MX2012005731A - Fragmento cristalizable (fc) de anticuerpo monomerico. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con polipéptidos Fc monoméricos y métodos para elaborar y utilizar estos polipéptidos. Los polipéptidos comprenden sustitución de uno o más residuos de interfase hidrofóbicos en la región CH3 con un aminoácido polar.

Description

FRAGMENTO CRISTALIZABLE (FC) DE ANTICUERPO MONOMERICO Antecedentes de la Invención Los anticuerpos juegan un papel central en la defensa contra moléculas extrañas invasoras. La capacidad de los anticuerpos para interactuar con el receptor Fe neonatal (FcRn, por sus siglas en inglés) de una manera dependiente del pH les confiere una vida media sérica prolongada (Ghetie y Ward 2000) . Este rasgo único de los anticuerpos permite prolongar la vida media de la proteína o péptido terapéutico en el suero al manipular moléculas de fusión con Fe. Los anticuerpos IgG que se encuentran de modo natural y las moléculas de fusión de Fe manipuladas son bivalentes y monoespecífica . Esto se debe a la naturaleza homodimérica de Fe. Para algunas aplicaciones terapéuticas sería deseable retener todos los atributos positivos conferidos por el anticuerpo o el fragmento Fe del anticuerpo pero obtener especificidad monovalente al manipular los Fe monoméricos .

Los anticuerpos pertenecen a la clase de proteínas denominadas inmunoglobulinas las cuales incluyen a IgG, IgA, IgE, IgM e IgD. La clase más abundante de inmunoglobulinas en el suero humano es IgG cuya estructura esquemática se muestra en la figura 1 (Deisenhofer 1981; Huber 1984; Roux 1999). La estructura de IgG tiene cuatro cadenas, dos cadenas ligeras y dos pesadas. Cada cadena ligera tiene dos dominios REF: 230667 y cada cadena pesada tiene cuatro dominios. El sitio de unión a antígeno se localiza en la región Fab (siglas en inglés para fragmento que se une a antígeno) el cual contiene un dominio de cadena ligera variable (VL, por sus siglas en inglés) y de cadena pesada variable (VH, por sus siglas en inglés) , así como dominios de cadena ligera constante (LC, por sus siglas en inglés) y pesada constante (CH1, por sus siglas en inglés) . El fragmento Fe (siglas en inglés para fragmento cristalizable) del anticuerpo contiene la región de dominio CH2 y CH3 de la cadena pesada. La molécula IgG se puede considerar como un heterotetrámero que tiene dos cadenas pesadas que se mantienen juntas por enlace disulfuro (-S-S-) en la región de bisagra y dos cadenas ligeras. El número de enlaces disulfuro de bisagra varía de entre las subclases de inmunoglobulina (Papadea y Check, 1989) . El sitio de unión FcRn se localiza en la región Fe del anticuerpo (Martin, West et al, 2001) y por lo tanto la propiedad de vida media en suero extendida del anticuerpo se retiene en el fragmento Fe. La región Fe sola se puede considerar como un homodímero de cadenas pesadas que comprende los dominios CH2 y CH3.

Sumario de la Invención En la presente se proporcionan polipéptidos Fe que contienen alteraciones en el dominio de interfase CH3 que reducen significativamente la capacidad del polipéptido para formar homodímeros . En modalidades preferidas, la reducción en dimerización es de aproximadamente 100%. Preferiblemente, los polipéptidos Fe incluyen uno o más aminoácidos cargados que son electrostáticamente desfavorables a la formación del homodímero CH3 y una sustitución de aminoácido de uno o más residuos de interfase CH3 hidrofóbicos con un residuo aminoácido polar, por ejemplo treonina.

En algunas modalidades, el dominio CH3 es un dominio CH3 de IgG humano que tiene alteraciones que son electrostáticamente desfavorables para la formación del homodímero CH3 que incluyen un aminoácido cargado negativamente, por ejemplo ácido aspártico, la posición 392 y/o la posición 409 y/o uno o más residuos de interfase hidrofóbica sustituidos que se seleccionan del grupo que consiste de Y349, L351, L368, V397, L398 e Y407.

El polipéptido Fe monomérico puede comprender además un dominio CH1 de anticuerpo o estar comprendido dentro de la cadena pesada del anticuerpo. En algunas modalidades, un anticuerpo monomérico comprende la cadena pesada monomérica y una cadena ligera, creando esencialmente un semianticuerpo . La cadena pesada monomérica puede tener uno o más residuos cisteína mutados para evitar la formación de enlace disulfuro. Las mutaciones cisteína particularmente útiles son aquellas en la región de bisagra de la cadena pesada.

En un aspecto de la invención, un polipéptido comprende un dominio CH3 de anticuerpo que tiene capacidad disminuida para formar homodímeros en comparación con un polipéptido que comprende un dominio CH3 natural. Los polipéptidos preferidos comprenden un dominio CH3 de un anticuerpo en donde el dominio CH3 comprende una secuencia de aminoácidos diferente del dominio CH3 natural de manera que uno o más aminoácidos cargados son sustituidos con aminoácidos electrostáticamente desfavorables para la formación del homodímero CH3 y uno o más residuos de interfase hidrofóbicos son sustituidos con un aminoácido polar .

Otros aspectos de la invención son ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos Fe monoméricos, vectores de expresión que comprenden a los ácidos nucleicos y células hospedadoras las cuales contienen los vectores de expresión.

Algunas modalidades de la invención incluyen además métodos para preparar un polipéptido Fe monomérico. En modalidades preferidas, los métodos comprenden cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido Fe monomérico bajo condiciones en donde el polipéptido Fe monomérico se expresa y después recuperar el polipéptido Fe monomérico del cultivo de célula hospedadora.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1A es un diagrama esquemático del anticuerpo IgGl con los dominios indicados . El anticuerpo IgGl es un tetrámero en forma de Y con dos cadenas pesadas (longitud más larga) y dos cadenas ligeras (longitud más corta) . Las dos cadenas pesadas se unen por enlaces disulfuro (-S-S-) en la región de bisagra. Fab - fragmento que une antígeno, Fe - fragmento cristalizable, VL - dominio de cadena ligera variable, VH - dominio de cadena pesada variable, CL - dominio de cadena ligera constante (sin variación de secuencia) , CHl - dominio 1 de cadena pesada constante, CH2 - dominio 2 de cadena pesada constante, CH3 -dominio 3 de cadena pesada constante. La figura IB es un diagrama esquemático del anticuerpo monovalente Fab fusionado a Fe monomérico. En este caso, la interfase de dominio CH3 se modifica a través de las mutaciones de aminoácidos .

La figura 2 muestra algunas de las modalidades que incluyen Fe monomérico (o monovalente) . Estas incluyen la fusión de las partes terminales N y C de Fe monomérico. La Fe retiene su capacidad para interactuar con el receptor FcRn, incluso sin dimerización de los dominios Fab, lo que genera una vida media suero más prolongada para proteínas/dominios que están fusionados al Fe monomérico. scFv - dominio variable de fragmento de cadena única.

La figura 3 muestra la estructura de interfase de dominio CH3 con residuos involucrados en la interacción dominio-dominio mostrada. Los residuos de interfase se identifican utilizando el método de recorte de distancia. Los residuos estructuralmente conservados y enterrados (área de superficie accesible por solvente <10%) se muestran con modelo de esferas y barras. Los residuos expuestos a solvente o estructuralmente no conservados se muestran en representación con barras. El análisis se basa en la estructura de cristal IgGl (código PDB; 1L6X) la cual se determina a alta resolución (1.65Á) (Idusogie, Presta et al. 2000) .

La figura 4A es una lista de construcciones diseñadas con mutaciones en la interfase de dominio CH3 de Fe y la figura 4B es un gel de coomassie SDS-PAGE teñido con reactivo de tinción azul GELCODER Blue Staining para ocho proteínas mutantes Fe purificadas. El mutante #4 de la tabla 2 no se incluye debido a cantidad insuficiente de proteína. Las construcciones se desplazan de modo similar en gel reducido y no reducido debido al hecho de que estas construcciones de Fe carecen de disulfuros de bisagra. En otras palabras, a diferencia de las moléculas IgG, no existen disulfuros entre cadena pesada que conecten las dos cadenas pesadas puesto que el objetivo aquí es obtener la cadena pesada Fe monomérica.

La figura 5A a la figura 5E muestran perfiles de cromatografía por exclusión de tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) de la totalidad de las 9 construcciones enumeradas en la tabla 2. Las construcciones muestran que el perfil SEC monoméríco ejemplar se marca como "monómero" .

La figura 6 es un análisis BIACORE de la unión de FcRn humano y de ratón a construcciones Fe naturales y mutantes .

La figura 7 es un análisis de tamaño de proteína utilizando ultracentrifugación analítica (AUC, por sus siglas en inglés) .

Las figuras 8A-8B son una comparación de secuencia del dominio CH3 de las subclases IgG humana y de ratón. Los residuos de la interfase de dominio CH3 identificada (24, tabla 1, indicado por "*") están altamente conservados. Por lo tanto, las mutaciones que llevan a monomeriaación en Fe de IgGl humana se pueden extender a otras subclases IgG humanas así como a especies diferentes a la humana. En la figura 8A la secuencias derivadas de IgGl, IgG2 , IgG3 e IgG4 humanas corresponden a las SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3 y SEC ID NO : 4, respectivamente. En la figura 8B la secuencias derivadas de IgGl humana, IgGl de ratón, lgG2a de ratón, IgG2b de ratón e IgG3 de ratón corresponden a las SEC ID NO: 5, SEC ID NO : 6, SEC ID NO : 7, SEC ID NO : 8 y SEC ID NO: 9, respectivamente.

La figura 9 muestra la farmacocinética de diversas moléculas de fusión Fe en ratones, como se describe en el ejemplo 2.

Descripción Detallada De la Invención La Fe natural es de naturaleza homodimérica y esta característica es impulsada por la fuerte interacción de alta afinidad que existe entre dos dominios CH3. En la presente se describen moléculas Fe monoméricas y métodos para elaborar y utilizar estas moléculas. Aunque el término "Fe" típicamente se considera como un homodímero de polipéptidos, el término, como se utiliza en la presente, debido a las propiedades únicas de los polipéptidos de la invención, también incluirá polipéptidos monoméricos los cuales comprenden una secuencia de aminoácidos que corresponde a la porción Fe de la cadena pesada, por ejemplo, que contienen un dominio CH2 y CH3.

Los métodos descritos en la presente demuestran que al sustituir residuos en la interfase de dominio CH3 , es posible romper completamente la asociación CH3/CH3 y aún así mantener la estabilidad a la molécula, y de esta manera obtener un Fe monomérico. La naturaleza monomérica del Fe alterado se puede determinar, por ejemplo, por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) y ultracentrifugación analítica (AUC, por sus siglas en inglés) . Las sustituciones llevan a cabo dos cosas - una es ocular la formación de homodímero del dominio CH3 y la otra es estabilizar la forma monomérica de Fe.

La metodología para identificar aminoácidos que constituyen una interfase CH3-CH3 se describe en el documento WO 2009089004. Un total de 48 estructuras cristalinas de anticuerpo las cuales presentan coordenadas que corresponden a la región Fe se identificaron de Protein Data Bank (PDB) (Bernstein, Koetzle et al. 1977) utilizando un algoritmo de búsqueda basado en la estructura (Ye y Godzik 2004) . El examen de las estructuras de cristal Fe identificadas muestra que la estructura determinada con la resolución más alta corresponde al fragmento Fe de RITUXIMAB unido a una versión minimizada del dominio B de la proteína A denominada Z34C (código PDB: 1L6X) . La estructura homodimérica de Fe biológica para 1L6X se generó utilizando las coordenadas de monómero Fe depositadas y simetría de cristal. Se utilizaron dos métodos para identificar los residuos involucrados en la interacción de dominio CH3-CH3: (i) contacto determinado por criterio de límite de distancia, y (ii) análisis de área de superficie accesible a solvente.

De acuerdo con el método basado en contacto, los residuos de la interfase se definen como residuos cuyos átomos pesados de cadena lateral se colocan más cercanos que el límite especificado desde los átomos pesados o cualquiera de los residuos en la segunda cadena. Aunque se prefiere el límite de distancia de 4.5 Á, uno también puede utilizar un límite de distancia más grande (por ejemplo, 5.5Á) con el fin de identificar los residuos de interfase (Bahar y Jernigan 1997) .

La tabla 1 enumera veinticuatro residuos de interfase identificados en base en el método de criterio de contacto utilizando el límite de distancia de 4.5Á. Estos residuos fueron examinados adicionalmente para conservación estructural. Para este propósito se identificaron 48 estructuras cristalinas Fe a partir de PDB y se superpusieron y analizaron por cálculo de desviación de media de raíz cuadrada para los átomos pesados de cadena lateral. La figura 3 muestra la interfase de dominio CH3 junto con posiciones estructuralmente conservadas, enterradas (% de ASA <10) y expuestas (% de ASA > 10) (% de ASA se refiere a la relación de ASA observado respecto a ASA estándar de aminoácidos; (Lee y Richards 1971) ) . La conservación de residuos de interfase entre las subclases de IgG humana y de ratón así como entre otras clases de Ig también se examinó a través de comparaciones de secuencia (figura 8) .

Diversas sustituciones o mutaciones de la porción Fe de un anticuerpo se describen en la presente. Estas variaciones se denominan por el aminoácido en aquella posición en la cadena pesada de anticuerpo natural basada en el esquema de numeración EU de Kabat seguido por el aminoácido sustituido en esa posición. Por ejemplo, cuando la tirosina en la posición EU 349 es sustituido con treonina, se denomina "Y349T". Mediante el término "secuencia natural" se quiere indicar una secuencia de aminoácidos como se encuentra de manera natural dentro de una especie de animales, por ejemplo humanos. La secuencia natural puede variar ligeramente entre individuos dentro de una población, por ejemplo diferentes alelos para las diversas cadenas inmunoglobulina se conocen en el ámbito.

Con el fin de desalentar la formación de homodímero uno o más residuos que constituyen la interfase CH3-CH3 se sustituyen con un aminoácido cargado de manera que la interacción se vuelve electrostáticamente desfavorable. En modalidades preferidas un aminoácido cargado positivamente en la interfase, tal como lisina, arginina o histidina se sustituye con un aminoácido cargado negativamente tal como ácido aspártico o ácido glutámico o un aminoácido cargado negativamente en la interfase se sustituye con un aminoácido cargado positivamente. Utilizando como un ejemplo la IgG humana, los residuos cargados dentro de la interfase que se pueden cambiar a un residuo de carga opuesta incluyen R355, D356, E357, E370, 392, D399, K409 y K439. En algunas modalidades preferidas, dos o más residuos cargados dentro de la interfase se cargan a una carga opuesta. Las moléculas ejemplares incluyen aquellas que comprenden mutaciones K392D y K409D y aquellas que comprenden mutaciones D399K y D356K.

Con el fin de mantener estabilidad del polipéptido en forma monomérica, uno o más residuos hidrofóbicos grandes que constituyen la interfase CH3-CH3 se sustituyen con un aminoácido polar pequeño. Utilizando IgG humana como un ejemplo, los residuos hidrofóbicos grandes de la interfase CH3-CH3 incluyen Y349, L351, L368, L398, V397, F405 e Y407. Los residuos aminoácidos polares pequeños incluyen asparagina, cisteína, glutamina, serina y treonina.

En los ejemplos, dos de los residuos Lys cargados positivamente que se encuentran localizados cercanamente a la interfase de dominio CH3 se mutan a Asp. La mutagénesis por exploración con treonina se ha llevado a cabo sobre los residuos hidrofóbicos grandes conservados estructuralmente en el fondo de estas dos mutaciones Lys a Asp. Las moléculas de Fe que comprenden las mutaciones K392D y K409D junto con diversas sustituciones con treonina se analizaron para formación de monómero. Las moléculas Fe monoméricas ejemplares incluyen aquellas que tienen sustituciones K392D, K409D e Y349T y aquellas que tienen sustituciones K392D, K409D y F405T.

Debido a la naturaleza semimolecular del monómero Fe, su estabilidad térmica es menor que la de un dímero Fe el cual tiene una interacción de dominio CH3-CH3 de alta afinidad. Con el fin de incrementar la estabilidad térmica, se pueden introducir uno o más enlace disulfuro intradominio en los dominios CH2 y CH3. Se pueden introducir enlaces disulfuro por mutación de uno o más de los siguientes pares de aminoácidos .

LYS246 - ASP249 SER267 - GLU269 THR393 - SER408 PR0245 - PR0257 PR0247 - ASP376 ASP249 - PR0257 VAL266 - TYR300 ASP270 - LYS326 L.EU309 - ASP312 ALA339 - PR0374 PR0343 - ALA431 ARG344 - TYR373 THR350 - LEU441 TRP381 - GLU388 PR0396 - PHE404 PHE241 - VAL262 LEU242 - LYS334 PHE243 - THR260 PR0245 - ASP249 LYS248 - ALA378 ASP249 - ARG255 THR250 - PR0257 LEU251 - HIS435 MET252 - ARG255 VAL259 - LEU306 CYS261 - SER304 VAL263 - VAL302 VAL264 - ASP265 LYS274 - SER324 ASN276 - LYS322 TYR278 - LYS320 ALA287 - LEU306 LYS290 - VAL303 ARG292 - VAL302 ASP312 - LYS317 SER324 - PR0331 GLU345 - ALA431 PR0346 - PHE372 VAL348 - LYS439 TYR349 - LEU368 LEU351 - THR366 PR0353 - GLU357 PR0353 - VAL363 SER354 - ASP356 LEU365 - LEU410 CYS367 - SER408 LYS370 - PHE405 SER375 - PR0396 SER375 - PHE404 ALA378 - MET428 GLU380 - SER426 TYR391 - LEU410 VAL422 - SER442 ASN434 - TYR436 Una capacidad de los anticuerpos para interactuar con el receptor Fe neonatal (FcRn, por sus siglas en inglés) , de una manera dependiente del pH le confiere una semivida sérica extendida. En modalidades preferidas, las moléculas Fe monoméricas de la presente invención retienen la capacidad para unir FcRn similarmente, si no de modo superior, a los polipéptidos Fe naturales (figura 6) . Como se muestra en el ejemplo 2, las moléculas Fe monoméricas de la presente invención pueden retener una vida media en suero prolongada mostrada por anticuerpos y, de esta manera, son útiles para prolongar la vida media sérica de los polipéptidos unidos covalentemente a, por ejemplo, fusionados al polipéptido Fe monomérico. Se contempla adicionalmente que el Fe monomérico puede ser manipulado para contener una o más mutaciones adicionales que incrementen la afinidad por FcRn y de esta manera incrementan adicionalmente la vida media de la molécula en circulación. Las mutaciones adicionales incluyen, pero no se limitan a, M252Y/S254T/T256E, M428L/N434S, T250Q/M428L, N434H( T307Q/N434A, T307Q/N434S, T307Q/E380A/N34S y V308P/N434S.

Las composiciones y métodos de la presente invención no se limitan a variantes de los alelos ejemplares descritos en la presente sino que incluyen aquellos que tienen por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 81%, por lo menos 82%, por lo menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% y por lo menos 99% de identidad con un alelo ejemplar descrito en este documento. Para propósitos de comparación de las características de las moléculas que contienen CH3 de la presente invención con las moléculas que contienen CH3 humano natural, las secuencia naturales son aquellas que se establecen en la figura 8 (a) como las SEC ID NOS: 1-4 (IgGl, IgG2 , IgG3 e IgG4 , respectivamente).

Se contempla que la creación de moléculas que contienen Fe monomérico no se limita a aquellas basadas en Fe de IgG sino que también son aplicables a la región Fe de otras subclases de inmunoglobulinas que incluyen IgA, IgE, IgD e IgM.

Virtualmente cualquier molécula que contenga un dominio Fe puede comprender un dominio Fe monomérico de la presente invención. Los ejemplos de estas moléculas se muestran en la figura 2. Como se muestra en la figura 2 se pueden fusionar o conjugar diversos péptidos a las partes N terminal o C terminal de Fe. En algunas modalidades, la molécula que contiene Fe se fusiona a un Fab para crear un semianticuerpo . El semianticuerpo se puede crear al expresar una cadena pesada que comprende una Fe monomérica y una cadena ligera recombinantemente en una célula, por ejemplo, una célula CHO. La cadena pesada puede contener una o más mutaciones adicionales. En algunas modalidades, la cadena pesada comprende además mutación de uno o más residuos cisteína en la región de bisagra (Alien et al., Biochemistry, 2009, mayo 5, 48 (17) :3755-66) .

Los polipéptidos Fe de la presente invención demuestran dimerización reducida en comparación con las moléculas Fe naturales. De esta manera, las modalidades de la invención incluyen composiciones que comprenden un anticuerpo o una molécula de fusión de Fe, en donde la cantidad de dimerización Fc-Fc presentada por el anticuerpo o la molécula de fusión Fe es menor de 15%, menor de 14%, menor de 13%, menor de 12%, menor de 11%, menor de 10%, menor de 9%, menor de 8%, menor de 7%, menor de 6%, menor de 5%, menor de 4%, menor de 3%, menor de 2% o menor de 1%. La dimerización se puede medir por cualquiera de diversas técnicas conocidas en el ámbito. Los métodos preferidos para medir dimerización incluyen cromatografía de exclusión de tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) , ultracentrifugación analítica (AUC, por sus siglas en inglés) , dispersión dinámica de luz (DLS, por sus siglas en inglés) y PAGE nativa.

Las moléculas de monómero de Fe descritas en la presente son útiles para extender la vida media de proteínas o dominios terapéuticos . Las enfermedades que pueden ser tratadas con un monómero Fe terapéutico pueden incluir inflamación, cáncer, trastornos metabólicos y otros. Los objetivos de fusión potenciales incluyen dominio de unión de proteína natural (tal como IL-IRa, TIMP3, péptido SHK, EPO, G-CSF) , fragmentos de anticuerpo (tal como Fab, scFv, diacuerpo, enlazantes derivados de dominio variable) andamiaje alternativo derivado de dominios de unión de proteína (tales como variantes Fn3 , variantes repetidas de ankirina, variantes de centirina, avímeros) y péptidos que reconocen antígenos específicos. Las proteínas de fusión de monómero Fe tienen la ventaja de tamaño pequeño y por lo tanto una capacidad potencialmente mejor para penetrar tejidos. Las proteínas de fusión de monómero Fe pueden ser especialmente útiles cuando se prefiere monovalencia de unión a objetivo. La monovalencia con frecuencia se prefiere cuando se direccionan moléculas de superficie celular que son susceptibles de agonismo cuando se dirigen utilizando anticuerpos multivalentes .

Definiciones A menos que se defina en otro sentido en este documento, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente invención tendrán los significados entendidos habitualmente por aquellos comúnmente expertos en el ámbito. Además, a menos que se requiera en otro sentido por el contexto, los términos en singular incluirán formas plurales y los términos plurales incluirán formas singulares. De modo general, las nomenclaturas utilizadas en relación y las técnicas de cultivo celular y de tejido, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y proteína y química de ácido nucleico e hibridación descritas en la presente son aquellas bien conocidas y utilizadas habitualmente en el ámbito. Los métodos y técnicas de la presente invención generalmente se llevan a cabo de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en el ámbito y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se mencionan y describen a través de la presente especificación, a menos que se indique en otro sentido. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) and Harlow and Lañe Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) , las cuales se incorporan en la presente como referencia. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se llevan a cabo de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se elaboran comúnmente en el ámbito o como se describe en la presente. La terminología utilizada en relación con y los procedimientos de laboratorio y técnicas de química analítica, química orgánica de síntesis y química médica y farmacéutica descrita en la presente son bien conocidos y utilizados habitualmente en el ámbito. Las técnicas estándar se pueden utilizar para síntesis química, análisis químico, preparación farmacéutica, formulación y suministro y en el tratamiento de pacientes.

A menos que se indique en otro sentido, los siguientes términos se entenderá que tienen los siguientes significados. El término "molécula aislada" (en donde la molécula es, por ejemplo, un polipéptido, un polinucleótido o un anticuerpo) es una molécula que, en virtud de su origen o fuente de derivación (1) no está asociada con componentes asociados naturalmente que la acompañan en su estado nativo, (2) está sustancialmente libre de otras moléculas de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, o (4) no se presenta en la naturaleza. De esta manera, una molécula que es sintetizada químicamente o que se expresa en un sistema celular diferente al de la célula en la cual se origina de modo natural estará "aislada" de sus componentes asociados de modo natural . Una molécula también se puede volver sustancialmente libre de los componentes con los que se asocia de modo natural mediante aislamiento, utilizando técnicas de purificación bien conocidas en el ámbito. La pureza u homogeneidad de una molécula se pueden analizar por numerosos medios bien conocidos en el ámbito. Por ejemplo, la pureza de una muestra polipeptídica se puede analizar utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción del gel para visualizar el polipéptido utilizando técnicas bien conocidas en el ámbito. Para algunos propósitos, se puede proporcionar una resolución mayor mediante la utilización de CLAP u otro medio bien conocido en el ámbito para purificación.

Las secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas se indican utilizando las abreviaturas estándar de una o de tres letras. A menos que se indique en otro sentido, las secuencias polipeptídicas tienen sus partes amino-terminales a la izquierda y sus partes carboxi-terminales a la derecha, y las secuencias de ácido nucleico de cadena sencilla y la secuencias de ácido nucleico con la cadena superior o de cadena doble tienen sus partes 5' terminal a la izquierda y sus partes 3' terminal a la derecha. Un polinucleótido particular o una secuencia polinucleotídica también se puede describir al explicar de que manera difiere con respecto a una secuencia de referencia.

Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" hacen referencia cada uno a una molécula que comprende dos o más residuos aminoácidos unidos entre si por enlaces peptídicos. Estos términos abarcan, por ejemplo, proteínas nativas y artificiales, fragmentos de proteína y análogos polipeptídicos (tales como muteínas, variantes y proteínas de fusión) de una secuencia proteínica así como proteínas modificadas post-traduceionalmente o de alguna otra manera, de modo covalente o no covalente. Un péptido, polipéptido o proteína puede ser monomérico o polimérico.

El término "fragmento polipeptídico" , de la manera en que se utiliza en la presente, se refiere a un polipéptido que tiene una supresión en la parte amino-terminal y/o carboxi-terminal en comparación con una proteína correspondiente de longitud completa. Los fragmentos pueden ser, por ejemplo, de una longitud de por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350 ó 400 aminoácidos. Los fragmentos también pueden ser de una longitud, por ejemplo, como máximo de 1,000, 750, 500, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 14, 13, 12, 11 ó 10 aminoácidos. Un fragmento puede comprender además, en cualquiera o en ambos de sus extremos, uno o más aminoácidos adicionales, por ejemplo una secuencia de aminoácidos de una proteína diferente como se encuentra en la naturaleza o una secuencia artificial de aminoácidos.

Los polipéptidos de la invención incluyen polipéptidos que han sido modificados de cualquier manera y por cualquier motivo, por ejemplo, para: (1) reducir la susceptibilidad a proteólisis, (2) reducir la susceptibilidad a oxidación, (3) alterar la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alterar afinidades de unión, y (4) conferir o modificar otras propiedades fisicoquímicas funcionales . Los análogos incluyen muteínas de un polipéptido. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos únicos o múltiples (por ejemplo sustituciones conservadoras de aminoácidos) en una secuencia como se presenta en la naturaleza (por ejemplo, en la porción del polipéptido fuera de uno o varios de los dominios que forman contactos intermoleculares) . Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella que no cambia sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (por ejemplo, un aminoácido de sustitución no debe presentar tendencia a romper una hélice que se genera en la secuencia original, o a romper otros tipos de estructura secundaria que caracterizan a la secuencia original o que son necesarias para su funcionalidad) . Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias polipeptídicas reconocidas en el ámbito se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed. , W. H. Freeman and Company, New York (1984) ) ; Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991); y Thornton et al. Nature 354:105 (1991), cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia.

Una "variante" de un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos en donde uno o más residuos aminoácidos se insertan dentro, se suprimen de y/o se sustituyen en la secuencia de aminoácidos en relación a otra secuencia polipeptídica . Las variantes de la invención incluyen aquellas que comprenden un dominio CH2 o CH3 variante. En algunas modalidades, una variante comprende una o más mutaciones que, cuando están presentes en una molécula Fe incrementan la afinidad por el polipéptido a uno o más FcyRs . Las variantes demuestran citotoxicidad incrementada mediada por células dependientes de anticuerpo. Los ejemplos de variantes que proporcionan estos se describen en la patente de E.U.A. número 7,317,091.

Otras variantes incluyen aquellas que disminuyen la capacidad de los polipéptidos que contienen el dominio CH3 a homodimerizar . Los ejemplos de las variantes Fe se describen en las patentes de E.U.A. números 5,731,168 y 7,183,076. Los ejemplos adicionales se describen en las solicitudes provisionales de E.U.A. en copropiedad, 61/019,569 presentada el 1/7/08 y 61/120,305, presentada el 12/5/08 (ambas incorporadas como referencia en su totalidad) .

Un "derivado" de un polipéptido es un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) que ha sido modificado químicamente, por ejemplo vía conjugación a otra porción química tal como, por ejemplo, polietilenglicol, un agente citotóxico, albúmina (por ejemplo, albúmina sérica humana) , fosforilación y glucosilación. A menos que se indique en otro sentido, el término "anticuerpo" incluye, además de los anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, derivados, variantes, fragmentos y muteínas de los mismos, cuyos ejemplos se describen en este documento.

El término "anticuerpo humano" incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivados de secuencias de inmunoglobulina humana. En una modalidad, la totalidad de los dominios variable y constante se derivan de secuencias inmunoglobulina humana (un anticuerpo completamente humano) . Estos anticuerpos se pueden preparar en una diversidad de maneras, cuyos ejemplos se describen a continuación, que incluyen a través de la inmunización con un antígeno de interés de un ratón que ha sido modificado genéticamente para expresar anticuerpos derivados de genes que codifican para la cadena pesada y/o ligera humana. En algunas modalidades, la cadena pesada del anticuerpo humano se altera en el dominio CH3 para reducir la capacidad de la cadena pesada a dimerizar.

Un anticuerpo humanizado tiene una secuencia que difiere de la secuencia de un anticuerpo derivado de una especie no humana por una o más sustituciones, supresiones y/o adiciones de aminoácidos de manera que el anticuerpo humanizado es menos probable que induzca una respuesta inmunitaria y/o que induzca una respuesta inmunitaria menos grave, en comparación con el anticuerpo de la especie diferente a la humana cuando se administra a un sujeto humano. En una modalidad, algunos aminoácidos en los dominios de infraestructura y constante de las cadenas pesada y/o ligera del anticuerpo de especie diferente a la humana se mutan para producir un anticuerpo humanizado. En otra modalidad, uno o varios de los dominios constantes de un anticuerpo humano se fusionan a uno o varios de los dominios variables de una especie no humana. Los ejemplos de la manera para producir anticuerpos humanizados se puede encontrar en las patentes de E.U.A. números 6,054,297, 5,886,152 y 5, 877, 293.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más anticuerpos adicionales. En un ejemplo de un anticuerpo quimérico, una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica, homologa o se deriva de un anticuerpo de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular mientras que el resto de una o varias de las cadenas son idénticas, homologas o derivadas de uno o varios anticuerpos de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo. También se incluyen fragmentos de anticuerpos los cuales presentan la actividad biológica deseada.

Los fragmentos o análogos de anticuerpos se pueden preparar fácilmente por aquellos habitualmente expertos en el ámbito siguiendo las enseñanzas de esta especificación y utilizando técnicas bien conocidas en el ámbito. Los fragmentos amino terminales y carboxi terminales preferidos o los análogos se presentan cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales se pueden identificar por comparación de los datos de secuencias nucleotídicas y/o de aminoácidos con bases de datos de secuencias públicas o registradas. Se pueden utilizar métodos de comparación computarizados para identificar motivos de secuencia o para predecir dominios de confirmación de protelna que se presenten en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Véase, por ejemplo, Bowie et al., 1991, Science 253:164.

Un "anticuerpo injertado de CDR" es un anticuerpo que comprende una o más CDR derivadas de un anticuerpo de una especie o isotipo particulares y la infraestructura de otro anticuerpo de una especie o isotipo igual o diferente.

El "porcentaje de identidad" de dos secuencias polinucleotídicas o dos secuencias polipeptídicas se determina al comparar las secuencias utilizando un programa de computadora GAP (una parte de GCG Wisconsin Package Versión 10.3 (Accelrys, San Diego, CA) ) utilizando sus parámetros implícitos.

El término "polinucleótido" , "oligonucleótido" y "ácido nucleico" se utilizan de manera intercambiable en la presente e incluyen moléculas de ADN (por ejemplo ADNc o ADN genómico) , moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) , análogos de ADN o ARN generados utilizando análogos nucleotídicos (por ejemplo ácidos péptido nucleicos y análogos nucleotídicos que no se encuentran de manera natural) e híbridos de los mismos. La molécula de ácido nucleico puede ser de cadena sencilla o de cadena doble. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden un marco de lectura abierto contiguo que codifica para un anticuerpo o una fusión Fe y un derivado, muteína o variante del mismo.

Los polinucleótidos de dos cadenas sencillas son "el complemento" entre sí si sus secuencias se alinean en una orientación antiparalela de manera que cada nucleótido en el polinucleótido es opuesto a su nucleótido complementario en el otro polinucleótido, sin introducción de separaciones y sin nucleótidos no pareados en el extremo 5 ' ó 31 de sus secuencias. Un polinucleótido es "complementario" a otro polinucleótido si los dos polinucleótidos pueden hibridizar entre sí bajo condiciones de rigurosidad moderada. De esta manera, un polinucleótido puede ser complementario a otro polinucleótido sin ser su complemento.

Un "vector" es un ácido nucleico que se puede utilizar para introducir otro ácido nucleico unido al mismo dentro de una célula. Un tipo de vector es un "plásmido" el cual se refiere a una molécula de ADN de cadena doble lineal o circular en la cual se pueden ligar segmentos adicionales de ácido nucleico. Otro tipo de vector es un vector viral (por ejemplo, retrovirus defectuosos de replicación, adenovirus y virus adeno-asociado) , en donde los segmentos de ADN adicionales se pueden introducir en el genoma viral. Algunos vectores son capaces de replicación autónoma en la célula hospedadora dentro de la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que comprenden un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos) . Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) se integran en el genoma de una célula hospedadora por introducción en la célula hospedadora y de esta manera se replican junto con el genoma del hospedador. Un "vector de expresión" es un tipo de vector que puede dirigir la expresión de un polinucleótido seleccionado.

Una secuencia nucleotídica está "unida operablemente" a una secuencia reguladora si la secuencia reguladora altera la expresión (por ejemplo el nivel, sincronización o ubicación de expresión) de la secuencia nucleotídica. Una "secuencia reguladora" es un ácido nucleico que altera la expresión (por ejemplo el nivel, sincronización o ubicación de expresión) de un ácido nucleico al cual está unido operablemente. Por ejemplo, la secuencia reguladora puede ejercer sus efectos directamente sobre el ácido nucleico regulado o a través de la acción de una o más moléculas adicionales (por ejemplo, polipéptidos que se unen a la secuencia reguladora y/o ácido nucleico) . Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, mej oradores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) . Los ejemplos adicionales de secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 18, Academic Press, San Diego, CA and Barón et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06.

Una "célula hospedadora" es una célula que se puede utilizar para expresar un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico de la invención. Una célula huésped puede ser procariota, por ejemplo E. coli o puede ser eucariota, por ejemplo, una eucariota de una sola célula (por ejemplo, una levadura u otro hongo) , una célula vegetal (por ejemplo una célula de planta de tabaco o de tomate) , una célula animal (por ejemplo una célula humana, una célula de mono, una célula de hámster, una célula de rata, una célula de ratón o una célula de insecto) o un hibridoma. Las células hospedadoras ejemplares incluyen las líneas de células de ovario de hámster Chino (CHO, por sus siglas en inglés) o sus derivados, que incluyen CHO, cepa DXB-11, la cual es deficiente en DHFR (véase Urlaub et al., 1980, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-20), líneas de células CHO las cuales crecen en medio libre de suero (véase Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31), células CS-9, un derivado de células CHO DXB-11, y células AM-l/D (descritas en la patente de E.U.A. número 6,210,924). Otras líneas de células CHO incluyen CHO-K1 (ATCC# CCL-61) , EM9 (ATCC#CRL 1861), y UV20 (ATCC# CRL-1862) . Los ejemplos de otras células hospedadoras incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (véase Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células HeLa, y líneas de células BHK (ATCC CRL 10) , la línea de células CVl/EBNA derivada de la línea de células CVl de riñón de mono verde Africano (ATCC CCL 70) (véase McMahan et al., 1991; EMBO J. 10:2821), células de riñón embriónico humano tales como 293, 293 EBNA o MSR 293, células A431 epidérmicas humanas, células humanas Colo205, otras líneas de células de primate transformadas, células diploides normales, cepas de células derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, células HL-60, U937, HaK o Jurkat. Típicamente, una célula hospedadora es una célula cultivada que se puede transformar o transfectar con un ácido nucleico que codifica para un polipéptido, el cual después se puede expresar en la célula hospedadora.

La frase "célula hospedadora recombinante" se puede utilizar para indicar una célula hospedadora que se ha transformado o transfectado con un ácido nucleico que se va a expresar. Una célula hospedadora también puede ser una célula que comprende el ácido nucleico pero que no lo expresa en el nivel deseado a menos que se introduzca una secuencia reguladora dentro de la célula hospedadora de manera que se vuelva unida operablemente con el ácido nucleico. Se entiende que el término célula hospedadora se refiere no solo a la célula objeto particular sino a la descendencia o descendencia potencial de esta célula. Debido a que se pueden presentar ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido, por ejemplo, a mutación o influencia ambiental, de hecho, la descendencia puede no ser idéntica a la célula original, pero aún se le incluye dentro del alcance del término como se utiliza en la presente.

Composiciones Farmacéuticas Los polipéptidos de la invención son particularmente útiles para la formulación en composiciones farmacéuticas. Las composiciones comprenden uno o más componentes adicionales tales como portadores, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables. De manera opcional, la composición comprende adicionalmente uno o más agentes fisiológicamente activos, por ejemplo, como se describe más adelante. En diversas modalidades particulares, la composición comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis agentes fisiológicamente activos además de uno o más de anticuerpo monomérico y/o proteína de fusión Fe de la presente invención.

En una modalidad, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo monomérico y/o una proteína de fusión Fe de la invención junto con una o más sustancias que se seleccionan del grupo que consiste de un amortiguador, un antioxidante tal como ácido ascórbico, un polipéptido de peso molecular bajo (tales como aquellos que tienen menos de 10 aminoácidos) , una proteína, un aminoácido, un carbohidrato tal como glucosa, sacarosa o dextrinas, un agente quelante tal como EDTA, glutatión, un estabilizante y un excipiente. La solución salina amortiguada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica con específica son ejemplos de diluyentes apropiados. De acuerdo con las normas apropiadas de la industria también se pueden agregar conservadores tales como alcohol bencílico. La composición se puede formular como un liofilizado utilizando soluciones excipientes apropiadas (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes. Los componentes adecuados son no tóxicos a quien los recibe a las dosificaciones y concentraciones utilizadas. Los ejemplos adicionales de componentes que se pueden utilizar en formulaciones farmacéuticas se presentan en Remington's Pharmaceuticals Science, 16th Ed. (1980) and 20th Ed. (2000) , Mack Publishing Company, Easton, PA.

Los kits para uso por los profesionales de la medicina se proporcionan incluyendo uno o más de un anticuerpo monomérico y/o proteínas de fusión Fe de la invención y una marca u otras instrucciones para uso en el tratamiento de cualquier otra condición descrita en la presente. En una modalidad, el equipo incluye preparación estéril de uno o más de un anticuerpo monomérico y/o una protelna de fusión Fe, la cual puede estar en forma de una composición como se describe en lo anterior y puede estar en uno o más frascos.

Las dosificaciones y la frecuencia de administración pueden variar de acuerdo con factores tales como la vía de administración, el anticuerpo monomérico particular y/o la proteína de fusión Fe utilizada, la naturaleza y gravedad de la enfermedad que se va a tratar, si la condición es aguda o crónica, y el tamaño y condición general del sujeto. Se pueden determinar dosificaciones apropiadas por procedimientos conocidos en la técnica pertinente, por ejemplo en ensayos clínicos que pueden involucrar estudios de incremento de dosis .

Un anticuerpo momomérico y/o una proteína de fusión Fe de la invención se puede administrar, por ejemplo, una o más de una vez, por ejemplo a intervalos regulares durante un periodo de tiempo. En modalidades particulares, un anticuerpo monomérico y/o una proteína de fusión Fe se administra durante un período de por lo menos una vez al mes o más, por ejemplo durante uno, dos o tres meses o incluso de manera indefinida. Para tratar condiciones crónicas, el tratamiento a largo plazo generalmente es más eficaz. No obstante, para tratar condiciones agudas puede ser suficiente una administración por períodos más cortos, por ejemplo de una a seis semanas. En general, el anticuerpo momomérico y/o la proteína de fusión Fe se administra hasta que el paciente manifiesta un )grado médicamente relevante de mejoría con respecto a valores iniciales para el indicador o indicadores seleccionados .

Como se entiende en el campo pertinente, las composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo monomérico y/o la proteína de fusión Fe de la invención se administran a un sujeto de una manera apropiada a la indicación. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por cualquier técnica adecuada que incluye, pero que no se limita a vía parenteral, tópica o por inhalación. Si se inyecta, la composición farmacéutica se puede administrar, por ejemplo, por vía intraarticular, intravenosa, intramuscular, intralesional , intraperitoneal o subcutánea, por inyección en bolo o por infusión continua. La administración localizada, por ejemplo en un sitio de enfermedad o daño se contempla, así como el suministro transdérmico y la liberación sostenida desde implantes. El suministro por inhalación incluye, por ejemplo, inhalación nasal u oral, uso de un nebulizador, inhalación del anticuerpo monomérico y/o la proteína de fusión Fe en forma de aerosol y similares.

Ejemplos Ejemplo 1 Los residuos involucrados en la interacción de dominio CH3--CH3 se identificaron utilizando un criterio de límite de distancia. Existen veinticuatro residuos localizados en la interfase de dominio CH3 (tabla 1) . Estos veinticuatro residuos se examinaron para conservación estructural de cadena lateral utilizando estructuras cristalinas de anticuerpo Fe conocidas disponibles (figura 3) . El análisis mostró una conservación estructural al tapar algunos de los residuos hidrofóbicos . La energía libre de asociación entre dos dominios CH3 también se calcula utilizando un método computacional (Pokala and Handel 2005) al mutar las 24 posiciones de interfase y L398 (un residuo en contacto con el residuo de interfase K392) con alanina, un residuo a la vez. El cálculo y el análisis de conservación estructural mostró que 6 de los 24 residuos contribuyen de manera significativa a la formación del dímero de dominio CH3. Estas 6 posiciones se analizaron para determinar el efecto de la sustitución.

TABLA 1: LISTA DE LOS RESIDUOS DE INTERFASE DE DOMINIO CH3 EN LA PRIMERA CADENA (A) Y SUS RESIDUOS DE CONTACTO DE CADENA LATERAL EN LA SEGUNDA CADENA (B) a aDebido a la simetría doble presente en la interacción de dominio CH3-CH3, cada interacción pareada está representada dos veces en la estructura (por ejemplo, Ser A 364 - Leu B3681 y Leu A 439 - Ser B 3641 ) . No obstante, los pares Leu A 351 - Pro B 352', Leu A 351 - Pro B 353', Lys A 392 - Leu B 398', Val A 397 - Thr B 393' y Tyr A 407 - Ser B 408' involucran contactos cadena lateral-cadena principal de manera que están representados solo una vez .

Las proteínas mutantes de Fe que corresponden a la sustitución de treonina en cada una de las 6 posiciones se generaron (tabla 2) . Adicionalmente también se generaron los mutantes Fe F405T Y407R e Y407R. Para incrementar la probabilidad de formación Fe monomérica completa, se generaron mutaciones en las 6 posiciones en el fondo de la variante Fe con debilitamiento de CH3/CH3, en la cual la lisina 392 y la lisina 409 mutaron a ácido aspártico (K392D K409D Fe) .

TABLA 2 ND; no determinado Se generaron las mutaciones enumeradas en la tabla 2 (#2 a #9) en IgGl Fe K392D K409D utilizando mutagénesis dirigida a sitio Multi-QuikChange (Strategene) . Los cebadores oligoméricos utilizados son los siguientes: #2: 51 -gaaccacaggtgactaccctgcccccatc (SEC ID NO: 10) #3: 5 ' -caggtgtacaccactcccccatcccggg (SEC ID NO: 11) #4: 51 -cagcctgacctgcactgtcaaaggcttctatc (SEC ID NO: 12) #5: 51 -cacgcctcccgrgactgactccgacggctc (SEC ID NO: 13) #6: 51 -gacggctccttcactctctatagcgac (SEC ID NO: 14) #7: 51 -ctccttcctcactagcgacctacc (SEC ID NO: 15) #8: 5 ' -gacggctccttcactctccgaagcgacctcacc (SEC ID NO: 16) #9: 5 ' -ctccttcttcctccgaagcgacctcacc (SEC ID NO: 17) .

Las mutaciones esperadas se confirmaron por secuenciado de ADN. Las proteínas Fe originales (hu IgG Fe K409D K392D) y imitantes se expresaron en células 293E utilizando un vector de expresión de mamífero transitorio pTT5. Las proteínas Fe se purificaron utilizando cromatografía estándar de proteína A (columna de 5 mi, Pierce) . El análisis de homogeneidad de proteína Fe (SEC) se utilizó usando una columna TOS046 mm SW3000 (TOSO Biosciences LLC, PA) . Se determinaron las concentraciones de proteína al medir la absorción a 280 nm y el cálculo utilizando 1 mg/ml = 1.74 D028o- En cada caso de muestra, se trataron 5 de proteína con amortiguador de muestra SDS no reductor o SDS reductor (Invitrogen) que se corre en 4-20% de gel TG (Invitrogen) y se tiñe con reactivo Gel-code (Pierce) .

El análisis BIAcore de FcRn humano y de ratón que se une a Fe mutante #1 (Fe K392D-K409D, dímero) , #2 (Fe K392D-K409D-Y349T, perfil SEC monomérico) y #6 (Fe K392D-K409D-Y349T, perfil SEC monomérico) utilizando un instrumento BIAcore 3000. Las células CHO producen huFc que se inmoviliza en las siguientes células 2 (Fc2) en un chip CM5. Se utiliza Fe 1 como un control de fondo. Se incuban FcRn humano 2 nM con 1, 10, 100 nM de las variantes Fe indicadas durante una hora antes de inyectarse a la superficie huFc de CHO. La unión reducida de FcRn a huFc de CHO inmovilizado indica unión de FcRn a las variantes de Fe en solución. Se incubó FcRn de ratón 2 nM con 0.1, 1 y 10 nM de variantes Fe durante una hora antes de que se inyectará a la superficie huFc de CHO.

Las concentraciones de proteína para Fe mutante son de 0.4 y 0.6 mg/ml, respectivamente. Se analizaron muestras en PBS por el Beckman Coulter ProteomeLab XL-1 Instrument. Se llevaron a cabo experimentos de velocidad de sedimentación a 50,000 rpm seguido por absorbancia a 280 nm en montaje de celda de pieza central de sector doble con ventanas de cuarzo. Se recolectaron exploraciones a 20°C sin retraso entre ellas. Se analizaron datos AUC-SV utilizando SEDFIT versión 9.4. En el análisis AUC-SV la relación de rozamiento, el ruido invariable en tiempo y los valores de menisco se permitió que flotaran durante el ajuste de mínimos cuadrados no lineal.

Ejemplo 2 Este ejemplo demuestra que los parámetros PK de las construcciones Fe de monómero de diversos pesos moleculares en ratones normales . El Fe monomérico comprende las mutaciones K392D-K409D-Y349T . El monómero Fe N297 A comprende el monómero Fe que tiene una mutación adicional en N297 para eliminar un sitio de glucosilación . Media IgG comprende un Fab fusionado al Fe monomérico. Fab de FnFn comprende el Fab fusionado a un dímero de fibronectina . Fab His es el Fab fusionado a una etiqueta histidina. El compuesto huFc WT delta H comprende un dímero Fe en WT menos la región de bisagra. Se asignaron cincuenta y cuatro ratones SCID a los siguientes grupos de tratamiento. Todos los ratones se dosificaron 10 mg/kg IV y se recolectó suero a las 0.25, 2, 4, 8, 20 y 32 horas.

TABLA 3 Resumen del Método Analítico Para cuantificación en las construcciones Fe monoméricas , se recubre una placa de microtitulación (Maxisorp, Nunc) ya sea con anticuerpo de chivo anti IgG humano específico para FCY (Jackson Cat #109-005-098) para los grupos 1, 2 y 6 o anticuerpo de chivo anti IgG humano específico para F(ab')2 (Jackson Cat #109-005-097) para los grupos 3, 4 y 5. Después de bloque con NFDM 10% (leche seca sin grasa) en PBST, los estándares, las muestras de control de calidad (QC, por sus siglas en inglés) y las muestras de prueba se incubaron después de pretratamiento a un factor de dilución de 50 en NFDM/PBST. Las construcciones no unidas se separan por lavado con amortiguador PBST. Posteriormente se agrega anticuerpo de chivo anti IgG humano específico para Fcy marcado con peroxidasa de rábano (Jackson Cat #109-035-098) para detectar construcciones Fe capturadas en los grupos 1, 2 y 6 mientras que se utilizó anticuerpo de chivo anti IgG humano específico para F(ab')2 (Jackson Cat#109-036-097) para detectar construcciones F(ab')2 capturadas en los grupos 3, 4 y 5. Después de una etapa de lavado final, la solución de sustrato TMB (1:1 de tetrametilbencidina y peróxido, Kirkegaard & Perry Laboratories) se agrega y se suspende con ácido fosfórico. Se determinan las densidades ópticas (DO, por sus siglas en inglés) a una longitud de onda de 450-650 nm. La conversión de los valores DO en concentraciones para los QC y los especímenes desconocidos se lleva a cabo a través de un programa Watson que media la comparación con una curva estándar analizada de modo concurrente, la cual se somete a regresión de acuerdo con el modelo logístico de cuatro parámetros .

TABLA 4 - DATOS PARA ESPECIMENES DE SUERO AQL > 125,000 mg/ml, BQL < 50 ng/ml .

TABLA 5 Este ejemplo demuestra que los parámetros PK de ratón normal, es decir, el grado de interacciones FcRn de las construcciones de monómero Fe de diversos pesos moleculares por encima o por debajo del umbral de depuración renal de -60 kDa. La construcción huFc WT delta H, la cual consiste de un dominio CH2-CH3 dimérico demuestra la mayor exposición/AUC en comparación con todas las demás construcciones pese a su peso molecular debajo del umbral de depuración. La molécula semi IgG, la cual consiste de un monómero Fe de Fab demuestra 35% de la exposición del dímero Fe pero tiene 3.5 veces mayor AUC en comparación con el dímero Fn de Fab pareado en tamaño, el cual consiste de un dímero de Fab- fibronectina, un resultado que demuestra el papel de Fe en incrementar la vida media y finalmente la exposición. El Fab solo y las construcciones de Fe monoméricas, ya sea la forma natural o la variante N297A la cual carece de glucosilacion debido a la separación del sitio de adición unido a N, todas demuestran depuración rápida y valores AUC mínimos de 17 a 38 veces menores que la construcción huFC WT delta H.

Referencias Bahar, I. y R. L. Jernigan (1997). " Inter-residue potentials in globular proteins and the dominance of highly specific hydrophilic interactions at cióse separation." J Mol Biol 266 (1) : 195-214.

Bernstein, F. C. T. F. Koetzle, et al. (1997) . "The Protein Data Bank: a computer-based archival file for macromolecular structures." J Mol Biol 112 (3) : 355-42.

Deisenhofer, J- (1981) . "Crystallographic refinement and atomic models of a human Fe fragment and its complex with fragment B of protein A from Staphylococcus aureus at 2-9- and 2.8 -A resolution" . Biochemistry 20(9) : 2631-70.

Ghetie, V. y E. S. ard (2000). "Múltiple roles for the major histocompatibility complex class I-related receptor FcRn" . Annu Rev Immunol 18:739-66.

Huber, R. (1984) . "Three-dimensional structure of antibodies". Behring Inst Mitt(76): 1-14.

Idusogie, E. E., L. G. Presta, et al. (2000). "Mapping of the Clq binding site on rituxan, a chimeric antibody with a human IgGl Fc". J Immunol 164 (8) : 4178-84.

Lee, B. y F. M. Richards (1971) . "The interpretation of protein structures: estimation of static accessibility" . J Mol Biol 55 (3 ): 379-400.

Martin, . L., A. P. West, Jr. , et al. (2001). "Crystal structure at 2.8 A of an FcRn/heterodimeric Fc complex:mechanism of pH-dependet binding". Mol Cell 7(4): 867-77.

Papadea, C. y I. J. Check (1989) . "Human immunoglobulin G and immnunoglobulin G subclasses : biochemical , genetic, and clinical aspects". Crit Rev Clin Lab Sci 27(l):27-58.

Pokala, N. y T. M. Handel (2005) . "Energy functions for protein design: adjustment with protein-protein complex affinities, models for the unfolded state, and negative design of solubility and specificity". J Mol Biol 347(1) :203-27.

Roux, K. H. (1999) . 11 Immunoglobulin structure and function as revealed by electrón microscopy" . Int Arch Allergy Immunol 120 (2) : 85-99.

Ye, Y . y A. Godzik (2004) . "FATCAT: a web server for flexible structure comparison and structure similarity searching" . Nucleic Acids Res 32 (Web Server issue) : W582-5.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (26)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un polipéptido Fe monomérico caracterizado porque comprende un dominio CH2 y CH3, en donde el dominio CH3 comprende : (a) dos o más aminoácidos cargados que son electrostáticamente desfavorables a la formación de homodímero CH3 ; y (b) una sustitución de aminoácido de uno o más residuos de interfase hidrofóbicos con un residuo aminoácido polar .

2. El polipéptido de Fe monomérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el residuo aminoácido polar es treonina.

3. El polipéptido de Fe monomérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio CH3 es un dominio CH3 de IgG.

4. La Fe monomérica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el residuo de interfase hidrofóbico se selecciona del grupo que consiste de Y349, L351, L368, V397, L398, F405 e Y407.

5. La Fe monomérica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el residuo de interfase hidrofóbico es Y349.

6. La Fe monomérica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la treonina sustituye a Y349.

7. La Fe monomérica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el residuo de interfase hidrofóbico es F405.

8. La Fe monomérica de con ormidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la treonina sustituye a F405.

9. El polipéptido de Fe monomérico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el dominio CH3 comprende un aminoácido cargado negativamente en la posición 392.

10. El polipéptido de Fe monomérico de conformidad con la reivindicación 9, ^caracterizado porque el aminoácido cargado negativamente es ácido aspártico.

11. El polipéptido de Fe monomérico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el dominio CH3 comprende un aminoácido cargado negativamente en la posición 409.

12. El polipéptido de Fe monomérico de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el aminoácido cargado negativamente es ácido aspártico.

13. El polipéptido de Fe monomérico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el dominio CH3 comprende un aminoácido cargado negativamente en la posición 392 y en la posición 409.

14. El polipéptido de Fe monomérico de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el aminoácido cargado negativamente es ácido aspártico.

15. El polipéptido de Fe monomérico de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque comprende además una treonina que sustituye un residuo de la interfase hidrofóbica .

16. El polipéptido de Fe monomérico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el residuo de interfase hidrofóbico se selecciona del grupo que consiste de Y349, L351, L368, V397, L398, F405 e Y407.

17. El polipéptido de Fe monomérico de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el residuo de interfase hidrofóbico es Y349.

18. El polipéptido de Fe monomérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende un dominio variable de anticuerpo.

19. El polipéptido de Fe monomérico de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el polipéptido comprende un dominio CH1.

20. El polipéptido de Fe monomérico de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el polipéptido comprende una cadena pesada de anticuerpo.

21. Un anticuerpo monomérico caracterizado porque comprende el polipéptido de Fe monomérico de conformidad con la reivindicación 20, y una cadena ligera de anticuerpo.

22. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque codifica para el polipéptido de Fe monomérico de conformidad con la reivindicación 1.

23. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende un ácido nucleico que codifica para el polipéptido de Fe monomérico de la reivindicación 1.

24. Una célula hospedadora caracterizada porque comprende un ácido nucleico que codifica para el polipéptido de Fe monomérico de conformidad con la reivindicación 1.

25. Un método para preparar un polipéptido de Fe monomérico, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de Fe monomérico de conformidad con la reivindicación 1 bajo condiciones en donde el polipéptido de Fe monomérico se expresa; y (b) recuperar el polipéptido de Fe monomérico del cultivo de célula hospedadora.

26. Un polipéptido caracterizado porque comprende un dominio CH3 de un anticuerpo, en donde el dominio CH3 comprende una secuencia polipeptídica diferente de un dominio CH3 natural de modo que : (a) uno o más aminoácidos cargados son sustituidos con aminoácidos electrostáticamente desfavorables para la formación del homodímero CH3 ; y (b) uno o más residuos de interfase hidrofóbicos son sustituidos con un aminoácido polar, en donde el polipéptido tiene una capacidad disminuida para formar homodímeros en comparación con un polipéptido que comprende un dominio CH3 natural.