MX2011010825A

MX2011010825A - Metodos y composiciones de nanoparticulas sin priones.

Info

Publication number: MX2011010825A
Application number: MX2011010825A
Authority: MX
Inventors: Patrick Soon-Shiong; Neil P Desai; Viktor Peykov
Original assignee: Abraxis Bioscience Llc
Priority date: 2009-04-15
Filing date: 2010-04-15
Publication date: 2012-01-20
Also published as: EP2419732A1; JP2012524104A; CY1122617T1; WO2010121000A1; IL215765A; PL2419732T3; LT2419732T; IL215765A0; PT2419732T; ES2764100T3; DK2419732T3; US20170100344A1; SG175239A1; RU2011146132A; US20100297243A1; AU2010236382B2; ME03596B; JP2015157839A; SI2419732T1; CN102460167A

Abstract

Se describen composiciones sin priones que comprenden nanopartículas que comprenden fármacos insolubles en albúmina y sustancialmente en agua. También se proporcionan métodos para producir composiciones libres de o sin priones y métodos de extracción de proteínas de prión de las composiciones de nanopartículas. También se proporcionan métodos de uso de las composiciones, así como equipos útiles para la realización de los métodos.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES DE NANOPARTÍCUIAS SIN PRIONES SOLICITUDES RELACIONADAS La solicitud reclama el beneficio de prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de los E.U.A. No. de Serie 61/169,665, presentada en abril 15, 2009, y la Solicitud de Patente Provisional de los E.U.A. No. de Serie 61/238,052, presentada en agosto 28, 2009, el contenido de cada una de las cuales se incorpora aquí en su totalidad.

CAMPO TÉCNICO La presente . invención se refiere a composiciones sin priones que comprenden nanopartículas que comprenden albúmina y fármacos substancialmente insolubles en agua, a métodos para producción, y a métodos para uso de las mismas.

ANTECEDENTES Las enfermedades de priones, también conocidas como encefalopatías espongiformes transmisibles (TSEs Transmissible Spongiform Encephalopathies ) , son un grupo de enfermedades neurodegenerativas transmisibles fatales. Ejemplos específicos de TSE incluyen tembladera o prurito lumbar, que ' afecta a ovejas y cabras, encefalopatía espongiforme bovina (BSE = Bovine Spongiform Encephalopathy) , encefalopatía de mink transmisible, encefalopatía espongiforme felina y enfermedad de desgaste crónico (CWD = Chronic Wasting Disease) . En los humanos, las enfermedades TSE pueden presentarse como kuru, enfermedad de Creutzfeldt-Jekob (CJD = Creutzfeldt-Jekob disease) , Síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS = Gerstmann-Straussler-Scheinker Syndrome) , insomnio fatal y enfermedad Creutzfeídt-Jekob variante (vCJD = variant Creutzfeldt-Jekob disease) . vCJD surgió en humanos como resultado de la epidemia de BSE en Gran Bretaña y más probablemente provocada por el consumo de productos alimenticios derivados de ganado infectado con BSE o la "enfermedad de las vacas locas" ("mad cow disease"). ( ill et al. (1996) Lancet 347:921-925). Debido a que el periodo de incubación para la enfermedad contraída oralmente puede ser más de 20 años en los humanos, la incidencia real de vCJD puede no ser aparente por muchos años.

Además de ingestión de productos infectados de origen bovino, la transfusión de sangre y trasplante de órganos representan otro modo de transmitir vCJD entre humanos (Brown et al. (1998) Transfusión 38:810-816; Diringer et al. (1984) Archives of Virology 82:105-109/ Manuelidis et al. (1978) Nature 271:778-779). Consideraciones principales surgieron desde la mitad de la década de 1990 ya que vCJD puede transmitirse a través de transfusión de sangre u otros productos de sangre de individuos infectados con TSE. Estos individuos pueden ser asintomáticos durante la fase prolongada pre-clínica y de incubación de vCJD, y la sangre obtenida de estos donadores puede ser capaz de transmitir la enfermedad a personas que reciben la sangre o productos de sangre derivados del donador.

Hay hasta la fecha al menos cuatro casos reportados en humanos de vCJD adquirida por transfusión de sangre en el Reino Unido. De 64 personas quienes recibieron sangre entera de 22 donadores, 4 personas desarrollaron vCJD. En la primera incidencia, el recipiente se enfermó 7 años después de recibir glóbulos rojos del donador quien permaneció asintomático y solo mostró signos de vCJD hasta 3 años después de la donación (Llewely et al. (2004) Lancet 363:417-421) . En la segunda incidencia, el donador murió de vCJD, dos años después de la donación, y el recipiente murió de aneurisma (no vCJD) 5 años después de donación (Peden et al. (2004) Lancet 364:527-529). En la autopsia del recipiente, PrPsc estuvo presente en los nodos linfáticos y el bazo, pero no en el cerebro. En la tercera incidencia, el recipiente murió de vCJD siete y medios años después de la transfusión de un donador quien desarrolló vCJD 20 meses después de la donación ( roe et al. (2006) Lancet 368:2061-2067). El cuarto incidente ocurrió en un recipiente ocho y medio años después de una transfusión del mismo donador en el tercer caso (Health Protection Agency-Health Protection Report, (2007) Vol. 1, No. 3, 26. Disponible en: http: //www. hpa. org. uk/hpr/archives /2007/news2007 /news0307. htm Una característica común de todas las enfermedades de priones es la conversión de la proteínas priones celular normal (PrPc) en una isoforma anormal (PrPsc). La diferencia entre PrPc y PrPsc se considera puramente conformacional, con PrPc que tiene estructuras alfa-helicoidales primordialmente y PrPsc que tiene primordialmente hojas beta que frecuentemente se ensamblan para formar agregados. PrPsc actúa como una plantilla para inducir que moléculas de proteínas normales se conviertan en la misma isoforma anormal, que después a su vez convierte más PrPc en PrPsc (Prusiner et al. (1998) Proc. Nati. Acad. ScL USA 95: 13363-13383) . Este proceso autocatalítico lleva a la formación exponencial de agregados de PrPsc neurotóxico (Aguzzi et al. (2007) Nat Rev Mol. Cell Biol. 8:552-561). Ligandos de priones y sus usos se han descrito en WO04/050851, WO06/010915, WO04/090102, y WO06/044459.

Estudios han mostrado que la más temprana aparición • de infectividad de priones en la sangre puede ocurrir durante la etapa temprana del periodo de incubación de la enfermedad (Brown et al. (2006) Blood infectivity in the transmissible spongiform encephalopathies . Chapter 4 In: Turner ML, ed. 95- 118) . Debido a que puede ser un prolongado tiempo antes del inicio de los síntomas de la enfermedad, los individuos silenciosamente infectados todavía pueden considerarse como donadores de sangre activos sanos. Además, algunos individuos pueden ser infectados en forma permanente o transitoria sin desarrollar la enfermedad. De esta manera es difícil si no imposible asegurar que fuentes de sangre para productos derivados de sangre estén libres de priones.

Composiciones de nanoparticulas basadas en albúmina se han desarrollado como un sistema para suministro de fármacos, para- suministrar fármacos substancialmente insolubles en agua. Ver, por ejemplo, las patentes de los E.U.A. Nos. 5,916,596; 6,506,405; 6,749,868, y 6,537,579 y también en las Publicaciones de Patentes de los E.U.A.. Nos. 2005/0004002 y 2007/0082838. La tecnología de nanoparticulas basada en albúmina utiliza las propiedades naturales únicas de la proteína albúmina para transportar y suministrar fármacos substancialmente insolubles en agua al sitio de la enfermedad. Estas nanoparticulas se incorporan fácilmente en los propios procesos de transporte del cuerpo y son capaces de explotar la atracción de los tumores a la albúmina, permitiendo el suministro de superiores concentraciones del fármaco activo al sitio objetivo. Además, la tecnología de nanoparticulas basada en albúmina ofrece la capacidad por mejorar la solubilidad de un fármaco al evitar la necesidad por productos químicos tóxicos, tales como solventes, en el proceso de administración, de esta manera mejorando potencialmente la seguridad a través de la eliminación de los efectos secundarios relacionados a solventes.

Las descripciones de todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patentes y solicitudes de patentes publicadas aquí referidas, aquí se incorporan por referencia en su totalidad.

BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención en un aspecto, proporciona composiciones de nanopartículas libres de priones (tales como composiciones farmacéuticas). En algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológicamente activos substancialmente insoluble en agua, en donde la composición está substancialmente libre de priones. En algunas modalidades, la composición es estéril. En algunas modalidades, la composición es filtrable estéril. En algunas modalidades, la composición además comprende un portador farmacéutico aceptable.

En algunas modalidades, la composición tiene menos de aproximadamente 100 fg/ml - de priones. En algunas modalidades, la composición tiene una infectividad de priones menor a aproximadamente 10 IU- ic/ml. En algunas modalidades, la composición tiene una infectividad de priones menor a aproximadamente 1 LDso/ml.

En algunas modalidades, la composición no muestra la presencia de una proteína prión basada en un ensayo de amplificación cíclica de plegamiento incorrecto o alterado de proteína (PMCA = Protein Misfolding Cyclic Amplification) . En algunas modalidades, la composición no muestra la presencia de priones con base en un ensayo IPCR. En algunas modalidades, la composición tiene una infectividad de priones menor a aproximadamente · 10 IU- ic/ml y no muestra la presencia de priones basada en un ensayo PMCA. En algunas modalidades, la composición tiene una infectividad de priones menor que aproximadamente 10 IU-ic/ml y no muestra la presencia de priones con base en un ensayo IPRC.

Las composiciones aquí descritas en general substancialmente están libres de PrPsc. En algunas modalidades, la composición también está substancialmente libre de PrPc. En algunas modalidades, la proporción molar-de PrPsc y PrPc en la composición no es mayor que aproximadamente 1:1, tal como no mayor que aproximadamente cualquiera de 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, .o 1:100000.

La composición aquí descrita en algunas modalidades contiene una cantidad (por ejemplo, una cantidad en trazas) de substancias introducidas durante un proceso de eliminación de priones. Por ejemplo, en algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológicamente activo substancialmente insoluble en agua, en donde la composición está substancialmente libre de priones, y en donde la composición comprende una cantidad (por ejemplo, una cantidad en trazas) de un ligando capaz de enlazar a priones. En algunas, modalidades, se proporciona una composición gue comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la composición está substancialmente libré de priones, y en donde la composición comprende una cantidad (por ejemplo, una cantidad en trazas) de un material de soporte (tal como un material de soporte aquí descrito, incluyendo una resina) . En algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la composición está substancialmente libre de priones, y en donde la composición comprende una cantidad de una resina PRDT (por ejemplo, una cantidad en trazas de una resina PRDT) . En algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la composición está substancialmente libre de priones, y en donde la composición comprende una cantidad de una resina DVR (por ejemplo, una cantidad en trazas de una resina DVR) .

En algunas modalidades, el nivel de un estabilizante de albúmina en la composición es menor que aquel de una composición en donde la albúmina aún no se ha liberado por un proceso de eliminación de priones. Estos estabilizantes de albúmina incluyen, por ejemplo N-acetil "triptofanato y caprilato de sodio.

En algunas modalidades, la composición es bioequivalente a una composición en donde la albúmina aún no se ha liberado por un proceso de eliminación de priones.

En algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la albúmina en la composición se obtiene por un método que comprende un proceso de eliminación de priones, el proceso de eliminación de priones comprende poner en contacto una composición de albúmina inicial con un ligando capaz de enlazar priones. En algunas modalidades, el proceso de eliminación de priones además comprende eliminar el ligando y proteínas enlazadas al mismo de la composición de albúmina.

En algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la albúmina en la composición se obtiene por un método que comprende: a) poner en contacto una composición inicial de albúmina con un ligando capaz de enlazar priones para provocar formación de un complejo entre el ligando y priones, y b) retirar el complejo de la composición inicial.

En algunas modalidades, la composición de albúmina inicial es un producto derivado de sangre. En algunas modalidades, la composición inicial de albúmina es una composición de albúmina preparada a partir de un fluido corporal (tal como sangre). En algunas modalidades, la albúmina es albúmina de suero humano.

En algunas modalidades, el ligando es un péptido (tal como cualesquiera péptidos que se proporcionan en la Tabla 1) . En algunas modalidades, el ' ligando es un anticuerpo que reconoce priones. En algunas modalidades, " el ligando es un compuesto químico (tal como compuestos basados en triazina) . En algunas modalidades, el ligando comprende un grupo amino, tal como un grupo amino en una amino resina.

El ligando puede enlazarse a un material de soporte, incluyendo por ejemplo, columna, lecho, matriz, filtro y membrana.

En otro aspecto, se proporcionan métodos para producir composiciones de nanopartículas libres de priones. Por ejemplo, en algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, el método comprende someter a una mezcla que comprende una solución de albúmina y una fase orgánica que contiene el agente farmacológico activo substancialmente insoluole en agua, dispersa en un solvente orgánico a una alta condición de cizalla, en donde la albúmina se obtiene por un método que comprende retirar priones de una composición inicial de albúmina. En algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, el método comprende someter uria mezcla que comprende una solución de albúmina y una fase orgánica que contiene el agente farmacológico · activo substancialmente insoluble en agua disperso en un solvente orgánico, a una alta condición de cizalla, en donde la albúmina se obtiene por un método que comprende poner en contacto una composición de albúmina inicial con un ligando capaz de ligar o enlazar con priones. En algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, el método comprende someter una mezcla que comprende una solución de albúmina y una fase orgánica que contiene el agente activo farmacológico substancialmente insoluble en agua disperso en un solvente orgánico a una alta condición de cizalla, en donde la albúmina se obtiene por un método que comprende: a) poner en contacto una composición de albúmina inicial con un ligando capaz de enlazar con priones, y b) retirar el ligando y la proteina ligada al mismo de la composición inicial.

En algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, el método comprende: a) retirar un prión o proteina prión de una composición inicial de albúmina; b) someter a una condición de alta cizalla, una mezcla que comprende una solución que comprende la albúmina retirada de priones y una fase orgánica que comprende el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua disperso en un solvente orgánico. En algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, el método comprende: a) poner en contacto una composición inicial de albúmina con un ligando capaz de enlazar a una proteina prión, para provocar formación de un complejo entre el ligando y una proteina prión, b) retirar el complejo de la composición inicial de albúmina; y c) someter a una condición de alta cizalla, una mezcla que comprende una solución que comprende la albúmina retirada de priones y una fase orgánica que comprende el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, disperso en un solvente orgánico.

En algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, que comprende: a) poner en contacto una solución de albúmina con un ligando capaz de enlazar a una proteina prión, b) retirar de la solución de albúmina el ligando y proteina enlazada al mismo, y c) someter a condición de alta cizalla una mezcla que comprende la solución1 de albúmina y una fase orgánica que comprende el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua disperso en un solvente orgánico. En algunas • modalidades, la mezcla no contiene substancialmente surfactantes .

Los priones pueden retirarse durante la formación de las nanoparticulas. Por ejemplo, en algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, que comprende: a) poner en contacto una mezcla que comprende una solución de albúmina y una fase orgánica que comprende el agente farmacológico activo substancialmente · insoluble en agua disperso en un solvente orgánico, con un ligando capaz de enlazar a una proteina prión. En algunas modalidades, el método además comprende: b) retirar de la mezcla el ligando y proteínas enlazadas al mismo. En algunas modalidades, el método además comprende c) someter la mezcla a una condición de alta cizalla. En algunas modalidades, la mezcla substancialmente no contiene surfactantes .

Las proteínas de prión también pueden retirarse después - de formación de la composición de nanopartículas . Por ejemplo, en algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, que comprende poner en contacto una mezcla que comprende una fase orgánica que comprende el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua disperso en un solvente orgánico y una solución de albúmina con un ligando capaz de enlazar a una proteína prión, en donde la mezcla se ha sometido a una condición de alta cizalla antes de poner en contacto con el ligando. En algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, que comprende: a) someter a condición de alta cizalla, una mezcla que comprende una fase orgánica que comprende el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, disperso en un solvente orgánico y una solución de albúmina, y b) poner en contacto la mezcla con un ligando capaz de enlazar con una proteína prión. En algunas modalidades, el método además comprende: c) retirar de la mezcla el ligando y proteínas enlazadas al mismo. En algunas modalidades, la mezcla está substancialmente libre de surfactantes .

En algunas modalidades, se proporciona un método para retirar una proteína prión de una composición que se sospecha contiene una proteína prión que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, el método comprende a) poner en contacto la composición de nanopartículas con un ligando capaz de enlazar a una proteína prión, b) retirar de la composición de nanopartículas el ligando y proteínas ligadas al mismo. En algunas modalidades, se proporciona un método para restirar una proteína prión de una composición de albúmina que se sospecha contiene una proteína prión anormal, que comprende: a) poner en contacto la composición que comprende albúmina con un ligando capaz de enlazar a una proteína prión, b) retirar el ligando y proteínas enlazadas al mismo de la composición de albúmina, en donde la composición de albúmina se emplea para producir una composición que comprende nanopartículas que comprenden nanopartículas que comprende albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua.

En algunas modalidades, se proporciona un método para retirar una proteina prión de una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, que comprende: a) determinar la presencia o ausencia de una proteina prión en la composición, b) poner en contacto la composición con un ligando capaz de enlazar una proteina prión, y c) retirar de la composición, el ligando y proteínas ligadas al mismo.

También se proporcionan composiciones elaboradas durante el proceso de eliminación de priones. Por ejemplo, en algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, además comprende un ligando capaz de enlazar a una proteína prión. En algunas modalidades, se proporciona una mezcla que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, y un ligando capaz de enlazar a una proteína prión enlazada a un material de soporte, tal como uno o más materiales de soporte aquí descritos. En algunas modalidades, se proporciona una columna cargada con una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la columna comprende un ligando capaz de enlazar a una proteína prión.

También se proporcionan composiciones elaboradas por los métodos aquí descritos. También se proporcionan métodos para utilizar las composiciones libres de priones aquí descritas. Por ejemplo, en algunas modalidades, se proporciona un método para administrar una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la composición está substancialmente libre de una proteina prión. En algunas modalidades, se 'proporciona un método para tratar una enfermedad (tal como cáncer) que comprende administrar una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y ua agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la composición está substancialmente libre de una proteina prión.

En algunas modalidades, se proporciona un método para administrar una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la albúmina en la composición se obtiene por un método que comprende un proceso de eliminación de priones, el proceso de eliminación de priones comprende poner en contacto una composición inicial de albúmina con un ligando capaz de enlazar una proteina prión. En algunas modalidades, el proceso de eliminación de priones además comprende retirar de la composición de albúmina, el ligando y proteínas enlazadas al mismo. En algunas modalidades, se proporciona un método para tratar una enfermedad (tal como cáncer) que comprende administrar una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la albúmina en la composición se obtiene por un método que comprende un proceso de eliminación de priones, el proceso de eliminación de priones comprende poner en contacto una composición inicial de albúmina con un ligando capaz de enlazar a una proteína prión.

También se proporcionan equipos y formas de dosis (tales como ampolletas, por ejemplo ampolletas selladas) que comprenden las composiciones de nanopartículas libres de priones descritas aquí y equipos útiles para los métodos aquí descritos. Además se proporcionan sistemas (incluyendo aparatos) para llevar a cabo uno o más métodos aquí descritos.

Estos y otros aspectos y ventajas de la presente invención serán aparentes de la subsecuente descripción detallada y reivindicaciones anexas. Habrá de entenderse que una, algunas o todas las propiedades de las diversas modalidades aquí descritas, pueden combinarse para formar otras modalidades de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 proporciona transferencias western y geles SDS-PAGE de resina DVR sometidas con homogeneizado de cerebro de hámster - tembladera o prurito lumbar (encefalopatía espongiforme, también conocida como scrapie) al 0.01% y 0.005% en albúmina a 20% o 25%. AMN31 fue la resina de control positivo. La señal observada fue la fracción de enlace. "-PK" y "+PK" denota ausencia o presencia de digestión de Proteinasa K.

La Figura 2 proporciona transferencias western y geles SDS-PAGE de resinas YVHEA y SYA tratadas con homogeneizado de cerebro de hámster-tembladera o prurito lumbar a 0.01% y 0.005% en albúmina 20% o 25%. AMN31 fue la resina de control positivo. La señal observada fue la fracción ligada. "-PK" y "+PK" denota ausencia o presencia de digestión de Proteinasa K.

La Figura 3 proporciona transferencias western y geles SDS-PAGE de resina D4 tratada con homogeneizado de cerebro de hámster-tembladera o prurito lumbar al 0.01% y 0.005% en albúmina 20% o 25%. AMN31 fue la resina de control positiva. La señal observada fue la fracción ligada. "-PK" y "+PK" denotan ausencia o presencia de digestión de Proteinasa K.

La Figura 4 ilustra el diagrama de flujo de proceso para la eliminación de TSE por la columna de resina de reducción de priones (columna de PRDT (Pathogen Removal and Diagnostic Technologies)) para albúmina al 20%.

La Figura 5 muestra un perfil de cromatografía modificada en el estudio de eliminación de TSE por la columna PRDT para albúmina al 20%.

La Figura 6 muestra una prueba de interferencia de transferencia Western de solución de albúmina al 20% con centrifugación (con y sin concentración a 10-veces) .

La Figura 7 ilustra el esguema de flujo de proceso para la eliminación de TSE por la columna de resina para reducción de priones (columna PRDT) para albúmina al 25%.

La Figura 8 muestra un perfil de cromatografía de una corrida modificada en el estudio de eliminación de TSE por la columna PRDT para albúmina al 25%.

La Figura 9 muestra la prueba de interferencia de transferencia Western de solución de albúmina al 25% con centrifugación (con y sin 10 veces de concentración) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones libres de priones (tales como composiciones farmacéuticas) que comprenden nanopartículas que comprenden albúmina y agentes farmacológicos activos substancialmente insolubles en agua y métodos para producir composiciones libres de priones.

La presente invención en un aspecto, proporciona composiciones .(tales como composiciones farmacéuticas) que comprenden nanopartículas que comprenden albúmina y agentes farmacológicos activos substancialmente insolubles en agua, en donde la composición está substancialmente libre de una proteina prión.

En otro aspecto, se proporciona un método para producir una composición libre de priones (tal como composiciones farmacéuticas) que comprenden nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua. También se proporcionan composiciones elaboradas durante el método de producción.

En otro aspecto, se proporciona un método para utilizar una composición libre de priones (tales como composiciones farmacéuticas) que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua.

También se proporcionan equipos y formas de dosis (tales como ampolletas por ejemplo ampolletas selladas) que comprenden las composiciones de nanoparticulas libres de priones aqui descritas y equipos y sistemas (incluyendo aparatos) útiles para los métodos aqui descritos.

"Libre de priones" se emplea aqui por conveniencia y en general para describir las composiciones de la invención y se pretende que abarque todas las modalidades aqui descritas.

Con referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro aqui, incluye (y describe) modalidades que se dirigen a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción con referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".

Se entiende que aspectos y modalidades de la invención aquí descritos incluyen que "consiste" y/o que "consiste esencialmente" de aspectos y modalidades.

Composiciones de nanoparticulas libres de priones La presente invención proporciona una composición (tal como una composición farmacéutica) que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la composición está substancialmente libre de una proteína prión. En algunas modalidades, la composición es estéril. En algunas modalidades, la composición es filtrable estéril. En algunas modalidades, la composición además comprende un portador farmacéutico aceptable.

En algunas modalidades, una proteína prión no puede detectarse en la composición por un método de detección que tienen una sensibilidad de detección de aproximadamente 100 fg/ml o superior, esto es, el resultado de prueba es negativo en un ensayo que utiliza un método que tiene una sensibilidad de detección de aproximadamente 100 fg/ml o superior (por ejemplo una sensibilidad de detección de aproximadamente 50 fg/ml, aproximadamente 10 fg/ml, aproximadamente 1 fg/ml, aproximadamente 0.1 fg/ml). El contenido de priones en la composición puede determinarse directamente a partir de la composición. En forma alterna, la composición puede ser procesada antes de la determinación, por ejemplo concentrada o enriquecida . a fin de facilitar la detección y cuantificación de la proteina prión en la composición.

Una forma para determinar si o no una composición está substancialmente libre de una proteina prión es ensayo de infectividad in vivo. Por ejemplo, la infectividad in vivo puede demostrarse por inoculación de la composición de prueba en modelos de' ratón, mink, hámster, o cabra. La infectividad puede determinarse por dosis letal (LD50), es decir, la dosis que cuando se administra por una ruta determinada (tal como por ruta intracerebral ) induce enfermedad en 50% de animales expuestos. En forma alterna, la infectividad puede determinarse por unidades infecciosas, es decir, la dosis infecciosa mínima capaz de transmitir la enfermedad a un animal experimental a otro por una ruta determinada. En general, 100 IU-ic/ml (unidades infecciosas determinadas por ruta intracerebral) corresponde a aproximadamente 10 LD50/ml y 1 pg/ml de proteína prión.

Otro método para determinar una proteína prión en la composición es reacción de cadena inmuno-polimerasa (IPCR), una técnica con la que la habilidad de amplificación exponencial de PCR se acopla a la detección de proteínas por anticuerpos en un formato ELISA y se aplica en un método IPCR en tiempo real modificado para detectar niveles ultra-bajos de proteina prión. Ver Barletta et al., J. Virology Method, 127 (2005) : 154-10 . Utilizando IPCR, PrPc. de hámster recombinante se detectó en forma consistente a 1 fg/ml y homogeneizados de cerebro de hámster infectado con tembladera o prurito lumbar (scrapie) digeridos con proteinasa K (PK) diluidos a 10~8 (aproximadamente 10-100 unidades infecciosas) se detecta con una respuesta de dosis semicuantitativa .

En algunas modalidades, la proteina prión en la composición se determina por Amplificación Cíclica por Plegamiento Incorrecto de Proteína (PMCA = Protein Misfolding Cyclic Amplification) . Este método se ha empleado para detectar PrPsc en la sangre. Otros métodos adecuados para determinar una proteína prión en la composición, incluyen pero no están limitados a: ELISA emparedado cuantitativo utilizando tecnología de fluorescencia mejorada con disociación resuelta en tiempo; barrido confocal fluorescente de color dual; inmunoensayo dependiente de conformación (CDI = Conformation Dependent Immunoassay) . Transferencia Western, transferencia de perlas, ensayos de desplazamiento de movilidad en gel, análisis de hibridización fluorescente in situ (FISH = Fluorescent In Situ Hybridization) , seguimiento de marcadores radioactivos o bioluminiscentes, resonancia magnética nuclear, resonancia paramagnética de electrones, espectroscopia de flujo detenido, cromatografía en columna, electroforesis capilar, u otros métodos también pueden ser desarrollados para detectar priones en la composición .

En algunas modalidades, la composición está substancialmente libre de una proteina prión con base en uno de los ensayos para detectar proteínas prión (tal como cualquiera de los ensayos descritos anteriormente) . En algunas modalidades, dos o más ensayos se emplean para analizar la composición, y la correlación entre estos diferentes ensayos se emplea para determinar si o no la composición está libre de una proteina' prión.

De esta manera, en algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la composición está substancialmente libre de una proteína prión. En algunas modalidades, la composición tiene una infectividad de priones menor a aproximadamente 100 fg/ml. En algunas modalidades, la composición tiene una infectividad de priones menor a aproximadamente 10 IU-ic/ml. En algunas modalidades, la composición tiene una infectividad prion menor a aproximadamente 1 LD50/ml. En algunas modalidades, la composición no muestra la presencia de una proteína prión ???· base en el ensayo de amplificación cíclico de plegamiento incorrecto de proteína (PMCA) . En algunas modalidades, la composición no muestra la presencia de una proteina prión con base en el ensayo IPCR. En algunas modalidades, la composición tiene una infectividad de priones menor a aproximadamente 10 IU-ic/ml y no muestra la presencia de una proteina prión con base en el ensayo PMCA. En algunas modalidades, la composición tiene una infectividad de priones menor a aproximadamente 10 IU-ic/ml y no muestra la presencia de una proteina prión con base en el ensayo IPRC. En algunas modalidades, la composición está libre de proteina prión con base en la norma que se proporciona en la Guia para Investigación de Procesos de Fabricación para Productos Medicinales Derivados de Plasma Respecto a Riesgo vCJD (CP P5136/03) , disponible en http : //www. emea . europa . eu/pdfs/human/bwp/513603en . pdf, el contenido de lo «cual se incorpora aquí en su totalidad.

Las composiciones aquí descritas en general están substancialmente libres de PrPsc. En algunas modalidades, la composición está también substancialmente libre de PrPc. En algunas modalidades, la proporción molar de PrPsc y PrPc en la composición no es mayor a aproximadamente 1:1, tal como no mayor que aproximadamente cualquiera de 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, o 1:100000.

En algunas modalidades, la composición está substancialmente libre de una proteina prión de humanos, bovinos, ovejas y roedores (tales como hámster, ratones y mink) . En algunas modalidades, la composición está substancialmente libre de la proteina prión tipo H, la proteina prión tipo L, o ambas. En algunas modalidades, la composición está substancialmente libre de enlace celular de proteina prión, la proteina prión libre, o ambas.

El término "PrPc" aquí empleado se refiere a la molécula de proteina prión activa, que se expresa naturalmente dentro del cuerpo del mamífero. El término "PrPsc" empleado aquí se refiere a la forma alterada conformacionalmente de la molécula PrPc que se considera infecciosa .

"Albúmina" empleada aquí se refiere a albúmina de origen natural y no abarca albúmina producida en forma recombinante . Albúmina de origen natural es ventajosa sobre albúmina recombinante debido a que es el ligando natural para receptores de albúmina in vivo. La albúmina empleada en los métodos aquí descritos en general retiene las modificaciones post-traducción de albúmina y de esta manera tiene riesgos reducidos de inmunogenicidad. En algunas modalidades, la albúmina se obtiene de una composición derivada de la sangre.

"Composición derivada de la sangre" aquí empleado incluye sangre entera, concentrado de glóbulos rojos, plasma, suero, porción rica en plaquetas y pobre en plaquetas, concentrado de plaquetas, glóbulos blancos, precipitado de plasma en sangre, precipitado y sobrenadante de fraccionación de plasma en sangre, intermediario de fraccionación en plasma, diversas otras sustancias que se derivan de la sangre, y semejantes. En algunas modalidades, la albúmina es de humano. En algunas modalidades, la albúmina es de un animal tal como bovino, de ovejas y roedores (tales como ratón, hámster, y mink) . En algunas modalidades, la albúmina se obtiene de una población de individuos (tales como humanos) algunos de los cuales han estado infectados con priones. En algunas modalidades, la albúmina se obtiene de una población de individuos (tal como humano) al menos algunos de los cuales se sospecha que han sido infectados con priones. En algunas modalidades, la albúmina se obtiene de un recolectado de individuos con tamaño de gran lote.

La composición aquí descrita en algunas modalidades contiene . cantidades en trazas de . sustancias que se introducen durante el proceso de eliminación de priones. Por ejemplo, en algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la composición está substancialmente libre de una proteina prión, y en donde la composición comprende una cantidad en trazas de un ligando capaz de enlazar a una proteina prión. En algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluole en agua, en donde la composición está substancialmente libre de una proteina prión, y en donde la composición comprende una cantidad en trazas de un material de soporte (tal como un material de un material de soporte aquí descrito, incluyendo una resina) . En algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la composición está substancialmente libre de una proteina prión, y en donde la composición comprende una cantidad en trazas de un ligando capaz de enlazar a una proteína prión y una cantidad en trazas de un material de soporte (tal como un material de un material de soporte aquí descrito, incluyendo una resina) .

"Cantidad en trazas" se refiere a una cantidad detectable que no afecta la propiedad de la composición, por ejemplo en términos de biodisponibilidad y/o bioequivalencia.

En algunas modalidades, la composición es bioequivalente a una composición en donde la albúmina no se ha liberado por un proceso de eliminación de priones. Bioequivalencia puede establecerse, por ejemplo por un intervalo de confianza de 90% de entre 0.80 y 1.25 tanto para Cmax y AUC, o un intervalo de confianza de 90% de entre 0.80 y 1.25 de AUC y un intervalo de confianza de 90% de entre 0.70 y 1.43 para Cmax.

En algunas modalidades, el nivel de estabilizante de albúmina en la composición es menor que el de una composición en donde la albúmina no se ha liberado por un proceso de eliminación de priones. Estos- estabilizantes de albúmina incluyen por ejemplo, N-acetil triptofanato y caprilato de sodio.

Las composiciones aquí descritas en general abarcan nanoparticulas que comprenden un agente farmacéutico activo substancialmente insoluble en agua y albúmina. En algunas modalidades, la composición de nanoparticulas comprende nanoparticulas que comprenden un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua y albúmina.¦ En algunas modalidades, las nanoparticulas en la composición aquí descrita tienen un diámetro promedio no mayor que aproximadamente 1000 nm, incluyendo por ejemplo no mayor que aproximadamente cualquiera de 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, o 60 nm. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 50% (por ejemplo al menos aproximadamente cualquiera de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 99%) de todas las nanoparticulas en la composición tienen un diámetro no mayor a aproximadamente 1000 nm, incluyendo por ejemplo no mayor que aproximadamente cualquiera de 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 190., 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, o 60 nm. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 50% (por ejemplo al menos cualquiera de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 99%) de todas las nanopartículas en la composición cae dentro del rango de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 nm, incluyendo por ejemplo cualquiera de aproximadamente 30 a aproximadamente 180 nm, y cualquiera de aproximadamente 40 a aproximadamente 150, aproximadamente 50 a aproximadamente 120, y aproximadamente 60 a aproximadamente 100 nm.

En algunas modalidades, al menos aproximadamente 5% (incluyendo por ejemplo al menos aproximadamente cualquiera de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90%) de la albúmina en la porción de nanoparticulas de la composición se entrelaza (por ejemplo entrelaza a través de uno o más enlaces disulfuro) .

En algunas modalidades, las nanoparticulas comprenden el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua (tal como paclitaxel) revestido con albúmina, (por ejemplo, albúmina de suero humano) .· En algunas modalidades, la composición comprende el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua tanto en forma de nanoparticulas como sin nanoparticulas, en donde al menos aproximadamente cualquiera de of 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 99% del agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua en la composición está en forma de nanoparticulas. En algunas modalidades, el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua en las . nanoparticulas constituye más de aproximadamente cualquiera de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 99% de las nanoparticulas en peso. En algunas modalidades, las nanoparticulas tienen una matriz no-polimérica . En algunas modalidades, las nanoparticulas comprenden un núcleo de agente farmacológico activó substancialmente insoluble en agua que está substancialmente libre de materiales poliméricos (tal como matriz polimérica) .

En algunas modalidades, la composición de nanoparticulas está substancialmente libre (tal como libre) de surfactantes o solvente orgánico (tal como Cremophor®, Tween 80, o cualesquiera otros solventes orgánicos empleados para la administración de agentes farmacológicos activos substancialmente insolubles en agua) . En algunas modalidades, la composición de nanoparticulas contiene menos que aproximadamente cualquiera de 20%, 15%, 10%, 7.5%, 5%, 2.5%, 1% o menos de solvente orgánico.

La eliminación de priones de la composición que contiene albúmina hace posible administrar superiores cantidades de albúmina sin estar involucrado o sin importar priones. La presente invención de esta manera también contempla composiciones (tales como composiciones farmacéuticas) que comprenden nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluole en agua, en donde la proporción en peso de albúmina al agente farmacéutico substancialmente insoluble en agua es de aproximadamente 20:1 o más, tal como aproximadamente cualquiera de aproximadamente 30:1 o más, aproximadamente 40:1 o más, o aproximadamente 50:1 o más. Proporciones ejemplares incluyen por ejemplo, aproximadamente 20:1 a aproximadamente 40:1, aproximadamente 40:1 a aproximadamente 60:1, aproximadamente 60:1 a aproximadamente 80:1, o aproximadamente 90:1 a aproximadamente 100:1. En algunas modalidades, la proporción en peso de albúmina y agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua en la composición de nanopartículas es de aproximadamente 18:1 o menos, tal como aproximadamente 15:1 o menos, por ejemplo aproximadamente 10:1 o menos. En algunas modalidades, la proporción en peso de albúmina y agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua en la composición cae dentro del intervalo de cualquiera de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 18:1, aproximadamente 2:1 a aproximadamente 15:1, aproximadamente 3:1 a aproximadamente 13:1, aproximadamente 4:1 a aproximadamente 12:1, aproximadamente 5:1 a aproximadamente .10:1. En algunas modalidades, la proporción en peso de albúmina y el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua en la porción de nanopartículas de la composición es aproximadamente cualquiera de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, ó rnenos.

En algunas modalidades, la composición de partículas comprende una o más de las características anteriores .

En algunas modalidades, la composición de nanopartículas es Abraxane™. Composiciones de nanopartículas que comprenden otros agentes farmacológicos activos insolubles substancialmente en agua (tales como docetaxel y ortataxel) también pueden comprender una o más de las características anteriores.

En algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la albúmina en la composición se obtiene por un método que comprende un proceso de eliminación de priones, el proceso de eliminación de priones comprende poner en contacto una composición inicial de albúmina con un ligando capaz de enlazar una proteina prión. En algunas modalidades, el proceso de eliminación de priones además comprende retirar de la composición de albúmina, el ligando y proteínas enlazadas al mismo.

En algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la albúmina en la composición se obtiene por un método que comprende: a) poner en contacto una composición inicial que comprende albúmina con un ligando capaz de enlazar a una proteina prión para provocar la formación de un complejo entre el ligando y una proteina prión, y b) retirar el complejo de la composición inicial.

Nanoparticulas que comprenden albúmina y fármacos substancialmente insolubles en agua se describen adicionalmente a continuación con más detalle. El método para retirar priones de una composición (tal como una composición inicial de albúmina, una composición de nanoparticulas que comprende albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, o una composición intermedia formada durante el proceso de elaboración de las nanoparticulas) se describen además a continuación con más detalle. La presente invención abarca composiciones producidas por cualquiera de los métodos aquí descritos.

Las composiciones aquí descritas en general tienen reducido nivel de proteínas de priones como se compara con composiciones en donde la albúmina no se ha liberado por un proceso de eliminación de priones. Por ejemplo, en algunas modalidades, la composición tiene menos de aproximadamente cualquiera de 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, o menos de proteínas priones con una composición en donde la albúmina no se ha liberado por un proceso de eliminación de priones. En algunas modalidades, la composición tiene cualquiera de aproximadamente 1, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, o 8 logs menos de proteínas de priones que una composición en donde la albúmina aún no se ha liberado por un proceso de eliminación de priones. En algunas modalidades, la composición tiene cualquiera de aproximadamente 1, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, o 8 logs menos de infectividad que una composición en donde la albúmina no se ha liberado por un proceso de eliminación de priones. En algunas modalidades, la composición de la presente invención es bioequivalente a una composición en donde la albúmina aún no se ha liberado por un proceso de eliminación de priones.

Aunque la presente solicitud se enfoca en albúmina, ' habrá de entenderse que otras proteínas normalmente encontradas en la sangre o el plasma, que incluyen, pero no están limitadas a, inmunoglobulina (incluyendo IgA e IgG) , lipoproteínas, apolipoproteína B, alfa-ácido glicoproteína, beta-2-macroglobulina, tiroglobulina, transferina, fibronectina, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, y semejantes, también se contemplan. Todas las descripciones relevantes respecto a albúmina que aquí se proporcionan son igualmente aplicables a estas otras proteínas en la proporción en la que se utilizan, en la' formación de nanoparticulas .

Métodos para producir composiciones de nanoparticulas libres de priones En otro aspecto, se proporcionan métodos para producir composiciones de nanoparticulas libres de priones. Por ejemplo, en algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, el método comprende someter una mezcla que comprende una solución de albúmina y una fase orgánica que contiene el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, disperso en un solvente orgánico, a una condición de alta cizalla, en donde la albúmina se obtuvo por un método que comprende eliminar una proteina prión de una composición inicial de albúmina. En algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, el método comprende someter una mezcla que comprende una solución de albúmina y una fase orgánica que contiene el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua disperso en un solvente orgánico a una condición de alta cizalla, en donde la albúmina se obtiene por un método que comprende poner en contacto una composición inicial de albúmina con un ligando capaz de enlazar con una proteina prión. En algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, el método comprende someter una mezcla que comprende una solución de albúmina y una fase orgánica que contiene el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, disperso en un solvente orgánico a una condición de alta cizalla, en donde la albúmina se obtiene por un método que comprende: a) poner en contacto una composición inicial de albúmina con un ligando capaz de enlazar con una proteína prión, y b) retirar el ligando y proteína ligada al mismo de la composición inicial.

En algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, el método comprende: a) retirar una proteína prión de una composición inicial de albúmina; b) someter a una mezcla que comprende una solución que comprende la albúmina retirada de priones y una fase orgánica. que comprende el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua disperso en un solvente orgánico, a una condición de alta cizalla. En algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, el método comprende: a) poner en contacto una composición inicial de albúmina con un ligando capaz de enlazar a una proteína prión para provocar formación de un complejo entre el ligando y una proteína prión, y b) retirar el complejo de la composición inicial de albúmina; c) someter a una condición de alta cizalla una mezcla que comprende una solución que comprende la albúmina retirada de priones y una fase orgánica que comprende el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua disperso en un solvente orgánico.

En algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, que comprende: a) poner en contacto una solución de albúmina con un ligando capaz de enlazar una proteína prión, b) retirar el ligando y proteínas enlazadas al mismo de la solución de albúmina, c) someter una mezcla que comprende la solución de albúmina y una fase orgánica que comprende el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua en un solvente orgánico, a una condición de alta cizalla. En algunas modalidades, la mezcla substancialmente no contiene surfactantes .

Los priones pueden retirarse durante la formación de las nanopartículas. Por ejemplo, en algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluole en agua, que comprende: a) poner en contacto una mezcla que comprende una solución de albúmina y una fase orgánica que comprende el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua en un solvente orgánico con un ligando capaz de enlazar a una proteina prión. En algunas modalidades, el método además comprende: b) retirar de la mezcla el ligando y proteínas enlazadas al mismo. En algunas modalidades, el método además comprende c) someter la mezcla a una condición de alta cizalla. En algunas modalidades, el método además comprende retirar el solvente orgánico de la mezcla. En algunas modalidades, la mezcla substancialmente no contiene surfactantes .

En algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, que comprende: a) someter a una condición de alta cizalla, una mezcla que comprende una solución de albúmina y una fase orgánica que comprende un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua disperso en un solvente orgánico; y b) poner en contacto la mezcla con un ligando capaz de enlazar una proteina prión. En algunas modalidades, el método además comprende: c) retirar de la mezcla el ligando y proteínas enlazadas al mismo. En algunas modalidades, el método además comprende retirar el solvente orgánico de la mezcla. En algunas modalidades, la mezcla no contiene substancialmente surfactantes .

En algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, que comprende poner en contacto una mezcla que comprende una fase orgánica que comprende el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, disperso en un solvente orgánico y una solución de albúmina con un ligando capaz de enlazar con una proteina prión, en donde la mezcla se ha sometido a una condición de alta cizalla antes de contacto con el ligando. En algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, que comprende: a) someter a una condición de alta cizalla, una mezcla que comprende una fase orgánica que comprende el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua disperso en un solvente orgánico y una solución de albúmina y b) poner en contacto la mezcla con un ligando capaz de enlazar a una proteina prión. En algunas modalidades, el método además comprende: c) retirar de la mezcla el ligando y proteínas enlazadas al mismo. En algunas modalidades, el método además comprende: d) retirar la fase acuosa de la mezcla. En algunas modalidades, la mezcla está substancialmente libre de surfactantes .

En algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, que comprende: a) someter a una condición de alta cizalla, una mezcla que comprende una fase orgánica que . comprende el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua disperso en un solvente orgánico y una solución de albúmina b) retirar el solvente orgánico, y c) poner en contacto la mezcla con un solvente orgánico retirado con un ligando capaz de enlazar una proteína prión. En algunas modalidades, el método además comprende: d) retirar de la mezcla el ligando y proteínas enlazadas al mismo. En algunas modalidades, el método además comprende: d) retirar la fase acuosa de la mezcla. En algunas modalidades, la mezcla está substancialmente libre de surfactantes .

En algunas modalidades, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, que comprende: a) someter a una condición de alta cizalla, una mezcla que comprende una fase orgánica que comprende el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua disperso en un solvente orgánico y una solución de albúmina b) retirar el solvente orgánico, c) agregar albúmina a la mezcla, y d) poner en contacto la mezcla con un ligando capaz de enlazar con una proteína prión. En algunas modalidades, el método además comprende: e) retirar la mezcla el ligando y proteínas enlazadas al mismo. En algunas, el método además comprende: f) retirar la fase acuosa de la mezcla. En algunas modalidades, la mezcla está substancialmente libre de surfactantes .

Los métodos aquí descritos en general incluyen la etapa de someter a una condición de alta cizalla, una mezcla que comprende una fase orgánica que comprende el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua disperso en un solvente orgánico y una solución de albúmina. En algunas modalidades, la condición de alta cizalla es homogeneización de alta presión, por ejemplo a una presión en el intervalo de aproximadamente 20685 a aproximadamente 206,850 kPa (aproximadamente 3000 a aproximadamente 30,000 psi) , incluyendo por ejemplo aproximadamente 41,370 a aproximadamente 172,375 kPa (aproximadamente 6000 a aproximadamente 25,000 psi), aproximadamente 62,055 a aproximadamente 124,110 kPa (aproximadamente 9000 a aproximadamente 18,000 psi), aproximadamente 68,950 a aproximadamente 172,375 kPa (aproximadamente 10,000 a aproximadamente 25,000 psi), aproximadamente 103,425 a aproximadamente 172,375 kPa (aproximadamente 15,000 a aproximadamente 25,000 psi). En algunas modalidades, el solvente orgánico es una mezcla de solvente orgánico substancialmente inmiscible en agua (tal como cloroformo o cloruro de metileno) y un solvente orgánico soluble en agua (tal como alcohol soluble en agua, incluyendo etanol y t-butanol). En algunas modalidades, la proporción (v/v) del solvente orgánico substancialmente inmiscible en agua y el solvente orgánico soluble en agua (por ejemplo en la proporción de cloroformo/etanol o cloroformo/butanol) es aproximadamente cualquiera de 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, o 9:1, o con una proporción de aproximadamente cualquiera de 3:7, 5:7, 4:6. 6:4, 5:5, 6:5, 8:5, 9:5, 9.5:5, 5:3, 7:3, 6:4, o 9.5:0.5.

En algunas modalidades, .el método además comprende retirar la fase orgánica de la mezcla (tal como eliminación por evaporación bajo presión reducida) . En algunas modalidades, el método además comprende retirar la fase acuosa de la mezcla. En algunas modalidades, el método además comprende filtrado estéril de las nanoparticulas formadas por el método anteriormente descrito.

En algunas modalidades, se proporciona un método para retirar una proteina prión de una composición que se sospecha contiene una proteína prión que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, el método comprende: a) poner en contacto la composición de nanopartículas con un ligando capaz de enlazar a una proteína prión, b) retirar de la composición de nanopartículas el ligando y proteínas enlazadas con él. En algunas modalidades, se proporciona un método para retirar una proteína prión de una composición de albúmina que se sospecha contiene una proteína prión anormal, que comprende: a) poner en contacto la composición que comprende albúmina con un ligando capaz de enlazar con una proteína prión, b) retirar el ligando y proteínas enlazadas al mismo de la composición de albúmina, en donde la composición de albúmina se emplea para producir una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua.

En algunas modalidades, se proporciona un método para retirar una proteína prión de una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, que comprende: a) determinar la presencia o ausencia de una proteína prión en la composición, b) poner en contacto la composición con un ligando capaz de enlazar con una proteína prión, y c) retirar de la composición el ligando y proteína ligados a él.

En algunas modalidades, una o más etapas de los métodos aq.ui descritos se llevan a cabo en un modo por lotes. En algunas modalidades, una o más etapas de los métodos aquí descritos se llevan a cabo en modo continuo.

Retirar prión antes de la formación de nanoparticulas La proteina prión puede retirarse de una composición inicial de albúmina antes que se elabore las composiciones de nanoparticulas que contienen albúmina. En general, el método comprende poner en contacto una composición inicial de albúmina con un ligando capaz de enlazar a una proteina prión, y retirar el ligando y proteina ligada de la composición de albúmina. Este proceso puede repetirse una o más veces, con el mismo o un ligando diferente. Dos o más ligandos también pueden emplearse simultáneamente durante el proceso de eliminación de priones .

En algunas modalidades, la composición inicial de albúmina es una composición derivada de la sangre. Por ejemplo, en algunas modalidades, la composición inicial de albúmina es sangre entera, concentrado de glóbulos rojos, plasma, suero, fracción rica en plaquetas y fracción pobre en plaquetas, concentrado de plaquetas, glóbulos blancos, precipitado de plasma de sangre, precipitado y sobrenadante de fraccionación de plasma de sangre, o intermediario de fraccionación de plasma. En algunas modalidades, la composición inicial de albúmina se obtiene de humanos. En algunas modalidades, la composición inicial de albúmina es de animales tales como bovinos, ovejas y roedores (tales como ratones, hámster y mink) . En algunas modalidades, la composición inicial de albúmina se obtiene de una población de individuos (tal como humanos) al menos algunos de los cuales se han infectado con priones. En algunas modalidades, la composición inicial de albúmina se obtiene de una población de individuos (tales como humanos) al menos algunos de los cuales se sospecha que han estado infectados con priones .

En algunas modalidades, la composición inicial de albúmina es una composición de albúmina preparada a partir de un fluido corporal (tal como sangre) por cualquiera de diversos métodos comunes en la técnica incluyendo intercambio de iones, afinidad, permeación de gel, y/o cromatografía hidrofóbica y/o por precipitación diferencial. En algunas modalidades, la composición inicial es una composición de albúmina purificada de la sangre (tal como sangre humana) . En algunas modalidades, la composición inicial de albúmina es una composición de albúmina purificada de suero (tal como suero humano) . En algunas modalidades, la composición inicial de albúmina tiene infectividad de priones de aproximadamente 100 IU- ic/ml, 90lU-ic/ml, 50lU-ic/ml o 10IU-ic/ml. En algunas modalidades, la concentración de albúmina en la composición inicial de albúmina es aproximadamente 1% (p/v) , incluyendo por ejemplo aproximadamente 2%, 3%, 4%, 5%, 6% , 7 % , 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, o 30%.

Durante el proceso de eliminación de priones, el ligando se pone en contacto con la composición inicial de albúmina y deja que ligue en proteínas priones en la composición inicial de albúmina. Condiciones adecuadas para el enlace puede determinarse y optimizarse para facilitar enlace de ligando a una proteína prión con base en la naturaleza de ligando y su especificidad de enlace a la proteína prión. El enlace en algunas modalidades se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 0 grados C a aproximadamente 39 grados C, incluyendo por ejemplo aproximadamente 20 grados C a aproximadamente 25 grados C. El enlace puede llevarse a cabo a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 10, incluyendo por ejemplo aproximadamente 5 a aproximadamente 9, aproximadamente 6 a aproximadamente 8, aproximadamente 6.8 a aproximadamente 7.5, aproximadamente 6.9 a aproximadamente 7.4, o aproximadamente 7. Opcionalmente, agentes de bloqueo pueden emplearse para reducir enlace no específico al ligando.

Después de la etapa de contacto, el ligando y proteínas enlazadas al mismo se retiran del resto de la composición. El término "retirar" como se emplea aquí, se refiere a la separación del ligando y proteína enlazada a él de la composición que contiene albúmina. La separación puede llevarse a cabo en una variedad de formas, dependiendo de la naturaleza del ligando y el material de soporte (de haber) empleado para facilitar la separación. Por ejemplo, el ligando y proteínas enlazadas al mismo pueden separarse por cromatografía, tal como pero no limitado a, capa delgada, cromatografía en columna y por lotes; separación de membrana y soporte sólido; separación de reactor; separación magnética, inmuno separación; separación coloidal; sedimentación; precipitación; o centrifugación.

En algunas modalidades, el ligando puede conectarse a un material de soporte tal como perlas o membranas, que a su vez se deja que contacten la composición inicial de albúmina. Soporte inmovilizado de ligando se deja que contacte la composición inicial de albúmina bajo una condición suficiente para provocar la formación de un complejo ligando-prión . La fase sólida después se separa de la composición, de esta manera retirando la proteína prión enlazada al ligando de la muestras. Por ejemplo, en una modalidad ejemplar, los ligandos se inmovilizan en una columna, tal como columna de cromatografía, una muestra (tal como la composición inicial de albúmina) se pasa entonces a través de la columna ya sea debido a la fuerza de gravedad o bajo presión, tal como en una columna de cromatografía de líquido con alta presión. Proteínas prión en la muestra enlazarán al ligando inmovilizado en la columna, y la muestra que pasa puede ser recolectada. Este proceso puede repetirse varias veces para lograr el' resultado deseado, utilizando los mismos o diferentes ligandos.

El gasto de flujo de una muestra (tal como la composición inicial de albúmina) en una columna puede ajustarse para llevar al máximo el enlace de ligando y las proteínas prión en una muestra. En algunas modalidades, el enlace se lleva a cabo a un1 gasto de flujo de aproximadamente 0.1 mi por minuto a aproximadamente 5.0 mi por minuto, aproximadamente 0.1 mi por minuto a aproximadamente 2.5 mi por minuto, aproximadamente 0.1 mi por minuto a aproximadamente 0.25 mi por minuto, aproximadamente 0.25 por minuto a aproximadamente 0.5 mi por minuto, aproximadamente 0.5 mi por minuto a aproximadamente 1.0 mi por minuto, aproximadamente 1.0 mi por minuto a aproximadamente 1.5 mi por minuto, aproximadamente 1.5 mi por minuto a aproximadamente 2.0 mi por minuto, aproximadamente 2.0 mi por minuto a aproximadamente 2.5 mi por minuto, aproximadamente 2.5 mi por minuto a aproximadamente 3.0 mi por minuto, aproximadamente 3.0 mi por minuto a aproximadamente 3.5 mi por minuto, aproximadamente 3.5 mi por minuto a aproximadamente 4.0 mi por minuto, aproximadamente 4.0 mi por minuto a aproximadamente- 4.5 mi por minuto, o aproximadamente .5 mi por minuto a aproximadamente 5.0 mi por minuto, incluyendo por ejemplo aproximadamente 0.1 mi por minuto, 0.25 mi por minuto, 0.5 mi por minuto, 1.0 mi por minuto, 1.5 mi por minuto, 1.7 mi por minuto, 1.8 mi por minuto, 1.9 mi por minuto, 2.0 mi por minuto, 2.1 mi por minuto, 2.3 mi por minuto, 2.5 mi por minuto, 2.7 mi por minuto, 3.0 mi por minuto, 3.5 mi por minuto, 4.0 mi por minuto, 4.5 mi por minuto, o 5.0 mi por minuto. En algunas modalidades, el gasto de flujo es al menos aproximadamente 10 mi por minuto, tal como al menos aproximadamente cualquiera de 20 mi por minuto, 30 mi por minuto, 40 mi por minuto, 50 mi por minuto.

El volumen de flujo pasante total o el tiempo del flujo pasante total durante un proceso de enlace también puede ajustarse para llevar al máximo el enlace del ligando y las proteínas prión en una muestra (tal como la composición inicial de albúmina) . En algunas modalidades, el volumen de flujo pasante total es aproximadamente 1 vez a aproximadamente 1000 veces el volumen de columna, incluyendo por ejemplo aproximadamente 2 veces a aproximadamente 10 veces el volumen de columna, aproximadamente 10 veces a aproximadamente 20 veces el volumen de columna, aproximadamente 20 veces a aproximadamente 30 veces el volumen de columna, aproximadamente 30 veces a aproximadamente 40 veces el volumen de columna, aproximadamente 40 veces a aproximadamente .50 veces el volumen de columna, aproximadamente 50 veces a aproximadamente 1000 veces el volumen de columna, aproximadamente 50 veces a aproximadamente 500 veces el volumen de columna, aproximadamente 100 veces a aproximadamente 600 veces el volumen de columna, o aproximadamente 200 veces a aproximadamente 800 veces el volumen de columna. En algunas modalidades, el volumen de flujo pasante total es aproximadamente 100 veces el volumen de columna. En otras modalidades, el volumen de flujo pasante total es aproximadamente 500 veces el volumen de columna. En algunas modalidades, el tiempo de flujo pasante total es aproximadamente 1 hora a aproximadamente 30 horas, incluyendo por ejemplo aproximadamente 2 horas a aproximadamente 25 horas, aproximadamente 3 horas a aproximadamente 20 horas, o aproximadamente 3 horas a aproximadamente 17 horas. En algunas modalidades, el tiempo de flujo pasante total es cualquiera de aproximadamente 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, o 20 horas. En algunas modalidades, el tiempo de flujo pasante total es más de aproximadamente 24 horas. En algunas modalidades, el tiempo de flujo pasante total es menos que aproximadamente 8, incluyendo por ejemplo cualquiera de 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, o 0.5 horas.

En forma alterna, el ligando puede primero ponerse en contacto con la composición inicial de albúmina, bajo una condición suficiente para provocar la formación de un complejo ligando-prión . El complejo ligando-prión después se retira subsecuentemente al utilizar una columna, tal como cromatografía basada en afinidad. Para facilitar la separación, el ligando puede conjugarse a un socio de enlace de manera tal que el complejo ligando/prión puede retirarse por un socio de enlace, por ejemplo al utilizar una columna de afinidad que contiene una molécula que reconoce el socio de enlace.

Además de cromatografía por lotes o en columna, también se prevé una variedad de otras configuraciones, modificaciones y variaciones del uso de los ligandos para enlazar proteínas prión. Estas variaciones y modificaciones incluyen, pero ño están limitadas a: procesos por lotes, procesos continuos, procesos de cromatografía de lecho móvil; procesos de baja, media o alta presión; o procesos de escala pequeña, media o grande. En algunas modalidades, los ligandos están en una membrana, perlas-fibras, impregnados en una malla no tejida, o fibras de revestimiento contenidas dentro de un alojamiento de filtro.

En algunas modalidades, la etapa de eliminación no resulta significativamente en pérdida de rendimiento y/o cambio en la propiedad y/o estabilidad de la albúmina. En algunas modalidades, la recuperación de la albúmina en su estado biológico original se mantiene substancialmente al menos a un nivel que excede de 50%, incluyendo por ejemplo 80%, o 90% o más. En algunas modalidades, la velocidad de recuperación de albúmina del proceso de eliminación de priones es superior a cualquiera de aproximadamente 80%, 90%, 95% o 99%. En algunas modalidades, la concentración de albúmina en la composición inicial de albúmina se ajusta o controla antes de la etapa de eliminación de priones a fin de reducir al mínimo enlace no específico y pérdida de albúmina durante el proceso. Por ejemplo, la concentración de albúmina puede estar en el intervalo de aproximadamente 1% a aproximadamente 50%, aproximadamente 5% a aproximadamente 25%, aproximadamente 5% a aproximadamente. 30%, aproximadamente 5% a aproximadamente 40%, aproximadamente 5% a aproximadamente 10%, aproximadamente 10% a aproximadamente 15%, aproximadamente 15% a aproximadamente 20%, aproximadamente 20% a aproximadamente 25%, aproximadamente 25% a aproximadamente 30% etc., incluyendo por ejemplo aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, o 30% de albúmina.

La composición resultante de albúmina puede analizarse para determinar la velocidad de eliminación o depuración del proceso de separación de priones. El ligando con proteínas priones enlazadas también puede analizarse (directamente o después de elución) para determinar la velocidad de eliminación o depuración.

La eliminación de proteínas priones puede evaluarse con base en reducción de proteina prión o reducción de infectividad . En algunas modalidades, al menos aproximadamente 50%, incluyendo por ejemplo al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, o 100% de las proteínas prion.es se retiran de la composición inicial de albúmina. En algunas modalidades, la infectividad de la composición de albúmina post-eliminación es al menos aproximadamente ???, 20x, 30x, 40x, 50x, 80x, lOOx, 200x, 500x, lOOOx, 104x, 105x, 106x, 107x, 108x, 109x menos, que la de la composición inicial de albúmina.

En algunas modalidades, la infectividad en serie se emplea para determinar la velocidad de eliminación del proceso de separación de priones. Diluciones en serie de muestras se realizan y las diluciones se examinan por actividad infecciosa, por ejemplo en un animal de ensayo. La dilución en la cual la mitad de los animales se infectan es el título infeccioso. Por ejemplo, si se requiere una dilución de 5 veces, la muestra puede definirse que tiene 5 logs de infectividad. Al comparar el log de infectividad de la composición inicial de albúmina y la de la composición de albúmina posterior de eliminación, se puede determinar la velocidad de eliminación del proceso de separación de priones. En algunas modalidades, el método de eliminación de priones resulta en una reducción de cualquiera de 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, or 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 logs de infectividad.

En algunas modalidades, la velocidad de eliminación del proceso de separación de priones se determina con base en experimentos de modificación con materiales infecciosos al seguir las etapas descritas aquí para el método de eliminación de priones. Agentes de modificación convenientes incluyen, pero no están limitados a, homogeneizado de cerebro, microsomas, dominios tipo caveolas, PrPsc purificado y fibrilas prión. En algunas modalidades, el agente modificador es detergente solubilizado (tal como sarcosilo solubilizado) . En algunas modalidades, la proporción de modificación en la composición está en el intervalo de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 0.25%, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 0.1%, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 0.005%, aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.075%, aproximadamente 0.075% a aproximadamente 0.01%, aproximadamente 0.01% a aproximadamente 0.1%, aproximadamente 0.1% a aproximadamente 0.5%, aproximadamente 0.5% a aproximadamente 0.75%, aproximadamente 0.75% a aproximadamente 1%, aproximadamente 1% a aproximadamente 2%, aproximadamente 2% a aproximadamente 3%, o aproximadamente 3% a aproximadamente 5%, incluyendo por ejemplo aproximadamente 0.001%, 0.005%, 0.075%, 0.01%, 0.1%, 0.5 f 0.75% l¾ 2%/ 3%, o 5%.

En algunas modalidades, los factores de reducción (RF = reduction factors) se emplean para determinar la velocidad de eliminación del proceso de separación de priones. El RF puede calcularse utilizando la fórmula: RF = <VixTiV(Vi Ta) o LogüPF] =[LogW(Vi) + LogioCTi)] - [Logi¾( ¾) + Log.sP¾]. en donde Vi y Ti son el volumen y titulo de la composición inicial de albúmina, respectivamente y V? y T2 son el volumen y titulo de la composición post-eliminación de albúmina. Factores de reducción pueden redondearse a 1 sitio decimal después del cálculo final. En algunas modalidades, un factor de reducción de al menos aproximadamente 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, o 8.0 logio de infectividad de las proteínas priones se retira de la composición inicial de albúmina. Por ejemplo, la proteína príón puede retirarse por un factor de reducción mayor a o igual a 2.5 logio en una fracción solubilizada con sarcosilo a 0.5% modificada en una composición de albúmina al 20%. Como otro ejemplo, la proteína prión también puede retirarse por un factor de reducción mayor que o igual a 2.0 logio en una fracción solubilizada de sarcosilo al 0.5% modificada en una composición de albúmina al 25%.

La eliminación de priones puede evaluarse por análisis de transferencia Western estándar. Por ejemplo, los ligandos post-enlace pueden primero tratarse con proteinasa K, que digiere todos los PrPc pero no PrPsc. La. digestión después se ejecuta en gel SDS y transfiere a una hoja de nitrocelulosa o membrana PVDF. Las bandas de PrPsc separadas después se visualizan utilizando 3F4 o 6H4. 3F4 reacciona con residuos aminoácidos 109-112 PrP de humanos, hámsters y felinos. En una modalidad ejemplar, se lleva a cabo incubación a una concentración de 0.6 ug/ml por un mínimo de una hora, después de lo cual el exceso de anticuerpo es lavado por arrastre y las membranas se incuban con un conjugado de peroxidasa de rábano picante anti-ratón conejo (1:1000 dilución) por un mínimo de una hora. Después de extenso lavado con TTBS, las membranas ' se revelaron utilizando quimioluminiscencia mejorado. En algunas modalidades, la eliminación de proteínas priones se evalúa de acuerdo con la Guía para Investigación de Procesos de Fabricación para Productos Medicinales Derivados de Plasma (Manufacturing Processes for Plasma-Derived Medicinal Products) Respecto al Riesgo de vCJD (CPMP5136/03 ) .

Ligandos capaces de enlazar a una proteína prión y material de soporte El término "Ligando" aquí empleado se refiere a una molécula a la cual una proteína prión o péptido se 'enlaza.

Un "ligando capaz de enlazar a una proteína prión" se refiere a un ligando que enlaza específicamente a una proteína prión bajo condiciones convenientes. En algunas modalidades, el ligando enlaza específicamente con una proteína prión humana. En algunas modalidades, el ligando específicamente enlaza con una proteína prión de hámster. En algunas modalidades, el ligando enlaza específicamente a una proteína de ratón. En algunas modalidades, el ligando enlaza con proteínas priones de múltiples especies. Por ejemplo, en algunas modalidades, el ligando enlaza con una proteína prión de humano, proteína prión de hámster, y proteína prión de ratón.

En algunas modalidades, el ligando enlaza a la proteína prión (tal como proteína prión de humano, proteína prión de hámster y/o proteína prión de ratón) con una alta afinidad de enlace. Por ejemplo, en algunas modalidades, el ligando tiene una Kasociación de enlace mayor a aproximadamente cualquiera de 107, 108, 109, 1010, o 1011.

Una cantidad de ligandos se han identificado que enlazan con proteína prión y de esta manera pueden emplearse en los métodos de la presente invención. Ver, por ejemplo, WO04/090102, WO04/050851, WO06/010915, y WO06/044459. Estos incluyen, por ejemplo, péptidos, compuestos químicos, y anticuerpos que reconocen específicamente una proteína prión. El ligando puede emplearse para retirar todas las formas de proteínas priones de una composición o puede seleccionarse selectivamente para detectar o retirar una forma sencilla de una proteina prión.

En algunas modalidades, el ligando para retirar priones es un péptido, tales como péptidos descritos en la solicitud publicada en TCP (PCT) No. WO04/05051. Por ejemplo, en algunas modalidades, el ligando es un péptido que tiene un aminoácido de cualquiera de SEQ ID NOs : 1-232 como se muestra en la Tabla 1. En algunas modalidades, el ligando es un tri.péptido, tales como péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 48, 102, 105, 108, 109, 110, 111, 143, 148, 193, 194, 195, 202, 203, 204, o 210. En algunas modalidades, el ligando es un péptido con seis aminoácidos, tales como 6-meros que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 152, 153, 180, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 188, 189, o 190. En algunas modalidades, el ligando tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150 ó 151.

Tabla 1 - Secuencias de aminoácidos que enlazan a secuencias de priones KIHKFLA (SEQ FLLIDTA (SEQ YEDQWQA DNPIDA (SEQ ID NO: 1) ID NO: 41) (SEQ ID NO: ID NO: 121) 81) GTHDFQA (SEQ GFLFKFA (SEQ E ADDNA FNEHEA (SEQ ID NO: 2) ID NO: 42) (SEQ ID NO: ID NO: 122) 82) KFGSTHA (SEQ PWTIYIA YEIDYGA WGADGA (SEQ ID NO: 3) (SEQ ID NO: (SEQ ID ID NO: 123) 43) NO: 83) FVNEIEA (SEQ WH (SEQ ID EFGYFDA VIYSHA (SEQ ID NO: 4) NO: 44) (SEQ ID ID NO: 124) NO: 84) GLHFKSA (SEQ WW (SEQ ID WGDEQDA HILEEA (SEQ ID NO: 5) NO: 45) (SEQ ID ID NO: 125) NO: 85) GRVLHHA (SEQ LW (SEQ ID HEEDWAA PHENFA' (SEQ ID NO: 6) NO: 46) (SEQ ID ID NO: 126) NO: 86) QKNSEWA (SEQ WNA (SEQ ID FEDFELA EDNGGA (SEQ ID NO: 7) NO: 47) (SEQ ID ID NO: 127).

NO: 87) HAYFTHA (SEQ EFW (SEQ ID TWGIDEA DSEGPA (SEQ ID NO: 8) NO: 48) (SEQ ID ID NO: 128) NO: 88) WPKGAVA (SEQ LPW (SEQ ID WDPTDYA FQEFTA (SEQ ID NO: 9) NO: .49) (SEQ ID ID NO: 129) NO: 89) RPWKKAA (SEQ YEY (SEQ ID NDKIHTA EGDEIA (SEQ ID NO: 10) NO: 50) (SEQ ID ID NO: 130) NO: 90) PKHIWPA (SEQ WPA (SEQ ID FEDFFSA (SEQ IYAETA ID NO: 11) NO: 51) ID NO: 91) (SEQ ID NO: 131) HKLWGVA (SEQ FNQ (SEQ ID YEWAEQA (SEQ RVRETA ID NO: 12) NO: 52) ID NO: 92)' (SEQ ID NO: 132) GGYKPYA (SEQ YHE (SEQ ID THVYFLA (SEQ EEPQWA ID NO: 13) NO: 53) ID NO: 93) (SEQ ID NO: 133) ENVSQNA (SEQ LFA (SEQ ID (S/T/W)XDFSD EGEEFA ID NO: 14) NO: 54) A (SEQ ID (SEQ ID NO: 94) NO: 134) HTYYNGA (SEQ NHY (SEQ ID YRTPNEA (SEQ (T/L) FNIH ID NO: 15) NO.: 55) ID NO: 95) A (SEQ ID NO: 135) KKKSDHA (SEQ TLG (SEQ ID (GIL) RSETA YDW (SEQ ID NO: 16) NO: 56) (SEQ ID NO: ID NO: 96) 136) HHLKGTA (SEQ WVD (SEQ ID IHN (SEQ ID NYT (SEQ ID NO: 17) NO: 57) NO: 97) ID NO: 137) KKHGVWA (SEQ YWDQA (SEQ WEY (SEQ ID SYT (SEQ ID NO: 18) ID NO: 5£i) NO: 98) ID NO: 138) DGTQAHA (SEQ YVHEA (SEQ DYW (SEQ ID WAD (SEQ ID ID NO: 19) ID NO: 59) NO: 99) NO: 139) APHRNNA (SEQ FDEA (SEQ WDW (SEQ ID QWG (SEQ ID ID NO: 20) ID NO: 60) NO: 100) NO: 140) HHGHNIA (SEQ LQWYDA (SEQ QD (SEQ ID · WGD (SEQ ID ID NO: 21) ID NO: 61) NO: 101) NO: 141) HTWHGQA (SEQ YTHSEA (SEQ YFE (SEQ ID EYF (SEQ ID ID NO: 22) ID NO: 62) NO: 102) NO: 142) HVFVTWA (SEQ WIDYEA (SEQ NYE (SEQ ID WEH (SEQ ID ID NO: 23) ID NO: 63) NO: 103) NO: 143) THHFYIA (SEQ VWIDAA (SEQ SYA (SEQ ID LYD (SEQ ID ID NO: 24) ID NO: 64) NO: 104) NO: 144) KLGWG (A/G) A WDEAEEA WDL (SEQ ID DYY (SEQ ID (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: NO: 105) NO: 145) 25) 65) GSKKKEA (SEQ YDSYSSA WLE (SEQ ID FYE (SEQ ID ID NO: 26) (SEQ ID NO: NO: 106) NO: 146) 66) PLLVVWA (SEQ NDFIDFA VQR (SEQ ID EYY (SEQ ID ID NO: 27) (SEQ ID NO: NO: 107) NO: 147) 67) WLLVGGA (SEQ YEPWGSA YID (SEQ ID YDY (SEQ ID ID NO: 28) (SEQ ID NO: NO: 108) NO: 148) 68) (W/G) QVLVYA EYGDWWA RWD (SEQ ID WDH (SEQ ID (SEQ ID NO: (SEQ ID NO; NO: 109) NO: 149) 29) 69) RRHQRQA (SEQ WDYDQEA DVR (SEQ ID RES (na) NVA c D ID NO: -30) (SEQ ID NO: NO: 110) (SEQ ID NO: 70) 150) LPWTFGA (SEQ DWGDPFA WSD (SEQ ID ES (na) PRQA ID NO: 31) (SEQ ID NO: NO: 111) (SEQ ID NO: 71) 151) 0 IFIIITA (SEQ DWPEVWA HWD (SEQ ID VARENIA ID NO: 32) (SEQ ID NO: NO: 112) (SEQ ID NO: 72) 152) P (X) IEPHA FHDFSEA WQD (SEQ ID RWEREDA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: NO: 113) (SEQ ID NO: 5 33) 73) 153) EWGIIWA (SEQ DTFWDYA WDD (SEQ ID EWWETV(SEQ ID NO: 34) (SEQ ID NO: NO: 114) ID NO: 154) 74) GWYIYFA (SEQ WNDLDNA WED (SEQ ID SVYQLDA 0 ID NO: 35) (SEQ ID NO: NO: 115) (SEQ ID NO: 75) 155) TLILFHA (SEQ ASALVYA ITN (SEQ ID (na) HEFYGA ID NO.: 36) (SEQ ID NO: NO: 116) (SEQ ID NO: 76) 156) FLLSNHA (SEQ LINAGGA YED (SEQ ID HE (na) (na) L ID NO: 37) (SEQ ID NO: NO: 117 ) VA (SEQ ID 77) NO: 157) QIRFFA (SEQ WESYVTA VADEEA (SEQ A(na) PV(na ID NO: 38) (SEQ ID NO: ID NO: 118) )A (SEQ ID 78) NO: 158) VLLVFEA (SEQ SDEGYA YYVDAA (SEQ YFDY LA ID NO: 39) (SEQ ID NO: ID NO: 119) (SEQ ID NO: 79) 159) GWVLEIA (SEQ YRWTGPA QDFNLA (SEQ FE (na) HRQA ID NO: 40) (SEQ ID NO: ID NO: 120) (SEQ ID NO: 80) 160) WRHEPAA (SEQ WTD (SEQ ID ID NO: 161) NO: 204) SS (na) KKDA FPK (SEQ ID (SEQ ID NO: NO: 205) 162) R(na) DKEAA HWK (SEQ ID (SEQ ID NO: NO.: 206) 163) Cont . (na)HEIFPA (SEQ ID NO: . WEE (SEQ ID NO: 207) 164) aK YHHRA (SEQ ID NO: 165) LLR (SEQ ID NO: 208) HWWPHNA (SEQ ID NO: 166) SYF (SEQ ID NO: 209) HWQVFYA (SEQ ID NO: 167) EYY (SEQ ID NO: 210) FHE (na) EIA(SEQ ID NO: DRDLTFA (SEQ ID NO: 211) 168) HADF (na ) QA (SEQ ID NO: HNWWIIA (SEQ ID NO: 212) 169) ALHFETA (SEQ ID NO: 170) EVKIGNA (SEQ ID NO: 213) DDPTGFA (SEQ ID NO: 171) SIV (SEQ ID NO:. 214) VAPGLGA (SEQ ID NO: 172) AYP (SEQ ID NO: 215) IFRLIEA (SEQ ID NO: 173) EVADEEA (SEQ ID NO: 216) GLERPEA (SEQ ID NO: 174) EYYVDAA (SEQ ID NO: 217) IVVRLWA (SEQ ID NO: 175) YDNPIDA (SEQ ID NO: 218) WHNPHYA (SEQ ID NO: 176) YFNEHEA (SEQ ID NO: 219) LIYKSDA (SEQ ID NO: 177) EWGADGA (SEQ ID NO: 220) EKPIFNA (SEQ ID NO: 178) DVIYSHA (SEQ ID NO: 221) HWSEPAA (SEQ ID NO: 179) WHILEEA (SEQ ID NO: 222) GHNWKEA (SEQ ID NO: 180) NPHENFA (SEQ ID NO: 223) Y HHDDA (SEQ ID NO: 181) HEDNGGA (SEQ ID NO: 224) GYPKENA (SEQ ID NO: 182) SDSEGPA (SEQ ID NO: 225) PVYWLYA (SEQ ID NO: 183) EFQEFTA (SEQ ID NO: 226) FGEHTPA ( SEQ ID NO: 184) QEGDEJA (SEQ ID NO: 227) FQGTREA (SEQ ID. NO: 185) DIYAETA (SEQ ID NO: 228) TGTNRYA (SEQ ID NO: 186) DRVRETA (SEQ ID NO: 229) KWATRYA ( SEQ ID NO: 187) FEEPQWA (SEQ ID NO: 230) NSTKFDA (SEQ ID NO: 188) FEGEEFA (SEQ ID NO: 231) LIYKEEA (SEQ ID NO: 189) (T/L) FNIHA (SEQ ID NO: 232) EHATYRA (SEQ ID NO: 190) HND (SEQ ID NO: 191) HER (SEQ ID NO: 192) HGD (SEQ ID NO: 193) HSD (SEQ ID NO: 194) HFD (SEQ ID NO: 195) WND (SEQ ID NO: 196) YEH (SEQ ID NO: 197) HWD (SEQ ID NO: 198) YHD (SEQ ID NO: 199) YDW (SEQ ID NO: 200) WDY (SEQ ID NO: 201) HYD (SEQ ID NO: 202) HWD (SEQ ID NO: 203) En algunas modalidades, el ligando es un péptido de la secuencia de aminoácidos de DVR, SYA, A N31, D4 o YVHEA. En algunas modalidades, el ligando es un péptido que enlaza a una proteina prión a una afinidad que es similar a o superior que la de DVR, SYA, A N31, D4 . o YVHEA. En algunas modalidades, el ligando es DVR. En otras modalidades, el ligando es AMN31. En algunas modalidades, los ligandos péptido se proporcionan en la forma de resinas (tales como ligados a resinas).

En algunas modalidades, el ligando es un anticuerpo que reconoce una proteina prión. Anticuerpos que reconocen proteínas priones se conocen en la técnica. Éstos incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos monoclonales 3F4, 6H4, o 16A1 8. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo específico de glicoforma, tal como ICSM-4 y ICSM-10. Anticuerpos convenientes ¿útiles para los métodos aquí descritos incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, y fragmentos Fv.

En algunas modalidades, el ligando enlaza a una secuencia específica de una proteína prión. Por ejemplo, en algunas modalidades, el ligando (tal como un ligando péptido o un ligando de anticuerpo) enlaza a cualquiera de las secuencias de proteína prión SEQ ID NOs : 133-146 citadas en la Tabla 2.

Tabla 2 — Secuencias de aminoácido-prión RYPxQ, x es G, P o N (SEQ ID NO: 233) xxYYux, x es G, P o N, u es R o Q (SEQ ID NO: 234) RYPGQ (SEQ ID NO: 235) DRYYRD (SEQ ID NO: 236) QAYYQR (SEQ ID NO: 237) QVYYRP (SEQ ID NO: 238) PHGGGWGQ (SEQ ID NO: 239) PHGGSWGQ (SEQ ID NO: 240) PHGGGWSQ (SEQ ID NO: 241) PHGGGGWSQ (SEQ ID NO : 242) PHGGGSN GQ (SEQ ID NO: 243) PHNPGY (SEQ ID NO: 244) PHNPSY (SEQ ID NO: 245) PHNPGY (SEQ ID NO: 246) En algunas modalidades, el ligando es un compuesto químico. Compuestos capaces de enlazar a una proteína prión puede encontrarse, por ejemplo en la publicación de la solicitud de PCT No. WO06/010915, que se incorpora aquí en su totalidad. En algunas modalidades, el ligando es. una triazina substituida. En algunas modalidades, el ligando es un compuesto que tiene la fórmula (I) : en donde R1 y R2 son iguales o diferentes y cada uno son alquilo opcionalmente substituido, cicloalquilo opcionalmente substituido, arilo opcionalmente substituido o grupos heteroarilo opcionalmente substituidos; R3 es hidrógeno o un sustituyente de grupo arilo o R3 es un soporte sólido conectado opcionalmente mediante un espaciador; Z representa un átomo de oxigeno, un átomo de azufre o NR4; Y representa un átomo de oxigeno, un átomo de azufre o NR5; en donde R4 y R5, que pueden ser iguales o diferentes, representan hidrógeno, alquilo opcionalmente substituido que contiene 1 a 6 átomos de carbono, fenilo opcionalmente substituido, bencilo opcionalmente substituido o ß-feniletilo opcionalmente substituido; y uno de X1 y X2 representa un átomo de nitrógeno y el otro de X1 y X2 representan un átomo de nitrógeno o CR6, en donde R6 representa un hidrógeno o un sustituyente de grupo arilo; para el enlace de afinidad de una proteina prión.

En algunas modalidades, el ligando es un compuesto de la fórmula ( II ) , R3 en donde R1 representa un grupo -(Cí^Jm-Q1, en donde m es desde O a 7, y Q1 representa -CRUR12R13 o -NRUR12, en donde Ru, R12 y R13 representan independientemente hidrógeno, alquilo, cicloalquilo o heterocicloalquilo, o dos de R11, R12 y R13, junto con el átomo de carbono o nitrógeno al cual se conectan, forman un grupo cicloalquilo opcionalmente substituido o heterocicloalquilo opcionalmente substituido; R2 representa un grupo -(CH2)n-Q2, en donde n es de 0 a 7, y Q2 representa ¦ -CR1R22R23 o -NR21R22, en donde R21, R22 y R23 representan independientemente hidrógeno, alquilo, cicloalquilo o heterocicloalquilo, o dos de R11, R12 y R13, junto con el átomo de carbono o nitrógeno al cual se conectan, forman un grupo cicloalquilo opcionalmente substituido o heterocicloalquilo opcionalmente substituido, y R3 es hidrógeno o un sustituyente de grupo arilo o R3 es un soporte sólido conectado opcionalmente por un espaciador; Z representa un átomo de oxigeno, un átomo de azufre o NR4; Y representa un átomo de oxigeno, un átomo de azufre o NR5; en donde R4 y R5, que pueden ser iguales o diferentes, representan hidrógeno, alquilo opcionalmente substituido que contiene 1 a 6 átomos de carbono, fenilo opcionalmente substituido, bencilo opcionalmente substituido o ß-feniletilo opcionalmente substituido; y uno de X1 y X2 representan un átomo de nitrógeno y el otro de X1 y X2 representa un átomo de nitrógeno o CR6, en donde R6 representa hidrógeno o un sustituyente de grupo arilo; para el enlace de afinidad de una proteina prión.

En algunas modalidades, a) X1 y X2 son ambos nitrógeno; b) ambos Z e Y representan NR4, en particular en donde R4 es hidrógeno; c) m es desde 0 a 4, más preferiblemente de 0 a 3, y más preferiblemente de 1 a 3; d) Q1 es -NR1:LR12; y R11 y R12 de preferencia forman junto con el átomo de nitrógeno al cual se conectan, un grupo heterocicloalquilo; e) n es de 0 a 4, más preferiblemente de 0 a 2, y más preferiblemente es 0; y f) R21 y R22 forman, junto con el átomo de carbono o átomo de nitrógeno al cual se conectan, un grupo cicloalquilo o heterocicloalquilo.

En algunas modalidades, Q2 representa un grupo cicloalquilo o heterocicloalquilo hidrofóbico, en especial con sistemas de anillo que comprenden al menos seis átomos.

En algunas modalidades, Q1 representa un grupo heterocicloalquilo, en especial piperidilo, en particular 1-piperidilo o piperazinilo, particularmente 1-piperazinilo .

En algunas modalidades, el ligando es un compuesto de la fórmula (III), en donde R1 representa una cadena alquileno -(CH2)P-CH3, en donde p es de 0 a 6, substituido por uno o más grupos carboxilo y opcionalmente substituido por uno o más sustituyentes del grupo alquilo adicionales; R2 representa un grupo -(CH2)q-Ar, en donde q es de 0 a 7, y Ar representa un grupo arilo opcionalmente substituido; y R3 es hidrógeno o un sustituyente de grupo arilo o R3 es un soporte sólido conectado opcionalmente por un espaciador; Z representa un átomo de oxigeno, un átomo de azufre o NR4; Y representa un átomo de oxigeno, un átomo de azufre o NR5; en donde R4 y R5, que pueden ser iguales o diferentes, representan hidrógeno, alquilo opcionalmente substituido que contiene 1 a 6 átomos de .carbono, fenilo opcionalmente substituido, bencilo opcionalmente substituido o ß-feniletilo opcionalmente substituido; y uno de X1 y X2 representa un átomo de nitrógeno y el otro de X1 y X2 representa un átomo de nitrógeno o CR6, en donde R6 representa hidrógeno o un sustituyente de grupo arilo; para el enlace de afinidad de una proteina prión.

En algunas modalidades, a) X1 y X2 son ambos nitrógeno; b) ambos Z e Y representan NR4, en particular en donde R4 es hidrógeno; c) p es de 0 a 4, más preferiblemente de 0 a 3; d) R1 está substituido, con uno o dos grupos carboxilo, al menos uno de esos grupos carboxilo es transportado por el átomo de carbono terminal' de la cadena alquileno -(CH2)p-CH3; e) q es de 0 a 4, más preferible de 0 a 3, y más preferible es 1 o 2; y f) Ar es un grupo aromático heterociclico o carbocíclico monocíclico, opcionalmente substituido por. uno o más sustituyentes , seleccionados del grupo que consiste de fenilo, fenoxi, tolilo, clorobencilo, metoxibencilo, fluorobencilo, piridilo e indoilo.

En algunas modalidades, R1 es carboximetilo, 4-carboxibutilo o 1- ( 1 , 3-dicarboxi ) propilo .

En algunas modalidades, Ar es fenilo, 4-hidroxifenilo o piridilo, en particular 2-piridilo.

En algunas modalidades, R3 es hidrógeno o un sustituyente de grupo arilo o R3 es un soporte sólido conectado opcionalmente por un espaciador; X1 y X2 son ambos N; Y y Z ambos representan NH; m. representa 2; Q1 representa piperidilo o piperazinilo; n representa 0 o 2; y Q2 representa l-piperidilo o adamantilo.

En algunas modalidades, R3 es hidrógeno o un sustituyente de grupo arilo o R3 es un soporte sólido conectado opcionalmente por un espaciador; X1 y X2 son ambos N; Y y Z ambos representan NH; R1 representa carboximetilo, 4-carboxibutilo y 1- (1, 3-dicarboxi) propilo; q representa 2; y Ar representa fenilo, 2-piridilo o 4-hidroxifenilo .

En algunas modalidades, el ligando es un compuesto o componente inorgánico, tal como pero .no limitado a, aluminio (tal como óxido de aluminio) o sílice (tal como sílice fusionada) . En algunas modalidades, el compuesto inorgánico es A1203 o Si02.

En algunas modalidades, el ligando comprende uno o más grupos funcionales. El término "grupo funcional" se emplea aquí para denotar grupos químicos, subgrupos o subestructuras que imparten comportamientos químicos, físicos o físico-químicos característicos de una molécula o un material. Grupos funcionales aquí descritos incluyen, pero no están limitados a, hidrofílicos, tales como de carga positiva, negativa o sin carga o neutros o hidrofóbicos . Grupos funcionales anfifílicos o multifuncionales también se prevén y caen dentro del alcance de la presente invención. Grupos funcionales incluyen grupos funcionales orgánicos e inorgánicos. Grupos funcionales preferidos contienen grupos amina, fenilo o sulfito. Un grupo amina preferido es un ión amonio primario, secundario, terciario o cuaternario tal como dimetilaminoetilo (DMAE) o trimetilaminoetilo (TMAE) .

Otros grupos funcionales ejemplares incluyen, pero no están limitados a: -CH2- CHOH-CH2NH2; -C6H5; - (CH2) 3-CH3; -CH2-CH2-NH (C2H5) 2; -S02-CH2- CF3 ' -CH2-CH2-H (CH3) 2; -CH2-CH2-(CH3)3; -(S03)2-. Grupos funcionales útiles adicionalmente incluyen grupos sulfonilo y grupos tresilo. Habrá de entenderse que grupos funcionales pueden estar inherentemente presentes en un ligando, o pueden agregarse al ligando por modificación química.

En algunas modalidades, el ligando contiene un grupo amino. Estos incluyen, por ejemplo resinas amino, tales como Toyopearl™ Amino-650M, Toyopearl™ Amino-AMN31 , TSK- GEL™- Amino 750C, o sus equivalentes funcionales. En algunas modalidades, el ligando comprende un grupo fenilo. Estos incluyen por ejemplo, TSK-GEL™ Phenyl-5P o su equivalente funcional..

En algunas modalidades, el ligando es un material polimérico, tales como resinas cromatográficas (por ejemplo amino resinas) , que ligan con selectividad y especificidad a proteínas prión. Un ejemplo de una resina cromatográfica son las Resinas de Reducción de Priones (PRDT) (ProMetic Biosciences, Ltd, 211 Cambridge Science Park, ilton Road, ¦ Cambridge, CB4 OWA, UK) . En algunas modalidades, el material polimérico contiene uno o más grupos funcionales, tales como los grupos funcionales descritos anteriormente. En algunas modalidades, el ligando es un material polimérico que tiene Una estructura principal metacrilato, tal como pero no limitada a, una resina comercialmente disponible TSK, TOYOPEARL o FACTOGEL (Tosoh Bioscience, Montgomery ville, PA) .

Otros ligandos que pueden emplearse en métodos de la presente invención incluyen, por ejemplo, ligandos que interactúan con placa amiloide, por ejemplo, Congo :E;Led (Ingrosso, L. , et al., Congo Red: Pr'olongs the Incubation Period in Scrapie-infected Hámsters. Virology 69:506-508 (1995)); 1,4-yodo, 4-deoxi doxorubicina (Tagliavini, F. , et al., Effectiveness of Anthracycline Against Experimental Prion Diseases in Syrian Hámsters. Science 276:1119-1122 (1997)); anfotericina 13, porfirinas y ftalocianinas (Priola, S.A., et al., Porphyrin and Phthalocyanine Antiscrapie Compounds, Science 287:1503-1506 (2000)); metales (Stacker et al., Biochemistry, 37, 7185- 7193 (1998)); péptidos que interactúan con PrP para formar complejos (ver patente de los E.U.A. No. 5,750,361 otorgada a Prusiner et al. y Solo, C. et al., Reversión of Prion Protein Conformational Changes in Synthetic p-sheet Breaker Peptides, Lances, 355:192-197 (2000)); heparina y otros polianiones polisulfatados (Caughey, B., et al., Binding of the Protease- sensitive Form of Protein prion PrP to Sulphated Glycosaminoglycan and Congo Red, J. Virology 68:2135-2141(1994)); anticuerpos (Kascsak, RJ., et al., Immunodiagnosis of Prion Disease, Immunological Invest. 26:259-268 (1997)); y otras proteínas, por ejemplo plasminógeno (Fischer, M. B. et al., Binding of Disease-associated Protein prion to: Plasminogen . , Nature 408:479-483 (2000) ) .

Los ligandos pueden conectarse a cualesquiera materiales de soporte. "Material de soporte" empleado aquí se refiere a cualquier compuesto o material que pueda proporcionar el medio físico o químico para separar el ligando y proteínas enlazadas al mismo del resto de la composición. El material de soporte puede ser partículas o no partículas, soluble o insoluble, poroso o no poroso.

Ejemplos de materiales de soporte incluyen, pero no están limitados a, polímeros de origen natural, por ejemplo un polisacárido tal como agarosa, alginato, carragenina, quitina, celulosa, dextrano o almidón; polímeros sintéticos-tales ' como poliacrilamida, poliestireno, poliacroleína, polivinil alcohol, polimetilacrilato, perfluorocarborio; compuestos inorgánicos tales como sílice, vidrio, diatomita ( kieselguhr ) , alúmina, óxido de hierro u otros óxidos de metal, ó copolímeros que consisten de cualquier combinación de los dos o más polímeros de origen natural, ' polímeros sintéticos o compuestos inorgánicos. También se contemplan materiales de soporte solubles que comprenden polímeros tales como dextrano, polietilen glicol, polivinil alcohol o almidón hidrolizado que proporcionan conjugados de matriz ligando -afinidad para utilizar en partición o separación líquida.

En algunas modalidades, el material de soporte es un soporte sólido tal como una columna, una perla, una membrana, un cartucho, un filtro, una piedra reactiva, una placa de microtitulación, un tubo de ensayo, polvo sólido, un módulo moldeado por extrusión o vaciado, una malla, un compuesto de partículas magnéticas, o cualesquiera otros materiales sólidos. Los materiales sólidos pueden ser revestidos con una sustancia tal como polietileno, polipropileno, poli ( 4-metilbuteno) , poliestireno, poliacrilato, polietilen tereftalato, rayón, nylon, poli(vinil butirato) , difluoruro de polivinilideno (PVDF = polyvinylidene difluoride) , siliconas, poliformaldehido, celulosa, acetato de celulosa, nitrocelulosa, y semejantes. En forma alterna, se emplean substancias que forman geles, tales como proteínas (por ejemplo gelatinas), lipopolisacáridos , silicatos, agarosa y poliacrilamidas . Polímeros tales como dextranos, polialquilen glicoles o surfactantes , tales como fosfolípidos , sales de alquil amonio de cadena larga (12-24 átomos de carbono) y semejantes también pueden ser empleadas. Los ligandos se conectan a o dispersan a través de los materiales de soporte.

En algunas modalidades, el material de soporte es agarosa activada, sílice, celulosa, vidrio, metacrilato, hidroxietilmetacrilato, poloacrilamida , estirendivinilbenzeno, Hyper D o perfluorocarburos . En algunas modalidades, el material de soporte es un material de metacrilato, del tipo vendido bajo la marca Toyopearl (disponible de Tosoh Bioscience LLC, 156 Keystone Drive, Montgomeryville, PA I 18936, USA) . WO 97/10887 describe métodos para conectar ligandos de afinidad a matrices de soporte, por ejemplo el uso de métodos de activación, y métodos para conectar el ligando de afinidad a una matriz mediante un espaciador, por ejemplo por reacciones de condensación, para formar conjugados de matriz-ligando de afinidad.

En algunas modalidades, los ligandos y/o materiales de soporte son reutilizables . En algunas modalidades, los ligandos y/o materiales de soporte son para un solo uso.

. La capacidad de enlace de priones de un ligando puede evaluarse al determinar el titulo infeccioso en un ligando. Por ejemplo, se prepara una serie de diluciones de un material de referencia y se prueba en un ensayo de transferencia Western estándar. Los títulos observados del material de referencia se comparan con los títulos correspondientes observados en un bioensayo. Los títulos de transferencia Western pueden entonces convertirse en títulos infecciosos utilizando la fórmula: Títulosbi0ensayo = Títulos [Transferencia wester] + (intercepción de un análisis de regresión lineal) / (pendiente de un análisis de regresión lineal). Una vez que se calcula el título infeccioso por mi, la proteína prión total ligada a la columna puede ser determinada. La capacidad del enlace de un ligando se determina utilizando la cantidad de una proteína prión observada directamente enlazada al ligando. En algunas modalidades, la capacidad de enlace de priones de un ligando es al menos aproximadamente 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.5, o 10.0 log10 ID50 por mi de ligando. En algunas modalidades, la capacidad de enlace de priones de un ligando es al menos aproximadamente 102, 103, 104, 105, 105, 107, o 108 ID50 por mi de ligando.

Método para producir nanopartículas Se conocen en la técnica métodos para producir composiciones que contienen albúmina y agentes farmacológicos activos substancialmente insolubles en agua. Por ejemplo, nanopartículas que contienen agentes farmacológicos activos substancialmente insolubles en agua y albúmina pueden prepararse bajo condiciones de altas fuerzas de cizalla (por ejemplo, sonicación, homogeneización a alta presión, o semejantes). Estos métodos se describen por ejemplo, en las patentes de los E.U.A. Nos. 5,916,596; 6,506,405; 6,749,868, y 6,537,579 y también en las publicaciones de patentes de los E.U.A. Nos. 2005/0004002 y 2007/0082838, y la Publicación PCT No. WO99/00113, que aquí cada una se incorporan por referencia en su totalidad.

En una modalidad ejemplar, el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua (por ejemplo, paclitaxel) se disuelve en un solvente orgánico. Solventes orgánicos convenientes incluyen, por ejemplo, cetonas, ésteres, éteres, solventes clorados y otros solventes conocidos en la técnica. Por ejemplo, el solvente orgánico puede ser cloruro de metileno. En algunas modalidades, él solvente orgánico puede ser en una mezcla de un solvente inmiscible en agua (tal como cloroformo) y un solvente miscible en agua (tal como solvente alcohol miscible en agua, tal como cloroformo/metanol, cloroformo/etanol , cloroformo/propanol, o cloroformo/t-butanol (por ejemplo con una proporción (v/v) de aproximadamente cualquiera de 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, o 9:1 o con una proporción (v/v) de aproximadamente cualquiera de 3:7, 5:7, 4:6, 5:5, 6:5, 8:5, 9:5, 9.5:5, 5:3, 7:3, 6:4, o 9.5:0.5). La solución se agrega a albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano) . La mezcla se somete a homogeneización de alta presión (por ejemplo, utilizando dispositivos de homogeneización estándar) . La emulsión puede ciclarse a través del homogeneizados de alta presión entre aproximadamente 2 a aproximadamente 100 ciclos, tal como aproximadamente 5 a aproximadamente 50 ciclos o aproximadamente 8 a aproximadamente 20 ciclos (por ejemplo, aproximadamente cualquiera de 8, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 ciclos). El solvente orgánico puede entonces retirarse por evaporación utilizando equipo conveniente conocido para este propósito, incluyendo, pero no limitado a, evaporadores rotatorios, evaporadores de película delgada, evaporadores de película descendente, evaporadores de película frotada, secadores por rocío, y semejantes. El solvente puede retirarse por ejemplo, a presión reducida (tal como aproximadamente cualquiera de 5 mm de Hg, 10 mm de Hg, 15 mm de Hg, 20 mm de Hg, 25 mm de Hg, 30 mm de Hg, 40 mm de Hg, 50 mm de Hg, 100 mm de Hg, 200 mm de Hg, o 300 mm de Hg) . La cantidad de tiempo utilizada para retirar el solvente bajo presión reducida puede ajustarse con base en el volumen de la formulación. Por ejemplo, para una formulación producida a una escala de 300 mL, el solvente puede . retirarse a aproximadamente 1 a aproximadamente 300 mm de Hg (por ejemplo, aproximadamente cualquiera de 5-100 mm de Hg, 10-50 mm de Hg, 20-40 mm de Hg, o 25 mm de Hg) por aproximadamente l a aproximadamente 120 minutos, incluyendo aproximadamente 5 a aproximadamente 60 minutos (por ejemplo, aproximadamente cualquiera de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 16, 18, 20, 25, o 30 minutos) .

Si se desea, solución de albúmina (tal como una solución de albúmina retirada de priones) puede agregarse a la dispersión para ajusfar la proporción de albúmina a fármaco (por ejemplo, paclitaxel) o para ajusfar la concentración del taxano (por ejemplo, paclitaxel) en la dispersión. Por ejemplo, solución de albúmina (por ejemplo, 25% p/v) puede agregarse para ajusfar la proporción de albúmina a agente farmacológicamente activo substancialmente insoluble en agua (por ejemplo, paclitaxel) a aproximadamente cualquiera de 18:1, 15,: 1 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7.5:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, o 1:18. Por ejemplo, solución de albúmina (por ejemplo, 25% p/v) u otra solución se agrega para ajustar la concentración del agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua (por ejemplo, paclitaxel) en la dispersión a aproximadamente cualquiera de 0.5 mg/ml, 1.3 mg/ml, 1.5 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, o 50 mg/ml. La dispersión puede ser filtrada en forma individual o en serie a través de uno o más filtros, tales como filtros de 1.2 µp?, 0.8 µp?, 0.45 um, y 0.22 µp?; combinaciones de dos o más de los mismos o la combinación con cualesquiera otros filtros conocidos en la técnica.

Si se desea, una segunda terapia (por ejemplo, uno o más compuestos útiles para tratar cáncer) , un agente antimicrobiano (tal como citrato o edetato) , azúcar (tal- como sacarosa) , y/o agente estabilizante, también pueden incluirse en la composición. Este agente adicional ya puede ser mezclado con el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua (por ejemplo, paclitaxel) y/o la albúmina durante preparación de la composición, o agregar después de que se prepara la composición de nanoparticulas. En algunas modalidades, el agente se mezcla con la composición de nanoparticulas antes de liofilización . En algunas modalidades, el agente se agrega a la composición liofilizada . En algunas modalidades, cuando la adición del agente cambia el pH de la composición, el pH en la composición en general es (pero no necesariamente) ajustado a un pH deseado. Valores de pH ejemplares de las composiciones incluyen, por ejemplo en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.5. En algunas modalidades, el pH de la composición se ajusta a no menos que aproximadamente 6, incluyendo por' ejemplo no menos que cualquiera de aproximadamente 6.5, 7, o 8 (por ejemplo, aproximadamente 8).

Como se discute a continuación con más detalle, el proceso de eliminación de priones puede llevarse a cabo de manera concurrente con el proceso de fabricación. Por ejemplo, el proceso de eliminación de priones puede llevarse a cabo después de que se forma la mezcla de albúmina y el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua y antes de someter la mezcla a la condición de alta cizalla. En algunas modalidades, el proceso de eliminación de priones puede llevarse a cabo después de que la mezcla se ha sometido a la condición de alta cizalla y antes de la eliminación del solvente orgánico. En algunas modalidades, el proceso de eliminación de priones se lleva a cabo después de la eliminación del solvente orgánico. En algunas modalidades, se agrega albúmina adicional a la suspensión post-evaporación antes del proceso de eliminación de priones. En algunas modalidades, el proceso de eliminación de priones se lleva a cabo bajo una condición estéril. En algunas modalidades, el proceso de eliminación de priones se lleva a cabo por uso de un cartucho que simultáneamente filtra estéril la composición.

Método para eliminar priones de las composiciones de nanopartículas o composiciones intermedias En un aspecto la presente invención proporciona métodos que comprenden eliminar proteínas de priones de composiciones de nanopartículas, tales como composiciones de nanopartículas formadas por los métodos anteriormente descritos. En otro aspecto, se proporcionan métodos para retirar „ proteínas priones de composiciones intermedias generadas durante el proceso de fabricación de nanopartículas (a continuación referido como "la composición intermedia").

En general, los métodos comprenden poner en contacto una composición que comprende albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua con un ligando capaz de enlazar una proteína prión, y retirar de la composición de nanopartículas, el ligando y proteína enlazada al mismo. Este proceso puede repetirse una o más veces, con un ligando igual o diferente. Dos o más ligandos también pueden emplearse en forma simultánea durante el proceso de eliminación de priones.

En algunas modalidades, la composición de nanopartículas en la composición intermedia tiene una infectividad de priones de aproximadamente 100 IU-ic/ml, 90IU-ic/ml, 50lU-ic/ml, o 10IU- ic/ml.

Durante el proceso de eliminación de priones, el ligando se pone en contacto con la composición de nanoparticulas o composición intermedia y deja que enlace a las proteínas priones en la composición de nanoparticulas o la composición intermedia. Condiciones adecuadas para el enlace pueden determinarse y optimizarse para facilitar enlace de ligando a una proteína prión con base en la naturaleza del ligando y su especificidad de enlace a la proteína prión. En algunas modalidades, el enlace se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 0 grados C a aproximadamente 39 grados C, incluyendo por ejemplo aproximadamente 20 grados C a aproximadamente 25 grados C. El enlace puede llevarse a cabo a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 10, incluyendo por _ ejemplo aproximadamente 5 a aproximadamente 9, aproximadamente 6 a aproximadamente 8, aproximadamente 6.8 a aproximadamente 7.5, aproximadamente 6.9 a aproximadamente 7.4, o aproximadamente 7. Opcionalmente, agentes de bloqueo pueden emplearse para reducir enlace no específico al ligando.

Después de la etapa de contacto, el ligando y proteínas enlazadas con el mismo se retiran del resto de la composición. La eliminación puede llevarse a cabo en una variedad de formas, dependiendo de la naturaleza del ligando y el material de soporte (de haber) empleado para facilitar la separación. Por ejemplo, el ligando y proteínas enlazadas al mismo pueden separarse por cromatografía, tal como, pero no limitado a, cromatografía de capa delgada, en columna y por lotes; soporte sólido y separación de membrana; separación de reactor; separación magnética, inmunoseparación; y separación coloidal.

En algunas modalidades, él ligando puede inmovilizarse en un soporte tal como perlas o membranas, que a su vez se deja que contacte la composición de nanopartículas o la composición intermedia. Soporte inmovilizado por ligandos se deja que contacte la composición de nanopartículas o la composición intermedia bajo una condición suficiente para provocar formación de un complejo ligando-priones . La fase sólida después se separa de la composición, de esta manera retirando la proteína prión enlazada al ligando de la muestra. Por ejemplo, en una modalidad ejemplar, los ligandos se inmovilizan en una columna, tal como una columna de cromatografía, una muestra (tal como la composición de nanopartículas) se pasa entonces a través de la columna ya sea debido a la fuerza de gravedad o bajo presión, tal como en una columna de cromatografía de líquido de alta presión. Proteínas prión en la muestra enlazarán al ligando inmovilizado en la columna, y la muestra pasante puede recolectarse. Este proceso puede repetirse varias veces para lograr el resultado deseado.

El gasto . de . flujo de una muestra (tal como composición de nanoparticulas o composición intermedia) en una columna, puede ajustarse para llevar al máximo el enlace de ligando y las proteínas de priones en una muestra. En algunas modalidades, el enlace se lleva a cabo a un gasto de flujo de aproximadamente 0.1 mi por minuto a aproximadamente 5.0 mi por minuto, aproximadamente 0.1 mi por minuto a aproximadamente 2.5 mi por minuto, aproximadamente 0.1 mi por minuto a aproximadamente 0.25 mi por minuto, aproximadamente 0.25 por minuto a aproximadamente 0.5 mi por minuto, aproximadamente 0.5 mi por minuto a aproximadamente 1.0 mi por minuto, aproximadamente 1.0 mi por minuto a aproximadamente 1.5 mi por minuto, aproximadamente 1.5 mi por minuto a aproximadamente 2.0 mi por minuto, aproximadamente 2.0 mi por minuto a aproximadamente 2.5 mi por minuto, aproximadamente 2.5 mi por minuto a aproximadamente 3.0 mi por minuto, aproximadamente 3.0 mi por minuto a aproximadamente 3.5 mi por minuto, aproximadamente 3.5 mi por minuto a aproximadamente 4.0 mi por minuto, aproximadamente 4.0 mi por minuto a aproximadamente 4.5 mi por minuto, o aproximadamente 4.5 mi por minuto a aproximadamente 5.0 mi por minuto, incluyendo por ejemplo aproximadamente 0.1 mi por minuto, 0.25 mi por minuto, 0.5 mi por minuto, 1.0 mi por minuto, 1.5 mi por minuto, 1.7 mi por minuto, 1.8 mi por minuto, 1. 9 mi por minuto, 2.0 mi por minuto, 2.1 mi por minuto, 2. 3 mi por minuto, 2.5 mi por minuto, 2.7 mi por minuto, 3. 0 mi por minuto, 3.5 mi por minuto, 4.0 mi por minuto, 4. 5 mi por minuto, o 5.0 mi por minuto . En algunas modalidades, el gasto de flujo es al menos aproximadamente 10 mi por minuto, tal como al menos aproximadamente cualquiera de 20 mi por minuto, 30 mi por minuto, 40 mi por minuto, 50 mi por minuto.

El volumen de flujo pasante total o el tiempo de flujo pasante total durante un proceso de enlace también pueden ajustarse para llevar al máximo el enlace del ligando y las proteínas priones en una muestras (tal como composición de nanopartículas o la composición intermedia) . En algunas modalidades, el volumen de flujo pasante total es aproximadamente 50 veces a aproximadamente 1000 veces el volumen de columna, incluyendo por ejemplo aproximadamente 50 veces a aproximadamente 500 veces del volumen de columna, aproximadamente 100 veces a aproximadamente 600 veces del volumen de columna, · o aproximadamente 200 veces a aproximadamente 800 veces del volumen de columna. En algunas modalidades, el' volumen de flujo pasante total es aproximadamente 100 veces el volumen de columna. En otras modalidades, el volumen de flujo pasante total es aproximadamente 500 veces el volumen de columna. En algunas modalidades, el tiempo de flujo pasante total es aproximadamente 1 hora a aproximadamente 30 horas, incluyendo por ejemplo aproximadamente 2 horas . a aproximadamente 25 horas, aproximadamente 3 horas a aproximadamente 20 horas, o aproximadamente 3 horas a aproximadamente 17 horas. En algunas modalidades, el tiempo de flujo pasante total es cualquiera de aproximadamente 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, o 20 horas. En algunas modalidades, el tiempo de flujo pasante total es más que aproximadamente 24 horas. En algunas modalidades, el tiempo de flujo pasante total es menos que aproximadamente 8, incluyendo por ejemplo cualquiera de 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, o 0.5 horas.

En forma alterna, el ligando puede primero ponerse en contacto con la composición de nanoparticulas o la composición intermedia, bajo una condición suficiente para provocar la formación de un complejo de ligando-prión . El complejo de ligando-prión después se retira subsecuentemente utilizando una columna, tal como cromatografía basada en afinidad. Para facilitar la separación, el ligando puede conjugarse con un socio de enlace de manera tal que el complejo ligando/prión puede retirarse al utilizar una columna de afinidad que contiene una molécula que reconoce el socio de enlace.

Además de cromatografía por lotes o en columna, una variedad de configuraciones, modificaciones y variaciones del uso de los ligandos para enlace de proteínas priones también se prevén. Estas variaciones y modificaciones incluyen, pero no están limitados a: procesos por lotes, procesos continuos, procesos de cromatografía en lecho móvil; procesos de presión baja, media o alta; o procesos a escala pequeña, media o grande. En algunas modalidades, los ligandos están en una membrana, lecho de fibras, impregnados en una malla no tejida, o fibras de revestimiento contenidas dentro de un alojamiento de filtros.

En algunas modalidades, la etapa de separación no resulta significativamente en pérdida de rendimiento y/o cambio en la propiedad y/o estabilidad de la albúmina. Para propósitos prácticos, la recuperación de la albúmina en su estado biológico original deberá mantenerse substancialmente al menos a un nivel que excede 50%, incluyendo por ejemplo 80%, o 90%, o más. En algunas modalidades, la velocidad de recuperación de albúmina del proceso de priones es superior que cualquiera de aproximadamente 80%, 90%, 95%, o 99%. En. algunas modalidades, la concentración de albúmina en la composición de nanopartículas se ajusta o controla antes de la etapa de eliminación de priones a fin de reducir al mínimo el enlace no específico y pérdida de albúmina durante el proceso. Por ejemplo, la concentración de albúmina puede estar en el intervalo de aproximadamente 1% a aproximadamente 50%, aproximadamente 5% a aproximadamente 25%, aproximadamente 5% a aproximadamente 30%, aproximadamente 5% a aproximadamente 40%, aproximadamente 5% a aproximadamente 10%, aproximadamente 10% a aproximadamente 15%, aproximadamente 15% a aproximadamente 20%, aproximadamente 20% a aproximadamente 25%, aproximadamente 25% a aproximadamente 30%, etc., incluyendo por ejemplo aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, o 30% de albúmina.

En algunas modalidades, la etapa de separación no resulta significativamente en pérdida de rendimiento y/o cambio en la propiedad y/o estabilidad de las nanoparticulas en la composición.

En algunas modalidades, la etapa de separación no resulta significativamente en pérdida de rendimiento •y/o cambio en la propiedad o carga del agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua en la composición.

En algunas modalidades, la etapa de separación no resulta significativamente en cambio en la proporción de albúmina al agente farmacológico substancialmente insoluble en agua en la composición.

La composición eliminada _ de priones puede ser analizada para determinar la velocidad de eliminación del proceso de eliminación de priones. El ligando con las proteínas de priones enlazadas también pueden analizarse (en forma directa o después de elución) para determinar la velocidad de eliminación.

La eliminación de proteínas priones puede determinarse con base en la reducción del nivel de proteínas priones y/o reducción de infectividad. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 50%, incluyendo por ejemplo al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, o 100% de las proteínas de priones se retiran de la composición de nanopartículas. En algunas modalidades, la infectividad de la composición de albúmina post-eliminación es de al menos aproximadamente lOx, 20x, 30x, 40x, 50x, 80x, ????, 200x, 500x, lOOOx, 10 x, 105x, 106x menos que de la composición de nanopartículas.

En algunas modalidades, la infectividad en serie se emplea para determinar la velocidad de eliminación del proceso de eliminación de priones. Diluciones en serie de muestras se realizan y diluciones se examinan para actividad infecciosa, por ejemplo- en un animal de ensayo. La dilución en la cual la mitad de los animales se infecta es el título infeccioso. Por ejemplo, si se requiere una dilución de 5 veces, la muestra puede definirse que tiene 5 logs de infectividad. Al comparar la infectividad log de la composición de nanopartículas y la de la composición de nanopartículas posterior a eliminación, se puede determinar la velocidad de eliminación del proceso de eliminación de priones. En algunas modalidades, el método de eliminación de priones resulta en una reducción de cualquiera de 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, o 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 logs de infectividad.

En algunas modalidades, la velocidad de eliminación del proceso de eliminación de priones se determina con base en experimentos de modificación con materiales infecciosos al seguir las etapas descritas aquí para el método de eliminación de priones. Agentes de modificación convenientes incluyen, pero no están limitados a homogeneizado de cerebro, microsomas, dominios tipo caveolas, PrPsc purificado y fibrilas de priones. En algunas modalidades, el agente de modificación es detergente solubilizado (tal como sarcosilo solubilizado) . En algunas modalidades, la proporción de modificación en la composición está en el intervalo de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 0.25%, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 0.1%, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 0.005%, aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.075%, aproximadamente 0.075% a aproximadamente 0.01%, aproximadamente 0.01% a aproximadamente 0.1%, aproximadamente 0.1% a aproximadamente 0.5%, aproximadamente 0.5% a aproximadamente 0.75%, aproximadamente 0.75% a aproximadamente 1%, aproximadamente 1% a aproximadamente 2%, aproximadamente 2% a aproximadamente 3%, o aproximadamente 3% a aproximadamente 5%, incluyendo por ejemplo aproximadamente 0.001%, 0.005%, 0.075%, 0.01%, 0.1%, 0 · 5¾ / 0.75*6^ 1"6 / 2"5/ 3 o 5s .

.En algunas modalidades, los factores de reducción (RF) se emplean para determinar la velocidad de eliminación del proceso de eliminación de priones. RF puede calcularse utilizando la fórmula: RF = (Vi x Tj)/(V2 x Ta) o LogHPff] =[Log,0(V0 + LogioCTi)] - [Logi^) + Log.oC¾)]- en donde Vi y Ti son el volumen y título de la composición inicial de albúmina, respectivamente y V2 y 2 son el volumen y título de la composición posterior a eliminación de albúmina. Factores de reducción pueden redondearse a 1 sitio decimal después del cálculo final. En algunas modalidades, un factor de reducción de al menos aproximadamente 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, o 8.0 logio de infectividad de las proteínas prión se retira de la composición inicial de albúmina. Por ejemplo, la proteína prión puede retirarse por un factor de reducción mayor que o igual a 2.5 logio en una fracción de sarcosilo solubilizada al 0.5% modificada en una composición de albúmina al 20%. Como otro ejemplo, la proteína prión también puede retirarse por un factor de reducción mayor que o igual a 2.0 logio en una fracción de sarcosilo solubilizada al 0.5% modificada en una composición al 25% de albúmina.

La eliminación de priones puede evaluarse por análisis de transferencia Western estándar. Por ejemplo, los ligandos post-enlace primero pueden tratarse con proteinasa K, que digiere todos los PrPc pero no PrPsc. La digestión después se ejecuta en gel SDS y transfiere a una hoja de nitrocelulosa o membrana PVDF. Las bandas PrPsc separadas después se visualizan utilizando 3F4 o 6H4. 3F4 reacciona con residuos 109-112 PrP de humanos, hámsters y felinos. En una modalidad ejemplar, la incubación se llevó a cabo a una concentración de 0.6 ug/ml por un mínimo de una hora,, después de lo cual se lavó por arrastre el exceso de anticuerpo y las membranas se incubaron con un conjugado de peroxidasa de rábano picante anti ratón conejo (dilución 1:1000) por un mínimo de una hora. Después de lavado extenso con TTBS, las membranas se revelaron utilizando quimioluminiscencia mejorada. En algunas modalidades, la eliminación de proteínas priones se evaluaron de acuerdo con las Guías para la Investigación de Procesos de Fabricación para Productos Medicinales Derivados de Plasma con Respecto a Riesgo de vCJD (CPMP5136/03) También aquí se contemplan composiciones elaboradas durante el proceso de eliminación de priones. De esta manera, en algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, además comprende un ligando capaz de enlazar a una proteína prión. En algunas modalidades, se proporciona una mezcla que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, y un ligando capaz de enlazar a una proteína prión conectada a un material de soporte, tal como uno o más materiales de soporte aquí descritos. En algunas modalidades, se proporciona una columna cargada con una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la columna comprende un ligando capaz de enlazar a una proteína prión. En algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua y una resina que comprende un ligando capaz de enlazar a una proteína prión. Por ejemplo, en algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y ' un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua y una resina DVR. En algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua y una resina PRDT .

En algunas ' modalidades, se proporciona una composición que comprende una mezcla de una solución de albúmina acuosa y un agente farmacológico · activo substancialmente insoluble en agua, disperso en un solvente orgánico, además comprende un ligando capaz de enlazar a una proteina prión . En algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende una mezcla de una solución de albúmina acuosa y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua disperso en un solvente orgánico, y un ligando capaz de enlazar a una proteina prión conectada a un material de soporte, tal como uno o más materiales de soporte aquí descritos. En algunas modalidades, se proporciona una columna cargada con una composición que comprende una mezcla de una solución de albúmina acuosa y un agente farmacológico , activo substancialmente insoluble en agua disperso · en un solvente orgánico, en donde la columna comprende un ligando capaz de enlazar a una proteina prión.

También se proporcionan composiciones elaboradas por los métodos aquí descritos. La composición en algunas modalidades es bioequivalente a una composición no sujeta a un proceso de eliminación de priones.

Composiciones de nanopartículas Las composiciones de nanopartícula aquí descritas comprenden nanoparticulas que comprenden (en diversas modalidades que esencialmente consisten de) albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua (tal como paclitaxel). Nanoparticulas de fármacos deficientemente solubles en agua (tales como taxano) se han descrito por ejemplo, en las patentes de los E.U.A. Nos. 5,916,596; 6,506,405; 6,749,868, y 6,537,579 y también en las publicaciones de patentes de los E.U.A. Nos. 2005/0004002 y 2007/0082838, y la solicitud de patente PCT WO08/137148, los contenidos de cada una de las cuales se incorporan aquí en su totalidad.

En algunas modalidades, la composición comprende nanoparticulas con un diámetro promedio no mayor que aproximadamente 1000 nanómetros (nm) , tal como no mayor que aproximadamente cualquiera de 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, y 100 nm. En algunas modalidades, los diámetros promedio de las nanoparticulas no son mayores que aproximadamente 200 nm. En algunas modalidades , los diámetros promedio de las nanoparticulas no son mayores que aproximadamente 150 nm. En algunas modalidades , los diámetros promedio de las nanoparticulas no son mayores que aproximadamente 100 nm. En algunas modalidades, el diámetro promedio de las nanoparticulas es aproximadamente 20 a aproximadamente 400 nm. En algunas modalidades, el diámetro promedio de las nanoparticulas es aproximadamente 40 a aproximadamente 200 nm. En algunas modalidades, las nanoparticulas son de filtrado estéril.

En algunas modalidades, las nanoparticulas en la composición aquí descrita tienen un diámetro . promedio no mayor que aproximadamente 200 nm, incluyendo por ejemplo no mayor que aproximadamente cualquiera de 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, o 60 nm. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 50% (por ejemplo al menos aproximadamente cualquiera de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 99%) de todas las nanoparticulas en la composición tienen un diámetro no mayor que aproximadamente 200 nm, incluyendo por ejemplo no mayor que aproximadamente cualquiera de 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, o 60 nm. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 50% (por ejemplo al menos cualquiera de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 99%) de todas las nanoparticulas en la composición caen dentro del intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 nm, incluyendo por ejemplo cualquiera de aproximadamente 30 a aproximadamente 180 nm, y cualquiera de aproximadamente 40 a aproximadamente 150, aproximadamente 50 a aproximadamente 120, y aproximadamente 60 a aproximadamente 100 nm.

En algunas modalidades, al menos aproximadamente 5% (incluyendo por ejemplo al menos aproximadamente cualquiera de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90%) de la albúmina en la porción de nanopartículas de la composición se entrelaza (por ejemplo entrelaza a través de uno o más enlaces disulfuro) .

En algunas modalidades, las nanoparticulas comprenden el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en . agua (tal como paclitaxel) revestido con un albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano) . En algunas modalidades, la composición comprende agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua en forma de no-nanoparticulas , en donde al menos aproximadamente cualquiera de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 99% del agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua en la composición está en forma de nanoparticulas. En algunas modalidades, el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua en las nanoparticulas constituye más de aproximadamente cualquiera de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 99% de las nanoparticulas, en peso. En algunas modalidades, las nanoparticulas tienen una matriz no polimérica. En algunas modalidades, las nanoparticulas comprenden un núcleo de agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua que está substancialmente libre de materiales poliméricos (tal como matriz polimérica) .

En algunas modalidades, la composición comprende albúmina tanto en porciones de nanoparticulas y no-nanoparticulas de la composición, en donde al menos aproximadamente cualquiera de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 99% de la albúmina en la composición está en la porción de no-nanoparticulas de la composición.

En algunas modalidades, la composición de nanoparticulas está substancialmente libre (tal como libre) de surfactantes (tales como Cremophor®, Tween 80, u otros solventes orgánicos empleados para la administración de agentes farmacológicamente activos substancialmente insolubles en agua) . En algunas modalidades, la composición de nanoparticulas contiene menos de aproximadamente cualquiera de 20%, 15%, 10%, 7.5%, 5%, 2.5%, 1% o menos de solvente orgánico. En algunas modalidades, la proporción en peso de albúmina y agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua en la composición de nanoparticulas es aproximadamente 18:1 o menos, tal como aproximadamente 15:1" o menos, por ejemplo aproximadamente 10:1 o menos. En algunas modalidades, la proporción en peso de albúmina y agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua en la composición, cae en el intervalo o rango de cualquiera de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 18:1, aproximadamente 2:1 a aproximadamente 15:1, aproximadamente 3:1 a aproximadamente 13:1, aproximadamente 4:1 a aproximadamente 12:1, aproximadamente 5:1 a aproximadamente 10:1. En algunas modalidades, la proporción en peso de albúmina y agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua en la porción de nanoparticulas de la composición es aproximadamente cualquiera de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:10, 1:15, o menos . En algunas modalidades, la proporción en peso de albúmina (tal como albúmina de suero humano) y el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua en la composición es cualquiera de lo siguiente: aproximadamente 1:1 a aproximadamente 18:1, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 15:1, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 12:1, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 10:1, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 9:1, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 8:1, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 7:1, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 6:1, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 5:1, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 4:1, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 3:1, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 2:1, o aproximadamente 1:1.

En algunas modalidades, la composición de nanoparticulas comprende uno o más de las características anteriores.

Las nanoparticulas aquí descritas pueden estar presentes en una formulación seca (tal como composición liofilizada) o suspendidas en un medio biocompatible . Medio biocompatible conveniente incluye, pero no está limitado a, agua, medio acuoso amortiguado, salino, salino amortiguado, soluciones opcionalmente amortiguadas de aminoácidos, soluciones opcionalmente amortiguadas de proteínas, soluciones opcionalmente amortiguadas de azúcares, soluciones opcionalmente amortiguadas de vitaminas, soluciones opcionalmente amortiguadas de polímeros sintéticos, emulsiones que contienen lípidos, y semejantes.

En algunas modalidades, el portador farmacéutico aceptable comprende albúmina de suero humano. · La albúmina de suero humano (HSA = Human Serum Albumin) es una proteína globular altamente soluble de Mr 65K y consiste de 585 aminoácidos. HSA es la proteína más abundante en el plasma y representa 70-80% de la presión osmótica coloidal del plasma humano. La secuencia de aminoácidos de HSA contiene un total de 17 puentes disulfuro, un tiol libre (Cys 34), y un triptofano sencillo (Trp 214) . El uso intravenoso de solución HSA se ha indicado para la prevención y tratamiento de choque hipovolúmico y en conjunto con transfusión de intercambio en el tratamiento de hiperbilirubinemia neonatal. Se contemplan otras albúminas, tales como albúmina de suero bovino. El uso de estas albúminas no-humanas puede ser apropiado, por ejemplo en el contexto de uso de estas composiciones en mamíferos no-humanos, tales como veterinario (incluyendo mascotas domésticas y en el contexto agrícola).

La albúmina de suero humano (HSA) tiene múltiples sitios de enlace hidrofóbicos (un total de ocho para ácidos grasos, un ligando endógeno de HSA) y liga a un conjunto diverso de agentes farmacológicos activos substancialmente insolubles en agua, especialmente compuestos hidrofóbicos neutros y de carga negativa. Dos sitios de enlace de alta afinidad se han propuesto en subdominios IIA y IIIA de HSA, que son cavidades hidrofóbicas altamente alargadas con residuos lisina y arginina cargados cerca de la superficie que funciona como puntos de conexión para características de ligando polar.

La albúmina en la composición en general sirve como un portador para el · agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, es decir la albúmina en la composición hace de más fácil suspensión en un medio acuoso al agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua o ayuda a mantener la suspensión en comparación con composiciones que no comprenden albúmina. Esto puede evitar el uso de .solventes tóxicos (o surfactantes ) para solubilizar el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, y de esta manera puede reducir uno o más efectos secundarios de administración del agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua en un individuo (tal como un humano) . De esta manera, en algunas modalidades, la composición aquí descrita está substancialmente libre (tal como libre) de surfactantes , tales como Cremophor (incluyendo Cremophor EL® (BASF)) . En algunas modalidades, la composición de nanoparticulas está substancialmente libre (tal como libre) de surfactantes . Una composición es "substancialmente libre de Cremophor" o "substancialmente libre de surfactante" si la cantidad de Cremophor o surfactante en la composición no es suficiente para provocar uno o más efectos secundarios en un individuo en donde la composición de nanoparticulas se administra al individuo.

La cantidad de albúmina en la composición aquí descrita variará dependiendo de otros componentes en la composición. En algunas modalidades, la composición comprende una albúmina en una cantidad que es suficiente para estabilizar el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua en una suspensión acuosa, por ejemplo en la forma de una suspensión coloidal estable (tal como una suspensión estable de nanoparticulas). En algunas modalidades, la albúmina está en una cantidad que reduce la velocidad de sedimentación del agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua en un medio acuoso. Para composiciones que contienen partículas, la cantidad de albúmina también depende del tamaño y densidad de las nanoparticulas del agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua.

Un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua es "estabilizado" en una suspensión acuosa si permanece suspendido en un medio acuoso (tal como sin precipitación o sedimentación visibles) por un periodo prolongado de tiempo, tal como por al menos aproximadamente cualquiera de 0.1, 0.2, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 36, 48, 60, o 72 horas. La suspensión en general, pero no en forma necesaria, es adecuada para administración a un individuo (tal como humano) . La estabilidad de la suspensión en general (pero no en forma necesaria) es evaluada a temperatura de almacenamiento (tal como temperatura ambiente (tal como 20-25 grados C) o condiciones refrigeradas (tal como 4 grados C) ) . Por ejemplo, una suspensión es estable a una temperatura de almacenamiento si no exhibe floculación o aglomeración de partículas visible a simple vista o cuando se ve bajo el microscopio óptico a 1000 veces, a aproximadamente quince minutos después de preparación de la suspensión. La estabilidad también puede evaluarse bajo condiciones de prueba acelerada, tal como a una temperatura que es superior a aproximadamente 40 grados C.

En algunas modalidades, la albúmina está presente en una cantidad que es suficiente para estabilizar al agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua en una suspensión acuosa a una cierta concentración. Por ejemplo, la concentración del agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua en la composición es aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 mg/ml, incluyendo por ejemplo cualquiera de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 8 mg/ml, aproximadamente 4 a aproximadamente 6 mg/ml, aproximadamente 5 mg /mi. En algunas modalidades, la concentración del agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua es al menos aproximadamente cualquiera de 1.3 mg/ml, 1.5 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, y 50 mg/ml. En algunas modalidades, la albúmina está presente en una cantidad que evita el uso de surfactantes (tales como Cremophor) , de manera tal que la composición está libre o sustancialmente libre de surfactante (tal como Cremophor) .

En algunas modalidades, la composición, en forma liquida, comprende de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 50% (p/v) (por ejemplo aproximadamente 0.5% (p/v) , aproximadamente 5% (p/v) , aproximadamente 10% (p/v) , aproximadamente 15% (p/v), aproximadamente 20% (p/v)', aproximadamente 25% (p/v) , aproximadamente 30% (p/v) , aproximadamente 40% (p/v), o aproximadamente 50% (p/v)) de albúmina. En algunas modalidades, la composición en forma liquida comprende aproximadamente 0.5% a aproximadamente 5% (p/v) de albúmina.

En algunas modalidades, la proporción en peso de albúmina, por ejemplo albúmina al agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua en la composición de nanoparticulas es tal que una cantidad suficiente de agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua liga a, o se transporta por la célula. Mientras que la proporción en peso de albúmina a agente farmacológicamente activo sustancialmente insoluble" en agua tendrá que ser optimizada para diferentes combinaciones de albúmina y agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua, en general la proporción en peso de albúmina, por ejemplo albúmina a agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua (p/p) es aproximadamente 0.01:1 a aproximadamente 400:1, aproximadamente 0.02:1 a aproximadamente 50:1, aproximadamente 0.05:1 a aproximadamente 20:1, aproximadamente 0.1:1 a aproximadamente 20:1, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 18:1, aproximadamente 2:1 a aproximadamente 15:1, aproximadamente 3:1 a aproximadamente 12:1, aproximadamente 4:1 a aproximadamente 10:1, aproximadamente 5:1 a aproximadamente 9:1, o aproximadamente 9:1. En algunas modalidades, la proporción en peso de albúmina a agente farmacológicamente activo sustancialmente insoluble en agua es aproximadamente cualquiera de 18:1 o menos, 15:1 o menos, 14:1 o menos, 13:1 o menos, 12:1 o menos, 11:1 o menos, 10:1 o menos, 9:1 o menos, 8:1 o menos, 7:1 o menos, 6:1 o menos, 5:1 o menos, 4:1 ó menos, y 3:1 o menos.

En algunas modalidades, la albúmina permite que la composición se administre a un individuo (tal como humano) sin efectos secundarios significantes. En algunas modalidades, la albúmina está en una cantidad que es efectiva para reducir uno o más efectos secundarios de la administración a un humano del agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua. El término "reducir uno o más efectos secundarios de administración del agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua" se refiere a la reducción, alivio, eliminación o evitar uno o más efectos indeseables provocados por el agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua, asi como efectos secundarios provocados por vehículos de suministro (tales como solventes que hacen a los agentes farmacológicos activos sustancialmente insolubles en agua adecuados para inyección) empleados para suministrar · el agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua. Estos efectos secundarios incluyen por ejemplo mielosupresión, neurotoxicidad, hipersensibilidad, inflamación, irritación venosa, flebitis, dolor, irritación de la piel, neuropatía periférica, fiebre neutropénica, reacción anafiláctica, trombosis venosa, extravasación y sus combinaciones. Estos efectos secundarios sin embargo son solamente ejemplares y otros efectos secundarios o combinación de . efectos secundarios asociados con agentes farmacológicos activos sustancialmente insolubles en agua, pueden reducirse.

En algunas modalidades, la composición comprende Abraxane® (o Nab-paclitaxel) . En algunas modalidades, la composición es Abraxane® (o Nab-paclitaxel). Abraxane® es una formulación de paclitaxel estabilizada por albúmina humana USP, que puede dispersarse en solución fisiológica directamente inyectable. Cuando se dispersa en un medio acuoso conveniente tal como inyección de cloruro de sodio al 0.9% o inyección de dextrosa al 5%, Abraxane™ forma una suspensión coloidal estable de paclitaxel. El tamaño de partículas promedio de las nanopartículas en la suspensión coloidal es aproximadamente 130 nanómetros. Ya que HSA está libremente soluble en agua, Abraxane™ puede reconstituirse en una amplia variedad de concentraciones en el intervalo de diluido (0.1 mg/ml de paclitaxel) a concentrado (20 mg/ml de paclitaxel), incluyendo por ejemplo aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 8 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml.

Agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua Las composiciones aquí descritas comprenden agentes farmacológicos activos sustancialmente insolubles en agua.

Por ejemplo, la solubilidad en agua del agente deficientemente soluble en agua a aproximadamente 20-25°C puede ser menor que aproximadamente 10 mg/ml, incluyendo por ejemplo menos que aproximadamente cualquiera de 5, 2, 1, 0.5, 0.2, 0.1, 0.05, 0.02, o 0.01 mg/ml. En algunas modalidades, el agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua es un sólido. En algunas modalidades, el agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua es un liquido. Agentes farmacológicos activos sustancialmente insolubles en agua aquí descritos pueden ser por ejemplo agente farmacéutico, agente de diagnóstico o un agente de valor nutricional.

Agentes farmacéuticos convenientes incluyen pero no están limitados a agentes anticáncer o antineoplásticos, agentes antimicrotúbulos , agentes inmunosupresores, anestésicos, hormonas, agentes para utilizar en desórdenes cardiovasculares, antiarritmicos , anticuerpos, antifungales , antihipertensivos , antiasmáticos, agentes antiinflamatorios, agentes antiartriticos, agentes vasoactivos, analgésicos/antipiréticos, antidepresores, antidiabéticos, agentes antifungales , antiinflamatorios, agentes antiansiedad, agentes inmunosupresores, agentes antimigraña, sedantes, agentes antiangina, agentes antipsicóticos, agentes antimaniacos, agentes antiartriticos, agentes antigota, anticoagulantes, agentes tromboliticos, agentes antifibrinolíticos , agentes hemoreológicos , agentes antiplaquetas, anticonvulsivos, agentes antiparkinson, antihistaminas/antipruriticos, agentes útiles para regulación del calcio, agentes antivirales, antimicrobianos, antiinfecciosos, broncodilatadores , hormonas, agentes hipoglicémicos , agentes hipolipidémicos , agentes antiúlcera/antireflujo, antináuseas/antieméticos y vitaminas solubles en aceite (por ejemplo, vitaminas A, D,- E, K, y semej antes ) .

En algunas modalidades, el agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua es cualquiera de los siguientes: un inhibidor de tirosina cinasa, un ' inhibidor de serie/treonina cinasa, un inhibidor de puercoespin, un inhibidor de topoisomerasa, un inhibidor de estructura de microtúbulos , un inhibidor de la ruta AKT quinasa, un inhibidor de proteasoma, un antimetabolito, y un agente basado en platino.

En algunas modalidades, el agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en. agua es un agente antineoplástico . En algunas modalidades, el agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua es un agente quimioterapéutico .

Agentes farmacológicos activos sustancialmente insolubles en agua convenientes incluyen pero no están limitados, a taxanos (tales como paclitaxel, docetaxel, ortataxel y otros taxanos) , epotilonas, camptotecinas, colchicinas, geladanamicinas, amiodaroñas , hormonas de tiroides, amfotericina, corticosteroides, propofol, melatonina, ciclosporina, rapamicina (sirolimus) y derivados, tacrolimus, ácidos micofenólicos, ifosfamida, vinorelbina, vancomicina, gemcitabina, SU5416, tiotepa, bleomicina, agentes de radiocontraste para diagnóstico, y sus derivados. Otros agentes farmacológicos activos sustancialmente insolubles en agua que son útiles en las composiciones de la invención se describen por ejemplo en las Patentes de los E.U.A. Números 5,916,596, 6,096,331, 6,749,868, y 6,537,539. Ejemplos adicionales de agentes farmacológicos activos sustancialmente insolubles en agua incluyen aquellos compuestos que son deficientemente solubles en agua y que se citan en la "Therapeutic Category and Biological Activity Index" de The Merck Index (12ava Edición, 1996) .

En algunas modalidades, el agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua es cualquiera de (y en algunas modalidades seleccionado del grupo que consiste de) paclitaxel,' docetaxel, CY196, ortataxel u otro taxano o análogo de taxano, 17-alil amino geldanamicina (17- AAG) , geldanamicina 18 derivatizada, camptotecina, propofol, amiodarona, ciclosporina, epotilona, radicicol, combretastatina, rapamicina,. amfotericina, liotironina, epotilona, colchicina, tiocolchicina y sus dimeros, hormona tiroides, péptido vasoactivo intestinal, corticosteroides , melatonina , tacrolimus, ácidos micofenólicos , epotilonas, radicicols, combretastatinas, y sus análogos o derivados. En algunas modalidades, el agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua es cualquiera de (y- en algunas modalidades seleccionado del grupo que consiste de) paclitaxel, docetaxel, CY196, ortataxel u otros taxanos, geldanamicina, 17- alil amino geldanamicina, tiocolchicina y sus dimeros, rapamicina, ciclosporina, epotilona, radicicol y combretastatina . En algunas modalidades, el agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua es rapamicina. En algunas modalidades, el agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua es 17-AAG. En algunas modalidades, el agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua es un derivado de tiocolchicina (tal como IDN5404). En algunas modalidades, el agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua es un taxano. En algunas modalidades, el agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua es paclitaxel. En algunas modalidades, el agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua es docetaxel. En algunas modalidades, el agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua es CY196.

En algunas modalidades, el agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua es un taxano o su derivado, que incluye pero no está limitado a paclitaxel, docetaxel y IDN5109 (ortataxel) , o su derivado. En algunas modalidades, la composición comprende un taxano no cristalino y/o amorfo (tal como paclitaxel o su derivado) . En algunas modalidades, la composición se prepara al utilizar un taxano anhidro (tal como docetaxel anhidro o su derivado) . Docetaxel anhidro se ha mostrado que produce una formulación más estable que puede elaborarse con un docetaxel hidratado tal como docetaxel trihidrato o hemi-hidrato .

Otros componentes en las composiciones de nanopartículas Las nanopartículas aquí descritas pueden estar presentes en una composición que incluye otros agentes, excipientes o estabilizantes. Por ejemplo, para incrementar la estabilidad al incrementar el potencial zeta negativo de nanopartículas, ciertos componentes de carga negativa pueden agregarse. Estos componentes de carga negativa incluyen pero no están limitados a sales biliares de ácidos biliares que consisten de ácido glicocólico, ácido cólico, ácido chenodeoxicólico, ácido taurocólico, ácido glicochenodeoxicólico, ácido taurochenodeoxicólico, ácido litocólico, ácido ursodeoxicólico, ácido deshidrocólico y otros; fosfolípidos basados en lecitina (yema de huevo) , que incluyen las siguientes fosfatidilcolinas : palmitoiloleoilfosfatidilcolina, palmitoillinoleoilfosfatidilcolina, estearoillinoleoilfosfatidi1colina, estearoiloleoilfosfatidilcolina, estearoilaraquidoilfosfatidilcolina y dipalmitoilfosfatidilcolina . Otros fosfolipidos incluyendo L-a-dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) , dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) , diesteariolfosfatidilcolina (DSPC), fosfatidilcolina de soya hidrogenada (HSPC Hydrogenated Soy Phosphatidilcholine) , y otros compuestos relacionados. Surfactantes o emulsificantes de carga negativa también son adecuados como aditivos, por ejemplo, colesteril sulfato de sodio y semejantes.

En algunas modalidades, la composición es adecuada para administración a un humano. En algunas modalidades, la composición es adecuada para administración a un mamífero tal como en el contexto veterinario, mascotas domésticas y animales agrícolas. Hay una amplia variedad de formulaciones convenientes de la composición de nanopartículas .(ver por ejemplo, las Patentes de los E.U.A. Números 5,916,596 y 6,096,331). Las siguientes formulaciones y métodos son solamente ejemplares y de ninguna manera son limitantes.

Formulaciones adecuadas para administración oral pueden consistir de (a) soluciones líquidas, tales como una cantidad efectiva del compuesto disuelto en diluyentes tales como agua, salino o jugo de naranja, (b) cápsulas, saquitos o tabletas, cada una que contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo, como sólidos o gránulos, (c) suspensiones en un liquido apropiado, y (d) emulsiones convenientes. Formas de tabletas pueden incluir uno o más de lactosa, manitol, almidón de maíz, almidón de papa, celulosa microcristalina, acacia, gelatina, dióxido de silicio coloidal, croscarmelosa sodio, talco, estearato de magnesio, ácido esteárico y otros excipientes, colorantes, diluyentes, agentes amortiguadores, agentes humectantes, conservadores, agentes saborizantes y excipientes farmacológicos compatibles. Formas de pastillas pueden comprender el ingrediente activo en un sabor, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto, así como pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia, emulsiones, geles y semejantes que contienen además del ingrediente activo, los excipientes como se conoce en la técnica.

Ejemplos de adecuados portadores, excipientes y diluyentes incluyen pero no están limitados a lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, acacia, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinil pirrolidona, celulosa, agua, solución salina, jarabe, metilcelulosa, metil- y propilhidroxibenzoatos, talco, estearato de magnesio y aceite mineral. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes emulsificantes, y agentes de suspensión, agentes conservadores, agentes endulzantes o agentes sabori zantes .

Formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas y no acuosas, de inyección estériles isotónicas, gue pueden contener antioxidantes, amortiguadores, · bacterioestáticos y solutos que hacen a la formulación compatible con la sangre del recipiente pretendido, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservadores. -Las formulaciones pueden presentarse en recipientes sellados de dosis unitarias o múltiples dosis, tales como ampolletas y frasquitos, y pueden almacenarse en una condición secada por congelamiento ( liofilizada) gue sólo requiere la adición del excipiente liquido estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes de uso. Soluciones y suspensiones de inyecciones extemporáneas pueden prepararse a partir de polvos estériles, gránulos y tabletas del tipo previamente descrito. Se prefieren formulaciones inyectables.

En algunas modalidades, la composición se formula para tener un intervalo de pH de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 9.0, incluyendo por ejemplo intervalos de pH de cualquiera de aproximadamente 5.0 a¦ aproximadamente 8.0, aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5, y aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.0. En algunas modalidades, el pH de la composición se formula a no menos que de aproximadamente 6, incluyendo por ejemplo no menos que de aproximadamente cualquiera de 6.5, 7, o 8 (tal como aproximadamente 8). La composición también puede hacerse isotónica con sangre por la adición de un modificador de tonicidad conveniente tal como glicerol .

Método para, utilizar composiciones de nanopartículas libres de priones También se proporcionan métodos para utilizar las composiciones, libres de priones aquí descritas. Por ejemplo, en algunas modalidades, se proporciona un método para administrar una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua, en donde la composición está sustancialmente libre de una proteína prión. En algunas modalidades, se proporciona un método para tratar una enfermedad (tal como cáncer) , que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua, en donde la composición está sustancialmente libre de una proteína prión.

En algunas modalidades, se proporciona un método para administrar una composición, que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la albúmina en la composición se obtuvo por un método que comprende un proceso de eliminación de priones, el proceso de eliminación de priones comprende poner en contacto una composición inicial de albúmina con un ligando capaz de enlazar a una proteina prión. En algunas modalidades, el proceso de eliminación de priones además comprende retirar el ligando y proteínas enlazadas al mismo de la composición de albúmina. En algunas modalidades, se proporciona un método para tratar una .enfermedad (tal como cáncer) en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva ¦ de composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la albúmina' en. la composición se obtiene por un método que comprende un proceso de eliminación de priones, el proceso de eliminación de priones comprende poner en contacto una composición inicial de albúmina con un ligando capaz de enlazar a una proteína prión.

En algunas modalidades, el individuo tiene vCJD.

En algunas modalidades, el individuo ya ha estado infectado con una proteína prión. En algunas modalidades, el individuo se sospecha que tiene vCJD o está infectado con una proteína prión. En algunas modalidades, el individuo es un portador asintomático de una proteína prión. En algunas modalidades, el individuo ha recibido cuando menos una vez transfusión de sangre. En algunas modalidades, el individuo tiene cuando menos 60 años de edad, tal como al menos aproximadamente 65, 70, o 75 años de edad. En algunas modalidades, el individuo está inmuno comprometido. En algunas modalidades, el individuo es un paciente de cáncer.

La expresión "cantidad efectiva" empleada aqui se refiere a una cantidad de un compuesto o composición suficiente para tratar un desorden, condición o enfermedad especificados tales como mejorar, paliar, reducir y/o retrasar uno o más de sus síntomas. Con referencia a cánceres u otra proliferación celular indeseada, una cantidad efectiva comprende una cantidad suficiente para provocar que un tumor se encoja y/o disminuya la velocidad de crecimiento del tumor (tal como para suprimir el crecimiento de tumor) . En algunas modalidades, una cantidad efectiva es una cantidad suficiente para retrasar el desarrollo. En algunas modalidades, una cantidad efectiva es una cantidad suficiente para evitar ocurrencia y/o recurrencia. Una cantidad efectiva puede suministrarse en una o más administraciones.

Cánceres a tratar por composiciones aquí descritas (tal como una composición que comprende un agente antineoplástico tal como taxano, rapamicina, y 17-AAG) incluyen pero no están limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Ejemplos de cánceres que pueden ser tratados por las composiciones aquí descritas, incluyen pero no están limitados a cáncer de células escamosas, cáncer pulmonar (incluyendo cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, incluyendo NSCLC escamoso) , cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular , cáncer gástrico o estomacal (incluyendo cáncer gastrointestinal), cáncer pancreático (tal como cáncer pancreático avanzado) , glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado (tal como carcinoma de hepatocelular), cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, melanoma, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñon o renal, cáncer de hígado, cáncer dé próstata (tal como cáncer de próstata avanzado) , cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorectal, cáncer rectal, sarcoma de tejido suave, sarcoma de Kaposi, linfoma de células B (incluyendo linfoma no Hodgkin de bajo grado/folicular (NHL) , linfocítico pequeño (SL = Small Lymphocytic) NHL, NHL de grado intermedio/folicular, NHL difuso de grado intermedio, NHL inmunoblástico de alto grado, NHL linfoblástico de alto grado, NHL de células no hendidas pequeñas de alto grado, NHL de enfermedad voluminosa, linfoma de células de manto, linfoma relacionada con SIDA (AIDS), y macroglobulinemia de Waldenstrom) , leucemia linfocítica crónica (CLL = Chronic Lymphocytic Leukemia) , leucemia linfoblástica aguda (ALL = Acute Lymphoblastic Leukemia) ,' mieloma, leucemia de células Pilosas, leucemia mieloblástica crónica, y desorden linfoproliferativo-post-transplante (PTLD = Post-Transplant Lymphoproliferative Disorder) , asi como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores del cerebro), y síndrome de Meigs . En algunas modalidades, se proporciona un método para tratar cáncer metastásico (esto es, cáncer .con metástasis del tumor primario) . En algunas modalidades, se proporciona un método para reducir proliferación celular y/o migración celular. En algunas modalidades, se proporciona un método para tratar hiperplasia.

En algunas modalidades, se proporcionan métodos para tratar cáncer en una o varias etapas avanzadas. En algunas modalidades, se proporcionan métodos para tratar cáncer de mama (gue puede ser HER2 positivo o HER2 negativo) , incluyendo, por ejemplo, cáncer de mama avanzada, cáncer de mama etapa IV, cáncer de mama localmente avanzado, y cáncer de mama metastásico. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pulmonar, incluyendo, por ejemplo cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCLC = Non-Small Cell Lung Cáncer) (NSCLC, tal como NSCLC avanzado) , cáncer pulmonar de células pequeñas (SCLC = Small Cell Lung Cáncer) (SCLC, tal como SCLC avanzado) , y malignidad de tumor sólido avanzado en el pulmón. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de ovarios, cáncer de cabeza y cuello, malignidades gástricas, melanoma .(incluyendo melanoma metastásico) , . cáncer colorectal, cáncer pancreático, y tumores sólidos (tales como tumores sólidos avanzados) . En algunas modalidades, el cáncer es cualquiera de (y en algunas modalidades seleccionadas del grupo que consiste de) cáncer de mama, cáncer colorectal, cáncer rectal, cáncer pulmonar de células no pequeñas, linfoma de no-Hodgkins (NHL = Non-Hodgkins Lymphoma) , cáncer de célula renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer pancreático, sarcoma de tejido suave, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovarios, mesotelioma, gliomas, glioblastomas , neuroblastomas , y mieloma múltiple. En algunas modalidades, el cáncer es un tumor sólido.

Individuos adecuados para recibir estas composiciones, dependen de la naturaleza del agente farmacéutico deficientemente soluble en agua, así como la enfermedad/condición/desorden a tratar y/o evitar. De acuerdo con esto, el término individual incluye cualquiera de vertebrados, mamíferos, y humanos. En algunas modalidades, el individuo es un mamífero, incluyendo, pero no limitado a, humano, bovino, equino, felino, canino, roedor o primate. En algunas modalidades, el individuo es un humano.

La dosis de la composición de la invención administrada a un individuo (tal como un humano) variará con la composición particular, el método de administración y la enfermedad particular a tratar. La dosis deberá ser suficiente para efectuar una respuesta deseable, tal como una respuesta terapéutica o profiláctica contra una enfermedad particular. Por ejemplo, la dosis de paclitaxel en la composición puede estar en el intervalo de 100-400 mg/m2 cuando se. suministra en un programa de 3 semanas, o 50-250 mg/m2 cuando se suministra en un programa semanal. Además, si se suministra en un régimen metronómico (por ejemplo, en forma diaria o unas cuantas veces por semana) , la dosis puede estar en el intervalo de aproximadamente 5-75 mg/m2.

Las composiciones aquí descritas . pueden administrarse a un individuo (tal como un humano) por diversas rutas, incluyendo por ejemplo, intravenosa, intra-arterial, intrapulmonar, intraportal, intrahepática, oral, de inhalación, intravesicular, intramuscular, intra-traqueal, subcutánea, intraocular, intratecal, transmucosal, y transdérmica . Por ejemplo, la composición de la invención puede administrarse por inhalación para tratar condiciones del tracto respiratorio. La composición puede emplearse para tratar condiciones ' respiratorias tales como fibrosis pulmonar, bronqueolitis obliterans, cáncer pulmonar, carcinoma broncoalveolar, y semejantes.

En algunas modalidades, la administración de la composición se realiza en conjunto con un filtro de eliminación de priones.

También se proporcionan aquí métodos para reducir efectos secundarios asociados con la administración de la composición de nanoparticulas . Por ejemplo, la invención proporciona métodos para reducir diversos efectos secundarios asociados con la administración del agente farmacéutico deficientemente soluble en agua, incluyendo, pero no limitado a mielosupresión, neurotoxicidad, hipersensibilidad, inflamación, irritación venosa, flebitis, dolor, irritación de la piel,' neuropatía periférica, fiebre neutropénica, reacción anafiláctica, toxicidad hematológica, y toxicidad cerebral o neurológica, y sus combinaciones. En algunas modalidades, se proporciona un método para reducir reacciones de hipersensibilidad asociadas con administración del agente farmacéutico deficientemente soluble en agua, incluyendo por ejemplo, salpullido de la piel o erupción cutánea, ronchas, eritema, disnea, taquicardia, y otros.

Equipos y sistemas La invención también proporciona equipos para utilizar en los presentes métodos. Los equipos de la invención incluyen uno o más recipientes que comprenden las composiciones de nanoparticulas libres de priones, y en algunas modalidades, además comprenden instrucciones para ¦ utilizar de acuerdo con cualquiera de los métodos aquí descritos. El equipo además puede comprender una descripción de selección de un individuo adecuado o tratamiento. Instrucciones suministradas en los equipos de la invención típicamente son instrucciones escritas en una etiqueta o inserto de empaque (por ejemplo, una hoja de papel incluida en el equipo) , pero también son aceptables instrucciones legibles por máquina (por ejemplo, instrucciones que se transportan en un disco de almacenamiento magnético u óptico) .

Los equipos de la invención están en empaque conveniente. Embalaje o empaque conveniente incluye, pero no está limitado a, ampolletas, botellas, tarros, empaque flexible (por ejemplo, bolsas de plástico o Mylar selladas) , y semejantes. Los equipos pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales tales como amortiguadores e información interpretativa.

Las instrucciones referentes al uso de las composiciones de nanopartículas en general incluyen información respecto a dosis, programa de dosis, y ruta de administración para el tratamiento pretendido. Los recipientes pueden ser dosis unitarias, paquetes a granel (por ejemplo, paquetes de múltiples dosis) o dosis sub- unitarias. Por ejemplo, pueden proporcionarse equipos que contienen dosis suficientes del agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua (tal como agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua) como se describe aquí para proporcionar tratamiento efectivo de un individuo para un periodo prolongado, tal como cualquiera de una semana, 2 semanas, 3 semanas, 4' semanas, 6 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, o más. Los equipos también pueden incluir múltiples dosis unitarias del agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua y composiciones farmacéuticas e instrucciones para uso y empacadas en cantidades suficientes para almacenamiento y uso en farmacias, por ejemplo farmacias de hospitales y farmacias de formulación.

En algunas modalidades, se proporciona un equipo para retirar una proteina prión de una composición de nanoparticulas que comprende albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, que comprende un ligando capaz de enlazar una proteina prión. En algunas modalidades, el equipo además comprende un material de soporte. En algunas modalidades, el equipo además comprende una instrucción para utilizar el ligando para retirar priones de la composición de nanoparticulas.

También se proporcionan sistemas para llevar a cabo los métodos aquí descritos. Por ejemplo, en algunas modalidades, se proporciona un sistema para fabricar composición de nanoparticulas libre de priones, que comprende albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, el sistema comprende 1) un aparato para producir la composición de nanoparticulas; y 2) un aparato para retirar proteínas priones de la albúmina utilizada para producir la composición de nanoparticulas. En algunas modalidades, el aparato para retirar proteínas priones de la albúmina empleada para producir la composición de nanoparticulas se integra en el aparato para producir la composición de nanoparticulas. En algunas modalidades, el aparato para producir la composición de nanoparticulas se separa del aparato para retirar las proteínas priones de la albúmina utilizada para producir la composición de nanoparticulas.

En algunas modalidades, se proporciona un sistema para fabricar composición de nanoparticulas libre de priones que comprende albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, el sistema comprende 1) un aparato para producir la composición de nanoparticulas; y 2) un aparato para retirar' proteínas priones (por ejemplo de una composición intermedia generada durante la elaboración de las nanoparticulas o de las composiciones de nanoparticulas generadas) . En algunas modalidades, el aparato para retirar proteínas priones se integra en el aparato para producir la composición de nanoparticulas. En algunas modalidades, el aparato para producir la composición de nanoparticulas se separa del aparato para retirar las proteínas priones.

Aquellos con destreza en la técnica reconocerán que son posibles varias modalidades dentro del alcance y espíritu de esta invención.

Todas las referencias, incluyendo publicaciones, solicitudes de patentes, y patentes,' aquí citadas incorporan de esta manera por referencia en la misma medi como si cada referencia se indicara en forma individual específica como incorporada por referencia y se establéele en su totalidad aquí.

Modalidades preferidas de esta invención se describen aquí, incluyendo el mejor modo conocidos por los inventores para llevar a cabo la invención. Modalidades de estas modalidades preferidas pueden ser aparentes para aquellos con destreza ordinaria en la técnica ante lectura de la descripción anterior. Los inventores esperan que las personas con destreza empleen estas modalidades como sea apropiado, y los inventores pretenden que la invención se practique de otra forma como se describe específicamente aquí. De acuerdo con esto, esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia descrita en las reivindicaciones aquí agregadas como se permite por la ley aplicable. Aún más, cualquier combinación de los elementos anteriormente descritos en todas sus modalidades posibles se abarca por la invención a menos que se indique de otra forma aquí o de otra forma sea contraindicado claramente por el contexto .

Modalidades ejemplares de la presente solicitud En un aspecto, se proporciona una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la composición está substancialmente libre de una proteina prión. En algunas modalidades, la composición tiene una infectividad de priones menor que aproximadamente 100 fg/ml. En algunas modalidades, la composición es cualquiera de las composiciones anteriormente descritas, en donde la composición tiene una infectividad de priones menor que aproximadamente 10 IU-ic/ml. En algunas modalidades, la composición es cualquiera de las composiciones anteriormente descritas, en donde la composición no muestra la presencia de una proteina prión con base en un ensayo de amplificación cíclica por plegamiento incorrecto de proteínas (PMCA = Protein Misfolding Cyclic Amplification) o con base en un ensayo IPCR. En algunas modalidades, la composición es cualquiera de las composiciones anteriormente descritas, que además comprende una cantidad en trazas de un ligando capaz de enlazar con una proteína prión. En algunas modalidades, la composición es cualquiera de las composiciones anteriormente descritas, además comprende uña cantidad en trazas de un material de soporte.

En otro aspecto, se proporciona una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un. agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, en donde la albúmina en la composición se obtiene por un método que comprende un proceso de eliminación de priones, el proceso de eliminación de priones comprende poner en contacto una composición inicial de albúmina con un ligando capaz de enlazar una proteina prión. En algunas modalidades, el proceso de eliminación de priones además comprende eliminar de la albúmina y composición, el ligando y proteínas enlazadas al mismo. En algunas modalidades, el ligando es un péptido. En algunas modalidades, el ligando es un compuesto basado en triazina.

En otro aspecto, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, el método comprende: a) retirar una proteína prión de una composición inicial de albúmina; b) someter a una condición de alta cizalla una mezcla que comprende una solución que comprende la albúmina retirada de priones y una fase orgánica que comprende el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua disperso en un solvente orgánico. En algunas modalidades, la etapa a)' comprende: 1) poner en contacto la solución inicial de albúmina con un ligando capaz de enlazar a una proteina prión. En algunas modalidades, la etapa a) además comprende: 2) retirar el ligando y proteínas enlazadas al mismo de la solución de albúmina. En algunas modalidades, el método es cualquiera de los métodos anteriormente descritos, que además comprende retirar el solvente orgánico de la mezcla. En algunas modalidades, la eliminación del solvente orgánico es por evaporación. En algunas modalidades, el método es cualquiera de los métodos anteriormente descritos, en donde el ligando es un péptido. En algunas modalidades, el método es cualquiera de los métodos anteriormente descritos, en donde el ligando es un compuesto basado en triazina. En algunas modalidades, el método es cualquiera de los métodos anteriormente descritos, en donde la composición inicial de albúmina es un producto derivado de la sangre.

En otro aspecto, se proporciona un método para producir una composición que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, que comprende: a) someter una mezcla que comprende una fase orgánica que comprende el agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua y una solución de albúmina a una condición de alta cizalla, y b) retirar una proteína prión de la mezcla. En algunas modalidades, la etapa b) comprende: 1) poner en contacto la mezcla con un ligando capaz de enlazar a una proteina prión. En algunas modalidades, la etapa b) además comprende: 2) retirar de la mezcla el ligando y proteínas enlazadas al mismo. En algunas modalidades, el ligando es un péptido. En algunas modalidades, el ligando es un compuesto basado en triazina.

También se proporcionan composiciones producidas por un método de conformidad con cualquiera de las , reivindicaciones 11-23. También se proporcionan los usos de cualquiera de las · composiciones anteriormente descritas para tratar una enfermedad, tal como cáncer.

En otro aspecto, se proporciona un método para retirar una proteína prión de una composición que se sospecha contiene una proteína prión que comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, que comprende: a) poner en contacto la composición con un ligando capaz de enlazar a una proteína prión, b) retirar de la composición el ligando de proteínas enlazadas al mismo. En algunas modalidades, el ligando es un péptido. En algunas modalidades, el ligando es un compuesto basado en triazina. También se proporcionan composiciones que se obtienen después del método.

En otro aspecto, se proporciona una composición que ¦ comprende nanopartículas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo substancialmente insoluble en agua, además comprende un ligando capaz de enlazar una proteina prión. En algunas modalidades, el ligando es un péptido. En algunas modalidades, el ligando es un compuesto basado en triazina.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no para limitar, la invención. Se entiende que los ejemplos aquí descritos son para propósitos ilustrativos solamente y que diversas modificaciones o cambios a la luz de la misma se sugerirán a personas con destreza en la técnica y habrán de incluirse dentro del espíritu y alcance de esta solicitud.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Desarrollo de un adsorbente de afinidad para eliminar una proteina prión de preparaciones de albiómina Este estudio tamiza un panel de cuatro resinas de ligandos de priones al someter el panel ' de cuatro resinas a dos preparaciones de albúmina comercialmente disponibles diferentes (que contienen 20% p/v o 25% p/v de albúmina) , modificadas con un homogeneizado de cerebro de hámster con prurito lumbar o tembladera (scrapie) en dos concentraciones diferentes (0.01% o 0.005%). El panel de cuatro resinas se identificó previamente por PRDT (Pathogen Removal and Diagnostic Technologies Inc; ProMetic Biosciences Ltd. , Cambridge, UK) como buenos enlazadores de priones en la presencia de albúmina al 25%. La selección de una resina óptima puede optimizar la incorporación de una etapa de reducción de priones en la producción de nanoparticulas de albúmina .

Metodología Equipos de Aislamiento de Seis Proteínas para Identificación de Sorbente (PIKSI™, ProMetic Biosciences Ltd) se empacaron con doce columnas (a aproximadamente 0.5 mL) de cada una de las cuatro resinas PRDT y la resina de control (Toyopearl Amino AMN31) . Cada resina se probó con soluciones que contienen 20% y 25% de albúmina modificadas con homogeneizado de cerebro de hámster de prurito lumbar o tembladera (scrapie) al 0.01% o 0.005% (SBH = Scrapie Hámster Brain Homogenate) en un formato en serie de tres columnas en un esfuerzo por evaluar la capacidad de enlace de cada resina a proteínas prión. La comparación del desempeño de resina se basó en enlace de proteína prión como se determina por transferencia Western y densitometría . Perfil de enlace total de proteínas se determina por geles SDS-PAGE. Las proteínas ligadas se desprendieron de las resinas tanto para enlace de proteína prión como detección de enlace de proteína total. Enlace de albúmina se determina utilizando espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000 para medir a'bsorbancia a 280 nm. Las señales observadas en las transferencias Western y geles SDS-PAGE corresponden a la fracción ligada de proteína prión y proteína total, respectivamente.

Las preparaciones de albúmina comerciales empleadas en esta invención fueron Albúmina (Humana) U.S.P. Human Albumin Grifols® 20%, Lote No. IBAB8MJ001, y Albúmina (Humana), USP, solución a 25% Baxter, Lote No. LA06D04AA.

Resultados Transferencia Western y SDS-PAGE Los resultados obtenidos muestran que todas las cuatro resinas ligadas con PrPsc modificado en soluciones de albúmina humana al 20% o 25%. La intensidad de señal PrPsc en transferencia Western (Figuras 1-3) sugiere que el enlace de priones fue el más fuerte para DVR, seguido por las resinas YVHEA, SYA, y D . La resina de control, AMN31, tuvo una fuerte señal esperada. El nivel de señal obtenida al utilizar la resina DVR sugiere que altas concentraciones de albúmina no interfieren con enlace de prión.

No se observó señal detectable en las columnas segunda y tercera cuando se utiliza DVR (Figura 1) a las diversas condiciones' probadas, aún cuando se probaron más largos tiempos de exposición, que indican que todo PrPsc detectable se captura por la primera columna DVR.

Intensidad de señal fue más débil para las otras resinas en la primera columna, con detección de proteína prión en la segunda columna de la serie (Figuras 2 y 3) , sugiriendo una interferencia posible de albúmina a enlace de proteina prión. Todos los tres ligandos no mostraron señal de priones en la tercera columna, indicando que las resinas son capaces de retirar selectivamente priones de las soluciones de albúmina modificadas con SBH. La concentración de PrPsc en cerebro de hámster fue de aproximadamente 50 pg/g, equivalente a aproximadamente 5 ng/mL de PrPsc en SBH al 0.01%, modificada en 250 mg/mL de solución de albúmina, generando un exceso de 50,000,000 veces de albúmina.

El patrón total de proteina que se observa en los geles SDS-PAGE teñidos con Coomassie (Figuras 1 a 3) muestra que DVR tiene un nivel mucho menor de enlace de proteina total que las resinas de enlace de priones restantes, que se considera una ventaja, a pesar del hecho de que la mayoría de ' las bandas observadas en el gel de proteína total provinieron de la modificación de homogeneizado de cerebro. Como se espera, la banda de proteína visible en el gel DVR tiene un peso molecular aparente similar a la albúmina (66.5 KDa) .

Densi tometría La eliminación de priones también se estimó en forma indirecta al calcular la proporción de señal densitométrica de PrPsc ligado a la resina contra la señal presente en las soluciones de albúmina modificadas con SBH. La capacidad de la resina DVR para ligar priones fue comparable con la resina de control positivo, adsorbiendo aproximadamente todos los PrPsc disponibles en la primera columna. Utilizando dosis infecciosas como la medida para enlace de priones, la- columna de DVR de 0.5 mL fue capaz de retirar priones en las soluciones de albúmina modificadas con SBH al 10 mL, que es equivalente a aproximadamente 106 ID50, considerando que 0.1% SBH contiene aproximadamente 106 ID5o/mL. De manera similar a lo que se observó en las transferencias Western, DVR tuvo el mejor desempeño en enlace de priones que YVHEA, D4, y SYA. Todas las tres resinas requirieron que la segunda columna de cada serie ligara adicionalmente cualquier proteína prión detectable presente en las soluciones de albúmina modificadas con SBH.

Enlace de Albúmina La concentración de albúmina se determinó utilizando espectrofotómétro NanoDrop® ND-1000 a una absorbancia de 280 nm para cuantificación de proteínas. ' Cada flujo pasante se midió para la concentración de albúmina después de pasar las soluciones de albúmina modificadas con SBH a través de cada una de las cuatro resinas (DVR, YVHEA, SYA, y D4), y la resina de control (AMN31) . La concentración de proteína de las soluciones de albúmina comerciales a 20% y 25% en la ausencia o presencia de modificaciones SBH de 0.01% o 0.005%, se midió antes de ser circulada a través de las columnas de resina. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Medición de concentración de albúmina en soluciones de albúmina comerciales (20% p/v o 25% p/v) modificadas con o sin homogeneizado de cerebro de hámster con prurito lumbar o tembladera 0.01% y 0.005%.

ConcentraConcentración Promeción medida dio (%) medida (%) (mg/mL) 20% de 24.8 248.0 albúmina 20% de 24.7 247.1 albúmina+ 24.6 0.01% modif. 20% de 24.3 243.3 albúmina+ 0.005% modif. 25% de 26.8 268.1 albúmina 25% de 28.3 282.5 albúmina+ 27.6 0.01% modif. 25% de 27.8 278.3 albúmina+ 0.005% modif.

Las concentraciones de las soluciones de albúmina comerciales se midieron superiores al valor comercialmente etiquetado, en especial para la preparación que contiene la solución de albúmina al 20% p/v. Sin embargo, ya que el estudio trató con valores comparativos, esto no fue de consideración. El promedio de tres valores se obtuvo, y la cantidad de la modificación se considera despreciable cuando se compara con la cantidad de albúmina presente en las soluciones en una concentración de proteina determinada. La concentración de albúmina se obtuvo después de hacer circular soluciones de albúmina modificadas con SBH a través de las resinas como se ilustra en las Tablas 4 y 5.

Tabla 4. Medición de concentración de albúmina después de hacer circular solución de albúmina comercial (20% p/v) modificada con o sin homogeneizado de cerebro de hámster de prurito lumbar o tembladera 0.01% y 0.005% a través de diferentes columnas de resina. ND = no detectado.

Concentración Pérdida de albúmina Concentración Pérdida de medida (mg/mL) albúmina (%) 0.01% modif. 260.4 ND DVR 0.005% modif. 260.4 ND 0.01% modif. 264.3 ND YVHEA 0.005% modif. 259.5 ND 0.01% modif. 245.5 0.2 SYA 0.005% modif. 241.7 1.7 0.01% modif. 263.0 ND D4 0.005% modif. 265.8 ND 0.01% modif. 249.8 ND AMN31 0.005% modif. 246.9 ND Tabla 5. Medición de concentración de albúmina después de hacer circular solución de albúmina comercial (25% p/v) modificada con o sin homogeneizado de cerebro de hámster con prurito lumbar o tembladera 0.01% y 0.005% a través de cuatro diferentes columnas de resina. ND = no detectado.

Concentración Pérdida de medida albúmina (mg/mL) (%) 0.01% modif. 268.8 2.6 DVR 0.005% modif. 284.2 ND 0.01% modif. 285.7 ND ' YVHEA 0.005% modif. 294.2 ND. 0.01% modif. 280.5 ND SYA 0.005% modif. 262.9 4.7 0.01% modif. 284.0 ND D4 0.005% modif. 261.1 5.4 0.01% modif. 272.4 1.3 AMN31 0.005% modif. 282.4 ND Ninguna de las resinas probadas mostró una pérdida significante de albúmina. De hecho, no se detectó pérdida para la mayoría de las condiciones. Los valores encontrados indican una variación de aproximadamente ± 5%. Los datos sugieren que la pérdida de albúmina no es probablemente un factor para seleccionar una de las resinas a esta escala dentro del intervalo de las condiciones probadas.

Conclusiones Con base en los resultados obtenidos, entre las cuatro resinas probadas, DVR es la mejor resina para retirar priones de soluciones de albúmina comerciales. La resina fue capaz de retirar alrededor de 106 ID50 en una columna de 0.5-mL. Este valor es similar a aquellos obtenidos en otras pruebas anteriores. Hubo poca pérdida de albúmina detectada en la proporción probada con 20 o 25% de albúmina/resina de 20. El enlace de albúmina deberá ser menor a las condiciones de proceso, ya que esta proporción es probable que aumente. Ejemplo 2 : Estudio de Factibilidad para Eliminación de Priones de Suspensiones Formuladas que Contienen Paclitaxel y Solución de Albúmina Humana La aplicación de la tecnología para la eliminación de priones en la composición de nanopartículas se evaluó utilizando suspensiones formuladas que contienen paclitaxel (por ejemplo, Abraxane™) y utilizando solución de albúmina humana que contiene diversos porcentajes de albúmina (% p/v) .

Condiciones Experimentales Sistemas de Estudio Se evaluaron suspensiones formuladas para Abraxane™ y formulación de azúcar-paclitaxel . Suspensión formulada ( FS = Formulated Suspensión) para Abraxane™ se formuló con suspensión post-evaporada (PE) que se obtiene de la producción y solución de albúmina humana (25%, Baxter, Deerfield, IL) , que contiene aproximadamente 7 mg/mL de paclitaxel y 56 mg/mL de albúmina humana. Suspensión Formulada (FS) para formulación de azúcar-paclitaxel se formula con suspensión post-evaporada (PE) que se obtiene de la producción, solución de albúmina humana (25%, Baxter) , sacarosa, cloruro de sodio y dihidrato edetato disodio, que. contiene aproximadamente 7 mg/ml de paclitaxel, 56 mg/ml de albúmina humana; 32 mg/ml de sacarosa, 8.4 mg/ml de NaCl, y 0.07 mg/ml de EDTA (ácido etilendiamintetraacético) .

Soluciones de Albúmina Humana en 25%, 20%, y 5% también se evaluaron. La solución de albúmina humana en 25% o 250 mg/ml se obtiene de Baxter; la solución de albúmina humana en 20% o 200 mg/ml (por ejemplo, Grifols®) se obtiene de Grifols Biologicals, Inc. (Los Angeles, CA) . Solución de albúmina humana 5% se elabora por dilución de albúmina humana al 25% (Baxter) con agua estéril para inyección.

Columnas para eliminación de priones Las columnas para eliminación de priones (1-ml) empleadas en este estudio fueron columnas de equipo de aislamiento de proteínas para identificación de sorbente (PIKSI® = Protein isolation Kit for Sorbent Identification) comercialmente disponibles, que contienen resina Toyopearl Amino 650CU (muestra AMN31) suministrada por Pro etic Biosciences, Ltd (Cambridge, UK) .

Condiciones de Flujo Pasante Para el estudio en la suspensión de formulación, el volumen de flujo pasante total fue aproximadamente 500 mL, que fue 500 veces el volumen de columna (1-ml) . El gasto de flujo fue aproximadamente 0.5 ml/min. El tiempo de flujo pasante total fue mayor a 16 horas. Se tomaron muestras cada dos horas. No se observó taponamiento de la columna.

Para el estudio en solución de albúmina, el volumen de flujo pasante total fue al menos 100 mL, que fue 100 veces el volumen de columna (1-ml). El gasto de flujo fue aproximadamente 0.5 ml/min. El tiempo de flujo pasante total fue mayor que 3 horas. Se tomaron muestras cada hora. No se observó obturación de la columna.

Resultados y Discusión Los resultados del estudio de factibilidad de eliminación de priones en la suspensión formulada se resumen en la Tabla 6 y la Tabla 7. Los resultados de pruebas físicas y químicas para la suspensión formulada para Abraxane™ no muestran diferencias significantes entre la suspensión pre y post columna, en términos de tamaño de partículas, pH, ensayo de paclitaxel e impurezas, ensayo de albúmina humana, y composición de albúmina humana. Igualmente, los resultados de pruebas físicas y químicas para la suspensión formulada para formulación de azúcar-paclitaxel no muestran diferencias significantes entre la suspensión pre y post columna, en términos de tamaño de partículas, pH, ensayo de paclitaxel e impurezas, ensayo de albúmina humana, composición de albúmina humana, sacarosa y EDTA.

Tabla 6 - Estudio de Factibilidad de Eliminación de Priones de Suspensión Formulada con Abraxane™.

Propiedades físicas y I.D. de Muestra químicas Pre- Post columna columna #1 #2 #3 Promedio 131 132 132 133 Tamaño de <5% 82 86 85 86 partículas <95% 193 190 191 192 (nm) <99.9% 254 250 251 252 PH 7.0 7.0 7.1 7.0 Paclitaxel (mg/mL) 6.9 6.9 6.9 6.8 ComposiPolímero 3.99 3.86 3.93 3.95 ción de Oligómero 1.32 1.36 1.32 1.34 albúmina Dímero 5.95 5.96 6.00 5.98 humana (%) Monómero 88.29 88.37 88.24 88.27 Albúmina humana total 55 56 56 56 (mg/mL) Impureza 7-Epi 0.08 0.08 NA NA (%) Total 0.25 0.25 NA NA Tabla 6 (continúa) Propiedades físicas y I.D. de Muestra químicas Post columna #4 #5 #6 #7 Promedio 133 133 131 130 Tamaño de <5% 85 87 84 82 partículas <95% 192 191 191 190 (nm) <99.9% 253 250 251 250 pH 7.0 7.0 7.0 7.0 Paclitaxel (mg/mL) 6.8 6.8 6.8 6.8 Composición Polímero 3.95 3.92 3.88 3.76 de albúmina Oligómero 1.31 1.32 1.34 1.39 humana (%) Dímero 6.00 5.99 5.98 5.96 Monómero 88.27 88.28 88.29 88.38 Albúmina humana total 56 56 56 56 (mg/mL) Impureza (%) 7-Epi 0.09 NA NA 0.09 Total 0.26 NA NA 0.26 * NA: Datos no Disponibles.

Tabla 7 - Estudio de Factibilidad de Eliminación de Priones de Suspensión Formulada de Azúcar-EDTA-Paclitaxel Propiedades físicas y I.D. de Muestra químicas Pre- Post columna columna #1 #2 #3 Promedio 129 130 133 131 Tamaño de <5% 80 81 85 82 partícula <95% 191 192 193 193 (nm) <99.9% 252 253 253 254 pH 6.8 6.8 6.8 6.9 •Paclitaxel (mg/mL) 6.5 6.5 6.5 6.5 Composición Polímero 3.90 3.90 3.91 3.89 de albúmina Oligómero 1.92 1.89 1.92 1.90 humana (%) Dímero 6.14 6.11 6.11 6.10 Monómero 88.02 88.10 88.07 88.09 Albúmina humana total 55 55 54 54 (mg/mL) Impureza 7-Epi 0.08 0.08 NA NA (%) Total 0.25 0.25 NA NA Sacarosa (mg/mL) 31.8 31.8 NA NA EDTA (mg/mL) 0.071 0.071 NA .NA Tabla 7 (continúa) Propiedades físicas y I.D. de Muestra químicas Post columna #4 #5 #6 #7 Promedio 132 132 130 131 Tamaño de <5% 84 85 81 85 partícula <95% 192 191 . 192 191 (nm) <99.9% 253 251 253 250 pH 6.8 6.8 6.9 6.9 Paclitaxel (mg/mL) 6.5 6.6 6.6 6.5 Composición Polímero 3.91 3.93 ' 3.94 3.93 de albúmina Oligómero 1.91 1.89 1.44 1.41 humana (%) Dímero 6.10 6.09 6.09 6.10 Monómero 88.06 88.09 88.03 88.04 Albúmina humana total 55 55 54 54 (mg/mL) Impureza 7-Epi 0.08 NA NA 0.09 (%) Total 0.25 NA NA 0.26 Sacarosa (mg/mL) 31.6 NA NA 31.9 EDTA (mg/mL) 0.070 NA NA 0.070 * NA: Datos no Disponibles.

Los resultados del estudio de factibilidad de eliminación de priones en las soluciones de albúmina se resumen en la Tabla 6. No hubo diferencias significantes entre la solución de pre y post columna en términos de ensayo de albúmina humana y composición de albúmina humana.

Tabla 8 - Estudio de Factibilidad de Eliminación de Priones de Solución de Albúmina Humana HA (%) I.D. de Muestra Poli- Oligo- Dimero mero mero Lote 28203-37A Albúmina Pre columna 3.66 0.28 2.38 Humana al Post columna #1 3.60 0.25 2.41 25% Post columna #2 3.63 0.28 2.38 (Baxter) Post columna #3 3.64 0.24 2.41 Post columna #4 3.64 0.26 · 2.40 Lote 28203-37B Albúmina Pre columna 4.85 0.51 3.25 Humana al Post columna #1 4.78 0.49 3.25 20% Post columna #2 4.78 0.51 3.25 (Grifols) Post columna #3 4.86 0.51 3.25 Lote 28203-37C Albúmina Pre columna 3.66 0.27 2.32 Humana al Post columna #1 3.33 0.25 2.31 5% Post columna #2 3.48 0.27 2.30 (Baxter) Post columna #3 3.54 0.27 2.31 Post columna #4 3.50 0.27 2.31 Cont .

HA (%) Total de HA I.D. de Muestra onómero (mg/mL) Lote 28203-373 Albúmina Pre columna 93.69 248 Humana al Post columna #1 93.74 248 25% Post columna #2 93.71 250 (Baxter) Post columna #3 93.71 247 Post columna #4 93.70 248 Lote 28203-37B Albúmina Pre columna 91.39 199 Humana al Post columna #1 91.48 199 20% Post columna #2 91.45 200 (Grifols) Post columna #3 91.38 200 Lote 28203-37C Albúmina Pre columna 93.75 52 Humana al Post columna #1 94.10 51 5% Post columna #2 93.94 51 (Baxter) Post columna #3 93.89 51 Post columna #4 93.92 52 Este estudio demuestra que el tratamiento de columna de eliminación de priones no tiene impacto adverso en las propiedades físicas y químicas de solución de albúmina humana y suspensiones formuladas tanto para formulación de Abraxane™ como azúcar-paclitaxel .

E emplo 3 : Eliminación de TSE por Resina de Reducción de Priones para Albúmina al 20% En este estudio, se evaluó eliminación de TSE potencial por columna de resinas de reducción de priones (columna PRDT; ProMetic Biosciences, Ltd) en 20% (p/v) albúmina (Grifols®) . El material de partida para la etapa de proceso de eliminación de TSE se modificó con un aqente TSE modelo. La etapa de proceso se realizó en los Laboratorios VirusSure (Virusure Forschung und Entwicklung GmbH, Vienna, Austria) . Diversas fracciones se recolectaron durante el desempeño de la etapa de proceso, y la capacidad de eliminación de TSE del proceso se calcula con base en una determinación de niveles de agente TSE utilizando un ensayo de Transferencia Western para la detección de PrPsc.

Este estudio sigue y refiere a las siguientes guias, incluyendo 1) CPMP/BWP/268/95 (revisado en 1996), Nota Para Guia en Estudios de Validación de Virus: El Diseño, Contribución e Interpretación de Estudios que Validan la Inactivación y Eliminación de Virus; 2) CPMP/BWP/5136/03 Guia en la Investigación de Procesos de Fabricación para Productos Medicinales Derivados de Plasma Respecto al Riesgo de vCJD; 3) Principios OECD de Buenas Prácticas de Laboratorio como se Establece en ENV/MC/CHE (98)17, revisado en 1997; 4) 21 CFR parte 58, Buena Práctica de Laboratorio (Good Laboratory Practice) , US FDA; 5) Directiva EU 2004/9/EG, Inspection und Uberprufung der Guten Laborpraxis (GLP) ; 6) Directiva EU 2004/ 10/EG, Anwendung der Grundsatze der guten Laborpraxis und zur Kontrolle ihrer Anwendung bei Versunchen mit chemischen Stoffen; 7) Austrian BGBI . II, 211. Verordnung, Chemikalien-GLP- Inspektionsverordnung, Jahrgang 2000; y 8) Austrian BGBI. II, 450. Verordnung, gute Laborpraxis 2006, Jahrgang 2006.

Materiales y Métodos Los siguientes artículos de prueba, reactivos y materiales se emplearon durante el curso de este estudio para la investigación de eliminación de TSE por las resinas de reducción de priones (columna PRDT) para albúmina al 20% (Grifols®) .

Albúmina Grifols® (humana) (solución USP al 20% (Lote: IBAB7GX001/TA09/0122) ) se empleó para una corrida modificada y prueba de interferencia.

Columna SepFast™ Desechable (Pro etic Biosciences Ltd. ) que contiene 5 mi de resina de eliminación de priones empacada en salino al 9% se emplea para la corrida del proceso.

Se prepararon diversos amortiguadores. Incluye lo siguiente: 1) NaCl 0.9% (9 g/1) se prepara como amortiguador de equilibrio para las resinas de reducción de priones; 2) Salino Amortiguado Tris (TBS = Tris Buffered Saline) se prepara como re-suspensión de la resina después de cromatografía; 3) NaCl 2 (116.88 g/1) se prepara como un amortiguador para regeneración de resina de reducción de priones; 4) Amortiguadores NaOH (0.1 M, 0.5M, y 1.0 M) se prepararon para ajustes de pH de las muestras de estudio modificadas e inactivación de intermediarios de proceso de material infeccioso; y 5) Amortiguadores HC1 (0.1 y 1.0 M) se prepararon para ajustes de pH de muestra de estudio modificada e intermediarios de proceso. 263 Prurito Lumbar o Tembladera (Scrapie) Prurito lumbar o tembladera (Scrapie) Adaptada de Hámster Cepa 263K (tratada con sarcosilo al 0.5%) se emplea en este estudio. La cepa 263K de prurito lumbar o tembladera adaptada de hámster proporciona las ventajas de altos títulos en los cerebros de los hámsters. Títulos típicos para un homogeneizado de cerebro al 10% están en el intervalo de 108-1010 ID5o' unidades por mi. La proteína PrPsc depositada por este agente es relativamente resistente a digestión con proteinasa K, permitiendo la posibilidad de distinguir entre la forma no asociada a la enfermedad de la proteína PrPc. La semilla cepa 263K de tembladera o prurito lumbar adaptado de hámster se suministra como un homogeneizado al 10% por el laboratorio de Dr. Robert Rohwer (Baltimore Research and Education Foundation, ail Stop 151-A, 10 North Greene Street, Baltimore, D 21201, USA) . Una fracción tratada con sarcosilo al 0.5% se elige para este experimento. Esta fracción se prepara a partir de un homogeneizado de cerebro crudo (del cual la fracción 263K microsomal/citosólica que se ha retirado) por tratamiento con sarcosilo al 0.5% seguido por centrifugación diferencial para retirar más 'grandes agregados, dejando sólo los fragmentos solubilizados con detergente en el sobrenadante. La fracción tratada con sarcosilo al 0.5% se preparó para imitar contaminación solubilizada por detergente (es decir como se encuentra en procesos que contienen detergente-solvente) y este tipo de fracción se ha empleado ampliamente en estudios de eliminación de priones para productos recombinantes y de plasma humano.

Ensayo de Transferencia Western para la Detección de PrPsc El ensayo de transferencia Western para la detección de PrPsc se emplea para la determinación semi-euantitativa a niveles de TSE (PrPsc) en las diversas muestras. El intervalo dinámico del ensayo de transferencia Western normalmente está en la región de 4-5 diluciones logio antes de que se pierda la señal, y de esta manera el ensayo es menos sensible que el bioensayo de hámster. Sin embargo, el ensayo de transferencia Western es una herramienta útil para estimar eliminación de priones por procesos de fabricación biofarmacéuticos .

En el ensayo de transferencia Western, la muestra primero se presentó a digestión con Proteinasa K para retirar la forma normal de la proteina, PrPc (todas las muestras de proceso se digirieron utilizando una concentración de Proteinasa K de 83 pg/ml) . Después de bloquear la reacción proteolitica, la muestra se mezcló con amortiguador SDS y fue hervida para desnaturalizar el PrPsc de su forma agregada. Diluciones 0.5 logio de la muestra después se preparan y cargan en un gel SDS-PAGE junto con un marcador de peso molecular. Después de electroforesis, el gel fue transferido Western sobre una membrana PVDF seguido por bloqueo y sondeo con anticuerpos permitiendo la detección de la proteina PrPsc ligada con el anticuerpo 3F4. La cepa 263K de tembladera o prurito lumbar resulta en un patrón de banda · característico en la región de 25 - 33 KDa, que ayuda a confirmar la presencia de la proteína de PrPsc en muestras. El punto extremo del título de la muestra se define como la primera dilución en donde no se observa señal en la transferencia Western .

Cálculo de Factores de Reducción Factores de Reducción (RF) se calcularon como sigue : F=(VixTi) / (V2xT2) En donde: Vi y Ti son el volumen y título del material de partida respectivamente, y V2 y T2 son el volumen y título de la fracción de producto respectivamente.

En términos logarítmicos, esta ecuación puede expresarse como: Logi0[RF]= [Logio (Vi) +Logi0 (Ti) ] - [Logio (V2) +Log10 (T2) ] Factores de reducción se redondearon a 1 sitio decimal sólo después del cálculo final.

Prueba de Interferencia El material de partida se probó sin dilüir y seguido por una pre-dilución 1.0 logio en TBSA. Después de modificación con 263K a una concentración final equivalente a un titulo dentro de aproximadamente 2 logio del punto extremo del material Scrapie para modificación, las muestras de material de partida sin diluir y pre-diluidas se centrifugaron .a 15.558 x g por 60 minutos a temperatura ambiente. Después de centrifugación el sobrenadante se decanta cuidadosamente y los gránulos vuelven a suspender con TBSA en 1/10 del volumen de muestra centrifugado original (equivalente a sin concentración efectiva por muestra pre-diluida 1.0 logio y equivalente a una concentración de 10 veces para la muestra sin diluir) . Digestión con proteinasa K y transferencia Western después se realiza siguiendo el protocolo estándar. Las muestras de columna y regeneración se diluyeron 0.5 logio o probaron sin diluir respectivamente antes de análisis por transferencia Western (es decir sin centrifugación) .

Ajuste de pH Antes de dividir en alícuotas y almacenamiento a <-60°C, las muestras se verificaron de pH 6 - 8 (no se requirió ajuste de pH para ninguna de las muestras) .

Equipo Los siguientes ítems de equipo principal se emplearon para desempeño de este estudio. Gabinete de Seguridad de Riesgo Biológico Estéril Clase II, congeladores Sanyo & Angelantoni <-60°C, refrigeradores Angelantoni 2- 8°C y congeladores <-15°C, báscula (analítica) Sartorius o ern e impresora, termómetro electrónico . Hanna, medidor de pH Mettler Toledo, baños de agua Grant o Selecta, Cronómetro Oregon Laboratory, microcentrífuga Hettich, Celda de Electroforesis BioRad Criterion, Aparato de Transferencia BioRad Criterion, sistema de Cromatografía AKTA, Fuente de Energía Wealtec, Regulador Agfa Film, y columna Biotoolomics empacada con resina PRDT .

Flujo de Proceso El esquema de flujo de proceso junto con las muestras recolectadas se ilustra en la Figura 4. Los volúmenes de las muestras respectivas pueden encontrarse en la Tabla 9 en la sección de Resultados.

En preparación del flujo de proceso, el gabinete de seguridad de Flujo Laminar (LF- = Laminar Flow) puede limpiarse y activarse por al menos 10 a 15 minutos para equilibrar. El baño de agua se equilibró a 30 + 2°C y el material de partida se equilibró hasta que se alcanzó una temperatura de 29.5°C. La solución para adicionar solubilizada con Sarcosilo al 0.5% se descongeló en el mismo baño de agua y tan pronto como se descongeló, se colocó en hielo hasta utilizar. La columna PRDT se equilibró a temperatura ambiente (23.0 ± 5.0°C) durante la noche.

La tubería de entrada de columna (superior) se conectó a la salida de AKTA. La tubería de la salida de la columna (fondo) se alimentó a un recipiente de recolección apropiado (matraz o tubo de centrifuga desechable de 50 mi) . Toda tubería fue cebada con agua para inyección (WFI = Water for Injection) de manera tal que no se introdujeron burbujas de aire al sistema.

La columna primero se equilibró con 5 volúmenes de columna (CV = Column Volumes) de WFI, y después con 10 CV de Amortiguador de Equilibrio. El gasto de flujo objetivo pasante fue 2.0 + 0.1 mi por minuto.

Preparación de Muestra y Cromatografía de Resina para Reducción de Friones 50.7 mi del material de partida equilibrado se adicionó con 0.51 mi de homogeneizado 263K solubilizado con sarcosilo al 0.5%. El · pH después se verificó y se encuentra que está dentro del intervalo objetivo de 6.9-7.4. Subsecuentemente, una alícuota de 0.5 mi se retira (muestra SS ) y se divide en alícuotas y almacena a <-60°C.

La muestra adicionada después se aplicó a la columna PRDT equilibrada anterior a un gasto de flujo de 1.8 ± 0.1 mi por minuto y el flujo pasante se recolecta como las siguientes fracciones: Mues'bra ID Volumen Descripción de Mues'bra El 2.1 mi Eluato 1 (-0-2 mi) E2 3.2 mi Eluato 2 (-2-5 mi) E3 5.4 mi Eluato 3 (-5-10 mi) E4 16.1 mi Eluato 4 (-10-25 mi) E5 30.3 mi Eluato 5 (-25-44 mi) La recolección de El empezó una vez que la absorbancia alcanzara 80% de la deflexión a escala integra. Por cada corrida, la fracción de flujo pasante se recolectó (el volumen de cada muestra de Eluato recolectado se determina por pesado) . Después de cargar la solución de Albúmina adicionada, la columna se lava con 10.0 mi de Amortiguador de Equilibrio. La recolección de la muestra E5 se detiene una vez que la absorbancia ha caído por debajo de 80% de la deflexión a escala completa. Siguiendo el lavado con Amortiguador de Equilibrio, la columna se regenera utilizando >20.0 mi de NaCl 2M (muestra REG) , y después de regeneración, la resina se retira y resuspende en 5 mi de TBS (muestra COL) .

Resultados Muestras de Corridas Adicionadas La Tabla 9 a continuación cita las muestras que se recolectaron de la corrida adicionada junto con el volumen de cada muestra. Cuando el tamaño de muestra se determina por peso, entonces se considera una densidad de 1.0 g/ml para permitir un cálculo del volumen por cada muestra. Todas las muestras se almacenaron divididas en alícuotas a -60 C hasta análisis. Una reproducción explorada del perfil de cromatografía de la corrida adicionada se muestra en la Figura 5.

Tabla 9: Resumen de Recolección de Volúmenes Durante la Ejecución del Proceso Descripción de Código de Volumen Actual de Muestra Muestra Muestra Recolectada en el Punto de Recolección (mi) Material de SP0913-SSM 51.2 Partida Adicionado (adicionado tratado con Sarcosilo) Eluato 1: 0-2 SP0913-E1 2.1 mi Eluato 2: 2-5 SP0913-E2 3.2 mi Eluato 3: 5.10 SP0913-E3 5.4 mi Eluato 4: 10-25 SP0913-E4 16.1 mi Eluato 5: 25-44 SP0913-E5 30.3 mi Fracción de SP0913-Reg 27.5 regeneración Muestra de SP0913-Col 10.0 resina Resultados de Interferencia Para superar la interferencia, todas las muestras excepto las muestras de resina y regeneración se diluyeron por 1.0 logio con TBS que contiene BSA al 0.1% seguido por una centrifugación y una concentración de 1/10. La muestra sin diluir probada por interferencia a una concentración lOx exhibe fuerte interferencia. Para las muestras de regeneración, se preparó una dilución 0.5 logio antes de probar para reducir la concentración de NaCl . Para las muestras de resina, conforme la resina se resuspende en amortiguador TBS, estas muestras se probaron sin pre-dilución.

La dilución de la muestra requerida para superar interferencia con albúmina se realizó utilizando pre-dilución 1.0 LoglO con centrifugación y resuspensión en 1/10 simo del volumen original. Ver Figura 6.

Datos de Titulación de Priones y Cálculo de Factores de Reducción El cálculo de factores de reducción de priones para las corridas de proceso se muestra en la Tabla 10. La dilución de muestra empleada para superar interferencia también se ilustra en la Tabla 10.

Tabla 10: Resumen de Datos de Titulación de Muestra y Factores de Reducción de Priones Muestra DescripDiluTítulo Muestra Volumen ID ción de ción de volumen adiciomuestra Log punto de nal para extrerecolec proceínter mo -ción sado feren -cia SP0913- Material 0.0 2.5 51.2 mi 50.7 mi SSM inicial adicionado SP0913- Eluato 0.0 0.0 50.7 mi ?1 fracción¦ 1 SP0913- Eluato 0.0 1.0 50.7 mi E2 fracción 2 SP0913- Eluato 0.0 1.0 50.7 mi E3 fracción 3 SP0913- Eluato 0.0 1.5 50.7 mi E4 fracción 4 SP0913- Eluato 0.0 1.0 50.7 mi E5 fracción 5 SP0913- fracción 0.5 0.0 27.5 mi Reg de regeneración SP0913- Resina de 0.0 3.0 10.0 mi Col columna Tabla 10 (continua) Muestra Factor de Volumen de Volumen de ID Corrección muestras muestras para volumen antes de después de procesado ajuste de pH ajuste de pH SP0913- 0.99 SSM SP0913- - El SP0913- - E2 SP0913- - E3 SP0913- - E4 SP0913- - E5 SP0913- - Reg SP0913- - Col Cont .

Muestra ID Factor de Volumen Carga corrección para Log Total ajuste de pH SP0913-SSM - 1.7 4.205 SP0913-E1 - 1.7 < 1.705 SP0913-E2 - 1.7 2.705 SP0913-E3 - 1.7 2.705 SP0913-E4 - 1.7 3.205 SP0913-E5 - 1.7 2.705 SP0913-Reg - 1.4 < 1.939 SP0913-Col - 1.0 4.000 Factor de Muestra Muestra Descripción Titulo RF Reducción # ID de muestra Log 1: Muestra SP0913- Material 4.205 1 SSM inicial adicionado Muestra SP0913- Eluato 1.705 2 El Fracción 1 < 2.50 Comentarios : RF para eluato 1 respecto a material inicial adicionado Factor de Muestra Muestra Descripción Titulo RF Reducción # ID de muestra Log 2 : Muestra SP0913- Material 4.205 1 SSM inicial adicionado Muestra SP0913- Eluato 2.705 6 E5 Fracción 5 1.50 Comentarios : RF para eluato 5 respeto a material inicial adicionado * Factores de corrección se aplican en el cálculo de volumen log final. Los factores de corrección aplicables para cada muestra son los factores de corrección de la propia muestra respectiva junto con todos los factores de corrección para muestras citadas a continuación de esa muestra.

** Un volumen de 50 mi se empleó con el propósito de calcular el factor de reducción para cada muestra de eluato, para asegurar una. comparación directa con el volumen cargado en la columna .

Un factor de reducción de 2.5 logio respecto al material inicial adicionado se calcula para muestras El, que representan los primeros 2.0 mi que pasan sobre la columna PRDT. En las muestras E2 a E5, se observó una irrupción de PrPsc en la · fracción de flujo pasante (factor de reducción 1.5 logio para muestra E5) . No se detectó PrPsc en la muestra de regeneración y los equivalentes de PrPsc ligado a la resina PRDT se discuten con más detalle en la sección de cálculo de la capacidad de enlace de priones de la resina PRDT inferior.

Cálculo dé la Capacidad de Enlace de Priones de las Resinas de Reducción de Priones A fin de estimar la capacidad de enlace de las resinas de reducción de priones (resina PRDT) para proteínas priones infecciosas, los títulos observados en la prueba de transferencia Western se relacionaron a los títulos infecciosos. El ensayo de transferencia Western empleó un material de 263K de título conocido. Una serie de diluciones del material de referencia se prepara y prueba en el ensayo de transferencia Western. Después de trazar los títulos obtenidos contra los títulos respectivos observados en el bioensayo de hámster, un análisis de regresión lineal se realiza para estimar la relación entre los dos sistemas de prueba. La pendiente e intersección para la linea de regresión se calculan como 1.0667 y -4.5867, respectivamente. Los parámetros de regresión se emplearon para convertir titulos de transferencia Western en títulos infecciosos utilizando la siguiente fórmula: TÍtulO[Bioensayo]= (Título [TransferenciaWestern] +4.5867/ ( 1.0667 ) .

Una vez que el título infeccioso por mi se calcula, el total de priones ligados a la columna pudo determinarse. La capacidad de enlace de proteína prión calculada de la resina de reducción de priones se muestra en la Tabla 11 a continuación. La capacidad se determina utilizando la cantidad de PrPsc que se observa directamente ligado a la resina de reducción de priones (muestras Reg y Col) .

Tabla 11: Capacidad de Enlace de Priones de Resina de Reducción de Priones (Resina PRDT) Muestra Descripción Total de PrPsc Capaci ID de muestra PrPsc Infec-dad Albúmina adicionada (logio ) cioso de con solución de (logi0ID50 enlace adición solubilizada total) = por mi de sarcosilo Total (ID50/ PrPsc + mi) 4.1 SP0913- 50 mi de 42* 8.3 - SSM albúmina adicionado con 0.5 mi ' de una solución de adición solubilizada con sarcosilo 5.0 mi de Resina PRDT; 50 mi de muestra SP0912-SSM cargada (gasto de flujo objetivo: 1.8 ml/min) SP0912- Lavado de < 1.9 < 6.0 < 5.3 Reg sal NaCl 2M logio/ (volumen de mi muestra 25.1 mi) SP0912- Resina de 4.0 8.1 7.4 Col Columna logio/ (volumen de mi muestra 8.7 mi) #Total de PrPSc incluye correcciones para volumen de muestra asi como concentración/dilución antes de prueba.

* Carga total con base en un volumen final de 50 mi cargado en la columna PRDT * Con base en un tamaño de columna de 5.0 mi.

El enlace total de PrPsc a la resina PRDT que sigue a un lavado con sal 2 fue 7.4 logio IDso/ml. No se detectó PrPsc en las fracciones de lavado con sal por transferencia Western. Eliminación de PrPsc significante (> 2.5 logio) también se observó.

Cuando se realiza prueba de interferencia, se probó el material de partida sin diluir, con centrifugación y concentración de 10 veces. Esto se realizó para permitir una evaluación de la. posibilidad para concentrar las muestras y de esta manera lograr superiores factores de reducción.

Ejemplo 4: Eliminación de TSE por Resinas de Reducción de Priones para Albúmina al 25% En este estudio, se evaluó la eliminación de TSE potencial por las resinas de reducción de priones (columna PRDT) en albúmina al 25% (Baxter, Deerfield, IL) . Materiales y Métodos empleados fueron los mismos como se describe en el Ejemplo 3, excepto porque solución de Albúmina (Humana) al 25% USP de Baxter (Lote: LA07D051AB/TA09/0123) se emplea como el material de partida para la corrida adicionada y prueba de interferencia.

Flujo de Proceso El proceso a escala reducida se estableció y realizó en las instalaciones ViruSure. El esquema de flujo de proceso junto con las muestras recolectadas se ilustra en la Figura 7. Los volúmenes de las muestras respectivas pueden encontrarse en la Tabla 12 en la Sección de Resultados. Los parámetros y procedimientos empleados en preparación de flujo de proceso, incluyendo conexión de la columna y AKTA, el equilibrio de columna es el mismo como se describe en el Ejemplo 3.

Preparación de Muestra y Cromatografía de Resina para Reducción de Priones 50.1 mi de material inicial equilibrado se adiciona con 0.51 mi de homogeneizado 263K solubilizado con sarcosilo al 0.5%. El pH después se verifica y encuentra que está dentro del intervalo objetivo de 6.9-7.4 con HC1 al 0.1 M o NaOH al 0.5 . El pH del material de partida adicionado (6.85) está fuera del intervalo objetivo de 6.9-7.4 (ver Sección de Desviaciones) . Después de la adición de 65 µ?- de NaOH 0.1 M y 50µ1 de NaOH 1 M, el valor de pH permaneció sin cambio, de manera tal que se tomó la decisión de cargar el material de partida a este pH. Subsecuentemente, una alícuota de 0.5 mi se retira (SSM de muestra) y divide en alícuotas y almacena a <-60°C.

La muestra adicionada después se aplica a la columna equilibrada anterior PRDT a un gasto de flujo de 1.8 ± 0.1 mi por minuto, y el flujo pasante se recolecta como las siguientes fracciones: ID de Volumen Descripción de Muestra Muestra El 2.3 mi Eluato 1 (-0-2 mi) E2 3.3 mi Eluato 2 (-2-5 mi) E3 5.6 mi Eluato 3 (-5-10 mi) E4 16.1 mi Eluato 4 {-10-25 mi) E5 32.7 mi Eluato 5 (-25-44 mi) La recolección de El empezó una vez que la absorbancia alcanzara 80% de la deflexión de escala íntegra. Por cada corrida, la fracción de flujo pasante se recolectó (el volumen de cada muestra de Eluato recolectado se determinó al pesar) . Después de cargar la solución de albúmina para adicionar la columna se lavó con 10.0 mi de Amortiguador de Equilibrio. La recolección de la muestra E5 se detuvo una vez que la absorbancia cayó por debajo de 80% de la deflexión de escala completa. Siguiendo el lavado con Amortiguador de Equilibrio, la columna se regeneró utilizando >20.0 mi de NaCl 2M (muestra REG) , y después de regeneración, la resina se retira y resuspende en 5 mi de TBS (muestra COL) .

Resultados Muestras de Corridas de Adición La Tabla 12 a continuación cita las muestras que se recolectaron de la corrida de adición junto con el volumen de cada muestra. Cuando el tamaño de muestra se determina por peso, entonces se consideró una densidad de 1.0 g/ml para permitir un cálculo del volumen por cada muestra. Todas las muestras se almacenaron divididas en alícuotas a < -60°C hasta análisis. Una reproducción explorada o digitalizada de perfil de cromatografía de la corrida adicionada se ilustra en la Figura 8.

Tabla 12: Resumen de Recolección de Volúmenes durante la Corrida de Proceso.

Descripción Código de Volumen actual de de muestra muestra muestra obtenido en el punto de recolección (mi) Material de SP0912-SSM 50.6 inicio de adición (adición tratada con sarcosilo) Eluato 1: 0-2 SP0912-E1 2.3 mi Eluato 2: 2-5 SP0912-E2 3.3 mi Eluato 3: SP0912-E3 5.6 5.10 mi Eluato 4: 10- SP0912-E4 16.1 25 mi Eluato 5: 25- SP0912-E5 32.7 44 mi Fracción de SP0912-Reg 25.1 regeneración Muestra de SP0912-Col 8.7 resina Resultados de Interferencia Para superar la interferencia con albúmina, todas las muestras excepto las muestras de resina y regeneración se diluyeron por 1.0 logio con TBS que contiene BSA al 0.1% seguido por una centrifugación y concentración 1/10. La muestra sin diluir probada por interferencia a una concentración de 10 veces exhibió fuerte interferencia. Para las muestras de regeneración, una dilución 0.5 logio se prepara antes de probar para reducir la concentración de NaCl . Para las muestras de resina, conforme la resina se resuspende en amortiguador TBS, estas muestras se prueban sin pre-dilución .

La dilución de muestra requerida para superar interferencia se realizó utilizando pre-dilución 1.0 logio con centrifugación y resuspensión en l/10ésimo del volumen original. Ver Figura 9.

Datos de Titulación Previos y Cálculo de Factores de Reducción El cálculo de los fáctores de reducción previos para las corridas de proceso se ilustra en la Tabla 13. La dilución de la muestra empleada para superar interferencias también se muestra en la Tabla 13.

Tabla 13: Resumen de Datos de Titulación de Muestra • y Factores de Reducción de Priones Muestra DescripDiluTítulo Muestra Volumen ID ción de ción de volumen adiciomuestra Log punto de nal para extrerecolec proceinter mo -ción sado feren -cía SP0912- Material 0.0 2.0 50.6 mi 50.2 mi SSM inicial adicionado SP0912- Eluato 0.0 0.0 50.2 mi El fracción 1 SP0912- Eluato 0.0 0.5 50.2 mi E2 fracción 2 SP0912- Eluato 0.0 1.0 50.2 mi E3 fracción 3 SP0912- Eluato 0.0 1.0 50.2 mi E4 fracción 4 SP0912- Eluato 0.0 1.0 50.2 mi E5 fracción 5 SP0912- fracción 0.5 0.0 25.1 mi Reg de regeneración SP0912- Resina de 0.0 3.0 8.7 mi Col columna Tabla 13 (continua) Muestra Factor de Volumen de Volumen de ID Corrección muestras muestras para volumen antes de después de procesado ajuste de pH ajuste de pH SP0913- 0.99 50.6 mi 50.7 mi SSM SP0913r - El SP0913- - E2 SP0913- - E3 SP0913- - E4 SP0913- - E5 SP0913- - Reg SP0913- - Col Cont .

Muestra ID Factor de Volumen Carga corrección para Log Total ajuste de pH SP0913-SSM 1.00 1.7 3.702 SP0913-E1 - 1.7 < 1.701 SP0913-E2 - 1.7 2.201 SP0913-E3 - 1.7 2.701 SP0913-E4 - 1.7 2.701 SP0913-E5 - 1.7 2.701 SP0913-Reg - 1.4 < 1.900 SP0913-CO1 - 0.9 3.940 Factor de Muestra Muestra Descripción Titulo RF Reducción # ID de muestra Log 1: Muestra SP0912- · Material 3.702 1 SSM' inicial adicionado Muestra SP0912- Eluato 1.701 2 El Fracción 1 < 2.00 Comentarios : RF para eluato 1 respecto a material inicial adicionado Factor de Muestra Muestra Descripción Titulo RF Reducción # ID de muestra Log 2: Muestra SP0912- Material 3.702 1 SSM inicial adicionado Muestra SP0912- Eluato 2.701 6 E5 Fracción 5 1.00 Comentarios : RF para eluato 5 respeto a material inicial adicionado * Factores de corrección se aplican en el cálculo de volumen log final. Los factores de corrección aplicables para cada muestra son los factores de corrección de la propia muestra respectiva junto con todos los factores de corrección para muestras citadas a continuación de esa muestra.

** Un volumen de 50 mi se empleó con el propósito de calcular el factor de reducción para cada muestra de eluato, para asegurar una comparación directa con el volumen cargado en la columna.

Un factor de reducción de > 2.5 logio respecto al material de inicio de adición se calcula para la muestra El, que representa los primeros 2.0 mi que se pasan sobre la columna PRDT. En las muestras E2 a E5, se observó una irrupción de PrPsc en la fracción de flujo pasante (factor de reducción 1.5 logio para la muestra E5) . No se detectó PrPsc en la muestra de regeneración y los equivalentes de PrPsc ligados a la resina PRDT se discuten con más detalle en la sección de cálculo de la capacidad de enlace de priones de la resina PRDT a continuación.

Cálculo de la Capacidad de Enlace de Priones de las Resinas de Reducción de Priones A fin de estimar la capacidad de enlace para las resinas de reducción de priones (resina PRDT) para proteínas priones infecciosas, los títulos observados en la prueba de transferencia Western se relacionaron a los títulos infecciosos. El ensayo de transferencia Western empleó un material 263K de título conocido. Una serie de diluciones del material de referencia se prepara y prueba en el ensayo de transferencia Western. Después de trazar los títulos obtenidos contra los títulos respectivos observados en el bioensayo de hámster, se realizó un análisis de regresión lineal para estimar la relación entre los dos sistemas de prueba. La pendiente e intercepción para _ la linea de regresión se calculan como 1.0667 y -4.5867, respectivamente. Los parámetros de regresión se emplearon para convertir títulos de transferencia Western en títulos infecciosos utilizando la siguiente fórmula: Título [Bioensayo] = ( ítulo [Transferenciawestern] +4.5867) / (1.0667) .

Una vez que el título infeccioso por mi se calcula, el total de priones ligados a la columna se determina. La capacidad de enlace de proteína prión calculada de la resina PRDT se ilustra en la Tabla 14 siguiente. La capacidad se determina utilizando la cantidad de PrPsc observado directamente ligada a la resina PRDT (muestras Reg y Col) .

Tabla 14: Capacidad de enlace de priones de resina PRDT Muestra Descripción Total de PrPsc Capaci ID de muestra PrPsc Infec-dad Albúmina adicionada (logio ) cioso de con solución de (logi0ID50 enlace adición solubilizada total) = por mi de sarcosilo Total (ID50/ PrPsc + mi) 4.1 SP0913- 50 mi de 3.7* 7.8 - SSM albúmina adicionado con 0.5 mi de una solución de adición solubilizada con sarcosilo 5.0 mi de Resina PRDT; 50 mi de muestra SP0912-SSM cargada (gasto de flujo objetivo: 1.8 ml/min) SP0912- Lavado de < 1.9 < 6.0 < 5.3 Reg sal NaCl 2M logio/ (volumen de mi muestra 25.1 mi) SP0912- Resina de 3.9 8.0 7.3 Col Columna logio/ (volumen de mi muestra 8.7 mi) #Total de PrPSc incluye correcciones para volumen de muestra así como concentración/dilución antes de prueba.

El enlace total de PrPsc a la matriz PRDT que sigue un lavado de sal 2M fue 7.4 logi0 ID50/ml. No se detecta PrPsc en las fracciones de lavado de sal por transferencia Western. Eliminación PrPsc significante (> 2.0 logio) también se observó.

El pH del material inicial adicionado fue 6.85. Después de agregar 65 µ? de NaOH 0.1 M y 50 µ? de NaOH 1 , el valor pH permaneció sin cambio. El efecto probablemente resultó de la capacidad amortiguadora significante de albúmina al 25%.

Cuando se realiza prueba de interferencia, el · material de partida se prueba sin diluir, con centrifugación y concentración 10-veces. Esto fue además de la prueba de interferencia descrita en el plan de estudio, y se realizó para permitir una evaluación de la posibilidad para concentrar las muestras y de esta manera lograr superiores factores de reducción.

Ejemplo 5. Análisis de estabilidad y en proceso para albúmina humana tratada con eliminación de priones En este experimento, se evalúa el efecto de la columna de eliminación de priones en la concentración y composición de albúmina humana. En dos experimentos separados, 1 litro de albúmina se trata con la columna PRIOCLEAR™ B (50 mi) (ProMetic Biosciences) . La muestra sin tratar recolectada al inicio de la corrida, y la muestra recolectada al final de la corrida, se someten a análisis de concentración y composición. Los resultados se ilustran en las Tablas 15 y 16.

Tabla 15. Resultado para Albúmina Humana en Experimentó Uno Descripción de ConcentraComposición de muestra ción de HA, HA (%) mg/mL Monómero HA, sin tratar 252 93.73 HA posterior a 253 93.93 columna de eliminación de priones, muestra recolectada al inicio de corrida HA posterior a 255 93.76 columna de eliminación de priones, muestra recolectada al final de la corrida (1L) Descripción de muestra Composición de HA (%) Dimero Polímero Olígómero HA, sin tratar 2.71 3.56 ND HA posterior a columna 2.71 3.36 ND de eliminación de priones, muestra recolectada al inicio de corrida HA posterior a columna 2.72 3.52 ND de eliminación de priones, muestra recolectada al final de la corrida (1L) Tabla 16. Resultado de Albúmina Humana en Experimento Dos Descripción de ConcentraComposición de muestra ción de HA, HA (%) mg/mL onómero HA, sin tratar 206 92.15 HA posterior a 181 92.26 columna de eliminación priones, muestra recolectada al inicio de corrida HA posterior a 206 92.19 columna de eliminación de priones, muestra recolectada al final de la corrida (1L) Cont .

Descripción de Composición HA (%) muestra Dimero Polímero Olígómero HA, sin tratar 3.08 4.34 0.44 HA posterior a 3.05 4.27 0.42 columna de eliminación priones, muestra recolectada al inicio de corrida HA posterior a 3.08 4.30 0.43 columna de eliminación de priones, muestra recolectada al final de la corrida (1 L) No se observaron diferencias significantes antes y después del proceso de eliminación de priones.

Además evaluamos la estabilidad en proceso de albúmina humana tratada para eliminación de priones y suspensiones de Abraxane® fabricados utilizando la albúmina humana tratada para eliminación de priones. El resultado se ilustra en las Tablas 17 y 18.

Tabla 17. Estabilidad en Proceso de Soluciones HA Tratadas del Experimento Uno y Suspensiones de Abraxane Fabricadas Utilizando HA Tratado.

Descripción de Condiciones de Concentración muestra almacenamiento de HA mg/mL Solución de HA Tiempo 0 255 concen24 hrs a 5°C 257 trada 48 hrs a 5°C 255 72 hrs a 5°C 255 Solución de HA Tiempo 0 51 diluida 24 hrs a 5°C 51 48 hrs a 5°C 51 72 hrs a 5°C 51 Suspensión de Tiempo 0 57 Abraxane® antes 24 hrs a 5°C 57 de liofilización 36 hrs a 5°C 55 Cont.

Descripción de Composición HA (%) muestra Monó- Dimero Polímero Olígo- mero mero Solución de HA 93.79 2.73 3.48 ND concentrada 93.76 2.74 3.50 ND 93.74 2.77 3.49 ND 93.76 2.73 3.50 ND Solución de HA 93.79 2.73 3.47 ND diluida 93.82 2.71 3.47 ND 93.83 2.70 3.4-7 ND 93.85 2.69 3.46 ND Suspensión de 88.39 7.14 3.26 1.22 Abraxane® antes 86.32 8.19 3.25 2.25 de liofilización 88.22 8.44 2.13 1.21 Tabla 18. Estabilidad en Proceso de Soluciones HA Tratadas del Experimento Dos y Suspensiones de Abraxane Fabricadas Utilizando HA Tratado.

Descripción de Condiciones de Concentración muestra almacenamiento HA mg/mL Solución de HA Tiempo 0 206 concentrada 24 hrs a 5°C 202.7 48 hrs a 5°C 204.1 72 hrs a 5°C 200.3 Solución de HA Tiempo 0 51.4 diluida 24 hrs a 5°C 51.1 48 hrs a 5°C 52.1 72 hrs a 5°C 51.7 Suspensión de Tiempo 0 57 Abraxane® antes 24 hrs a 5°C 57.1 de l'iofili- 36 hrs a 5°C 57.4 zación Cont .

Descripción de Composición de HA (%) muestra Monó- Dimero Polímero Olígo- mero mero Solución de HA 92.22 3.09 4.25 0.44 concentrada 92.28 3.03 4.26 0.43 92.32 2.99 4.25 0.44 92.14 3.06 4.35 0.44 Solución de HA 92.28 3.04 4.26 0.42 diluida 92.30 3.01 4.27 0.43 92.38 2.95 • 4.24 0.43 92.45 2.93 4.22 0.41 Suspensión de 85.78 8.30 3.97 1.94 Abraxane® antes de 85.28 8.67 ' 3.95 2.10 liofilización 87.72 7.62 3.43 1.23 Además comparamos la estabilidad acelerada de albúmina humana en productos de Abraxane® terminados fabricados utilizando albúmina humana tratada para eliminación de priones (Lote de planta piloto utilizando albúmina humana tratada para eliminación de priones) y productos de Abraxane® terminados fabricados utilizando albúmina humana no tratada para eliminación de priones (lote de Exhibición Abraxane, lote de Validación de Abraxane y lote de planta piloto Abraxane) . El resultado se ilustra en la Tabla 19.

Tabla 19. Estabilidad acelerada de HA en Productos Terminados Abraxane Fabricados utilizando HA Tratado para eliminación de Priones. Comparación con Fabricación de Productos Terminados utilizando HA sin Tratar.

Descripción de muestra Experimentos Condiciones de almacenamiento Lote de planta piloto Tiempo 0 utilizando HA tratado 2W a 55°C Experimento 1 para eliminación de 1M a 55°C priones 1M a 40°C Lote de exhibición de Tiempo 0 Abraxane Experimento 1 3M a 40°C 3M a 40°C Lote de planta piloto Tiempo 0 utilizando HA tratado 2W a 55°C Experimento 2 para eliminación de priones Lote de validación de Tiempo 0 Experimento 2 proceso Abraxane 3M a 40°C 6M a 40°C Lote de planta piloto Experimentos Tiempo 0 Abraxane 1 y 2 2 a 55°C Descripción de Composición HA muestra Monómero Dimero Q. "6 Cambio % Cambio durante durante almacenaalmacenamiento miento Lote de planta 84.66 N/A 9.33 N/A piloto 70.39 -14.27 17.16 7.83 utilizando HA 61.83 -22.83 19.34 10.01 tratado para 76.22 -8.44 14.58 5.25 eliminación de priones Lote de 86.70 N/A 9.40 N/A exhibición de 71.20 -15.50 17.20 7.80 Abraxane 63.90 -22.80 19.30 9.90 Lote de planta 84.44 N/A 9.03 N/A piloto 72.43 -12.01 16.02 6.99 utilizando HA tratado para eliminación de priones Lote de 86.70 N/A 7.00 N/A validación de 75.60 -11.10 14.30 7.30 proceso 68.80 -17.90 16.80 9.80 Abraxane Lote de planta 89.45 N/A 5.73 N/A piloto Abraxane 75.19 -14.26 14.92 9.19 Cont .

Descripción de Composición HA muestra Polímero Oligómero o. o, O Cambio O Cambio durante durante almacena almacenamiento miento Lote de planta 2.76 N/A 3.25 N/A piloto 8.77 6.01 3.67 0.42 utilizando HA 14.55 11.79 4.27 1.02 tratado para 5.71 2.95 3.49 0.24 eliminación de priones Lote de 2.1 N/A 2.50 N/A exhibición de 8.9 6.80 2.70 0.20 Abraxane 13.9 . 11.80 3.00 0.50 Lote de planta 2.32 N/A 4.17 N/A piloto 7.12 4.80 4.39 0.22 utilizando HA tratado para eliminación de priones Lote de 1.5 N/A 4.80 N/A validación de 5.4 3.90 4.70 -0.10 proceso 9.2 7.70 5.20 0.40 Abraxane Lote de planta 1.33 N/A 3.5 N/A piloto 6.21 4.88 3.68 0.18 Abraxane Comparación de .datos de estabilidad muestra que almacenamiento por 2 semanas a 55°C es equivalente a almacenamiento por 3 meses a 40°C. No se observaron diferencias significantes durante el proceso de fabricación y durante la prueba en proceso entre lotes de planta piloto fabricados utilizando albúmina humana tratada por eliminación de priones y lotes de planta piloto fabricados utilizando albúmina humana sin tratar. No hubo diferencias significantes entre las propiedades de los productos terminados fabricados utilizando albúmina humana tratada para eliminación de priones y las propiedades del producto terminado fabricado utilizando albúmina humana sin tratar.

Ejemplo 6: Evaluación del Efecto de Columna de Eliminación de Priones en Suspensión en Proceso Abraxane®.

Este experimento evalúa el efecto de eliminación de priones de suspensión en proceso de Abraxane® es decir la suspensión de Abraxane® antes de liofilización . Columnas de equipo PIKSI comercialmente disponibles (1 ce), que contienen resina Toyopearl Amino 650CU, ProMetic Biosciences se emplean en este experimento.

En dos experimentos separados, 0.5 L de Abraxane® en suspensión de proceso que contiene albúmina humana, se procesaron a través de la columna. Los resultados de. análisis se resumen en la Tabla 20.

Tabla 20. Efecto de Columna de Eliminación de Priones en Suspensión en Proceso de-Abraxane.

MuesConcenComposición HA Pacli- tra tración Monó- Di- Poli- Oligó- taxel, No. HA, mero mero mero Mero mg/mL mg/mL 1 55 88.29 5.95 3.99 1.32 6.9 2 56 88.37 5.96 3.86 1.36 6.9 3 56 88.38 5.96 3.76 1.39 6.8 Cont .

MuesImpurezas % Tamaño de partículas, tra mm pH No. 7-Epipa- Total Prom <5% <95% <99.9% clitaxel 1 0.08 0.25 131 82 193 254 7.0 2 0.08 0.25 132 86 190 250 7.0 3 0.09 0.26 130 82 190 250 7.0 Muestra 1: Suspensión en Proceso de Abraxane, sin Tratar .

Muestra 2: Suspensión en Proceso de Abraxane, Posterior a Columna de Eliminación de Priones, muestra Recolectada al Inicio de la Corrida.

Muestra 3: Suspensión en Proceso de Abraxane, posterior, a Columna de Eliminación de Priones, muestra Recolectada al Final de la Corrida (0.5L).

Como se ilustra en la Tabla 20, la prueba física y química de la suspensión en proceso de Abraxane® tratada para eliminación de priones no muestra diferencias significantes entre la suspensión sin tratar . y tratada en términos de tamaño de partículas, pH, ensayo de paclitaxel e impurezas, ensayo de albúmina humana (HA) y composición de HA.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua, en donde la composición está sustancialmente libre de una proteina prión.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición tiene una infectividad de priones menor a aproximadamente 100 fg/ml .

3. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la composición tiene una infectividad de priones menor que aproximadamente 10 IU-ic/ml.

4. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque la composición no muestra la presencia de una proteina prión con base en un ensayo de amplificación cíclica de plegamiento incorrecto de proteínas (P CA = Protein Misfolding Cyclic Amplification) o con base en un ensayo IPCR.

5. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque además comprende una cantidad en trazas de un ligando capaz de enlazar a una proteína prión.

6. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque además comprende una cantidad en trazas de un material de soporte.

7. Una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua, en donde la albúmina en la composición se obtiene por un método que comprende un proceso de eliminación de priones, el proceso de eliminación de priones comprende poner en contacto una composición inicial de albúmina con un ligando capaz de enlazar a una proteina prión.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el proceso de eliminación de priones además comprende eliminar el ligando y las proteínas enlazadas al mismo de la albúmina y composición .

9. La composición de conformidad' con la reivindicación 8, caracterizada porque el ligando es un péptido .

10. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el ligando es un compuesto basado en triazina.

11. Un método para producir una composición que ¦ comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua, el método se caracteriza porque comprende: a) retirar una proteína prión de una composición inicial de albúmina; b) someter una mezcla que comprende una solución- que comprende la albúmina eliminada de priones y una fase orgánica que comprende el agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua disperso en un solvente orgánico, a una condición de alta cizalla.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la etapa a) comprende: 1) poner en contacto la solución inicial de albúmina con un ligando capaz de enlazar a una proteina prión.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la etapa a) además comprende: 2) eliminar el ligando y las proteínas enlazadas al mismo de la solución de albúmina.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, caracterizado porque además comprende retirar el solvente orgánico de la mezcla.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la eliminación del solvente orgánico es por evaporación.

. 16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-15, caracterizado porque el ligando es un péptido .

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-15, caracterizado porque el ligando es un compuesto basado en triazina.

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-17, caracterizado porque la composición inicial de albúmina es un producto derivado de sangre.

19. Un método para producir una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua, caracterizado porque comprende: a) someter una mezcla que comprende una fase orgánica que comprende el agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua y una solución de albúmina, a una condición de alta cizalla, y b) retirar una proteina prión de la mezcla.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la etapa b) comprende: 1) poner en contacto la mezcla con un ligando capaz de enlazar a una proteina prión.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la etapa b) además comprende: 2) retirar el ligando y proteínas enlazadas al mismo de la mezcla .

22. El método de conformidad con la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque el ligando es un péptido.

23. El método de conformidad con la ramificación 20 ó 21, caracterizado porque el ligando es un compuesto basado en triazina.

24. Una composición producida por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-23.

25. Un método para retirar una proteina prión de una composición que se sospecha contiene una proteina prión que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua, que comprende: a) poner en contacto la composición con un ligando capaz de enlazar a una proteina prión, b) retirar el ligando y proteínas enlazadas al mismo de la composición.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el ligando es un péptido.

27. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el ligando es un compuesto basado en triazina.

28. Una composición que comprende nanoparticulas que comprenden albúmina y un agente farmacológico activo sustancialmente insoluble en agua, que además comprende un ligando capaz de enlazar a una proteína prión.

29. La composición de conformidad con la reivindicación '28, caracterizada porque el ligando es un péptido.

30. La composición de conformidad con . la reivindicación 28, caracterizada porque el ligando es un compuesto basado en triazina.

31. Uso de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y 24 para tratar una enfermedad .

32. El uso de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad es cáncer.