MX2011003426A - Procesamiento mejorado de g-csf humano recombinante. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un precursor de G-CSF que comprende un péptido señal y un péptido G-CSF, en donde el péptido señal tiene la secuencia del péptido señal natural humano de la molécula G-CSF/b con por lo menos una de las siguientes mutaciones: supresión de G1u29, inserción de G1u26, sustitución de Lys11Leu, sustitución His21Phe, y sustitución G1u28Leu.

Description

PROCESAMIENTO MEJORADO DE G-CSF HUMANO RECOMBINANTE ANTECEDENTES DE LA INVENCION G-CSF es una glucoproteína de 20 kDa estabilizada por dos enlaces disulfuro intracadena y que contiene una porción carbohidrato unida a O única. El G-CSF tiene 174 aminoácidos. G-CSF se sintetiza por células de médula ósea, macrófagos y fibroblastos. Su función principal es ser un factor de crecimiento y diferenciación para granulocitos neutrofílieos y sus células precursoras. También se sabe en el ámbito que G-CSF activa neutrófilos maduros. Además, estimula el crecimiento/diferenciación de diversas células progenitoras hematopoyéticas (en sinergia con factores de crecimiento hematopoyéticos adicionales) y promueve la proliferación y migración de células endoteliales . Clínicamente, G-CSF se utiliza para el tratamiento de deficiencias en niveles de granulocitos neutrofílicos (neutropenia causada, por ejemplo, por cáncer/quimioterapia, SIDA o transplante de médula ósea) .

SUMARIO DE LA INVENCION Con el fin de tratar neutropenia, los pacientes con G-CSF idéntico humano, se transfectan células humanas con un plásmido que codifica para G-CSF natural humano. Después de purificación de G-CSF del sobrenadante de cultivo celular de los clones seleccionados, se observa que una cantidad Ref.: 218231 sustancial de G-CSF secretado es cortable en la parte N terminal- en tres aminoácidos. Este corte no es específico del clon y no puede ser eliminado por modificación de las condiciones de cultivo celular.

En base en esta observación se concluye que el procesamiento de las proteína precursora de G-CSF en células, especialmente células HEK293F no es preciso. De manera detallada, se concluye que el complejo de peptidasa de señal no solo separa en la posición esperada con el fin de remover fisiológicamente el péptido señal sino que adicionalmente en una o más posiciones que llevan al corte en la parte N terminal .

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Sorprendentemente se ha encontrado que el corte en la parte N terminal se puede reducir si se utiliza un péptido señal modificado y un precursor G-CSF correspondiente.

Por lo tanto, en una modalidad, la invención proporciona un precursor de G-CSF que comprende un péptido señal y un péptido G-CSF, en donde el péptido señal tiene la secuencia del péptido señal natural humano de la molécula G-CSF/b humana (SEC ID NO: 4) con por lo menos una de las siguientes mutaciones: supresión de Glu29, inserción de Glu26, sustitución LysllLeu, sustitución His21Phe, y sustitución Glu28Leu.

En una modalidad preferida, el precursor G-CSF tiene por lo menos 2 o por lo menos 3 o por lo menos 4 o la totalidad de las cinco mutaciones mencionadas antes.

En una modalidad adicional de la invención, el precursor G-CSF tiene hasta 3 mutaciones adicionales que se seleccionan de inserción, supresión y sustitución.

Una modalidad adicional de la invención es un polinucleótido que codifica para el precursor de G-CSF de la invención y un polinucleótido complementario al polinucleótido mencionado antes.

Una modalidad adicional de la invención es un vector que comprende el polinucleótido de la invención y una célula transfectada que comprende ya sea el polinucleótido de la invención o el vector de la invención.

En una modalidad preferida, es una célula eucariótica, preferiblemente una célula humana, de manera más preferible una célula HEK293 y de manera más preferible una célula HEK293F o una célula derivada de HEK293F .

En una modalidad, la transfección es transitoria y, en otra modalidad, la transfección es estable.

Una modalidad adicional de la invención es un método para expresar G-CSF que comprende las etapas de: cultivar células transíectadas de la invención en un medio de cultivo adecuado, aislar G-CSF del medio de cultivo.

En una modalidad preferida, el cultivo es a un pH dentro del intervalo de 6.8 a 7.5, preferiblemente de 7.1 a 7.3, de manera más preferible de aproximadamente 7.2. Preferiblemente, el pH se controla durante el cultivo.

En una modalidad adicional, el cultivo es en presencia de insulina en un intervalo de 5 a 25 mg/ml, preferiblemente de 15 a 25 mg/ml, de manera más preferible de 15 a 20 mg/ml.

Sorprendentemente con el péptido señal modificado de la invención, el G-CSF producido tiene una proporción de truncado muy pequeña, preferiblemente inferior a 5% de las moléculas, de manera más preferible inferior a 1% del G-CSF total. Se considera que 1% está en el límite de detección.

Preferiblemente, el medio de cultivo está libre de suero .

El patrón de glucosilación de G-CSF principal se encuentra sin cambio y la actividad es la misma que la de G-CSF natural.

Por lo tanto, el método de la presente invención produce un G-CSF el cual es altamente adecuado para aplicaciones farmacéuticas.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1 muestra el análisis de G-CSF natural humano, con el péptido señal natural utilizando el programa TargetP.

La figura 2 muestra el análisis de G-CSF natural humano, con el péptido señal SP9 utilizando el programa TargetP.

La figura 3 muestra el análisis de G-CSF natural » humano con el péptido señal SP10 utilizando el programa TargetP .

La figura 4 muestra la expresión de la proteína G-CSF madura de células HEK293F utilizando construcciones que codifican para las proteínas precursoras con el péptido señal natural (el nivel de expresión es 100%) con los péptidos señal SP9 o SP10, respectivamente.

Las figuras 5a- 5e muestran el cromatograma del secuenciado de aminoácidos de la parte amino terminal (degradación de Edman) de G-CSF natural humano, con el péptido señal SP9. La figura 5a a la figura 5e corresponden a los residuos 1 a 5. Un resumen del análisis de secuencia de aminoácidos se proporciona en la tabla siguiente.

Las figuras 6a- 6e muestran el cromatograma del secuenciado de aminoácidos de la parte amino terminal (degradación de Edman) de G-CSF natural humano con el péptido señal SP10. La figura 5a a la figura 5e corresponden a los residuos 1 a 5. Un resumen del análisis de secuencia de aminoácidos se proporciona en la tabla siguiente.

Las figuras 7a- 7e muestran el cromatograma de un secuenciajrdro de aminoácidos de la parte amino terminal v (degradación de Edman) de G ANOCYTE. La figura 6a a la figura 6e corresponden a los residuos 1 a 5. Un resumen del análisis de secuencia de aminoácidos se proporciona en la tabla siguiente.

Las figuras 8a-8e muestran el cromatograma del secuenciado de aminoácidos de la parte amino terminal (degradación de Edman) de G-CSF natural humano, con el péptido señal natural. La figura 7a a la figura 7e corresponden a los residuos 1 a 5) . Un resumen del análisis de secuencia de aminoácidos se proporciona en la tabla siguiente . la figura 9 muestra la comparación de la relación de G-CSF Ifde longitud completa para 2 clones ejemplares que resultan del aislamiento por clon de una transfección estable con G-CSF SP9. La fracción residual, no de longitud completa, comprende principalmente G-CSF truncado en la parte N terminal ^en 3 aminoácidos. La línea en la relación de G-CSF de longitud completa 99% se correlaciona con el corte en la parte N terminal de < 1%, el cual es un límite de detección menor del¦ análisis .

La figura 10 muestra la comparación de la relación de G-CSF de longitud completa en el ejemplo del clon 1 para diferentes pH de cultivo en cultivos en un reactor de tanque agitado. El clon 1 resulta del aislamiento de clon de una transfección estable con el vector SP9 de G-CSF.

La parte residual - fracción que no es longitud completa comprende principalmente G-CSF truncado en la parte N terminal por 3 aminoácidos. La relación de G-CSF de longitud completa del cultivo de referencia para el clon 1 en matraces de agitación (sin control de pH) se muestra en la primera barra en gris. La línea con una relación de G-CSF de longitud completa 99% se correlaciona con el corte en la parte N terminal de < 1%, el cual es el límite de detección inferior del análisis.

La figura 11 muestra la comparación de relación de G-CSF de longitud completa en el ejemplo del clon 2 para diferente pH de cultivo en cultivos de reactor de tanque agitado. El clon 2 resulta del aislamiento de clon de una transfección estable con el vector SP9 de G-CSF. El residual fracción que no es longitud completa comprende principalmente G-CSF cortado en la parte N terminal por 3 aminoácidos. La relación de G-CSF de longitud completa del cultivo de referencia para el clon 2 en los matraces de agitación (sin control de pH) se muestra en la primera barra en gris. La línea en una relación de G-CSF de longitud completa 99% se correlaciona con el corte N terminal de < 1%, el cual es el límite de detección inferior del análisis.

La figura 12 muestra la comparación de relación de G-CSF de longitud completa en el ejemplo del clon 2 para diferentes concentraciones de insulina en el medio de cultivo. El clon 2 resulta del aislamiento de clon de una transfección estable con el vector SP9 de G-CSF. El residual -fracción que no es de longitud completa comprende principalmente G-CSF cortado en la parte N terminal por 3 aminoácidos. La línea en la relación de G-CSF de longitud completa a 99% se correlaciona con el corte en la parte N terminal de < 1%, el cual es el límite de detección inferior del análisis.

La figura 13 muestra la comparación de la relación de G-CSF de longitud completa para diferentes días de cosecha en el ejemplo del clon 2 cultivado en el modo de alta densidad celular a gran escala con aplicación de 15 mg/1 de insulina al medio de cultivo, sin aplicación de un control de pH. El clon 2 resulta de un aislamiento de clon de una transfección estable con el vector SP9 de G-CSF. El residual fracción que no es de longitud completa comprende principalmente G-CSF cortado en la parte N terminal por 3 aminoácidos. La línea en la relación de G-CSF de longitud completa 99% se correlaciona con el corte N terminal de < 1%, el cual es el límite de detección inferior del análisis. f EJEMPLO 1 Optimización del péptido precursor de G-CSF para procesamiento correcto de proteína El ADNc para la isoforma b de GTCSF humano , natural ha sido publicada en la base de datos GenBank (N _172219) . Esencialmente, cualquier proteína precursora de G-CSF que tenga cualquier secuencia derivada de NM_172219 es de uso para la modificación de la secuencia de péptido señal de la presente invención. En una modalidad ejemplar, la proteína precursora tiene la secuencia presentada en la presente como SEC ID NO: 1 (GenBank NP_757373) : MAGPATQSP KLMALQLLLWHSALWTVQEATPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAAL QEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIP APLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQAL EGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLV ASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP La proteína precursora de G-CSF natural no procesada (SEC ID NO: 1) comprende 204 aminoácidos e incluye un péptido señal de 30 aminoácidos. El procesamiento se publica que sucede en los residuos Ala30 y Thr31 (GenBank NP_757373) .

Literatura reciente describe la secuencia de consenso de péptido señal eucariótico y la función del complejo de peptidasa de señal (Rapoport, 2007, Nature 450 (29), 663 - 669; Tuteja, 2005, Aren Biochem Biophys 441, 107-111; Dalbey et al., 1997, Protein Science 6, 1129-1138).

La secuencia de aminoácidos del péptido señal de G-CSF se compara con las características propuestas del péptido señal de consenso descrita en lo anterior. Se ha encontrado - lo ¬ que varios residuos aminoácidos no coinciden con el modelo propuesto. De manera detallada, el motivo Ala-X-Ala propuesto en el extremo C terminal del péptido señal, el cual se considera que es crucial para la precisión de la separación, se interrumpe por un aminoácido cargado (Glu29) en el péptido precursor G-CSF. Además, los residuos cargados Lysll y His21 se localizan en la región hidrofóbica del péptido señal y por lo tanto no están alineados con los requerimientos del modelo .

El péptido señal de G-CSF natural se analizó in silico con el programa SignalP y TargetP (www.cbs.dtu.dk/services; Emanuelsson et al., 2007, Nature Protocols 2, 953-971) : El programa demostró que el procesamiento se predice en la parte N terminal G-CSF correcta (Thr31) , pero adicionalmente en varios otros sitios (figura 1) . No obstante, el procesamiento en el sitio de corte (Gly34) no se predice por este programa.

EJEMPLO 2 El péptido señal de G-CSF natural se modeló in silico por cambios mínimos en su secuencia de aminoácidos con respecto al modelo de peptidasa de señal hipotética indicado antes. La posición de separación resultante nuevamente se analiza utilizando el, programa SignalP y TargetP. Algunos modelos diseñados in silico, por ejemplo denominados como SP9 G-CSF y SP10 G-CSF resultaron en predicción de únicamente la posición correcta (Thr31) para procesamiento de G-CSF, lo cual se tomó como un indicio para un péptido señal optimizado (véase figura 2 y figura 3 para análisis in silico de los sitios de separación SP9 G-CSF y SP10 G-CSF, respectivamente) . Varias de estas construcciones se seleccionaron para síntesis de gen (GeneArt, Regensburg, Alemania) . Los genes sintéticos que codifican para los péptidos SP9 G-CSF y SP10 G-CSF, respectivamente, se clonaron en un vector de expresión eucariótico y se utilizaron para transfección de células HEK293F.

EJEMPLO 3 Proteína Precursora de SP9 G-CSF La proteína precursora de SP9 G-CSF resulta de la secuencia de péptido señal de la proteína precursora G-CSF humana natural (SEC ID NO: 1) . De manera detallada, el ácido glutámico en la posición 29 (Glu29) del péptido señal natural se separa y se inserta en la posición 26 (Glu26) . En una modalidad ejemplar, la proteína precursora G-CSF SP9 tiene la secuencia que se presenta en la presente como la SEC ID NO: 2) : MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWETVQATPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAAL QEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQAL EGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLV ASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP EJEMPLO 4 Proteína precursora SP10 G-CSF La proteína precursora SP10 G-CSF resulta de la secuencia de péptido señal de G-CSF humano natural (SEC ID NO: 1) . En detalle, al sustituir lisina en la posición 11 por leucina (LysllLeu) , histidina 21 por fenilalanina (His21Phe) y glutamina 28 por leucina (Glu28Leu) . En una modalidad ejemplar, el péptido SplO G-CSF tiene la secuencia presentada en la presente como SEC ID NO: 3: MAGPATQSPMLLMALQLLLWFSALWTVLEATPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAAL QEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQAL EGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELG APALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLV ASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP Es importante hacer notar que pese los cambios realizados en el péptido señal, el péptido G-CSF maduro permanece natural (SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, residuos 31-204) . í- EJEMPLO 5 Transfecciones transitorias con vectores de expresión que codifican para SP9 G-CSF y SP10 G-CSF Células HEK293F se transfectaron de manera transitoria con vectores de expresión que codifican para SP9 G-CSF o SP10 G-CSF, respectivamente. Los sobrenadantes se recolectaron después de tres días. La secreción de G-CSF se midió por ELISA. Los datos mostraron niveles de expresión comparables a G-CSF con péptido señal natural o incluso a un nivel de expresión mayor (figura 4) .

V . 13 - Se purificó G-CSF a alta pureza. La purificación de los dos productos, SP9 G-CSF y SplO G-CSF, respectivamente, se realizó de manera similar a G-CSF natural, sin modificación alguna del protocolo.

EJEMPLO 6 Las secuencias amino terminal de G-CSF natural, el producto comercial GRANOCYTE (Chugai patente CA1341389, G-CSF producida en células CHO) , SP9 G-CSF y SP10 G-CSF se determinan por degradación de Edman (TopLab, Martinsried, Alemania) . Sorprendentemente, los datos de los dos productos de expresión SP9 G-CSF y SP10 G-CSF mostraron únicamente la parte N terminal correcta sin corte alguno (figura 5 y figura 6) . Lo mismo se observó para GRANOCYTE (figura 7) . En contraste, el corte se encontró para G-CSF con el péptido señal natural (figura 8) - para varias otras construcciones diseñadas, aunque únicamente se predijo un sitio de ruptura por SignalP o TargetP in silico (no mostrado) .

EJEMPLO 7 Se midió la actividad de SP9 G-CSF y SP10 G-CSF en un análisis de proliferación de células y se comparó con GRANOCYTE. La actividad proliferante de células de SP9 G-CSF y SP10 G-CSF es superior a la de GRANOCYTE.

EJEMPLO 8 La glucosilación de SP9 G-CSF y SP10 G-CSF se determinó' por análisis de huella dactilar de masa de péptido v MALDI TOF después de digestión con GluC. El espectro reflector no mostró diferencia alguna de SP9 G-CSF o SP10 G-CSF con G-CSF natural producido en células HEK293F .

EJEMPLO 9 Evaluación de clones que resulta de una transfección estable con el vector de expresión que codifica para SP9 G-CSF Células HEK293F se transfectaron de manera estable con el vector de expresión que codifica para SP9 G-CSF. Los clones homogéneos se aislaron después de estabilización de la transfección. Los sobrenadantes de los clones seleccionados se analizaron para diferentes escalas de fermentación. Para esto se purificó G-CSF hasta una pureza alta a partir de los sobrenadantes recolectados y se evaluó tomando en consideración su secuencia amino terminal, patrón de glucosilación y actividad.

Se observó que, aunque el corte en la parte N terminal por 3 aminoácidos no es observable para SP9 G-CSF, el sobrenadante resultante analizado a partir de un acumulado de transfección transitorio, el corte de los 3 aminoácidos no se puede suprimir completamente para algunos clones. Este efecto depende del clon y además depende de la escala de cultivo y de las condiciones de cultivo.

La dependencia de clon (figura 9) sugiere que la modificación de la secuencia de péptido señal G-CSF que resulta en el vector SP9 G-CSF soporta la separación correcta del péptido señal en una mayor medida; no obstante, una separación correcta 100% aún es influida por el metabolismo específico del clon.

El enfoque principal para alterar el metabolismo específico del clon es la aplicación de condiciones de cultivo optimizadas.

La influencia de pH de cultivo en la ruptura correcta de la secuencia de péptido señal de G-CSF se evalúa para 2 clones ejemplares. Ambos clones se cultivan en reactores de tanque de agitación escala de laboratorio, cada uno con valores de pH definidos de 6.6; 6.8; 7.0 y 7.2. Los sobrenadantes que contienen G-CSF se purifican hasta una alta pureza y se avalúan respecto a su secuencia amino terminal (figura 10 y figura 11) . Para ambos clones ejemplares se observa que un procesamiento correcto de la secuencia de péptido señal, lo cual resulta en una relación de G-CSF de longitud completa de >99% se puede obtener al controlar el pH de cultivo celular de los clones de G-CSF a pH 7.2. El valor de >99% corresponde al límite de detección inferior del método de secuenciado de 1%.

EJEMPLO 10 Los cultivos de matraz de agitación sin control de pH y con variación de la concentración de insulina en el medio de cultivo se realizaron en el ejemplo de un clon. Las concentraciones de insulina se hacen variar en un intervalo entre 5 mg/1 de insulina a 20 mg/1 de insulina. El G-CSF que contiene sobrenadante se purifica a alta pureza y se evalúa respecto a su secuencia amino terminal (figura 12). En el ejemplo del clon evaluado es observable que la optimización de la concentración de insulina en el medio de cultivo a un intervalo de entre 15 a 20 mg/1 de insulina para el caso de condiciones de cultivo no controladas de pH resulta en un procesamiento correcto de la secuencia de péptido señal.

Un cultivo de alta densidad celular a gran escala utilizando el modo de perfusión para suministro de medio se realiza en el ejemplo de un clon. El pH del cultivo no se controla y varía en un intervalo de 6.8 a 7.2 durante el cultivo. La concentración de insulina en el medio de cultivo se ajusta a la concentración optimizada de 15 mg/1 de insulina. Los sobrenadantes que contienen G-CSF de 4 puntos de tiempo de cultivo seleccionados en el día de cultivo 6, 7, 17 y 21 se purificaron a alta pureza y se evaluaron respecto a su secuencia amino terminal (figura 13) . Un procesamiento correcto de la secuencia de péptido señal, que resulta en >99% de G-CSF de longitud completa se obtiene para todos los sobrenadantes analizados, independiente de la densidad celular y la productividad de G-CSF. La aplicación de una concentración de insulina optimizada de 15 mg/1 de este modo es eficaz para evitar el corte en la parte N terminal en cultivos de alta densidad celular a gran escala.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un precursor de G-CSF que comprende un péptido señal y un péptido G-CSF, caracterizado porque el péptido señal tiene una secuencia del péptido señal natural humano de la molécula G-CSF/b humana con por lo menos una mutación que se selecciona del grupo que consiste de: supresión de Glu29, inserción de Glu26, sustitución de Lysllleu, sustitución de His21Phe, y sustitución de Glu28Leu.

2. El precursor de G-CSF de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene por lo menos dos, o por lo menos tres o por lo menos cuatro o cinco mutaciones, de conformidad con la reivindicación 1.

3. El precursor de G-CSF de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque tiene hasta 3 mutaciones adicionales en el péptido señal que se seleccionan de inserción, supresión y sustitución.

4. Un polinucleótido caracterizado porque codifica para un precursor de G-CSF de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un polinucleótido, caracterizado porque es complementario al polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4.

6. Un vector, caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4 ó 5.

7. Una célula transfectada, caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4 ó 5 o el vector de conformidad con la reivindicación 6.

8. La célula transfectada de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la célula es una célula eucariótica, preferiblemente una célula humana, de manera más preferible una célula HEK293 y de manera más preferible una célula HEK293F .

9. La célula transfectada de conformidad con la reivindicación 7 ú 8, caracterizada porque la transfeccion es transitoria .

10. La célula transfectada de conformidad con la reivindicación 7 ú 8, caracterizada porque la transfeccion es estable .

11. Un método para expresar G-CSF, caracterizado porque comprende las etapas de: cultivar células transfectadas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 en un medio de cultivo adecuado; aislar G-CSF del medio en cultivo.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el cultivo es a un pH dentro del intervalo de 6.8 a 7.5, preferiblemente de 7.1 a 7.3.

13. El método de conformidad con la reivindicación 11 ó 12, caracterizado porque el cultivo es en presencia de insulina en un intervalo de 5 a 25 mg/ml, preferiblemente 15 a 25 mg/ml, de manera más preferible 15 a 20 mg/ml.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque el medio de cultivo está libre de suero.