificación. Las muestras de sangre se incubaron en microtubos a 37°C y se inspeccionaron visualmente una vez por minuto para la presencia de un coágulo. Se registró el tiempo de formación de los coágulos. Si no se formó un coágulo en 60 min, el tiempo de coagulación se registró como > 60min. La sangre de ratones normales coagula en aproximadamente 4 min (intervalo 2-7 min, n = 10 ratones) en el ensayo de WBCT.
En un segundo grupo de estudios, a los ratones con la hemofilia A se les administró una sola dosis intravenosa de 50 Ul/kg del rFVIIIFc, el ReFacto® o el Advate® (4 ratones por cada punto de tiempo) . Se recogió sangre por punción cardiaca en un décimo de volumen de 3.2% de citrato de sodio a las 0.25, 8, 24, 48 y 72 horas después de la dosificación. El plasma se preparó y se almacenó a -80°C hasta el análisis de la actividad del FVIII por medio del uso de un ensayo cromogénico de actividad específica del FVIII.
Estudios en perro con hemofilia A En un estudio de dosis única PK/PD del rFVIIIFc, a dos perros con hemofilia A de la colonia Chapel Hill se les administró una sola dosis intravenosa de 125 Ul/kg y las muestras de sangre se recolectaron pre-dosis y después de la dosis en puntos de tiempo seleccionados para el WBCT, el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA, por sus siglas en inglés), la concentración plasmática del FVIIIFc, la hematología y la bioquímica sanguínea. Los puntos de tiempo para el WBCT incluyeron pre-dosis, 5 y 30 min y 1, 2, 4, 8, 24, 32, 48, 72, 96, 144, y 168 horas después de la dosificación. La colecciones de sangre para la actividad de coagulación (TTPA) y la concentración plasmática del FVIIIFc incluyeron los puntos de tiempo indicados anteriormente, para el WBCT así como 15 min y 3, 6, 12 horas después de la dosificación .
Se llevó a cabo un segundo estudio en el que el ReFacto18 (114 Ul/kg para el perro M12 y 120 Ul/kg para el perro M38) se administró por vía intravenosa. Se midió el WBCT hasta que los tiempos de coagulación fueron = 20 min (en consonancia con FVIII: C> 1%), y luego 125 Ul/kg del rFVIIIFc se administraron por vía intravenosa a los mismos perros y se colectaron las muestras de sangre para el WBCT, el TTPa, la concentración plasmática de FVIIIFc, la hematología y la bioquímica sanguínea. Los puntos de tiempo para el WBCT incluyeron pre-dosis, 5 y 30 min y 1, 2, 4, 8, 24, 32, 48, 72 h después de la dosificación. La sangre se recogió también a las 96, 120, 144, y 168 horas después . de la dosificación con el FVIIIFc. La colección de sangre para la actividad de coagulación y la concentración plasmática del FVIIIFc incluyeron los puntos de tiempo mencionados más arriba para el WBCT así como 15 min y 3, 6, 12 horas después de la dosificación.
El procedimiento del WBCT en los perros con la hemofilia A fue ligeramente diferente que el de los ratones con la hemofilia A. Después de la dosificación con el rFVIIIFc o el ReFacto°, se recogió un mi de sangre en diversos puntos temporales y 0.5 mi se distribuyeron en dos tubos de vidrio siliconizado que se colocaron posteriormente en un baño de agua a 28°C. A partir de un minuto, un tubo se inclinó cada 30 segundos, sin perturbar el segundo. Cuando se formó un coágulo en el tubo inclinado, el segundo tubo se inclinó entonces cada 30 segundos hasta que se formó un coágulo. El tiempo para un coágulo completamente gelificado en el segundo tubo se registró como el WBCT.
Actividad FVIII en el plasma Medición de la actividad del FVIII en el plasma por un ensayo cromogénico específico para el FVIII Las muestras de plasma se evaluaron para la actividad del Factor VIII por un método automatizado cromogénico por medio del uso de un instrumento Sysmex CA1500 y los reactivos fueron de Siemans Healthcare Diagnostics (Dallas, TX, kit #B4238-40) . La actividad de rFVIIIFc se determinó por medio del uso de una curva estándar creada con la 7ma Norma Internacional para el concentrado del FVIII (NIBSC código 99/678) que se añadió en el plasma humano depletado del Factor VIII (Stago, Estados Unidos) en concentraciones en el intervalo desde 1.5 hasta 0.016 Ul/ml.
Medición del rFVIIIFc o el FVIII por ELISA FVIIIFc en plasma de perro por ELISA Un anticuerpo específico para el dominio Al del FVIII (Green Mountain Antibodies: G A-8002) se recubrió sobre placas de 96 pocilios y se incubó durante 1 hora a 37°C. Las placas recubiertas se bloquearon con solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20, CaCl2 y albúmina de suero bovino durante 1 hora a temperatura ambiente y después los estándares, los controles y las muestras se prepararon en el. lasma de perro normal, se diluyeron 1:10 y después se añadieron a las placas y se incubaron durante 1 hora a 37°C. Las placas se lavaron y luego se añadió (F (ab) '2 ) de burro anti- Fe humano-HRP (Jackson: 709-036-098) y se incubó durante 1 hora a 37°C. Después del lavado, se añadió a las placas TMB (sustrato supersensible BioFx: TMBS-0100-01) , la reacción del sustrato se interrumpió con ácido y se midió la absorbancia en un lector de placas SpectraMax Plus (Molecular Devices) a 450 nm . eFacto® en el plasma de perro por ELISA Un anticuerpo anti-FVIII específico para el dominio Al de la cadena pesada (Green Mountain Antibodies: GMA-8002) se recubrió sobre placas de 96 pocilios y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas recubiertas se bloquearon durante 1 hora a 37 °C y después del lavado, los estándares, los controles y las muestras se prepararon en plasma de perro normal y se diluyeron 1:10 se añadieron a las placas y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente . Las placas se lavaron y luego se trataron con el anticuerpo de detección, un anti-FVIII pre-diluido conjugado con peroxidasa de rábano picante (Affinity Biologicals: F8C-EIA-D) , y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar se añadió a las placas TMB (sustrato BioFx supersensible : TMBS-0100-01) durante 10 minutos. La reacción del sustrato se inactivo con ácido y la señal se midió en un lector de placas SpectraMax Plus (Molecular Devices) a una longitud de onda de 450 nm.
La medición de fibrinogeno La concentración de fibrinogeno en el plasma se midió en Esoterix (Research Triangle Park, Carolina del Norte) por medio del uso de un kit que contenía el reactivo HemosILD PT-Fibrinogen-HS ( Instrumentation Laboratory, Lexington, MA, Catálogo # 0008468210) y el analizador de coagulación ACL 7000 (Beckman Coulter) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante .
La medición de plaquetas Las plaquetas se contaron en sangre total anti-coagulada con EDTA por métodos automatizados por medio del uso del analizador de hematología Vet-ABC-Diff que se programó con una tarjeta inteligente específica de especie (SCIL Animal Care Co. , Gurnee, IL) .
Análisis Farmacocinético Los parámetros farmacocinéticos se calcularon mediante un análisis no compart imental por medio del uso del software de WinNonlin Pharsight, versión 5.2 (Mountain View, CA) . Los parámetros farmacocinéticos incluyeron la concentración máxima en plasma (Cmsx) , el área bajo curva de la concentración plasmática contra el tiempo (AUC) , la vida media de eliminación (ti/2) , el volumen de distribución (Vss) , y el aclaramiento (Cl) .
Resultados FVIII-Fc recombinante El rFVIIIFc es una fusión recombinante del FVIII con el dominio B humano suprimido con el Fe de la IgGl humana, sin secuencia enlazadora intermedia (rFVIIIFc Figura 1) · El rFVIIIFc purificado tenía una actividad específica de aproximadamente 9000 Ul/mg que se determinó por medio del uso de un ensayo de actividad cromogénica. El FVIII ® recombinante con el dominio B suprimido (ReFacto ) tuvo una 7 actividad específica informada de 9110 a 13700 Ul/mg. La conversión de la actividad específica a Ul/nmol para tener en cuenta la diferencia de tamaño entre el FVIIIFc y el ReFacto° (216 kDa y 170 kDa, respectivamente) , indicó que las dos proteínas tuvieron actividades específicas aproximadamente equivalentes (1970 Ul/nmol del rFVIIIFc y 1521 a 2287 Ul/nmol de ReFacto®) . Así, la actividad del FVIII de rFVIIIFc no se ve afectada por la fusión del C-terminal de FVIII humano al N-terminal del Fe humano.
Administración a ratones con hemofilia A Se administró por vía intravenosa una dosis única de 50 Ul/kg del rFVIIIFc o el ReFacto® a ratones con deficiencia del Factor VIII (n = 6/grupo) . Se tomaron muestras de sangre pre-dosis y después de la dosificación durante 120 horas y el BCT se determinó como se describió en Materiales y Métodos . El WBCT de línea de base fue mayor que 60 min. Los datos de un experimento representativo se muestran en la Figura 2 y la Tabla 3. Inmediatamente después de la administración, ya sea con el rFVIIIFc o el ReFacto®, el WBCT se corrigió a 2-17 minutos. La sangre de los ratones tratados con el ReFacto18 perdió la capacidad de coagular en 42 horas, mientras que la sangre de todos los ratones tratados con el rFVIIIFc aún coagulaba a las 96 horas, la sangre de uno de seis coaguló a las 113 horas, pero todos habían perdido la capacidad de coagulación a las 120 horas. Estos datos sugieren que la duración del efecto del rFVIIIFc es de aproximadamente dos a tres veces más larga que para ReFacto®.
La actividad cromogénica del rFVIIIFc, el ReFacto® o el ® Advate (Factor VIII recombinante completo) se estudió en los ratones con deficiencia de Factor VIII después de una dosis intravenosa única de 50 Ul/kg. Se recogió sangre pre-dosis y después de la dosificación a las 8, 24, 48 y 72 horas. La actividad se midió por medio del uso de un ensayo cromogénico de actividad específica de FVIII y se muestra en la Figura 3. Los parámetros farmacocinéticos se muestran en la Tabla 4. La vida media circulante para rFVIIIFc fue de aproximadamente 1.6 a 2 veces más larga (11.1 horas) en comparación con el Advate® (7 h) y el ReFacto® (5 h) . La Cmáx fue de 1.6 ± 0,36 Ul/ml para el rFVIIIFc en comparación con 0.47 ± 0.30 Ul/ml para el Advate® y 0.67 ± 0.44 Ul/ml para el ReFacto®. La exposición sistémica de rFVIIIFc fue notablemente mayor para el rFVIIIFc (22.6 h*Ul/ml) en comparación con el ReFacto® (6.94 h»Ul/ml) y el Advate® (3.90 h«Ul/ml) y el aclaramiento del rFIIIFc fue notablemente inferior _ (2.09 ml/h/kg) en comparación con ambos el ReFacto® (7.2 ml/h/kg) y el Advate® (12.8 h/ml/kg) en los ratones con la hemofilia A.
Administración a perros con hemofilia A La farmacodinámica (PD) y la farmacocinética (PK) del rFVIIIFc se estudiaron en la colonia de Chapel Hill de perros con la hemofilia A. Una sola dosis intravenosa de 125 Ul/kg del rFVIIIFc se administró a cada uno de cuatro perros con hemofilia A y el WBCT se corrigió inmediatamente a la normalidad (Figura 4) . El intervalo del WBCT en perros normales fue 8-12 min. El WBCT se mantuvo por debajo de 20 min, el tiempo consistente con el FVIII: C> 1%, durante aproximadamente 96 horas con la excepción de un perro que tenía WBCT <20 min durante 72 h. Además, aPTT inmediatamente se corrigió a la normalidad (Tabla 6) . La concentración del rFVIIIFc en el plasma se midió por medio del uso de un ELISA específico que se diseñó para detectar tanto la porción FVIII como la Fe de la molécula. Las curvas de concentración plasmática contra tiempo se muestran en la Figura 5. El análisis PK de los datos mostró que la t1/2 fue de 15.7 + 1.7 h (Tabla 5) . Se obtuvieron resultados similares cuando se midió rFVIIIFc por medio del uso de un ensayo cromogénico de actividad específica del FVIII (t1/2=15.4 ± 0.3 h. Tabla 5) y las curvas de concentración en el plasma en función del tiempo fueron similares al usar ambos métodos (Figuras 5 y 6) . Cuando los datos de actividad se convirtieron de Ul/ml a ng/ml por medio del uso de la actividad específica para rFVIIIFc, hubo una buena correlación con los datos de ELISA, lo que demostró que la proteína que se midió por ELISA estaba completamente activa.
Dos de los perros tratados con el rFVIIIFc también © recibieron una sola dosis de ReFacto , 114 Ul/kg para el perro M12 y 120 Ul/kg para el perro M38, 72 horas antes de la dosificación con el rFVIIIFc. Los WBCT y aPPT se corrigieron a la normalidad inmediatamente después de la dosificación con el ReFacto . Sin embargo, la normalización del WBCT después de la dosis única del rFVIIIFc duró aproximadamente dos veces más en comparación con el ReFacto (Figura 4) . Además, la vida media en plasma del rFVIIIFc (15.7 + 1.7 horas) fue de aproximadamente el doble de tiempo para el rFVIIIFc en comparación con el ReFacto-0 (7.0 y 6.7 h) cuando la concentración de las proteínas en el plasma se midieron por ELISA (Tabla 5) . Se obtuvieron resultados similares cuando las dos moléculas se midieron por la actividad cromogénica específica del FVIII.
Para evaluar el riesgo potencial de trombogenicidad, se midieron las plaquetas y el fibrinógeno. Después de la ® dosificación, ya sea con el rFVIIIFc o el ReFacto , los números de plaquetas y la concentración de fibrinógeno en plasma no cambiaron con respecto a los valores pre-dosis (datos no presentados) .
Discusión El FVIIIFc recombinante se produjo en las células de riñon embrionario humano 293 (HEK 293) a partir de una línea de células transíectadas de manera estable y se purificó del medio de cultivo celular. La producción en una línea celular humana representa un cambio significativo en la manufactura en comparación con los productos del rFVIII que se comercializan actualmente que se producen en células de ovario de hámster chino o células de riñon de hámsters bebés. La razón de este cambio fue que se esperaba que las células humanas estuvieran mejor equipadas para realizar las modificaciones post-traduccionales necesarias a la porción FVIII de esta molécula.
La conversión de la actividad específica a Ul/nmol para tener en cuenta la diferencia de pesos moleculares para el rFVIIIFc y el FVIIIB recombinante con el dominio B suprimido ( eFacto ) indicó que las actividades específicas son similares para ambas proteínas (1970 Ul/nmol para rFVIIIFc y 1521-2287 .Ul/nmol de ReFacto®). Es sorprendente que la actividad específica' del rFVIIIFc no se afecta por la fusión del extremo C-terminal de FVIII con el N-terminal de Fe ya que los dominios Cl y C2 del FVIII están implicados en la unión al fosfolípido que es esencial para la plena actividad del FVIII (Fay, PJ, J. Hematology 83:103-8 (2006) y Raut, S, y otros, Br. J. Haematol . 107:323 (1999), cada uno de los cuales se incorpora como referencia en la presente en su totalidad) .
El tratamiento de la hemofilia A es a-demanda en el momento de un episodio de sangrado o de profilaxis para la prevención del sangrado. Aunque el tratamiento a-demanda todavía se usa frecuentemente, hay una tendencia a la profilaxis y la prevención del daño articular (Blanchette P, y otros Haemophilia 2004:10; 679-683, Manco-Johnson, MJ, y otros N. Engl. J. Med. 2007;. 357:535-544, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . Los productos del FVIII actuales se administran cada . dos a tres días para la profilaxis debido a la relativamente corta vida media de 10-12 horas con el fin de mantener un FVIII :C por encima de 1% en los pacientes (Morfini, H, Haemophilia 2003; 9 (suppl l):94-99; discusión' 100, White GC, y otros Thromb Haemost . 1997:77:660-7, Blanchette, P, y otros J. Thromb. Haemost. agosto de 2008; 6 (8) : 1319-26, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . Las terapias con el FVIII de acción más prolongada que proporcionan una protección prolongada del sangrado representarían una notable mejora en la calidad de vida de los pacientes con hemofilia A. Las estrategias para extender la vida media de los factores de coagulación incluyen aquellas que fueron exitosas para otras moléculas, incluyendo la pegilación (Rostin J , y otros Bioconj Chem. 2000; 11:387-96, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) , la glicopegilación (Stennicke HR, y otros Thromb Haemost. 2008; 100:920-8, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) , la formulación con liposomas pegilados (Spira J, y otros Blood 2006; 108:3668-3673, Pan J, y otros, Blood 2009;. 114:2802-2811, cada una de la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) y la conjugación con la albúmina (Schulte S., Thromb Res.. 2008; 122 Suppl 4: S14-9, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . La pegilación representa un enfoque para reducir el aclaramiento, sin embargo, el efecto de la modificación in vivo se desconoce actualmente. El resultado de la pegilación directa del FVIII in vivo es actualmente desconocido, mientras que el FVIII que se formuló con liposomas pegilados se estudió clínicamente y mostró un modesto o ningún efecto en períodos de sangrado (Spira J, y otros Blood 2006;. 108:3668-3673, Spira J, y otros Thromb Haemost . septiembre de 2008; 100 (3) :429-34 , cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) .
El presente enfoque para extender la vida media del FVIII fue fundir recombinantemente el FVIII al dominio Fe de la IgGl. El Fe se une al receptor que ocurre naturalmente, FcRn, del cual la función normal es la protección de la IgG de la degradación. Los resultados descritos en la presente representan la caracterización inicial farmacocinética y la eficacia del rFVIIIFc en comparación con un producto del rFVIII en ratones con hemofilia A y en perros con hemofilia A. En ambas especies, la vida media del rFVIIIFc fue aproximadamente el doble del rFVIII cuando se midió por la actividad de FVIII o por ELISA (perros solamente) . Estos datos también se correlacionan bien con los resultados del BCT de ambos modelos animales, es decir, la duración del efecto del rFVIIIFc en el WBCT fue aproximadamente el doble de tiempo en comparación con el ReFacto®. En los perros, la Cmáx y el aclaramiento fueron similares para el rFVIIIFc y el ® ReFacto , pero el AUC y el volumen de distribución en estado estacionario fueron aproximadamente 1.5 veces y 2 veces mayores para el rFVIIIFc en comparación con el ReFacto18, respectivamente. Los parámetros farmacocinéticos del ReFacto81 en este modelo animal son consistentes con los valores descritos en la literatura (Brinkhous K, y otros Sem Thromb . Haemost . 2002; 28:269-272, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) .
Si estos resultados se traducen en la misma extensión de la vida media en humanos, esto podría representar un avance significativo en el tratamiento de pacientes con hemofilia A.
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Ejemplo 2 El objetivo del estudio fue determinar la farmacocinética y la farmacodinámica del rFVIIIFc y el BDD-rFVIII- (Xyntha ) en macacos después de una dosis intravenosa única.
Materiales y métodos El rFVIIIFc (Biogen Idee) , se suministró como un líquido congelado a una concentración de.1.2 mg/ml, y 9882 Ul/ml. La actividad específica fue 8235 Ul/mg. El almacenamiento fue a -70 ° C. Se diluyó antes de la inyección.
Nombre: Xyntha (Novis Pharmaceuticals) , suministrado en forma de polvo liofilizado que se reconstituye de acuerdo con las instrucciones del fabricante para producir una solución con una concentración nominal de 525 Ul/ml. El almacenamiento fue de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Animales Se usaron monos cinomolgos de la colonia de New Iberia Research Center (NIRC) , y el estudio (Estudio NIRC # 8733-0903) se llevó a cabo en virtud de un protocolo que se aprobó por el NIRC IACUC (APS 2008-8733-058) en NIRC en New Iberia , LA.
Se usaron en el estudio seis monos cinomolgos no tratados previamente (tres machos, tres hembras) que se determinó que estaban en buen estado de salud.
El estudio se realizó en cumplimiento con el protocolo, y los procedimientos operativos estándar de UL Lafayette-NIRC.
Diseño del estudio El rFVIIIFc se administró por vía intravenosa a 125 Ul/kg a cada uno de los seis monos (tres machos, tres hembras) . Xyntha (BDD-rFVIII) se administró por vía intravenosa a los mismos animales a 125 Ul/kg en un diseño cruzado. Los animales del Grupo 1 (n = 3) recibieron Xyntha el, día 0 y rFVIIIFc el día 3, mientras que los animales del grupo 2 (n = 3) recibieron rFVIIIFc en el día 0 seguido por Xyntha en el día 4. El día adicional entre las dosis para el grupo 2 fue para asegurar que el rFVIIIFc tuviera suficiente tiempo para descender por debajo de los niveles de la línea de base previstos. La sangre se recogió para el plasma en un décimo de volumen de citrato de sodio al 3.2% de cada animal pre-dosis y después de la dosificación a 0.25, 4, 12, 24, 36, 48 y 72 horas para la medición del rFVIIIFc o Xyntha por ELISA y un ensayo cromógenico de la actividad específica del FVIII.
ELISA para medir rFVIIIFc y FVIII en el plasma Método para medir el rFVIIIFc en el plasma de mono.
Este ensayo enzimático inmunoabsorbente (ELISA) se diseñó para cuantificar el rFVIIIFc en el plasma de mono. En este método de ELISA, un anticuerpo de cabra anti-IgG humána(H + L) (absorbida en mono) de los Laboratorios Bethyl (Cat. # A80-319A) se diluyó en amortiguador de recubrimiento y se inmovilizó sobre una placa de microtitulación de muestra de 96 pocilios. La placa se aspiró, y todos los sitios no-adsorbidos se bloquearon con la adición de amortiguador de bloqueo (BSA/lxTris 3%) durante aproximadamente 2 horas a 37°C. Las muestras de plasma se diluyeron 1:20 con amortiguador de dilución de muestra alto en calcio (3% de leche descremada seca/TBST con 30 mM de CaCl2) y se dispensaron sobre la placa de muestra. Las placas se incubaron durante aproximadamente 2 horas a 37°C. La placa se lavó posteriormente y se añadió a la placa el anticuerpo de ratón anti-Factor VIII con el dominio B suprimido (a.BDDAl) (dominio Al) de Green Mountain Antibodies (Cat. # GMA-8002) y se incubaron durante aproximadamente 1 hora a 37 °C. Después de lavar la placa, se añadió a la placa el anticuerpo de cabra aríti-IgG2a de ratón conjugado a HRP de Southern Biotech (Cat # 1080-05) y se incubaron durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavó de nuevo y se añadió una solución de tetrametilbenzidina (TMB) el sustrato de la peroxidasa y se incubaron durante aproximadamente .30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo por adición de una solución de parada no ácida. El color se desarrolló en proporción a la cantidad del rFVlllFc en la muestra. Las placas se leyeron en un lector de absorción para placas por medio del uso de una longitud de onda de detección única, 650 nm. Las concentraciones del rFVIIIFc se determinaron sobre una curva estándar, que se obtuvo al graficar la densidad óptica (QD, por sus siglas en inglés) en función de la concentración por medio del uso de un programa de cuatro parámetros de ajuste de curva logística. El intervalo de la curva de calibración de este método fue 0.400 ng/ml-51.2 ng/ml en 5% de plasma de mono (8.00 ng/ mi -1024 ng/ml en 100% de plasma mono) . Un calibrador fuera del intervalo calificado del ensayo a 0.200 ng/ml en plasma de mono al 5% puede incluirse para que sirva como un punto de anclaje para facilitar el ajuste de la curva. El punto de anclaje se elimina o se retiene en base a la mejor forma de la curva (es decir, el número más alto de los estándares de lectura dentro de una precisión definida, %RE) .
Método para medir el Factor VIII en plasma de mono Este ensayo de inmunoabsorción enzimático (ELISA) se diseñó para cuantificar el FVIII en plasma de mono. En este método de ELISA, el anticuerpo de ratón aBDDAl FVIII de Green Mountain Antibodies (Cat. # GMA-8002) se diluyó en amortiguador de recubrimiento y se inmovilizó sobre una placa de microtitulación de muestra de 96 pocilios. La placa se aspiró y todos los sitios no-adsorbidos se bloquearon con la adición de amortiguador de bloqueo (BST/lxTris 3%) durante aproximadamente 1 hora a 37°C. Las muestras de plasma se diluyeronn 1:20 con amortiguador de dilución de la muestra alto en calcio (amortiguador de bloqueo con 100 mM de CaCl2) y se dispensaron sobre la placa de la muestra. Las placas se incubaron durante aproximadamente 2 horas a 37 °C. Después de lavar la placa, un anticuerpo de detección del kit de Affinity Biologizals Biologicals, un anticuerpo policlonal marcado con HRP (Cat. # F8C-EIA-D) , se volvió a diluir en TBS/0.05% de Tween 20, y se añadió a la placa y se incubó durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó de nuevo y se añadió una solución de tetrametilbenzidina (TMB) sustrato de la peroxidasa y se incubó durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo por adición de una solución de parada ácida. El color se desarrolló en proporción a la cantidad de FVIIIFc en la muestra. Las placas se leyeron en un lector de absobancia para placas con una única longitud de onda de detección, 450 nm. Las concentraciones de FVIII se determinaron sobre una curva estándar que se obtuvo al graficar la densidad óptica (OD) en función de la concentración por medio del uso de un programa de cuatro parámetros de ajuste de curva logística. El intervalo de la curva de calibración de este método fue 0.625 ng/ml -20 ng/ml en de plasma de mono al 5% (12.5 ng/m - 400 ng/ml en plasma de mono al 100%) . Pueden incluirse dos calibradores fuera del intervalo completo del ensayo en 0.313 y 0.156 ng/ml en plasma de mono al 5% para servir como puntos de anclaje para facilitar el ajuste de la curva. Los puntos de anclaje se eliminan o se pueden eliminar o retener sobre la base de la mejor forma de la curva (es decir, el número más alto de los estándares de lectura con una precisión definida, %RE) .
Ensayo cromogenico específico para el FVIII La actividad del FVIII en las muestras de plasma de monos cinomolgos se estimó sobre la base de la dosis administrada, y luego se diluyó a aproximadamente 0.25 - 1 Ul/ml en plasma humano suprimido del Factor VIII (Diagnostica Stago) . Las muestras se analizaron en un CA1500 Sysmex (Siemens Diagnostic Healthcare) por medio del uso de un kit cromogénico para rl FVIII (Siemens) . En este ensayo cromogénico, el rFVIIIFc en las muestras de plasma se activó por la trombina. El Factor VIII activado (FVIIIa) a continuación, aceleró la conversión del Factor X (FX) al Factor Xa (FXa) en presencia del factor IX activado (FlXa) , fosfolípidos (PL) e iones de calcio. La actividad del FXa se evaluó mediante la hidrólisis de un sustrato p-nitroanilida específico a FXa. La velocidad inicial de liberación de p-nitroanilina (pNA) medida a 405 nm fue proporcional a la actividad del FXa, y por lo tanto a la actividad del FVIII en la muestra. El límite de cuantificación de la actividad del FVIII debido a rFVIIIFc en este ensayo fue de ~ 0.3 Ul/ml. El ensayo pudo medir la actividad total del FVIII hasta un límite inferior de aproximadamente 0.06 Ul/ml con una precisión de ± 20%. La actividad que se calculó en la muestra pre-dosis para los animales individuales se restó del valor en cada punto de tiempo para generar las curvas de la DP (actividad FVIII vs . tiempo) .
Se generó una curva estándar a partir del 7™a Norma Internacional para el concentrado del FVIII NIBSC diluido a 1 Ul/ml en plasma humano deficiente de FVIII. Las curvas de calibración se diluyeron en serie en el instrumento Sysmex para dar concentraciones de 0.15, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0053 y 0.0026 Ul/ml. Dado que el instrumento diluyó todas las muestras 1:10 internamente, las concentraciones del FVIII estándar correspondieron a las concentraciones en plasma de 1.5 a 0.026 Ul/ml, que fue el intervalo de actividades de FVIII que se pudo medir.
Análisis de PK Los perfiles de concentración en el tiempo se evaluaron por medio del uso del módulo de análisis no compartimental en el programa de software WinNonlin' (Versión 5.2, Pharsight Corporation, Mountain View, CA) .
Resultados La concentración del rFVIIIFc en el plasma de mono se midió por medio del uso de un formato de ELISA sándwich que medía ambas porciones FVIII y Fe de la molécula y los datos se muestran en la Tabla 7. Todas las muestras pre-dosis estuvieron por debajo del límite de cuantificación . La Figura 7 ilustra la concentración media en el plasma del rFVIIIFc y Xyntha del grupo en el tiempo y las curvas de la concentración plasmática individual contra el tiempo se muestran en la Figura 8. Un resumen de los parámetros farmacocinéticos de rFVIIIFc y Xyntha se muestran en las Tablas 9 y 10, respectivamente. El tl/2 medio para el rFVIIIFc fue de 11.9 ± 1.7 horas (intervalo 9.3 a 14.1 horas) y para Xyntha, el tl/2 medio de eliminación fue de 12.7 ± 4.4 horas (intervalo 9.2 a 19.9 horas).
La actividad del FVIII se midió por medio del uso de un ensayo cromogénico de actividad específica de FVIII y los datos se muestran en la Tabla 8. La. actividad pre-dosis debida al FVIII endógeno se restó de todas las muestras. Un gráfico de los datos medios del grupo se muestra en la Figura 9 y las curvas de la concentración plasmática individual vs . tiempo se muestran en la Figura 10. Un resumen de los parámetros farmacocinéticos se presenta para el rFVIIIFc y Xyntha en las Tablas 9 y 10, respectivamente. El tl/2 medio de eliminación fue de 16.1 ± 6.9 horas (intervalo de 11.6 a 29.4 horas) para el rFVIIIFc y 12.5 ± 1.7 horas (intervalo de 10.4 a 14.3 horas) para Xyntha.
Discusión y Conclusiones Las vidas medias de eliminación fueron similares para el rFVIIIFc y Xyntha después de una dosis intravenosa única de 125 Ul/kg si el artículo de prueba se midió por ELISA o por un ensayo de actividad cromogénico.
Ejemplo 3 Este será un ensayo fase I/IIa, abierto, cruzado, de escalado de dosis, multi-centro, y el primer estudio en humanos diseñado para evaluar la seguridad, tolerabilidad y farmacocinética de una dosis única de rFVIIIFc en sujetos con hemofilia A severa (definida como <1 Ul/dl [1%] del factor endógeno VIII [FVIII] ) . Un total de aproximadamente 12 pacientes que se trataron previamente se inscribirán y dosificarán con el rFVIIIFc a 25 o 65 Ul/kg. Después de la selección (prevista dentro de los 28 días anteriores a la primera dosis de Advate® [rFVIII] , el agente comparador de referencia) y un mínimo de 4 días (96 horas) transcurridos sin tratamiento con FVIII antes de la primera inyección, aproximadamente 6 sujetos recibirán una única dosis de 25 Ul/kg de Advate® seguida de un perfil farmacocinético (PK) de 3 días (72 horas) y entonces se cruzarán y recibirán una sola dosis de 25 Ul/kg, de etiqueta abierta de rFVIIIFc para un perfil PK de 7-días (168 horas) . Los primeros 3 sujetos se dosificarán secuencialmente . Para los primeros tres (3) sujetos tratados con 25 Ul/kg de rFVIIIFc, cada sujeto será objeto de una evaluación del inhibidor a los 14 días (336 horas) después de la inyección del rFVIIIFc. La dosificación del siguiente sujeto (para los primeros tres sujetos solamente) se producirá una vez que se complete el ensayo del inhibidor. Después de que el tercer sujeto complete el ensayo del inhibidor de 14 días, los otros tres sujetos de 25 Ul/kg y los seis sujetos de 65 Ul/kg comenzarán a inscribirse secuencialmente con al menos 1 día de separación dentro de cada grupo de dosis.
Una semana después de que el último sujeto recibe la dosis del rFVIIIFc de 25 Ul/kg, aproximadamente 6 sujetos únicos se reclutarán para el cohorte de 65 Ul/kg. Cada sujeto del cohorte de 65 Ul/kg recibirá una sola dosis de 65 Ul/kg de Advate® seguido por un perfil PK de 4 días (96 horas) luego se cruzráa y recibirá una sola dosis del rFVIIIFc de 65 Ul/kg, de etiqueta abierta para un perfil de PK de 10 días (240 horas) . Si un episodio de sangrado se produce antes de la primera inyección del rFVIIIFc en cualquier cohorte, el sujeto debe usarse para el tratamiento con el producto FVIII del pre-estudio y debe pasar un intervalo de al menos 4 días antes de recibir la primera inyección de rFVIIIFc para el perfil PK.
Todos los sujetos se seguirán por un período de evaluación de la seguridad de 14 días (336 horas) y 28 días tras la administración de 25 Ul/kg o 65 Ul/kg rFVIIIFc por seguridad. Todos los sujetos se' someterán a un muestreo farmacocinético pre y post-dosificación junto con muestras de sangre para el análisis de la actividad, del FVIII en puntos de tiempo designados.
Ejemplo 4 Actividad en el Complejo Xasa Para investigar la unión de las proteínas del Factor VIII (el rBDD FVIII y el rFVIIIFc) con el FlXa, y medir la capacidad de estas proteínas para activar el FX, se realizaron estudios cinéticos para examinar estas interacciones en el contexto del complejo Xasa. Este ensayo implicó la formación del complejo Xasa con el FIX activado y la proteína rBDD FVIII o rFVIIIFc activadas sobre una superficie de fosfolípidos en presencia de calcio, y el monitoreo de la conversión de FX a FXa por la medición de la escisión de un sustrato cromogénico o fluorogénico .
Brevemente, el FVIII se activa por primera vez con OÍ-trombina durante 5 minutos, luego se mezcla con FlXa en presencia de Ca2+, y las vesículas de fosfolípidos sintéticos (25% fosfatidilserina (PS) / 75% fosfatidilcolina (PC) ) o plaquetas. Bajo las condiciones descritas a continuación, FVIIIa y FlXa interactuan en presencia de una superficie de fosfolípidos e iones de calcio para formar un complejo Xasa activo que media la conversión de FX en FXa a través de un procesamiento proteolítico . A su vez, FXa escinde un sustrato cromogénico o fluorogénico específico por FXa. El sustrato escindido es cromogénico y por lo tanto la cantidad de sustrato escindido en una solución es indicativa de la cantidad de FXa generado. Esto se cuantifica por medio de la medición de la absorbancia de la solución a 405 nm.
A. Activación del factor X La capacidad de rBDD FVIII y rFVIIIFc para activar a FX se estudió en el contexto del complejo Xase como se describió anteriormente. Las proteínas de FVIII activadas por trombina se incubaron con FlXa y fosfolípidos en presencia de calcio, a continuación se añadieron a diferentes concentraciones de FX en presencia de un sustrato específico por FX y se determinó la velocidad de generación de FXa (Figura 11) .
En base a estos datos, se calcularon la Km y la Vmáx de las diferentes proteínas del FVIII en el contexto del complejo Xasa (Chang 1997) (Tabla 11) . Los datos se expresaron como el promedio de los seis análisis (3 experimentos que contenían corridas duplicadas) ± la desviación estándar correspondiente. En base a estos datos, se encontró que estas proteínas (rBDD FVIII y rFVIIIFc) tenían valores comparables de Km y Vmáx, dentro de la variación del ensayo. Por lo tanto, el complejo Xasa que se forma con el rFVIIIFc se comportó de forma similar al complejo Xasa formado con el produto licenciado rBDD FVIII (ReFacto) con respecto a las interacciones con los fosfolípidos y la capacidad para activar FX. Nótese que estos datos comparables también demuestran que rFVIIIFc se activa en un grado comparable a rBDD FVIII después de una breve incubación con trombina.
B. Interacción con el FlXa La interacción entre el rBDD FVIII y el rFVIIIFc con el FlXa también se examinó en el contexto del complejo Xasa. El complejo Xasa se montó como anteriormente, por medio del uso de una cantidad fija del FX y niveles variados del FlXa, y se determinó la velocidad de generación (Figura 12) . A partir de estos datos, se determió el valor de Kd para el complejo Xasa formado con ambas proteínas de FVIII a FlXa (Chang, 1997) . Los datos se expresaron como el promedio de los seis análisis (3 experimentos que contenían corridas duplicadas) ± la desviación estándar correspondiente (T.abla 12) . Se encontró que ambas proteínas tenían similares valores de Kd y Vmáx, lo que indicó que rFVIIIFc tenía interacciones con el FlXa comparables a las del producto licenciado rBDD FVIII.
Ejemplo 5 Los datos farmacocinéticos provisionales para el ensayo clínico Fase i/lla que se discutieron en el Ejemplo 3 demostraron los siguientes resultados para el FVIIIFc. El FVIIIFc tenía aproximadamente un 50% de aumento en la exposición sistémica (AUCINF) , aproximadamente un 50% de reducción en el aclaramiento (Cl) , y aproximadamente un 50-70% de aumento en la vida media de eliminación y el MRT en comparación con el Advate (FVIIIr de longitud completa) . Además, el FVIIIFc mostró un incremento en los valores C168, TBLP1 , TBLP3 y TBLP5 en comparación con el Advate.
AUCINF Área bajo la curva de concentración-tiempo de cero a infinito Beta HL Vida media de la fase de eliminación; también referido como ti2p C168Actividad del FVIIIFc estimada por encima del valor de la línea de base aproximadamente 168 horas después de la dosis.
Cl Aclaramiento MRT empo medio de residenc TBLP1 empo después de la dosis previsto por modelo cuando la actividad del FVIIIFc disminuye a aproximadamente 1 Ul/dl por encima de la línea de base TBLP3 Tiempo después de la dosis previsto por el modelo cuando la actividad del FVIIIFc disminuye a aproximadamente 3 Ul/dl por encima de la línea de base.
TBLP5 Tiempo después de la dosis previsto por el modelo cuando la actividad del FVIIIFc disminuye a aproximadamente 5 Ul/dl por encima de la línea de base Ejemplo 6 Se creó una proteína de fusión recombinante Factor VIII con el dominio B suprimido-Fc (rFVIIIFc) como un método para prolongar la vida media del FVIII. La farmacocinética (PK) del rFVIIIFc se comparó con la del rFVIII recombinante en ratones con hemofilia A. Se encontró que la vida media terminal fue el doble de tiempo para el rFVIIIFc en comparación con el rFVIII. Con el fin de confirmar que él mecanismo subyacente de la extensión de la vida media se debió a la protección de los rFVIIIFc por FcRn, se evaluó la PK en ratones de FcRn noqueado y ratones transgénicos para FcR humano. Se administró una sola dosis intravenosa (125 Ul/kg) y la concentración plasmática se midió por medio del uso de un ensayo de actividad cromogénica. La Cmáx fue similar entre el rFVIIIFc y el rFVIII (Xyntha®) en ambas cepas de ratones. Sin embargo, mientras que la vida media para el rFVIIIFc fue comparable a la del rFVIII en los ratones noqueados de FcRn, la vida media para el rFVIIIFc se extendió a aproximadamente el doble que la del rFVIII en los ratones transgénicos para hFcRn. Estos resultados confirman que el FcRn media o es responsable de la prolongada vida media de rFVIIIFc en comparación con rFVIII. A partir de que se mostró que la hemostasia en sangre total medida por tromboelastometría de rotación (ROTEM) correlaciona con la eficacia de los factores de coagulación en los modelos de sangrado de ratones con hemofilia, así como en aplicaciones clínicas, se trató de evaluar la eficacia ex vivo del rFVIIIFc en ratones con la hemofilia A por medio del uso de ROTEM. Se administró a ratones con hemofilia A ratones una sola dosis intravenosa de 50 Ul/kg de rFVIIIFc, Xynth ® (FVIII) o ADVATE® (FVIII) . A los 5 minutos después de la dosis, la formación de coágulos fue similar con respecto al tiempo de coagulación (TC) , el tiempo de la formación de coágulos (CFT) y el ángulo a. Sin embargo, rFVIIIFc demostró un CT significativamente mejor a las 72 y 96 horas después de la dosis, y el CFT y el ángulo también fueron mejores a las 96 horas en comparación tanto con Xyntha® (FVIII) como con ADVATE® (FVIII) , de conformidad con la PK prolongada de rFVIIIFc. Por lo tanto la construcción de una fusión Fe de FVIII produce una molécula con un mecanismo de acción definido que tiene una mayor vida media y el potencial para proporcionar una protección prolongada de sangrado.
Ejemplo 7 Este ejemplo presenta los resultados finales del análisis de la actividad del FVIII para 16 pacientes tratados con 25 y 65 Ul/kg de los productos del FVIII. Ver los Ejemplos 3 y 5.
En este Ejemplo, el rFVIIIFc es una proteína de fusión recombinante compuesta de una sola molécula de FVIII humano recombinante con el dominio B suprimido (BDD-rFVIII) que se fusiona al dominio dimérico Fe de la IgGl humana, sin la intervención de una molécula enlazadora. Esta construcción de proteína también se refiere en la presente como proteína híbrida heterodimérica rFVIIIFc, proteína de fusión de Fe monomérico FVIIIFc, híbrido de monómero FVIIIFc, híbrido de FVIIIIFc monomérico, y FVIIIFc monómero-dimero . Ver el Ejemplo 1, la Figura 1, y la Tabla 2A.
Los estudios preclínicos con el rFVIIIFc demostraron una prolongación de aproximadamente 2 veces en la vida media de la actividad del rFVIII en comparación con los productos del rFVIII comercialmente disponibles. La justificación de este estudio fue evaluar la seguridad y tolerabilidad de una dosis única del rFVIIIFc en una formulación líquida congelada y proporcionar datos sobre la PK en sujetos con hemofilia A severa. Para este estudio, estuvieron disponibles 16 pacientes evaluables para la evaluación de PK. Una sola administración de dos dosis de ambos rFVIIIFc y Advate a una dosis nominal de 25 (n = 6) y 65 Ul/kg de peso corporal (n=10) se infundieron por vía intravenosa durante 10 minutos aproximadamente. Las muestras de sangre para las evaluaciones de PK en el plasma se obtuvieron antes de la infusión, así como hasta 10 días después de la dosificación. Las PK de la actividad del FVIII, tanto para el Advate como para el rFVIIIFc se caracterizaron en este estudio por medio del uso de un método dependiente del modelo.
Objetivos El objetivo primario de este estudio fue evaluar la seguridad y la tolerabilidad de una administración única de dos dosis del rFVIIIFc (25 y 65 Ul/kg) en pacientes que se trataron previamente (PTP) de 12 años o mayores con hemofilia A severa.
Los objetivos secundarios fueron determinar los parámetros farmacocinét icos (PK) determinados por la actividad farmacodinámica (PD) del Factor VIII en el tiempo después de una administración única de 25 o 65 Ul/kg del rFVIIIFc en comparación con el Advate en los ensayos de coagulación y cromogénico de una etapa.
Diseño del estudio (ver el Ejemplo 3) Se tomaron muestras de sangre para las evaluaciones de la PK de la actividad del FVIII en la visita, de selección (dentro de los 28 días anteriores a la dosificación con Advate) ; en el día 0 (inyección del Advate) antes de la inyección y a los 10 y 30 minutos y 1, 3, 6, y 9 horas después de la inyección; en el día 1 a las 24 horas posteriores a la inyección del Advate; en el día 2 a las 48 horas posteriores a la inyección del Advate, el día 3 a las 72 horas posteriores a la inyección del Advate, y en el día 4 a las 96 horas . después de la inyección de altas dosis del Advate (cohorte B solamente) .
Se tomaron muestras de sangre para las evaluaciones de PK de la actividad del FVIII en el día de la inyección del rFVIIIFc justo antes de la administración del rFVIIIFc, a los 10 y 30 minutos y 1, 3, 6 y 9 horas después de la inyección del rFVIIIFc; el día 1 a las 24 horas posteriores a la inyección del rFVIIIFc, en los días 2 al 5 a las 48, 72, 96 y 120 horas después de la inyección del rFVIIIFc, en el día 7 a las 168 horas posteriores a la inyección del rFVIIIFc; en los días 8, 9 y 10 a las 192, 216, y 240 horas después de la inyección de altas dosis del rFVIIIFc (cohorte B solamente) . La actividad del FVIII se midió también en la visita final del estudio (28 días después de la inyección del rFVIIIFc) a las 672 horas después de la inyección del rFVIIIFc.
Modelos farmacocinéticos y cálculos Abreviaturas TBLP1 = Tiempo después de la dosis previsto por el modelo cuando la actividad del Factor VIII declina a aproximadamente 1 Ul/dl por encima de la línea de base.
TBLP3 = Tiempo después de la dosis previsto por el modelo cuando la actividad del Factor VIII declina a aproximadamente 3 Ul/dl por encima de la línea de base.
KV_M = Cmáx_M/Dosis Real (UI / kg) KV_OB = Cmáx_OB / Dosis Real (Ul/kg) IVR_M = 100 x Cmáx_M volumen plasmático (di) / dosis total en UI, donde el volumen plasmático en mi = (23.7 x Ht en cm) + (9.0 x Pt en kg) - 1709.
IVR_OB=100 x Cmáx_OB volumen plasmático (di) / dosis total en UI, donde el volumen plasmático en mi = (23.7 x Ht en cm) + (9.0 x Pt en kg) - 1709.
Resultados Figura 13. Media (± SE) de la actividad del FVIII del grupo observada contra los perfiles de tiempo, ordenados por nivel de dosis, agrupados por compuesto (ensayo de una etapa, 25 Ul/kg (A) y 65 Ul/kg (B) ) y (ensayo cromogénico, 25 Ul/kg (C) y 65 Ul/kg (D) ) .
Figura 14. Media (± SE) de la actividad del FVIII del grupo observada contra los perfiles de tiempo, agrupadas por nivel de dosis y compuesto (ensayo de una etapa; A) (ensayo cromogénico; B) .
Farmacocinética de dosis única (ensayo de una sola etapa) L actividad del FVIII que se observó aumentó fuertemente después de la infusión intravenosa corta tanto del Advate como del rFVIIIFc, con unos valores de Cmáx medios (± SD) previstos por el modelo de 56.6 ± 4.74 y 121 + 28.2 Ul/dl para el Advate y 55.6 ±'8.18 y 108 ± 16.9 Ul/dl para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente. Todos los pacientes que se trataron con el Advate y el rFVIIIFc tuvieron incrementos en la actividad de FVIII relacionados con la dosis. El aumento que se observó tanto en la Cmáx como la AUCINF fue ligeramente menos que proporcional a la dosis en el intervalo de dosis evaluadas.
Después del final de la infusión, la disminución de la actividad del FVIII observada exhibió características de decaimiento monoexponencial hasta que se alcanzó el nivel de referencia. La velocidad de disminución de la actividad del FVIII fue más lenta para el rFVIIIFc que para el Advate con valores medios de vida media de eliminación (± SD) previstos por el modelo de 11.9 ± 2.98 y 10.4 + 3.03 h para el Advate y 18.0 ± 3.88 y 18.4 ± 6.99 h para el rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente. Los valores de vida media de eliminación parecen ser independientes de la dosis en el intervalo de dosis evaluada, para ambos productos del FVIII.
La exposición sistémica total del FVIII (que se ensayó por AUCINF) fue de ~ 48% y 61% mayor después de la administración del rFVIIIFc que la del Advate a las dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente. Los valores de AUCINF medios (± SD) predichos por el modelo fueron 974 ± 259 y 1810 ± 606 h*Ul/dl para Advate y 1440 ± 316 y 2910 ± 1320 hr*Ul/dl para el rFVIIIFc en los grupos de dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente.
Similar a la vida media de eliminación, el MRT se prolongó para el rFVIIIFc en relación con el Advaté. La media de los valores del MRT (+ SD) previstos por el modelo fueron 17.1 ± 4.29 y 14.9 ± 4.38 h parael Advate y 25.9 + 5.60 y 26.5 ± 10.1 h para el rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 de Ul/kg, respectivamente. Los valores de MRT parecían ser independientes de la dosis en el intervalo de dosis evaluada, para ambos productos del FVIII.
Adicionalmente , se determinaron los valores primarios de los parámetros farmacocinéticos CL y V. Los valores de CL para rFVIIIFc sólo representaron aproximadamente un 66% de los observados para el Advate en dosis equivalentes. La media de los valores de Cl (+ SD) previstos por el modelo fueron 2.70 ± 0.729 y 4.08 ± 1.69 mi / h / kg para el Advate y 1.80 ± 0.409 y 2.69 ± 1.25 ml/h /kg para el rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 de Ul/kg , respectivamente. Los valores de V fueron comparables entre el Advate y el rFVIIIFc con una media de los valores de V (± SD) previstos por el modelo de 43.9 ± 4.27 y 56.1 ± 13,4 ml/kg para el Advate y 45.3 ± 7.23 y 61.6 ± 10.6 ml/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente. Se observaron ligeros aumentos en los valores de la media de CL y V con dosis crecientes del Advate y el rFVIIIFc; sin embargo, el aumento de la desviación¦ estándar en la dosis de 65 Ul/kg junto con niveles de dosis limitados confundieron una evaluación de la dependencia de la dosis de estos parámetros. Por ejemplo, el CV% de la media geométrica de los valores de CL para el grupo de tratamiento del rFVIIIFc aumentó de 23.0% (25 Ul/kg) a 48.6% (65 Ul/kg) .
Además de los parámetros PK primarios, se determinaron parámetros PK secundarios (por ejemplo, valores K, IVR, etc) se determinaron para evaluar la duración del efecto del FVIII. También se observaron evidencias de diferencias de PK ya que el rFVIIIFc demostró un aumento de los valores de TBLPland TBLP3 en comparación con el Advate en dosis equivalentes. Los valores de IVR y K para el Advate y el rFVIIIFc parecieron comparables. Un ligero aumento en los valores TBLP3 y TBLP1 y se observó con dosis cada vez mayores del Advate y el rFVIIIFc. Por el contrario, ligeros descensos en los valores medios de IVR y K se observaron con dosis crecientes del Advate y el rFVIIIFc. Como se indicó anteriormente, una evaluación de la dependencia de la dosis de estos parámetros se confundió por los niveles de dosis limitados.
El TBLP1 medio (± SD) observado fue de 2.88 ± 0.733 y 2.93 ± 0.848 Ul/dl por Ul/kg para el Advate y 4.28 ± 0.873 y 5.16 ± 2.02 Ul/dl por Ul/kg para el rFVIIIFc en los grupos de dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente. El TBLP3 medio (± SD) observado fue de 2.06 ± 0.527 y 2.26 ± 0,666 Ul/dl por Ul/kg para el Advate y 3.09 ± 0.623 y 3.93 ± 1.59 Ul/dl por Ul/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente.
Los valores medios de IVR y K calculados por medio del uso de los valores Cmáx observados (a los que se resta la línea de base y el fármaco residual en el modelo) fueron en general mayores que los valores que se determinaron por medio de los valores de Cmáx previstos por el modelo; en consonancia con una ligera subestimación de la actividad máxima que se observó por medio del uso del modelo de un compartimiento. Los valores de K medios (± SD) observados fueron 2.57 ± 0.198 y 2.13 ± 0.598 Ul/dl por Ul/kg para el Advate y 2.46 ± 0.330 y 1.85 ± 0.332 Ul/dl por Ul/kg para el rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente. Los valores de IVR medios (± SD) observados fueron 94.1 ± 15.6 y 85.8 + 16.5% para el Advate y 89.5 ± 11.9 y 74.8 + 6.72% para el rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente.
Farmacocinetica de dosis única (ensayo cromogénico) La actividad del FVIII que se observó aumentó considerablemente después de la infusión intravenosa corta del Advate o el rFVIIIFc, con una media (± SD) de valores Cmáx prevista por el modelo de 70.2 ± 9.60 y 157 ± 38.6 Ul/dl para el Advate y 70.3 + 10,0 y 158 + 34.7 Ul/dl para el rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente.
Todos los pacientes que se trataron con el Advate y el rFVIIIFc tuvieron incrementos en la actividad del FVIII relacionados con la dosis. El aumento que se observó tanto en la Cmáx como la AUCINF fue ligeramente menos que proporcional a la dosis en el intervalo de dosis evaluadas.
Después del final de la infusión, la disminución de la actividad del FVIII observada exhibió características de decaimiento monoexponencial hasta que se alcanzó el nivel de referencia. La velocidad dé disminución de la actividad del FVIII fue más lenta para rFVIIIFc que para el Advate con una media (+ SD) de valores de vida media de eliminación prevista por el modelo de 10.7 ± 1.98 y 10.3 ± 3.27 h para Advate y 16.2 ± 2.92 y 19.0 ± 7.94 h para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente. Los valores de vida media de eliminación parecían ser independientes de la dosis en el intervalo de dosis evaluada, para ambos productos del FVIII .
La exposición sistémica total del FVIII (que se evaluó por AUCINF) fue de ~ 53% y 84% mayor después de la administración del rFVIIIFc que del Advate a las dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente. La media (± SD) de los valores AUCINF previstos por el modelo fueron 1080 ± 236 y 2320 ± 784 h*UI/dl para el Advate y 1650 ± 408 y 4280 ± 1860 hr*UI/dl para él rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente.
Similar a la vida media de eliminación, el MRT se prolongó para el rFVIIIFc en relación con el Advate . La media (+ SD) de los valores MRT previstos por el modelo fueron 15.3 ± 2.86 y 14.8 ± 4.72 h para el Advate y 23.4 ± 4.22 y 27.3 ± 11.4 h para el rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente. Los valores de MRT parecían ser independientes de la dosis en el intervalo de dosis evaluada, para ambos productos de FVIII.
Adicionalmente , se determinaron los valores primarios de los parámetros farmacocinéticos CL y V. Los valores de CL para el rFVIIIFc sólo representaban el 58-66% de los observados para el Advate en dosis equivalentes. Las medias (± SD) de los valores de CL previstas por el modelo fueron 2.39 ± 0.527 y 3.21 ± 1.40 ml/h/ g para el Advate y 1.57 '± 0.349 y 1.86 ± 0.970 ml/h/kg para el rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente. Los valores de V fueron comparables entre el Advate y el rFVIIIFc con una media (± SD) para los valores V prevista por el modelo de 35.8 ± 5.52 y 43.6 ± 11.2 ml/kg para el Advate y 35.9 ± 6.65 y 42.7 + 8.91 ml/kg para el rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente. El aumento en las medias de los valores de CL y V se observó con dosis crecientes del Advate y el rFVIIIFc, sin embargo, el aumento de las desviaciones estándar a 65 Ul/kg junto con niveles de dosis limitadas confundieron una evaluación de la dependencia de la dosis de estos parámetros.
Además de los parámetros PK primarios, se determinaron los parámetros PK secundarios (por ejemplo, valores K, IVR, etc) se determinaron para evaluar la duración del efecto del FVIII. También se observaron evidencias de diferencias de PK ya que el rFVIIIFc demostró un aumento de los valores de TBLPly TBLP3 en comparación con el Advate en dosis equivalentes. Los valores de IVR y K para el Advate y el rFVIIIFc parecieron comparables.
Un ligero aumento en los valores TBLP3 y TBLP1 se observó con dosis cada vez mayores del Advate y el rFVIIIFc. Por el contrario, ligeros descensos en los valores medios de IVR y K se observaron con dosis crecientes del Advate y el rFVIIIFc. Como se indicó anteriormente, una evaluación de la dependencia de la dosis de estos parámetros se confundió por los niveles de dosis limitados." Las medias (± SD) de TBLP1 que se observaron fueron 2.70 ± 0.511 y 3.09 ± 0.978 Ul/dl por Ul/kg para el Advate y 4.06 ± 0.798 y 5.66 ± 2.38 Ul/dl por Ul/kg para el rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente. Las medias (+ SD) de TBLP3 que se observaron fueron 1.98 + 0.377 y 2.39 ± 0.718 Ul/dl por Ul/kg para el Advate y 3.04 ± 0.598 y 4.44 ± 1.84 Ul/dl por Ul/kg para el rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente.
Los valores medios de IVR y K calculados por medio del uso de los valores Cmáx observados (a los que se resta la línea de base y el fármaco residual en el modelo) fueron en general mayores que los valores que se determinaron por medio de los valores de Cmáx previstos por el modelo; en consonancia con una ligera subestimación de la actividad máxima que se observó por medio del uso del modelo de un compartimiento. Las medias (± SD) de los valores K observados fueron 3.08 ± 0.429 y 2.85 ± 0.721 Ul/dl por Ul/kg para el Advate y 3.12 ± 0.451 y 2.92 ± 0.985 Ul/dl por Ul/kg para el rFVIIIFc para los grupos dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente. Las medias (± SD) de los valores IVR ¦ observados fueron de 112 ± 14.5 y 116 + 26.9% para el Advate y 113 ± 16.3 y 117 ± 33.6% para el rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente.
Conclusiones Todos los pacientes tratados con el Advate y el rFVIIIFc tuvieron aumentos comparables en Cmáx y AUCINF en relación con la dosis en el intervalo de dosis evaluado. Los niveles plasmáticos máximos de actividad del Advate y del rFVIIIFc se observaron generalmente en la primera hora después del final de la infusión y permanecieron detectables durante varios días después de la dosificación. Después del final de la infusión, la disminución de la actividad del FVIII corregida por la línea de base exhibió una decadencia monoexponencial hasta que se alcanzó la línea de base para ambos productos . Los valores de los parámetros de vida media de eliminación y MRT parecieron ser independientes de la dosis en el intervalo de dosis evaluado, para ambos productos de FVIII. Se observaron ligeros incrementos en los valores de las medias de CL y V con dosis crecientes del Advate y el rFVIIIFc; sin embargo, el aumento de la variabilidad intersujeto en la dosis de 65 Ul/kg junto con niveles de dosis limitados confundieron una evaluación de la dependencia de la dosis de estos parámetros.
La comparación de la PK de la actividad del rFVIIIFc y el Advate, mostró un aumento aproximado del 48-61% (ensayo de una sola etapa) o 53-84% (ensayo cromogénico) en la exposición sistémica, una reducción aproximada del 30-40% en aclaramiento, y un aumento aproximado de 50 -80%, tanto en la vida media de eliminación como el MRT para el rFVIIIFc en relación con el Advate a dosis comparables. La evidencia de la diferencia de PK se observó también al demostrar el rFVIIIFc un aumento de los valores de TBLP1 y TBLP3 en comparación con el Advate a dosis equivalentes. Los valores de IVR y K para el Advate y el rFVIIIFc parecieron comparables.
Los parámetros PK que se obtuvieron a partir de los resultados del ensayo cromogénico en general coincidieron con los del ensayo de una etapa, excepto que el ensayo cromogénico produjo una mayor estimación de los parámetros de exposición (por ejemplo, Cmáx, AUCINF, etc.) Con las mejorías observadas en la PK, el rFVIIIFc puede proporcionar una protección prolongada del sangramiento, lo que permite inyecciones menos frecuentes para las personas con hemofilia A.
Ejemplo 8 Sobre la base del análisis de PK provisional del primer estudio en humanos del rFVH : Fe (Ejemplo 3), se diseñó el estudio A-LONG. A-LONG es un estudio abierto, multicéntrico de evaluación de la seguridad, la farmacocinética y la eficacia de la fusión del Factor VIII recombinante Fe (FVIII:Fc) en la prevención y tratamiento de hemorragias en pacientes previamente tratados con hemofilia A severa (definida como < 1 Ul/dl [<1%] FVIII endógeno) .
Aproximadamente 106 sujetos se inscribirán en uno de tres regímenes: un régimen de profilaxis adaptado (brazo 1) , un régimen de dosificación semanal (brazo 2) , y un régimen a-demanda (brazo 3) .
Brazo 1: Régimen de profilaxis adaptado ' El brazo 1 va a incluir un grupo global y un subgrupo de PK. Se inscribirán aproximadamente 66 sujetos. El régimen inicial será dos veces por semana 25 Ul/kg en el primer día, seguido por 50 Ul/kg en el cuarto día de la semana. A los sujetos se les administrará el rFVIIIFc en este régimen de profilaxis semanal hasta que los resultados de PK para el rFVIIIFc estén disponibles. Con base en estos resultados, se establecerá un régimen de profilaxis adaptado para cada individuo, en el que la dosis y el intervalo se determinarán para mantener un nivel base de 1-3% de actividad del FVIII. A cada sujeto entonces se le administrará su régimen de profilaxis adaptado durante todo el estudio.
Los sujetos se monitorearán durante todo el estudio y se harán los ajustes de la dosis en curso y el intervalo. Los ajustes sólo se harán cuando un sujeto experimenta episodios de sangrado inaceptables definidos como = 2 episodios hemorrágicos espontáneos en dos meses continuos. En este caso, el ajuste se dirigirá a niveles de 3-5%.
Brazo 2: Régimen de dosificación semanal Aproximadamente 20 sujetos se inscribirán/aleatorizarán y se someterán a perfiles abreviados de PK del rFVIIIFc de la siguiente manera: , lavado de al menos 96 horas, una dosis única del rFVIIIFc de 65 Ul/kg; comienzo de muestreo abreviado en el Día 0 de rFVIIIFc, lo que incluye la pre-inyección y 10 (± 2) minutos, 3 horas (± 15 minutos) , 72 (± 2) horas [día 3], y 96 (± 2) horas [día 4] desde el inicio de la inyección. A continuación del perfil de PK abreviado, a los sujetos se les administrará una dosis fija de 65 Ul/kg de rFVIIIFc cada 7 días.
Brazo 3: Régimen a-demanda Se evaluarán en el estudio un mínimo de 10 cirugías mayores en por lo menos 5 sujetos. La cirugía mayor se define como cualquier procedimiento quirúrgico (electivo o de emergencia) que implica la anestesia general y/o asistencia respiratoria en el que se penetra y se expone una cavidad principal del cuerpo, o por la cual se produce un deterioro sustancial de las funciones físicas o fisiológicas (por ejemplo, la laparotomía, la toracotomía, la craneotomía, el reemplazo de articulaciones y la amputación^ de miembros) .
Para la profilaxis durante la cirugía, los sujetos se tratarán con 35 a 50 Ul/kg de rFVIIIFc cada 12 a 24 horas. Antes de la cirugía, el médico revisará el perfil de PK de rFVIIIFc del sujeto y ensayará el régimen de dosis de reemplazo del Factor VIII que generalmente se requiere para el tipo de cirugía programada y el estado clínico del sujeto. La recomendación para la dosificación adecuada del rFVIIIFc en el período de tratamiento quirúrgico, que incluye el tiempo de rehabilitación, tomará en consideración estos factores.
Los objetivos principales de este estudio son: (a) evaluar la seguridad y la tolerabilidad del rFVIIIFc que se administra como profilaxis, a-demanda, y en los regímenes de tratamiento quirúrgico, y (b) evaluar la eficacia del rFVIIIFc que se administra como profilaxis, a-demanda, y en los regímenes de tratamiento quirúrgico. Los objetivos secundarios de este estudio son: (a) caracterizar el perfil PK del rFVIIIFc y comparar la PK del FVIIIFc con el producto 1 que se comercializa en la actualidad, el Advate, (b) evaluar las respuestas individuales con el FVIIIFc, y (c) evaluar el consumo del FVIIIFc.
Objetivos principales · Evaluar la seguridad y la tolerabilidad del rFVIIIFc que se administra como profilaxis, semanalmente, a-demanda-, y los regímenes de tratamiento quirúrgico • Evaluar la eficacia del rFVIIIFc que se administra como profilaxis adaptada, a-demanda, y los regímenes de tratamiento quirúrgico Objetivos secundarios • Caracterizar el perfil PK del rFVIIIFc y comparar la PK del rFVIIIFc con el producto que se comercializa en la actualidad, el Advate® · Evaluar las respuestas individuales con el rFVIIIFc • Caracterizar el intervalo de dosis y horario necesarios para prevenir adecuadamente la hemorragia en un régimen de profilaxis; mantener la homeostasis en un ambiente quirúrgico, o para tratar episodios hemorrágicos en perfil a-demanda, el tratamiento semanal, o la profilaxis adaptada • Evaluar el consumo del rFVIIIFc (por ejemplo, el consumo total anual de rFVIIIFc por sujeto) Ejemplo 9 Evaluación clínica de la ROTEMt En el estudio en el Ejemplo 8, además de la medición de la actividad plasmática del FVIII por el ensayo de tiempo de la tromboplastina parcial activada en una etapa (aPTT) , la tromboelastometría rotacional de sangre total (ROTEM) también se exploró para evaluar la mejora en la hemostasia global por el rFVIIIFc y el Advate en 2 sujetos, en concreto, uno en la cohorte de dosis baja y uno en la cohorte de dosis alta.
El rFVIIIFc y el Advate parecen comparablemente activos en la formación de coágulos, cuando se añadieron en la sangre de los sujetos antes del tratamiento con el rFVIIIFc. El tiempo de coagulación (CT, por sus siglas en inglés) fue lineal con respecto a la dosis del rFVIIIFc y el Advate en un intervalo de aproximadamente 1% de 100% de lo normal, y la respuesta a la dosis fue comparable entre el rFVIIIFc y el Advate en el mismo sujeto.
Después de la dosificación con el Advate y posteriormente el rFVIIIFc, la sangre entera, citratada se muestreó en diversos puntos temporales y se controló la formación de coágulos después de la recalcificación por la ROTEM. A pesar de un CT variable en la línea de base debido a los niveles de FVIII residuales antes de la dosificación con el Advate o el rFVIIIFc, ambos productos de manera efectiva corrigieron el CT a niveles comparables 30 minutos después de la inyección. Además, la mejoría en el CT se mantuvo mejor en y después de 3 horas post-inyección de 25 Ul/kg del rFVIIIFc en relación al Advate en el sujeto dosificado a esta dosis baja. Sin embargo, la mejoría diferencial del rFVIIIFc contra el Advate fue mucho menos apreciable en la dosis de 65 Ul/kg. TABLAS Tabla 1: Secuencias de polinucleótidos A. El FVIIIFc con el dominio B suprimido (i) Secuencia de ADN de la cadena del FVIIIFc con el dominio B suprimido (péptido señal de FVIII subrayado, región Fe en negrita ) (sec. con núm. de ident : 1, de codificación de la sec . con núm. de ident : 2) 661 A TGCAAATAGA GCTCTCCACC TGCTTCTTTC 721 TGTGCCTTTT GCGATTCTGC TTTAGTGCCA CCAGAAGATA CTACCTGGGT GCAGTGGAAC 781 TGTCATGGGA CTATATGCAA AGTGATCTCG GTGAGCTGCC TGTGGACGCA AGATTTCCTC 841 CTAGAGTGCC AAAATCTTTT CCATTCAACA CCTCAGTCGT GTACAAAAAG ACTCTGTTTG 901 TAGAATTCAC GGATCACCTT TTCAACATCG CTAAGCCAAG GCCACCCTGG ATGGGTCTGC 961 TAGGTCCTAC CATCCAGGCT GAGGTTTATG ATACAGTGGT CATTACACTT AAGAACATGG 1021 CTTCCCATCC TGTCAGTCTT CATGCTGTTG GTGTATCCTA CTGGAAAGCT TCTGAGGGAG 1081 CTGAATATGA TGATCAGACC AGTCAAAGGG AGAAAGAAGA TGATAAAGTC TTCCCTGGTG 1141 GAAGCCATAC ATATGTCTGG CAGGTCCTGA AAGAGAATGG TCCAATGGCC TCTGACCCAC 1201 TGTGCCTTAC CTACTCATAT CTTTCTCATG TGGACCTGGT AAAAGACTTG AATTCAGGCC 1261 TCATTGGAGC CCTACTAGTA TGTAGAGAAG GGAGTCTGGC CAAGGAAAAG ACACAGACCT 1321 TGCACAAATT TATACTACTT TTTGCTGTAT TTGATGAAGG GAAAAGTTGG CACTCAGAAA 1381 CAAAGAACTC CTTGATGCAG GATAGGGATG CTGCATCTGC TCGGGCCTGG CCTAAAATGC 14 1 ACACAGTCAA TGGTTATGTA AACAGGTCTC TGCCAGGTCT GATTGGATGC CACAGGAAAT 1501 CAGTCTATTG GCATGTGATT GGAATGGGCA CCACTCCTGA AGTGCACTCA ATATTCCTCG 1561 AAGGT CACAC ATTTCTTGTG AGGAACCATC GCCAGGCGTC CTTGGAAATC TCGCCAATAA 1621 . CTTTCCTTAC TGCTCAAACA CTCTTGATGG ACCTTGGACA GTTTCTACTG TTTTGTCATA 1681 TCTCTTCCCA CCAACATGAT GGCATGGAAG CTTATGT CAA AGTAGACAGC TGTCCAGAGG 1741 AACCCCAACT ACGAATGAAA AATAATGAAG AAGCGGAAGA CTATGATGAT GATCTTACTG 1801 ATTCTGAAAT GGATGTGGTC AGGTTTGATG ATGACAACTC TCCTTCCTTT ATCCAAATTC 1861 GCTCAGTTGC CAAGAAGCAT CCTAAAACTT GGGTACATTA CATTGCTGCT GAAGAGGAGG 1921 ACTGGGACTA TGCTCCCTTA GTCCTCGCCC CCGATGACAG AAGTTATAAA AGTCAATATT 1981 TGAACAATGG CCCTCAGCGG ATTGGTAGGA AGTACAAAAA AGTCCGATTT ATGGCATACA 2041 CAGATGAAAC CTTTAAGACT CGTGAAGCTA TTCAGCATGA ATCAGGAATC TTGGGACCTT 2101 TACTTTATGG GGAAGTTGGA GACACACTGT TGATTATATT TAAGAATCAA GCAAGCAGAC 2161 CATATAACAT CTACCCTCAC GGAATCACTG ATGTCCGTCC TTTGTATTCA AGGAGATTAC 2221 CAAAAGGTGT AAAACATTTG AAGGATTTTC CAATTCTGCC AGGAGAAATA TTCAAATATA 2281 AATGGACAGT GACTGTAGAA GATGGGCCAA CTAAATCAGA TCCTCGGTGC CTGACCCGCT 2341 ATTACTCTAG TTTCGTTAAT ATGGAGAGAG ATCTAGCTTC AGGACTCATT GGCCCTCTCC 2401 TCATCTGCTA CAAAGAATCT GTAGATCAAA GAGGAAACCA GATAATGTCA GACAAGAGGA 2461 ATGTCATCCT GTTTTCTGTA TTTGATGAGA ACCGAAGCTG GTACCTCACA GAGAATATAC 2521 AACGCTTTCT CCCCAATCCA GCTGGAGTGC AGCTTGAGGA TCCAGAGTTC CAAGCCTCCA 2581 ACATCATGCA CAGCATCAAT GGCTATGTTT TTGATAGTTT GCAGTTGTCA GTTTGTTTGC 264 1 ATGAGGTGGC ATACTGGTAC ATTCTAAGCA TTGGAGCACA GACTGACTTC CTTTCTGTCT 2 701 TCTTCTCTGG ATATACCTTC AAACACAAAA TGGTCTATGA AGACACACTC ACCCTATTCC 2761 CATTCTCAGG AGAAACTGTC TTCATGTCGA TGGAAAACCC AGGTCTATGG ATTCTGGGGT 2 82 1 GCCACAACTC AGACTTTCGG AACAGAGGCA TGACCGCCTT ACTGAAGGTT TCTAGTTGTG 2 881 ACAAGAACAC TGGTGATTAT TACGAGGACA GTTATGAAGA TATTTCAGCA TACTTGCTGA 2 94 1 GTAAAAACAA TGCCATTGAA CCAAGAAGCT TCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC 3 001 ATCAACGGGA AÁTAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GACTATGATG 3 061 ATACCATATC AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGAG GATGAAAATC 3121 AGAGCCCCCG CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC 3 181 TCTGGGATTA TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT CAGAGTGGCA 3241 GTGTCCCTCA GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC 33 01 CCTTATACCG TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG 3361 AAGTTGAAGA TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC TATTCCTTCT 3421 ATTCTAGCCT TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT' 3481 . TTGTCAAGCC TAATGAAACC AAAACTTÁCT TTTGGAAAGT GCAACATCAT ATGGCACCCA 3541 CTAAAGATGA GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG 3601 ATGTGCACTC AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA -CACTAACACA CTGAACCCTG 3661 CTCATGGGAG ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC TTTGATGAGA 3721 CCAAAAGCTG GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC 3781 AGATGGAAGA TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA 3841 TGGATACACT ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA 3901 GCATGGGCAG CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC 3961 GAAAAAAAGA GGAGTATAAA ATGGCACTGT ACAATCTCTA TCCAGGTGTT TTTGAGACAG 4021 TGGAAATGTT ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGA ATGCCTTATT GGCGAGCATC 4081 TACATGCTGG GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG 4 14 1 GAATGGCTTC TGGACACATT AGAGATTTTC AGATTACAGC TTCAGGACAA TATGGACAGT 42 01 GGGCCCCAAA GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG AGCACCAAGG 426 1 AGCCCTTTTC TTGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC GGCATCAAGA 432 1 CCCAGGGTGC CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC ATCATGTATA 43 81 GTCTTGATGG GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC CACTGGAACC TTAATGGTCT 444 1 TCTTTGGCAA TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAACCCT CCAATTATTG 4501 CTCGATACAT CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT CGCATGGAGT 4561 TGATGGGCTG TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT 462 1 CAGATGCACA GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT 46 81 CAAAAGCTCG ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG GTGAATAATC 474 1 CAAAAGAGTG GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA GTAACTACTC 4801 AGGGAGTAAA ATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC TCCAGCAGTC 4 86 1 AAGATGGCCA TCAGTGGACT CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA 4921 ATCAAGACTC CTTCACACCT GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG ACTCGCTACC 4981 TTCGAATTCA CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG GTTCTGGGCT 5041 GCGAGGCACA GGACCTCTAC GACAAAACTC ACACATGCCC ACCGTGCCCA GCTCCAGAAC 5101 TCCTGGGCGG ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC CTCATGATCT 5161 CCCGGACCCC TGAGGTCACA TGCGTGGTGG TGGACGTGAG CCACGAAGAC CCTGAGGTCA 5221 AGTTCAACTG GTACGTGGAC GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG 5281 AGCAGTACAA CAGCACGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC 5341 TGAATGGCAA GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGC CCTCCCAGCC CCCATCGAGA 5401 AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC CTGCCCCCAT 5461 CCCGGGATGA GCTGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTATC 5521 CCAGCGACAT CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA 5581 CGCCTCCCGT GTTGGACTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA 5641 AGAGCAGGTG GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA 5701 ACCACTACAC GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA A (ii) Secuencia de ADN del Fe (péptido señal de la Igic de ratón subrayado) (sec. con núm. de ident : 3, de codificación de la sec. con núm. de ident : 4) 7981 ATGGA GACAGACACA 8041 CTCCTGCTAT GGGTACTGCT GCTCTGGGTT CCAGGTTCCA CTGGTGACAA AACTCACACA 8101 TGCCCACCGT ' GCCCAGCACC TGAACTCCTG GGAGGACCGT CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA 8161 AAACCCAAGG ACACCCTCAT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT GGTGGTGGAC 8221 GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG TGGACGGCGT GGAGGTGCAT 8281 AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TACAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC 8341 CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC 8401 AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA 8461 CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGC GATGAGCTGA CCAAGAACCA GGTCAGCCTG 8521 ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG 8581 CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGTTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC 8641 CTCTACAGCA AGCTCACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC 8701 TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG 8761 GGTAAA B. FVIIIFc de longitud completa (i) Secuencia de ADN del FVIIIFc de longitud completa, (péptido señal del FVIII subrayado, región Fe en negrita) (sec. con núm. de ident : 5 , de codificación de la sec . con núm. de ident : 6) 661 ATG CAAATAGAGC TCTCCACCTG 721 CTTCTTTCTG TGCCTTTTGC GATTCTGCTT TAGTGCCACC AGAAGATACT ACCTGGGTGC 781 AGTGGAACTG TCATGGGACT ATATGCAAAG TGATCTCGGT GAGCTGCCTG TGGACGCAAG 841 ATTTCCTCCT AGAGTGCCAA AATCTTTTCC ATTCAACACC TCAGTCGTGT ACAAAAAGAC 901 TCTGTTTGTA GAATTCACGG ATCACCTTTT CAACATCGCT AAGCCAAGGC CACCCTGGAT 961 GGGTCTGCTA GGTCGTACCA TCCAGGCTGA GGTTTATGAT ACAGTGGTCA TTACACTTAA 1021 GAACATGGCT TCCCATCCTG TCAGTCTTCA TGCTGTTGGT GTATCCTACT GGAAAGCTTC 1081 TGAGGGAGCT GAATATGATG ATCAGACCAG TCAAAGGGAG AAAGAAGATG ATAAAGTCTT 1141 CCCTGGTGGA AGCCATACAT ATGTCTGGCA GGTCCTGAAA GAGAATGGTC CAATGGCCTC 1201 TGACCCACTG TGCCTTACCT ACTCATATCT TTCTCATGTG GACCTGGTAA AAGACTTGAA 1261 TTCAGGCCTC ATTGGAGCCC TACTAGTATG ' TAGAGAAGGG AGTCTGGCCA AGGAAAAGAC 1321 ACAGACCTTG CACAAATTTA TACTACTTTT TGCTGTATTT GATGAAGGGA AAAGTTGGCA 1381 CTCAGAAACA AAGAACTCCT TGATGCAGGA TAGGGATGCT GCATCTGCTC GGGCCTGGCC 1441 TAAAATGCAC ACAGTCAATG GTTATGTAAA CAGGTCTCTG CCAGGTCTGA TTGGATGCCA 1501 CAGGAAATCA GTCTATTGGC ATGTGATTGG AATGGGCACC ACTCCTGAAG TGCACTCAAT 1561 ATTCCTCGAA GGTCACACAT TTCTTGTGAG GAACCATCGC CAGGCGTCCT TGGAAATCTC 1621 GCCAATAACT TTCCTTACTG CTCAAACACT CTTGATGGAC CTTGGACAGT TTCTACTGTT 1681 TTGTCATATC TCTTCCCACC AACATGATGG CATGGAAGCT TATGTCAAAG TAGACAGCTG 1741 TCCAGAGGAA CCCCAACTAC GAATGAAAAA TAATGAAGAA GCGGAAGACT ATGATGATGA 18 01 TCTTACTGAT TCTGAAATGG ATGTGGTCAG GTTTGATGAT GACAACTCTC CTTCCTTTAT 186 1 CCAAATTCGC TCAGTTGCCA AGAAGCATCC TAAAACTTGG GTACATTACA TTGCTGCTGA 192 1 AGAGGAGGAC TGGGACTATG CTCCCTTAGT CCTCGCCCCC GATGACAGAA GTTATAAAAG 1981 TCAATATTTG AACAATGGCC CTCAGCGGAT TGGTAGGAAG TACAAAAAAG TCCGATTTAT 2 041 GGCATACACA GATGAAACCT TTAAGACTCG TGAAGCTATT CAGCATGAAT CAGGAATCTT ' 2 101 GGGACCTTTA CTTTATGGGG AAGTTGGAGA CACACTGTTG ATTATATTTA AGAATCAAGC 2 161 AAGCAGACCA TATAACATCT ACCCTCACGG AATCACTGAT GTCCGTCCTT TGTATTCAAG 222 1 GAGATTACCA AAAGGTGTAA AACATTTGAA GGATTTTCCA ATTCTGCCAG QAGAAATATT 22 81 CAAATATAAA TGGACAGTGA CTGTAGAAGA TGGGCCAACT AAATCAGATC CTCGGTGCCT 234 1 GACCCGCTAT TACTCTAGTT TCGTTAATAT GGAGAGAGAT CTAGCTTCAG GACTCATTGG 24 01 CCCTCTCCTC ATCTGCTACA AAGAAT CTGT AGATCAAAGA GGAAACCAGA TAATGTCAGA 2461 CAAGAGGAAT GTCATCCTGT TTTCTGTATT TGATGAGAAC CGAAGCTGGT ACCTCACAGA 2521 GAATATACAA CGCTTTCTCC CCAATCCAGC TGGAGTGCAG CTTGAGGATC CAGAGTTCCA 2581 AGCCTCCAAC ATCATGCACA GCATCAATGG CTATGTTTTT GATAGTTTGC AGTTGTCAGT 2641 TTGTTTGCAT GAGGTGGCAT ACTGGTACAT TCTAAGCATT GGAGCACAGA CTGACTTCCT 2701 TTCTGTCTTC TTCTCTGGAT ATACCTTCAA ACACAAAATG GTCTATGAAG ACACACTCAC 2761 CCTATTCCCA TTCTCAGGAG AAACTGTCTT CATGTCGATG GAAAACCCAG GTCTATGGAT 2821 TCTGGGGTGC CACAACTCAG ACTTTCGGAA CAGAGGCATG ACCGCCTTAC TGAAGGTTTC 2881 TAGTTGTGAC AAGAACACTG GTGATTATTA CGAGGACAGT TATGAAGATA TTTCAGCATA 2941 CTTGCTGAGT AAAAACAATG CCATTGAACC AAGAAGCTTC TCCCAGAATT CAAGACACCC 3001 TAGCACTAGG CAAAAGCAAT TTAATGCCAC CACAATTCCA GAAAATGACA TAGAGAAGAC 3061 TGACCCTTGG TTTGCACACA GAACACCTAT GCCTAAAATA CAAAATGTCT CCTCTAGTGA 3121 TTTGTTGATG CTCTTGCGAC AGAGTCCTAC TCCACATGGG CTATCCTTAT CTGATCTCCA 3181 AGAAGCCAAA TATGAGACTT TTTCTGATGA TCCATCACCT GGAGCAATAG ACAGTAATAA 3241 CAGCCTGTCT GAAATGACAC ACTTCAGGCC ACAGCTCCAT CACAGTGGGG ACATGGTATT 3301 TACCCCTGAG TCAGGCCTCC AATTAAGATT AAATGAGAAA CTGGGGACAA CTGCAGCAAC 3361 AGAGTTGAAG AAACTTGATT TCAAAGTTTC TAGTACATCA AATAATCTGA TTTCAACAAT 3421 TCCATCAGAC AATTTGGCAG CAGGTACTGA TAATACAAGT TCCTTAGGAC CCCCAAGTAT 3481 GCCAGTTCAT TATGATAGTC AATTAGATAC CACTCTATTT GGCAAAAAGT CATCTCCCCT 3541 TACTGAGTCT GGTGGACCTC TGAGCTTGAG TGAAGAAAAT AATGATTCAA AGTTGTTAGA 3601 ATCAGGTTTA ATGAATAGCC AAGAAAGTTC ATGGGGAAAA AATGTATCGT CAACAGAGAG 3661 TGGTAGGTTA TTTAAAGGGA AAAGAGCTCA TGGACCTGCT TTGTTGACTA AAGATAATGC 3721 CTTATTCAAA GTTAGCATCT CTTTGTTAAA GACAAACAAA ACTTCCAATA ATTCAGCAAC • 3781 TAATAGAAAG ACTCACATTG ATGGCCCATC ATTATTAATT GAGAATAGTC CATCAGTCTG 3841 GCAAAATATA TTAGAAAGTG ACACTGAGTT TAAAAAAGTG ACACCTTTGA TTCATGACAG 3901 AATGCTTATG GACAAAAATG CTACAGCTTT GAGGCTAAAT CATATGTCAA ATAAAACTAC 3961 TTCATCAAAA AACATGGAAA TGGTCCAACA GAAAAAAGAG GGCCCCATTC CACCAGATGC 4021 ACAAAATCCA GATATGTCGT TCTTTAAGAT GCTATTCTTG CCAGAATCAG CAAGGTGGAT 4081 ACAAAGGACT CATGGAAAGA ACTCTCTGAA CTCTGGGCAA GGCCCCAGTC CAAAGCAATT 4141 AGTATCCTTA GGACCAGAAA AATCTGTGGA AGGTCAGAAT TTCTTGTCTG AGAAAAACAA 4201 AGTGGTAGTA GGAAAGGGTG AATTTACAAA GGACGTAGGA CTCAAAGAGA TGGTTTTTCC 4261 AAGCAGCAGA AACCTATTTC TTACTAACTT GGATAATTTA CATGAAAATA ATACACACAA 4321 TCAAGAAAAA AAAATTCAGG AAGAAATAGA AAAGAAGGAA ACATTAATCC AAGAGAATGT 4381 AGTTTTGCCT CAGATACATA CAGTGACTGG CACTAAGAAT TTCATGAAGA ACCTTTTCTT 4441 ACTGAGCACT AGGCAAAATG TAGAAGGTTC ATATGACGGG GCATATGCTC CAGTACTTCA 4501 AGATTTTAGG TCATTAAATG ATTCAACAAA TAGAACAAAG AAACACACAG CTCATTTCTC 4561 AAAAAAAGGG GAGGAAGAAA ACTTGGAAGG CTTGGGAAAT CAAACCAAGC AAATTGTAGA 4621 GAAATATGCA TGCACCACAA GGATATCTCC TAATACAAGC CAGCAGAATT TTGTCACGCA 4681 ACGTAGTAAG AGAGCTTTGA AACAATTCAG ACTCCCACTA GAAGAAACAG AACTTGAAAA 4741 AAGGATAATT GTGGATGACA CCTCAACCCA GTGGTCCAAA AACATGAAAC ATTTGACCCC 4801 GAGCACCCTC ACACAGATAG ACTACAATGA GAAGGAGAAA GGGGCCATTA CTCAGTCTCC 4 861 CTTATCAGAT TGCCTTACGA GGAGT CATAG CATCCCTCAA GCAAATAGAT CTCCATTACC 4 921 CATTGCAAAG GTATCATCAT TTCCATCTAT TAGACCTATA TATCTGACCA GGGTCCTATT 4 981 · CCAAGACAAC TCTTCTCATC TTCCAGCAGC ATCTTATAGA AAGAAAGATT CTGGGGTCCA 504 1 AGAAAGCAGT CATTTCTTAC AAGGAGCCAA AAAAAATAAC CTTTCTTTAG CCATTCTAAC 5101 CTTGGAGATG ACTGGTGATC AAAGAGAGGT TGGCTCCCTG GGGACAAGTG CCACAAATTC 5161 AGTCACATAC AAGAAAGTTG AGAACACTGT TCTCCCGAAA CCAGACTTGC CCAAAACATC 522 1 TGGCAAAGTT GAATTGCTTC CAAAAGTTCA CATTTATCAG AAGGAC CTAT TCCCTACGGA 5281 AACTAGCAAT GGGTCTCCTG GCCATCTGGA TCTCGTGGAA GGGAGCCTTC TTCAGGGAAC 534 1 AGAGGGAGCG ATTAAGTGGA ATGAAGCAAA CAGACCTGGA AAAGTTCCCT TTCTGAGAGT 54 01 AGCAACAGAA AGCTCTGCAA AGACTCCCTC CAAGCTATTG GATCCTCTTG CTTGGGATAA 5461 CCACTATGGT ACTCAGATAC CAAAAGAAGA GTGGAAATCC CAAGAGAAGT CACCAGAAAA 5521 AACAGCTTTT AAGAAAAAGG ATACCATTTT GTCCCTGAAC GCTTGTGAAA GCAATCATGC 5581 AATAGCAGCA ATAAATGAGG GACAAAATAA GCCCGAAATA GAAGTCACCT GGGCAAAGCA 5641 AGGTAGGACT GAAAGGCTGT GCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC ATCAACGGGA 5701 AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GACTATGATG ATACCATATC · 5761 AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGAG GATGAAAATC AGAGCCCCCG 5821 CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC TCTGGGATTA 5881 TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT CAGAGTGGCA GTGTCCCTCA 5941 GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC CCTTATACCG 6001 TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG AAGTTGAAGA 6061 TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC TATTCCTTCT ATTCTAGCCT 6121 TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT TTGTCAAGCC 6181 TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT GCAACATCAT ATGGCACCCA CTAAAGATGA 6241 GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG ATGTGCACTC 6301 AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA CTGAACCCTG CTCATGGGAG 6361 ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC TTTGATGAGA CCAAAAGCTG 6421 GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC AGATGGAAGA 6481 TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA TGGATACACT 6541 ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA GCATGGGCAG 6601 CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC GAAAAAAAGA 6661 GGAGTATAAA ATGGCACTGT ACAATCTCTA TCCAGGTGTT TTTGAGACAG TGGAAATGTT 6721 ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGA ATGCCTTATT GGCGAGCATC TACATGCTGG 6781 GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG GAATGGCTTC 6841 TGGACACATT AGAGATTTTC AGATTACAGC TTCAGGACAA TATGGACAGT GGGCCCCAAA 6901 GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG AGCACCAAGG AGCCCTTTTC 6961 TTGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC GGCATCAAGA CCCAGGGTGC 7021 CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC ATCATGTATA GTCTTGATGG 7081 GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC- CACTGGAACC TTAATGGTCT TCTTTGGCAA 7141 TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAACCCT CCAATTATTG CTCGATACAT 7201 CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT CGCATGGAGT TGATGGGCTG 7261 TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT CAGATGCACA 7321 GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT CAAAAGCTCG 7381 ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG GTGAATAATC CAAAAGAGTG 7441 GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA GTAACTACTC AGGGAGTAAA 7501 ATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC TCCAGCAGTC AAGATGGCCA 7561 TCAGTGGACT CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA ATCAAGACTC 7621 CTTCACACCT GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG ACTCGCTACC TTCGAATTCA 7681 . CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG GTTCTGGGCT GCGAGGCACA 7741 GGACCTCTAC GACAAAACTC ACACATGCCC ACCGTGCCCA GCTCCAGAAC TCCTGGGCGG 7801 ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC CTCATGATCT CCCGGACCCC 7861 TGAGGTCACA TGCGTGGTGG TGGACGTGAG CCACGAAGAC CCTGAGGTCA AGTTCAACTG 7921 GTACGTGGAC GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTACAA 7981 CAGCACGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC TGAATGGCAA 8041 GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGC CCTCCCAGCC CCCATCGAGA AAACCATCTC 8101 CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCGGGATGA 8161 GCTGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTATC CCAGCGACAT 8221 CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT 8281 GTTGGACTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG 8341 GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA ACCACTACAC 8401 GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA A (ii) Fe (misma secuencia que A (ii) (sec. con núm. de ident : 3 ) ) ] c . (i) Secuencia de ADN de la cadena pesada (HC) -Fe (sin enlazador entre HC y Fe) (péptido señal subrayado, región Fe en negrita) (sec. con núm. de ident: 7, de codificación de la sec. con núm. de ident: 8) ATGCAAATA ftGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG CTTTAGTGCC ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGG ACTATATGCA AAGTGATCTC GGTGAGCTGC CTGTGGACGC AAGATTTCCT CCTAGAGTGC CAAAATCTTT TCCATTCAAC ACCTCAGTCG TGTACAAAAA GACTCTGTTT GTAGAATTCA CGGATCACCT TTTCAACATC GCTAAGCCAA GGCCACCCTG GATGGGTCTG CTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGAGGTTTAT GATACAGTGG TCATTACACT TAAGAACATG GCTTCCCATC CTGTCAGTCT TCATGCTGTT GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATG ATGATCAGAC CAGTCAAAGG GAGAAAGAAG ATGATAAAGT CTTCCCTGGT GGAAGCCATA CATATGTCTG GCAGGTCCTG AAAGAGAATG GTCCAATGGC CTCTGACCCA CTGTGCCTTA CCTACTCATA TCTTTCTCAT GTGGACCTGG TAAAAGACTT GAATTCAGGC CTCATTGGAG CCCTACTAGT ATGTAGAGAA GGGAGTCTGG CCAAGGAAAA GACACAGACC TTGCACAAAT TTATACTACT TTTTGCTGTA TTTGATGAAG GGAAAAGTTG GCACTCAGAA ACAAAGAACT CCTTGATGCA GGATAGGGAT GCTGCATCTG CTCGGGCCTG GCCTAAAATG CACACAGTCA ATGGTTATGT AAACAGGTCT CTGCCAGGTC TGATTGGATG CCACAGGAAA TCAGTCTATT GGCATGTGAT TGGAATGGGC ACCACTCCTG AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGTCACA CATTTCTTGT GAGGAACCAT CGCCAGGCGT CCTTGGAAAT CTCGCCAATA ACTTTCCTTA CTGCTCAAAC ACTCTTGATG GACCTTGGAC AGTTTCTACT GTTTTGTCAT ATCTCTTCCC ACCAACATGA TGGCATGGAA GCTTATGTCA AAGTAGACAG CTGTCCAGAG GAACCCCAAC TACGAATGAA AAATAATGAA GAAGCGGAAG ACTATGATGA TGATCTTACT GATTCTGAAA TGGATGTGGT CAGGTTTGAT GATGACAACT CTCCTTCCTT TATCCAAATT CGCTCAGTTG CCAAGAAGCA TCCTAAAACT TGGGTACATT ACATTGCTGC TGAAGAGGAG GACTGGGACT ATGCTCCCTT AGTCCTCGCC CCCGATGACA GAAGTTATAA AAGTCAATAT TTGAACAATG GCCCTCAGCG GATTGGTAGG AAGTACAAAA AAGTCCGATT TATGGCATAC ACAGATGAAA CCTTTAAGAC TCGTGAAGCT ATTCAGCATG AATCAGGAAT CTTGGGACCT TTACTTTATG GGGAAGTTGG AGACACACTG 2 61GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCG CGGGAGGAGC AGTACAACAG CACGTACCGT 2521GTGGTCAGCG TCCTCACCGT CCTGCACCAG GACTGGCTGA ATGGCAAGGA GTACAAGTGC 2581AAGGTCTCCA ACAAAGCCCT CCCAGCCCCC ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AGCCAAAGGG 2641CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG CCCCCATCCC GGGATGAGCT GACCAAGAAC 2701CAGGTCAGCC TGACCTGCCT GGTCAAAGGC TTCTATCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG 2761GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCAGGC CTCCCGTGTT GGACTCCGAC 2821GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC 2881GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC 2941TCCCTGTCTC CGGGTAAA (ii) Secuencia de ADN de la cadena pesada (HC) -Fe (enlazador de 5 aminoácidos entre HC y Fe) (péptido señal subrayado, región Fe en negrita, enlazador de 5 aminoácidos con doble subrayado) (sec. con núm. de ident : 9, de codificación de la sec. con núm. de ident : 10) 1 ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG CTTTAGTGCC 61 ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGG ACTATATGCA AAGTGATCTC 121 GGTGAGCTGC CTGTGGACGC AAGATTTCCT CCTAGAGTGC CAAAATCTTT TCCATTCAAC 181 ACCTCAGTCG TGTACAAAAA GACTCTGTTT GTAGAATTCA CGGATCACCT TTTCAACATC 2 1 GCTAAGCCAA GGCCACCCTG GATGGGTCTG CTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGÁGGTTTAT 3 01 GATACAGTGG TCATTACACT TAAGAACATG ' GCTTCCCATC CTGTCAGTCT TCATGCTGTT 3 61 GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATG ATGATCAGAC CAGTCAAAGG 421 GAGAAAGAAG ATGATAAAGT CTTCCCTGGT GGAAGCCATA CATATGTCTG GCAGGTCCTG 4 81 AAAGAGAATG GTCCAATGGC CTCTGACCCA CTGTGCCTTA CCTACTCATA TCTTTCTCAT 54 1 GTGGACCTGG TAAAAGACTT GAATTCAGGC CTCATTGGAG CCCTACTAGT ATGTAGAGAA 6 01 GGGAGTCTGG CCAAGGAAAA GACACAGACC TTGCACAAAT TTATACTACT TTTTGCTGTA 66 1 TTTGATGAAG GGAAAAGTTG GCACTCAGAA ACAAAGAACT CCTTGATGCA GGATAGGGAT 72 1 GCTGCATCTG CTCGGGCCTG GCCTAAAATG CACACAGTCA ATGGTTATGT AAACAGGTCT 781 CTGCCAGGTC TGATTGGATG CCACAGGAAA · TCAGTCTATT GGCATGTGAT TGGAATGGGC 84 1 ACCACTCCTG AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGT CACA CATTTCTTGT GAGGAAC C AT 901 CGCCAGGCGT CCTTGGAAAT CTCGCCAATA ACTTTCCTTA CTGCTCAAAC ACTCTTGATG 961 GACCTTGGAC AGTTTCTACT GTTTTGTCAT ATCTCTTCCC ACCAACATGA TGGCATGGAA 1021GCTTATGTCA AAGTAGACAG CTGTCCAGAG GAACCCCAAC TACGAATGAA AAATAATGAA 1081GAAGCGGAAG ACTATGATGA TGATCTTACT GATTCTGAAA TGGATGTGGT CAGGTTTGAT 1141GATGACAACT CTCCTTCCTT TATCCAAATT CGCTCAGTTG CCAAGAAGCA TCCTAAAACT 1201TGGGTACATT ACATTGCTGC TGAAGAGGAG GACTGGGACT ATGCTCCCTT AGTCCTCGCC 1261CCCGATGACA GAAGTTATAA AAGTCAATAT TTGAACAATG GCCCTCAGCG GATTGGTAGG 1321AAGTAC AAA AAGTCCGATT TATGGCATAC ACAGATGAAA CCTTTAAGAC TCGTGAAGCT 1381ATTCAGCATG AATCAGGAAT CTTGGGACCT TTACTTTATG GGGAAGTTGG AGACACACTG 1441 TGATTATAT TTAAGAATCA AGCAAGCAGA CCATATAACA TCTACCCTCA CGGAATCACT 1501GATGTCCGTC CTTTGTATTC AAGGAGATTA CCAAAAGGTG TAAAACATTT GAAGGATTTT 1561CCAATTCTGC CAGGAGAAAT ATTCAAATAT AAATGGACAG TGACTGTAGA AGATGGGCCA 1621ACTAAATCAG ATCCTCGGTG CCTGACCCGC TATTACTCTA GTTTCGTTAA TATGGAGAGA 1681GATCTAGCTT CAGGACTCAT TGGCCCTCTC CTCATCTGCT ACAAAGAATC TGTAGATCAA 1741AGAGGAAACC AGATAATGTC AGACAAGAGG AATGTCATCC TGTTTTCTGT ATTTGATGAG 1801AACCGAAGCT GGTACCTCAC AGAGAATATA CAACGCTTTC TCCCCAATCC AGCTGGAGTG 1861CAGCTTGAGG ATCCAGAGTT CCAAGCCTCC AACATCATGC ACAGCATCAA TGGCTATGTT 1921TTTGATAGTT TGCAGTTGTC AGTTTGTTTG CATGAGGTGG CATACTGGTA CATTCTAAGC 1981 TTGGAGCAC AGACTGACTT CCTTTCTGTC TTCTTCTCTG GATATACCTT CAAACACAAA 2041ATGGTCTATG AAGACACACT CACCCTATTC CCATTCTCAG GAGAAACTGT CTTCATGTCG 2101ATGGAAAACC CAGGTCTATG GATTCTGGGG TGCCACAACT CAGACTTTCG GAACAGAGGC 2161ATGACCGCCT TACTGAAGGT TTCTAGTTGT GACAAGAACA CTGGTGATTA TTACGAGGAC 2221AGTTATGAAG ATATTTCAGC ATACTTGCTG AGTAAAAACA ATGCCATTGA ACCAAGAAGC 2281TTCTCCCAGA ATGACAAAAC TCACACATGC CCACCGTGCC CAGCTCCAGA ACTCCTGGGC 2341GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC 2401CCTGAGGTCA CATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC 2461 GGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC 2521AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG GCTGAATGGC 2581AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC 2641TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAT 2701GAGCTGACCA AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC 2761ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC 2821GTGTTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG 2881TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC 2941ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAA (iii) Secuencia de ADN de cadena ligera (LC) -Fe (péptido señal subrayado, región Fe en negrita) (sec. con núm. de ident : 11, de codificación de la sec . con núm. de ident: 12) 1 ATGGAGACAG ACACACTCCT GCTATGGGTA CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG TTCCACTGGT 61 GAAATAACTC GTACTACTCT TCAGTCAGAT CAAGAGGAAA TTGACTATGA TGATACCATA 121 TCAGTTGAAA TGAAGAAGGA AGATTTTGAC ATTTATGATG AGGATGAAAA TCAGAGCCCC 181 CGCAGCTTTC AAAAGAAAAC ACGACACTAT TTTATTGCTG CAGTGGAGAG GCTCTGGGAT 241 TATGGGATGA GTAGCTCCCC ACATGTTCTA - AGAAACAGGG CTCAGAGTGG CAGTGTCCCT 301 CAGTTCAAGA AAGTTGTTTT CCAGGAATTT ACTGATGGCT CCTTTACTCA GCCCTTATAC 361 CGTGGAGAAC TAAATGAACA TTTGGGACTC CTGGGGCCAT ATATAAGAGC AGAAGTTGAA 421 GATAATATCA TGGTAACTTT CAGAAATCAG GCCTCTCGTC CCTATTCCTT CTATTCTAGC 481 CTTATTTCTT ATGAGGAAGA TCAGAGGCAA GGAGCAGAAC CTAGAAAAAA CTTTGTCAAG 541 CCTAATGAAA CCAAAACTTA CTTTTGGAAA GTGCAACATC ATATGGCACC CACTAAAGAT 601 GAGTTTGACT GCAAAGCCTG GGCTTATTTC TCTGATGTTG ACCTGGAAAA AGATGTGCAC 661 TCAGGCCTGA TTGGACCCCT TCTGGTCTGC CACACTAACA CACTGAACCC TGCTCATGGG 721 AGACAAGTGA CAGTACAGGA ATTTGCTCTG TTTTTCACCA TCTTTGATGA GACCAAAAGC 781 TGGTACTTCA CTGAAAATAT GGAAAGAAAC TGCAGGGCTC CCTGCAATAT CCAGATGGAA 841 GATCCCACTT TTAAAGAGAA TTATCGCTTC CATGCAATCA ATGGCTACAT AATGGATACA 901 CTACCTGGCT TAGTAATGGC TCAGGATCAA AGGATTCGAT GGTATCTGCT CAGCATGGGC 961 AGCAATGAAA ACATCCATTC TATTCATTTC AGTGGACATG TGTTCACTGT ACGAAAAAAA 1021GAGGAGTATA AAATGGCACT GTACAATCTC TATCCAGGTG TTTTTGAGAC AGTGGAAATG 1081TTACCATCCA AAGCTGGAAT TTGGCGGGTG GAATGCCTTA TTGGCGAGCA TCTACATGCT 1141GGGATGAGCA CACTTTTTCT GGTGTACAGC AATAAGTGTC AGACTCCCCT GGGAATGGCT 1201TCTGGACACA TTAGAGATTT TCAGATTACA GCTTCAGGAC AATATGGACA GTGGGCCCCA G261AAGCTGGCCA GACTTCATTA TTCCGGATCA ATCAATGCCT GGAGCACCAA GGAGCCCTTT 1321TCTTGGATCA AGGTGGATCT GTTGGCACCA ATGATTATTC ACGGCATCAA GACCCAGGGT 1381GCCCGTCAGA AGTTCTCCAG CCTCTACATC TCTCAGTTTA TCATCATGTA TAGTCTTGAT 1441GGGAAGAAGT GGCAGACTTA TCGAGGAAAT TCCACTGGAA CCTTAATGGT CTTCTTTGGC 1501AATGTGGATT CATCTGGGAT AAAACACAAT ATTTTTAACC CTCCAATTAT TGCTCGATAC 1561ATCCGTTTGC ACCCAACTCA TTATAGCATT CGCAGCACTC TTCGCATGGA GTTGATGGGC 1621TGTGATTTAA ATAGTTGCAG CATGCCATTG GGAATGGAGA GTAAAGCAAT ATCAGATGCA 1681CAGATTACTG CTTCATCCTA CTTTACCAAT ATGTTTGCCA CCTGGTCTCC TTCAAAAGCT 1741CGACTTCACC TCCAAGGGAG GAGTAATGCC TGGAGACCTC AGGTGAATAA TCCAAAAGAG 1801TGGCTGCAAG TGGACTTCCA GAAGACAATG AAAGTCACAG GAGTAACTAC TCAGGGAGTA 1861AAATCTCTGC TTACCAGCAT GTATGTGAAG . GAGTTCCTCA TCTCCAGCAG TCAAGATGGC 1921CATCAGTGGA CTCTCTTTTT TCAGAATGGC AAAGTAAAGG TTTTTCAGGG AAATCAAGAC 1981TCCTTCACAC CTGTGGTGAA CTCTCTAGAC CCACCGTTAC TGACTCGCTA CCTTCGAATT 2041CACCCCCAGA GTTGGGTGCA CCAGATTGCC CTGAGGATGG AGGTTCTGGG CTGCGAGGCA 2101CAGGACCTCT ACGACAAAAC TCACACATGC CCACCGTGCC CAGCTCCAGA ACTCCTGGGC 2161GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC 2221CCTGAGGTCA CATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGÁGGT CAAGTTCAAC 2281TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC 2341AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG GCTGAATGGC 2401AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC 2461TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAT 2521GAGCTGACCA AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC 2581ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC 26 1GTGTTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG 2701TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC 2761ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAA Tabla 2: Secuencias polipeptídicas A. Híbrido de monómero del FVIII con el dominio B suprimido- Fe (BDD FVIIIFc monómero dímero) : que se creó por coexpresión de las cadenas de BDD FVIIIFc y Fe .
Construcción - fusión HC-LC-Fc. Un cásete de expresión de Fe se cotransfecta con BDD FVIII-Fc para generar el monómero BDD FVIIIFc. Para la cadena de FVIIIFc BDD, la secuencia de Fe se muestra en negrita; la secuencia de HC se muestra en doble subrayado; la secuencia restante del dominio B se muestra en cursiva. Los péptidos señales están subrayados . o i) Cadena del FVIII con el dominio B suprimido-Fc (secuencia señal de 19 aminoácidos subrayada) (sec. con núm. de ident : 2) MQIELSTCFFLCLLRFCFS ATRRYYLGAVELS DYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFT DHLFNIAKPRPP MGLLGPTIQAEVYDTWITLK MASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDD QTSOREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKEMGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALL VCREGSLAKEKTOTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETK SLMODRDAASARAWPKMHTV GYV NRSLPGLIGCHRKSVY HVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVR HROASLEISPITFLTAQTL LMDLGOFLLFCHISSHOHDGMEAYVKVDSCPEEPOLRMK NEEAEDYDDDLTDSEMDWRF DDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSOYLNNGPQRIGR KYKKVRFMAYTDETFKTREAIOHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFK QASRPYNIYPHGITD VRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDL ASGLIG'PLLICYKESVDQRGNQIMSDKR VILFSVFDENRS YLTENIQRFLPNPAGVOLE DPEFQASNI HSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYE DTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDI SAYLLSKIMAIEVRSFSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYD EDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERL DYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGS FTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFR QASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPR KNFVKPNETKTYF KVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLN PAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTEN ERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYI MDTLPGLVMAQDQRIR YLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETV EMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWA PKLARLHYSGSINA STKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFI IMYSLD GKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPI IARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGC DLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNA RPQV NPKEWL QVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKYFQGNQDSFT PWNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALR EVLGCEAQDLYDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF WYVDGVEVH AKTKPREEQYNSTYR WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQG VF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ii) Cadena Fe (péptido señal heterólogo de 20 aminoácidos de la cadena Igi de ratón subrayado) (sec. con núm. de ident: 4) METDTLLLWVLLLWVPGSTG DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF N YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK B. Híbrido de monómeros del FVIIIFc de longitud completa (dimero de monomero FVIIIFc de longitud completa) : que se creó por la coexpresion de las cadenas de FVIIIFc y Fe.
Construcción = fusión de HC-B-LC-Fc. Un cásete de expresión de Fe se cotransfecta con el FVIII-Fc de longitud completa para generar el monómero de longitud completa FVIIIFc. Para la cadena FVIIIFc, la secuencia de Fe se muestra en negrita; secuencia de HC se muestra en doble subrayado; la secuencia del dominio B se muestra en cursiva.
Los péptidos señales están subrayados. i) Cadena de FVIIIFc de longitud completa (péptido señal de FVIII subrayado (sec. con núm. de ident : 6) MQIELSTCFFLCLLRFCFS ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFT DHLFNIAKPRPP MGLLGPTIQAEVYDTWITLK MASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDD OTSOREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGP ASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALL VCREGSLAKEKTOTLHKFILLFAVFDEGKS HSETK SLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYV NRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVR HRQASLEISPITFLTAQTL LMDLGOFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPOLRMKN EEAEDYDDDLTDSE DWRF DDDNSPSFIQIRSVAKKHP TWVHYIAAEEED DYAPLVLAPDDRSYKSQYLNMGPQ IGR KYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFK OASRPYNIYPHGITD VRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYK TVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDL ASGLIGPLLICYKESVDORGNQIMSDKR VILFSVFDENRS YLTENIQRFLPNPAGVOLE DPEFOASNIMHSINGYVFDSLOLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYE DTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFR RGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDI SAYhhSYNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSS SDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMV FTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSM PVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESG RLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQN ILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNP DMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVWG KGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENWLPQI HTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEE NLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDT STQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFP SIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQRE VGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLD LVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEW KSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPP VLK HQJ5EITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDÍYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAA VERLWDYGMSSSPHVLR RAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYI RAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMA PTKDEFDCKA AYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDE TKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLV AQDQRIR YLLS MGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLH AGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPF S IKVDLLAPM11HGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGN VDSSGIKHNIFNPPI IARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQI TASSYFTNMFAT SPSKARLHLQGRSNAWRPQWNPKE LQVDFQKT KVTGVTTQGVKSL LTS YVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKYKVFQGNQDSFTPW SLDPPLLTRYLRIHPQS VHQIALRMEVLGCEAQDLYDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VWDVSHEDPEVKF YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPEN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH HYTQKSLSLS PGK ii) Cadena Fe (péptido señal heterólogo de 20 aminoácidos de la cadena Igic de ratón subrayado) (sec. con núm. de ident : 4) METDTLLL VLLLWVPGSTG DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF N YVDGVEVHNAKTKPREEQY STYRWSVLTVLHQD LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK C. Híbrido de heterodimero FVIII-Fc Esto se hace por la cotransfección de HC-Fc y las construcciones LC-Fc. Se hicieron dos construccións de HC-Fc. Una no tiene enlazador entre HC y Fe (HC-Fc) , mientras que la otra tiene un enlazador de 5 aminoácidos entre HC y Fe (HC +5- Fe) . El péptido señal de FVIII se usó para las construcciones de HC-Fc, mientras que la secuencia de señal de la IgK de ratón se usó para la construcción LC-Fc. (i) HC-Fc (la secuencia de Fe se muestra en negrita, el péptido señal subrayado) (sec. con núm. de ident: 8) MQIELSTCFFLCLLRFCFS ATRRYYLGAVELS DYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFT DHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTWITLK MASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDD QTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALL VCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARA PKMHTVNGYV NRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVR HRQASLEISPITFLTAQTL LMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKN EEAEDYDDDLTDSEMDWRF DDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEED DYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGR KYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFK QASRPYNIYPHGITD VRPLYSRRLP GVKHLKDFPILPGErFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFV MERDL ASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRS YLTENIQRFLPNPAGVQLE DPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYE DTLTLFPFSGETVFMSMENPGL ILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDK TGDYYEDSYEDI SAYLLSK AIEPRDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL ISRTPEVTCVWDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (ii) HC+5- Fe (la secuencia de Fe se muestra en . negrita, la secuencia del enlazador de 5 aminoácidos (del dominio B de FVIII) se muestra en cursiva, el péptido señal subrayado.) (sec. con núm.. de ident . :10) MQIELSTCFFLCLLRFCFS ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFT DHLFNIAKPRPP MGLLGPTIQAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDD QTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALL VCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETK SLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYV NRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTL LMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDWRF DDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLN GPQRIGR KYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFK QASRPYNIYPHGITD VRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDL ASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLE DPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYE DTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRG TALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDI SAYLLSK NAIEPRSFSQM3KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL ISRTPEVTCV WDVSHEDPEVKFN YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQD LNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK (iii) LC-Fc6His (la secuencia de Fe se muestra en negrita, el péptido señal subrayado.) (sec. con núm. de ident . : 12) METDTLLL VLLLWVPGSTG EITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAV ERLWDYGMSSSPHVLR RAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIR AEVEDNIMVTFR QASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRK FVKPNETKTYFWKVQHHMAP TKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDET KS YFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSM GSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHA GMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQ APKLARLHYSGSINAWSTKEPFS WIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKK QTYRGNSTGTLMVFFG V DSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLR ELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQIT ASSYFTNMFATWSPS ARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTM VTGVTTQGVKSLL TSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPWNSLDPPLLTRYLRIHPQSW VHQIALRMEVLGCEAQDLYDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV WDVSHEDPEVKF WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQD LNGKEYKCKV SN ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN G2PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ Tabla 3 Determinación del tiempo de coagulación de la sangre total (WBCT) en los ratones con hemofilia A después de una dosis intravenosa única de 50 Ul/kg del rFVIIIFc o el ReFacto® .
ND = No determinaddo ya que el punto de tiempo previo fue >60 min B.
ND = No determinaddo ya que el punto de tiempo previo fue >60 min Tabla 4 Parámetros de PK después de una dosis única por vía intravenosa en ratones con hemofilia A (50 Ul/kg) Tabla 5 Parámetros farmacocinéticos después de una dosis única por vía intravenosa en perros con hemofilia A (125 Ul/kg del rFVIIIFc, 114 y 120 Ul/kg del eFacto®) determinada a partir de los datos de actividad cromogénica B. PK determinada a partir de los datos de ELISA Promedio + sd, n = 4 para el rFVIIIFc, n = 2 para el ReFacto® *sd no reportado para el ReFacto® porque hubo solamente dos perros Tabla 6 La actividad de coagulación medida por aPTT en perros con hemofilia A después de una dosis única por vía intravenosa con el rFVIIIFc o el ReFacto®.
Tabla 7 Concentración plasmática del rFVIIIFc o Xyntha en monos administrados con una sola dosis intravenosa de 125 Ul/kg medida por ELISA.
A. Concentración en plasma del rFVIIIFc ^g/ml) Tabla 8 Concentración plasmática del rFVIIIFc o Xyntha en monos que recibieron una dosis intravenosa única de 125 Ul/kg medida por el ensayo cromogénico de actividad específica del FVIII (informado en Ul/ml) .
A . Xyntha BLQ = por debajo del límite de cuantif icación Tabla 9 Parámetros PK del rFVIIIFc después de una dosis Tabla 10 Parámetros PK de Xyntha después de una dosis única IV (125 Ul/kg) Tabla 11 Activación del factor X TABLA 12 Interacción con el factor IXa Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (46)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un método para disminuir la incidencia de un episodio de sangrado en un sujeto humano, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una dosis terapéutica de un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido del Factor VIII de acción prolongada en un intervalo de dosificación; en donde la dosis terapéutica es de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 90 IU/kg; en donde el intervalo de dosificación es cada 72 horas o más .
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sujeto tiene hemofilia A.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la disminución de la incidencia de un episodio de sangrado previene o trata los episodios de sangrado .
4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la administración es para profilaxis de rutina.
5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque · la administración es para un tratamiento a-demanda.
6. El' método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la administración es para profilaxis adaptada.
7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque a través del nivel del Factor VIII :C de plasma en el sujeto es mantenido por encima de 1 IU/dl.
8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la dosis terapéutica es 20-30 IU/kg, 30-40 IU/kg, 40-50 IU/kg, 50-60 IU/kg, 60-70 IU/kg, 70-80 IU/kg, u 80-90 IU/kg.
9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la dosis terapéutica es 20 IU/kg, 25 IU/kg, 30 IU/kg, 35 IU/kg, 40 IU/kg, 45 IU/kg, 50 IU/kg, 55 IU/kg, 60 IU/kg, 65 IU/kg, 70 IU/kg, 75 IU/kg, 80 IU/kg, 85 IU/kg, o 90 IU/kg.
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1· a 9, caracterizado- porque el intervalo de dosificación es de aproximadamente una vez cada 72 horas o • más .
11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el intervalo de dosificación es de aproximadamente una vez cada 72 horas, aproximadamente una vez cada cinco días, aproximadamente una vez cada seis días, o aproximadamente una vez cada siete días.
12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el intervalo de dosificación es de aproximadamente una vez cada cinco días o más .
13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el intervalo de dosificación es de aproximadamente dos veces a la semana.
14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la dosis terapéutica es de aproximadamente 65 IU/kg a aproximadamente 90 IU/kg.
15. El método de .conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el intervalo de ¦ dosificación es de aproximadamente cada siete días o más.
16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende administrar al sujeto dos veces por semana, una primera dosis terapéutica de aproximadamente 20IU/kg a aproximadamente 65 IU/kg de la proteina quimérica y una segunda dosis terapéutica de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 65 IU/kg de la proteina quimérica.
17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el intervalo de dosificación entre la primera dosis y la segunda dosis es de aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas o aproximadamente cinco días.
18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque la administración resuelve mas de 5-20%, mas que 5-15%, más que 5-10%, más que 10-20%, o más que 10-15% de episodios de sangrado .
19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la administración resuelve mas de 80-100%, mas que 80-90%, más que 85-90%, más que 90-100%, más que 90-95% o más que 95-100% de episodios de sangrado.
20. Un método para mantener la homeostasis en un sujeto humano en necesidad de una cirugía, caracterizado porque comprende administrár al sujeto una dosis terapéutica de un polipéptido quimérico que comprende una porción del Factor Vil y una segunda porción en un intervalo de dosificación, en donde la dosis terapéutica es de aproximadamente 20 IU/kg, y en donde el intervalo de dosificación es cada 12 a 72 horas.
21. El método de conformidad con de la reivindicación 20, caracterizado porque a través del nivel del Factor VIII :C de plasma en el paciente es mantenido por encima de 3 IU/dl.
22. El método de conformidad con la reivindicación 20 o 21, caracterizado porque la administración previene un episodio de sangrado en el paciente.
23; El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el episodio de sangrado es espontaneo.
24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque el sujeto está en necesidad de profilaxis quirúrgica, manejo perioperativo o tratamiento por cirugía.
25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, caracterizado porque la cirugía es cirugía menor, cirugía mayor, extracción dental, amigdalectomía, herniotomía inguinal, sinovectomía, remplazo total de. rodilla, craneotomía, osteosíntesis, cirugía por trauma, cirugía intracraneal, cirugía intra-abdominal, cirugía intratorácica , o cirugía de remplazo articular.
26. El método de conformidad con cualquiera de las ¦ reivindicaciones 20 a 25, caracterizado porque la cirugía es una cirugía de emergencia.
27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizado porque la depuración media (CL) (actividad) en el sujeto es de aproximadamente 2.33 ± 1.08 ml/hora/kg o menos.
28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, caracterizado porque el tiempo medio de permanencia ( RT) (actividad) en el sujeto es de aproximadamente 1.5 veces mayor que el MRT medio de un polipéptido que consiste de la porción del Factor VIII.
29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, caracterizado porque MRT es de aproximadamente 14 a 41.3 horas.
30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado porque un¦ Tl/2 (actividad) en el sujeto es de aproximadamente 1.5 veces mayor que el Tl/2 medio (actividad) de un polipéptido que consiste de la porción del Factor VIII.
31. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado porque un Tl/2 (actividad) es de aproximadamente 11 a 26.4 horas.
32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, caracterizado porque una recuperación media incremental (valor K) en un sujeto es de aproximadamente 90 % de la recuperación media incremental de un polipéptido que consiste de la porción del Factor VIII.
33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, caracterizado porque una recuperación media incremental (valor K) en un sujeto es de aproximadamente 1.38 a 2.88 Ul/dl por Ul/kg.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la recuperación media incremental (valor K) en el sujeto es de aproximadamente 70% a aproximadamente 125% de la recuperación media incremental de un polipéptido que consiste de la porción del Factor VIII.
35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, caracterizado porque un Vss medio (actividad) en el sujeto es de aproximadamente 37.7 a 79.9 ml/kg .
36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, caracterizado porque una AUC/dosis media (actividad) en el sujeto es de aproximadamente 19.2*h/dl por Ul/kg a 81.7 UI*h/dl por Ul/kg.
37. El método ' de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, caracterizado porque el polipéptido del Factor VIII de acción prolongada es el Factor III pegilado .
38. El método de conformidad cón cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, caracterizado porque el polipéptido del Factor VIII de acción prolongada es un polipéptido quimérico que comprende una porción del Factor III y una segunda porción.
39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la segunda porción es una porción Fe o una porción de albúmina.
40. El método de conformidad con la reivindicación 38 39, caracterizado porque el polímero quimérico es un híbrido monómero dímero del FVIIIFc.
41. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37 a 40, caracterizado porque la porción del Factor VIII comprende el Factor VIII de longitud completa, el Factor VIII maduro o el Factor VIII con una supresión total o parcial del dominio B.
42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la porción FVIII comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% o 95% idéntica a los aminoácidos 1 a 1438 de la SEQ ID NO: 2 [[dominio B suprimido FVIIIFc]] o aminoácidos 1 a 2332 de la SEQ ID NO: 6 [[FVIIIFc longitud completa] ] .
43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la porción FVIII comprende los aminoácidos 1 a 1438 de la SEQ ID NO: 2 [ [dominio B suprimido FVIIIFc]] o a los aminoácidos 1 a 2332 de la SEQ ID NO: 6 [[FVIIIFc longitud completa]] .
44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37 a 43, caracterizado porque la segunda porción del polipéptido quimérico comprende una región Fe la cual es al menos 90% o 95% idéntica a los aminoácidos 1439 a 1665 de la SEQ ID NO: 2 o a los aminoácidos 2333 a 2559 de la SEQ ID NO: 6.
45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la segunda porción comprende los aminoácidos 1439 a 1665 de la SEQ ID NO: 2 o a los aminoácidos 2333 a 2559 de la SEQ ID NO: 6.
46. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 45, caracterizado porque el polipéptido FVII de acción prolongada es administrado como parte de una composición farmacéutica que comprende al menos un excipiente .
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