CN110234355B

CN110234355B - 单体人IgG1 Fc和双特异性抗体

Info

Publication number: CN110234355B
Application number: CN201880009333.7A
Authority: CN
Inventors: 陈维灶; 孝作祥; 付涛
Original assignee: Zhejiang Shimai Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Zhejiang shimai Pharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2017-02-01
Filing date: 2018-02-01
Publication date: 2021-11-09
Anticipated expiration: 2038-02-01
Also published as: WO2018144784A1; EP3576789A4; EP3576789A1; US20190367611A1; CN110234355A

Abstract

本发明涉及单体Fc(mFc)多肽和制备和使用这样的多肽的方法。多肽包含IgG1 Fc结构域，在CH3疏水界面中有一个或两个残基(T366和Y407)的突变。本发明还讨论了制备包含mFc的双特异性抗体及其变体的方法。

Description

单体人IgG1 Fc和双特异性抗体

背景技术

抗体在防御入侵的非自身分子方面起重要作用。抗体通过Fc(可结晶片段)区域以pH依赖性方式与新生儿Fc受体(FcRn)相互作用的能力赋予它们延长的血清半衰期(Ghetie和Ward 2000)。抗体的这种独特特征允许通过工程化Fc融合分子来延长血清中治疗性蛋白质或肽的半衰期。天然存在的IgG抗体和工程化Fc融合分子是二价和单特异性的。这是由于抗体Fc的同源二聚体性质。对于某些治疗应用，期望保留抗体或抗体的Fc片段赋予的所有积极属性，同时通过工程化单体Fc(mFc)多肽实现灵活性和特异性。

人血清中最丰富的免疫球蛋白类是IgG。IgG结构具有四条链：两条轻链和两条重链；每条轻链具有两个结构域，每条重链具有四个结构域。抗原结合位点位于ab区(抗原结合片段)，其含有可变轻链(VL)和可变重链(VH)结构域以及恒定轻链(CL)和恒定重链(CH1)结构域。抗体的Fc(可结晶片段)区域含有重链的CH2和CH3结构域区域(图1)。IgG分子可以被认为是具有通过铰链区的二硫键(-S-S-)保持在一起的两条重链和两条轻链的异四聚体。IgG的FcRn(新生儿Fc受体)结合位点位于抗体的Fc区(Martin，West等，2001)，因此抗体的延长的血清半衰期特性保留在Fc片段中。单独的Fc片段可以被认为是包含CH2和CH3结构域的重链的同源二聚体。具有完整抗体一半大小的单价抗体仅包含一条轻链和一条重链，在重链Fc区中具有一些突变以使抗体在水溶液/血清中稳定。已经成功开发了在Fc区中具有三个或更多个突变的单价IgG用于靶向癌症生物标志物(Merchant，Ma等，2013)。与具有三个或更多个突变的Fc相比，在Fc区中仅具有两个突变的单价IgG可以导致在人中没有或更低免疫原性。

随着遗传和蛋白质工程技术的最新进展，出现了双特异性抗体(BsAb)，例如BiTE、Xmab和CrossMab双特异性技术，以显示出有希望的应用(Nagorsen，Bargou等，2009)(Schaefer，Regula等，2011)。两种BsAb被批准用于治疗，超过30种正在进行临床开发。BiTE是一种具有通过(G4S)3多肽接头连接的两个单链抗体可变片段(scFv)的融合蛋白。在不存在Fc的情况下，它们不可以用蛋白质A和G纯化，并且具有短的体内半衰期，因此，在临床使用中需要连续输注。Roche CrossMab含有Fc，因此体内半衰期比BiTE长得多。CrossMab使用用于Fc异二聚化的杵臼技术，但不可以产生100％异二聚化抗体。Xmab双特异性技术在CH3结构域使用CH1/CL相互作用和静电相互作用的组合以分别在两个Fc多肽的N端和C端形成两个抗原结合位点。但是由于Xmab在N端和C端的两个结合位点的长距离，不容易形成类似于在天然细胞毒性T细胞识别过程中形成的免疫突触。因此，迫切需要制备新型抗体，例如工程化双特异性抗体，以改善癌症或其他疾病的治疗。

发明内容

本发明提供一种单体Fc(mFc)多肽，其包含CH2和CH3结构域，其中所述CH3结构域包含一个或两个氨基酸置换。本发明提供一种mFc多肽，其包含CH2和CH3结构域，其中所述CH3结构域由具有一个或两个氨基酸置换的CH3及其变体组成。本发明中的置换显著降低多肽形成同源二聚体的能力。在一个实施方式中，二聚化的降低为40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在另一个实施方式中，单体Fc多肽是非天然存在的多肽。本发明还提供包含mFc多肽的双特异性抗体的各种构型。

在另一个实施方式中，mFc多肽包含IgG CH3结构域，其中所述CH3结构域包含T366或Y407或位点两者处的氨基酸置换。在一个实施方式中，T366可以被D(天冬氨酸)、L(亮氨酸)、W(色氨酸)和N(天冬酰胺)置换。在另一个实施方式中，Y407可以被I(异亮氨酸)、F(苯丙氨酸)、L(亮氨酸)、M(甲硫氨酸)、H(组氨酸)、K(赖氨酸)、S(丝氨酸)、Q(谷氨酰胺)、T(苏氨酸)、W(色氨酸)、A(丙氨酸)、G(甘氨酸)或N(天冬酰胺)置换。在另一个实施方式中，上述置换可以与每个Fc上的两个置换混合匹配。在另一个实施方式中，单体Fc的置换仅由T366和Y407处的两个氨基酸组成。T366处的置换是但不限于T366D、T366L、T366W或T366N，并且Y407处的置换是但不限于Y407I、Y407F、Y407L、Y407M、Y407H、Y407K、Y407S、Y407Q、Y407T、Y407W、Y407A、Y407G或Y407N。在另一个实施方式中，具有置换的CH3形式的单体Fc多肽比在CH3结构域中具有三个或更多个氨基酸置换的那些具有更低的免疫原性或无免疫原性。在某些实施方式中，单体Fc及其变体选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ IDNO:17。

单体Fc(mFc)多肽进一步与抗体可变结构域连接或包含在抗体重链内。在某些实施方式中，单体抗体包含单体重链和轻链，基本上产生半抗体。在另一个实施方式中，单体重链包含一个或多个突变的半胱氨酸残基以防止形成二硫键。特别有用的半胱氨酸突变是重链铰链区中的那些。

在一个实施方式中，包含具有一个或两个氨基酸置换的抗体CH3结构域的Fc多肽与包含野生型CH3结构域的多肽相比具有降低的形成同源二聚体的能力。本发明中的置换显著降低了多肽形成同源二聚体的能力。在一个实施方式中，二聚化的降低为40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一个实施方式中，Fc多肽与包含三个或更多个置换的Fc多肽相比可具有更低免疫原性。

本发明的其他方面是编码具有一个或两个氨基酸置换的单体Fc多肽及其变体的非天然存在的多核苷酸序列。在某些实施方式中，分离的DNA编码包含SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的多核苷酸序列。在另一个实施方式中，本发明提供包含这样的核酸的表达载体和包含这样的表达载体以表达多肽的宿主细胞。

本发明的实施方式还包括制备含有一个或两个氨基酸置换的单体Fc多肽的方法。在一个实施方式中，所述方法包括在表达单体Fc多肽的条件下，用编码单体Fc多肽的DNA瞬时或稳定转染宿主细胞，然后从宿主细胞培养物中回收单体Fc多肽。

本发明还包括制备具有用于异二聚化的CH1/CL和用于延长的半衰期的mFc的双特异性抗体形式的方法。本发明提供包含如上所述的mFc的双特异性抗体形式的设计，其中这样的双特异性抗体具有延长的半衰期，可能更低的免疫原性，并且不干扰CH1和CL的异二聚化强度。

在一个实施方式中，本文提供双特异性单体Fc抗体(Bi-mFc)，其包含：(a)具有式V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4-L4-mFc的多肽链，其中mFc是mFc多肽链，其中VI、V2、V3和V4是具有相同或不同氨基酸序列的免疫球蛋白可变区，其中L1、L2、L3和L4是接头，并且其中L4可以存在或不存在；或(b)具有下式的多肽链：mFc-L4-V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4，其中mFc是单体Fc多肽链，其中VI、V2、V3和V4是具有相同或不同氨基酸序列的免疫球蛋白可变区，其中L1、L2、L3和L4是接头，并且其中L4可以存在或不存在；或(c)具有下式的多肽链：V1-L1-V2-L2-mFc-L4-V3-L3-V4，其中mFc是单体Fc多肽链，其中VI、V2、V3和V4是具有相同或不同氨基酸序列的免疫球蛋白可变区，其中L1、L2、L3和L4是接头，并且其中L2可以存在或不存在。

Bi-mFc包含单体，其中Bi-mFc介导由免疫效应细胞对展示靶细胞蛋白的靶细胞的细胞溶解，但不介导免疫效应细胞对不展示靶细胞蛋白的细胞的细胞溶解。Bi-mFc结合靶细胞和/或免疫效应细胞。在另一个实施方式中，(a)、(b)或(c)的mFc多肽链包含一个或多个抑制FcγR结合的置换，包括但不限于L234A、L235A、和在N297处的任何置换中的一个或多个。

在一个实施方式中，本发明提供双特异性抗体，其包含单体Fc融合蛋白，所述单体Fc融合蛋白包含具有一个或两个氨基酸置换的CH3结构域。在一个实施方式中，本发明提供双特异性抗体，其包含含有CH2和CH3结构域的单体Fc融合蛋白，其中CH3包含一个或两个氨基酸置换。在另一个实施方式中，本发明提供双特异性抗体，其包含含有CH2和CH3结构域的单体Fc融合蛋白，其中CH3结构域由两个氨基酸置换组成，其中两个氨基酸置换位于T366和Y407处。在另一个实施方式中，本发明包括双特异性抗体，其含有两条不同链，其中1)一条链包含在CH3上具有一个或两个氨基酸置换的mFc(如上所述)，其中其N端通过接头与CL连接，CL的N端通过另一个接头与单链可变片段(scFv)连接；2)另一条链包含1)的mFc，其中其N端通过接头与CH1连接，并且CH1的N端通过另一个接头与相同或另一种scFv连接；和3)两条不同链通过CL和CH1的异二聚化连接。在另一个实施方式中，本发明包含与上文提到的类似的双特异性抗体，其中scFv也可以与mFc的C端连接。在另一个其他实施方式中，通过一个或多个二硫键增强异二聚化(图7)。

本发明还提供双特异性抗体形式iBiBody，其包含结合蛋白、Fab，和一种或多种单体Fc多肽，其中所述结合蛋白与所述Fab的N端或C端连接，并且其中所述一种或多种单体Fc多肽与所述Fab的其他末端连接。

本发明提供包含如上所述的mFc的双特异性抗体形式iBiBody的设计，其中这样的双特异性抗体具有延长的半衰期，可能更低的免疫原性或没有免疫原性，并且不干扰Fab的VH-CH1和VL-CL的异二聚化强度。在某些实施方式中，使用缩短的铰链和mFc，这保留与新生儿FcR(“良好FcR”)的结合，其介导抗体的长半衰期，同时降低或消除与大多数其他FcR(“不良FcR”)的结合。包含单体Fc的iBiBody双特异性抗体具有更长半衰期和高水平表达的优点。它易于构建且易于纯化。

在一个实施方式中，iBiBody的结合蛋白可以是抗体片段(例如Fab、scFv、双抗体、可变结构域衍生结合物、纳米抗体)。在一个实施方式中，iBiBody的结合蛋白是识别特异性抗原的替代性支架衍生蛋白质结合结构域(例如Fn3变体、锚蛋白重复变体、centyrin变体、avimer、affibody)。在一个实施方式中，iBiBody的结合蛋白是天然可溶性配体或受体。在另一个实施方式中，iBiBody的结合蛋白是结合另外的实体的任何蛋白质。

附图说明

图1人IgG1Fc诱变文库的设计和单体Fc(mFc)的选择。

图2鉴定7种保留与蛋白A和G的结合的第一代mFc变体。

图3 7种mFc变体的表达和纯化。

图4PBS(pH7.4)中第一代mFc变体的寡聚状态。

图5通过随机化mFc7的M407残基鉴定9种第二代mFc变体。

图6PBS(pH7.4)中第二代mFc变体的寡聚状态。

图7具有用于异二聚化的CH1/CL和用于延长的半衰期的mFc的新型双特异性抗体形式。

图8概念验证双特异性抗体的产生。

图9纯化双特异性抗体的尺寸排阻色谱(SEC)。SEC显示KappaSelect纯化双特异性抗体含有解离的scFv 1-CK-mFc7.x单体、异二聚体和更高阶的寡聚体，其可以通过SEC很好地彼此分离，从而产生相对纯的scFv l-CK-mFc7.x/scFv 2-CH1-mFc7.x的异二聚体。

图10(a)-10(c)仅具有一条多肽链的双特异性抗体形式的实例。

图11具有mFc的“i形”双特异性抗体形式(iBiBody)的实例。

具体实施方式

定义

除非本文另有定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。通常，与本文所描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质和核酸化学和杂交相关的命名法和技术是本领域众所周知和常用的那些。除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常根据本领域众所周知的常规方法进行，并且如本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述。参见，例如，Sambrook等Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)和Ausubel等,Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Associates(1992),和Harlow and Lane Antibodies:ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)，其通过引用并入本文。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域通常实现的或如本文所述的。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及药物和药物化学结合使用的术语及其实验室程序和技术是本领域公知和常用的那些。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。

除非另有说明，否则以下术语应理解为具有以下含义：术语“分离的分子”(其中分子是例如多肽，多核苷酸或抗体)是如下的分子：由于其起源或衍生来源而(1)与在其天然状态下伴随其的天然相关组分不相关联，(2)基本上不含来自同一物种的其他分子，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。因此，化学合成或在与其天然来源的细胞不同的细胞***中表达的分子将与其天然相关组分“分离”。还可以使用本领域众所周知的纯化技术通过分离使分子基本上不含天然相关组分。可以通过本领域众所周知的一些方法测定分子纯度或同质性。例如，可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶染色以使用本领域众所周知的技术使多肽可视化来测定多肽样品的纯度。出于某些目的，可以通过使用HPLC或本领域众所周知的其他方法进行纯化来提供更高的分离度。

使用标准的单字母或三字母缩写表示多核苷酸或核酸和多肽序列。除非另有说明，否则多肽序列具有在左侧的氨基末端和在右侧的羧基末端，单链核酸序列和双链核酸序列的顶部链具有在左侧的5’端和在右侧的3’端。特定的多肽或多核苷酸序列也可以通过解释它与参考序列如何不同来描述。

术语“肽”，“多肽”和“蛋白质”各自是指包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基的分子。这些术语包括天然和人工蛋白质、蛋白质序列的蛋白质片段和多肽类似物(例如突变、变体和融合蛋白)以及翻译后修饰或以其他方式共价或非共价修饰的蛋白质。肽、多肽或蛋白质可以是单体的或聚合的。

如本文所用的术语“多肽片段”是指与相应的全长蛋白质相比具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽。片段可以是，例如，长度为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、80、90、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸。片段还可以是，例如，长度至多为1,000、750、500、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11或10个氨基酸。片段可以在其末端中的任一或两者处还包含一个或多个另外的氨基酸，例如来自不同天然存在蛋白质或人工氨基酸序列的氨基酸序列。

本发明的多肽包含以任何方式和出于任何原因修饰的多肽，例如，以：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变用于形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(4)赋予或改变其他物理化学或功能特性。类似物包括多肽的突变。例如，可以在天然存在序列中(例如，在形成分子间接触的结构域外的多肽的部分中)进行单个或多个氨基酸置换(例如，保守氨基酸置换)。“保守氨基酸置换”是基本上不改变母体序列的结构特征的置换(例如，替换氨基酸不应倾向于破坏在母体序列中出现的螺旋，或破坏表征母体序列或是其功能所必需的其他类型的二级结构)。

本领域公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins,Structures andMolecular Principles(Creighton,Ed.,W.H.Freeman and Company,New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.BrandenandJ.Tooze,eds.,GarlandPublishing,New York,N.Y.(1991))；和Thornton等Nature 354:105(1991)，各自通过引用并入本文。

多肽的“变体”包含氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸残基相对于另一多肽序列***到氨基酸序列中、从氨基酸序列缺失或置换到氨基酸序列中。本发明的变体包括含有变体CH2或CH3结构域的变体。在某些实施方式中，变体包含当其存在于Fc分子中时增加多肽对一种或多种FcRn的亲和力的一种或多种突变。

这样的变体展示出增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。提供这些的变体的实例描述于美国专利号7,317,091。

其他变体包括降低含有CH3结构域的多肽的同源二聚化能力的变体。这样的Fc变体的实例描述于US 5,731,168和7,183,076、9,493,578和9,200,060中。

多肽的“衍生物”是已经化学修饰的多肽(例如，抗体)，例如通过缀合至另外的化学部分，例如聚乙二醇、细胞毒剂、白蛋白(例如，人血清白蛋白)、磷酸化和糖基化。除非另有说明，否则术语“抗体”除包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体外，还包括其衍生物、变体、片段和突变，其实例如本文所述。

本文所用的术语“抗体”是含有至少一个VH或VL区，在许多情况下是重链和轻链可变区的蛋白质或多肽。因此，术语“抗体”包括具有多种形式的分子，包括单链Fv抗体(scFv，其含有通过接头连接的VH和VL区)、Fab、F(ab)2’、Fab’、scFv:Fc抗体(如Carayannopoulosand Capra,Ch.9in FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY,3rd ed.,Paul,ed.,Raven Press,NewYork,1993,pp.284-286中所述)或含有两条全长重链和两条全长轻链的全长抗体，例如哺乳动物中发现的天然IgG抗体。Fc结构域可以是单体或二聚体。抗体可以是“单体的”，即包含单个多肽链。抗体可包含多条多肽链(“多聚体的”)或可包含两条(“二聚体的”)、三条(“三聚体的”)或四条(“四聚体的”)多肽链。抗体可以是嵌合的。天然抗体的轻链和重链分别具有CL和CH1结构域，其形成特异性CH1/CL相互作用。

术语“双特异性抗体”是结合两种不同抗原的抗体。

如本文所用的术语“双特异性单体Fc抗体”(Bi-mFc)包含具有mFc的第一多肽链，和，任选地，第二多肽链。在许多实施方式中，Bi-mFc包含第一和第二多肽链。在一些实施方式中，Bi-mFc是仅包含第一多肽链的单体。第一多肽链包含通过接头分开的两个VH区和两个VL区，和Fc多肽链。Fc多肽链可以相对于四个免疫球蛋白可变区是N端或C端，并且它可以通过接头与可变区连接。该接头可以存在或不存在。第二多肽链如果存在则包含mFc多肽链。因此，Bi-mFc可以是单体或异二聚体。

术语“iBiBody”是包含结合蛋白、Fab，和一种或多种单体Fc多肽的双特异性抗体，其中所述结合蛋白与所述Fab的N端或C端连接，并且其中所述一种或多种单体Fc多肽与所述Fab的其他末端连接。所述结合蛋白和Fab结合两种不同的抗原。

本文所用的术语“疏水残基”或“疏水氨基酸”包括具有疏水侧链的氨基酸，包括但不限于甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)和色氨酸(W)。

术语“人抗体”包括具有一个或多个衍生自人免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的所有抗体。在一个实施方式中，所有可变区和恒定区均衍生自人免疫球蛋白序列(全人抗体)。

可以以多种方式制备这些抗体，包括通过用感兴趣的抗原来免疫经遗传修饰以表达衍生自人重链和/或轻链编码基因的抗体的小鼠。在某些实施方式中，人抗体的重链在CH3结构域中被改变以降低重链二聚化的能力。

人源化抗体通过一个或多个氨基酸置换、缺失和/或添加而具有不同于衍生自非人物种的抗体的序列的序列，使得人源化抗体与非人物种抗体相比，当其被施用于人受试者时，较不可能诱导免疫应答和/或诱导较不严重的免疫应答。

在一个实施方式中，使非人物种抗体的重链和/或轻链的框架和恒定结构域中的某些氨基酸突变以产生人源化抗体。在另一个实施方式中，来自人抗体的恒定结构域与非人物种的可变结构域融合。如何制备人源化抗体的实例可以在美国专利号6,054,297、5,886,152和5,877,293中找到。

术语“嵌合抗体”是指含有来自一种抗体的一个或多个区域和来自一种或多种其他抗体的一个或多个区域的抗体。在嵌合抗体的一个实例中，重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体相同、同源或从其衍生，而链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体相同、同源或从其衍生。还包括表现出期望生物活性的这样的抗体的片段。

本领域普通技术人员遵循本说明书的教导并使用本领域众所周知的技术可以容易地制备抗体的片段或类似物。片段或类似物的优选氨基和羧基末端出现在功能结构域的边界附近。可以通过比较核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库来鉴定结构域和功能结构域。计算机化比较方法可用于鉴定在具有已知结构和/或功能的其他蛋白质中出现的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。参见，例如，Bowie等，1991，Science 253：164。

“CDR移植抗体”是包含衍生自特定物种或同种型的抗体的一个或多个CDR和相同或不同物种或同种型的另一种抗体的框架的抗体。

通过使用GAP计算机程序(GCG Wisconsin Package，版本10.3(Accelrys，SanDiego，CA)的一部分)使用其默认参数比较序列来确定两个多核苷酸或两个多肽序列的“百分比同一性”。

术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”在全文可互换使用，并且包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物(例如，肽核酸和非天然存在核苷酸类似物)，及其杂合体。核酸分子可以是单链或双链的。在一个实施方式中，本发明的核酸分子包含编码抗体或Fc融合体的连续开放阅读框，及其衍生物、突变或变体。

如果两条单链多核苷酸的序列可以以反平行方向排列使得一条多核苷酸中的每个核苷酸与另一多核苷酸中的互补核苷酸相反而不引入缺口并且在任一序列的5’或3’端没有未配对的核苷酸，则两条单链多核苷酸是彼此的“互补物”。如果两条多核苷酸可以在中等严格条件下彼此杂交，则多核苷酸与另一多核苷酸“互补”。

因此，多核苷酸可以与另一多核苷酸互补而不是其互补序列。

“载体”是可用于将与其连接的另一核酸引入细胞的核酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指线性或环状双链DNA分子，其中可以连接另外的核酸区段。另一种类型的载体是病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其中可以将另外的DNA片段引入病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，包含细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。“表达载体”是可以指导所选多核苷酸表达的载体类型。

如果调节序列影响核苷酸序列的表达(例如，表达的水平、时间或位置)，则核苷酸序列与调节序列“可操作地连接”。“调节序列”是影响与其可操作地连接的核酸的表达(例如，表达的水平、时间或位置)的核酸。调节序列可以例如直接对受调节的核酸发挥作用，或通过一种或多种其他分子(例如结合调节序列和/或核酸的多肽)的作用来发挥作用。调节序列的实例包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。调节序列的其他实例描述于例如Goeddel,1990,Gene Expression Technology:Methods inEnzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif,and Baron et al.,1995,NucleicAcids Res.23:3605-06，其通过引用并入本文。

“宿主细胞”是可用于表达核酸，例如本发明的核酸的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌，或者它可以是真核生物，例如，单细胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)，植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)，动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)，或杂交瘤。示例性宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系或其衍生物，包括CHO株DXB-11，其具有DHFR缺陷(参见Urlaub等,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-20)，在无血清培养基中生长的CHO细胞系(参见Rasmussen等,1998,Cytotechnology 28:31)，CS-9细胞，其是DXB-11CHO细胞的衍生物，和AM-1/D细胞(描述于美国专利号6,210,924)。其他CHO细胞系包括CHO-K1(ATCC#CCL-61)、EM9(ATCC#CRL-1861)和UV20(ATCC#CRL-1862)。其他宿主细胞的实例包括猴肾细胞的COS-7系(ATCC CRL 1651)(参见Gluzman等，1981，Cell 23：175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCCCCL 163)、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系、衍生自非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL 70)(参见McMahanetal.,1991,EMBOJ.10:2821，其通过引用并入本文)、人胚胎肾细胞(例如293、293EBNA或MSR 293)、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其他转化的灵长类动物细胞系、正常二倍体细胞，衍生自原代组织、原代外植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞的体外培养的细胞株。通常，宿主细胞是培养的细胞，其可以用编码随后可以在宿主细胞中表达的多肽的核酸转化或转染。

短语“重组宿主细胞”可用于表示已用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞也可以是包含核酸但除非将调节序列引入宿主细胞中使其与核酸可操作地连接否则不以所期望的水平表达的细胞。应理解，术语宿主细胞不仅指特定的受试细胞，还指这样的细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于例如突变或环境影响而在后代中发生，所以这样的后代可以事实上并不与母体细胞相同，但仍包括在本文所用术语的范围内。

“结合蛋白”包括天然蛋白结合结构域，抗体片段(例如Fab、scFv、双抗体、可变结构域衍生结合物、纳米抗体)，替代性支架衍生蛋白质结合结构域(例如Fn3变体、锚蛋白重复变体、centyrin变体、avimer、affibody)或识别特定抗原的任何蛋白质。结合蛋白可以与mFc多肽连接以形成mFc融合蛋白。

抗原结合片段(Fab)是包含VH、VL、CH1和CL结构域的抗体的抗原结合部分。在优选的实施方式中，VH与CH1连接，VL与CL结构域连接。在其他实施方式中，VH与CL连接，VL与CH1连接。

药物组合物

本发明的多肽特别适用于配制成药物组合物。这样的组合物包含一种或多种另外的组分，例如生理学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。任选地，组合物另外地包含一种或多种生理活性剂，例如，如下所述。在各种具体实施方式中，除一种或多种本发明的单体抗体和/或Fc融合蛋白外，组合物还包含一种、两种、三种、四种、五种或六种生理活性剂。

在一个实施方式中，药物组合物包含本发明的单体抗体和/或Fc融合蛋白以及一种或多种选自缓冲液，抗氧化剂例如抗坏血酸，低分子量多肽(例如具有少于10个氨基酸的那些)，蛋白质，氨基酸，碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖或糊精，螯合剂例如EDTA，谷胱甘肽，稳定剂和赋形剂的物质。中性缓冲盐水或与同种血清白蛋白混合的盐水是合适稀释剂的实例。根据适当的工业标准，还可以加入防腐剂如苄醇。可以使用合适的赋形剂溶液(例如蔗糖)作为稀释剂将组合物配制成冻干物。

合适的组分在所用的剂量和浓度下对接受者无毒。可用于药物制剂的组分的其他实例见Remington's Pharmaceutical Sciences,16th Ed.(1980)and 20th Ed.(2000),Mack Publishing Company,Easton,Pa，其通过引用并入本文。

提供了供医疗从业者使用的试剂盒，其包括本发明的一种或多种单体抗体和/或Fc融合蛋白，以及用于治疗本文所讨论的任何病症的标签或其他说明书。在一个实施方式中，试剂盒包括一种或多种单体抗体和/或Fc融合蛋白的无菌制备物，其可以是如上公开的组合物的形式，并且可以在一个或多个小瓶中。

剂量和给药频率可根据例如施用途径、所用特定单体抗体和/或Fc融合蛋白、待治疗疾病的性质和严重性、病症是否是急性或慢性以及受试者的大小和一般状况等因素而变化。适当的剂量可以通过相关领域中已知的程序确定，例如，在可以涉及剂量递增研究的临床试验中。

本发明的单体抗体和/或Fc融合蛋白可以施用例如一次或多于一次，例如，在一段时间内以规则间隔施用多于一次。在特定的实施方式中，单体抗体和/或Fc融合蛋白在至少一个月或更长的时间施用，例如，一个月、两个月或三个月或甚至无限期。对于治疗慢性病，长期治疗通常是最有效的。然而，对于治疗急性病症，施用较短时间，例如1至6周，可以是足够的。通常，施用单体抗体和/或Fc融合蛋白直到患者表现出对于一个或多个所选指标相比于基线的医学相关程度的改善。

如在相关领域中所理解的，将包含本发明的单体抗体和/或Fc融合蛋白的药物组合物以适合于适应症的方式施用于受试者。药物组合物可以通过任何合适的技术施用，包括但不限于肠胃外、局部或通过吸入。如果注射，药物组合物可以例如通过关节内、静脉内、肌肉内、病灶内、腹膜内或皮下途径、通过推注或连续输注施用。

考虑了例如在疾病或损伤部位的局部施用，以及从植入物的透皮递送和持续释放。通过吸入递送包括例如鼻腔或口腔吸入，使用喷雾器，吸入气溶胶形式的单体抗体和/或Fc融合蛋白，等等。

野生型Fc本质上是同源二聚体，并且该特征由两个CH3结构域之间存在的强烈的高亲和力相互作用驱动。本文描述了单体Fc分子以及制备和使用这样的分子的方法。尽管术语“Fc”通常被认为是多肽的同源二聚体，但本文所用的术语由于本发明多肽的独特性质，还包括单体多肽，其包含对应于重链的Fc部分的氨基酸序列，即含有CH2和CH3结构域(图1；例如SEQ ID NO:1)。

本文所用的术语“单体Fc多肽”或“单体Fc”(mFc)是含有CH2和CH3结构域的单体多肽。所述CH2结构域和CH3结构域可以是野生型Fc CH2或CH3结构域的变体。

本文所用的术语“单体Fc融合蛋白”是含有mFc和与mFc连接的另一结构域的单体融合蛋白。

本文描述的方法证实通过置换CH3结构域界面处的残基，可以完全破坏CH3/CH3结合，然而保持分子的稳定性，从而实现单体Fc。

可以通过例如尺寸排阻色谱(SEC)和分析超离心(AUC)来评估改变的Fc的单体性质。置换实现两件事——一个是阻碍CH3结构域的同源二聚体形成，另一个是使Fc的单体形式稳定。

用于鉴定构成CH3/CH3界面的氨基酸的方法公开于WO2009089004中。使用基于结构的搜索算法(Ye和Godzik 2004)从Protein Data Bank(PDB)(Bernstein，Koetzle等，1977)鉴定了总共48个具有对应于Fc区的坐标的抗体晶体结构。

Fc的原子坐标是从人IgG1抗体(Protein Data Bank条目1HZH)的晶体结构中提取。通过使用PyMOL分子图形***(版本1.5.0.4；Schrodinger，LLC)表示Fc界面处的所有疏水残基。

根据基于接触的方法，界面残基定义为其侧链重原子的位置比第二链中任何残基的重原子更接近特定限值的残基。尽管4.5A距离限值是优选的，但是也可以使用更长的距离限值(例如，5.5A)以识别界面残基(Bahar和Jernigan 1997)。

本文描述了抗体的Fc部分的各种置换或突变。这样的变异被命名为基于Kabat的EU编号方案在野生型抗体重链的位置处的氨基酸，随后是被置换到该位置的氨基酸。例如，当EU位置407的酪氨酸被甲硫氨酸置换时，将其命名为“Y407M”。“Fc”是指在动物物种(例如人)内天然存在的氨基酸的野生型序列。野生型序列可以在群体内的个体之间略微变化，例如，各种免疫球蛋白链的不同等位基因是本领域已知的。图2列出使用基于可溶性表达的单克隆ELISA(semELISA)基于蛋白G ELISA筛选鉴定的具有一个或两个氨基酸置换的七种mFc变体。在CH3的407位处的疏水残基置换是优选的。相比之下，在366位没有氨基酸残基类型的偏好使用。非还原性SDS-PAGE和尺寸排阻色谱显示这些mFc变体在PBS(pH7.4)中具有次优的寡聚状态(图3和4)。

图5列出通过随机化第一代变体mFc7的Y407M残基，基于相同蛋白G ELISA筛选鉴定的9种第二代mFc变体(图5)。366位的氨基酸残基固定为亮氨酸。尺寸排阻色谱分析显示，PBS(pH7.4)中纯化的9种第二代mFc7.2、mFc7.5、mFc7.7、mFc7.18、mFc7.21、mFc7.24、mFc7.27和mFc7.28蛋白的80％以上作为单体洗脱(一些实例在图6中)。在第二代mFc变体的407位没有氨基酸残基类型的偏好使用。

为了保持对蛋白质G的亲和力和单体形式的多肽的稳定性，可以用选自亮氨酸、色氨酸或天冬酰胺的氨基酸替换残基T366，同时构成CH3/CH3界面的大疏水残基之一Y407可以用选自异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺的氨基酸替换。

抗体以pH依赖性方式与新生儿Fc受体(FcRn)相互作用的能力赋予其延长的血清半衰期。在一个实施方式中，本发明的单体Fc分子保留与野生型Fc多肽相似、如果不优于野生型Fc多肽的结合FcRn的能力。

本发明的组合物和方法不限于本文公开的示例性等位基因的变体，而是包括与本文公开的示例性等位基因具有至少98％和至少99％同一性的那些。出于比较本发明的含CH3分子的特征与野生型人含CH3分子的特征的目的，野生型IgG1CH3结构域的序列示于图2SEQ ID NO:1。

考虑含单体Fc分子的产生不限于基于IgG1Fc的那些，但也适用于IgG2、IgG3、IgG4和其他免疫球蛋白亚类(包括IgA，IgE，IgD和IgM)的Fc区。CH3结构域界面残基在IgG之间高度保守。因此，导致人IgG1Fc中的单体化的突变可以扩展到其他人IgG亚类以及除人以外的物种。

事实上，任何含有Fc结构域的分子都可以包含本发明的单体Fc结构域。这样的分子的实例如图7和10所示。如图7和10所示，各种scFv肽和结合蛋白可以与Fc的N端或C端融合或连接。

在某些实施方式中，mFc多肽与Fab连接以产生半抗体。这样的半抗体可以通过在细胞(例如CHO细胞)中重组地表达包含单体Fc的重链和轻链来产生。重链可含有一个或多个进一步突变。在某些实施方式中，重链还包含铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基的突变(Allen等,Biochemistry.2009May 5；48(17):3755-66，其通过引用并入本文)。

本发明的Fc多肽相比于野生型Fc分子表现出降低的同源二聚化。因此，本发明的实施方式包括包含抗体或Fc融合分子的组合物，其中通过所述抗体或Fc融合分子表现的Fc-Fc同源二聚化的量小于60％、小于20％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。可以通过本领域已知的许多技术测量二聚化。测量二聚化的优选方法包括尺寸排除色谱(SEC)、分析超离心(AUC)、动态光散射(DLS)和Native PAGE。

本文所述的单体Fc分子可用于延长治疗性蛋白质或结构域的半衰期。可以用Fc单体治疗剂治疗的疾病可以包括炎症、癌症、代谢紊乱等。潜在的融合靶标包括天然蛋白结合、抗体片段(例如Fab、scFv、双抗体、可变结构域衍生结合物)，和替代性支架衍生蛋白结合结构域(例如Fn3变体、锚蛋白重复变体，centyrin变体、avimers、affibody和knottin)，和识别特定抗原的肽。Fc单体融合蛋白具有尺寸小的优点，因此具有潜在地更好的穿透组织的能力。当单价的靶标结合为优选的时，Fc单体融合蛋白可以特别有用。当靶向使用多价抗体靶向时易于二聚化的细胞表面分子时，这样的单价通常是优选的。

本发明的实施方式还包括制备具有用于异二聚化的CH1/CL和用于延长的半衰期的mFc的双特异性抗体形式的方法。除了将效应细胞再靶向于癌症部位外，还建立了双特异性抗体的新应用。可同时结合细胞表面抗原和有效负载的双特异性抗体是治疗和诊断用途的理想递送***。可以开发可以同时抑制两种相关信号分子的双特异性抗体以克服固有的或获得性的抗性并且是更有效的血管生成抑制剂。双特异性抗体也可以通过模拟因子VIII的功能用于治疗血友病A。双特异性抗体在骨病和感染以及中枢神经***疾病中也具有广泛的应用前景。

在异二聚化双特异性抗体的另一个实施方式中，单体Fc融合蛋白之一包含单链可变片段(scFv)、mFc结构域和CL结构域。在某些实施方式中，CL和scFv通过接头1连接，而mFc和CL通过接头2连接。在某些实施方式中，接头2可具有一个或多个半胱氨酸残基以形成二硫键。另一个单体Fc融合蛋白包含相同或另一种scFv、mFc结构域和CH1结构域。在某些实施方式中，CH1和scFv通过接头1连接，而mFc和CH1通过接头2连接。在某些实施方式中，接头2可具有一个或多个半胱氨酸残基以形成二硫键(图7)。

双特异性抗体也可以是双特异性单体Fc抗体(Bi-mFc)。包含具有一个或两个氨基酸置换的CH3结构域的Bi-mFc可以单价地结合两种不同的抗原。此外，它可以通过其Fc区在微酸性pH(约pH5.5-6.0)下与新生儿Fc受体(FcRn)结合。这种与FcRn的相互作用可以延长分子在体内的半衰期。第一多肽链(其在一些情况下，是唯一的多肽链)包含mFc结构域和两个VH区加上通过接头分开的两个VL区。mFc结构域可以相对于四个免疫球蛋白可变区是N端、C端或中间，并且它可以通过接头与可变区连接。第二多肽链当存在时，包含mFc多肽链。Bi-mFc可以与免疫效应细胞和靶细胞结合和/或可以通过免疫效应细胞介导靶细胞的细胞溶解。仅具有一条多肽的Bi-mFc的一般结构示于图10中。图10示出了mFc结构域位于中间(a)的实施方式，和mFc结构域位于C端(b)的实施方式和mFc结构域位于N端(c)的实施方式。在一个实施方式中，双特异性抗体包含通过接头与mFc的N端连接的scFv，并且mFc的C端通过接头与相同或另一scFv连接。在另一个实施方式中，双特异性抗体包含mFc，其中其N端通过接头与scFv2连接，然后相同或另一scFv通过另一接头与第一scFv连接。在另一个实施方式中，双特异性抗体包含mFc，其中其C端通过接头与scFv连接，并且scFv通过另一接头与相同或另一scFv连接(图10)。

更特定的实施方式指定免疫球蛋白可变区的顺序和接头的长度，并指定哪些免疫球蛋白可变区可以相关联以形成效应细胞蛋白或靶细胞蛋白的结合位点。通常，抗体的抗原结合部分包含VH和VL区，在本文中称为“VH/VL对”，尽管在一些情况下VH或VL区可以在没有配偶体的情况下结合抗原。参见，例如，美国申请公开2003/0114659。“VH/VL对”可以通过接头连接以形成单链可变结构域(scFv)。

在一组实施方式中，四个可变区可以按以下顺序排列：VH1-接头1-VL1-接头2-VH2-接头3-VL2，其中VH1/VL1是抗原结合对，并且VH2/VL2是另一抗原结合对。在该组实施方式中，接头1和接头3可以是至少15个氨基酸长，并且接头2可以少于12个氨基酸长。在一些实施方式中，VH1/VL1对可以结合靶细胞蛋白，并且VH2/VL2对可以结合效应细胞蛋白。在其他实施方式中，VH1/VL1对可以结合效应细胞蛋白，并且VH2/VL2对可以结合靶细胞蛋白。

在另一组实施方式中，四个可变区可以按以下顺序排列：VL1-接头1-VH1-接头2-VL2-接头3-VH2，其中VH1VL1是抗原结合对，并且VH2VL2是抗原结合对。在这些实施方式中，接头2可以小于12个氨基酸长，并且接头1和接头3可以是至少15个氨基酸长。在一些实施方式中，VH1/VL1对可以结合靶细胞蛋白，并且VH2/VL2对可以结合效应细胞蛋白。在其他实施方式中，VH1/VL1对可以结合效应细胞蛋白，并且VH2/VL2对可以结合靶细胞蛋白。

在另一组实施方式中，四个可变区可以按以下顺序排列：VH1-接头1-VL1-接头2-VL2-接头3-VH2，其中VH1/VL1是抗原结合对，并且VH2/VL2是抗原结合对。在这些实施方式中，接头2可以小于12个氨基酸长，并且接头1和接头3可以是至少15个氨基酸长。在一些实施方式中，VH1/VL1对可以结合靶细胞蛋白，VH2/VL2对可以结合效应细胞蛋白。在其他实施方式中，VH1/VL1对可以结合效应细胞蛋白，并且VH2/VL2对可以结合靶细胞蛋白。

在另一组实施方式中，四个可变区可以按以下顺序排列：VL1-接头1-VH1-接头2-VH2-接头3-VL2，其中VH1/VL1是抗原结合对，并且VH2/VL2是抗原结合对。在这些实施方式中，接头2可以小于12个氨基酸长，并且接头1和接头3可以是至少15个氨基酸长。在一些实施方式中，VH1/VL1对可以结合靶细胞蛋白，并且VH2/VL2对可以结合效应细胞蛋白。在其他实施方式中，VH1/VL1对可以结合效应细胞蛋白，并且VH2/VL2对可以结合靶细胞蛋白。

在一个方面，双特异性抗体包含一条多肽链或两条具有不同氨基酸序列的不同多肽链。第一多肽链包含具有一个或两个氨基酸置换的mFc结构域和两个VH区加上通过接头分开的两个VL区。mFc结构域可以相对于四个免疫球蛋白可变区是N端、C端或中间，并且它可以通过接头与可变区连接。第二多肽链包含mFc结构域。

其他种类的改变也可以是作为Bi-mFc的一部分的Fc多肽链的一部分。在一个方面，包含在Bi-mFc中的Fc区可包含一个或多个“抑制Fcγ受体(FcγR)结合至与如上定义的Fc区的改变”。在另一个方面，包含在Bi-mFc中的Fc区可以包含一个或多个如上定义的“延长半衰期的Fc改变”。在另一方面，一个或多个“增强ADCC的改变”可以包含在作为Bi-mFc的一部分的Fc区中。

在一些实施方式中，“i形”双特异性抗体(iBiBody)包含两个单体Fc(mFc)融合蛋白(图11)。在某些实施方式中，单体Fc融合蛋白之一包含结合蛋白、mFc结构域和VL-CL结构域。在一个方面，所述结合蛋白通过接头与VL-CL结构域的N端或C端连接。所述mFc结构域通过另一接头与VL-CL结构域的相对末端连接。另一种单体Fc融合蛋白包含mFc结构域和VH-CH1结构域。在某些其他实施方式中，单体Fc融合蛋白之一包含结合蛋白、mFc结构域和VH-CH1结构域。在一个方面，所述结合蛋白通过接头与VH-CH1结构域的N端或C端连接。所述mFc结构域通过另一接头与VH-CH1的相对末端连接。另一单体Fc融合蛋白包含mFc结构域和VL-CL。两个单体Fc融合蛋白的所述VL、CL、VH和CH1形成Fab。在某些实施方式中，结合蛋白是scFv。在某些实施方式中，与mFc连接的接头可以具有一个或多个半胱氨酸残基以形成二硫键。

在其他实施方式中，“i形”双特异性抗体(iBiBody)包含一个单体Fc(mFc)融合蛋白和另一个不含mFc的多肽链(图11)。在一个方面，所述mFc和结合蛋白可以在所述iBiBody的一条多肽链上。在另一个方面，所述mFc和结合蛋白可以位于所述iBiBody的两条不同的多肽链上。

在某些实施方式中，单体Fc融合蛋白包含结合蛋白、mFc结构域和VL-CL结构域。

在一个方面，所述结合蛋白通过接头与VL-CL结构域的N端或C端连接。

所述mFc结构域通过另一接头与VL-CL结构域的相对末端连接。另一条多肽链包含VH-CH1结构域。

在某些其他实施方式中，单体Fc融合蛋白包含结合蛋白、mFc结构域和VH-CH1结构域。

在一个方面，所述结合蛋白通过接头与VH-CH1结构域的N端或C端连接。所述mFc结构域通过另一接头与VH-CH1的相对末端连接。另一条多肽链包含VL-CL。所述iBiBody的所述VL、CL、VH和CH1形成Fab。

在进一步的其他实施方式中，单体Fc融合蛋白包含mFc结构域和VH-CH1结构域。所述mFc结构域通过接头与VH-CH1结构域的N端或C端连接。另一条多肽链包含VL-CL和结合蛋白。所述结合蛋白通过接头与VL-CL结构域的N端或C端连接。所述iBiBody的所述VL、CL、VH和CH1形成Fab。在进一步的其他实施方式中，单体Fc融合蛋白包含mFc结构域和VL-CL结构域。所述mFc结构域通过接头与VL-CL的N端或C端连接。另一条多肽链包含VH-CH1和结合蛋白。所述结合蛋白通过接头与VH-CH1结构域的N端或C端连接。所述iBiBody的所述VL、CL、VH和CH1形成Fab。

其他类型的改变也可以是作为iBiBody一部分的Fc多肽链的一部分。在一个方面，包含在iBiBody中的mFc多肽可以包含一个或多个“抑制Fcγ受体(FcγR)结合至如上定义的Fc区的接头”。在另一个方面，包含在iBiBody中的Fc区可以包含一个或多个如上定义的“延长半衰期的Fc改变”。在另一方面，一个或多个“增强ADCC的改变”可以包含在作为iBiBody一部分的Fc区中。

在一个实施方式中，包含具有一个或两个氨基酸置换的CH3结构域的“i形”双特异性抗体(iBiBody)可以单价地结合两种不同的抗原。此外，它可以通过其Fc区在微酸性pH(约pH5.5-6.0)下与新生儿Fc受体(FcRn)结合。这种与FcRn的相互作用可以延长分子在体内的半衰期。iBiBody可以与免疫效应细胞和靶细胞结合和/或可以通过免疫效应细胞介导靶细胞的细胞溶解。

靶细胞通过多特异性，至少双特异性抗体构建体募集T细胞的重定向裂解涉及细胞溶解性突触形成和递送穿孔素和颗粒酶。所接合的T细胞能够进行连续靶细胞裂解，并且不受干扰肽抗原加工和呈递的免疫逃逸机制，或克隆T细胞分化的影响；参见，例如，WO2007/042261。

除了将效应细胞再靶向于癌症部位外，还建立了双特异性抗体的新应用。可同时结合细胞表面抗原和有效负载的双特异性抗体是用于治疗和诊断用途的理想递送***。可以开发能够同时抑制两个相关信号分子的双特异性抗体以克服固有的或获得性的抗性并且是更有效的血管生成抑制剂。双特异性抗体也可以通过模拟因子VIII的功能用于治疗血友病A。双特异性抗体在骨病和感染以及中枢神经***疾病中也具有广泛的应用前景。

实施例

实施例1

用于鉴定人IgG1Fc界面处的T366和Y407(Kabat编号)的诱变的计算分析

人IgG1晶体结构(PDB条目1HZH)的计算分析揭示CH3的Y407残基(Kabat编号方案)通过产生疏水性包装相互作用而在Fc的同源二聚化中起关键作用。我们还在CH3界面处鉴定了与Y407残基非常接近并且与T366残基排队(line)的空隙结构。我们假设CH3的这两个残基的置换可以导致允许mFc的稳定形成的新CH3界面。为了测试该假设，我们通过用简并密码子NNS随机化T366和Y407残基来产生Fc突变体的噬菌体展示文库，其编码完整组的标准氨基酸。用蛋白质A缀合树脂淘选该文库以富集与蛋白质A保持结合的克隆，这表明Fc突变体的正确折叠。之后用蛋白G包被的96孔板进行筛选以鉴定也与蛋白G结合的个体克隆(图1)。

从人IgG1抗体(Protein Data Bank条目1HZH)的晶体结构中提取Fc的原子坐标。通过使用PyMOL分子图形***(版本1.5.0.4；Schrodinger，LLC)表示Fc界面处的所有疏水残基。通过伴随地可视化界面处氨基酸残基的侧链来定位界面处的空隙结构。使用具有合适的侧链旋转异构体的PyMOL诱变向导(wizard)对单点突变进行建模。

构建、淘选和筛选Fc突变体的噬菌体展示文库以鉴定第一代单体Fc(mFc)

通过使用基于可溶性表达的单克隆ELISA(semELISA)(Chen等，Mol Immunol2010,47：912)用蛋白G包被的96孔板筛选文库导致鉴定7种mFc变体。它们都在CH3的407位具有疏水残基。相比之下，在366位没有氨基酸残基类型的偏好使用。

通过定点随机诱变构建Fc突变体的噬菌体展示文库。

MFcF1,5’-GATCGGCCCAGGCGGCCGCACCTGAACTCCTGGGG-3’(正义)(SEQ ID NO:18)；

MFcR1,5’-CAGGCTGACCTGGTTCTTGG-3’(反义)(SEQ ID NO:19)；

MFcF2,5’-CAGGTCAGCCTGNNSTGCCTGGTCAAAGGCTTC-3’(正义)(SEQ ID NO:20)；

MFcR2,5’-GAGGAAGAAGGAGCCGTC-3’(反义)(SEQ ID NO:21)；

MFcF3,5’-GGCTCCTTCTTCCTCNNSAGCAAGCTCACCGTGGAC-3’(正义)(SEQ ID NO:22)；

MFcR3,5’-GATCGGCCGGCCTGGCCTTTACCCGGAGACAGGG-3’(反义)(SEQ ID NO:23)。

为了随机化Fc的T366和Y407残基，Fc的三个基因片段：编码N端部分的片段1、编码中间部分的片段2(含有T366突变)和编码C端部分的片段3(含有Y407突变)，分别使用作为模板的Fc编码质粒和引物对MFcF1/MFcR1、MFcF2/MFcR2和MFcF3/MFcR3通过PCR进行扩增。片段2和3通过重叠PCR用相同摩尔浓度的模板两者在不存在引物的情况下进行7个循环并且在存在引物MFcF2和MFcR3的情况下进行15个另外的循环而连接在一起。然后通过用引物MFcF1和MFcR3进行重叠PCR将产物与片段1连接，产生Fc突变体的全长片段。用SfiI消化最终产物，并克隆到噬菌粒载体pWC1中。通过用脱盐和浓缩的连接对大肠杆菌菌株TGI电穿孔感受态细胞(Lucigen)进行电穿孔来制备噬菌体文库，如前所述(Chen等，J Mol Biol2008,382：779-789)。为了选择与蛋白A保持结合(表明Fc的适当折叠)的Fc突变体，我们将噬菌体文库(1010pfu)通过含有400μl蛋白A琼脂糖的柱，并用10mL PBS(pH7.4)洗涤柱两次。用0.1mM乙酸缓冲液(pH3.0)洗脱结合的噬菌体，并用洗脱缓冲液的1/10体积的1MTris-HCl缓冲液(pH9.0)中和。用洗脱的噬菌体感染对数期的TG1细胞并铺板产生单克隆。为了鉴定保持与蛋白G结合的个体Fc突变体，随机挑选单克隆，接种至96孔板中，并用1mM异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷诱导蛋白质表达。孵育过夜后，如前所述(Chen等，MolImmunol 2010,47：912-921)，通过使用基于可溶性表达的单克隆ELISA(semELISA)针对与蛋白G的结合筛选个体克隆的上清液。随机选择单克隆进行测序、表达和纯化mFc突变体的单体状态的表征(图2)。

七种mFc变体的表达和纯化。七种mFc变体在大肠杆菌菌株HB2151中表达，并通过使用蛋白质A缀合树脂从周质的可溶性级分中纯化。在非还原性SDS-PAGE上，野生型人IgG1Fc作为同源二聚体迁移，具有约50kDa的表观分子量(aMW)，而所有mFc变体作为单体跑胶，具有约30kDa的aMW(图3)。

尺寸排阻色谱法

用蛋白质分子量标准品碳酸酐酶(29kDa)、卵清蛋白(44kDa)、伴清蛋白(75kDa)、醛缩酶(158kDa)和铁蛋白(440kDa)校准Superdex200 10/300GL柱(GE Healthcare)。将PBS(pH7.4)中浓度为0.5mg/mL的纯化蛋白装载到预平衡柱上，用PBS(pH7.4)以0.5mL/min洗脱。尺寸排阻色谱显示PBS中纯化mFc7蛋白(pH7.4)的约90％作为单体洗脱，而其他mFc变体形成更多的同二聚体和更高阶的寡聚体。[图4][表1]。

用于鉴定第二代mFc的mFc7的M407残基的诱变

我们假设通过完善mFc7中的T366L和Y407M突变可以进一步改善Fc单体的形成。7种第一代mFc变体中的3种含有T366L突变，表明该突变对于Fc单体的稳定形成可能是必要的。因此，我们通过随机化M407残基同时保持T366L突变完整，制备了mFc7突变体的小噬菌体展示文库。通过使用具有蛋白G的semELISA来直接筛选该文库导致鉴定9种第二代mFc变体。与在CH3的407位都具有疏水残基的第一代变体形成对比，第二代变体的407位没有氨基酸残基类型的偏好使用。为了随机化mFc7的M407残基，我们另外使用以下引物：

mFc7F,5’-GGCTCCTTCTTCCTCNNSAGCAAGCTCACCGTG-3’(正义)(SEQ ID NO:24)；

mFc7R:5’-GAGGAAGAAGGAGCCGTC-3’(反义)(SEQ ID NO:25)。

通过分别使用作为模板的mFc7编码质粒和引物对MFcF1/mFc7R和mFc7F/MFcR3来PCR扩增编码mFc7的N和C端部分的基因片段。用初级PCR产物作为模板和引物MFcF1和MFcR3通过重叠PCR组装mFc7突变体的全长基因片段。用SfiI消化最终产物，并克隆到噬菌粒载体pWC1中。转化DH5α化学感受态细胞(Lucigen)并涂布在琼脂平板上。随机选择单克隆用于测序、表达和纯化mFc7突变体的单体状态的表征。[图5]

根据制造商的方案，通过蛋白A Sepharose 4Fast Flow柱层析(GE Healthcare)从HB2151周质的可溶性级分中纯化Fc变体。使用Superdex200 10/300GL柱(GEHealthcare)进行Fc蛋白质同质性分析(SEC)。通过测量280nm处的吸收并使用1mg/ml＝1.74OD280计算来测定蛋白质浓度。

尺寸排阻色谱(SEC)显示，PBS(pH7.4)中不低于80％的纯化的mFc7.21、mFc7.22、mFc7.24、mFc7.27和mFc7.28蛋白洗脱为单体。mFc7.21、mFc7.24和mFc7.28显示出比mFc7更高的单体百分比，而mFc7.22没有观察到改善(图6)[表1]。本发明首次提供了仅用两个氨基酸突变就成功产生mFc，其与先前报道的mFc相比可导致在人中没有或更低免疫原性。

表1.通过SEC测量的mFc变体的寡聚状态的实例。

mFc变体	单体(％)	二聚体(％)	寡聚体(％)
				mFc3(SEQ ID NO:3)	60	40	0
mFc7(SEQ ID NO:5)	90	10	0
				mFc8(SEQ ID NO:6)	58	38	4
mFc12(SEQ ID NO:7)	45	55	0
				mFc7.21(SEQ ID NO:13)	97	3	0
mFc7.22(SEQ ID NO:14)	80	20	0
				mFc7.24(SEQ ID NO:15)	95	5	0
mFc7.27(SEQ ID NO:16)	90	10	0
				mFc7.28(SEQ ID NO:17)	96	4	0

实施例2.双特异性抗体

具有用于异二聚化的CH1-CK和用于延长的半衰期的mFc7.x的概念验证双特异性抗体的克隆。

我们提出mFc可用于产生新的双特异性抗体形式，其可成功解决一些众所周知的双特异性抗体形式，例如双特异性T细胞接合物(BiTE)(Amgen)和CrossMab(Roche)的潜在问题。在我们新提出的形式中，人IgG CHI和CL(κ或λ)用作用于有效异二聚化的支架，mFc用于避免Fc同二聚化的问题并延长体内双特异性抗体的半衰期。具体地，在我们的双特异性抗体的一个臂中，scFv或其他结合蛋白通过多肽接头与CL的N端融合；后者通过相同或不同的多肽接头进一步与mFc的N端融合。在我们的双特异性抗体的另一个臂中，scFv或其他结合蛋白通过多肽接头与CH1的N端融合；后者通过相同或不同的多肽接头进一步与mFc的N端融合。多肽接头的实例包括但不限于G4S重复和全长或部分IgG铰链序列。

双特异性抗体的产生

为了提供概念验证，我们随机选择两种scFv(scFv1和scFv2)以产生所提出的形式的双特异性抗体。我们使用先前构建的具有CH1-CK的双特异性抗体，命名为BiCD20CD3(未发表)，作为模型，以产生具有用于延长的半衰期的mFc7.x的新型双特异性抗体。

使用以下引物：

bnIgG20L1,

5’-GTGTAAGCTTACCATGGGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTG-3’(正义)(SEQ ID NO:26)；

LCKR,5’-TGGGCACGGTGGACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3’(反义)(SEQ ID NO:27)；

MFc7.xF1,5’-TGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGG-3’(正义)(SEQ ID NO:28)；

MFc7.xR1,5’-GATCGAATTCTTATTTACCCGGAGACAGGG-3’(反义)(SEQ ID NO:29)；

bnIgG20H1,

5’-GTGTTCTAGAGCCGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTC-3’(正义)(SEQ ID NO:30)；

HCHR,5’-TGGGCACGGTGGACAAGATTTGGGCTCAAC-3’(反义)(SEQ ID NO:31)；

MFc7.xR2,5’-CGGCCGTCGCACTCATTTACCCGGAGACAGGG-3’(反义)；(SEQ ID NO:32)；

AAF,5’-TGAGTGCGACGGCCGGCA-3’(正义)(SEQ ID NO:33)；

AAAR,5’-CCCGAGGTCGACGCTCTC-3’(反义)(SEQ ID NO:34)。

在BiCD20CD3中，抗CD20scFv(下文称为scFv1)通过G4S多肽接头与CK的N端融合，而抗CD3scFv(下文称为scFv 2)通过相同的接头与CH1的N端连接。为了克隆具有mFc7.x的新的双特异性抗体，分别用作为模板的BiCD20CD3质粒和引物对bnIgG20L1/LCKR和bnIgG20H1/HCHR来PCR扩增scFv 1-CK和scFv2-CH1基因片段。分别用作为模板的mFc7.x质粒和引物对MFc7.xF1/MFc7.xR1和MFc7.xF1/MFc7.xR2来PCR扩增两个mFc7.x基因片段。通过分别用引物对bnIgG20L1/MFc7.xR1和bnIgG20H1/MFc7.xR2进行重叠PCR将ScFv 1-CK和scFv 2-CH1与两个mFc7.x片段连接。scFv 2-CH1-mFc7.x进一步与poly A信号基因片段(polyA)连接，其通过用引物bnIgG20H1和AAAR进行重叠PCR，用pDin1作为模板和引物AAAF和AAAR进行PCR扩增。将ScFv1-CK-mFc7.x和scFv2-CH1-mFc7.x-polyA分别通过HindIII/EcoRI和XbaI/SalI限制性位点依次克隆到pDin1载体中。

如图8所示，人抗体κ轻链恒定区(CK)和人IgG1恒定区1(CH1)用于异二聚化，mFc7.x用于延长双特异性抗体的半衰期。具体地，在一个臂中，scFv1通过由单拷贝的G4S基序组成的多肽接头与CK的N端融合，并且CK通过由五个氨基酸残基CPPCP(人IgG1铰链序列的一部分)组成的多肽接头与mFc7.x的N端进一步融合。在另一个臂中，分别通过相同的接头，scFv 2与CH1的N端融合，CH1与mFc7.x的N端进一步融合。G4S接头为scFv发挥其功能提供了足够的灵活性，而CPPCP接头产生两个链间二硫键以稳定异二聚体。将双特异性抗体克隆到Dinova表达载体pDin1中，其允许同时表达两种不同的基因盒。它在293自由型细胞中瞬时表达，并根据制造商的说明书使用GE Healthcare HiTrap KappaSelect树脂从培养上清液中亲和纯化。在非还原性SDS-PAGE上，大部分纯化蛋白质作为预期的异二聚体迁移，具有约120kDa的表观分子量(aMW)，接近其计算的分子量(cMW)124kDa。蛋白质的其余部分是解离的scFv1-CK-mFc7.x链，具有约60kDa的aMW，也接近其cMW 62kDa。在还原性条件下，解离的scFv1-CK-mFc7.x和scFv2-CH1-mFc7.x链由于几乎相同的cMW 62kDa而没有很好地分离(图8)。

纯化的双特异性抗体的尺寸排阻色谱(SEC)。

SEC显示KappaSelect纯化双特异性抗体含有解离的scFv1-CK-mFc7.x单体、异二聚体和更高阶的寡聚体，其可以通过SEC很好地彼此分离，从而产生相对纯的scFv 1-CK-mFc7.x/scFv2-CH1-mFc7.x的异二聚体。用碳酸酐酶(29kDa)、卵清蛋白(44kDa)、伴清蛋白(75kDa)、醛缩酶(158kDa)和铁蛋白(440kDa)的蛋白质分子量标准品校准Superdex200 10/300GL柱(GE Healthcare)。将PBS(pH7.4)中浓度为0.5mg/mL的纯化蛋白装载到预平衡柱上，用PBS(pH7.4)以0.5mL/min洗脱(图9)。

实施例3.仅具有一条多肽链的双特异性mFc抗体。

仅具有一条多肽链的双特异性mFc抗体的实例显示于图10中。在一种形式中，scFv1和scFv 2分别通过多肽接头(a)与mFc的N和C端融合。在另一种形式中，scFv 1通过多肽接头与scFv 2的N端融合，后者通过相同或不同的多肽接头(b)进一步与mFc的N端连接。而在另一种形式中，mFc与scFv 1的N端融合，后者通过相同或不同的多肽接头(c)进一步与scFv2的N端连接。scFv 1或scFv2也可以是其他结合蛋白。

实施例4.“i形”双特异性抗体(iBiBody)

具有用于异二聚化的Fab的VH-CH1和VL-CL和用于延长的半衰期的mFc的新型“i形”双特异性抗体形式(iBiBody)的设计。mFc可用于产生新的双特异性抗体形式，其可成功解决一些众所周知的双特异性抗体形式，例如双特异性T细胞接合物(BiTE)(Amgen)和CrossMab(Roche)的潜在问题。设计了新型“i形”不对称双特异性抗体形式(iBiBody)，其包含结合蛋白、Fab和一种或多种单体Fc多肽，其中所述结合蛋白与所述Fab的N端或C端连接，并且其中所述一种或多种单体Fc多肽与所述Fab的其他末端连接。iBiBody设计的实例如图11所示。多肽接头的实例包括但不限于G4S重复和全长或部分IgG铰链序列。

假设在Fab和mFc之间使用缩短的人IgG1铰链序列，例如CPPCP，可导致通过创造空间位阻而降低与Fc受体(FcR)结合，其消除FcR结合介导的毒性，例如淋巴细胞减少，以及通过去除蛋白酶切割位点而增加抗体稳定性。

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尽管出于清楚理解的目的通过说明和实施例详细描述了前述发明，但是实施某些改变和修改对于本领域技术人员是显而易见的。因此，描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。

Claims

1.一种单体Fc多肽，其包含CH2和CH3结构域，其中所述CH3结构域仅包含在对应于根据Kabat编号的SEQ ID NO:1的位置T366和Y407的位置处的两个氨基酸置换，其中T366被L(亮氨酸)置换，而Y407被I(异亮氨酸)、F(苯丙氨酸)、L(亮氨酸)、M(甲硫氨酸)、H(组氨酸)、K(赖氨酸)、S(丝氨酸)、Q(谷氨酰胺)、T(苏氨酸)、W(色氨酸)、A(丙氨酸)、G(甘氨酸)或N(天冬酰胺)置换。

2.一种非天然存在的单体Fc多肽，其为SEQ ID NO:1所示的多肽的变体，其中所述变体仅包含在根据Kabat编号的位置T366和Y407处的氨基酸置换，其中T366被L(亮氨酸)置换，Y407被I(异亮氨酸)、F(苯丙氨酸)、L(亮氨酸)、M(甲硫氨酸)、H(组氨酸)、K(赖氨酸)、S(丝氨酸)、Q(谷氨酰胺)、T(苏氨酸)、W(色氨酸)、A(丙氨酸)、G(甘氨酸)或N(天冬酰胺)置换。

3.根据权利要求2的单体Fc多肽，其具有选自SEQ ID NO:3、5和9-17的氨基酸序列。

4.一种单体Fc融合蛋白，其包含根据权利要求1-3中任一项所述的单体Fc多肽和与所述单体Fc多肽融合的抗体可变结构域。

5.一种抗体重链，其包含根据权利要求1-3中任一项所述的单体Fc多肽。

6.一种单体抗体，其包含根据权利要求4所述的单体Fc融合蛋白或权利要求5所述的抗体重链，和抗体轻链。

7.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1-3中任一项所述的单体Fc多肽。

8.一种表达载体，其包含根据权利要求7所述的多核苷酸，所述多核苷酸编码所述单体Fc多肽。

9.一种宿主细胞，其包含根据权利要求8所述的表达载体，所述表达载体编码所述单体Fc多肽。

10.一种制备单体Fc多肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)在其中表达根据权利要求1-3中任一项所述的单体Fc多肽的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码所述单体Fc多肽的DNA；和(b)从宿主细胞培养物中回收所述单体Fc多肽。

11.一种双特异性抗体，其包含单一多肽链，所述多肽链包含根据权利要求1-3中任一项所述的单体Fc多肽。

12.根据权利要求11的双特异性抗体，其包含四个可变区，所述可变区按以下顺序中的任一种排列：

(a)VH1-接头1-VL1-接头2-VH2-接头3-VL2；

(b)VL1-接头1-VH1-接头2-VL2-接头3-VH2；

(c)VH1-接头1-VL1-接头2-VL2-接头3-VH2；和

(d)VL1-接头1-VH1-接头2-VH2-接头3-VL2；

其中，所述VH1和VL1形成第一抗原结合对，并且所述VH2和VL2形成第二抗原结合对。

13.根据权利要求12的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合对结合靶细胞蛋白，并且所述第二抗原结合对结合效应细胞蛋白；或所述第一抗原结合对结合效应细胞蛋白，并且所述第二抗原结合对结合靶细胞蛋白。

14.一种双特异性抗体，其包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包含根据权利要求1-3中任一项所述的单体Fc多肽。

15.根据权利要求14的双特异性抗体，其中所述第二多肽链包含权利要求1-3中任一项所述的单体Fc多肽。

16.根据权利要求15的双特异性抗体，其中所述第一多肽链中的单体Fc多肽的N端或C端通过接头与轻链恒定区(CL)连接，CL的N端或C端通过另一接头与单链可变片段(scFv)连接；并且所述第二多肽链中的单体Fc多肽的N端或C端通过接头与重链恒定区1(CH1)连接，CH1的N端或C端通过另一接头与另一种scFv连接；并且其中所述第一多肽链和所述第二多肽链通过CL和CH1的异二聚化连接。