JP5622286B2 - 組換えヒトg−csfの改善されたプロセシング - Google Patents
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Description
ヒト同一G−CSFを用いて好中球減少症患者を処置するために、ヒト野生型G−CSFをコードするプラスミドをヒトの細胞にトランスフェクトした。選択したクローンの細胞培養上清からG−CSFを精製した後、かなりの量の分泌G−CSFでN末端が3アミノ酸切断されていることが観察された。この切断は、クローン特異的ではなく、細胞培養条件を変えても取り除くことはできなかった。
驚くべきことに、改変したシグナルペプチド及び対応するG−CSF前駆体を用いることでN末端切断が減少することが見出された。
Glu29の欠失、
Glu26の挿入、
Lys11Leuの置換、
His21Pheの置換、及び
Gln28Leuの置換。
適切な培養培地中で本発明のトランスフェクト細胞を培養する工程;
上記培養培地からG−CSFを単離する工程
を含む、G−CSFを発現する方法である。
正確なタンパク質プロセシングのためのG−CSF前駆体ペプチドの最適化
野生型ヒトG−CSFアイソフォームbのcDNAがGenBankデータベースに公開されていた(NM_172219)。NM_172219に由来する任意の配列を有するG−CSF前駆体タンパク質の基本的に全てが、本発明のシグナルペプチド配列の改変に有用である。例示的な一実施形態では、前駆体タンパク質は、本明細書中に配列番号1(GenBank NP_757373)で示される配列を有する:
MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEATPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP
野生型G−CSFシグナルペプチドを、上記の仮説的シグナルペプチダーゼモデルに関してアミノ酸配列の変化を最小にしてインシリコでモデル化した。得られた切断位置を、ソフトウェアSignalP及びTargetPを用いて再度解析した。インシリコ設計したモデル中のごく小数、例えばSP9 G−CSF及びSP10 G−CSFと命名したものが、G−CSFプロセシングが正しい位置(Thr31)でのみ予測され、これを最適化されたシグナルペプチドのヒントとした(SP9 G−CSF及びSP10 G−CSFの切断部位のインシリコ解析についてはそれぞれ図2及び図3を参照されたい)。複数のそのようなコンストラクトを選んで遺伝子合成した(ドイツ、レーゲンスブルクのジーンアート社(GeneArt))。SP9 G−CSFペプチド及びSP10 G−CSFペプチドをそれぞれコードする合成遺伝子を、真核生物用発現ベクターにクローニングし、HEK293F細胞のトランスフェクションに用いた。
SP9 G−CSF前駆体タンパク質
SP9 G−CSF前駆体タンパク質は、野生型ヒトG−CSF前駆体タンパク質(配列番号1)のシグナルペプチド配列から得る。具体的には、野生型シグナルペプチドの29位のグルタミン酸(Glu29)を除去し、26位に挿入した(Glu26)。例示的な実施形態では、SP9 G−CSF前駆体タンパク質は本明細書中に配列番号2で示す配列を有する:
MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWETVQATPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP
SP10 G−CSF前駆体タンパク質
SP10 G−CSF前駆体タンパク質は、野生型ヒトG−CSF(配列番号1)のシグナルペプチド配列から得る。具体的には、11位のリジンをロイシンに置換し(Lys11Leu)、ヒスチジン21をフェニルアラニンに置換し(His21Phe)、グルタミン28をロイシンに置換した(Gln28Leu)。例示的な実施形態では、SP10 G−CSFペプチドは本明細書中に配列番号3で示す配列を有する:
MAGPATQSPMLLMALQLLLWFSALWTVLEATPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP
SP9 G−CSF及びSP10 G−CSCFをコードする発現ベクターを用いた一過性トランスフェクション
SP9 G−CSF又はSP10 G−CSFをそれぞれコードする発現ベクターでHEK293F細胞を一過性にトランスフェクトした。3日後に上清を回収した。G−CSFの分泌をELISAで測定した。データから、野生型シグナルペプチドを有するG−CSFに匹敵するか、それよりも高い発現レベルが示された(図4)。
野生型G−CSF、市販品であるグラノサイト(中外製薬のカナダ特許第1341389号、CHO細胞中で産生されたG−CSF)、SP9 G−CSF、及びSP10 G−CSFのアミノ末端配列をエドマン分解により決定した(ドイツ、マーティンスリート(Martinsried)のトップラボ社(TopLab))。驚くべきことに、2種類の発現産物SP9 G−CSF及びSP10 G−CSFのデータは、切断のない正しいN末端のみを示していた(図5及び図6)。同じことがグラノサイトでも観察された(図7)。一方、野生型シグナルペプチドを有するG−CSFでは切断が見られ(図8)、また、他の複数の設計コンストラクトでも、インシリコでSignalP又はTargetPにより1ヶ所のみの切断部位が予測されていたにも関わらず、切断が見られた(不図示)。
細胞増殖アッセイにおいてSP9 G−CSF及びSP10 G−CSFの活性を測定し、グラノサイトと比較した。SP9 G−CSF及びSP10 G−CSFの細胞増殖活性はグラノサイトよりも優れていた。
GluC消化後にMALDI TOFペプチドマスフィンガープリント解析を行い、SP9 G−CSF及びSP10 G−CSFのグリコシル化を決定した。反射スペクトル(reflector spectrum)は、HEK293F細胞によって産生されたSP9 G−CSF又はSP10 G−CSFと野生型G−CSFとの間に何ら差を示さなかった。
SP9 G−CSFをコードする発現ベクターを用いた安定トランスフェクションにより得られたクローンの評価
HEK293F細胞を、SP9 G−CSFをコードする発現ベクターで安定にトランスフェクトした。トランスフェクション安定後に均質なクローンを単離した。選択したクローンの上清を異なる発酵規模で解析した。そのために、回収した上清からG−CSFを高純度に精製し、そのアミノ末端配列、グリコシル化パターン、及び活性について評価した。
pHを調整せずに培養培地中のインスリン濃度を変えた振盪フラスコ培養を1つのクローンを例に行った。インスリン濃度は5mg/L〜20mg/Lで変化させた。G−CSF含有上清を高純度に精製し、そのアミノ末端配列について評価した(図12)。評価したクローンの例において、pH調整のない培養条件の場合、培養培地中のインスリン濃度を15〜20mg/Lに最適化することでシグナルペプチド配列の正確なプロセシングが得られることが観察された。
Claims (14)
- シグナルペプチドとヒトG−CSFペプチドとを含むG−CSF前駆体であって、前記シグナルペプチドが、以下の変異の少なくとも1つを有するヒトG−CSF/b分子のヒト野生型シグナルペプチドの配列(配列番号4)を有する、G−CSF前駆体:
Glu29の欠失、
Glu26の挿入、
Lys11のLeuによる置換、
His21のPheによる置換、及び
Gln28のLeuによる置換。 - 請求項1に記載の変異の少なくとも3つを有する、請求項1に記載のG−CSF前駆体。
- 請求項1又は請求項2に記載のG−CSF前駆体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項3に記載のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
- 請求項3又は請求項4に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項3若しくは請求項4に記載のポリヌクレオチド、又は請求項5に記載のベクターを含むトランスフェクト細胞。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項6に記載のトランスフェクト細胞。
- 前記細胞がHEK293F細胞である、請求項6又は請求項7に記載のトランスフェクト細胞。
- トランスフェクションが一過性である、請求項6〜請求項8のいずれか一項に記載のトランスフェクト細胞。
- トランスフェクションが安定である、請求項6〜請求項8のいずれか一項に記載のトランスフェクト細胞。
- 請求項6〜請求項10のいずれか一項に記載のトランスフェクト細胞を適切な培養培地中で培養する工程;
前記培養培地からG−CSFを単離する工程
を含む、G−CSFを発現させる方法。 - 培養が、pH6.8〜7.5で行われる、請求項11に記載の方法。
- 培養が、5〜25mg/mlのインスリン存在下で行われる、請求項11又は請求項12に記載の方法。
- 前記培養培地が無血清である、請求項11〜請求項13のいずれか一項に記載の方法。
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