MX2011006088A

MX2011006088A - Oligonucleotidos inmunoestimuladores.

Info

Publication number: MX2011006088A
Application number: MX2011006088A
Authority: MX
Inventors: Risini Dhammika Weeratna; Heather Lynn Davis
Original assignee: Coley Pharm Group Inc
Priority date: 2008-12-09
Filing date: 2009-12-01
Publication date: 2011-06-21
Also published as: SI2759306T1; TWI370740B; AR074501A1; IL213162A; PL2759306T3; US20150086610A1; BRPI0923341A2; IL213162A0; DK2759306T3; MY160201A; MY172421A; RU2477753C2; CN102333538A; ES2572563T3; HK1165325A1; RU2610690C2; SG171829A1; WO2010067262A1; CA2745096C; SI2376107T1

Abstract

La invención se refiere a oligonucleótidos inmunoestimuladores y procedimientos de uso de oligonucleótidos inmunoestimuladores para inducir una respuesta inmune específica de antígeno; la invención se refiere además a una vacuna que comprende un oligonucleótido inmunoestimulador y un antígeno y comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable; los oligonucleótidos inmunoestimuladores de la invención, en algunas modalidades, incluyen uno o más enlaces modificados.

Description

OLIGONUCLEÓTIDOS INMUNOESTIMULADORES CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a oligonucleótidos inmunoestimuladores y a procedimientos de uso de oligonucleótidos inmunoestimuladores para inducir una respuesta inmune específica de antígeno.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El ADN bacteriano tiene efectos inmunoestimuladores para activar a los linfocitos B y linfocitos citolíticos naturales, pero el ADN de vertebrados no (Tokunaga, T., y col., 1988. Jpn. J. Cáncer Res. 79: 682-686; Tokunaga, T., y col., 1984, JNCI 72: 955-962; Messina, J. P., y col., 1991 , J. Immunol. 147: 1759-1764; y revisado en Krieg, 1998, En: Applied Oligonucleotide Technology, C. A. Stein y A. M. Krieg, (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., New York, N.Y., págs. 431-448). Ahora se entiende que estos efectos inmunoestimuladores del ADN bacteriano son el resultado de la presencia de dinucleótidos CpG no metilados en contextos de bases particulares (motivos CpG), que son comunes en el ADN bacteriano, pero que están metilados y escasamente representados en el ADN de vertebrados (Krieg y col, 1995 Nature 374:546-549; Krieg, 1999 Biochim. Biophys. Acta 1489: 107-116). Los efectos inmunoestimuladores del ADN bacteriano pueden mimetizarse con oligodesoxinucleótidos sintéticos (ODN) que contienen estos motivos CpG. Dichos CpG ODN tienen efectos altamente estimuladores sobre leucocitos humanos y murinos, induciendo la proliferación de células B; la secreción de citocinas e inmunoglobulinas; la actividad lítica de linfocitos citolíticos naturales (NK) y la secreción de IFN-gamma; y la activación de células dendriticas (DC) y otras células presentadoras de antígeno para expresar moléculas co-estimuladoras y secretar citocinas, especialmente las citocinas de tipo Th1 que son importantes para promover el desarrollo de respuestas de linfocitos T de tipo Th1. Estos efectos inmunoestimuladores de CpG ODN de estructura fosfodiéster nativos son altamente específicos de CpG en el sentido de que los efectos se reducen drásticamente si el motivo CpG se metila, se cambia a GpC o se elimina o altera de otro modo (Krieg y col, 1995 Nature 374: 546-549; Hartmann y col, 1999 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96: 9305-10).

Se ha descrito anteriormente que la actividad inmunoestimuladora de oligonucleótidos CpG depende del número de motivos CpG, las secuencias flanqueantes del dinucleótido CG, la localización del motivo o motivos de CpG y la separación entre los motivos de CpG (Bailas y col., 1996, J. Immunol. 157(5): 1840-5; Hartmann y col., 2000, J. Immunol., 164(3): 1617-24; Klinman y col., 2003, Clin. Exp. Immunol., 133(2): 227-32). En este documento se describe un oligonucleótido inmunoestimulador que tiene el motivo CpG 3' eliminado que sorprendentemente conserva su actividad inmunoestimuladora. También se describe una vacuna que comprende el oligonucleótido inmunoestimulador y un antígeno y procedimientos de uso de dicha vacuna.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En aspectos de la invención, se proporciona un oligonucleótido inmunoestimulador que comprende la secuencia de nucleótidos 5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3' (SEQ ID NO: 1). En algunas modalidades, el oligonucleótido inmunoestimulador comprende uno o más enlaces modificados. En ciertas modalidades, el oligonucleótido inmunoestimulador comprende uno o más enlaces fosforotioato. En ciertas modalidades, todos los enlaces internucleotídicos del oligonucleótido son enlaces fosforotioato. En algunas modalidades, el oligonucleótido inmunoestimulador comprende al menos un análogo de nucleótido sustituido lipófilo y un dinucleótido de pirimidina-purina.

En aspectos de la invención se proporciona una vacuna que comprende un antígeno y un oligonucleótido inmunoestimulador que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 , que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, el oligonucleótido inmunoestimulador está en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune específica de antígeno. En otras modalidades, la respuesta inmune específica de antígeno inducida es una respuesta inmune Th1. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno microbiano, un autoantigeno o una sustancia adictiva. En otras modalidades, el antígeno bacteriano está asociado con Staphylococcus aureus o el antígeno bacteriano está asociado con una bacteria que causa caries dental. En otras modalidades, la bacteria es Streptococcus mutans, Streptococcus sobrínus, Streptococcus sanguis, Lactobacillus acidophilis o Actinomyces viscosus. En otras modalidades, el antígeno bacteriano está asociado con una bacteria que produce enfermedad periodontal. En modalidades adicionales, la bacteria es Porphyromonas gingivalis o Actinobacillus actinomycetemcomitans. En algunas modalidades, el antígeno viral está asociado con el Virus Respiratorio Sincitial (VRS), virus Herpes Simple 1 , virus Herpes Simple 2, Virus de la Inmunodeficiencia Humana-1 (VIH-1 ) o VIH-2. En otras modalidades, el antígeno parasitario está asociado con un parásito que causa malaria. En algunas modalidades, el autoantigeno es un antígeno tumoral, un antígeno asociado con la enfermedad de Alzheimer, un antígeno contra un anticuerpo humano o un antígeno que se expresa a partir de elementos retrovirales endógenos humanos. En otras modalidades, el antígeno tumoral es HER2, MAGE, NY-ESO, PSA, CEA o una forma variante de EGFR. En otras modalidades, cuando el antígeno está asociado con la enfermedad de Alzheimer, el antígeno es tau o ß-amiloide. En algunas modalidades, el antígeno es IgE. En algunas modalidades, el antígeno es un hapteno de nicotina conjugado con un portador. En otras modalidades adicionales, el vehículo con el que se conjuga el hapteno de nicotina es toxina diftérica (DT). En otras modalidades, el antígeno es un péptido, una proteína recombinante, una proteína purificada, el patógeno destruido completo, un vector viral o virus vivo atenuado, un vector bacteriano o bacteria viva atenuada, un polisacárido, un hapteno o se codifica por ADN plasmídico.

En algunas modalidades, el antígeno se conjuga con un portador. En modalidades adicionales, el portador es toxina diftérica (DT). En otras modalidades, el portador es una partícula similar a virus. En modalidades adicionales, la partícula similar a virus es el fago de ARN Q-ß, el antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) o el antígeno de núcleo de hepatitis B (HBcAg). En algunas modalidades, la vacuna comprende además uno o más adyuvantes. En modalidades adicionales, el adyuvante es un agonista para un receptor de tipo Toll (TLR) que no es TLR 9. En otras modalidades, el agonista es para TLR 3. En modalidades adicionales, el agonista TLR 3 es políl:C estabilizado. En algunas modalidades, el agonista es para TLR 4. En modalidades adicionales, el agonista de TLR 4 es un derivado de lipopolisacárido (LPS). En otras modalidades adicionales, el derivado de LPS es MPL o GLA. En otras modalidades, el agonista es para TLR 5. En modalidades adicionales, el agonista de TLR 5 es flagelina. En algunas modalidades, el agonista es para TLR 7 u 8. En modalidades adicionales, el agonista de TLR 7 u 8 es una molécula pequeña de la familia de la imidazoquinolina. En otras modalidades, el adyuvante es una sal de aluminio. En modalidades adicionales, la sal de aluminio es hidróxido de aluminio. En algunas modalidades, el adyuvante es un complejo inmunoestímulador (ISCOM). En otras modalidades, el adyuvante es una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite. En algunas modalidades, el adyuvante es un liposoma. En otras modalidades, el adyuvante es un sistema de suministro. En modalidades adicionales, el sistema de suministro es una nanopartícula o una micropartícula.

En algunas modalidades, el oligonucleótido inmunoestimulador comprende uno o más enlaces modificados. En modalidades adicionales, el oligonucleótido inmunoestimulador comprende uno o más enlaces fosforotioato. En ciertas modalidades, todos los enlaces internucleotídicos del oligonucleótido son enlaces fosforotioato. En otras modalidades, el oligonucleótido inmunoestimulador comprende al menos un análogo de nucleótido sustituido lipófilo y un dinucleótido de pirimidina-purina. En algunas modalidades, la vacuna se formula para administración. En modalidades adicionales, la vacuna se formula para administración mediante una vía parenteral, siendo la vía parenteral intramuscular, subcutánea, intradérmica, intravenosa o intraperitoneal. En otras modalidades adicionales, la vacuna se formula para administración mediante una vía tópica, siendo la vía tópica la piel, una superficie transdérmica o una superficie mucosa. En modalidades adicionales, la vía mucosa es oral, intranasal, intravaginal, intrarrectal, intrabucal o infraocular.

En algunos aspectos de la invención, un procedimiento para inducir una respuesta inmune específica de antígeno en un sujeto que lo necesite comprende administrar un sujeto un antígeno y un oligonucleótido inmunoestimulador que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune específica de antígeno en dicho sujeto. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno microbiano, un autoantígeno o una sustancia adictiva. En modalidades adicionales, el antígeno microbiano es un antígeno bacteriano, un antígeno viral o un antígeno parasitario. En otras modalidades, el antígeno bacteriano está asociado con Staphylococcus aureus o el antígeno bacteriano está asociado con una bacteria que causa caries dental. En modalidades adicionales, la bacteria es Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Streptococcus sanguis, Lactobacillus acidophilis o Actinomyces viscosus. En otras modalidades, el antígeno bacteriano está asociado con una bacteria que causa enfermedad periodontal. En modalidades adicionales, la bacteria es Porphyromonas gingivalis o Actinobacillus actinomycetemcomitans. En algunas modalidades, el antígeno viral está asociado con el virus Respiratorio Sincitial (VRS), virus Herpes Simple 1 , virus Herpes Simple 2, Virus de la Inmunodeficiencia Humana-1 (VIH-1) o VIH-2. En otras modalidades, el antígeno parasitario está asociado con un parásito que causa malaria. En algunas modalidades, el autoantígeno es un antígeno tumoral, un antígeno asociado con la enfermedad de Alzheimer, un antígeno frente a un anticuerpo humano o un antígeno que se expresa a partir de elementos retrovirales endógenos humanos. En modalidades adicionales, el antigeno tumoral es HER2, MAGE, NY-ESO, PSA, CEA o una forma variante de EGFR. En otras modalidades, cuando el antígeno se asocia con la enfermedad de Alzheimer, el antígeno es tau o ß-amiloide. En algunas modalidades, el antígeno es IgE.

En algunas modalidades, el antígeno es hapteno de nicotina conjugado con un portador. En modalidades adicionales, el portador con el que se conjuga el hapteno de nicotina es toxina diftérica (DT). En otras modalidades, el antígeno es un péptido, una proteína recombinante, una proteína purificada, patógeno destruido completo, un vector viral o virus vivo atenuado, un vector bacteriano o bacteria viva atenuada, un polisacárido, un hapteno o está codificado por ADN plasmídico.

En algunas modalidades, el antígeno está conjugado con un portador. En modalidades adicionales, el portador es toxina diftérica (DT). En otras modalidades, el portador es una partícula similar a virus. En modalidades adicionales, la partícula similar a virus es el fago de ARN Q-ß, el antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) o el antígeno de núcleo de hepatitis B (HBcAg). En algunas modalidades, la vacuna comprende además uno o más adyuvantes. En modalidades adicionales, el adyuvante es un agonista para un receptor de tipo Toll (TLR) que no es TLR 9. En otras modalidades, el agonista es para TLR 3. En modalidades adicionales, el agonista de TLR 3 es polil:C estabilizado. En algunas modalidades, el agonista es para TLR 4. En modalidades adicionales, el agonista de TLR 4 es un derivado de lipopolisacárido (LPS). En otras modalidades adicionales, el derivado de LPS es MPL o GLA. En otras modalidades, el agonista es para TLR 5. En modalidades adicionales, el agonista de TLR es flagelina. En algunas modalidades, el agonista es para TLR 7 u 8. En modalidades adicionales, el agonista de TLR 7 u 8 es una molécula pequeña de la familia de la imidazoquinolina. En otras modalidades, el adyuvante es una sal de aluminio. En modalidades adicionales, la sal de aluminio es hidróxido de aluminio. En algunas modalidades, el adyuvante es un complejo inmunoestimulador (ISCOM). En otras modalidades, el adyuvante es una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite. En algunas modalidades, el adyuvante es un liposoma. En otras modalidades, el adyuvante es un sistema de suministro. En modalidades adicionales, el sistema de suministro es una nanopartícula o una micropartícula.

En algunas modalidades, el oligonucleótido inmunoestimulador comprende uno o más enlaces modificados. En modalidades adicionales, el oligonucleótido inmunoestimulador comprende uno o más enlaces fosforotioato. En ciertas modalidades, todos los enlaces ¡nternucleotídicos del oligonucleótido son enlaces fosforotioato. En otras modalidades, el oligonucleótido inmunoestimulador comprende al menos un análogo de nucleótido sustituido lipófilo y un dinucleótido de pirimidina-purina. En algunas modalidades, el antigeno y/o oligonucleótido inmunoestimulador se formulan para administración. En modalidades adicionales, el antígeno y/u oligonucleótido inmunoestimulador se formulan para administración por una vía parenteral, siendo la vía parenteral intramuscular, subcutánea, intradérmica, intravenosa o intraperitoneal. En otras modalidades adicionales, el antigeno y/u oligonucleótido inmunoestimulador se formulan para administración por una vía tópica, siendo la vía tópica la piel, una superficie transdérmica o una superficie mucosa. En modalidades adicionales, la vía mucosa es oral, intranasal, intravaginal, ¡ntrarrectal, ¡ntrabucal o ¡ntraocular. En algunas modalidades, el antígeno y el oligonucleótido inmunoestimulador se administran por la misma vía, por vías similares o por vías diferentes. En otras modalidades, el antígeno y el oligonucleótido inmunoestimulador se administran conjuntamente, simultáneamente o por separado. En modalidades adicionales, el antígeno y el oligonucleótido inmunoestimulador se administran en el transcurso de un intervalo de 24 horas de separación entre sí. En algunas modalidades, el sujeto es una especie tratada por veterinaria. En otras modalidades, el sujeto es un sujeto no roedor. En algunas modalidades, el sujeto es un ser humano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : Aumento de las respuestas inmunes humorales en ratones. Se inmunizaron ratones adultos (6-8 semanas; n = 0/grupo) con 1 µg de HBsAg (panel a la izquierda) o 20 µg de OVA (panel a la derecha) sin adyuvante o en combinación con CPG 24555, 10103 ó 7909 (10 g) u ODN de control sin CpG 2137 (10 µg; con OVA solamente. Se ensayó plasma de 2 semanas (para HBsAg) o 1 semana (para OVA) después del último refuerzo para determinar los niveles de IgG total, lgG1 e lgG2a/c específico de antígeno (anti-HBs o anti-OVA). Cada barra representa la media geométrica de los títulos (± ETM) para IgG total. Los títulos se definieron como la mayor dilución que da como resultado un valor de absorbancia dos veces mayor que el de plasma no inmune con un valor de corte de 0.05. Los números encima de cada barra representan la proporción de lgG2a(o 2c)/lgG1 específica de antígeno.

Figura 2: Naturaleza de respuesta inmune humoral inducida en ratones. Se inmunizaron ratones adultos (6-8 semanas; n = 10/grupo) con 1 µg de HBsAg (panel a la izquierda) o 20 µg de OVA (panel a la derecha) sin adyuvante o en combinación con CPG 24555, 10103 ó 7909 (10 µg) u ODN de control sin CpG 2137 (10 µg; con OVA solamente). Se ensayó plasma de 2 semanas (para HBsAg) o 1 semana (para OVA) después del último refuerzo para determinar los niveles de lgG1 (barras transparentes) e lgG2a o lgG2c (barras negras) frente a HBsAg (Anti-HBs) u OVA (anti-OVA). Cada barra representa la media geométrica (± ETM) del título de dilución a punto final de ELISA para el grupo entero (n = 10). Los títulos se definieron como la mayor dilución que da como resultado un valor de absorbancia dos veces mayor que el de plasma no inmune con un valor de corte de 0.05.

Figura 3: Respuestas de linfocitos T citotóxicos inducidas en ratones. Se inmunizaron ratones adultos (6-8 semanas; n = 5/grupo) con 1 g de HBsAg (panel a la izquierda) o 20 µg de OVA (panel a la derecha) sin adyuvante o en combinación con CPG 24555, 10103 ó 7909 (10 µg) u ODN de control sin CpG 2137 (10 µg; con OVA solamente). Se ensayaron esplenocitos de 2 semanas (para HBsAg) o 1 semana (para OVA) después del último refuerzo con respecto a respuestas de CTL específicos de antígeno usando un ensayo de liberación de 51Cr convencional.

Figura 4: Aumento no mediado por CpG en las respuestas de CTL en ratones deficientes en TLR9. Se inmunizaron ratones adultos deficientes en TLR9 (6-8 semanas; n = 5 grupo) con 20 µg de OVA sin adyuvante o en combinación con CPG 24555, 10103 ó 7909 (10 µg) u ODN de control sin CpG 2137 (10 µg). Se ensayaron esplenocitos de 1 semana después del último refuerzo con respecto a respuestas de CTL específicas de OVA usando un ensayo de liberación de 5 Cr convencional.

Figura 5: Linfocitos T CD8 específicos de OVA en ratones de tipo silvestre frente a ratones deficientes en TLR9. Se inmunizaron ratones adultos de tipo silvestre y deficientes en TLR9 (6-8 semanas; n = 5/grupo) con 20 µg de OVA sin adyuvante o en combinación con CPG 24555, 10103 ó 7909 (10 µg) u ODN de control sin CpG 2137 (10 µg). Se ensayaron esplenocitos de 1 semana después del último refuerzo con respecto a linfocitos T CD8 específicos de OVA usando tetrámeros de MHC de Clase I H-2Kb -SIINFEKL.

Figura 6: Secreción de IFN-g específica de antígeno en ratones. Se inmunizaron ratones adultos (6-8 semanas; n = 5/grupo) con 1 µg de HBsAg (panel a la izquierda) o 20 µg de OVA (panel a la derecha) sin adyuvante o en combinación con CPG 24555, 10103 ó 7909 (10 µg) u ODN de control sin CpG 2137 (10 µg; con OVA solamente). Se estimularon esplenocitos de 2 semanas (para HBsAg) o 1 semana (para OVA) después del último refuerzo con el antígeno pertinente como se muestra en las figuras durante 72 h y se ensayaron los sobrenadantes de cultivo para determinar el IFN-? mediante ELISA.

Figura 7: Aumento no mediado por CpG en la secreción de IFN-g específico de antígeno en ratones deficientes en TLR9. Se inmunizaron ratones adultos deficientes en TLR9 (6-8 semanas; n = 5/grupo) con 20 µg de OVA sin adyuvante o en combinación con CPG 24555, 10103 ó 7909 (10 µg) u ODN de control sin CpG 2137 (10 µg). Se estimularon esplenocitos 1 semana después del último refuerzo con OVA a concentraciones de 0, 0.5 y 1 mg/ml durante 72 h y se ensayaron los sobrenadantes de cultivos para determinar el IFN-? mediante ELISA.

Figuras 8A-8B: Poblaciones de linfocitos T secretores de multicitocinas específicos de antígeno en ratones. Se inmunizaron ratones adultos (6-8 semanas; n = 5/grupo) con 1 g de HBsAg con antígeno solo o en combinación con CPG 24555, 10103 ó 7909 (10 µg). Se re-estimularon esplenocitos de 2 semanas después del refuerzo con el antígeno HBsAg (para CD4) o el péptido HBs de Clase I (para CD8) y se cuantificaron las poblaciones de células CD4 (Figura 8A) y CD8 (Figura 8B) que secretan IFN-?, TNF-a y/o IL-2 usando citometría de flujo.

Figuas 9A-9C: Inmunidad innata in vivo en ratones BALB/c. A ratones BALB/c (n = 5/grupo) se les inyectó por vía subcutánea PBS (control de placebo), CPG 24555, CPG 10103 u ODN de control sin CpG 2137 a un nivel de dosis de 100 µ9. Se extrajo sangre de los animales a las 3 horas después de la inyección y se ensayó el plasma para determinar la presencia de IP-10 (Figura 9A) e IL-12 (Figura 9B) o IL-6 (Figura 9C) usando un ELISA comercial.

Figuras 10A-10C: Inmunidad humoral ¡n vivo en ratones BALB/c. Se inmunizaron ratones BALB/c por vía intramuscular con HBsAg (1 µg) ± CPG 24555 ó 10103 (10 µg)1 OVA (20 µg) ± CPG 24555 ó 10103 (10 µg), o con influenza A HA de Texas 1/77, H3N2 (1 µg) + alumbre (25 µg AI3+), ± CPG 24555 ó 10103 (10 µg). Los ratones se inmunizaron a los 0 y 14 días (HBsAg), a los 0, 7 y 21 días (OVA) o el día 0 solamente (HA). La Figura 10A muestra los títulos de IgG totales específicos de HBsAg a las 2 semanas después del refuerzo medidos mediante ELISA de punto final. La Figura 10B muestra los títulos de IgG totales específica de OVA a 1 semana después de último refuerzo. La Figura 10C muestra la cinética de IgG total específica de HA a diversos tiempos después de la inmunización medida mediante ELISA de punto final.

Figuras 1 1A-1 1 B: Respuestas de linfocitos T en ratones BALB/c. A ratones BALB/c se les inyectó por vía intramuscular HBsAg (1 µg) con o sin CPG ODN 2455, CPG 10103 u ODN de control sin CpG 2137 a 10 µg. Los ratones recibieron las inyecciones a los 0 y 14 días. La Figura 1 1A muestra CTL específicos de HBsAg medidos por liberación por 51Cr a las 2 semanas después del refuerzo. A ratones C57bl/6 se les inyectó por vía intramuscular OVA (20 µg) con o sin CPG ODN 2455, CPG 10103 u ODN de control sin CpG 2137 a 10 Los ratones recibieron las inyecciones a los 0, 7 y 21 días. La Figura 1 1 B muestra CTL específicos de OVA medidos por liberación de 51 Cr a 1 semana después del último refuerzo.

Figuras 12A-12B: Respuestas de linfocitos T en ratones BALB/c. A ratones BALB/c se les inyectó por vía intramuscular HBsAg (1 con o sin CPG ODN 2455, CPG 10103 u ODN de control sin CpG 2137 a 10 µg. Los ratones recibieron las inyecciones a los 0 y 14 días. Se incubaron esplenocitos de dos semanas después del último refuerzo con el antígeno respectivo durante 72 horas y los sobrenadantes de cultivo se ensayaron con respecto a la presencia de IFN-? mediante ELISA (Figura 12A). A ratones C57bl/6 se les inyectó por vía intramuscular OVA (20 µ9) con o sin CPG ODN 2455, CPG 10103 u ODN de control sin CpG 2137 a 10 Los ratones recibieron las inyecciones a los 0, 7 y 21 días. Se incubaron esplenocitos de una semana después del último refuerzo con el antígeno respectivo durante 72 horas y los sobrenadantes de cultivo se ensayaron con respecto a la presencia de IFN-? mediante ELISA (Figura 12B).

Figura 13: Anti-HA a 6 semanas después de la inmunización. Se inmunizaron ratones BALB/c hembra con HA (1 µ9) ± CpG u ODN de control (10 g) ± alumbre (25 µg de Al3+) en un volumen total de 50 µ?. La cantidad de anti-HA se midió a las 6 semanas después de la inmunización.

Figura 14: Títulos de inhibición de la hemaglutinación (HIA) a las 4 semanas después de la inmunización. Se evaluó la funcionalidad de los anticuerpos usando un ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HIA). Se midió la capacidad para aumentar los títulos de HIA en solitario o en combinación con alumbre.

Figura 15: Secreción de IFNy específico de HA. Se inmunizaron ratones BALB/c hembra con HA (1 µg) ± CpG u ODN de control (10 µg) ± alumbre (25 µg de Al3+) en un volumen total de 50 µ?. Los esplenocitos retirados a las 6 semanas después de la inmunización se usaron para ensayar la secreción de IFNy específico de antígeno.

Figura 16: Respuestas humorales en primates no humanos. Se inmunizaron monos Cynomolgus (3-5 años de edad; n = 5 por grupo) con Engerix-B (10 µg de HBsAg; 250 µg de Al3+) en solitario o en combinación con 0.5 mg de CPG 7909 o CPG 24555 por inyección intramuscular a las semanas 0, 4 y 8. Se extrajo sangre de los animales a intervalos de tiempo regulares y se midieron los títulos de anticuerpo específico de HBsAg usando kits disponibles en el mercado (MONOLISA™ Anti-HBS).

Figura 17: Respuestas humorales en primates no humanos. Se inmunizaron monos Cynomolgus (3-5 años de edad; n = 5 por grupo) con Engerix-B (10 µg de HBsAg; 250 µg de Al3) en solitario o en combinación con 0.5 mg de CPG 7909 o CPG 24555 por inyección intramuscular las semanas 0, 4 y 8. Se ensayaron los plasmas de 4 semanas después de la 2a inmunización y 2 semanas después de la 3a inmunización para determinar la avidez de anticuerpo usando el procedimiento de elución con tiocianato de sodio.

Figuras 18A-18C: Respuestas de linfocitos T en primates no humanos: Se inmunizaron monos Cynomolgus (3-5 años de edad; n = 5 por grupo) con Engerix-B (10 µg de HBsAg; 250 µg de Al3) en solitario o en combinación con 0.5 mg de CPG 7909 o CPG 24555 por inyección intramuscular las semanas 0, 4 y 8. Se ensayaron monocitos de sangre periférica (PBMC) antes de la vacunación y a varios puntos de tiempo después de la vacunación para determinar la secreción de citocinas intracelulares mediada por linfocitos T CD4 específicos de HBsAg por citometría de flujo. La Figura 18A muestra la secreción de IFN-?. La Figura 18B muestra la secreción de IL-2. La Figura 18C muestra la secreción de TNF-a.

Figuras 19A-19B: Respuestas de linfocitos T: Linfocitos T CD4 polifuncionales; Análisis cuantitativo. Se inmunizaron monos Cynomolgus (3-5 años de edad; n = 5 por grupo) con Engerix-B (10 µg de HBsAg; 250 µg de Al3) en solitario o en combinación con 0.5 mg de CPG 7909 o CPG 24555 por inyección intramuscular las semanas 0, 4 y 8. Se ensayaron monocitos de sangre periférica (PBMC) a las 2 semanas después de la 3a inmunización para determinar los linfocitos T CD4 específicos de HBsAg que secretaban una, dos o tres citocinas por citometría de flujo. La Figura 19A muestra el número de linfocitos T CD4 específicos de HBsAg que secretan una, dos o tres citocinas por millón de linfocitos T CD4 analizados. La Figura 19B muestra la proporción de linfocitos T productores de citocinas individuales, dobles y triples dentro de la población de linfocitos T CD4 específicos de HBsAg total.

Figuras 20A-20B: Respuestas de linfocitos T: linfocitos T CD4 polifuncionales; análisis cualitativo. Se midió el número de células que secretaban IL-2, IFN-? y TNFa o combinaciones de estas citocinas. Se inmunizaron ratones Cynomolgus (3-5 años de edad; n = 5 por grupo) con Engerix-B (10 µg de HBsAg; 250 µg de Al3) en solitario o en combinación con 0.5 mg de CPG 7909 o CPG 24555 por inyección intramuscular las semanas 0, 4 y 8. Se ensayaron monocitos de sangre periférica (PBMC) a las 2 semanas después de la 3a inmunización para determinar el número de linfocitos T CD4 específicos de HBsAg que secretaban IL-2, IFN-? y TNFa o combinaciones de estas citocinas por citometría de flujo.

Descripción de las secuencias SEQ ID NO: 1 - Secuencia de nucleótidos de oligonucleótido inmunoestimulador CPG ODN 24555.

SEQ ID NO: 2 - Secuencia de nucleótidos de oligonucleótido inmunoestimulador CPG 10103.

SEQ ID NO: 3 - Secuencia de nucleótidos de oligonucleótido inmunoestimulador CPG 7909.

SEQ ID NO: 4 - Secuencia de nucleótidos del oligonucleótido sin CpG 22881.

SEQ ID NO: 5 - Secuencia de nucleótidos del oligonucleótido sin CpG 2137.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los aspectos de la invención se basan, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que la eliminación de un motivo CpG de un oligonucleótido inmunoestimulador no tenia un impacto negativo sobre la capacidad del oligonucleótido inmunoestimulador para aumentar las respuestas inmunes específicas de antígeno. También ha sido sorprendente descubrir que la eliminación de dicho motivo CpG permite la generación de una población de linfocitos T específicos de antígeno que es diferente. En particular, se ha descubierto que dicha población de linfocitos T específicos de antígeno comprende más linfocitos T secretores de IFN-gamma y más linfocitos T polifuncionales.

En aspectos de la invención, el oligonucleótido inmunoestimulador tiene la secuencia de ácido nucleico 5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3' (CPG ODN 24555; SEQ ID NO: 1 ). La secuencia de ácido nucleico del oligonucleótido inmunoestimulador de la SEQ ID NO: 1 difiere de un oligonucleótido inmunoestimulador descrito anteriormente (ODN 10103) 5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3' (SEQ ID NO: 2) por la inversión del dinucleótido CG más 3'. Las similitudes en la actividad entre los dos oligonucleótidos inmunoestimuladores es sorprendente ya que se ha descrito anteriormente que la actividad inmunoestimuladora de oligonucleótidos CpG depende del número de motivos CpG, de las secuencias que flanquean el dinucleótido CG, de la localización de motivo o motivos CpG y de la separación entre los motivos CpG (Bailas y col., 1996, , J. Immunol. 157(5): 1840-5; Hartmann y col., 2000, J. Immunol., 164(3): 1617-24; Klinman y col., 2003, Clin. Exp. Immunol., 133(2): 227-32). La eliminación del dinucleótido CG más 3' en el oligonucleótido inmunoestimulador CPG ODN 24555 (SEQ ID NO: 1) no dio como resultado un impacto negativo sobre la capacidad de este oligonucleótido inmunoestimulador para aumentar las respuestas inmunes específicas de antígeno como se habría esperado a partir de descripciones anteriores. El CPG ODN 24555 demostraba una actividad inmunoestimuladora similar y, en algunos casos aumentados, cuando se comparaba con CPG ODN 10103.

Además, se ha descubierto que CPG ODN 24555 induce una población diferente de linfocitos T específicos de antígeno en comparación con CPG ODN 10103 (véase las Figuras 8A-8B, cuadro 1 y cuadro 2). En particular, se ha descubierto sorprendentemente que la población de linfocitos T específicos de antígeno (en particular la población de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno) generada usando CPG ODN 24555 como adyuvante comprende más linfocitos T secretores de IFN-gamma y más linfocitos T polifuncionales en comparación con la población de linfocitos T específicos de antígeno generada usando CPG ODN 10103 o CPG ODN 7909.

Por ejemplo, se obtuvo una mayor proporción en linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que producían IFN-? cuando se comparaba con la población de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno obtenida con CpG ODN 10103. También se obtuvo una mayor proporción de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno polifuncionales que producían tanto IFN-? como TNF-a, tanto IFN-? como IL-2 o tanto TNF- como IL-2, o incluso triples productores que secretaban IFN-?, TNF-a e IL-2 cuando se comparaba con la población de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno obtenida con CPG ODN 10103 o CPG ODN 7909. También se obtuvo una proporción mayor de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno productores de TNF-a cuando se comparaba con la población de células CD8+ específicas de antígeno obtenidas con CPG ODN 10103. También se obtuvo una mayor proporción de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno productores tanto de IFN-? como de IL-2, tanto de TNF-a como de IL-2, o incluso triples productores que secretaban IFN-?, TNF-a e IL-2 cuando se comparaba con la población de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno obtenida con CPG ODN 10103 o CPG ODN 7909.

Recientemente se ha destacado la importancia de la polifuncionalidad de linfocitos T en la inmunogenicidad. En particular, la polifuncionalidad de linfocitos T específicos de antigeno en términos de producción de quimiocinas (tales como IFN-?, TNF-a e IL-2) se ha correlacionado en algunos casos con su potencial protector (véase, por ejemplo, Harari A, y col., Immunol Rev. 2006; 211 : 236-54, Makedonas G y Betts MR. Springer Semin Immunopathol. 2006; 28(3): 209-19, Precopio ML y col., J Exp Med. 2007 204(6): 1405-16, Xu R y col. Vaccine. 2008; 26(37): 4819-29) que, según se cree, se debe a su mejor función efectora en comparación con linfocitos T que secretan una sola citocina.

El CPG ODN 24555 permite ventajosamente generar poblaciones de linfocitos T específicos de antígeno polifuncionales cuando se usa como un adyuvante que puede ser importante en un entorno de vacunación.

Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden ser bicatenarios o monocatenarios. Generalmente, las moléculas bicatenarias son más estables in vivo mientras que las moléculas monocatenarias tienen una mayor actividad inmune. En algunos aspectos de la invención, se prefiere que el ácido nucleico sea monocatenario y en otros aspectos se prefiere que el ácido nucleico sea bicatenario.

Los términos "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se usan indistintamente en este documento para referirse a nucleótidos múltiples (es decir, moléculas que comprenden un azúcar (por ejemplo, ribosa o desoxirribosa) unido a un grupo fosfato y a una base orgánica intercambiable que es una pirimidina sustituida (por ejemplo, citosina (C), timidina (T) o uracilo (U)) o una purina sustituida (por ejemplo, adenina (A) o guanina (G)). Como se usa en este documento, los términos se refieren a oligodesoxirribonucleótidos, oligorribonucleótidos (es decir, un polinucleótido menos el fosfato) y cualquier otro polímero que contenga bases orgánicas. Pueden obtenerse moléculas de ácido nucleico a partir de fuentes de ácido nucleico existentes (por ejemplo, ADN genómico o ADNc), pero preferiblemente son sintéticos (por ejemplo, producidos por síntesis de ácido nucleico).

En aspectos de la invención, los oligonucleótidos inmunoestimuladores pueden incluir diversas modificaciones y sustituciones químicas en comparación con el ARN y ADN natural, que impliquen un puente internucleosidico fosfodiéster, una unidad de ß-D-ribosa y/o una base de nucleósido natural (adenina, guanina, citosina, timina o uracilo). El especialista conoce ejemplos de modificaciones químicas y se describen, por ejemplo, en Uhlmann E. y col. (1990), Chem. Rev. 90: 543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke, S.T. y col. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36: 107-129; y Hunziker J. y col., (1995), Mod. Synth. Methods 7: 331-417. Un oligonucleótido de conformidad con la invención puede tener una o más modificaciones, encontrándose cada modificación en un puente internucleosidico fosfodiéster particular y/o en una unidad de ß-D-ribosa particular y/o en una posición de base de nucleósido natural particular en comparación con un oligonucleótido de la misma secuencia que está compuesto por ADN o ARN natural.

En aspectos de la invención, los oligonucleótidos pueden comprender una o más modificaciones. Dichas modificaciones pueden seleccionarse de: a) la sustitución de un puente internucleosidico fosfodiéster localizado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleósido por un puente internucleosídico modificado, b) la sustitución de un puente fosfodiéster localizado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleósido por un puente desfosfo, c) la sustitución de una unidad de fosfato de azúcar de la estructura de fosfato de azúcar por otra unidad, d) la sustitución de una unidad de ß-D-ribosa por una unidad de azúcar modificada y e) la sustitución de una base de nucleósido natural.

Los ácidos nucleicos también incluyen purinas y pirimidinas sustituidas, tales como bases modificadas de pirimidina con propino C-5 y de purina 7-desaza-7-substituida (Wagner y col., 1996, Nat. Biotechnol. 14: 840-4). Las purinas y pirimidinas incluyen, pero sin limitación, adenina, citosina, guanina, timidina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina y otras nucleobases de origen natural y no natural, y restos aromáticos sustituidos y no sustituidos. Los especialistas en la técnica conocen bien otras modificaciones de este tipo.

Una base modificada es cualquier base que sea químicamente diferente de las bases de origen natural que se encuentran típicamente en el ADN y ARN, tales como T, C, G, A y U pero que comparten estructuras químicas básicas con estas bases de origen natural. La base de nucleósido modificado puede seleccionarse, por ejemplo, de hipoxantina, dihidrouracilo pseudouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-aminouracilo, 5-alquiluracilo (C1-C6), 5-alqueniluracilo (C2-C6), 5-alquíniluracilo (C2-C6), 5-(hidroximetill)uracílo, 5-clorouracilo, 5-fluorourac¡lo, 5-bromouracilo, 5-hidroxicitosina, 5-alquilcitosina (C1-C6), 5-alquenilcitosina (C2-C6), 5-alquinilcitosina (C2-C6), 5-clorocitosina, 5- fluorocitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilguanina, 2,4-diamino-purina, 8-azapurina, una 7-desazapurina sustituida, preferiblemente 7-desaza-purina 7-sustituida y/o 7-desaza-purina 8-substituida, 5-hidroximetilcitosina, ?/4-alquilcitosina (por ejemplo, ?/4-etilcitosina), 5-hidroxidesoxicitidina, 5-hidroximetildesoxicitidina, ?/4-alquildesoxicitidina (por ejemplo, ?/4-etildesoxicitidina), 6-tiodesoxiguanosina, desoxirribonucleósidos de nitropirrol, C5-propinilpirimidina, diaminopurina (por ejemplo 2,6-diaminopurina), inosina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina u otras modificaciones de una base de nucleósidó natural. Esta lista pretende ser ejemplar y no debe considerarse limitante.

En algunos aspectos de la invención, el dinucleótido CpG de los oligonucleótidos inmunoestimuladores descritos en este documento está preferiblemente no metilado. Un motivo CpG no metilado es una secuencia dinucleotídica de citosina-guanina no metilada (es decir, una citosina 5' no metilada seguida de guanosina 3' y unida por un enlace fosfato). En otros aspectos, los motivos CpG están metilados. Un motivo CpG metilado es una secuencia dinucleotídica de citosina-guanina metilada (es decir, una citosina 5' metilada seguida de una guanosina 3' y unida por un enlace fosfato).

En algunos aspectos de la invención, un oligonucleótido inmunoestimulador puede contener una citosina modificada. Una citosina modificada es un análogo de base de pirimidina de origen natural o de origen no natural de citosina que puede sustituir a esta base sin afectar a la actividad inmunoestimuladora del oligonucleótido. Las citosinas modificadas incluyen, pero sin limitación, citosinas sustituidas en posición 5 (por ejemplo, 5-metil-citosina, 5-fluoro-citosina, 5-cloro-citosina, 5-bromo-citosina, 5-yodo-citosina, 5-hidroxi-citosina, 5-hidroximetil-citosina, 5-difluorometil-citosina y 5-alquinil-citosina no sustituida o sustituida), citosinas sustituidas en posición 6, citosinas sustituidas en posición ?/4 (por ejemplo ?/4-etil-citosina), 5-aza-citosina, 2-mercapto-citosina, isocitosina, pseudo-isocitosina, análogos de citosina con sistemas de anillo condensado (por ejemplo, ?/,?/'-propilencitosina o fenoxazina). Algunas de las citosinas preferidas incluyen 5-metil-citosina, 5-fluoro-citosina, 5-hidroxi-citosina, 5-hidroximetil-citosina y ?/4-etil-citosina. En otra modalidad de la invención, la base de citosina está sustituida por una base universal (por ejemplo 3-nitropirrol, base P), un sistema de anillo aromático (por ejemplo, fluorobenceno o difluorobenceno) o un átomo de hidrógeno (dSpacer). En algunos aspectos, un oligonucleótido inmunoestimulador puede contener uracilo y/o sus derivados (por ejemplo, 5-fluoro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-bromovinil-uracilo, 4-tio-uracilo, 5-hidroxi-uracilo, 5-propinil-uracilo).

En algunos aspectos de la invención, un oligonucleótido inmunoestimulador puede contener una guanina modificada. Una guanina modificada es un análogo de base de purina de origen natural o de origen no natural de guanina que puede sustituir a esta base sin afectar a la actividad inmunoestimuladora del oligonucleótido. Las guaninas modificadas incluyen, pero sin limitación, 7-desazaguanina, guanina 7-desaza-7-sustituida, hipoxantina, guaninas ?/2-sustituidas (por ejemplo, ?/2-metil-guanina), 5- amino-3-metil-3H,6/-/-tiazol[4,5-d]pirimidin-2,7-diona, 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, purina, indol, adenina, adeninas sustituidas (por ejemplo, ?/6-metil-adenina, 8-oxo-adenina), guanina 8-sustituida (por ejemplo, 8-hidroxiguanina u 8-bromoguanina) y 6-tioguanina. En otra modalidad de la invención, la base de guanina está sustituida por una base universal (por ejemplo, 4-metil-indol, 5-nitro-indol o base K), un sistema de anillo aromático (por ejemplo, benzimidazol o dicloro-benzimidazol, amida del ácido 1-metil-1 H-[1 ,2,4]triazol-3-carboxilico) o un átomo de hidrógeno (dSpacer).

En determinados aspectos, los oligonucleótidos pueden incluir enlaces internucleotídicos modificados. Estos enlaces modificados pueden ser parcialmente resistentes a degradación (por ejemplo, están estabilizados). Una "molécula de ácido nucleico estabilizada" se referirá a una molécula de ácido nucleico que es relativamente resistente a degradación in vivo (por ejemplo, mediante una exo- o endonucleasa). La estabilización puede estar en función de la longitud o de la estructura secundaria. Los ácidos nucleicos que tienen una longitud de decenas a cientos de kilobases son relativamente resistentes a la degradación in vivo. Para ácidos nucleicos más cortos, la estructura secundaria puede estabilizar y aumentar su efecto. La formación de una estructura de tallo-bucle puede estabilizar una molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, si el extremo 3' de un ácido nucleico tiene autocomplementariedad con una región cadena arriba de modo que puede plegarse hacia atrás y formar una estructura de tallo-bucle, entonces el ácido el nucleico puede estabilizarse y presentar más actividad.

La estabilización de ácido nucleico también puede conseguirse mediante modificaciones de la cadena principal de fosfato. Los oligonucleótidos que tienen enlaces fosforotioato, en algunas modalidades, pueden proporcionar una actividad máxima y proteger al oligonucleótido de la degradación por exo- y endonucleasas intracelulares.

Para uso ¡n vivo, los ácidos nucleicos son preferiblemente relativamente resistentes a degradación (por ejemplo, mediante endo- y exonucleasas). Se ha demostrado que la modificación de la cadena principal de ácido nucleico proporciona una actividad aumentada de los ácidos nucleicos cuando se administran in vivo. Las estructuras secundarias, tales como tallos-bucles, pueden estabilizar a los ácidos nucleicos frente a la degradación. Como alternativa, la estabilización de ácidos nucleicos puede conseguirse por modificaciones de la cadena principal de fosfato. Un ácido nucleico estabilizado preferido tiene al menos una cadena principal modificada con fosforotioato parcial. Los fosforotioatos pueden sintetizarse usando técnicas automatizadas que emplean química de fosforamidato o H-fosfonato. Pueden generarse aril- y alquil-fosfonatos por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4,469,863; y pueden generarse alquilfosfotriésteres (en los que el resto oxígeno cargado está alquilado como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5,023,243 y en la Patente Europea N° 092,574) mediante síntesis en fase sólida automatizada usando reactivos disponibles en el mercado. Se han descrito procedimientos para generar otras modificaciones y sustituciones de la cadena principal de ADN (Uhlmann, E. y Peyman, A. (1990) Chem. Rev. 90: 544; Goodchild, J. (1990) Bioconjugate Chem. 1 : 165). Los ácidos nucleicos 2'-0-metilo con motivos CpG también causan activación inmune, así como los ácidos nucleicos CpG modificados con etoxi. De hecho, no se han descubierto modificaciones de la cadena principal que supriman completamente el efecto de CpG, aunque se reduce enormemente por sustitución de la C con una 5-metil C. Las construcciones que tienen enlaces fosforotioato proporcionan una actividad máxima y protegen al ácido nucleico de la degradación por exo- y endonucleasas intracelulares. Otros ácidos nucleicos modificados incluyen ácidos nucleicos modificados con fosfodiéster, combinaciones de ácido nucleico con fosfodiéster y fosforotioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditioato, p-etoxi y combinaciones de los mismos. Cada una de estas combinaciones y sus efectos particulares sobre las células inmunes se analizan en más detalle con respecto a ácidos nucleicos CpG en la Solicitudes de Patente PCT Publicadas PCT/US95/01570 (WO 96/02555) y PCT/US97/19791 (WO 98/18810) y en la Patente de Estados Unidos N° 6,194,388 B1 expedida el 27 de febrero de 2001 y la Patente de Estados Unidos N° 6,239,116 B1 expedida el 29 de mayo de 2001. Se piensa que estos ácidos nucleicos modificados pueden mostrar más actividad estimuladora debido a la resistencia a nucleasas aumentada, a una captación celular aumentada y a una unión a proteínas aumentada y/o una localización intracelular alterada.

Para la administración in vivo, los ácidos nucleicos pueden asociarse con una molécula que de cómo resultado una unión con mayor afinidad a una superficie de célula diana (por ejemplo, célula B, célula monocítica o célula asesina natural (NK)) y/o una captación celular aumentada por células diana para formar un "complejo de suministro de ácido nucleico". Los ácidos nucleicos pueden asociarse iónicamente o covalentemente con moléculas apropiadas usando procedimientos que son bien conocidos en la técnica. Pueden usarse una diversidad de agentes de acoplamiento o entrecruzamiento tales como proteína A, carbodiimida o /V-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP). Como alternativa, los ácidos nucleicos pueden encapsularse en liposomas o virosomas usando técnicas bien conocidas.

Otros ácidos nucleicos estabilizados incluyen, pero sin limitación, análogos de ADN no iónicos tales como alquil- y aril-fosfatos (en los que el oxígeno de fosfonato cargado se sustituye por un grupo alquilo o arilo), fosfodiéster y alquilfosfotriésteres, en los que el resto de oxígeno cargado está alquilado. Los ácidos nucleicos que contienen un diol, tales como tetraetilenglicol o hexaetilenglicol, en cualquiera o ambos extremos terminales también han demostrado ser sustancialmente resistentes a la degradación por nucleasas. En algunas modalidades, un oligonucleótido inmunoestimulador de la invención puede incluir al menos un análogo de nucleótido sustituido lipófilo y/o un dinucleótido de pirimidina-purina.

Los oligonucleótidos pueden tener uno o dos extremos 5' accesibles. Es posible generar oligonucleótidos modificados que tengan dos extremos 5' de este tipo, por ejemplo, por unión de dos oligonucleótidos a través de un enlace 3'-3' para generar un oligonucleótido que tenga uno o dos extremos 5' accesibles. El enlace 3'3' puede ser un fosfodiéster, fosforotioato o cualquier otro puente internucleosídico modificado. Se conocen en la técnica procedimientos para realizar dichos enlaces. Por ejemplo, dichos enlaces se han descrito en Seliger, H. y col., Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3' and 5'-5'-internucleotidic linkages, Nucleosides & Nucleotides (1991 ), 10 (1-3), 469-77 y Jiang, y col., Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7 (12), 2727-2735.

Además, pueden prepararse oligonucleótidos con unión 3'-3' en los que el enlace entre los nucleósidos terminales 3' no es un fosfodiéster, fosforotioato ni otro puente modificado usando un espaciador adicional, tal como un resto tri- o tetraetilenglicol fosfato (Durand, M. y col., Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31 (38), 9197-204, Patente de Estados Unidos N° 5,658,738 y Patente de Estados Unidos N° 5,668,265). Como alternativa, el engarce no nucleotídico puede proceder de etanodiol, propanodiol o de una unidad de desoxirribosa abásica (dSpacer) (Fontanel, Marie Laurence y col., Sterical Recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-attached to oligonucleotides; Nucleic Acids Research (1994), 22 (1 1), 2022-7) usando química de fosforamidita convencional. Los engarces no nucleotídicos pueden incorporarse una vez o múltiples veces o combinarse entre sí dejando cualquier distancia deseable entre los extremos 3' de los dos oligonucleótidos a unir.

Un puente internucleosidico fosfodiéster localizado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleósido puede sustituirse por un puente internucleosidico modificado, seleccionándose el puente internucleosidico modificado por ejemplo de puentes fosforotioato, fosforoditioato, A/R^-fosforamidato, boranofosfato, a-hidroxibencil fosfonato, éster de fosfato-(Ci-C2i)-0-alquilo, fosfato-[(C6-Ci2)aril-(Ci-C2i)-0-alquil]éster, (CrC8)alquilfosfonato y/o (C6-C12)arilfosfonato, (C7-Ci2)-a-hidroximetil-arilo (por ejemplo, como se describe en el documento WO 95/01363), donde el arilo-(C6-C12), arilo-(C6-C2o) y arilo-(C6-C14) se sustituyen opcionalmente por halógeno, alquilo, alcoxi, nitro, ciano y donde R1 y R2 son, de forma independiente entre sí, hidrógeno, alquilo-(Cr Ci8), arilo-(C6-C2o), arilo-(C6-Ci4), alquilo-(Ci-C8), preferiblemente hidrógeno, alquilo-(CrC8), preferiblemente alquilo-(Ci-C4) y/o metoxietilo o forma R y R2 junto con el átomo de nitrógeno que lo lleva, un anillo heterocíclico de 5 ó 6 miembros que puede contener adicionalmente un heteroátomo adicional del grupo O, S y N.

La sustitución de un puente fosfodiéster localizado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleósido por un puente desfosfo (se describe puentes desfosfo, por ejemplo, en Uhlmann E. y Peyman A. en "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Capítulo 16, pág. 355 ff), seleccionándose el puente desfosfo por ejemplo de los puentes desfosfo formacetal, 3'-tioformacetal, metilhidroxilamina, oxima, metilendimetil-hidrazo, dimetilensulfona y/o grupos sililo.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de la invención pueden tener opcionalmente cadenas principales quiméricas. Una cadena principal quimérica es una que comprende más de un tipo de enlace. En una modalidad, la cadena principal quimérica puede representarse mediante la fórmula: 5' Y1N1ZN2Y2 3'. Y-i e Y2 son moléculas de ácido nucleico que tienen entre 1 y 10 nucleótidos. e Y2 incluyen cada uno al menos un enlace internucleotídico modificado. Puesto que al menos dos nucleótidos de los oligonucleótidos quiméricos incluyen modificaciones de la cadena principal estos ácidos nucleicos son un ejemplo de un tipo de ácido nucleicos inmunoestimuladores estabilizados.

Con respecto a los oligonucleótidos quiméricos, Y1 e Y2 se consideran independientes entre si. Esto significa que cada uno de Y1 e Y2 puede o no tener secuencias diferentes y enlaces de cadena principal diferentes entre sí en la misma molécula. En algunas modalidades, Y1 y/o Y2 tienen entre 3 y 8 nucleótidos. Ni y N2 son moléculas de ácido nucleico que tienen entre 0 y 5 nucleótidos siempre que N-|ZN2 tengan al menos 6 nucleótidos en total. Los nucleótidos de N-|ZN2 tienen una cadena principal fosfodiéster y no incluyen ácidos nucleicos que tengan una cadena principal modificada. Z es un motivo de ácido nucleico inmunoestimulador seleccionado preferiblemente de los oligonucleótidos inmunoestimuladores enumerados en este documento.

Los nucleótidos centrales (NiZN2) de la fórmula ??????2?2 tienen enlaces internucleotídicos fosfodiéster e Yi e Y2 tienen al menos uno, pero pueden tener más de uno o incluso pueden tener todos los enlaces internucleotídicos modificados. En modalidades preferidas, Yi y/o Y2 tienen al menos dos o entre dos y cinco enlaces internucleotídicos modificados o Yi tiene cinco enlaces internucleotídicos modificados e Y2 tiene dos enlaces internucleotídicos modificados. El enlace internucleotídico modificado en algunos casos es un enlace modificado fosforotioato, un enlace fosforoditioato o un enlace modificado p-etoxi.

Los ácidos nucleicos también incluyen ácidos nucleicos que tienen azúcares de cadena principal que están unidos covalentemente a grupos orgánicos de bajo peso molecular distintos de un grupo hidroxilo en la posición 2' y distintos de un grupo fosfato en la posición 5'. Por lo tanto, los ácidos nucleicos modificados pueden incluir un grupo ribosa 2'-0-alquilado. Además, los ácidos nucleicos modificados pueden incluir azúcares tales como arabinosa o 2'-fluoroarabinosa en lugar de ribosa. Por lo tanto, los ácidos nucleicos pueden ser heterogéneos en la composición de estructura principal conteniendo de este modo cualquier combinación posible de unidades poliméricas unidas entre sí, tales como ácidos peptidonucleicos (que tienen una cadena principal de aminoácidos con bases de ácido nucleico). En algunas modalidades, los ácidos nucleicos son homogéneos en la composición de la cadena principal.

Una unidad de fosfato de azúcar (es decir, una ß-D-ribosa y un puente internucleosídico fosfodiéster juntos que forman una unidad de fosfato de azúcar) de la cadena principal de fosfato de azúcar (es decir, una cadena principal de fosfato de azúcar está compuesta por unidades de fosfato de azúcar) puede sustituirse por otra unidad, donde por ejemplo la otra unidad es adecuada para generar un oligómero "derivado de morfolino" (como se describe, por ejemplo, en Stirchak E. P. y col. (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6129-41), es decir, por ejemplo, la sustitución por un derivado de morfolino; o generar un ácido nucleico de poliamida ("PNA"; como se describe, por ejemplo, en Nielsen P. E. y col. (1994) Bioconjug. Chem. 5:3-7), es decir, por ejemplo, la sustitución de una unidad de cadena principal de PNA, por ejemplo, por 2-aminoetilglicina. El oligonucleótido puede tener otras modificaciones y sustituciones de cadena principal de carbohidrato, tales como ácidos peptidonucleicos con grupos fosfatos (PHONA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA), y oligonucleótidos que tienen secciones de cadena principal con engarces alquilo o engarces amino. El engarce alquilo puede estar ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido y ser quiralmente puro o una mezcla racémica.

Una unidad de ß-ribosa o una unidad de -D-2'-desoxirribosa puede sustituirse por una unidad de azúcar modificado, seleccionándose la unidad de azúcar modificado por ejemplo de ß-D-ribosa, a-D-2'-desoxirribosa, L-2'-desoxirribosa, 2'-F-2'-desoxirribosa, 2'-F-arabinosa, 2'-0-(C1-C6)alquil-ribosa, preferiblemente 2'-0-(Ci-C6)alquil-ribosa es 2'-0-metilrribosa, 2'-0-(C1-C6)alquenil-ribosa, 2'-[0-(C1-C6)alquil-0-(Ci-C6)alquil]-ribosa, 2'-NH2-2'-desoxirribosa, ß-D-xilo-furanosa, a-arabinofuranosa, 2,4-didesoxi-p-D-eritro- hexo-piranosa, un carbocíclico (descrito, por ejemplo, en Froehler J. (1992) Am. Chem. Soc. 1 14: 8320) y/o análogos de azúcar de cadena abierta (descritos, por ejemplo, en Vandendriessche y col. (1993) Tetrahedron 49: 7223) y/o análogos de bicicloazúcar (descritos, por ejemplo, en Tarkoy M. y col. (1993) Helv. Chim. Acta. 76: 481 ).

En algunas modalidades, el azúcar es 2'-0-metilrribosa, particularmente para uno o ambos nucleótidos unidos por un enlace internucleosidico fosfodiéster o similar a fosfodiéster.

Los oligonucleótidos de la invención pueden sintetizarse de novo usando cualquiera de varios procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el procedimiento de b-cianoetil fosforamidita (Beaucage, S. L, y Caruthers, M. H., (1981) Tet. Let. 22: 1859); procedimiento de nucleósido H-fosfonato (Garegg y col., (1986) Tet. Let. 27: 4051-4054; Froehler y col., (1986) Nucí. Acid Res.14: 5399-5407; Garegg y col., (1986) 27: 4055-4058; Gaffney y col., (1988) Tet. Let. 29: 2619-2622). Estas químicas pueden realizarse mediante una diversidad de sintetizadores de ácido nucleico automatizados disponibles en el mercado. Estos oligonucleótidos se denominan oligonucleótidos sintéticos. Como alternativa, pueden producirse dinucleótidos ricos en T y/o TG a gran escala en plásmidos (véase Sambrook T. y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor laboratory Press, Nueva York, 1989) y separarse en trozos más pequeños o administrarse como plásmidos completos. Pueden prepararse ácidos nucleicos a partir de secuencias de ácido nucleico existentes (por ejemplo, genómico o ADNc) usando técnicas conocidas, tales como las que emplean enzimas de restricción, exonucleasas o endonucleasas.

En una modalidad de la invención, todos los enlaces internucleotídicos del oligonucleótido inmunoestimulador son enlaces fosforotioato.

Pueden sintetizarse cadenas principales modificadas tales como fosforotioatos usando técnicas automatizadas que emplean química de fosforamidato o /-/-fosfonato. Pueden generarse aril- y alquil-fosfonatos, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4,469,863 y pueden generarse alquilfosfotriésteres (en los que el resto oxígeno cargado está alquilado, como se describen en la Patente de Estados Unidos N° 5,023,243) mediante síntesis en fase sólida automatizada usando reactivos disponibles en el mercado. Se han descrito procedimientos para generar otras modificaciones y sustituciones de cadena principal de ADN (por ejemplo, Uhlmann, E. y Peyman, A., Chem. Rev. 90: 544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1 : 165, 1990).

Los ácidos nucleicos preparados de esta forma se denominan ácido nucleico aislado. Un "ácido nucleico aislado" se refiere generalmente a un ácido nucleico que está separado de componentes, con lo que está separado de una célula, de un núcleo, de mitocondrias o de cromatina y cualquier componente que pueda considerarse como contaminante.

En una modalidad, el oligonucleótido inmunoestimulador de la invención consiste en 5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3' donde * indica enlace fosforotioato.

En una modalidad, el oligonucleótido inmunoestimulador de la invención induce que una alta proporción de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno secreten IFN-?. En una modalidad, el oligonucleótido inmunoestimulador de la invención es capaz de inducir que al menos el 40%, preferiblemente al menos el 45%, aún preferiblemente al menos el 50%, aún preferiblemente aproximadamente el 53% de los linfocitos T CD4+ específicos de antígeno secreten IFN-?, en la población de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que secretan IFN-?, TNF-a y/o IL-2. En una modalidad, dicha proporción de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que secretan IFN-? se determina por citometría de flujo policromática. Un ejemplo de dicha determinación se describe en el Ejemplo 1 del presente documento (véase el párrafo 'Poblaciones de linfocitos T secretores de multicitocinas específicos de antígeno').

En una modalidad, el oligonucleótido inmunoestimulador de la invención es capaz de inducir que al menos el 10%, preferiblemente al menos el 15%, aún preferiblemente al menos el 20%, aún preferiblemente aproximadamente el 22% de los linfocitos T CD4+ específicos de antígeno secreten tanto IFN-? como TNF-a, en la población de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que secretan IFN-?, TNF- y/o IL-2. En una modalidad, dicha proporción de linfocitos T CD4+ específicos de antigeno polifuncionales que secretan tanto IFN-? como TNF-a se determina por citometría de flujo policromática. Un ejemplo de dicha determinación se describe en el Ejemplo 1 del presente documento (véase el párrafo 'Poblaciones de linfocitos T secretores de multicitocinas específicos de antigeno').

En una modalidad, el oligonucleótido inmunoestimulador de la invención es capaz de inducir que al menos el 30%, preferiblemente al menos el 40%, aún preferiblemente al menos el 45%, aún preferiblemente aproximadamente el 47% de los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno secrete tanto IFN-? como TNF- , en la población de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno que secretan IFN-?, TNF-a y/o IL-2. En una modalidad, dicha proporción de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno polifuncionales que secretan tanto IFN-? como TNF-a se determina por citometría de flujo policromática. Un ejemplo de dicha determinación se describe en el Ejemplo 1 del presente documento (véase el párrafo 'Poblaciones de células secretoras de multicitocinas específicas de antígeno').

Los ácidos nucleicos de la invención pueden usarse como terapias independientes. Una terapia independiente es una terapia en la que puede conseguirse un resultado profilácticamente o terapéuticamente beneficioso a partir de la administración de un solo agente o composición. Por consiguiente, los ácidos nucleicos descritos en este documento pueden usarse en solitario en la prevención o tratamiento de una enfermedad infecciosa debido a que los ácidos nucleicos son capaces de inducir respuestas inmunes que sean beneficiosas para el desenlace terapéutico de estas enfermedades. Algunos de los procedimientos a los que se hace referencia en este documento se refieren al uso de los ácidos nucleicos en combinación con otros agentes terapéuticos.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden usarse en una vacuna. Cuando se usan en una vacuna, el ácido nucleico puede administrarse con un antigeno. Preferiblemente, el antígeno es específico para el trastorno que se busca prevenir o tratar. Por ejemplo, si el trastorno es una enfermedad infecciosa, el antígeno procede preferiblemente del organismo infeccioso (por ejemplo, bacteria, virus, parásito, hongo, etc.), si el trastorno implica un autoantígeno (por ejemplo, un tumor, un trastorno neurodegenerativo tal como enfermedad de Alzheimer, un antígeno frente a un anticuerpo humano o un antígeno que se expresa a partir de elementos retrovirales endógenos humanos), el antígeno procede preferiblemente del trastorno particular asociado con el antígeno. Si el trastorno implica una sustancia adictiva, el antígeno procede preferiblemente de la sustancia adictiva particular asociada con el antígeno (por ejemplo, un hapteno de nicotina).

Como se usan en este documento, los términos "trastorno" y "enfermedad" se usan indistintamente.

En una modalidad, la invención se refiere al oligonucleótido inmunoestimulador de la invención para el uso como un adyuvante en una vacuna para el tratamiento o la prevención de una enfermedad, comprendiendo dicha vacuna al menos un antígeno y beneficiándose dicha enfermedad de la generación de linfocitos T específicos de antígeno polifuncionales.

Se ha descubierto que el CPG ODN 24555 induce que una mayor proporción de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno produzcan IFN-? en comparación con una población de linfocitos T CD4+ específicos de antigeno obtenida con CPG ODN 10103. Además, se obtuvo una mayor proporción de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno polifuncionales que producen tanto IFN-? como TNF-a, tanto IFN-? como IL-2, tanto TNF-a como IL-2, o incluso triples productores de IFN-y,TNF- e IL-2 en comparación con la población de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno obtenida con CPG ODN 10103 o CPG ODN 7909. Se obtuvo también una mayor proporción de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno polifuncionales que producían tanto IFN-? como IL-2, tanto TNF-a como IL-2, o incluso triples productores de IFN-?, TNF-a e IL-2 en comparación con la población de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno obtenida con CPG ODN 10103 o CPG ODN 7909.

El IFN-?, TNF- e IL-2 se han implicado en una diversidad de enfermedades. Por ejemplo, el TNF-a se ha implicado en el cáncer y el IFN-? se ha implicado en enfermedades infecciosas tales como infecciones virales. Por lo tanto, en una modalidad, la invención se refiere al oligonucleótido inmunoestimulador de la invención para el uso como un adyuvante en una vacuna para el tratamiento o la prevención del cáncer. En una modalidad, la invención se refiere al oligonucleótido inmunoestimulador de la invención para el uso como un adyuvante en una vacuna para el tratamiento o la prevención del cáncer, donde dicha vacuna comprende al menos un antígeno tumoral, preferiblemente cualquiera de los antígenos tumorales descritos en este documento.

En una modalidad, la invención se refiere al oligonucleótido inmunoestimulador de la invención para el uso como adyuvante en una vacuna para el tratamiento o la prevención de una enfermedad infecciosa. En una modalidad, la invención se refiere al oligonucleótido inmunoestimulador de la invención para el uso como un adyuvante en una vacuna para el tratamiento o la prevención de una enfermedad infecciosa, donde dicha vacuna comprende al menos un antigeno microbiano, preferiblemente cualquiera de los antígenos microbianos descritos en este documento.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores son útiles en algunos aspectos de la invención como vacuna profiláctica para la prevención de una infección (es decir, una enfermedad infecciosa) un trastorno asociado con autoantígeno o un trastorno asociado con una sustancia adictiva. Preferiblemente, la vacunación profiláctica se usa en sujetos a los que no se les ha diagnosticado la afección para la que se busca vacuna y, más preferiblemente, los sujetos se consideran en riesgo de desarrollar una de estas afecciones. Por ejemplo, el sujeto puede ser uno que esté en riesgo de desarrollar una infección con un organismo infeccioso o susceptible a un trastorno asociado con un autoantígeno o susceptible a un trastorno asociado con una sustancia adictiva.

Un sujeto en riesgo, como se usa en este documento, es un sujeto que tiene cualquier riesgo de exposición a un patógeno causante de infección, un trastorno asociado con un autoantigeno o un trastorno asociado con una sustancia adictiva. Un sujeto en riesgo también incluye sujetos que tienen una predisposición a desarrollar dichos trastornos. Algunas predisposiciones pueden ser genéticas (y por lo tanto pueden identificarse mediante análisis genético o por la historia familiar). Algunas predisposiciones son ambientales (por ejemplo, exposición previa a agentes infecciosos, autoantigenos o sustancias adictivas). Para un sujeto en riesgo de desarrollar una infección, un ejemplo de dichos sujetos es un sujeto que vive en o que espera viajar a un área en la que se ha encontrado o existe un tipo particular de agente infeccioso o puede ser un sujeto que por su estilo de vida o procedimientos médicos se exponga a un organismo directa o indirectamente por contacto con fluidos corporales que puedan contener organismos infecciosos. Los sujetos en riesgo de desarrollar una infección también incluyen poblaciones generales a las que una agencia médica recomiende vacunación para un organismo infeccioso particular.

Un sujeto es un sujeto tratado por la medicina veterinaria, un roedor o un sujeto no roedor. Los sujetos no roedores incluyen, pero sin limitación, seres humanos o animales vertebrados tales como perro, gato, caballo, vaca, cerdo, oveja, cabra, pollo, primate (por ejemplo, mono) y peces (especies de acuicultura, por ejemplo, salmón). Los sujetos roedores incluyen, pero sin limitación, ratas y ratones. En algunas modalidades, un sujeto es un ser humano.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores también pueden administrarse a un sujeto sin un antígeno para protección a más corto plazo frente a una infección. En este caso, dosis repetidas permitirán una protección a mayor largo plazo.

Un sujeto que tiene una infección es un sujeto que se ha expuesto a un patógeno infeccioso y tiene niveles detectables agudos o crónicos del patógeno en el cuerpo o en residuos corporales. Cuando se usan terapéuticamente, los oligonucleótidos inmunoestimuladores pueden usarse de forma independiente o en combinación con otro agente terapéutico. Por ejemplo, pueden usarse oligonucleótidos inmunoestimuladores terapéuticamente con un antígeno para montar una respuesta inmune sistémica o mucosa específica de antígeno que sea capaz de reducir el nivel de o erradicar el patógeno infeccioso.

Una enfermedad infecciosa, como se usa en este documento, es una enfermedad que surge de la presencia de un microorganismo extraño en el cuerpo. Es particularmente importante desarrollar estrategias vacunales eficaces y tratamientos para proteger las superficies mucosas del cuerpo que son el sitio principal de entrada de patógenos.

Un trastorno asociado con un autoantígeno es cualquier trastorno que está causado por un antígeno de las propias células o productos celulares del sujeto que causa una respuesta inmune en dicho sujeto. Por ejemplo, en algunas modalidades, un autoantígeno es un antígeno tumoral, un antígeno asociado con enfermedad de Alzheimer, un antígeno frente a un anticuerpo, o un antígeno que se expresa a partir de elementos retrovirales endógenos humanos. Un antígeno tumoral puede ser HER2, MAGE, NYESO-1 , PSA, CEA o una forma variante de EGFR. Un antígeno asociado con la enfermedad de Alzheimer puede ser tau o ß-amiloide. Un antígeno frente a un anticuerpo puede ser un antígeno frente a un anticuerpo humano, por ejemplo, en algunas modalidades el antígeno es IgE.

En algunas modalidades, un antígeno tumoral es MAGE A1 , MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A6, MAGE A10, MAGE A12, HAGE (CT13), BAGE, BORIS, SSX-2, LAGE-1 , CAMEL (fase de lectura abierta LAGE-1 alt), GAGE 1 ,2,3, TRAG-3, NY-ESO-1 , Melan-A/MART-1 , tírosinasa, tyrpl (gp75), tyrp2, gp100/pmel17, PAP, PSA, CEA, Ep-CAM, PSMA, MUC1 , MUC2, HER-2, AFP, EphA2, FGF-5, htert, ¡CE, Livina (ML-IAP), RAGE, RU2, Survivína, Survivina 2B, WT1 , antígeno de Thomsen-Friedenreich (TF), 5T4, PSCA, STEAP, TGR, Adipofilina, AIM-2, G250, OGT, TGFaRII, CO-95 (KIAA1416), CO-94 (seb4D), CO-9 (HDAC 5), CO-61 (HIP1 R), CO-58 (KNSL6), CO-45, CO-42 (TRIP4), CO-41 (MBD2), Ren-32 (Lamina C), TNKL (BC-203), CO-26 (MNK 1 ), SDCCAG3, GA733-2, STn, CA125, EGFRvIll, BCR-abl, Receptor de Folato de Alta Afinidad, Mesotelina, hCG, FAP alfa, Ciclina 1 , Topoisomerasa, Serpina B5/Maspina, Legumaína, CDK4, PRAME, ADAM 17, EDDR1 , CDC2, Proteína de Replicación A, CDK2, GM2, Globo H, TF(c), Ley, Tn(c), STn(c), GD2, GD3 o GD3L.

Un trastorno asociado con una sustancia adictiva es cualquier trastorno que implica una sustancia química o biológica que provoca que un sujeto desarrolle una adicción a una sustancia adictiva. Por ejemplo, en algunas modalidades, una sustancia adictiva puede ser nicotina o cocaína. En algunas modalidades, un antígeno de nicotina puede ser un hapteno de nicotina conjugado con un vehículo. En algunas modalidades, el vehículo con el que se conjuga un hapteno de nicotina es toxina diftérica.

Como se usan en este documento, los términos "tratar", "tratado" o "que se trata" cuando se usan con respecto a una enfermedad infecciosa se refieren a un tratamiento profiláctico que aumenta la resistencia en su sujeto (un sujeto en riesgo de infección) a una infección con un patógeno o en otras palabras disminuye la probabilidad de que el sujeto se infecte con el patógeno así como un tratamiento después de que el sujeto (un sujeto que se ha infectado) se haya infectado para combartir la infección, por ejemplo, reducir o eliminar la infección o prevenir que empeore.

Los términos "tratar", "tratado" o "que se trata" cuando se usan con respecto a un trastorno asociado con un autoantígeno se refieren a un tratamiento profiláctico que aumenta la resistencia de un sujeto (un sujeto en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con un autoantígeno) a desarrollar dicho trastorno o disminuye la probabilidad de que el sujeto desarrolle el trastorno asociado con un autoantígeno así como tratamiento después de que el sujeto (un sujeto en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con un autoantígeno) haya desarrollado dicho trastorno o comience a desarrollar signos o síntomas de desarrollo a dicho trastorno para reducir el efecto del trastorno, por ejemplo, reducir o eliminar los signos o síntomas asociados con el trastorno o prevenir que empeoren.

Los términos "tratar", "tratado" o "que se trata", cuando se usan con respecto a un trastorno asociado con una sustancia adictiva, se refieren a un tratamiento profiláctico que aumenta la resistencia de un sujeto (un sujeto en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con una sustancia adictiva) a desarrollar dicho trastorno o disminuye la probabilidad de que el sujeto desarrolle el trastorno asociado con una sustancia adictiva así como un tratamiento después de que el sujeto (un sujeto en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con un sustancia adictiva) haya desarrollado dicho trastorno o comience a desarrollar signos o síntomas de desarrollo de dicho trastorno, para reducir el efecto del trastorno, por ejemplo, reducir o eliminar los signos o síntomas asociados con el trastorno o evitar que empeoren.

El tratamiento de un sujeto con un oligonucleótido inmunoestimulador como se describe en este documento da como resultado la reducción de la infección o la supresión completa de la infección, reducción de los signos o síntomas asociados con un trastorno asociado con un autoantígeno o la supresión completa del trastorno, o la reducción de los signos/síntomas asociados con un trastorno asociado con una sustancia adictiva o la supresión completa del trastorno. Un sujeto puede considerarse como tratado si dichos síntomas relacionados con la enfermedad infecciosa, trastorno asociado con un autoantígeno o trastorno asociado con una sustancia adictiva se reducen, se controlan o se suprimen como resultado de dicho tratamiento. Para una enfermedad infecciosa, dicho tratamiento también incluye una reducción en la cantidad de agente infeccioso presente en el sujeto (por ejemplo, dichas cantidades pueden medirse usando ensayos convencionales tales como ELISA conocidos por los especialistas en la técnica). Para un trastorno asociado con un autoantígeno, dicho tratamiento también incluye una reducción en la cantidad de autoantígeno presente en el sujeto o una reducción en la respuesta inmune inducida como resultado del autoantígeno. Para un trastorno asociado con una sustancia adictiva, dicho tratamiento también incluye una reducción en los signos/síntomas asociados con la adicción a una sustancia adictiva.

Un "antígeno" como se usa en este documento es una molécula que es capaz de provocar una respuesta inmune. Los antígenos incluyen, pero sin limitación células, extractos celulares, proteínas, proteínas recombinantes, proteínas purificadas, polipéptidos, péptidos, polisacáridos, conjugados polisacáridos, miméticos peptídícos y no peptídicos de polisacáridos y otras moléculas codificadas por ADN plasmídico, haptenos, moléculas pequeñas, lípidos, glicolípidos, carbohidratos, patógenos destruidos completos, virus y extractos virales, virus vivos atenuados o vector viral, bacterias vivas atenuadas o un vector bacteriano y organismos multicelulares tales como parásitos y alérgenos. El término antígeno incluye ampliamente cualquier tipo de molécula que sea reconocida por un sistema inmune de huésped como extraña. Los antígenos incluyen, pero sin limitación, antígenos microbianos, autoantígenos y sustancias adictívas.

En algunos aspectos, un antígeno se conjuga con un portador. En algunas modalidades, el vehículo es toxina diftérica o una partícula similar a virus. En algunas modalidades, una partícula similar a virus está compuesta por fago de ARN Q-ß, antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) o antígeno de núcleo de hepatitis B (HBcAg).

Un "antígeno microbiano" como se usa en este documento es un antígeno de un microorganismo e incluye, pero sin limitación, virus, bacterias, parásitos y hongos. En algunas modalidades, un antígeno bacteriano es uno asociado con la bacteria Staphylococcus aureus. En otras modalidades, un antígeno bacteriano es uno asociado con una bacteria que causa caries dental, por ejemplo, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Streptococcus sanguis, Lactobcaillus acidophilis o Actinomyces viscosus. En algunas modalidades, un antígeno bacteriano es uno asociado con una bacteria que causa enfermedad periodontal, por ejemplo, Porphyromonas gingivalis o Actinobacillus actinomycetemcomitans. En algunas modalidades, un antígeno viral es uno asociado con Virus Respiratorio Sincitial (RSV), Virus Herpes Simple 1 (HSV1 ), Virus Herpes Simple 2 (HSV2) o Virus de la Inmunodeficiencia Humana-1 (VIH-1 ) o VIH-2. En algunas modalidades, un antígeno parasitario es uno asociado con un parásito que cause malaria.

Dichos antígenos incluyen el microorganismo intacto así como aislados naturales y fragmentos o derivados de los mismos y también compuestos sintéticos que son idénticos a o similares a antígenos de microorganismos naturales e inducen una respuesta inmune específica para ese microorganismo. Un compuesto es similar a un antígeno de microorganismo natural si induce una respuesta inmune (humoral y/o celular) contra un antígeno de microorganismo natural. Dichos antígenos se usan rutinariamente en la técnica y son bien conocidos por los especialistas en la técnica.

En algunos aspectos de la invención, el sujeto está "expuesto al" antígeno. Como se usa en este documento, la expresión "expuesto a" se refiere a la etapa activa de poner en contacto al sujeto con un antígeno o la exposición pasiva del sujeto al antígeno in vivo. Los procedimientos para la exposición activa de un sujeto a un antígeno son bien conocidos en la técnica. En general, un antígeno se administra directamente al sujeto por cualquier medio tal como administración intravenosa, intramuscular, oral, transdérmica, mucosa, intranasal, intratraqueal o subcutánea. El antígeno puede administrarse por vía local o sistémica. Los procedimientos para administrar el antígeno y el oligonucleótido inmunoestimulador se describen en más detalle a continuación. Un sujeto se expone de forma pasiva a un antígeno si un antígeno se hace disponible por exposición a las células inmunes en el cuerpo. Un sujeto puede exponerse de forma pasiva a un antígeno, por ejemplo, por entrada de un patógeno extraño en el cuerpo.

Los procedimientos en los que un sujeto se expone de forma pasiva a un antígeno pueden depender particularmente del momento fijado para la administración del oligonucleótido inmunoestimulador. Por ejemplo, en un sujeto en riesgo de desarrollar una enfermedad infecciosa, al sujeto puede administrarse el oligonucleótido inmunoestimulador con regularidad cuando el riesgo sea mayor. Además, el oligonucleótido inmunoestimulador puede administrarse a viajeros antes de que viajen a tierras extrañas cuando estén en riesgo de exponerse a agentes infecciosos. El oligonucleótido inmunoestimulador también puede administrarse a soldados o civiles en riesgo de exponerse a armas biológicas para inducir una respuesta inmune sistémica o mucosa al antígeno cuando y si el sujeto se expone a las mismas.

Los ejemplos de virus que se han descubierto en seres humanos incluyen, pero sin limitación: Retroviridae (por ejemplo, Virus de la Inmunodeficiencia Humana tales como VIH-1 (también denominados HTLV-III, LAV o HTLV-III/LAV, o VIH-lll; y otros aislados tales como VIH-LP); Picornaviridae (por ejemplo, virus de la polio, virus de la hepatitis A; enterovirus, virus Coxsackie humano, rinovirus, ecovirus); Caliciviridae (por ejemplo, cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubéola); Flaviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronoviridae (por ejemplo, coronavirus); Rhabdoviradae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del ébola); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus parainfluenza, virus de la paperas, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus influenza); Bungaviridae (por ejemplo, virus Hantaan, virus bunga, flebovirus y virus Nairo); Arenaviridae (virus de la fiebre hemorrágica); Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (vuris de la hepatitis B); Parvoviridae (parvovirus); Papovaviridae (papilomavirus, políomavirus); Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus); Herpesviridae (virus Herpes Simple (HSV) 1 y 2, virus de la varicela zoster, citomegalovirus (CMV), herpesvirus); Poxvirídae (virus de la viruela, virus vaccinia, poxvirus); e Iridoviridae (por ejemplo, virus de la fiebre porcina africana); y virus no clasificados (por ejemplo, los agentes etiológicos de las encefalopatías espongiformes, agente de la hepatitis delta (que se piensa que es un virus satélite defectuoso del virus de la hepatitis B), los agentes de la hepatitis no A, no B (clase I = trasmitida de forma interna; clase 2 = trasmitida por vía parenteral (es decir, Hepatitis C); Norwalk y virus relacionados y astrovirus). En algunas modalidades, los virus son Virus Respiratorio Sincitial (RSV), Virus Herpes Simple 1 (HSV1 ), Virus Herpes Simple 2 (HSV2), Virus de la Inmunodeficíencia Humana-1 (VIH1 ) o VIH2.

Aunque muchos de los antígenos microbianos descritos en este documento están relacionados con trastornos humanos, la invención también es útil para tratar otros vertebrados no humanos. Los vertebrados no humanos también son capaces de desarrollar infecciones que pueden prevenirse o tratarse con los ácidos nucleicos inmunoestimuladores descritos en este documento. Por ejemplo, además del tratamiento de enfermedades humanas infecciosas, los procedimientos de la invención son útiles para tratar infecciones de animales.

Tanto las bacterias gram negativas como gram positivas sirven como antígenos en animales vertebrados. Dichas bacterias gram positivas incluyen, pero sin limitación, especies de Pasteurella, especies de Staphylococci y especies de Streptococcus. Las bacterias gram negativas incluyen, pero sin limitación, Escherichia coli, especies de Pseudomonas y especies de Salmonella. Los ejemplos específicos de bacterias infecciosas incluyen, pero sin limitación, Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps. (por ejemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus Grupo A), Streptococcus agalactiae (Streptococcus Grupo B), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (especies anaerobias), Streptococcus pneumoniae, pathogenic Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium períringens, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia y Actinomyces israelli. En algunas modalidades, una bacteria es una que causa caires dental, por ejemplo Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Streptococcus sanguis, Lactobacillus acidophilis o Actinomyces viscosus. En otras modalidades, una bacteria es una que causa enfermedad periodontal, por ejemplo Porphyromonas gingivalis o Actinobacillus actinomycetemcomitans.

Los polipéptidos de patógenos bacterianos incluyen, pero sin limitación, una proteína de membrana externa regulada por hierro (IROMP), una proteína de membrana externa (OMP) y una proteína A de Aeromonis salmonicida que causa furunculosis, proteína p57 de Renibacterium salmoninarum que causa enfermedad renal bacteriana (BKD), antígeno asociado con superficie principal (msa), una citosina expresada en superficie (mpr), una hemolisina expresada en superficie (ish), y un antígeno flagelar de yersiniosis; una proteína extracelular (ECP), una IROMP y una proteína estructural de pasterelosis; una OMP y una proteína flagelar de Vibrosis anguillarum y V. ordalii; una proteína flagelar, una proteína OMP, aroA y purA de Edwardsiellosis ictaluri y E. tarda; y antígeno superficial de Ichthyophthirius y una proteína estructural y reguladora de Cytophaga columnari; y una proteína estructural y reguladora de Ríckettsia.

Los ejemplos de hongos incluyen Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Otros organismos infecciosos (es decir, protistas) incluyen Plasmodium spp. tales como Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax y Toxoplasma gondii. Los parásitos de la sangre y/o tejidos incluyen Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania trópica, Leishmania spp., Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense y Trypanosoma rhodesiense (enfermedad del sueño africana), Trypanosoma cruzi (enfermedad de Chagas) y Toxoplasma gondii. En algunas modalidades, un parásito es uno asociado con malaria. Se han descrito exhaustivamente otros microorganismos médicamente importantes en la bibliografía, por ejemplo, véase C. G. A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983.

Muchas vacunas para el tratamiento de vertebrados no humanos se describen en Bennett, K., Compendium of Veterinary Products, 3a ed. North American Compendiums, Inc., 1995. Como se ha analizado anteriormente, los antigenos incluyen microbios infecciosos tales como virus, parásitos, bacterias y hongos y fragmentos de los mismos procedentes de fuentes naturales u obtenidos sintéticamente. Los virus infecciosos de vertebrados tanto humanos como no humanos incluyen retrovirus, virus de ARN y virus de ADN. Este grupo de retrovirus incluye tanto retrovirus simples como retrovirus complejos. Los retrovirus simples incluyen los subgrupos de retrovirus de tipo B, retrovirus de tipo C y retrovirus de tipo D. Un ejemplo de un retrovirus de tipo B es virus del tumor mamario de ratón (MMTV). Los retrovirus de tipo C incluyen los subgrupos de tipo C del grupo A (incluyendo el virus del sarcoma de Rous (RSV), virus de la leucemia aviar (ALV) y virus de la mieloblastosis aviar (AMV)) y tipo C grupo B (incluyendo virus de la leucemia felina (FELV), virus de la leucemia del mono gibón (GALV), virus de la necrosis del bazo (SNV), virus de la reticuloendoteliosis (RV) y virus del sarcoma de los simios (SSV)). Los retrovirus de tipo D incluyen virus del mono de Mason-Pfizer (MPMV) y retrovirus de los simios tipo 1 (SRV-1 ). Los retrovirus complejos incluyen los subgrupos de lentivirus, virus de la leucemia de linfocitos T y los virus espumosos. Los lentivirus incluyen VIH-1 , pero también incluyen VIH-2, SIV, virus Visna, virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) y virus de la anemia infecciosa equina (EIAV). Los virus de la leucemia de linfocitos T incluyen HTLV-1 , HTLV-II, virus de la leucemia de linfocitos T de simios (STLV) y virus de la leucemia bovina (BLV). Los virus espumosos incluyen virus espumosos humanos (HFV), virus espumosos de los simios (SFV) y virus espumosos bovinos (BFV).

Los ejemplos de otros virus de ARN que son antigenos en animales vertebrados incluyen, pero sin limitación, miembros de la familia Reoviridiae, incluyendo el género Orthoreovirus (múltiples serotipos de retrovirus tanto de mamíferos como de aves), del género Orbivirus (virus de la lengua azul, virus Eugenangee, virus Kemerovo, virus de la enfermedad de los caballos africana, virus de la Fiebre por Garrapatas del Colorado), el género Rotavirus (rotavirus humano, virus de la diarrea de terneros de Nebraska, rotavirus de los simios, rotavirus bovino u ovino, rotavirus aviar); la familia Picornaviridae, incluyendo el género Enterovirus (poliovirus, virus Coxsackie A y B, virus huérfanos citopáticos entéricos humanos (ECHO), virus de la hepatitis A, enterovirus de los Simios, virus de la encefalomielitis murina (ME), Poliovirus muris, enterovirus Bovinos, enterovirus Porcinos, el género Cardiovirus (virus de la Encefalomiocarditis (EMC), Mengovirus), el género Rinovirus (rinovirus Humanos incluyendo al menos 1 13 subtipos; otros rinovirus), el género Aptovirus (Glosopeda (FMDV)); la familia Calciviridae, incluyendo exantema Vesicular de virus porcino, virus de león marino de San Miguel, picornavirus Felino y virus Norwalk; la familia Togaviridae, incluyendo el género Alphavirus (virus de la encefalitis equina del Este, virus del bosque de Semliki, virus Sindbis, virus Chikungunya, virus O'Nyong-Nyong, virus del río Ross, virus de la encefalitis equina Venezolana, virus de la encefalitis equina del Oeste), el género Flavirius (virus de la fiebre amarilla del Mosquito, virus Dengue, virus de la encefalitis Japonesa, virus de la encefalitis de San Luis, virus de la encefalitis del Valle Murray, virus del Nilo Occidental, virus Kunjin, virus transmitido por garrapata Europea Central, virus transmitido por garrapata del Lejano Oriente, virus del bosque Kyasanur, virus Louping III, virus Powassan, virus de la fiebre hemorrágica de Omsk, el género Rubivirus (virus de la Rubéola), el género Pestivirus (virus de la enfermedad de las Mucosas, virus del cólera porcino, virus de la enfermedad de la Frontera); la familia Bunyaviridae, incluyendo el género Bunyvirus (Bunyamwera y virus relacionados, virus del grupo de la encefalitis de California), el género Phlebovirus (virus Siciliano de la fiebre de las Moscas de los Arenales, virus de la fiebre del Valle del Rift), el género Nairovirus (virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, virus de la enfermedad de ovejas de Nairobi) y el género Uukuvirus (Uukuniemi y virus relacionados); la familia Orthomyxoviridae, incluyendo el género de virus Influenza (virus Influenza tipo A, muchos subtipos humanos); virus influenza porcino y virus influenza Aviar y Equino; influenza tipo B (muchos subtipos humanos) e influenza tipo C (posible género aparte); la familia paramixoviridae, incluyendo el género Paramixovirus (virus Parainfluenza tipo 1 , virus Sendai, virus de la Hemadsorción, virus Parainfluenza tipos 2 a 5, Virus de la Enfermedad de Newcastle, virus de las Paperas), el género Morbilivirus (virus del Sarampión, virus de la panencefalitis esclerosante subaguda, virus del moquillo, virus de la peste bovina), el género Neumovirus (virus respiratorio sincitial (VRS), virus respiratorio sincitial Bovino y virus de la Neumonía); la familia Rhabdoviridae, incluyendo el género Vesiculovirus (VSV), virus Chandipura, virus Flanders-Hart Park), el género Lyssavirus (virus de la Rabia), Rabdovirus de peces y dos Rabdovirus probables (virus Marburg y virus del Ébola); la familia Arenaviridae, incluyendo virus de la coriomeningitis Linfocítica (LCM), complejo de virus Tacaribe y virus Lassa; la familia Coronoaviridae, incluyendo Virus de la Bronquitis Infecciosa (IBV), virus de la Hepatitis, coronavirus entérico Humano y peritonitis infecciosa Felina (coronavirus Felino).

Los virus de ADN ilustrativos que son antígenos en animales vertebrados incluyen, pero sin limitación, la familia Poxviridae, incluyendo el género Ortopoxvirus (virus de la Viruela mayor, de la Viruela menor, de la Viruela de Mono, Vaccinia, de la Viruela de la Vaca, de la Viruela del Búfalo, de la Viruela del Conejo, Ectromelia), el género Leporipoxvirus (Mixoma, Fibroma), el género Avipoxvirus (virus de la viruela de las aves de corral, otros poxvirus aviares), el género Capripoxvirus (viruela de la oveja, viruela de la cabra), el género Suipoxvirus (Viruela porcina), el género Parapoxvirus (virus de la dermatitis pustular contagiosa como pseudoviruela de las vacas, virus de la estomatitis papular bovina); la familia Iridoviridae (virus de la fiebre porcina africana, virus de rana 2 y 3, virus de la linfocistosis de peces); la familia Herpesviridae, incluyendo los virus herpes alfa (Herpes Simple Tipo 1 y 2, Varicela Zoster, virus del aborto Equino, virus herpes Equino 2 y 3, virus de la pseudorrabia, virus de la queraconjuntivitis bovina infecciosa, virus de la rinotraqueítis bovina infecciosa, virus de la rinotraqueítis felina, virus de la laringotraqueitis infecciosa), los Beta-herpesvirus (citomegalovirus Humano y citomegalovirus de suidos y monos); los gama-herpesvirus (virus Epstein-Barr (EBV), virus de la enfermedad de Marek, Herpes saimirí, Herpesvirus áteles, Herpesvirus sylvilagus, virus herpes de cobayas, virus del tumor de Lucke); la familia Adenoviridae, incluyendo el género Mastadenovirus (subgrupos Humanos A, B, C, D, E y sin grupo; adenovirus de los simios (al menos 23 serotipos), hepatitis canina infecciosa y adenovirus de ganado, cerdos, ovejas, ranas y muchas otras especies, el género Aviadenovirus (adenovirus Aviares); y adenovirus no cultivables; la familia Papoviridae, incluyendo el género Papilomavirus (papilomavirus Humanos, papilomavirus bovinos, papilomavirus de conejo de Shope y diversos papilomavirus patógenos de otras especies), el género Poliomavirus (poliomavirus, agente vacuolante de los Simios (SV-40), agente vacuolante de los Conejos (RKV), virus K, virus BK, virus JC y otros virus de polioma de primates tales como papilomavirus Linfotrófico); la familia Parvoviridae incluyendo el género de virus adeno-asociados, el género Parvovirus (virus de la panleucopenia Felina, parvovirus bovino, parvovirus canino, virus de la enfermedad del visón Aleutiano, etc.). Además, los virus de ADN pueden incluir virus que no se ajusten en las familias anteriores tales como virus de la enfermedad de Kuru y Creutzfeld-Jacob y agentes neuropáticos infecciosos crónicos (virus CHINA).

En una modalidad, la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmune específica de antígeno que comprende administrar un antígeno y un oligonucleótido inmunoestimulador de la invención donde al menos el 40%, preferiblemente al menos el 45%, aún preferiblemente al menos el 50%, aún preferiblemente aproximadamente 53% de los linfocitos T CD4+ específicos de antígeno inducidos secretan IFN-? en la población de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que secretan IFN-?, TNF-a y/o IL-2. En una modalidad, dicha proporción de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que secretan IFN-? se determina por citometría de flujo policromática. Un ejemplo de tal determinación se describe en el ejemplo 1 del presente documento (véase el párrafo 'Poblaciones de linfocitos T secretores de multicitocinas específicos de antígeno'). En una modalidad, el antígeno y oligonucleótido inmunoestimulador se administran en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune específica de antígeno en dicho sujeto. En una modalidad, el antígeno es cualquiera de los antigenos descritos en este documento.

En una modalidad, la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmune específica de antígeno que comprende administrar un antígeno y un oligonucleótido inmunoestimulador de la invención donde al menos el 10%, preferiblemente al menos el 15%, aún preferiblemente al menos el 20%, aún preferiblemente aproximadamente el 22% de los linfocitos T CD4+ específicos de antigeno inducidos son productores de citocinas dobles, secretando preferentemente tanto IFN-? como TNF-a en la población de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que secretan IFN-?, TNF- y/o IL-2. En una modalidad, dicha proporción de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que secretan tanto IFN-? como TNF- se determina por citometría de flujo policromática. Un ejemplo de tal determinación se describe en el ejemplo 1 del presente documento (véase el párrafo Poblaciones de linfocitos T secretores de multicitocinas específicos de antígeno'). En una modalidad, el antígeno y oligonucleótido inmunoestimulador se administran en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune específica de antígeno en dicho sujeto. En una modalidad, el antigeno es cualquiera de los antígenos descritos en este documento.

En una modalidad, la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmune específica de antígeno que comprende administrar un antígeno y un oligonucleótido inmunoestimulador de la invención donde al menos el 30%, preferiblemente al menos el 40%, aún preferiblemente al menos el 45%, aún preferiblemente aproximadamente el 47% de los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno inducidos son productores de citocinas dobles que secretan preferentemente tanto IFN-? como TNF-a en la población de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno que secretan IFN-?, TNF-a y/o IL-2. En una modalidad, dicha proporción de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno que secretan tanto IFN-? como TNF- se determina por citometría de flujo policromática. Un ejemplo de tal determinación se describe en el ejemplo 1 del presente documento (véase el párrafo Poblaciones de linfocitos T secretores de multicitocinas específicos de antígeno'). En una modalidad, el antígeno y oligonucleótido inmunoestimulador se administran en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune específica de antígeno en dicho sujeto. En una modalidad, el antígeno es cualquiera de los antígenos descritos en este documento.

En una modalidad, la invención se refiere al oligonucleótido inmunoestimulador de la invención para el uso en la inducción de una respuesta inmune frente a un antígeno, donde al menos el 40%, preferiblemente al menos el 45%, aún preferiblemente al menos el 50%, aún preferiblemente aproximadamente el 53% de los linfocitos T CD4+ específicos de antígeno inducidos secretan IFN-? en la población de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que secretan IFN-?, TNF-a y/o IL-2. En una modalidad, dicha proporción de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que secretan IFN-? se determina por citometría de flujo policromática. Un ejemplo de tal determinación se describe en el ejemplo 1 del presente documento (véase el párrafo 'Poblaciones de linfocitos T secretores de multicitocinas específicos de antígeno'). En una modalidad, el antígeno es cualquiera de los antígenos descritos en este documento.

En una modalidad, la invención se refiere al oligonucleótido inmunoestimulador de la invención para el uso en la inducción de una respuesta inmune frente a un antígeno, donde al menos el 10%, preferiblemente al menos el 15%, aún preferiblemente al menos el 20%, aún preferiblemente aproximadamente el 22% de los linfocitos T CD4+ específicos de antígeno inducidos son productores de citocinas dobles, que secretan preferentemente tanto IFN-? como TNF-a en la población de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que secretan IFN-?, TNF-a y/o IL-2. En una modalidad, dicha proporción de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que secretan tanto IFN-? como TNF-a se determina por citometría de flujo policromática. Un ejemplo de tal determinación se describe en el ejemplo 1 del presente documento (véase el párrafo 'Poblaciones de linfocitos T secretores de multicitocinas específicos de antígeno'). En una modalidad, el antígeno es cualquiera de los antígenos descritos en este documento.

En una modalidad, la invención se refiere al oligonucleótido inmunoestimulador de la invención para el uso en la inducción de una respuesta inmune frente a un antígeno, donde al menos el 30%, preferiblemente al menos el 40%, aún preferiblemente al menos el 45%, aún preferiblemente aproximadamente el 47% de los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno inducidos son productores de citocinas dobles, que secretan preferentemente tanto IFN-? como TNF-a en la población de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno que secretan IFN-?, TNF-a y/o IL-2. En una modalidad, dicha proporción de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que secretan tanto IFN-? como TNF-a se determina por citometría de flujo policromática. Un ejemplo de tal determinación se describe en el ejemplo 1 del presente documento (véase el párrafo 'Poblaciones de linfocitos T secretores de multicitocinas específicos de antígeno'). En una modalidad, el antígeno es cualquiera de los antígenos descritos en este documento.

En una modalidad, la invención se refiere al oligonucleótido ¡nmunoestimulador de la invención para el uso como un adyuvante en una vacuna donde dicha vacuna induce una respuesta inmune frente a un antígeno y donde al menos el 40%, preferiblemente al menos el 45%, aún preferiblemente al menos el 50%, aún preferiblemente aproximadamente el 53% de los linfocitos T CD4+ específicos de antígeno inducidos secretan IFN-? en la población de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que secretan IFN-?, TNF-a y/o IL-2. En una modalidad, dicha proporción de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que secretan IFN-? se determina por citometría de flujo policromática. Un ejemplo de tal determinación se describe en el ejemplo 1 del presente documento (véase el párrafo 'Poblaciones de linfocitos T secretores de multicitocinas específicos de antígeno'). En una modalidad, el antígeno es cualquiera de los antígenos descritos en este documento.

En una modalidad, la invención se refiere al oligonucleótido ¡nmunoestimulador de la invención para el uso como un adyuvante de una vacuna donde dicha vacuna induce una respuesta inmune frente a un antígeno y donde al menos el 10%, preferiblemente al menos el 15%, aún preferiblemente al menos el 20%, aún preferiblemente aproximadamente el 22% de las linfocitos T CD4+ específicos de antígeno inducidos son productores de citocinas dobles, que secretan preferentemente tanto IFN-? como TNF-a en la población de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que secretan IFN-?, TNF-a y/o IL-2. En una modalidad, dicha proporción de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno dobles productores que secretan tanto IFN-? como TNF-a se determina por citometría de flujo policromática. Un ejemplo de tal determinación se describe en el ejemplo 1 del presente documento (véase el párrafo 'Poblaciones de linfocitos T secretores de multicitocinas específicos de antígeno'). En una modalidad, el antígeno es cualquiera de los antígenos descritos en este documento.

En una modalidad, la invención se refiere al oligonucleótido inmunoestimulador de la invención para el uso como un adyuvante en una vacuna donde dicha vacuna induce una respuesta inmune frente a un antígeno y donde al menos el 30%, preferiblemente al menos el 40%, aún preferiblemente al menos el 45%, aún preferiblemente aproximadamente el 47% de los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno inducidos son productores de citocinas dobles, que secretan preferentemente tanto IFN-? como TNF-a en la población de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno que secretan IFN-?, TNF-a y/o IL-2. En una modalidad, dicha proporción de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno dobles productores que secretan tanto IFN-? como TNF-a se determina por citometría de flujo policromática. Un ejemplo de tal determinación se describe en el ejemplo 1 del presente documento (véase el párrafo 'Poblaciones de linfocitos T secretores de multicitocinas específicos de antígeno'). En una modalidad, el antígeno es cualquiera de los antígenos descritos en este documento.

En una modalidad, la invención se refiere a una vacuna que comprende un antígeno y un oligonucleótido inmunoestimulador de la invención para el uso en la inducción de una respuesta inmune contra dicho antígeno, donde al menos el 40%, preferiblemente al menos el 45%, aún preferiblemente al menos el 50%, aún preferiblemente aproximadamente el 53% de los linfocitos T CD4+ específicos de antígeno inducidos secretan IFN-? en la población de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que secretan IFN-?, TNF-ot y/o IL-2. En una modalidad, dicha proporción de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que secretan IFN-? se determina por citometría de flujo policromática. Un ejemplo de tal determinación se describe en el ejemplo 1 del presente documento (véase el párrafo 'Poblaciones de linfocitos T secretores de multicitocinas específicos de antígeno'). En una modalidad, el antígeno es cualquiera de los antígenos descritos en este documento.

En una modalidad, la invención se refiere a una vacuna que comprende un antígeno y un oligonucleótido inmunoestimulador de la invención para el uso en la inducción de una respuesta inmune contra dicho antígeno donde al menos el 10%, preferiblemente al menos el 15%, aún preferiblemente al menos el 20%, aún preferiblemente aproximadamente el 22% de los linfocitos T CD4+ específicos de antígeno inducidos son productores de citocinas dobles, que secretan preferentemente tanto IFN-? como TNF-a en la población de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que secretan IFN-?, TNF-a y/o IL-2. En una modalidad, dicha proporción de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que secretan tanto IFN-? como TNF-a se determina por citometría de flujo policromática. Un ejemplo de tal determinación se describe en el ejemplo 1 del presente documento (véase el párrafo 'Poblaciones de linfocitos T secretores de multicitocinas específicos de antígeno'). En una modalidad, el antígeno es cualquiera de los antígenos descritos en este documento.

En una modalidad, la invención se refiere a una vacuna que comprende un antígeno y un oligonucleótido inmunoestimulador de la invención para el uso en la inducción de una respuesta inmune contra dicho antígeno en el que al menos el 30%, preferiblemente al menos el 40%, aún preferiblemente al menos el 45%, aún preferiblemente aproximadamente el 47% de los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno inducidos son productores de citocinas dobles, que secretan preferentemente tanto IFN-? como TNF-a en la población de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno que secretan IFN-?, TNF-a y/o IL-2. En una modalidad, dicha proporción de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno que secretan tanto IFN-? como TNF-a se determina por citometría de flujo policromática. Un ejemplo de tal determinación se describe en el ejemplo 1 del presente documento (véase el párrafo 'Poblaciones de linfocitos T secretores de multicitocinas específicos de antígeno'). En una modalidad, el antígeno es cualquiera de los antígenos descritos en este documento.

El lenguaje "cantidad eficaz" de una molécula de ácido nucleico se refiere a la cantidad necesaria o suficiente para realizar un efecto biológico deseado. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un ácido nucleico que contiene al menos una CpG no metilada para tratar un trastorno podría ser la cantidad necesaria para eliminar una infección microbiana o un tumor. Una cantidad eficaz para el uso como un adyuvante de vacuna podría ser esa cantidad útil para reforzar la respuesta inmune de un sujeto a una vacuna. Una "cantidad eficaz" para tratar una enfermedad infecciosa, un trastorno asociado con un autoantígeno o un trastorno asociado con una sustancia adictiva puede ser esa cantidad útil para inducir una respuesta inmune específica de antígeno. La cantidad eficaz para cualquier aplicación particular puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o afección que se trate, el oligonucleótido inmunoestimulador de CpG particular que se administra, el tamaño del sujeto o la gravedad de la enfermedad o afección. Un especialista en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad eficaz de un oligonucleótido particular sin necesitar una experimentación innecesaria.

En aspectos de la invención, una vacuna puede incluir además un adyuvante. En algunas modalidades, un adyuvante es un agonista para un receptor de tipo Toll (TLR) que no es TLR9. Un agonista para un TLR en algunas modalidades es un agonista para TLR3 (por ejemplo, poliliC estabilizado), TLR4 (por ejemplo, un derivado de lipopolisacárido (LPS), por ejemplo, MPL o GLA), TLR5 (por ejemplo, flagelina), TLR7 (por ejemplo, una molécula pequeña de la familia de ¡midazoquinolinas) o TLR8 (por ejemplo, una molécula pequeña de la familia de ¡midazoquinolinas). En algunas modalidades, el adyuvante es sal de aluminio, por ejemplo, hidróxido de aluminio, un complejo inmunoestimulador (ISCOM), una emulsión de aceite en agua o agua en aceite, un liposoma o un sistema de suministro, por ejemplo, una nanopartícula o micropartícula.

La expresión cantidad eficaz de un oligonucleótido inmunoestimulador de CpG se refiere a la cantidad necesaria o suficiente para realizar un efecto biológico deseado. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un oligonucleótido inmunoestimulador de CpG administrado con un antígeno para inducir una respuesta inmune específica de antígeno es la cantidad necesaria para inducir una respuesta inmune en respuesta a un antígeno después de la exposición al antígeno. En combinación con las enseñanzas proporcionadas en este documento, eligiendo entre los diversos oligonucleótidos inmunoestimuladores y factores de ponderación tales como potencia, biodisponibilidad relativa, peso corporal del paciente, gravedad de efectos secundarios adversos y modo preferido de administración, se puede planear un régimen profiláctico o terapéutico eficaz que no provoque toxicidad sustancial y todavía sea eficaz para tratar el sujeto particular. La cantidad eficaz para cualquier aplicación particular puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o afección que se trate, el oligonucleótido inmunoestimulador de CpG particular que se administra, el tamaño del sujeto 0 la gravedad de la enfermedad o afección. Un especialista habitual en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad eficaz de un oligonucleótido inmunoestimulador de CpG particular y/o antígeno y/u otro agente terapéutico sin necesitar una experimentación innecesaria a la luz de esta descripción.

Las presentes dosis de los compuestos descritos en este documento para suministro local varían típicamente de aproximadamente 0.1 µg a 50 mg por administración que, dependiendo de la aplicación, podrían administrarse diariamente, semanalmente o mensualmente y cualquier otra cantidad de tiempo entre éstas. Más típicamente, las dosis locales varían de aproximadamente 10 µg a 10 mg por administración y opcionalmente de aproximadamente 100 µg a 1 mg, estando 2-4 administraciones separadas por días o semanas. Más típicamente, las dosis inmunoestimulantes varían de 1 µg a 10 mg por administración y más típicamente de 10 µ9 a 1 mg con administraciones diarias o semanales. Las presentes dosis de los compuestos descritos en este documento para suministro parenteral con el fin de inducir una respuesta inmune específica de antígeno, en el que los compuestos se suministran con un antígeno pero no con otro agente terapéutico son típicamente de 5 a 10,000 veces mayores que la dosis local eficaz para un adyuvante de vacuna o aplicaciones inmunoestimulantes y más típicamente de 10 a 1 ,000 veces superior y más típicamente de 20 a 100 veces superior. Las dosis de los compuestos descritos en este documento para suministro parenteral, por ejemplo, para inducir una respuesta inmune innata, para aumentar la ADCC, para inducir una respuesta inmune específica de antígeno cuando los oligonucleótidos inmunoestimuladores de CpG se administran en combinación con otros agentes terapéuticos o en vehículos de suministro especializados varía típicamente de aproximadamente 0.1 µ9 a 10 mg por administración que, dependiendo de la aplicación, podrían administrarse diariamente, semanalmente o mensualmente y cualquier otra cantidad de tiempo entre éstas. Más típicamente, las dosis parenterales para estos fines varían de aproximadamente 10 µ§ a 5 mg por administración y más típicamente de aproximadamente 100 µg a 1 mg, estando 2-4 administraciones separadas por días o semanas. En algunas modalidades, sin embargo, las dosis parenterales para estos fines pueden usarse en un intervalo de 5 a 10,000 veces superior que las dosis típicas descritas anteriormente.

Para cualquier compuesto descrito en este documento, la cantidad terapéuticamente eficaz puede determinarse inicialmente a partir de modelos animales. Una dosis terapéuticamente eficaz también puede determinarse a partir de datos humanos para oligonucleótidos de CpG que se han ensayado en seres humanos (por ejemplo, se han iniciado ensayos clínicos humanos) y para compuestos que se sabe que presentan actividades farmacológicas similares, tales como otros adyuvantes, por ejemplo, LT y otros antígenos para fines de vacunación. Pueden ser necesarias dosis mayores para administración parenteral. La dosis aplicada puede ajustarse basándose en la biodisponibilidad relativa y en la potencia del compuesto administrado. El ajuste de la dosis para conseguir una eficacia máxima basada en los procedimientos descritos anteriormente y otros procedimientos son bien conocidos en la técnica y se incluyen en las capacidades del especialista habitual.

Las formulaciones de la invención se administran en soluciones farmacéuticamente aceptables que pueden contener rutinariamente concentraciones farmacéuticamente aceptables de sal, agentes tamponantes, agentes conservantes, vehículos compatibles, adyuvantes y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos.

Para uso en terapia, una cantidad eficaz del oligonucleótido inmunoestimulador de CpG puede administrarse a un sujeto por cualquier modo que suministre el oligonucleótido a la superficie deseada. La administración de la composición farmacéutica de la presente invención puede conseguirse por cualquier medio conocido por el especialista. Las vías preferidas de administración incluyen, pero sin limitación, parenteral (por ejemplo, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intravenosa, intravesical o intraperitoneal), tópica (por ejemplo, dérmica (transdérmica), mucosal), oral, intranasal, intravaginal, intrarrectal, transbucal, intraocular o sublingual.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores en solitario o junto con otros agentes terapéuticos pueden administrarse por cualquier vía descrita en este documento. En algunas modalidades preferidas, la administración es local. La administración local puede incluir aplicación tópica a superficies de mucosa, por ejemplo, la piel, tal como la de la boca y genitales.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores, cuando es deseable suministrarlos por vía sistémica, pueden formularse para administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección en embolada o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma farmacéutica monodosis, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.

Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los oligonucleótidos inmunoestimuladores en forma soluble en agua. Además, las suspensiones de los oligonucleótidos inmunoestimuladores pueden prepararse como suspensiones para inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos o liposomas. Las suspensiones para inyección acuosas pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes adecuados o agentes que aumenten la solubilidad de los oligonucleótidos inmunoestimuladores para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores, cuando es deseable suministrarlos por vía sistémica, pueden formularse para administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección en embolada o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma farmacéutica monodosis, por ejemplo, en ampollas o recipientes multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.

Se puede diluir o aumentar el volumen del agente terapéutico con un material inerte. Estos diluyentes podrían incluir carbohidratos, especialmente manitol, a-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, dextranos modificados y/o almidón. También pueden usarse determinadas sales inorgánicas como cargas incluyendo trifosfato calcico, carbonato de magnesio y/o cloruro de sodio. Algunos diluyentes disponibles en el mercado son Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress y Avicell.

Para contribuir a la disolución del compuesto terapéutico en el entorno acuoso podría añadirse un tensioactivo como un agente humectante. Los tensioactivos pueden incluir detergentes aniónicos tales como laurilsulfato sódico, sulfosuccinato sódico de dioctilo y/o sulfonato sódico de dioctilo. Podrían usarse detergentes catiónicos y podrían incluir cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio. La lista de detergentes no iónicos potenciales que podrían incluirse en la formulación como tensioactivos son lauromacrogol 400, estearato de polioxil 40, aceite de ricino de polioxietileno hidrogenado 10, 50 y/o 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y/o 80, éster de ácido graso de sacarosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Estos tensioactivos podrían estar presentes en la formulación de los oligonucleótidos inmunoestimuladores en solitario o como una mezcla en diferentes proporciones.

Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los oligonucleótidos inmunoestimuladores en forma soluble en agua. Además, pueden prepararse suspensiones de los oligonucleótidos inmunoestimuladores como suspensiones para inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen ácidos grasos tales como aceite de sésamo o ésteres de ácido graso sintético tales como oleato de etilo o triglicéridos o liposomas. Las suspensiones para inyección acuosas pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes adecuados o agentes que aumenten la solubilidad de los oligonucleótidos inmunoestimuladores para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.

Como alternativa, los oligonucleótidos inmunoestimuladores pueden estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua pirógena estéril antes, del uso.

Para administración oral, los compuestos (es decir, oligonucleótidos inmunoestimuladores de CpG, antígenos y otros agentes terapéuticos) pueden formularse fácilmente por combinación de los oligonucleótidos inmunoestimuladores con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales vehículos permiten que los oligonucleótidos inmunoestimuladores de la invención se formulen como comprimidos, pildoras, grageas, capsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares para ingestión oral por un sujeto que se vaya a tratar. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse como excipiente sólido, opcionalmente moliendo una mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir adyuvantes adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato sódico. Opcionalmente, las formulaciones orales también pueden formularse en solución salina o tampones, es decir, EDTA para neutralizar condiciones ácidas internas o puede administrarse sin ningún vehículo.

También se contemplan formas farmacéuticas orales de los anteriores agentes o formulaciones. Los agentes o formulaciones pueden modificarse químicamente de modo que el suministro oral del derivado sea eficaz. Generalmente, la modificación química contemplada es la unión de al menos un resto al propio agente o formulación, permitiendo dicho resto (a) la inhibición de la proteolisis; y (b) la captación en el torrente sanguíneo desde el estómago o el intestino. También se desea el aumento en la estabilidad global del agente o formulación y un aumento en el tiempo de circulación en el cuerpo. Los ejemplos de tales restos incluyen: polietilenglicol, copolímeros de etílenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona y poliprolina. Abuchowski y Davis, 1981 , "Soluble Polymer-Enzyme Adducts" En: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-lnterscience, New York, N.Y., págs. 367-383; Newmark, y col., 1982, J. Appl. Biochem. 4: 185-189. Otros polímeros que podrían usarse son poli-1 ,3-dioxolano y poli-1 ,3,6-tioxocano. Se prefieren para uso farmacéutico, como se ha indicado anteriormente, restos de polietilenglicol.

También se contempla el suministro intranasal de una composición farmacéutica de la presente invención. El suministro intranasal permite el paso de una composición farmacéutica de la presente invención al torrente sanguíneo directamente después de administrar el producto terapéutico a la nariz sin la necesidad de deposición del producto en el pulmón. Las formulaciones para suministro nasal incluyen las que contienen dextrano o ciclodextrano.

Para administración intranasal, un dispositivo útil es un frasco pequeño, duro al que se une un pulverizador de dosis medida. En una modalidad, la dosis medida se suministra extrayendo la composición farmacéutica de la solución de la presente invención hacia una cámara de volumen definido, teniendo dicha cámara un orificio dimensionado para aerosolizar una formulación de aerosol por formación de una pulverización cuando se comprime un líquido en la cámara. La cámara se comprime para administrar la composición farmacéutica de la presente invención. En una modalidad específica, la cámara es un dispositivo de pistón. Tales dispositivos están disponibles en el mercado.

Como alternativa, un frasco lavador de plástico con un orificio o abertura dimensionada para aerosolizar una formulación de aerosol por formación de una pulverización cuando se estruja el frasco. La abertura se encuentra habitualmente en la parte superior del frasco y la parte superior generalmente está ahusada para ajustarse parcialmente en los conductos nasales para una administración eficaz de la formulación en aerosol. Preferiblemente, el inhalador nasal proporcionará una cantidad medida de la formulación en aerosol para administración de una dosis medida del fármaco.

Para administración transbucal, las composiciones pueden adoptar la forma de comprimidos o grageas formuladas de forma convencional.

Los compuestos también pueden formularse en composiciones rectales o vaginales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos también pueden formularse como una preparación de liberación prolongada. Tales formulaciones de acción prolongada pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico o como derivados muy poco solubles, por ejemplo, una sal muy poco soluble.

Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender vehículos o excipientes en fase sólida o gel adecuados. Los ejemplos de tales vehículos o excipientes incluyen pero sin limitación carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles.

Son formas de preparación farmacéutica líquida o sólida adecuadas, por ejemplo, soluciones acuosas o salinas para inhalación, microencapsuladas, introducidas en estructuras cocleares, aplicadas como revestimiento sobre partículas de oro microscópicas, contenidas en liposomas, nebulizadas, aerosoles, gránulos para implantación en la piel o secadas sobre un objeto afilado para arañar la piel. Las composiciones farmacéuticas también incluyen gránulos, polvos, comprimidos, comprimidos recubiertos, (micro)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, cremas, gotas o preparaciones con liberación prolongada de compuestos activos, en cuya preparación se usan normalmente excipientes y aditivos y/o adyuvantes tales como disgregantes, aglutinantes, agentes de revestimiento, agentes de hinchamiento, lubricantes, aromatizantes, edulcorantes o solubilizantes como se ha descrito anteriormente. Las composiciones farmacéuticas son adecuadas para usar en una diversidad de sistemas de suministro farmacológico. Para un breve resumen de procedimientos para suministrar fármacos véase Langer, Science 249: 1527-1533, 1990.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de CpG y opcionalmente otros compuestos terapéuticos y/o antígenos pueden administrarse por sí mismos (puros) o en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Cuando se usan en medicina, las sales deben ser farmacéuticamente aceptables pero pueden usarse convenientemente sales no farmacéuticamente aceptables para preparar sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. Tales sales incluyen, pero sin limitación, las preparadas a partir de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p-tolueno sulfónico, tartárico, cítrico, metanosulfónico, fórmico, malónico, succínico, naftaleno-2 sulfónico y bencenosulfónico. Además, tales sales pueden prepararse como sales de metales alcalinos o alcalinotérreos tales como sales de sodio, potasio o calcio del grupo ácido carboxílico.

Los agentes tamponantes adecuados incluyen: ácido acético y una sal (1-2% p/v); ácido cítrico y una sal (1-3% p/v); ácido bórico y una sal (0.5-2.5% p/v); y ácido fosfórico y una sal (0.8-2% p/v). Los conservantes adecuados incluyen cloruro de benzalconio (0.003-0.03% p/v); clorobutanol (0.3-0.9% p/v); parabenos (0.01-0.25% p/v) y timerosal (0.004-0.02% p/v).

Las composiciones farmacéuticas de la invención contienen una cantidad eficaz de un oligonucleótido ¡nmunoestimulador de CpG y opcionalmente antigenos y otros agentes terapéuticos opcionalmente incluidos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término vehículo farmacéuticamente aceptable se refiere a una o más cargas sólidas o líquidas compatibles, diluyentes o sustancias encapsulantes que sean adecuadas para la administración a un ser humano u otro animal vertebrado. El término vehículo indica un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el ingrediente activo para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también son capaces de mezclarse con los compuestos de la presente invención y entre sí de una forma tal que no exista interacción que alteraría sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.

La presente invención se ilustra además mediante los siguientes Ejemplos, que de ningún modo deben interpretarse como limitantes adicionalmente. El contenido completo de todas las referencias (incluyendo las referencias bibliográficas, patentes expedidas, solicitudes de patentes publicadas y solicitudes de patente en trámite junto con la presente) citadas por toda esta solicitud se incorporan expresamente por la presente como referencia en su totalidad.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 El oligonucleótido inmunoestimulador CPG 24555 se comparó con los oligonucleótidos CPG 10103 y CPG 7909 para determinar su capacidad para aumentar respuestas inmunes específicas de antígeno en ratones cuando se inmunizaron por vía intramuscular (IM) usando antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) u ovoalbúmina (OVA) como antígenos de modelo.

Procedimientos y Materiales Todos los ODN se prepararon a partir de olígodesoxinucleótido liofilizado (ODN). En resumen, los ODN se disolvieron en tampón Tris-EDTA sin endotoxina a pH 8.0 (OmniPur®; EM Science, Gibbstown, NJ) y se diluyeron en solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS) sin endotoxina estéril a pH 7.2 (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) en condiciones asépticas para evitar tanto la contaminación microbiana como por endotoxina. Las soluciones madre se almacenaron a 4°C hasta el uso.

Se adquirieron ratones BALB/c y C57BI/6 de tipo silvestre hembra de Charles River Canadá (Quebec, Canadá). Se criaron ratones deficientes en TLR9 en fondo C57 en Taconic Farms y se transfirieron a Coley Animal Care Facility para los estudios. Los ratones se alojaron en jaulas microaislantes en el Animal Care Facility en Coley Pharmaceutical Group Canadá. Todos los estudios se realizaron de conformidad con el Comité de Cuidados Animales de Coley Canadá bajo las orientaciones de la Association for assessment and accreditation of laboratory animal care (AAALAC International) y el Canadian Council on Animal Care. Los animales tenían un peso de aproximadamente 18-20 g al comienzo del estudio.

Inmunización de ratones Antígeno de superficie de Hepatitis B (HBsAg) Se inmunizaron ratones BALB/c por vía intramuscular (IM) (n=1 O/grupo) en el músculo tibial anterior izquierdo con un 1 µg de HBsAg; subtipo ad (Cliniqa, 4076), en solitario o en combinación con 10 µg de CPG 24555, CPG 10103 o CPG 7909 en un volumen total de 50 µ?. A las 2 semanas después de la sensibilización, se extrajo sangre de los animales por medio de la vena submandibular usando heparina como un anticoagulante y se reforzaron usando la misma formulación de vacuna usada para la inmunización primaria. A las dos semanas después del refuerzo, se extrajo sangre de los animales por punción cardiaca usando heparina como un anticoagulante, se eutanasiaron por dislocación cervical y se extirparon los bazos asépticamente para uso en inmunoensayo para la detección de actividad de CTL específica de antígeno, secreción de IFN-? (sobrenadantes de cultivo) y linfocitos T CD4 frente a CD8 secretores de multicitocinas (IFN-?, TNF-a e IL-2). Se usó plasma de cada punto de tiempo del que se extrajo sangre para detección de IgG total específica de antígeno e isotipos de IgG lgG1 e lgG2a.

Ovoalbúmina de Pollo (OVA) Se inmunizaron por vía intramuscular (IM) ratones de tipo silvestre C57BI/6 y deficientes en TLR9 (C57BI/6 TLR9-/-) (n=1 O/grupo) en el músculo tibial anterior izquierdo con 20 µg de OVA calidad VII (Sigma, A7641 ) en solitario o en combinación con 10 µg de CPG 24555, CPG 10103, CPG 7909 u ODN de control sin CpG 2137 en un volumen total de 50 µ?. Los animales se reforzaron usando la misma formulación de vacuna que se usó para la inmunización primaria a los 14 y 21 días después de la inmunización primaria. A los 7 días después del último refuerzo, se extrajo sangre de los animales por punción cardiaca usando heparina como un anticoagulante, se eutanasiaron por dislocación cervical y se extirparon los bazos asépticamente para uso en ensayo inmune para detección de actividad de CTL específica de antígeno, secreción de IFN-? (sobrenadantes de cultivo), linfocitos T CD8 positivos a tetrámero y linfocitos T CD4 frente a CD8 secretores de multicitocinas (IFN-?, TNF-a e IL-2). Se usó plasma para detección de IgG total específica de antígeno e isotipos de IgG lgG1 e lgG2c.

Inmunoensa os Determinación de títulos de anticuerpo especifico de antigeno Se detectaron anticuerpos (IgG total, lgG1 e lgG2a/c) específicos para HBsAg (anti-HBs) u ovoalbúmina (anti-OVA) y se cuantificaron por ensayo de ELISA de dilución a punto final que se realizó por triplicado en muestras de animales individuales. Se definieron los títulos a punto final como la mayor dilución de plasma que da como resultado un valor de absorbancia (DO 450 nm) dos veces superior que el de plasma no inmune con un valor de corte de 0.05. Estos se describieron como títulos medios geométricos de grupo (TMG) ± ETM.

Evaluación de respuestas de CTL Los bazos extirpados 1 semana (para OVA) o 2 semanas (para HBsAg) después de la última inmunización se usaron para ensayo de respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de antígeno. Los bazos se homogeneizaron en una suspensión de una sola célula en medio de cultivo de tejido RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT) complementado con suero bovino fetal al 10% (Hyclone, Logan, UT), solución de penicilina-estreptomicina (concentración final de 1000 U/ml y 1 mg/ml respectivamente; Invitrogen, Burlington, ON), L-glutamina (concentración final de 2 mM; Invítrogen, Burlington, ON) y ß-mercaptoetanol 5*10"5 M (Invitrogen, Burlington, ON). Se reestimularon linfocitos específicos de HBsAg en suspensiones de esplenocitos (3 x 106 células/ml) durante 5 días por incubación con una línea celular murina irradiada (P815/S) que expresaba HBsAg y linfocitos específicos de OVA en suspensiones de esplenocitos (3 x 106 células/ml) se re-estimularon durante 5 días por incubación con una línea celular murina irradiada (EG.7) que expresaba OVA. Después de la reestimulación, se determinó el potencial de los linfocitos para destruir células que expresaban HBsAg u OVA usando un ensayo de liberación de 5 Cr. Los resultados se presentan como un % de lisis específica a diferentes proporciones de efector con respecto a diana (E:T).

Evaluación de la secreción de IFN-? específico de antígeno por esplenocitos Se usaron esplenocitos de 1 semana (para OVA) o 2 semanas (para HBsAg) después de la última inmunización para medir la secreción de IFN-? después de la reestimulación con antígeno. En resumen, se prepararon suspensiones de esplenocitos como se hizo para el ensayo de CTL y se ajustaron a una concentración final de 5 x 106 células por mi en medio de cultivo de tejidos RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT) complementado con suero de ratón normal al 2% (Cedarlane Laboratories, Ontario, Canadá), solución de penicilina-estreptomicina (concentración final de 1000 U/ml y 1 mg/ml respectivamente; Invitrogen, Burlington, ON), L-glutamina (concentración final de 2 mM; Invitrogen, Burlington, ON) y ß-mercaptoetanol 5x10"5 M (Invitrogen, Burlington, ON). [RPMI 1640 Completo]. Se sembró en placas una suspensión de esplenocitos sobre placas de cultivo de tejidos de fondo en U de 96 pocilios (100 µ?/pocillo) junto con 100 µ? de cada estimulante (como se describe en leyendas de las figuras apropiadas) diluido a concentraciones apropiadas en RPMI 1640 Completo. Se usó concanavalina A (10 µg/ml, Sigma) como control positivo y como controles negativos se usaron células cultivadas con medios en solitario. Cada muestra de esplenocitos se sembró en placas por triplicado y las células se incubaron en una incubadora de C02 al 5% humidificada a 37°C durante 72 h. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron al final del período de incubación y se almacenaron a -80°C hasta que se ensayaron. Se usaron kits de ensayo disponibles en el mercado (IFN-? de ratón OptEIA; BD Pharmingen, Mississauga, ON) de conformidad con las instrucciones del fabricante para ensayar los niveles de IFN-? en sobrenadantes de cultivo.

Cuantificación de población CD8 positiva para tetrámero de OVA También se usaron suspensiones de esplenocitos obtenidas como se ha descrito anteriormente para la cuantificación de poblaciones CD8 positivas para tetrámero de OVA por FACS. Se transfirieron esplenocitos (2x106) de bazos individuales a tubos de ensayo de 12x75 mm que contenían 500 µ? de tampón de tinción: DPBS que contenía suero bovino fetal al 1 % (Hyclone, Logan, UT) y Azida Sódica al 0.1% (Sigma). Las células se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos y se retiró el sobrenadante. Se bloquearon los receptores Fe por incubación de las células a 4°C durante 10 minutos con CD16/CD32 anti-ratón (bloqueante de Fe) (BD Pharmingen). Las células se lavaron con tampón de tinción y se tiñeron durante 20 minutos a 4°C usando tetrámero específico de OVA de clase 1 (SIINFEKL) (Beckman Coulter). Después las células se lavaron de nuevo con tampón de tinción y se tiñeron durante 20 minutos a 4°C con CD8a-FITC anti-ratón (BD Pharmingen). Las células se lavaron con tampón de tinción, se resuspendieron en 500 µ? de tampón de tinción y se analizaron usando un citómetro de flujo FC500 (Beckman coulter). Los linfocitos T CD8 específicos de OVA se identificaron como células que eran tanto positivas para CD8a como para el tetrámero. Los datos se expresan como % de células positivas para CD8 y tetrámero.

Cuantificación de poblaciones de linfocitos T secretores de multicitocinas específicas de antigeno Se reestimularon suspensiones de esplenocitos combinados para cada grupo en placas de cultivo de tejido de 24 pocilios en medio de cultivo de tejidos RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT) complementado con suero de ratón normal al 2% (Cedarlane Laboratories, Ontario, Canadá), solución de penicilina-estreptomicina (concentración final de 1000 U/ml y 1 mg/ml respectivamente; Invitrogen, Burlington, ON), L-glutamina (concentración final de 2mM; Invitrogen, Burlington, ON) y ß-mercaptoetanol 5 ? 10"5 M (Invitrogen, Burlington, ON).

Para la reestimulación con CD4: se estimularon 5x106 células durante una noche en un volumen final de 1 mi que contenía 5 µg/ml de HBsAg.

Para la reestimulación con CD8; se estimularon 5x106 células durante 5 horas en un volumen final de 1 mi que contenía 5 µg/ml de péptido HBs (IPQSLDSWWTSL).

Se usaron medios sin estimulantes como control negativo cuando se usaron 10 ng/ml de PMA (Sigma) y 1 µg/ml 1 de ionomicina (Sigma) [añadido durante las últimas 4 horas de incubación] como controles positivos. Además, durante las últimas 4 horas de reestimulación, se añadió Brefelden A (BD Pharmingen) y monensina (BD Pharmingen) para interrumpir el transporte de proteínas.

Después de la reestimulación, las células se lavaron con tampón de tinción y se bloquearon los receptores Fe incubando células a 4°C durante 10 minutos con CD16/CD32 anti-ratón (bloqueante de Fe) (BD Pharmingen). Después las células se centrifugaron y se resuspendieron en tampón de tinción que contenía 5 µg/ml de CD4-ECD anti-ratón (Invitrogen) o CD8-ECD anti-ratón (Invitrogen) y se incubaron durante 30 minutos a 4°C. Las células se lavaron con tampón de tinción y se resuspendieron en Solución BD Fix/Perm (BD Pharmingen) durante 20 minutos a 4°C. Las células se lavaron de nuevo con solución de lavado BD Perm (BD Pharmingen), se resuspendieron en solución de lavado BD Perm 1X (BD Pharmingen) que contenía 5 µg/ml de cada uno de IL-2-FITC (BD Pharmingen), TNF-APC (BD Pharmingen) e IFN-?- PeCy7 (BD Pharmingen) y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. Las células se lavaron con solución de Lavado BD Perm 1X (BD Pharmingen), se resuspendieron en tampón de tinción normal y se analizaron usando un citómetro de flujo FC500 (Beckman Coulter).

RESULTADOS Respuestas inmunes humorales Los tres CpG ODN ensayados (CPG 24555, 10103 y 7909) aumentaban significativamente los títulos de IgG total específica de HBsAg y OVA en ratones de tipo silvestre (P<0.05). No había diferencias significativas entre los tres CpG ODN en términos de su capacidad para aumentar la IgG total especifica de HBsAg u OVA en ratones (Figura 1 ).

La capacidad de CPG 24555, CPG 10103 y CPG 7909 para aumentar los títulos de anticuerpos en animales deficientes en TLR9 se ensayó usando OVA. Los títulos de anticuerpo totales detectados 1 semana después del refuerzo con cualquiera de los regímenes de vacunación eran inferiores a 100 y ninguno de los CpG ODN era capaz de aumentar significativamente los títulos de anticuerpo contra OVA en comparación a cuando se usaba la vacuna en solitario o en combinación con ODN sin CpG 2137 (no se muestran los datos).

En ratones, la distribución de isotipos de IgG se usa ampliamente como indicación de la naturaleza de la respuesta inmune, siendo los niveles de lgG2a o lgG2c indicativos de una respuesta inmune desplazada hacia Th1 mientras que los títulos elevados de lgG1 son indicativos de una respuesta inmune desplazada hacia Th2. Los tres CpG ODN ayudaban a inducir respuestas inmunes desplazadas hacia Th1 fuertes con proporciones de lgG2a/lgG1 e lgG2c/lgG1 >1 (Figura 1 ) y con títulos de lgG2a/c significativamente aumentados en comparación con cuando el antígeno se usaba en solitario (P<0.05) (Figura 2).

Respuestas inmunes celulares: Respuestas de CTL Una forma funcional de medir respuestas basadas en Th1 es medir la actividad de CTL frente a células diana presentadoras de antígeno. Como se observa en la Figura 3, todos los CpG ODN ensayados eran capaces de aumentar significativamente las respuestas de CTL específicas de antígeno frente a OVA en ratones en comparación con cuando el antígeno se usaba en solitario o en combinación con ODN sin CPG 2137 (P<0.05; Figura 3 panel derecho). No había diferencias significativas entre el CpG ODN ensayado para promover la inducción de CTL específicos de OVA excepto a una proporción de E:T de 6.25:1 donde tanto los grupos de CPG 24555 como los de CPG 7909 mostraban CTL específicos de OVA significativamente mayores que los grupos que recibieron CPG 10103.

Con HBsAg, tanto CPG 24555 como 10103, pero no CPG 7909, eran capaces de inducir respuestas de CTL específicos de antígeno significativamente mayores en comparación con cuando el antígeno se usó en solitario. (P<0.05; Figura 3 panel izquierdo). No había diferencias significativas entre CPG 24555 y CPG 10103 en su capacidad para promover la inducción de respuestas de CTL específicos de HBsAg en ratones.

No se observó un aumento mediado por CpG ODN de las respuestas de CTL en ratones deficientes en TLR9 (Figura 4).

Linfocitos T CD8 específicos de antígeno Se usaron tetrámeros específicos H-2Kb-SIINFEKL del MHC de Clase I para cuantificar las respuestas de linfocitos T CD8 en ratones inmunizados con OVA. Todos los CpG ODN ensayados aumentaban los linfocitos T CD8 específicos de antígeno en comparación con cuando el OVA se usó en solitario o en combinación con el ODN de control sin CPG 2137 (Figura 5). El CPG 7909 era superior al CPG 24555 y 10103 para promover la inducción de linfocitos T CD8 específicos de OVA (P<0.05). No había diferencias significativas entre CPG 24555 y 10103 en su capacidad para inducir linfocitos T CD8 específicos de OVA (P>0.05).

No se observó aumento mediado por CPG de linfocitos T CD8 específicos de OVA en ratones deficientes en TLR9 (Figura 5).

Secreción de IFN-? especifico de antigeno También se investigó la producción de interferón gama (IFN-?) en respuesta a estimulación con antígeno como una medida de la inmunidad celular por detección de la citocina en un sobrenadante de cultivo de esplenocitos reestimulados con antígeno de vacuna usando inmunoensayo enzimático. Los sobrenadantes de cultivo de esplenocitos recogidos de animales inmunizados con HBsAg u OVA usando CPG 24555 o CPG 10103 mostraban niveles significativamente superior de IFN-? en comparación con los inmunizados con antígeno en solitario. Cuando se usó HBsAg, CPG 24555 era significativamente mejor para promover la secreción de IFN-? especifica de antígeno en comparación con CPG 10103 o CPG 7909 (Figura 6; panel izquierdo). Cuando se usó con OVA CPG 24555 era igual a CPG 0103 pero superior a CPG 7909 para promover la secreción de IFN-? específica de antígeno (Figura 6; panel derecho).

No se observó aumento mediado por CpG ODN de la secreción de IFN-? específica de antigeno en animales deficientes en TLR9 (Figura 7).

Poblaciones de linfocitos T secretores de multicitocinas específicos de antigeno De conformidad con descubrimientos más recientes, la producción de IFN-? por linfocitos T en solitario no es predictiva de la capacidad de linfocitos T específicos de antígeno para inducir respuestas inmunes protectoras. Por lo tanto, en este estudio se evaluó la capacidad de linfocitos T CD4 y CD8 específicos de antígeno para producir IL-1 , TNF-a e IFN-? usando citometría de flujo policromática.

Con linfocitos T tanto CD4 como CD8, se observó un nivel relativamente bajo de secreción de IL-2 en comparación con la secreción de IFN-? y TNF-a (Figuras 8A-8B). Con linfocitos T CD4, el CPG 24555 ayudaba a inducir un mayor porcentaje de linfocitos T secretores de citocinas dobles en comparación con CPG 10103 y 7909 (se obtenía un 23% con CPG 24555, mientras que se obtenía un 4 y un 6% con CPG 10103 y 7909 respectivamente). En conjunto, se observó un porcentaje muy pequeño de linfocitos T CD4 específicos de HBsAg productores de citocinas triples (un 2, 0 y 1% con CPG 24555, 10103 y 7909 respectivamente) (Figura 8A).

Con linfocitos T CD8, tanto CPG 24555 como CPG 7909 ayudaron a inducir un alto nivel de linfocitos T secretores de citocinas dobles en comparación con CPG 10103 (el 48 y el 56 % con CPG 24555 y CPG 7909, respectivamente, mientras que sólo se obtenía el 19% con CPG 10103). De forma similar a las células CD4, se observó un porcentaje muy pequeño de linfocitos T CD8+ específicos de HBsAg productores de citocinas triples (1 , 0 y 0% con CPG 24555, 10103 y 7909 respectivamente) (Figura 8B).

CUADRO 1 Porcentaje de linfocitos T CD4+ específicos de HBsAg que son productores de una sola, dos o tres citocinas que secretan IFN-? v/o IL-2 y/o TNF-a * Indica la proporción total de linfocitos que producen estas citocinas ya sean productores individuales, dobles o triples * Indica la proporción total de linfocitos que producen estas dos citocinas ya sean productores dobles o triples.

CUADRO 2 Porcentaje de linfocitos T CD8+ específicos de HBsAg que son productores individuales, dobles o triples que secretan IFN^y v/o IL-2 v/o TNF-a * Indica la proporción total de linfocitos que producen estas citocinas ya sean productores individuales, dobles o triples * Indica la proporción total de linfocitos que producen estas dos citocinas ya sean productores dobles o triples Discusión Se diseñaron estudios para comparar CPG 24555 con CPG 10103 y CPG 7909 por su capacidad para aumentar respuestas inmunes específicas de antígeno en ratones cuando se usaban con 2 antígenos modelo: HBsAg y OVA. CPG 24555 y CPG 10103 tenían una secuencia de nucleótidos idéntica excepto porque el CPG 24555 tenía una inversión del nucleótido CG más 3' que daba como resultado la eliminación de un motivo CpG en el CPG 24555. El CPG 7909 es un CpG ODN de clase B que ha demostrado actividad adyuvante en ensayos clínicos humanos con varios antígenos de vacunas.

La eliminación del motivo de CpG 3' en CPG 24555 no tuvo ningún impacto negativo sobre su capacidad para aumentar respuestas inmunes específicas de antígeno y mostraba un aumento igual (respuestas de anticuerpos y linfocitos T CD8 específicos de antígeno como se midió por tinción de tetrámeros) o mejor (secreción de IFN-? específica de antígeno) de respuestas inmunes adaptativas en comparación con CPG 10103. De forma similar, el CPG 24555 era igual al CPG 7909 para aumentar respuestas de anticuerpos específicas de antígeno así como respuestas de CTL. El CPG 24555 era superior a CPG 7909 para promover la secreción de IFN-? específica de antígeno.

El aumento de respuestas inmunes adaptativas con los tres CpG ODN ensayados era dependiente de TLR9, ya que no se observó ningún aumento en las respuestas inmunes adaptativas en ratones deficientes en TLR9.

Como se muestra en el cuadro 1 , se obtuvo una mayor proporción de linfocitos T CD4+ específicos de antigeno que producían IFN-? con CPG 24555. También se obtuvo una mayor proporción de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno polifuncionales que producían al menos dos citocinas entre IFN-?, TNF-a e IL-2 (es decir, tanto IFN-? como TNF-a, tanto IFN-? como IL-2 o tanto TNF-a como IL-2, o incluso triples productoras que secretaban IFN-?, TNF-a e IL-2).

En lo que respecta a linfocitos T CD8+ (Cuadro 2), se obtuvo una mayor proporción de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno polifuncionales que producían dos citocinas y, en particular, se obtuvo IFN-? y TNF-a, tanto IFN-? como IL-2.

En conjunto, estos resultados demuestran que CPG 24555 es mejor que CPG 10103 para generar poblaciones de linfocitos T específicos de antígeno polifuncionales cuando se usa como adyuvante. Esto puede tener importancia, ya que se piensa que los linfocitos T polifuncionales, en particular en términos de producción de quimiocinas (tales como IFN-?, TNF-a e IL-2), son mejores células efectoras en comparación con linfocitos T que secretan una sola citocina.

EJEMPLO 2 Comparación de CPG 24555 y CPG 10103 Secuencias de nucleótidos de ODN ensayados CPG ODN 10103 5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO: 2) CPG ODN 24555 5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO: 1) ODN Sin CpG 22881 5' T*G*C*T*G*C*T*T*T*T*T*G*G*C*T*G*C*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO: 4) ODN Sin CpG 2137 5' T*G*C*T*G*C*T*T*T*T*G*T*G*C*T*T*T*T*G*T*G*C*T*T 3' (SEQ ID NO: 5) * indica enlace fosforotioato (PS) La porción subrayada de las secuencias representa la diferencia entre CPG ODN 10103 y CPG ODN 24555.

Motivo de CpG óptimo para seres humanos: GTCGTT Inmunidad innata en PBMC Humanos Se incubaron PBMC humanos (5x106/ml) con concentraciones variables de CPG 10103, CPG 24555 u ODN de control sin CpG 22881 durante 24 ó 48 h. Los sobrenadantes celulares se recogieron y se ensayaron con respecto a la secreción de citocinas/quimiocinas usando un kit de ELISA comercial (Cuadro A y Cuadro B).

CUADRO A Secreción de IFN-a. MCP-1 e 1P-10 CUADRO B Secreción de IL-6, IL- 0 e IL-2R ODN IL-6 IL-10 IL-2R (5 donantes) (6 donantes) (3 donantes) EC50 Máx EC50 Máx EC50 Máx (nM) (pg/ml) (nM) (pg/ml) (nM) (pg/ml) CPG 10103 120 330 120 120 390 1 70 CpG 24555 190 450 100 160 190 200 ODN sin GpC 210 210 140 20 250 140 22881 Inmunidad innata in vivo en ratones BALB/c Se inyectó a ratones BALB/c (n=5/grupo) por vía subcutánea PBS (control de placebo), CPG 24555, CPG 10103 u ODN de control sin CpG 2137 a un nivel de dosis de 100 µg. Se extrajo sangre de los animales a las 3 horas después de la inyección y se ensayó el plasma con respecto a IP-10 (Figura 9A) e IL-12 (Figura 9B) o IL-6 (Figura 9C) usando un ELISA comercial. Los resultados que se muestran son las medias del grupo ± error típico de la media (NS = no significativo).

Inmunidad humoral in vivo en ratones BALB/c A ratones BALB/c se les inyectó por vía intramuscular HBsAg (1 µg) con o sin CPG 2455, CPG 10103 u ODN de control sin CpG 2137 a 10 µg. Los ratones recibieron las inyecciones los días 0 y 14. Los resultados que se muestran son títulos de IgG total específica de HBsAg a las 2 semanas después del refuerzo medidos por ELISA de punto final (Figura 10A).

A ratones C57bl/6 se les inyectó por vía intramuscular OVA (20 µ9) con o sin CPG ODN 2455, CPG 10103 u ODN de control sin CpG 2137 a 10 µg. Los ratones recibieron las inyecciones los días 0, 7 y 21. Los resultados que se muestran son títulos de IgG total específica de OVA a 1 semana después del último refuerzo (Figura 10B).

A ratones BALB/c se les inyectó por vía intramuscular influenza A HA de Texas 1/77, H3N2 (1 ± alumbre (25 µg AI3+) con o sin CPG ODN 2455, CPG 10103 u ODN de control sin CpG 2137 a 10 Los resultados que se muestran son la cinética de IgG total específica de HA a diversos tiempos después de la inmunización medida por ELISA de punto final (Figura 10C).

Respuestas de linfocitos T en ratones BALB/C A ratones BALB/c se les inyectó por vía intramuscular HBsAG (1 µ9) con o sin CPG ODN 2455, CPG 10103 u ODN de control sin CpG 2137 a 0 Los ratones recibieron las inyecciones los días 0 y 14. Los resultados que se muestran son CTL específicos de HBsAg medidos por liberación de 5 Cr a las 2 semanas después del refuerzo (Figura 1 1A).

A ratones C57bl/6 se les inyectó por vía intramuscular OVA (20 µ9) con o sin CPG ODN 2455, CPG 10103 u ODN de control sin CpG 2137 a 10 µg. Los ratones recibieron las inyecciones los días 0, 7 y 21. Los resultados que se muestran son CTL específicos de OVA medidos por liberación de 51Cr a 1 semana post último refuerzo (Figura 1 1 B).

A ratones BALB/c se les inyectó por vía intramuscular HBsAG (1 µ9) con o sin CPG ODN 2455, CPG 10103 u ODN de control sin CpG 2137 a 10 µg. Los ratones recibieron las inyecciones los días 0 y 14. Se incubaron esplenocitos de 2 semanas después del último refuerzo con el antígeno respectivo durante 72 horas y se ensayaron los sobrenadantes de cultivo para IFN-? por ELISA (Figura 12A).

A ratones C57bl/6 se les inyectó por vía intramuscular OVA (20 µg) con o sin CPG ODN 2455, CPG 10103 u ODN de control sin CpG 2137 a 10 Los ratones recibieron las inyecciones los días 0 y 14. Se incubaron esplenocitos de 1 semana después del último refuerzo con el antígeno respectivo durante 72 horas y se ensayaron los sobrenadantes de cultivo con respecto a IFN-? por ELISA (Figura 12B).

Resultados y Discusión CPG 10103 y CPG 24555 tienen secuencias de nucleótidos idénticas excepto por la inversión del dinucleótido CG más 3' presente en CPG 10103 en GC en CPG 24555 que tiene como resultado la eliminación de un motivo CpG en CPG 24555. Basándose en los informes previos, dada la misma secuencia flanqueante, localización de motivos y separación, un número aumentado de motivos CPG debería conducir a una estimulación inmune aumentada. Basándose en los conocimientos anteriores, se esperaba que el CPG 24555 fuera menos inmunoestimulador que el CPG 10103 y menos eficaz como adyuvante de vacuna. Sin embargo, los resultados anteriores demuestran que CPG 24555 tiene un potencial inmunoestimulador y una actividad adyuvante similar o superior en comparación con CPG 10103.

EJEMPLO 3 Comparación de CPG 10103. CPG 24555 v CPG 7909 como Adyuvante de Vacuna para Antígeno de Hemaglutinina de Influenza (HA) en Ratones BALB/C Procedimientos y Materiales Se inmunizaron ratones BALB/c hembra (10/grupo) por inyección intramuscular (IM) en el músculo tibial anterior (TA) izquierdo con hemaglutinina de Influenza A (HA) de Texas 1/77, H32N2 (1 µg) ± CpG u ODN de control (10 mg) ± alumbre (25 mg de AI3+) en un volumen total de 50 µ?. Se extrajo sangre de los ratones a diferentes intervalos de tiempo después de la inmunización para evaluar la respuesta de anticuerpos específica de HA. Se sacrificó a la mitad de los animales por grupo a las 6 semanas de la inmunización para evaluar las respuestas inmunes mediadas por células (CTL, secreción de IFN-g específica de HA y análisis citométrico de flujo de secreción de citocinas de linfocitos T).

CUADRO 3 Resultados y Discusión Anti-HA a las 6 Semanas Después de la Inmunización A las 6 semanas después de la inmunización, se midió la cantidad de anti-HA. El CPG 24555 era superior que el CPG 10103 y que el CPG 7909 para aumentar la IgG específica de HA (Figura 13).

Títulos de Inhibición de Hemaglutinación (HIA) a las 4 Semanas Después de la Inmunización Se evaluó la funcionalidad de los anticuerpos usando un ensayo de inhibición de hemaglutinación (HIA). Cuando se usó en solitario como adyuvante, el CPG 24555 era superior al CPG 10103 (p=0.009) e igual que el CPG 7909 (p=0.1) para aumentar los títulos de HIA (Figura 14). Los 3 CpG ODN ensayados eran equivalentes para aumentar los títulos de HIA cuando se usaron en combinación con alumbre.

Secreción de IFNy Específico de HA Se midió la concentración de IFNy secretado. El CPG 24555, cuando se usó en solitario como adyuvante, era superior al CPG 10103 para aumentar la secreción de IFN-? especifico de HA (marcador de inmunidad mediada por células) (Figura 15). Cuando se usó en combinación con alumbre, el CPG 24555 era superior al CPG 10103 y al CPG 7909 para aumentar la secreción de IFN-? específica de HA (Figura 15).

EJEMPLO 4 Comparación de CPG 24555 y CPG 7909 como Adyuvante de Vacuna contra Antígeno de Superficie de Hepatitis B (HBsAg) en Monos Cynomolgus Materiales y Procedimientos Se inmunizaron por vía intramuscular monos Cynomolgus (3-5 años; de 2.5 a 5.5 kg; n = 5/grupo; excepto n=4 en el grupo de HBsAg + IMX) (inyección IM de 0.6 mi en el cuádriceps derecho) con: 1) Engerix-B (dosis pediátrica; 10 mg de HBsAg) 2) Engerix-B + CPG 7909 (0.5 mg) 3) Engerix-B + CPG 24555 (0.5 mg) Los animales recibieron 3 inmunizaciones; a la semana 0 (sensibilización), 4 (refuerzo 1 ) y 8 (refuerzo 2). Se extrajo sangre de los animales antes de la sensibilización, 4 semanas después de la sensibilización (semana 4), 2 semanas después del refuerzo 1 (semana 6), 4 semanas después del refuerzo 1 (semana 8) y 2 semanas después del refuerzo 2 (semana 10).

Los ensayos inmunes específicos de HBsAg se realizaron de la forma siguiente: 1 ) Titulo de anticuerpos y avidez 2) Secreción de citocina intracelular (IL-2, IFN-?, TNF-ct) 3) Linfocitos T polifuncionales 4) Ensayo ELISPOT: IL2, TNF-a, IFN-?, Perforina Resultados y Discusión Respuestas Humorales Era evidente la posibilidad de exposición previa de los animales en este estudio al virus de la hepatitis B por el alto nivel de títulos de anticuerpos específicos de HBsAg detectados antes de la prevacunación. Además, un animal en el envío dio positivo para HBV por serología sugiriendo una posible exposición a HBV. Sin embargo, todos los animales usados en este estudio dieron negativo para HBV por PCR. Hubo un aumento en el título anti-HBsAg con cada refuerzo. La adición de CpG a Engerix-B aumentaba los títulos de anticuerpos específicos de HBsAg en comparación con cuando Engerix-B se usaba en solitario (Figura 16). Además, la adición de CpG mejoraba la avidez del anticuerpo en comparación con cuando Engerix-B se usaba en solitario (Figura 17). El CPG 2455 era equivalente al CPG 7909 para aumentar tanto el título de anticuerpos como la avidez.

Respuestas de Linfocitos T: Secreción de Citocinas Intracelulares por Linfocitos T CD4 La adición de CpG a Engerix-B tendía a aumentar la frecuencia de secreción de IFN-? y TNF-a, pero no de IL-2, mediada por linfocitos T CD4 (Figuras 18A-18C). En conjunto, el CPG 24555 era equivalente o mejor que el CPG 7909 para la inducción de citocinas mediadas por CD4.

Respuestas de Linfocitos T: Linfocitos T CD4 Polifuncionales; Análisis Cuantitativo Se midió el número de células que secretaban una, dos o tres citocinas en la semana 10 (2 semanas después del refuerzo 2). CPG 24555 era equivalente a CPG 7909 en la inducción de linfocitos T CD4 específicos de Engerix-B que secretaban una citocina. En conjunto, se detectó un nivel relativamente bajo de linfocitos T CD4 productores triples de citocinas. Sin embargo, el CPG 24555 inducía más linfocitos T CD4 triples productores de citocinas que el CPG 7909 o Engerix-B en solitario (Figura 19A). Además, los animales inmunizados con Engerix-B + CPG 24555 tenían una mayor proporción de linfocitos T triples productores de citocinas en comparación con los animales inmunizados con Engerix-B en solitario o Engerix-B + CPG 7909 (Figura 19B).

Respuestas de Linfocitos T: Linfocitos T CD4 polifuncionales; Análisis Cualitativo Se midió el número de células que secretaban IL-2, IFN-? y TNFa o combinaciones de estas citocinas. El CPG 24555 era equivalente o mejor que el CPG 7909 para inducir linfocitos T polifuncionales (Figura 20A y Figura 20B).

Respuestas de Linfocitos T: Polifuncionalidad de Linfocitos T CD4 La proporción de linfocitos T CD4 triples productores de citocinas se midió a las 2 semanas después del refuerzo 2. Se observó una mayor proporción de linfocitos T CD4 triples productores de citocinas con CPG 24555 en comparación con CPG 7909.

Conclusiones Basándose en los datos, la eliminación del motivo 3' CpG en CPG 24555 no tenia ningún impacto negativo sobre su capacidad para aumentar respuestas inmunes específicas de antígeno y mostraba un aumento equivalente o mejor de respuestas inmunes adaptativas en comparación con CPG 1013 y CPG 7909. La actividad adyuvante de CPG 24555 observada con múltiples antigenos en ratones también se trasladó a primates no humanos, mostrando el CPG 24555 una actividad adyuvante igual (inmunidad humoral) o superior (linfocitos T polifuncionales específicos de Ag) que la de CPG 7909 con el antígeno de superficie de hepatitis B en monos Cynomolgus.

Los especialistas en la técnica reconocerán o serán capaces de determinar, sin usar más que una experimentación de rutina, muchos equivalentes de las modalidades específicas de la invención descritos en este documento. Dichos equivalentes pretenden incluirse en las siguientes reivindicaciones.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un oligonucleótido inmunoestimulador que comprende la secuencia de nucleótidos 5' TCGTCG I I I I I CGGTGCTTTT 3' (SEQ ID NO:1).

2. El oligonucleótido inmunoestimulador de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende el oligonucleótido uno o más enlaces modificados.

3. El oligonucleótido inmunoestimulador de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque comprende el oligonucleótido uno o más enlaces fosforotioato.

4. El oligonucleótido inmunoestimulador de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende el oligonucleótido al menos un análogo de nucleótido sustituido lipófilo y un dinucleótido de pirimidina-purina.

5. Una vacuna que comprende un antígeno y un oligonucleótido inmunoestimulador que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 , que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. La vacuna de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el oligonucleótido inmunoestimulador está en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune específica de antígeno.

7. La vacuna de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque la respuesta inmune específica de antígeno inducida es una respuesta inmune Th1.

8. La vacuna de conformidad la reivindicación 5, caracterizada además porque el antígeno es un antígeno microbiano, un autoantígeno o una sustancia adictiva.

9. La vacuna de conformidad la reivindicación 8, caracterizada además porque el antígeno microbiano es un antígeno bacteriano, un antígeno viral o un antigeno parasitario.

10. La vacuna de conformidad la reivindicación 9, caracterizada además porque a) el antígeno bacteriano está asociado con Staphylococcus aureus, una bacteria que causa caries dental o una bacteria que causa enfermedad periodontal; b) el antígeno viral está asociado con el Virus Respiratorio Sincitial (VRS), virus Herpes Simple 1 , virus Herpes Simple 2, Virus-1 de la Inmunodeficiencia Humana (VIH-1) o VIH-2, o c) el antígeno parasitario está asociado con un parásito que causa malaria.

11. La vacuna de conformidad la reivindicación 10, caracterizada además porque a) la bacteria que causa caries dental es Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Streptococcus sanguis, Lactobacillus acidophilis, o Actinomyces viscosus; o b) la bacteria que causa enfermedad periodontal es Porphyromonas gingivalis o Actinobacillus actinomycetemcomitans.

12. La vacuna de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el autoantigeno es un antígeno tumoral, un antígeno asociado con la Enfermedad de Alzheimer, un antígeno contra un anticuerpo humano, un antígeno que se expresa a partir de elementos retrovirales endógenos humanos, o un hapteno de nicotina conjugado con un portador.

13. La vacuna de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque a) el antígeno tumoral es HER2, MAGE, NY-ESO, PSA, CEA o una forma variante de EGFR; b) el antígeno asociado con la Enfermedad de Alzheimer es tau o ß-amiloide; c) el antígeno e IgE; o d) el portador con el que se conjuga el hapteno de nicotina es toxina diftérica (DT).

14. La vacuna de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el antígeno es un péptido, una proteína recombinante, una proteína purificada, un patógeno destruido completo, un vector viral o virus vivo atenuado, un vector bacteriano o bacteria viva atenuada, un polisacárido, un hapteno o está codificado por un ADN plasmídico.

15. La vacuna de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el antígeno está conjugado con un portador.

16. La vacuna de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque el vehículo es toxina diftérica (DT) o una partícula similar a virus, siendo la partícula similar a virus fago de ARN Q-ß, antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) o antígeno de núcleo de hepatitis B (HBcAg).

17. La vacuna de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque comprende además uno o más adyuvantes.

18. La vacuna de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque el adyuvante es un agonista para un receptor de tipo Toll (TLR) que no es TLR 9.

19. La vacuna de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque el agonista es para TLR 3, TLR4, TLR 5, TLR 7 o TLR8.

20. La vacuna de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque a) el agonista de TLR 3 es polil:C estabilizado; b) el agonista de TLR 4 es un derivado de lipopolisacárido (LPS); c) el agonista de TLR 5 es flagelina; o d) el agonista de TLR 7 o TLR9 es una molécula pequeña de la familia de imidazoquinolina.

21. La vacuna de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque el derivado de LPS es MPL o GLA.

22. La vacuna de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque el adyuvante es una sal de aluminio, un complejo inmunoestimulador (ISCOM), una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite, un liposoma o un sistema de suministro.

23. La vacuna de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque a) la sal de aluminio es hidróxido de aluminio; o b) el sistema de suministro es una nanopartícula o una micropartícula.

24. La vacuna de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el oligonucleótido inmunoestimulador comprende uno o más enlaces modificados.

25. La vacuna de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque a) el oligonucleótido inmunoestimulador comprende uno o más enlaces fosforotioato; o b) el oligonucleótido inmunoestimulador comprende al menos un análogo de nucleótido sustituido lipófilo y un dinucleótido de pirimidina-purina.

26. La vacuna de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque la vacuna está formulada para administración.

27. La vacuna de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque a) la vacuna está formulada para administración por una vía parenteral, siendo la vía parenteral intramuscular, subcutánea, intradérmica, intravenosa o intraperitoneal; o b) la vacuna está formulada para administración por una vía tópica, siendo la vía tópica la piel, transdérmica o una superficie mucosa.

28. La vacuna de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque la vía mucosa es oral, intranasal, intravaginal, intrarrectal, intrabucal o intraocular.

29. El uso un antígeno y un oligonucleótido inmunoestimulador que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 para la elaboración de una vacuna para la inducción de una respuesta inmune específica de antígeno en un sujeto.

30. El uso como se reclama en la reivindicación 29, en donde el antígeno es un antígeno microbiano, un autoantígeno o una sustancia adictiva.