MX2007012667A - Tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (eii). - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al tratamiento de la EII, especialmente la colitis ulcerativa (CU), con un anticuerpo que se une al CD20.

Description

TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL (EII) Esto es una pnondad de reivindicación de una solicitud no provisional bajo 35 USC § 119 para la solicitud provisional n° 60/671.902, presentada el 15 de abnl de 2005, y cuya divulgación completa se incorpora a la presente memona descnptiva como referencia. Campo de la invención La presente invención se refiere al tratamiento de la En, especialmente la colitis ulcerativa (CU), con un anticuerpo que se une al CD20.

Antecedentes de la invención Enfermedad inflamatoria intestinal (El I) La enfermedad mflamatona intestinal (EII) es el nombre de un grupo de trastornos que provocan la inflamación de los intestinos. Los síntomas de la EII incluyen calambres y dolor abdominal, diarrea, pérdida de peso y hemorragia intestinal La opinión de consenso actual sobre la patogénesis de la EII se centra en el papel de la desregulación determinada por vía genética en la respuesta inmune del anfitnón a la flora bactenológica residente (Pallone y col , The immune system in inflammatory bowel disease, en Satsangí J, Sutherland LR, editores. Inflammatory Bowel Disease, España: Churchill Livmgstone, 85-93 (2003)). La enfermedad de Crohn y la colitis ulcerativa (CU) son las formas más comunes de EII. La enfermedad de Crohn normalmente causa úlceras a lo largo de los intestinos grueso y delgado. Por lo general, la enfermedad de Crohn o bien deja el recto intacto o provoca inflamación o infección con drenaje alrededor del recto. Casi sin excepción, la CU afecta al recto y se extiende hacia las partes contiguas o la totalidad del colon La actividad de la enfermedad es normalmente intermitente, con recidivas y períodos de quiescencia. La imagen sigmoidoscópica o colonoscópica es característica. En los casos leves de esta enfermedad, la mucosa del colon tiene un aspecto hiperémico y granular. Cuando la enfermedad es más grave, aparecen pequeñas úlceras esparcidas, y la mucosa es característicamente friable, pudiendo sangrar de forma espontánea. En términos histológicos, la infiltración ínflamatona en las células presente en la enfermedad activa normalmente incluye neutrófilos, que a menudo invaden las cnptas y también conllevan lesiones epiteliales y distorsión de las cnptas. Por lo general, hay una cantidad supenor a la normal de lmfocitos en la lámina propia y la plasmacitosis basal. En Estados Unidos, entre 500.000 y 700 000 pacientes padecen CU (Loftus, Gastroenterology 126: 1504-1517(2004)) Las manifestaciones extracolónicas de la CU incluyen arrntis, uveitis, estomatitis aftosa, pioderma gangrenoso y entema nodoso La terapia inicial para los enfermos leves o moderados es normalmente un aminosalicilato. En ensayos controlados, la mejora de la enfermedad bajo diversos cntenos se produjo hasta en un 30% de los sujetos de los grupos tratados con placebo; por tanto, no aplicar tratamiento específico alguno podría ser una opción para aquellos pacientes que desarrollen la enfermedad en un grado muy leve La CU izquierda distal que afecta al recto y el colon sigmoide puede tratarse eficazmente con formulaciones de enemas de 5-ammosal?c?lato (5-ASA). En pacientes con CU activa que no responden al tratamiento estándar de 5 -ASA y aquellos cuya enfermedad es más grave, los corticosteroides orales han sido la base pnncipal de la terapia sintomática aguda De todos modos, los corticosteroides no son efectivos para mantener a largo plazo la remisión en pacientes con CU dado que, con el paso del tiempo, su uso se asocia a un nivel significativo de toxicidad (Lennard- Jones y col , Lancet 1.188-189 (1965)). Las opciones terapéuticas de los pacientes que no respondan a los medicamentos basados en 5-ASA ni los corticosteroides para exacerbaciones de la enfermedad son limitadas. Muchos de estos pacientes se tratan con agentes inmunosupresores, por lo general 6-mercaptopunna (6-MP) o azatiopnna, que pueden retardar de forma significativa el comienzo del efecto terapéutico en la enfermedad activa. En pacientes con enfermedad grave que no responden a los corticosteroides IV en altas dosis y están esperando someterse a una colectomía, se ha observado una eficacia significativa a corto plazo de la ciclosponna IV en un pequeño estudio controlado con placebo QJichtigerjy col , NEnglJMed 330:1841-1845 (1994)) En última instancia, la colectomía es necesana en un 25%-40% de los pacientes. Existe una clara necesidad no cubierta de un agente terapéutico seguro y eficaz que permita un control rápido de la enfermedad e induzca la remisión prolongada de la misma. Aunque la patogénesis de la CU todavía no se comprende por completo, cada vez hay más pruebas de que la CU podría ser un trastorno autoinmune, donde las células B intervienen en la patofisiología de la enfermedad Las células B, así como las T, están presentes en los agregados hnfoides básales, una característica histopatológica considerada como un indicio de CU y observada en secciones histológicas de pacientes con CU activa (Yeung y col , Gut 47:212-227(2000)). Al evaluar los parámetros clínicos e histológicos que pudiesen predecir una recidiva en pacientes con CU quiescente, la presencia de una cantidad supenor a la normal de células plasmáticas en la porción basal de la mucosa resultó ser un factor independiente de predicción de la recidiva (Bitton y col , Gastroenterology 120 A 320 (2001 )). Si bien se considera que son células T activadas las que provocan la inflamación de la mucosa en la CU, estos pacientes tienen un perfil de modelo de expresión citoquínica T-helper-2 (Th2) (Monteleone y col , Gut 50 (Suplemento III) 64 (2002)). Dado que las citoquinas Th2 generan clásicamente respuestas inmunológicas mediadas por células B y la producción de anticuerpos, podría postularse que las células B desempeñan un papel central en la CU. En la lámina propia de la mucosa colónica inflamada de pacientes con CU se han encontrado cantidades supenores a las normales de IgG, IgM, IgA y células plasmáticas, así como una producción supenor a la normal de anticuerpos contra antígenos y autoantígenos luminales intestinales (MacDermott y col , Gastroenterology 81.844-852 (1981)) Además, se van acumulando datos sobre la presencia de anticuerpos en pacientes con CU, si bien todavía no se sabe con certeza que estos anticuerpos desempeñen un papel concreto en la patogénesis de la CU. Aproximadamente dos terceras partes de los pacientes con CU tienen un anticuerpo circulante conocido como anticuerpo citoplasmático antineutrófilo pennuclear (p-ANCA), que se dmge contra los leucocitos neutrófilos (Qumtony col , Gut 42:788-791 (1998)). Recientemente, se ha mostrado que el p-ANCA presente en algunas formas de vascu tis, y que se dmge contra un componente neutrófilo distinto (mieloperoxidasa), es en sí la causa de la vascuhtis y las lesiones tisuiares en modelos animales expenmentales de vascuhtis (X?ao>> col , J Clin Invest 1 10.955-963 (2002)). Otro marcador de la autommunidad es la respuesta de las células B de la mucosa del colon contra la isoforma 5 humana de la tropormosina 0JTM5), un autoantígeno putativo en la CU. La mucosa del colon de los pacientes con CU presentó una cantidad supenor a la normal, y muy significativa a efectos estadísticos, de células B de la lámina propia que producían IgG contra hTM5 en comparación con pacientes con colitis de Crohn o sin EII, lo cual suginó que los anticuerpos ant?-hTM5 desempeñaban un papel importante y distinto en la CU (Onumajy col., Clin Exp Immunol 121 :466-471 (2000)). De forma similar, la cantidad de inmunocitos IgG ant?-hTM5 fue significativamente supenor en pacientes con CU en comparación con los controles realizados en sujetos sin IEE, observándose que 21 de 23 pacientes (un 91%) tenían inmunocitos que producían IgG, independientemente de la actividad clínica (Onuma^ col , Clin Exp Immunol 121 :466-471 (2000)). Además, el anticuerpo ant?-hTM5 se ha detectado en el suero de pacientes con CU y colangitis esclerosante pnmana (Sakimaki y col, Gut Al-.li' ß-l X (2000)). Se ha demostrado que los anticuerpos anti-colon en el suero de pacientes con CU pueden reaccionar con antígenos de superficie en células epiteliales colómcas o la mucina colónica en células caliciformes (Inoue y col , Gastroenterology 121 :1523 (2001)). Estos anticuerpos pueden contnbuir a la destrucción de la mucosa del colon a través de mecanismos citotóxicos, dependientes de anticuerpos y mediados por células, contra las células epiteliales colómcas.

En un estudio, se observó que la colitis crónica espontánea que se produce en ratones con deficiencia del receptor de células T (TCR)a se agravaba en ausencia de células B maduras. La descendencia de ratones con deficiencia del TCRa y colitis crónica cruzados con ratones con bloqueo de la expresión de aµ desarrolla una forma de colitis más grave que los ratones con deficiencia del TCRa. En este estudio, la gravedad aumentada de la colitis no se debió a la flora patogénica sino la ausencia completa de células B. En ratones con bloqueo de la expresión de aµ, la colitis crónica se atenuó marcadamente en aquellos ejemplares de entre 3 y 4 semanas de edad que recibieron antes de que comenzase la enfermedad una transferencia adoptiva de células B penféncas de ratones con deficiencia del TCRa. Este hecho sugiere que las células B desempeñan un papel supresor en el desarrollo de la colitis en estos modelos munnos (Mizoguchi y col, Int Immunol 12:597-605 (2000)). Anticuerpos del CD20 y su uso terapéutico Los lmfocitos son una de las muchas clases de glóbulos blancos que se producen en la médula ósea durante la hematopoyesis. Hay dos poblaciones pnncipales de lmfocitos: los linfocitos B (células B) y T (células T). Los hnfocitos que nos interesan de manera particular en este estudio son las células B. Las células B maduran en la médula ósea y la abandonan expresando un anticuerpo de unión a antígeno en su superficie celular. Cuando una célula B virgen se encuentra por pnmera vez con el antígeno para el cual su anticuerpo unido a la membrana es específico, la célula comienza a dividirse rápidamente y su progenie se diferencia en células B de memona y células efectoras, llamadas "células plasmáticas". Las células B de memona tienen mayor duración y siguen expresando el anticuerpo unido a la membrana con la misma especificidad que la célula parental ongmal. Las células plasmáticas no producen un anticuerpo unido a la membrana sino una forma secretada del mismo. Los anticuerpos secretados son las pnncipales moléculas efectoras de la inmunidad humoral. El antígeno CD20 (también llamado antígeno humano de diferenciación restnngido a hnfocitos B, Bp35) es una proteína transmembrana hidrófoba con un peso molecular de aproximadamente 35 kD que se encuentra en lmfocitos pre-B y B maduros. Valentine y col , J Bwl Chem. 264 (19): 11282-11287 (1989) y Einfeld y col , EMBOJ. 7 (3):711-717 (1988) El antígeno se expresa también en más del 90% de los lmfomas no Hodgkín de células B (LNH) (Anderson y col Blood 63 (6): 1424-1433 (1984)), pero no se encuentra en las células madre hematopoyéticas, las células pro-B, las células plasmáticas normales u otros tejidos normales (Tedder^ col J Immunol 135 (2):973-979 (1985)). El CD20 regula una(s) etapa(s) temprana(s) del proceso de activación de la iniciación y la diferenciación del ciclo celular (Tedder y col , supra), y posiblemente funciona como un canal de iones de calcio Tedder y col , J Cell Biochem 14DJ95 (1990). Dada la expresión del CD20 en los nfomas de células B, este antígeno puede ser un candidato para actuar sobre estos hnfomas. En esencia, esa acción puede generalizarse de la siguiente manera: se administran a un paciente los anticuerpos específicos del antígeno CD20 de superficie de las células B. Estos anticuerpos ant?-CD20 se unen específicamente al antígeno CD20 de las células B tanto (ostensiblemente) normales como malignas; el anticuerpo unido al antígeno CD20 de superficie puede causar la destrucción o reducción de las células B neoplásicas. Además, los agentes químicos o las etiquetas radioactivas con potencial para destruir el tumor pueden conjugarse con el anticuerpo anti-CD20 de modo que el agente actúe específicamente sobre las células B neoplásicas. Independientemente del planteamiento, un objetivo fundamental es destruir el tumor; el planteamiento específico puede determinarse mediante el anticuerpo ant?-CD20 que se utilice en particular, y por tanto, los planteamientos disponibles para actuar sobre el antígeno CD20 pueden vanar considerablemente. El anticuerpo ntuximab (RITUXAN®) es un anticuerpo monoclonal, munno/humano, quiménco y creado mediante ingeniería genética, que se dinge contra el antígeno CD20. El ntuximab es el anticuerpo llamado "C2B8" en la patente de EE.UU. n° 5.736.137, concedida el 7 de abpl de 1998 (Anderson y col). El ntuximab está indicado para el tratamiento de pacientes con hnfomano Hodgkín de células B, con presencia de CD20, de grado bajo o folicular, con recidiva o refractana. In vitro, se ha demostrado que el ntuximab media en la citotoxicidad dependiente de complementos (CDC) y la citotoxicidad con mediación celular dependiente de anticuerpos (ADCC) e induce la apoptosis (Reff y col , Blood 83 (2):435-445 (1994); Maloney y col, Blood 88:637a (1996); Manches y col , Blood 101:949-954 (2003)). La sinergia entre el ntuximab y las quimioterapias y toxinas también se ha observado a escala expenmental. En particular, el ntuximab sensibiliza las líneas celulares del lmfoma de células B humanas resistente a medicamentos a los efectos citotóxicos de la doxorrubicina, el CDDP, el VP-16, la toxina de la diftena y la ncina (Demidem y col, Cáncer Chemotherapy & Radiopharmaceutwals 12 (3):177-186 (1997)). Los estudios preclínicos en vivo han mostrado que el ptuximab reduce la presencia de células B en la sangre penfénca, los nodulos linfáticos y la médula ósea de los monos cinomolgus. Reff col , Blood 83:435-445 (1994). El ntuximab también se ha estudiado en vanos trastornos autoinmunes benignos, en los cuales las células B y los autoanticuerpos parecen desempeñar un papel en la fisiopatología de la enfermedad. Edwards y col , Biochem Soc Trans 30:824-828 (2002). Se ha informado que el ntuximab alivia potencialmente los signos y síntomas de, por ejemplo, la artntis reumatoide (AR) (Leandro y col , Ann Rheum Dis 61 883-888 (2002), Edv/atds y col , Arthntis Rheum , 46 (Suplemento 9) S46 (2002); Stahl y col, Ann Rheum Dis., 62 (Suplemento 1): OP004 (2003); E ety y col , Arthritis Rheum 48(9): S439 (2003)), el lupus (Eisenberg, Arthntis Res. Ther. 5:157-159 (2003); Leandro y col. Arthntis Rheum. 46: 2673-2677 (2002); Gorman y col, Lupus, 13: 312-316 (2004)), la púrpura trombocitopénica inmune (D'Arenay col , Leuk Lymphoma 44:561-562 (2003); Stasiy col , Blood, 98: 952-957 (2001); Saleh col, Semin. Oncol, 27 (Suplemento 12):99-103 (2000); Zaiay col, Haematolgica, 87: 189-195 (2002); Ratanatharathorn y col , Ann. Int Med , 133: 275-279 (2000)), la aplasia pura de hematíes (Auner col , Br. J. Haematol, 116: 725-728 (2002)), la anemia autoinmune (Zajajy col, Haematologica 87:189-195 (2002) (la fe de erratas aparece en Haematologica 87:336 (2002)), la enfermedad por cnoaglutinmas (Layios y col , Leukemia, 15: 187-8 (2001); Berentseny co/, Blood. 103: 2925-2928 (2004); Berentsen .y col, Br. J Haematol., 115: 79-83 (2001); Bauduer, Br. J. Haematol., 112: 1083-1090 (2001); Damianiy col, Br. J Haematol., 114: 229-234 (2001)), el síndrome de clase B de resistencia grave a la insulina (CoWy col, N Engl J. Med., 350: 310-311 (2004), la cnoglobulmemia mixta (DeVitay col, Arthritis Rheum. 46 Suplemento 9:S206/S469 (2002)), la miastema gravis (Zaja col, Neurology, 55: 1062-63 (2000); Wylamy col, J Pediatr., 143: 674-677 (2003)), la granulomatosis de Wegener (Specksy col, Arthritis & Rheumatism AA: 2836-2840 (2001)), el pénfigo vulgar refractano (Dupuy y col, Arch Dermatol, 140:91-96 (2004)), la dermatomiositis (Levine, Arthritis Rheum., 46 (Suplemento 9):S1299 (2002)), el síndrome de Sjogren (Somer y col, Arthritis & Rheumatism, 49: 394-398 (2003)), la cnoglobulinemia mixta activa de clase II (Zaja col , Blood, 101: 3827-3834 (2003)), el pénfigo vulgar (Dupay y col , Arch Dermatol., 140: 91-95 (2004)), la neuropatía autoinmune (Pestronk y col , J. Neurol Neurosurg Psychiatry 74:485-489 (2003)), el síndrome opsoclono-mioclono paraneoplásico (Pranzatelh y col. Neurology 60 (Suplemento 1) P05J28:A395 (2003)) y la esclerosis múltiple recurrente-remitente (EMRR). Cross y col. (resumen) "Resultados preliminares de un ensayo clínico de fase II de la acción del ntuximab en la EM" Octava Reunión Anual de los Comités Amencanos para la Investigación y el Tratamiento de la Esclerosis Múltiple, 20-21 (2003). Se ha llevado a cabo un estudio de fase II (WA 16291 ) en pacientes con artntis reumatoide (AR) que, tras un seguimiento de 48 semanas, ha proporcionado datos sobre la segundad y eficacia del ntuximab. Emery y col Arthritis Rheum 48 (9):S439 (2003); Szczepanski y col. Arthritis Rheum 48 (9):S121 (2003); Edwards y col, N Engl. J Med. 350:2572-82 (2004). Se realizó una distnbución uniforme y aleatona de un total de 161 pacientes en cuatro versiones de tratamiento: metotrexato, ntuximab solo, ntuximab más metotrexato y ntuximab más ciclofosfamida (CTX). El régimen de tratamiento del ntuximab consistió en un gramo administrado por vía intravenosa los días 1 y 15. La mayoría de pacientes con AR toleró bien las infusiones de ntuximab, si bien un 36% de estos pacientes expepmentó al menos una reacción adversa durante su ppmera infusión (en comparación con un 30% de los pacientes que recibieron placebo). En general, la mayoría de reacciones adversas se consideró entre leve y moderada y se produjo de forma equilibrada a través de todos los grupos de tratamiento. Hubo un total de 19 reacciones adversas graves a través de los cuatro regímenes a lo largo de las 48 semanas, con una frecuencia ligeramente mayor en el grupo de ptuximab más ciclofosfamida. La incidencia de infecciones estuvo bien equilibrada a través de todos los grupos. La tasa media de infecciones graves en esta población de pacientes con AR fue de 4,66 por 100 pacientes-años, una cifra mfepor a la tasa de infecciones que requineron un ingreso hospitalapo en pacientes con RA (9,57 por 100 pacientes-años) que se publicó en un estudio epidemiológico realizado en toda una comunidad. Doran y col , Arthritis Rheum 46:2287-2293 (2002). El perfil de segundad del ptuximab en una pequeña cantidad de pacientes con trastornos neurológicos, incluyendo la neuropatía inmune Q?estronk col , supra), el síndrome opsoclono-mioclono O'ranzatelh y col , supra) y la EMRR (Cross y col , supra), fue similar al que se observó en oncología o AR. En un ensayo patrocinado por investigadores (EPI), todavía en curso, sobre el ptuximab en combinación con ?nterferón-3 (J N-3) o acetato de glatiramero en pacientes con EMRR (Cross y col , supra), 1 de cada 10 pacientes tratados ingresó en el hospital para pernoctar en observación tras expepmentar fiebres y ngores moderados después de la ppmera infusión de ptuximab, mientras que los 9 pacientes restantes concluyeron el régimen de 4 infusiones sin manifestar reacciones adversas. Las publicaciones de patentes relatives a los anticuerpos del CD20 y las moléculas de unión al CD20 incluyen las patentes de EE.UU. nos 5.776 456, 5.736.137, 5.843.439, 6.399.061 y 6.682.734, así como los documentos US 2002/0197255, US 2003/0021781, US 2003/0082172, US 2003/0095963, US 2003/0147885 (Anderson y col); la patente de EE.UU. n° 6.455.043 y los documentos US 2003/0026804 y WO 2000/09160 (Gpllo-López, A.); el documento WO 2000/27428 (Gnllo-López y White); los documentos WO 2000/27433 y US 2004/0213784 (Gpllo-López y Leonard), el documento WO 2000/44788 (Braslawsky y col ); el documento WO 2001/10462 (Rastetter, W.); el documento WOO 1/10461 (Rastetter y White); el documento WO 2001/10460 (White y Gpllo-López); los documentos US 2001/0018041, US 2003/0180292 y WO 2001/34194 (Hanna y Hapharan); los documentos US 2002/0006404 y WO 2002/04021 (Hanna y Hapharan); los documentos US 2002/0012665 y WO 2001/74388 (Hanna, N ); el documento US 2002/0058029 (Hanna, N.); el documento US 2003/0103971 (Hapharan y Hanna); los documentos US 2002/0009444 y WO 2001/80884 (Gpllo-López, A.); el documento WO 2001/97858 (White, C); los documentos US 2002/0128488 y WO 2002/34790 (Reff, M.); el documento WO 2002/060955 (Braslawsky col ); el documento WO 2002/096948 (Braslawskyy col); el documento WO 2002/079255 (Reff y Davies); la patente de EE.UU. n° 6.171.586 y el documento WO 1998/56418 (Lam y col); el documento WO 1998/58964 (Raju, S.); el documento WO 1999/22764 (Raju, S.); el documento WO 1999/51642 y las patentes de EE.UU. nos 6J94.551, 6.242J95, 6.528.624 y 6.538.124 (Idusogie y col); el documento WO 2000/42072 (Presta, L.); el documento WO 2000/67796 (Curd y col); el documento WO 2001/03734 (Grillo-López y col); los documentos US 2002/0004587 y WO 2001/77342 (Miller y Presta); el documento US 2002/0197256 (Grewal, I.); el documento US 2003/0157108 (Presta, L.); el documento WO 04/056312 (Lowman y col); los documentos US 2004/0202658 y WO 2004/091657 (Benyunes, KJ; el documento WO 2005/000351 (Chan, A.); el documento US 2005/0032130A1 (Beresini y col); el documento US 2005/0053602A1 (Brunetta, P.); las patentes de EE.UU. nos 6.565.827, 6.090.365, 6.287.537, 6.015.542, 5.843.398, y 5.595.721, (Kaminski y col); las patentes de EE.UU. nos 5.500.362, 5.677J80, 5.721J08, 6J20.767 y 6.652.852 (Robinson y col); la patente de EE.UU. n° 6.410.391 (Raubitschek y col); la patente de EE.UU. n° 6.224.866 y el documento WO00/20864 (Barbera-Guillem, E.); el documento WO 2001/13945 (Barbera-Guillem, E.); el documento WO 2000/67795 (Goldenberg); los documentos US 2003/0133930 y WO 2000/74718 (Goldenberg y Hansen); los documentos US 2003/0219433 y WO 2003/68821 (?ansen y col); el documento WO2004/058298 (Goldenberg y Hansen); el documento WO 2000/76542 (Golayy col); el documento WO 2001/72333 (Wolin y Rosenblatt); la patente de EE.UU. n° 6.368.596 (Ghetiey col); la patente de EE.UU. n° 6.306.393 y el documento US 2002/0041847 (Goldenberg, D.); el documento US 2003/0026801 (Weiner y Hartmann); el documento WO 2002/102312 Q3ngleman, E.); el documento US 2003/0068664 (Albitar y col); el documento WO 2003/002607 (Leung, S.); los documentos WO 2003/049694, US2002/0009427 y US 2003/0185796 (Woliny col); el documento WO 2003/061694 (Sing y Siegall); el documento US 2003/0219818 (Bohen y col); los documentos US 2003/0219433 y WO 2003/068821 (Hansen y col); el documento US 2003/0219818 (Bohen y col); el documento US2002/0136719 (Shenoyy col); el documento WO 2004/032828 (Wahly col) y el documento WO 2002/56910 (Hayden-Ledbetter); US 2003/0219433 Al (Hanseny col); WO 2004/035607 (Teelingy col); US 2004/0093621 (Shitaray col); WO 2004/103404 (Watkins y col); WO 2005/000901 (Teddery col); US 2005/0025764 (Watkins y col); WO2005/016969 y US 2005/0069545 Al (Carry col); y WO 2005/014618 (Chang y col). Véase también la patente de EE.UU. n° 5.849.898 y el documento EP 330.191 (Seedy co/.); el documento EP332,865A2 (Meyer y Weiss); la patente de EE.UU. n° 4.861.579 (Meyery col); el documento US2001/0056066 (Bugelski y col) y el documento WO 1995/03770 (Bhat y col); Las publicaciones relativas a la terapia con ptuximab incluyen: Perotta y Abuel, "Response of chronic relapsmg ITP of 10 years duration to ptuximab" Resumen n° 3.360 Blood 10 (1) (sección 1-2): página 88B (1998) ("Respuesta de 10 años de duración de la PTI crónica recurrente al ptuximab"); Perottay col, "Rituxan m the treatment of chronic ídiopathic thrombocytopemc purpura (ITP)'J Blood, 94: 49 (resumen) (1999); Matthews, R., "Medical Heretics" New Scientist (7 de abpl de 2001) ("Herejes médicos"); Leandro y col , "Lymphocyte depletion m rheumatoid arthptis: early evidence for safety, efficacy and dose response" Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001) ("Reducción de linfocitos en artptis reumatoide: datos iniciales sobre segundad, eficacia y respuesta a la dosis"); Leandroy col , "An open study of B lymphocyte depletion ín systemic lupus erythematosus'J Arthritis and Rheumahsm, 46:2673-2677 (2002) ("Un estudio abierto de la reducción de hnfocitos B en el lupus eptematoso sistémico"), en que, durante un período de dos semanas, cada paciente recibió dos infusiones de 500 mg de ptuximab, dos infusiones de 750 mg de ciclofosfamida y una elevada dosis de corticosteroides orales, y dos de los pacientes tratados sufrieron una recidiva a los 7 y 8 meses, respectivamente, recibiendo de nuevo el tratamiento, aunque con diferentes protocolos; Weide y col , "Successful long-term treatment of systemic lupus erythematosus with ptuximab mamtenance therapy" Lupus, 12- 779-782 (2003) ("Tratamiento prolongado con éxito del lupus eptematoso sistémico mediante terapia de mantenimiento con ptuximab"), en que un paciente recibió tratamiento con ptuximab (375 mg/m2 x 4, repetido a intervalos semanales), postenormente se le administró ptuximab cada 5-6 meses y, por último, se le aplicó una terapia de mantenimiento de 375 mg/m2 de ptuximab cada tres meses, y un segundo paciente con LES refractano se trató con éxito con ptuximab y está recibiendo terapia de mantenimiento cada tres meses, con buena respuesta por parte de ambos pacientes al ptuximab; Edwards y Cambpdge, "Sustamed improvement ín rheumatoid arthptis following a protocol designed to deplete B lymphocytes" Rheumatology 40:205-211 (2001) ("Mejoría sostenida de la artptis reumatoide siguiendo un protocolo diseñado para reducir los hnfocitos B"); Cambpdge y col , "B lymphocyte depletion ín patients with rheumatoid arthptis: A randomized, placebo controlled tpal ín patients with rheumatoid arthptis" Arthritis Rheum., 46 (Suplemento 9): S1350 (2002); Edwardsy col , "Ef??cacy and safety of ntuximab, a B-cell targeted chimepc monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled tpal ín patients with rheumatoid arthptis" Arthritis and Rheumatism 46 (9): S197 (2002); Pavelka y col, Ann Rheum. Dis., 63: (Sl):289-90 (2004), Emeryy col , Arthritis Rheum 50 (S9):S659 (2004); Levine y Pestronk, "IgM antibody-relatedpolyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using ntuximab" Neurology 52: 1701-1704 (1999) ("Pohneuropatías relacionadas con anticuerpos IgM: quimioterapia con ntuximab para reducir las células B"); DeVita y col , "Efficacy of selective B cell blockade m the treatment of rheumatoid arthptis" Arthritis & Rheum 46-2029-2033 (2002) ("Eficacia del bloqueo selectivo de las células B en el tratamiento de la artptis reumatoide"); Hidashida y col, "Treatment of DMARD-refractory rheumatoid arthptis with ptuximab" ("Tratamiento de la artritis reumatoide refractapa a DMARD con ptuximab"), presentado en el Annual Scient c Meeting of the American College of Rheumatology (Congreso Científico Anual del Instituto Americano de Reumatología), 24-29 de octubre, Nueva Orleans, LA, (2002); Tuscano, J. "Successful treatment of ínf ximab-refractory rheumatoid arthptis with ptuximab" ("Tratamiento satisfactopo con ptuximab de la artritis reumatoide refractapa al ínfliximab"), presentado en el Annual Scientific Meeting ofthe American College of Rheumatology (Congreso Científico Anual del Instituto Americano de Reumatología); 24-29 de octubre, Nueva Orleans, LA, (2002); "Pathogenic roles of B cells ín human autoimmunity; msights from the clinic", Martín y Chan, Immumty 20:517-527 (2004) ("Funciones patogénicas de las células B en la autoinmumdad humana; perspectivas desde la clínica"); Silverman y Weisman, "Rituximab Therapy and Autoimmune Disorders, Prospects for Anti-B Cell Therapy'J Arthritis and Rheumatism, 48: 1484-1492 (2003) ("Terapia con ptuximab y trastornos autoinmunes; perspectivas para el tratamiento anti-células B"); Kazkaz e Isenberg, "Anti B cell therapy (ptuximab) ín the treatment of autoimmune diseases'J Current opinión in pharmacology, A- 398-402 (2004) ("Terapia anti-células B (ntuximab) para el tratamiento de enfermedades autoinmunes"); 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Liang y Tedder, Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine, sección- "CD20 as an Immunotherapy Target" ("El CD20 como una diana de la inmunoterapia"), fecha de publicación del artículo en Internet: 15 de enero de 2002, titulado "CD20"; Apéndice 4A titulado "Monoclonal Antibodies to Human Cell Surface Antigens" ("Anticuerpos monoclonales para antígenos humanos de la superficie celular") por Stockingery col, editores: Coligany col, en Current Protocols in Immunology (2003 John Wiley & Sons, Ine), fecha de publicación en Internet: mayo de 2003; fecha de publicación impresa: febrero de 2003; Pemche y Morpson, "CD Antibodies/molecules: Defimtion; Antibody Engmeepng" ("Anticuerpos/moléculas CD: definición; Ingeniería de los anticuerpos"), en Wüey Encyclopedia of Molecular Medicine, sección: "Chimepc, Humanized and Human Antibodies" ("Anticuerpos quiméncos, humanizados y humanos"), publicado en Internet el 15 de enero de 2002; Specks y col "Response of Wegener's granulomatosis to ant?-CD20 chimepc monoclonal antibody therapy" Arthntis & Rheumatism 44:2836-2840 (2001) ("Respuesta de la granulomatosis de Wegener a la terapia con anticuerpos quimépcos monoclonales ant?CD20"), ingreso del resumen en Internet e invitación a cargo de Koegh y col, "Rituximab for Remission Induction ín Severe ANCA-Associated Vascuhtis: "Rituximab para inducción de la remisión en vascu tis grave asociada a ANCA: Report of a Prospective Open-Label Pilot Tpal ín 10 Patients" ("Rituximab para inducir la remisión en vascuhtis grave asociada a ANCA: informe de un ensayo piloto prospectivo abierto en 10 pacientes"), Amencan College of Rheumatology (Instituto Amepcano de Reumatología), número de la sesión: 28-100, título de la sesión: Vascuhtis, clase de sesión: Sesión concurrente ACR, categoría ppmapa: 28 Vasculitis, sesión 18/10/2004 0?ttp://www abstractsonhne com/viewer/SearchResults.asp); Epksson, "Short-term outeome and safety ín 5 patients with ANCA-positive vascuhtis treated with ntuximab", Kidney and Blood Pressure Research, 26: 294 (2003) ("Resultado y segundad a corto plazo en 5 pacientes con vascuhtis positiva en ANCA tratados con ptuximab"); Jayney col, "B-cell depletion with ptuximab for refractory vasculitis" Kidney and Blood Pressure Research, 26: 294 (2003) ("Reducción de las células B con ptuximab para la vascuhtis refractapa"); Jayne, cartel 88 (11 Seminano Internacional sobre Vasculitis y ANCA), 2003 Amencan Society of Nephrology (Sociedad Amencana de Nefrología); Stone y Specks, "Rituximab Therapy for the Induction of Remission and Tolerance ín ANCA-associated Vascuhtis" ("Terapia con ptuximab para inducir la remisión y la tolerancia en la vascuhtis asociada al ANCA"), en el Resumen de Investigaciones de Ensayos Clínicos de la Red de Tolerancia Inmune de 2002-2003, http . /www ímmunetolerance org/research/autoimmune/tnals/stone.html y Leandro y col , "B cell repopulation occurs mamly from na?ve B cells ín patient with rheumatoid arthptis and systermc lupus erythematosus" Arthritis Rheum , AB (Suplemento 9): S 1160 (2003) ("La repoblación de las células B se produce ppncipalmente a partir de células B vírgenes en pacientes con artptis reumatoide y lupus eptematoso sistémico") Resumen de la invención En un pnmer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para tratar los casos moderados-graves de la enfermedad mflamatona intestinal (EII) en un sujeto humano que consiste en administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo del CD20 y cuyo resultado es una respuesta clínica o la remisión de la enfermedad en el sujeto. En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para tratar la enfermedad inflamatopa intestinal (EII) en un sujeto humano con EII activa que consiste en administrar al paciente sólo una o dos dosis de un anticuerpo del CD20, obteniendo ya como resultado tras d?cha(s) dosis la remisión de la enfermedad o una respuesta clínica. La invención ofrece además un procedimiento para tratar la enfermedad mflamatona intestinal (EII) en un sujeto humano con EII activa que consiste en administrar al paciente cantidades eficaces de un anticuerpo del CD20 y, postepormente, un segundo medicamento seleccionado del grupo integrado por un aminosa cilato, un corticosteroide oral, la 6-mercaptopunna (6-MP) y la azatioppna. En otro aspecto adicional, la invención se refiere a un procedimiento para reducir el resultado del índice de actividad de la enfermedad (IAE) en un sujeto humano con colitis ulcerativa (CU) activa que consiste en administrar al sujeto un anticuerpo del CD20 en una cantidad eficaz para reducir ese resultado del IAE. En un segundo aspecto adicional, la invención se relaciona con un artículo fabncado que consta de: i. un envase que contiene un anticuerpo del CD20, y n un prospecto con instrucciones para tratar la enfermedad inflamatopa intestinal (EII) en un sujeto humano que indican la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo del CD20.

Descripción breve de los dibujos La figura 1 A muestra una alineación de secuencias que compara las secuencias de aminoácidos del dominio de la cadena ligera vanable (VL) de cada 2H7 mupno (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 1 ), la vanante 2H7 vi 6 humanizada (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 2) y el subgrupo I de la cadena ligera kappa humana (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 3). Las regiones de determinación de complementanedad (CDRs) de la VL de 2H7 y hu2H7.vl6 son las siguientes- CDRl (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 4), CDR2 (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 5) y CDR3 (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 6). La figura IB muestra una alineación de secuencias que compara las secuencias de aminoácidos del dominio de la cadena pesada vapable (VH) de cada 2H7 mupno (IDENTEFICADOR DE SECUENCIA N° 7), la vanante 2H7.vl 6 humanizada (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 8) y la secuencia humana de consenso del subgrupo III de la cadena pesada (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 9) Las CDRs de la VH de 2H7 y hu2H7.vl6 son las siguientes: CDRl (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N0 10), CDR2 (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 11) y CDR3 (IDENTMCADOR DE SECUENCIA N° 12). En las figuras ÍA y IB, las CDRl, CDR2 y CDR3 de cada cadena están entre paréntesis, flanqueadas por las regiones de estructura, FR1-FR4, según se indica. 2H7 se refiere al anticuerpo munno 2H7. Los astepscos entre dos filas de secuencias indican las posiciones que son diferentes entre las dos secuencias. La numeración de residuos se ha realizado de acuerdo con Kabaty col. , Sequences of Immunological Interest, 5a edición del Servicio Público de Salud, Institutos Nacionales de la Salud, Bethesda, Md. (1991), con las inserciones mostradas como a, b, c, d y e. La figura 2 muestra una alineación del 2H7 vi 6 maduro y las cadenas ligeras del 2H7.v511 (IDENTIFIC ADORES DE SECUENCIA Nos 13 y 15, respectivamente), con numeración de residuos del dominio vapable según Kabat y numeración de residuos del dominio constante según Eu. La figura 3 muestra una alineación del 2H7.vl6 maduro y las cadenas pesadas del 2H7.v511 (IDENTIFIC ADORES DE SECUENCIA Nos 14 y 16, respectivamente), con numeración de residuos del dominio vapable según Kabat y numeración de residuos del dominio constante según Eu. En la figura 4 se representa un esquema del estudio para el protocolo del Ejemplo 1. Descripción detallada de las realizaciones preferentes I. Definiciones La "enfermedad mflamatopa intestinal" o "EII" se refiere al grupo de trastornos que provoca la inflamación de los intestinos, manifestado por lo general a través de síntomas como calambres y dolor abdominal, diarrea, pérdida de peso y hemorragia intestinal. Las formas pnncipales de la EII son la colitis ulcerativa (CU) y la enfermedad de Crohn. La "colitis ulcerativa" o "CU" es una enfermedad ínflamatopa, crónica y episódica, del intestino grueso y el recto caractenzada por diarreas sanguinolentas. La colitis ulcerativa se caractepza por la inflamación crónica de la mucosa colónica y puede categopzarse según su ubicación: la "proctitis" sólo se manifiesta en el recto, la "proctosigmoiditis" afecta al recto y el colon sigmoide, la "colitis izquierda" abarca todo el lado izquierdo del intestino grueso y la "pancohtis" inflama el colon entero.

La "enfermedad de Crohn'J llamada también "ententis regional", es una enfermedad autoinmune crónica que puede afectar a cualquier parte del tracto gastrointestinal pero por lo general se ongma en el íleon (la zona de encuentro del intestino delgado y el grueso). La enfermedad de Crohn, en contraste con la colitis ulcerativa, se caractenza por una inflamación crónica que se extiende a través de todas las capas de las paredes intestinales y afecta al mesentepo así como los nodulos linfáticos regionales. Tanto si el intestino delgado o el colon están afectados o no, el proceso básico de la patología es el mismo. La colitis ulcerativa y la enfermedad de Crohn pueden distinguirse entre sí por factores clínicos, endoscópicos, patológicos y serológicos en más del 90% de los casos; el resto se considera una EII indeterminada (Harnson's Ppnciples of Internal medicine (Pnncipios de Hamson de medicina interna), 12a edición, página 1.271 (1991)). La EII "moderada-grave" es una modalidad de la enfermedad en que los signos o síntomas que presenta el sujeto son supenores a un grado leve. Un gastroenterólogo capacitado puede identificar a estos sujetos El paciente con EII moderada-grave puede haberse tratado con corticosteroides orales para la CU durante dos años antes de la exploración, y/o la intensidad del tratamiento puede haber sido igual o supenor a una dosis equivalente de prednisona de 20 mg/día durante al menos dos semanas. Estos sujetos pueden ser refráctanos a los esteroides y/o dependientes de éstos. Un paciente con CU moderada-grave puede seleccionarse sobre la base de su resultado del IAE; por ejemplo, un resultado del IAE >6, un resultado de hemorragia rectal >2 y/o un resultado de la sigmoidoscopia flexible >2 indican que el sujeto tiene CU moderada-grave. De forma alternativa, o adicionalmente, pueden aplicarse los cntenos para evaluar los grados leve, moderado y grave de la enfermedad tal como se descpben en Truelove y Witts BrMedJ. 2: 1041-1048 (1955) (véase la Tabla 1 a continuación) para identificar a estos sujetos. Por lo general, los pacientes con colitis fulminante o tóxica evacúan más de 10 veces al día, tienen hemorragias constantes, distensión y sensibilidad abdominal y presentan pruebas radiológicas de edema y posiblemente dilatación intestinal.

Tabla 1: Criterios de Truelove v Witts para evaluar la actividad de la enfermedad en la colitis ulcerativa Evacuaciones dianas (cantidad) < o = a 5 > 5 Hematoquecia Pequeñas cantidades Grandes cantidades Temperatura < 37,5 °C > o = a 37,5 °C Pulso < 90/mmuto > o = 90/m?nuto Tasa de sedimentación de entrocitos < 30 mm/hora > o = a 30 mm/hora Hemoglobina > 10 g/dl < o = a l0 g/dl • Aquellos sujetos que no cumplan estos 6 cptenos de determinación de una actividad grave tienen una enfermedad moderadamente activa. En la presente memopa descpptiva, un "sujeto" es un sujeto humano. Un sujeto con EII "activa" expepmenta al menos un síntoma de la EII en el momento de la exploración o el tratamiento inicial. La EII "refractapa a los esteroides" es una clase de EII que progresa, o empeora, aunque se administren esteroides al sujeto con EII. Un sujeto con EII "dependiente de esteroides" depende del tratamiento con esteroides, y no puede disminuir o abandonar su administración debido a los síntomas persistentes. Un "síntoma" de la EII es un fenómeno mórbido o una manifestación alejada de los parámetros normales en cuanto a estmctura, función o sensación, que el sujeto expenmenta y constituye un indicio de EII. La "mucosa" es el tejido húmedo que recubre órganos y cavidades coforales particulares por todo el cuefo, incluyendo el tracto gastrointestinal. Las glándulas que hay a lo largo de la mucosa segregan mucosidad (un fluido espeso). El "colon" es la porción del intestino grueso que se extiende desde el ciego hasta el recto. La mucosa "colónica" es la mucosa que recubre el colon. Los "parches de Peyer" son folículos linfáticos agregados que se encuentran por todo el cuefo, especialmente en los recubnmientos mucosos de los tractos digestivo y respiratopo. Por "remisión de la enfermedad" se entiende sustanclalmente la inexistencia de síntomas de la enfermedad. La remisión puede lograrse dentro de un marco temporal especificado, como un período de 8 semanas, desde el inicio del tratamiento con, o la dosis inicial de, el antagonista o anticuefo. La remisión también puede mantenerse durante un plazo de tiempo, como 324 ó 348 semanas. La remisión de la enfermedad también puede definirse como una sigmoidoscopia que dé 0 ó 1 como resultado y/o una hemorragia rectal que den 0 como resultado. Una "sigmoidoscopia" es una inspección, a través de un endoscopio, del mtenor del colon sigmoide. Un "resultado de una sigmoidoscopia" se refiere al resultado asignado por un médico sobre la base de una sigmoidoscopia El sistema preferente del resultado de una sigmoidoscopia es el siguiente: 0 = estado normal o enfermedad inactiva 1 = enfermedad leve (eptema, modelo vascular reducido, friabilidad leve) 2 = enfermedad moderada (eptema marcado, modelo vascular ausente, friabilidad, erosiones) 3 = enfermedad grave 03>emorrag?a espontánea, ulceración) Una "hemorragia rectal" se refiere a cualquier hemopagia que haya o se opgine en el recto. Un "resultado de una hemorragia rectal" es el resultado del grado asignado a la extensión, si la hay, de una hemorragia rectal El resultado diano de la hemonagia representa la hemorragia más grave del día. El sistema preferente del resultado de una hemorragia rectal es: 0 = no se percibe sangre 1 = pequeñas cantidades de sangre en las deposiciones en menos de la mitad de ocasiones 2 = presencia obvia de sangre en las deposiciones en la mayoría de ocasiones 3 = excreción sólo de sangre "Respuesta clínica" significa una mejoría de los síntomas de la enfermedad. La respuesta clínica puede lograrse dentro de un marco temporal determinado, por ejemplo, un período de 8 semanas, desde el inicio del tratamiento con, o la dosis inicial de, el antagonista o anticuefo. La respuesta clínica también puede mantenerse durante un plazo de tiempo, como 324 ó 348 semanas. La respuesta clínica puede evaluarse en términos de la reducción del resultado del índice de actividad de la enfermedad (IAE); por ejemplo, el resultado del IAE puede reducirse en 3 o más puntos. Un sistema del resultado del "índice de actividad de la enfermedad (IAE)" es un procedimiento para evaluar cuantitativamente la actividad de la CU. El sistema preferente del resultado del IAE se muestra a continuación en la Tabla 2. Tabla 2 Sistema del resultado del IAE para evaluar la actividad de la CU Frecuencia de las deposiciones (cada sujeto actúa como su propio control a la hora de establecer el grado de anormalidad de la frecuencia de las deposiciones) 0 = cantidad normal de deposiciones para este sujeto 1 = 1 0 2 deposiciones más de lo normal 2 = 3 04 deposiciones más de lo normal 3 = 5 o más deposiciones más de lo normal Hemorragia rectal (el resultado diario de la hemorragia representa la hemorragia más grave del día) 0 = no se percibe sangre 1 = pequeñas cantidades de sangre en las deposiciones en menos de la mitad de ocasiones 2 = presencia obvia de sangre en las deposiciones en la mayoría de ocasiones 3 = excreción sólo de sangre Datos sobre la base de una protosigmoidoscopia flexible 0 = estado normal o enfermedad inactiva 1 = enfermedad leve (eritema, modelo vascular reducido) 2 = enfermedad moderada (eritema marcado, modelo vascular ausente, friabilidad, erosiones) 3 = enfermedad grave (hemorragia espontánea, ulceración) Evaluación global del médico (reconoce los otros 3 criterios, el registro diario de las molestias abdominales y la sensación general de bienestar del sujeto y otras observaciones, como los datos físicos y el estado de rendimiento del sujeto) 0 = normal 1 = enfermedad leve 2 = enfermedad moderada 3 = enfermedad grave Un "autoanticuefo" es un anticuefo que el sujeto genera y se dirige contra un antígeno propio del sujeto. Una "tropomiosina" es una proteína fibrosa que se puede extraer del músculo. Existen 8 isoformas humanas conocidas de la tropomiosina. En las células epiteliales del colon, la isoforma 5 humana de la tropomiosina (hTM5) es la isoforma predominante, con menos cantidades de la isoforma 4 (hTM4).

Por "anticuefo ant?-hTM5" se entiende un autoanticuefo que el sujeto ha generado y se dipge contra la hTM5 de dicho sujeto. El "anticuefo citoplasmático antmeutrófilo pepnuclear (p-ANCA)" se refiere al autoanticuefo que el sujeto genera y se dipge contra componentes de los leucocitos neutrófilos de dicho sujeto. "Pepnuclear" se refiere al modelo de coloración de estos autoanticuefos. Un nivel de autoanücuefos "atípico" significa un nivel de dichos autoanticuefos que supera el normal. Ese nivel de autoanticuefos normal o típico podría ser el nivel que se detecta en la mucosa o el tejido colónico de un sujeto normal, o que no padezca EII. Una "célula B" es un linfocito que madura dentro de la médula ósea, e incluye una célula B virgen, una célula B de memopa o una célula B efectora (células plasmáticas). En la presente memopa descpptiva, la célula B puede ser una célula B normal o benigna. En la presente memopa descpptiva, un "marcador de la superficie de células B" o "antígeno de la superficie de células B" es un antígeno que se expresa en la superficie de una célula B y se puede actuar sobre él mediante un antagonista o anticuefo que se le une. Ejemplos de marcadores de la superficie de células B serían marcadores de la superficie de leucocitos como el CD10, el CDl 9, el CD20, el CD21, el CD22, el CD23, el CD24, el CD37, el CD40, el CD53, el CD72, el CD73, el CD74, el CDw75, el CDw76, el CD77, el CDw78, el CD79a, el CD79b, el CD80, el CD81, el CD82, el CD83, el CDw84, el CD85 y el CD86 (para conocer sus descppciones, consulte The Leukocyte Antigen Facts Book (Libro de datos sobre los antígenos de leucocitos), 2a edición, 1997, editores Barclay y col, Academic Press, Harcourt Brace & Co., Nueva York). Otros marcadores de la superficie de células B incluyen el RP105, el FcRH2, el CR2 de células B, el CCR6, el P2X5, el HLA-DOB, el CXCR5, el FCER2, el BR3, el Btig, el NAG14, el SLGC16270, el FcRHl, el IRTA2, el ATWD578, el FcRH3, el IRTA1, el FcRH6, el BCMA, y el 239287 El marcador de la superficie de células B de interés particular se expresa preferentemente en las células B en comparación con los otros tejidos del sujeto que no pertenecen a células B, y se puede expresar tanto en células B precursoras como maduras. El antígeno "CD20J o "CD20J es una fosfoproteína no ghcosilada, de aproximadamente 35 -kDa, que se encuentra en la superficie de más del 90% de las células B de la sangre pepfépca o los órganos hnfoides. El CD20 está presente tanto en células B normales como malignas, pero no se expresa en las células madre. Otros nombres que se dan al CD20 en la bibliografía son "antígeno restpngido a lmfocitos B" y "Bp35". El antígeno CD20 se descpbe en Clarky col , Proc. Nati Acad Sci (EE.UU.) 82:1766 (1985), por ejemplo Un "antagonista de los marcadores de la superficie de células B" es una molécula que, al unirse en las células B a un marcador de la superficie de células B, destruye o reduce las células B del sujeto y/o interfiere en una o más de las funciones de las células B,por ejemplo, disminuyendo o impidiendo la respuesta humoral que las células B provocan. El antagonista es preferentemente capaz de reducir las células B (es decir, disminuir los niveles de células B circulantes) en un sujeto tratado con dicho antagonista. Esta reducción puede conseguirse a través de diversos mecanismos, como la citotoxicidad con mediación celular dependiente de anücuefos (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente de complementos (CDC), la inhibición de la proliferación de células B y/o la inducción de la muerte de las células B (por ejemplo, vía apoptosis). Los antagonistas incluidos en el ámbito de la presente invención pueden ser anticuefos, péptidos sintéticos o de secuencia nativa, mmunoadhesinas y antagonistas de molécula pequeña que se unen a un marcador de la superficie de células B como el CD20, opcionalmente conjugados o fusionados con un agente citotóxico. El antagonista preferente está constituido por un anticuefo. En la presente memona descnptiva, un "antagonista anticuefo del CD20" es un anticuefo que, al unirse al CD20 en las células B, destmye o reduce las células B del sujeto y/o interfiere en una o más de las funciones de las células B,por ejemplo, disminuyendo o impidiendo la respuesta humoral que las células B provocan El antagonista anticuefo es preferentemente capaz de reducir las células B (es decir, disminuir los niveles de células B circulantes) en un sujeto tratado con dicho antagonista. Esta reducción puede conseguirse a través de diversos mecanismos, como la citotoxicidad con mediación celular dependiente de anticuefos (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente de complementos (CDC), la inhibición de la proliferación de células B y/o la inducción de la muerte de las células B (por ejemplo, vía apoptosis) En la presente memopa descpptiva, el término "anticuefo" se emplea en su sentido más amplio y cubre específicamente los anticuefos monoclonales, los anticuefos pohclonales, los anticuefos multiespecíficos (por ejemplo, los anticuefos biespecíficos) formados a partir de, al menos, dos anticuefos intactos y los fragmentos de anticuefos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada. Los "fragmentos de anticuefos" comprenden una porción de un anticuefo intacto, que preferentemente comprende la región de unión a antígeno del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuefos son los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, los diacuefos, los anticuefos lineales, las moléculas de anticuefos de cadena única y los anticuefos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuefos.

En la presente memopa descnptiva, un "Aanticuefo intacto®" es aquél que comprende dos regiones de unión a antígeno y una región Fc. El anticuefo intacto tiene preferentemente una región Fc funcional. Ejemplos de anticuefos del CD20 son: el "C2B8", que actualmente se llama "ntuximab" ("RITUXAN®") (patente de EE.UU n° 5.736.137); el anticuefo mupno 2B8 marcado con ?tpo-[90] denominado "Y2B8" o "Ibptumomab Tiuxetán" (ZEVALIN®) y comercializado por IDEC Pharmaceuticals, Inc. (patente de EE.UU. n° 5.736.137; 2B8 depositado en la ATCC bajo adquisición con el n° HB 11388 el 22 de junio de 1993); el anticuefo munno IgG2a "Bl", llamado también "Tositumomab'J opcionalmente marcada con 131I para generar el "131I-B1" o anticuefo "íodina 1131 tositumomab" (BEXXAR™) y comercializado por Copxa (véase, además, la patente de EE.UU. n° 5.595.721); el anticuefo monoclonal munno "1F5" (Press y col , Blood 69 (2).584-591 (1987) y vanantes del mismo incluyendo una "estmctura parcheada" o 1F5 humanizado (documento WO 2003/002607, Leung, S.; depósito en la ATCC HB-96450); el anticuefo munno 2H7 y el q mépco 2H7 (patente de EE.UU. n° 5.677.180); el 2H7 humanizado (documento WO 2004/056312, Lowmany col , y como se establece a continuación); el 2F2 (HuMax-CD20), un anticuefo totalmente humano, de alta afinidad, dipgido a la molécula del CD20 en la membrana celular de las células B (Genmab, Dinamarca; véase, por ejemplo, Glennie y Van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) y Cragg y col , Blood 101 : 1045-1052 (2003); documento WO 2004/035607; documento US2004/0167319); los anticuefos monoclonales humanos especificados en los documentos WO 2004/035607 y US2004/0167319 (Teelmgy col ); los anticuefos con cadenas complejas de azúcares enlazadas a N-ghcósidos y unidas a la región Fc descpta en el documento US 2004/0093621 (Shitaray col); los anticuefos monoclonales y los fragmentos de unión a antígeno que se unen al CD20 (documento WO 2005/000901 , Teddery col.) como el HB20-3, el HB20-4, el HB20-25 y el MB20-11 ; las moléculas de unión al CD20 como la sene AME de ant?cuefos, >or ejemplo, los anticuefos AME 33 tal como se especifican en los documentos WO 2004/103404 y US2005/0025764 (Watkinsy col , Eli Lilly/ Applied Molecular Evolution, AME); las moléculas de unión al CD20 como las descntas en el documento US 2005/0025764 (Watkins y col ), el anticuefo A20 o las vanantes del mismo como el anticuefo A20 quiménco o humanizado (cA20 y hA20, respectivamente) (documento US 2003/0219433 , Immunomedics), los anticuefos de unión al CD20, incluyendo el Leu- 16 con reducción de epítopos, el 1H4 o el 2B8, opcionalmente conjugados con IL-2, como se indica en los documentos US 2005/0069545 Al y WO 2005/16969 (Carry col); el anticuefo biespecífico que se une al CD22 y el CD20, por ejemplo, el hLL2xhA20 (documento WO2005/14618, Chang y col); los anticuefos monoclonales L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl o NU-B2 disponibles a través del International Leukocyte Typmg Workshop (Valentine y col , en: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., página 440, Oxford University Press (1987)) y el H4 (Haisma y col , Blood 92:184 (1998)). En la presente memopa descpptiva, los anticuefos del CD20 preferentes son anticuefos del CD20 humanos, humanizados o quimépcos, más preferentemente ptuximab, el anticuefo 2H7 humanizado, el anücuefo humano del CD20 2F2 (Hu-Max-CD20) (Genmab) y el anticuefo A20 humanizado (Immunomedics). En la presente memopa descpptiva, los términos "ntuximab" o "RITUXAN®" se refieren al anticuefo monoclonal munno/humano, quiménco y creado mediante ingeniería genética, dmgido contra el antígeno CD20 y denominado "C2B8" en la patente de EE.UU. n° 5.736J37, incluyendo fragmentos del mismo que retienen la capacidad de unirse al CD20. Puramente para los propósitos de la presente memopa descnptiva y a menos que se indique lo contrapo, un anticuefo "2H7 humanizado" es una vanante humanizada del anticuefo 2H7 munno, eficaz a la hora de reducir las células B circulantes en vivo. En una realización, el anticuefo 2H7 humanizado comprende una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las siguientes secuencias de CDRs: Secuencia RASSSVSYXH de la CDR L 1 en que X es M o L (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 21), por ejemplo, el IDENTiFICADOR DE SECUENCIA N° 4 (figura ÍA), Secuencia de la CDR L2 del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 5 (figura ÍA), Secuencia QQWXFNPPT de la CDR L3 en que X es S o A (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 22), por ejemplo, el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 6 (figura ÍA), Secuencia de la CDR Hl del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 10 (figura IB), Secuencia AIYPGNGXTSYNQKFKG de la CDR H2 en que X es D o A (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 23), por ejemplo, el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 11 (figura IB), y Secuencia VVYYSXXYWYFDV de la CDR H3 en que X en la posición 6 es N, A, Y, W o D, y en la posición 7 es S o R (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 24), por ejemplo, el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 12 (figura IB). Por lo general, las antenores secuencias de CDRs están presentes en las secuencias humanas de las estructuras ligera vanable y pesada vapable, como sustanclalmente los residuos humanos de la FR de consenso del subgrupo I humano kappa de la cadena ligera (VL6I) y sustanclalmente los residuos humanos de la FR de consenso del subgrupo III humano de la cadena pesada (VHIII). Véase también el documento WO 2004/056312 (Lowmany col ). La región pesada vanable puede unirse a una región constante humana de la cadena IgG, pudiendo ser la región, por ejemplo, IgGl o IgG3, incluyendo regiones de secuencia nativa y constantes vanantes. En una realización preferente, este anticuefo comprende la secuencia del dominio pesado vapable del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 8 (vl6, tal como se muestra en la figura IB), comprendiendo también opcionalmente la secuencia del dominio ligero vapable del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 2 (vi 6, tal como se muestra en la figura 1 A), que opcionalmente comprende una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones 56, 100, y/o 100a, or ejemplo D56A, N100A o NI OOY y/o SlOOaR, del dominio pesado vapable y una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones 32 y/o 92, por ejemplo M32L y/o S92A, del dominio ligero vanable. Preferentemente, el anticuefo es un anticuefo intacto que comprende las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de los JDENTIFIC ADORES DE SECUENCIA Nos 13 ó 15 , y las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de los IDENTEFIC ADORES DE SECUENCIA N°s 14, 16, 17 ó 20. Un anticuefo 2H7 humanizado preferente es el ocrehzumab (Genentech). En la presente memopa descpptiva, el anücuefo puede comprender adicionalmente al menos una sustitución de aminoácido en la región Fc que mejora la actividad de la ADCC, como un anticuefo en que las sustituciones de aminoácidos se produzcan en las posiciones 298, 333 y 334, preferentemente S298A, E333A y K334A, utilizando la numeración Eu para los residuos de la cadena pesada. Véase también la patente de EE.UU. n° 6.737 056B1, Presta. Cualquiera de estos anticuefos puede comprender al menos una sustitución en la región Fc que mejora la unión al FcRn o la vida media del suero, por ejemplo, una sustitución en la posición 434 de la cadena pesada, como N434W. Véase también la patente de EE.UU. n° 6.737.056B1, Presta. Cualquiera de estos anticuefos puede comprender adicionalmente al menos una sustitución en la región Fc que mejora la actividad de la CDC, por ejemplo, comprendiendo al menos una sustitución en la posición 326, preferentemente, K326A o K326W. Véase también la patente de EE.UU. n° 6.528.624B 1 (Idusogie y col) Algunas vanantes preferentes del 2H7 humanizado son aquéllas que comprenden el dominio ligero vapable del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 2 y el dominio pesado vanable del JDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 8, incluyendo las que tienen o no sustituciones en una región Fc (si está presente) y las que comprenden un dominio pesado vanable con alteraciones NI 00 A, o D56A y N100A, o D56A, N100Y y SlOOaR en el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 8 y un dominio ligero vapable con alteraciones M32L, o S92A, o M32L y S92A en el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 2.

M34 en el dominio pesado variable del 2H7.vl6 se ha identificado como una fuente potencial de estabilidad para los anticuefos y es otro candidato potencial a la sustitución. En un resumen de varias realizaciones preferentes de la invención, la región variable de las variantes basadas en el 2H7.vl6 comprenden las secuencias de aminoácidos del vi 6 excepto en las posiciones de sustituciones de aminoácidos que se indican a continuación en la Tabla 3. A menos que se indique lo contrario, las variantes del 2H7 tendrán la misma cadena ligera que el vi 6.

Tabla 3 Ejemplos de variantes del anticuerpo 2H7 humanizado Una versión preferente del 2H7 humanizado comprende la siguiente secuencia del dominio ligero variable del 2H7.vl 6: o DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKV?GKR (JDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 2); y la secuencia del dominio pesado vanable del 2H7.vl6: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYN QKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWWD\^GQGTLVTVSS (JDENTIFICADOR DE SECUENCIA N0 8). Cuando el anticuefo 2H7.vl6 humanizado sea un anticuefo intacto, puede comprender la siguiente secuencia de aminoácidos de la cadena ligera: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLGYAPSNLASGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVE? RTVAAPSVFGFPPSDEQLKSGTAS WCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 13); y la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 14 o: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYN QKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS ASTKGPS WPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PK?TLMISRTPEVTC VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR SVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 17). Otra versión preferente del 2H7 humanizado comprende la siguiente secuencia del dominio ligero vapable del 2H7.v511 : DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEGKR (GDENTGFICADOR DE SECUENCIA N° 18); y la secuencia del dominio pesado vanable del 2H7.v511: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGA TSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSYRYWYFDVWGQGTLV TVSS (IDEN?FICADOR DE SECUENCIA N° 19). Cuando el anticuefo 2H7.v511 humanizado sea un anticuefo intacto, puede comprender la siguiente secuencia de aminoácidos de la cadena ligera: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLGYAPSNLASGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEGKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 15); y la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 16 o: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYN QKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N° 20). Los anücuefos "inhibidores del crecimiento" son aquéllos que impiden o reducen la proliferación de una célula que exprese un antígeno al cual el anticuefo se une. Por ejemplo, el anticuefo puede impedir o reducir la proliferación de células B in vitro y/o en vivo. Los anücuefos que "inducen la apoptosis" son aquéllos que inducen la muerte celular programada, r ejemplo de una célula B, tal como se determina en los ensayos estándar de apoptosis, es decir, mediante la unión de anexina V, la fragmentación del ADN, la contracción de las células, la dilatación del retículo endoplasmático, la fragmentación celular y/o la formación de vesículas en la membrana (llamadas cuefos apoptóticos). Los "anticuefos nativos" son por lo general glicoproteínas heterotetraméncas con una masa atómica de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras 0J) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se enlaza a una pesada mediante un enlace covalente disulfuro, mientras que la cantidad de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de los distintos isotipos de mmunoglobulma. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro separados regularmente dentro de la cadena. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio vanable (VH) seguido de una cantidad de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio vanable en un extremo (VL) y uno constante en el otro; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el ppmer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio vapable de la cadena ligera se alinea con el dominio vapable de la cadena pesada Se cree que ciertos residuos particulares de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios vapables de las cadenas ligera y pesada. El término "vapable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios vapables difieren ampliamente en sus secuencias de un anticuefo a otro y se utilizan para la unión y especificidad de cada anücuefo en particular con relación a su antígeno particular. De todos modos, la vapabihdad no se distpbuye uniformemente a través de los dominios vapables de los anticuefos. Se concentra en tres segmentos, denominados regiones hipervapables, de los dominios vapables tanto de la cadena ligera como la pesada. Las porciones más conservadas de los dominios vapables se llaman regiones de estmctura (FRs). Cada dominio vapable de las cadenas pesada y ligera nativas comprende cuatro FRs que, en gran parte, adoptan una configuración de hoja-/3. Dichas FRs están conectadas por tres regiones hipervanables que crean bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de la hoja-jS. Las FR mantienen unidas y en estrecha proximidad las regiones hipervapables de cada cadena, las cuales, junto con las de la otra, contnbuyen a la formación del punto de unión a antígeno de los anticuefos (véase Kabaty col , Sequences of Proteins oflmmunological ínter est, 5a edición, Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de la Salud, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuefo a un antígeno, pero desarrollan diversas funciones efectoras, como la participación del anticuefo en la citotoxicidad con mediación celular dependiente de anticuefos (ADCC). La digestión con papaína de anticuefos produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, llamados fragmentos "Fab'J cada uno de ellos con un solo punto de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cnstalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos puntos de unión a antígeno y todavía es capaz de establecer un enlace cmzado con el antígeno. "Fv" es el fragmento de anticuefo mínimo que contiene un punto completo de reconocimiento y unión a antígeno. Esta región está compuesta por un dímero de un domino vapable de cadena pesada y otro de cadena ligera en una estrecha asociación no covalente. En esta configuración, las tres regiones hipervapables de cada dominio vanable mteractúan para definir un punto de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervapables confieren al anticuefo una especificidad de unión a antígeno. No obstante, incluso un dominio vanable simple (o la mitad de un Fv que comprenda únicamente tres regiones hipervapables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer un antígeno y unirse a él, aunque con una afinidad menor que el punto de unión completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el pnmer dominio constante (CH1) de la cadena pesada Los fragmentos Fab' se diferencian de los Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de un anticuefo. Fab'-SH es la designación que se da en la presente memona descnptiva a los Fab' en que el (los) res?duo(s) de cisteína de los dominios constantes presenta(n) al menos un gmpo tiol libre. Los fragmentos F(ab')2 de anticuefos se produjeron ongmalmente como pares de fragmentos Fab' con cisternas bisagra entre ellos. También se conocen otros emparejamientos químicos de fragmentos de anticuefos. Las "cadenas ligeras" de anticuefos (mmunoglobuhnas) de cualquier vertebrado pueden asignarse a una de dos clases claramente distintas, denominadas kappa (?) y lambda (?), sobre la base de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Según la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus "cadenas pesadas" (si están presentes), los anticuefos pueden asignarse a distintas clases. Existen cinco clases ppncipales de anticuefos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y vanas de éstas pueden seguir dividiéndose en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las distintas clases de anticuefos se denominan a, d, 6, y y µ, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las distintas clases de mmunoglobuhnas son muy conocidas. A menos que se indique lo contrapo, en la presente memona descpptiva la numeración de los residuos de una cadena pesada de ínmunoglobulma es la del índice EU tal como se descpbe en Kabaty col , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de la Salud, Bethesda, MD (1991), mcoforada expresamente a la presente memopa como referencia. El "índice EU tal como se descpbe en Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuefo humano IgGl EU. En la presente memopa descpptiva, el término "región Fc" se utiliza para definir una región C terminal de una cadena pesada de mmunoglobulina, incluidas las regiones Fc de secuencia nativa y las vanantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de mmunoglobuhna pueden vanar, la región Fc de la cadena pesada IgG humana se suele definir como la extensión desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el terminal carboxilo del mismo. La hsina C terminal (residuo 447 según el sistema de numeración EU) de la región Fc puede eliminarse, por ejemplo, durante la producción o punficación del anticuefo, o generando mediante recombinación el ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuefo. Por consiguiente, una composición de anticuefos intactos puede comprender poblaciones de anticuefos con todos los residuos K447 eliminados, poblaciones de anticuefos sin residuos K447 eliminados y poblaciones de anticuefos con una mezcla de anticuefos con y sin el residuo K447 Una "región Fc funcional" tiene una "función efectora" de una región Fc de secuencia nativa. Algunos ejemplos de "funciones efectoras" incluyen la unión al Clq, la citotoxicidad dependiente de complementos, la unión al receptor de Fc, la citotoxicidad con mediación celular dependiente de anticuefos (ADCC), la fagocitosis, la regulación a la baja de receptores en la superficie celular (por ejemplo, el receptor de células B, BCR), etc. Estas funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, el dominio vapable de un anticuefo), y se pueden evaluar mediante diversos ensayos, tal y como se desvela en esta memopa descnptiva, por ejemplo Una "región Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácido idéntica a la secuencia de aminoácido de una región Fc que se pueda encontrar en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia nativa incluyen una región Fc IgGl humana de secuencia nativa (alotipos A y no A), una región Fc IgG2 humana de secuencia nativa, una región Fc IgG3 humana de secuencia nativa y una región Fc IgG4 humana de secuencia nativa, así como las vanantes de cualquiera de ellas que se producen de forma natural Una "región Fc vanante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa en al menos una modificación de aminoácidos, preferentemente una o más sustituciones de aminoácidos Preferentemente, la región Fc vanante tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región Fc de secuencia nativa o la región Fc de un pohpéptido parental, por ejemplo, entre una y diez sustituciones de aminoácidos, y preferentemente entre una y cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido parental. En la presente memona descnptiva, la región Fc vanante tendrá preferentemente al menos un nivel de homología del 80%, mejor aún si es del 90% e ideal si llega a ser del 95%, con una región Fc de secuencia nativa y/o una región Fc de un pohpéptido parental. La "citotoxicidad con mediación celular dependiente de anticuefos" y las siglas "ADCC" se refieren a una reacción con mediación celular en que las células citotóxicas no específicas que expresan receptores de Fc (FcRs) (por ejemplo, las células asesinas naturales (NK), los neutrófilos y los macrófagos) reconocen en una célula diana el anticuefo unido a ella y postenormente producen la hsis de la célula Las pnncipales células que median en la ADCC, las células NK, sólo expresan Fc?RIDJ mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FCTRIII. La expresión del FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu Rev Immunol, 9:457-492 (1991) A fin de evaluar la actividad de la ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo de ADCC in vüro, como el que se descnbe en las patentes de EE.UU. nos 5.500.362 ó 5.821.337. Entre las células efectoras útiles para estos ensayos se encuentran las células sanguíneas mononucleares pepfépcas (PBMC) y las asesinas naturales (NK). Como alternativa, o adicionalmente, la actividad de la ADCC de la molécula de interés se puede evaluar en vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el que se desvela en Clynes y col , PNAS (EE UU.) 95:652-656 (1998). Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan al menos el Fc RIII y realizan la función efectora de la ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median en la ADCC serían las células sanguíneas mononucleares pepféncas (PBMC), las células asesinas naturales O K), los monocitos, las células T citotóxicas y los neutrófilos, pero son las PBMC y las NK las células preferentes Los términos "receptor de Fc" o "FcR" se emplean para descpbir un receptor que se une a la región Fc de un anticuefo. El FcR preferente es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferente es aquél que se une a un anticuefo IgG (un receptor gamma) y pertenece a las subclases de receptores FcyRI, Fc?RII y Fc? RUI, incluyendo las vanantes aléhcas y las formas de estos receptores enlazadas alternativamente. Los receptores Fc? II incluyen el Fc RIIA (un "receptor activador") y el FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), los cuales tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren ppncipalmente en sus dominios citoplasmáticos El receptor activador Fc?RUA contiene en su dominio citoplasmático un motivo activador inmunorreceptor basado en la tirosina (1TAM). El receptor inhibidor Fc?RIIB contiene en su dominio citoplasmático un motivo inhibidor inmunorreceptor basado en la tirosina (ÍTEM). (Véase Daéron, Annu Rev Immunol 15:203-234 (1997)). En Ravetch y Kmet, Annu.

Rev Immunol, 9:457-492 (1991), Capely col, Immunomethods, A:25-?>A (1994)ydeHaas co/., J. Lab Clin Med., 126:330-341 (1995) también se revisan los FcRs. Otros FcRs, incluidos aquéllos que se identifiquen en el futuro, se engloban en el término "FcR" empleado en la presente memopa descppüva.

Este término también incluye el receptor neonatal, FcRn, responsable de la transferencia de los IgGs matemos al feto y la homeostasis de la inmunoglobulina (Guyer y col , J. Immunol, 117:587 (1976) y Kimy col , J ImmunoL, 24:249 (1994)). La "citotoxicidad dependiente de complementos" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula de producir la lisis de una sustancia objetivo en presencia del complemento. La ta de activación del complemento se inicia mediante la unión del pnmer componente del sistema del complemento (Clq) a una molécula (por ejemplo, un anticuefo) que forme complejo con un antígeno cognado. A fin de evaluar la activación del complemento, se puede efectuar un ensayo de CDC, por ejemplo, tal como se descnbe en Gazzano-Santoro y col, J Immunol Methods, 202:163 (1996).

Los fragmentos "Fv de cadena simple" o "scFv" de un anticuefo comprenden los dominios VH y VL del anticuefo presentes en una cadena simple de pohpéptidos. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende también un enlazador de pohpéptidos entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión antígena. Para una reseña sobre los scFv, véase Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, volumen 113, Rosenburg and Moore editores., Sppnger-Verlag, Nueva York, páginas 269-315 (1994). El término "diacuefos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuefos con dos puntos de unión a antígeno que comprenden un dominio vanable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio vapable de cadena ligera (V ) en la misma cadena de pohpéptidos (VH - VL). Mediante el uso de un enlazador que sea demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, estos dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios compleméntanos de otra cadena y crear dos puntos de unión antígena. Los diacuefos se descpben con más detalle en, por ejemplo, la patente europea 404.097, el documento WO 93/11161 y Holhnger y col , Proc Nati Acad Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). El término "anücuefo monoclonal'J en el contexto de la presente memona descnptiva, se refiere a un anticuefo obtenido de una población de anticuefos sustanclalmente homogénea, es decir, los anticuefos individuales que comprende la población son idénticos y/o se unen al (a los) m?smo(s) epítopo(s), excepto en el caso de posibles vanantes que pudiesen surgir durante la producción del anticuefo monoclonal, estando dichas vanantes, por lo general, presentes en cantidades insignificantes. Generalmente, dicho anticuefo monoclonal incluye un anticuefo que comprende una secuencia de pohpéptidos que se une a una diana, obteniéndose dicha secuencia de pohpéptidos unida a una diana mediante un proceso que incluye la selección de una secuencia de pohpéptidos única unida a una diana a partir de una gran vanedad de secuencias de pohpéptidos. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un único clon a partir de una gran vanedad de clones, como un conjunto de clones de hibndoma, clones de fago o clones recombmantes del ADN. Debería entenderse que la secuencia seleccionada de unión a una diana puede sufrir más alteraciones, por ejemplo, para mejorar la afinidad con la diana, humanizar la secuencia de unión a la diana, mejorar su producción en cultivo celular, reducir su mmunogenicidad en vivo, crear un anticuefo multiespecífico, etc., y que un anticuefo que comprende la secuencia alterada de unión a una diana es también un anticuefo monoclonal de esta invención. A diferencia de las preparaciones de anticuefos policlonales que generalmente incluyen distintos anticuefos dmgidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuefo monoclonal de una preparación de anticuefos monoclonales se dinge contra un único determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuefos monoclonales tienen la ventaja de que no suelen estar contaminadas por otras mmunoglobulmas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuefo de que se ha obtenido de una población de anticuefos sustanclalmente homogénea, y no debe mtefretarse que seanecesano producir el anticuefo por algún procedimiento en particular. Por ejemplo, los anticuefos monoclonales que se utilicen de conformidad con la presente invención pueden obtenerse a partir de diversas técnicas, incluido, por ejemplo, el procedimiento del hibndoma (por ejemplo, Kohier y col, Nature, 256:495 (1975); Harlowy col, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spnng Harbor Laboratory Press, 2a edición 1988); Hammerhng y col, en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)), los procedimientos del ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 4.816.567), las tecnologías de reproducción de imágenes de fago (véase, or ejemplo, Clacksony col, Nature, 352:624-628 (1991); Marksy col, J. Mol Bwl, 222:581-597 (1991); Sidhuy col.,1 Mol Biol. 338 (2):299-310 (2004); Leeyco/., /. Mol Biol 340 (5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101 (34):12467-12472 (2004); yLeey co/. /. / mMno/. e/ ío? 284 (l-2):119-132 (2004))y las tecnologías para producir anücuefos humanos o semejantes a los humanos en animales que tienen partes o la totalidad de los locí de la mmunoglobulina humana o los genes que codifican las secuencias de la mmunoglobulma humana (véase,por ejemplo, el documento WO 1998/24893; el documento WO 1996/34096; el documento WO 1996/33735; el documento WO 1991/10741; Jakobovits y col, Proc. Nati. Acad. Sci USA, 90:2551 (1993); Jakobovits y col, Nature, 362:255-258 (1993); Bmggemanny col, Year in Immuno., 7:33 (1993); las patentes de EE.UU. nos 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas de GenPharm) y 5.545.807; el documento WO 1997/17852; las patentes de EE.UU. nos 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425 y 5.661.016; Marksy col, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonbergyco/., Nature, 368: 856-859 (1994); Mornson, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild y col, Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996) y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol, 13: 65-93 (1995). En la presente memopa descnptiva, los anticuefos monoclonales incluyen específicamente los anticuefos "quiméncos" (inmunoglobulinas) en que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes de anticuefos obtenidos de una especie en particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuefos en particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes de anticuefos obtenidos de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuefos, así como fragmentos de dichos anticuefos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (patente de EE.UU. n° 4.816.567 y Mornson y col, Proc Nati Acad Sci USA, 81 :6851-6855 (1984)). Los anticuefos quiméncos de interés en la presente memopa descpptiva incluyen los anticuefos "ppmatizados'J que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominios vanables obtenidas de un ppmate no humano (por ejemplo, los monos del Viejo Mundo, como el babuino, el macaco rhesus o el mono cynomolgus) y secuencias humanas de regiones constantes (patente de EE.UU. n° 5.693.780). Las formas "humanizadas" de los anticuefos no humanos (por ejemplo, los mupnos) son anücuefos quiméncos que contienen una secuencia mínima denvada de la inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuefos humanizados son mmunoglobulmas humanas (anticuefo receptor) en que los residuos de una región hipervanable del receptor se sustituyen por los residuos de una región hipervapable de una especie no humana (anticuefo donante), como el ratón, la rata, el conejo o los pnmates no humanos, que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de estmctura (FR) de la mmunoglobuhna humana se sustituyen por sus correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuefos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentren en el anticuefo receptor o el donante. Estas modificaciones se llevan a cabo para refinar aún más el rendimiento del anticuefo. En general, el anticuefo humanizado comprenderá sustanclalmente todos los dominios vapables (o al menos uno, y típicamente dos), en los cuales todos, o sustanclalmente todos, los bucles hipervanables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas, o sustanclalmente todas, las FRs son las de una secuencia de inmunoglobulina humana, excepto en la(s) sust?tuc?ón(es) de FRs tal como se ha indicado antenormente. Opcionalmente, el anticuefo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, típicamente humana. Para más detalles, véase Jones y col , Nature, 321 :522-525 (1986), Riechmann y col , Nature, 332:323-329 (1988) y Presta, Curr Op Struct. Biol , 2:593-596 (1992). El término "región hipervapable", en el contexto de la presente memona descpptiva, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuefo responsables de la unión al antígeno. La región hipervapable comprende residuos de aminoácidos de una "región de determinación de complementanedad" o "CDR" (por ejemplo, los residuos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) del dominio vapable de la cadena ligera y 31-35 (Hl), 50-65 0H2) y 95-102 (H3) del dominio vanable de la cadena pesada; Kabat y col, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5d edición, Servicio Público de Salud, Institutos Nacionales de la Salud, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervapable" (por ejemplo, los residuos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) del dominio vanable de la cadena ligera y 26-32 (Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) del dominio vanable de la cadena pesada; Chothia y Lesk, J Mol Biol , 196.901-917 (1987)). Los residuos de una "estmctura" o "FR" son aquellos residuos de un dominio vanable distintos de los de una región hipervanable, tal como se define en la presente memopa descnptiva. Un "anticuefo desnudo" es un anticuefo (tal como se define en la presente memopa descpptiva) que no se conjuga con una molécula heteróloga, como un segmento citotóxico o una etiqueta radiactiva. En la presente memona descnptiva, un "Aanticuefo intactoA" es aquél que comprende dos reglones de unión a antígeno y una región Fc. El anticuefo intacto tiene preferentemente una región Fc funcional. Un anticuefo "aislado" es aquél que se ha identificado y separado, y/o recuperado, a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son matepales que mterfeprían en el diagnóstico o los usos terapéuticos del anticuefo, y podrían incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En las realizaciones preferentes, el anticuefo se punficará (1) en más del 95% de su peso tal como se determina por el método de Lowry, y más preferentemente, en más del 99% de su peso, (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de una secuencia de aminoácidos N-termmal o internos mediante un secuenciador de taza giratopa, o (3) hasta alcanzar la homogeneidad mediante SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras, empleando una tinción con azul de Coomassie o, preferentemente, plata. Los anticuefos aislados incluyen el anticuefo in situ dentro de células recombmantes, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuefo no estará presente. De todas formas, normalmente, el anticuefo aislado se preparará mediante al menos una etapa de pupficación. Un anticuefo con "Amaduración de afinidad®" es aquél con una o más alteraciones en una o más reglones hipervapables del mismo que resultan en una mejora de la afinidad del anticuefo al antígeno, en comparación con un anticuefo parental que no posea d?cha(s) alterac?ón(es). Los anticuefos con maduración de afinidad preferentes tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares con el antígeno diana. Los anticuefos con maduración de afinidad se producen mediante procedimientos bien conocidos en el sector. En Marksy col , Bio/Technology, 10:779-783 (1992), se descpbe la maduración de afinidad a través de la transposición de los dominios VH y VL. La mutagénesis aleatona de la CDR y/o los residuos de estructura se descpben en: Barbas y col , Proc Nat Acad Sci, USA, 91 :3809-3813 (1994), Schier y col , Gene, 169:147-155 (1995), Yelton y col , J Immunol , 155.1994-2004 (1995), Jacksonyco/ , J Immunol , 154(7):3310-9 (1995) y Hawkms y co/ , J Mol Bwl , 226-889-896 (1992).

En la presente memoria descnptiva, el "tratamiento" de un sujeto se refiere tanto al tratamiento terapéutico como las medidas profilácticas o preventivas. Entre las personas que necesitan tratamiento se incluyen aquéllas que ya tienen EII así como las que deben tomar medidas para prevenirla. De aquí que tal vez hayan diagnosticado EII al paciente o éste quizá tenga predisposición o sea susceptible a la EII. Los términos "tratando", "tratar" o "tratamiento", en el contexto de la presente memona descnptiva, incluyen tratamientos preventivos (por ejemplo, profilácticos), paliativos y curativos. El término "agente inmunosupresor'J tal como se usa en la presente memopa descnptiva para la terapia asociada, se refiere a sustancias que supnmen o enmascaran el sistema mmunológico del paciente que aquí se está tratando. Estos agentes incluirían sustancias que suppmen la producción de citoquma, regulan a la baja o supnmen la autoexpresión de antígenos o enmascaran los antígenos del MHC (complejo ppncipal de histocompatibihdad). Ejemplos de estos agentes serían las pipmidmas 2-armno-6-apl-5-sust?tu?das (véase la patente de EE.UU. n° 4.665.077); los medicamentos antnnflamatopos no esteroides (NSAIDs); el ganciclovir; el tacrolimus; los glucocorticoides como el cortisol o la aldosterona; los agentes antnnflamatonos como un inhibidor de la ciclooxigenasa; un inhibidor de la 5-hpox?genasa o un antagonista receptor del leucorneno; los antagonistas de la pupna como la azatiopnna o el micofenolato mofetil (MMF), los agentes alquilantes como la ciclofosfarmda; la bromocpptma; el danazol; la dapsona, el glutaraldehído (que enmascara los antígenos del MHC, tal como se descnbe en la patente de EE.UU n° 4 120 649); los anticuefos anti-idiotípicos para los antígenos y fragmentos del MHC; la ciclosponna, la 6 mercaptopupna; los esteroides como los corticosteroides, los glucocorticosteroides o los análogos a los glucocorticoides, por ejemplo, prednisona, metilprednisolona, incluyendo succmato sódico de metilpredmsolona (SOLU-MEDROL®), y dexametasona; los inhibidores de la dihidrofolato reductasa como el metotrexato (oral o subcutáneo); los agentes contra la malapa como la cloroquina y la hidroxicloroquma; la sulfasalazma; la leflunomida; la citoquma o los anticuefos o antagonistas receptores de citoquina incluyendo los anticuefos anti-interferón-alfa, -beta o -gamma, los anticuefos anti-factor de necrosis tumoral(TNF)-alfa (ínfliximab (REMICADE®) o adalimumab), la mmunoadhesina anti-TNF-alfa (etanercept), los anticuefos anti-TNF-beta, los anticuefos anti-mterleukm-2 (IL-2) y anti-receptores de DJ-2 y los anticuefos y antagonistas anti-receptores de mterleukm-6 (DJ-6); los anticuefos ant?-LFA-1, incluyendo los anti-CDl la y ant?-CD18; los anücuefos ant?-L3T4; la globulina anti-hnfocitos heteróloga; los anticuefos pan-T, preferentemente los anü-CD3 o ant?-CD4/CD4a, un péptido soluble que contenga un dominio de unión a LFA-3 (documento WO 90/08187 publicado el 26 de julio de 1990); la estreptoquinasa; el factor de crecimiento transformador-beta (TGF-beta), la estreptodornasa, el ARN o ADN del anfitpón; el FK506; el RS- 61443; el clorambucil; la deoxispergualina; la rapamicina; el receptor de células T (Coheny col , patente de EE.UU. n° 5.114 721); los fragmentos del receptor de células T (Offhery col , Science, 251 : 430-432 (1991); el documento WO 90/11294; Ianeway, Nature, 341 : 482 (1989) y el documento WO 91/01133); los antagonistas del BAFF como los anticuefos o inmunoadhesinas del BAFF o el BR3 y los antagonistas del zTNF4 (para una reseña, véase Mackay y Mackay, Trends Immunol, 23:113-5 (2002) y también la definición más adelante); los agentes biológicos que interfieren en las señales auxiliares de las células T, como el receptor ant?-CD40 o el ligando ant?-CD40 (CDl 54), incluyendo los anticuefos de bloqueo del ligando CD40-CD40 (por ejemplo, Dupe y col, Science, 261 : 1328-30 (1993); Mohany col , J Immunol , 154: 1470-80 (1995)) y CTLA4-Ig (Fmcky col , Science, 265: 1225-7 (1994)) y los anticuefos de receptores de células T (documento EP 340.109) como el T10B9. El término "agente citotóxico", en el contexto de la presente memopa descnptiva, se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de las células y/o causa su destrucción. El término pretende incluir isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, 1131, 1125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 y los isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos y toxinas como las de molécula pequeña o las enzimáticamente activas de opgen bactenano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil para el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos serían los agentes alquilantes como la tiotepa y la ciclofosfarmda (CYTOXAN®); los sulfonatos de alquilo como el busulfán, el improsulfán y el piposulfán; las azipdinas como la benzodopa, la carboquona, la meturedopa y la uredopa; las etilomminas y metilamelaminas incluyendo la altretamma, la tnetilenomelarmna, la tpetilenofosforarmda, la tnetilenotiofosforamida y la tpmetilolomelarmna; los acetogenmos (en especial, el bullatacín y la bullatacmona), el delta-9-tetrah?drocannabmol (dronabinol, MARINOL®); la beta-lapachona; el lapachol; las colchicinas; el ácido betulínico, una camptotecma (incluyendo el topotecán análogo sintético (HYCAMTIN®), el CPT-11 (mnotecán, CAMPTOSAR®), la acetilcamptotecina, la escopolectma y la 9-am?nocamptotec?na); la bnostatma; la calhstatina; el CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adocelesma, carcelesma y bicelesma); la podofilotoxma; el ácido podofilínico; la teniposida; las cnptoficinas (particularmente la cnptoficina 1 y la 8); la dolastatina; la duocarmicma (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CB1-TM1); la eleuterobina; la pancratistatma; una sarcodictina, la espongistatina; los gases nitrógeno como el clorambucil, la clornafacina, la colofosfamida, la estramustina, la ífosfarmda, la mecloretamma, el clorhidrato de óxido de mecloretamina, el melfalán, la novembichma, la fenestepna, la pred mustina, la trofosfamida y la uramustma; las nitrosureas como la carmustma, la clorozotocma, la fotemustina, la lomustma, la nimustma y la ranimustina, los antibióticos como los de enedina (por ejemplo, la calicheamicina, especialmente la cahcheamicma gamma II y la omega II (véase, por ejemplo, Agnew, Chem Intl Ed EngL, 33: 183-186 (1994)); la dinemicina, incluyendo la dmemicina A; una esperarmcina; el cromóforo de neocarcmostatma y los cromóforos de antibióticos de enedina cromoproteína relacionados (las aclacmomismas, la actinomicma, la autramicma, la azasepna, las bleomicmas, la cactinomicma, la carabicma, la carminomicina, la carcinofilma, las cromomicmas, la dactmomicina, la daunormbicma, la detorrubicma, la 6-d?azo-5-oxo-L-norleucma, la doxormbicina (incluyendo ADRIAMYCIN®, la morfohno-doxormbicina, la cianomorfolino-doxorrubicma, la 2-p?rrol?no-doxormb?c?na, la inyección de liposomas de doxormbicina HC 1 (DOXIL®) y la desoxidoxormbicina), la epirrubicma, la esorrubicina, la ídarrubicma, la marcelomicina, las mitomicmas como la mitomicina C, el ácido micofenólico, la nogalamicma, las olivomicmas, la peplomicma, la potfiromicina, la purormcma, la quelamicina, la rodorrubicma, la estreptonigpna, la estreptozocma, la tubercidina, el ubemmex, la cmostatma y la zormbicina); los antimetabohtos como el metotrexato, la gemcitabina (GEMZAR®), el tegafur (UFTORAL®), la capecitabina (XELODA®), una epotilona y el 5-fluorourac?lo (5-FU); los análogos del ácido fólico como la denoptenna, el metotrexato, la teroptenna y el tnmetrexato; los análogos de la punna como la fludarabma, la 6-mercaptopunna, la tiamippna y la tioguanina; los análogos de la pinmidina como la ancitabma, la azacitidina, la 6-azaund?na, el carmofur, la citarabma, la didesoxiupdina, la doxiflundina, la enocitabma y la floxundma; los antiadrenales como la armnoglutetimida, el mitotano y el tnlostano; un reabastecedor del ácido fóhco como el ácido folínico; la aceglatona; el glucósido aldofosfamida, el ácido aminolevulínico; el eniluracilo; la amsacpna; el bestrabucil; el bisantreno; el edatraxato; la defofamina; la demecolcina; la diaziquona; la elformtina; el acetato de elrptmio; el etoglúcido; el nitrato de galio; la hidroxiurea; el lentmán; la lomdainina; los maitansmoides como la maitansma y las ansamitocinas; la mitoguazona; la rmtoxantrona; el mopidanmol; la nitraenna, el pentostatín, el fenamet; la pirarmbicina; la losoxantrona; la 2-et?lh?drac?da; la procarbacina; el complejo pohsacápdo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); el razoxano; la pzoxina; el sizofirán; el espirogermanio; el ácido tenuazónico; la tpaciquona; la 2,2J2"-tpclorotnetilamina; los tncotecenos (especialmente la toxina T-2, el verracurín A, el rondín A y la anguidma), el uretano; la vmdesina (ELDISINE®, FILDESIN®); la dacarbacina; la manomustma; el mitobronitol, el mitolactol, el pipobromán; la gacitosina; la arabinosida ("Ara-C"); la tiotepa; los taxoides, por ejemplo, el pac taxel (TAXOL®), la formulación de nanopartículas de pachtaxel mediante ingeniería de albúmina (ABRAXANE™) y el doxetaxel (TAXOTERE®); el clorambucil; la 6-tioguanina; la mercaptopunna, el metatrexato; los análogos de platino o los basados en platino como el cisplatmo y el carboplatmo; la vinblastina (VELBAN®); el platino; el etopósido (VP-16); la ífosfamida; la mitoxantrona, la vmcnstina (ONCOVIN®); el oxahplatmo; la leucovovma; la vinorrelbina (NAVELBINE®); la novantrona; el edatrexato; la daunormcina; la ammoptepna; el ibandronato; el inhibidor RFS 2000 de la topoisomerasa; la difluorometilornitina (DMFO); los retmoides como el ácido retinoico y las sales, los ácidos o los denvados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de las sustancias antenores, así como las combinaciones de una o más de las sustancias antepores como la CHOP, la abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincnstina y prednisolona, y la FOLFOX, la abreviatura de un régimen de tratamiento con oxahplatino (ELOXATIN™) combinado con 5 -FU y leuco vo vina. También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que regulan, reducen, bloquean o inhiben los efectos de las hormonas que pueden fomentar el crecimiento del cáncer y se presentan a menudo en la forma de un tratamiento sistémico o del cuefo entero. Estos agentes podrían ser hormonas propiamente. Como ejemplos tendríamos los antiestrógenos y los moduladores selectivos de receptores de estrógenos (SERMs), incluyendo, por ejemplo, el tamoxifeno (también el tamoxifeno NOLVADEX®), el raloxifeno (EVISTA®), el droloxifeno, el 4-h?drox?tamox?feno, el tpoxifeno, el keoxifeno, el LY 117018, la onapnstona y el toremifeno Q7ARESTON®); las antiprogesteronas; los reguladores a la baja de los receptores de estrógenos (ERDs); los antagonistas de los receptores de estrógenos como el fulvestrant (FASLODEX®); los agentes que oppmen o cieñan los ovapos, por ejemplo, los agonistas de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH) como el acetato de leuprohda (LUPRON® y ELIGARD®), el acetato de goserelma, el acetato de buserehna y la tppterehna; los antiandrógenos como la flutamida, la nilutamida y la bicalutamida y los inhibidores de la aromatasa que inhiben el enzima aromatasa, encargado de regular la producción de estrógenos en las glándulas adrenales, como, por ejemplo, las 4(5)-?m?dazolas, la ammoglutetimida, el acetato de megestrol (MEGASE®), el exemestano (AROMASEN®), la formestania, la fadrozola, la vorozola (RTVISOR®), la letrozola (FEMARA®) y la anastrozola (ARIMEDEX®). Además, esta definición de los agentes quimioterapéuticos incluye los bisfosfonatos como el clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®), el etidronato (DIDROCAL®), elNE-58095, el ácido zoledrómco/zoledronato (ZOMETA®), el alendronato (FOSAMAX®), el pamidronato (AREDIA®), el tiludronato (SKELID®) o el nsedronato (ACTONEL®), así como la troxacitabina (un análogo de la citosma nucleósida 1,3-d?oxolano); los oligonucleótidos antisentido, en particular los que inhiben la expresión génica en las mtas de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, como, por ejemplo, el PKC -alfa, el Raf, el H-Ras y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); las vacunas como THERATOPE® y las que se aplican para terapias génicas, por ejemplo, la ALLOVECTEN®, la LEUVECTIN® y la VAXED® ; el inhibidor de la topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®); el rmRH (por ejemplo, ABARELEX®); el ditosilato de lapatiniba (un inhibidor de molécula pequeña doble tirosma qumasa del ErbB-2 y el EGFR conocido también como GW572016) y las sales, los ácidos o los depvados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de las sustancias antepores. El término "citoquma" es un término genénco para aquellas proteínas, liberadas por una población de células, que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de estas citoqumas son las linfoquinas; las monoqumas; las ínterleuqumas OXs) como la DJ-1 Ja EL-la, la IL-2, la IL-3, la IL-4, la E -5, la IL-6, la IL-7, la IL-8, la IL-9, la IL-11, la E -12 y la EL-15, incluyendo la PROLEUKIN® rIL-2, la IL-4 humana y los mutantes de la EL-4 humana como, por ejemplo, un mutante que contenga una mutación en la región de la EL-4 que participa en la unión a la IL-2R gamma, por ejemplo, cuando Arg 21 cambia a un residuo Glu; un factor de necrosis tumoral como el TNF-OÍ O el TNF-j3 y otros factores pohpéptidos incluyendo el LE? y el ligando de kit (KL). En el contexto de la presente memona descnptiva, el término citoquma incluye proteínas de fuentes naturales o cultivos de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citoqumas de secuencia nativa, incluyendo entidades de molécula pequeña producidas por vía sintética y los denvados y las sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. El término "hormona" se refiere a hormonas pohpéptidas, que por lo general segregan los órganos glandulares con conductos. Entre estas hormonas se incluyen, por ejemplo, las hormonas del crecimiento como la del crecimiento humano, el crecimiento humano N-metionil y el crecimiento bovino; la hormona paratiroide, la tiroxma; la insulina; la promsulma; la relaxma; el estradiol; la terapia de sustitución de hormonas; los andrógenos como la calusterona, el propionato de dromostanolona, el epitiostanol, la mepitiostana o la testolactona; la prorrelaxina; las hormonas ghcoproteínas como la hormona de estimulación folicular Q^SH), la hormona de estimulación tiroidea (TSH) y la hormona luteinizante (LH); la prolactma; el lactógeno placentapo, el péptido asociado a la gonadotropina munna; la hormona de liberación de la gonadotropina; la inhibina; la activina; la sustancia inhibidora mullenana y la trombopoyetina En el contexto de la presente memona descnptiva, el término hormona incluye proteínas de fuentes naturales o cultivos de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las hormonas de secuencia nativa, incluyendo entidades de molécula pequeña producidas por vía sintética y los depvados y las sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. El término "factor de crecimiento" se refiere a las proteínas que fomentan el crecimiento e incluyen, por ejemplo, el factor de crecimiento hepático; el factor de crecimiento fibroblástico; el factor de crecimiento endotehal vascular; los factores de crecimiento nervioso como el NGF-/3; el factor de crecimiento denvado de las plaquetas; los factores de crecimiento transformador (TGFs) como el TGF-a y el TGF- 3; los factores I y II de crecimiento similar a la insulina; la eptropoyetma (EPO); los factores osteoinductivos; los mterferones como el interferón-a, el -ß y el -?, los factores de estimulación de colonias (CSFs) como el macrófago-CSF (M-CSF); el granulocito-macrofago-CSF (GM-CSF) y el granulocito-CSF (G-CSF). En el contexto de la presente memopa descnptiva, el término factor de crecimiento mcluye proteínas de fuentes naturales o cultivos de células recombmantes y equivalentes biológicamente activos del factor de crecimiento de secuencia nativa, incluyendo entidades de molécula pequeña producidas por vía sintética y los depvados y las sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. El término "mtegpna" se refiere a una proteína receptora que permite a las células tanto unirse como responder a la matpz extracelular e interviene en diversas funciones celulares como la curación de hepdas, la diferenciación celular, la migración de células tumorales y la apoptosis. Forman parte de una gran familia de receptores de adhesión celular que participan en la matpz extracelular de las células y las interacciones entre células. Las integpnas funcionales constan de dos subumdades de glicoproteína transmembrana, llamadas alfa y beta, que están unidas de forma no covalente. Todas las subunidades alfa comparten cierta homología entre sí, al igual que las beta. Los receptores siempre contienen una cadena alfa y una beta. Ejemplos de estos receptores serían el Alphaóbetal, el Alpha3betal, el Alpha7betal, el LFA-1 etc. En el contexto de la presente memona descpptiva, el término "mtegpna" incluye proteínas de fuentes naturales o cultivos de células recombmantes y equivalentes biológicamente activos de la mtegnna de secuencia nativa, incluyendo entidades de molécula pequeña producidas por vía sintética y los depvados y las sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. Para los propósitos de la presente memopa descnptiva, el "factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa)" se refiere a la molécula TNF-alfa humana que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se descpbe en Pemnca y col , Nature, 312:721 (1984) o Aggarwal y col, JBC, 260:2345 (1985). En la presente memopa descpptiva, un "inhibidor del TNF-alfa" es un agente que inhibe, hasta cierto punto, una función biológica del TNF-alfa, normalmente a través de la unión a dicha molécula y neutralizando su actividad. Ejemplos de inhibidores del TNF específicamente estudiados en la presente memona descpptiva son el etanercept (ENBREL®), el ínfliximab (REMICADE®) y el adahmumab (HUMIRA™) Los ejemplos de "medicamentos antirreumáticos modificadores de la enfermedad" o "DMARDs" incluyen la hidroxicloroquina, la sulfasalazina, el metotrexato, la leflunomida, el etanercept, el mfhximab, la azatioppna, la D-penicilamina, las sales doradas (orales), las sales doradas (intramusculares), la mmocichna, la ciclosponna incluyendo la ciclospopna A y la tópica, la proteína A estafilococal (Goodyear y Silverman, J Exp Med , 197, (9), páginas 1125-39 (2003)), incluyendo las sales y los denvados de la misma, etc. Ejemplos de "medicamentos antnnflamatopos no esteroides" o "NSAEDs" serían la aspinna, el ácido acetilsahcíhco, el íbuprofeno, el naproxeno, la indometacina, el sulindac, la tolmetina, los inhibidores de COX-2 como el celecoxib (CELEBREX®), labenzenosulfonam?da4-(5-(4-met?lfen?l)-3- (tpfluoromet?l)-lH-p?razol-l -yl) y el valdecoxib (B EXTRA®) y el meloxicam (MOBIC®), incluyendo las sales y los denvados del mismo, etc. En la presente memona descpptiva, los ejemplos de "antagonistas o anticuefos de la integpna" incluirían un anticuefo LF A- 1 , como el efahzumab (RAPTEVA®), comercializado por Genentech, o un anticuefo de la integpna alfa 4 como el natahzumab (ANTEGREN*8), comercializado por Biogen, o los depvados de la fenüalanina diazacíchca (documento WO 2003/89410), los depvados de la fenilalamna (documentos WO 2003/70709, WO 2002/28830, WO 2002/16329 y WO 2003/53926), los depvados del ácido fenilpropiónico (documento WO 2003/10135), los depvados de la enamina (documento WO 2001/79173), los depvados del ácido propanoico (documento WO 2000/37444), los depvados del ácido alcanoico (documento WO 2000/32575), los denvados del fenil sustituido (patente de EE.UU. nos 6.677.339 y 6.348.463), los depvados de la amina aromática (patente de EE.UU. n° 6.369.229), los pohpéptidos del dominio de la disintegnna ADAM (documento US2002/0042368), los anhcuefos de la _?ntegnna alfavbeta3 (documento EP 633945), los denvados de los aminoácidos bicíclicos con puente aza (documento WO 2002/02556), etc. Los "corticosteroides" se refieren a cualquiera de las diversas sustancias sintéticas o de producción natural, con la estmctura química general de los esteroides, que emula o aumenta los efectos de los corticosteroides que se producen de forma natural. Los ejemplos de corticosteroides sintéticos incluirían la prednisona, la prednisolona (incluyendo la metilprednisolona, como el succinato sódico de metilprednisolona SOLU-MEDROL®), la dexametasona o la dexametasona tnamcinolona, la hidrocortisona y la betametasona. En la presente memona descnptiva, los corticosteroides preferentes serían la prednisona, la metilprednisolona, la hidrocortisona o la dexametasona. Tal como se emplea en la presente memopa descpptiva, el término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad del anticuefo o antagonista que resulta eficaz para tratar la EII. Por lo general, las cantidades eficaces se determinan por el efecto que tienen en comparación con el efecto observado cuando se administra una composición sin ingredientes activos (es decir, un control) a un individuo con una situación similar. Un "prospecto" se refiere a las instrucciones que habitualmente se incluyen en los envases comerciales de los productos terapéuticos y contienen información sobre las indicaciones, el uso, la dosificación, la posología, las contraindicaciones, otros productos terapéuticos que pueden combinarse con el producto envasado y/o advertencias relativas al uso de dichos productos terapéuticos, etc. Un "medicamento" es un fármaco activo para tratar la EII, sus síntomas o efectos secúndanos.

II. Terapia de la EII La invención de la presente memona descnptiva ofrece un procedimiento para tratar la EII en un sujeto humano que consiste en administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un anticuefo (o antagonista) que se une a un marcador de la superficie de las células B, como el CD20. En particular, la invención ofrece procedimiento para tratar los casos moderados-graves de la enfermedad inflamatopa intestinal (EII) en un sujeto humano que consiste en administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuefo (o antagonista) del CD20 y cuyo resultado es una respuesta clínica y/o la remisión de la enfermedad. Esta administración también puede reducir las células B de la mucosa colónica, los parches de Peyer, los tejidos u órganos hnfoides secúndanos, como los nodulos linfáticos y el bazo, y la sangre, pero especialmente de la mucosa colónica del sujeto. La Efl puede adoptar las formas de colitis ulcerativa (CU) o enfermedad de Crohn, pero preferentemente CU. El sujeto tratado en la presente memopa descnptiva puede tener formas activas de EII, CU o enfermedad de Crohn. Por lo general, el nivel de la enfermedad del sujeto tratado, en cualquiera de sus tres modalidades, será moderado-grave. Además, el sujeto podría padecer una EII, una CU o una enfermedad de Crohn refractapas a los esteroides y/o dependientes de éstos. Los sujetos tratados en la presente memona descnptiva pueden: haber recibido un diagnóstico de EII >6 meses antes de la exploración; presentar >20 cm de enfermedad activa en la sigmoidoscopia de la exploración; tener la enfermedad activa definida por un resultado del LAE de entre >6 y <11 , con >2 para la hemorragia rectal y >2 para la sigmoidoscopia flexible; haber recibido tratamiento para la CU con corticosteroides durante los dos años antenores a la exploración; haber recibido un tratamiento con una intensidad supenor a una dosis equivalente de prednisona de 20 mg/día durante al menos dos semanas; ser resistente o refractano al etanercept, el ínfliximab o el adahmumab; haber recibido tratamiento con una dosis estable de aminosahcilato durante >3 semanas; haber recibido tratamiento con una dosis estable de corticosteroides orales durante >2 semanas; haber recibido tratamiento con 6-MP durante un período de 3 meses y una dosis estable de dicho medicamento durante >4 semanas o haber recibido un tratamiento con azatioppna durante un período de 3 meses y una dosis estable durante >4 semanas.

El tratamiento estándar para sujetos con CU activa moderada-grave es una terapia con dosis estándar de: un aminosahcilato, un corticosteroide oral, 6-mercaptopunna (6-MP) y/o azatioppna. La terapia con un anticuefo del CD20, tal como se desvela en la presente memona descpptiva, mejorará la remisión de la enfermedad (control rápido de la enfermedad y/o remisión prolongada) y/u ofrecerá una respuesta clínica supepor a la obtenida con el tratamiento estándar para estos sujetos. La administración del anticuefo puede dar como resultado la remisión de la enfermedad, alcanzándose dicha remisión alrededor de la semana 8. Preferentemente, el tiempo de remisión de la enfermedad es infenor al que tarda un sujeto que no se trate con el anticuefo del CD20. Además, la duración de la remisión es preferentemente mayor que la de un sujeto que no se trate con el anticuefo del CD20. Por ejemplo, la duración de la remisión podría ser de al menos 24 semanas, mejor aún al menos 48 e idealmente al menos 2 años, desde el tratamiento inicial o la manifestación de la remisión. La remisión puede definirse como una sigmoidoscopia que dé 0 ó 1 como resultado y/o una hemorragia rectal que dé 0 como resultado. La administración del anticuefo puede dar como resultado una respuesta clínica, obteniéndose dicha respuesta, por ejemplo, alrededor de la semana 8. En la presente memopa descpptiva, la respuesta clínica puede definirse como una reducción del resultado del índice de actividad de la enfermedad (LAE), disminuyendo, por ejemplo, en 3 o más puntos En una realización, el sujeto jamás se ha tratado antenormente con un anticuefo del CD20.

Preferentemente, el sujeto no padece malignidad en las células B. El sujeto también es preferentemente una persona que no padezca una enfermedad autoimmune, aparte de la EII, la CU o la enfermedad de Crohn. La invención también ofrece un procedimiento para reducir el resultado del índice de actividad de la enfermedad (IAE) en un sujeto humano con colitis ulcerativa (CU) activa que consiste en administrar al sujeto un anticuefo del CD20 en una cantidad eficaz para reducir ese resultado del EAE.

Preferentemente, el sistema del resultado del IAE es como el de la Tabla 2 de la presente memona descpptiva, y la administración del anticuefo del CD20 reduce el resultado del IAE en 3 o más puntos.

Adicionalmente, el procedimiento también sirve para tratar la enfermedad inflamatona intestinal (EII) activa en sujetos humanos con un(os) n?vel(es) atíp?co(s) de anticuefos citoplasmáticos antmeutrófilos pennucleares (p-ANCA) y/o autoanticuefos anti-isoforma 5 humana de la tropomiosma (hTM5). La administración de un anticuefo del CD20 en el sujeto reduce eficazmente su(s) n?vel(es) de anticuefos p-ANCA y/o ant?-hTM5. El médico determinará la dosis exacta de acuerdo con los estándares aceptados, teniendo en cuenta la naturaleza y gravedad del estado que deba tratarse, la clase de antagonista o anticuefo, las características del sujeto, etc. Cualquier profesional con aptitudes normales será capaz de determinar dicha dosis. Preferentemente, el anticuefo se administra por vía sistemática, intravenosa o subcutánea. En función de la vía y el procedimiento de administración, el antagonista o anticuefo se puede administrar en una dosis única, como infusión prolongada o intermitentemente a lo largo de un período amplio. La administración intravenosa se realizará normalmente mediante inyección o infusión en bolo a lo largo de un período típico de vanas horas. Se pueden emplear formulaciones de liberación sostenida.

En una realización preferente, el procedimiento comprende la administración de una o más dosis de entre 200 y 2.000 mg, mejor aún de entre 500 y 1.500 mg e idealmente entre 750 y 1.200 mg. Por ejemplo, se pueden administrar una o cuatro dosis, o sólo una o dos. Según esta realización, el anticuefo podría administrarse dentro de un período de alrededor de un mes, mejor aún entre 2 y 3 semanas e idealmente unas 2 semanas. Cuando se administre más de una dosis, la última (por ejemplo, la segunda o tercera) se realiza preferentemente enfre 1 y 20 días, mejor aún entre 6 y 16 días e idealmente entre 14 y 16 días después de la administración de la dosis antenor. Las dosis separadas se administran preferentemente dentro de un período total de entre 1 día y cuatro semanas, y mejor aún enfre 1 y 20 días (por ejemplo, un período de 6-18 días). La cantidad de cada una de estas dosis separadas del anticuefo debería ser preferentemente de entre 200 y 2.000 mg, mejor aún entre 500 y 1.500 mg e idealmente entre 750 y 1.200 mg. De todos modos, tal como se ha indicado antepormente, estas cantidades sugepdas del antagonista o anticuefo están sujetas en gran medida al cntepo terapéutico. El factor clave para seleccionar una dosis y programación apropiadas es el resultado obtenido, tal como se ha indicado antenormente. Por ejemplo, al pnncipio, tal vez se requieran dosis relativamente supepores para el tratamiento de la EII activa. No obstante, una dosis postepor puede ser supepor a otra antepor. A fin de obtener los resultados más eficaces, el antagonista o anticuefo se administra por lo general lo más rápidamente posible tras la ppmera señal, diagnóstico, apanción o manifestación de la enfermedad o trastorno o durante sus remisiones. Por tanto, la invención ofrece un procedimiento para tratar la enfermedad mflamatona intestinal (EII) en un sujeto humano con EII activa que consiste en administrar al paciente sólo una o dos dosis de un anticuefo del CD20, obteniendo ya como resultado tras d?cha(s) dosis la remisión de la enfermedad o una respuesta clínica Preferentemente, estas dosis se administran intravenosa (EV) o subcutáneamente (SC). Si se administra un par de dosis intravenosas, la cantidad de cada una de ellas debería ser preferentemente de entre 200 y 2.000 mg. El antagonista o anticuefo se administra por cualquier medio apto, incluyendo las vías parenteral, subcutánea, mtrapentoneal, intratecal, mtraarticular e intranasal, por inhalación y, si se desea para un tratamiento inmunosupresor local, la administración también puede ser infralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, infraartepal, mtrapentoneal o subcutánea. Además, el antagonista o anticuefo podría administrarse correctamente mediante infusión de efecto rápido, por ejemplo, con dosis cada vez menores del antagonista o anticuefo. Preferentemente, la dosificación se realiza mediante inyecciones, mejor aún por vía intravenosa o subcutánea, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. El sujeto puede volver a tratarse con el antagonista o anticuefo, recibiendo más de una exposición, al menos dos, o un conjunto de dosis; por ejemplo, entre 2 y 60 exposiciones, más particularmente entre 2 y 40 e idealmente enfre 2 y 20. En una realización, se puede aplicar cualquier segundo tratamiento cuando las señales o los síntomas de la enfermedad reaparezcan, ésta ya no remita y/o los niveles de los anticuefos p-ANCA o ant?-hTM5 asciendan, etc. En ofra realización, se puede aplicar cualquier segundo tratamiento a intervalos definidos. Por ejemplo, las exposiciones postepores se pueden administrar en vanos intervalos, como, por ejemplo, enfre 24 y 28 semanas o enfre 48 y 56, incluso más tiempo. Preferentemente, estas exposiciones se administran a intervalos de alrededor de 24 a 26, 38 a 42 ó 50 a 54 semanas cada uno. En una realización, cada exposición de antagonista o anticuefo se administra como dosis única. En otra realización alternativa, cada exposición de antagonista o anticuefo se administra como dosis separada. De todas formas, no es necesano que cada exposición de antagonista o anticuefo se administre como dosis única o separada. El antagonista preferente es un anticuefo. En los procedimientos establecidos en la presente memopa descpptiva, el anticuefo del CD20 podría ser un anticuefo desnudo o conjugarse con ofra molécula como un agente citotóxico o una citoquina. Preferentemente, el anücuefo es un anticuefo desnudo e intacto. En la presente memopa descpptiva, el anticuefo del CD20 preferente es un anticuefo del CD20 humano, humanizado o quimépco, más preferentemente ntuximab, el anticuefo 2H7 humanizado, el anticuefo humano del CD202F2 (HuMax-CD20) (Genmab) y el anticuefo A20 humanizado (Immunomedics). Los más preferentes son el ntuximab o el 2H7 humanizado.

En otra realización más de todos los procedimientos de la presente memona descnptiva, el sujeto jamás se ha tratado antepormente con medicamentos, como un agente para tratar la EII, y/o jamás se ha fratado antenormente con un antagonista o anticuefo de un marcador de la superficie de células B (por ejemplo, jamás se ha tratado antenormente con un anticuefo del CD20). En cualquiera de los procedimientos de la presente memona descpptiva, se puede administrar al sujeto, junto con el antagonista o anticuefo que se une al marcador de la superficie de células B, una cantidad eficaz de un segundo medicamento (cuando el antagonista o anticuefo que se une al marcador de la superficie de células B (por ejemplo, el anticuefo del CD20) sea un ppmer medicamento). La clase de este segundo medicamento depende de diversos factores, incluyendo la clase de EII, la gravedad de la misma, el estado y la edad del sujeto, la clase y dosis del ppmer medicamento empleado, etc. Ejemplos de estos medicamentos adicionales u otras terapias serían otro agente para tratar la EflJ un agente quimioterapéutico, un medicamento de la clase del interferón como el interferón-alfa (por ejemplo, de Amanllo Biosciences, Inc.), el IFN-beta-la (REBEF® y AVONEX®) o el EFN-beta-lb (BETASERON®), un ohgopéptido como el acetato de glatiramero (COPAXONE®), un agente de bloqueo del ligando CD40-CD40, un agente citotóxico (como una mitoxantrona (NOVANTRONE®), el metotrexato, la ciclofosfamida, el clorambucil, la leflunomida y la azatioppna), uno o más agentes inmunosupresores (por ejemplo, la azatiopnna, la 6-mercaptopupna o la ciclosponna), la inmunoglobulina intravenosa (gammaglobulma), una terapia de reducción de hnfocitos (por ejemplo, la mitoxantrona, la ciclofosfamida, los anticuefos CAMPATH™, el ant?-CD4 y la cladpbina), un polipéptido constmido con al menos dos dominios que comprendan un antígeno desinmunizado y autoneactivo o su fragmento reconocido específicamente por los receptores Ig de las células B autopeacüvas (documento WO 2003/68822), la irradiación total del cuefo, el trasplante de médula ósea, un antagonista o anticuefo de la mtegnna (por ejemplo, un anticuefo LFA-1 como el efahzumab (RAPTEVA®), comercializado por Genentech, o un anticuefo de la mtegpna 4 alfa como el natalizumab (ANTEGREN®), comercializado por Biogen Idee, u ofros indicados antenormente), un esteroide como los corticosteroides (por ejemplo, la metilprednisolona como el succinato sódico de metilpredmsolona SOLU-MEDROL™ para inyección, la prednisona como la prednisona en dosis bajas, la dexametasona o los glucocorticoides, incluyendo la terapia sistémica con corticosteroides), una terapia inmunosupresora sin reducción de linfocitos (por ejemplo, MMF o ciclosponna), un medicamento reductor de colesterol de la clase "estatina" (que incluye cepvastatina (BAYCOL™), fluvastatina (LESCOL™), atorvastatma (LEPITOR™), lovastatina (MEV ACOR™), pravastatma (PRAVACHOL™) y simvastatma (ZOCOR™)), el estradiol, la testosterona (opcionalmente en dosis elevadas; Stuve y col. Neurology 8:290-301 (2002)), un andrógeno, la terapia de sustitución de hormonas, un inhibidor del TNF como el etanercept (ENBREL®), el infliximab (REMICADE®) y el adahmumab (HUMERA™), un medicamento antirreumático modificador de enfermedades (DMARD), un medicamento antnnflamatopo no esteroide (NSAED), la plasmaféresis o intercambio de plasma, la tpmetoppma-sulfametoxazola (BACTREM™, SEPTRA™), el micofenolato mofetil, los bloqueadores de H2 o los inhibidores de la bomba de protones (durante el uso de la terapia inmunosupresora potencialmente ulcerogénica), la levotiroxina, la ciclosponna A (por ejemplo, SANDEMMUNE®), un análogo de la somatastatina, la citoquina, la citoquina o un anticuefo o antagonista receptor de citoquina, un antimetabohto, la ci gía rehabihtativa o colectomía, la radioyodma, la tiroidectomía, un antagonista del BAFF como los anticuefos o las ínmunoadhesmas del BAFF o el BR3, un receptor ant?-CD40 o un ligando ant?-CD40 (CDl 54), un antagonista o anticuefo receptor ant?-EL-6, un anticuefo ant?-EL-2 como el dachzumab, otro antagonista o anticuefo de la superficie de células B como un anticuefo humanizado 2H7 u otro anticuefo humanizado o humano del CD20 con ntuximab, los corticosteroides orales (por ejemplo, dentro de los 2 años antepores al tratamiento inicial con el anticuefo o antagonista del CD20), la prednisona (por ejemplo, una dosis equivalente de prednisona de 20 mg/día durante al menos 2 semanas), el etanercept, el ínfliximab, el adahmumab, el aminosalicilato (por ejemplo, dosis estable durante >3 semanas), los corticosteroides orales (por ejemplo, dosis estable durante >2 semanas), el 6-MP (por ejemplo, tratamiento durante un período de 3 meses, con una dosis estable durante >4 semanas), la azatioppna (por ejemplo, tratamiento durante un período de 3 meses, con una dosis estable durante >4 semanas), un inhibidor de la calcineunna, la ciclospopna, el tacrohmus, el sirolimus, el metotrexato, el micofenolato mofetil, una preparación rectal tópica, una terapia no biológica de reducción celular como el ADACOLUMN®, un antibiótico, un antidiarreico, un agente de unión del ácido bílico como la colestiramina, el 5-ASA oral y/o tópico, un esteroide oral y/o tópico, el MLN-02, la mesalamma, una crema de cortisona, un enema de hidrocortisona, la sulfasalazma, la alsalazma, la balsalazida, la metilprednisolona, la hidrocortisona, el ACTH, los corticosteroides intravenosos, el GELTEX™ (Genzyme), un anticuefo ant?-CD3 como el visihzumab (NUVION®), el OPC-6535, el CBP 1011, la tahdomida, el ISIS 2302, el BXT-51072, un factor de crecimiento como el factor de crec?rmento-2 de la queratinocita (KGF-2, REPEFERMIN™), el RPD-58, el antegrén, el FK-506, etc. Los segundos medicamentos preferentes incluyen uno, dos, fres o cuatro de: un aminosahcilato, un corticosteroide oral, 6-mercaptopunna (6-MP) y azaüoppna En un procedimiento preferente de "terapia de combinación" de la presente memona descnptiva, la invención proporciona un procedimiento para tratar la enfermedad mflamatona intestinal (EII) en un sujeto humano con EII activa que consiste en administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuefo del CD20 y, postenormente, una cantidad eficaz de un segundo medicamento seleccionado del gmpo integrado por un aminosahcilato, un corticosteroide oral, la 6-mercaptopupna (6-MP) y la azatiopnna. Todos estos segundos medicamentos pueden usarse combinándose unos con otros o por sí solos con el ppmer medicamento, de modo que la expresión "segundo medicamento", tal como se emplea en la presente memona descnptiva, no significa que sea el único medicamento además del ppmero, respectivamente. Por tanto, no es necesano que el segundo medicamento sea un solo medicamento, sino que puede comprender o constar de más de uno. Estos segundos medicamentos, tal como se establece en la presente memopa descpptiva, se utilizan normalmente con las mismas dosis y vías de administración indicadas antenormente en la presente memona descnptiva o aproximadamente entre el 1 y el 99% de las dosis empleadas hasta este momento. Si finalmente se utilizan estos segundos medicamentos, como opción, se usan en cantidades infepores a las correspondientes en caso de que el pnmer medicamento no estuviese presente, especialmente en dosis postenores a la dosis inicial del pnmer medicamento a fin de eliminar o reducir los efectos secúndanos que éste causara Por ejemplo, la terapia con un anticuefo del CD20 permite de acuerdo con la presente memopa descnptiva disminuir o interrumpir la administración de esteroides.

La administración combinada incluye en la presente memopa descpptiva la coadmimstración, utilizando formulaciones separadas o una única formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden, en que preferentemente existe un período en el cual ambos (o todos los) agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. En cuanto al procedimiento de segundo tratamiento de la presente memona descpptiva, donde se administra como segundo medicamento una cantidad eficaz de un conjunto de dosis de un anticuefo, se puede administrar con cualquier conjunto de dosis, por ejemplo, sólo con uno o más de uno. En una realización, el segundo medicamento se administra con el conjunto inicial de dosis. En otra realización, el segundo medicamento se administra con el conjunto inicial de dosis y el segundo. En otra realización más, el segundo medicamento se administra con todos los conjuntos de dosis. La administración combinada de un segundo medicamento incluye la coadministración (administración conc rente), utilizando formulaciones farmacéuticas separadas o una única, y la administración consecutiva en cualquier orden, en que preferentemente existe un período en el cual ambos (o todos los) agentes activos (medicamentos) ejercen simultáneamente sus actividades biológicas El anticuefo o antagonista de la presente memona descnptiva se administra por cualquier medio apto, incluyendo las vías parenteral, tópica, subcutánea, intrapeptoneal, intrapulmonar, intranasal y/o mtralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa (?.v.), infraartenal, intrapeptoneal o subcutánea. La administración mtratecal también se contempla (véase, por ejemplo, el documento US 2002/0009444, Gnllo-López, A., referente a la introducción infratecal de un anticuefo del CD20). Además, el antagonista o anticuefo podría administrarse correctamente mediante infusión de efecto rápido, por ejemplo, con dosis cada vez menores del anücuefo o antagonista. Preferentemente, la dosis se administra vía intravenosa o subcutánea y mejor aún mediante ?nfus?ón(es) ?ntravenosa(s). Si se dispone de múltiples conjuntos de dosis de anticuefos, cada uno de ellos puede ofrecerse a través del mismo medio de administración o uno distinto. En una realización, cada conjunto de dosis se administra por vía intravenosa. En otra realización, cada conjunto de dosis se administra por vía subcutánea. En ofra realización más, los conjuntos de dosis se administran por vía tanto intravenosa como subcutánea, y los anticuefos pueden ser los mismos o diferentes. A continuación presentamos una discusión de los procedimientos para producir, modificar y formular estos antagonistas y anticuefos. III. Producción de antagonistas y anticuerpos Los procedimientos y artículos fabpcados de la presente invención utilizan, o incoforan, un antagonista o anticuefo que se une a un marcador de la superficie de células B. Por consiguiente, aquí descpbiremos los procedimientos para generar estos antagonistas o anticuefos. El marcador de la superficie de células B se que empleará para producir, o examinar, antagonistas o anticuefos podría ser, por ejemplo, una forma soluble del antígeno, o una porción del mismo, que contenga el epítopo deseado. Como alternativa, o adicionalmente, las células que expresan en su superficie un marcador de la superficie de células B se pueden usar para generar, o examinar, antagonistas o anticuefos. Otras formas del marcador de la superficie de células B útiles para generar antagonistas o anticuefos serán obvias para los expertos en la matena. Preferentemente, el marcador de la superficie de células B es el antígeno CD20. Si bien el antagonista preferente es un anticuefo, en la presente memona descnptiva también se contemplan otros antagonistas aparte de los anticuefos. Por ejemplo, el antagonista puede comprender un antagonista de molécula pequeña opcionalmente fusionado, o conjugado, con un agente citotóxico (como los que se descnben en la presente memona descnptiva). Las bibliotecas de moléculas pequeñas se pueden cotejar con el marcador de la superficie de células B de interés en la presente memona descpptiva a fin de identificar una molécula pequeña que se una a ese antígeno. También es posible seguir examinando aún más las propiedades antagonistas de la molécula pequeña y/o conjugarla con un agente citotóxico. El antagonista también podría ser un péptido generado por diseño racional o reproducción de imágenes de fago (véase, por ejemplo, el documento WO98/35036 publicado el 13 de agosto de 1998). En una realización, la molécula elegida podría ser una "emulación de la CDR" o un análogo del anticuefo diseñado sobre la base de las CDRs de un anticuefo. Si bien estos péptidos pueden ser antagonistas por sí mismos, el péptido podría fusionarse opcionalmente con un agente citotóxico a fin de aumentar o mejorar sus propiedades antagonistas. A continuación se descpben ejemplos de las técnicas para producir anticuefos utilizadas de acuerdo con esta invención. (i) Anticuerpos peticiónales Los anticuefos pohclonales se producen preferentemente en animales mediante inyecciones múltiples subcutáneas (sc) o intrapeptoneales (íp) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que sea inmunogénica en la especie que se pretende inmunizar, por ejemplo, la hemocianina de la lapa cahforniana (keyhole hmpet), la albúmina sénca, la tiroglobulma bovina o un inhibidor de la tnpsma de la soja utilizando un agente bifuncional o denvativo, por ejemplo, el éster de maleimidobenzol sulfosuccmimida (conjugación a través de residuos de cisterna), la N-hidroxisuccmimida (a través de residuos de hsma), el glutaraldehído, el anhídpdo succínico, el SOCl2 o el R1N=C=NR, donde R y R1 son gmpos alquilo diferentes. Los animales se inmunizan contra el antígeno, los conjugados inmunogénicos o los denvados combinando, por ejemplo, 100 ó 5 µg de la proteína o el conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con tres volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución en múltiples puntos vía mfradérmica Un mes más tarde, los animales se refuerzan con entre 1/5 y 1/10 de la cantidad ongmal del péptido o el conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples puntos Entre siete y catorce días más tarde, los animales se desangran, y el suero se analiza para titular los anücuefos. Los animales se refuerzan hasta obtener los niveles adecuados de titulación. Preferentemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un reactivo reticulante diferente. Los conjugados también se pueden obtener en cultivos celulares recombinantes como fusiones proteínicas. También, los agentes agregantes como el alumbre se utilizan adecuadamente para incrementar la respuesta inmune. (ü) Anticuerpos monoclonales Los anticuefos monoclonales se obtienen a partir de una población de anticuefos sustanclalmente homogéneos, es decir, los anticuefos individuales que forman la población son idénticos excepto en posibles mutaciones de formación natural que podrían estar presentes en cantidades insignificantes. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anücuefo de que no es una mezcla de anticuefos discretos. Por ejemplo, los anticuefos monoclonales se pueden obtener mediante el procedimiento del hibpdoma descnto por ppmera vez en Kohier y col , Nature, 256:495 (1975), o los procedimientos del ADN recombmante (patente de EE UU. n° 4.816.567). En el procedimiento del hibndoma, un ratón u otro animal anfitnón apropiado, como un hámster, se inmuniza como se descnbió antenormente para obtener hnfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuefos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Después, los hnfocitos se fusionan con las células de mieloma utilizando un agente fusionador adecuado, como por ejemplo glicol de pohetileno, para formar una célula de hibndoma (Goding, Monoclonal Antibodies - Principies and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)). Las células de hibndoma preparadas de este modo se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contenga una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células parentales de mieloma sin fusionar. Por ejemplo, si las células parentales de rmeloma no poseen el enzima hipoxantina-guanina-fosforpbosil-transferasa OHGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibn domas generalmente incluirá hipoxantma, ammoptenna y timidma (medio HAT), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células con déficit de HGPRT. Las células de mieloma preferentes son aquéllas que se fusionan eficazmente, soportan altos niveles estables de producción de anticuefos por parte de las células productoras de anticuefos seleccionadas y son sensibles a un medio como el HAT. Enfre éstas, las líneas celulares de mieloma preferentes son líneas de mieloma munno, como las depvadas de los tumores de ratones MOPC-21 y MPC-11 disponibles a través del Salk Institute Cell Distnbution Center, San Diego, California, EE.UU , y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles a través de la Amencan Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE UU. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma mupno-humano también se han descpto para la producción de anticuefos monoclonales humanos (Kozbor, J Immunol , 133 3001 (1984) y Brodeur y col , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)). El medio de cultivo en que las células de hibndoma crecen se analiza para la producción de anticuefos monoclonales dingidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuefos monoclonales producidos por las células de hibndoma está determinada por la mmunoprecipitación o un ensayo de unión in vitro, como el ensayo de radioinmunidad Q^IA) o el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA). La afinidad de unión de un anticuefo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis Scatchard de Munsony col , Ana Biochem , 107:220 (1980). Después de identificar que las células de hibndoma producen anticuefos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar limitando los procedimientos de dilución y pueden crecer mediante procedimientos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies Principies and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)) Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, un medio D-MEM o un RPMI-1640. Además, las células de hibpdoma pueden crecer en vivo en un animal como tumores con ascitis. Los anticuefos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, los fluidos ascíticos o el suero mediante procedimientos convencionales de punficación de mmunoglobulmas, como por ejemplo, la proteína- A-sefarosa, la cromatografía de hidroxilapatita, la electroforesis en gel, la diálisis o la cromatografía de afinidad. Los anticuefos monoclonales también pueden producirse a través de la recombmación. Se aisla el ADN que codifica los anticuefos monoclonales y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas ohgonucleotídicas capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anücuefos mupnos). Las células de hibndoma sirven como fuente preferente de dicho ADN Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que después se transfectan en células anfitpón, como por ejemplo las células E. cok, las células COS de monos, las células de ovapo de hámster chino (CHO) o las células de mieloma que, de otro modo, no producen la proteína de la inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuefos monoclonales en las células anfitnón recombinantes. En Skerra et al Curr Opinión in Immunol , 5 :256-262 (1993) y Plückthun, Immunol Revs , 130:151-188 (1992) hay artículos sobre la expresión recombinante en las bactepas del ADN que codifica el anticuefo. En otra forma de realización, los anticuefos monoclonales o fragmentos de anücuefos se pueden aislar de librerías de fagos de anücuefos generados mediante las técnicas descptas en McCaffertyy col , Nature, 348:552-554 (1990). En Clackson y col , Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y col , J Mol Bwl , 222.581-597 (1991) se descnbe el aislamiento de anticuefos munnos y humanos, respectivamente, utilizando librerías de fagos En publicaciones postepores también se descpbe la producción de anticuefos humanos de alta afinidad (rango nM) mediante la transposición de la cadena (Marksy col , Bw/Technology, 10.779-783 (1992)), así como la infección combmatona y la recombinación en vivo como estrategias para elaborar bibliotecas de fagos muy amplias (Waterhousey col , Nuc Acids Res , 21.2265-2266 (1993)). Por tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibpdoma de anticuefos monoclonales para aislar a éstos. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia de codificación de los dominios humanos constantes de las cadenas pesada y ligera en el lugar de sus secuencias munnas homologas (patente de EE.UU. n° 4.816.567; Mornson, y col, Proc Nati Acad. Sci. USA, 81:6851 ( 1984)), o uniendo de forma covalente a la secuencia de codificación de la mmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificación de un pohpéptido que no sea inmunoglobulina. Típicamente, dichos pohpéptidos que no son inmunoglobulmas se sustituyen por los dominios constantes de un anticuefo, o los dominios vanables de un punto de combinación con el antígeno de un anticuefo para crear un anticuefo bivalente quimépco que comprenda un punto de combinación con el antígeno con especificidad para un antígeno y otro punto de combinación con el antígeno con especificidad para otro antígeno diferente (ni) Anticuerpos humanizados Los procedimientos para humanizar anticuefos no humanos se han descnto en la matepa. Preferentemente, un anticuefo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él desde una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se conocen a menudo como residuos "importados", que generalmente se toman de un dominio vapable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y sus colaboradores (Jones y col, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmanny col , Nature, 332:323-327 (1988) y Verhoeyeny col , Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las secuencias de la región hipervapable por las secuencias correspondientes de un anticuefo humano. Por consiguiente, dichos anticuefos "humanizados" son anticuefos quimépcos (patente de EE.UU. n° 4.816.567) en que se ha sustituido sustanclalmente menos de un dominio vanable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana En la práctica, los anticuefos humanizados son generalmente anticuefos humanos en que algunos residuos de la región hipervapable y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos de puntos análogos de anticuefos de roedores. La elección de los dominios vapables humanos, tanto ligeros como pesados, para realizar los anticuefos humanizados es muy importante para disminuir la antigemcidad. De acuerdo con el procedimiento llamado "la más apta", la secuencia del dominio vanable de un anticuefo de un roedor se coteja con toda la librería de secuencias conocidas de dominios vanables humanos. La secuencia humana más parecida a la de los roedores se acepta entonces como la región de estructura humana (FR) para el anticuefo humanizado (Simsy col , J. Immunol, 151 :2296 (1993); Chothiay col, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro procedimiento utiliza una región de estructura concreta denvada de la secuencia de consenso de todos los anticuefos humanos de un subgrupo en particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura se puede utilizar para vanos anticuefos humanizados (Cartery col, Proc. Nati. Acad Sci USA, 89:4285 (1992); Presta y col , J. Immunol, 151:2623 (1993)). Es importante también que los anticuefos se humanicen con retención de alta afinidad con el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, siguiendo el procedimiento preferente, los anticuefos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y vanos productos humanizados conceptuales que utilizan modelos tpdimensionales de las secuencias parentales y las humanizadas. Los modelos tndimensionales de la mmunoglobuhna están comúnmente disponibles, y los expertos en la matena los conocen de sobra. Existen programas informáticos que ilustran y muestran las estructuras probables de conformación tndimensional de las secuencias de mmunoglobuhnas candidatas seleccionadas. La inspección de estas visuahzaciones permite analizar el papel que los residuos probablemente desempeñan en el funcionamiento de la secuencia de mmunoglobulma candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la mmunoglobulma candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de la FR se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias receptoras y de importación y lograr así la característica deseada del anticuefo, como por ejemplo una mayor afinidad con el (los) antígeno(s) diana. En general, los residuos de la región hipervanable influyen directamente y en mayor medida en la unión al antígeno. (iv) Anticuerpos humanos Como alternativa a la humanización, se pueden generar anticuefos humanos. Por ejemplo, actualmente es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, una vez inmunizados, de generar un repertopo completo de anticuefos humanos cuando no se produzca inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descnto que la eliminación homocigótica del gen de la región (JH) del anticuefo que se une a la cadena pesada en ratones quimépcos y mutantes de línea germinal inhibe por completo la producción de anticuefos endógenos. La transferencia de la matpz de genes humanos de la inmunoglobulina de línea germinal a uno de estos ratones mutantes de línea germinal ocasionará la producción de anticuefos humanos al actuar sobre el antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits y col , Proc Nati Acad Sci USA, 90:2551 (1993); Jakobovits y col , Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann y col , Year in Immuno , 7-33 (1993) y las patentes de EE.UU. nos 5.591.669, 5.589.369 y 5.545.807. Alternativamente, la tecnología de reproducción de imágenes de fagos (McCafferty y col , Nature 348-552-553 (1990)) se puede utilizar para producir anücuefos humanos y fragmentos de anücuefos in vitro, a partir de repertonos de genes de dominios vapables (V) de la mmunoglobuhna de donantes sin inmunizar. De acuerdo con esta técnica, los genes de los dominios V de los anücuefos se clonan dentro de la estmctura en un gen proteínico de revestimiento o bien mayor o menor de un bactepófago filamentoso, como el M 13 o fd, y se presentan como fragmentos de anücuefo funcionales en la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una sola fila del genoma del fago, las selecciones que se basan en las propiedades funcionales del anücuefo también dan lugar a la selección del gen que codifica el anücuefo que muestra esas propiedades. Por tanto, el fago emula algunas de las propiedades de la célula B. La reproducción de imágenes de fagos se puede realizar en diversos formatos; para su reseña consulte, por ejemplo, Johnson, Kevín S. y Chiswell, David J., Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Se pueden utilizar vanas fuentes de segmentos del gen V para la reproducción de imágenes de fagos. En Clackson y col , Nature, 352-624-628 (1991) se habla del aislamiento de una matnz diversa de anücuefos anti-oxazolona pertenecientes a una pequeña librería de combinación aleatopa de genes V denvados del bazo de ratones inmunizados. Se puede construir un repertono de genes V de donantes humanos no inmunizados, y se pueden aislar anücuefos contra una matpz diversa de antígenos (incluidos los autoantígenos) siguiendo esencialmente las técnicas descptas por Marks y col., J. Mol Bwl 222:581-597 (1991) o Gpffith y col, EMBO J. 12:725-734 (1993). Véanse, también, las patentes de EE.UU. nos 5.565.332 y 5.573.905. Los anücuefos humanos también se pueden generar mediante células B activadas in vitro (véanse las patentes de EE.UU. nos 5.567.610 y 5.229.275). (v) Fragmentos de anticuerpos Se han desarrollado vanas técnicas para la producción de fragmentos de anücuefos. Tradicionalmente, estos fragmentos se denvaban a través de la digestión proteolítica de anücuefos intactos (véase, por ejemplo, Mopmoto y col , Journal of Biochemical and Biophyswal Methods 24:107-117 (1992) y Brennany col , Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora se pueden producir directamente mediante células anfitnón recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anücuefos se pueden aislar de las librerías de fagos de anücuefos descptas antenormente. Como alternativa, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E coh y emparejarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cartery col , Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). Según otro planteamiento, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar directamente de cultivos de células anfitrión recombinantes. Otras técnicas para producir fragmentos de anücuefos serán obvias para los profesionales expertos En otras formas de realización, el anücuefo de elección es un fragmento Fv de cadena simple (scFv). Véase el documento WO 93/16185 y las patentes de EE.UU. nos 5.571.894 y 5.587.458. El fragmento de anücuefo puede ser también un "anücuefo lineal", por ejemplo, tal y como se descnbe en la patente de EE.UU. n° 5.641.870. Estos fragmentos de anücuefos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. (vi) Anücuefos biespecíficos Los anücuefos biespecíficos son anücuefos que tienen especificidades de unión con al menos dos epítopos diferentes Los anticuefos biespecíficos ejemplares se pueden unir a dos epítopos diferentes del marcador de la superficie de células B. Ofros de estos anticuefos se pueden unir a un ppmer marcador de la superficie de células B y después a un segundo. Como alternativa, un brazo de unión anti-marcador de células B se puede combinar con un brazo que se una a una molécula activadora de un leucocito, como por ejemplo una molécula receptora de células T (por ejemplo, la CD2 o la CD3) o los receptores Fc para IgG (FcyR), como por ejemplo el FcyRI (CD64), el Fc-yREE (CD32) y el Fc-RIU (CDl 6), para centrar los mecanismos de defensa celular en la célula B. Los anücuefos biespecíficos también se pueden utilizar para localizar agentes citotóxicos de la células B. Estos anücuefos poseen un brazo de unión al marcador de la célula B y un brazo que se une al agente citotóxico (por ejemplo, sapopna, anti-interferón-a, alcaloide de la vinca, cadena A de ncino, metofrexato o hapteno con un isótopo radiactivo). Los anticuefos biespecíficos se pueden preparar como anücuefos de longitud completa o fragmentos de anücuefos (por ejemplo, anücuefos biespecíficos F(ab')2). Los procedimientos para realizar anücuefos biespecíficos son conocidos en la matepa. La producción tradicional de anücuefos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de mmunoglobulma, en que las dos cadenas tienen distintas especificidades (Millstem y col , Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la vapedad aleatopa de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibndomas (cuadromas) producen una posible mezcla de 10 moléculas diferentes de anücuefos, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La pupficación de la molécula correcta, que generalmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante complicada, y la cantidad de producto que se obtiene es baja. En el documento WO 93/08829 y Traunecker y col , EMBO J , 10:3655-3659 (1991), se desvelan procedimientos similares.

Según un planteamiento distinto, los dominios vanables de anticuefos con las especificidades de unión deseadas (puntos de combinación anücuefo-antígeno) se fusionan a las secuencias de los dominios constantes de la mmunoglobuhna. La fusión se lleva a cabo preferentemente con un dominio constante de la cadena pesada de la mmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra CH2 y CH3. Preferentemente, la ppmera región constante de la cadena pesada (CH1) debe contener el punto necesano para la unión de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina, y, si se desea, de la cadena ligera también, se insertan en vectores de expresión separados y se cofransfectan a un organismo anfirnón adecuado Esto ofrece una gran flexibilidad a la hora de ajustar las proporciones mutuas de los fres fragmentos de pohpépüdos en realizaciones donde los índices desiguales de las tres cadenas de pohpépüdos utilizadas en la construcción proporcionan las producciones óptimas. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación de dos o todas tres cadenas de pohpépüdos en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de pohpépüdos en índices iguales da como resultado producciones elevadas o los índices no tienen particular importancia. En una realización preferente de este planteamiento, los anücuefos biespecíficos se componen de una cadena pesada de mmunoglobuhna híbpda con una pnmera especificidad de umón en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbpda (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro. Se descubnó que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de mmunoglobulma no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de mmunoglobulina en sólo una de las mitades de la molécula biespecífica proporciona una forma sencilla de separación Este planteamiento se desvela en el documento WO 94/04690 Para obtener mayores detalles sobre la generación de anücuefos biespecíficos, véase, por ejemplo, Sureshy col, Methods in Enzymology, 121 :210 (1986). Según otro planteamiento descnto en la patente de EE.UU. n° 5.731.168, la interfaz entre un par de moléculas de anticuefos se puede modificar para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de un cultivo celular recombinante. La mterfaz preferente comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante del anticuefo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales cortas de aminoácidos de la interfaz de la ppmera molécula del anücuefo se reemplazan con cadenas laterales más largas (por ejemplo, ürosma o tpptófano). Las "cavidades" compensatonas de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) larga(s) se crean en la mterfaz de la segunda molécula del anücuefo al reemplazar las cadenas laterales largas de aminoácidos por cadenas más cortas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar la producción del heterodímero con relación a otros productos finales no deseados como los homodímeros. Los anticuefos biespecíficos incluyen anücuefos reüculados o "heteroconjugados'J Por ejemplo, uno de los anücuefos del heteroconjugado se puede emparejar con la avidina, el otro con la bioüna. Estos anücuefos se han propuesto, por ejemplo, para conseguir que las células del sistema inmunitano actúen sobre células no deseadas (patente de EE.UU. n° 4.676.980) y para el tratamiento de la infección de VIH (documentos WO 91/00360 y WO 92/200373 y la patente europea EP 03089). Los anticuefos heteroconjugados se pueden obtener utilizando cualquier procedimiento de reticulación oportuno. Los agentes reticulantes adecuados se conocen bien en la matepa y se desvelan en la patente de EE UU. n° 4.676.980, junto con una sene de técnicas de reticulación. Las técnicas para generar anücuefos biespecíficos a partir de fragmentos de anücuefos también se han descnto en la bibliografía. Por ejemplo, los anücuefos biespecíficos se pueden preparar mediante un enlace químico. En Brennany col, Science, 229: 81 (1985) se descpbe un procedimiento en que los anücuefos intactos se escinden por vía proteolítica para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia de arsenito de sodio del agente que forma complejos con el diüol para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en depvados del tionitrobenzoato (TNB). Uno de los denvados del Fab'-3ENB se reconvierte entonces en Fab'-üol por reducción con mercaptoeülamina y se mezcla con una cantidad equimolar de otro depvado del Fab'-TNB para formar el anticuefo biespecífico. Los anücuefos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Los recientes progresos han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E coh, que se pueden emparejar químicamente para formar anticuefos biespecíficos. En Shalabyy col , J Exp Med , 175: 217-225 (1992) se descpbe la producción de una molécula F(ab')2 de anücuefo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secretó por separado a partir de E coli y se sometió a un emparejamiento químico dipgido in vitro para formar el anücuefo biespecífico. El anücuefo biespecífico formado de esta manera fue capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y células T humanas normales, así como desencadenar la actividad líüca de los hnfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano. También se han descpto vanas técnicas para realizar y aislar fragmentos de anücuefos biespecíficos directamente de cultivos celulares recombmantes. Por ejemplo, se han producido anücuefos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina. Kostelnyy col ,J Immunol , 148 (5): 1547-1553 (1992). Los pépüdos con cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos anücuefos diferentes mediante fusión génica Los homodímeros del anticuefo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se reoxidaron para formar los heterodímeros del anticuefo. Este procedimiento también se puede utilizar para producir los homodímeros del anücuefo. La tecnología "diacuefo" descpta por Hollmgery col , Proc Nati Acad Sci USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para realizar fragmentos de anücuefos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio vanable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio vapable de la cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento enfre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios compleméntanos VL y VH de otro fragmento, formando, por tanto, dos puntos de unión al antígeno. También se ha informado de otra estrategia para realizar fragmentos de anücuefos biespecíficos mediante el uso de dímeros Fv de cadena única (sFv). Véase Gmbery col , J Immunol , 152:5368 (1994). También se contemplan los anücuefos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anücuefos tnespecíficos Tutty col , J Immunol 147: 60 (1991). IV. Conjugados y otras modificaciones del antagonista o anticuerpo El antagonista o anücuefo usado en los procedimientos o incluido en los artículos fabncados en la presente memopa descnptiva se conjuga opcionalmente con otro agente, como un agente citotóxico o una citoquma (por ejemplo, EL2; véase, por ejemplo, el documento WO2005/016969). La conjugación se conseguirá habitualmente a través de un enlace covalente, la naturaleza precisa del cual vendrá determinada por la molécula agente y el punto de enlace en el pohpéptido del antagonista o anücuefo del CD20. Por lo general, un agente no peptídico se modifica mediante la adición de un enlazador que permite la conjugación con el antagonista o anücuefo del CD20 a través de sus cadenas laterales de aminoácidos, cadenas de carbohidratos o agrupaciones reactivas introducidas en el antagonista o anücuefo del CD20 por modificación química. Por ejemplo, se puede anexar un medicamento a través del gmpo e-armno de un residuo de hsina o un gmpo a-ammo libre, intercambiando un disulfuro por un residuo de cisteína o por oxidación de los dioles 1,2- en una cadena de carbohidratos con ácido penódico para permitir la anexión de un medicamento que contenga vanos nucleófilos a través de un enlace de base Schiff. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 4 256.833. Los agentes modificadores de proteínas incluyen los reactivos de arrimos (por ejemplo, los esteres, los isotiociantatos, los aldehidos y los hahdos de sulfoml), los reactivos del üol (por ejemplo, los denvados del haloacetil y las maleimidas) y los reactivos del ácido carboxíhco y los aldehidos. Los polipéptidos del antagonista o anücuefo del CD20 pueden unirse de forma covalente a agentes peptídicos a través de reactivos reticulares bifuncionales. Los reactivos heterobifuncionales se utilizan más comúnmente y permiten el emparejamiento controlado de dos proteínas distintas a fravés de dos porciones de reactivos diferentes (por ejemplo, un reactivo de aminos más üol, yodoacetamida o maleirmda). El uso de estos agentes de enlace se conoce bien en la matepal. Véase, por ejemplo, Bnnkley, supra, y la patente de EE.UU. n° 4.671.958. También pueden emplearse enlazadores peptídicos. Como alternativa, un polipépüdo de un antagonista o anücuefo del CD20 puede enlazarse con una porción peptídica a través de la preparación de un pohpéptido de fusión. Ejemplos de otros agentes de emparejamiento con proteínas bifuncionales serían el N-succ?n?m?d?l-3-(2-p?pd?ld?t?o) propionato (SPDP), el succ?n?m?d?l-4-QN-male?m?dometil) c?clohexano-1-carboxilato, el íminotiolano (IT), los denvados bifuncionales de los írmdoésteres (como el dimetil adipirmdato HCL), los esteres activos (como el disuccinimidil suberato), los aldehidos (como los glutaraldehídos), los compuestos de bis-azido (como la bis (p-azidobenzoil) hexanodiamma), los depvados de bis-diazonio (como la b?s-(p-d?azon?obenzo?l)-eülenod?amma), los dnsocianatos (como el 2,6-dnsoc?anato de tolueno) y los compuestos bis-acüvos de flúor (como el l,5-d?fluoro-2,4-dimtrobenceno). Alternativamente, se puede realizar una proteína de fusión que contenga el antagonista o anücuefo y el agente, por ejemplo, mediante técnicas de recombinación o síntesis de pépüdos. En la presente memopa descnptiva también se contemplan otras modificaciones del antagonista o anticuefo. Por ejemplo, el antagonista o anticuefo se puede enlazar con uno de vanos polímeros no proteináceos, por ejemplo, el polietilenglicol, el pohpropilenghcol, los pohoxialquilenos o los copolímeros de pohetilenglicol y polipropilenglicol. El antagonista o anticuefo desvelado en la presente memopa descpptiva también se puede formular como hposoma. Los hposomas que contienen el antagonista o anücuefo se preparan mediante procedimiento bien conocidos en la matena, como los descptos en Epstein y col , Proc. Nati Acad. Scí USA, 82:3688 (1985); Hwangy col , Proc Nati Acad Sci USA, 77:4030 (1980); las patentes de EE.UU. nos 4.485.045 y 4.544.545 y el documento W097/38731 publicado el 23 de octubre de 1997.

Los hposomas con tiempo de circulación mejorado se desvelan en la patente de EE.UU. n° 5.013.556.

Los hposomas particularmente útiles se pueden generar mediante el procedimiento de evaporación de fase inversa con una composición hpídica que comprenda fosfatidilcolma, colesterol y fosfatidiletanolamina depvada de PEG (PEG-PE). Los hposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' de un anticuefo de la presente invención se pueden conjugar con los hposomas tal como se descpbe en Martin y col , J Biol Chem 257- 286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro Opcionalmente, el hposoma puede contener un agente quimioterapéutico. Véase Gabizon y col , J National Cáncer Inst 81 (19):1484 (1989). Se contempla(n) también la(s) mod?ficac?ón(es) en las secuencias de aminoácidos de los antagonistas o anücuefos de proteínas o pépüdos descntos en la presente memona descnpüva. Por ejemplo, podría ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del antagonista o anticuefo. Las vanantes de la secuencia de aminoácidos del antagonista o anticuefo se pueden preparar introduciendo cambios nucleótidos adecuados en el ácido nucleico del antagonista o anücuefo, o mediante síntesis del péptido. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del antagonista o anticuefo. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se realiza para llegar a la construcción final, siempre que ésta posea las características deseadas. Los cambios en los aminoácidos también pueden alterar los procesos posfraduccionales del antagonista o anticuefo, como por ejemplo cambiar el número o la posición de los puntos de ghcosilación. Un procedimiento útil para identificar ciertos residuos o regiones del antagonista o anticuefo que son ubicaciones preferentes para la mutagénesis se llama "mutagénesis de barndo de alanina" tal como se descpbe en Cunnmgham y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989). Aquí, se identifica un residuo o gmpo de residuos de dianas (por ejemplo, residuos cargados como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen por un aminoácido con carga negativa o neutral (preferentemente alanma o polialanma) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Estas ubicaciones de los aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan entonces introduciendo más u otras vanantes en, o para, los puntos de sustitución. Por tanto, a pesar de que el sitio donde introducir una vanación de una secuencia de aminoácidos esté predeterminado, no es necesano que la naturaleza de la mutación per se tenga un carácter predeterminado. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un punto en particular, se realiza el barndo de alamna o la mutagénesis aleatona en el codón o región diana, y se examina si las vanantes expresadas del antagonista o anticuefo desarrollan la actividad deseada. Las inserciones en las secuencia de aminoácidos incluyen fusiones en los extremos a ino y/o carboxi terminal que varían en longitud desde un simple residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones dentro de la secuencia de uno o múltiples residuos de aminoácidos. Ejemplos de inserciones terminales serían un antagonista o anticuefo con un residuo metionil en el extremo N-terminal o el antagonista o anticuefo fusionado con un pohpéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula del antagonista o anticuefo incluyen la fusión con el extremo N- o C-terminal del antagonista o anticuefo de un enzima o un polipéptido que aumente la vida media sérica del antagonista o anticuefo. Otra clase de variante es una variante de sustitución de un aminoácido. En estas variantes, al menos un residuo de aminoácidos de la molécula del antagonista o anticuefo se sustituye por un residuo diferente. Los puntos de mayor interés para la mutagénesis por sustitución de los antagonistas anticuefos incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan las alteraciones en las FRs.

Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 4 bajo el encabezado "sustituciones preferentes". Si dichas sustituciones ocasionan un cambio en la actividad biológica, entonces los productos se pueden examinar, y se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 4, o como se describe con más detalle a continuación con referencia a las clases de aminoácidos. Tabla 4 Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del antagonista o anticuefo se logran seleccionando sustituciones que difieran significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura de la columna del pohpéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación plana o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el punto diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Los residuos que aparecen de forma natural se dividen en gmpos sobre la base de las propiedades comunes de sus cadenas laterales: (1) hidrófobos: norleucma, met, ala, val, leu, lie; (2) hidrófilos neutrales: cys, ser, thr; (3) acídicos: asp, glu; (4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que influyen en la onentación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: tf, tyr, phe. Las sustituciones no conservadoras supondrán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Cualquier residuo de cisteína no implicado en mantener la conformación adecuada del antagonista o anticuefo también se puede sustituir, generalmente con sepna, para mejorar la estabilidad oxidaüva de la molécula y evitar reticulaciones aberrantes. A la inversa, la(s) un?ón(es) de cisteína se puede(n) agregar al antagonista o anticuefo para mejorar su estabilidad (en particular, donde el antagonista o anticuefo sea un fragmento de anticuefo, como un Fv). Una clase particularmente preferente de vanante de sustitución implica la sustitución de uno o más residuos de las regiones hipervanables de un anticuefo parental. Por lo general, la(s) vapante(s) resultante(s) selecc?onada(s) para profundizar en su desarrollo tendrá(n) propiedades biológicas mejoradas con relación al anücuefo parental desde el cual se generó (generaron). Una manera práctica de generar dichas vanantes de sustitución es la maduración de afinidad mediante la representación de imágenes de fagos. De manera resumida, vanos sitios de regiones hipervanables (por ejemplo, los sitios 6-7) se mutan para generar todas las sustituciones posibles de armnos en cada punto. Las vanantes del anücuefo generadas de este modo se presentan de forma monovalente, a partir de partículas de fagos filamentosos, como fusiones con el producto del gen III de M13 que hay dentro de cada partícula. Las vanantes representadas en fagos se examinan entonces para detectar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) tal como se desvela en la presente memona descpptiva. A fin de identificar los puntos de la región hipervanable válidos como candidatos para la modificación, se puede realizar una mutagénesis con barndo de alanma para identificar los residuos de la región hipervapable que contnbuyen significativamente a la unión al antígeno. Como alternativa, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estmctura cpstahna del complejo antígeno-anticuefo para identificar los puntos de contacto entre el anticuefo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y los residuos adyacentes son candidatos a la sustitución de acuerdo con las técnicas explicadas en la presente memopa descnptiva. Una vez generadas dichas vanantes, el panel de vanantes está sujeto a examen tal como se descnbe en la presente memona descpptiva, y los anticuefos con propiedades supenores en uno o más ensayos pertinentes se pueden seleccionar para profundizar en su desarrollo. Otra clase de vanante de aminoácido del antagonista o anücuefo altera el patrón de ghcosilación opginal del antagonista o anücuefo. Alterar significa eliminar una o más porciones de carbohidratos encontradas en el antagonista o anticuefo y/o añadir uno o más puntos de glicosilación que no están presentes en el antagonista o anticuefo. La ghcosilación de los polipéptidos se realiza generalmente por enlace N u O. El enlace N se refiere a la anexión de la porción de carbohidratos a la cadena lateral de un residuo de esparraguina. Las secuencias de tnpéptidos esparraguina-X-senna y esparraguma-X-treonma, donde X es cualquier aminoácido excepto la prohna, son las secuencias de reconocimiento para la anexión enzimática de la porción de carbohidratos a la cadena lateral de la esparraguina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tppéptidos en un pohpéptido crea un punto de ghcosilación potencial. La ghcosilación por enlace O se refiere a la anexión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un ácido hidroxiam o, más comúnmente sepna o treonina, a pesar de que también se puede utilizar 5-h?drox?prolma y 5-h?drox?hs?na. La adición de puntos de glicosilación al antagonista o anticuefo se logra convenientemente alterando la secuencia del aminoácido para que contenga una o más de las secuencias de tnpépüdos descntas antepormente (para puntos de glicosilación unidos por enlace N). La alteración también se puede realizar añadiendo, o sustituyendo, uno o más residuos de sepna o treonina a la secuencia del antagonista o anticuefo opginal (para puntos de ghcosilación unidos por enlace O). Cuando el antagonista o anücuefo comprende una región Fc, el carbohidrato anexo al mismo se puede alterar. Por ejemplo, los anticuefos con una estructura de carbohidratos madura que no tienen fucosa anexa a una de sus regiones Fc se descnben en la solicitud de patente de EE.UU n° 2003/0157108 Al, Presta, L. Véase también el documento US 2004/0093621 Al (Kyowa Hakko Kogyo Co , Ltd). Los anticuefos con una N-acetilglucosarmna (GlcNAc) bisectnz en el carbohidrato anexo a una región Fc del anticuefo se mencionan en el documento WO03/011878, Jean-Mairet y col. y la patente de EE.UU. n° 6 602 684, Umanay col Los anticuefos con al menos un residuo de galactosa en el ohgosacándo anexo a una región Fc del anticuefo se descpben en el documento WO97/30087, Patel y col Véanse, también, los documentos W098/58964 Q .aju, S.) y W099/22764 Q .aju, S.) relativos a los anticuefos con carbohidratos alterados anexos a sus regiones Fc. En la presente memopa descnptiva, la vanante de glicosilación preferente comprende una región Fc, en que una estructura de carbohidratos anexa a la región Fc carece de fucosa. Estas vanantes han mejorado la función de la ADCC. Opcionalmente, la región Fc también comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la zona que mejorar aún más la ADCC; por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración Eu de residuos). Entre las publicaciones relacionadas con los anticuefos "defucosilados" o "con déficit de fucosa" podríamos citar: la solicitud de patente de EE.UU. n° US 2003/0157108 Al, Presta, L; el documento WO 00/61739A1; el documento WO01/29246A1; el documento US2003/0115614A1; el documento US2002/0164328 Al; el documento US2004/0093621A1; el documento US2004/0132140A1; el documento US2004/0110704A1; el documento US2004/0110282 A 1 ; el documento US2004/0109865 A 1 ; el documento WO03/085119A 1 ; el documento WO03/084570A1 , Okazakiy col , J Mol Bwl 336: 1239-1249 (2004) y Yamane-Ohnuki y col , Biotech Bioeng 87: 614 (2004). Enfre los ejemplos de líneas celulares que producen anticuefos defucosilados encontraríamos las células Lee 13 CHO con déficit de fucosilación de proteínas (Rrpkay col , Arch. Biochem Biophys 249:533-545 (1986); la solicitud de patente de EE.UU. n° US 2003/0157108 Al, Presta, L y el documento WO 2004/056312 Al, Adams y col, especialmente el ej emplo 11 ) y las líneas celulares bloqueadas, como el gen alfa- 1 ,6-fucos?ltransferasa, el FUT8 y células CHO bloqueadas (Yamane-Ohnuki y col, Biotech Bioeng. 87: 614 (2004)). Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican las vanantes de las secuencias de aminoácidos del antagonista o anticuefo se preparan mediante una vanedad de procedimientos conocidos en la matena. Estos procedimientos incluyen, pero sin limitarse a, el aislamiento desde una fuente natural (en el caso de vanantes de las secuencias de aminoácidos que aparezcan de forma natural) o la preparación por mutagénesis mediada por ohgonucleótidos (o dipgida al punto), la mutagénesis dipgida mediante PCR y la mutagénesis por inserción de un cásete de una vanante preparada antenormente o una versión no vanante del antagonista o anticuefo. Podría ser deseable modificar el antagonista o anticuefo de la invención con relación a la función efectora, por ejemplo, para incrementar la citotoxicidad con mediación celular dependiente de anticuefos (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente de complementos (CDC) del antagonista o anticuefo. Esto se puede lograr introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fc de un antagonista o anticuefo. De manera alternativa, o adicionalmente, se pueden introducir uno o más residuos de cisterna en la región Fc, lo que permite la formación de un enlace de disulfuro entre las cadenas de esta región. El anticuefo homodimépco generado de esta manera puede tener mayor capacidad de mternahzación y/o un nivel más elevado de muerte celular mediada por complementos y citotoxicidad con mediación celular dependiente de anticuefos (ADCC). Véase Carón y col , J Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J Immunol 148:2918-2922 (1992). Los anticuefos homodiméncos con actividad antitumoral mejorada también se pueden preparar utilizando reticuladores heterobifuncionales tal como se descpbe en Wolff y col , Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). De manera alternativa, se puede diseñar un anticuefo con dobles regiones Fc y, por tanto, potenciar la hsis de los complementos y las capacidades de la ADCC. Véase Stevenson y col , Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). En el documento WO00/42072 (Presta, L.) se descnben los anticuefos con función de ADCC mejorada en presencia de células efectoras humanas, comprendiendo dichos anticuefos las sustituciones de los aminoácidos en la región Fc de los mismos. Preferentemente, el anticuefo con ADCC mejorada comprende sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración Eu de residuos). Preferentemente, la región Fc alterada es una región Fc IgGl humana que comprende o consiste en sustituciones en una, dos o tres de estas posiciones. Opcionalmente, estas sustituciones se combinan con otra(s) sust?tuc?ón(es) que ?ncrementa(n) la unión al Clq y/o la CDC. Los anticuefos con unión alterada al Clq y/o citotoxicidad dependiente de complementos (CDC) se descnben en el documento W099/51642 y las patente de EE.UU. nos 6.194.55 IB 1, 6.242J95B1, 6.528.624B1 y 6.538.124 (Idusogie y col ) Los anticuefos comprenden una sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones de aminoácidos 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 y/o 334 de sus regiones Fc (numeración Eu de residuos). La sustitución de uno o más residuos en las posiciones 326, 327, 333 y/o 334 puede mejorar la unión al Clq y/o la función de la CDC A fin de incrementar la vida media sépca del anticuefo, se le puede incoforar un epítopo de unión a receptor de rescate (especialmente un fragmento del anticuefo) tal como se descnbe en la patente de EE.UU. n° 5.739.277, por ejemplo. Tal como se utiliza en la presente memona descnptiva, el término "epítopo de unión a receptor de rescate" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula IgG (por ejemplo, IgG|, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable de incrementar la vida media sépca en vivo de la molécula IgG. Los anticuefos con una unión mejorada al receptor neonatal Fc (FcRn), y vidas medias mejoradas, se descpben en los documentos WO00/42072 (Presta, L ) y US2005/0014934A1 (Hintony col). Estos anticuefos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la zona que mejoran la unión de la región Fc al FcRn. Por ejemplo, la región Fc puede tener sustituciones en una o más de las posiciones 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428 ó 434 (numeración Eu de residuos). La vanante preferente de anticuefo que comprenda una región Fc con unión mejorada al FcRn comprende sustituciones de aminoácidos en una, dos, o tres de las posiciones 307, 380 y 434 de su región Fc (numeración Eu de residuos). También se contemplan los anticuefos diseñados con tres o más (preferentemente cuatro) puntos de unión al antígeno funcional (solicitud de patente de EE.UU. n° US2002/0004587 A 1 , Millery col ). V. Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas del antagonista o anticuefo utilizado de acuerdo con la presente invención se preparan para su almacenamiento mezclando un antagonista o anticuefo que tenga el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores opcionales que sean farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16" edición, Osol, A. Editores (1980)), en forma de formulaciones hofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen soluciones como el fosfato, el citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen el ácido ascórbico y la metioruna, conservantes (como el clomro amónico de octadecildimetilbenzil; el clomro de hexametomo; el clomro de benzalcomo; el clomro de bencetonio; el fenol; el alcohol butílico o bencílico; los alquil parabenos como por ejemplo el metil o el propil parabeno; el catecol; el resorcinol; el ciclohexanol; el 3-pentanol y el m-cresol); los pohpéptidos de ba o peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); las proteínas, tales como la albúmina sénca, la gelatina o las mmunoglobulmas; los polímeros hidrófilos como por ejemplo la polivinilpirrolidona, los aminoácidos como por ejemplo la glicina, la glutamina, la esparraguina, la histidina, la arginma o la hsma; los monosacándos, disacápdos y ofros carbohidratos incluyendo la glucosa, la mañosa o las dextnnas; agentes quelantes como por ejemplo el EDTA; los azúcares como por ejemplo la sacarosa, el manitol, la trehalosa o el sorbitol, los contraiones que forman sales como por ejemplo el sodio, los complejos metálicos (por ejemplo, los complejos de proteína Zn) y/o los tensoactivos no iónicos como por ejemplo TWEEN™, PLURONICS™ o el polietilenghcol (PEG). Las formulaciones ejemplares del anticuefo ant?-CD20 se descpben en el documento WO 1998/56418. En esta publicación se descnbe una formulación líquida de múltiples dosis que comprende 40 mg/ml de ntuximab, 25 mM de acetato, 150 mM de trehalosa, 0,9% de alcohol bencílico, 0,02% de polisorbato 20 con un pH de 5,0 y una caducidad mínima de dos años en almacenamiento a 2-8 °C. Otra formulación del anticuefo ant?-CD20 de interés comprende 10 mg/ml de ptuximab en 9,0 mg/ml de clomro sódico, 7,35 mg/ml de citrato sódico dihidratado, 0,7 mg/ml de pohsorbato 80 y agua esténl para inyecciones con pH 6,5. Las formulaciones hofi zadas adaptadas para la administración subcutánea se descpben en la patente de EE.UU. n° 6 267.958 (Andyay col ). Estas formulaciones hofihzadas puedes reconstituirse con un diluyente adecuado en una alta concentración de proteínas, y la formulación reconstituida se puede administrar por vía subcutánea al sujeto que se trata en la presente memopa descnptiva. La formulación de la presente memopa descnptiva también puede contener más de un compuesto activo (un segundo medicamento tal como se indicó antenormente) como fuese necesano, preferentemente aquéllos con actividades complementapas que no tienen efectos adversos enfre sí. La clase y las cantidades eficaces de estos medicamentos dependen, por ejemplo, de la cantidad de antagonista o anticuefo presente en la formulación, y los parámetros clínicos de los sujetos que se están tratando. Los medicamentos preferentes de esta clase se indican a continuación. Los ingredientes activos también se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o pohmepzación interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y pol?-(met?lmetacnlato), respectivamente, en sistemas de presentación de medicamentos coloidales (por ejemplo, hposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Dichas técnicas se desvelan en Remington 's Pharmaceutical Sciences, 16 edición, Oslo, A , Editores, (1980) Se pueden elaborar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada serían las matnces semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el antagonista o anticuefo, cuyas matpces están en forma de elementos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas Entre las matnces de liberación sostenida se incluirían los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, el pol?-(2-h?drox?et?l-metacplato) o el poh-(v?n?lalcohol)), los pohláctidos (patente de EE.UU n° 3.773.919), los copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, el acetato de etilenvinilo no degradable, los copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico como por ejemplo LUPRON DEPOT J™ (microesferas inyectables compuestas por copolímeros de ácido láctico-ácido ghcóhco y acetato de leuprohda) y el ácido pol?-D-(-)-3-hidroxibutípco Las formulaciones para administrar en vivo deben ser estéples. Esto se logra filtrando a través de membranas de filtración esténles.

VI. Artículos fabricados En otra realización de la invención, se proporcionan artículos fabncados que contienen matepales útiles para el tratamiento de una EII descnta antenormente. En un aspecto, el artículo fabncado comprende (a) un envase con un antagonista (por ejemplo, un anticuefo) que se une a un marcador de la superficie de células B (por ejemplo, el CD20), opcionalmente en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y (b) un prospecto con instrucciones para fratar una EII en un sujeto humano. En todos estos aspectos, el prospecto se incluye en el envase o está asociado al mismo. Entre los envases adecuados se encuentran, por ejemplo, botes, viales, jepngas, etc. Los envases pueden estar hechos de diversos matenales como vidno o plástico. El envase tiene una composición eficaz en el tratamiento de la EII y puede tener un puerto de acceso estépl (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón que se puede perforar con una aguja hipodérmica). Al menos un agente activo de la composición es el antagonista o anticuefo. La etiqueta o el prospecto indican que la composición se utiliza para fratar a un sujeto humano elegible para el tratamiento, por ejemplo, alguien que padezca EII o con predisposición hacia ella, incluyendo la modalidad de EII o CU moderada-grave, con consejos específicos sobre las cantidades y los intervalos de las dosis del antagonista o anticuefo y cualquier otro medicamento que se suministre. El artículo fabpcado también puede comprender un envase adicional que contiene una solución diluyente farmacéuticamente aceptable, como agua bactepostática para inyección (BWF 1 ), una solución salina fosfatada, una solución de Ringer y/o una solución de dextrosa. También puede incluir otros matenales deseables desde el punto de vista comercial y del usuano, incluidas otras soluciones, diluyentes, filtros, agujas y jepngas. Opcionalmente, el artículo fabpcado de la presente memopa descpptiva comprende además un envase que contiene un segundo medicamento, en que el anticuefo es el pnmer medicamento, así como instrucciones en un prospecto para tratar al sujeto con ese segundo medicamento, en una cantidad eficaz. El segundo medicamento puede ser cualquiera de los mencionados antenormente, siendo los más relevantes un aminosahcilato, un corticosteroide oral, la 6-mercaptopunna (6-MP) y la azatiopnna.

El siguiente ejemplo no limitador proporciona mayores detalles de la invención. Las divulgaciones de todas las citas de las especificaciones del producto están expresamente mcoforadas en la presente memopa descpptiva por referencia. Ejemplo 1 Terapia de la EH Esto es una evaluación del ntuximab en sujetos humanos con CU active tal como se define en los cptenos de inclusión. Los datos de la micromatpz de genes han demostrado que los genes de las células B y la expresión del CD20 expepmentan una regulación al alza en la CU humana. Este ejemplo ofrece un protocolo para la terapia de los sujetos con CU. El esquema de estudio de este protocolo se representa en la Figura 4. En la presente memona descnptiva, la terapia incluye un período de exploración de unas dos semanas, otro de estudio de alrededor de 24 semanas y un tercero de seguimiento de 24 semanas. A lo largo del estudio, se realizarán ngurosas evaluaciones de la segundad. El período de exploración desde el día -14 hasta el 0 incluye un histonal médico, una revisión médica, una valoración de laboratono, la recolección diana de datos y una sigmoidoscopia flexible con biopsias para confirmar la enfermedad activa y determinar el resultado de referencia inicial del índice de actividad de la enfermedad (IAE) El resultado del IAE se utiliza para identificar sujetos potenciales para mscnbirse en el estudio y valorar la actividad clínica del ntuximab. Los sujetos recibirán una infusión intravenosa (IV) de 1 gramo de ntuximab (o placebo) en los días 1 y 15. Todos los sujetos seguirán con dosis estables de uno o más de los siguientes productos a partir de al menos la semana 8: un armnosalicilato, un corticosteroide oral, 6-mercaptopupna (6-MP) y/o azatiopnna. En todas las visitas del estudio se realizará una supervisión de la segundad con evaluaciones de las revisiones penódicas físicas y de laboratopo. Tras las visitas de los días 1 y 15, los sujetos tendrán visitas programas cada 4 semanas hasta la semana 24 y después cada 3 meses hasta la semana 48. Además, los sujetos volverán los días 2 y 16 sólo para una toma de muestras farmacocinéticas 0?K). Durante la semana 8 se efectuarán repetidas sigmoidoscopias flexibles con biopsias para su estudio histológico, valorar la evolución de la enfermedad y evaluar la reducción de las células B de la mucosa. En la semana 24 se practicará una sigmoidoscopia adicional con biopsias para evaluar el estado de la enfermedad y la recuperación de la reducción de células B en la mucosa colónica. La valoración histológica de la inflamación en las muesfras de la biopsia se puntuará de acuerdo con una escala estandanzada (Geboes y col , Gut 47:404-409 (2000)). Durante la semana 8 se calculará un resultado del IAE para determinar la proporción de sujetos que consiguen la remisión de la enfermedad. El resultado del LAE también se calculará en la visita de la semana 24. Cuando no se efectúe una sigmoidoscopia flexible, se realizará una valoración clínica en las visitas (es decir, los días 1 y 15 y en las semanas 4, 12, 16, 20, 36 y 48). El investigador y el patrocinador realizarán un seguimiento de los sujetos hasta la semana 48 o hasta lograr la recuperación de las células B, lo que más tarde se produzca. La recuperación de las células B se define como los niveles de células B que han vuelto a su valor de referencia inicial (día 1) o el límite más bajo dentro de los parámetros normales. Este ejemplo ofrece una evaluación de la segundad y tolerabihdad del ptuximab en sujetos adultos con CU activa La medida ppmana del resultado de la segundad es la frecuencia con que se producen exacerbaciones de la CU definidas en el protocolo (empeoramiento de la enfermedad). La evaluación de las células B proseguirá hasta la semana 48 o hasta lograr recuperarlas, lo que más tarde se produzca. En este ejemplo también se evalúa la actividad clínica terapéutica del ntuximab en la CU mediante el sistema del resultado del IAE tal como se ha definido antenormente. En diversos estudios clínicos pivotales, se ha empleado un sistema de resultados del IAE para valorar la actividad de la CU (Schroedery col , N Engl J Med 317:1625-1629 (1987)). Como punto final secundano de la actividad clínica se ha tomado la remisión de las señales y los síntomas de la enfermedad activa, evidenciada por el cese de las hemopagias rectales y la curación de la mucosa friable. La duración de la remisión también se medirá. Los resultados de la sigmoidoscopia flexible y el IAE en la semana 24 y el seguimiento clínico hasta la semana 48 permitirán evaluar la duración del efecto terapéutico. MEDIDAS DEL RESULTADO Medida primaria del resultado de la seguridad La medida pnmapa del resultado de la segundad es la frecuencia con que se producen exacerbaciones adversas de la CU definidas en el protocolo durante el período del estudio (desde el día 1 hasta la semana 24). Una exacerbación de la CU definida en el protocolo debe cumplir con uno o más de los siguientes cntenos: * Un aumento de S puntos en el resultado del LAE • Megacolon tóxico inminente o sospechoso • Necesidad de hospitalización para un exacerbación de CU • Bajo el cpteno clínico del investigador, empeoramiento médicamente significativo de la enfermedad Medidas secundarias del resultado Las medidas secundapas del resultado son las siguientes: • Otras medidas del resultado de la segundad • Incidencia de infecciones graves, definidas como infecciones que requieren hospitalización o antibióticos IV • Incidencia de todos los eventos adversos (graves y no graves) clasificados de acuerdo con los Cntepos de toxicidad común para los eventos adversos del Instituto Nacional del Cáncer (NCI- CTCAE), versión 3.0 • Incidencia de anormalidades clínicas en las pmebas de laboratono • Proporción de sujetos que consiguen la remisión de la enfermedad en la semana 8 • La remisión de la enfermedad se define como una sigmoidoscopia que dé 0 ó 1 como resultado (sin friabilidad) y una hemorragia rectal que dé 0 como resultado. • Proporción de sujetos que muestran una respuesta clínica en la semana 8 • La respuesta clínica se define como una reducción de ^ puntos en el resultado del LAE.

• Tiempo que la remisión de la enfermedad tarda en manifestarse • Duración de la remisión de la enfermedad tal como determine el investigador • Cambio respecto a los valores de referencia inicial durante el período del estudio en los resultados del Cuestionapo de la enfermedad mflamatopa intestinal (CEII) Se examinarán los efectos del ptuximab en diversos marcadores farmacodinámicos comparando los valores de referencia inicial con los exhibidos durante el tratamiento en la sangre, el suero y las muestras tisuiares. Estas valoraciones serán las siguientes: • Panel de lmfocitos en la sangre con conteo de células B (CDl 9+ y otros subconjuntos de fenotipos de células B) • Niveles Ig del suero (total, IgA, IgG e IgM) • Anticuefos específicos para la CU (p-ANCA) • Reducción de células B en las biopsias colónicas, medida sobre una base ínmunohistoquímica (IHC) SUJETOS Criterios de inclusión Los sujetos deben cumplir los siguientes cntepos para ser elegibles a formar parte del estudio. • Consentimiento informado por escnto • Edad entre 18 y 75 años y capacidad de comprender los procedimientos del estudio • Diagnóstico de la CU >6 meses antes de la exploración • >20 cm de enfermedad activa en la sigmoidoscopia de exploración • Enfermedad activa, definida sobre la base de un resultado del IAE de enfre >6 y <11 , con >2 en el caso de la hemorragia rectal y >2 para la sigmoidoscopia flexible realizada en la exploración. • Tratamiento con corticosteroides orales para la CU durante dos años antes de la exploración • La intensidad del tratamiento debería haber sido igual o supepor a una dosis equivalente de prednisona de 20 mg/día durante al menos dos semanas • Colonoscopia practicada en los dos últimos años para determinar el grado de la enfermedad y descartar la existencia de pólipos • Colonoscopia con biopsias apropiadas para descartar una displasia practicada durante el año antepor a la exploración si la enfermedad de la CU es >10 años • Los sujetos con potencial reproductor (hombres y mujeres) deben utilizar un medio de anticoncepción fiable (por ejemplo, anticonceptivos hormonales, parches, anillo vaginal, dispositivo intrautenno, barreras físicas) durante el tratamiento del estudio y un año después de haber tomado la última dosis del medicamento del estudio • Cancelación de todas las terapias biológicas expenmentales antenores (por ejemplo, etanercept, infliximab, adahmumab o ntuximab) al menos 15 semanas antes de pasar por el proceso de asignación aleatopa de medicamentos • Tratamiento actual con una o más de las siguientes terapias en dosis estables durante el período indicado antenor a la fecha de referencia inicial (día 1): Aminosahcilato, dosis estable durante >3 semanas Corticosteroides orales, dosis estable durante >2 semanas Tratamiento con 6-MP durante un período de 3 meses, con una dosis estable durante >4 semanas Tratamiento con azatioppna durante un período de 3 meses, con una dosis estable durante >4 semanas • Con relación a todas las terapias que se han indicado y se han utilizado antenormente pero no en la actualidad en el día 1, los sujetos deben haber interrumpido la administración de aminosalicilatos durante >2 semanas y abandonado los tratamientos con azatiopnna, 6-MP o corticosteroides orales durante >4 semanas antes de la fecha de referencia inicial.

Criterios de exclusión Los sujetos que cumplan los siguientes cptenos no podrán formar parte del estudio: • Colitis grave que, según el cnteno del investigador, probablemente llevará al sujeto a someterse a una colectomía o la administración de un inhibidor de la calcineupna en un plazo de 12 semanas fras la fecha de referencia inicial (día 1) • Sospecha clínica o pmeba radiográfica de perforación colónica o megacolon tóxico • Histonal de colangitis esclerosante ppmana • Histonal de displasia colónica y/o pólipos adenomatosos en el colon • Tratamiento con ciclosponna, tacrohmus, sirohmus, metotrexato o micofenolato mofetil dentro de las 8 semanas antepores a la exploración • Tratamiento con una preparación rectal tópica dentro de las 2 semanas antenores a la exploración • Uso de medicamentos antnnflamatonos no esteroides (NSAEDs) aparte de aspipna en bajas dosis dentro de las 4 semanas antepores a la fecha de referencia inicial • Resultados positivos de Clostridium difßcile en pmebas de huevos o parásitos, patógenos o toxinas en heces en el momento de la exploración • Recepción/tratamiento con cualquier vacuna viva dentro de las 4 semanas antenores al proceso de asignación aleatopa de medicamentos • Tratamiento antenor con cualquier terapia no biológica de reducción de células como el ADACOLUMN® • Histopal de obstrucción o resección del colon o el intestino delgado • Uso de agentes antidiarreicos durante el período de exploración • Histonal de hepatitis B o C Exclusiones por seguridad general • Histopal de reacciones alérgicas o anafilácticas graves a anticuefos humanizados, quimépcos o totalmente humanos o anticuefos munnos monoclonales • Enfermedad cardíaca o pulmonar significativa (incluyendo la enfermedad pulmonar obstructiva) • Pmebas de significantes enfermedades concomitantes no controladas como las enfermedades cardiovasculares o los trastornos del sistema nervioso, pulmonares, renales, hepáticos, endocnnos o gastrointestinales • Infección bactepana, vinca, fúngica, micobactenana o de otra clase, conocida y activa (incluyendo la tuberculosis o la enfermedad micobactepana atípica, pero excluyendo las infecciones fúngicas en el blanco de las uñas) o cualquier otro episodio de infección importante que requiera hospitalización o tratamiento con antibióticos EV dentro de las cuatro semanas antepores a la exploración, o dos en el caso de los antibióticos orales • Histopal de infección significativa recupente o infecciones bactepanas recurrentes • Inmunodeficiencia pnmapa o secundana (padecida en el pasado o actualmente activa), incluyendo el VIH • Histonal de cáncer, incluyendo tumores sólidos y malignidades hematológicas (excepto los carcinomas de células básales y escamosas de la piel que se hayan extifado y curado) • Mujeres embarazadas o madres lactantes • Histonal de consumo de alcohol, drogas o sustancias químicas dentro de los 6 meses antepores a la exploración • Falta de acceso venoso pepfénco Criterios de exclusión de las pruebas de laboratorio (en la exploración) • Creatinma en el suero >1 ,4 mg/dL en mujeres o >1 ,6 mg/dL en hombres • Límite de aspartato aminotransferasa (AST) o alanina aminotransferasa (ALT) >2,5 veces supepor al normal • Conteo de plaquetas < 100 000/µL • Hemoglobina <8,5 gr/dL • Neutrófilos <1 500/µL Conteo de lmfocitos <100/µL Serología positiva de hepatitis B o C IgG <5,65 mg/mL IgM <0,55 mg/mL Conteo de células B <1,1% Electrocardiograma (ECG) que muestra una anormalidad cardíaca significativa que, a cnteno del investigador pnncipal, podría poner en peligro la salud del sujeto si participase en este estudio TRATAMIENTO DEL ESTUDIO Formulación El ptuximab se formula para la administración IV como un producto estépl en una solución de 9,0 mg/mL de clomro sódico, 0,7 mg/mL de pohsorbato 80, 7,35 mg/mL de dehidrato de citrato sódico y agua estépl para inyecciones (pH 6,5). El anticuefo se suministra para su uso comercial en viales de 10 mL y 50 mL con una concentración de 10,0 mg/mL. Los viales de 10 mL contienen 100 mg de anticuefo. Los viales de 50 mL contienen 500 mg de anticuefo. No se utiliza conservante alguno porque el vial se ha diseñado para un solo uso. Los centros médicos que colaboren con el estudio recibirán viales de 50 mL con 500 mg de ptuximab y viales de 50 mL con una cantidad equivalente de placebo.

Dosificación, administración y almacenamiento El tratamiento del estudio consistirá en 1 gramo de ptuximab o una cantidad equivalente de placebo administrado por vía intravenosa en los días 1 y 15. Los sujetos recibirán un tratamiento profiláctico con acetaminofeno (1 gr) y difenidramina HC 1 (50 mg), o su equivalente, por vía oral entre 30 y 60 minutos antes del inicio de cada infusión. Los sujetos podrían hospitalizarse para permanecer bajo observación, en particular tras su pnmera infusión, a cnteno del investigador. La administración del ntuximab debe supervisarse muy de cerca, teniendo siempre a mano equipos de reanimación completa. Si se produce una exacerbación de la CU definida en el protocolo antes de la segunda infusión, ésta se pospondrá. Las soluciones de ptuximab para infusión se mantienen estables a una temperatura de entre 2 y 8 °C (36 y 46 °F) durante 24 horas y a temperatura ambiente durante 24 horas más. No use el producto pasada la fecha de caducidad impresa en el cartón. No se han observado incompatibilidades enfre el ntuximab y las bolsas de clomro de polivinilo o pohetileno.

TERAPIAS CONCOMITANTES Y EXCLUIDAS Antes de la fecha de referencia inicial (día 1), todos los sujetos llevarán un régimen de dosis estables de un aminosahcilato, un corticosteroide oral, 6-MP y/o azatiopnna durante períodos vapables. A lo largo de todo el estudio y en los períodos de seguimiento, los sujetos deberían mantener su dosis constante de aminosahcilato, 6-MP y/o azatioppna Las dosis de corticosteroides orales deberían permanecer estables hasta pasada la semana 8, si resulta médicamente aceptable. Transcurnda la semana 8, la dosis debería disminuirse si el médico lo indicase. Las terapias para enfermedades distintas de la CU pueden proseguir, excepto en los casos que se especifican a continuación. El uso de vims o vacunas de bactepa vivas se prohibe desde el día -28 hasta el final del período del estudio. Estas vacunas pueden incluir, pero sin limitarse a, el sarampión, las paperas, la mbeola, la polio, el bacilo de Calmette-Guenn, la fiebre amaplla y la fiebre tifoidea TY21a. Las vacunas que no contienen organismos vivos (por ejemplo, la gnpe, el Pneumovax®, el tétano) no se prohiben pero podrían no ser eficaces. Se recomienda revisar el registro de vacunas del sujeto y los posibles requisitos y, si fuera necesano, administrar cualquier vacuna dosis de refuerzo al menos 28 días antes de iniciar el tratamiento con el medicamento del estudio. El tratamiento con ciclospopna, tacrohmus, sirolimus, metotrexato o micofenolato mofetil se prohibe dentro de las 8 semanas antenores a la exploración y durante el estudio. La ciclosponna puede usarse en cualquier formulación según el cntepo del investigador como una medicación de rescate para una exacerbación de la CU definida en el protocolo. Si la medicación de rescate es necesana antes de la semana 8, se considerará que el sujeto no responde al tratamiento, aunque debería continuar con las visitas del estudio programadas. Otros medicamentos excluidos durante el período del estudio son los siguientes: • Antibióticos para tratar la CU Los antibióticos se pueden usar para tratar infecciones según indique el médico pero no como terapia para una CU. • Los NSAIDs, con la excepción de aspmna en dosis bajas para profilaxis cardiovascular • Terapias rectales tópicas para la CU • Antidiarreicos • Laxantes • Agentes de unión del ácido bíhco como la colestiramina • Los medicamentos o tratamientos expepmentales están prohibidos PROCEDIMIENTOS DE ENSAYO Se obtendrán muestras de suero para análisis PK y HACA en intervalos de tiempo preestablecidos de acuerdo con la programación de valoración. El ensayo de mmunoabsorción enzimática (ELISA) farmacocinética del ntuximab se utilizará para medir el nivel de ntuximab en las muestras de suero humano. El HACA ELISA del ntuximab es un ensayo puente, en que se utiliza el ntuximab como reactivo de captura y el ptuximab biotinilado y la estreptavidma-HRP para la detección. En el ensayo se emplea una curva de calibración preparada con anticuefos de cabra policlonales pupficados para mayor afinidad que actúan sobre el ptuximab; por tanto, los resultados de este ensayo son relativos para este anticuefo policlonal en términos de unidades relativas. Todos los análisis del p-ANCA se efectuarán en un laboratono central. Se utilizará la inmunofluorescencia indirecta para determinar la presencia de ANCAs. Además, los ensayos de ELISA se pueden usar para determinar la especificidad del ANCA con la rmeloperoxidasa u ofros antígenos pertinentes tal como decida el laboratono central Análisis de la actividad clínica Se evaluará la actividad clínica del ntuximab en la CU. Se calcularán las proporciones de sujetos que expenmenten una remisión de la enfermedad y respuestas clínicas durante la semana 8, y para cada brazo de tratamiento se generarán intervalos correspondientes de un 95% de confianza. Se proporcionarán las diferencias en los tratamientos y los intervalos de un 95% de confianza. La duración de la remisión de la enfermedad se resumirá para cada brazo de tratamiento. El tiempo medio de la respuesta de la remisión de la enfermedad se resumirá para cada brazo de tratamiento mediante el método Kaplan-Meier sólo para fines descnptivos. Los sujetos con CU activa tratados con el anticuefo del ptuximab, tal como se ha descnto antenormente, expenmentarán una mejoría en las señales y los síntomas de la CU, incluyendo la remisión de la enfermedad y/o una respuesta clínica (obtenida en la semana 8), la obtención de una sigmoidoscopia con un resultado de 0 ó 1 y una hemonagia rectal con un resultado de 0, una reducción del resultado del IAE (igual o supenor a 3 puntos), una reducción de las células B en la mucosa colónica y/o una reducción del nivel de anticuefos p-ANCA.

A partir de todo lo antenor, se apreciará que, aunque las realizaciones específicas de la invención se han descnto en la presente memona descnptiva para fines ilustrativos, se pueden realizar diversas modificaciones sin desviarse del espíptu y el alcance de la invención. Por consiguiente, la invención no está limitada excepto por las reivindicaciones que se incluyen a continuación.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un procedimiento para tratar los casos moderados-graves de la enfermedad ínflamatona intestinal (EII) en un sujeto humano que consiste en administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuefo del CD20 y cuyo resultado es una respuesta clínica o la remisión de la enfermedad. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en que la EII es una colitis ulcerativa (CU). 3. El procedimiento de la reivindicación 1, en que la EII es una enfermedad de Crohn. 4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el sujeto tiene EII activa 5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que la administración del anticuefo da como resultado la remisión de la enfermedad. 6. El procedimiento de la reivindicación 5, en que la remisión se consigue alrededor de la semana 8. 7. El procedimiento de la reivindicación 5 o la 6, en que gracias a la administración del anticuefo se consigue una sigmoidoscopia con un resultado de 0 ó 1 y una hemorragia rectal con un resultado de 0 8 El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que la administración del anticuefo da como resultado una respuesta clínica. 9. El procedimiento de la reivindicación 8, en que la respuesta clínica se consigue alrededor de la semana 8. 10. El procedimiento de la reivindicación 8 o la 9, en que la administración del anticuefo reduce el resultado del índice de actividad de la enfermedad (IAE). 11. El procedimiento de la reivindicación 10, en que el resultado del IAE, establecido según el sistema de resultado de la Tabla 2 de la presente memopa descnptiva, se reduce en 3 o más puntos 12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que la administración del anticuefo reduce las células B de la mucosa colónica. 13 El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el anticuefo es quiménco, humano o humanizado. 14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el anticuefo comprende ptuximab 15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 13, en que el anticuefo comprende el 2H7 humanizado. 16. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 13, en que el anticuefo comprende el 2F2 (huMax-CD20). 17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el anticuefo es un anticuefo desnudo. 18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 16, en que el anticuefo se conjuga con otra molécula. 19. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el anticuefo se administra con una dosis de entre 200 y 2.000 mg y una frecuencia de una a cuatro dosis en un período aproximado de un mes. 20. El procedimiento de la reivindicación 19, en que la dosis es enfre 500 y 1.500 mg. 21. El procedimiento de la reivindicación 19 o la 20, en que la dosis es entre 750 y 1.200 mg. 22. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 21, en que el anticuefo se administra en una o dos dosis. 23. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 22, en que el anticuefo se administra en un período de entre 2 y 3 semanas. 24. El procedimiento de la reivindicación 23, en que el período es de unas dos semanas. 25. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el anticuefo se administra por vía intravenosa. 26. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el anticuefo se administra por vía subcutánea. 27. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que se administra un segundo medicamento en una cantidad eficaz, y el anticuefo del CD20 es un pnmer medicamento. 28. El procedimiento de la reivindicación 27, en que el segundo medicamento es más de un medicamento. 29. El procedimiento de la reivindicación 27 o la 28, en que el segundo medicamento se selecciona del gmpo integrado por un ammosalicilato, un corticosteroide oral, la 6-mercaptopunna (6-MP) y la azatiopnna. 30. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones de la 27 a la 29, en que el segundo medicamento se administra en una cantidad menor que la empleada si el anticuefo del CD20 no se administra a un sujeto tratado con el segundo medicamento. 31. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el sujeto jamás se ha fratado antenormente con un anticuefo del CD20. 32. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el sujeto no padece una malignidad de células B. 33. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el sujeto no padece una enfermedad autoinmune, aparte de la EIE 34. Un procedimiento para fratar la enfermedad ínflamatopa intestinal (EII) en un sujeto humano con EII activa que consiste en administrar al paciente sólo una o dos dosis de un anticuefo del CD20, obteniendo ya como resultado tras d?cha(s) dosis la remisión de la enfermedad o una respuesta clínica. 35. El procedimiento de la reivindicación 34, en que las dosis, una o dos, se administran por vía intravenosa (IV). 36. El procedimiento de la reivindicación 34, en que las dosis, una o dos, se administran por vía subcutánea (SQ) 37. El procedimiento de la reivindicación 34, en que se administra un par de dosis intravenosas, cada una de ellas de entre 200 y 2.000 mg. 38. Un procedimiento para fratar la enfermedad mflamatona intestinal (EII) en un sujeto humano con EII activa que consiste en administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuefo del CD20 y, postenormente, un segundo medicamento seleccionado del gmpo integrado por un aminosahcilato, un corticosteroide oral, la 6-mercaptopupna (6-MP) y la azatiopnna. 39. Un procedimiento para reducir el resultado del índice de actividad de la enfermedad (IAE) en un sujeto humano con colitis ulcerativa (CU) activa que consiste en administrar al sujeto un anticuefo del CD20 en una cantidad eficaz para reducir ese resultado del IAE. 40. El procedimiento de la reivindicación 39, en que el resultado del IAE, establecido según el sistema de resultado de la Tabla 2 de la presente memona descpptiva, se reduce en 3 o más puntos. 41. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el sujeto presenta un nivel atípico del anticuefo citoplasmático antineutrófilo pennuclear (p-ANCA) o el autoanticuefo anti-isoforma 5 humana de la tropomiosina 0YFM5). 42. Un artículo fabpcado que comprende: i. un envase que contiene un anticuefo del CD20, y n un prospecto con instrucciones para tratar la enfermedad mflamatona intestinal (EII) en un sujeto humano que indican la administración de una cantidad eficaz del anticuefo del CD20.