KR101496694B1

KR101496694B1 - 재조합 인간 ｇ―ｃｓｆ의 개선된 가공

Info

Publication number: KR101496694B1
Application number: KR1020117007410A
Authority: KR
Inventors: 카롤라 슈뢰더; 엘리자베스 카자데문트; 페터 쇨레만; 미카엘 레네러
Original assignee: 옥타파마 아게
Priority date: 2008-10-02
Filing date: 2009-10-02
Publication date: 2015-02-27
Also published as: EP2352754B1; TR201908609T4; JP2012504405A; JP5622286B2; AU2009299811A2; CA2738116C; BRPI0920841A2; ZA201102156B; CN102164955B; IL211839A0; CN102164955A; EP2352754A1; US20110294989A1; RU2563536C2; RU2011117308A; WO2010037855A1; IL211839A; MX2011003426A; US8436142B2; AU2009299811A1

Abstract

신호 펩티드 및 G-CSF 펩티드를 포함하는 G-CSF 전구체로서, 상기 신호 펩티드는 하기 돌연변이 중 하나 이상을 갖는 인간 G-CSF/b 분자의 인간 야생형 신호 펩티드의 서열을 갖는 것인 G-CSF 전구체:
- Glu29의 결실,
- Glu26의 삽입,
- Lys11Leu 치환,
- His21Phe 치환, 및
- Gln28Leu 치환.

Description

재조합 인간 Ｇ―ＣＳＦ의 개선된 가공{Improved processing of recombinant human G-CSF}

신호 펩티드 및 G-CSF 펩티드를 포함하는 G-CSF 전구체에 관한 것이다.

G-CSF는 두 개의 사슬내 디술피드 결합에 의해 안정화되고 하나의 O-결합(O-linked) 탄수화물 모이어티를 포함하는 20 kDa 당단백질이다. 성숙(mature) G-CSF는 174개의 아미노산을 갖는다. G-CSF는 골수 세포, 대식세포 및 섬유모세포에 의해 합성된다. 그의 주요 기능은 호중구성 과립구 및 그의 전구 세포를 위한 성장 및 분화 인자이다. 당해 기술 분야에서 G-CSF는 또한 성숙 호중구를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 또한, G-CSF는 (추가적인 조혈성 성장 인자들과 상승적으로 작용하여) 다양한 다른 조혈성 전구 세포의 성장/분화를 촉진하고 내피 세포의 증식 및 이동을 증진한다. 임상적으로, G-CSF는 호중구성 과립구 수준의 결핍(예를 들면, 암/화학요법, AIDS, 또는 골수 이식에 의해 유발된 호중구감소증)을 치료하기 위해 이용된다.

발명의 요약

인간의 동일한 G-CSF에 의해 호중구감소증(neutropenia)을 치료하기 위해, 인간 세포를 야생형 G-CSF를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 선택된 클론의 세포 배양물 상층액으로부터 G-CSF를 정제한 후, 분비된 G-CSF의 상당한 양이 N-말단에서 3개의 아미노산이 절단되었다는 것을 관찰하였다. 이 절단(truncation)은 클론-특이적이지 않고 세포 배양 조건의 변형에 의해 제거될 수 없었다.

이 관찰에 근거하여, 세포, 특히, HEK293F 세포에서 G-CSF 전구체 단백질의 가공이 정확하지 않다는 결론을 얻었다. 상세하게, 신호 펩티다아제 복합체(signal peptidase complex)가 생리학적으로 신호 펩티드를 제거하기 위해 예상되는 위치에서 뿐만 아니라, 추가적으로 N-말단 절단을 초래하는 하나의 또 다른 위치에서 절단했다는 결론을 얻었다.

놀랍게도, 변형된 신호 펩티드 및 상응하는 G-CSF 전구체가 이용되는 경우, N-말단 절단이 감소될 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 신호 펩티드 및 G-CSF 펩티드를 포함하는 G-CSF 전구체로서, 상기 신호 펩티드는 하기 돌연변이 중 하나 이상을 갖는 인간 G-CSF/b 분자의 인간 야생형 신호 펩티드의 서열(서열번호 4)을 갖는 것인 G-CSF 전구체를 제공한다:

- Glu29의 결실,

- Glu26의 삽입,

- Lys11Leu 치환,

- His21Phe 치환, 및

- Gln28Leu 치환.

바람직한 구체예에서, 상기 G-CSF 전구체는 전술된 5개의 돌연변이 중 2개 이상, 또는 3개 이상 또는 4개 이상 또는 모두를 가질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 G-CSF 전구체는 삽입, 결실 및 치환으로부터 선택된 3개까지의 추가적인 돌연변이를 갖는다.

본 발명의 또 다른 구체예는 본 발명의 G-CSF 전구체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 전술된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 형질감염된 세포이다.

바람직한 구체예에서, 상기 세포는 진핵생물 세포, 바람직하게는 인간 세포, 보다 바람직하게는 HEK293 세포 및 보다 바람직하게는 HEK293F 세포 또는 HEK293F 유래 세포이다.

일 구체예에서, 형질감염은 일시적이고, 다른 구체예에서, 형질감염은 안정적이다.

본 발명의 추가적인 구체예는 G-CSF를 발현시키는 방법이고, 상기 방법은

- 적절한 배양 배지에서 본 발명의 형질감염된 세포들을 배양하는 단계,

- 상기 배양 배지로부터 G-CSF를 단리하는 단계를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 배양은 6.8 내지 7.5, 바람직하게는 7.1 내지 7.3의 범위 내의 pH, 보다 바람직하게는 약 7.2의 pH에서 수행된다. 바람직하게는 상기 pH는 배양 동안 조절된다.

또 다른 구체예에서, 배양은 5 내지 25 mg/ml, 바람직하게는 15 내지 25 mg/ml, 보다 바람직하게는 15 내지 20 mg/ml 범위의 인슐린의 존재 하에 수행된다.

놀랍게도, 본 발명의 변형된 신호 펩티드가 존재하는 경우, 생성된 G-CSF는 매우 낮은 절단 비율, 바람직하게는 분자의 5% 미만, 보다 바람직하게는 전체 G-CSF의 1% 미만을 갖는다. 1%가 검출 한계로 간주된다.

바람직하게는, 배양 배지는 무혈청 배지이다.

주요한 G-CSF의 글리코실화 패턴은 변하지 않고 활성은 야생형 G-CSF와 동일하다.

따라서, 본 발명의 방법은 약제학적 응용을 위해 매우 적합한 G-CSF를 제조한다.

도 1은 프로그램 TargetP를 이용한, 야생형 신호 펩티드를 갖는 인간, 야생형 G-CSF의 분석을 보여준다.
도 2는 프로그램 TargetP를 이용한, SP9 신호 펩티드를 갖는 인간, 야생형 G-CSF의 분석을 보여준다.
도 3은 프로그램 TargetP를 이용한, SP10 신호 펩티드를 갖는 인간, 야생형 G-CSF의 분석을 보여준다.
도 4는 각각 야생형 신호 펩티드(발현 수준은 100%임), SP9 또는 SP10 신호 펩티드를 갖는 전구체 단백질을 코딩하는 구축물(construct)을 이용한, HEK293F 세포에서 성숙 G-CSF 단백질의 발현을 보여준다.
도 5는 SP9 신호 펩티드를 갖는 인간, 야생형 G-CSF의 아미노 말단 아미노산 서열결정(Edman 분해)의 크로마토그램을 보여준다. 도 5a 내지 5e는 잔기 1 내지 5에 해당한다. 아미노산 서열 분석의 요약이 하기의 표에 제공된다.
도 6은 SP10 신호 펩티드를 갖는 인간, 야생형 G-CSF의 아미노 말단 아미노산 서열결정(Edman 분해)의 크로마토그램을 보여준다. 도 6a 내지 6e는 잔기 1 내지 5에 해당한다. 아미노산 서열 분석의 요약이 하기의 표에 제공된다.
도 7은 GRANOCYTE의 아미노 말단 아미노산 서열결정(Edman 분해)의 크로마토그램을 보여준다. 도 7a 내지 7e는 잔기 1 내지 5에 해당한다. 아미노산 서열 분석의 요약이 하기의 표에 제공된다.
도 8은 야생형 신호 펩티드를 갖는 인간, 야생형 G-CSF의 아미노 말단 아미노산 서열결정(Edman 분해)의 크로마토그램을 보여준다. 도 8a 내지 8e는 잔기 1 내지 5에 해당한다. 아미노산 서열 분석의 요약이 하기의 표에 제공된다.
도 9는 G-CSF SP9에 의한 안정한 형질감염의 클론 분리로부터 수득된 2개의 대표적인 클론에 대한 전장 G-CSF의 비율의 비교를 보여준다. 잔여-비-전장(non full length) 분획은 주로 N-말단에서 3개의 아미노산이 제거된 N-말단 절단 G-CSF를 포함한다. 99% 전장 G-CSF 비의 선은 분석의 검출 하한인 1% 이하의 N-말단 절단과 상관된다.
도 10은 교반-탱크 반응기 배양에서 상이한 배양 pH에 대한 클론 1의 예에서 전장 G-CSF의 비의 비교를 보여준다. 클론 1은 G-CSF SP9 벡터에 의한 안정한 형질감염의 클론 분리로부터 수득된다. 잔여-비-전장 분획은 주로 N-말단에서 3개의 아미노산이 제거된 N-말단 절단 G-CSF를 포함한다. 진탕 플라스크(pH 조절 불포함)에서 클론 1에 대한 기준 배양의 전장 G-CSF의 비가 첫번째 막대에서 회색으로 표시된다. 99% 전장 G-CSF 비의 선은 분석의 검출 하한인 1% 이하의 N-말단 절단과 상관된다.
도 11은 교반-탱크 반응기 배양에서 상이한 배양 pH에 대한 클론 2의 예에서 전장 G-CSF의 비의 비교를 보여준다. 클론 2는 G-CSF SP9 벡터에 의한 안정한 형질감염의 클론 분리로부터 수득된다. 잔여-비-전장 분획은 주로 N-말단에서 3개의 아미노산이 제거된 N-말단 절단 G-CSF를 포함한다. 진탕 플라스크(pH 조절 불포함)에서 클론 2에 대한 기준 배양의 전장 G-CSF의 비가 첫번째 막대에서 회색으로 표시된다. 99% 전장 G-CSF 비의 선은 분석의 검출 하한인 1% 이하의 N-말단 절단과 상관된다.
도 12는 배양 배지 중 상이한 인슐린 농도에 대한 클론 2의 예에서 전장 G-CSF의 비의 비교를 보여준다. 클론 2는 G-CSF SP9 벡터에 의한 안정한 형질감염의 클론 분리로부터 수득된다. 잔여-비-전장 분획은 주로 N-말단에서 3개의 아미노산이 제거된 N-말단 절단 G-CSF를 포함한다. 99% 전장 G-CSF 비의 선은 분석의 검출 하한인 1% 이하의 N-말단 절단과 상관된다.
도 13은 pH 조절의 적용 없이, 배양 배지에 15 mg/L 인슐린을 적용하여, 대규모, 고 세포 밀도 모드로 배양된 클론 2의 예에서 상이한 수집일(harvest day)에 대한 전장 G-CSF의 비의 비교를 보여준다. 클론 2는 G-CSF SP9 벡터에 의한 안정한 형질감염의 클론 분리로부터 수득된다. 잔여-비-전장 분획은 주로 N-말단에서 3개의 아미노산이 제거된 N-말단 절단 G-CSF를 포함한다. 99% 전장 G-CSF 비의 선은 분석의 검출 하한인 1% 이하의 N-말단 절단과 상관된다.

실시예 1

정확한 단백질 가공을 위한 G-CSF 전구체 펩티드의 최적화

야생형, 인간 G-CSF 이소형 b cDNA가 GenBank 데이터베이스(NM_172219)에 공개되었다. NM_172219로부터 유래된 서열을 갖는 G-CSF 전구체 단백질은 본질적으로 본 발명의 신호 펩티드 서열의 변형을 위해 유용하다. 대표적인 구체예에서, 상기 전구체 단백질은 본 명세서에서 서열번호 1로 표시된 서열을 갖는다(GenBank NP_757373):

미가공 야생형 G-CSF 전구체 단백질 (서열번호 1)은 30개의 아미노산으로 구성된 신호 펩티드를 포함한, 204개의 아미노산을 포함한다. 가공은 잔기 Ala30과 Thr31 사이에서 일어나는 것으로 발표되었다(GenBank NP_757373).

최근의 문헌은 진핵생물 신호 펩티드 컨센서스 서열(consensus sequence) 및 신호 펩티다아제 복합체(signal peptidase complex)의 기능을 기술한다 (Rapoport, 2007, Nature 450 (29), 663 - 669; Tuteja, 2005, Arch Biochem Biophys 441, 107-111; Dalbey et al., 1997, Protein Science 6, 1129-1138).

G-CSF 신호 펩티드의 아미노산 서열을 전술된 컨센서스 신호 펩티드의 제안된 특징과 비교하였다. 여러 아미노산 잔기들이 제안된 모델에 맞지 않는다는 것을 발견했다. 상세하게, 절단의 정확성을 위해 중요한 것으로 간주되는, 신호 펩티드의 C-말단에 있는 Ala-X-Ala 모티프가 G-CSF 전구체 펩티드에서 하전된 아미노산 (Glu29)에 의해 중단된다. 또한, 하전된 잔기 Lys11 및 His21은 신호 펩티드의 소수성 영역에 위치하고 따라서 상기 모델의 요건을 충족시키지 않는다.

소프트웨어 SignalP 및 TargetP (www.cbs.dtu.dk/services; Emanuelsson et al., 2007, Nature Protocols 2, 953-971)로 야생형 G-CSF 신호 펩티드를 인 실리코(in silico)로 분석하였다. 소프트웨어는 가공이 정확한 G-CSF N-말단(Thr31)에서, 그러나 추가적으로 여러 다른 부위에서 일어나는 것으로 예측된다는 것을 보여주었다(도 1). 그러나, 절단(truncation) 부위(Gly34)에서의 가공은 이 소프트웨어에 의해 예측되지 않았다.

실시예 2

야생형 G-CSF 신호 펩티드를 전술된 가설적 신호 펩티다아제 모델에 대해 그의 아미노산 서열의 최소 변화에 의해 인 실리코로 모델링하였다. 결과적으로 수득된 절단 위치를 소프트웨어 SignalP 및 TargetP를 이용하여 다시 분석하였다. 소수의 인 실리코로 설계된 모델(in silico designed model), 예를 들면, SP9 G-CSF 및 SPlO G-CSF로 명명된 모델이 G-CSF 가공을 위한 정확한 위치(Thr31)의 예측을 가져왔고, 이것을 최적화된 신호 펩티드를 위한 힌트로 받아들였다(SP9 G-CSF 및 SP10 G-CSF 절단 부위의 인 실리코 분석에 대해, 각각 도 2 및 도 3 참조). 여러 개의 그와 같은 구축물을 유전자 합성을 위해 선택하였다 (GeneArt, Regensburg, Germany). 각각 SP9 G-CSF 및 SPlO G-CSF 펩티드를 코딩하는 합성 유전자를 진핵생물 발현 벡터에 클로닝하고 HEK293F 세포의 형질감염을 위해 이용하였다.

실시예 3

SP9 G-CSF 전구체 단백질

SP9 G-CSF 전구체 단백질을 야생형, 인간 G-CSF 전구체 단백질의 신호 펩티드 서열(서열번호 1)로부터 수득하였다. 상세하게, 야생형 신호 펩티드의 29번 위치의 글루탐산 (Glu29)이 제거되고 26번 위치에 삽입되었다 (Glu26). 대표적인 구체예에서, SP9 G-CSF 전구체 단백질은 본 명세서에서 서열번호 2로 표시된 서열을 갖는다:

실시예 4

SP1O G-CSF 전구체 단백질

SP10 G-CSF 전구체 단백질을 야생형, 인간 G-CSF 전구체의 신호 펩티드 서열(서열번호 1)로부터 수득하였다. 상세하게, 11번 위치에서 라이신을 루이신으로 치환하고(Lys11Leu), 21번 위치에서 히스티딘을 페닐알라닌으로 치환하며(His21Phe), 28번 위치에서 글루탐산을 루이신으로 치환(Gln28Leu)하였다. 대표적인 구체예에서, SP10 G-CSF 펩티드는 본 명세서에서 서열번호 3으로 표시되는 서열을 갖는다:

신호 펩티드 중의 변화에도 불구하고, 성숙 G-CSF 펩티드는 야생형(서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 잔기 31-204)으로 유지된다는 것을 주목하는 것이 중요하다.

실시예 5

SP9 G-CSF 및 SP1O G-CSF를 코딩하는 발현 벡터에 의한 일시적 형질감염

HEK293F 세포를 각각 SP9 G-CSF, 또는 SPlO G-CSF를 코딩하는 발현 벡터에 의해 일시적으로 형질감염시켰다. 3일 후에 상층액을 수집했다. G-CSF 분비를 ELISA에 의해 측정하였다. 데이터는 야생형 신호 펩티드를 갖는 G-CSF와 유사한 발현 수준 또는 그보다 더 높은 발현 수준을 보여주었다(도 4).

G-CSF를 고 순도까지 정제하였다. 두 개의 산물, SP9 G-CSF 및 SPlO G-CSF 각각의 정제를 프로토콜의 변형 없이 야생형 G-CSF와 같이 수행하였다.

실시예 6

야생형 G-CSF, 시판 제품 GRANOCYTE (Chugai patent CA1341389, CHO 세포에서 제조된 G-CSF), SP9 G-CSF 및 SP1O G-CSF의 아미노 말단 서열을 Edman 분해(TopLab, Martinsried, Germany)에 의해 결정하였다. 놀랍게도, 두 개의 발현 산물 SP9 G-CSF 및 SP1O G-CSF의 데이터는 절단 없이 정확한 N-말단 만을 보여주었다(도 5 및 도 6). 동일한 결과를 GRANOCYTE에 대해 관찰하였다(도 7). 대조적으로, 야생형 신호 펩티드를 갖는 G-CSF 및 여러 다른 설계된 구축물에서 절단이 발견되었으나(도 8), 인 실리코로 SignalP 또는 TargetP에 의해 단 하나의 절단 부위만 예측되었다(표시되지 않음).

실시예 7

SP9 G-CSF 및 SP1O G-CSF의 활성을 세포 증식 분석법에서 측정하고 GRANOCYTE에 비교하였다. SP9 G-CSF 및 SP1O G-CSF의 세포 증식 활성은 GRANOCYTE의 경우보다 탁월했다.

실시예 8

SP9 G-CSF 및 SP1O G-CSF의 당화를 GluC 처리(digestion) 후에 MALDI TOF 펩티드 질량 지문 분석(mass fingerprint analysis)에 의해 결정하였다. 반사 스펙트럼(reflector spectrum)은 HEK293F 세포에서 제조된 야생형 G-CSF 대비 SP9 G-CSF 또는 SP10 G-CSF의 차이를 보이지 않았다.

실시예 9

SP9 G-CSF를 코딩하는 발현 벡터에 의한 안정한 형질감염으로부터 수득된 클론의 평가

HEK293F 세포를 SP9 G-CSF를 코딩하는 발현 벡터에 의해 안정적으로 형질감염시켰다. 형질감염의 안정화 후에 균일한 클론을 분리하였다. 선택된 클론의 상층액을 상이한 발효 규모에 대해 분석하였다. 이를 위해, 수집된 상층액으로부터 G-CSF를 고 순도까지 정제하고 그들의 아미노 말단 서열, 당화 패턴 및 활성에 대해 평가하였다.

N-말단으로부터 3개의 아미노산의 절단이 일시적 형질감염 풀로부터 분석된 상층액 중 SP9 G-CSF에 대해 관찰되지 않았으나, 3개의 아미노산 절단이 일부 클론의 경우 완전히 억제되지 않았다. 이 효과는 클론 의존적이었고, 또한 배양 규모 및 배양 조건에 의존적이었다.

클론 의존성(도 9)은 SP9 G-CSF 벡터를 초래하는 G-CSF 신호 펩티드 서열의 변형이 주로 신호 펩티드의 정확한 절단을 뒷받침하나; 100% 정확한 절단은 여전히 클론 특이적 대사에 의해 영향받는다.

클론 특이적 대사에 영향을 미치는 주요한 방식은 최적화된 배양 조건의 적용이다.

G-CSF의 신호 펩티드 서열의 정확한 절단에 대한 배양 pH의 영향을 2개의 대표적인 클론에 대해 평가하였다. 두 개의 클론을 모두 랩-규모 교반 탱크 반응기(lab-scale stirred tank reactor)에서 배양하였고, 이들은 각각 6.6; 6.8; 7.0 및 7.2의 정의된 pH 값을 가졌다. G-CSF 함유 상층액을 고 순도까지 정제하고 그들의 아미노 말단 서열에 대해 평가하였다(도 10 및 도 11). 두 개의 대표적 클론 모두에 대해, 99%보다 높은 전장 G-CSF 비율을 가져온, 신호 펩티드 서열의 정확한 가공이 G-CSF 클론의 세포 배양의 pH를 pH 7.2로 조절하는 것에 의해 달성될 수 있다는 것을 관찰하였다. 99%보다 높은 값은 서열결정 방법의 검출 하한 1%와 일치한다.

실시예 10

하나의 클론의 예에 대해 pH 조절을 포함하지 않고 배양 배지 중 인슐린 농도의 변화를 포함하는 진탕 플라스크 배양을 수행하였다. 인슐린 농도를 5 mg/L 인슐린 내지 20 mg/L 인슐린의 범위에서 변화시켰다. G-CSF 함유 상층액을 고 순도까지 정제하고 그들의 아미노 말단 서열에 대해 평가하였다(도 12). 평가된 클론의 예에 대해, pH 비-조절 배양 조건에서 배양 배지 중 인슐린 농도의 15 내지 20 mg/L 인슐린 범위로의 최적화가 신호 펩티드 서열의 정확한 가공을 가져왔다는 것을 관찰할 수 있었다.

배지 공급에 대해 관류(perfusion) 방식을 이용한 대규모 고 세포 밀도 배양을 하나의 클론의 예에 대해 수행하였다. 배양의 pH는 조절하지 않았고 배양 동안 6.8 내지 7.2의 범위에서 변했다. 배양 배지 중 인슐린 농도를 15 mg/L 인슐린의 최적화된 농도로 조절하였다. 배양 6일차, 7일차, 17일차 및 21일차에 4개의 선택된 시점에 수득된 G-CSF 함유 상층액을 고 순도로 정제하고 그들의 아미노 말단 서열에 대해 평가하였다 (도 13). 세포 밀도 및 G-CSF 생산성과 관계없이, 모든 분석된 상층액에 대해, 99%보다 높은 전장 G-CSF를 초래하는, 신호 펩티드 서열의 정확한 가공을 달성하였다. 따라서, 15 mg/L의 최적화된 인슐린 농도의 적용은 대규모 고 밀도 세포 배양에서 N-말단 절단의 방지를 위해 효과적이다.

SEQUENCE LISTING <110> Octagene GmbH <120> Improved processing of recombinant human G-CSF <130> 090651wo <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 204 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln 1 5 10 15 Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro 20 25 30 Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu 35 40 45 Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys 50 55 60 Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu 65 70 75 80 Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser 85 90 95 Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu 100 105 110 Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu 115 120 125 Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala 130 135 140 Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu 145 150 155 160 Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg 165 170 175 Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu 180 185 190 Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 195 200 <210> 2 <211> 204 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln 1 5 10 15 Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Glu Thr Val Gln Ala Thr Pro 20 25 30 Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu 35 40 45 Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys 50 55 60 Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu 65 70 75 80 Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser 85 90 95 Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu 100 105 110 Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu 115 120 125 Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala 130 135 140 Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu 145 150 155 160 Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg 165 170 175 Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu 180 185 190 Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 195 200 <210> 3 <211> 204 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Leu Leu Met Ala Leu Gln 1 5 10 15 Leu Leu Leu Trp Phe Ser Ala Leu Trp Thr Val Leu Glu Ala Thr Pro 20 25 30 Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu 35 40 45 Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys 50 55 60 Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu 65 70 75 80 Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser 85 90 95 Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu 100 105 110 Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu 115 120 125 Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala 130 135 140 Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu 145 150 155 160 Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg 165 170 175 Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu 180 185 190 Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 195 200 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln 1 5 10 15 Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala 20 25 30

Claims

신호 펩티드 및 G-CSF 펩티드를 포함하는 G-CSF 전구체로서, 상기 신호 펩티드는 하기 돌연변이 중 하나 이상을 갖는, 서열번호 4의 인간 G-CSF/b 분자의 인간 야생형 신호 펩티드의 서열을 갖는 것인 G-CSF 전구체:
- Glu29의 결실,
- His21Phe 치환, 및
- Gln28Leu 치환.
제1항에 있어서, 제1항에 기재된 돌연변이 중 2개 이상, 또는 3개 이상의 돌연변이를 갖는 것인 G-CSF 전구체.
제1항에 있어서, 상기 신호 펩티드에 삽입, 결실 및 치환으로부터 선택된 3개 이하의 추가적인 돌연변이를 갖는 것인 G-CSF 전구체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 G-CSF 전구체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제4항의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드.
제4항의 폴리뉴클레오티드 또는 그에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제4항의 폴리뉴클레오티드 또는 그에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질감염 세포(transfected cell)로서, 상기 세포는 인간 세포인 것인 형질감염 세포.
제7항에 있어서, 상기 세포는 HEK293 세포인 것인 형질감염 세포.
제7항에 있어서, 상기 형질감염은 일시적인 것인 형질감염 세포.
제7항에 있어서, 상기 형질감염은 안정된 것인 형질감염 세포.
하기 단계를 포함하는 G-CSF를 발현시키는 방법:
- 적절한 배양 배지에서 제7항의 형질감염 세포를 배양하는 단계,
- 상기 배양 배지로부터 G-CSF를 단리하는 단계.
제11항에 있어서, 배양은 6.8 내지 7.5 범위 내의 pH에서 수행되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 배양은 5 내지 25 mg/ml 범위의 인슐린의 존재 하에서 수행되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 배양 배지는 무혈청 배지인 것인 방법.
제1항에 있어서, 하기 돌연변이 중 하나 이상을 추가적으로 갖는 것인 G-CSF 전구체:
- Glu26의 삽입 및,
- Lys11Leu 치환.
제7항에 있어서, 상기 세포는 HEK293F 세포인 것인 형질감염 세포.
제11항에 있어서, 배양은 7.1 내지 7.3 범위 내의 pH에서 수행되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 배양은 15 내지 25 mg/ml 범위의 인슐린의 존재 하에서 수행되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 배양은 15 내지 20 mg/ml 범위의 인슐린의 존재 하에서 수행되는 것인 방법.