JP2022051964A - 第VIII-Fc因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法 - Google Patents
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Abstract
Description
et al. 2006)。この疾患は、特発性出血や外傷後の過剰な出血により特徴付けられる。長い期間にわたり、筋肉や関節中に繰り返し出血し(幼少期に始まることが多い)、その結果、血友病性関節症や不可逆的な関節損傷が起こる。この損傷は進行性であり、関節の可動性が非常に限定されたり、筋萎縮症や慢性痛が起こったりする可能性がある(非特許文献1(その全体として参照により本明細書中に組み込まれる))。
本実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
第VIII因子の投与を必要とする被験体への第VIII因子の投与方法であって、前記第VIII因子部分からなる等価量のポリペプチドに必要とされる用量投与間隔より少なくとも約1.5倍長い用量投与間隔で、第VIII因子部分および第二部分を含む治療的用量のキメラポリペプチドを前記被験体に投与することを包含する方法。
(項目2)
前記キメラポリペプチドがFc部分を含む項目1記載の方法。
(項目3)
前記用量投与間隔が、前記第VIII因子部分からなる等価量のポリペプチドに必要とされる用量投与間隔より、少なくとも約1.5~6倍、1.5~5倍、1.5~4倍、1.5~3倍または1.5~2倍長い項目1または2記載の方法。
(項目4)
前記用量投与間隔が、前記第VIII因子部分からなる等価量のポリペプチドに必要とされる用量投与間隔より、少なくとも約1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5または6倍長い項目3記載の方法。
(項目5)
前記キメラポリペプチドの前記用量投与間隔が、約5、6、7、8、9、10、11、12、13または14日毎またはそれ以上の間隔である項目1~4のいずれかに記載の方法。
(項目6)
前記被験体が予防的処置を必要としている項目1~5のいずれかに記載の方法。
(項目7)
前記被験体がオンデマンド処置を必要としている項目1~4のいずれかに記載の方法。(項目8)
前記被験体が出血症状出現に対する処置を必要としている項目7記載の方法。
(項目9)
前記被験体が、関節出血症、筋肉出血、口腔出血(oral bleed)、出血、筋肉への出血、口腔出血(oral hemorrhage)、外傷、頭部外傷、消化器出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙における出血、腹膜後隙における出血、あるいは腸腰筋鞘における出血に関する処置を必要としている項目8記載の方法。
(項目10)
前記被験体が、外科的予防、手術中管理または外科手術に関する処置を必要としている項目7記載の方法。
(項目11)
前記外科手術が、小手術、大手術、抜歯術、扁桃摘出術、鼠径ヘルニア切除術、滑膜切除術、人工膝関節全置換術、開頭術、骨接合術、外傷手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術または関節置換術である項目10記載の方法。
(項目12)
前記キメラポリペプチドの前記用量投与間隔が、24~36、24~48、24~72、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71または72時間あるいはそれより長い時間毎に約1回である項目7~11のいずれかに記載の方法。
(項目13)
前記治療的用量が10~100 IU/kgである項目1~12のいずれかに記載の方法。
(項目14)
前記治療的用量が10~20、20~30、30~40、40~50、50~60、60~70、70~80、80~90または90~100 IU/kgである項目12記載の方法。
(項目15)
前記治療的用量が10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100 IU/kgである項目13記載の方法。
(項目16)
前記被験体がヒトである項目1~15のいずれかに記載の方法。
(項目17)
前記第VIII因子がヒト第VIII因子である項目1~16のいずれかに記載の方法。
(項目18)
前記第VIII因子がBドメインの完全または部分欠失を有する項目1~17のいずれかに記載の方法。
(項目19)
前記キメラポリペプチドの第VIII因子部分が、シグナル配列を有さない、表2に示した第VIII因子アミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1~1438;配列番号6のアミノ酸1~2332;配列番号8のアミノ酸1~740;配列番号10のアミノ酸1~745;または配列番号12のアミノ酸1~684)と少なくとも90%または95%同一である項目17記載の方法。
(項目20)
前記キメラポリペプチドの第VIII因子部分が、シグナル配列を有さない、表2に示した第VIII因子アミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1~1438;配列番号6のアミノ酸1~2332;配列番号8のアミノ酸1~740;配列番号10のアミノ酸1~745;または配列番号12のアミノ酸1~684)と同一である項目19記載の方法。
(項目21)
前記キメラポリペプチドの第VIII因子部分が、シグナル配列を有する、表2に示した第VIII因子アミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸-19~1438;配列番号6のアミノ酸-19~2332;配列番号8のアミノ酸-19~740;配列番号10のアミノ酸-19~745;または配列番号12のアミノ酸-20~684)と少なくとも90%または95%同一である項目17記載の方法。
(項目22)
前記キメラポリペプチドの第VIII因子部分が、シグナル配列を有する、表2に示した第VIII因子アミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸-19~1438;配列番号6のアミノ酸-19~2332;配列番号8のアミノ酸-19~740;配列番号10のアミノ酸-19~745;または配列番号12のアミノ酸-20~684)と同一である項目21記載の方法。
(項目23)
前記キメラポリペプチドの前記第二部分が、表2に示したFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1439~1665;配列番号6のアミノ酸2333~2559;配列番号8のアミノ酸741~967;配列番号10のアミノ酸746~972;配列番号12のアミノ酸685~924)と少なくとも90%または95%同一である項目17または18記載の方法。
(項目24)
前記キメラポリペプチドの前記第二部分が、表2に示したFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1439~1665;配列番号6のアミノ酸2333~2559;配列番号8のアミノ酸741~967;配列番号10のアミノ酸746~972;配列番号12のアミノ酸685~924)と同一である項目23記載の方法。
(項目25)
前記キメラポリペプチドが、前記キメラポリペプチドと結合した第二ポリペプチドを含むハイブリッドの形態であり、前記第二ポリペプチドが本質的にFcからなる項目1~24のいずれかに記載の方法。
(項目26)
前記キメラポリペプチドが、シグナル配列を有さない、表2A(i)に示した第VIII因子およびFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1~1665)と少なくとも90%または95%同一である、あるいはシグナル配列を有する、表2A(i)に示した第VIII因子およびFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸-19~1665)と少なくとも90%または95%同一である配列を含む項目25記載の方法。
(項目27)
前記キメラポリペプチドが、シグナル配列を有さない、表2A(i)に示した第VIII因子およびFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1~1665)と同一である、あるいはシグナル配列を有する、表2A(i)に示した第VIII因子およびFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸-19~1665)と同一である配列を含む項目26記載の方法。
(項目28)
前記第二ポリペプチドが本質的に、シグナル配列を有さない、表2A(ii)に示したアミノ酸配列(配列番号4のアミノ酸1~227)と少なくとも90%または95%同一である、あるいはシグナル配列を有する、表2A(ii)に示したアミノ酸配列(配列番号4のアミノ酸-20~227)と少なくとも90%または95%同一である配列からなる項目25~27のいずれかに記載の方法。
(項目29)
前記第二ポリペプチドが本質的に、シグナル配列を有さない、表2A(ii)に示したアミノ酸配列(配列番号4のアミノ酸1~227)と同一である、あるいはシグナル配列を有する、表2A(ii)に示したアミノ酸配列(配列番号4のアミノ酸-20~227)と同一である配列からなる項目28記載の方法。
(項目30)
前記キメラポリペプチドが、少なくとも1つの賦形剤を含む薬学的組成物の一部として投与される項目1~29のいずれかに記載の方法。
(項目31)
第VIII因子の投与を必要とする被験体に第VIII因子を投与する方法であって、第VIII因子部分および第二部分を含む治療的用量のキメラポリペプチドを前記被験体に投与して、前記第VIII因子部分からなる等価量のポリペプチドにより得られるAUCより少なくとも約1.25倍大きい血漿濃度対時間曲線下面積(AUC)を得ることを包含する方法。
(項目32)
前記キメラポリペプチドが、約5、6、7、8、9、10、11、12、13または14日毎またはそれ以上の用量投与間隔で投与される項目31記載の方法。
(項目33)
前記被験体が予防的処置を必要としている項目31~32のいずれかに記載の方法。
(項目34)
前記被験体がオンデマンド処置を必要としている項目31記載の方法。
(項目35)
前記被験体が出血症状出現に対する処置を必要としている項目32記載の方法。
(項目36)
前記被験体が、関節出血症、筋肉出血、口腔出血(oral bleed)、出血、筋肉への出血、口腔出血(oral hemorrhage)、外傷、頭部外傷、消化器出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙における出血、腹膜後隙における出血、あるいは腸腰筋鞘における出血に対する処置を必要としている項目33記載の方法。
(項目37)
前記被験体が、外科的予防、手術中管理または外科手術に対する処置を必要としている項目34記載の方法。
(項目38)
前記外科手術が、小手術、大手術、抜歯術、扁桃摘出術、鼠径ヘルニア切除術、滑膜切除術、人工膝関節全置換術、開頭術、骨接合術、外傷手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術または関節置換術である項目37記載の方法。
(項目39)
前記キメラポリペプチドの前記用量投与間隔が、24~36、24~48、24~72、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71または72時間あるいはそれより長い時間毎に約1回である項目34~38のいずれかに記載の方法。
(項目40)
前記治療的用量が10~100 IU/kgである項目31~39のいずれかに記載の方法。
(項目41)
前記治療的用量が10~20、20~30、30~40、40~50、50~60、60~70、70~80、80~90または90~100 IU/kgである項目40記載の方法。
(項目42)
前記治療的用量が10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100 IU/kgである項目41記載の方法。
(項目43)
前記被験体がヒトである項目31~42のいずれかに記載の方法。
(項目44)
前記第VIII因子がヒト第VIII因子である項目31~43のいずれかに記載の方法。
(項目45)
前記第VIII因子がBドメインの完全または部分欠失を有する項目31~44のいずれかに記載の方法。
(項目46)
前記キメラポリペプチドの第VIII因子部分が、シグナル配列を有さない、表2に示した第VIII因子アミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1~1438;配列番号6のアミノ酸1~2332;配列番号8のアミノ酸1~740;配列番号10のアミノ酸1~745;または配列番号12のアミノ酸1~684)と少なくとも90%または95%同一である項目44記載の方法。
(項目47)
前記キメラポリペプチドの第VIII因子部分が、シグナル配列を有さない、表2に示した第VIII因子アミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1~1438;配列番号6のアミノ酸1~2332;配列番号8のアミノ酸1~740;配列番号10のアミノ酸1~745;または配列番号12のアミノ酸1~684)と同一である項目46記載の方法。
(項目48)
前記キメラポリペプチドの第VIII因子部分が、シグナル配列を有する、表2に示した第VIII因子アミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸-19~1438;配列番号6のアミノ酸-19~2332;配列番号8のアミノ酸-19~740;配列番号10のアミノ酸-19~745;または配列番号12のアミノ酸-20~684)と少なくとも90%または95%同一である項目44記載の方法。
(項目49)
前記キメラポリペプチドの第VIII因子部分が、シグナル配列を有する、表2に示した第VIII因子アミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸-19~1438;配列番号6のアミノ酸-19~2332;配列番号8のアミノ酸-19~740;配列番号10のアミノ酸-19~745;または配列番号12のアミノ酸-20~684)と同一である項目48記載の方法。
(項目50)
前記キメラポリペプチドの前記第二部分が、表2に示したFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1439~1665;配列番号6のアミノ酸2333~2559;配列番号8のアミノ酸741~967;配列番号10のアミノ酸746~972;配列番号12のアミノ酸685~924)と少なくとも90%または95%同一である項目43または44記載の方法。
(項目51)
前記キメラポリペプチドの前記第二部分が、表2に示したFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1439~1665;配列番号6のアミノ酸2333~2559;配列番号8のアミノ酸741~967;配列番号10のアミノ酸746~972;配列番号12のアミノ酸685~924)と同一である項目50記載の方法。
(項目52)
前記キメラポリペプチドが、前記キメラポリペプチドと結合した第二ポリペプチドを含むハイブリッドの形態であり、前記第二ポリペプチドが本質的にFcからなる項目31~51のいずれかに記載の方法。
(項目53)
前記キメラポリペプチドが、シグナル配列を有さない、表2A(i)に示した第VIII因子およびFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1~1665)と少なくとも90%または95%同一である、あるいはシグナル配列を有する、表2A(i)に示した第VIII因子およびFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸-19~1665)と少なくとも90%または95%同一である配列を含む項目52記載の方法。
(項目54)
前記キメラポリペプチドが、シグナル配列を有さない、表2A(i)に示した第VIII因子およびFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1~1665)と同一である、あるいはシグナル配列を有する、表2A(i)に示した第VIII因子およびFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸-19~1665)と同一である配列を含む項目53記載の方法。
(項目55)
前記第二ポリペプチドが本質的に、シグナル配列を有さない、表2A(ii)に示したアミノ酸配列(配列番号4のアミノ酸1~227)と少なくとも90%または95%同一である、あるいはシグナル配列を有する、表2A(ii)に示したアミノ酸配列(配列番号4のアミノ酸-20~227)と少なくとも90%または95%同一である配列からなる項目52~54のいずれかに記載の方法。
(項目56)
前記第二ポリペプチドが本質的に、シグナル配列を有さない、表2A(ii)に示したアミノ酸配列(配列番号4のアミノ酸1~227)と同一である、あるいはシグナル配列を有する、表2A(ii)に示したアミノ酸配列(配列番号4のアミノ酸-20~227)と同一である配列からなる項目55記載の方法。
(項目57)
前記キメラポリペプチドが、少なくとも1つの賦形剤を含む薬学的組成物の一部として投与される項目31~56のいずれかに記載の方法。
(項目58)
第VIII因子の投与を必要とする被験体に第VIII因子を投与する方法であって、第VIII因子およびFcを含む治療的用量のポリペプチドを、約5、6、7、8、9、10、11、12、13または14日毎またはそれ以上の用量投与間隔で前記被験体に投与することを包含する方法。
(項目59)
前記被験体が予防的処置を必要としている項目58記載の方法。
(項目60)
前記治療的用量が10~100 IU/kgである項目58~59のいずれかに記載の方法。
(項目61)
前記治療的用量が10~20、20~30、30~40、40~50、50~60、60~70、70~80、80~90または90~100 IU/kgである項目60記載の方法。
(項目62)
前記治療的用量が10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100 IU/kgである項目61記載の方法。
(項目63)
前記被験体がヒトである項目58~62のいずれかに記載の方法。
(項目64)
前記第VIII因子がヒト第VIII因子である項目58~63のいずれかに記載の方法。
(項目65)
前記第VIII因子がBドメインの完全または部分欠失を有する項目58~64のいずれかに記載の方法。
(項目66)
前記第VIII因子が、シグナル配列を有さない、表2に示した第VIII因子アミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1~1438;配列番号6のアミノ酸1~2332;配列番号8のアミノ酸1~740;配列番号10のアミノ酸1~745;または配列番号12のアミノ酸1~684)と少なくとも90%または95%同一である項目64記載の方法。
(項目67)
前記第VIII因子が、シグナル配列を有さない、表2に示した第VIII因子アミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1~1438;配列番号6のアミノ酸1~2332;配列番号8のアミノ酸1~740;配列番号10のアミノ酸1~745;または配列番号12のアミノ酸1~684)と同一である項目66記載の方法。
(項目68)
前記第VIII因子が、シグナル配列を有する、表2に示した第VIII因子アミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸-19~1438;配列番号6のアミノ酸-19~2332;配列番号8のアミノ酸-19~740;配列番号10のアミノ酸-19~745;または配列番号12のアミノ酸-20~684)と少なくとも90%または95%同一である項目64記載の方法。
(項目69)
前記第VIII因子が、シグナル配列を有する、表2に示した第VIII因子アミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸-19~1438;配列番号6のアミノ酸-19~2332;配列番号8のアミノ酸-19~740;配列番号10のアミノ酸-19~745;または配列番号12のアミノ酸-20~684)と同一である項目68記載の方法。
(項目70)
前記第二部分が、表2に示したFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1439~1665;配列番号6のアミノ酸2333~2559;配列番号8のアミノ酸741~967;配列番号10のアミノ酸746~972;配列番号12のアミノ酸685~924)と少なくとも90%または95%同一である項目64または65記載の方法。
(項目71)
前記第二部分が、表2に示したFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1439~1665;配列番号6のアミノ酸2333~2559;配列番号8のアミノ酸741~967;配列番号10のアミノ酸746~972;配列番号12のアミノ酸685~924)と同一である項目70記載の方法。
(項目72)
前記キメラポリペプチドが、前記キメラポリペプチドと結合した第二ポリペプチドを含むハイブリッドの形態の第VIII因子-Fcキメラポリペプチドであり、前記第二ポリペプチドが本質的にFcからなる項目58~71のいずれかに記載の方法。
(項目73)
前記キメラポリペプチドが、シグナル配列を有さない、表2A(i)に示した第VIII因子およびFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1~1665)と少なくとも90%または95%同一である、あるいはシグナル配列を有する、表2A(i)に示した第VIII因子およびFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸-19~1665)と少なくとも90%または95%同一である配列を含む項目72記載の方法。
(項目74)
前記キメラポリペプチドが、シグナル配列を有さない、表2A(i)に示した第VIII因子およびFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1~1665)と同一である、あるいはシグナル配列を有する、表2A(i)に示した第VIII因子およびFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸-19~1665)と同一である配列を含む項目73記載の方法。
(項目75)
前記第二ポリペプチドが本質的に、シグナル配列を有さない、表2A(ii)に示したアミノ酸配列(配列番号4のアミノ酸1~227)と少なくとも90%または95%同一である、あるいはシグナル配列を有する、表2A(ii)に示したアミノ酸配列(配列番号4のアミノ酸-20~227)と少なくとも90%または95%同一である配列からなる項目72~74のいずれかに記載の方法。
(項目76)
前記第二ポリペプチドが本質的に、シグナル配列を有さない、表2A(ii)に示したアミノ酸配列(配列番号4のアミノ酸1~227)と同一である、あるいはシグナル配列を有する、表2A(ii)に示したアミノ酸配列(配列番号4のアミノ酸-20~227)と90%または95%同一である配列からなる項目75記載の方法。
(項目77)
前記ポリペプチドが、少なくとも1つの賦形剤を含む薬学的組成物の一部として投与される項目58~76のいずれかに記載の方法。
(項目78)
シグナル配列を有さない、表2に示した第VIII因子アミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1~1438;配列番号6のアミノ酸1~2332;配列番号8のアミノ酸1~740;配列番号10のアミノ酸1~745;または配列番号12のアミノ酸1~684)と少なくとも90%または95%同一である第VIII因子およびFcを含むポリペプチド。
(項目79)
前記第VIII因子が、シグナル配列を有さない、表2に示した第VIII因子アミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1~1438;配列番号6のアミノ酸1~2332;配列番号8のアミノ酸1~740;配列番号10のアミノ酸1~745;または配列番号12のアミノ酸1~684)と同一である項目78記載のポリペプチド。
(項目80)
シグナル配列を有する、表2に示した第VIII因子アミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸-19~1438;配列番号6のアミノ酸-19~2332;配列番号8のアミノ酸-19~740;配列番号10のアミノ酸-19~745;または配列番号12のアミノ酸-20~684)と少なくとも90%または95%同一である第VIII因子およびFcを含むポリペプチド。
(項目81)
前記第VIII因子が、シグナル配列を有する、表2に示した第VIII因子アミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸-19~1438;配列番号6のアミノ酸-19~2332;配列番号8のアミノ酸-19~740;配列番号10のアミノ酸-19~745;または配列番号12のアミノ酸-20~684)と同一である項目80記載のポリペプチド。(項目82)
前記Fcが、表2に示したFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1439~1665;配列番号6のアミノ酸2333~2559;配列番号8のアミノ酸741~967;配列番号10のアミノ酸746~972;配列番号12のアミノ酸685~924)と少なくとも90%または95%同一である項目78~81記載のポリペプチド。
(項目83)
前記Fcが、表2に示したFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1439~1665;配列番号6のアミノ酸2333~2559;配列番号8のアミノ酸741~967;配列番号10のアミノ酸746~972;配列番号12のアミノ酸685~924)と同一である項目82記載のポリペプチド。
(項目84)
シグナル配列を有さない、表2A(i)に示した第VIII因子およびFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1~1665)と少なくとも90%または95%同一である、あるいはシグナル配列を有する、表2A(i)に示した第VIII因子およびFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸-19~1665)と少なくとも90%または95%同一である配列を含む項目78記載のポリペプチド。
(項目85)
シグナル配列を有さない、表2A(i)に示した第VIII因子およびFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸1~1665)と同一である、あるいはシグナル配列を有する、表2A(i)に示した第VIII因子およびFcアミノ酸配列(配列番号2のアミノ酸-19~1665)少なくとも90%または95%同一である配列を含む項目84記載のポリペプチド。
(項目86)
第二ポリペプチドを含むハイブリッドの形態であり、前記第二ポリペプチドが本質的にFcからなる項目78~85のいずれかに記載のポリペプチド。
(項目87)
前記第二ポリペプチドが本質的に、シグナル配列を有さない、表2A(ii)に示したアミノ酸配列(配列番号4のアミノ酸1~227)と少なくとも90%または95%同一である、あるいはシグナル配列を有する、表2A(ii)に示したアミノ酸配列(配列番号4のアミノ酸-20~227)と少なくとも90%または95%同一である配列からなる項目85記載のポリペプチド。
(項目88)
前記第二ポリペプチドが本質的に、シグナル配列を有さない、表2A(ii)に示したアミノ酸配列(配列番号4のアミノ酸1~227)と同一である、あるいはシグナル配列を有する、表2A(ii)に示したアミノ酸配列(配列番号4のアミノ酸-20~227)と90%または95%同一である配列からなる項目86記載のポリペプチド。
(項目89)
前記第VIII因子からなるポリペプチドに比して、少なくとも約1.5~6倍、1.5~5倍、1.5~4倍、1.5~3倍または1.5~2倍長い半減期を有する項目78~88のいずれかに記載のポリペプチド。
(項目90)
項目78~85のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(項目91)
表1の第VIII因子-Fcヌクレオチド配列(配列番号1、5、7、9または11)を含む項目90記載のポリヌクレオチド。
(項目92)
第VIII因子-Fcポリペプチドおよび項目86~89のいずれかに記載の第二ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(項目93)
ベクター、プラスミド、ファージまたはウイルスである項目90~92のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
(項目94)
DNAまたはRNAである項目90~93のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
(項目95)
項目89~94のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む培養ヒト胚性細胞。
(項目96)
HEK293細胞である項目95記載の細胞。
(項目97)
第VIII因子-Fcハイブリッドタンパク質の産生方法であって、以下の:
コード化第VIII因子-Fcキメラポリペプチドおよび本質的にFcからなるコード化ポリペプチドの発現を可能にする条件下で項目95または96記載の細胞を培養すること;そして
コード化第VIII因子-Fcハイブリッドタンパク質を回収すること
を包含する方法。
(項目98)
項目97記載の方法により産生されるタンパク質。
(項目99)
前記キメラポリペプチドが以下の:
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵するリン脂質小胞と相互作用する能力;
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵する第X因子を活性化するXアーゼ複合体を形成する能力;
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵する5分以内にαトロンビンにより活性化される能力;および
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵する第IXa因子と相互作用する能力
からなる群から選択される1つ以上の特質を有する項目1~57のいずれか一項に記載の方法。
(項目100)
前記キメラポリペプチドが、以下の:
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドのKmの約1、約1.5または約2標準偏差以内のKmで第X因子を活性化するXアーゼ複合体を形成すること(ここで、Kmは第X因子濃度の一関数として測定される);
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドのVmaxの約1、約1.5または約2標準偏差以内のVmaxで第X因子を活性化するXアーゼ複合体を形成すること(ここで、Vmaxは第X因子濃度の一関数として測定される);
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドのKdの約1、約1.5または約2標準偏差以内のKdで第X因子を活性化するXアーゼ複合体を形成すること(ここで、Kdは第IXa因子濃度の一関数として測定される);そして
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドのVmaxの約1、約1.5または約2標準偏差以内のVmaxで第X因子を活性化するXアーゼ複合体を形成すること(ここで、Vmaxは第IXa因子濃度の一関数として測定される);
からなる群から選択される1つ以上の特質を有する項目99記載の方法。
(項目101)
前記ポリペプチドが以下の:
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵するリン脂質小胞と相互作用する能力;
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵する第X因子を活性化するXアーゼ複合体を形成する能力;
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵する5分以内にαトロンビンにより活性化される能力;および
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵する第IXa因子と相互作用する能力からなる群から選択される1つ以上の特質を有する項目58~77のいずれか一項に記載の方法。
(項目102)
前記ポリペプチドが、以下の:
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドのKmの約1、約1.5または約2標準偏差以内のKmで第X因子を活性化するXアーゼ複合体を形成すること(ここで、Kmは第X因子濃度の一関数として測定される);
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドのVmaxの約1、約1.5または約2標準偏差以内のVmaxで第X因子を活性化するXアーゼ複合体を形成すること(ここで、Vmaxは第X因子濃度の一関数として測定される);
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドのKdの約1、約1.5または約2標準偏差以内のKdで第X因子を活性化するXアーゼ複合体を形成すること(ここで、Kdは第IXa因子濃度の一関数として測定される);そして
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドのVmaxの約1、約1.5または約2標準偏差以内のVmaxで第X因子を活性化するXアーゼ複合体を形成すること(ここで、Vmaxは第IXa因子濃度の一関数として測定される);
からなる群から選択される1つ以上の特質を有する項目101記載の方法。
(項目103)
以下の:
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵するリン脂質小胞と相互作用する能力;
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵する第X因子を活性化するXアーゼ複合体を形成する能力;
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵する5分以内にαトロンビンにより活性化される能力;および
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵する第IXa因子と相互作用する能力
からなる群から選択される1、約1.5または約2またはそれ以上の特質を有する項目78~89および98のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目104)
前記ポリペプチドが、以下の:
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドのKmの約1、約1.5または約2標準偏差以内のKmで第X因子を活性化するXアーゼ複合体を形成すること(ここで、Kmは第X因子濃度の一関数として測定される);
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドのVmaxの約1、約1.5または約2標準偏差以内のVmaxで第X因子を活性化するXアーゼ複合体を形成すること(ここで、Vmaxは第X因子濃度の一関数として測定される);
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドのKdの約1、約1.5または約2標準偏差以内のKdで第X因子を活性化するXアーゼ複合体を形成すること(ここで、Kdは第IXa因子濃度の一関数として測定される);そして
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドのVmaxの約1、約1.5または約2標準偏差以内のVmaxで第X因子を活性化するXアーゼ複合体を形成すること(ここで、Vmaxは第IXa因子濃度の一関数として測定される);
からなる群から選択される1つ以上の特質を有する項目101記載の方法。
(項目105)
前記用量がIU/kg当たり1.38 IU/dLより大きい平均増分回収率(K値)(活性:観察値)を有する項目1~77のいずれかに記載の方法。
(項目106)
前記用量がIU/kg当たり少なくとも約1.5、少なくとも約1.85または少なくとも約2.46 IU/dLの平均増分回収率(K値)(活性:観察値)を有する項目1~77および104のいずれかに記載の方法。
(項目107)
前記キメラポリペプチドが、前記患者集団または前記被験体における、以下の:
約2.33±1.08 mL/時/kgまたはそれ未満の前記患者集団における平均クリアランス(CL)(活性);
約1.8~2.69 mL/時/kgの前記患者集団における平均クリアランス(CL)(活性);
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドのクリアランスの約65%である前記患者集団における平均クリアランス(CL)(活性);
約1.22~5.19 mL/時/kgの前記被験体におけるクリアランス(CL)(活性);
少なくとも約26.3±8.33時間の前記患者集団における平均滞留時間(MRT)(活性);
約25.9~26.5時間の前記患者集団における平均MRT(活性);
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドの平均MRTより約1.5倍長い前期患者集団における平均MRT(活性);
約14~41.3時間の前記被験体における平均滞留時間(MRT)(活性);
約18.3±5.79時間の前記患者集団における平均t1/2ベータ(活性);
約18~18.4時間である前記患者集団における平均t1/2ベータ(活性);
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドの平均t1/2ベータより約1.5倍長い前記患者集団における平均t1/2ベータ(活性);
約11~26.4時間の前記被験体におけるt1/2ベータ(活性);
IU/kg当たり約2.01±0.44 IU/dLの前記患者集団における平均増分回収率(K値)(活性;観察値);
IU/kg当たり約1.85~2.46 IU/dLの前記患者集団における平均増分回収率(K値)(活性;観察値);
前記第VIII因子部分からなるポリペプチドの平均増分回収率の約90%である前記患者集団における平均増分回収率(K値)(活性;観察値);
IU/kg当たり約1.38~2.88 IU/dLの前記被験体における増分回収率(K値)(活性;観察値);
約55.1±12.3 mL/kgの前記患者集団における平均Vss(活性);
約45.3~56.1 mL/kgの前記患者集団における平均Vss(活性);
約37.7~79.4 mL/kgの前記被験体における平均Vss(活性);
IU/kg当たり約49.9±18.2 IU*h/dLの前記患者集団における平均AUC/用量(活性);
IU/kg当たり約44.8~57.6 IU*h/dLの前記患者集団における平均AUC/用量(活性);そして
IU/kg当たり約19.2~81.7 IU*h/dLの前記被験体におけるAUC/用量;
からなる群から選択される1つ以上の薬物動態パラメーターを示す項目1~75および104~106のいずれかに記載の方法。
(項目108)
前記第二部分がXTENまたはアルブミンである項目1~77および104~106のいずれかに記載の方法。
(項目109)
前記治療的用量が約10~約150、100~110、110~120、120~130、130~140、140~150、110、115、120、125、130、135、140、145または150 IU/kgである項目1~77および104~106のいずれかに記載の方法。
(項目110)
前記用量投与間隔が1.5~5、1.5、2、3、4または5日またはそれ以上である項目1~77および104~106のいずれかに記載の方法。
al., N. Engl. J. Med. 344:1773-9 (2001)(その全体が参照により本明細書中に組み込まれる))。出血症状をオンデマンドで治療するか、または予防的治療により出血症状が起こるのを防止するために利用可能な血漿由来の組換えFVIII産物がある。これらの産物の半減期(10~12時間)に基づいて(White G.C., et al., Thromb. Haemost. 77:660-7 (1997); Morfini, M., Haemophilia 9 (suppl 1):94-99; discussion 100 (2003))、治療レジメンには、通常、予防のためには週2~3回、そしてオンデマンド治療のためには1日1~3回の頻繁な静脈内投与が必要である(Manco-Johnson, M.J., et al., N. Engl. J. Med. 357:535-544 (2007))(その全体が参照により本明細書中に組み込まれる)。そのような頻繁な投与は、苦痛を伴い、かつ不便である。
2(4): 301-6 (1988)(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。本発明の一部であるさらなるBドメイン欠失としては、たとえば:アミノ酸982~1562または760~1639の欠失(Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942))、797~1562の欠失(Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347))、741~1646の欠失(Kaufman(PCT公開出願番号国際公開第87/04187号))、747~1560の欠失(Sarver, et al., DNA (1987) 6:553-564))、741~1648の欠失(Pasek(PCT出願第88/00831号))、816~1598または741~1689の欠失(Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597))(それぞれは、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる)が挙げられる。前記欠失のそれぞれは、任意の第VIII因子配列でなされる可能性がある。
(1984); Wood, W. I., et al., Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G. A., et al., Nature 312:337-342 (1984);国際公開第87/04187号;国際公開第88/08035号;国際公開第88/03558号;米国特許第4,757,006)(それぞれは、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる)、そしてアミノ酸配列がcDNAから推定された。Caponら、米国特許第4,965,199(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)は、ほ乳類宿主細胞における第VIII因子の産生およびヒト第VIII因子の精製のための組換えDNA法を開示している。CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞およびBHKC(ベビーハムスター腎臓細胞)におけるヒト第VIII因子発現が報告されている。Bドメインの一部または全部を欠失させるためにヒト第VIII因子を修飾し(米国特許第4,994,371号および第4,868,112号(それぞれは、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる))、そしてヒト第VIII因子Bドメインのヒト第V因子Bドメインでの置換が実施された(米国特許第5,004,803号(その全体が参照により本明細書に組み込まれる))。ヒト第VIII因子をコード化するcDNA配列および予想されるアミノ酸配列はそれぞれ、米国出願公開第2005/0100990号(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)の配列番号1および2で示される。
al. 1994, Nature 372:379(その全体が参照により本明細書に組み込まれる))。FcのFcRnとの主な接触域は、CH2およびCH3ドメインの接合点付近である。Fc-FcRn接触は、全て1つのIg重鎖内である。FcRn結合パートナーとしては、例えば、全IgG、IgGのFcフラグメント、およびFcRnの完全結合領域を含むIgGの他のフラグメントが挙げられる。主な接触部位としては、CH2ドメインのアミノ酸残基248、250~257、272、285、288、290~291、308~311、および314ならびにCH3ドメインのアミノ酸残基385~387、428、および433~436が挙げられる。免疫グロブリンもしくは免疫グロブリンフラグメント、または領域のアミノ酸ナンバリングについての言及は、すべて、Kabat et al. 1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Public Health, Bethesda; MD(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に基づく。(FcRn受容体はヒトをはじめとするいくつかのほ乳類種から単離されている。ヒトFcRn、ラットFcRn、およびマウスFcRnの配列は公知である(Story et al. 1994, J. Exp.
Med. 180: 2377)(その全体が参照により本明細書に組み込まれる))。Fcは、免疫グロブリンのヒンジ領域の有無にかかわらず免疫グロブリンのCH2およびCH3ドメインを含み得る。例示的なFc変異体は、国際公開第2004/101740号および国際公開第2006/074199号(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)で提供される。
約14~41.3時間の前記対象中の平均滞留時間(MRT)(活性);
約1.22~5.19mL/時/kg以下の前記対象中のクリアランス(CL)(活性);
約11~26.4時間の前記対象中のt1/2ベータ(活性);
1IU/kgあたり約1.38~2.88IU/dLの前記対象中の増分回収率(incremental recovery)(K値)(活性;観察値);
約37.7~79.4mL/kgの前記対象中のVss(活性);および
1IU/kgあたり約19.2~81.7IU*h/dLの前記対象中のAUC/用量。
1IU/kgあたり1.38IU/dLを越える平均増分回収率(K値)(活性;観察値);
1IU/kgあたり少なくとも約1.5、少なくとも約1.85、または少なくとも約2.46IU/dLの平均増分回収率(K値)(活性;観察値)。
約2.33±1.08mL/時/kg以下の前記患者集団における平均クリアランス(CL)(活性);
約1.8~2.69mL/時/kgの前記患者集団における平均クリアランス(CL)(活性);
修飾がなく前記第VIII因子を含むポリペプチドのクリアランスの約65%である前記患者集団における平均クリアランス(CL)(活性);
少なくとも約26.3±8.33時間の前記患者集団における平均滞留時間(MRT)(活性);
約25.9~26.5時間の前記患者集団における平均MRT(活性);
修飾がなく前記第VIII因子を含むポリペプチドの平均MRTよりも約1.5倍長い前記患者集団における平均MRT(活性);
約18.3±5.79時間の前記患者集団における平均t1/2ベータ(活性);
約18~18.4時間である前記患者集団における平均t1/2ベータ(活性);
修飾がなく前記第VIII因子を含むポリペプチドの平均t1/2ベータよりも約1.5倍長い前記患者集団における平均t1/2ベータ(活性);
1IU/kgあたり約2.01±0.44IU/dLの前記患者集団における平均増分回収率(K値)(活性;観察値);
1IU/kgあたり約1.85~2.46IU/dLの前記患者集団における平均増分回収率(K値)(活性;観察値);
修飾がなく前記第VIII因子を含むポリペプチドの平均増分回収率の約90%である前記患者集団における平均増分回収率(K値)(活性;観察値);
約55.1±12.3mL/kgの前記患者集団における平均Vss(活性);
約45.3~56.1mL/kgの前記患者集団における平均Vss(活性);
1IU/kgあたり約49.9±18.2IU*h/dLの前記患者集団における平均AUC/用量(活性);
1IU/kgあたり約44.8~57.6IU*h/dLの前記患者集団における平均AUC/用量(活性)。
必要な単位=体重(kg)×所望の第VIII因子増加(IU/dLまたは正常値の%)×0.5(IU/dLあたりのIU/kg)
を用いて決定される。
Size)=500または対象ヌクレオチド配列の長さ(いずれか短い方)。
Biol. Chem 268:22105-22111 (1993)(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)は、ヒトサイトカインIL-1aの詳細な突然変異分析を行った。彼らは、ランダム突然変異誘発を使用して、分子の全長にわたって変異体あたり平均して2.5アミノ酸変化である3,500を越える個々のIL-1a突然変異体を生成させた。複数の突然変異をあらゆる可能なアミノ酸位置で調査した。調査者らは、分子のほとんどは[結合または生物学的活性]のいずれかに対してほとんど影響を及ぼすことなく改変することができる」ことを見いだした。(要約を参照のこと)。実際、調査した3,500を越えるヌクレオチド配列のうち、わずか23の独自のアミノ酸配列だけが、野生型とは活性が有意に異なるタンパク質を産生した。
et al.、Blood 116:270-79(2010)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アミノ酸のタンパク質に対するトランスファー-RNA媒介性付加、例えばアルギニル化、およびユビキチン化が挙げられる。いくつかの実施形態において、第VIII因子は、任意の都合のよい位置でペグ化など修飾される。いくつかの実施形態において、第VIII因子は、第VIII因子の表面に露出したアミノ酸で、好ましくは、操作されたシステインであり得る表面に露出したシステインでペグ化される。Mei et al. (2010)。いくつかの実施形態において、修飾された第VIII因子、たとえばペグ化第VIII因子は、長時間作用性第VIII因子である。
要約
組換えBドメイン欠失第VIII-Fc因子(rFVIIIFc)融合タンパク質を作製して、FVIIIの半減期を延長した。rFVIIIFcを重症の血友病Aのマウスおよびイヌモデルで研究し、rFVIII(ReFacto(登録商標))と比較した。血友病Aマウスにおける全血凝固時間(WBCT)は2~3倍長く補正され、そして血漿中の除去半減期は、ReFacto(登録商標)と比較すると、rFVIIIFcについてほぼ2倍の長さであった。血友病Aイヌでは、rFVIIIFcの静脈内投与(125IU/kg)はWBCTを正常値に修正した。WBCTは、ReFacto(登録商標)で治療されたイヌについては48時間であるのに比べて、約96時間にわたって20分未満(この時間は、FVIII:C>1%に一致する)にとどまった。イヌ血漿におけるrFVIIIFcの除去半減期は、ELISAまたは色素生成検定を用いて測定した場合、それぞれ15.7±1.7時間および15.4±0.3時間であった。ReFacto(登録商標)は、WBCTをrFVIIIFcの約1/2の長さに修正し、血漿半減期は7.0時間であった。したがって、FVIIIをFcに融合することにより、血漿半減期が増加し、出血から長時間保護する能力を有する分子が産生された。
死亡率の低下、関節損傷の予防および生活の質の改善は、血漿由来の組換えFVIIIの開発による重大な功績である。出血からの長時間の保護は、血友病A患者の治療における別の重要な進展である。本発明者等は、FVIIIの半減期を延長するための方法として組換え第VIII-Fc因子(rFVIIIFc)キメラタンパク質およびハイブリッドを作製した。
Immunol. 1993:10:219-27; Chamow SM, and
Ashkanazi A, Trends Biotechnol. 1996:14:52-60; Fisher et al., N. Engl. J. Med. 1996:334(26):1697-702(それぞれは、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる))。これらのうちのいくつかは重要な治療分子となった(例えば、エタネルセプト、アレファセプト、アバタセプト)。これらの融合タンパク質において、2つのエフェクター分子が2つのFc分子と結合する。この実施例では、rFVIIIFcを、モノマーFc融合タンパク質(表2A(i)中の配列(配列番号2)から構成される1コピーのポリペプチド(シグナル配列の有無を問わない)および表2A(ii)中の配列(配列番号4)(シグナル配列の有無を問わない)からなる1コピーのポリペプチド)として、すなわち、1コピーのエフェクター分子のみを用いて構築し(図1を参照のこと)、本明細書中に提示した研究は、血友病Aのマウスおよびイヌモデルにおいてこの新規タンパク質の薬力学および薬物動態学をrFVIIIと比較する。シグナル配列は、分泌中に切断される。このタンパク質構築物を、本明細書中では、FVIIIFcモノマーFc融合タンパク質、FVIIIFcモノマーハイブリッド、モノマーFVIIIIFcハイブリッド、およびFVIIIFcモノマー-ダイマーと称する。このタンパク質の構造および産生については、実施例1、図1、表2A;ならびに米国特許第7,404,956号および第7,348,004号(そのそれぞれはその全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照のこと。
FVIII調製物
組換えFVIIIFc
FVIII特異的プライマーを用いて、ヒト肝臓ポリA RNA(Clonetech)から、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)により、ヒト組換えBドメイン欠失FVIIIのコード配列を得た。FVIII配列は、FVIIIに関するネイティブシグナル配列を含む。Bドメイン欠失は、2682bpの全体的欠失に関してセリン743(S743;2287bp)からグルタミン1638(Q1638;4969bp)までであった。このタンパク質の構造および製造に関しては、実施例1、図1、表2A;ならびに米国特許第7,404,956号および第7,348,004号(これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される)を参照されたい。
組換えBドメイン欠失FVIII(ReFacto(登録商標))をNovis Pharmaceuticalsから購入し、メーカーの使用説明書に従って調製した。ReFacto(登録商標)(組換えBドメイン欠失FVIII)は、配列番号2のアミノ酸1~1438と同じアミノ酸配列を有する。
血友病Aマウスは、ペンシルバニア大学のKazazian博士から入手し(Bi L, et al., Nat. Genet. 1995; 10(1): 119-121;この記載内容は参照により本明細書中で援用される)、Syntonixで繁殖された129×B6バックグラウンドでのFVIIIエキソン16ノックアウトである。これらのマウスは、全血凝固時間延長(>60分)を示し、したがって、重症血友病Aの良好なモデルである。
血友病Aマウス試験
全血凝固時間(WBCT)に及ぼすrFVIIIFcおよびReFacto(登録商標)の作用を、FVIII欠損マウスで試験した。各タンパク質を50 IU/kgで静脈内投与して、各マウスの尾静脈から、用量投与前に、そして用量投与後の種々の時点で、血液を採取した。血液試料を37℃で微細管中でインキュベートして、血餅の存在に関して1分間に1回、視覚的に検査した。血餅形成の時間を記録した。血餅が60分までに生じなかった場合、凝固時間を>60分と記録した。正常マウスからの血液は、WBCT検定において約4分で凝固する(範囲 2~7分;n=マウス10匹)。
rFVIIIFcの単一回用量投与PK/PD試験において、Chapel Hillコロニーからの2匹の血友病Aイヌに、125 IU/kgの単一回静脈内用量投与を施して、WBCT、活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)、FVIIIFc血漿濃度、血液学的および血清化学に関して、用量投与前、および用量投与後の選定時点に、血液試料を採取した。WBCTに関する時点は、用量投与前、用量投与後5および30分、ならびに1、2、4、8、24、32、48、72、96、144および168時間を包含した。凝固活性(aPTT)およびFVIIIFc血漿濃度に関する血液採取は、WBCTに関する上記の時点、ならびに用量投与後15分および3、6、12時間を包含した。
FVIII特異的色素生成検定による血漿中のFVIII活性の測定
Sysmex CA1500計器およびSiemans Healthcare Diagnostics(Dallas, TX;キット番号B4238-40)からの試薬を用いて、自動発色法により、FVIII活性に関して血漿試料を試験した。1.5~0.016 IU/mLの範囲の濃度でヒトFVIII欠失血漿(Stago USA)中に加えた第7次国際標準因子FVIII濃縮物(NIBSC コード 99/678)を用いて作成した標準曲線を用いて、rFVIIIFcの活性を確定した。
ELISAによるイヌ血漿中のFVIIIFc
A1ドメインに特異的なFVIII抗体(Green Mountain Antibodies:GMA-8002)を96ウェルプレート上に被覆し、37℃で1時間インキュベートした。被覆プレートを、室温で1時間、トゥイーン20、CaCl2およびウシ血清アルブミンを含有するトリス緩衝化生理食塩水で遮断して、次に、正常イヌ血漿中に調製された標準、対照および試料を、1:10希釈し、次いで、プレートに付加して、37℃で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次に、ロバ(F(ab)’2)抗ヒトFc-HRP(Jackson:709-036-098)を付加して、37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、TMB(BioFx超高感度基質:TMBS-0100-01)をプレートに付加し、酸で基質反応をクエンチして、SpectraMax
Plusプレート読取機(Molecular Devices)で450nmで、吸光度を測定した。
重鎖上のA1ドメインに特異的な抗FVIII抗体(Green Mountain Antibodies:GMA-8002)を96ウェルプレート上に被覆し、室温で2時間インキュベートした。被覆プレートを、37℃で1時間遮断し、洗浄後、標準、対照および試料を正常イヌ血漿中で調製し、次いで1:10希釈し、プレートに付加して、室温で2時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次に、検出抗体、予備希釈抗FVIIIホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体(Affinity Biologicals:F8C-EIA-D)で処理して、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、TMB(BioFx超高感度基質:TMBS-0100-01)をプレートに10分間付加した。酸で基質反応をクエンチして、SpectraMax Plusプレート読取機(Molecular Devices)で450nmの波長で、シグナルを測定した。
メーカーの使用説明書に従って、HemosIL(商標)PT-フィブリノーゲン-HS試薬(ILL, MA、カタログ番号0008468210)およびACL 7000凝固分析器(Beckman Coulter)を含有するキットを用いて、Esoterix(Research Triangle Park, NC)で、血漿中のフィブリノーゲンの濃度を測定した。
種特異的スマートカードでプログラムされたVet-ABC-Diff血液学分析器(SCIL Animal Care Co., Gurnee, IL)を用いて、自動化方法により、EDTA抗凝固化全血で血小板を計数した。
PharsightからのWinNonlinソフトウェア、バージョン5.2(Mountain View, Ca)を用いて、非分画解析により、薬物動態パラメーターを算定した。PKパラメーターは、血漿中最大濃度(Cmax)、血漿濃度対時間曲線下面積(AUC)、排出半減期(t1/2)、配分の容積(Vss)およびクリアランス(Cl)を包含した。
組換えFVIII-Fc
rFVIIIFcは、介在リンカー配列を有さないヒトBドメイン欠失FVIIIとヒトIgG1からのFcとの組換え融合物である(rFVIIIFc:図1)。
IU/nmolおよびReFacto(登録商標)に関しては1521~2287 IU/nmol)、ということを示す。したがって、rFVIIIFcのFVIII活性は、ヒトFVIIIのC末端とヒトFcのN末端との融合による影響を受けない。
単一回50 IU/kg用量のrFVIIIFcまたはReFacto(登録商標)をFVIII欠損マウス(n=6/群)に静脈内投与した。血液試料を用量投与前および120時間に亘る用量投与後に採取し、WBCTを材料および方法に記載したように決定した。基線WBCTは、60分より大きかった。代表的実験からのデータを、図2および表3に示す。rFVIIIFcまたはReFacto(登録商標)の用量投与直後に、WBCTを2~17分に補正した。ReFacto(登録商標)で処置されたマウスからの血液は42時間までに凝固する能力を失ったが、一方、rFVIIIFcで処置された全マウスからの血液は96時間で未だ凝固し、6匹のうちの1匹からの血液は、113時間で凝固していたが、しかし120時間までにはすべてが凝固する能力を失っていた。これらのデータは、rFVIIIFcに関する作用の持続期間は、ReFacto(登録商標)よりも約2~3時間長い、ということを示唆する。
rFVIIIFcの薬力学(PD)および薬物動態(PK)を、血友病AイヌのChapel Hillコロニーで試験した。125 IU/kgのrFVIIIFcの単一回静脈内用量投与を、4匹の血友病Aイヌの各々に施して、WBCTは直ちに正常に補正された(図4)。正常イヌにおけるWBCTの範囲は、8~12分である。約96時間を通してWBCTは20分より低いままであったが、この時間はFVIII:C>1%と一致する。但し、1匹は72時間の間、<20分のWBCTを示した。さらに、aPTTも直ちに正常に補正された(表6)。分子のFVIIIおよびFc部分の両方を検出するよう意図された特異的ELISAを用いて、血漿中のrFVIIIFcの濃度を測定した。血漿濃度対時間曲線を、図5に示す。データのPK分析は、t1/2が15.7±1.7時間であることを示した(表5)。FVIII特異的色素生成活性検定を用いてrFVIIIFcを測定した場合に、同様の結果を得た(t1/2=15.4±0.3時間、表5)。血漿濃度対時間曲線は、両方法を用いて、同様であった(図5および6)。rFVIIIFcに関する特異的活性を用いて活性データをIU/mLからng/mLに変換した場合、ELISAデータとの良好な相関が認められ、それにより、ELISAにより測定されたタンパク質が十分に活性であったことが実証された。
組換えFVIIIFcを、安定的トランスフェクト化細胞株からのヒト胚性腎臓293(HEK293)細胞中で産生し、細胞培地から精製した。ヒト細胞株中での産生は、チャイニーズハムスター卵巣細胞またはハムスター乳仔腎臓細胞において産生される一般に市販されているrFVIII製品と比較して、製造に際して有意の変化を示す。この変化についての論理的根拠は、この分子のFVIII部分に必要な翻訳後修飾を実施するよう、最良の備えをヒト細胞は有すると予測される、ということであった。
11: 387-96;この記載内容は参照により本明細書中で援用される)、糖PEG化(Stennicke HR, et al., Thromb. Haemost. 2008; 100: 920-8;この記載内容は参照により本明細書中で援用される)、ペギル化リポソームを用いる処方(Spira J, et al., Blood ;2006; 108: 3668-3673; Pan J, et al.,
Blood 2009; 114: 2802-2811;これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される)ならびにアルブミンとの共役(Schulte S., Thromb. Res. 2008; 122 Suppl 4: S14-9;この記載内容は参照により本明細書中で援用される)を包含する。ペギル化は、クリアランスを低減するためのアプローチを表わすが、しかしながら、in vivoでの修飾の作用は現在のところ知られていない。in vivoでのFVIIIの直接ペギル化の結果は現在のところ未知であるが、一方、ペギル化リポソームを用いて処方されるFVIIIは、臨床的に研究されてきており、出血期間に中等度の影響を及ぼすかまたは全く影響を及ぼさないことを示している(Spira J, et al., Blood ;2006; 108: 3668-3673;Spira J, et al., Thromb. Haemost. 2008 Sep; 100(3): 429-34;これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される)。
rFVIIIFc(Biogen Idec):1.2mg/mLおよび9882 IU/mLの濃度で、凍結液として供給。特異的活性は8235IU/mg。-70℃で保存。それを注射前に希釈。
ニュー・イベリア・リサーチセンター(NIRC)コロニーからのカニクイザルを用い、NIRC(New Iberia, LA)で、承認されたNIRC IACUCプロトコール(APS 2008-8733-058)下で、試験(NIRC試験番号8733-0903)を実行した。
6匹のサル(雄3匹、雌3匹)の各々に、125 IU/kgでrFVIIIFcを静脈内投与した。交差試験で、125 IU/kgで、同一動物にXyntha(登録商標)(BDD-rFVIII)を静脈内投与した。群1動物(n=3)は、0日目にXynthaを、3日目にrFVIIIFcを摂取したが、一方、群2動物(n=3)は、0日目にrFVIIIFcを、その後、4日目にXynthaを摂取した。群2に関しては用量投与間の付加的な日は、計画基線レベルより低く低減するのに十分な時間をrFVIIIFcが有したことを保証するためであった。ELISAならびにFVIII特異的色素生成活性検定によるrFVIIIFcまたはXynthaの測定のために、用量投与前、用量投与後0.25、4、12、24、36、48および72時間目に、各動物から、10分の1容積3.2%クエン酸ナトリウム中に血漿に関して血液を採取した。
サル血漿中のrFVIIIFcの測定方法
サル血漿中のrFVIIIFcを定量するために、この酵素結合免疫吸着検定(ELISA)を設計する。このELISA法では、Bethyl Laboratoriesからのヤギ抗ヒトIgG-(H+L)抗体(サル、吸着)(カタログ番号A80-319A)を、被覆緩衝液中に希釈し、96ウェル微量滴定試料プレート上に固定した。プレートを吸引し、37℃で2時間、遮断緩衝液(3%BSA/1×トリス)を付加することにより、すべての非吸着部位を遮断する。血漿試料を高カルシウム試料希釈緩衝液(3%無脂肪乾燥ミルク/TBST、30mMのCaCl2を含有)で1:20に希釈し、試料プレート上に分配する。プレートを、37℃で約2時間、インキュベートする。その後、プレートを洗浄し、Green Mountain Antibodiesからのマウス抗Bドメイン欠失(α.BDDA1)因子VIII(A1ドメイン)抗体(カタログ番号GMA-8002)をプレートに付加し、37℃で約1時間インキュベートする。プレートを洗浄後、Southern BiotechからのHRP共役ヤギ抗マウスIgG2a抗体(カタログ番号1080-05)をプレートに付加し、室温で約30分間インキュベートする。プレートを再び洗浄し、テトラメチルベンジジン(TMB)ペルオキシダーゼ基質溶液を付加し、室温で約30分間インキュベートする。非酸性停止溶液の付加により、反応を停止する。試料中のrFVIIIFcの量に比例して、発色する。単一検出波長650nmを用いて、吸光度プレート読取機でプレートを読取る。4-パラメーター・ロジスティック曲線当てはめプログラムを用いて、光学密度(OD)対濃度をプロットすることにより得られる標準曲線で、rFVIIIFc濃度を決定する。この方法の較正曲線範囲は、5%サル血漿中で0.400ng/mL~51.2ng/mL(100%サル血漿中では8.00ng/mL~1024ng/mL)である。5%サル血漿中で0.200ng/mLでの検定の適格範囲外の一較正物質が含まれて、曲線当てはめを促すためのアンカーポイントとして役立ち得る。曲線の最適当てはめに基づいて、アンカーポイントが除去されるかまたは保持される(すなわち、最高数の標準が限定精度内で読取る、%RE)。
サル血漿中のFVIIIを定量するために、この酵素結合免疫吸着検定(ELISA)を設計する。このELISA法では、Green Mountain AntibodiesからのマウスαBDDA1 FVIII抗体(カタログ番号GMA-8002)を被覆緩衝液中に希釈し、96ウェル微量滴定試料プレート上に固定した。プレートを吸引し、37℃で1時間、遮断緩衝液(3%BST/1×トリス)を付加することにより、すべての非吸着部位を遮断する。血漿試料を高カルシウム試料希釈緩衝液(100mMのCaCl2を含有する遮断緩衝液)で1:20に希釈し、試料プレート上に分配する。プレートを、37℃で約2時間、インキュベートする。プレートを洗浄後、Affinity Biologicals Kitからの検出抗体、HRP標識ポリクローナル抗体(カタログ番号F8C-EIA-D)をTBS/0.05%トゥイーン20中でさらに希釈し、プレートに付加し、室温で約1時間インキュベートする。プレートを再び洗浄し、テトラメチルベンジジン(TMB)ペルオキシダーゼ基質溶液を付加し、室温で約30分間インキュベートする。酸性停止溶液の付加により、反応を停止する。試料中のFVIIIFcの量に比例して、発色する。単一検出波長450nmを用いて、吸光度プレート読取機でプレートを読取る。4-パラメーター・ロジスティック曲線当てはめプログラムを用いて、光学密度(OD)対濃度をプロットすることにより得られる標準曲線で、FVIII濃度を決定する。この方法の較正曲線範囲は、5%サル血漿中で0.625ng/mL~20ng/mL(100%サル血漿中では12.5ng/mL~400ng/mL)である。5%サル血漿中で0.313および0.156ng/mLでの検定の適格範囲外の2較正物質が含まれて、曲線当てはめを促すためのアンカーポイントとして役立ち得る。曲線の最適当てはめに基づいて、アンカーポイントが除去されるかまたは保持される(すなわち、最高数の標準が限定精度内で読取る、%RE)。
カニクイザル血漿試料中のFVIII活性を投与用量に基づいて概算し、次いで、ヒトFVIII欠失血漿(Diagnostica Stago)中で約0.25~1 IU/mlに希釈した。FVIII色素生成キット(Siemens)を用いて、Sysmex CA1500(Siemens Diagnostic Healthcare)で試料を分析した。この色素生成検定では、血漿試料中のrFVIIIFcをトロンビンにより活性化する。次に、活性化因子VIII(FVIIIa)は、活性化因子IX(FIXa)、リン脂質(PL)およびカルシウムイオンの存在下で、第X因子(FX)の第Xa因子(FXa)への転換を促す。FXaに特異的なp-ニトロアニリド基質の加水分解により、FXa活性を査定する。405nmで測定されるp-ニトロアニリン(pNA)の放出の初期速度はFXa活性に比例し、したがって、試料中のFVIII活性に比例する。この検定におけるrFVIIIFcによるFVIII活性の定量限界は、~0.3 IU/mlである。検定は、±20%の精度で約0.06 IU/mlの下限より低い総FVIII活性を測定し得る。個々の動物に関する用量投与前試料の算定活性を各時点での値から差し引いて、PD曲線(FVIII活性対時間)を作成した。
WinNonlinソフトウェアプログラム(バージョン5.2;Pharsight
Corporation, Mountain View, CA)で、非分画解析モジュールを用いて、濃度時間プロフィールを評価した。
分子のFVIIIおよびFc部分の両方を測定するサンドイッチELISAフォーマットを用いて、サル血漿中のrFVIIIFcの濃度を測定した。データを表7に報告する。用量投与前試料はすべて、定量限界より低かった。図7は、長時間に亘る群平均rFVIIIFcおよびXyntha血漿濃度を示す。個々の血漿濃度対時間曲線を、図8に示す。rFVIIIFcおよびXynthaに関するPKパラメーターの要約を、それぞれ表9および10に示す。rFVIIIFcに関する平均t1/2は11.9±1.7時間(9.3~14.1時間の範囲)であり、そしてXynthaに関しては、平均排出t1/2は12.7±4.4時間(9.2~19.9時間の範囲)であった。
排出半減期は、125 IU/kgの単一回静脈内用量投与後のrFVIIIFcおよびXynthaでほぼ同じであった。
これは、重症(<1 IU/dL [1%]内因性因子VIII[FVIII])血友病Aを有する被験体におけるrFVIIIFcの単一回用量投与の安全性、耐容性および薬物動態を評価するよう意図されたI/IIa相・非盲検・交差・用量増加・マルチセンターおよびヒト初回試験である。合計約12名の治療歴のある患者を登録し、25または65 IU/kgでrFVIIIFcを投与する。スクリーニング(参照比較物質であるAdvate(登録商標)[rFVIII]の初回投与前28日以内に計画予定)ならびに初回注射前に無FVIII処置で最低4日(96時間)経過後、約6名の被験体がAdvate(登録商標)の単一回25 IU/kg用量投与を受けて、その後、3日間(72時間)薬物動態(PK)プロフィールを、次いで交差試験を受けて、7日間(168時間)PKプロファイリングのためのrFVIIIFcの25 IU/kg単一回、非盲検用量投与を受けた。最初の3名の被験体には、順次用量投与する。25 IU/kgのrFVIIIFcを用量投与した最初の3名の被験体に関しては、各被験体はrFVIIIFcの注射後14日目(336時間)に阻害剤査定を受ける。次の被験体(最初の3名の被験体のみに関して)の用量投与は、一旦、阻害剤試験が完了したら、行なう。3番目の被験体が14日阻害剤査定を完了した後、残りの3名の被験体(25 IU/kg)および6名の被験体(65 IU/kg)が、各用量群内で、少なくとも1日は離して逐次的に、加入し始める。
Xアーゼ複合体内の活性
FVIIIタンパク質(rBDD FVIIIおよびrFVIIIFc)とFIXaとの結合を調べるために、そしてFXを活性化するこれらのタンパク質の能力を測定するために、動態試験を実施して、Xアーゼ複合体の状況でのこれらの相互作用を検査した。この検定は、カルシウムの存在下でのリン脂質表面での活性化FIXおよび活性化rBDD
FVIIIまたはrFVIIIFcタンパク質とのXアーゼ複合体の形成を、ならびに色素生成または蛍光発生性基質の切断により測定した場合のFXのFXaへの転換をモニタリングすることを包含した。
FXを活性化するrBDD FVIIIおよびrFVIIIFcの能力を、上記のXアーゼ複合体の状況で試験した。トロンビン活性化FVIIIタンパク質を、カルシウムの存在下でFIXaおよびリン脂質とともにインキュベートし、次いで、FX特異的基質の存在下で異なる濃度のFXに付加して、FXa生成の速度を確定した(図11)。
rBDD FVIIIおよびrFVIIIFcとFIXaとの相互作用も、Xアーゼ複合体の状況で調べた。Xアーゼ複合体は、一定量のFXおよび種々のFIXaレベルを用いて、上記のように集合され、そしてFXa生成速度が決定される(図12)。これらのデータから、FIXaに対するFVIIIタンパク質の両方を用いて形成されるXアーゼ複合体に関するKd値を確定する(Chang 1997)。6つの分析物(二重反復実行を含有する3つの実験)の平均±対応する標準偏差、として、データを表す(表12)。両タンパク質は同様のKdおよびVmax値を有することが判明したが、これは、rFVIIIFcが認可rBDD FVIII製品と同様のFIXaとの匹敵する相互作用を有する、ということを示す。
実施例3で考察したI/IIa相臨床試験に関する暫定薬物動態データは、FVIIIFcに関する下記の結果を実証した。FVIIIFcは、ADVATE(全長rFVIII)と比較して、全身曝露(AUCINF)の約50%増、クリアランス(Cl)の約50%減、ならびに排出半減期およびMRTの約50~70%増を示した。さらに、FVIIIFcは、ADVATEと比較して、C168、TBLP1、TBLP3およびTBLP5値の増大を示した。
ベータHL :排出相半減期;t1/2βとしても言及される
C168 :用量投与後約168時間での基線を上回る概算FVIIIFc活性
Cl :クリアランス
MRT :平均滞留時間
TBLP1 :FVIIIFc活性が基線を上回る約1 IU/dLに減少した場合の用量投与後のモデル予測時間
TBLP3 :FVIIIFc活性が基線を上回る約3 IU/dLに減少した場合の用量投与後のモデル予測時間
TBLP5 :FVIIIFc活性が基線を上回る約5 IU/dLに減少した場合の用量投与後のモデル予測時間
実施例6
組換えBドメイン欠失因子VIII-Fc(rFVIIIFc)融合タンパク質は、FVIIIの半減期を延長するためのアプローチとして作製されてきた。rFVIIIFcの薬物動態(PK)を、血友病AマウスにおいてrFVIIIと比較した。終末半減期は、rFVIIIと比較してrFVIIIFcに関しては2倍長い、ということが判明した。半減期の延長に関する根本的機序がFcRnによるrFVIIIFcの保護のためであることを確証するために、FcRnノックアウトおよびヒトFcRnトランスジェニックマウスにおいて、PKを評価した。単一回静脈内用量(125 IU/kg)を投与して、色素生成活性検定を用いて血漿濃度を測定した。Cmaxは、両マウス系統において、rFVIIIFcおよびrFVIII(XYNTHA(登録商標))間で同様であった。しかしながらrFVIIIFcに関する半減期はFcRnノックアウトマウスにおいてはrFVIIIのものに匹敵したが、一方、rFVIIIFcに関する半減期は、hFcRnトランスジェニックマウスにおいてはrFVIIIより約2倍長く延長された。これらの結果は、FcRnが、rFVIIIと比較した場合、rFVIIIFcの半減期延長を媒介するかまたはそれに関与する、ということを確証する。回転血栓弾性測定法(ROTEM)により測定される全血の血流遮断は、血友病マウスの出血モデルにおける、ならびに臨床的適用において、凝固因子の効力と相関することが示されているため、ROTEMを用いて血友病AマウスにおけるrFVIIIFcのex vivo効力を評価しようとした。血友病Aマウスに、50 IU/kg rFVIIIFc、XYNTHA(登録商標)(FVIII)またはADVATE(登録商標)(FVIII)の単一回静脈内用量投与を施した。用量投与の5分後、血餅形成は、凝固時間(CT)、血餅形成時間(CFT)およびα角に関して同様であった。しかしながら、rFVIIIFcは、用量投与後72および96時間にCTの有意の改善を示し、そしてCFTおよびα角も、rFVIIIFcのPK延長と一致して、XYNTHA(登録商標)(FVIII)およびADVATE(登録商標)(FVIII)の両方に比して96時間で改善された。したがって、FVIIIのFc融合物の構築は、半減期増大と出血からの防御延長を提供する能力を有する作用の明示された機序を有する分子を産生する。
この実施例は、25および65 IU/kgのFVIII製品で処置された患者16名からのFVIII活性に関する最終分析結果を示す。実施例3および5参照。
この試験の第一の目的は、重症血友病Aを有する年齢12歳以上の治療歴のある患者(PTP)における2つの用量のrFVIIIFc(25および65 IU/kg)の単一回投与の安全性および耐容性を査定することであった。
スクリーニング来院時(Advateの用量投与前28日以内);注射前(Advateの注射)0日目ならびに注射後10および30分ならびに1、3、6および9時間目に;Advateの注射後24時間での1日目に;Advateの注射後48時間での2日目に;Advateの注射後72時間での3日目に;高用量のAdvateの投与後96時間での4日目に(コホートBのみ)、FVIII活性PK評価のために、血液試料を採取した。
略号
TBLP1=FVIII活性が、基線を越えた約1 IU/dLに減少した場合の用量投与後のモデル予測時間。
KV_OB=Cmax_OB/実用量(IU/kg)
IVR_M=100×Cmax_M×血漿容積(dL)/総用量(IU);ここで、血漿溶積(mL)=(23.7×体長(cm))+(9.0×体重(kg))-1709。
図13. 観察群平均(+SE)FVIII活性対時間プロフィール。用量レベルにより類別。化合物により群分け(1段階検定;25 IU/kg(A)および65 IU/kg(B)ならびに色素生成検定;25 IU/kg(C)および65 IU/kg(D))。
観察FVIII活性は、AdvateまたはrFVIIIFcの短時間IV注入後に急に増大し、平均(±SD)モデル予測Cmax値は、25および65 IU/kg用量群に関してそれぞれ、Advateに関しては56.6±4.74および121±28.2
IU/dLであり、rFVIIIFcに関しては55.6±8.18および108±16.9 IU/dLであった。AdvateおよびrFVIIIFc処置患者はすべて、FVIII活性の用量関連増大を示した。CmaxおよびAUCINFの両方において観察された増大は、評価された用量範囲を上回る用量に比例するよりわずかに低かった。
観察FVIII活性は、AdvateまたはrFVIIIFcの短時間IV注入後に急に増大し、平均(±SD)モデル予測Cmax値は、25および65 IU/kg用量群に関してそれぞれ、Advateに関しては70.2±9.60および157±38.6
IU/dLであり、rFVIIIFcに関しては70.3±10.0および158±34.7 IU/dLであった。
AdvateおよびrFVIIIFc処置患者はすべて、評価された用量範囲全体でCmaxおよびAUCINFの匹敵する用量関連性増大を示した。AdvateおよびrFVIIIFc活性のピーク血漿レベルは注入終了後1時間以内に一般的に観察され、用量投与後数日間、依然として検出可能であった。注入終了後、ベースライン補正FVIII活性の減少は、両製品に関して基線レベルに到達するまで、単一指数関数型崩壊特性を示した。排出半減期およびMRTに関するパラメーター値は、両FVIII製品に関して評価された用量範囲全体で用量非依存性であると思われた。AdvateおよびrFVIIIFcの用量増大に伴って、平均CLおよびV値のわずかな増大が認められた;しかしながら、用量レベル限定と結び付けて考えられる65 IU/kg用量での被験体間変動の増大は、これらのパラメーターの用量依存性の査定を混乱させた。
rFVIII:Fcのヒトで最初の試験からの暫定PK分析(実施例3)に基づいて、A-LONG試験を計画した。A-LONGは、重症血友病A(<1 IU/dL[<1%]内因性FVIIIと定義される)を有する治療歴のある被験体における出血の防止および処置に際しての組換え因子VIIIFc融合物(FVIII-Fc)の安全性、薬物動態および効力の非盲検マルチセンター評価である。
アーム1は、全群およびPK亜群を包含する。約66名の被験体が登録される。最初のレジメンは、週2回、初日に25 IU/kg、その後、その週の第4日に50 IU/kgである。rFVIIIFcに関するPK結果が得られるまで、被験体はこの週予防レジメンでrFVIIIFcを投与する。この結果に基づいて、各個体に関して目的に合わせた予防レジメンが確立されるが、この場合、用量および間隔は、1~3%FVIII活性のトラフレベルを保持するよう決定される。次いで、各被験体は、その個々の目的に合わせた予防レジメンを試験中ずっと受ける。
約20名の被験体が登録され/無作為化されて、以下のような簡易rFVIIIFc PKプロファイリングを受ける:少なくとも96時間の洗い出し;rFVIIIFc 65 IU/kgの単一回用量投与;0日目にrFVIIIFcで開始して、注射前、ならびに注射開始から10(±2)分、3時間(±15分)、72(±2)時間[第3日]、ならびに96(±2)時間[第4日]を含めた簡易試料採取。簡易PKプロファイリング後、次に被験体は7日毎に65 IU/kgの一定用量投与を受ける。
少なくとも5名の被験体における最低10の主要外科手術を、本試験で評価する。大手術は、全身麻酔および/または呼吸補助を伴う任意の外科的手法(待機または緊急)と定義され、この場合、大きい体腔が貫通され、曝露されるか、あるいは身体的または生理学的機能の実質的減損が生じる(例えば、開腹術、開胸術、開頭術、関節置換術および四肢切断術)。
・予防、週、要求に応じた、および外科的処置レジメンとして施されるrFVIIIFcの安全性および耐容性を評価すること
・予防、要求に応じた、および外科的処置レジメンとして施されるrFVIIIFcの効力を評価すること
第二の目的
・rFVIIIFcのPKプロフィールを特性化し、FVIIIFcのPKを現行の市販製品であるAdvate(登録商標)と比較すること
・rFVIIIFcによる個体応答を評価すること
・予防レジメンにおける出血を適切に防止し;外科的設定における恒常性を保持し;あるいは要求に応じた、週処置または予防設定における出血症状発現を処置するために必要とされる用量およびスケジュールの範囲を特性化すること
・rFVIIIFc消費を評価すること(例えば総年間rFVIIIFc消費量/被験体)。
臨床的ROTEM査定
実施例8における試験では、一段階活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)検定による血漿FVIII活性の測定のほかに、全血回転血栓弾性測定(ROTEM)も調べられて、2名の被験体、具体的には、低用量コホート1名および高用量コホート1名におけるrFVIIIFcおよびAdvateによる全般的血流遮断の改善を査定した。
表1:ポリヌクレオチド配列
A. Bドメイン欠失FVIIIFc
(i)Bドメイン欠失FVIIIFc鎖DNA配列(下線:FVIIIシグナルペプチド;太字:Fc領域)(配列番号1:これは配列番号2をコードする)
(ii)Fc(A(ii)(配列番号3)と同一配列)
C. 重鎖(HC)-Fc DNA配列(HCおよびFc間にリンカーなし)(下線:シグナルペプチド;太字:Fc領域)(配列番号7:これは配列番号8をコードする)
C.
(ii)重鎖(HC)-Fc DNA配列(HCおよびFc間に5アミノ酸リンカー)(下線:シグナルペプチド;太字:Fc領域;二重下線:5アミノ酸リンカー)(配列番号9:これは配列番号10をコードする)
A. Bドメイン欠失FVIII-Fc単量体ハイブリッド(BDD FVIIIFc単量体二量体):BDD FVIIIFcおよびFc鎖を同時発現することにより作製
構築物=HC-LC-Fc融合物。Fc発現カセットをBDDFVIII-Fcと同時トランスフェクトして、BDD FVIIIFc単量体を生成する。BDD FVIIIFc鎖に関しては、Fc配列を太字で示す;HC配列を二重下線で示す;残りのBドメイン配列をイタリック体で示す。シグナルペプチドには下線を付す。
構築物=HC-B-LC-Fc融合物。Fc発現カセットを全長FVIII-Fcと同時トランスフェクトして、全長FVIIIFc単量体を生成する。FVIIIFc鎖に関しては、Fc配列を太字で示す;HC配列を二重下線で示す;Bドメイン配列をイタリック体で示す。シグナルペプチドには下線を付す。
C. FVIII-Fcへテロ二量体ハイブリッド
これは、HC-FcおよびLC-Fc構築物を同時トランスフェクトすることにより製造される。2つのHC-Fc構築物が製造されている。一方はHCおよびFc間にリンカーを有さず(HC-Fc)、他方は、HCおよびFc間に5アミノ酸リンカーを有する(HC+5-Fc)。FVIIIシグナルペプチドをHC-Fc構築物のために用いたが、一方で、マウスIgκシグナル配列をLC-Fc構築物のために用いた。
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- 明細書に記載の方法。
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