MX2007001064A - Metodos y composiciones para modular la activacion del factor de crecimiento de hepatocitos. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona metodos y composiciones para modular la actividad de la hepsina y la trayectoria de senas ilacion de HGF/c-met, en particular, regulando la activacion de pro-HGF mediante hepsina.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA MODULAR LA ACTIVACIÓN DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DE HEPATOCITOS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud es una solicitud no provisional presentada bajo 37 CFR 1.53 (b) (1), que reivindica la prioridad bajo 35 USC 119 (e) para la solicitud provisional número 60/591,339 presentada en Julio 26 de 2004, cuyo contenido se incorpora en la presente mediante la referencia. CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere en general a los campos de la biología molecular y de la regulación del factor de crecimiento. Más específicamente, la invención se refiere a moduladores de la trayectoria de señalización HGF/c-met, y a los usos de dichos moduladores. ANTECEDENTES La hepsina (también conocida como TMRPRSS1) es una serina proteasa similar a quimiotripsina expresada en la superficie celular y es miembro de la familia de las serinas proteasas de transmembrana tipo II (TTSP) , que incluyen también matriptasa (conocida también como MT-SP1) y enteropeptidasa (1). El gen de hepsina humano, localizado en el cromosoma 19 en qll-13.2 (2), codifica para un polipéptido de 417 aminoácidos (3) comprendido de un corto extremo citoplásmico de terminal N, una región de transmembrana y un dominio extracelular (Arg45-Leu417 ) compuesto de los dominios del receptor eliminador rico en cisteína (SRCR) y proteasa. El zimógeno de hepsina se activa automáticamente al desdoblar Argl62-Ilel63 (4), formando una enzima heterodimérica con el dominio de proteasa unido por disulfuro (Cysl53-Cys277 ) al dominio SRCR. Adicionalmente a la unión Cys-Cys covalente, la estructura cristalina de hepsina recientemente determinada reveló que los dominios SRCR y de proteasa comparten una extensa región de interfaz, absorbiendo cada dominio aproximadamente 1200 Á2 (5) . Debido a que esta región de interfaz se localiza cercana a los residuos próximos a la membrana del dominio SRCR, el dominio de hepsina proteasa y el sitio activo pueden colocarse cercanos a la superficie celular (5). Esto difiere fundamentalmente de otras serina proteasas instañadas en la superficie celular, tales como factores de coagulación Vlla (FVIIa)1, IXa y Xa, cuyos sitios activos se ubican muy por arriba (60-80 Á) de la superficie de membrana (6-8). La función fisiológica de la hepsina ha sido elusiva. Excepto por el factor de coagulación VII, no se conocen sustratos macromoleculares y no se han identificado inhibidores fisiológicamente relevantes. Un papel de la hepsina en la coagulación sanguínea se sugirió por Kazama et al., (1995) (9) demostrando que las células transfectadas con hepsina pueden activar el factor de coagulación VII. Sin embargo, ratones deficientes en hepsina fueron viables y no sobrerregulados en cáncer de próstata (17-22). La coloración in situ mostró expresión de hepsina en células epiteliales de las glándulas secretorias prostéticas (19) . La expresión de hepsina se correlacionó con la transformación neoplásica (19), siendo la mayor en tumores de pacientes con enfermedad avanzada y la menor en hiperplasia benigna (18, 22). En contraste, un estudio encontró que la baja expresión de la proteína hepsina se correlacionó con altas puntuaciones Gleason y grandes tumores (20) . No es claro si esta aparente contradicción se relaciona con los métodos utilizados, i.e., imunohistoquímica (20) vs . cuantificación ARN (18, 22). Además, la hepsina también se encuentra fuertemente sobrerregulada en cáncer ovárico (23) y en carcinoma de célula renal, en donde se asocia principalmente con el tipo celular epitelial (12). En la superficie celular epitelial, la hepsina se sitúa idealmente para interactuar con componentes de la matriz extracelular y otras proteínas asociadas a la membrana. Se sabe que las serina proteasas similares a quimiotripsina, incluyendo la matriptasa TTSP (sinónimo de MT-SP1) (24, 25), que se relacionan estructuralmente con la hepsina, activan enzimas fibrinolíticas, metaloproteasas de matriz y formas latentes de factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) . El HGF promueve la proliferación celular, la migración, angiogénesis, supervivencia y morfogénesis activando la tirosina cinasa receptor Met (revisada en (26, 27)). Adicionalmente a su importancia en fisiología normal, la trayectoria HGF/Met se ha implicado en el crecimiento de tumor invasivo y en la metástasis de tumor (26) . El HGF tiene alta similitud con el plasminógeno de serina proteasa y se compone de una cadena alfa conteniendo un dominio N y cuatro dominios Kringle, y una cadena beta con homología con proteasas similares a quimiotripsina. Esta se secreta en la matriz extracelular como un precursor monocatenario inactivo (pro-HGF) y requiere la división de activación en Arg94- Val495 para formar el heterodímero /ß unido por disulfuro biológicamente competente (28-31). Esta etapa es mediada por serina proteasas de conversión pro-HGF, tales como el activador del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFA) (32), matriptasa (33, 34), activador de plasminógeno tipo uroquinasa (u-PA) (35), factor Xlla (36), factor Xla y calicreína de plasma (34). El HGFA y matriptasa se inhiben mediante inhibidores tipo Kunitz expresados en la superficie celular, tales como las dos variantes de unión del inhibidor del activador del factor de crecimiento de hepatocitos HAI-1 (37, 38) y HAI-1B (34), y mediante HAI-2 (39) (conocido también como bicunina placentaria) (40) que también inhibe potentemente el factor Xla y calicreína de plasma (41), mientras que HAI-1B tiene poca o ninguna actividad inhibidora (34). En consecuencia, la disponibilidad biológica del depósito pro-HGF en la matriz extracelular se regula por las actividades de convertasas pro-HGF y sus inhibidores. El perfil de expresión de hepsina en tejidos de cáncer como se describió anteriormente, acoplado con su papel potencial en la actuación como regulador de otros factores de crecimiento cuya desregulación podría ser la base e la carcinogénesis, sugiere que la modulación de la interacción de hepsina con su sustrato podría probar ser un procedimiento terapéutico eficaz. A este respecto, existe una clara necesidad de identificar el sustrato fisiológico de hepsina y/o su(s) modulador (es) fisiológico (s) . la invención cubre esta necesidad y proporciona otros beneficios. Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo solicitudes y publicaciones de patente, se incorporan por la referencia en su totalidad. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Como se describe en la presente, un sustrato fisiológico para hepsina, una proteína de superficie celular altamente sobreexpresada en múltiples cánceres, es el factor de crecimiento de hepatocitos, que en sí se conoce por jugar un importante papel en muchos aspectos del desarrollo del cáncer. Se muestra en la presente que la hepsina divide proHGF con una actividad comparable con la potente convertasa fisiológica pro-HGF, HGFA (activador del factor de crecimiento de hepatocitos) . El HGF bicatenario (activado) generado por hepsina, exhibe actividades biológicas normales, incluyendo la inducción de fosforilación de Met tirosina, la estimulación de la proliferación celular y la estimulación de la migración celular. Adicionalmente, dos inhibidores del dominio Kunitz, HAI-1B y HAI-2, se identifican en la presente como reguladores fisiológicos de la actividad enzimática de hepsina. La invención proporciona métodos y composiciones en base, al menos en parte, a estos descubrimientos, que se describen abajo en mayor detalle. Se muestra que la hepsina y su interacción con HGF y/o sus inhibidores fisiológicos, puede ser un objetivo único y ventajoso para una mayor regulación fina en el diseño de procedimientos profilácticos y/o terapéuticos contra condiciones patológicas asociadas con la señalización anormal o no deseada de la trayectoria HGF/Met (referida también como "c-met") . En consecuencia, la invención proporciona métodos, composiciones, equipos y artículos de manufactura para la identificación y el uso de sustancias capaces de modular la trayectoria HGF/c-met a través de la modulación de las moléculas de interacción fisiológica implicadas en la regulación de la activación HGF. Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona un método de visualización (o identificación) de una sustancia inhibidora candidato (i.e., antagonista) que inhibe la activación hepsina del HGF, comprendiendo dicho método: (a) poner en contacto una sustancia candidato con una primera muestra que comprende hepsina y un sustrato pro-HGF, y (b) comparar la cantidad de activación del sustrato pro-HGF en la muestra con la cantidad de activación del sustrato pro-HGF en una muestra de referencia que comprende cantidades similares de hepsina y sustrato pro-HGF a la primera muestra, pero que no se ha puesto en contacto con dicha sustancia candidato, mediante lo cual la disminución en la cantidad de activación del sustrato pro-HGF en la primera muestra comparada con la muestra de referencia, indica que la sustancia candidato es capaz de inhibir la activación de hepsina de HGF monocatenario (pro-HGF) . En una modalidad, la hepsina en una muestra se encuentra en una cantidad efectiva para activar dicho pro-HGF. Un sustrato pro-HGF adecuado para su uso en estos métodos puede encontrarse en un número de formas, siempre que imite la característica del sitio de desdoblamiento de hepsina en pro-HGF. Ejemplos del sustrato pro-HGF incluyen, pero no se limitan a, HGF monocatenario de longitud total que comprende una forma del tipo silvestre de la unión péptido R494-V495, y cualquier fragmento de HGF que comprende esta unión péptido. Tal fragmento puede ser de cualquier longitud, por ejemplo de al menos (aproximadamente) 5, 7, 10, 15, 20, 25 aminoácidos de longitud, o de entre (aproximadamente) 4 y 25, 5 y 20, 7 y 15 aminoácidos de longitud. Generalmente y preferentemente, un sustrato pro-HGF comprende una unión péptido R494-V495 capaz de dividirse mediante hepsina de tipo silvestre. En una modalidad, el sustrato pro-HGF comprende un sitio de desdoblamiento de HGF humano que se ajusta al sitio de desdoblamiento de consenso de las proteasas (i.e., residuo básico en a posición Pl y dos residuos hidrófobos de aminoácidos en las posiciones Pl' y P2' - R494, Pl' V495, P2' V496). En otro aspecto, la invención proporciona un método para visualizar una sustancia que bloquea la activación pro-HGF mediante hepsina, comprendiendo dicho método la visualización de una sustancia que se une (preferentemente, pero no necesariamente, específicamente) a hepsina o pro-HGF y bloquea la interacción específica (e.g., unión) entre hepsina y pro-HGF. En algunas modalidades, la sustancia compite con hepsina por la unión a HGF. En algunas modalidades, la sustancia compite con pro-HGF por la unión a hepsina. En una modalidad, la sustancia, comprende, consiste o esencialmente consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% de similitud o identidad de secuencia con respecto a proHGF (e.g., humano), e.g., un fragmento de HGF humano que comprende residuos de aminoácido 494 (Arg) unidos a péptido para 495 (Val). En algunas modalidades, en donde la sustancia comprende, consiste o esencialmente consiste de tal secuencia de aminoácidos, el fragmento se encuentra mutado o desprovisto de al menos una porción de cadena beta de HGF, de manera que dicho fragmento tiene actividad reducida de activación de c-met en comparación con el HGF de tipo silvestre . Como será evidente para el experto en la técnica, los análisis de visualización consistentes con los descritos anteriormente también pueden comprender una primera etapa de visualización en base a la lectura de formación del complejo hepsina-HGF para obtener un primer grupo de sustancias moduladoras candidato, seguida por una segunda etapa de visualización en base a la capacidad del primer grupo de sustancias moduladoras candidato para modular la activación de HGF y/o la conversión de HGF en una forma capaz de activar la trayectoria HGF/c-met. Las lecturas adecuadas pueden ser cualquiera evidente para el experto en la técnica, en base a un conocimiento de la formación del complejo de enzima-sustrato y/o de las actividades biológicas asociadas con la trayectoria de señalización HGF/c-met. La formación del complejo de enzima-sustrato puede calcularse utilizando, por ejemplo, análisis bioquímicos de rutina (e.g., electroforesis de gel, cromatografía, NMR, etc.). Las actividades biológicas de HGF/c-met incluyen, pero no se limitan a fosforilación C-met, fosforilación de moléculas celulares que son sustratos de C-met cinasa, crecimiento celular (proliferación, supervivencia, etc.), angiogénesis, migración celular, morfogénesis celular, etc. En un aspecto, la invención proporciona antagonistas HGF/c-met que fracturan la trayectoria de señalización de HGF/c-met. por ejemplo, la invención proporciona una molécula que inhibe la división hepsina de pro-HGF (e.g., división en la posición R494-V495). La molécula puede ejercer su función inhibidora en cualquier número de formas, incluyendo, pero sin limitarse a la unión ya sea de hepsina o pro-HGF de manera que se inhibe la división hepsina de pro-HGF, unión al complejo de hepsina-pro-HGF de manera que se inhibe la división de pro-HGF. Y/o la unión de pro-HGF o hepsina (solos o en complejo) de manera que se inhiben los efectos' de división mediante hepsina (e.g., inhibición o liberación de HGF subsecuente a la división mediante hepsina) . En una modalidad, una molécula de antagonista de la invención no inhibe la unión de HGF a c-met. Por ejemplo, en una modalidad, una molécula antagonista de la invención no es un anticuerpo o su fragmento que tiene una capacidad inhibidora y/o de unión similar al anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el Número de Acceso del American Type Culture Collection ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3.3.13) o HB-11895 (hibridoma 5D5.11.6). En una modalidad, una molécula antagonista de la invención inhibe las actividades biológicas asociadas con la activación de HGF/c-met.

En un aspecto, un antagonista de la invención se deriva del descubrimiento descrito en la presente, de que los inhibidores del activador del factor de crecimiento de hepatocitos (HAI-1, HAI-1B, HAI-2) son potentes inhibidores de la activación hepsina de pro-HGF. En una modalidad, la invención proporciona un antagonista de la activación de proHGF mediante hepsina, comprendiendo dicho antagonista al menos una porción (incluyendo todos) los HAI-1, HAI-1B o HAI-2 humanos. En una modalidad, dicha porción comprende una secuencia de dominio Kunitz (KD) capaz de inhibir la activación de pro-HGF mediante hepsina. En una modalidad, dicha secuencia de dominio Kunitz es el dominio Kunitz 1 (KD1) de HAI-1 o HAI-1B. En una modalidad, un antagonista de la invención comprende una secuencia KD1 variante que tiene al menos aproximadamente el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con el KD1 de tipo silvestre de HAI-1 humano, en donde dicha secuencia variante tiene al menos una capacidad comparable al KD1 de tipo silvestre para inhibir la división de hepsina de pro-HGF humano. En una modalidad, un antagonista de la invención comprende una secuencia KD1 variante que tiene entre aproximadamente el 70% y 99%, aproximadamente 75% y 98%, aproximadamente 80% y 97%, 85% y 95% de identidad de secuencia con el KD1 de tipo silvestre de HAI-1 humano, en donde dicha secuencia tiene al menos una capacidad comparable al KD1 de tipo silvestre para inhibir la división de hepsina del pro-HGF humano. En una modalidad, dicha secuencia de dominio Kunitz es uno o ambos dominios Kunitz de HAI-2. En una modalidad, un antagonista de la invención comprende una secuencia de dominio Kunitz HAI-2 que tiene al menos aproximadamente el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con el (los) dominio (s) Kunitz correspondiente (s) del HAI-2 de tipo silvestre humano, en donde dicha secuencia variante tiene al menos una capacidad comparable al HAI-2 de tipo silvestre para inhibir la división de hepsina de pro-HGF humano. En una modalidad, un antagonista de la invención comprende una secuencia HAI-2 de dominio Kunitz variante que tiene entre aproximadamente el 70% y 99%, aproximadamente 75% y 98%, aproximadamente 80% y 97%, 85% y 95% de identidad de secuencia con el (los) dominio (s) Kunitz correspondiente (s) de HAI-2 de tipo silvestre humano, en donde dicha secuencia tiene al menos una capacidad comparable al HAI-2 de tipo silvestre para inhibir la división de hepsina del pro-HGF humano. En algunas modalidades, un antagonista de la invención es o comprende una molécula pequeña, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, aptámero o una combinación de los mismos. Los antagonistas, como se describen en la presente, pueden obtenerse rutinariamente utilizando técnicas conocidas en la técnica (incluyendo aquellas descritas abajo en mayor detalle) en base al descubrimiento de la interacción de hepsina, inhibidores de activador del factor de crecimiento de hepatocitos y pro-HGF como se describe en la presente. Por ejemplo, en algunas modalidades, un antagonista de la invención compite con hepsina por la unión a HGF, pero no tiene la capacidad para dividir pro-HGF en el sitio de desdoblamiento de hepsina. En algunas modalidades, un antagonista de la invención compite con pro-HGF por la unión a hepsina. Por ejemplo, en una modalidad, dicho antagonista comprende, consiste o esencialmente consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de similitud o identidad de secuencia con respecto a pro-HGF (e.g., humano) y es capaz de unirse sustancialmente a hepsina, pero carece de un sitio de desdoblamiento de hepsina (e.g., un sitio Pl que comprende la unión péptido R494-V495 de HGF humano de tipo silvestre) y/o carece de la capacidad de activar c-met (e.g., en donde muta la cadena beta de HGF, se encuentra desprovisto de la cadena beta de HGF o una porción de la misma, etc.) . En una modalidad, un antagonista de la invención, comprende, consiste o esencialmente consiste de un fragmento HGF capaz de unirse a hepsina, en donde tal fragmento se encuentra desprovisto de al menos una porción de la cadena beta de HGF de manera que dicho fragmento tiene una actividad reducida de activación de c-met en comparación con el HGF de tipo silvestre. En consecuencia, la invención proporciona un mutante HGF capaz de unirse sustancialmente a hepsina, pero que tiene una actividad moduladora de HGF/c-met disminuida en comparación con el HGF de tipo silvestre, e.g., un antagonista de la actividad de HGF/c-met o una variante de HGF que exhibe una reducción, pero no una ausencia, de actividad HGF biológica (e.g., actividad estimulante del crecimiento celular) . En una modalidad, un antagonista de la invención es capaz de inhibir la actividad biológica de HGF de tipo silvestre (in vivo) (tal actividad biológica incluye, pero no se limita a la estimulación de la proliferación celular, mejoramiento de la supervivencia celular, promoción de angiogénesis, inducción/promoción de la migración celular) . En una modalidad, un antagonista de la invención proporciona reducida actividad promotora del crecimiento celular (incluyendo, pero sin limitarse a proliferación celular, supervivencia celular, angiogénesis, migración celular) . En algunas modalidades, un antagonista de la invención se obtiene mediante un método de visualización o identificación de la invención como se describe en la presente . En un aspecto, una molécula antagonista de la invención se encuentra unida a una toxina tal como un agente citotóxico. Estas moléculas/sustancias pueden formularse o administrarse en combinación con un agente aditivo/mejorador tal como un agente de radiación y/o quimioterapéutico. En un aspecto, la invención proporciona una molécula capaz de mejorar la división de pro-HGF mediante hepsina, en donde dicha molécula es capaz de interferir con la interacción de HAI-1, HAI-1B y/o HAI-2 con hepsina. En algunas modalidades, una molécula mejoradora de la invención es o comprende una molécula pequeña, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, aptámero o una combinación de los mismos. Por ejemplo, una molécula mejoradora de la invención puede comprender, consistir o esencialmente consistir de un fragmento, o variante del mismo, de HAI-1, HAI-1B y/o HAI-2, en donde dicho fragmento es capaz de unirse a hepsina, pero no inhibe sustancialmente la división hepsina de pro-HGF. En una modalidad, dicha molécula es capaz de inhibir competitivamente la unión de HAI-1, HAI-1B y/o HAI-2 de tipo silvestre a hepsina. En una modalidad, una molécula mejoradora de la invención es un anticuerpo que interfiere con la formación de un complejo que comprende hepsina y HAI-1, HAI-1B y/o HAI-2. En una modalidad, una molécula mejoradora de la invención es hepsina o una variante de la misma (incluyendo cualquiera de las definidas abajo), en donde la hepsina o su variante es capaz de efectuar la división de pro-HGF en el sitio R494-V495.

La invención también proporciona métodos y composiciones útiles para modular estados de enfermedad asociados con la desregulación del eje de señalización de HGF/c-met. En consecuencia, en un aspecto, la invención proporciona un método para modular la activación de c-met en un sujeto, comprendiendo dicho método la administración al sujeto de una molécula moduladora de HGF/c-met de la invención (e.g., una molécula antagonista, como se describe en la presente, que inhibe la división de hepsina de pro-HGF), mediante la cual se modula la activación de c-met. En una modalidad, dicha molécula es un antagonista de HGF/c-met que inhibe la actividad de HGF/c-met. En una modalidad, dicha molécula es una molécula mejoradora que incrementa la actividad de HGF/c-met. En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar una condición patológica asociada con la activación de c-met en un sujeto, comprendiendo dicho método la administración al sujeto de un antagonista de c-met de la invención (e.g., cualquiera de los antagonistas de la división de pro-HGF mediante hepsina, como se describe en la presente) , mediante lo cual se inhibe la activación de c-met. La trayectoria de señalización de HGF/c-met se encuentra implicada en múltiples funciones biológicas y fisiológicas, incluyendo, e.g., la estimulación del crecimiento celular (e.g., proliferación celular, supervivencia celular, migración celular, morfogénesis celular) y angiogénesis. Por consiguiente, en otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento celular activado por c-met (e.g., proliferación y/o supervivencia) , comprendiendo dicho método poner en contacto una célula o tejido con un antagonista de la invención, mediante lo cual se inhibe la proliferación celular asociada con la activación de c-met. aún en otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir la angiogénesis, comprendiendo dicho método la administración a una célula, tejido y/o sujeto con una condición asociada con angiogénesis anormal, un antagonista de la invención, mediante lo cual se inhibe la angiogénesis. Aún en otro aspecto, la invención proporciona un método para mejorar la angiogénesis, comprendiendo dicho método la administración a una célula, tejido y/o sujeto con una condición que se beneficiaría de un incremento en la angiogénesis y/o asociado con una cantidad sub-óptima de angiogénesis, una molécula mejoradora de la invención, mediante lo cual mejora la angiogénesis. En un aspecto, la invención proporciona el uso de un antagonista de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad tal como un cáncer, un tumor, un trastorno de proliferación celular, un trastorno inmune (tal como autoinmune) y/o un trastorno relacionado con la angiogénesis. El antagonista puede ser de cualquiera de las formas descritas en la presente, incluyendo anticuerpo, fragmento de anticuerpo, molécula pequeña (e.g., una molécula orgánica), polipéptido (e.g., un oligopéptido), ácido nucleico (e.g., un oligonucleótido, tal como un oligonucleótido de antisentido o ARN de interferencia) , un aptámero o combinaciones de los mismos . En un aspecto, la invención proporciona el uso de una molécula mejoradora de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como cicatrización de heridas (e.g., heridas asociadas con diabetes, trauma, etc.). La molécula mejoradora puede ser cualquiera de las formas descritas en la presente incluyendo anticuerpo, fragmento de anticuerpo, molécula pequeña (e.g., una molécula orgánica), polipéptido (e.g., un oligopéptido), ácido nucleico (e.g., un oligonucleótido, tal como un oligonucleótido de antisentido o ARN de interferencia) , un aptámero o combinaciones de los mismos. En un aspecto, la invención proporciona el uso de un ácido nucleico de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno de proliferación celular, un trastorno inmune (tal como autoinmune) y/o un trastorno relacionado con la angiogénesis (e.g., cicatrización de heridas). En un aspecto, la invención proporciona el uso de un vector de expresión de la invención, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno de proliferación celular, un trastorno inmune (tal como autoinmune) y/o un trastorno relacionado con la angiogénesis (e.g., cicatrización de heridas). En un aspecto, la invención proporciona el uso de una célula huésped de la invención, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno de proliferación celular, un trastorno inmune (tal como autoinmune) y/o un trastorno relacionado con la angiogénesis (e.g., cicatrización de heridas). En un aspecto, la invención proporciona el uso de un artículo de manufactura de la invención, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno de proliferación celular, un trastorno inmune (tal como autoinmune) y/o un trastorno relacionado con la angiogénesis (e.g., cicatrización de heridas). En un aspecto, la invención proporciona el uso de un equipo de la invención, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno de proliferación celular, un trastorno inmune (tal como autoinmune) y/o un trastorno relacionado con la angiogénesis (e.g., cicatrización de heridas). En un aspecto, la invención proporciona un método para inhibir la proliferación celular activada por c-met, comprendiendo dicho método poner en contacto una célula o tejido con una cantidad efectiva de un antagonista de la invención, mediante lo cual se inhibe la proliferación celular asociada con la activación de c-met. En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar una condición patológica asociada con la desregulación de la activación de c-met en un sujeto, comprendiendo dicho método la administración al sujeto de una cantidad efectiva de un antagonista de la invención, mediante lo cual se trata dicha condición. En un aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa c-met o factor de crecimiento de hepatocitos, o ambos, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula con un antagonista de la invención ocasionando así la inhibición del crecimiento de dicha célula. En una modalidad, la célula se pone en contacto con HGF expresado por una célula diferente (e.g., a través de un efecto parácrino) .

En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar terapéuticamente a un mamífero que tiene un tumor canceroso que comprende una célula que expresa c-met o factor de crecimiento de hepatocitos, o ambos, comprendiendo dicho método la administración a dicho mamífero de una cantidad efectiva de un antagonista de la invención, tratando así efectivamente a dicho mamífero. En una modalidad, la célula se pone en contacto con HGF expresado por una célula diferente (e.g., a través de un efecto parácrino). En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar o prevenir un trastorno de proliferación celular asociado con el aumento en la expresión o actividad de hepsina, c-met y/o factor de crecimiento de hepatocitos, comprendiendo dicho método la administración a un sujeto que necesita tal tratamiento, una cantidad efectiva de un antagonista de la invención, tratando o previniendo así efectivamente dicho trastorno de proliferación celular. En una modalidad, dicho trastorno de proliferación es cáncer. En un aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de una célula, en donde el crecimiento de dicha célula depende, al menos en parte, de un efecto de potenciación del crecimiento de hepsina, c-met y/o factor de crecimiento de hepatocitos, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula con una cantidad efectiva de un antagonista de la invención, inhibiendo así el crecimiento de dicha célula. En una modalidad, la célula se pone en contacto con HGF expresado por una célula diferente (e.g., a través de un efecto parácrino). En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar terapéuticamente un tumor en un mamífero en donde el crecimiento de dicho tumor depende, en parte, de un efecto de potenciación del crecimiento de hepsina, c-met y/o factor de crecimiento de hepatocitos, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula con una cantidad efectiva de un antagonista de la invención, tratando así efectivamente dicho tumor. En una modalidad, la célula se pone en contacto con HGF expresado por una célula diferente (e.g., a través de un efecto parácrino) . Los métodos de la invención pueden utilizarse para afectar cualquier estado patológico adecuado, por ejemplo, células y/o tejidos asociados con la desregulación de la trayectoria de señalización de hepsina y/o HGF/c-met. En una modalidad, una célula objetivo en un método de la invención es una célula de cáncer. Por ejemplo, una célula de cáncer puede seleccionarse del grupo que consiste de una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer colorrectal, una célula de cáncer pulmonar, una célula de carcinoma papilar (e.g., de la glándula tiroides), una célula de cáncer de colon, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer ovárico, una célula de cáncer cervical, una célula de cáncer del sistema nervioso central, una célula de cáncer de próstata, una célula de sarcoma osteogénico, una célula de carcinoma renal, una célula de carcinoma hepatocelular, una célula de cáncer de vejiga, una célula de carcinoma gástrico, una célula de carcinoma escamoso de cabeza y cuello, una célula de melanoma y una célula de leucemia. En una modalidad, una célula objetivo en un método de la invención es una célula hiperproliferativa y/o hiperplásica . En una modalidad, una célula objetivo en un método de la invención es una célula displásica. Aún en otra modalidad, una célula objetivo en un método de la invención es una célula metastática. Los métodos de la invención pueden comprender además etapas de tratamiento adicionales. Por ejemplo, en una modalidad, un método comprende además una etapa en donde una célula y/o tejido objetivo (e.g., una célula de cáncer) se expone a tratamiento de radiación o a un agente quimioterapéutico. Como se describe en la presente, la activación de c-met es un importante proceso biológico cuya desregulación conduce a numerosas condiciones patológicas. En consecuencia, en una modalidad de los métodos de la invención, una célula objetivo (e.g., una célula de cáncer) es una cuya activación de c-met se encuentra aumentada en comparación con una célula normal del mismo origen de tejido. En una modalidad, . Un método de la invención ocasiona la muerte de una célula objetivo. Por ejemplo, el contacto con un antagonista de la invención puede dar como resultado la incapacidad de la célula para señalizar a través de la trayectoria de c-met, lo cual da como resultado la muerte celular. La desregulación de la activación de c-met (y por tanto la señalización) puede resultar de un número de cambios celulares, incluyendo, por ejemplo, sobreexpresión de HGF (ligante del cognado de c-met) y/o de c-met en sí. Por consiguiente, en algunas modalidades, un método de la invención comprende la dirección a una célula en donde el c-met o el factor de crecimiento de hepatocitos, o ambos, se encuentra más abundantemente expresado por dicha célula (e.g., una célula de cáncer) en comparación con una célula normal del mismo origen de tejido. Una célula que expresa c-met puede regularse mediante HGF a partir de una diversidad de fuentes, i.e., de manera autócrina o parácrina. Por ejemplo, en una modalidad de los métodos de la invención, una célula objetivo se pone en contacto/se une por medio del factor de crecimiento de hepatocitos expresado en una célula diferente (e.g., a través de un efecto parácrino). Dicha célula diferente puede ser del mismo o diferente origen de tejido. En una modalidad, una célula objetivo se pone en contacto/se une por medio del HGF expresado por la célula objetivo en sí (e.g., a través de un efecto/circuito autócrino) . En un aspecto, la invención proporciona un método que comprende la administración a un sujeto de una molécula mejoradora de la invención. Las condiciones adecuadas que van a tratarse mediante este método incluyen cualquier condición patológica asociada con un nivel fisiológico anormalmente/indeseablemente bajo de angiogénesis asociado con la actividad HGF/c-met en un sujeto. Ejemplos de tales condiciones incluyen pero no se limitan a cicatrización de heridas, hipertrofia cardiaca, infarto cardiaco, isquemia de limbo, enfermedad arterial periférica, etc. En un aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden uno o más antagonistas o mejoradores de la invención, y un vehículo. En una modalidad, el vehículo es farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican para una molécula antagonista o mejoradora de la invención. En una modalidad, un ácido nucleico de la invención codifica para una molécula antagonista o mejoradora que es o comprende un polipéptido (e.g., un oligopéptido). En una modalidad, un ácido nucleico de la invención codifica para una molécula antagonista o mejoradora que es o comprende un anticuerpo o su fragmento. En un aspecto, la invención proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico de la invención.

En un aspecto, la invención proporciona células huésped que comprenden un ácido nucleico o un vector de la invención. El vector puede ser de cualquier tipo, por ejemplo, un vector recombinante tal como un vector de expresión. Puede utilizarse cualquiera de una variedad de célula huésped. En una modalidad, una célula huésped es una célula procariótica, por ejemplo, E. coli. En una modalidad, una célula huésped es una célula eucariótica, por ejemplo, una célula de mamífero tal como una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO) . En un aspecto, la invención proporciona métodos para producir una molécula antagonista o mejoradora de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona un método para producir un antagonista que es o comprende un anticuerpo (o su fragmento) , comprendiendo dicho método la expresión en una célula huésped adecuada de un vector recombinante de la invención que codifica para dicho anticuerpo (o su fragmento), y la recuperación de dicho anticuerpo. En otro ejemplo, la invención proporciona un método para producir una molécula antagonista o mejoradora que es o comprende un polipéptido (tal como un oligopéptido) , comprendiendo dicho método la expresión en una célula huésped adecuada de un vector recombinante de la invención que codifica para dicho polipéptido (tal como un oligopéptido), y la recuperación de dicho polipéptido (tal como un oligopéptido) .

En un aspecto, la invención proporciona un artículo de manufactura que comprende un envase; y una composición contenida dentro del envase, en donde la composición comprende una o más moléculas antagonistas o mejoradoras de la invención. En una modalidad, la composición comprende un ácido nucleico de la invención. En una modalidad, una composición que comprende una molécula antagonista o mejoradora comprende además un vehículo, que en algunas modalidades, es farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, un artículo de manufactura de la invención comprende además instrucciones para administrar la composición (e.g., la molécula antagonista o mejoradora) a un sujeto. En un aspecto, la invención proporciona un equipo que comprende un primer envase que comprende una composición que contiene una o más de las moléculas antagonistas o mejoradoras de la invención; y un segundo envase que comprende un amortiguador. En una modalidad, el amortiguador es farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, una composición que comprende una molécula antagonista o mejoradora comprende además un vehículo, que en algunas modalidades es farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, un equipo comprende además instrucciones para administrar la composición (e.g., la molécula antagonista o mejoradora) a un sujeto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Pureza y actividad de hepsina hacia el factor VII. (A) La hepsina soluble expresada en célula CHO comprendió el dominio extracelular completo (Arg45 - Leu417) y una marca His8 de terminal C. Geles coloreados (condiciones de reducción) de hepsina purificada muestran que la hepsina se convirtió espontáneamente en su forma bicatenaria mediante división en Argl63 -Ilel63 (verificada por secuencia de terminal N) . (B) Activación del zimógeno de factor VII mediante hepsina (40 nM) en presencia de vesículas PCPS y CaCl2 a 37°C durante un período de 2 horas. Se indican las posiciones del zimógeno FVII así como del dominio de cadena ligera (l.c.) y proteasa (h.c.) de la fórmula FVIIa. Se muestran los marcadores de peso molecular como Mr x 10"3. Figura 2. Activación específica de pro-HGF mediante hepsina. Se incubó pro-HGF marcado con 125I (0.05 mg/ml) en 20 mM de Hepes, pH 7.5, 150 mM de NaCl (amortiguador Hepes) con concentraciones disminuidas de hepsina y HGFA: etapas de dilución de enzimas de 3 veces, a partir de 40 nM en el campo 2 hasta 0.16 nM en el campo 7. (A) Hepsina y (B) HGFA. Después de 4 horas a 37°C las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE bajo condiciones de reducción seguido por la exposición a películas de rayos x. Se indican las posiciones de pro-HGF, cadena alfa de HGF y cadena beta de HGF (doble) .

El campo 1 es un alícuota tomado inmediatamente el inicio de la reacción. (C) Activación de plasminógeno mediante t-PA y hepsina. El plasminógeno (0.12 mg/ml) se incubó con t-PA (40 nM) , hepsina (40 nM) o amortiguador (control) en amortiguador Hepes. Los alícuotas tomados en diferentes puntos de tiempo se analizaron mediante SDS-PAGE (condiciones de reducción) seguido por coloración con Simply Blue Safe Stain. Campo 1, amortiguador a 0.5 horas; campo 2, t-PA a 0.5 horas; campo 3, hepsina a 0.5 horas; campo 4, amortiguador a 5 horas; campo 5, t-PA a 5 horas; campo 6, hepsina a 5 horas. Se indican las posiciones del plasminógeno (Pig) y de la cadena pesada de (h.c.) plasmina. Figura 3. Fosforilación de Met mediante pro-HGF activado mediante hepsina y HGFA. (A) Se dividió pro-HGF no marcado (0.3 mg/ml) con 40 nM de hepsina o 40 nM de HGFA produciendo una conversión de >95%. El HGF producido mediante división de hepsina (HGFhepsma) y mediante división de HGFA (HGFHGFA) se analizó mediante SDS-PAGE (condiciones de reducción) y se coloreó con Simply Blue Safe Stain. (B) La fosforilación del receptor Met se calculó en un análisis KIRA exponiendo células A549 a concentraciones aumentadas de HGFhepsma (círculos), HGFHGFA (cuadrados), o scHGF (rombos), una forma monocatenaria no divisible de HGF. Las actividades se expresaron como porcentaje de la señal máxima obtenida con una preparación de HGF de control. Los valores son el promedio ± SD de tres experimentos. Figura 4. Proliferación celular y migración con pro-HGF activado mediante hepsina (HGFhepsina) y HGFA (HGFHGFA) • (A) Proliferación celular de células BxPC3 en presencia de concentraciones incrementadas de HGFhepsina (barras rellenas) y HGFHGFA (barras abiertas). Los valores son el promedio de dos experimentos. (B) Cuantificación de la migración celular estimulada por concentraciones incrementadas de HGFepsina (barras rellenas) y HGFHGFA (barras abiertas) agregadas a la cámara inferior de un sistema de migración celular transpozo. Los valores son el promedio ± SD de tres experimentos. Las actividades en análisis de proliferación y migración se expresaron como el porcentaje de células de control expuestas a 100 ng/ml de una preparación de HGF de control, que se incluyó en cada experimento. Figura 5. Inhibición de la actividad enzimática de hepsina en un análisis amidolítico. Se incubó hepsina (0.4 nM) con inhibidores durante 30 minutos a temperatura ambiente y se determinó la actividad enzimática hacia S2366 (0.2 mM -Km) en un lector cinético de microplaca. (v), sHAI-lB, (t), sHAI-lB(R260A) , (?) , sHAI-lB (K401A) , (?) , sHAI-2. Figura 6. Inhibición de la activación de pro-HGF mediante formas mutantes de sHAI-lB y mediante sHAI-2. Se incubó pro-HGF marcado con 125I (0.05 mg/ml) con hepsina (15 nM) e inhibidores durante 4 horas a 37°C. Se analizaron los alícuotas de reacción como se describió en la Figura 1. Hepsina a 15 nM se encontró presente en cada muestra. Los inhibidores se encontraron a 1 µM. Campo 1, alícuota a t=0; 2, sin inhibidor; 3, sHAI-lB; 4, sHAI-lB (R260A) ; 5, sHAI-1B(K401A); 6, sHAI-2. Se indican las posiciones de pro-HGF, cadena alfa de HGF y cadena beta de HGF (doble) . Figura 7. Una modalidad de una secuencia de aminoácidos de hepsina natural humana. Figura 8. Otra modalidad de una secuencia de aminoácidos de hepsina natural humana. FORMAS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN La invención proporciona métodos, composiciones, equipos y artículos de manufactura que comprenden moduladores de la trayectoria de señalización de HGF/c-met, incluyendo métodos para utilizar tales moduladores. Se proporcionan en la presente detalles de estos métodos, composiciones, equipos y artículos de manufactura. Técnicas Generales La práctica de la presente invención, a menos que se indique de otra manera, empleará técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica, e inmunología, que se encuentran en la experiencia técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989), "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, y actualizaciones periódicas); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullís et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001) . Definiciones El término "hepsina" como se utiliza en la presente abarca polipéptidos de secuencia natural, variantes de polipéptido, y fragmentos de un polipéptido de secuencia natural y de variantes de polipéptido (que se definen adicionalmente en la presente) capaz de dividir pro-HGF de una manera similar a la hepsina de tipo silvestre. El polipéptido hepsina descrito en la presente puede ser aquel aislado de una diversidad de fuentes, tales como de tipos de tejido humano o de otra fuente, o se prepara mediante métodos recombinantes o sintéticos. Los términos "hepsina", "polipéptido hepsina", "enzima hepsina", y "proteína hepsina" incluyen también variantes de un polipéptido hepsina como se describe en la presente. Un "polipéptido hepsina de secuencia natural" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido hepsina correspondiente derivado de la naturaleza. En una modalidad, un polipéptido hepsina de secuencia natural comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (ver Figura 7). En una modalidad, un polipéptido hepsina de secuencia natural comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 (ver Figura 8) . Tal polipéptido hepsina de secuencia natural puede aislarse de la naturaleza o puede producirse mediante medios recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido hepsina de secuencia natural" abarca específicamente formas truncadas o secretadas de origen natural del polipéptido hepsina específico (e.g., una secuencia de dominio extracelular), formas variantes de origen natural (e.g., formas alternativamente unidas) y variantes alélicas de origen natural del polipéptido. "Variante de polipéptido hepsina", o sus variaciones, significa un polipéptido hepsina, generalmente un polipéptido hepsina activo, como se define en la presente, que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de las secuencias de polipéptido hepsina de secuencia natural como se describe en la presente. Tales variantes de polipéptido hepsina incluyen, por ejemplo, polipéptidos hepsina en donde se agregan o se suprimen uno o más residuos de aminoácido en la terminal N o C de una secuencia de aminoácidos natural.

Ordinariamente, una variante de polipéptido hepsina tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos para una secuencia de polipéptido hepsina de secuencia natural como se describe en la presente. Ordinariamente, los polipéptidos hepsina variantes son de al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, . 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 aminoácidos de longitud o más. Opcionalmente los polipéptidos hepsina variantes tendrán no más de una sustitución de aminoácido conservadora en comparación con una secuencia polipéptido hepsina natural, alternativamente no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoácido conservadoras en comparación con la secuencia de polipéptido hepsina natural. "Identidad de secuencia de aminoácido porcentual (%)" con respecto a una secuencia de péptidos o polipéptidos, se define como el porcentaje de residuos aminoácido en una secuencia candidato que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia de péptido o polipéptido específica, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr la máxima identidad de secuencia porcentual, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación, para propósitos de determinación de la identidad de secuencia de aminoácidos porcentual, puede lograrse de diversas maneras dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, utilizando software públicamente disponible tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación sobre la longitud total de las secuencias que se comparan. Para los propósitos en la presente, sin embargo, los valores % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa computarizado de comparación de secuencia ALIGN-2, como se describe en la Pat. de EU No. 6,828,146. El término "vector", como se utiliza en la presente, pretende referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un circuito de ADN circular de doble cadena en el cual pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector fago. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los segmentos de ADN adicionales pueden ligarse en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la cual se introducen (e.g., vectores bacteriales que tienen un origen de replicación bacterial y vectores episomales de mamífero) . Otros vectores (e.g., vectores de mamífero no episomales) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped al introducirse en la célula huésped, y por consiguiente se replican conjuntamente con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se unen operativamente. Tales vectores se refieren en la presente como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores recombinantes"). En general, los vectores de expresión útiles en técnicas de ADN recombinante se encuentran frecuentemente en forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse de manera intercambiable dado que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada. "Polinucleótido" o "ácido nucleico", utilizados de manera intercambiable en la presente, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados o bases, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse en un polímero mediante ADN o ARN polimerasa, o mediante una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si se presenta, la modificación a la estructura de nucleótido puede impartirse antes o después del ensamblado del polímero. La secuencia de nucleótidos puede interrumpirse por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede modificarse además después de la síntesis, tal como mediante conjugación con una marca. Otros tipos de modificaciones incluyen por ejemplo, "tapas", sustitución de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleótido tales como, por ejemplo, aquellos con uniones no cargadas (e.g., metil fosfonatos, fosforotioésteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc.), y con uniones cargadas (e.g., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellos que contienen residuos pendientes, tales como, por ejemplo, proteínas (e.g., nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, ply-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (e.g., acridina, psoralen, etc.), aquellos que contienen queladores (e.g., metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquiladores, aquellos con uniones modificadas (e.g., ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas de el(los) polinucleótido (s) . Además, cualquiera de los grupos hidroxilo comúnmente presentes en los azúcares puede reemplazarse, por ejemplo, mediante grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos estándar de protección o activados para preparar uniones adicionales para nucleótidos adicionales, o pueden conjugarse a soportes sólidos o semi-sólidos . La terminación 5' y 3' OH puede fosforilarse o sustituirse con aminas o residuos orgánicos de grupo de tapa de desde 1 hasta 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivatizarse a grupos estándar de protección. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o deoxirribosa generalmente conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-0-metil-, 2'-0-alil, 2' -fluoro- o 2' -azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclicos, azúcares alfa anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosa, azúcares furanosa, sedoheptulosas, análogos acílicos y análogos nucleósido abásicos tales como metil ribosida. Una o más uniones fosfodiéster pueden reemplazarse por grupos alternativos de unión. Estos grupos de unión alternativos incluyen, pero no se limitan a, modalidades en donde el fosfato se reemplaza por P(0)S ("tioato"), 0(S)S ("ditioato") , "(0)NR.sub.2 ("amidato"), P(0)R, P(0)0R', CO o CH.sub.2 ("formacetal") , en los cuales R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C.) conteniendo opcionalmente una unión éter (-0-) , arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todas las uniones en un polinucleótido necesitan ser idénticas. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos referidos en la presente, incluyendo ARN y ADN. "Oligonucleótido" como se utiliza en la presente, se refiere en general a polipéptidos cortos generalmente monocatenarios, generalmente sintéticos que son generalmente, pero no necesariamente de menos de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente exclusivos. La descripción anterior para polinucleótidos es igual y enteramente aplicable a oligonucleótidos. El término "factor de crecimiento de hepatocitos" o "HGF" como se utiliza en la presente, se refiere, a menos que se indique de manera específica o contextual de otra manera, a cualquier polipéptido HGF natural o variante (ya sea de origen natural o sintético) que es capaz de activar la trayectoria de señalización HGF/c-met bajo condiciones que permiten que ocurra tal proceso. El término "HGF de tipo silvestre" se refiere generalmente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una proteína HGF de origen natural. El término "secuencia HGF de tipo silvestre" se refiere en general a una secuencia de aminoácidos encontrada en un HGF de origen natural . Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se utilizan de manera intercambiable en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (e.g., para anticuerpos monoclonales de longitud total o intactos) , anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (e.g., anticuerpos biespecíficos siempre que exhiban la actividad biológica deseada) y también pueden incluir ciertos fragmentos de anticuerpo (como se describe en mayor detalle en la presente) . Un anticuerpo puede ser humano, humanizado y/o madurado por afinidad. "Fragmentos de anticuerpo" comprenden solo una porción de un anticuerpo intacto, en donde la porción retiene preferentemente al menos una, preferentemente la mayoría o todas las funciones normalmente asociadas con esa porción cuando se encuentra presente en un anticuerpo intacto. En una modalidad, el fragmento de anticuerpo comprende un sitio de unión de antígeno del anticuerpo intacto y por tanto retiene la capacidad para unir el antígeno. En otra modalidad, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo uno que comprende la región Fc, retiene al menos una de las funciones biológicas normalmente asociadas con la región Fc cuando se encuentra presente en un anticuerpo intacto, tal como la unión FcRn, modulación de la vida media del anticuerpo, la función ADCC y la unión de complemento. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una vida media in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, tal fragmento de anticuerpo puede comprender un brazo de unión de antígeno unido a una secuencia Fc capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento . El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, i.e., los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden encontrarse presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un solo antígeno. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpo monoclonal que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra una sola determinante en el antígeno. Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntico con u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como a fragmentos de tales anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Patente de E.U. No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 81:6851-6855 (1984)). Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (e.g., murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen mínima secuencia derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en las cuales los residuos de una región hipervariable del recipiente se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como de ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad, y capacidad deseada. En algunas instancias, los residuos de la región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo recipiente o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se efectúan para refinas adicionalmente el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno y típicamente dos dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los circuitos hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FRs son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc) , típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechman et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). Ver también los siguientes artículos de revisión y referencias citadas en los mismos: Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol . , 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech., 5:428-433 (1994) . Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o que se ha producido utilizando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos como se describe en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos no humanos de unión de antígeno. Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más de sus CDRs lo cual da como resultado un aumento en la afinidad del anticuerpo para el antígeno, en comparación con un anticuerpo de origen que no posee esa(s) alteración (es) . Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno objetivo. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen mediante procedimientos conocidos en la técnica. Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad mediante arrastre de dominio VH y VL . La mutagénesis aleatoria de residuos CDR y/o de estructura se describe por: Barbas et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91:3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol . , 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154 (7) : 3310-9 (1995); y Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992). Un anticuerpo de "bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno que une. Los anticuerpos de bloqueo preferidos o anticuerpos antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno. Un "anticuerpo agonista", como se utiliza en la presente, es un anticuerpo que imita al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés. Un "trastorno" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con una sustancia/molécula o método de la invención. Este incluye trastornos o enfermedades crónicas o agudas incluyendo aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Ejemplos no limitantes de los trastornos que van a tratarse en la presente incluyen tumores malignos y benignos; malignidades no leucemia y linfoides; trastornos neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y otros glandulares, macrofagales, epiteliales, estromales y blastocoélicos; y trastornos inflamatorios, inmunológicos y otros relacionados con la angiogénesis. Los términos "trastorno de proliferación celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos asociados con algún grado de proliferación celular anormal. En una modalidad, el trastorno de proliferación celular es cáncer. "Tumor" como se utiliza en la presente, se refiere a todo crecimiento y proliferación celular neoplásica, ya sea maligna o benigna, y a toda célula o tejido pre-canceroso o canceroso. Los términos "cáncer", "canceroso", "trastorno de proliferación celular", "trastorno proliferativo" y "tumor" no son mutuamente exclusivos como se refieren en la presente. Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por el crecimiento/proliferación celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de célula escamosa, cáncer pulmonar de célula pequeña, cáncer pulmonar de célula no pequeña, adenocarcinoma del pulmón, carcinoma escamoso del pulmón, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer hepático, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer renal, cáncer hepático, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer tiroideo, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. Como se utiliza en la presente, "tratamiento" se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el curso natural del individuo o célula tratado, y puede llevarse a cabo ya sea por profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la prevención de la ocurrencia o recurrencia de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución del grado de progreso de la enfermedad, mejoramiento o paliación del estado de la enfermedad, y remisión o pronóstico mejorado. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención se utilizan para retardar el desarrollo de una enfermedad o trastorno. Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosis y durante períodos de tiempo necesarios para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una sustancia/molécula de la invención, agonista o antagonista puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad de la sustancia/molécula, agonista o antagonista para emitir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una en la cual se compensa todo efecto tóxico o dañino de la sustancia/molécula, agonista o antagonista mediante los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva en dosis y durante períodos de tiempo necesarios para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, pero no necesariamente, dado que una dosis profiláctica se utiliza en sujetos previo a o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva. El término "agente citotóxico" como se utiliza en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de las células y/o ocasiona la destrucción de las células. El término pretende incluir isótopos radiactivos ( e . g . , Ar211, I131, I125, Y90, Re188, Sm153, Bi212 , P32 e isótopos radiactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos e.g., metotrexato, adriamicina, vinca alcaloides (vincristina, vinblastina, etoposida) , doxorrubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorrubicina u otros agentes de intercalado, enzimas y sus fragmentos tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos, y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen fungal, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas, y los diversos agentes antitumor y anticáncer descritos abajo. Se describen abajo otros agente citotóxicos. Un agentes tumoricida ocasiona la destrucción de las células de tumor. Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes de alquilación tales como tiotepa y CITOXAN® ciclofosfamida; alquil sulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan, aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa, y uredopa; etilenoiminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosformaida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinoma) ; delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®) ; beta-lapacona; lapacol; colquicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®) , CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecin, scopolectin, y 9-aminocamptotecin) ; briostatin; calistatin; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatin; duocarmicin (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobin; pancratistatin; una sarcodicitina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro de mecloretamina óxido, melfalan, novembicin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocin, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimustina; antibióticos tales como antibióticos de enediina (e.g., caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama II y caliqueamicina omega II (ver, e.g., Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994)); dinemicin, incluyendo dinemicin A; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos de antibiótico de cromoproteína enediina relacionados), aclacinomisinas, actinomicin, autramicin, azaserina, bleomicinas, cactinomicin, carabicin, carminomicin, cazinofilin, cromomicinas, dactinomicin, daunorrubicin, detorrubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicin (incluyendo ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorrubucin, cianomorfolino-doxorrubicin, inyección de liposoma 2-pirrolino-doxorrubicin HCl (DOXIL®) y deoxidoxorrubicin) , epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicin, olivomicinas, peplomicin, potfiromicin, puromicin, quelamicin, rodorubicin, estreptonigrin, estreptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zotorubicin, anti-metabolitos tales como mototrexato, gemcitabina (GEMZAR®) , tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), una epotilona, y 5-fluoroacil (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterin, metotrexato, pteropterin, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxiflridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como clausterona, dromostanolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminogluteimida, mitotano, trilostano; rellenador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicosida; ácido aminoleuvínivo; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfonitina; eliptinio acetato; etoglucid; galio nitrato; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantro; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet : pirarrubicin; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxin; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2, 2', 2''-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridin A y anguidina) ; uretan; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, e.g., paclitaxel (TAXOL®), formulación de paclitaxel de nanopartículas fabricadas de albúmina (ABRAXANE™) , y doxetaxel (TAXOTERE®); clorambucil; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatin y carboplatin; vinblastina (VELBAN®) ; platino; etoposida (VP16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®) ; oxaliplatin; leucovovin; vinoreblina (NOVALBINA®) ; novantrona; edatrexato; daunomicin; aminopterin; ibandronato; inhibidor topoisomerasa RFS 2000; diflurometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicin, vincristina y prednisona y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatin (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovovin. También incluidos en esta definición se encuentran agentes anti-hormonales que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer, y frecuentemente se encuentran en forma de tratamiento sistémico, o corporal total. Pueden ser hormonas en sí. Ejemplos incluyen anti-estrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERMs), incluyendo, por ejemplo, tamoxifen (incluyendo NOVALDEX® tamoxifen), raloxifeno (EVISTAR®) , droloxifeno, 4-hidroxitamoxifen, trioxifeno, keoxifeno, LY1170018, onapristona, y toremifeno (FARESTON®) ; anti-progesteronas; sub-reguladores del receptor de estrógeno (ERDs) ; antagonistas del receptor de estrógeno tales como fluvestrant (FASLODEX®); agentes que funcionan para suprimir o desactivar los ovarios, por ejemplo, agonistas de hormona de liberación de la hormona leutinizante (LHRH) tales como leuprolida acetato (LUPRON® y ELIGARD®) , goserelin acetato, buserelin acetato y tripterelin; otros anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; e inhibidores de aromatasa que inhibe la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, por ejemplo, 4 (5) -imidazolos, aminoglutetimida, megesterol acetato (MEGASE®) , exemestano (AROMASIN®) , formestania, fadrozolo, vorozolo (RIVISOR®) , letrozolo (FEMARA®, y anastrozolo (ARIMIDEX®) . Adicionalmente, tal definición de agentes quimioterapéuticos incluye bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®) , etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zolendrónico/zolendronato (ZOMETA®, alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®) , tiludronato (SKELID®) , o risedronato (ACTONEL®) ; así como troxacitabina (un análogo de 1, 3-dioxolano nucleósido citosina) ; oligonucleótidos de antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en trayectorias de señalización implicadas en proliferación celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; vacunas tales como vacuna THERATOPE® y vacunas de terapia de gen, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; inhibidor topoisomerasa 1 (e.g., LUROTECAN®) ; rmRH (e.g., ABARELIX®) ; lapatinib ditosilato (un inhibidor de molécula pequeña ErbB-2 y EGFR doble de tirosina cinasa también conocido como GW572016) ; inhibidores COX-2 tales como celecoxib (CELEBREX®); 4- (5- ( 4-metilfenil) -3-( trifluorometil) -lH-pirazol-1-il) bencenosulfonamida; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores. Un "agente inhibidor del crecimientos" cuando se utiliza en la presente se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula cuyo crecimiento depende de la activación de HGF/c-met ya sea in vitro o in vivo. Por tanto, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células dependientes de HGF/c-met es fase S. ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean el progreso del ciclo celular (en un sitio diferente a la fase S) , tales como los agentes que inducen el arresto de Gl y el arresto de fase" M. Los bloqueadores clásicos en fase M incluyen los vincas (vincristina y vinblastina) , taxanos, e inhibidores de topoisomerasa II tales como doxorrubicina, epirubicina, daunorrubicina, etoposida y bleomicina. Aquellos agentes que arrestan Gl también se extienden al arresto sobre la fase S, por ejemplo, agentes de alquilación ADN tales como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, mototrexato, 5-fluoroacil y ara-C. Puede encontrarse información adicional en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son drogas anticáncer ambas derivadas del árbol tejo. Docetaxel (TAXOTERE®), Rhone-Poulenc Rorer) , derivado del tejo Europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblado de microtúbulos de dímeros tubulina y estabilizan los microtúbulos evitando la despolimerización, lo cual da como resultado la inhibición de mitosis en las células. "Doxorrubicin" es un antibiótico. El nombre químico completo de doxorrubicin es (8S-cis) -10- [ (3-amino-2,3, 6-trideoxi-a-L-lixo-hexapiranosil) oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6, 8, ll-trihidroxi-8- (hidroxiacetil) -l-metoxi-5, 12-naftacenodiona . Composiciones y Métodos de la Invención A. Anticuerpos En una modalidad, la presente invención proporciona anticuerpos que pueden encontrar su uso en la presente como agentes terapéuticos y/o diagnósticos. Los anticuerpos ejemplares incluyen, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados. 1. Anticuerpos Policlonales Los anticuerpos policlonales surgen preferentemente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante (especialmente cuando se utilizan péptidos sintéticos) a una proteína inmunogénica en la especie que va a inmunizarse. Por ejemplo, el antígeno puede conjugarse a hemocianina de lapa californiana (KLH) , albúmina de suero, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja, utilizando un agente bifuncional o de derivación, e.g., maleimidobenzoil sulfosuccinimida éster (conjugación a través de residuos cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuos lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12 o R1N=C=NR, en donde R y R1 son diferentes grupos alquilo. Se inmuniza a los animales contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados combinando e.g., 100 µg o 5 µg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución de manera intradérmica en múltiples sitios. Un mes después, se refuerza a los animales con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días después, se sangra a los animales y se analiza el suero por titulación de anticuerpo. Se refuerza a los animales hasta estabilizar la titulación. También pueden producirse conjugados en cultivo celular recombinante como fusiones de proteína. También se utilizan adecuada mente agentes de agregación tales como alum para mejorar la respuesta inmune. 2. Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos monoclonales pueden producirse utilizando el método hibridoma primeramente descrito por Kohier et al., Nature 256:495 (1975), o pueden producirse mediante métodos de ADN recombinante (Patente de E.U. No. 4,816,567) . En el método hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped adecuado, tal como un hámster, como se describió anteriormente para emitir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Después de la inmunización, los linfocitos se aislan y después se fusionen con una línea celular mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietileno glicol, para formar una célula hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986) ) . Las células hibridoma así preparadas se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células mieloma de origen no fusionadas (también referidas como socio de fusión) . Por ejemplo, si las células mieloma de origen carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo selectivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT. Las células mieloma socios de fusión preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la producción a alto nivel del anticuerpo por las células de producción de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio selectivo que selecciona contra las células de origen no fusionadas. Las líneas celulares mieloma preferidas son líneas mieloma murinas, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EUA, y SP-2 y derivados, e.g., células X63-Arg8-653 disponibles del American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, EUA. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor J. Immunol . , 133:3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). El medio de cultivo en el cual se cultivan las células hibridoma se analiza por la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un análisis de unión in vitro, tal como un radioinmunoanálisis (RÍA) o análisis inmunoabsorbentes de unión de enzima (ELISA) . La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal, por ejemplo, puede determinarse mediante el análisis Scatchard descrito en Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980). Una vez identificadas las células hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones pueden subclonarse limitando los procedimientos de dilución y cultivarse mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986). El medio de cultivo adecuado para este propósito incluye, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores ascitos en un animal e.g., mediante inyección ip de las células en ratones. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido de ascitos o suero mediante procedimientos de purificación de anticuerpo convencionales tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad (e.g., utilizando proteína A o proteína G sefarosa) o cromatografía de intercambio de ion, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis, etc. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla y secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (e.g., utilizando sondas de oligonucleótido capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que después se transfectan en células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células de Ovario de Hámster Chino (CHO) , o células mieloma que de otra manera no producen proteína de anticuerpo, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en células huésped recombinantes. Los artículos de revisión acerca de la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican para el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol . , 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol . Revs., 130:151-188 (1992) . En una modalidad adicional, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de bibliotecas fago de anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas fago. Publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) mediante arrastre de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como infección de combinación y recombinación in vivo como una estrategia para construir muy grandes bibliotecas fago (Waterhouse et al., Nuc. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)). De esta manera, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas hibridoma tradicionales de anticuerpo monoclonal para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El ADN que codifica para el anticuerpo puede modificarse para producir polipéptidos de anticuerpo quiméricos o de fusión, por ejemplo, sustituyendo las secuencias de dominio constante humano de cadena pesada y de cadena ligera (CH y CL) para las secuencias murinas homologas (Patente de E.U. No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 81:6851 (1984)) o fusionando la secuencia de codificación de inmunoglobulina con toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no inmunoglobulina (polipéptido heterólogo) . Las secuencias de polipéptidos no inmunoglobulina pueden sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo quimérico bivalente que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente. 3. Anticuerpos Humanos y Humanizados los anticuerpos de la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (e.g., murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o sus fragmentos (tales como Fv. Fab, FabX F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpo de unión de antígeno) que contienen mínima secuencia derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en las cuales los residuos de una región de determinación de complementariedad (CDR) del recipiente se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como de ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunas instancias, los residuos de estructura Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo recipiente ni en la CDR importada o las secuencias de estructura. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno y típicamente dos dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también de manera óptima al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992) ] .

Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos se conocen en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en el mismo de una fuente no humana. Estos residuos de aminoácido no humanos se refieren frecuentemente como residuos de "importación", que se toman típicamente desde un dominio variable de "importación". La humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)], sustituyendo las CDRs de roedor o secuencias CDR para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de E.U. No. 4,816,567), en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. La selección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que van a utilizarse en la preparación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad y la respuesta HAMA (anticuerpo humano anti-ratón) cuando el anticuerpo se pretende para uso terapéutico humano. De acuerdo con el llamado método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se visualiza contra toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humano conocidas. La secuencia de dominio V humano que se encuentra más cercana a la del roedor se identifica y se acepta la región de estructura humana (FR) dentro de la misma para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro método utiliza una región de estructura particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligera o pesada. La misma estructura puede utilizarse para diversos anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA., 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)). Además es importante que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias de origen y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales se encuentran comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Se encuentran disponibles programas de computadora que ilustran y despliegan probables estructuras de conformación tridimensionales de secuencias de inmunoglobulina candidato seleccionadas. La inspección de estas imágenes permite el análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, i.e., el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidato para unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias recipientes y de importación de manera que se logra la característica del anticuerpo deseada, tal como un incremento en la afinidad para el (los) antígeno(s) objetivo. En general, los residuos de región hipervariable se encuentran directa y más sustancialmente implicados en la influencia en la unión de antígeno. Se contemplan diversas formas de anticuerpo humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab, que se conjuga opcionalmente con uno o más agentes citotóxicos a fin de generar un inmunoconjugado. Alternativamente, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgGl intacto. Como una alternativa a la humanización, pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, es posible ahora producir animales transgénicos (e.g., ratones) capaces, al inmunizarse, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homózigua del gen de la región de unión de cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la completa inhibición de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de la disposición del gen de inmunoglobulina de línea germinal humana en tales ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos al reto con antígeno. Ver, e.g., Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA., 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); Patentes de E.U. Nos. 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (todas de GenPharm) ; 5,545,807; y WO 97/17852. Alternativamente, la tecnología de imagen fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 [1990]) puede utilizarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de repertorios de gen de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes de dominio V de anticuerpo se clonan en marco a un gen de proteína de cubierta ya sea mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se despliegan como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma fago, las selecciones en base a las propiedades funcionales del anticuerpo dan como resultado también la selección del gen que codifica para el anticuerpo que exhibe esas propiedades. Así, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. la imagen fago puede efectuarse en una diversidad de formatos, revisados e.g., en Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J. Current Opinión in Structural Biology, 3:564-571 (1993). Diversas fuentes de segmentos de gen V pueden utilizarse para la imagen fago. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) aisló una disposición diversa de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados puede construirse y pueden aislarse anticuerpos para una disposición diversa de antígenos (incluyendo auto-antígenos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver también Patentes de E.U. Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Como se trató anteriormente, los anticuerpos humanos también pueden generarse mediante células B activadas in vitro (ver Patentes de E.U. Nos. 5,567,610 y 5,229,275). 4. Fragmentos de anticuerpo En ciertas circunstancias existen ventajas en el uso de fragmentos de anticuerpo, en lugar de anticuerpos completos . El tamaño más pequeño de los fragmentos permite una rápida limpieza y puede conducir a un mejor acceso a tumores sólidos. Diversas técnicas se han desarrollado para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron a través de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, e.g., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse ahora directamente o mediante células huésped recombinantes. Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv pueden todos expresarse en y secretarse de E. coli, permitiendo así la fácil producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las bibliotecas fago de anticuerpos antes descritas, alternativamente, los fragmentos Fab' -SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro procedimiento, los fragmentos F)ab')2 pueden aislarse directamente de un cultivo de célula huésped recombinante. El fragmento Fab y F(ab')2 con una vida media in vivo aumentada que comprende residuos epítope de unión de receptor silvestre se describe en la Patente de E.U. No. 5,869,046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán aparentes para el técnico experto. En otras modalidades, el anticuerpo seleccionado es un fragmento Fv monocatenario (scFv) . Ver WO 93/16185; Patente de E.U. No. 5,571,894; y Patente de E.U. No. 5,587,458. Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que se derivan de regiones constantes; por tanto, son adecuados para la unión reducida no específica durante el uso in vivo. Las proteínas de fusión sFv pueden construirse para producir la fusión de una proteína efector ya sea en la terminación amino o carboxi de un sFv. Ver, Antibody Engineering, ed., Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", e.g., como se describe en la Patente de E.U. No. 5,641,870, por ejemplo. Tales fragmentos de anticuerpo lineal pueden ser no específicos o biespecíficos. 5. Anticuerpos Biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos diferentes epítopes. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden unir dos diferentes epítopes de hepsina, HGF y/o complejo de hepsina: HGF como se describe en la presente. Otros de tales anticuerpos pueden combinar un sitio de unión en estas entidades con un sitio de unión para otro polipéptido. Alternativamente, puede combinarse un brazo de anticuerpo con un brazo que se une a una molécula de activación en un leucocito tal como una molécula receptor de célula T (e.g., CD3), o receptores Fc para IgG (FcyR), tal como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) , a fin de enfocar y localizar mecanismos de defensa celular a la hepsina y/o célula que expresa HGF y/o de unión. Los anticuerpos biespecíficos también pueden utilizarse para localizar agentes citotóxicos en células que expresan y/o se unen a hepsina, HGF y/o complejo de hepsina: HGF. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión de polipéptido y un brazo que se une al agente citotóxico (e.g., saporina, anti-interferón-a, vinca alcaloide, cadena A de ricina, metotrexato o hapteno de isótopo radiactivo) . Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud total o fragmentos de anticuerpo (e.g., anticuerpos F(ab')2 biespecíficos). La WO 96/16673 describe un anticuerpo anti-ErbB2/anti-FcyRIII biespecífico y la Patente de E.U. No. 5,837,234 describe un anticuerpo anti-ErbB2/anti-FcyRI biespecífico. Se muestra un anticuerpo anti-ErbB2/Fca biespecífico en la WO 98/02463. La Patente de E.U. No. 5,821,337 muestra un anticuerpo anti-ErbB2/anti-CD3 biespecífico.

Se conocen en la técnica métodos para producir anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud total se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)) . Debido a la rápida selección de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales una tiene la correcta estructura biespecífica. La purificación de la molécula correcta, que se efectúa comúnmente mediante etapas de cromatografía de afinidad, es algo problemática, y los rendimientos del producto son bajos. Procedimientos similares se describen en la WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) . De acuerdo con un procedimiento diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de antígeno-antígeno) se fusionan a las secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. Preferentemente, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada Ig que comprende al menos parte de las regiones CH2 y CH3 de articulación. Se prefiere que la primera región constante de cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican para las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, para la cadena ligera de inmunoglobulina, se encuentran insertados en vectores de expresión separados, y se co-transfectan en una célula huésped adecuada. Esto proporciona mayor flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de tres fragmentos polipéptido en modalidades en las que las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan un óptimo rendimiento del anticuerpo biespecífico deseado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas polipéptido en un solo vector de expresión cuando la expresión de al menos dos de las cadenas polipéptido en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no tienen un efecto significativo en el rendimiento de la combinación de cadena deseada . En una modalidad preferida de este procedimiento, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (proporcionando una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, dado que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo fácil de separación. Este procedimiento se describe en la WO 94/04690. Para detalles adicionales para la generación de anticuerpos biespecíficos, ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986). De acuerdo con otro procedimiento descrito en la Patente de E.U. No. 5,731,168, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo puede fabricarse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La interfaz preferida comprende al menos una parte del dominio CH3. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácido pequeñas de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo, se reemplaza con cadenas laterales más grandes (e.g., tirosina o triptofan) . Se crean "cavidades" compensadoras de tamaño idéntico o similar para la(s) cadena (s) lateral (es) grande (s) en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando grandes cadenas laterales de aminoácido con unas más pequeñas (e.g., alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros. Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas (Patente de E.U. No. 4,676,980), y para el tratamiento de infección VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados pueden producirse utilizando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son muy conocidos en la técnica, y se describen en la Patente de E.U. No. 4,676,980, conjuntamente con un número de técnicas de reticulación. Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse utilizando unión química. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describen un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se dividen proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante ditiol, arsenita de sodio, para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab' -TNB se reconvierte entonces en el Fab' -tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab' -SH a partir de E. coli, que puede acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizada. Cada fragmento Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de unirse a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y las células T humanas normales, así como de activar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos de tumor de mama humano. También se han descrito diversas técnicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente a partir del cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando zipers de leucina. Kostelny et al., J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos de ziper de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a as porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos mediante fusión de gen. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región de articulación para formar monómeros y después se re-oxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología "diabody" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para producir fragmentos e anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un VH conectado a un VL mediante una unión que es demasiado corta para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan al emparejamiento con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión de antígeno. También se ha reportado otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante el uso de dímeros Fv monocatenarios (sFv) . Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994). Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos . Tutt et al., J. Immunol., 147:60 (1991). 6. Anticuerpos Heteroconjugados Los anticuerpos heteroconjugados también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos unidos de manera covalente. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas [Patente de E.U. No. 4,676,980], y para el tratamiento de infección VIH [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089] . Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro utilizando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio disulfuro o formando una unión tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la Patente de E.U. No. 4,676,980. 7. Anticuerpos Multivalentes Un anticuerpo multivalente puede internalizarse (y/o catabolizarse) más rápido que un anticuerpo bivalente mediante la expresión celular de un antígeno al cual se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (diferentes a los de clase IgM) con tres o más sitios de unión de antígeno (e.g., anticuerpos tetravalentes) , que pueden producirse fácilmente mediante la expresión recombinante del ácido nucleico que codifica para las cadenas polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión de antígeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste de) una región Fc o una región de articulación. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fc y tres o más sitios de unión de antígeno de terminación amino para la región Fc. El anticuerpo multivalente preferido comprende (o consiste de) tres a aproximadamente ocho, pero preferentemente cuatro sitios de unión de antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena polipéptido (y preferentemente dos cadenas polipéptido) , en donde la(s) cadena (s) polipéptido comprende (n) dos o más dominios variables. Por ejemplo, la(s) cadena (s) polipéptido puede (n) comprender VD1- (XI) n-VD2- (X2) n-Fc, en donde CDl es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena polipéptido de una región Fc, XI y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, la(s) cadena (s) polipéptido puede (n) comprender: cadena VH-CHl-unión flexible-VH-CHl-región Fc; o cadena VH-CHl-VH-CHl-región Fc . El anticuerpo multivalente en la presente comprende además preferentemente al menos dos (y preferentemente cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente en la presente, por ejemplo, puede comprender de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados en las presente comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, comprenden además un dominio CL. 8. Fabricación de la Función Efector Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efector, e.g., a fin de mejorar la citotoxicidad dependiente del antígeno mediada por la célula (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede lograrse introduciendo una o más sustituciones de aminoácido en una región Fc del anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, pueden introducirse residuos cisteína en la región Fc, permitiendo así la formación de la unión disulfuro intercatenaria en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o destrucción celular aumentada mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Ver, Carón et al., J. Exp. Med., 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol . , 148:29182922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumor aumentada también pueden prepararse utilizando reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, puede fabricarse un anticuerpo que tiene regiones Fc dobles y en consecuencia puede tener lisis de complemento mejorada y capacidades ADCC. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Para incrementar la vida media en suero del anticuerpo, puede incorporarse un epítope de unión de receptor silvestre en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la Patente de E.U. 5,739,277, por ejemplo. Como se utiliza en la presente, el término "epítope de unión de receptor silvestre" se refiere a un epítope de la región Fc de una molécula IgG (e.g., IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4) responsable por el incremento en la vida media en suero de la molécula IgG. 9. Inmunoconjugados La invención también se refiere a inmunoconjugados, o conjugados de anticuerpo-droga (ADC) , que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, una droga, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (e.g., una toxina enzimáticamente activa de origen bacterial, fungal, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (i.e., un radioconjugado) . El uso de conjugados de anticuerpo-droga para el suministro local de agentes citotóxicos o citostáticos, i.e., drogas para destruir o inhibir las células de tumor en el tratamiento del cáncer (Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drg. Del. Rev. 26:151-172; Patente de E.U. 4,975,278) teóricamente permite el suministro dirigido del residuo de droga a tumores y la acumulación intracelular en los mismos, en donde la administración sistémica de estos agentes de droga no conjugados puede dar como resultado niveles de toxicidad no aceptables en células normales así como en células de tumor que pretenden eliminarse (Baldwin et al., (1986) Lancet pp . (Mar. 15 de 1986) : 603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers of Citotoxic Agents in Cáncer Therapy: A Review" en Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, A. Pinchera et al., (eds.), pp. 475-506). Mediante esto se busca la máxima eficacia con mínima toxicidad. Se ha reportado que tanto los anticuerpos policlonales como los anticuerpos monoclonales son útiles en estas estrategias (Rowland et al., (1986) Cáncer Immunol . Immunother., 21:183-87). Las drogas en estos métodos incluyen daunomicin, daunorrubicin, metotrexato, y vindesina (Rowland et al., (1986) supra). Las toxinas utilizadas en conjugados de anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacteriales tales como la toxina de difteria, toxinas vegetales tales como ricina, toxinas de molécula pequeña tales como geldamicina (Mandler et al., (2000) Jour. Of the Nat. Cáncer Inst., 92 (19) : 1573-1581; Mandler et al., (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 93:8618-8623), y caliqueamicina (Lode et al., (1998) Cáncer Res. 58:2928; Hinman et al., (1993) Cáncer Res. 53:3336-3342). Las toxinas pueden efectuar sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos que incluyen unión tubulina, unión ADN, o inhibición topoisomerasa. Algunas drogas citotóxicas tienden a ser inactivas o menos activas cuando se conjugan con grandes anticuerpos o ligantes de receptor de proteína. ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) es un conjugado de anticuerpo-radioisótopo compuesto de un anticuerpo monoclonal kappa IgGl murino dirigido contra el antígeno CD20 encontrado en la superficie de linfocitos B normales y malignos y radioisótopo n?In o 90Y unido por una unión tiourea-quelador (Wiseman et al., (2000) Eur. Jour. Nucí. Med. 27 (7) : 766-77; Wiseman et al., (2002) Blood 99(12) :4336-42; Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol., 20(10) :2453-63; Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol., 20 (15) :3262-69) . Aunque ZEVALIN tiene actividad contra linfoma no de Hodgkin (NHL) de célula B, la administración da como resultado severas y prolongadas citopenias en la mayoría de los pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicin, Wyeth Pharmaceuticals), un conjugado de droga de anticuerpo compuesto de un anticuerpo hu CD33 unido a caliqueamicina, se aprobó en el 2000 para el tratamiento de leucemia mieloide aguda por inyección (Drugs of the Future (2000) 25(7) :686; Patentes de E.U. Nos. 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001) . Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), un conjugado de droga de anticuerpo compuesto del anticuerpo hu C242 unido a través de la unión disulfuro SPP al residuo de droga maitansinoide, DM1, se encuentra avanzando en pruebas de Fase II para el tratamiento de cánceres que expresan CanAg, tales como de colon, pancreático, gástrico y otros. MLN-2704 (Millenium Pharm, BZL Biologics, Immunogen Inc.), un conjugado de droga de anticuerpo compuesto del anticuerpo monoclonal de antígeno de membrana específico anti-próstata (PSMA) unido al residuo de droga maitansinoide, DM1, se encuentra en desarrollo para el tratamiento potencial de tumores de próstata. Los péptidos auristatin, auristatin E (AE) y monometilauristatin (MMAE) , análogos sintéticos de dolastatin, se conjugaron a anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y en carcinomas) y cAClO (específicos para CD30 en malignidades hematológicas) (Doronina et al., (2003) Nature Biotechnology 21 (7) : 778-784 ) se encuentran bajo desarrollo terapéutico. Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados se han descrito anteriormente. Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden utilizarse incluyen cadena A de difeteria, fragmentos activos no de unión de la toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantin, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcin, crotin, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restrictocin, fenomicin, enomicin, y los tricotecenos . Se encuentra disponible una variedad de radionúclidos para la producción de anticuerpos radioconjugados . Ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y, y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se producen utilizando una diversidad de agentes bifuncionales de acoplamiento de proteínas tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP) , iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl), esteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina) , diisocianatos (tales como tolueno 2, 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente de quelación ejemplar para la conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Ver WO 94/11026. Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como caliqueamicina, maitansinoides, un tricoteceno, y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también se contemplan en la presente. Maitansina y maitansinoides En una modalidad, un anticuerpo (de longitud total o fragmentos) de la invención se conjuga a una o más moléculas maitansinoides. Los maitansinoides son inhibidores mitotóticos que actúan inhibiendo la polimerización tubulina. La maitansina se aisló primeramente a partir del arbusto de África del este Maytenus serrata (Patente de E.U. No. 3,896,111). Subsecuentemente, se descubrió que ciertos microbios producen también maitansinoides, tales como maitansinol y esteres de maitansinol C-3 (Patente de E.U. No. 4,151,042). El maitansinol sintético y sus derivados y análogos se describen, por ejemplo, en las Patentes de E.U. Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608 4,265,814 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269 4,309,428 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348 4,331,598 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533 cuyas descripciones se incorporan expresamente en la presente mediante la referencia. Conjugados de maitansinoide-anticuerpo En un intento por mejorar el índice terapéutico, la maitansina y los maitansinoides se han conjugado a anticuerpos que se unen específicamente a antígenos de célula de tumor. Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en las Patentes de E.U. Nos. 5,208,020, 5,416,064 y la Patente Europea EP 0 425 235 Bl, cuyas descripciones se incorporan expresamente en la presente mediante la referencia. Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 93:8618-8623 (1996) describieron inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide designado DM1 unido al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal humano. Se encontró que el conjugado es altamente citotóxico hacia células cultivadas de cáncer de colon, y mostraron actividad anti-tumor en un análisis de crecimiento de tumor in vivo. Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992) describen inmunoconjugados en los cuales un maitansinoide se conjugó a través de una unión disulfuro al anticuerpo murino A7 uniéndose a un antígeno en líneas celulares de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.l que se une al oncógeno HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado TA.1-maitansinoide se probó in vitro en la línea celular de cáncer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antígenos de superficie por célula. El conjugado de droga logró un grado de citotoxicidad similar a la droga de maitansinoide libre, que pudo incrementarse aumentando el número de moléculas maitansinoides por molécula de anticuerpo. El conjugado A7-maitansinoide mostró baja citotoxicidad sistémica en ratones. Conjugados de anticuerpo-maitansinoide (inmunoconjugados) Los conjugados de anticuerpo maitansinoide se preparan uniendo químicamente un anticuerpo a una molécula maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica ya sea del anticuerpo o de la molécula maitansinoide. Un promedio de 3-4 moléculas maitansinoides conjugadas por molécula de anticuerpo ha mostrado eficacia para mejorar la citotoxicidad de células objetivo sin afectar negativamente la función o solubilidad del anticuerpo, aunque se esperaría que incluso una molécula de toxina/anticuerpo mejore la toxicidad durante el uso de anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son muy conocidos en la técnica y pueden sintetizarse mediante técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Los maitansinoides se describen, por ejemplo, en la Patente de E.U. No. 5,208,020 y en las otras patentes y publicaciones no patentes referidas anteriormente, los maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tal como diversos esteres de maitansinol. Existen muchos grupos de unión conocidos en la técnica para producir conjugados de anticuerpo-maitansinol, incluyendo, por ejemplo, los descritos en la Patente de E.U. No. 5,208,020 o Patente EP 0 425 235 Bl, y Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992). Los grupos de unión incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles al ácido, grupos lábiles a peptidasa, o grupos lábiles a la esterasa, como se describe en las patentes antes identificadas, siendo preferidos los grupos disulfuro y tioéter. Los conjugados del anticuerpo y el maitansinoide pueden producirse utilizando una variedad de agentes bifuncionales de acoplamiento de proteína tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipi idato HCl) , esteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina) , diisocianatos (tales como tolueno 2, 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activo (tales como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno) . Los agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N-succinimidil-3- (2-piridilditio)propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]) y N-succinimidil-4-(2-piridiltio) pentanoato (SPP) para proporcionar una unión disulfuro . La unión puede unirse a la molécula de maitansinoide en diversas posiciones, dependiendo del tipo de la unión. Por ejemplo, una unión éster puede formarse por la reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción puede presentarse en la posición C-3 teniendo un grupo hidroxilo en la posición C-14 modificado con hidroximetilo, en la posición C-15 modificado con un grupo hidroxilo, y en la posición C-20 teniendo un grupo hidroxilo. En una modalidad preferida, la unión se forma en la posición C-3 del maitansinol o un análogo de maitansinol. Caliqueamicina Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina. La familia caliqueamicina de antibióticos es capaz de producir fracturas de ADN bicatenario en concentraciones sub-picomolares. Para la preparación de los conjugados de la familia caliqueamicina, ver Patentes de E.U. No. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (todas para American Cyanamid Company). Los análogos estructurales de caliqueamicina que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a yi1, a21, o^1, N-acetil-yi1, PSAG y ?1! (Hinman et al., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las Patentes de E.U. antes mencionadas para American Cyanamid) . Otra droga anti-tumor que puede conjugarse al anticuerpo es QFA que es un antifolato. Tanto caliqueamicina como QFA tienen sitios intracelulares de acción y no cruzan fácilmente la membrana de plasma. En consecuencia, la absorción celular de estos agentes a través de internalización mediada por anticuerpo mejora grandemente sus efectos citotóxicos. Otros agentes citotóxicos Otros agentes antitumor que pueden conjugarse a los anticuerpos de la invención incluyen BCNU, estreptozoicin, vincristina y 5-fluoroacil, la familia de agentes conocida colectivamente como complejo LL-E33288 descrita en las Patentes de E.U. 5,053,394, así como las esperamicinas (Patente de E.U. No. 5,877,296). Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden utilizarse incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos de no unión de toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena A de ricina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantin, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcin, crotin, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restrictocin, fenomicin, enomicin, y los tricotecenos . Ver, por ejemplo, WO 93/21232 publicada en Octubre 28 de 1993. La presente invención contempla además un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (e.g., una ribonucleasa o una ADN endonucleasa tal como una desoxirribonucleasa; Dnasa) . Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radiactivo.

Se encuentra disponible una variedad de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos radioconjugados . Los D Re~ 188, S o™m153, DBi. 212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu. Cuando el conjugado se utiliza para detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios escintigráficos, por ejemplo, tc99m o I123, o una marca giratoria para visualización por resonancia magnética nuclear (NMR) (también conocida como visualización por resonancia magnética, mri), tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Las radio-marcas u otras pueden incorporarse en el conjugado en análisis conocidos. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse mediante síntesis química de aminoácidos utilizando precursores de aminoácido adecuados que implican, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Las marcas tales como tc99m, o I123, Re186 e In111 pueden unirse a través de un residuo cisteína en el péptido. Itrio-90 puede unirse a través de un residuo lisina. El método IODOGEN (Fraker et al., (1978) Biochem. Biophys. Res.

Commun. 80:49-57 puede utilizarse para incorporar yodo-124. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico puede producirse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl), esteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina) , diisocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987). El .ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente de quelación ejemplar para la conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Ver WO 94/11026. La unión puede ser una "unión divisible" facilitando la liberación de la droga citotóxica en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse una unión lábil al ácido, unión sensible a peptidasa, unión fotolábil, unión dimetil o unión que contiene disulfuro (Chari et al, Cáncer Research 52:127-131 (1992); Patente de E.U. No. 5,208,020). Los compuestos de la invención contemplan expresamente, pero no se limitan a, ADC preparado con reactivos reticuladores: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB ( succinimidil- (4-vinilsulfona) benzoato) que se encuentran comercialmente disponibles (e.g., de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, E.U.A.). Ver páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog. PREPARACIÓN DE CONJUGADOS DE DROGA DE ANTICUERPO En los conjugados de droga de anticuerpo (ADC) de la invención, un anticuerpo (Ab) se conjuga a uno o más residuos de droga (D) , e.g., aproximadamente 1 a aproximadamente 20 residuos de droga por anticuerpo, a través de una unión (L) . El ADC de la Fórmula i puede prepararse mediante diversas vías, empleando reacciones de química orgánica, y reactivos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo: (1) reacción de un grupo nucleofílico de un anticuerpo con un reactivo de unión bivalente para formar Ab-L a través de una unión covalente, seguida por la reacción con un residuo de droga D; y (2) reacción de un grupo nucleofílico de un residuo de droga con un reactivo de unión bivalente para formar D-L a través de una unión covalente, seguida por la reacción con el grupo nucleofílico de un anticuerpo.

Ab-(L-D)p Los grupos nucleofílicos en anticuerpos incluyen, pero no se limitan a: 8i) grupos amina de terminal N, (ii) grupos amina de cadena lateral, e.g., lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, e.g., cisteína, y (iv) grupos de azúcar hidroxilo o amino en donde el anticuerpo es glicosilado. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleofílicos y capaces de reaccionar para formar uniones covalentes con grupos electrofílicos en residuos de unión y reactivos de unión incluyendo: (i) esteres activos tales como esteres NHS, esteres HOBt, haloformatos, y haluros ácidos; (ii) haluros alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) aldehidos, cetonas, grupos carboxilo y maleimido. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros intercadena reductibles, i.e., puentes cisteína. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para conjugación con reactivos de unión mediante el tratamiento con un agente de reducción tal como DTT (ditiotreitol). Cada puente cisteína formará por tanto, teóricamente, dos nucleófilos tiol reactivos. Los grupos nucleofílicos adicionales pueden introducirse en anticuerpos a través de la reacción de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) dando como resultado la conversión de una amina en un tiol. Los conjugados de droga de anticuerpo de la invención también pueden producirse mediante la modificación del anticuerpo para introducir residuos electrofílicos, que pueden reaccionar con sustituyentes nucleofílicos en el reactivo o droga de unión. Los azúcares de anticuerpos glicosilados pueden oxidarse, e.g., con reactivos oxidantes de periodato, para formar grupos aldehido o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de reactivos de unión o residuos de droga. Los grupos resultantes imina de base Schiff pueden formar una unión estable o pueden reducirse, e.g., mediante reactivos borohidruro para formar uniones amina estables. En una modalidad, la reacción de la porción carbohidrato de un anticuerpo glicosilado ya sea con galactosa oxidasa o sodio meta-periodato puede producir grupos carbonilo (aldehido y cetona) en la proteína que pueden reaccionar con grupos apropiados en la droga (Hermanson, Bioconjugate Techniques) . En otra modalidad, las proteínas que contienen residuos serina o treonina de terminal N pueden reaccionar con sodio meta-periodato, dando como resultado la producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stoh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Tal aldehido puede reactivarse con un residuo de droga o nucleófilo de unión. De manera similar, los grupos nucleofílicos en un residuo de droga incluyen, pero no se limitan a: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato, y arilhidazida capaces de reactivarse para formar uniones covalentes con grupos electrofílicos en residuos de unión y reactivos de unión incluyendo: (i) esteres activos tales como esteres NHS, esteres HOBt, haloformatos, y haluros de ácido; (ii) haluros alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) aldehidos, cetonas, grupos carboxilo y maleimido. Alternativamente, puede producirse una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y el agente citotóxico, e.g., mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptido. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifican para las dos porciones del conjugado ya sea adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica para un péptido de unión que no destruye las propiedades deseadas del conjugado. Aún en otra modalidad, el anticuerpo puede conjugarse a un "receptor" (tal como estreptavidina) para su uso en la pre-dirección al tumor en donde el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al pacientes, seguido por el retiro del conjugado no unido de la circulación utilizando un agente de limpieza y después por la administración de un "ligante" (e.g., avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (e.g., un radionucleótido) .

. Inmunoliposoma Los anticuerpos descritos en la presente también pueden formularse como inmunoliposomas. Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactante útil para el suministro de una droga a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en. una formación bicapa, similar a la disposición de lípidos de las membranas biológicas. Los liposoma que contienen el anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77:4030 (1980); Pat. de E.U. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y WO 97/38731 publicadas en Octubre 23 de 1997. Los liposomas con tiempo de circulación aumentado se describen en la Patente de E.U. No. 5,013,556. Pueden generarse liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación en fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada de PEG (PEG-PE) . Los liposomas se extruyen a través de filtros de un tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse a los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio disulfuro. Un agente quimioterapéutico se encuentra opcionalmente contenido dentro del liposoma. Ver Gabizon et al., J. National Cáncer Inst., 81(19) :1484 (1989) . B. Oligopéptidos de Unión Los oligopéptidos de unión de la invención son oligopéptidos que se unen, preferentemente de manera específica, a hepsina, HGF y/o complejo hepsina:HGF como se describe en la presente. Los oligopéptidos de unión pueden sintetizarse químicamente utilizando metodología conocida de síntesis de oligopéptido o pueden prepararse y purificarse utilizando tecnología recombinante. Los oligopéptidos de unión son comúnmente de al menos aproximadamente 5 aminoácidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 aminoácidos de longitud o más, en donde tales oligopéptidos son capaces de unirse, preferentemente de manera específica a un polipéptido como se describe en la presente. Los oligopéptidos de unión pueden identificarse sin experimentación indebida utilizando técnicas muy conocidas. A este respecto, se anota que las técnicas para visualizar bibliotecas de oligopéptidos por oligopéptidos capaces de unirse específicamente a un polipéptido objetivo son muy conocidas en la técnica (ver e.g., Patentes de E.U. Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; Publicaciones PCT Nos. WO 84/03506 y WO 84/03564; Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82:178-182 (1985); Geysen et al., en Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol . Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988); Cwirla, S.E. et al., (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87:6378; Lowman H.B. et al., (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson T. et al., (1991) Nature 352:624; Marks J.D., et al., (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang A.S. et al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88:8363 y Smith G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol. , 2: 668) . A este respecto, el despliegue de bacteriófago (fago) es una técnica muy conocida que permite visualizar grandes bibliotecas de oligopéptido para identificar miembro (s) de aquellas bibliotecas capaces de unirse específicamente a un objetivo polipéptido. El despliegue fago es una técnica mediante la cual se despliegan polipéptidos variantes como proteínas de fusión para la proteína de recubrimiento en la superficie de las partículas bacteriófago (Scott, J.K. y Smith G.P. (1990) Science 249:386). La utilidad del despliegue fago reside en el hecho de que grandes bibliotecas de variantes de proteína selectivamente aleatorizadas (o cADNs clonados aleatoriamente) pueden seleccionarse rápida y eficientemente para aquellas secuencias que se unen a una molécula objetivo con alta afinidad. El despliegue de bibliotecas de péptido (Cwirla S.E. et al., (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87:6378) o proteína (Lowman H.B. et al., (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson T. et al., (1991) Nature, 352:624; Marks J.D. et al., (1991) J. Mol. Biol. 222:581; Kang, A.S. et al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88:8363) en fago, se ha utilizado para visualizar millones de polipéptidos u oligopéptidos por unas con propiedades de unión específicas (Smith G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). La selección de bibliotecas fago de mutantes aleatorios requiere una estrategia para construir y propagar un gran número de variantes, un procedimiento por purificación de afinidad utilizando el receptor objetivo, y un medio para evaluar los resultados de enriquecimientos de unión. Patentes de E.U. Nos. 5,223,409, 5, 403,484, 5,571,689, y 5,663,143. Aunque la mayoría de los métodos de despliegue fago han utilizado sistemas de despliegue de fago filamentoso, fago lambdoide (WO 95/34683; E.U. 5,627,024), también se conocen sistemas de despliegue de fago T4 (Ren et al., Gene, 215:439 (1998); Zhu et al., Cáncer Research., 58(15) :3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity 65(11) :4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195 (2) : 303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5:1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10:173 (1995)) y sistemas de despliegue fago T7 (Smith y Scott, Methods in Enzymology, 217:228-257 (1993); E.U. 5,766,905) . Actualmente, se han desarrollado muchas otras mejoras y variaciones del concepto básico de despliegue fago. Estas mejoras aumentan la capacidad de los sistemas de despliegue para seleccionar bibliotecas de péptido para unión a moléculas objetivo seleccionadas y para desplegar proteínas con el potencial para visualizar estas proteínas por las propiedades deseadas. Se han desarrollado dispositivos de reacción combinatoria para reacciones de despliegue fago (WO 98/14277) y se han utilizado bibliotecas de despliegue fago para analizar y controlar interacciones bimoleculares (WO 98/20169; WO 98/20159) y propiedades de péptidos helicoidales constreñidos (WO 98/200306) . La WO 97/35196 describe un método para aislar un ligante de afinidad en el cual una biblioteca de despliegue fago se pone en contacto con una solución en la cual el ligante se unirá a una molécula objetivo y una segunda solución en la cual el ligante de afinidad no se unirá a la molécula objetivo, para aislar selectivamente ligantes de unión. La WO 97/46251 describe un método para biopaneo de una biblioteca de despliegue fago aleatoria con un anticuerpo de afinidad purificado y después aislar el fago de unión, seguido por un proceso de micropaneo utilizando pozos de microplaca para aislar fago de unión de alta afinidad. El uso de la proteína A de Staphylococcus aureus como marca de afinidad también se ha reportado (Li et al., (1998) Mol. Biotech., 9:187). La WO 97/47314 describe el uso de bibliotecas de sustracción de sustrato para distinguir especificidades de enzima utilizando una biblioteca combinatoria que puede ser una biblioteca de despliegue fago. Un método para la selección de enzimas adecuado para su uso en detergentes utilizando despliegue fago, se describe en la WO 97/09446. Métodos adicionales para la selección de proteínas de unión específica se describen en las Patentes de E.U. Nos. 5,498,538, 5,432,018 y la WO 98/15833. También se describen métodos para la generación de bibliotecas de péptidos y para visualización de estas bibliotecas en las Patentes de E.U. Nos. 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192 y 5,723,323. C. Moléculas pequeñas de unión Las moléculas pequeñas de unión son preferentemente moléculas orgánicas diferentes a los oligopéptidos o anticuerpos como se definen en la presente, que se unen, preferentemente de manera específica a hepsina, HGF y/o complejo hepsina:HGF como se describe en la presente. Las moléculas pequeñas orgánicas de unión pueden identificarse y sintetizarse químicamente utilizando metodología conocida (ver, e.g., Publicaciones PCT Nos. WO 00/00823 y WO 00/39585) . Las moléculas pequeñas orgánicas de unión son comúnmente de menos de 2000 daltons en tamaño, alternativamente de menos que aproximadamente 1500, 750, 500, 250, o 200 daltons en tamaño, en donde tales moléculas pequeñas orgánicas capaces de unirse, preferentemente de manera específica a un polipéptido como se describe en la presente, pueden identificarse sin experimentación indebida utilizando técnicas muy conocidas. A este respecto, se anota que las técnicas para visualizar bibliotecas de moléculas pequeñas orgánicas por moléculas capaces de unirse a un objetivo polipéptido son muy conocidas en la técnica (ver, e.g., Publicaciones PCT Nos. WO 00/00823 y WO 00/39585). Las moléculas pequeñas orgánicas de unión pueden ser, por ejemplo, aldehidos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas, carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hidrazinas N-sustituidas, hidrazidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéteres, disulfuros, ácidos carboxílicos, esteres, ureas, carbamatos, carbonatos, cetales, tiocetales, acétales, tioacetales, aril haluros, aril sulfonatos, alquil haluros, alquil sulfonatos, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, anilinas, alquenos, alquinos, dioles, amino alcoholes, oxazolidinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, epóxidos, aziridinas, isocianatos, sulfonil cloruros, compuestos diazo, cloruros ácidos, o lo similar. D. Visualización por Anticuerpos, oligopéptidos de Unión y Moléculas Pequeñas de Unión con las Propiedades Deseadas Las técnicas para la generación de anticuerpos, oligopéptidos y moléculas pequeñas de ha invención se han descrito anteriormente. pueden seleccionarse además anticuerpos, oligopéptidos u otras moléculas pequeñas con ciertas características biológicas, según se desee. Los efectos inhibidores del crecimiento de un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula pequeña de la invención pueden lograrse mediante métodos conocidos en la técnica, e.g., utilizando células que expresan heparina y/o pro-HGF ya sea de manera endógena o después de la transfección con el(los) gen(es) respectivo (s) . por ejemplo, las líneas celulares de tumor apropiadas, y las células transfectadas con heparina y/o polipéptido HGF pueden tratarse con un anticuerpo monoclonal, oligopéptido u otra molécula pequeña de la invención en varias concentraciones durante algunos días (e.g., 2-7 días) y colorearse con violeta cristal o MTT o analizarse mediante algún otro análisis colorimétrico. Otro método para medir la proliferación sería la comparación de la absorción de 3H-timidina por las células tratadas en presencia o ausencia de un anticuerpo, oligopéptido de unión o molécula pequeña de unión de la invención. Después del tratamiento, las células se cosechan y la cantidad de radiactividad se incorpora en el ADN cuantificada en un contador de escintilación. Los controles positivos apropiados incluyen el tratamiento de una línea celular seleccionada con un anticuerpo inhibidor del crecimiento conocido por inhibir el crecimiento de esa línea celular. La inhibición del crecimiento de células de tumor in vivo puede determinarse de diversas maneras conocidas en la técnica. La célula de tumor puede ser una que sobreexpresa una hepsina y/o polipéptido pro-HGF. El anticuerpo, oligopéptido de unión o molécula pequeña orgánica de unión inhibirá proliferación celular de una hepsina y/o célula de tumor que expresa HGF in vitro o in vivo por aproximadamente 25-100% en comparación con la célula de tumor no tratada, más preferentemente por aproximadamente 30-100%, e incluso más preferentemente por aproximadamente 50-100% o 70-100%, en una modalidad, a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 µg/ml. La inhibición del crecimiento puede calcularse a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 µg/ml o aproximadamente 0.5 nM a 200 nM en cultivo celular, en donde la inhibición del crecimiento se determina 1-10 días después de la exposición de las células de tumor al anticuerpo. El anticuerpo es inhibidor del crecimiento in vivo, si la administración del anticuerpo a aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal da como resultado la reducción del tamaño del tumor o la reducción de la proliferación de células de tumor dentro de aproximadamente 5 días a 3 meses desde la primera administración del anticuerpo, preferentemente dentro de aproximadamente 5 a 30 días . Para seleccionar un anticuerpo, el oligopéptido de unión o la molécula pequeña orgánica de unión que induce la destrucción celular, la pérdida de la integridad de la membrana indicada e.g., por yoduro de propidio (Pl), la absorción de azul de tripan o 7AAD pueden lograrse con relación al control. Puede efectuarse un análisis de absorción de Pl en ausencia de células de complemento y efector inmunes. Las células de tumor que expresan hepsina y/o polipéptido pro-HGF se incuban con medio solo o con medio que contiene el anticuerpo apropiado (e.g., a aproximadamente 10 µg/ml), oligopéptido de unión o molécula pequeña orgánica de unión. Las células se incuban durante un período de 3 días. Después de cada tratamiento, las células se lavan y se alicuotan en tubos de 35 mm de 12 x 75 tapados (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para retiro de grupos de células. Los tubos reciben entonces Pl (10 µg/ml) . Las muestras pueden analizarse utilizando un citómetro de flujo FACSCAN® y software FACSCONVERT® CellQuest (Becton Dickinson) . Los anticuerpos, oligopéptidos de unión o moléculas pequeñas orgánicas de unión que inducen niveles estadísticamente significativos de destrucción celular determinados por la absorción de Pl pueden seleccionarse como anticuerpos, oligopéptidos de unión o moléculas pequeñas orgánicas de unión que inducen la destrucción celular. Para visualizar anticuerpos, oligopéptidos u otras moléculas pequeñas orgánicas que se unen a un epítope en una unión polipéptido mediante un anticuerpo de interés, puede efectuarse un análisis de bloqueo cruzado de rutina tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988). Este análisis puede utilizarse para determinar si un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula pequeña orgánica de prueba, se une al mismo sitio o epítope que un anticuerpo conocido. Alternativamente, o adicionalmente, puede efectuarse un mapeo de epítope mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la secuencia de anticuerpo puede mutagenizarse tal como mediante exploración alanina, para identificar residuos de contacto. El anticuerpo mutante se prueba inicialmente por la unión con un anticuerpo policlonal para asegurar el plegado apropiado. En un método diferente, los péptidos correspondientes a diferentes regiones de un polipéptido pueden utilizarse en análisis de competencia con los anticuerpos de prueba o con un anticuerpo de prueba y un anticuerpo con un epítope caracterizado o conocido. E . Terapia de Prodroga Dependiente de Anticuerpo Mediada por Enzimas (ADEPT) Los anticuerpos de la presente invención también pueden utilizarse en una ADEPT conjugando el anticuerpo a una enzima de activación de prodroga que convierte una prodroga (e.g., un agente quimioterapéutico peptidil, ver WO 81/01145) en una droga activa anti-cáncer. Ver, por ejemplo, WO 88/07378 y Patente de E.U. No. 4,975,278. El componente de enzima del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar en una prodroga de tal manera que la convierte en su forma citotóxica más activa. Las enzimas útiles en el método de esta invención, incluyen, pero no se limitan a alcalina fosfatasa útil para convertir prodrogas que contienen fosfato en drogas libres; arilsulfatasa útil para convertir prodrogas que contienen sulfato en drogas libres; citosina deaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en la droga anti-cáncer, 5-fluoroacil; proteasas tales como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L) , útiles para convertir prodrogas que contienen péptido en drogas libres; D-alanilcarboxipeptidasas útiles para convertir prodrogas que contienen sustituyentes de D-aminoácido; enzimas de división de carbohidrato tales como ß-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir prodrogas glicosiladas en drogas libres; ß-lactamasa útil para convertir drogas derivatizadas con ß-lactams en drogas libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir drogas derivatizadas en sus nitrógenos amina con grupos fenoxiacetil o fenilacetil, respectivamente, en drogas libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, conocidas también en la técnica como "abzimas", pueden utilizarse para convertir las prodrogas de la invención en drogas activas libres (ver, e.g., Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Pueden prepararse conjugados de anticuerpo-abzima como se describe en la presente para el suministro de la abzima a una población de células de tumor. Las enzimas de esta invención pueden unirse covalentemente a los anticuerpos mediante técnicas muy conocidas en la técnica tales como el uso de los reactivos heterobifuncionales de reticulación tratados anteriormente. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden al menos la región de unión de antígeno de un anticuerpo de la invención unida a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención, pueden construirse utilizando técnicas de ADN recombinante muy conocidas en la técnica (ver. e.g., Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984). F. Variantes de Anticuerpo Adicionalmente a los anticuerpos descritos en la presente, se contempla que pueden prepararse variantes de anticuerpo. Las variantes de anticuerpo pueden prepararse introduciendo cambios de nucleótido apropiados en el ADN de codificación, y/o mediante la síntesis del anticuerpo deseado. Los expertos en la técnica apreciarán que los cambios de aminoácido pueden alterar los procesos post-translacionales del anticuerpo, tales como el cambio del número o posición de los sitios de glicosilación, o la alteración de las características de anclaje de membrana. Las variaciones en los anticuerpos descritos en la presente pueden efectuarse, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y líneas guía para las mutaciones conservadoras y no conservadoras descritas, por ejemplo, en la Patente de E.U. No. 5,364,934. Las variaciones pueden ser una sustitución, supresión o inserción de uno o más codones que codifican para el anticuerpo lo que da como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos en comparación con el anticuerpo o polipéptido de secuencia natural. Opcionalmente, la variación es mediante la sustitución de al menos un aminoácido con cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del anticuerpo. La guía para determinar cuál residuo de aminoácido puede insertarse, sustituirse o suprimirse sin afectar adversamente la actividad deseada puede encontrarse comparando la secuencia del anticuerpo con la de moléculas de proteína homologas conocidas y minimizando el número de cambios a la secuencia de aminoácidos hechos en regiones de alta homología. Las sustituciones de aminoácido pueden ser el resultado del reemplazo de un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como el reemplazo de una leucina con una serina, i.e., reemplazos de aminoácido conservadores. Las inserciones o supresiones pueden encontrarse opcionalmente en el rango de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse produciendo sistemáticamente inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y probando las variantes resultantes por la actividad exhibida por la secuencia de origen. Se proporcionan en la presente fragmentos de anticuerpo y polipéptido. Tales fragmentos pueden truncarse en la terminal N o la terminal C, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, al compararse con un anticuerpo o proteína natural de longitud total. Ciertos fragmentos carecen de residuos de aminoácido no esenciales para una actividad biológica deseada del anticuerpo o polipéptido. Los fragmentos de anticuerpo o polipéptido pueden prepararse mediante cualquiera de un número de técnicas convencionales. Los fragmentos de péptido deseados pueden sintetizarse químicamente. Un procedimiento alternativo implica la generación de fragmentos de anticuerpo o polipéptido mediante digestión enzimática, e.g., tratando la proteína con una enzima conocida por dividir las proteínas en sitios definidos por residuos de aminoácido particulares, o mediante digestión del ADN con enzimas de restricción adecuadas y aislamiento del fragmento deseado. Aún otra técnica adecuada implica el aislamiento y amplificación de un fragmento de ADN que codifica para un fragmento de anticuerpo o polipéptido deseado, mediante reacción de cadena polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que definen la terminación deseada del fragmento ADN se emplean en los iniciadores 5' y 3' en la PCR. Preferentemente, los fragmentos de anticuerpo y polipéptido comparten al menos una actividad biológica y/o inmunológica con el anticuerpo o polipéptido natural descrito en la presente. En modalidades particulares, las sustituciones conservadoras de interés se muestran en la siguiente tabla bajo el encabezado de sustituciones preferidas. Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen más cambios sustanciales, denominados sustituciones ejemplares en esta tabla, o como se describen abajo con referencia a las cíases de aminoácidos, y se visualizan los productos.

Las modificaciones sustanciales en la función o identidad inmunológica del anticuerpo o polipéptido se logran seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura de la estructura de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con las similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A.L. Lehninger, en Biochemistry, segunda ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) no polar: Ala (A), Val (V), Leu (L) , He (I), Pro (O), Phe (F), Trp (W) , Met (M) (2) polar no cargado: Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Cys (C) , Tyr (Y), Asn (N) , Gln (Q) (3) acídico: Asp (D) , Glu (E) (4) básico: Lys (K) , Arg (R) , His (H) Alternativamente, los residuos de origen natural pueden dividirse en grupos en base a propiedades comunes de cadena lateral: ;i) hidrófobo: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrófilo neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acídico: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen en la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromático: Trp, Tyr, Phe. Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra case. Tales residuos sustituidos también pueden introducirse en los sitios de sustitución conservadora o, más preferentemente, en los sitios restantes (no conservados). Las variaciones pueden producirse utilizando métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis mediada por oligonucleótidos (sitio-dirigida), exploración alanina, y mutagénesis PCR. La mutagénesis sitio-dirigida [Cárter et al., Nucí. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucí. Acids Res., 10:6487 (1987)], la mutagénesis de cásete [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], la mutagénesis de selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas, pueden efectuarse en el ADN clonado para producir el ADN variante de anticuerpo o polipéptido. También puede emplearse el análisis de exploración de aminoácidos para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de exploración preferidos se encuentran los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina, y cisteína. Alanina es típicamente un aminoácido de exploración preferido entre este grupo debido a que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de cadena principal de la variante [Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. Alanina también es típicamente preferido debido a que es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente en posiciones tanto sepultadas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución alanina no produce cantidades adecuadas de variante, puede utilizarse un aminoácido isotérico. También puede sustituirse cualquier residuo cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo o polipéptido, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad de oxidación de la molécula y evitar la reticulación aberrante. Por el contrario, la(s) unión (es) cisteína pueden agregarse al anticuerpo o polipéptido para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv) .

Un tipo particularmente preferido de variante de sustitución implica la sustitución de uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo de origen (e.g., un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s) variante (s) resultante (s) seleccionada (s) para desarrollo adicional, tendrá (n) propiedades biológicas mejoradas en relación al anticuerpo de origen del cual se genera (n). Una manera conveniente para la generación de tales variantes de sustitución implica la maduración de afinidad utilizando despliegue fago. Brevemente, se mutan diversos sitios de región hipervariable (e.g., 6-7 sitios) para generar todas las sustituciones amino posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas se despliegan de una manera monovalente a partir de partículas fago filamentosas como fusiones al producto del gen III del M13 empacadas dentro de cada partícula. Las variantes de despliegue fago se visualizan entonces por su actividad biológica (e.g., afinidad de unión) como se describe en la presente. A fin de identificar los sitios de región hipervariable candidato para modificación, puede efectuarse mutagénesis de exploración alanina para identificar los residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión de antígeno. Alternativamente o adicionalmente, puede ser benéfico analizar una estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el polipéptido antígeno. Tales residuos de contacto y los residuos vecinos son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente. Una vez generadas tales variantes, el panel de variantes se somete a visualización como se describe en la presente y pueden seleccionarse los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más análisis relevantes para desarrollo adicional. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos de origen natural) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o sitio-dirigida) , mutagénesis PCR, y mutagénesis de cásete de una variante preparada previamente o una versión no variante del anticuerpo. G. Modificaciones de Anticuerpos y Polipéptidos Las modificaciones covalentes de anticuerpos y polipéptidos se incluyen dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye la reacción de residuos de aminoácido objetivo de un anticuerpo o polipéptido con un agente de derivatización orgánico capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos de terminal N o C del anticuerpo o polipéptido. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para la reticulación del anticuerpo o polipéptido a una matriz o superficie de soporte no soluble en agua para uso en el método para purificación de anticuerpos, y viceversa. Los agentes de reticulación comúnmente utilizados incluyen, e.g., 1, 1-bis (diazoacetil) -2-feniletano, glutaraldehído, esteres N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, esteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo disuccinimidil esteres tales como 3, 3' -ditiobis (succinimidilpropionato) , maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1, 8-octano y agentes tales como metil-3- [ (p-azidofenil) ditio] propioimidato. Otras modificaciones incluyen la deamidación de residuos glutaminil y asparaginil a los residuos glutamil y aspartil correspondientes, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos seril o treonil, metilación de los grupos a-amino de cadenas laterales lisina, arginina, e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], acetilación de la amina de terminal N, y amidación de cualquier grupo carboxilo de terminal C. Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo o polipéptido incluida dentro del alcance de esta invención, comprende la alteración del patrón natural de glicosilación del anticuerpo o polipéptido. "La alteración del patrón natural de glicosilación" pretende ser, para los propósitos en la presente, la supresión de uno o más de los residuos carbohidrato encontrados en el anticuerpo o polipéptido de secuencia natural (ya sea retirando el sitio de glicosilación subyacente o suprimiendo la glicosilación mediante medios químicos y/o enzimáticos), y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no se encuentran presentes en el anticuerpo o polipéptido de secuencia natural. Adicionalmente, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas naturales, que implican un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos residuos carbohidrato presentes. La glicosilación de anticuerpos y otros polipéptidos es típicamente ya sea unida a N o unida a O. Unida a N se refiere a la unión del residuo carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del residuo carbohidrato a la cadena lateral asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede utilizarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina . La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo o polipéptido se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias tripéptido antes descritas (para sitios de glicosilación de unión N) . la alternación también puede producirse por la adición de o la sustitución por uno o más de los residuos serina o treonina a la secuencia del anticuerpo o polipéptido original (para sitios de glicosilación de unión O) . La secuencia de aminoácidos de anticuerpo o polipéptido puede alterarse opcionalmente a través de cambios en el nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica para el anticuerpo o polipéptido en bases preseleccionadas de manera que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados. Otro medio para incrementar el número de residuos carbohidrato en el anticuerpo o polipéptido es mediante acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Tales métodos se describen en la técnica, e.g., en la WO 87/05330 publicada el 11 de Septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp . 259-306 (1981). El retiro de los residuos carbohidrato presentes en el anticuerpo o polipéptido puede lograrse químicamente o enzimáticamente o mediante la sustitución de mutación de codones que codifican para residuos de aminoácido que sirven como objetivos para glicosilación. Se conocen técnicas de desglicosilación química en la técnica y se describen, por ejemplo, por Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y por Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). La división enzimática de residuos carbohidrato en polipéptidos puede lograrse mediante el uso de una variedad de endo y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987). Otro tipo de modificación covalente de anticuerpo o polipéptido comprende la unión del anticuerpo o polipéptido a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, e.g., polietileno glicol (PEG) , polipropileno glicol, o polioxialquilenos, de la manera descrita en las Patentes de E.U. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337. El anticuerpo o polipéptido también puede atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato) , respectivamente) , en sistemas de suministro de droga coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Ed., (1980). El anticuerpo o polipéptido de la presente invención también puede modificarse de manera que forme moléculas quiméricas que comprenden un anticuerpo o polipéptido fusionado a otro, polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos. En una modalidad, tal molécula quimérica comprende una fusión del anticuerpo o polipéptido con un polipéptido de marca que proporciona un epítope al cual puede unirse selectivamente el anticuerpo anti-marca. La marca de epítope se coloca generalmente en la terminación amino o carboxilo del anticuerpo o polipéptido. La presencia de tales formas marcadas con epítope del anticuerpo o polipéptido puede detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido de marca. También, proporcionar una marca de epítope permite que el anticuerpo o polipéptido se purifique fácilmente mediante purificación de afinidad utilizando un anticuerpo anti-marca u otro tipo de matriz de afinidad que se una a la marca de epítope. Son muy conocidos en la técnica diversos polipéptidos de marca y sus anticuerpos respectivos. Los ejemplos incluyen marcas poli-histidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gly) ; el polipéptido de marca flu HA y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la marca c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 para la misma [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985); y la marca de glicoproteína D del virus de herpes simple (gD) y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553 (1990)]. Otros polipéptidos de marca incluyen el péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el péptido de epítope KT3 [Martin et al., Science 255:192-194 (1992)]; un péptido de epítope a-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; y la marca de péptido de proteína del gen 10 T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87:6393-6397 (1990)]. En una modalidad alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del anticuerpo o polipéptido con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (referida también como "inmunoadhesina") , tal fusión podría ser a la región Fc de una molécula IgG. Las fusiones Ig incluyen preferentemente la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana suprimido o no activado) de un anticuerpo o polipéptido en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula Ig. En una modalidad particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye la articulación, CH2 y CH3, o la articulación, regiones CHX, CH2 y CH3 de una molécula IgGl. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina ver también la Patente de E.U. No. 5,428,130 expedida en Junio 27 de 1995. H. Preparación de Anticuerpos y Polipéptidos La siguiente descripción se refiere principalmente a la producción de anticuerpos y polipéptidos mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico que codifica para el anticuerpo y el polipéptido. Por supuesto, se contempla que pueden emplearse métodos alternativos, muy conocidos en la técnica, para preparar anticuerpos y polipéptidos. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos apropiada, o sus porciones, puede producirse mediante síntesis de péptido directa utilizando técnicas de fase sólida [ver e.g., Stewart et al, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteína in vitro puede efectuarse utilizando técnicas o mediante automatización. La síntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo, utilizando un sintetizador Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) utilizando las instrucciones del fabricante. diversas porciones del anticuerpo o polipéptido pueden sintetizarse químicamente por separado y combinarse utilizando métodos químicos o enzimáticos para producir el anticuerpo o polipéptido deseado. 1. Aislamiento de ADN que codifica para anticuerpo o polipéptido El ADN que codifica para anticuerpo o polipéptido puede obtenerse de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que posee ARNm de anticuerpo o polipéptido y que lo expresa en un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN humano de anticuerpo o polipéptido puede obtenerse convenientemente de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido humano. El gen que codifica para anticuerpo o polipéptido también puede obtenerse de una biblioteca genómica o mediante procedimientos sintéticos conocidos (e.g., síntesis automatizada de ácido nucleico). Las bibliotecas pueden visualizarse con sondas (tales como oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. La visualización del ADNc o biblioteca genómica con la sonda seleccionada puede conducirse utilizando procedimientos estándar, tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Un medio alternativo para aislar el gen que codifica para el anticuerpo o polipéptido es utilizar metodología PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995) ] . Se conocen bien en la técnica las técnicas para visualizar la biblioteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótido seleccionadas como sondas deben ser de una longitud suficiente y suficientemente no ambiguas a modo de minimizar falsos positivos. El oligonucleótido se encuentra preferentemente marcado de manera que pueda detectarse al hibridarse al ADN en la biblioteca que se visualiza. Los métodos de marcado son muy conocidos en la técnica e incluyen el uso de radio marcas como ATP marcado con 32P, marcado por biotinilación o por enzimas. Las condiciones de hibridación, incluyendo rigidez moderada y alta rigidez, se proporcionan en Sambrook et al., supra. Las secuencias identificadas en tales métodos de visualización de bibliotecas pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas tales como GenBank u otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de secuencia (ya sea a nivel aminoácido o nucleótido) dentro de las regiones definidas de la molécula o a través de la secuencia de longitud total pueden determinarse utilizando métodos conocidos en la técnica como se describe en la presente. El ácido nucleico que tiene secuencia de codificación de proteínas puede obtenerse visualizando bibliotecas seleccionadas de ADNc o genómicas utilizando la secuencia de aminoácido deducida descrita en la presente por primera vez, y, si es necesario, utilizando los procedimientos convencionales de extensión primaria como se describe en Sambrook et al., supra, para detectar precursores y procesar intermediarios de ARNm que pueden no haberse transcrito de manera inversa en ADNc. 2. Selección y Transformación de Células Huésped Las células huésped se transfectan o transforman con expresión de los vectores de clonación descritos en la presente para la producción de anticuerpo o polipéptido y se cultivan en un medio nutritivo convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformadores, o amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como el medio, la temperatura, el pH y lo similar, pueden seleccionarse por el técnico experto sin experimentación indebida. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed., (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., supra. Los métodos de transfección de célula eucariótica y transformación de célula procariótica son conocidos por el técnico de experiencia ordinaria, por ejemplo, CaCl2, CaP04, mediado por liposoma y electroporación. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se lleva a cabo utilizando técnicas estándar apropiadas para tales células.

El tratamiento de calcio empleando cloruro de calcio, como se describe en Sambrook et al., supra, o electroporación, se utiliza generalmente para procariotos. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células vegetales, como se describe por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada en Junio 29 de 1989. Para células de mamífero son tales paredes celulares, puede emplearse el método de precipitación de fosfato de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Se han descrito aspectos generales de transfecciones de sistema de célula huésped de mamífero en la Patente de E.U. No. 4,399,216. Las transformaciones en levadura se llevan a cabo típicamente de acuerdo con el método de Van Solingen et al., J. Bact. 130:946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (EUA), 76:3929 (1979). Sin embargo, también pueden utilizarse otros métodos para introducir el ADN en células, tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplasto bacterial con células intactas, o policationes, e.g., polibreno, poliornitina. Para diversas técnicas para la transformación de células de mamífero, ver Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988). Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en la presente, incluyen células de procarioto, levadura o eucariotos más altos. Los procariotos adecuados incluyen, pero no se limitan a eubacterias, tales como organismos Gram-positivo o Gram-negativo, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como E. coli. Diversas cepas de E. coli se encuentran disponibles públicamente, tales como la especie MM294 de E. coli K12 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); cepa W3110 de E. coli (ATCC 27,325) y K5772 (ATCC 53,635). Otras células huésped procarióticas adecuadas incluyen Enterobacteriaceae tales como Escherichia, e.g., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilis y B. lichenifiormis (e.g., B. licheniformis 41P descrita en DD 266,710 publicada en Abril 12 de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. La cepa W3110 es un huésped o huésped de origen particularmente preferido debido a que es una cepa huésped común para fermentaciones del producto de ADN recombinante. Preferentemente, la célula huésped secreta mínimas cantidades de enzimas proteolíticas . Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para efectuar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas al huésped, incluyendo los ejemplos de tales huéspedes, cepa 1A2 W3110 de E. coli, que tiene el genotipo completo tonA: la cepa 9E4 W3110 de E. coli, que tiene el genotipo completo tonA ptr3; cepa 27C7 W3110 de E. coli (ATCC 55,244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA -15 (argF-lac) 169 degP ompT kanr; cepa 37D6 W3110 de E. coli, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; cepa 40B4 W3110 de E. coli, que es la cepa 37D6 con una mutación de supresión degP no resistente a canamicina; y una cepa de E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante descrita en la Patente de E.U. No. 4,946,783 expedida en Agosto 7 de 1990. Alternativamente, son adecuados los métodos de clonación in vitro, e.g., PCR u otras reacciones de polimerasa de ácido nucleico. El anticuerpo de longitud total, fragmentos de anticuerpo y proteínas de fusión de anticuerpo pueden producirse en bacterias, en particular cuando no es necesaria la glicosilación y la función de efector Fc, tal como cuando el anticuerpo, terapéutico se conjuga a un agente citotóxico (e.g., una toxina) y el inmunoconjugado por sí mismo muestra efectividad en la destrucción de la célula de tumor. Los anticuerpos de longitud total tienen una mayor vida media en circulación. La producción en E. coli es más rápida y más eficiente en costo. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, ver e.g., U.S. 5,648,237 (Cárter et al) U.S. 5,789,199 (Joly et al), y U.S. 5,840,523 (Simmons et al), que describe las secuencias de iniciación de translación regio (TIR) y de señal para optimizar la expresión y secreción, estas patentes incorporadas en la presente mediante la referencia. Después de la expresión, el anticuerpo se aisla a partir de pasta celular de E. coli en una fracción soluble y puede purificarse mediante, e.g., una columna de proteína A o g dependiendo del isotipo. La purificación final puede efectuarse de manera similar al proceso para purificar el anticuerpo expresado e.g., en células CHO. Además de los procariotos, los microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o de expresión adecuados para vectores que codifican para anticuerpo o polipéptido. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariótico comúnmente utilizado. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139,383 publicada en Mayo 2 de 1985); huéspedes Kluveromyces (Patente de E.U. No. 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tales como, e.g., K. Lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154 (2 ): 737-742 [1983]), K. Fragilis (ATCC 12,424), K. Bulgaricus (ATCC 16,045), K. Wickeramii (ATCC 24,178), K. Waltii (ATCC 56,500), K. Drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. Thermotolerans, y K. Marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 publicada en Octubre 31 de 1990); y hongos filamentosos tales como e.g., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada en Enero 10 de 1991), y huéspedes Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 81:1470-1474 [1984]) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en la presente e incluyen, pero no se limitan a levaduras capaces de crecer en metanol seleccionadas del género que consiste de Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Puede encontrarse una lista de las especies específicas ejemplares de esta clase de levaduras en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs 269 (1982). Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpo o polipéptido gicosilado se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales, tales como cultivos celulares de algodón, maíz, soja, petunia, tomate y tabaco. Se han identificado numerosas cepas bacilovirales y variantes, y células huésped de insecto permisivas correspondientes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx morí . Una variedad de cepas virales para transfección se encuentran públicamente disponibles, e.g., la variante L-l de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus pueden utilizarse como el virus en la presente de acuerdo con la presente invención, particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda . Sin embargo, ha sido mayor el interés en células de vertebrados, y la propagación de las células de vertebrados en cultivo (cultivo en tejido) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas de célula huésped de mamífero útiles son la línea CVl de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embriónico humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77:4216 (1980)); células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CVl ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3a, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL 51); células TRI (Mather et al., Annals. N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Las células huésped se transforman con los vectores de expresión y de clonación antes descritos para la producción de anticuerpo o polipéptido y se cultivan en medio nutritivo convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformadores, o amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas. 3. Selección y uso de un Vector Replicable El ácido nucleico (e.g., ADNc o ADN genómico) que codifica para el anticuerpo o polipéptido puede insertarse en un vector replicable para clonación (amplificación del ADN) o para expresión. Diversos vectores se encuentran públicamente disponibles. El vector, por ejemplo, puede encontrarse en forma de un plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general el ADN se inserta en un sitio (s) endonucleasa de restricción apropiado utilizando técnicas conocidas en la técnica. los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento de mejoramiento, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligación estándar muy conocidas por el técnico experto. El polipéptido puede producirse de manera recombinante no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de desdoblamiento específico en la terminal N de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que codifica para el anticuerpo o polipéptido insertado en el vector. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de alcalina fosfatasa, penicilinasa, lpp, o líderes estables de enterotoxina II. Para la secreción de levadura la secuencia de señal puede ser, e.g., el líder de levadura invertasa, líder del factor alfa (incluyendo líderes Saccharomyces y Kluyveromyces a-factor, el último descrito en la Patente de E.U. No. 5,010,182), o el líder de ácido fosfatasa, el líder glucoamilasa de C. albicans (EP 362,179 publicada en Abril 4 de 1990=, o la señal descrita en la WO 90/13646 publicada en Noviembre 15 de 1990. En la expresión de células de mamífero, las secuencias de señal de mamífero pueden utilizarse para dirigir la secreción de la proteína, tal como las secuencias de señal de polipéptidos secretados de la misma especie o relacionada, así como líderes secretorios virales. Los vectores tanto de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Tales secuencias son muy conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas. El origen del plásmido 2u es adecuado para levaduras, y diversos orígenes virales (SV40, . Polioma, adenovirus, VSV, o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. Los vectores de expresión y de clonación contendrán típicamente un gen de selección, llamado también un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, e.g., ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotrópicas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio de complejo, e.g., el gen que codifica para D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para absorber el ácido nucleico que codifica para el anticuerpo o polipéptido, tales como DHFR o timidina cinasa. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR de tipo silvestre es la línea celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada como se describe por Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 77:4216 (1980). Un gen de selección para uso en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptofan, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics 85:12 (1977)]. Los vectores de expresión y de clonación contienen comúnmente un promotor operablemente unido a la secuencia de ácido nucleico que codifica para el anticuerpo o polipéptido para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por una variedad de células huésped potenciales son muy conocidos. Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procarióticos incluyen los sistemas promotores de ß-lactamasa y lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], alcalina fosfatasa, un sistema promotor de triptofan (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], y promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 80:21-25 (1983)]. Los promotores para uso en sistemas bacteriales contendrán también una secuencia Shine-Dalgrano (S.D.) operablemente unida al ADN que codifica para el anticuerpo o polipéptido. Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)], u otras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa, hexocinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicertato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa. Otros promotores de levadura que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol dehidrogenasa 2, isocitocromo C, ácido fosfatasa, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneina, gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para uso en la expresión de levadura se describen adicionalmente en la EP 73,657. La transcripción de anticuerpo o polipéptido a partir de vectores en células huésped de mamífero se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus polioma, virus de viruela (UK 2,211,504 publicada en Julio 5 de 1989), adenovirus (tales como adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis B y virus 40 de simio (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, e.g., el promotor actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores de choque térmico, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de célula huésped. La transcripción de un ADN que codifica para el anticuerpo o polipéptido mediante eucariotos más altos puede incrementarse insertando una secuencia de mejoramiento en el vector. Los mejoradores son elementos de acción cis de ADN, comúnmente de aproximadamente 10 a 300 bp, que actúan en un promotor para incrementar su transcripción. Se conocen muchas secuencias de mejoramiento de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína, e insulina) .

Sin embargo, típicamente, se utiliza un mejorador de un virus de célula eucariótica. Ejemplos incluyen el mejorador SV40 en el último extremo del origen de replicación (bp 100-270), el mejorador de promotor citomegalovirus, el mejorador polioma en el último extremo del origen de replicación y mejoradores adenovirus. El mejorador puede colocarse en el vector en una posición 5' o 3' para la secuencia de codificación de anticuerpo o polipéptido, pero se ubica preferentemente en el sitio 5' desde el promotor. Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucarióticas (células de levadura, hongo, insecto, vegetal, animal, humano o nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán las secuencias necesarias para terminar la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias se encuentran comúnmente disponibles de las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3' de ADNs o ADNcs eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótido transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica para el anticuerpo o polipéptido. Aún otros métodos, vectores y células huésped adecuados para adaptación a la síntesis del anticuerpo o polipéptido en cultivo celular de vertebrado recombinante, se describen en Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117.060; y EP 117,058. 4. Cultivo de Células Huésped Las células huésped utilizadas para producir el anticuerpo o polipéptido de esta invención pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como el FIO de Ham (Sigma), Minimal Essential Médium (MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Modified Eagle's Médium de Dulbecco (DMEM), (Sigma), son adecuados para el cultivo de células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz., 58-44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980), Patentes de E.U. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o Patente de E.U. Re. 30,985 puede utilizarse como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), amortiguadores (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (tales como droga GENTAMYCIN™) , elementos de rastro (definidos como compuestos inorgánicos comúnmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar) , y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario puede incluirse también en concentraciones apropiadas que serán conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones del cultivo, tales como la temperatura, el pH y lo similar, son aquellas previamente utilizadas con la célula huésped seleccionada para expresión, y serán aparentes para el técnico de experiencia ordinaria. 5. Detección de la Amplificación/Expresión del Gen La amplificación y/o expresión del gen puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante inmunoanálisis Southern convencional, inmunoanálisis Northern para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77:5201-5205 (1980)], inmunoanálisis de punto (análisis de ADN) o hibridación in situ, utilizando una sonda apropiadamente marcada, en base a las secuencias proporcionadas en la presente. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que puedan reconocer duplas específicas, incluyendo duplas de ADN, duplas de ARN, y duplas híbridas de ADN-ARN o duplas de ADN-proteína. Los anticuerpos, a su vez, pueden marcarse y el análisis puede llevarse a cabo cuando la dupla se une a una superficie, de manera que al formarse la dupla en la superficie, pueda detectarse la presencia del anticuerpo unido a la dupla. Alternativamente, la expresión del gen puede medirse mediante métodos inmunológicos, tales como coloración inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y análisis del cultivo celular o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto de gen.

Los anticuerpos útiles para coloración inmunohistoquímica y/o análisis de fluidos muestra pueden ser ya sea monoclonales o policlonales, y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, pueden prepararse anticuerpos contra un polipéptido de secuencia natural o contra un péptido sintético en base a la secuencia de ADN proporcionada en la presente, o contra la secuencia exógena fusionada al ADN de polipéptido y que codifica para un epítope de anticuerpo específico. 6. Purificación de Anticuerpo y Polipéptido Las formas de anticuerpo y polipéptido pueden recuperarse del medio de cultivo o de lisados de célula huésped. Si se encuentran unidos a la membrana, pueden liberarse de la membrana utilizando una solución detergente adecuada (e.g., Triton-X 100) o mediante división enzimática. Las células empleadas en la expresión de anticuerpo y polipéptido pueden fracturarse mediante diversos medios físicos o químicos, tales como ciclado de congelación-descongelación, sonicación, fractura mecánica o agentes de .lisado celular. Puede ser deseable purificar el anticuerpo y polipéptido a partir de proteínas de célula recombinante o polipéptidos. Los siguientes procedimientos son ejemplares de procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio de ion; precipitación de etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio de catión tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; filtración de gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de Sepharose de proteína A para retirar contaminantes tales como IgG; y columnas de quelación de metal para unir formas marcadas con epítope del anticuerpo y polipéptido. Pueden emplearse diversos métodos de purificación de proteína y tales métodos son conocidos en la técnica y se encuentran descritos, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification : Principies and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). La(s) etapa(s) de purificación seleccionada (s) dependerá (n) , por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y del anticuerpo o polipéptido particular producido. Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, el polvo particulado, ya sea de células huésped o fragmentos lisados, se retira, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos secretados al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta celular se congela en presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA, y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. El polvo celular puede retirarse mediante centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión se concentran generalmente primero utilizando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Milipore. Puede incluirse un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolisis y pueden incluirse antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios. La composición de anticuerpo preparada de las células puede purificarse utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La adaptabilidad de la proteína A como ligante de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier dominio de inmunoglobulina Fc presente en el anticuerpo. La proteína A puede utilizarse para purificar anticuerpos basados en cadenas pesadas humanas de yl, y2 o y4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 62:1-13 (19893)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para y3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual se une el ligante de afinidad es más frecuentemente agarosa, pero se encuentran disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli (estirenodivinil) benceno permiten más rápidas proporciones de flujo y más cortos tiempos de procesamiento que los que pueden lograrse con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para purificación de proteínas tales como fraccionamiento en una columna de intercambio de ion, precipitación de etanol, HPLC en fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina, cromatografía SEPHAROSE™ en una resina de intercambio de anión o catión (tal como una columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación de sulfato de amonio, también se encuentran disponibles dependiendo del anticuerpo que va a recuperarse. Después de cualquier etapa de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes, puede someterse a cromatografía de interacción hidrófoba a bajo pH utilizando un amortiguador de elución a un pH de entre aproximadamente 2.5-4.5, preferentemente llevada a cabo a bajas concentraciones de sal (e.g., de aproximadamente 0-0.25 M de sal). I. Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos, oligopéptidos de unión, moléculas pequeñas orgánicas o inorgánicas de unión y/o polipéptidos utilizados de acuerdo con la presente invención, se preparan para almacenamiento mezclando el anticuerpo, polipéptido, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica que tiene el grado de pureza deseado, con vehículos excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables, (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones hidrofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos a los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como acetato, fosfato tris, citrato y otros ácidos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; preservativos (tales como octadecildimetilbencil cloruro de amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol, resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menor que aproximadamente 10 residuos; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes de quelación tales como EDTA; tonificadores tales como trehalosa y cloruro de sodio; azúcares tales como sucrosa; manitol, trehalosa o sorbitol; surfactantes tales como polisorbato; contra iones formadores de sal tales como sodio; complejos de metal (e.g., complejos de Zn-proteína) ; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN®, PLURONICS®, o polietileno glicol (PEG) . La formulación puede comprender el anticuerpo en una concentración entre 5-200 mg/ml, preferentemente entre 10-100 mg/ml . Las formulaciones en la presente también pueden contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular tratada, preferentemente, aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, además de un anticuerpo, oligopéptido de unión o molécula pequeña orgánica o inorgánica de unión, puede ser deseable incluir en la formulación un anticuerpo adicional, e.g., un segundo anticuerpo que se une a un epítope diferente en el mismo polipéptido o un anticuerpo para algún otro objetivo tal como un factor de crecimiento que afecte el crecimiento del cáncer particular. Alternativamente o adicionalmente, la composición puede comprender además un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, agente inhibidor de crecimiento, agente anti-hormonal y/o cardioprotector. Tales moléculas se encuentran adecuadamente presentes en combinación en cantidades efectivas para el propósito pretendido. Los ingredientes activos también puede atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de suministro de droga coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington' s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Ed., (1980). Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semi permeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, con matrices en forma de artículos configurados, e.g., películas o microcápsulas, ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , poliláctidos (Pat. de E.U. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y y-etil-L-glutamato, etileno-vinil acetato no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT® (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y leuprolida acetato), y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico . Las formulaciones que van a utilizarse para administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. J. Tratamiento con Anticuerpos, Oligopéptidos de Unión y Moléculas Pequeñas Orgánicas/Inorgánicas de Unión Para determinar la expresión de polipéptidos (hepsina y/o HGF) en el cáncer, se encuentran disponibles diversos análisis de detección. En una modalidad, la sobreexpresión del polipéptido puede analizarse mediante inmunohistoquímica (IHC). Secciones de tejido embebidas en parafina de una biopsia de tumor, pueden someterse al análisis IHC y ajustarse a un criterio de intensidad de coloración del polipéptido como sigue: Puntuación 0 - no se observa coloración o la coloración de membrana es menor que el 10% de las células de tumor. Puntuación 1* - se detecta una coloración de membrana débil/apenas perceptible en más del 10% de las células de tumor. Las células se encuentran coloreadas solo en parte de su membrana.

Puntuación 2+ - se observa una coloración de membrana de débil a moderada en más del 10% de las células de tumor. Puntuación 3+ - se observa una coloración de membrana de moderada a fuerte en más del 10% de las células de tumor. Aquellos tumores con puntuaciones 0 o 1+ para la expresión de polipéptido pueden caracterizarse sin sobreexpresión del polipéptido, mientras que aquellos tumores con puntuaciones 2+ o 3+ pueden caracterizarse con sobreexpresión del polipéptido. Alternativamente o adicionalmente, pueden efectuarse análisis FISH tales como el INFORM® (comercializado por Ventana, Arizona) o PATHVISION® (Vysis, Illinois) en tejido de tumor fijo a formalina, embebido en parafina para determinar el grado (si existe) de sobreexpresión del polipéptido en el tumor. La sobreexpresión o amplificación del polipéptido puede evaluarse utilizando un análisis de detección in vivo, e.g., administrando una molécula (tal como un anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica) que se une a la molécula que va a detectarse y se marca con una marca detectable (e.g., un isótopo radiactivo o una marca fluorescente) y explorando externamente al paciente para la localización de la marca.

Como se describió anteriormente, los anticuerpos, oligopéptidos y moléculas pequeñas orgánicas de la invención tienen diversas aplicaciones no terapéuticas. Los anticuerpos, oligopéptidos y moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas de la presente invención pueden ser útiles para determinar etapas de cánceres que expresan polipéptidos (e.g., en radiovisualización) . Los anticuerpos, oligopéptidos y moléculas pequeñas orgánicas también son útiles para la purificación o inmunoprecipitación de polipéptidos a partir de células, para la detección y cuantificación de polipéptidos in vitro, e.g., en un ELISA o inmunoanálisis Western, para destruir y eliminar las células que expresan polipéptido de una población de células mezcladas como una etapa en la purificación de otras células. Actualmente, dependiendo de la etapa del cáncer, el tratamiento del cáncer implica una o una combinación de las siguientes terapias: cirugía para retirar el tejido canceroso, terapia de radiación, y quimioterapia. La terapia con anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica puede ser especialmente deseable en pacientes ancianos que no toleran la toxicidad y efectos secundarios de la quimioterapia y en enfermedades metastásicas en donde la radiación tiene utilidad limitada. Los anticuerpos, oligopéptidos y moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas dirigidos al tumor de la invención son útiles para aliviar cánceres que expresan polipéptidos al diagnóstico inicial de la enfermedad o durante la recaída. Para aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica puede utilizarse solo, o en terapia de combinación con e.g., hormonas, antiangiogénicos o compuestos radio marcados, o con cirugía, crioterapia, y/o radioterapia. El tratamiento con anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica puede administrarse conjuntamente con otras formas de terapia convencional, ya sea consecutivamente con terapia pre o post convencional. Las drogas quimioterapéuticas tales como TAXOTERE® (docetaxel), TAXOL® (paclitaxel), estramustina y metoxantrona se utilizan en el tratamiento del cáncer, en particular, en pacientes con mucho riesgo. En el presente método de la invención para el tratamiento o alivio del cáncer, puede administrarse al paciente con cáncer el anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica en conjunción con tratamiento con uno o más de los agentes quimioterapéuticos precedentes. En particular, se contempla la terapia de combinación con paclitaxel y derivados modificados (ver, e.g., EP 0600517). El anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica se administrará con una dosis terapéuticamente efectiva del agente quimioterapéutico. En otra modalidad, el anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica se administra en conjunción con quimioterapia para mejorar la actividad y eficacia del agente quimioterapéutico, e.g., paclitaxel. La Physicians' Desk Reference (PDR) describe dosis de estos agentes que se han utilizado en el tratamiento de diversos cánceres. El régimen de dosificación y las dosis de estas drogas quimioterapéuticas antes mencionadas que son terapéuticamente efectivas, dependerán del cáncer particular que se trata, del grado de la enfermedad y otros factores familiares al médico experto en la técnica, y pueden determinarse por el médico. En una modalidad particular, un conjugado que comprende un anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica conjugada con un agente citotóxico, se administra al paciente. Preferentemente, el inmunoconjugado unido a la proteína se interna mediante la célula dando como resultado un incremento en la eficacia del inmunoconjugado para destruir la célula de cáncer a la cual se une. En una modalidad preferida, el agente citotóxico se dirige a o interfiere con un ácido nucleico en la célula de cáncer. Ejemplos de tales agentes citotóxicos se describieron anteriormente e incluyen maitansinoides, caliqueamicinas, ribonucleasas y endonucleasas de ADN. Los anticuerpos, oligopéptidos, moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas o sus conjugados de toxina se administran a un paciente humano, de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa, e.g., en una sola vez o mediante infusión continua durante un período de tiempo, mediante vías intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o inhalación. Se prefiere la administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica. Otros regímenes terapéuticos pueden combinarse con la administración del anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica. La administración combinada incluye la co-administración utilizando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden en donde preferentemente existe un período de tiempo en el que ambos (o todos) agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Preferentemente, tal terapia combinada da como resultado un efecto terapéutico sinergístico. También puede ser deseable combinar la administración del anticuerpo o anticuerpos, oligopéptidos o moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas con la administración de un anticuerpo dirigido contra otro antígeno tumoral asociado con el cáncer particular. En otra modalidad, los métodos de tratamiento terapéutico de la presente invención implican la administración combinada de un anticuerpo (o anticuerpos), oligopéptidos o moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas y uno o más agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores del crecimiento, incluyendo la co-administración de cócteles de diferentes agentes quimioterapéuticos. Los agentes quimioterapéuticos incluyen, fosfato de estramustina, prednimustina, cisplatina, 5-fluoroacil, melfalan, ciclofosfamida, hidroxiurea e hidroxiureataxanos (tales como paclitaxel y docetaxel) y/o antibióticos de antraciclina. La preparación y programas de dosificación para tales agentes quimioterapéuticos puede utilizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como se determine empíricamente por el médico experto. La preparación y programas de dosificación para tal quimioterapia se describe también en Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) . El anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica puede combinarse con un compuesto antihormonal; e.g., un compuesto anti-estrógeno tal como tamoxifen; una anti-progesterona tal como onapristona (ver, EP 616 812); o un anti-andrógeno tal como flutamida, en dosis conocidas para tales moléculas. Cuando el cáncer que va a tratarse es un cáncer independiente al andrógeno, el paciente puede haberse sometido previamente a terapia anti-andrógeno, y después de que el cáncer se vuelve independiente al andrógeno, el anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica (y opcionalmente otros agentes como se describe en la presente) puede administrarse al paciente. Algunas veces, puede ser benéfico co-administrar también al paciente un cardioprotector (para evitar o reducir la disfunción del miocardio asociada con la terapia) o una o mas citosinas. Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede someterse a retiro quirúrgico de células cancerosas y/o a terapia de radiación, antes de, simultáneamente con o posterior a la terapia con anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica. Las dosis adecuadas para cualquiera de los agentes anteriores coadministrados, son aquellas actualmente utilizadas y pueden disminuirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente y del anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica. Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis y forma de administración se seleccionarán por el médico de acuerdo con criterios conocidos. La dosis apropiada del anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica dependerá del tipo de enfermedad que se trata, como se definió anteriormente, de la severidad y curso de la enfermedad, ya sea que anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica se administre para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica, y de la discreción del médico que lo trata. El anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica se administra adecuadamente al paciente en una vez o durante una serie de tratamientos. Preferentemente, el anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica se administra mediante infusión intravenosa o mediante inyecciones subcutáneas. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, de aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal (e.g., aproximadamente 0.1-15 mg/kg/dosis) del anticuerpo, puede ser una dosis inicial candidato para administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Un régimen de dosificación puede comprender la administración de una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguida por una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. Una dosis diaria típica puede fluctuar de aproximadamente 1 µg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores antes mencionados. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se sostiene hasta que se presenta una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. El progreso de esta terapia puede monitorearse fácilmente mediante métodos y análisis convencionales en base a los criterios conocidos por el médico u otras personas expertas en la técnica. Además de la administración de la proteína de anticuerpo al paciente, la presente solicitud contempla la administración del anticuerpo mediante terapia de gen. Tal administración de ácido nucleico que codifica para el anticuerpo se encuentra abarcada por la expresión "administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo". Ver por ejemplo, WO 96/07321 publicada en Marzo 14 de 1996 referente al uso de la terapia de gen para generar anticuerpos intracelulares. Existen dos procedimientos principales para introducir el ácido nucleico (contenido opcionalmente en un vector) en las células del paciente; in vivo y ex vivo. Para el suministro in vivo, el ácido nucleico se inyecta directamente al paciente, comúnmente en el sitio en donde se requiere el anticuerpo. Para tratamiento ex vivo, se retiran las células del paciente, se introduce el ácido nucleico en esta células aisladas y las células modificadas se introducen al paciente ya sea directamente, o por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que se implantan en el paciente (ver e.g., Patentes de E.U. Nos. 4,892,538 y 5,283,187). Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del huésped pretendido. Las técnicas adecuadas para la transferencia del ácido nucleico en células de mamífero in vitro, incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextran, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Un vector comúnmente utilizado para suministro ex vivo del gen es un vector retroviral. Las técnicas actualmente preferidas de transferencia de ácido nucleico in vivo incluyen la transfección con vectores virales ) tales como adenovirus, virus de herpes simple 1, virus adeno-asociado) y sistemas a base de lípidos (los lípidos útiles para la transferencia mediada por lípidos del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo) . Para revisión de los protocolos de marcado de gen y terapia de gen actualmente conocidos, ver Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). Ver también WO 93/25673 y las referencias citadas en la misma. Los anticuerpos de la invención pueden encontrase en diferentes formas abarcadas por la definición de "anticuerpo" en la presente. Por tanto, los anticuerpos incluyen anticuerpo de longitud total o intacto, fragmentos de anticuerpo, anticuerpo de secuencia natural o variantes de aminoácido, anticuerpos humanizados, quiméricos o de fusión, inmunoconjugados, y sus fragmentos funcionales. En los anticuerpos de fusión, una secuencia de anticuerpos se encuentra fusionada a una secuencia de polipéptidos heteróloga. Los anticuerpos pueden modificarse en la región Fc para proporcionar las funciones efector deseadas. Como se trata en mayor detalle en las secciones en la presente, con las regiones Fc apropiadas, el anticuerpo desnudo unido en la superficie celular puede inducir citotoxicidad, e.g., a través de la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) o reclutando al complemento en la citotoxicidad dependiente del complemento, o algún otro mecanismo. Alternativamente, cuando se desea eliminar o reducir la función de efector, a fin de minimizar los efectos secundarios o las complicaciones terapéuticas, pueden utilizarse ciertas otras regiones Fc. En una modalidad, el anticuerpo compite por la unión o se une sustancialmente a, el mismo epítope que los anticuerpos de la invención. Se contemplan también los anticuerpos que tienen las características biológicas de los presentes anticuerpos de la invención, incluyendo específicamente las características de dirección al tumor in vivo y cualquiera de inhibición de proliferación celular o citotóxica . Se describen en detalle en la presente, métodos para producirlos anticuerpos anteriores. Los presentes anticuerpos, oligopéptidos y moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas son útiles para tratar un cáncer que expresa hepsina y/o HGF, o para aliviar uno o más de los síntomas del cáncer en un mamífero. Los métodos de la invención abarcan el uso de antagonistas en el tratamiento y/o alivio de los síntomas de tumores metastásicos asociados con estos cánceres. El antagonista de anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica es capaz de unirse a al menos una porción de las células de cáncer que expresan el (los) polipéptido (s) (hepsina y/o HGF) en el mamífero. En una modalidad, el anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica es efectivo para destruir o matar las células de tumor que expresan y/o responden al polipéptido o inhibir el crecimiento de tales células de tumor, in vitro o in vivo, al unirse al polipéptido. Tal anticuerpo incluye un anticuerpo desnudo (no conjugado a ningún agente) . Los anticuerpos desnudos que tienen propiedades de inhibición citotóxica o de crecimiento celular pueden adicionarse con un agente citotóxico para hacerlos incluso más potentes en la destrucción de la célula de tumor. Pueden conferirse propiedades citotóxicas a un anticuerpo, e.g., conjugando el anticuerpo con un agente citotóxico, para formar un inmunoconjugado como se describe en la presente. En algunas modalidades, el agente citotóxico o un agente inhibidor del crecimiento es una molécula pequeña. En algunas modalidades se utilizan toxinas tales como caliqueamicina o un maitansinoide y análogos o derivados de las mismas. La invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica de la invención, y un vehículo. Para propósitos del tratamiento del cáncer, las composiciones pueden administrarse al paciente que necesita tal tratamiento, en donde la composición puede comprender uno o más de los anticuerpos presentes como un inmnoconjugado o como el anticuerpo desnudo. En una modalidad adicional, las composiciones pueden comprender estos anticuerpos, oligopéptidos o moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas en combinación con otros agentes terapéuticos tales como los agentes citotóxicos o inhibidores del crecimiento, incluyendo agentes quimioterapéuticos. La invención proporciona también formulaciones que comprenden un anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica de la invención, y un vehículo. En una modalidad, la formulación es una formulación terapéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otro aspecto de la invención es aislar ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos. Se encuentran abarcados los ácidos nucleicos que codifican las cadenas H y L y especialmente los residuos de región hipervariable, cadenas que codifican el anticuerpo de secuencia natural así como variantes, modificaciones y versiones humanizadas del anticuerpo. La invención proporciona también métodos útiles para tratar un cáncer o aliviar uno o más de los síntomas del cáncer en un mamífero, que comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica al mamífero. Las composiciones terapéuticas de anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica pueden administrarse a corto plazo (agudo) o de modo crónico o intermitente según lo dirija el médico. También se proporcionan métodos para inhibir el crecimiento de, y para destruir una célula que expresa y/o responde al polipéptido (hepsina y/o HGF) . La invención también proporciona equipos y artículos de manufactura que comprenden al menos un anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica. Los equipos .que contienen anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica encuentran su uso, e.g., para análisis de destrucción celular, para purificación o inmunoprecipitación del polipéptido de las células. Por ejemplo, para aislamiento y purificación de un polipéptido, el equipo puede contener un anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica acoplado a perlas (e.g., perlas de sefarosa) . Pueden proporcionarse equipos que contienen los anticuerpos, oligopéptidos o moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas para la detección y cuantificación de un polipéptido in vitro, e.g., en un ELISA o un inmunoanálisis Western. Tal anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica útil para la detección puede proporcionarse con una marca tal como una fluorescente o radio marca. K. Artículos de Manufactura y Equipos Otra modalidad de la invención es un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento de un cáncer que expresa polipéptido (hepsina y/o HGF) tal como cáncer de próstata y ovárico. El artículo de manufactura comprende un envase y una etiqueta o inserto de empaque en o asociado con el envase. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los envases pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El envase contiene una composición efectiva para tratar una condición de cáncer y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un obturador perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica) . Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica de la invención. La etiqueta o inserto de empaque indica que la composición se utiliza para tratar el cáncer. La etiqueta o inserto de empaque comprenderá además instrucciones para administrar la composición de anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica al paciente con cáncer. Adicionalmente, el artículo de manufactura puede comprender además un segundo envase que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. También se proporcionan equipos útiles para varios propósitos, e.g., para análisis de expresión de polipéptido o de destrucción celular, para purificación o inmunoprecipitación de un polipéptido a partir de células. Para el aislamiento y purificación de un polipéptido, el equipo puede contener un anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica acoplado a perlas (e.g., perlas de sefarosa) . Pueden proporcionarse equipos que contienen los anticuerpos, oligopéptidos o moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas para la detección y cuantificación de un polipéptido in vitro, e.g., en un ELISA o un inmunoanálisis Western. Como con el artículo de manufactura, el equipo comprende un envase y una etiqueta o inserto de empaque en o asociado con el envase. El envase contiene una composición que comprende al menos un anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica de la invención. Pueden incluirse envases adicionales que contiene anticuerpos de control e.g., diluyentes y amortiguadores. La etiqueta o inserto de empaque pueden proporcionar una descripción de la composición así como instrucciones para el uso pretendido in vivo o detección. L. Polipéptidos y Ácidos Nucleicos que Codifican para Polipéptidos - Formas y Aplicaciones Específicas Las secuencias de nucleótidos (o sus complementos) que codifican polipéptidos de la invención, tienen diversas aplicaciones en la técnica de la biología molecular, así como usos para terapia, etc. El ácido nucleico que codifica para polipéptidos también serán útiles para la preparación de polipéptidos mediante las técnicas recombinantes descritas en la presente, en donde esos polipéptidos pueden encontrar su uso, por ejemplo, en la preparación de anticuerpos como se describe en la presente. Un gen de polipéptido de longitud total de secuencia natural o sus porciones, puede utilizarse como sonda de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar otros ADNcs (por ejemplo, aquellos que codifican para variantes de origen natural de un polipéptido o de un polipéptido de otra especie) que tienen una identidad de secuencia deseada para una secuencia de polipéptido natural descrita en la presente. Opcionalmente, la longitud de las sondas será de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases. Las sondas de hibridación pueden derivarse de regiones al menos parcialmente nuevas de la secuencia de nucleótidos natural de longitud total en donde aquellas regiones pueden determinarse sin experimentación indebida o de secuencias genómicas incluyendo promotores, elementos mejoradores e intrones del polipéptido de secuencia natural. A manera de ejemplo, un método de visualización comprenderá el aislamiento de la región de codificación del gen de polipéptido utilizando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación pueden marcarse mediante una variedad de marcas incluyendo radionucleótidos tales como 32P o 35D, o marcas enzimáticas tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda a través de sistemas de acoplamiento de avidina/biotina . Las sondas marcadas que tienen una secuencia complementaria a la del gen de polipéptido de la presente invención, pueden utilizarse para visualizar bibliotecas de ADNc humano, ADN o ARNm genómico para determinar a cuáles miembros de tales bibliotecas se hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen en mayor detalle en los Ejemplos abajo. Cualquiera de las secuencias EST descritas en la presente solicitud pueden emplearse de manera similar como sondas, utilizando los métodos descritos en la presente. Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos incluyen oligonucleótidos de antisentido o sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico monocatenaria (ya sea ARN o ADN) capaz de unirse para dirigirse a una secuencia de polipéptidos ARNm (sentido) o de polipéptidos ADN (antisentido) . Los oligonucleótidos de antisentido o sentido, de acuerdo con la presente invención, comprenden un fragmento de la región de codificación de una hepsina que codifica para ADN, fragmentos pro-HGF o de unión como se describe en la presente. Tal fragmento comprende generalmente 14 nucleótidos, preferentemente de aproximadamente 14 a 30 nucleótidos. La capacidad para derivar un oligonucleótido de antisentido o sentido, en base a la secuencia de ADNc que codifica para una proteína dada se describe, por ejemplo, en Stein y Cohén (Cáncer Res. 48:2659 1988) y van der Krol et al., (Bio/Techniques 6:958, 1988). La unión de oligonucleótidos de antisentido o sentido para dirigirse a secuencias de ácido nucleico da como resultado la formación de duplas que bloquean la transcripción o translación de la secuencia objetivo por uno de diversos medios, incluyendo degradación mejorada de las duplas, terminación prematura de la transcripción o translación o por otros medios. Tales métodos se encuentran abarcados por la presente invención. Los oligonucleótidos de antisentido pueden utilizarse por tanto para bloquear la expresión de una proteína, en donde la proteína puede jugar un papel en la inducción de cáncer en mamíferos. Los oligonucleótidos de antisentido o sentido comprenden además oligonucleótidos que tienen estructuras de azúcar-fosfodiéster modificadas (u otras uniones de azúcar, tales como las descritas en la WO 91/06629) y en donde las uniones de azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con uniones de azúcar resistentes son estables in vivo (i.e., capaces de resistir la degradación enzimática) pero retienen especificidad de secuencia para ser capaces de unirse a secuencias de nucleótidos objetivo. Los sitios intragénicos preferidos para la unión de antisentido incluyen la región que incorpora el codón de translación de inicio/comienzo (5' -AUG/5' -ATG) o el codón de terminación/detención (5' -UAA, 5' -UAG y 5' -UGA/5' -TAA, 5' -TAG y 5' -TGA) de la estructura abierta de lectura (ORF) del gen. Estas regiones se refieren a una porción del ARNm o gen que abarca de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (i.e., 5' o 3') desde un codón de translación de inicio o terminación. Otras regiones preferidas para unión de antisentido incluyen: intrones; exones; uniones de intrón-exón; la estructura de lectura abierta (ORF) o "región de codificación", que es la región entre el codón de translación de inicio y el codón de translación de terminación; la tapa 5' de un ARNm que comprende un residuo guanosina N7-metilado unido a el residuo más 5' del ARNm a través de una unión 5' -5' trifosfato e incluye una estructura de tapa 5' en sí así como los primeros 50 nucleótidos adyacentes a la tapa; la región 5' no trasladada (5' UTR), la porción de un ARNm en la dirección 5' desde el codón de translación de inicio e incluyendo por tanto los nucleótidos entre el sitio de tapa 5' y el codón de translación de inicio de un ARNm o los nucleótidos correspondientes en el gen; y la región 3' no trasladada (3'UTR), la porción de un ARNm en la dirección 3' desde el codón de translación de terminación, e incluyendo por tanto los nucleótidos entre el codón de translación de terminación y el extremo 3' de un ARNm o los nucleótidos correspondientes en el gen. Ejemplos específicos de compuestos de antisentido preferidos útiles para inhibir la expresión de un polipéptido incluyen oligonucleótidos que contienen estructuras modificadas o uniones internucleósido no naturales. Los oligonucleótidos que tienen estructuras modificadas incluyen aquellos que retienen un átomo de fósforo en la estructura y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la estructura. Para los propósitos de esta especificación, y como se refiere algunas veces en la técnica, los oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su estructura internucleósido también pueden considerarse como oligonucleótidos. Las estructuras de oligonucleótidos modificadas incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosforotioésteres, aminoalquilfosfotri-ésteres, metil o otros alquil fosfonatos incluyendo 3' -alquileno fosfonatos, 5' -alquileno fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforoamidatos incluyendo 3' -amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y borano-fosfatos que tienen uniones 3' -5' normales, análogos 2 ' -5' unidos de éstos, y aquellos que tienen polaridad invertida en donde una o más uniones internucleótido es una unión 3' a 3' , 5' a 5' o 2' a 2'. Los oligonucleótidos preferidos que tienen polaridad invertida comprenden una sola unión 3' a 3' en la unión internucleótido más 3' i.e., un solo residuo nucleósido invertido que puede ser abásico (falta la base núcleo o tiene un grupo hidroxilo en su lugar) . Diversas sales, sales mezcladas y formas de ácido libre también se incluyen. Las patentes de los Estados Unidos representativas que muestran la preparación de las uniones que contienen fósforo incluyen, pero no se limitan a, Patentes de E.U. Nos.: 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; ,399,676; 5,405,939; 5,453,496 5,455,233 5,466,677 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821 5,541,306 5,550,111 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361 5,194,599 5,565,555 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 y 5,625,050, cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia. Las estructuras de oligonucleótido modificadas preferidas que no incluyen un átomo de fósforo en las mismas tienen estructuras formadas por uniones interbucleósido alquilo o cicloalquilo de cadena corta, uniones internucleósido mezcladas de heteroátomo y alquilo o cicloalquilo, o una o más uniones internucleósido heteroatómicas o heterocíclicas de cadena corta. Estas incluyen aquellas que tienen uniones morfolino (formadas en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido) ; estructuras siloxano; estructuras sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras formacetil o tioformacetil; estructuras metileno formacetil y tioformacetil; estructuras riboacetil; estructuras que contienen alqueno; estructuras sulfamato; estructuras metilenoimino y metilenohidrazino; estructuras sulfonato y sulfonamida; estructuras amida; y otras que tienen partes componentes mezcladas N, O, S y CH.sub.2. Las Patentes de Estados Unidos representativas que muestran la preparación de tales oligonucleótidos incluyen, pero no se limitan a, Patentes de E.U. Nos.: 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; ,264,564 5,405, 938 5,434,257 5,466, 677; 5,470,967 5,489, 677 5,541,307 5,561,225 5,596,086; 5,602,240 5,610,289 5,602,240 5, 608,046 5, 610,289: 5,618,704 5, 623,070 5,663,312 5, 633,360 5,677,437; 5,792, 608 5,646,269 y 5,677,439, cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia. En otros oligonucleótidos de antisentido preferidos, las uniones tanto de azúcar como internucleósido, i.e., la estructura, de las unidades de nucleósido se reemplazan con nuevos grupos. Las unidades base se mantienen para hibridación con un compuesto objetivo de ácido nucleico apropiado. Un compuesto oligomérico tal, un oligonucleótido mimético que ha mostrado tener excelentes propiedades de hibridación, se refiere como un ácido nucleico péptido (PNA). En compuestos PNA, la estructura de azúcar de un oligonucleótido se reemplaza con una estructura que contiene amida, en particular una estructura aminoetilglicina . Las bases núcleo se retienen y se unen directamente o indirectamente a átomos de aza nitrógeno de la porción amida de la estructura. Las Patentes de Estados Unidos representativas que muestran la preparación de compuestos PNA incluyen pero no se limitan a las Patentes de E.U. Nos. ,539,082; 5,714,331 y 5,719,262, cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia. Puede encontrarse enseñanza adicional de compuestos PNA en Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500. Los oligonucleótidos de antisentido preferidos incorporan estructuras fosforotioato y/o estructuras heteroátomo, y en particular -CH2-NH-0-Ch2, -CH2-N (CH3) -0-CH2-[conocida como estructura metileno (metilimino) o MMI], -CH2-0-N(CH3) -CH2-, -CH2-N(CH3)-N-(CH3)-CH2- y -O-N (CH3) -CH2-CH2- [en donde la estructura fosfodiéster natural se representa como -0-P-0-CH2] descritas en la patente de E.U. No. 5,489,677 antes referida, y las estructuras amida de la patente de E.U. No. 5,602,240 antes referida. También se prefieren los oligonucleótidos de antisentido que tienen estructuras morfolino de la patente de E.U. No. 5,034,506 antes referida. Los oligonucleótidos modificados también pueden contener uno o más residuos de azúcar sustituidos. Los oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2' : OH; F; O-alquilo, o N-alquilo; 0-alquenilo, S-alquenilo o N-alquenilo; O-alquinilo, S-alquinilo o N-alquinilo; o O-alquilo-O-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo puede ser alquilo Ci a Cío sustituido o no sustituido o alquenilo C a Cío y alquinilo. Son particularmente preferidos O [ (CH2) nO]mCH3, 0(CH2)nOCH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)n0NH2 y 0 (CH2) nON [ (CH2) nCH3) ] 2, en donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos de antisentido preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2 ' : alquilo inferior de Ci a Cío, alquilo inferior sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo, o O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, S02, CH3, ON02, N02, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de división de ARN, un grupo informante, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2' -metoxietoxi (2' -0-CH2-CH2OCH3 conocido también como 2' -O- (2-metoxietil) o 2'-M0E) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) i.e., un grupo alcoxialcoxi. Una modificación adicional preferida incluye 2'-dimetilaminooxietoxi, i.e., un grupo O (CH2) 2ON (CH3) 2, conocido también como 2'-DMAOE, como se describe en los ejemplos abajo en la presente, y 2' -dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2' -O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), i.e., 2'-0-CH2-0-CH2-N(CH2) . Una modificación adicional preferida incluye ácidos nucleicos cerrados (LNAs) en los cuales el grupo 2' -hidroxilo se encuentra unido al átomo de carbono 3' o 4' del anillo de azúcar formando así un residuo azúcar bicíclico. La unión es preferentemente un grupo metileno (-CH2) que hace un puente con el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4' en donde n es 1 o 2. Los LNAs y su preparación se describen en la WO 98/39352 y WO 99/14226. Otras modificaciones preferidas incluyen 2' -metoxi (2'-0-CH3), 2'-aminopropoxi (2' -OCH2CH2CH2 NH2) , 2' -alilo (2'-CH2-CH=CH2), 2'-0-alilo (2' -0-CH2-CH=CH2) y 2' -fluoro (2'-F). la modificación 2' puede encontrarse en la posición arabino (arriba) o en la posición ribo (abajo) . Una modificación arabino 2' preferida es 2'-F. También pueden efectuarse modificaciones similares en otras posiciones en el oligonucleótido, particularmente en la posición 3' del azúcar en el nucleótido de terminación 3' o en los oligonucleótidos 2' -5' unidos y en la posición 5' del nucleótido de terminación 5' . Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos de azúcar tales como residuos ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosil . Las Patentes de Estados Unidos representativas que muestran la preparación de tales estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero no se limitan a, Patentes de E.U. Nos: 4,981,957; 5,118,800 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,427 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747 y 5,700,920 cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. Los oligonucleótidos también pueden incluir modificaciones o sustituciones de base núcleo (referida frecuentemente en la técnica simplemente como "base") . Como se utiliza en la presente, las bases núcleo "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases purina adenina (A) y guanina (G) , y las bases pirimidina timina (T) , citosina (C) y uracilo (U) . Las bases núcleo modificadas incluyen otras bases núcleo sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C) , 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracil y citosina, 5-propinil (-C=C-CH3 o -CH2-C=CH) uracilo y citosina y otros derivados alquinilo de bases pirimidina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo) , 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8 sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil y otros uracilos y citosinas 5 sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina . Bases núcleo modificadas adicionales incluyen pirimidinas tricíclicas tales como fenoxazina citidina (lH-pirimido [5, 4-b] [ 1, 4 ] benzoxazin-2 (3H) -ona), fenotiazina citidina (lH-pirimido [5, 4-b] [1, 4 ] benzotiazin-2 (3H) -ona) , grupos G tales como una fenoxazina citidina sustituida (e.g., 9- (aminoetoxi) -H-pirimido [5, 4-b] [1, 4] benzoxazin-2 (3H) -ona) , carbazolo citidina (2H-pirimido [4, 5-b] indol-2-ona) , piridoindolo citidina (H-pirido [3', 2' : 4 , 5]pirrolo [2, 3-d] pirimidin-2-ona) . Las bases núcleo modificadas también pueden incluir aquellas en las cuales la base purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo 7-deaza-adenina, 7-dezaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Bases de núcleo adicionales incluyen aquellas descritas en la Patente de E.U. No. 3,687,808, aquellas descritas en The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, y aquellas descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613. Ciertas de estas bases núcleo son particularmente útiles para incrementar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos de la invención. Estas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina . Las sustituciones 5-metilcitosina han mostrado incrementarla estabilidad de la dupla de ácido nucleico por 0.6-1.2 grados C. (Sanghvi et al., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, pp. 276-278) y son sustituciones base preferidas, incluso más particularmente al combinarse con modificaciones de azúcar 2' -O-metoxietilo. Las Patentes representativas de los Estados Unidos que muestran la preparación de bases núcleo modificadas incluyen pero no se limitan a: Pat. de E.U. No. 3,687,808 así como las Patentes de E.U. Nos.: 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273 5,367,066; 5.432,272; 5.457,187; 5,459,255; 5,484,908 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588 6,005,096; 5,681,941 y 5,750,692, cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia. Otra modificación de oligonucleótidos de antisentido une químicamente al oligonucleótido uno o más residuos o conjugados que mejoran la actividad, distribución celular o absorción celular del oligonucleótido. Los compuestos de la invención pueden incluir grupos conjugados unidos de manera covalente a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados de la invención incluyen intercaladores, moléculas informantes, poliaminas, poliamidas, polietileno glicoles, poliéteres, grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas de oligómeros y grupo que mejoran las propiedades farmacocinéticas de oligómeros. Los grupos conjugados típicos incluyen colesteroles, lípidos, lípidos de catión, fosfolípidos, fosfolípidos catiónicos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluorescentes, rhodaminas, cumarinas, y colorantes. Los grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas, en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la absorción de oligómero, mejoran la resistencia del oligómero a la degradación, y/o refuerzan la hibridación específica de secuencia con el ARN. Los grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la absorción, distribución, metabolismo o excreción del oligómero. Los residuos conjugados incluyen, pero no se limitan a residuos lípidos tales como un residuo colesterol (Letsinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let. 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, e.g., hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucí. Acids Res. 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, e.g., residuos dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, e.g., di-hexadecil-rac-glicerol o trietil-amonio 1, 2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucí. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietileno glicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido adamantano acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651-3654), un residuo palmitil (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta., 1995, 1264, 229-237), o un residuo octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol . Los oligonucleótidos de la invención también pueden conjugarse a sustancias de droga activa, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, cetoprofeno, (S) -(+) -pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2, 3, 5-triyodobenzoico, ácido folínico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometacina, un barbiturato, una cefalosporina, una droga sulfa, un antidiabético, un antibacterial o un antibiótico. Los conjugados de oligonucleótido-droga y su preparación se describen en la solicitud de patente de E.U. Ser. No. 09/334,130 (presentada en Junio 15 de 1999) y las Patentes de E.U. Nos 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465 .541,313 5.545,730 5,552,538 5,578,717 5,580,731 ,591,584 5,109,124 5,118,802 5,138,045 5,414, 077 ,486, 603 5,512,439 5,578,718 5, 608,046 4,587,044 4,605,735 4, 667,025 4,762,779 4,789,737 4,824, 41 4,835,263 4, 876, 335 4, 904,582 4, 958,013 5,082,830 ,112,963 5,214, 136 5,082,830 5,112,963 5,214,136 ,245,022 5,254,469 5,258,506 5,262,536 5,272,250 ,292,873 5,317,098 5,371,241 5,391,723 5,416,203 ,451,463 5,510,475 5,512, 667 5,514,785 5,565,552 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 y 5,688,941, cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia. No es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado se encuentren uniformemente modificadas, y de hecho más de una de las modificaciones antes mencionadas puede incorporarse en un solo compuesto o incluso en un solo nucleósido dentro de un oligonucleótido. La presente invención incluye también compuestos de antisentido que son compuestos quiméricos. Los compuestos de antisentido "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de esta invención, son compuestos de antisentido, particularmente oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una producida de al menos una unidad de monómero, i.e., un nucleótido en el caso de un compuesto oligonucleótido. Estos oligonucleótidos contienen típicamente al menos una región en donde el oligonucleótido se modifica a fin de conferir mediante el aumento en la resistencia del oligonucleótido a la degradación de nucleasa, incremento en la absorción celular, y/o incremento en la afinidad de unión para el ácido nucleico objetivo. Una región adicional del oligonucleótido puede servir como un sustrato para enzimas capaces de dividir los híbridos de ARN: ADN o ARN-ARN. A manera de ejemplo, RNasa H es una endonucleasa celular que divide la cadena de ARN de una dupla de ARN:ADN. La activación de RNasa H, en consecuencia, da como resultado la división del objetivo ARN, mejorando así grandemente la eficiencia de la inhibición del oligonucleótido de la expresión del gen. Consecuentemente, pueden obtenerse frecuentemente resultados comparables con oligonucleótidos más cortos cuando se utilizan oligonucleótidos quiméricos, en comparación con fosforotioato deoxioligonucleótidos que se hibridan a la misma región objetivo. Los compuestos de antisentido quiméricos de la invención pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o miméticos de oligonucleótido como se describió anteriormente. Los oligonucleótidos de antisentido quiméricos preferidos incorporan al menos un azúcar 2' modificado (preferentemente 2' -O- (CH2) 2-0-CH3) en la terminación 3' para conferir resistencia a nucleasa y una región con al menos 4 azúcares 2'-H contiguos para conferir actividad de RNasa H. Tales compuestos se han referido también en la técnica como híbridos o gápmeros. Los gápmeros preferidos tienen una región de azúcares 2' modificados (preferentemente 2' -O- (CH2) 2-0-CH3) en la terminación 3' y en la terminación 5' separados por al menos una región que tiene al menos 4 azúcares 2'-H contiguos e incorporan preferentemente uniones de estructura fosforotioato. Las Patentes representativas de los Estados Unidos que muestran la preparación de tales estructuras híbridas, incluyen, pero no se limitan a, Patentes de E.U. Nos. 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356 y 5,700,922 cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. Los compuestos de antisentido utilizados de acuerdo con esta invención pueden producirse conveniente y rutinariamente a través de la técnica muy conocida de síntesis en fase sólida. El equipo para tal síntesis se comercializa mediante diversos vendedores incluyendo, por ejemplo Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Adicionalmente o alternativamente puede emplearse cualquier otro medio para tal síntesis conocido en la técnica. es muy conocido el uso de técnicas similares para preparar oligonucleótidos tales como los fosforotioatos y derivados alquilados. Los compuestos de la invención también pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse y de otra manera asociarse con otras moléculas, estructuras de molécula o mezclas de compuestos, como por ejemplo, liposomas, moléculas objetivo receptoras, formulaciones orales, rectales, tópicas u otras, para auxiliar en la absorción, distribución y/o absorción. Las Patentes representativas de los Estados Unidos que muestran la preparación de tales formulaciones de absorción y/o distribución incluyen, pero no se limitan a, Patentes de E.U. Nos. 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016 ,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; y 5,595,756 cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia. Otros ejemplos de oligonucleótidos de sentido o antisentido incluyen aquellos oligonucleótidos unidos de manera covalente a residuos orgánicos, tales como los descritos en la WO 90/10048, y otros residuos que aumentan la afinidad del oligonucleótido para una secuencia de ácido nucleico objetivo, tal como poli- (L-lisina) . Aún adicionalmente, los agentes de intercalado, tales como elipticina, y agentes de alquilación o complejos de metal pueden unirse a oligonucleótidos de sentido o antisentido para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido de antisentido o sentido para la secuencia de nucleótido objetivo. Los oligonucleótidos de antisentido o sentido pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo mediante cualquier método de transferencia de gen, por ejemplo, transfección de ADN mediada porCaP04, electroporación, o utilizando vectores de transferencia de gen tales como el virus Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, un oligonucleótido de antisentido o sentido se inserta en un vector retroviral adecuado. Una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo se pone en contacto con el vector retroviral recombinante, ya sea in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no se limitan a, los derivados del retrovirus murino M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV) , o los vectores de copia doble designados DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver WO 90/13641) . Los oligonucleótidos de sentido o antisentido también pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos objetivo mediante formación de un conjugado con una molécula de unión de ligante, como se describe en la WO 91/04753. Las moléculas de unión de ligante adecuadas, incluyen, pero no se limitan a receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citosinas, u otros ligantes que se unen a receptores de superficie celular. Preferentemente, la conjugación de la molécula de unión de ligante no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula de unión de ligante para unirse a su molécula o receptor correspondiente, o para bloquear la entrada del oligonucleótido de sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula. Alternativamente, un oligonucleótido de sentido o antisentido puede introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo mediante la formación de un complejo de oligonucleótido-lípido como se describe en la WO 90(10448. El complejo de oligonucleótido-lípido de sentido o antisentido se encuentra preferentemente disociado dentro de la célula mediante una lipasa endógena. Las moléculas de ARN o ADN de antisentido o sentido son generalmente de al menos aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, alternativamente, de al menos aproximadamente, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000 nucleótidos de longitud, en donde en este contexto, el término "aproximadamente" significa la longitud de la secuencia de nucleótidos referida más o menos el 10% de esa longitud referida. Las sondas también pueden emplearse en técnicas PCR para generar un depósito de secuencias para la identificación de secuencias de codificación de polipéptidos cercanamente relacionadas . Las secuencias de nucleótidos que codifican para un polipéptido también pueden utilizarse para construir sondas de hibridación para elaborar un mapa del gen que codifica para el polipéptido y para el análisis genético de individuos con desórdenes genéticos. Pueden elaborarse mapas de las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente para un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma utilizando técnicas conocidas, tales como hibridación in situ, análisis de unión contra marcadores cromosomales conocidos, y visualización de hibridación con bibliotecas. El polipéptido puede utilizarse en análisis para la identificación de proteínas o moléculas implicadas en una interacción de unión con el polipéptido. Mediante tales métodos, pueden identificarse los inhibidores de interacción de unión del receptor/ligante. Las proteínas implicadas en tales interacciones de unión también pueden utilizarse para visualizar inhibidores de péptido o molécula pequeña de la interacción de unión. Pueden diseñarse análisis de visualización para encontrar compuestos guía que imitan la actividad biológica de un polipéptido natural o de un receptor para el polipéptido. Tales análisis de visualización incluirán análisis dóciles a la visualización de alto desempeño de bibliotecas químicas, haciéndolas particularmente adecuadas para la identificación de candidatos de droga de molécula pequeña. Las moléculas pequeñas contempladas incluyen compuestos sintéticos orgánicos o inorgánicos. Los análisis pueden efectuarse en una variedad de formatos, incluyendo análisis de unión de proteína-proteína, análisis de visualización bioquímica, inmunoanálisis y análisis en base a células que se encuentran muy caracterizados en la técnica. Los ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido o sus formas modificadas también pueden utilizarse para generar ya sea animales transgénicos o animales "knock out" que a su vez, son útiles en el desarrollo y visualización de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (e.g., un ratón o rata) es un animal que tiene células que contienen un transgén, cuyo transgén se introdujo en el animal o en un ancestro del animal en una etapa prenatal, e.g., una etapa embriónica. Un transgén es un ADN que se integra en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico. En una modalidad, el ADNc que codifica para un polipéptido puede utilizarse para clonar un ADN genómico que codifica para el polipéptido de acuerdo con técnicas establecidas y utilizarse las secuencias genómicas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan el ADN que codifica para el polipéptido. Los métodos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se han vuelto convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo en las Patentes de E.U. Nos. 4,736,866 y 4,870,009. Típicamente, las células particulares se dirigirán por a incorporación de transgén de polipéptido con mejoradores específicos del tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica para un polipéptido introducido en la línea germinal del animal en una etapa embriónica, pueden utilizarse para examinar el efecto del aumento de expresión del ADN que codifica para un polipéptido. Tales animales pueden utilizarse como animales de prueba para reactivos que se cree que confieren protección de, por ejemplo, condiciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. De acuerdo con esta faceta de la invención, un animal se trata con el reactivo y una reducida incidencia de la condición patológica, en comparación con animales no tratados portadores del transgén, indicaría una potencial intervención terapéutica para la condición patológica. Alternativamente, pueden utilizarse homólogos no humanos de un polipéptido para construir un animal de gen "knock out" que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica para el polipéptido como resultado de la recombinación homologa ente el gen endógeno que codifica para el polipéptido y el ADN genómico alterado que codifica para el polipéptido introducido en una célula progenitora embriónica del animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica para el polipéptido puede utilizarse para clonar el ADN genómico que codifica para el polipéptido de acuerdo con técnicas establecidas. Una porción del ADN genómico que codifica para el polipéptido puede detectarse o reemplazarse con otro gen, tal como un gen que codifica para un marcador seleccionado que puede utilizarse para monitorear la integración. Típicamente, se incluyen varias kilobases de ADN lateral no alterado (en los extremos 5' y 3' ) en el vector [ver e.g., Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores homólogos de recombinación] . El vector se introduce en una línea de célula progenitora embriónica (e.g., mediante electroporación) y las células en las cuales el ADN introducido se ha recombinado de manera homologa con el ADN endógeno se seleccionan [ver, e.g., Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. Las células seleccionadas se inyectan entonces en un blastocito de un animal (e.g., un ratón o rata) para formar quimeras de agregación [ver e.g., Bradley en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. Un embrión quimérico puede entonces implantarse en un animal adoptivo hembra pseudopreñado adecuado y llevar a término el embrión para crear un animal "knock out". La progenie que porta el ADN recombinado de manera homologa en sus células germinales puede identificarse mediante técnicas estándar y utilizarse para criar animales en los cuales todas las células del animal contienen el ADN recombinado de manera homologa. Los animales knock out pueden caracterizarse por ejemplo, por su capacidad para defenderse contra ciertas condiciones patológicas y por su desarrollo de condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido. El ácido nucleico que codifica para los polipéptidos también puede utilizarse en terapia de gen. En aplicaciones de terapia de gen, se introducen genes en células a fin de lograr la síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente efectivo, por ejemplo para el reemplazo de un gen defectuoso. La "terapia de gen" incluye tanto terapia de gen convencional, en donde se logra un efecto duradero mediante un solo tratamiento, como la administración de agentes terapéuticos de gen, que implica la administración una sola vez o repetida de un ADN o ARNm terapéuticamente efectivo. Los ARNs y ADNs de antisentido pueden utilizarse como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. Se ha mostrado ya que los oligonucleótidos de antisentido cortos pueden importarse en células en donde actúan como inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares ocasionadas por su restringida absorción por la membrana celular (Zamecnik et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 83:4143-4146 [1986]). Los oligonucleótidos pueden modificarse para mejorar su absorción, e.g., sustituyendo sus grupos fosfodiéster de carga negativa por grupos no cargados. Existe una variedad de técnicas disponibles para la introducción de ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del huésped pretendido. Las técnicas adecuadas para la transferencia del ácido nucleico en células de mamífero in vitro, incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextran, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Las técnicas de transferencia de gen in vivo actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales (típicamente retrovirales) y transfección mediada por recubrimiento viral de proteína-liposoma (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 [1993]). En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que dirige las células objetivo, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular o la célula objetivo, un ligante para un receptor de la célula objetivo, etc. Cuando se emplean liposomas, las proteínas que se unen a una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis, pueden utilizarse para dirigir y/o facilitar la absorción, e.g., proteínas cápsido o sus fragmentos, trópicos para un tipo celular particular, anticuerpos para proteínas que experimentan internalización en e ciclado, proteínas que dirigen la localización intracelular y mejoran la vida media intracelular. La técnica de endocitosis mediada por receptor se describe, por ejemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem., 262, 4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87. 3410-3414 (1990). Para revisión de los protocolos de marcación de gen y terapia de gen ver Anderson et al., Science, 256, 808-813 (1992). Las moléculas de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos o sus fragmentos descritos en la presente, son útiles para la identificación de cromosomas. A este respecto, existe una necesidad continua por identificar nuevos marcadores de cromosomas, dado que actualmente se encuentran disponibles relativamente pocos reactivos de marcado de cromosomas en base a los datos de secuencia reales. Cada molécula de ácido nucleico de la presente invención puede utilizarse como marcador de cromosomas. Los polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden utilizarse de manera diagnóstica para tipificar tejidos, en donde los polipéptidos pueden expresarse diferencialmente en un tejido en comparación con otro, preferentemente en un tejido enfermo en comparación con un tejido normal del mismo tipo de tejido. Las moléculas de ácido nucleico encontrarán su uso para la generación de sondas para PCR, inmunoanálisis Northern, inmunoanálisis Southern e inmunoanálisis Western. Esta invención abarca métodos para visualizar compuestos para la identificación de aquellos que evitan el efecto del polipéptido (antagonistas) . Los análisis de visualización para candidatos de droga antagonista se diseñan para identificar compuestos que se unen o se complej an con los polipéptidos codificados por los genes identificados en la presente, o que de otra manera interfieren con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares, incluyendo e.g., inhibiendo la expresión del polipéptido a partir de las células. Tales análisis de visualización incluirán análisis dóciles para la visualización de alto desempeño de bibliotecas químicas, haciéndolas particularmente adecuadas para la identificación de candidatos de droga de molécula pequeña. Los análisis pueden llevarse a cabo en una variedad de formatos, incluyendo análisis de unión de proteína-proteína, análisis de visualización bioquímica, inmunoanálisis, y análisis a base de células, que se encuentran muy caracterizados en la técnica. Los análisis para antagonistas son comunes en que llaman al contacto de la droga candidato con un polipéptido codificado por un ácido nucleico identificado en la presente bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir la interacción de estos dos componentes. En análisis de unión, la interacción es la unión y el complejo formado puede aislarse i detectarse en la mezcla de reacción. En una modalidad particular, el polipéptido o la droga candidato se inmoviliza en una fase sólida, e.g., en una placa de microtitulación, mediante uniones covalentes o no covalente. La unión no covalente se logra generalmente recubriendo la superficie sólida con una solución del polipéptido y secando. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado, e.g., un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido que va a inmovilizarse, puede utilizarse para anclarlo a una superficie sólida. El análisis se lleva a cabo agregando el componente no inmovilizado, que puede marcarse mediante una marca detectable, al componente inmovilizado, e.g., la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando la reacción se completa, los componentes no reactivados se retiran, e.g., mediante lavado, y se detectan los complejos anclados en la superficie sólida. Cuando el componente originalmente no inmovilizado porta una marca detectable, la detección de marca inmovilizada en la superficie indica la complejación presentada. Cuando el componente originalmente no inmovilizada no porta una marca, la complejación puede detectarse, por ejemplo, utilizando un anticuerpo marcado que se une específicamente al complejo inmovilizado. Si el compuesto candidato interactúa con, pero no se une a un polipéptido, su interacción con el polipéptido puede analizarse mediante métodos muy conocidos para la detección de interacciones de proteína-proteína. Tales análisis incluyen procedimientos tradicionales, tales como e.g., reticulación, co-inmunoprecipitación, y co-purificación a través de gradientes o columnas cromatográficas. Adicionalmente, las interacciones de proteína-proteína pueden monitorearse utilizando un sistema genético en base a levadura descrito por Fields y colaboradores (Fields y Song, Nature (Londres), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88:9578-9582 (1991)) como se describe por Chevray y Nathans, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:5789-5793 (1991). Muchos activadores de transcripción, tales como levadura GAL4, consisten de dos dominios modulares físicamente discretos, uno que actúa como el dominio de unión de ADN, el otro funcionando como el dominio de activación de transcripción. El sistema de expresión de levadura descrito en las publicaciones anteriores (generalmente referido como el "sistema de dos híbridos") toma ventaja de esta propiedad, y emplea las dos proteínas híbridas, una en la cual la proteína objetivo se fusiona al dominio de unión de ADN de GAL4, y otra en la cual las proteínas de activación candidato se fusionan al dominio de activación. La expresión de un gen informante GALl-lacZ bajo el control de un promotor GAL4-activado depende de la reconstrucción de la actividad de GAL4 a través de una interacción de proteína-proteína. Las colonias que contienen polipéptidos de interacción se detectan con un sustrato cromogénico para ß-galactosidasa. Un equipo completo (MATCHMAKER™) para identificar las interacciones de proteína-proteína entre dos proteínas específicas utilizando la técnica de dos híbridos se encuentra comercialmente disponible de Clontech. Este sistema también puede extenderse para producir mapas de dominios de proteína implicados en interacciones de proteína específicas así como para cruzar residuos de aminoácido que son cruciales para estas interacciones. Los compuestos que interfieren con la interacción de un gen que codifica para un polipéptido identificado en la presente y otros componentes intra o extacelulares, pueden probarse como sigue: comúnmente se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto del gen y el componente intra o extracelular bajo condiciones y durante un tiempo que permite la interacción y unión de los dos productos. Para probar la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la unión, la reacción se efectúa en ausencia y en presencia del compuesto de prueba. Además, puede agregarse un placebo a una tercera mezcla de reacción para servir como un control positivo. La unión (formación de complejo) entre el compuesto de prueba y el componente intra o extracelular presente en la mezcla se monitorea como se describió anteriormente. La formación de un complejo en la(s) reacción (es) de control, pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba, indica que el compuesto de prueba interfiere con la interacción del compuesto de prueba y su socio de reacción. Para analizar por antagonistas, el polipéptido puede agregarse a una célula conjuntamente con el compuesto que va a visualizarse por una actividad particular, y la capacidad del compuesto para inhibir la actividad de interés en presencia del polipéptido indica que el compuesto es un antagonista para el polipéptido. Alternativamente, los antagonistas pueden detectarse combinando el polipéptido y un antagonista potencial con receptores polipéptido unidos a membrana o receptores codificados bajo las condiciones apropiadas para un análisis de inhibición competitivo. El polipéptido puede marcarse, tal como por radiactividad, de manera que el número de moléculas de polipéptido unidas al receptor, puede utilizarse para determinar la efectividad del antagonista potencial. El gen que codifica para el receptor puede identificarse mediante numerosos métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, paneo de ligante y selección FACS. Coligan et al., Current Protocols in Immun . , 1(2): Capítulo 5 (1991). Preferentemente, se emplea clonación de expresión en donde el ARN poliadenilado se prepara a partir de una célula que responde al polipéptido y una biblioteca ADNc creada de este ARN se divide en depósitos y se utiliza para transfectar células COS u otras células que no responden al polipéptido. Las células transfectadas se cultivan en portaobjetos de vidrio y se exponen al polipéptido marcado. El polipéptido puede marcarse mediante una variedad de medios incluyendo yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína cinasa sitio-específica. Después de fijar e incubar, los portaobjetos se someten a análisis autorradiográfico. Los depósitos positivos se identifican y se preparan sub-depósitos y se retransfectan utilizando un proceso interactivo de sub-depósito y re-visualización, que produce eventualmente un solo clon que codifica para el receptor putativo. Como un procedimiento alternativo para la identificación del receptor, el polipéptido marcado puede unirse por fotoafinidad con preparaciones de membrana celular o de extracto que expresan la molécula receptor. El material reticulado se disuelve mediante PAGE y se expone a película de rayos X. El complejo marcado que contiene el receptor puede extraerse, disolverse en fragmentos de péptido, y someterse a micro secuencia de proteína. La secuencia de aminoácidos obtenida de la micro secuencia se utilizará para diseñar un conjunto de sondas de oligonucleótido degeneradas para visualizar una biblioteca de ADNc para la identificación del gen que codifica el receptor putativo. En otro análisis para antagonistas, las células de mamífero o una preparación de membrana que expresa el receptor se incuban con el polipéptido marcado en presencia del compuesto candidato. Entonces puede medirse la capacidad del compuesto para mejorar o bloquear esta interacción. Ejemplos más específicos de antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones de inmunoglobulina con un polipéptido, y, en particular, anticuerpos, incluyendo sin limitación, anticuerpos poli y monoclonales y fragmentos de anticuerpo, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos anti-idiopáticos, y versiones quiméricas y humanizadas de tales anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo. Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteína cercanamente relacionada, por ejemplo, una forma mutante del polipéptido que reconoce el receptor, pero no imparte efecto, inhibiendo así competitivamente la acción del polipéptido. Otro antagonista potencial es una construcción de ARN o ADN preparada utilizando tecnología de antisentido, en donde, e.g., una molécula de ARN o ADN de antisentido actúa para bloquear directamente la translación del ARNm hibridándose al ARNm marcado y evitando la translación de proteína. La tecnología de antisentido puede utilizarse para controlar la expresión del gen a través de la formación de triple hélice o de ADN o ARN de antisentido, ambos métodos basados en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la porción 5' de codificación de la secuencia de polinuceótidos, que codifica para los polipéptidos maduros en la presente, puede utilizarse para diseñar un oligonucleótido de ARN de antisentido de desde aproximadamente 10 a 40 pares base de longitud. Un oligonucleótido de ADN se diseña para ser complementario a una región del gen implicada en la transcripción (triple hélice, ver Lee et al., Nucí. Acids Res. 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), previniendo así la transcripción y la producción del polipéptido. El oligonucleótido de ARN de antisentido se hibrida a ARNm in vivo y bloquea la translación de la molécula de ARNm en el polipéptido (antisentido, Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Ratón, FL, 1988). Los oligonucleótidos antes descritos también pueden suministrarse a células de manera que el ARN o ADN de antisentido puede expresarse in vivo para inhibir la producción del polipéptido. Cuando se utiliza ADN de antisentido, se prefieren los oligodeoxirribonucleótidos derivados del sitio de translación-inicio, e.g., entre aproximadamente las posiciones -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos del gen objetivo. Los antagonistas potenciales incluyen moléculas pequeñas que se unen al sitio activo, el sitio de unión del receptor, o factor de crecimiento u otro sitio de unión relevante del polipéptido, bloqueando así la actividad biológica normal del polipéptido. Ejemplos e moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, péptidos pequeños o moléculas similares al péptido, preferentemente péptidos solubles, y compuestos sintéticos orgánicos o inorgánicos no peptidilo. Las ribozimas son moléculas enzimáticas capaces de catalizar la división específica del ARN. Las ribozimas actúan por hibridación específica de secuencia al ARN objetivo complementario, seguido por división endonucleolítica. Los sitios específicos de división de ribozima dentro de un objetivo de ARN potencial pueden identificarse mediante técnicas conocidas. Para detalles adicionales, ver e.g., Rossi, Current Biology, 4:469:471 (1994), y publicación PCT No. WO 97/33551 (publicada en Septiembre 18 de 1997) . Las moléculas de ácido nucleico en la formación de triple hélice utilizadas para inhibir la transcripción, deben ser monocatenarias y compuestas de deoxinucleótidos . La composición base de estos oligonucleótidos se diseña de manera que promueve la formación de triple hélice a través de reglas Hoogsteen de emparejamiento de base, que requieren generalmente estiramientos calculables de purinas o pirimidinas en una cadena de una dupla. Para detalles adicionales, ver, e.g., publicación PCT No. WO 97/33551, supra . Estas moléculas pequeñas pueden identificarse mediante cualquiera o más de los análisis de visualización tratados anteriormente y/o mediante cualquiera de otras técnicas de visualización muy conocidas por los expertos en la técnica. El ácido nucleico que codifica para el polipéptido puede utilizarse para producir el polipéptido de manera recombinante utilizando técnicas muy conocidas en la técnica como se describe en la presente. A su vez, los polipéptidos producidos pueden emplearse para la generación de anticuerpos utilizando técnicas muy conocidas en la técnica y como se describe en la presente. Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido identificado en la presente, así como otras moléculas identificadas mediante los análisis de visualización anteriormente, pueden administrarse para el tratamiento de diversos trastornos, incluyendo cáncer, en forma de composiciones farmacéuticas.

Si el polipéptido es intracelular y los anticuerpos completos se utilizan como inhibidores, se prefieren los anticuerpos de internalización. Sin embargo, también pueden utilizarse lipofecciones o liposomas para suministrar el anticuerpo, o fragmento de anticuerpo en las células. Cuando se utilizan fragmentos de anticuerpo, se prefiere el fragmento de inhibición más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína objetivo. Por ejemplo, en base a las secuencias de región variable de un anticuerpo, pueden diseñarse moléculas de péptido que retienen la capacidad para unirse a la secuencia de proteínas objetivo. Tales péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante. Ver, e.g., Marasco et al., Proc. Nati. Acad. Sci EUA 90:7889-7893 (1993). La presente formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario, para la indicación particular tratada, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Alternativamente o adicionalmente, la composición puede comprender un agente que mejora su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citosina, agente quimioterapéutico, o agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas se encuentran adecuadamente presentes en cantidades efectivas para el propósito pretendido.

Los siguientes ejemplos se ofrecen solo para propósitos de ilustración, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención en modo alguno. EJEMPLOS Reactivos El sustrato cromogénico S2366 se obtuvo de DiaPharma Group, Inc., (West Chester, OH), el plasminógeno Lys de Haematologic Technologies Inc., (Essex Junction, VT) y el activador de plasminógeno tipo tejido (t-PA) de Genentech, Inc., (South San Francisco, CA) . Pro-HGF, expresado en células de ovario de hámster Chino (CHO) en ausencia de suero y purificado mediante cromatografía HiTrap Sepharose SP, se proporcionó por Davis Kahn (Genentech) . El HGFA que comprende los residuos Val373 - Arg407 se expresó en un sistema de expresión de bacilovirus y se purificó como se describe (34). El FVII recombinante humano purificado, expresado en células 293 humanas, fue donado por Mark O'Connell (Genentech) y se describió recientemente (42). Se utilizó dioleoil 1, 2-diacil-sn-glicero-3- (fosfo-L-serina) (PS) y oleoil 1, 2-diacil-sn-glicero-3-fosfocolina (PC) (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL) para producir vesículas de PCPS (proporción molar 7:3) esencialmente como se describe (43). Los marcadores del peso molecular fueron los estándares SeeBlue Plus2 y MultiMark (Invitrogen, Carlsbad, CA) .

Expresión y purificación de hepsina El ADNc de hepsina de longitud total, obtenido del consorcio I.M.A.G.E. (ATCC Manassas, VA), se digirió con endonucleasas de restricción EcoRI y Notl (New Engand Biolabs Inc., Beverly, MA) y se insertó en el vector de expresión eucariótica pRK5E. Un ADNc de hepsina secretado marcado con His se construyó mediante fusión del ADNc que codifica para la secuencia de señal de HGF humano (aminoácidos Metí Gly31) con el ADNc que codifica para el dominio extracelular de hepsina humana (Arg45 - Leu417): sistema de numeración de acuerdo con Somoza et al., 2003 (5)) . Además, se agregó una marca His8 a la terminal C después de Leu417 y la construcción final de ADNc se insertó en el vector de expresión eucariótica pCMV-PD5. La hepsina se expresó en un sistema de expresión transitorio de célula de ovario de hámster Chino (CHO) y se purificó mediante cromatografía de afinidad de ácido niquel-nitrilotriacético (Ni-NTA) esencialmente como se describió para la producción de sHAI-lB de tipo silvestre (34). Expresión y purificación de mutantes sHAI-lB, sHAI-lB y sHAI-2 Se produjo una forma soluble de HAI-1B (sHAI-lB) que comprende el dominio extracelular completo en un sistema de expresión transitoria CHO y se purificó como se describió previamente (34). Utilizando mutagénesis sitio-dirigida, los residuos Pl de KD1 (Arg260) y KD2 (Lys401) se cambiaron individualmente a Ala y las proteínas resultantes, sHAI-lB (R260A) y sHAI-lB (K401A) , se expresaron y se purificaron como se describió (34). Se obtuvo HAI-2 de longitud total a partir de una biblioteca de ADNc derivada de ARN de pulmón fetal humano (BD Biosciences Clontech., Palo Alto, CA) utilizando el sitio oligo dT/Notl como iniciador y adaptador con el sitio Salí para la segunda cadena. El ADNc se digirió con Salí y Notl; los ADNcs mayores que 2.8 kb se unieron a pRK5D. El ADN monocatenario de la biblioteca de ADNc de pulmón humano/pRK5D se generó utilizando métodos de biología molecular estándar. El iniciador inverso (5' -TTTCTTGAGGCACTCCTCCTTG-3' ) se recoció al depósito de ADNc monocatenario y se extendió utilizando polimerasa de ADN T7 y T4. Se transformó E. coli con el ADN bicatenario sintetizado y las colonias se visualizaron utilizando métodos estándar de hibridación de filtro. El tamaño del inserto se analizó mediante PCR y la restricción de digestión endonucleasa, Xbal. Los clones de HAI-2 de longitud total se identificaron y se confirmaron mediante secuencia de ADN. Una forma soluble de HAI-2 (sHAI-2) se produjo construyendo un ADNc que codifica para el dominio extracelular (Ala28 - Lysl97; sistema de numeración de acuerdo con Kawaguchi et al., 1997 (39)) de HAI-2 y agregando una marca His8 de terminal C con un separador Gly.

El ADNc obtenido se insertó entonces en un vector de expresión de bacilovirus derivado de pVLl393 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) . Se expresó sHAI-2 en el sistema de expresión de bacilovirus y se purificó mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA esencialmente como se describió para la producción de la cadena ß de HGF (44) . Las concentraciones de proteína se determinaron mediante análisis cuantitativo de aminoácidos. FVII y análisis de activación de plasminógeno Se activó FVII a una concentración de 0.11 mg/ml mediante 230 nM de hepsina en 30 mM de Tris-HCl, pH 8.4, 20 mM de imidazolo, 200 mM de NaCl (amortiguador Tris) en presencia de 0.5 mM de vesículas de PCPS y 5 mM de CaCl2 a 37°C. Los alícuotas de reacción tomados en diferentes puntos de tiempo se analizaron mediante SDS-PAGE (condiciones de reducción) utilizando un gel de gradiente al 4-20% (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Los geles se colorearon con Simply Blue Safe Stain (Invitrogen) . El plasminógeno a 0.12 mg/ml se incubó con 40 nM de hepsina o 40 nM de t-PA (control positivo) en 20 mM de Hepes, pH 7.5, 150 mM de NaCl (amortiguador Hepes) a 37°C. los alícuotas de reacción tomados en diferentes puntos de tiempo se analizaron mediante SDS-PAGE como se describió para análisis de activación de FVII. Activación de pro-HGF mediante hepsina y HGFA Se incubó pro-HGF (0.3 mg/ml) en amortiguador Hepes con 40 nM de hepsina o con 40 nM de HGFA durante 4 horas a 37°C y se almacenó a -20°C hasta su uso posterior. El análisis del material digerido, HGFhepsina y HGFHGFA» mediante SDS-PAGE indicó que >95% de pro-HGF se convirtió en HGF bicatenario. Se llevó a cabo el análisis de activación de proHGF y el marcado con 125I de pro-HGF como se describió (34, 45). Brevemente, el pro-HGF marcado con 125I a 0.05 mg/ml en amortiguador Hepes se incubó con aumento en las concentraciones (0.16 -40 nM) de hepsina o HGFA a 37°C. después de 4 horas, se retiraron los alícuotas y se analizaron mediante SDS-PAGE (gel de gradiente al 4-20%) (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) . Para estudios de inhibición, se incubó hepsina (15 nM) en amortiguador Hepes con 1 µM de sHAI-lB, sHAI-lB (K401A) , sHAI-lB (R260A) , o sHAI-2 a 37°C. después de 4 horas, las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE y se colorearon con Simply Blue Safe Stain (Invitrogen). Análisis de inhibición de enzimas Las condiciones del análisis fueron similares a las descritas por Somoza et al., 2003 (5) utilizando el sustrato cromogénico S2366 (hidrocloruro de L-piroglutamil-L-prolil-L-arginina-p-nitroanilina) . Se incubó hepsina (concentración final de 0.4 nM) con aumento en las concentraciones de inhibidores en amortiguador Tris durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se agregó el sustrato S2366 y el cambio en la absorbencia a 105 nm se midió en un lector de microplaca cinético (Molecular Devices, Sunnyvale CA) . Las concentraciones de hepsina y S2366 en esta mezcla final de reacción fueron de 0.4 nM y 0.2 mM (determinadas Kra=0.2 mM) , respectivamente. Las actividades inhibidoras se expresaron como actividad de fracción (v?/v0) de la actividad de enzimas no inhibidas. Las concentraciones de inhibidor dando 50% de inhibición (IC50) se calcularon ajustando los datos a un programa de ajuste de curva de regresión de cuatro parámetros (Kaleidograph, Synergy Software, Reading, PA) . Se llevaron a cabo al menos tres experimentos independientes para cada inhibidor . Análisis de proliferación celular y migración Los análisis de proliferación se llevaron a cabo con la línea celular de adenocarcinoma pancreático humano BxPC3 obtenida de la European Collection of Cell Cultures (CAMR, Centre for Applied Microbiology and Research, Salisbury, Wiltshire, UK) . Las células se cultivaron en medio RPMI conteniendo FCS al 10% (Sigma, St. Louis, MO) , 10 mM de Hepes, 2 mM de glutamina, Penicillin-Streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 250 µg/ml de G418 (Invitrogen) .

Se lavaron las capas celulares confluentes con PBS seguido por 10 mM de EDTA/PBS y se retiraron después de la incubación con tripsina. Las células se resuspendieron en medio de crecimiento y se sembraron (10,000 - 15,000 células/pozo) en placas MT de fondo blanco de 96 pozos (Cultur Píate™, Packard/PerkinElmer, Boston, MA) . Después de 24 horas, el medio de crecimiento se reemplazó con RPMI-0, 1% BSA. Después de 24 horas adicionales, el medio se retiró y se agregaron varias concentraciones de HGFhepsina y HGFHGFA en RPMI-0, 1% BSA y las células se dejaron crecer durante 72 horas. La proliferación celular se cuantificó entonces mediante el uso del CellTiter-Glo Luminiscent Kit (Promega, Madison, Wl) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. se midió la luminiscencia en un luminómetro de microplaca Tropix TR717 (Berthold 75323, Bad Wildbad, Alemania) . Después de la sustracción de los valores de respaldo (proliferación en ausencia de HGF) , se expresaron las actividades de HGFhepsina y HGFHGFA como porcentaje de la proliferación de BxPC3 mediante 100 ng/ml de una preparación de control de HGF (obtenida del Dr. Ralph Schwall, Genentech). Se llevaron a cabo análisis de migración celular con la línea celular de cáncer de mama MDA-MB435 (HTB-129, ATCC, Manassas, VA) como se describió (44). Brevemente, 0.2 ml de una suspensión celular en medio libre de suero (0.6-0.8 x 106 células/ml) se agregaron a las cámaras superiores de placas transpozo de 24 pozos (tamaño de poro 8 µm) (HTS Multiwell™ Insert System, Falcon, Frankiin Lakes, NJ (pre-recubiertas con 10 µg/ml de colágeno de rabo de rata Tipo I (Upstate, Lake Placid, NY) . Se agregaron preparaciones de HGF a la cámara inferior en medio libre de suero. Después de la incubación durante 13-14 horas, las células en el lado ápico de a membrana se retiraron y aquellas que migraron al lado basal se fijaron en paraformaldehído al 4% seguido por la coloración con solución de violeta cristal al 0.5%. Las células se solubilizaron en ácido acético al 10% y se midió el A56o en un lector de microplaca Molecular Devices. Las actividades pro-migratorias de los mutantes HGF se expresaron como porcentaje de una preparación de control de HGF después de sustraer la migración basal en ausencia de HGF. Análisis de fosforilación del receptor Met El análisis de activación del receptor cinasa (KIRA) se llevó a cabo como se describe (44). Brevemente, se sembraron células A549 de carcinoma pulmonar (CCL-185, ATCC, Manassas, VA) en placas de 96 pozos a una densidad de 50,000 células por pozo. Después de una incubación durante la noche a 37°C, el medio de crecimiento se retiró y las células se saciaron con suero durante 30 a 60 minutos en medio conteniendo FBS al 0.1%. Se agregaron concentraciones aumentadas de HGFhepsina y HGFHGFA en un medio conteniendo FBS al 0.1%. como control se utilizó una forma monocatenaria no divisible de HGF (scHGF) en la cual el sitio de desdoblamiento se mutó (Arg494Glu) (44) . Después de 10 minutos de incubación a 37°C, el medio se retiró y las células se lisaron con amortiguador de lisis (Cell Signaling Technologies, Beverly, MA) suplementadas con un cóctel de inhibidor de proteasa. El anticuerpo marcado con BV-TAG 4G10 y el anticuerpo biotinilado anti-Met se agregaron a los lisados celulares. Después de una incubación durante 1.5 a 2 horas, se agregaron perlas magnéticas de estreptavidina (Dynabeads, Bio Veris) y se incubaron durante 45 minutos. Las perlas con material unido (anticuerpo anti-Met/Met/anticuerpo anti-fosforotirosina) se capturaron mediante un imán aplicado externamente. Después de la etapa de lavado, se midió una señal quimioluminiscente generada por la fuente luminosa como unidades luminiscentes relativas en un instrumento Bio Veris. Para cada experimento, se expresó la fosforilación Met mediante HGFhepS1na y HGFHGFA como porcentaje de la máxima señal obtenida con una preparación de control de HGF. Resultados Procesamiento proteolitico de pro-HGF mediante hepsina Una forma soluble de hepsina que abarca el dominio extracelular completo (Arg45 - Leu417; sistema de numeración de acuerdo con Somoza et al., 2003 (5)) y se expresó una marca Hisß de terminal C en células CHO. Durante el proceso de purificación, el zimógeno de hepsina se convirtió espontáneamente en su forma bicatenaria (Figura ÍA) , más probablemente debido a una auto-activación (4). La secuencia de terminal N del dominio de proteasa de -30 kDa (163IVGGRDTSLGR173) confirmó la división en la unión péptido Argl62 - Ilel63 esperada proporcionando la enzima activa. La hepsina convirtió activamente el zimógeno FVII en FVIIa bicatenario (Figura IB), consistente con los experimentos reportados por Kazama et al., 1995 (9) utilizando hepsina expresada en la superficie celular para determinar la activación de FVII. La actividad de hepsina hacia pro-HGF se examinó midiendo la conversión de pro-HGF 125I marcado en HGF bicatenario. Los resultados mostraron que el pro-HGF se dividió mediante hepsina de una manera dependiente de la concentración (Figura 2A) . la actividad de hepsina fue comparable con la de HGFA (Figura 2B) , logrando ambas enzimas una conversión completa del pro-HGF a una concentración de 4-13 nM. En el mismo sistema de análisis, el factor Xla de activadores pro-HGF, el factor Xlla y la calicreína de plasma requieren concentraciones aproximadamente 5-6 veces mayores para una conversión completa de pro-HGF (45). La secuencia de terminal N de las cadenas ß de HGF de -36 kDa y -39 kDa dieron secuencias idénticas (495VVNGIPTRTNIG506) mostrando que la hepsina procesó en pro-HGF en la unión péptido Arg494 -Val495 esperada. A diferencia del factor Xla y la calicreína de plasma, la hepsina no produjo el fragmento de cadena a2 de HGF (mediante la división entre Arg424 -His425) (45), incluso después de prolongados períodos de reacción. Además, la hepsina (40 nM) careció completamente de la capacidad de activar el plasminógeno durante una reacción de 5 horas (Figura 2C) . En comparación, el t-PA procesó eficientemente el plasminógeno con aproximadamente el 50% del zimógeno ya dividido después de 0.5 horas (Figura 2C) . Actividad biológica de HGF generado por digestión de hepsina El pro-HGF no marcado (0.3 mg/ml) se convirtió completamente (>95%) en HGF con 30 nM de hepsina o con 40 nM de HGFA (Figura 3A) para dar HGFhepSÍna y HGFHGFA respectivamente. En un análisis de receptor cinasa (KIRA) con células A549 de carcinoma pulmonar, ambas preparaciones de HGF indujeron aumentos similares dependientes de la concentración en la fosforilación de Met, logrando una máxima actividad a 250 ng/ml (Figura 3B) . Como se mostró previamente (44), una forma monocatenaria no divisible de HGF (scHGF) con un sitio de desdoblamiento cambiado (R94E) no tuvo actividad (Figura 3B) . Los experimentos de control mostraron que la hepsina o el HGFA solos no tuvieron efectos (datos no mostrados). Además la HGFhepsina promovió eficientemente la proliferación de células BxPC3 de cáncer pancreático. La actividad fue comparable con la del HGFHGFA en el rango examinado de 5-199 ng/ml (Figura 4A) . se obtuvieron resultados similares en un análisis de migración celular con células MDA-MB435 utilizando un sistema de migración transpozo recubierto con colágeno. Como se encontró en los análisis de proliferación celular, los efectos pro-migratorios de HGFhepsina fueron dependientes de la concentración y no distinguibles de la actividad de HGFHGFA (Figura 4B) . Inhibición de la actividad enzimática de hepsina mediante SHAI-1B y sHAI-2 Una imagen inicial de 26 sustratos cromogénicos comercialmente disponibles mostró que S2366, un sustrato reportado por Somoza et al., 2003 (5), se hidrolizó mediante hepsina a la proporción más alta (datos no mostrados) . Utilizando S2366 como sustrato, se calcularon las actividades inhibidoras de formas solubles altamente purificadas de HAI-1B de tipo silvestre (sHAI-lB) y HAI-2 (sHAI-2) . Además, produjimos los dos mutante sHAI-lB, sHAI-lB (R260A) y sHAI-lB (K401A) en los cuales los dominios Kunitz individuales se desactivaron reemplazando los residuos Pl (Arg260 en KD1 y Lys401 en KD2) con alanina (34). Los resultados mostraron que tanto sHAI-lB como sHAI-2 inhiben potentemente la actividad enzimática de hepsina con valores IC50 de 21.1 ± 2.7 nM y 1.3 ± 0.3 nM, respectivamente (Figura 5). Además, el sHAI-lB (K401A) mutante conteniendo un KD2 no funcional fue igualmente potente como sHAI-lB de tipo silvestre, mientras que sHAI-lB (R260A) tuvo una reducción de actividad de > 47 veces (Figura 5) . Los valores IC50 obtenidos se resumen en la Tabla 1. Tabla 1. Inhibición de hepsina mediante inhibidores de dominio Kunitz Inhibidores IC50 (nM) SHAI-1B wt 21.1 ± 2.7 SHAI-1B (K401A) 18.2 ± 3.7 SHAI-1B (R260A) >1000 SHAI-2 1.3 ± 0.3 Inhibición de la activación de pro-HGF mediada por hepsina Se calculó la capacidad de sHAI-lB y sHAI-2 para interferir con el procesamiento del sustrato macromolecular en un análisis de activación de 125I-HGF. Los resultados obtenidos concordaron totalmente con sus actividades inhibidoras determinadas en análisis amidolíticos . En concentraciones de 1 µM, sHAI-2, sHAI-lB de tipo silvestre y sHAI-lB (K401A) , hubo una completa inhibición de la división de pro-HGF (Figura 6) . En contraste, 1 µM de sHAI-lB (R260A) no mostró inhibición y la activación de pro-HGF procedió a completar la conversión. Discusión La trayectoria de señalización de HGF/Met juega un importante papel en la fisiología y patología humana incluyendo invasión y metástasis de tumor. La disponibilidad local de HGF activo se controla mediante serina proteasas similares a quimiotripsina y sus inhibidores cognado, que regulan el procesamiento de pro-HGF no activo en el ambiente extracelular. En consecuencia, las perturbaciones de esta trayectoria de convertasa pro-HGF ?en corriente ascendente' en el cáncer pueden promover el crecimiento del tumor acelerando el procesamiento de pro-HGF. Aquí, se demuestra que la hepsina, una serina proteasa altamente sobre regulada en cáncer de próstata y de ovario, es un potente activador de pro-HGF. En consecuencia, la hepsina probablemente juega un importante papel en efectuar el crecimiento del tumor activando la trayectoria de señalización de HGF/Met, que se encuentra implicada en cáncer de próstata (46, 48) así como ovárico (49, 50) . La hepsina dividió proteolíticamente pro-HGF en la unión péptido Arg494 - Val495 sin ninguna división adicional en el dominio Kringle 4 Arg424 - His425, un sitio reconocido por el factor Xla y calicreína de plasma (45). El HGF bicatenario generado por la hepsina fue completamente funcional, induciendo la fosforilación del receptor Met y promoviendo la proliferación y migración celular con actividades comparables con el HGF generado por HGFA. El mecanismo molecular subyacente a la conversión mediada por enzimas de pro-HGF inactivo en un factor de crecimiento activo, tiene similitud con la conversión del zimógeno proteolítico a enzima de serina proteasas similares a quimiotripsina. Esto es soportado por estudios recientes en las consecuencias estructurales de la activación pro-HGF, demostrando que la división en Arg494 - Val495 conduce a cambios conformacionales en la cadena beta de HGF similar a proteasa y en la maduración total de un sitio de unión del receptor Met (44, 51) . Este sitio de unión Met, que se centra en la "región del sitio activo" y el "dominio de activación" de HGF, tiene una marcada semejanza con la región de procesamiento de sustrato de serina proteasas (44, 51). En consecuencia, la división de pro-HGF mediante hepsina efectúa reordenamientos estructurales en HGF beta que permiten la formación de complejos de señalización de HGF/Met productivos. La actividad proteolítica de hepsina hacia proHGF parece altamente específica, dado que no dividió el plasminógeno, el homólogo estructural más cercano de pro-HGF. La hepsina no tuvo actividad proteolítica hacia otros sustratos de serina proteasa, tales como protrombina, proteína C, factor X y factor IX (9). Estudios con ratones nulos en HGF muestran que la trayectoria de HGF/Met es esencial para el desarrollo y supervivencia embriónica normal (52, 53). En contraste, los ratones deficientes en el gen de hepsina se desarrollaron normalmente, indicando que no es probable que la hepsina sea el activador de HGF principal durante la embriogénesis . Similar a la hepsina, las deficiencias de las otras convertasas de pro-HGF conocidas matriptasa (54, factor XI (55), precalicreína (56) y u-PA (57) no son letales embriónicos. Debido a su importancia en la embriogénesis y la fisiología post-natal, la actividad HGF puede regularse de manera concertada mediante múltiples sistemas de convertasa de pro-HGF. Si es así, las deficiencias combinadas del gen de convertasa de pro-HGF deben dar como resultado defectos en el desarrollo similares a los de ratones nulos en HGF. Alternativamente, la convertasa de pro-HGF que regula el procesamiento de HGF durante la embriogénesis puede no haberse identificado aún. HAI-1B, HAI-1 y HAI-2 son inhibidores epiteliales de superficie celular y se expresan en muchos tejidos normales y en tumores (34, 58-63). Por tanto, se encuentran idealmente ubicados para regular la actividad enzimática de TTSPs expresados en célula epitelial y posiblemente otras serina proteasas asociadas a la superficie celular. Realmente, las variantes de unión HAI-1, HAI-1 y HAI-1B inhiben potentemente la matriptasa TTSP (MT-SP1) y los complejos de HAI-1 con matriptasa se han encontrado en leche de mama humana (38). Aquí, se demuestra que tanto sHAI-lB como sHAI-2 son también potentes inhibidores de la actividad enzimática de hepsina. Además, los experimentos de mutagénesis dirigidos al residuo Pl demostraron que la inhibición de hepsina se encuentra mediada completamente por KDl de sHAI-lB, dado que el sHAI-lB (R260A) fue inactivo en análisis de pro-HGF y tuvo <1% de actividad del mutante KD2 y de tipo silvestre en análisis amidolíticos . En consecuencia, hepsina, matriptasa y HGFA no solo tienen actividades comparables de conversión de pro-HGF (34) sino que también se inhiben mediante sHAI-lB con potencias iguales (16 - 30 nM) de una manera específica de KDl (34, 64). Las variantes de unión HAI-1 y HAI-1B solo difieren por la ausencia o presencia de 16 aminoácidos ubicados en la terminal C de KDl. Su patrón de expresión en tejidos, incluyendo tumores de próstata y de ovario, se idéntica y hasta ahora no se han encontrado diferencias significativas en la potencia y el patrón de proteasa objetivo. En consecuencia, se considera que las funciones in vivo de las dos variantes de unión son equivalentes. El papel de los dominios Kunitz de HAI-2 no se dirigió específicamente en nuestro estudio. Para la mayoría de sus enzimas objetivo, HAI-2 utiliza los dominios Kunitz tanto de terminal N como C (41, 65) . La asociación funcional de hepsina con HAI-1B u HAI-2 in vitro conjuntamente con su ubicación en superficies celulares epiteliales sugiere que pueden constituir un sistema inhibidor de enzimas fisiológicamente relevante. Por ejemplo, las dos variantes de unión HAI-1 y HAI-2 se expresan en líneas celulares normales de próstata y de cáncer de próstata (34, 59, 61) y el antígeno HAI-1 se localizó en la capa celular secretoria del epitelio glandular de próstata (59). De manera intrigante, la expresión de hepsina en tumores de próstata se localizó en el mismo compartimento epitelial (19, 20), soportando la idea de que HAI-1 y posiblemente HAI-2 se asocian con hepsina in vivo. Aunque la expresión de hepsina se encuentra fuertemente sobre regulada en cáncer de próstata (17-22), HAI-1 y HAI-2 se incrementan solo ligeramente (aproximadamente 1.5 veces) de acuerdo con los resultados de la expresión de gen reportados por Welsh et al., 2001 (17). Como consecuencia, la actividad enzimática de hepsina en tumores puede encontrarse inadecuadamente controlada y podría conducir a un aumento en el procesamiento de pro-HGF y en el progreso del tumor. Desigualdades similares de los sistemas de convertasa pro-HGF/inhibidor se han descrito para matriptasa/HAI-1 en cáncer ovárico (62, 63), HGFA/HAI-1 en cáncer colorrectal (66, 67) y HGFA/HAI-1 en carcinoma de célula renal (68). La sobre regulada expresión de hepsina en algunos de estos cánceres sugiere que ciertos sistemas de convertasa/inhibidor comprenden múltiples enzimas y en consecuencia proporciones aumentadas de enzima/inhibidor podrían magnificar las consecuencias para el mal . En conclusión, los resultados presentados muestran que la hepsina activa eficientemente pro-HGF, revelando así un vínculo funcional entre hepsina en la superficie epitelial del tumor y la matriz extracelular que contiene el precursor del factor de crecimiento inactivo. El descubrimiento de que HAI-1B y HAI-2 son potentes inhibidores de hepsina, que se encuentra sobre regulada en cáncer de próstata y ovario, proporciona nuevos procedimientos para el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, los dominios Kunitz funcionales de HAI-1B o HAI-2 podrían servir como estructuras para generar inhibidores de enzimas más específicos y/o más potentes mediante el uso de tecnología de visualización fago, que se ha aplicado con éxito a otras estructuras de dominio Kunitz (69,70) . Notas/Abreviaturas """Factor Vlla, FVIIa; amortiguador Hepes, 20 mM Hepes pH 7.5, 150 mM de NaCl; amortiguador Tris, 30 mM de Tris-HCl, pH 8.4, 30 mM de imidazolo, 200 mM de NaCl; pro-HGF, factor de crecimiento de hepatocitos monocatenario, HGF, factor de crecimiento de hepatocitos bicatenario; HGFA activador del factor de crecimiento de hepatocitos; HAI-1, inhibidor-1 del activador del factor de crecimiento de hepatocitos; HAI-1B, una variante de unión del inhibidor-1 del activador del factor de crecimiento de hepatocitos; HAI-2 inhibidor-2 del activador del factor de crecimiento de hepatocitos; KDl y KD2, dominio Kunitz de terminal N y C de HAI-1B; sHAI-lB, forma soluble de HAI-1B que abarca el dominio extracelular; sHAI-2 forma soluble de HAI-2 que abarca el dominio extracelular; HGFhepsina/ HGF producido por la activación de pro-HGF con hepsina; HGFHGFA? HGF producido por la activación de pro-HGF con HGFA; scHGF, HGF monocatenario no divisible con un sitio de desdoblamiento mutado (Arg494Glu) ; u-PA, activador de plasminógeno tipo urocinasa; t-PA, activador de plasminógeno de tipo tejido, Ni-NTA, ácido níquel-nitrilotriacético .

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Claims (7)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para identificar una sustancia inhibidora candidato que inhibe la activación de hepsina de HGF, comprendiendo dicho método: (a) poner en contacto una sustancia candidato con una primera muestra que comprende hepsina y un sustrato pro-HGF, y (b) comparar la cantidad de activación del sustrato pro-HGF en la muestra con la cantidad de activación del sustrato pro-HGF en una muestra de referencia que comprende cantidades similares de hepsina y sustrato pro-HGF como la primera muestra, pero que no se ha puesto en contacto con dicha sustancia candidato, mediante lo cual la disminución en la cantidad de activación del sustrato pro-HGF en la primera muestra comparada con la muestra de referencia, indica que la sustancia candidato es capaz de inhibir la activación de hepsina de HGF monocatenario (proHGF) .
2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde la hepsina en la muestra se encuentra en una cantidad efectiva para activar dicho pro-HGF.
3. 3. El método de la reivindicación 1, en donde el sustrato pro-HGF es un polipéptido que comprende HGF o su fragmento del mismo que comprende una forma tipo silvestre de la unión péptido R494-V495.
4. 4. El método de la reivindicación 1, en donde el sustrato pro-HGF comprende un sitio de desdoblamiento de HGF humano que se ajusta al sitio de desdoblamiento de consenso de proteasas, en donde el sitio de desdoblamiento comprende un residuo básico en la posición Px y dos residuos hidrófobos de aminoácidos en las posiciones Pi' y P2' .
5. 5. Una molécula antagonista que inhibe la interacción de hepsina y el factor de crecimiento de hepatocitos .
6. 6. La molécula antagonista de la reivindicación 5, en donde la molécula comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo.
7. 7. La molécula antagonista de la reivindicación 5, en donde la molécula comprende un polipéptido que comprende una secuencia de dominio 1 Kunitz.