CN101023182B - 调节肝细胞生长因子活化的方法和组合物 - Google Patents

调节肝细胞生长因子活化的方法和组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN101023182B
CN101023182B CN2005800316874A CN200580031687A CN101023182B CN 101023182 B CN101023182 B CN 101023182B CN 2005800316874 A CN2005800316874 A CN 2005800316874A CN 200580031687 A CN200580031687 A CN 200580031687A CN 101023182 B CN101023182 B CN 101023182B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
cell
hgf
polypeptide
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2005800316874A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101023182A (zh
Inventor
丹尼尔·K·柯克霍弗
保罗·M·莫兰
马克·D·皮克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genentech Inc
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of CN101023182A publication Critical patent/CN101023182A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101023182B publication Critical patent/CN101023182B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Abstract

本发明提供调节肝丝酶活性和HGF/c-met信号路径的方法和组合物，特别是通过调节肝丝酶活化前HGF进行调节的方法和组合物。

Description

调节肝细胞生长因子活化的方法和组合物
相关申请
该申请是在37CFR 1.53(b)(1)规定下提交的非临时申请，依照35USC119(e)的规定要求2004年7月26日提交的，内容在此合并引入作为参考的申请号为60/591,339的临时申请的优先权。 
技术领域
一般说来，本发明涉及分子生物学和生长因子调节领域。更具体地说，本发明涉及HGF/c-met信号路径的调节剂和所述调节剂的用途。 
背景 
肝丝酶(hepsin)(也称为TMRPRSS1)是细胞表面表达的凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，是II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)家族的成员，其中II型跨膜丝氨酸蛋白酶也包括基质蛋白酶(也称为MT-SP1)和肠肽酶(1)。位于19号染色体上的q11-13.2区的人肝丝酶基因(2)编码包含短的N-末端胞质尾、跨膜区和胞外域(Arg45-Leu417)的417个氨基酸的多肽(3)，其中胞外域由清除受体半胱氨酸富集区(SRCR)和蛋白酶域组成。肝丝酶酶原通过Arg162-Ile163处的切割被自动催化活化(4)，形成具有二硫化物连接(Cys153-Cys277)到SRCR域的蛋白酶域的异二聚体酶。除共价的Cys-Cys键之外，最近确定的肝丝酶的晶体结构显示SRCR和蛋白酶域共用广泛的分界面区，每个域埋藏大约 
Figure G05831687420070322D000011
(5)。因为这一分界面区靠近SRCR域的近膜侧的残基，因此肝丝酶蛋白酶域和活性部位可能位于接近细胞表面的位置(5)。这基本上不同于其它细胞表面装配的丝氨酸蛋白酶类，例如，活性部位位于膜表面上方更远地方 
Figure G05831687420070322D000012
的凝血因子VIIa(FVIIa)1、IXa和Xa。 
肝丝酶的生理机能仍然是难以捉摸的。除凝血因子VII外，没有高分子底物是已知的，而且也没有鉴定出生理学上相关的抑制剂。Kazama et al.(1995)(9)表明肝丝酶转染细胞可以活化凝血因子VII，这暗示了肝丝酶在 血液凝固中的作用。但是，缺乏肝丝酶的小鼠能存活，而且没有显示出血液凝固紊乱(10，11)，这令人怀疑肝丝酶在正常止血中的重要性。但是，肝丝酶在病理情况下，例如肾细胞癌(12)中有助于纤维蛋白形成是可能的，其中肾细胞癌中缺乏血液凝固的主要起始因子—组织因子(13，14)。而且，其它研究也暗示肝丝酶和细胞生长之间存在功能连接。已经报告肝丝酶具有促进生长(15)或抑制生长的活性(16)，具体效果取决于使用的肿瘤细胞系和实验条件。有关肝丝酶的其它信息也可参见如下文献：PCT申请WO2004/009803；美国专利No.6,482,630；美国专利No.6,423,543；美国专利No.5,981,830；美国专利申请2004/0009911A1；美国专利申请20040001801A1；美国专利申请2003/0223973A1；美国专利申请2003/0175736A1；美国专利申请2003/0013097A1(也可以是WO02/059373)；美国专利申请2003/0049645A1(也可以是WO02/064839)和美国专利申请2004/0132156。 
最近的基因表达实验鉴定出肝丝酶是***癌中最高度上调基因中的一个(17-22)。原位染色显示肝丝酶在***分泌腺的上皮细胞上表达(19)。肝丝酶的表达与瘤性转化相关(19)，即在患有重病的病人的肿瘤中表达最高，在良性增生中表达最低(18，22)。与此相反，一项研究发现肝丝酶蛋白质的低表达与高Gleason得分和大肿瘤相关(20)。这一明显的矛盾是否与使用的方法，即免疫组织化学(20)对RNA定量(18，22)有关还不清楚。而且，在主要与上皮细胞类型(12)有关的卵巢癌(23)和肾细胞癌中，肝丝酶也明显上调。 
位于上皮细胞表面上的肝丝酶理论上会与细胞外基质成分及其它膜结合蛋白相互作用。已经已知包括结构上与肝丝酶相关的TTSP基质蛋白酶(同义词MT-SP1)(24，25)的凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶能活化纤维蛋白溶酶、基质金属蛋白酶，以及生长因子的潜在形式(latent form)，例如肝细胞生长因子(HGF)。HGF通过活化受体酪氨酸激酶Met(在(26，27)中进行了综述)促进细胞增殖、迁移、血管发生、存活和形态发生。除了在正常生理学中的重要性之外，HGF/Met路径已经牵涉侵入性肿瘤生长和肿瘤转移(26)。HGF与丝氨酸蛋白酶纤溶酶原具有高度的相似性，由包含N域和四个Kringle域的α链，以及与凝乳蛋白酶样蛋白酶具有同源性的β链组成。HGF是以非活性单链前体(前HGF)形式被分泌到细胞外基质中的， 因此需要在Arg494-Val495进行切割活化以形成有生物活性的二硫化物连接的α/β异源二聚体(28-31)。这一步骤是由前HGF(pro-HGF)转化丝氨酸蛋白酶，例如肝细胞生长因子活化剂(HGFA)(32)、基质蛋白酶(33，34)、尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化因子(u-PA)(35)、因子XIIa(36)、因子XIa和血浆激肽释放酶(34)介导的。HGFA和基质蛋白酶被细胞表面表达的库尼茨(kunitz)型抑制剂，例如这两个肝细胞生长因子活化剂抑制剂剪接变体HAI-1(37，38)和HAI-1B(34)，以及HAI-2(39)抑制。HAI-2(又称为胎盘双库尼抑制剂)(40)也能有效地抑制因子XIa和血浆激肽释放酶(41)，而HAI-1B几乎没有抑制活性(34)。因此，细胞外基质中的前HGF库的生物可利用性受前HGF转化酶和它们的抑制剂的活性调节。 
肝丝酶在如上所述的癌组织中的表达谱，连同它在作为其它生长因子的调节剂中的潜在作用暗示调节肝丝酶与它的底物的相互作用可以被证明是有效的治疗方法，其中所述其它生长因子的失调可能成为致癌作用的基础。在这点上明确需要鉴定肝丝酶的生理学底物和/或它的生理学调节剂。本发明满足了这一需要，而且提供了其它益处。 
所有在这里引用的参考文献，包括专利申请和出版物，都被全部引入作为参考。 
发明公开的内容 
如同这里描述的那样，肝丝酶的生理学底物是本身在癌症发展的许多方面起重要作用的肝细胞生长因子，肝丝酶是在多种癌症中明显过表达的细胞表面蛋白质。在这里显示肝丝酶以可与有效的生理学前HGF转化酶HGFA(肝细胞生长因子活化剂)相比较的活性切割前HGF。肝丝酶产生的双链HGF(活化的)显示出正常的生物学活性，包括诱导Met酪氨酸磷酸化、刺激细胞增殖和刺激细胞迁移。另外，在这里已经鉴定，两个库尼茨域抑制剂HAI-1B和HAI-2可以作为肝丝酶酶活性的生理学调节剂。本发明提供了至少部分基于这些发现的方法和组合物，下文将对它们进行更详细的描述。已经表明肝丝酶和它与HGF和/或HGF的生理学抑制剂的相互作用可能是设计对抗与HGF/Met(也称为″c-met″)路径的信号发送异常或不需要的信号发送有关的病理学条件的预防和/或治疗方法时进行更精细调节的独特有利的目标靶。因此，本发明提供鉴定和使用能够通过调节与HGF活化调节有关的生理学相互作用分子来调节HGF/c-met路径的物质的方法、组合物、试剂盒和制品。 
因此，一方面，本发明提供了筛选(或鉴定)抑制HGF的肝丝酶活化的候选抑制剂(即拮抗剂)物质的方法，所述方法包括：(a)让候选物质接触包含肝丝酶和前HGF底物的第一样品，和(b)将样品中前HGF底物活化的量与参考样品中前HGF底物活化的量进行比较，参考样品包含与第一样品相似的肝丝酶和前HGF底物量，但它不与所述的候选物质接触，与参考样品相比第一样品中前HGF底物活化的量下降表明候选物质能够抑制肝丝酶活化单链HGF(前HGF)。在一个实施方案中，样品中的肝丝酶是活化所述前HGF的有效量的肝丝酶。适合在这些方法中使用的前HGF底物可以以多种形式存在，只要它能模仿肝丝酶切割前HGF的位点特征就可以。前HGF底物的实例包括，但不局限于包含R494-V495肽键的野生型形式的全长单链HGF和包含该肽键的HGF任何片段。这种片段可以是任何长度，例如长度可以是至少(大约)5、7、10、15、20、25个氨基酸，或者长度可以在(大约)4和25、5和20、7和15个氨基酸者之间。通常优选包含能够被野生型肝丝酶切割的R494-V495肽键的前HGF底物。在一个实施方案中，前HGF底物包含与蛋白酶共有切割位点相适应的人HGF切割位点(即位置P1的碱性残基，位置P1′，P2′上的两个疏水氨基酸残基-P1R494，P1′V495，P2′V496)。 
另一方面，本发明提供了筛选阻断前HGF被肝丝酶活化的物质的方法，所述方法包括筛选结合(优选，但不是必须，特异性地结合)肝丝酶或前HGF，并阻断肝丝酶和前HGF之间特异性相互作用(例如结合)的物质。在一些实施方案中，该物质与肝丝酶竞争性地结合HGF。在一些实施方案中，该物质与前HGF竞争性地结合肝丝酶。在一个实施例中，所述物质包含与前HGF(例如人)具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、99％序列相似性或同一性的氨基酸序列，或者由与前HGF(例如人)具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、99％序列相似性或同一性的氨基酸序列组成，或者基本上由具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、99％序列相似性或同一性的氨基酸序列组成，例如包含连接到495(Val)上的氨基酸残基494(Arg)肽的人HGF片段。在一些实施例中，所述物质包含这样的氨基酸序列、或由这样的氨基酸序列组成，或者基本上由这样的氨基酸序列组成，该片段被突变或者该片段缺乏HGFβ链的至少一部分，这样就使所述片段与野生型HGF相比，具有降低的c-met活化活性。 
与如上所述的那些筛选一致的筛选测定还可以包含筛选第一步骤以及随后的筛选第二步骤，所述第一步骤基于对肝丝酶-HGF复合物形成的测定(readout)以获得第一组候选调节物质，所述第二步骤基于第一组候选调节物质调节HGF活化和/或将HGF转化为能活化HGF/c-met路径的形式的能力，这对本领域熟练技术人员来说是很显然的。合适的测定可以是本领域熟练技术人员显而易见的，以对酶底物复合物形成和/或与HGF/c-met信号路径有关的生物学活性的认识为基础的任何测定方法。可以利用，例如常规生物化学测定(例如凝胶电泳、层析、NMR等等)测量酶底物复合物的形成。HGF/c-met生物学活性包括，但不局限于C-met磷酸化、作为C-met激酶底物的细胞分子的磷酸化、细胞生长(增殖、存活等等)、血管发生、细胞迁移、细胞形态发生等等。 
一方面，本发明提供破坏HGF/c-met信号路径的HGF/c-met拮抗剂。例如：本发明提供抑制肝丝酶切割前HGF(例如，在R494-V495位置切割)的分子。该分子可以以许多途径发挥抑制功能，包括但不限于结合肝丝酶或前HGF使肝丝酶切割前HGF被抑制、结合肝丝酶-前HGF复合物使前HGF的切割被抑制和/或结合前HGF或肝丝酶(单独地或在复合物中)使肝丝酶切割HGF的效应被抑制(例如，抑制肝丝酶切割后HGF的释放)。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂分子不抑制HGF结合c-met。例如，在一个实施例中，本发明的拮抗剂分子是与保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)、保藏号为ATCC HB-11894(杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895(杂交瘤5D5.11.6)的杂交瘤细胞系产生的抗体具有类似的抑制和/或结合能力的抗体或其片段。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂分子抑制与HGF/c-met活化有关的生物学活性。 
在本发明的一个方面，本发明的拮抗剂分子源自这里描述的肝细胞生长因子活化抑制剂(HAI-1、HAI-1B、HAI-2)是肝丝酶活化前HGF的有效抑制剂的发现。在一个实施方案中，本发明提供了肝丝酶活化前HGF的拮抗剂，所述拮抗剂包含人HAI-1、HAI-1B或HAI-2的至少一部分(包括全部)。在一个实施例中，所述部分包含能够抑制肝丝酶活化前HGF的库尼茨域(Kunitz Domain，KD)序列。在一个实施方案中，所述库尼茨域序列 是HAI-1或HAI-1B的库尼茨域1(KD1)。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂包含与人HAI-1的野生型KD1具有至少大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的变体KD1序列，其中所述变体序列在抑制肝丝酶切割人前HGF方面具有至少可与野生型KD1相比的能力。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂包含与人HAI-1的野生型KD1具有大约70％和99％之间、大约75％和98％之间、大约80％和97％之间、85％和95％之间的序列同一性的变体KD1序列，其中所述变体序列在抑制肝丝酶切割人前HGF方面具有至少可与野生型KD1相比的能力。在一个实施方案中，所述库尼茨域序列是HAI-2的一个或两个库尼茨域。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂包含与野生型人HAI-2的对应库尼茨域具有至少大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的变体HAI-2库尼茨域序列，其中所述变体序列在抑制肝丝酶切割人前HGF方面具有至少可与野生型HAI-2相比的能力。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂包含与野生型人HAI-2的对应的库尼茨域具有大约70％和99％之间、大约75％和98％之间、大约80％和97％之间、85％和95％之间的序列同一性的变体HAI-2库尼茨域序列，其中所述变体序列在抑制肝丝酶切割人前HGF方面具有可与野生型HAI-2相比的能力。 
在一些实施方案中，本发明的拮抗剂是或包含小分子、肽、抗体、抗体片段、适体(aptamer)或其组合。利用本领域已知的技术(包括那些在下文中更详细描述的技术)，基于本文描述的肝丝酶、肝细胞生长因子活化抑制剂和前HGF之间相互作用的发现，可以常规获得这里描述的拮抗剂。例如，在一些实施方案中，本发明的拮抗剂与肝丝酶竞争结合HGF，但它不具有在肝丝酶切割位点切割前HGF的能力。在一些实施方案中，本发明的拮抗剂与前HGF竞争性结合肝丝酶。例如，在一个实施方案中，所述拮抗剂包含与前HGF(例如人的前HGF)具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％序列相似性或同一性的氨基酸序列，或者由与前HGF(例如人的前HGF)具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％序列相似性或同一性的氨基酸序列组成，或者基本上由具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％序列相似性或同一性的氨基酸序列组成，而且它基本上能够结合肝丝酶，但它缺乏肝丝酶切割位点(例如，包含野生型人HGF R494-V495肽连接的P1位点)和/或缺乏活化c-met的能力(例 如，其中HGF β链发生了突变，缺乏HGF β链或其部分等等)。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂包含能够结合肝丝酶的HGF片段、或由能够结合肝丝酶的HGF片段组成，或者基本上由能够结合肝丝酶的HGF片段组成，其中所述片段缺乏HGF β链的至少一部分，这样使所述片段与野生型HGF相比，具有降低的c-met活化活性。 
因此，本发明提供基本上能结合肝丝酶，但与野生型HGF相比具有降低的HGF/c-met调节活性的HGF突变体，例如HGF/c-met活性的拮抗剂，或者显示出降低的HGF生物活性，但不是没有HGF生物活性(例如，细胞生长刺活化性)的HGF变体。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂能够抑制野生型HGF的生物活性(体内)(这种生物活性包括，但不局限于刺激细胞增殖、增强细胞存活、促进血管发生、诱导/促进细胞迁移)。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂提供了降低的细胞生长促进活性(包括但不限于减低的细胞增殖促进活性、降低的细胞存活促进活性、降低的血管发生促进活性、降低的细胞迁移促进活性)。 
在一些实施方案中，通过这里描述的本发明的筛选或鉴定方法来获得本发明的拮抗剂。 
一方面，本发明拮抗剂分子与毒素，例如细胞毒剂连接。可以与添加剂/增强剂，例如放疗剂和/或化疗剂一起来配制或联合施用这些分子/物质。 
一方面，本发明提供了能够增强肝丝酶切割前HGF的分子，其中所述分子能够干扰HAI-1、HAI-1B和/或HAI-2与肝丝酶的相互作用。在一些实施方案中，本发明的增强分子是或包含小分子、肽、抗体、抗体片段、适体或其组合。例如，本发明的增强分子可以包含HAI-1、HAI-1B和/或HAI-2的片段或其变体，或由HAI-1、HAI-1B和/或HAI-2的片段或其变体组成，或基本上由HAI-1、HAI-1B和/或HAI-2的片段或其变体组成，其中所述片段能够结合肝丝酶，但基本上不抑制肝丝酶切割前HGF。在一个实施方案中，所述分子能够竞争性地抑制野生型HAI-1、HAI-1B和/或HAI-2结合肝丝酶。在一个体实施方案中，本发明的增强分子是干扰包含肝丝酶和HAI-1、HAI-1B和/或HAI-2的复合物形成的抗体。在一个体实施方案中，本发明的增强分子是肝丝酶或其变体(包括下文限定的那些变体中的任何一种)，其中所述肝丝酶或其变体能够影响前HGF在R494-V495位点的切割。 
本发明也提供对调节与HGF/c-met信号轴失调有关的疾病状态有用的 方法和组合物。因此，一方面，本发明提供了在受试者中调节c-met活化的方法，所述方法包括给受试者施用本发明的HGF/c-met调节分子(例如，这里描述的抑制肝丝酶切割前HGF的拮抗剂分子)，借此调节c-met活化。在一个实施方案中，所述分子是抑制HGF/c-met活性的HGF/c-met拮抗剂。在一个实施方案中，所述分子是增加HGF/c-met活性的增强分子。一方面，本发明提供了治疗受试者中与c-met活化有关的病理状态的方法，所述方法包括给受试者施用本发明的c-met拮抗剂(例如，这里描述的肝丝酶切割前HGF的任何拮抗剂)，借此抑制c-met活化。 
HGF/c-met信号路径与多种生物学和生理功能有关，包括，例如刺激细胞生长(例如，细胞增殖、细胞存活、细胞迁移、细胞形态发生)和血管发生。因此，另一方面，本发明提供了抑制c-met活化的细胞生长(例如，增殖和/或存活)的方法，所述方法包括使细胞或组织接触本发明的拮抗剂，借此抑制与c-met活化有关的细胞增殖。在另一方面，本发明提供了抑制血管发生的方法，所述方法包括给具有与异常血管发生有关的状态的细胞、组织和/或受试者施用本发明的拮抗剂，借此抑制血管发生。在另一方面，本发明提供了增强血管发生的方法，所述方法包括给具有将从增加的血管发生中受益的状态和/或与最适量以下的血管发生有关的状态的细胞、组织和/或受试者施用本发明的增强分子，借此增强血管发生。 
一方面，本发明提供了本发明的拮抗剂在制备治疗和/或预防疾病，例如，癌症、肿瘤、细胞增生性紊乱、免疫(例如，自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱的药物中的用途。所述拮抗剂可以是这里描述的任何形式，包括抗体、抗体片段、小分子(例如，有机分子)、多肽(例如，寡肽)、核酸(例如，寡核苷酸，例如反义寡核苷酸或干扰RNA)、适体或其组合。 
一方面，本发明提供本发明的增强分子在制备治疗和/或预防疾病，例如，伤口愈合(例如，与糖尿病有关的创伤，外伤等等)的药物中的用途。增强分子可以是这里描述的任何形式，包括抗体、抗体片段、小分子(例如，有机分子)、多肽(例如，寡肽)、核酸(例如，寡核苷酸，例如反义寡核苷酸或干扰RNA)、适体或其组合。 
一方面，本发明提供了本发明的核酸在制备治疗和/或预防疾病，例如癌症、肿瘤、细胞增生性紊乱、免疫(例如，自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱(例如，伤口愈合)的药物中的用途。 
一方面，本发明提供了本发明的表达载体在制备治疗和/或预防疾病，例如癌症、肿瘤、细胞增生性紊乱、免疫(例如，自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱(例如伤口愈合)的药物中的用途。 
一方面，本发明提供了本发明的宿主细胞在制备治疗和/或预防疾病，例如癌症、肿瘤、细胞增生性紊乱、免疫(例如，自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱(例如，伤口愈合)的药物中的用途。 
一方面，本发明提供了本发明的制品在制备治疗和/或预防疾病，例如癌症、肿瘤、细胞增生性紊乱、免疫(例如，自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱(例如，伤口愈合)的药物中的用途。 
一方面，本发明提供了本发明的试剂盒在制备治疗和/或预防疾病，例如癌症、肿瘤、细胞增生性紊乱、免疫(例如，自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱(例如，伤口愈合)的药物中的用途。 
一方面，本发明提供了抑制c-met活化的细胞增殖的方法，所述方法包括使细胞或组织接触有效量的本发明的拮抗剂，借此抑制与c-met活化有关的细胞增殖。 
一方面，本发明提供了治疗与受试者c-met活化失调有关的病理状态的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的本发明的拮抗剂，借此治疗所述状态。 
一方面，本发明提供了抑制表达c-met或肝细胞生长因子，或表达c-met和肝细胞生长因子两者的细胞生长的方法，所述方法包括使所述细胞接触本发明的拮抗剂，从而使所述细胞的生长被抑制。在一个实施方案中，使所述细胞接触不同细胞表达的HGF(例如，通过旁泌性效应)。 
一方面，本发明提供了治疗患有癌性肿瘤的哺乳动物的治疗方法，其中癌性肿瘤包含表达c-met或肝哺乳动物生长因子，或表达c-met和肝哺乳动物生长因子两者的细胞，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效量的本发明的拮抗剂，从而有效治疗所述哺乳动物。在一个实施方案中，使所述细胞接触不同细胞表达的HGF(例如，通过旁泌性效应)。 
一方面，本发明提供了治疗或防止与肝丝酶、c-met和/或肝细胞生长因子表达增加或活性增加有关的细胞增生性紊乱的方法，所述方法包括给需要这种治疗的受试者施用有效量的本发明的拮抗剂，从而有效治疗或防止所述的细胞增生性紊乱。在一个实施方案中，使所述细胞接触不同细胞表 达的HGF(例如，通过旁泌性效应)。在一个实施方案中，所述增生性紊乱是癌症。 
一方面，本发明提供了抑制细胞生长的方法，其中所述细胞的生长至少部分依赖于肝丝酶、c-met和/或肝细胞生长因子的生长加强效应，所述方法包括使所述细胞接触有效量的本发明的拮抗剂从而抑制所述细胞的生长。在一个实施方案中，使所述细胞接触不同细胞表达的HGF(例如，通过旁泌性效应)。 
一方面，本发明提供了治疗哺乳动物体内肿瘤的方法，其中所述肿瘤的生长至少部分依赖于肝丝酶、c-met和/或肝细胞生长因子的生长加强效应，所述方法包括使所述细胞接触有效量的本发明的拮抗剂从而有效治疗所述肿瘤。在一个实施方案中，使所述细胞接触不同细胞表达的HGF(例如，通过旁泌性效应)。 
本发明的方法可用于影响任何合适的病理状态，例如与肝丝酶和/或HGF/c-met信号路径失调有关的细胞和/或组织。在一个实施方案中，本发明的方法靶向的细胞是癌细胞。例如：所述癌细胞可以选自：乳腺癌细胞、结肠直肠癌细胞、肺癌细胞、***状癌细胞(例如甲状腺的)、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、***细胞、中枢神经***癌细胞、***癌细胞、成骨肉瘤细胞(osteogenic sarcoma cell)、肾癌细胞、肝细胞癌细胞、膀胱癌细胞、胃癌细胞、头和颈鳞状细胞癌细胞、黑素瘤细胞和白血病细胞。在一个实施方案中，本发明的方法靶向的细胞是过度增生(hyperproliferative)和/或增生性(hyperplastic)细胞。在一个实施方案中，本发明的方法靶向的细胞是发育异常的细胞(dysplastic cell)。在另一个实施方案中，本发明的方法靶向的细胞是转移性细胞。 
本发明的方法可以更进一步地包含附加的治疗步骤。例如，在一个实施方案中，方法更进一步地包括其中靶细胞和/或组织(例如癌细胞)暴露于放疗或化疗剂的步骤。 
c-met活化是一个重要的生物过程，其失调会导致许多病理状态发生，这里已经描述这一点。因此，在本发明方法的一个实例中，靶向的细胞(例如癌细胞)是与相同组织来源的正常细胞相比，c-met活化增强的细胞。在一个实施方案中，本发明的方法导致靶细胞死亡。例如：接触本发明的拮抗剂可以导致细胞不能通过c-met路径传送信号，而这会导致细胞死亡。 
c-met活化(和因此传送信号)的失调可以由许多细胞变化引起，包括，例如，HGF(c-met的相关配体)和/或c-met自身的过表达。因此，在一些实施方案中，本发明的方法包括靶向与相同组织来源的正常细胞相比，其中c-met或肝细胞生长因子，或两者的表达更丰富的细胞(例如，癌细胞)。可以通过多种来源的HGF，即以自分泌或旁泌性方式调节表达c-met的细胞。例如：在本发明的方法的一个实例中，用不同细胞表达的肝细胞生长因子(例如经由旁泌性效应)来接触/结合靶细胞。所述不同细胞可以具有相同或不同的组织起源。在一个实施方案中，用靶细胞自身表达的HGF(例如，经由自分泌效应/环)来接触/结合该靶细胞。 
一方面，本发明提供包括给受试者施用本发明的增强分子的方法。能用这种方法治疗的合适的状态包括与异常低/不期望低的血管发生生理水平有关的任何病理状态，其中血管发生与受试者的HGF/c-met活性有关。这种状态的实例包括，但不限于，伤口愈合、心脏肥大、心肌梗塞、肢体局部缺血、末梢动脉疾病(peripheral arterial disease)等等。 
一方面，本发明提供包含一种或多种本发明的拮抗剂或增强剂和载体的组合物。在一个实施方案中，所述载体是药学上可接受的载体。 
一方面，本发明提供编码本发明的拮抗剂或增强剂分子的核酸。在一个实施方案中，本发明的核酸编码拮抗剂或增强剂分子，该拮抗剂或增强剂分子是多肽(例如，寡肽)，或包含多肽(例如，寡肽)。在一个实施方案中，本发明的核酸编码拮抗剂或增强剂分子，该拮抗剂或增强剂分子是抗体或其片段，或包含抗体或其片段。 
一方面，本发明提供包含本发明的核酸的载体。 
一方面，本发明提供包含本发明的核酸或载体的宿主细胞。载体可以是任何类型，例如可以是重组载体，如表达载体。可以使用多种宿主细胞中的任何宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如，大肠杆菌。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。 
一方面，本发明提供制造本发明的拮抗剂或增强剂分子的方法。例如，本发明提供制造是抗体(或其片段)或包含抗体(或其片段)的拮抗剂的方法，所述方法包括在适当的宿主细胞中表达本发明的编码所述抗体(或其片段)的重组载体和回收所述抗体。在另一个实施方案中，本发明提供 制造是或包含多肽(例如寡肽)的拮抗剂或增强剂分子的方法，所述方法包括在适当的宿主细胞中表达本发明的编码所述多肽(例如寡肽)的重组载体和回收所述多肽(例如寡肽)。 
一方面，本发明提供了包含容器和装在容器中的组合物的制品，其中所述组合物包含本发明的一种或多种拮抗剂或增强剂分子。在一个实施方案中，所述组合物包含本发明的核酸。在一个实施方案中，包含拮抗剂或增强剂分子的组合物更进一步地包含载体，在一些实施方案中载体是药学上可接受的载体。在一个实施方案中，本发明制品更进一步地包含将组合物(例如，拮抗剂或增强剂分子)施用给受试者的说明。 
一方面，本发明提供包括装有组合物的第一容器和装有缓冲液的第二容器的试剂盒，其中组合物包含本发明的一种或多种拮抗剂或增强剂分子。在一个实施方案中，缓冲液是药学上可接受的缓冲液。在一个实施方案中，包含拮抗剂或增强剂分子的组合物更进一步地包含载体，在一些实施方案中载体是药学上可接受的载体。在一个实施方案中，试剂盒更进一步地包含将组合物(例如，拮抗剂或增强剂分子)施用给受试者的说明。 
附图简述 
图1肝丝酶纯度和对因子VII的活性。(A)CHO细胞表达的可溶性肝丝酶包含全部的细胞外域(Arg45-Leu417)和C末端His8标签。纯化的肝丝酶的染色凝胶(还原条件)显示肝丝酶已经通过在Arg163-Ile163的切割自然地变为双链形式(已经通过N-末端测序证实)。(B)37℃在存在PCPS小囊和CaCl2的条件下，肝丝酶在2小时的时间里活化因子VII酶原。标明了FVII酶原、FVIIa的轻链(l.c)和蛋白酶域(h.c)的位置。分子量标记显示为Mr×10-3。 
图2肝丝酶特异性活化前HGF。在20mM Hepes，pH 7.5，150mM NaCl(Hepes缓冲液)中，用浓度逐渐降低的肝丝酶和HGFA孵育125I标记的前HGF(0.05mg/ml)：酶的3倍稀释步骤，从第2道的40nM降至第7道的0.16nM。(A)肝丝酶和(B)HGFA。在37℃进行4小时之后，通过SDS-PAGE在还原条件下分析样品，接下来将样品曝光到X线胶片上。标明前HGF、HGF α-链和HGF β-链(双联体)的位置。第1道是刚好在反应开始时取的样品等分。(C)t-PA和肝丝酶活化纤溶酶原。纤溶酶原(0.12mg/ml)在 Hepes缓冲液中与t-PA(40nM)、肝丝酶(40nM)或缓冲液(对照)孵育。通过SDS-PAGE(还原条件)分析在不同时间点取的样品等份，接下来用Simply Blue Safe染色剂染色。第1道，缓冲液0.5小时；第2道，t-PA 0.5小时；第3道，肝丝酶0.5小时；第4道，缓冲液5小时；第5道，t-PA 5小时；第6道，肝丝酶5小时。标明了纤溶酶原(Plg)和纤溶酶重链(h.c)的位置。 
图3肝丝酶和HGFA活化的前HGF的Met磷酸化。(A)用40nM肝丝酶或40nM HGFA切割未标记的前HGF(0.3mg/ml)产生＞95％的转化。通过SDS-PAGE(还原状态)分析肝丝酶切割(HGF肝丝酶)和HGFA切割(HGFHGFA)产生的HGF，接下来用Simply Blue Safe Stain进行染色。(B)通过将A549细胞暴露给浓度逐渐增加的HGF肝丝酶(圆圈)、HGFHGFA(正方形)或scHGF(菱形)、未切割的单链形式的HGF，在KIRA测定中测量Met受体的磷酸化。用使用HGF对照制品获得的最大信号的百分比来表示活性。得到的值是三个实验的平均值±SD。 
图4用肝丝酶(HGF肝丝酶)和HGFA(HGFHGFA)活化的前HGF进行的细胞增殖和迁移。(A)在浓度逐渐增加的HGF肝丝酶(填充柱)和HGFHGFA (未填充柱)存在时BxPC3细胞的细胞增殖情况。数值是两个实验的平均值。(B)通过逐渐增加添加到孔间细胞迁移***的下层腔中的HGF肝丝酶(填充柱)和HGFHGFA(未填充柱)的浓度刺激的细胞迁移的定量。数值是三个实验的平均值±SD。在增殖和迁移测定中的活性用暴露于100ng/ml的对照HGF制品的对照细胞的百分比来表示，其中对照HGF制品包括在每个实验中。 
图5在氨溶解(amidolytic)测定中的肝丝酶酶活性的抑制。在室温让肝丝酶(0.4nM)与抑制剂孵育30min，在动态微板读数器(kinetic microplatereader)上确定对S2366(0.2mM～Km)的酶活性。(□)、sHAI-1B、 
Figure G05831687420070322D000131
sHAI-1B(R260A)、(l)、sHAI-1B(K401A)、(l)、sHAI-2。 
图6sHAI-1B和sHAI-2的突变体形式对前HGF活化的抑制。125I标记的前HGF(0.05mg/ml)与肝丝酶(15nM)和抑制剂在37℃一起孵育4小时。按照图1中的描述分析反应等分样品。每个样品中存在15nM的肝丝酶。抑制剂是1uM。第1道，t＝0时的等分；第2道，没有抑制剂；第3道，sHAI-1B；第4道，sHAI-1B(R260A)；第5道sHAI-1B(K401A)；第 6道，sHAI-2。标明前HGF、HGF α-链和HGF β-链(双联体)的位置。 
图7人天然肝丝酶的氨基酸序列的一个实例。 
图8人天然肝丝酶的氨基酸序列的另一个实例。 
实施本发明的方式 
本发明提供包含HGF/c-met信号路径调节剂的方法、组合物、试剂盒和制品，包括使用这种调节剂的方法。 
在这里提供了这些方法、组合物、试剂盒和制品的细节。 
一般技术 
除非另有陈述，否则本发明的实施将使用在本领域技术内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学传统技术。文献中对这些技术进行了充分解释，例如，″Molecular Cloning：A LaboratoryManual″，second edition(Sambrook et al.，1989)；″Oligonucleotide Synthesis″(M.J.Gait，ed.，1984)；″Animal Cell Culture″(R.I.Freshney，ed.，1987)；″Methods in Enzymology″(Academic Press，Inc.)；″Current Protocols inMolecular Biology″(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987，and periodic updates)；″PCR：The Polymerase Chain Reaction″，(Mullis et al.，ed.，1994)；″A PracticalGuide to Molecular Cloning″(Perbal Bernard V.，1988)；″Phage Display：ALaboratory Manual″(Barbas et al.，2001)。 
定义 
这里使用的术语″肝丝酶(hepsin)″包括能够以类似于野生型肝丝酶的方式切割前HGF的天然序列多肽、多肽变体，以及天然序列多肽和多肽变体(这里将对它们进行更进一步地限定)的片段。这里描述的肝丝酶多肽可以是分离自多种来源的多肽，例如来自人组织类型或另一个来源的多肽，或者是通过重组或合成方法制备的多肽。术语″肝丝酶″、″肝丝酶多肽″、″肝丝酶(hepsin enzyme)″和″肝丝酶蛋白质″的也包括这里公开的肝丝酶多肽的变体。 
″天然序列肝丝酶多肽″包含与来源于自然界的对应肝丝酶多肽具有相同氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，天然序列肝丝酶多肽包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列(参见图7)。在一个实施方案中，天然序列肝丝酶多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列(参见图8)。可以从自然界中分离这种天 然序列肝丝酶多肽，或者可以通过重组或合成方法制备这种多肽。术语″天然序列肝丝酶多肽″特别包括具体肝丝酶多肽的天然发生的截短或分泌形式(例如，细胞外域序列)、天然发生的变体形式(例如，可替换的拼接形式)和多肽的天然发生的等位基因变体。 
″肝丝酶多肽变体″或其变异形式指肝丝酶多肽，通常是与这里公开的任何天然序列的肝丝酶多肽序列具有至少大约80％的氨基酸序列同一性的活性肝丝酶多肽。这样的肝丝酶多肽变体包括，例如，在天然氨基酸序列的N-或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的多肽。通常，肝丝酶多肽变体与这里公开的天然序列的肝丝酶多肽序列具有至少大约80％的氨基酸序列同一性，或者至少大约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。通常，肝丝酶变体多肽是长度为至少大约10个氨基酸、或者至少大约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600个氨基酸或更多个氨基酸的多肽。与天然肝丝酶多肽序列相比，肝丝酶变体多肽任选可以具有最多一个保守氨基酸替换，或者最多2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸替换。 
肽或多肽序列的″氨基酸序列同一性百分比(％)″定义为在对序列进行比对并在必要时引入缺口实现了最大的百分比序列同一性之后，候选序列中与具体肽或多肽序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，其中不认为任何保守取代是序列同一性的一部分。在本领域可以以多种方式实现确定氨基酸序列同一性百分比的比对，例如利用公众可利用的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域熟练技术人员可以确定测量比对时的适当参数，包括需要对进行比较的全长序列进行最大比对的任何算法。但是，为了实现本文的目的，可以按照美国专利6,828,146中的描述利用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列同一性百分比数值。 
这里使用的术语″载体″用来指能转运另一个核酸到连接它的地方的核 酸分子。一种载体是″质粒″，质粒是指可以将附加DNA片段连接到其中的环状双链DNA环。另一种载体是噬菌体载体。另一种载体是病毒载体，其中附加DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们***其中的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型(episomal)哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型(non-episomal)哺乳动物载体)在引入宿主细胞时可以整合到宿主细胞基因组中，因此能够与宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导与它们可操作性连接的基因的表达。这种载体在这里称为″重组表达载体″(或简称为″重组载体″)。通常，在重组DNA技术中应用的表达载体经常是质粒形式。在本发明的说明书中，″质粒″和″载体″可以交换使用，因为质粒是最常用的载体形式。 
″多核苷酸″或″核酸″在这里可交换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物，或者是通过DNA或RNA聚合酶，或合成反应可以合并到聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和它们的类似物。如果存在修饰，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。可以通过非核苷酸成分中断核苷酸序列。可以在合成之后更进一步地修饰多核苷酸，例如与标记物结合。其它修饰类型包括，例如：″加帽″、用类似物替换一个或多个天然发生的核苷酸、核苷酸间修饰，例如：具有不带电荷的键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等等)和带电荷的键(例如硫代磷酸(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯等等.)的修饰、包含附加部分的那些修饰，所述附加部分例如，蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等等)、具有***剂(例如，吖啶、补骨脂素等等)的那些修饰、包含螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、金属氧化物等等)的那些修饰、包含烷化剂的那些修饰、具有修饰键的那些修饰(例如、α-异头物核酸等等)，以及未修饰形式的多核苷酸的核苷酸间修饰。更进一步地，可以取代通常存在于糖中的任何羟基，例如可以用膦酸基团、磷酸基团替换，通过标准的保护基团也可以对其进行保护，可以对其进行活化以制备连接到附加核苷酸上的附加键，或者可以将其连接到固体或半固体支持物上。可以用胺或1-20个碳原子的有机封端基团部分磷酸化或替换5′和3′末端OH。其它的羟基也可以衍生成标准的保护基。多核苷酸还可以包含本领域通常已经已 知的核糖或脱氧核糖的相似形式，包括，例如2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基、2’-氟-或2’-叠氮基核糖、碳环糖类似物、α-异头物糖(anomeric sugar)、差向异构体糖，例如***糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚糖、非环形类似物和非碱性(abasic)核苷类似物，例如甲基核糖核苷。可以用可选择的连接基团替代一个或多个磷酸二酯键。这些可选择的连接基团包括，但不局限于其中磷酸盐被P(O)S(″硫代酸(thioate)″)、P(S)S(″二硫代酸(dithioate)″)、″(O)NR.sub.2(″酰胺化″)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH.sub.2(″formacetal″)替代的实施方案，其中每个R或R’独立地是H，或者任选地包含醚(-O-)键、芳烃基、链烯基、环烷基、环烯基或araldyl的替换或未替换的烷基(1-20C)。多核苷酸中的所有键并不需要是相同的。前面的描述适用于这里提到的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。 
这里使用的″寡核苷酸″通常指短的单链合成多核苷酸，其长度通常少于大约200个核苷酸，但不是必须少于大约200个核苷酸。术语″寡核苷酸″和″多核苷酸″不是互相排斥的。上述的有关多核苷酸的描述同样完全地适用于寡核苷酸。 
除非特别说明或上下文另外标明，否则这里使用的术语″肝细胞生长因子″或″HGF″指在允许活化HGF/c-met信号路径的条件下，任何能够活化HGF/c-met信号路径的天然HGF多肽或HGF多肽变体(不论是天然发生的，还是合成的)。术语″野生型HGF″泛指包含天然发生的HGF蛋白质的氨基酸序列的多肽。术语″野生型HGF序列″泛指在天然发生的HGF中发现的氨基酸序列。 
术语″抗体″和″免疫球蛋白″在广义上可交换使用，包括单克隆抗体(例如，全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，只要显示出想要的生物学活性的双特异性抗体)，也可以包括某些抗体片段(这里将进行更详细的描述)。抗体可以是人的、人源化的和/或亲合力成熟的抗体。 
″抗体片段″仅仅包含完整抗体的一部分，其中这部分优选保留通常与存在于完整抗体中的那部分相关的功能的至少一种，优选大多数或全部。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合部位，因此保留了结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段保留了通常与存在于完整抗体中的Fc区有关的生物功能的至少一种，例 如结合FcRn、抗体半衰期调节、ADCC功能和结合补体。在一个实施方案中，抗体片段是具有基本上与完整抗体相似的体内半衰期的单价抗体。例如，这样的抗体片段可以包含连接到Fc序列上的抗原结合臂，其中Fc序列能够使片段具有体内稳定性。 
这里使用的术语″单克隆抗体″指从基本上均一的抗体群中获得的抗体，即除可能少量存在的天然发生的可能突变之外，包含在该群体中的各抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异的靶向单个抗原的抗体。而且，与典型地包括靶向不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每个单克隆抗体只靶向抗原上的单个决定簇。 
这里的单克隆抗体特别包括嵌合抗体，以及这种抗体的显示出想要的生物活性的片段，其中嵌合抗体的重链和/或轻链的一部分等同于或同源于由特殊物种获得的抗体或属于特殊抗体类别或亚类的抗体的对应序列，这些链的剩余部分等同于或同源于由另一个物种获得的抗体或属于另一个抗体类别或亚类的抗体的对应序列(美国专利No.4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984)) 
非人(例如，鼠的)抗体的″人源化″形式是包含由非人免疫球蛋白获得的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体抗体高变区的残基被来自非人物种的抗体(供体抗体)，例如具有想要的特异性、亲合力和能力(capacity)的小鼠、大鼠、兔子或非人类灵长目动物的抗体的高变区残基替代。在有些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被对应的非人残基替代。而且，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。作这些修饰可以更进一步地改进抗体的性能。通常，人源化抗体基本上包含至少一个，典型地两个可变区的全部，其中全部或基本上全部的高变环相当于非人免疫球蛋白的那些高变环，全部或基本上全部的FRs是人免疫球蛋白序列的FRs。人源化抗体也可以任选包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地包含人免疫球蛋白恒定区的一部分。可以参见Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)以了解更多的细节。也可参见下列综述文章和其中引用的参考文献：Vaswani and Hamilton，Ann.Allergy，Asthma&Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle and Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)。 
″人抗体″是具有的氨基酸序列相当于人产生的抗体和/或利用这里公开的任何制造人抗体的技术已经制备出来的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的定义特别排除了包含非人的抗原结合残基的人源化抗体。 
″亲合力成熟″抗体是在一个或多个CDRs中具有一个或多个改变的抗体，所述改变导致与不具有那些改变的亲代抗体相比，抗体对抗原的亲合力发生了改进。优选对目标抗原的亲合力是纳摩尔，甚至是皮摩尔的亲合力成熟抗体。通过本领域已知的方法可以生产亲合力成熟抗体。Marks et al.Bio/Technology 10：779-783(1992)描述了通过VH和VL区改组进行亲合力成熟的技术。Barbas et al.Proc Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al.Gene 169：147-155(1995)；Yelton et al.J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al.，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)和Hawkins et al，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)中描述了CDR和/或框架残基的随机诱变。 
″阻断抗体″或″拮抗剂″抗体是抑制或降低它结合的抗原的生物活性的抗体。优选的阻断抗体或拮抗剂抗体基本上抑制或完全抑制抗原的生物活性。 
这里使用的″激动剂抗体″是模仿目的多肽的至少一种功能活性的抗体。 
″紊乱(疾病)(disorder)″是将从用本发明的物质/分子或方法进行的治疗中获益的任何状态。这包括慢性和急性紊乱，或包括使哺乳动物易患所讨论的紊乱的那些病理学状态的疾病。这里治疗的紊乱的非限制实例包括恶性和良性肿瘤；非白血病和淋巴恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑及其它腺体、巨噬细胞(macrophagal)、上皮细胞、间质和囊胚腔的紊乱(blastococlic disorder)；和炎性的、免疫学的及其它血管发生相关紊乱。 
术语″细胞增生性紊乱(疾病)″和″增生性紊乱(疾病)″指与一定程度的异常细胞增殖有关的紊乱(疾病)。在一个实施方案中，细胞增生性紊乱(疾病)是癌症。 
这里使用的″肿瘤″指所有不论是恶性还是良性的赘生性细胞的生长和增殖，所有癌前和癌细胞和组织。这里提到的术语″癌症″、″癌的″、″细胞增生性紊乱(疾病)″、″增生性紊乱(疾病)″和″肿瘤″不是互相排斥的。 
术语″癌症″和″癌″指或描述的是哺乳动物中典型地以无限制的细胞生 长/增殖为特征的生理状态。癌症的实例包括，但不局限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤(blastoma)、肉瘤和白血病。这种癌症更特殊的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌(hepatocellular cancer)、胃肠癌、胰腺癌、恶性胶质瘤(glioblastoma)、***、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌(hepatoma)、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(liver cancer)和各种类型的头和颈癌。 
这里使用的″治疗″指尝试改变被治疗的个体或细胞的天然进程的临床介入，可以以预防为目的而实施或在临床病理学进程中实施。治疗的合乎需要的效应包括防止疾病发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、防止转移、降低疾病进展的速度、改善或缓解疾病状态，缓解或改进预后。在一些实施方案中，本发明的抗体被用来延缓疾病或紊乱的发展。 
″有效量″指在必需的用药时段实现想要的治疗或预防结果的有效量。 
本发明的物质/分子、激动剂或拮抗剂的″治疗有效量″可以随一些因素，例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重、物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引起想要的反应的能力而变化。治疗有效量也是物质/分子、激动剂或拮抗剂的治疗有益效果超过任何有毒或不利影响的剂量。″预防有效量″指在必需的用药时段实现想要的预防结果的有效量。因为预防剂量是在疾病之前或疾病早期施用给受试者的，因此通常预防有效量小于治疗有效量，但这并不是必须的。 
这里使用的术语″细胞毒剂″指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞发生破坏的物质。该术语包括放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它***剂、酶和其片段，例如溶核酶、抗生素，毒素，例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体、以及下文公开的各种抗肿瘤和抗癌剂。其它的细胞毒剂描述如下。破坏癌细胞的制剂会导致肿瘤细胞破坏。 
″化疗剂″是对癌症治疗有用的化合物。化疗剂的实例包括烷化剂，例如噻替派(thiotepa)和 环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，例如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(特别是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢***酚(tetrahydrocannabinol)(屈***酚(dronabinol)， 
Figure G05831687420070322D000212
)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成的类似物托泊替康(topotecan)( 
Figure G05831687420070322D000213
)、CPT-11(依立替康(irinotecan)， 
Figure G05831687420070322D000214
)、乙酰喜树碱(acetylcamptothecin)、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱(aminocamptothecin))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括它的阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成的类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，例如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如加利车霉素(calicheamicin)，特别是加利车霉素γII和加利车霉素ωI1(例如，参见 Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)、包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团(chromophore)和有关的色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括 
Figure G05831687420070322D000221
吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、阿霉素HCl脂质体注射剂( 
Figure G05831687420070322D000222
)和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine)( 
Figure G05831687420070322D000223
)、替加氟(tegafur)( 
Figure G05831687420070322D000224
)、卡培他滨(capecitabine)( )、epothilone和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，例如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如甲酰四氢叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙 (edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)； 多糖复合物(JHS NaturalProducts，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)( 
Figure G05831687420070322D000232
Figure G05831687420070322D000233
)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如，紫杉醇(paclitaxel)( 
Figure G05831687420070322D000234
)、清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉醇(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel)( 
Figure G05831687420070322D000235
)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)( 
Figure G05831687420070322D000236
)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)( )；奥沙利铂(oxaliplatin)；甲酰四氢叶酸(leucovorin)；长春瑞滨(vinorelbine)( 
Figure G05831687420070322D000238
)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)；上述所有物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及上述的两个或更多个组合，例如CHOP和FOLFOX，CHOP是环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和***龙(prednisolone)的联合治疗的缩写，FOLFOX是奥沙利铂(oxaliplatin)(ELOXATINTM)联合5-FU和甲酰四氢叶酸进行治疗的缩写。 
调节、降低、阻断或抑制激素作用的抗激素制剂也包括在该定义内，其中所述的激素可以促进癌症生长，所述的抗激素制剂经常以***或整体治疗形式存在。所述抗激素制剂可以是激素本身。实例包括抗***剂和选择性的***受体调节剂(SERMs)，包括，例如：他莫昔芬(tamoxifen)(包括 
Figure G05831687420070322D000241
他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)( 
Figure G05831687420070322D000242
)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟泰米芬(4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)( 
Figure G05831687420070322D000243
)；抗孕酮类；***受体下调剂(ERDs)；***受体拮抗剂，例如氟维司群(fulvestrant)( 
Figure G05831687420070322D000244
)；那些起抑制或阻断卵巢功能的制剂，例如：促黄体素释放激素(LHRH)激动剂，例如醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)( 
Figure G05831687420070322D000245
和 
Figure G05831687420070322D000246
)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素剂，例如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；和抑制肾上腺中调节***产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，例如，4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)( 
Figure G05831687420070322D000247
)、依西美坦(exemestane)( 
Figure G05831687420070322D000248
)、formestanie、法倔唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)( 
Figure G05831687420070322D000249
)、来曲唑(letrozole)( 
Figure G05831687420070322D0002410
)和阿那曲唑(anastrozole)( 
Figure G05831687420070322D0002411
)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，例如氯膦酸盐(clodronate)(例如： 
Figure G05831687420070322D0002412
或 
Figure G05831687420070322D0002413
)、依替膦酸钠(etidronate)( 
Figure G05831687420070322D0002414
)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)( )、阿伦膦酸盐(alendronate)( 
Figure G05831687420070322D0002416
)、帕米膦酸盐(pamidronate)( 
Figure G05831687420070322D0002417
)、替鲁膦酸盐(tiludronate)( 
Figure G05831687420070322D0002418
)或利塞膦酸盐(risedronate)( 
Figure G05831687420070322D0002419
)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制信号路径中和异常细胞增殖有关联的基因的表达的寡核苷酸，例如：PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，例如 
Figure G05831687420070322D0002420
疫苗和基因治疗疫苗，例如： 
Figure G05831687420070322D0002421
疫苗、 疫苗和 
Figure G05831687420070322D0002423
疫苗；拓扑异构酶抑制剂(例如， 
Figure G05831687420070322D0002424
)；rmRH(例如， 
Figure G05831687420070322D0002425
)；lapatinibditosylate(ErbB-2和EGFR双酪氨酸激酶小分子抑制剂，又名GW572016)； COX-2抑制剂，例如塞来考昔(celecoxib)( 4-(5-(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺；和上述所有物质的药学可接受盐、酸或衍生物。 
这里使用的″生长抑制剂″指抑制细胞生长的化合物或组合物，其中细胞的生长在依赖于体外或体内的HGF/c-met活化。因此，生长抑制剂可以是能显著降低S期HGF/c-met-依赖细胞百分比的制剂。生长抑制制剂的实例包括阻断细胞周期进展(在除S期以外的其它时间点)的制剂，例如诱导G1期和M期停止的制剂。典型的M期阻断剂包括长***属(vinca)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxane)和拓扑异构酶II抑制剂，例如，多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻断G1的制剂也可以延伸到S期阻断，例如DNA烷化剂，如他莫昔芬(tamoxifen)、***(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(fluorouracil)和ara-C。在The Molecular Basis of Cancer，Mendelsohn and Israel，eds.，Chapter 1，entitled″Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplasticdrugs″by Murakami et al.(WB Saunders：Philadelphia，1995)中，特别是13页可以发现更多信息。紫杉烷类(紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))都是由紫杉树获得的抗癌药。由欧洲紫杉获得的多西他赛( 
Figure G05831687420070322D000252
Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇( 
Figure G05831687420070322D000253
Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进微管蛋白二聚体组装成微管，并通过防止解聚作用稳定微管，这会导致细胞有丝***受到抑制。 
“多柔比星(Doxorubicin)”是蒽环类抗生素。多柔比星的完整化学名是(8S-顺式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-并四苯二酮((8S-cis)-10-[(3-amino-2，3，6-trideoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7，8，9，10-tetrahydro-6，8，11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5，12-naphthacenedione)。 
本发明的组合物和方法
A.抗体
在一个实施方案中，本发明提供了发现在这里可以用作治疗和/或诊断制剂的抗体。示范的抗体包括多克隆的、单克隆的、人源化的、双特异性的和异偶联抗体。 
1.多克隆抗体 
优选通过多重皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂在动物中收集多克隆抗体。将相关抗原连接到在被免疫的物种中能产生免疫原性的蛋白质上可能是有用的(特别是当使用合成肽时)。例如：利用双功能制剂或衍生制剂，例如马来酰亚胺苯酰硫代琥珀酰亚胺酯(maleimidobenzoylsulfo succinimide ester)(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1 是不同的烷基，可以将抗原连接到钥孔血蓝素(KLH)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂上。 
通过组合，例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别免疫兔子或小鼠)和3体积的福氏完全佐剂，并在多个位点将溶液注射到皮内使动物免疫抗原、产生免疫原性的偶联物、或衍生物。一个月以后，通过在多个位点皮下注射处于福氏完全佐剂中的是原有量1/5-1/10的肽或偶联物加强免疫动物。7-14天后，采集动物血液，测定血清中的抗体滴度。加强免疫动物是直到滴度达到高水平稳定状态(plateaus)。也可以在重组细胞培养中以蛋白质融合物来制备偶联物。聚集剂，例如明矾(alum)也可以适当地用于增强免疫反应。 
2.单克隆抗体
可以利用Kohler et al.，Nature，256：495(1975)最初描述的杂交瘤方法，或者通过重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制备单克隆抗体。 
在杂交瘤方法中，按照如上所述免疫的方法免疫小鼠或其它适当的宿主动物，例如仓鼠以得到产生或能够产生抗体的淋巴细胞，其中抗体特异性地结合用来进行免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。在免疫以后，分离淋巴细胞，然后利用适当的助融剂，例如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies： Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。 
接种制备得到的杂交瘤细胞，让其生长在适当的培养基中，培养基优选包含抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞(也称为融合配偶体)生长或存活的一种或多种物质。例如：如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么适合杂交瘤的选择性培养基典型地包括阻止HGPRT缺乏细胞生长的次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT培养基)。 
优选的融合配偶体骨髓瘤细胞是那些能高效进行融合，支持选择的抗体生产细胞高水平稳定生产抗体，并对选择淘汰未融合亲代细胞的选择性培养基敏感的骨髓瘤细胞。优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，例如那些从获自美国加利福尼亚圣地亚哥的Salk研究所细胞分布中心(SalkInstitute Cell Distribution Center)的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤获得的骨髓瘤细胞系，SP-2及其衍生物，例如从美国弗吉尼亚州Manassas的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得的X63-Ag8-653细胞。也已经描述生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；和Brodeur et al.，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。 
测定杂交瘤细胞生长其中的培养基中生产的针对抗原的单克隆抗体。优选通过免疫沉淀反应或通过体外结合测定，例如放射免疫测定(RIA)或(酶联免疫吸附测定)(ELISA)测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。 
例如，单克隆抗体的结合亲合性可以通过Munson et al.Anal.Biochem.， 107：220(1980)中描述的Scatchard分析确定。 
一旦鉴定出那些产生具有想要的特异性、亲合性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，就可以通过有限稀释方法亚克隆该克隆，并通过标准方法使它们生长(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。实现这一目的的适当培养基包括，例如：D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，可以将杂交瘤细胞作为动物体内的腹水肿瘤使其在体内生长，例如通过腹膜内注射细胞到小鼠体内可以实现这一点。 
利用常规的抗体纯化方法，例如亲和层析(例如利用蛋白质A或蛋白 质G-Sepharose)或离子交换层析、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析等等，可以适当地从培养基、腹水或血清中分离亚克隆分泌的单克隆抗体。 
利用常规程序(例如，通过使用能特异结合到编码鼠抗体重链和轻链基因上的寡核苷酸探针)很容易分离编码单克隆抗体的DNA，并能对其进行测序。杂交瘤细胞可以作为这种DNA的优选来源。一旦分离出这种DNA，就可以将DNA置入表达载体中，表达载体随后被转染到宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生抗体蛋白质的骨髓瘤细胞里，以实现在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述包括Skerra et al.，Curr.Opinion inImmunol.，5：256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。 
在更进一步的实施方案中，单克隆抗体或抗体片段可以分离自使用McCafferty et al.，Nature，348：552-554(1990)中描述的技术产生的抗体噬菌体库。Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.， 222：581-597(1991)描述了使用噬菌体库分别分离鼠和人抗体的过程。后来的出版物描述了通过链改组(Marks et al.，Bio/Technology，10：779-783(1992))，以及作为构建非常大的噬菌体库策略的组合感染和体内重组(Waterhouse et al.，Nuc.Acids.Res.21：2265-2266(1993))生产高亲合力(nM范围)人抗体的情况。因此，这些技术是分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行的替换方法。 
可以修饰编码抗体的DNA以产生嵌合的或融合的抗体多肽，例如，通过用人重链和轻链恒定域(CH和CL)序列替换同源的鼠序列(美国专利No.4,816,567和Morrison，et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，81：6851(1984))，或者通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列融合可以实现这一点。非免疫球蛋白多肽序列可以替代抗体恒定域，或者它们可以替换抗体的一个抗原结合部位的可变域以产生包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点的嵌合的二价抗体。 
3.人和人源化抗体
本发明的抗体可以更进一步地包含人源化抗体或人抗体。非人(例如，鼠的)抗体的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv，Fab，Fab’，F(ab’)2或抗体的其它的抗原结合子序列)，所述免疫球 蛋白、免疫球蛋白链或其片段包含来源于非人免疫球蛋白的最少序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种的抗体(供体抗体)，例如具有期望特异性、亲合性和能力(capacity)的小鼠、大鼠或兔子的抗体的CDR残基替代。在有些情况下，人免疫球蛋白的Fv骨架残基被对应的非人残基替代。人源化抗体也可以包含既没有在受体抗体中发现，也没有在被引入的CDR或骨架序列中发现的残基。通常，人源化抗体基本上包含至少一种，典型地两种可变域(variable domain)的全部，其中全部或基本上全部的CDR区相当于非人免疫球蛋白的那些CDR区，全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白的共有序列。人源化抗体优选也包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地包含人免疫球蛋白的恒定区[Jones et al.，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332：323-329(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)]。 
人源化非人抗体的方法在本领域为大家所熟知。通常，人源化抗体具有来自非人来源的被引入的其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常被称为″引入″残基，″引入″残基典型地取自″引入″可变域。遵循Winter和其同事的方法[Jones et al.，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann etal.，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，239：1534-1536(1988)]，通过用啮齿类动物的CDRs或CDR序列替换人抗体的对应序列基本上可以完成人源化。因此，这种″人源化抗体″是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本上小于完整人可变域的部分已经被来自非人物种的对应序列替换。实际上，人源化抗体典型地是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被啮齿类动物抗体中来自相似位点的残基替换的人抗体。 
选择制造人源化抗体时使用的人轻链和重链可变域对减少抗体治疗人类时的抗原性和HAMA反应(人抗小鼠抗体)非常重要。根据所谓的″最佳拟合″方法，可以针对已知的人可变域序列的全体库筛选啮齿类动物抗体的可变域序列。鉴定最接近啮齿类动物V域序列的人V域序列，它内部的人框架区(FR)被接受用于人源化抗体(Sims et al.，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一个方法使用了由具体轻链或重链亚群的所有人抗体的共有序列获得的具体框架区。相同的框架区可以用于几种不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 89：4285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.151：2623(1993))。 
更进一步地，人源化抗体保留对抗原的高结合亲合力及其它有利的生物学特性是重要的。为了实现这一目标，依照优选方法，可以通过使用亲代和人源化序列的三维模型分析亲代序列和各种理论上的人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可得到的，而且为本领域熟练技术人员所熟悉。说明和显示选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。这些研究可以对残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用进行分析，即对影响候选免疫球蛋白的抗原结合能力的残基进行分析。这样，可以从受体序列和引入序列中选择和组合FR残基，以实现想要的抗体特性，例如，增加的对目标抗原的亲合力。通常，高变区残基直接并且最大程度地影响抗原结合。 
可以考虑各种形式的人源化抗体。例如：人源化抗体可以是抗体片段，例如任选连接到一种或多种细胞毒剂上产生免疫偶联物的Fab。或者，人源化抗体可以是完整的抗体，例如完整的IgG1抗体。 
可以产生人抗体作为人源化抗体的替换物。例如：现在产生免疫时能在缺少内源免疫球蛋白生产的情况下生产人抗体所有成员的转基因动物(例如，小鼠)是可能的。例如：已经描述在嵌合的种系突变小鼠中纯合缺失抗体重链连接区(JH)基因会导致内源抗体生产完全被抑制。将人的种系免疫球蛋白基因排列转移到这种种系突变小鼠中将导致抗原激发时产生人抗体。例如，参见Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann et al.，Year inImmuno.7：33(1993)；美国专利Nos.5,545,806、5,569,825、5,591,669(都是GenPharm的)；5,545,807和WO 97/17852。 
或者，可以利用噬菌体展示技术(McCafferty et al.，Nature 348：552-553[1990])在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因库制备人抗体和抗体片段。依据这种技术，抗体V域(domain)基因被克隆到丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白(例如M13或fd)基因的阅读框(in-frame)内，并作为功能抗体片段展示在噬菌体颗粒表面。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，因此基于抗体功能特性的选择也会导致对编码呈现那些特性的抗体的基因的选择。因此，噬菌体模仿B细胞的一些特性。可以以多种形式完成噬菌体展示，例如，Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.， Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)进行了综述。数种来源的V基因片段可用于噬菌体展示。Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)从来自免疫小鼠脾脏的V基因的小随机组合库分离了抗噁唑酮抗体的多种排列。可以构建来自未免疫人供体的全部V基因，并且基本上遵循Marks etal.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)，或Griffith et al.，EMBO J.12：725-734(1993)中描述的技术可以分离到针对多种多样的抗原排列(包括自身抗原)的抗体。也可以参见美国专利Nos.5,565,332和5,573,905。 
正如以上所讨论的，也可以通过体外活化的B细胞来产生人抗体(参见，美国专利5,567,610和5,229,275)。 
4.抗体片段
在某些环境中，使用抗体片段，而不是完整抗体具有优势。大小较小的片段允许快速清除，而且可以导致更容易进入实体瘤。 
已开发了多种技术用于生产抗体片段。传统上，这些片段通过对完整抗体进行蛋白水解消化来衍生(见例如，Morimoto等，J.Biochem.Biojphys.Methods 24：107-117(1992)和Brennan等，Science 229：81(1985))。然而，这些片段现在可通过重组宿主细胞直接生产。Fab，Fv和ScFv抗体片段均可在大肠杆菌中表达并从中分泌，从而使这些片段的大量生产变得更容易。也可自上述的抗体噬菌体文库分离抗体片段。可选地，Fab’-SH片段可自大肠杆菌直接回收并利用化学方法偶联形成F(ab’)2片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一方法，F(ab’)2片段可直接从重组宿主细胞培养物中分离。包括补救受体结合表位残基并具有延长的体内半寿期的Fab和F(ab′)2片段在美国专利5,869,046中描述。熟练技术人员掌握其它产生抗体片段的技术。其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。见WO 93/16185；美国专利5,571,894；和美国专利5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点但缺乏恒定区的唯一种类；因此，其适于在体内应用期间降低非特异结合。可以构建sFv融合蛋白，从而在sFv的氨基或羧基末端融合效应蛋白。见上文的Antibody Engineering，Borrebaeck编辑。抗体片段也可以是“线性抗体”，例如在美国专利5,641,870中描述。此种线型抗体片段可以是单特异或双特异的。 
5.双特异性抗体
双特异抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。典型的双 特异抗体可结合本文所述的肝丝酶、HGF和/或肝丝酶：HGF复合物的两种不同表位。其它此种抗体可将针对肝丝酶、HGF和/或肝丝酶：HGF复合物的结合位点与针对另一多肽的结合位点组合。或者，抗体臂可以与结合白细胞上触发分子的臂组合，触发分子例如T细胞受体分子(例如CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγR(CD16)，以将细胞防御机制集中和定位到表达和/或结合肝丝酶和/或HGF的细胞上。双特异抗体也可用来将细胞毒剂定位到表达和/或结合肝丝酶、HGF和/或肝丝酶：HGF复合物的细胞上。这些抗体具有多肽结合臂和结合细胞毒剂的臂(例如结合皂草素(saporin)，抗α-干扰素，长春花生物碱，蓖麻毒蛋白A链，氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)。可以将双特异抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异抗体)。 
WO96/16673描述了双特异性抗ErbB2/抗FcγRIII抗体，美国专利5,837,234披露了双特异性抗ErbB2/抗FcγRI抗体。在WO98/02463中显示双特异性抗ErbB2/Fcα抗体。美国专利5,821,337教导了双特异性抗ErbB2/抗CD3抗体。 
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统制备是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两条链具有不同特异性(Millstein et al，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链轻链随机分配，这些杂交瘤(“四链瘤”(quadroma))产生10种不同抗体分子的可能混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。对所述正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤来进行)非常复杂，且产量很低。类似的方法在WO93/08829和Traunecker等，EMBO J，10：3655-3659(1991)中披露。 
依据另一不同方法，可将具有所需结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合优选与包含至少一部分铰链区、CH2及CH3区的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少一种融合中。可将编码免疫球蛋白重链融合体，以及必要时，编码免疫球蛋白轻链的DNA***不同表达载体，共转染至适当宿主细胞。在使用非等比的三种多肽链进行构建以获得所需双特异性抗体最佳产量的实施方案中，这提供了调整三种多肽片段的相互比例上的较大灵活性。但也可在至少两种多肽链以等比例表达而获得高产时或所述比例对所需链组合的产量无明显影响时，将两种或所有三 种多肽链的编码序列***同一表达载体。 
在该方法的一个优选实施方案中，所述双特异性抗体由一条臂上的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。已发现这种不对称结构有利于从不想要的免疫球蛋白链的混合中分离出所需双特异性化合物，因为只有该双特异性分子的一半存在免疫球蛋白轻链，这使得分离更加容易。此方法公开于1994年3月3日公开的WO94/04690中。制备双特异性抗体的进一步细节可以参见，例如Suresh等，Methods in Enzymology，121：210(1986)。 
根据美国专利5,731,168所述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，使得从重组细胞培养中获得的异二聚体的百分比最大。优选的界面包括CH3结构域的至少一部分。在该方法中，源于第一抗体分子界面上的一条或多条氨基酸小侧链被较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)取代。与所述大侧链大小相同或相近的互补“沟”可通过将氨基酸大侧链用小侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代而在第二抗体分子的界面上形成。这提供了一种机制，其使异二聚体的产量比其它不想要的终产物如同型二聚体高。 
双特异性抗体包括交联抗体或“异源偶联的”抗体。例如，可使异源偶联物中的抗体之一与抗生物素蛋白偶联，使另一抗体与生物素偶联。有观点认为，这类抗体可用于将免疫***细胞导向不想要的细胞(美国专利4,676,980)，也可用于治疗HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。异源偶联抗体可通过任何适当的交联方法制备。适当的交联制剂和多种交联技术为本领域已知，在美国专利4,676,980号中获得。 
从抗体片段制备双特异性抗体的技术已有文献。例如，双特异性抗体可利用化学连接制备。Brennan等，科学229：81(1985)中描述了将完整抗体经蛋白水解切割制备F(ab′)2片段的方法。这些片段在二硫醇络合剂***存在下被还原，使邻近的二硫醇稳定，并阻止分子间二硫键的形成。生成的Fab′片段被转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。其中一种Fab′-TNB衍生物经巯基乙胺还原再转化成Fab′-硫醇，再与等摩尔量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。如此产生的双特异性抗体可作为酶的选择性固相化中所用的试剂。 
近期的进展促进了Fab′-SH片段从大肠杆菌的直接回收，该片段可经化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)描 述了完全人源化双特异抗体F(ab′)2分子的产生。每一Fab′片段分别从大肠杆菌中分泌出来，体外直接化学偶联形成双特异性抗体。如此制备的双特异性抗体能与过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞结合，还能引发人类细胞毒淋巴细胞对人乳腺肿瘤靶向的裂解活性。直接从重组细胞培养中制备并分离双特异性抗体片段的多种技术也已有描述。例如，可用亮氨酸拉链制备双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab′部分通过基因融合而连接。使抗体的同二聚体在铰链区被还原成单体，然后被再氧化形成抗体的异二聚体。该方法也可用于制备抗体同二聚体。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)所述的“双抗体(diabody)”技术提供了另一种制备双特异性抗体片段的方法。所述片段中含有VH，其通过接头与VL相连，该接头非常短，使得同一链的两个结构域之间无法配对。因此，同一片段上的VH和VL结构域被迫与另一片段上的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。此外还报道了另一种用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体的策略。见Gruber等，J.Immunol.，152：5368(1994)。 
本发明还涉及二价以上的抗体。例如可制备三特异抗体。Tutt等J.Immunol.147：60(1991)。 
6.异源偶联抗体
异源偶联抗体也在本发明的范围内。异源偶联抗体由两个共价连接的抗体组成。例如，已经计划使这种抗体将免疫***细胞靶向到不需要的细胞上[美国专利No.4,676,980]和将其用于治疗HIV感染[WO 91/00360；WO92/200373；EP 03089]。打算利用合成蛋白化学作用，包括那些涉及交联剂的合成蛋白化学作用中的已知方法在体外制备该抗体。例如，可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键构建免疫毒素。实现这一目的的适当的试剂实例包括亚氨基硫醇盐(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸酯(methyl-4-mercapto butyrimidate)，以及如美国专利No.4,676,980中公开的那些试剂。 
7.多价抗体
多价抗体比二价抗体更容易被表达与该抗体结合的抗原的细胞内化(和/或异化)。本发明的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价 抗体(例如四价抗体)(它们不是IgM类)，通过使编码所述抗体多肽链的核酸重组表达可轻易制备该抗体。多价抗体可以包含二聚体化结构域和三个或更多个抗原结合位点。优选的二聚体化结构域包括Fc区或铰链区，或由它们组成。在本文中，抗体包含Fc区和三个或更多个位于Fc区氨基端的抗原结合位点。优选的多价抗体在此包括三到约八个抗原结合位点，或由它们组成，但优选四个抗原结合位点。多价抗体包括至少一条多肽链(并优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变区。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变区，VD2是第二可变区，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，n是0或1。例如，多肽链可包括VH-CH1-柔韧接头(flexible linker)-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体优选进一步包含至少两个(优选四个)轻链可变区多肽。例如本文的多价抗体可包含从约两个到约八个轻链可变区多肽。本文的轻链可变区多肽包含轻链可变区以及可选地进一步包含CL结构域。 
8.效应器功能改造
修饰本发明抗体的效应器功能可能是合乎需要的，例如，可以增强抗体的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)。通过在抗体的Fc区***一个或多个氨基酸替换可以实现这一点。或者或另外可以在Fc区引入半胱氨酸残基，从而允许在该区域内形成链间二硫键。因此产生的同型二聚体抗体可能具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron et al.，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。也可以依照Wolff et al.，Cancer Research 53：2560-2565(1993)中的描述利用异双功能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚体抗体。或者，可以通过工程改造使抗体具有双Fc区，从而使该抗体具有增强的补体溶解作用和ADCC能力。参见Stevenson et al.，Anti-Cancer Drug Design3：219-230(1989)。为了增加抗体的血清半衰期，可以依照，例如美国专利5,739,277中的描述将补救受体结合表位掺入抗体中(特别是抗体片段中)。这里使用的术语″补救受体结合表位″指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3 或IgG4)的Fc区负责增加IgG分子体内血清半衰期的表位。 
9.免疫偶联物
本发明也涉及包含连接到细胞毒剂，例如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的具有酶活性的毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)上的抗体的免疫偶联物或抗体药物偶联物(ADC)。 
抗体-药物偶联物在癌症治疗中用于局部投递细胞毒剂或抑制细胞试剂(即用于杀死或抑制肿瘤细胞的药物)的用途(Syrigos and Epenetos，Anticancer Research 19：605-614(1999)；Niculescu-Duvaz and Springer，Adv.Drg.Del.Rev.26：151-172(1997)；美国专利4,975,278)理论上能将药物部分靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而***施用这些未经偶联的药物制剂可能对试图消除的肿瘤细胞以及对正常细胞导致不可接受的毒性水平(Baldwin et al.，Lancet 603-05(1986年5月15日)；Thorpe，“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，在《MonoclonalAntibodies′84：Biological And Clinical Applications》中，A.Pinchera等人编，第475-506页，1985)。由此试图获得最大功效及最小毒性。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报道可用于这些策略(Rowland et al.，Cancer Immunol.Immunother.21：183-87(1986))。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)(Rowland et al.，1986，见上文)。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler et al.，Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581(2000)；Mandler et al.，Bioorganic&Med.Chem.Letters 10：1025-1028(2000)；Mandler et al.，Bioconjugate Chem.13：786-791(2002))、美登木素生物碱类(EP 1391213；Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996))、和加利车霉素(calicheamicin)(Lode et al.，Cancer Res.58：2928(1998)；Hinman et al.，Cancer Res.53：3336-3342(1993))。所述毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其毒害细胞和抑制细胞的效果。有些细胞毒药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联时趋于失活或活性降低。 
Figure G05831687420070322D000361
(ibritumomab tiuxetan，Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1κ单克隆抗体与通过硫脲接头-螯合剂所结合的111In或90Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶 联物(Wiseman et al.，Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77(2000)；Wiseman et al.，Blood 99(12)：4336-42(2002)；Witzig et al.，J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63(2002)；Witzig et al.，J.Clin.Oncol.20(15)：3262-69(2002))。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且长时间的血细胞减少。MYLOTARGTM(gemtuzumabozogamicin，Wyeth Pharmaceuticals)，即由人CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future 25(7)：686(2000)；美国专利4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。Cantuzumabmertansine(Immunogen Inc.)，即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱药物部分DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于治疗表达CanAg的癌症诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期试验。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL Biologics，Immunogen Inc.)，即由抗***特异膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物部分DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于***肿瘤潜在治疗的开发。将多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物auristatin肽、auristatin E(AE)和单甲基auristatin(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96(对癌上的Lewis Y特异)和cAC10(对恶性血液肿瘤上的CD30特异)偶联(Doronina et al.，NatureBiotechnology 21(7)：778-784(2003))，且正在进行治疗性开发。 
上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸 酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitettaet al.，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。 
本文还设想了抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065及这些毒素具有毒素活性的片段的偶联物。 
美登素和美登木素生物碱类
在一个实施方案中，本发明的抗体(全长或片段)与一个或多个美登木素生物碱分子偶联。 
美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝***抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533，明确将其公开内容收入本文作为参考。 
美登木素生物碱-抗体偶联物
在改进其治疗指数的尝试中，已经将美登素和美登木素生物碱类与特异结合肿瘤细胞抗原的抗体偶联。例如下列专利公开了包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其治疗用途：美国专利5,208,020；5,416,064；及欧洲专利EP 0425235B1，明确将其公开内容收入本文作为参考。Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992) 记载了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3×105个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药物相似的一定程度的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低***性细胞毒性。 
抗体-美登木素生物碱偶联物(免疫偶联物)
抗体-美登木素生物碱偶联物可通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。 
本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利5,208,020或欧洲专利0425235B1及Chari et al.，CancerResearch 52：127-131(1992)中所公开的。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的，优选二硫化物和硫醚基团。 
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson et al。Biochem.J.173：723-737(1978))和N-琥珀酰亚 氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键连接。 
根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成键连接。 
加利车霉素
另一种感兴趣的免疫偶联物包含与一个或多个加利车霉素分子偶联的抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；5,877,296(都授予美国Cyanamid公司)。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG和θI 1(Hinman et al.，Cancer Research 53：3336-3342(1993)；Lode et al.，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可与抗体缀合的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效果。 
其它细胞毒剂
可与本发明抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利5,053,394、5,770,710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利5,877,296)。 
可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素 (enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。 
本发明还设想了抗体和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。 
为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时，可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Tc99m或I123，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。 
可以已知方式将放射性或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用牵涉例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc99m或I123、Re186、Re188和In111。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Frakeret al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57(1978))可用于掺入碘-123。《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》(Chatal，CRC Press，1989)详细记载了其它方法。 
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利5,208,020)。 
本发明的化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的ADC：商品化(如购自Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMB S、sulfo-KMUS、sulfo-MB S、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。见2003-2004年度应用手册和产品目录(ApplicationsHandbook and Catalog)第467-498页。 
抗体-药物偶联物的制备
在本发明的抗体-药物偶联物(ADC)中，将抗体(Ab)经接头(L)与一个或多个药物部分(D)缀合，例如每个抗体偶联约1个至约20个药物部分。可采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成Ab-L，随后与药物部分D反应；和(2)药物部分的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成D-L，随后与抗体的亲核基团反应。 
Ab-(L-D)p    I 
抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端氨基；(ii)侧链氨基，如赖氨酸；(iii)侧链巯基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、巯基、和羟基是亲核的，能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)处理使抗体具有与接头试剂缀合的反应活性。每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)的反应，导致胺转变为硫醇，从而将额外亲核基团引入抗体。 
还可通过修饰抗体来生成本发明的抗体-药物偶联物，即引入可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子部分。可用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物部分的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的键，或者可用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰(醛和 酮)基团，它可与药物上的适宜基团反应(Hermanson，BioconjugateTechniques)。在另一个实施方案中，包含N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan&Stroh，Bioconjugate Chem.3：138-146(1992)；US 5362852)。此类醛可与药物部分或接头亲核体反应。 
同样，药物部分上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。 
或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码偶联物两个部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。 
在又一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲和素)偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(如放射性核苷酸)偶联的“配体”(如亲合素)。 
10.免疫脂质体
这里公开的抗体也可以配制成免疫脂质体。″脂质体″是由各种脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的对递送药物到哺乳动物有用的小囊泡。脂质体的成分通常以与生物膜的脂质排列相似的双层形式排列。本领域的已知方法已经制备出包含抗体的脂质体，例如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：3688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；美国专利Nos.4,485,045和544,545；1997年19月23日公开的WO97/38731中描述的方法。美国专利No.5,013,556中公开了循环时间增强的脂质体。 
特别有用的脂质体可以通过反相蒸发法，用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物来制备。通过挤压脂质体通过具有限定孔径大小的过滤器来产生具有想要直径大小的脂质体。可以依照Martin et al.，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中的描述通过二硫化物交换反应将本发明的抗体的Fab’片段结合到脂质体上。化疗剂任选包含在脂质体内部。参见Gabizon et al.，J.National Cancer Inst.81(19)：1484 (1989)。 
B.结合寡肽
本发明的结合寡肽是结合，优选特异性结合肝丝酶、HGF和/或这里描述的肝丝酶：HGF复合物的寡肽。可以使用已知的寡肽合成方法化学合成结合寡肽，或者可以使用重组技术来制备和纯化寡肽。结合寡肽长度通常是至少大约5个、或者至少大约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸或更多氨基酸，其中这种寡肽能结合，优选特异性结合这里描述的多肽。使用众所周知的技术，不需要进行过度实验就可以鉴定出结合寡肽。在这方面，已经注意到筛选寡肽库以选择能特异性结合多肽靶的技术在本领域为大家所熟知(例如，参见美国专利Nos.5,556,762、5,750,373、4,708,871、4,833,092、5,223,409、5,403,484、5,571,689、5,663,143；PCT公开Nos.WO 84/03506和WO84/03564；Geysenet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81：3998-4002(1984)；Geysen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：178-182(1985)；Geysen et al.，in Synthetic Peptidesas Antigens，130-149(1986)；Geysen et al.，J.Immunol.Meth.，102：259-274(1987)；Schoofs et al.，J.Immunol.，140：611-616(1988)，Cwirla，S.E.et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6378；Lowman，H.B.et al.(1991) Biochemistry，30：10832；Clackson，T.et al.(1991)Nature，352：624；Marks，J.D.et al.(1991)，J.Mol.Biol.，222：581；Kang，A.S.et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8363和Smith，G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.，2：668)。 
在这方面，噬菌体(噬菌粒)展示是允许筛选大的寡肽库以鉴定那些库中能特异结合多肽靶的成员的一个众所周知的技术。噬菌体展示是变体多肽作为外壳蛋白的融合蛋白质显示在噬菌体颗粒表面上的技术(Scott，J.K.and Smith，G.P.(1990)Science，249：386)。应用噬菌体展示在于从选择性随机化的蛋白质变体(或随机克隆的cDNAs)的大容量库中能够快速和高效 地选出以高亲合性结合靶分子的那些序列的事实。噬菌体上的肽(Cwirla，S.E.et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6378)或蛋白质(Lowman，H.B.et al.(1991)Biochemistry，30：10832；Clackson，T.et al.(1991)Nature，352：624；Marks，J.D.et al.(1991)，J.Mol.Biol.，222：581；Kang，A.S.et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8363)展示库已经被用来从几百万的多肽或寡肽中筛选具有特异性结合特性的多肽或寡肽(Smith，G.P.(1991)CurrentOpin.Biotechnol.，2：668)。分选随机突变体的噬菌体库需要构建和扩增许多变体的策略，使用靶受体进行亲合纯化的方法和评估结合富集结果的方式。美国专利Nos.5,223,409、5,403,484、5,571,689和5,663,143。 
虽然大多数噬菌体展示方法已经使用丝状噬菌体，但是λ噬菌体展示***(WO95/34683；美国5,627,024)、T4噬菌体展示***(Ren et al.，Gene，215：439(1998)；Zhu et al.，Cancer Research，58(15)：3209-3214(1998)；Jiang etal.，Infection&Immunity，65(11)：4770-4777(1997)；Ren et al.，Gene，195(2)：303-311(1997)；Ren，Protein Sci.，5：1833(1996)；Efimov et al.，VirusGenes，10：173(1995)和T7噬菌体展示***(Smith and Scott，Methods inEnzymology，217：228-257(1993)；U.S.5,766,905)也是已知的。 
对基本噬菌体展示已经有了许多其它的改进和变化。这些改进增强了展示***从肽库中筛选结合选定目标分子的能力，并且增强了展示功能蛋白的能力，所述功能蛋白具有筛选想要特性的那些蛋白质的潜能。已经研发出进行噬菌体展示反应的组合反应装置(WO98/14277)，也已经使用噬菌体展示库来分析和控制双分子的相互作用(WO98/20169；98/20159)和受到限制的螺旋肽的特性(WO8/20036)。WO 97/35196描述了分离亲合性配体的方法，其中噬菌体展示库接触第一溶液和第二溶液以选择性地分离结合的配体，在所述第一溶液中，配体将结合靶分子；在所述第二溶液中，所述亲合性配体。WO 97/46251描述了用亲合纯化的抗体生物淘洗(biopanning)随机噬菌体展示库，然后分离结合的噬菌体，接下来使用微量滴定板的各孔通过微淘洗过程分离高亲合力结合的噬菌体的方法。也已经报道使用金黄色葡萄球菌蛋白质A作为亲合标记的方法(Li et al.(1998)MolBiotech.，9：187)。WO97/47314描述了底物扣减库(substrate substractionlibraries)使用可能是噬菌体展示库的组合库判别酶特异性的用途。WO97/09446中描述了利用噬菌体展示选择适合在去污剂中使用的酶的方法。 
在美国专利5,498,538、5,432,018和WO 98/15833中描述了另外的选择特异性结合蛋白的方法。 
在美国专利5,723,286、5,432,018、5,580,717、5,427,908、5,498,530、5,770,434、5,734,018、5,698,426、5,763,192和5,723,323中也公开了产生肽库和筛选这些库的方法。 
C.结合小分子
结合性小分子优选是除这里限定的结合，优选特异性结合肝丝酶、HGF和/或这里限定的肝丝酶：HGF复合物的寡肽或抗体以外的有机分子。利用已知方法可以鉴定和化学合成结合性有机小分子(参见，例如，PCT公开号WO00/00823和WO00/39585)。结合性有机小分子的大小通常小于大约2000道尔顿，或者小于大约1500、750、500、250或200道尔顿，其中利用众所周知的技术不需要过度实验就可以鉴定能结合，优选特异性结合这里描述的多肽的这种有机小分子。在这方面，已经注意到筛选有机小分子库以选择能结合多肽靶的技术在本领域为大家所熟知(参见，例如，PCT公开号WO00/00823和WO00/39585)。结合性有机小分子可以是，例如：醛类、酮类、肟类、腙类、半卡巴腙类、卡巴肼类、伯胺类、仲胺类、叔胺类、N-取代的肼类、酰肼类、醇类、醚类、硫醇类、硫醚类、二硫化物、羧酸类、酯类、酰胺类、脲类、氨基甲酸酯类、碳酸酯类、酮缩醇类、硫代酮缩醇类、乙缩醛类、硫代乙缩醛类、芳基卤、磺酸芳基酯类、烷基卤、磺酸烷基酯类、芳族化合物、杂环化合物、苯胺类、烯烃类、炔烃类、二醇类、氨基醇类、噁唑烷类、噁唑啉类、噻唑烷类、噻唑啉类、烯胺类、磺酰胺类、环氧化物、氮丙啶类、异氰酸酯类、磺酰氯类、重氮化合物、酰基氯类等等。 
D.筛选具有想要特性的抗体、结合寡肽和结合小分子
产生本发明的抗体、寡肽和小分子的技术已经如上所述。可以更进一步地依照要求选择具有某些生物学特性的抗体、寡肽或其它小分子。 
可以通过本领域已知的方法，例如使用内源性表达肝丝酶和/或前HGF的细胞，或用各自的基因转染后表达肝丝酶和/或前HGF的细胞评价本发明的抗体、寡肽或其它小分子的生长抑制效果。例如，可以用各种不同浓度 的本发明的单克隆抗体、寡肽或其它小分子处理适当的肿瘤细胞系和肝丝酶和/或HGF多肽转染的细胞几天(例如，2-7天)，用结晶紫或者MTT进行染色，或者通过其它的比色测定进行分析。另一个测量增殖的方法可以通过比较存在或不存在本发明的抗体、结合寡肽或结合小分子时处理的细胞对3H胸腺密啶核苷的吸收情况进行。处理后，收获细胞，在闪烁计数器中测定掺入DNA中的放射性的量。适当的阳性对照包括用已知的抑制细胞系生长的生长抑制性抗体处理选择的那种细胞系。肿瘤细胞体内的生长抑制可以通过本领域已知的多种方式确定。肿瘤细胞可以是过表达肝丝酶和/或前HGF多肽的肿瘤细胞。与未处理的肿瘤细胞相比，抗体、结合寡肽或结合性有机小分子在体内或体外抑制表达肝丝酶和/或HGF的肿瘤细胞大约25-100％，更优选大约30-100％，甚至更优选大约50-100％或70-100％的细胞增殖，在一个实施方案中，抗体浓度是大约0.5-30μg/ml。在细胞培养中可以以大约0.5-30μg/ml或大约0.5nM-200nM的抗体浓度测量生长抑制，其中在让肿瘤细胞接触抗体后的1-10天确定生长抑制。如果施用大约1μg/kg至大约100mg/kg体重的抗体会导致从第一次施用抗体起的大约5天到3个月内，优选大约5天到30天内肿瘤体积变小或肿瘤细胞增殖降低，那么抗体在体内就是抑制生长的。 
为了选择导致细胞死亡的抗体、结合寡肽或结合性有机小分子，可以相对于对照评价，例如碘化丙锭(PI)、台盼蓝或7AAD吸收指示的膜完整性的丧失。在缺少补体和免疫效应细胞时可以实施PI吸收测定。表达肝丝酶和/或前HGF多肽的肿瘤细胞单独与培养基或包含适当抗体、结合寡肽或结合性有机小分子(例如大约10μg/ml)的培养基一起孵育。孵育细胞3天时间。在处理每个细胞后，洗涤细胞并将细胞等分到35毫米滤网加帽的12×75的管中(每管1ml，每个处理组3管)以除去细胞团。然后让管接受PI(10μg/毫升)。可以利用 
Figure G05831687420070322D000471
流式细胞仪和 
Figure G05831687420070322D000472
CellQuest软件(Becton Dickinson)分析样品。选择通过PI吸收确定的诱导统计学上显著水平的细胞死亡的那些抗体、结合寡肽或结合性有机小分子作为诱导细胞死亡的抗体、结合寡肽或结合性有机小分子。 
为了筛选与目的抗体结合的多肽上的表位的结合的抗体，寡肽或其它有机小分子，可以进行常规的交叉封闭测定，例如Antibodies，ALaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)中描 述的测定。该测定可用于确定试验抗体、寡肽或其它有机小分子是否与已知的抗体结合相同的位点或表位。或者或另外通过本领域已知的方法进行表位作图。例如，可以通过丙氨酸扫描诱变处理抗体序列以鉴定接触的残基。最初测试突变抗体与多克隆抗体的结合以保证适当的折叠。在不同的方法中，对应于多肽不同区域的肽可用于测试抗体或具有已表征表位或已知表位的测试抗体和抗体的竞争测定中。 
E.抗体依赖的酶介导的前体药物治疗(ADEPT)
本发明的抗体还可以用于ADEPT，通过使该抗体与将前体药物(例如肽基化疗剂，参见WO81/01145)转化成活性抗癌药的前体药物活化酶偶联来进行。例如，参见WO 88/07378和美国专利US4,975,278。 
用于ADEPT的免疫偶联物的酶成分包括能够对前体药物起作用的任意酶，按照这类方式以便将所述的前体药物转化成其更具活性的细胞毒性形式。 
用于本发明方法的酶包括，但不限于：用于将含有磷酸盐的前体药物转化成游离药物的碱性磷酸酶；用于将含有硫酸盐的前体药物转化成游离药物的芳香基硫酸酯酶；用于将无毒性的5-氟胞嘧啶转化成抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；用于将含肽的前体药物转化成游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌属(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；用于转化含有D-氨基酸取代基的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；用于将糖基化前体药物转化成游离药物的碳水化合物裂解酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；用于将用β-内酰胺类衍生的药物转化成游离药物的β-内酰胺酶；和用于将用苯氧基乙酰基或苯基乙酰基在胺氮上衍生的药物分别转化成游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，具有酶活性的抗体，在本领域中也称作″抗体酶″可以用于将本发明的前体药物转化成游离活性药物(例如，参见Massey，Nature 328：457-458(1987))。可以如本文所述制备用于将抗体酶递送至肿瘤细胞群的抗体-抗体酶偶联物。 
通过本领域众所周知的技术，例如通过利用上述讨论的异双官能团交联试剂，可以将本发明的酶共价结合到抗体上。或者，可以使用本领域众所周知的重组DNA技术构建融合蛋白，它们包括本发明抗体的至少抗原结 合区和与其连接的本发明酶的至少功能活性部分(参见，例如Neuberger etal.，Nature 312：604-608(1984))。 
F.抗体变体
除这里描述的抗体之外，可以考虑制备抗体变体(变体)。通过导入适当的核苷酸变化到编码DNA中，和/或通过合成想要的抗体可以制备抗体变体。本领域熟练技术人员理解所述氨基酸变化可以改变抗体的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数目或位置，或者改变膜锚定特性。 
例如，可以利用美国专利5,364,934中列出的保守和非保守突变的任何技术和准则在这里描述的抗体中产生变异。变异可以是编码抗体的一个或多个密码子的替换、缺失或***，其中替换、缺失或***导致氨基酸序列与天然序列的抗体或多肽相比发生了变化。变异任选可以是用抗体一个或多个域中的任何其它氨基酸替换至少一个氨基酸。通过将抗体序列与同源已知蛋白质分子比较，并使高度同源区域中发生的氨基酸序列变化的数目最小化可以得到确定哪个氨基酸残基可以在对想要的活性没有不利影响的情况下被***、替换或删除方面的启示。氨基酸替换可以是另一个具有相似结构和/或化学性能的氨基酸替换一个氨基酸的结果，例如用丝氨酸替换苏氨酸，即保守氨基酸替换。***或缺失可以任选发生在约1-5个氨基酸的范围内。通过***地在序列中制造氨基酸***、缺失或替换并测试所产生的变体的由亲代序列显示的活性，可以确定允许的变异。 
本文提供了抗体和多肽片段。例如，和全长天然抗体或蛋白质相比，这种片段可以在N末端或C末端被截短，或者可以缺少内部的残基。某些片段缺少维持抗体或多肽目的生物活性的非必需氨基酸残基。 
可以通过许多传统方法中的任何方法来制备抗体和多肽片段。可以化学合成想要的肽片段。一个替换方法涉及通过酶消化，例如用已知的在特殊氨基酸残基限定的位点切割蛋白质的酶处理蛋白质，或者通过用适当的限制性内切酶消化DNA和分离想要的片段来产生抗体或多肽片段。但另一个适用技术涉及分离和通过聚合酶链反应(PCR)扩增编码想要的抗体或多肽片段的DNA片段。PCR时，在5’和3’引物中使用限定出DNA片段想要的末端的寡核苷酸。抗体和多肽片段优选与本文公开的天然抗体或多肽共用至少一种生物学和/或免疫活性。 
在具体实施方案中，感兴趣的保守替换显示在下表中优选替换这一标题下。如果这种替换导致生物活性发生变化，那么导入该表中替换举例标题下的更实质性的变化，或者更进一步地导入在下文中描述的与氨基酸类别有关的变化，并筛选产物。 
  原始残基   替换举例   优选替换
  Ala(A)   Val；Leu；Ile   Val
  Arg(R)   Lys；Gln；Asn   Lys
  Asn(N)   Gln；His；Asp，Lys；Arg   Gln
  Asp(D)   Glu；Asn   Glu
  Cys(C)   Ser；Ala   Ser
  Gln(Q)   Asn；Glu   Asn
  Glu(E)   Asp；Gln   Asp
  Gly(G)   Ala   Ala
  His(H)   Asn；Gln；Lys；Arg   Arg
  Ile(I)   Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸   Leu
  Leu(L)   正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe   Ile
  Lys(K)   Arg；Gln；Asn   Arg
  Met(M)   Leu；Phe；Ile   Leu
  Phe(F)   Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr   Tyr
  Pro(P)   Ala   Ala
  Ser(S)   Thr   Thr
  Thr(T)   Val；Ser   Ser
  Trp(W)   Tyr；Phe   Tyr
  Tyr(Y)   Trp；Phe；Thr；Ser   Phe
  Val(V)   Ile；Leu；Met；Phe；Ala；Norleucine   Leu
对抗体的生物学特性的实质性修改可通过选择取代来完成，所述取代的效应在维持(a)取代区多肽框架的结构，例如片层结构或螺旋构象，(b)该分子靶位点的电荷或疏水性，(c)侧链的大小这几方面有显著差异。天然残基根据共有的侧链特性可分为： 
(1)疏水性：正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸 
(2)中性亲水：半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸 
(3)酸性：天冬氨酸，谷氨酸 
(4)碱性：天冬酰胺，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，精氨酸 
(5)影响侧链定向的残基：甘氨酸，脯氨酸，和 
(6)芳香族：色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。 
非保守取代将限定上述某一类的成员被另一类取代。这种替换的残基也可以被引入保守替换位点中，或者更优选地被引入剩余的(非保守)位点中。 
利用本领域已知的方法，例如寡核苷酸介导(定点)的诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变可以产生变异。可以在克隆的DNA上实行定点诱变[Carteret al.，Nucl.Acids Res.，13：4331(1986)；Zoller et al.，Nucl.Acids Res.，10：6487(1987)]、盒式诱变[Wells et al.，Gene，34：315(1985)]、限制选择诱变[Wells etal.，Philos.Trans.R.Soc.London SerA，317：415(1986)]或其它已知的技术，以产生抗体或多肽变体DNA。 
还可以使用扫描氨基酸分析鉴定沿着连续序列的一个或多个氨基酸。在扫描氨基酸之中优选的是相对小的中性氨基酸。这样的氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。典型地，丙氨酸是这些基团中优选的扫描氨基酸，因为它消除了β碳以外的侧链，而且很少会改变变体的主链构象[Cunningham and Wells，Science，244：1081-1085(1989)]。典型地，丙氨酸也是优选的，因为它是最常见的氨基酸。更进一步地，经常会在埋藏的位点和暴露的位点发现它[Creighton，The Proteins，(W.H.Freeman&Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，150：1(1976)]。如果丙氨酸替换不产生足量的变体，可以使用等构氨基酸。 
通常，也可以用丝氨酸替换不参与保持抗体或多肽合适构象的任何半胱氨酸残基以改善分子的抗氧化性和防止发生异常交联。相反，可以添加半胱氨酸键到抗体或多肽中以改善它的稳定性(特别是，当抗体是抗体片段，例如Fv片段时)。 
取代变体的特别优选类型包括取代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体高变区的一或多个残基。通常，所选用于进一步开发的所得变体相对于其所来源的亲本抗体应具有改进的生物学活性。产生这种取代变体的一个方便方法是利用了噬菌体展示的亲和力成熟。简单地说，使高变区的几个位点(如6-7个位点)突变以便在每一位点产生所有可能的氨基酸取代。这样产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，其为与每个颗粒内包装的M13基因III产物的融合体。然后筛选噬菌体展示的变体是否具有本文所述生物学活性(如结合亲和力)。为了鉴定备选的高变区修饰位点，可通 过丙氨酸扫描诱变来鉴定对抗原结合作出主要贡献的高变区残基。或者或此外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以确定抗原多肽与抗体之间的接触点也较有利。这些接触残基及邻近残基是根据本文所述技术进行取代的候选位点。一旦产生这样的变体，如本文所述对它们全部进行筛选，选出在一或多个相关实验中具有良好特性的抗体以便进一步开发。 
利用本领域已知的多种方法可以制备编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括，但不局限于从天然来源分离(在存在天然发生的氨基酸序列变体的情况下)、或者通过寡核苷酸介导(或定位)诱变、PCR诱变和盒式诱变以前制备的抗体变体或抗体的非变体型式来制备。 
G.抗体和多肽的修饰
抗体和多肽的共价修饰包括在本发明的范围内。一种共价修饰包括使抗体或多肽的靶氨基酸残基与有机衍生剂反应，其中有机衍生剂能与选择的抗体或多肽的侧链或N或C末端残基反应。用双功能试剂进行的衍生作用是有用的，例如，可以将抗体或多肽交联到纯化抗体方法中使用的不溶于水的支持基质或表面上，反之亦然。通常使用的交联剂包括，例如，1，1-双(重氮基乙酰基)-2-苯乙烷；戊二醛；N-羟基琥珀酰亚胺酯类，例如，与4-叠氮基水杨酸的酯类；同双官能亚氨基酯类，包括二琥珀酰亚胺基酯类，诸如3，3′-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)；双官能马来酰亚胺类，诸如双-N-马来酰亚氨基-1，8-辛烷；和诸如甲基-3-[(对-叠氮基苯基)二硫代]丙酰亚氨酸酯类。 
其它修饰包括分别使谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰基脱酰胺成相应的谷氨酰基和天冬氨酰残基；使脯氨酸和赖氨酸羟化；使丝氨酰基或苏氨酰基残基磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基甲基化[T.E.Creighton， Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，SanFrancisco，pp.79-86(1983)]；N-末端胺的乙酰化；和任意C-末端羧基的酰胺化。 
包含在本发明范围内的抗体或多肽的另一种共价修饰包括改变抗体或多肽的天然糖基化模式。为实现这里描述的目的设计″改变天然糖基化模式″指删除在天然序列抗体或多肽中发现的一个或多个糖部分(通过化学和/或酶方法除去潜在的糖基化位点或删除糖基化)和/或添加一个或多个在天然 序列抗体或多肽中不存在的糖基化位点。另外，该短语包括涉及存在的不同糖部分的性质和比例变化的天然蛋白质糖基化中的质变。 
抗体及其它多肽的糖基化典型地是N-连接或O-连接。N-连接指碳水化物部分附着到天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是酶催化碳水化物部分附着到天冬酰胺侧链上的识别顺序，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，多肽中存在这些三肽序列中的任何一个就可以产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一个附着到羟氨基酸上，虽然也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟基赖氨酸，但通常大多数附着到丝氨酸或苏氨酸上。 
通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述的三肽序列(适合于N-连接糖基化位点)可以方便地添加糖基化位点到抗体或多肽上。也可以通过添加或替换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基到原有抗体或多肽序列上来实施改变(适合于O-连接糖基化位点)。通过DNA水平的变化，特别是通过突变编码抗体或多肽的DNA的预选碱基以产生翻译成想要氨基酸的密码子，可以任选改变抗体或多肽的氨基酸序列。 
另一个增加抗体或多肽上糖部分数目的方式是通过化学偶联或酶催化偶联糖苷到多肽上。本领域已经描述这种方法，例如在1987年9月月11日公开的WO 87/05330和Aplin and Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)中已经描述该方法。 
可以用化学方法或酶方法，或者通过突变替换编码作为糖基化靶的氨基酸残基的密码子完成除去存在于抗体或多肽上的糖部分的过程。化学方法去糖基化技术本领域已经已知，例如在Hakimuddin，et al.，Arch.Biochem.Biophys.，259：52(1987)和Edge et al.，Anal.Biochem.，118：131(1981)中已描述。通过利用Thotakura et al.，Meth.Enzymol.，138：350(1987)描述的多种内-和外糖苷酶可以实现用酶从多肽上切割糖部分。 
抗体或多肽的另一种共价修饰包括以美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中列出的方式，连接抗体或多肽到多种非蛋白质聚合物中的一种上，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯上。例如，还可以在通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶-微囊和聚-(甲基甲基丙烯酸酯)微囊)中，在胶体递药***(例如，脂质体、清蛋白微球、微乳、纳米粒和纳米囊)中或在 粗乳状液中俘获抗体或多肽。Remington′s Pharmaceutical Sciences，16thedition，Oslo，A.，Ed.，(1980)中公开了这种技术。 
以形成包含融合到另一个异源多肽或氨基酸序列上的抗体或多肽的嵌合分子的方式也可以修饰本发明的抗体或多肽。 
在一个实施方案中，这种嵌合分子包含抗体或多肽与标记多肽的融合物，其中标记多肽(tag polypeptide)提供了抗标记抗体可以选择性结合的表位。表位标记通常位于抗体或多肽的氨基或羧基末端。利用针对标记多肽的抗体可以检测抗体或多肽的这种表位标记形式的存在。提供表位标记也使抗体或多肽能通过使用抗标记抗体或另一种结合表位标记的亲合基质很容易地纯化出来。各种不同的标记多肽和它们各自的抗体在本领域为大家所熟知。实例包括聚组氨酸(poly-his)或聚-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标记；flu HA标记多肽和它的抗体12CA5[Field et al.，Mol.Cell.Biol.，8：2159-2165(1988)]；c-myc标记以及其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体[Evan et al.，Molecular and Cellular Biology，5：3610-3616(1985)]；和单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标记和它的抗体[Paborsky et al.，Protein Engineering，3(6)：547-553(1990)]。其它的标记多肽包括该Flag肽[Hopp et al.，BioTechnology，6：1204-1210(1988)]；KT3表位肽[Martin et al.，Science，255：192-194(1992)]；α微管蛋白表位肽[Skinner et al.，J.Biol.Chem.，266：15163-15166(1991)]；和T7基因10蛋白质肽标记[Lutz-Freyermuth et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6393-6397(1990)]。 
在替换的实施方案中，嵌合分子可以包含抗体或多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白的特殊区域的融合物。为了得到二价形式的嵌合分子(也称为″免疫粘附素″)，这种融合可以是与IgG分子的Fc区域的融合。Ig融合优选包括抗体或多肽的可溶性形式(跨膜域被删除或失活)代替Ig分子内的至少一个可变区的替换。在特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合包括IgG1分子的铰链、CH2和CH3，或者铰链、CH1、CH2和CH3区域。产生免疫球蛋白融合物的方法可以参见1995年6月27日授权的美国专利No.5,428,130。 
H.抗体和多肽的制备
下面的描述主要涉及通过培养用包含抗体和多肽的编码核酸的载体转化或转染的细胞生产抗体和多肽的过程。当然，可以考虑用本领域为大家 所熟知的替换方法来制备抗体和多肽。例如，可以通过使用固相技术的直接肽合成来产生适当的氨基酸序列或其部分[参见，例如Stewart et al.，Solid-Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154(1963)]。生物体外蛋白质合成可以采用人工技术或自动化方式实行。例如，利用制造商的说明，使用适用的生物***肽合成器(Applied Biosystems Peptide Synthesizer)(Foster City，CA)可以完成自动化合成。可以以化学方法分别合成抗体或多肽的各个部分，然后利用化学方法或酶法组合各个部分产生想要的抗体或多肽。 
1.编码抗体或多肽的DNA的分离
可以从cDNA库中获得编码抗体或多肽的DNA，其中cDNA库是从认为具有抗体或多肽mRNA并以可检测水平表达抗体或多肽的组织中制备的。因此，人抗体或多肽DNA可以方便地获自从人组织制备的cDNA库。也可以从基因组库或通过已知的合成过程(例如自动化核酸合成)获得抗体或多肽编码基因。 
可以用设计的鉴定目的基因或目的基因编码的蛋白质的探针(例如，至少大约20-80个碱基)来筛选库。可以利用标准程序，例如，Sambrook etal.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中的描述来实施用选择的探针筛选cDNA或基因组库的过程。分离编码抗体或多肽基因的替换方式是使用PCR方法[上文Sambrook et al.，；Dieffenbach et al.，PCR Primer：A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press，1995)]。 
筛选cDNA库的技术在本领域为大家所熟知。选择作为探针的寡核苷酸序列应该具有足够长度，而且应该足够清楚以使假阳性降到最低。优选对寡核苷酸进行标记，这样当寡核苷酸与被筛选库中的DNA杂交时就可以检测到。标记方法在本领域为大家所熟知，包括使用放射性标记，像32P标记的ATP、生物素化或酶标记。在上文的Sambrook et al.中提供了杂交条件，包括中等严谨和高度严谨杂交条件。 
在这种库筛选法中鉴定的序列可以与储存在公众可获得的数据库，例如GenBank或其它私人序列数据库中的其它已知序列进行比较和比对。利用本领域已知的方法，依照这里的描述可以确定所述分子限定区域内或全长序列的序列同一性(在氨基酸或核苷酸水平)。 
利用这里首次公开的推断的氨基酸序列，通过筛选选择的cDNA或基因组库可以获得具有蛋白质编码序列的核酸，而且必要时，可以依照上文Sambrook et al.的描述利用常规的引物延伸方法检测可能已经逆转录成cDNA的mRNA的前体和加工中间体。 
2.宿主细胞的选择和转化
用这里描述的适合于生产抗体或多肽的表达或克隆载体转染或转化宿主细胞，并在修饰的适合诱导启动子、选择转化体或扩增编码目的序列的基因的常规营养培养基中进行培养。本领域熟练技术人员不需要过度实验就能够选择确定培养条件，例如培养基、温度、pH等等。通常，在MammalianCell Biotechnology：a Practical Approach，M.Butler，ed.(IRL Press，1991)和上文的Sambrook et al中能发现最大化细胞培养生产率的原则、操作规程和实用技术。 
真核细胞转染和原核细胞转化的方法为普通技术人员所知，例如可通过CaCl2、CaPO4、脂质体介导和电穿孔进行。可利用适合于这种细胞的标准技术实施转化，而这取决于使用的宿主细胞。上文Sambrook et al中描述的使用氯化钙的钙处理或电穿孔通常被用于原核生物。依照Shaw et al.，Gene，23：315(1983)和1989年6月9日公开的WO 89/05859中的描述可以用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染转化某些植物细胞。对于没有这种细胞壁的哺乳动物细胞，可以使用Graham and van der Eb，Virology，52：456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。美国专利No.4,399,216中已经描述哺乳动物细胞宿主***转染的一般情况。典型地，可以依照Van Solingen et al.，J.Bact.，130：946(1977)和Hsiao et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，76：3829(1979)的方法进行酵母转化。但是，也可以使用其它***DNA到细胞中的方法，例如核显微注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞的融合或多聚阳离子，例如聚凝胺(polybrene)、聚鸟氨酸。转化哺乳动物细胞的各种技术参见Keown et al.，Methods in Enzymology，185：527-537(1990)和Mansour etal.，Nature，336：348-352(1988)。 
克隆或表达载体中的DNA的适当的宿主细胞包括原核生物、酵母或更高级的真核生物细胞。适当的原核生物包括，但不局限于真细菌类，革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如，肠杆菌科，例如大肠杆菌。各种大肠杆菌菌株是公众可得到的，例如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)； 大肠杆菌X1776(ATCC31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC27,325)和K5772(ATCC53,635)。其它适当的原核生物宿主细胞包括肠杆菌科，例如埃希氏杆菌属，例如，大肠杆菌、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏杆菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属，例如，鼠伤寒沙门氏菌、沙雷氏菌属，例如，Serratia marcescans，志贺氏菌属，以及芽胞杆菌属，例如，枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌(1989年4月12日公开的DD 266,710中公开的地衣芽胞杆菌41P)、假单胞菌属，例如，铜绿假单胞菌和链霉菌属。这些实例是说明性的，而不是限制性的。菌株W3110是一个特别优选的宿主或亲代宿主，因为它是重组DNA产物发酵的常见宿主菌株。宿主细胞优选分泌最小量的蛋白水解酶。例如：可以修饰菌株W3110以在编码宿主内源蛋白质的基因中引起遗传突变，这种宿主的实例包括具有完全的基因型tonA的大肠杆菌W3110菌株1A2；具有完全基因型tonA ptr3的大肠杆菌W3110菌株9E4；具有完全基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kanr的大肠杆菌W3110菌株27C7(ATCC55,244)；具有完全基因型tonA ptr3 phoAE15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr的大肠杆菌W3110菌株37D6；大肠杆菌W3110菌株40B4是具有非卡那霉素抗性degP缺失突变的菌株37D6和1990年8月7日授权的美国专利4,946,783中公开的、具有突变的周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。或者，体外克隆方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反应也是适合的。 
可以在细菌中生产全长抗体、抗体片段和抗体融合蛋白质，特别是当不需要糖基化和Fc效应器功能时，例如当治疗的抗体结合到细胞毒剂(例如毒素)上，免疫偶联物本身显示出破坏肿瘤细胞的功效时更是如此。全长抗体在循环中具有更长的半衰期。在大肠杆菌中进行生产更快，而且成本效率更高。在细菌中表达抗体片段和多肽可以参见，例如描述了适合于优化表达和分泌的翻译起始区(TIR)和信号序列的美国专利5,648,237(Carter et.al)、美国专利5,789,199(Joly et al)和美国专利5,840,523(Simmonset al)，这些专利在此合并作为参考。表达后，从可溶级分中的大肠杆菌细胞糊分离抗体，而且可以通过，例如依据同种型选择的蛋白质A或G柱纯化抗体。可以按照与纯化，例如纯化CHO细胞中表达的抗体的过程相似的方式进行最后纯化。 
除原核生物外，真核微生物，例如丝状真菌或酵母是适合于抗体或多 肽编码载体的适当的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是通常使用的低等真核宿主微生物。其它的包括稷酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach and Nurse，Nature，290：140[1981]；1985年5月2日公开的EP 139,383)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主(美国专利4,943,529；Fleer et al.，Bio/Technology，9：968-975(1991))，例如乳克克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt et al.，J.Bacteriol.，154(2)：737-742[1983])、脆性克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克曼氏克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906；Van den Berg et al.，Bio/Technology，8：135(1990))、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维氏酵母(K.marxianus)；西洋蓍霉(yarrowia)(EP402,226)；巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)(EP183,070；Sreekrishna et al.，J.Basic Microbiol.，28：265-278[1988])；念珠菌属(Candida)；瑞氏木霉属(Trichoderma reesia)(EP244,234)；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)(Case et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：5259-5263[1979])；许旺氏酵母属(schwanniomyces)，例如西方许旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日公开的EP394,538)；丝状真菌，例如，链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、Tolypocladium(1991年1月10日公开的WO 91/00357)，曲霉属宿主，例如，构巢曲霉(A.nidulans)(Ballance et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，112：284-289[1983]；Tilburn et al.，Gene，26：205-221[1983]；Yelton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：1470-1474[1984]和黑曲霉(A.niger)(Kelly and Hynes，EMBO J.，4：475-479[1985])。甲基营养(methylotropic)酵母在本文中是合适的，包括但不限于能够在甲醇上生长的酵母，其选自汉逊氏酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克勒克氏酵母属(Kloeckera)、毕赤氏酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)和红酵母属(Rhodotorula)。属于这类酵母中典型的具体种类的实例可以在C.Anthony， The Biochemistry of Methylotrophs，269(1982)中找到。 
适合于表达糖基化抗体或多肽的适当的宿主细胞源自多细胞机体。无脊椎动物细胞的实例包括昆虫细胞，例如，果蝇S2和Spodoptera Sf9，以及植物细胞，例如棉花、玉米、马铃薯、大豆、牵牛花(petunia)、番茄(tomato) 和烟草的细胞培养物。已经鉴定许多杆状病毒(baculoviral)菌株和变体，以及来自宿主，例如草地夜蛾(Spodoptera Frugiperda，毛虫)、埃及伊蚊(Aedesaegypti，蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus，蚊子)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)的对应许可昆虫宿主细胞。公众可获得适合于转染的多种病毒株，例如，家蚕蛾NPV的加利福尼亚Y级夜蛾(Autographa california)NPV和Bm-5菌株的L-1变体，依照本发明，这种病毒可用作这里描述的病毒，特别适合于转染草地夜蛾细胞。 
但是在脊椎动物细胞中意义最大，而且在培养中繁殖脊椎动物细胞(组织培养)已经变成常规程序。有效哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293细胞或经过再克隆后能在悬浮培养物中生长的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977))；仓鼠幼鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：4216(1980))；小鼠足细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK ATCC CCL 34)；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝细胞癌细胞系(Hep G2)。 
用上述适合于生产抗体或多肽的表达或克隆载体转染或转化宿主细胞，并在修饰的适合诱导启动子、选择转化体或扩增编码目的序列的基因的常规营养培养基中进行培养。 
3.可复制载体的选择和使用 
可以将编码抗体或多肽的核酸(例如，cDNA或基因组DNA)***可复制的载体用于克隆(扩增DNA)或表达。公众可以获得各种载体。载体可以是，例如，质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体形式。可以通过多种方法将适当的核酸序列***载体中。通常利用本领域已知的技术将DNA***适当的限制性内切酶位点。载体组件通常包括，但不局限于一个或多个信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。可使用熟练技术人员已知的标准连接技术构建适当的包含这些组件 中的一个或多个的载体。 
不仅可以直接重组生产多肽，而且可以以与异源多肽的融合多肽形式来重组生产多肽，其中异源多肽可以是信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N末端具有特异切割位点的其它多肽。通常，信号序列可以是载体的一个组件，或者可以是***载体中的抗体或多肽编码DNA的一部分。信号序列可以是，例如，选自碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II引导部分的原核生物信号序列。适合于酵母分泌的信号序列可以是，例如，酵母转化酶引导序列、α因子引导序列(包括酵母菌属和克鲁维酵母属α因子引导序列，美国专利5,010,182对后者进行了描述)，或酸性磷酸酶引导序列、C.albicans葡糖淀粉酶引导序列(参见1990粘4月4日公开的EP 362,179)，或1990年11月15日公开的WO 90/13646中描述的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列，例如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列和病毒分泌引导序列可用来指导蛋白质分泌。 
表达和克隆载体都包含使载体能够在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。适合于多种细菌、酵母和病毒的这种序列为大家所熟知。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌、2μ质粒起点适合于酵母，各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)对哺乳动物细胞中的克隆载体有用。 
表达和克隆载体典型地包含选择基因，也称为可选择标记。典型的选择基因编码那些(a)赋予抗生素或其它毒素，例如，氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素抗性(b)补充营养缺陷不足，或(c)提供不能从复合培养基中获得的重要营养素的蛋白质，例如，编码适合于芽胞杆菌属的D-丙氨酸消旋酶的基因。 
适合于哺乳动物细胞的适当的可选择标记的实例是那些能够鉴定有能力摄取抗体或编码多肽的核酸的细胞的可选择标记，例如DHFR或胸苷激酶。当使用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是依照Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980)的描述制备和扩增缺乏DHFR活性的CHO细胞系。供酵母使用的适当的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因[Stinchcomb et al.，Nature，282：39(1979)；Kingsman et al.，Gene，7：141(1979)；Tschemper et al.，Gene，10：157(1980)]。trp1基因提供了选择缺少在色氨酸中的生长能力的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1的选 择标记[Jones，Genetics，85：12(1977)]。 
表达和克隆载体通常包含可操作性地与抗体或编码多肽的核酸序列相连的指导mRNA合成的启动子。多种潜在的宿主细胞识别的启动子为大家熟知。适合原核生物宿主使用的启动子包括β内酰胺酶和乳糖启动子***[Chang et al.，Nature，275：615(1978)；Goeddel et al.，Nature，281：544(1979)]、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子***[Goeddel，Nucleic Acids Res.，8：4057(1980)；EP 36,776]和杂合启动子，例如tac启动子[deBoer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：21-25(1983)]。供细菌***使用的启动子也包含可操作性地与编码抗体或多肽的DNA连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。 
供酵母宿主使用的适当的促进序列的实例包括适合于3-磷酸甘油酸激酶[Hitzeman et al.，J.Biol.Chem.，255：2073(1980)]或其它糖酵解酶[Hess etal.，J.Adv.Enzyme Reg.，7：149(1968)；Holland，Biochemistry，17：4900(1978)]，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶的启动子。其它的酵母启动子是适合于乙醇脱氢酶2、异细胞色素C(isocytochrome C)、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶，以及负责麦芽糖和半乳糖应用的酶的启动子区域，其中酵母启动子是具有另外的生长条件控制的转录优点的诱导启动子。EP 73,657中更进一步地描述了供酵母表达使用的适当的载体和启动子。 
在哺乳动物宿主细胞中从载体转录抗体或多肽可受到选自如下的启动子的控制，所述启动子例如，通过从病毒，例如多瘤病毒(polyoma virus)、鸡痘病毒(fowlpox virus)(1989年7月5日公开的UK 2,211,504)、腺病毒(例如腺病毒2)、牛***状瘤病毒(bovine papilloma virus)、鸟类肉瘤病毒(aviansarcoma virus)、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)的基因组中获得的启动子，来自异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子和来自热休克蛋白启动子，条件是这种启动子与宿主细胞***相容。 
通过将增强子序列***载体可以增加高等真核生物对编码抗体或多肽的DNA的转录。增强子是作用于启动子以增加转录的DNA顺式作用元件，通常长大约10-300bp。现在从哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋 白、α甲胎蛋白和胰岛素)中已经知道许多增强子序列。但是典型地可以使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括在复制起点近侧的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点近侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。增强子可以在抗体或多肽编码序列的5’或3’位置处剪接到载体中，但优选位于启动子5’位点。 
在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人，或来自其它多细胞机体的有核细胞)中使用的表达载体也包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这种序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA的5′非翻译区获得，偶而可以从真核或病毒DNA或cDNA的3′非翻译区获得。这些区域包含编码抗体或多肽的mRNA的非翻译部分中作为多(聚)腺苷酸片段被转录的核苷酸片段。 
Gething et al.，Nature，293：620-625(1981)；Mantei et al.，Nature，281：40-46(1979)；EP 117,060和EP 117,058中仍然描述了适合于改进重组脊椎动物细胞培养中合成抗体或多肽的其它方法、载体和宿主细胞。 
4.培养宿主细胞 
可以在多种培养基中培养用于生产本发明抗体或多肽的宿主细胞。市场上可买到的培养基，例如，Ham’s F10(Sigma)、极限必需培养基((MEM)，(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)，和达尔伯克氏改良伊格尔培养基((DMEM)，Sigma)适合于培养宿主细胞。另外，Ham et al.，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes et al.，Anal.Biochem.102：255(1980)，美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195或美国专利Re.30,985中描述的任何培养基可用作宿主细胞培养基。这些培养基中的任何培养基都可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(例如，胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如，氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如，HEPES)、核苷酸(例如，腺苷和胸腺密啶核苷)、抗菌素(例如，庆大霉素药物)、微量元素(定义为存在的最终浓度通常在微摩尔范围的无机化合物)，以及葡萄糖或能量能量源。也可以包括本领域熟练技术人员所知的任何适当浓度的其它必要补充物。培养条件，例如，温度、pH等等是以前选择的表达宿主细胞用到的条件，因此对本领域普通技术人员来说是显而易见的。 
5.检测基因扩增/表达
例如，以这里提供的序列为基础，利用适当的标记探针，通过常规的Southern印迹、测定mRNA转录的Northern印迹[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205(1980)]、斑点印迹(DNA分析)或原位杂交可以在样品中直接测定基因扩增和/或表达。或者，可以使用能识别特异双链体，包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂种双链体或DNA-蛋白质双链体的抗体依次标记抗体，测定可以在双链体结合到表面的条件下进行，这样当表面上形成双链体时，就可以检测结合到双链体上的抗体的存在。 
或者，可以通过免疫方法，例如细胞或组织切片的免疫组织化学染色和测定细胞培养物或体液直接对基因产物的表达进行定量测定基因表达。可用于免疫组织化学染色和/或液体样品测定的抗体可以是单克隆或多克隆抗体，而且可以在任何哺乳动物中制备。以这里提供的DNA序列为基础，针对天然序列多肽或合成肽，或者针对融合到多肽DNA上的编码特异抗体表位的外源序列可以方便地制备抗体。 
6.抗体和多肽的纯化
可以从培养基或宿主细胞溶解产物中回收抗体和多肽形式。如果抗体结合膜，那么利用适当的洗涤液(例如，Triton-X 100)或通过酶催化裂解就能够从膜上释放抗体。通过各种物理或化学方法，例如冻融循环、超声处理、机械破碎或细胞溶解剂可以破坏用于表达抗体和多肽的细胞。 
从重组细胞蛋白质或多肽中纯化抗体和多肽是符合要求的。下列过程是适当的纯化过程的示范：通过在离子交换柱上进行分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在二氧化硅或阳离子交换树脂，例如DEAE上进行层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；利用，例如Sephadex G-75进行的凝胶过滤；蛋白质A Sepharose柱除去污染物，例如IgG；和结合表位标记形式的抗体和多肽的金属螯合柱。可以使用各种蛋白质纯化方法，这些方法在本领域是已知的，例如Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，Springer-Verlag，New York(1982)中已经描述这些方法。例如，选择的纯化步骤取决于使用的生产过程的性质和产生的特殊抗体或多肽。 
当利用重组体技术时，抗体可以在细胞内，周质空间中产生，或者可以直接分泌到培养基中。如果抗体是在细胞内产生的，那么第一步就是通过，例如离心或超滤除去宿主细胞或溶解的片段的微粒碎片。Carter et al.， Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的过程。简而言之就是在存在醋酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟化物(PMSF)的情况下解冻细胞糊大约30分钟。通过离心可以除去细胞碎片。当抗体被分泌到培养基中时，通常首先利用市场上可买到的蛋白质浓缩过滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自这种表达***的上清液。蛋白酶抑制剂，例如PMSF可以包括在上述的任何步骤内以抑制蛋白质水解，而且抗生素也可以包括在其中以阻止偶发污染物的生长。 
利用，例如，羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析可以纯化从细胞制备的抗体组合物，其中亲和层析是优选的纯化技术。蛋白质A作为亲合配体的适应性取决于存在于抗体中的任何免疫球蛋白Fc域的种类和同种型。蛋白质A可用于纯化以人γ1、γ2或γ4重链为基础的抗体(Lindmarket al.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。推荐的蛋白质G可用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.，EMBO J.5：15671575(1986))。大多数亲合配体附着于其上的基质常常是琼脂糖，但也可以使用其它基质。与琼脂糖实现的流速和处理时间相比，机械稳定基质，例如可控多孔玻璃或多聚(苯二乙烯)苯(poly(styrenedivinyl)benzene)允许更快的流速和更短的处理时间。当抗体包含CH3域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)对纯化是有用的。也可以依据待回收的抗体使用其它的蛋白质纯化技术，例如在离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上的层析、在肝素SEPHAROSETM上的层析、在阴离子或阳离子交换树脂上(例如，聚天冬氨酸柱)的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。 
在任何初步纯化步骤之后，可以利用pH在大约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，让包含目的抗体和污染物的混合物经受低pH疏水性相互作用层析，优选在低盐浓度(例如大约0-0.25M盐)条件下进行。 
I.药物制剂
通过将具有想要纯度的抗体、多肽、寡肽或有机小分子/无机小分子与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备冻干剂型或水溶液形式的本发明使用的抗体、结合寡肽、结合性有机小分子或无机小分子和/或多肽的可贮藏的治疗剂型(Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂所使用的剂量和浓度对接受者没有毒性，它包括缓冲液，例如醋酸盐、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；包括抗坏血酸和甲硫氨酸的抗氧化剂；防腐剂((诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯己双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚；丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间-甲酚)；低分子量(低于约10个残基)多肽类；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；张力剂(tonicifiers)，诸如海藻糖和氯化钠；糖类，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇；表面活性剂，诸如聚山梨醇酯；成盐抗衡离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如 
Figure G05831687420070322D000651
Figure G05831687420070322D000652
或聚乙二醇(PEG)。抗体优选包括浓度为5-200mg/ml，优选10-100mg/ml的抗体。 
这里的制剂也可以包含待治疗的特殊适应症必需的一种以上活性化合物，优选那些具有不会不利地影响彼此的补充活性的活性化合物。例如，除抗体、结合寡肽，或结合有机或无机小分子之外，在一个制剂中包含另外的抗体，例如结合相同多肽上的不同表位的第二抗体，或针对一些其它靶标，例如影响特殊癌生长的生长因子的抗体可能是合乎需要的。或者或另外地，组合物可以更进一步地包含化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂和/或心脏保护剂。这种分子可以以对预定目标有效的量适当地组合存在。 
还可以在通过例如凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶-微囊和聚-(甲基甲基丙烯酸酯)微囊)中，在胶体递药***(例如，脂质体、清蛋白微球、微乳、纳米粒和纳米囊)中或在粗乳状液中俘获活性组分。这类技术披露在Remington′s Pharmaceutical Sciences，16thedition，Oslo，A.，Ed.，(1980)中。 
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适的实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述的基质为成形制品形式，例如薄膜或微囊。缓释基质的实例包括：聚酯类；水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))；聚交酯类(美国专利US3,773,919)；L-谷氨酸和γ乙基-L-谷 氨酸酯的共聚物；不能降解的乙烯-乙酸乙烯酯；可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，诸如LUPRON 
Figure G05831687420070322D000661
(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)；和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。 
用于体内给药的制剂必须是无菌的。可以通过无菌滤膜过滤实现这一目的。 
J.抗体、结合寡肽和结合有机/无机小分子的处理
为了确定癌中多肽(肝丝酶和/或HGF)的表达，可利用各种检测测定。在一个实施方案中，可以通过免疫组织化学(IHC)来分析多肽的过表达。来自肿瘤活检的石蜡包埋组织切片可以经IHC测定，判定多肽染色强度的标准如下： 
得分0：没有观察到染色或者在少于10％的肿瘤细胞中观察到膜染色。 
得分1+：在超过10％的肿瘤细胞中检测到模糊的/勉强可觉察的膜染色。所述细胞只有部分膜被染色。 
得分2+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到弱到中等的完全膜染色。 
得分3+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到中等到强的完全膜染色。 
多肽表达得分记为0或1+的那些肿瘤可以称为不过表达所述多肽，而那些得分为2+或3+的肿瘤可以称为过表达所述多肽。 
或者或另外地，可以在***固定的石蜡包埋肿瘤组织上进行FISH测定，例如 
Figure G05831687420070322D000662
(Ventana，Arizona出售)或 
Figure G05831687420070322D000663
(Vysis，Illinois)以确定肿瘤中多肽过表达(如果有)的程度。 
利用体内检测测定，例如通过施用结合待检测的分子并被可检测的标记(例如放射性同位素或荧光标记)标记的分子(例如抗体、寡肽或有机小分子)，以及从外部扫描病人以定位标记可以评估多肽过表达或扩增。 
如上所述，本发明的抗体、寡肽和有机小分子具有各种非治疗应用。本发明的抗体、寡肽和有机/无机小分子可用于对多肽表达癌进行分期(例如，用在放射成像中)。抗体、寡肽和有机小分子也可用于从细胞中纯化多肽或免疫沉淀多肽，以体外检测多肽和对多肽进行定量，例如用在ELISA或Western印迹中作为纯化其它细胞的步骤，从混合细胞群体中杀死或除去表达多肽的细胞。 
当前，癌症治疗取决于癌症发展的阶段，涉及下列治疗方法中的一种 或组合：手术除去癌组织、放疗和化疗。抗体、寡肽或有机小分子治疗在上了年纪的病人中可能是特别合乎需要的，因为它们不能很好地耐受化疗的毒性和副作用，而且在转移性疾病中放疗只有有限的有效性。当初期诊断疾病时或疾病复发期间，本发明的肿瘤目标抗体、寡肽和有机/无机小分子对减轻表达多肽的癌症是有用的。在治疗上应用时，抗体、寡肽或有机/无机小分子可单独使用，或与，例如激素、抗血管发生剂(antiangiogens)或放射标记化合物，或者与手术、冷冻疗法和/或放疗进行组合(联合)治疗。抗体、寡肽或者有机/无机小分子的治疗可以与其它常规治疗一起施用，可以连续地与常规治疗同时、在常规治疗前或常规治疗后施用。化疗药物，例如 (多西他赛(docetaxel))、 
Figure G05831687420070322D000672
(紫杉醇(paclitaxel))、雌莫司汀(estramustine)和米托蒽醌(mitoxantrone)用于治疗癌症，特别是用于治疗高风险病人。在本发明目前的治疗或减轻癌症的方法中，可以将抗体、寡肽或有机/无机小分子和一种或多种在前的化疗剂进行的治疗一起施用给癌症病人。特别可以考虑与紫杉醇和其修饰的衍生物(参见，例如，EP0600517)的联合治疗。抗体、寡肽或有机/无机小分子可以与治疗有效量的化疗剂一起施用。在另一个实施方案中，抗体、寡肽或有机/无机小分子与化疗一起施用以增强化疗剂，例如，紫杉醇的活性和功效。The Physicians′Desk Reference(PDR)已经公开了这些试剂用于各种癌症治疗的剂量。治疗有效的这些上述化疗药物的给药方法和剂量取决于待治疗的特定癌症、疾病发展的程度，以及为本领域熟练内科医师熟知并能被内科医师确定的其它因素。 
在一个特定的实施方案中，将包含与细胞毒剂偶联的抗体、寡肽或有机/无机小分子的偶联物施用给病人。结合到蛋白质上的免疫偶联物优选被细胞内化，这导致免疫偶联物杀死它结合的癌细胞的治疗效能增加。在一个优选实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。这种细胞毒剂的实例如上所述，包括美登木素生物碱类、加利车霉素、核糖核酸酶和DNA内切核酸酶。 
依照与已知方法，例如静脉内给药(例如静脉推注(bolus)或一段时间内连续输注方式进行的静脉内给药)、通过肌内给药、腹膜内给药、脑脊髓内(intracerobrospinal)给药、皮下给药、关节内给药、滑膜内给药、鞘内给药、口服给药、局部给药或吸入途径给药可以将抗体、寡肽、有机/无机小 分子或其毒素偶联物施用给病人。优选静脉内或皮下施用抗体、寡肽或有机小分子。 
其它的治疗方案可以与施用寡肽或有机/无机小分子联合。联合给药包括使用分开的制剂(separate formulations)或单个药物制剂(singlepharmaceutical formulation)的同时给药(co-administration)，以及以任何次序连续给药(consecutive administration)，其中优选有一段时间两个(或全部)活性剂同时发挥它们的生物学活性。优选这样的联合治疗产生协同治疗效果。 
所述抗体、寡肽或有机/无机小分子与针对与特定癌症有关的另一肿瘤抗原的抗体联合施用也可能是所期望的。 
在另一个实施方案中，本发明的治疗方法涉及联合施用抗体(或多种抗体)、寡肽或有机/无机小分子和一种或多种化疗剂或生长抑制剂，包括同时给药不同化疗剂的鸡尾酒样混合物。化疗剂包括磷酸雌莫司汀、泼尼莫司汀(prednimustine)、顺铂(cisplatin)、5-氟尿嘧啶、美法仑(melphalan)、环磷酰胺、羟基脲(hydroxyurea)和羟基脲紫杉烷(hydroxyureataxanes)(例如，紫杉醇和多西他赛)和/或蒽环类抗生素。可以依照制造商的说明或熟练技术人员凭经验确定的方法来使用这种化疗剂制品和其给药方案。在Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams&Wilkins，Baltimore，MD(1992)中也描述了这种化疗剂的制品和给药方案。 
抗体、寡肽或有机/无机小分子可以以这种分子已知的剂量与抗激素化合物，例如，抗***化合物，例如它莫西芬(tamoxifen)；抗***，例如奥那司酮(onapristone)(参见EP 616812)或抗雄激素，例如氟他米特(flutamide)联合。当待治疗的癌症是依赖雄激素的癌症时，病人可以预先经受抗雄激素治疗，在癌症变成雄激素不依赖性的癌症之后，可以给病人施用所述抗体、寡肽或有机/无机小分子(和这里描述的任意其它试剂)。 
有时，也给病人同时施用心脏保护剂(防止或降低与治疗有关的心肌功能障碍)或一种或多种细胞因子是有益的。除上述治疗方式之外，病人还可以在抗体、寡肽或有机/无机小分子治疗之前、同时或之后经受手术除去癌细胞和/或放射疗法。上述任何共同施用制剂的适当剂量是目前使用的剂量，也可以由于与抗体、寡肽或有机/无机小分子的联合作用(协同作用)，所述任何共同施用制剂的剂量可能会降低。 
为了预防或治疗疾病，将依照已知的标准由内科医师选择给药剂量和方式。抗体、寡肽或有机/无机小分子的适当剂量取决于上文限定的待治疗的疾病的种类、疾病的严重性和病程、施用抗体、寡肽或有机/无机小分子是为了预防目的还是治疗目的、以前的治疗、病人的临床病史，病人对抗体、寡肽或有机/无机小分子的反应和主治医师的判断。抗体、寡肽或有机/无机小分子可以适当地一次施用给病人或通过一系列的治疗施用给病人。优选通过静脉内输注或皮下注射来施用抗体、寡肽或有机/无机小分子。依据疾病的类型和严重性，可以将大约1ug/kg-大约50mg/kg体重(例如，大约0.1-15mg/kg/剂)的抗体作为初始候选剂量(initial candidate dosage)施用给病人，例如，可以通过一次或多次单独的给药(separate administrations)，或通过连续输注来施用。给药方案可以包括施用大约4mg/kg的初始负载剂量(initial loading dose)的抗体，接下来施用大约2mg/kg的每周维持量。但是，其它给药方案也可能是有用的。典型的每日剂量可以随上述因素在大约1μg/kg到大约100mg/kg或更高剂量的范围内变化。随情况不同，可以在几天或更长时间里重复给药，可以持续到疾病的症状得到期望的抑制。通过常规方法和测定，以内科医师或本领域其它熟练技术人员所知的标准为基础，可以很容易地监测这些治疗的进展。 
除了施用抗体蛋白质对给病人外，本申请的应用考虑通过基因治疗施用抗体。这种施用编码抗体的核酸包括在″施用治疗有效量的抗体″这一表述方式中。参见，例如，1996年3月14日公开的涉及利用基因治疗产生胞内抗体的WO96/07321。 
有两个主要的使核酸(任选包含在载体中)进入病人细胞的方法—体内(in vivo)和回体(ex vivo)方法。为了进行体内递送，可以将核酸直接注射到病人体内，通常注射到需要抗体的位点。为了进行回体治疗，可以取出病人的细胞，然后将核酸引入这些分离的细胞中，并直接将修饰的细胞施用给病人，或者通过，例如包封在被植入病人体内的多孔膜内将修饰的细胞施用给病人(参见，例如，美国专利Nos.4,892,538和5,283,187)。可获得多种将核酸***活细胞的技术。所述技术将随核酸是被转移到体外的培养细胞里，还是被转移到体内预定的宿主细胞里而变化。适合于体外转移核酸到哺乳动物细胞里的技术包括利用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀法等等。回体递送基因通常使用的载体 是逆转录病毒载体。 
当前优选的体内(in vivo)核酸转移技术包括使用病毒载体(例如，腺病毒、单纯性疱疹病毒I型或腺病毒相关病毒)和基于脂质的***(用于脂质介导的基因转移有用的脂质是DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行转染。当前已知的基因标记和基因治疗规程的综述可以参见Anderson et al.，Science256：808-813(1992)。也可以参见WO93/25673和其中引用的参考文献。 
本发明的抗体可以是包括在这里的″抗体″定义中的不同形式的抗体。因此，抗体包括全长或完整抗体、抗体片段、天然序列抗体或氨基酸变体、人源化、嵌合或融合抗体、免疫偶联物和其功能片段。在融合抗体中，抗体序列与异源的多肽序列融合。可以在Fc区修饰抗体以提供想要的效应器功能。就像在本文比较详细讨论的那样，结合在细胞表面的具有适当的Fc区域的裸抗体可以诱导细胞毒性，例如，经由抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)，通过在补体依赖的细胞毒性中补充补体或其它机制诱导细胞毒性。或者，除去或降低效应器功能以使副作用或治疗并发症降到最低程度，此时可以使用某些其它的Fc区域。 
在一个实施方案中，本发明涉及与本发明的抗体竞争性结合或充分结合(substantially bind)相同的表位的抗体。也考虑具有本发明抗体的生物学特性的抗体，其中生物学特性特别包括体内肿瘤靶向和任何细胞增殖抑制特性或细胞毒特性。 
这里详细描写了产生上述抗体的方法。 
本发明的抗体、寡肽和有机/无机小分子具有治疗表达肝丝酶和/或HGF的癌症，或减轻哺乳动物中该癌症的一种或多种症状的用途。本发明的方法包括在治疗和/或减轻与这些癌症有关的转移性肿瘤的症状时使用拮抗剂。抗体、寡肽或有机/无机小分子拮抗剂能结合哺乳动物中表达多肽(肝丝酶和/或HGF)的癌细胞的至少一部分。在一个实施方案中，抗体、寡肽或有机/无机小分子在体外或体内结合多肽时，在破坏或杀死表达多肽的肿瘤细胞和/或应答的肿瘤细胞，或抑制这样的肿瘤细胞的生长方面是有效的。这样的抗体包括裸抗体(不偶联到任何制剂上)。具有细胞毒或细胞生长抑制特性的裸抗体可以更进一步地与细胞毒剂固定(harness)在一起，使它们在肿瘤细胞破坏方面更加有效。例如，通过将抗体与细胞毒剂偶联形成这里描述的免疫偶联剂可以将细胞毒特性赋予给抗体。在一些实施方案中，细 胞毒剂或生长抑制剂是小分子。在一些实施方案中，使用了毒素，例如加利车霉素或美登木素生物碱，及其类似物或衍生物。 
本发明提供了包含本发明的抗体、寡肽或有机/无机小分子和载体的组合物。为了实现治疗癌症的目的，可以将组合物施用给需要这种治疗的病人，其中组合物可以包括以免疫偶联物或裸抗体存在的一种或多种抗体。在更进一步的实施方案中，组合物可以包括与其它治疗剂，例如细胞毒剂或生长抑制剂，包括化疗剂组合的抗体、寡肽或有机/无机小分子。本发明也提供了包含本发明的抗体、寡肽或有机/无机小分子和载体的制剂。在一个实施方案中，该制剂是包含药学上可接受载体的治疗制剂。 
本发明另一方面是分离的编码抗体的核酸。包括编码H和L链，特别是高变区残基的核酸，编码天然序列抗体，以及该抗体的变体、修饰形式和人源化形式的各链的核酸。 
本发明也提供在哺乳动物中治疗癌症或减轻癌症的一种或多种症状的有用方法，包括给哺乳动物施用治疗有效量的抗体、寡肽或有机/无机小分子。可以在内科医师的指导下，短期(急性(acute))，长期或间断地施用抗体、寡肽或有机/无机小分子治疗组合物。也提供了抑制表达多肽(肝丝酶和/或HGF)的细胞和/或应答细胞的生长和杀死表达多肽(肝丝酶和/或HGF)的细胞和/或应答细胞的方法。 
本发明也提供包含至少一种抗体、寡肽或有机/无机小分子的试剂盒和制品。发现包含抗体、寡肽或有机/无机小分子的试剂盒可用于，例如细胞杀伤测定，从细胞中纯化或免疫沉淀多肽。例如，为了分离和纯化多肽，所述试剂盒可以包含与珠子(例如，琼脂糖凝胶珠子)偶联在一起的抗体、寡肽或有机/无机小分子。为了体外检测和定量多肽，例如在ELISA或Western印迹中检测和定量多肽，可以提供包含该抗体、寡肽或有机/无机小分子的试剂盒。可以和标记，例如荧光或放射标记一起提供这种用于检测的抗体、寡肽或有机/无机小分子。 
K.制品和试剂盒
本发明的另一个实施方案是包含用于治疗表达多肽(肝丝酶和/或HGF)的癌症，例如***癌和卵巢癌的原料的制品。所述制品包含容器和标记或位于容器上的包装说明书或与容器相连的包装说明书。适当的容器包括， 例如瓶、管形瓶、注射器等等。容器可以由多种原料，例如玻璃或塑料组成。容器装有能有效治疗癌症状态的组合物，而且可能有无菌存取孔(例如，容器可能是静脉用溶液袋或具有可被皮下注射针穿过的塞子的管形瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体、寡肽或有机/无机小分子。标记或包装说明书表明组合物可用于治疗癌症。标记或包装说明书更进一步地包括施用抗体、寡肽或有机/无机小分子组合物给癌症病人的说明。另外，制品可以更进一步地包括含有药学上可接受的缓冲液，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水Ringer氏溶液和葡萄糖溶液的第二容器。它可以更进一步地包括合乎市场和用户需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。 
也可以提供可用于多种目的试剂盒，例如，用于杀死表达多肽的细胞的测定的试剂盒，用于从细胞中纯化或免疫沉淀多肽的试剂盒。为了分离和纯化多肽，所述试剂盒可以包含与珠子(例如，琼脂糖凝胶珠子)偶联在一起的抗体、寡肽或有机/无机小分子。为了体外检测和定量多肽，例如在ELISA或Western印迹中检测和定量多肽，可以提供包含该抗体、寡肽或有机/无机小分子的试剂盒。和制品一样，所述试剂盒可以包含容器和标记或位于容器上的包装说明书或与容器相连的包装说明书。容器装有包含本发明的至少一种抗体、寡肽或有机/无机小分子的组合物。还可以包括那些包含，例如稀释剂、缓冲液和对照抗体的另外的容器。所述标记或包装说明书可以提供对组合物的描述，以及计划的体外使用或检测使用的说明。 
L.多肽和编码多肽的核酸-它们的具体形式和应用
编码本发明的多肽的核苷酸序列(或它们的互补序列)在分子生物学领域具有多种应用，而且可用于治疗等等。编码多肽的核酸对通过这里描述的重组技术制备多肽有用，其中发现那些多肽可用于，例如制备这里描述的抗体。 
全长天然序列多肽基因或其部分可用作杂交探针从cDNA库中分离与这里公开的天然多肽序列具有想要的序列同一性的其它cDNAs(例如，那些编码天然发生的多肽变体或来自其它物种的多肽的cDNAs)。探针的长度任选可以是大约20-大约50个碱基。可以从全长天然核苷酸序列的至少部分新区域或包括天然序列多肽的启动子、增强子元件和内含子的基因组序 列获得杂交探针，其中不需要过度的实验就可以确定那些新区域。举例来说，筛选方法包括使用已知的DNA序列合成大约40个碱基的选择探针来分离多肽基因的编码区域。可以使用多种标记物，包括放射性核素，例如 32P或35S，或酶标记，例如，经由亲和素/生物素偶联***与所述探针连在一起的碱性磷酸酶来标记杂交探针。具有与本发明的多肽基因的探针互补的序列的标记探针可用于筛选人cDNA、基因组DNA或mRNA库以确定探针与这些库中的哪些成员杂交。在下面的实施方案中将更进一步地详细描述杂交技术。类似地，在本申请公开的任何EST序列都可以使用这里公开的方法用作探针。 
编码多肽的核酸的其它有用片段包括包含能结合靶多肽mRNA(有义)或多肽DNA(反义)序列的单链核酸序列(RNA或DNA)的反义或有义寡核苷酸。依照本发明的反义或有义寡核苷酸包括编码这里描述的肝丝酶、前HGF或结合片段的DNA的编码区域的片段。这种片段通常包含至少大约14个核苷酸，优选包含大约14-30个核苷酸。例如，Stein and Cohen(CancerRes.48：2659，1988)和van der Krol et al.(BioTechniques 6：958，1988)中描述了基于编码给定蛋白质的cDNA序列，衍生反义或有义寡核苷酸的能力。 
反义或有义寡核苷酸结合靶核酸序列会导致形成通过几种方式中的一种阻断目标序列转录或翻译的双链体，其中几种方式包括增强双链体的降解、转录或翻译过早终止或其它方式。这种方法也包括在本发明的范围内。因此该反义寡核苷酸可用来阻断蛋白质表达，其中蛋白质在诱导哺乳动物癌症中起作用。反义或有义寡核苷酸更进一步地包括具有修饰的糖-磷酸二酯骨架(或其它的糖键，例如WO 91/06629中描述的那些)和其中糖键能抵抗内源核酸酶的寡核苷酸。具有抵抗性糖键的这种寡核苷酸在体内是稳定的(即，能抵抗酶降解)，但是它保留了能结合靶核苷酸序列的序列特异性。 
优选的用于反义结合的基因内位点包括导入基因开放阅读框(ORF)的起始/起动密码子(5′-AUG/5′-ATG)或终止/中止密码子(5′-UAA、5′-UAG和5-UGA/5′-TAA、5′-TAG和5′-TGA)的区域。这些区域指mRNA或基因的一部分，包括从翻译起始或终止密码子起的任意方向(即5’或3’)的约25-约50个连续核苷酸。供反义结合的其它优选区域包括：内含子；外显子；内含子-外显子接合处；是翻译起始密码子和翻译终止密码子之间区域的开 放阅读框(ORF)或″编码区域″；包含经由5′-5′三磷酸酯键连接到mRNA的最5′端残基上的N7-甲基化鸟嘌呤核苷残基的mRNA5′帽，它包括5′帽结构本身和靠近帽的开始的50个核苷酸；5′未翻译区域(5′UTR)，是在翻译起始密码子5′方向的mRNA部分，因此包括5帽位点和mRNA的翻译起始密码子或基因上的对应核苷酸之间的核苷酸；和3′未翻译区域(3′UTR)，是在翻译终止密码子3′方向的mRNA部分，因此包括mRNA的翻译终止密码子和mRNA的3′末端或基因上的对应核苷酸之间的核苷酸。 
可用于抑制多肽表达的优选的反义化合物的具体实例包括含有修饰的骨架或非天然的核苷间键的寡核苷酸。具有修饰骨架的寡核苷酸包括那些在骨架中保留了磷原子和那些在骨架中不含有磷原子的寡核苷酸。对本申请说明书和本领域有时引用的文献来说，那些在它们的核苷间骨架中没有磷原子的修饰寡核苷酸还可以被认为是寡核苷。优选的修饰的寡核苷酸骨架包括，例如：硫代磷酸(phosphorothioates)、手性硫代磷酸(chiralphosphorothioates)、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基及其它烷基膦酸盐，包括3′-烯基膦酸酯、5′-烯基膦酸酯和手性膦酸酯、亚膦酸酯(phosphinate)、磷酰胺(phosphoramidate)，包括3′-氨基磷酰胺(3’-aminophosphoramidate)和氨烷基磷酰胺(aminoalkylphosphoramidates)、硫羰磷酰胺(thionophosphoramidates)、硫羰烷基膦酸酯(thionoalkyphosphonates)、硫羰烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriesters)、具有正常3′-5′键的硒基磷酸酯(selenophosphates)和硼基磷酸酯(borano-phosphates)，它们的2′-5′连接的类似物，以及具有相反极性(inverted polarity)的寡核苷酸，在具有相反极性的寡核苷酸中，一个或多个核苷酸间键是3′-3’、5′-5′或2′-2′键。优选的具有相反极性的寡核苷酸在最3′端的核苷酸间键处包括单个3′-3′键，即可能是脱碱基的单个反转的核苷(single inverted nucleoside)残基(失去核碱基或者在其位置上具有羟基)。也包括上述物质的各种盐，混合盐和游离酸形式。典型的教导制备包含磷的键的美国专利包括，但不局限于美国专利3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050，在这里将每一篇文献都引入作为参考。 
优选的其中不包含磷原子的修饰的寡核苷酸骨架具有由短链烷基或环烷基核苷间键，混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键，或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。这些包含那些具有吗啉代(morpholino)的连接(部分在核苷的糖部分中形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；formacetyl和thioformacetyl骨架；亚甲基formacetyl和thioformacetyl骨架；核糖乙酰基(riboacetyl)架；含有烯烃的骨架；氨基磺酸基酯(sulfamate)骨架；methyleneimino和methylenehydrazino骨架；磺酸酯和氨磺酰骨架；酰胺骨架；以及其它具有混合的N，O，S和CH2组成部分的骨架。典型的教导制备这种寡核苷的美国专利包括，但不局限于美国专利5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，在此将每一篇文献都引入作为参考。 
在其它优选的反义寡核苷酸中，用新的基团替换了糖和核苷间键，即核苷酸单元的骨架。保持了与适当的核酸靶化合物杂交的碱基单元。这样的寡聚化合物被称为肽核酸(PNA)，已经显示这种寡核苷酸模拟物具有优良的杂交特性。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被包含酰胺的骨架替换，特别是被氨乙基甘氨酸骨架替换。所述核碱基(nucleobases)被保留，并被直接地或间接地与骨架酰胺部分的氮杂原子结合。典型的教导制备PNA化合物的美国专利包括，但不局限于美国专利5,539,082；5,714,331和5,719,262，在这里将每一篇文献引入作为参考。在Nielsen et al.，Science，1991，254，1497-1500中可以发现对PNA化合物更进一步的教导。 
优选的反义寡核苷酸整合了硫代磷酸骨架和/或杂原子骨架，特别是在上述参考的美国专利5,489,677中描述的-CH2-NH-O-CH2-，-CH2-N(CH3)-O-CH2-(称为亚甲基(甲基亚胺)或MMI骨架)，-CH2-O-N(CH3)-CH2-，-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-[其中天然磷酸二酯骨架以-O-P-O-CH2-表示]和上述参考的美国专利5,602,240中的酰胺骨架。具有上述参考的美国专利5,034,506的吗啉代骨架结构的反义寡核苷酸也是优选的。 
修饰的寡核苷酸也可以包含一个或多个取代的糖部分。优选的寡核苷 酸在2′位置包括下列中的一个：OH；F；O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未被取代的C1-C10烷基或C2-C10烯基和炔基。特别优选的是O[(CH2)nO]mCH3，O(CH2)nOCH3，O(CH2)nNH2，O(CH2)nCH3，O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m来自于1至大约10。其它优选的反义寡核苷酸在2′位置包括下列中的一个：C1-C10低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或氧-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2、CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、聚烷氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报告基团、嵌入剂或改善寡核苷酸药效学特性的基团，及其它具有相似特性的取代基。优选的修饰包括2′-甲氧乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3，又名′-O-(2-甲氧乙基)或2′-MOE)(Martin et al.，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504)，即烷氧烷氧基团。更进一步的优选修饰包括在下文实施方案中描述的2′-二甲氨氧乙氧基(2′-dimethylaminooxyethoxy)，即O(CH2)2ON(CH3)2基，又名2′-DMAOE，这在下面的实例中描述，以及2’-二甲氨乙氧乙氧基(2’-dimethylaminoethoxyethoxy)(本领域也已经作为2′-O-二甲基氨乙氧乙基(dimethylaminoethoxyethyl)或2′-DMAEOE已知)，即2′-O-CH2-O-CH2-N(CH2)。 
更进一步优选的修饰包括其中2′-羟基连接到糖环的3’或4’碳原子上而形成二环糖部分的锁核酸(locked Nucleic Acid)(LNA)。连接优选是桥接2’氧原子和4’碳原子的亚甲基(-CH2)n基团，其中n是1或2。WO 98/39352和WO 99/14226中描述了LNA和其制备方法。 
其它优选的修饰包括2’-甲氧基(2′-O-CH3)、2′-氨丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)、2′-烯丙基(2′-CH2-CH＝CH2)、2′-O-烯丙基(2′-O-CH2-CH＝CH2)和2’-氟代(2’-F)。2’修饰可以在arabino(向上)位置或ribo(向下)位置。优选的2′arabino修饰是2′-F。也可以在寡核苷酸的其它位置进行类似的修饰，特别是3′末端核苷酸的糖的3′位置，2′-5′连接的寡核苷酸内，以及5′末端核苷酸的5′位置。寡核苷酸也可以具有糖模拟物，例如用环丁基部分代替五呋喃(pentofuranosyl)糖。教导制备这种修饰的糖结构的代表性的美国专利包括，但不局限于美国专利：4,981,957；5,118,800； 5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747和5,700,920，在此将每一篇文献的内容都全部引入作为参考。 
寡核苷酸也可以包括核碱基(在本领域常常简称为″碱基″)修饰或取代。在这里使用的″未修饰的″或″天然的″碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的碱基包括其它合成和天然的碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基及其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基及其它烷基衍生物、2-硫代嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(propynyl)(-C≡C-CH3或-CH2-C＝CH)尿嘧啶和胞嘧啶及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基及其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代，特别是5-溴代、5-三氟甲基及其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。更进一步地修饰的碱基包括三环嘧啶，例如吩噁嗪胞啶(phenoxazine cytidine)(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)(1H-pyrimido[5，4-b][1，4]benzoxazine-2(3H)-one)、吩噻嗪胞啶(phenothiazinecytidine)(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)(1H-pyrimido[5，4-b][1，4]benzothiazine-2(3H)-one)、G夹(G-clamps)，例如取代的吩噁嗪胞啶(phenoxazine cytidine)(例如9-(2-氨乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)(9-(2-aminoethoxy)-H-pyrimido[5，4-b][1，4]benzoxazine-2(3H)-one)、咔唑胞啶(carbazole cytidine)(2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮)(2H-pyrimido[4，5-b]indol-2-one)、吡啶吲哚胞啶(pyridoindole cytidine)(氢-吡啶并[3’，2’：4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-one)(H-pyrido[3’，2’：4，5]pyrrolo[2，3-d]pyrimidine-2-one)。修饰的碱基也可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环，例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮取代的那些碱基。更进一步的碱基包括那些在美国专利3,687,808，The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，pages 858-859， Kroschwitz，J.I.，ed.John Wiley&Sons，1990和Englisch et al.，AngewandteChemie，International Edition，1991，30，613中公开的碱基。这些碱基中的某些对增加本发明的寡聚化合物的结合亲合力特别有用。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶，N-2，N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤(aminopropyladenine)，5-丙炔尿嘧啶(5-propynyluracil)和5-丙炔胞嘧啶(5-propynylcytosine)。已经显示5-甲基胞嘧啶取代可以使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2.degree.C.(Sanghvi et al，Antisense Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，pp.276-278)，因此是优选的碱基取代，与2’-O-甲氧乙基糖修饰联合时更是特别优选的。典型的教导制备修饰的碱基的美国专利包括，但不局限于美国专利3,687,808，以及美国专利4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121、5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096；5,681,941和5,750,692，在此将每一篇文献都引入作为参考。 
反义寡核苷酸的另外的修饰涉及用化学方法将增强寡核苷酸的活性，细胞分布或细胞摄取量的一个或多个部分或偶联物连接到寡核苷酸上。本发明的化合物可以包括共价结合到功能基团，伯羟基或仲羟基(primary orsecondary hydroxyl groups)上的偶联基团。本发明的偶联基团包括嵌入剂、报告分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物药效特性的基团和增强寡聚物药物代谢动力学特性的基团。典型的偶联基团包括胆固醇、脂质、阳离子脂质、磷脂、阳离子磷脂、生物素、吩嗪(phenazine)、叶酸盐(folate)、菲啶(phenanthridine)、蒽醌(anthraquinone)、吖啶(acridine)、荧光素、若丹明(rhodamine)、香豆素(coumarin)和染料。在本发明的上下文中增强药效特性的基团包括改善寡聚物摄取、增强寡聚物对降解的抗性和/或加强与RNA的序列特异性杂交的基团。在本发明的上下文中增强药物代谢动力学特性的基团包括改善寡聚物摄取、分布、代谢或***的基团。偶联物部分(conjugate moieties)包括但不局限于脂质部分，例如，胆固醇部分(Letsingeret al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553-6556)、胆酸(Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Let.，1994，4，1053-1060)硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(tritylthiol)(Manoharan et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660，306-309；Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3，2765-2770)、硫代胆固醇 (thiocholesterol)(Oberhauser et al.，Nucl.Acids Res.，1992，20，533-538)、脂肪族链，例如十二烷基二醇(dodecandiol)或十一烷基残基(Saison-Behmoaraset al.，EMBO J.，1991，10，1111-1118；Kabanov et al.，FEBS Lett.，1990，259，327-330；Svinarchuk et al.，Biochimie，1993，75，49-54)、磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油(di-hexadecyl-rac-glycerol)或三乙基铵-1，2-二-O-十六烷基-rac-甘油基-3-H-膦酸盐(酯)(triethyl-ammonium1，2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonate)(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654；Shea et al.，Nucl.Acids Res.，1990，18，3777-3783)，多胺或聚乙二醇链(Manoharan et al.，Nucleosides&Nucleotides，1995，14：969-973，)，或金刚烷胺乙酸(adamantane acetic acid)(Manoharan etal.，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654)，棕榈酰部分(palmityl moiety)(Mishra et al.，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229-237，1995)，或十八胺或己胺-羰基-氧胆固醇部分。本发明的寡核苷酸也可以结合到活性药物物质，例如：阿司匹灵(aspirin)、华法令(warfarin)、保泰松(phenylbutazone)、布洛芬(ibuprofen)、舒洛芬(suprofen)、联苯丁酮酸(fenbufen)、优洛芬(ketoprofen)、(S)-(+)吡喃洛芬((S)-(+)-pranoprofen)、卡布洛芬(carprofen)、丹酰肌氨酸(dansylsarcosine)、2，3，5-三碘苯甲酸、氟灭酸(flufenamic acid)、甲酰四氢叶酸(folinic acid)、苯(并)噻二嗪(benzothiadiazide)、***、二氮杂环丁烯(diazetine)、indomethicin、巴比妥酸盐(barbiturate)、头孢菌素(cephalosporin)、磺胺药(sulfa drug)、抗糖尿病药、抗菌素或抗生素上。在美国专利申请334,130(1999年6月5日申请)和美国专利4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717、5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241、5,391,723；5,416,203、5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941中描述了寡核苷酸药物偶联物和它们的制备方法，在此将每一篇文献引入作为参考。 
不必将给定化合物中的所有位置都均匀地修饰，实际上超过一个的上述修饰可以纳入到单个化合物中，甚至可以纳入到寡核苷酸内的单个核苷处。本发明也包括是嵌合化合物的反义化合物。在本发明的上下文中的″嵌合的″反义化合物或″嵌合体″是包含两个或更多个化学独特区域的反义化合物，特别是寡核苷酸，其中每个化学独特区域(chemically distinct regions)由至少一个单体单元(monomer unit)组成，在寡核苷酸化合物情况下所述单体单元即为核苷酸。这些寡核苷酸典型地包含至少一个寡核苷酸被修饰的区域，该修饰赋予寡核苷酸增加的核酸酶降解抗性，增强的细胞摄取，和/或增加的对靶核酸的结合亲合力。寡核苷酸的另外区域可以作为能切割RNA:DNA或RNA:RNA杂合体(hybrid)的酶的底物。举例来说，RNase H是能切割RNA:DNA双链体中的RNA链的细胞核酸内切酶。因此，活化RNaseH可导致RNA靶标被切割，从而能大大增强寡核苷酸抑制基因表达的效率。因此，当使用嵌合的寡核苷酸时，用较短的寡核苷酸经常可以获得与和相同的目标区杂交的硫代磷酸脱氧寡核苷酸类似的结果。可以以如上所述的两个或更多个寡核苷酸、修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构(composite structure)形式形成本发明的嵌合的反义化合物。优选的嵌合的反义寡核苷酸在3’末端纳入了至少一个赋予核酸酶抗性的2’修饰的糖(优选2’-O-(CH2)2-O-CH3)和赋予RNase H活性的具有至少4个连续的2’-H糖的区域。这种化合物在本领域也被称为杂合体(hybrid)或gapmers。优选的gapmers在3’末端和5’末端具有2’修饰的糖(优选2’-O-(CH2)2-O-CH5)，被具有至少4个连续2’-H糖的至少一个区域分隔，并且该gapmers优选纳入硫代磷酸酯骨架连接。典型的教导制备这种杂合体结构的美国专利包括，但不局限于美国专利5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356和5,700,922，在这里将每篇文献引入作为参考。 
可以利用公知的固相合成方法，常规方便地制备本发明中使用的反义化合物。几家供应商，包括，例如Applied Biosystems(Foster City，CA加利福尼亚)在出售适合于这种合成的设备。可以另外使用或替换使用其它的任何适合这种合成的材料和方式。已经公知可利用类似的方法制备寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基衍生物。也可以将本发明的碱基寡聚物掺合，包封，偶联结合或其它方式连接到其它分子，分子结构或化合物的混合物中，例 如连接到有助于摄取，分布和/或吸收的脂质体，受体靶分子，口服制剂，直肠给药制剂，局部给药制剂或其它制剂。典型的教导制备这种摄取、分布和/或吸收促进制剂的美国专利包括，但不局限于美国专利5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575和5,595,756，在这里将每篇文献引入作为参考。 
有义或反义寡核苷酸的其它实例包括那些共价连接到有机部分上的寡核苷酸，例如WO 90/10048中描述的那些部分(moieties)，及共价连接到增加寡核苷酸对靶核酸序列的亲合力的其它部分，例如聚-(L-赖氨酸)。还有嵌入剂，例如玫瑰树碱(ellipticine)，烷化剂或金属复合物可以更进一步地附着于有义或反义寡核苷酸上以修饰有义或反义寡核苷酸对靶核苷酸序列的结合特异性。 
通过任何基因转移方法，包括，例如CaPO4介导的DNA转染、电穿孔或使用基因转移载体，例如，EB病毒可以将反义或有义寡核苷酸引入包含靶核酸序列的细胞。在优选方法中，反义或有义寡核苷酸被***适当的逆转录病毒载体中。包含靶核酸序列的细胞可以在体内或回体(ex vivo)接触重组逆转录病毒载体。适当的逆转录病毒载体包括，但不局限于那些由鼠逆转录病毒M-MuLV、N2(由M-MuLV获得的逆转录病毒)，或被命名为DCT5A、DCT5B和DCT5C的双拷贝载体(参见WO 90/13641)获得的载体。 
依照WO 91/04753的描述，也可以通过与配体结合分子形成偶联物将有义或反义寡核苷酸引入包含靶核苷酸序列的细胞。适当的配体结合分子包括，但不局限于，细胞表面受体、生长因子、其它细胞因子或结合细胞表面受体的其它配体。配体结合分子的偶联优选基本上不干扰配体结合分子结合对应分子或受体的能力，或不阻断有义或反义寡核苷酸或其偶联物形式进入细胞。 
或者，可以依照WO 90/10448的描述，通过形成寡核苷酸脂质-复合物偶联物将有义或反义寡核苷酸引入包含靶核苷酸序列的细胞。有义或反义寡核苷酸-脂质复合物优选在细胞内通过内源脂肪酶发生离解。 
反义或有义RNA或DNA分子的长度通常是至少大约5个核苷酸，或 者至少大约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000个核苷酸，其中术语″大约″在上下文中指参考的核苷酸序列长度加上或减去参考长度的10％。 
在PCR技术中也可以使用探针以产生鉴定密切相关的多肽编码序列的序列库。 
编码多肽的核苷酸序列还可以用于构建对编码多肽的基因进行作图和对患有遗传病的个体进行遗传分析的杂交探针。利用已知的技术，例如原位杂交、针对已知染色体标记的连锁分析和库的杂交筛选，可以用这里提供的核苷酸序列对染色体和染色体的特定区域进行作图。 
多肽可用于鉴定涉及多肽的结合相互作用的其它蛋白质或分子的测定中。通过这种方法，可以鉴定受体/配体结合相互作用的抑制剂。涉及这种结合相互作用的蛋白质还可以用于筛选结合相互作用的肽或小分子抑制剂。筛选测定可以设计成发现模拟天然多肽或多肽受体的生物活性的先导化合物的形式。这种筛选测定包括适合高通量筛选化学制剂库的测定，这使它们特别适合于鉴定小分子药物候选物。考虑的小分子包括合成的有机或无机化合物。测定可以以多种形式进行，包括在本领域已经被清楚表征的蛋白质-蛋白质结合测定、生物化学筛选测定、免疫测定和基于细胞的测定。 
编码多肽或其修饰形式的核酸还可以用于产生之后用于开发和筛选治疗有用试剂中有用的转基因动物或″敲除″动物。转基因动物(例如，小鼠或大鼠)是具有包含转基因的细胞的动物，其中转基因是在出生以前，例如胚胎期被引入动物或动物祖先中的。转基因是被整合到细胞基因组中的 DNA，从该细胞将发育成转基因动物。在一个实施方案中，依照已确定的技术，可用编码多肽的cDNA克隆编码多肽的基因组DNA和用于产生转基因动物的基因组序列，其中转基因动物包含表达编码多肽的DNA的细胞。产生转基因动物，特别是如小鼠或大鼠的动物的方法在本领域已经变成常规方法，例如已经描述在美国专利4,736,866和4,870,009中。通常使多肽转基因与组织特异性增强子整合实现特殊细胞的靶向。包含一个拷贝的在胚胎期被引入动物种系的编码多肽的转基因的转基因动物可用于研究编码多肽的DNA的表达增加产生的效果。这种动物能可用作试剂的试验动物，其中的试剂被认为能提供保护，例如对与多肽过表达有关的病理学状态的保护。依据本发明的这一方面可知，与负载转基因的未处理动物相比，用所述试剂处理的动物病理状态的发病率降低表明对病理状态产生了潜在的治疗干预。 
或者，多肽的非人同系物可用于构建基因″敲除″动物，其中由于编码多肽的内源基因和被引入该动物的胚胎干细胞的编码所述多肽的改变的基因组DNA之间的同源重组，基因″敲除″动物的编码所述多肽的基因有缺陷或被改变。例如：编码所述多肽的cDNA可依照确定的技术用于克隆编码所述多肽的基因组DNA。编码所述多肽的基因组DNA的一部分可以删除或可以用另一个基因，例如用于监测整合作用的编码可选择标记的基因取代编码所述多肽的基因组DNA的一部分。载体中典型地包括几千碱基的未改变的侧接DNA(在5’和3’末端)[参见，例如，描述同源重组载体的Thomasand Capecchi，Cell，51：503(1987)]。将该载体引入胚胎干细胞系(例如，通过电穿孔)，并选择其中***的DNA已经与内源DNA发生同源重组的细胞[参见，例如Li et al.，Cell，69：915(1992)]。然后把选择的细胞注入动物(例如，小鼠或大鼠)胚泡以形成聚集嵌合体[参见，例如，Bradley，inTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach，E.J.Robertson，ed.(IRL，Oxford，1987)，pp.113-152]。然后将嵌合的胚胎植入适当的假孕雌性养育动物中，让胚胎发育至足月产生″敲除″动物。通过标准技术可以鉴定其生殖细胞中包含同源重组DNA的子代，而且可利用该子代来繁殖所有细胞都包含同源重组DNA的动物。敲除动物可以表现下列特性，例如，具有抵御某些病理学状态的能力和由于缺少多肽而发展成病理学状态的特性。 
编码多肽的核酸也可以用于基因治疗。在基因治疗应用中，基因被引入细胞以实现体内合成治疗有效的基因产物，例如，替换有缺陷的基因。″基因治疗″包含常规基因治疗和施用基因治疗制剂，前者通过单次治疗可以实现持久的效果，后者涉及一次或重复施用治疗有效的DNA或mRNA。反义RNA和DNA可用作阻断体内某些基因表达的治疗剂。已经显示短的反义寡核苷酸可以被引入细胞，尽管因为细胞膜的限制性吸收它们的胞内浓度低，但它们可以起抑制剂的作用。例如，通过用不带电的基团取代它们的带负电的磷酸二酯基团可以修饰寡核苷酸，以增强它们的摄取。 
可获得多种将核酸导入活细胞的技术。所述技术将随核酸是被转移到体外的培养细胞里，还是被转移到体内预定宿主的细胞里而变化。适合于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞里的技术包含使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀法等等。当前优选的体内基因转移技术包括用病毒(典型地是逆转录病毒)载体进行的转染和病毒外壳蛋白脂质体介导的转染(Dzau et al.，Trends in Biotechnology 11，205-210[1993])。在有些情况下，用靶向靶细胞的试剂，例如特异性针对细胞表面膜蛋白或靶细胞的抗体、针对靶细胞上受体的配体等等来提供核酸来源是合乎需要的。使用脂质体时，结合与胞吞作用有关的细胞表面膜蛋白的蛋白质，例如特殊细胞类型向性的衣壳蛋白质或其片段、针对在循环中经历内化的蛋白质的抗体、靶向胞内定位和增强胞内半衰期的蛋白质，可用来起靶向作用和/或促进摄取。例如，Wu et al.，J.Biol.Chem.262，4429-4432(1987)和Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，3410-3414(1990)描述了受体介导内吞作用的技术。当前已知的基因标记和基因治疗规程的综述可以参见Anderson et al.，Science 256，808-813(1992)。 
这里描述的编码多肽的核酸分子或其片段对染色体鉴定有用。在这方面正存在鉴定新的染色体标记的需要，因为基于实际的序列资料，目前只能得到的相对少的染色体标记试剂。本发明的每个核酸分子都可以被用作染色体标记。 
本发明的多肽和核酸分子在诊断上可用于组织分型，其中一个组织中多肽的表达与另一个组织相比存在差别，优选有病组织中多肽的表达与相同组织类型的正常组织相比存在差别。发现核酸分子有产生供PCR、Northern分析、Southern分析和Western分析用的探针的用途。 
本发明包括筛选化合物以鉴定那些阻止多肽作用的化合物(拮抗剂)的方法。设计拮抗剂药物候选物的筛选测定方法以鉴定结合这里确定的基因编码的多肽或与该多肽形成复合物的化合物、或干扰编码的多肽与其它细胞蛋白质的相互作用的化合物，包括，例如抑制细胞表达多肽的化合物。这种筛选测定方法包括适合高通量筛选化学制剂库的测定，这使它们特别适合鉴定小分子药物候选物。 
测定可以以多种形式进行，包括在本领域已经被清楚表征的蛋白质-蛋白结合测定、生物化学筛选测定、免疫测定和基于细胞的测定。 
对拮抗剂的所有测定都有共同之处，在于它们都要求药物候选物接触这里确定的核酸编码的多肽，接触的条件和时间足以允许这两个成分发生相互作用。 
在结合测定中，相互作用是结合，而且可以在反应混合物中分离或检测形成的复合物。在特定的实施方案中，多肽或药物候选物被共价或非共价的附着固定在固相上，例如固定在微量滴定板上。非共价附着通常伴有用多肽溶液包被固体表面并进行干燥。或者，可用特异性针对待固定多肽的固定的抗体，例如单克隆抗体，将多肽锚定在固体表面上。通过添加被可检测的标记物标记的非固定成分到固定成分，例如包含锚定的成分的包被表面，可以实施测定。当反应完成时，通过，例如洗涤除去未反应成分，并检测锚定在固体表面上的复合物。当最初的非固定成分携带可检测标记物时，固定在表面上的标记物的检测表明发生了复合(complexing)。当最初的非固定成分不携带可检测标记物时，可以通过，例如利用特异性结合固定的复合物的标记抗体检测复合。 
如果候选化合物干扰多肽，但不结合多肽，那么通过众所周知的检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法可以测定候选化合物与多肽的相互作用。这种测定包括传统方法，例如，交联、共免疫沉淀和通过梯度或层析柱进行的共纯化。另外，通过利用如Chevray and Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5789-5793(1991)公开的Fields和同事(Fields and Song，Nature(London)，340：245-246(1989)；Chien et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：9578-9582(1991))描述的基于酵母的遗传***，可以监测蛋白质-蛋白质相互作用。许多转录活化剂，例如酵母GAL4，由两个物理上分离的模块域(modulardomain)组成，一个起DNA结合域的作用，另一个起转录活化域的作用。在 上述出版物中描述的酵母表达***(泛指″双杂交***″)利用了这一特性，并使用了两个杂合体蛋白，一个是其中靶蛋白质被融合到GAL4的DNA结合域的蛋白，另一个其中是候选活化蛋白质被融合到活化域的蛋白。GAL1-lacZ报告基因在GAL4活化启动子控制下的表达取决于经由蛋白质-蛋白质相互作用实现的GAL4活性的重建(reconstitution)。用β半乳糖苷酶的产色底物检测包含相互作用多肽的集落。利用双杂交技术确定两个具体蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用的完整试剂盒(MATCHMAKERTM)在市场上可从Clontech买到。该***还可以延伸到对涉及具体蛋白质相互作用的蛋白质域作图和精确地找到对这些相互作用重要的氨基酸残基。 
可以如下测试干扰编码这里鉴定的多肽的基因与其它胞内或胞外成分相互作用的化合物：通常在条件和时间足以允许所述基因产物和所述胞内或胞外成分发生相互作用和结合的情形下制备包含所述基因产物和所述胞内或胞外成分的反应混合物。为了测试候选化合物抑制结合的能力，可以在缺少和存在所述测试化合物的情况下进行反应。另外，可添加空白对照剂(placebo)到第三反应混合物中作为阳性对照。依照上文的描述，监测测试化合物和存在于混合物中的胞内或胞外成分的结合(复合物形成)。在对照反应中形成复合物，但在包含测试化合物的反应混合物中不形成复合物表明测试化合物干扰了测试化合物和它的反应配偶体的相互作用。 
为了测定拮抗剂，所述多肽可以和待筛选特殊活性的化合物一起添加到细胞中，存在多肽时化合物具有抑制目的活性的能力表明化合物是多肽拮抗剂。或者，可以通过将多肽和潜在拮抗剂在用于竞争性抑制测定的适当条件下与膜结合多肽受体或编码的受体联合(combine)来检测拮抗剂。可以标记多肽，例如通过放射活性标记多肽，这样结合到受体上的多肽分子的数目就可用于确定潜在拮抗剂的效应。通过本领域熟练技术人员已知的许多方法，例如，配体淘洗和FACS拣选可以鉴定编码受体的基因。Coliganet al.，Current Protocols in Immun.，1(2)：Chapter 5(1991)。优选使用其中多(聚)腺苷酸化的RNA是从对多肽应答的(responsive)细胞中制备的表达克隆，由此RNA产生的cDNA库被分成群(pool)，而且可用来转染COS细胞或对多肽不应答的其它细胞。将生长在载玻片上的已转染细胞暴露于标记的多肽。可以通过多种方式，包括碘化作用或纳入位点专一的蛋白质激酶的识别位点来标记多肽。在固定和孵育后，对载玻片进行放射自显影分析。鉴定阳 性群，并利用相互作用的亚群和再筛选过程制备和再转染亚群，最后产生编码推定受体的单个克隆。 
作为受体鉴定的替换方法，可以将标记的多肽通过光亲和性连接到细胞膜或表达受体分子的提取制备物上。通过PAGE分辨交联材料，并将交联材料暴露于X线胶片。可以切除包含受体的标记复合物，将标记复合物分解成肽片段，并对标记复合物进行蛋白质微测序。从微测序中获得的氨基酸序列可用来设计一组简并的寡核苷酸探针筛选cDNA库以鉴定编码推定受体的基因。 
在拮抗剂另一种测定中，可以在存在候选化合物的情况下，让表达受体的哺乳动物细胞或膜制备物与标记的多肽一起孵育。然后可以测定化合物增强或阻断这一相互作用的能力。 
潜在拮抗剂的更具体的实例包括结合免疫球蛋白与多肽融合物的寡核苷酸，特别是抗体，包括，但不限于多克隆抗体和单克隆抗体、抗体片段、单链抗体、抗独特型抗体、这种抗体或片段的嵌合或人源化型式、以及人抗体和抗体片段。或者，潜在拮抗剂可以是密切相关的蛋白质，例如，识别受体但不产生效应的多肽的突变形式，因此可以竞争性地抑制所述多肽的作用。 
另一个潜在的拮抗剂是利用反义技术制备的反义RNA或DNA构建物，例如反义RNA或DNA分子通过与靶mRNA杂交和阻止蛋白质翻译起作用，直接阻断mRNA的翻译。可以通过三股螺旋形成或反义DNA或RNA将反义技术用于控制基因表达，两种方法都基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，编码这里的成熟多肽的多核苷酸序列的5’编码部分可用于设计长度为大约10-40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被设计成与涉及转录的基因区域互补(三股螺旋(triple helix)，参见Lee et al.，Nucl.Acids Res.，6：3073(1979)；Cooney et al.，Science，241：456(1988)；Dervan et al.，Science，251：1360(1991)，因此能阻止多肽的转录和生产。反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交，从而阻断mRNA分子翻译成多肽(antisense-Okano，Neurochem.，56：560(1991)；Oligodeoxynucleotides asAntisense Inhibitors of Gene Expression(CRC Press：Boca Raton，FL，1988))；还可以将如上所述的寡核苷酸递送给细胞，这样反义RNA或DNA可以在体内表达以抑制多肽生产。当使用反义DNA时，由翻译起始位点，例如靶 基因核苷酸序列的大约-10和+10位置之间获得寡脱氧核糖核苷酸是优选的。 
潜在的拮抗剂包括结合活性部位、受体结合部位、生长因子或多肽的其它相关结合部位从而阻断多肽正常生物活性的小分子。小分子的实例包括，但不局限于小肽或肽样分子，优选可溶性肽，和合成的非肽基有机或无机化合物。 
核酶是能够催化RNA的特异性切割的酶催化RNA分子。核酶通过与互补的靶RNA进行序列特异性杂交，然后进行内切核酸酶(endonucleolytic)切割起作用。通过已知技术可以鉴别潜在RNA靶内的特异核酶切割位点。为了解详情，可参见，例如Rossi，Current Biology，4：469-471(1994)和PCT公开No.WO 97/33551(1997年9月18日公开)。 
在三螺旋结构中用于抑制转录的核酸分子应该是单链的由脱氧核苷酸组成的分子。设计这些寡核苷酸的碱基组成，使它能通过Hoogsteen碱基配对规则促进三螺旋形成，而这通常需要双链体的一条链上有相当大的嘌呤或嘧啶延伸范围。更多细节参见，例如上文的PCT申请WO 97/33551。 
通过上文讨论筛选测定中的任何一种或多种测定和/或本领域熟练技术人员众所周知的任何其它筛选技术可以鉴定这些小分子。 
利用本领域众所周知的技术和参照这里的描述，可以将分离的编码多肽的核酸用于重组生产多肽。然后使用本领域众所周知的技术和参照这里的描述，可以将生产的多肽用于产生抗体。 
可以以药物组合物形式施用特异地结合这里鉴定的多肽的抗体，以及通过以上公开的筛选测定方法鉴定的其它分子来治疗各种紊乱，包括癌症。 
如果多肽是胞内的，而且使用完整的抗体作为抑制剂，那么优选内化抗体(internalizing antibody)。但是，脂转染(lipofections)或脂质体还可以用于递送抗体或抗体片段到细胞里。使用抗体片段时，优选特异地结合靶蛋白质结合域的最小抑制片段。例如：以抗体可变区序列为基础，可以将肽分子设计成保留了结合靶蛋白质序列能力的肽分子。可以以化学方法合成和/或通过DNA重组技术生产这种肽。参见，例如Marasco et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：7889-7893(1993)。 
这里的制剂也可以包含待治疗的特定适应症必需的一种以上的活性化合物，优选那些不会不利地彼此影响的、具有补充活性的活性化合物。或 者或另外地，所述组合物可以更进一步地包含增强它功能的试剂，例如，细胞毒剂、细胞因子、化疗剂或生长抑制剂。这样的分子可以以对预定目标有效的量适当地组合存在。 
提供下面的实施列只是用作解释说明目的，无论如何，无意用它们限制本发明的范围。 
实施方案
试剂 
产色底物S2366是从DiaPharma Group，Inc.(West Chester，OH)获得的、Lys-纤溶酶原是从Haematologic Technologies Inc.(Essex Junction，VT)获得的、组织型纤维蛋白溶酶原活化因子(t-PA)是从Genentech，Inc.(South SanFrancisco，CA)获得的。在缺少血清的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达并利用HiTrap Sepharose SP层析纯化的前HGF是由David Kahn(Genentech)提供的。在杆状病毒表达***中表达包含残基Val373-Arg407的HGFA并依照(34)的描述进行纯化。在人293细胞中表达的纯化人重组FVII是MarkO’Connell(Genentech)的赠品，而且最近已经被描述(42)。基本上依照(43)的描述，利用二油酰1，2-二酰基-sn-甘油基-3-(磷酸-L-丝氨酸)(PS)(Dioleoyl 1，2-diacyl-sn-glycero-3-(phospho-L-serine))和油酰1，2-二酰基-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(oleoyl 1，2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(PC)(Avanti Polar Lipids Inc.，Alabaster，AL)来产生PCPS小囊泡(vesicle)(7∶3摩尔比)。分子量标记是SeeBlue Plus2和MultiMark标准(Invitrogen，Carlsbad，CA)。 
肝丝酶的表达和纯化 
用限制内切核酸酶EcoRI和Not I(New England Biolabs Inc.Beverly，MA)消化从I.M.A.G.E.协会(consortium)(ATCC，Manassas，VA)获得的肝丝酶全长cDNA，并将其***真核表达载体pRK5E。通过将编码人HGF信号序列(氨基酸Met1-Gly31)的cDNA与编码人肝丝酶细胞外域(Arg45-Leu417，依照Somoza et al.，2003(5)的编号***)的cDNA融合构建分泌的His标记的肝丝酶cDNA。另外，将His8标记添加到C末端Leu417 之后，最后的cDNA构建物被***真核表达载体pCMV.PD5。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞短暂表达***中表达肝丝酶，并基本上利用生产野生型sHAI-1B(34)时描述的镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析进行纯化。 
sHAI-1B、sHAI-1B突变体和sHAI-2的表达和纯化 
在CHO细胞短暂表达***中生产包含全部细胞外域的HAI-1B的可溶形式(sHAI-1B)，并依照先前(34)的描述进行纯化。利用定位诱变分别将KD1(Arg260)和KD2(Lys401)的P1残基转变为Ala，表达产生的蛋白质sHAI-1B(R260A)和sHAI-1B(K401A)，依照(34)的描述进行纯化。 
利用寡dT/Not I位点作为引物和具有Sal I位点的第二链衔接头，从来源于人胎儿肺RNA的cDNA库(BD Biosciences Clontech，Palto Alto，CA)中获得全长HAI-2。用Sal I和Not I消化cDNA；大于2.8kb的cDNA连接到pRK5D上。利用标准分子生物学方法产生人肺cDNA/pRK5D库的单链DNA。反向引物(5′-tttcttgaggcactcctccttg-3′)复性连接到单链cDNA群(pool)上，利用T7或T4DNA聚合酶进行延伸。用合成的双链DNA转化大肠杆菌，并利用标准滤膜杂交方法筛选集落。通过PCR和限制性内切酶XbaI消化分析***物大小。通过DNA测序鉴定和确认HAI-2全长克隆。通过构建编码HAI-2细胞外域(Ala28-Lys197，依照Kawaguchi et al.，1997(39)的编号***)的cDNA和添加有Gly间隔物的C末端His8标记生产HAI-2的可溶形式(sHAI-2)。然后将获得的互补DNA***来源于pVL1393的杆状病毒表达载体(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)。在杆状病毒表达***中表达sHAI-2，并基本上利用生产HGF β-链(44)时描述的Ni-NTA亲和层析进行纯化。通过定量氨基酸分析确定蛋白质浓度。 
FVII和纤溶酶原活化测定 
37℃在存在0.5mM PCPS小囊泡和5mM CaCl2的情况下，通过存在于30mM Tris-HCl，pH 8.4，30mM咪唑，200mM NaCl(Tris缓冲液)中的230nM的肝丝酶活化浓度为0.11mg/ml的FVII。利用4-20％的梯度凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)，通过SDS-PAGE(还原条件)分析在不同时间点取的反应等份。用Simply Blue Safe染色剂对凝胶进行染色(invitrogen)。 
0.12mg/ml的纤溶酶原在37℃与存在于20mM Hepes，pH 7.5，150mMNaCl(Hepes缓冲液)中的40nM肝丝酶或40nM t-PA(阳性对照)一起孵育。依照FVII活化测定中的描述，通过SDS-PAGE分析在不同时间点取的反应等份。 
肝丝酶和HGFA活化前HGF 
37℃时，前HGF(pro-HGF)(0.3mg/ml)与40nM肝丝酶或40nM HGFA在Hepes缓冲液中一起孵育4h，然后储存在-20℃直到再使用。通过SDS-PAGE对消化的材料、HGF肝丝酶和HGFHGFA的分析表明＞95％的前HGF被转变为双链HGF。 
依照描述(34，45)进行前HGF活化测定和前HGF 125I标记。简而言之就是Hepes缓冲液中的0.05mg/ml的125I标记的前HGF在37℃与浓度逐渐增加的肝丝酶或HGFA(0.16-40nM)一起孵育。4h之后，除去等份样品，并通过SDS-PAGE(4-20％的梯度凝胶)(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行分析。为了进行抑制研究，肝丝酶(15nM)37℃在Hepes缓冲液中与1μMsHAI-1B、sHAI-1B(K401A)、sHAI-1B(R260A)或sHAI-2孵育。4h后，通过SDS-PAGE分析样品，并利用Simply Blue Safe染色剂(invitrogen)进行染色。 
酶抑制测定 
测定条件与Somoza et al.2003(5)描述的利用产色底物S2366(L-焦磷酸谷氨酰(pyroglutamyl)-L-脯氨酰-L-精氨酸-p-硝基苯胺盐酸化物(L-pyroglutamyl-L-prolyl-L-arginine-p-nitroaniline hydrochloride))的条件相似。在室温，肝丝酶(最终浓度为0.4nM)在Tris缓冲液中与浓度逐渐增加的抑制剂一起孵育30分钟。添加底物S2366，并在动态微板读数器(Molecular Devices，Sunnyvale CA)上测量405nm处的吸光度变化。在最后的反应混合物中肝丝酶和S2366的浓度分别是0.4nM和0.2mM(确定的Km＝0.2mM)。抑制活性用不受抑制的酶活性的分数活性(vi/v0)来表示。通过将数据拟合到四参数回归曲线拟合程序(Kaleidagraph，SynergySoftware，Reading，PA)来计算产生50％抑制的抑制剂浓度(IC50)。对每个抑制剂实施至少三个独立实验。 
细胞增殖和迁移测定 
用从欧洲细胞培养中心(European Collection of Cell Cultures)(CAMR，Centre for Applied Microbiology and Research，Salisbury，Wiltshire，UK)获得的人胰腺腺癌细胞系BxPC3进行增殖测定。细胞生长在包含10％FCS(Sigma，St.Louis，MO)、10mM hepes、2mM谷氨酰胺、青霉素-链霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)和250μg/ml G418(Invitrogen)的RPMI培养基中。用PBS洗涤汇合的细胞层后用10mM EDTA/PBS进行洗涤，在用胰蛋白酶孵育之后解吸附细胞层。将细胞再悬浮到生长培养基中，并接种(10,000-15,000细胞/孔)到96孔白底MT板中(Cultur PlateTM，Packard/PerkinElmer，Boston，MA)。在24小时以后，用RPMI-0.1％BSA替换生长培养基。再过另外的24小时之后，除去培养基，添加存在于RPMI-0.1％BSA中的各种浓度的HGF肝丝酶和HGFHGFA，并让细胞生长72小时。然后依照制造商的说明，通过利用CellTiter-Glo Luminescent试剂盒(Promega，Madison，WI)对细胞增殖进行定量。在Tropix TR717微板光度计(Berthold 75323，Bad Wildbad，Germany)上测量发光。在减去背景值(缺少HGF时的增殖)后，HGF肝丝酶和HGFHGFA的活性表示为100ng/ml HGF对照制品(从Dr.Ralph Schwall，Genentech获得)的BxPC3增殖的百分比。 
依照(44)的描述，用乳腺癌细胞系MDA-MB435(HTB-129，ATCC，Manassas VA)进行细胞迁移测定。简而言之，将存在于没有血清的培养基中的0.2ml细胞悬液(0.6-0.8×106个细胞/ml)添加到用10μg/ml的大鼠尾I型胶原(Upstate，Lake Placid，NY)预包被的24孔跨孔板(transwell plates)(孔径大小8μm)(HTS MultiwellTM Insert System，Falcon，Franklin Lakes，NJ)的上层室中，无血清培养基中的HGF制剂被添加到下层室中。在孵育13-14小时以后，除去膜顶面(apical side)上的细胞，并用4％的多聚甲醛固定迁移到基面(basal side)的细胞，然后用0.5％的龙胆紫溶液对这些细胞进行染色。将细胞溶解在10％的乙酸中，并在分子装置微板读数器(MolecularDevices microplate reader)上测量A560。减去缺少HGF时的基础(basal)迁移后，HGF突变体的促迁移(Pro-migratory)活性表示为HGF对照制剂的百分比。 
Met受体磷酸化测定 
依照(44)的描述进行激酶受体活化测定(KIRA)。简而言之就是将肺癌A549细胞(CCL-185，ATCC，Manassas，VA)以每孔50,000细胞的密度接种到96孔板中。37℃孵育过夜后，除去生长培养基，使细胞在包含0.1％FBS的培养基中经受血清饥饿30-60分钟。在包含0.1％FBS的培养基中添加浓度逐渐增加的HGF肝丝酶和HGFHGFA。我们使用了其中切割位点发生突变(Arg494Glu)的不能被切割的单链形式的HGF(scHGF)作为对照(44)。37℃孵育10分钟之后，除去培养基并用补充有蛋白酶抑制剂鸡尾酒样混合物的溶解缓冲液(Cell Signaling Technologies，Beverly，MA)溶解细胞。将BV-TAG标记的4G10抗体和生物素化的抗Met抗体添加到细胞溶解物中。在孵育1.5-2小时以后，添加链亲和素磁珠(Dynabeads，Bio Veris)并孵育45分钟。用外部施加的磁体俘获具有结合材料(抗Met抗体/Met/抗磷酸酪氨酸抗体)的珠子。洗涤步骤后，在Bio Veris仪器上测量光源产生的化学发光信号的相对发光单位。每个实验的HGF肝丝酶、HGFHGFA或scHGF引起的Met磷酸化表示为用HGF对照制剂获得的最大信号的百分比。 
结果
肝丝酶蛋白水解处理前HGF 
在CHO细胞中表达包含全部细胞外域(Arg45-Leu417；依照Somoza etal.，2003(5)的编号***)和C末端His8标记的可溶形式的肝丝酶。在纯化处理期间，肝丝酶酶原很可能由于自身活化(4)而自然地变为双链形式(图1A)。～30kda蛋白酶域的N-末端测序(163IVGGRDTSLGR173)证实裂解发生在产生活性酶的预期的Arg162-Ile163肽键位置。肝丝酶积极地将FVII酶原转换成双链FVIIa(图1B)，这与Kazama et al.，1995(9)报道的利用细胞表面表达的肝丝酶确定FVII活化的实验一致。通过测量125I标记的前HGF转化成双链HGF来研究肝丝酶对前HGF的活性。结果显示前HGF以浓度依赖方式被肝丝酶切割(图2A)。肝丝酶的活性与HGFA的活性相当(comparable)(图2B)，在4-13nM的浓度时两个酶都实现了完全转化前HGF。在相同的测定***中，前HGF活化物因子XIa、因子XIIa和血浆激肽释放酶(kallikrein)要实现完全转化前HGF需要高大约5-6倍的浓度(45)。～36kDa和～39kDa HGFβ链的N-末端测序得到相同的序列 (495VVNGIPTRTNIG506)，显示肝丝酶在预期的Arg494-Val495肽键处加工前HGF。即使在延长的反应周期之后，肝丝酶仍不象因子XIa和血浆激肽释放酶，它不产生HGF α2链片段(通过Arg424-His425之间的切割产生)(45)。而且肝丝酶(40nM)在5小时的反应期间完全缺少活化纤溶酶原的能力(图2C)。与此相比，t-PA能高效加工纤溶酶原，在0.5小时后已经切割大约50％的酶原(图2C)。 
肝丝酶消化产生的HGF的生物活性 
用40nM肝丝酶或40nM HGFA可以将未标记的前HGF(0.3mg/ml)完全地转换(＞95％)成HGF，分别产生HGF肝丝酶和HGFHGFA。在用A549肺癌细胞进行的激酶受体测定(KIRA)中，两个HGF制剂在Met磷酸化中都诱导了类似的浓度依赖性增加，在250ng/ml时达到了最大活性(图3B)。如以前所示(44)，具有改变的切割位点(R494E)的不可切割的单链形式的HGF(scHGF)没有活性(图3B)。对照实验显示单独的肝丝酶或HGFA不产生效应(数据没有显示)。而且，HGF肝丝酶高效地促进了BxPC3胰癌细胞的增殖。该活性与研究范围为5-100ng/ml(图4A)的HGFHGFA的活性相当(comparable)。在利用胶原包被的跨孔(transwell)迁移***中，用MDA-MB435细胞进行的细胞迁移测定可获得类似的结果。就象在细胞增殖测定中发现的那样，HGF肝丝酶的促迁移效应是浓度依赖性的，与HGFHGFA 的活性是不可区别的(图4B)。 
sHAI-1B和sHAI-2抑制肝丝酶酶活性 
26个市场上可买到的产色底物的初期筛选显示Somoza et al.，2003(5)报道的底物S2366可以被肝丝酶高速水解(数据未显示)。利用S2366作为底物，测量高度纯化的可溶形式的野生型HAI-1B(sHAI-1B)和HAI-2(sHAI-2)的抑制活性。另外，我们制备了通过替换P1残基(KD1中的Arg260和KD2中的lys401)使各个库尼茨域失活的两个sHAI-1B突变体sHAI-1B(R260A)和sHAI-1B(K401A)。结果显示sHAI-1B和sHAI-2都能有力地抑制肝丝酶的酶活性，IC50值分别是21.1±2.7nM和1.3±0.3nM(图5)。而且，包含无功能KD2的突变体sHAI-1B(K401A)与野生型sHAI-1B同样有效，而sHAI-1B(R260A)具有＞47倍的降低的活性(图5)。获得的IC50 值概括在表1中。 
表1.库尼茨域抑制剂抑制肝丝酶 
Figure G05831687420070322D000951
肝丝酶介导的前HGF活化的抑制 
在125I-前-HGF活化测定中测量sHAI-1B和sHAI-2干扰大分子底物加工的能力。获得的结果与酰胺分解测定(amidolytic assay)测定中确定的抑制活性完全一致(图6)。在1μm浓度的sHAI-2、野生型sHAI-1B和sHAI-1B(K401A)中出现了对前HGF切割的完全抑制(图6)。与此相反，1μmsHAI-1B(R260A)没有显示抑制，前HGF活化进展到完全转化(图6)。 
讨论
HGF/Met信号路径在人生理学和病理学，包括肿瘤侵袭和转移中起重要作用。活性HGF的局部可利用性受细胞外环境中调节非活性前HGF加工的凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶和它们的相关抑制剂的控制。因此，癌症中′上游′前HGF转化酶路径的混乱可以通过加快前HGF加工促进肿瘤生长。这里，我们证明在***癌和卵巢癌中高度上调的丝氨酸蛋白酶-肝丝酶是前HGF的有效活化剂。因此，肝丝酶可能在HGF/Met信号路径活化引起的肿瘤生长中起重要作用(49，50)，所述HGF/Met信号路径与***癌(46-48)和卵巢癌(49，50)有关。 
肝丝酶在Arg494-Val495肽键处蛋白水解切割前HGF，在因子XIa和血浆激肽释放酶辨别的位置--Kringle域4的Arg424-His425处不产生任何另外的切割(45)。肝丝酶产生的双链HGF完全是有功能的，具有可与HGFA产生的HGF相比较的诱导Met受体磷酸化，促进细胞增殖和迁移的活性。肝丝酶介导非活性的前HGF转化成活性生长因子的潜在分子机制与凝乳蛋 白酶样丝氨酸蛋白酶蛋白水解酶原成酶的转化具有相似性。最近对前HGF活化的结构结果的研究支持这一点，结果表明Arg494-Val495处的切割导致蛋白酶样HGFβ链的构象变化和Met受体结合部位的完全成熟(44，51)。集中在HGF′活性部位区′和′活化域′上的Met结合部位与丝氨酸蛋白酶的底物加工区具有显著的相似性(44，51)。因此，肝丝酶对前HGF的切割引起HGFβ的结构重排，该结构重排允许形成许多的(productive)HGF/Met信号复合物。肝丝酶对前HGF的蛋白水解活性显示出高度特异性，因为它不切割前HGF结构上最接近的同系物纤溶酶原。肝丝酶对其它的丝氨酸蛋白酶底物，例如凝血酶原、蛋白质C、因子X和因子IX(9)却没有蛋白水解活性。 
对HGF无效小鼠(HGF null mice)的研究显示HGF Met路径对正常胚胎发育和存活是必不可少的(52，53)。与此相反，缺乏肝丝酶基因的小鼠能正常地发育，这表明肝丝酶不太可能是胚胎发生期间重要的HGF活化剂。与肝丝酶类似，其它已知的前HGF转化酶基质蛋白酶(54)、因子XI(55)、前激肽释放酶(56)和u-PA(57)的缺乏不是胚胎致死性的。因为HGF活性在胚胎发生中和出生后的生理学中的重要性，因此可以通过多重前HGF转化酶***以协调的方式调节HGF的活性。如果是这样的话，联合的前HGF转化酶基因缺陷应该导致与HGF无效小鼠类似的生长发育缺陷。或者，还没有鉴定出前HGF转化酶在胚胎发生期间调节HGF加工。 
HAI-1B、HAI-1和HAI-2是上皮细胞表面抑制剂，在许多正常组织和肿瘤内表达(34，58-63)。这样理论上它们就能调节上皮细胞表达的TTSPs和可能的其它细胞表面相关丝氨酸蛋白酶的酶活性。实际上，HAI-1剪接变体HAI-1和HAI-1B有效地抑制TTSP基质蛋白酶(MT-SP1)，而且在人母乳中已经发现HAI-1与基质蛋白酶的复合物(38)。我们在这里证明sHAI-1B和sHAI-2也是肝丝酶酶活性的有力抑制剂。而且，指向P1残基的诱变实验也证明肝丝酶的抑制完全是由sHAI-B的KD1介导的，因为突变体sHAI-1B(R260A)在前HGF测定中是非活性的，而且在酰胺分解测定中具有＜1％的野生型和KD2突变体活性。因此，肝丝酶、基质蛋白酶和HGFA不仅具有类似的前HGF转换活性(34)，而且也被sHAI-1B以相等效能(16-30nM)KD1特异方式抑制(34，64)。剪接变体HAI-1和HAI-1B的差别仅在于缺乏或存在位于KD1C末端的16个氨基酸。它们在组织中的表达模式，包括在***肿瘤和卵巢肿瘤中的表达模式是相同的，而且到目前 为止没有发现它们的效能和靶蛋白酶模式方面存在明显差别。因此，我们认为这两个剪接变体是体内功能同等物。在我们的研究中没有特别论述HAI-2库尼茨域的作用。HAI-2对大部分目标酶都使用N-和C末端库尼茨域(41，65)。 
肝丝酶与HAI-1B和HAI-2在体外的功能联系与它们在体内的上皮细胞表面的定位一起暗示它们可以构成生理学上相关的酶抑制剂***。例如：正常***和***癌细胞系中表达两种HAI-1剪接变体和HAI-2(34，59，61)，而且HAI-1抗原位于***腺上皮的分泌细胞层(59)。让人感兴趣的是***肿瘤中的肝丝酶表达位于相同的上皮细胞区室(comparment)中(19，20)，这支持HAI-1和可能的HAI-2在体内与肝丝酶相关的观点。当肝丝酶表达在***癌中强烈上调时(17-22)，依照Welsh etal.，2001(17)报道的基因表达结果HAI-1和HAI-2(17)仅轻微增加(大约1.5倍)。因此，肿瘤内的肝丝酶酶活性可能没有被适当地控制，从而导致前HGF加工和肿瘤进展增强。已经描述了与卵巢癌中的基质蛋白酶/HAI-1(68)、结肠直肠癌中的HGFA/HAI-1(66，67)和肾细胞癌中的HGFA/HAI-1(68)类似的不平衡的前HGF转化酶/抑制剂***。在这些癌的一些癌中的上调表达暗示某些转化酶/抑制剂***包括多重酶，因此增加的酶/抑制剂比例可以放大恶性后果。 
总之，上述结果显示肝丝酶高效地活化前HGF，因此揭示了肿瘤上皮细胞表面上的肝丝酶和包含非活性生长因子前体的细胞外基质之间的功能连接。HAI-1B和HAI-2是在***癌和卵巢癌中上调的肝丝酶的有效抑制剂的这一发现提供了癌症治疗的新方法。例如：HAI-1B或HAI-2的功能库尼茨域可以作为使用噬菌体展示技术产生更特异的和/或更有效力的酶抑制剂的支架(scaffold)，其中噬菌体展示技术已经成功地应用于其它的库尼茨域支架(69，70)。 
脚注/缩写 
1因子VIIa，FVIIa；Hepes缓冲液，20mM Hepes，pH 7.5，150mM NaCl；Tris缓冲液，30mM Tris-HCl，pH 8.4，30mM咪唑，200mM NaCl；前HGF，单链肝细胞生长因子；HGF，双链肝细胞生长因子；HGFA肝细胞生长因子活化剂；HAI-1，肝细胞生长因子活化物抑制剂-1；HAI-1B，肝细胞生长因 子活化物抑制剂-1的剪接变体；HAI-2，肝细胞生长因子活化物抑制剂-2；KD1和KD2，HAI-1B的N-和C末端库尼茨域；sHAI-1B，包含细胞外域的HAI-1B的可溶性形式；sHAI-2，包含细胞外域的HAI-2的可溶性形式；HGF肝丝酶，用肝丝酶活化前HGF产生的HGF；HGFHGFA，用HGFA活化前HGF产生的HGF；scHGF，具有突变切割位点(Arg494Glu)的不可切割的单链HGF；u-PA，尿激酶型血纤维蛋白溶解酶原活化剂；t-PA，组织型血纤维蛋白溶解酶原活化剂。Ni-NTA，镍次氮基三乙酸。 
参考文献的部分列表
1.Szabo，R.，Wu，Q.，Dickson，R.B.，Netzel-Arnett，S.，Antalis，T.M.，andBugge，T.H.(2003)Thromb.Haemost.90，185-193 
2.Tsuji，A.，Torres-Rosado，A.，Arai，T.，Le Beau，M.M.，Lemons，R.S.，Chou，S.-H.，and Kurachi，K.(1991)J Biol Chem 266，16948-16953 
3.Leytus，S.P.，Loeb，K.R.，Hagen，F.S.，Kurachi，K.，and Davie，E.W.(1988)Biochemistry 27，1067-1074 
4.Vu，T.-K.H.，Liu，R.W.，Haaksma，C.J.，Tomasek，J.J.，and Howard，E.W.(1997)J Biol Chem 272，31315-31320 
5.Somoza，J.R.，Ho，J.D.，Luong，C.，Ghate，M.，Sprengeler，P.A.，Mortara，K.，Shrader，W.D.，Sperandio，D.，Chan，H.，McGrath，M.E.，and Katz，B.A.(2003)Structure 11，1123-1131 
6.McCallum，C.D.，Hapak，R.C.，Neuenschwander，P.F.，Morrissey，J.H.，and Johnson，A.E.(1996)J.Biol.Chem.271，28168-28175 
7.Mutucumarana，V.P.，Duffy，E.J.，Lollar，P.，and Johnson，A.E.(1992)J.Biol.Chem.267，17012-17021 
8.Husten，E.J.，Esmon，C.T.，and Johnson，A.E.(1987)J.Biol.Chem.262，12953-12961 
9.Kazama，Y.，Hamamoto，T.，Foster，D.C.，and Kisiel，W.(1995)J.Biol.Chem.270，66-72 
10.Wu，Q.，Yu，D.，Post，J.，Halks-Miller，M.，Sadler，J.E.，and Morser，J.(1998)J.Clin.Invest.101，321-326 
11.Yu，I.-S.，Chen，H.-J.，Lee，Y.-S.E.，Huang，P.-H.，Lin，S.-R.，Tsai， T.-W.，and Lin，S.-W.(2000)Thromb.Haemost.84，865-870 
12.Zacharski，L.R.，Ornstein，D.L.，Memoli，V.A.，Rousseau，S.M.，andKisiel，W.(1998)Thromb.Haemost.79，876-877 
13.Rapaport，S.I.，and Rao，L.V.M.(1995)Thromb.Haemost.74，7-17 
14.Mann，K.G.(1999)Thromb.Haemost.82，165-174 
15.Torres-Rosado，A.，O′Shea，K.S.，Tsuji，A.，Chou，S.-H.，and Kurachi，K.(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90，7181-7185 
16.Srikantan，V.，Valladares，M.，Rhim，J.S.，Moul，J.W.，and Srivastava，S.(2002)Cancer Res.62，6812-6816 
17.Welsh，J.B.，Sapinoso，L.M.，Su，A.I.，Kern，S.G.，Wang-Rodriguez，J.，Moskaluk，C.A.，Frierson Jr.，H.F.，and Hampton，G.M.(2001)Cancer Res.61，5974-5978 
18.Stamer，T.A.，Warringyon，J.A.，Caldwell，M.C.，Chen，Z.，Fan，Z.，Mahadevappa，M.，McNeal，J.E.，Nolley，R.，and Zhang，Z.(2001)J.Urol.166，2171-2177 
19.Magee，J.A.，Araki，T.，Patil，S.，Ehrig，T.，True，L.，Humphrey，P.A.，Catalona，W.J.，Watson，M.A.，and Milbrandt，J.(2001)Cancer Res.61，5692-5696 
20.Dhanasekaran，S.M.，Barrette，T.R.，Ghosh，D.，Shah，R.，Varambally，S.，Kurachi，K.，Pienta，K.J.，Rubin，M.A.，and Chinnaiyan，A.M.(2001)Nature412，822-826 
21.Luo，J.，Duggan，D.J.，Chen，Y.，Sauvageot，J.，Ewing，C.M.，Bittner，M.L.，Trent，J.M.，and Isaacs，W.B.(2001)Cancer Res.61，4683-4688 
22.Stephan，C.，Yousef，G.M.，Scorilas，A.，Jung，K.，Jung，M.，Kristiansen，G.，Hauptmann，S.，Kishi，T.，Nakamura，T.，Loening，S.A.，andDiamandis，E.P.(2004)J.Urol.171，187-191 
23.Tanimoto，H.，Yan，Y.，Clarke，J.，Korourian，S.，Shigemasa，K.，Parmley，T.H.，Parham，G.P.，and O′Brien，T.J.(1997)Cancer Res.57，2884-2887 
24.Lin，C.-Y.，Anders，J.，Johnson，M.，Sang，Q.A.，and Dickson，R.B.(1999)J.Biol.Chem.274，18231-18236 
25.Takeuchi，T.，Shuman，M.A.，and Craik，C.S.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，11054-11061 
26.Birchmeier，C.，Birchmeier，W.，Gherardi，E.，and Vande Woude，G.F.(2003)Nature Rev. Mol. Cell Biol.4，915-925 
27.Trusolino，L.，and Comoglio，P.M.(2002)Nature Rev. Cancer 2，289-300 
28.Hartmann，G.，Naldini，L.，Weidner.K.M.，Sachs，M.，Vigna，E.，Comoglio，P.M.，and Birchmeier，W.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，11574-11578 
29.Lokker，N.A.，Mark，M.R.，Luis，E.A.，Bennett，G.L.，Robbins，K.A.，Baker，J.B.，and Godowski，P.J.(1992)EMBO J 11，2503-2510 
30.Naka，D.，Ishii，T.，Yoshiyama，Y.，Miyazawa，K.，Hara，H.，Hishida，T.，and Kitamura，N.(1992)J.Biol.Chem.267，20114-20119 
31.Gak，E.，Taylor，W.G.，Chan，A.M.-L.，and Rubin，J.S.(1992)FEBSLett.311，17-21 
32.Miyazawa，K.，Shimomura，T.，Kitamura，A.，Kondo，J.，Morimoto，Y.，and Kitamura，N.(1993)J.Biol.Chem.268，10024-10028 
33.Lee，S.-L.，Dickson，R.B.，and Lin，C.-Y.(2000)J.Biol.Chem.275，36720-36725 
34.Kirchhofer，D.，Peek，M.，Li，W.，Stamos，J.，Eigenbrot，C.，Kadkhodayan，S.，Elliott，J.M.，Corpuz，R.T.，Lazarus，R.A.，and Moran，P.(2003)J.Biol.Chem.278，36341-36349 
35.Naldini，L.，Tamagnone，L.，Vigna，E.，Sachs，M.，Hartmann，G.，Birchmeier，W.，Daikuhara，Y.，Tsubouchi，H.，Blasi，F.，and Comoglio，P.M.(1992)EMBO J.11，4825-4833 
36.Shimomura，T.，Miyazawa，K.，Komiyama，Y.，Hiraoka，H.，Naka，D.，Morimoto，Y.，and Kitamura，N.(1995)Eur.J.Biochem.229，257-261 
37.Shimomura，T.，Denda，K.，Kitamura，A.，Kawaguchi，T.，Kito，M.，Kondo，J.，Kagaya，S.，Qin，L.，Takata，H.，Miyazawa，K.，and Kitamura，N.(1997)J.Biol.Chem.272，6370-6376 
38.Lin，C.-Y.，Anders，J.，Johnson，M.，and Dickson，R.B.(1999)J.Biol. Chem.274，18237-18242 
39.Kawaguchi，T.，Qin，L.，Shimomura，T.，Kondo，J.，Matsumoto，K.，Denda，K.，and Kitamura，N.(1997)J.Biol.Chem.272，27558-27564 
40.Marlor，C.W.，Delaria，K.A.，Davis，G.，Muller，D.K.，Greve，J.M.，and Tamburini，P.P.(1997)J.Biol.Chem.272，12202-12208 
41.Delaria，K.A.，Muller，D.K.，Marlor，C.W.，Brown，J.E.，Das，R.C.，Roczniak，S.O.，and Tamburini，P.P.(1997)J.Biol.Chem.272，12209-12214 
42.Kelley，R.F.，Yang，J.，Eigenbrot，C.，Moran，P.，Peek，M.，Lipari，M.T.，and Kirchhofer，D.(2004)Biochemistry 43，1223-1229 
43.Mimms，L.T.，Zampighi，G.，Nozaki，Y.，Tanford，C.，and Reynolds，J.A.(1981)Biochemistry 20，833-840 
44.Kirchhofer，D.，Yao，X.，Peek，M.，Eigenbrot，C.，Lipari，M.T.，Billeci，K.L.，Maun，H.R.，Moran，P.，Santell，L.，Wiesmann，C.，and Lazarus，R.A.(2004)J.Biol.Chem.(in press) 
45.Peek，M.，Moran，P.，Mendoza，N.，Wickramasinghe，D.，andKirchhofer，D.(2002)J.Biol.Chem.277，47804-47809 
46.Gmyrek，G.A.，Walburg，M.，Webb，C.P.，Yu，H.-M.，You，X.，Darracott Vaughan，E.，Vande Woude，G.F.，and Kundsen，B.S.(2001)Am.J.Pathol.159，579-590 
47.Knudsen，B.S.，Gmyrek，G.A.，Inra，J.，Scherr，D.S.，Vaughan，E.D.，Nanus，D.M.，Kattan，M.W.，Gerald，W.L.，and Vande Woude，G.F.(2002)Urology 60，1113-1117 
48.Zhu，X.，and Humphrey，P.A.(2000)Urology 56，1071-1074 
49.Huntsman，D.，Resau，J.H.，Klineberg，E.，and Auersperg，N.(1999)Am.J.Pathol.155，343-348 
50.Wong，A.S.T.，Pelech，S.L.，Woo，M.M.M.，Yim，G.，Rosen，B.，Ehlen，T.，Leung，P.C.K.，and Auersperg，N.(2001)Oncogene 20，1318-1328 
51.Stamos，J.，Lazarus，R.A.，Yao，X.，Kirchhofer，D.，and Wiesmann，C.(2004)EMBO J.23，2325-2335 
52.Schmidt，C.，Bladt，F.，Goedecke，S.，Brinkmann，V.，Zschiesche，W.，Sharpe，M.，Gherardi，E.，and Birchmeier，C.(1995)Nature(London)373， 699-702 
53.Uehara，Y.，Minowa，O.，Mori，C.，Shiota，K.，Kuno，J.，Noda，T.，andKitamura，N.(1995)Nature(London)373，702-705 
54.List，K.，Haudenschild，C.C.，Szabo，R.，Chen，W.，Wahl，S.M.，Swaim，W.，Engelholm，L.H.，Behrendt，N.，and Bugge，T.H.(2002)Oncogene21，3765-3779 
55.Gailani，D.，Lasky，N.M.，and Broze Jr.，G.J.(1997)Blood Coag.Fibrinol.8，134-144 
56.Hathaway，W.E.，Wuepper，K.D.，Weston，W.L.，Humbert，J.R.，Rivers，R.P.A.，Genton，E.，August，C.S.，Montgomery，R.R.，and Mass，M.F.(1976)Am.J.Med.60，654-664 
57.Carmeliet，P.，Schoonjans，L.，Kieckens，L.，Ream，B.，Degen，J.，Bronson，R.，De Vos，R.，van den Oord，J.J.，Collen，D.，and Mulligan，R.C.(1994)Nature 368，419-424 
58.Hamasuna，R.，Kataoka，H.，Meng，J.-Y.，Itoh，H.，Moriyama，T.，Wakisaka，S.，and Koono，M.(2001)Int.J.Cancer 93，339-345 
59.Kataoka，H.，Suganuma，T.，Shimomura，T.，Itoh，H.，Kitamura，N.，Nabeshima，K.，and Koono，M.(1999)J.Histochem.Cytochem.47，673-682 
60.Kataoka，H.，Itoh，H.，Uchino，H.，Hamasuna，R.，Kitamura，N.，Nabeshima，K.，and Koono，M.(2000)Cancer Lett.148，127-134 
61.Parr，C.，and Jiang，W.G.(2001)Int.J.Oncol.19，857-863 
62.Oberst，M.，Anders，J.，Xie，B.，Singh，B.，Ossandon，M.，Johnson，M.，Dickson，R.B.，and Lin，C.-Y.(2001)Am.J.Pathol.158，1301-1311 
63.Oberst，M.D.，Johnson，M.D.，Dickson，R.B.，Lin，C.-Y.，Singh，B.，Stewart，M.，Williams，A.，al-Nafussi，A.，Smyth，J.F.，Gabra，H.，and Sellar，G.C.(2002)Clin.Cancer Res.8，1101-1107 
64.Denda，K.，Shimomura，T.，Kawaguchi，T.，Miyazawa，K.，andKitamura，N.(2002)J.Biol.Chem.277，14053-14059 
65.Qin，L.，Denda，K.，Shimomura，T.，Kawaguchi，T.，and Kitamura，N.(1998)FEBS lett.436，111-114 
66.Kataoka，H.，Hamasuna，R.，Itoh，H.，Kitamura，N.，and Koono，M. (2000)Cancer Res.60，6148-6159 
67.Kataoka，H.，Uchino，H.，Denda，K.，Kitamura，N.，Itoh，H.，Tsubouchi，H.，Nabeshima，K.，and Koono，M.(1998)Cancer Lett.128，219-227 
68.Yamauchi，M.，Kataoka，H.，Itoh，H.，Seguchi，T.，Hasui，Y.，andOsada，Y.(2004)J.Urol.171，890-896 
69.Dennis，M.S.，and Lazarus，R.A.(1994)J.Bilo.Chem.269，22129-22136 
70.Dennis，M.S.，Herzka，A.，and Lazarus，R.A.(1995)J.Biol.Chem.270，25411-25417 

Claims (3)

1.鉴定抑制肝细胞生长因子(HGF)的肝丝酶活化的候选抑制剂物质的方法，所述方法包括：
(a)让候选物质接触包含肝丝酶和前HGF底物的第一样品，其中
前HGF底物是由前HGF或其含有R494-V495肽键的野生型形式的片段组成的多肽，
和
(b)将样品中前HGF底物活化的量与参考样品中前HGF底物活化的量进行比较，所述参考样品包含与第一样品相似量的肝丝酶和前HGF底物，但它不与所述的候选物质接触，与参考样品相比第一样品中前HGF底物活化的量下降表明候选物质能够抑制肝丝酶活化单链HGF。
2.权利要求1的方法，其中所述物质结合肝丝酶或前HGF。
3.权利要求1的方法，其中样品中的肝丝酶是有效量的活化所述前HGF的肝丝酶。
CN2005800316874A 2004-07-26 2005-07-25 调节肝细胞生长因子活化的方法和组合物 Expired - Fee Related CN101023182B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US59133904P 2004-07-26 2004-07-26
US60/591,339 2004-07-26
PCT/US2005/026446 WO2006014928A1 (en) 2004-07-26 2005-07-25 Methods and compositions for modulating hepatocyte growth factor activation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101023182A CN101023182A (zh) 2007-08-22
CN101023182B true CN101023182B (zh) 2013-04-17

Family

ID=35094502

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2005800316874A Expired - Fee Related CN101023182B (zh) 2004-07-26 2005-07-25 调节肝细胞生长因子活化的方法和组合物

Country Status (16)

Country Link
US (3) US7432044B2 (zh)
EP (1) EP1774022B1 (zh)
JP (2) JP5226308B2 (zh)
KR (1) KR101222254B1 (zh)
CN (1) CN101023182B (zh)
AU (1) AU2005269463B2 (zh)
BR (1) BRPI0512482A (zh)
CA (1) CA2570323C (zh)
ES (1) ES2532610T3 (zh)
HK (1) HK1100294A1 (zh)
IL (1) IL179917A0 (zh)
MX (1) MX2007001064A (zh)
NZ (1) NZ551908A (zh)
RU (1) RU2405041C2 (zh)
WO (1) WO2006014928A1 (zh)
ZA (1) ZA200700745B (zh)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5962639A (en) 1987-11-06 1999-10-05 Washington Research Foundation Synthetic peptides corresponding to telopeptide sequences of cross-linked type I collagen metabolites
WO2000062065A1 (en) * 1999-04-09 2000-10-19 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The National Institutes Of Health Complex formed by n-linked glycoproteins (siblings) and factor h
EP1831370A4 (en) 2004-12-13 2009-08-12 Alethia Biotherapeutics Inc POLYNUCLEOTIDE AND POLYPEPTIDE SEQUENCES PARTICIPATING IN BONE REMODELING
ES2536921T3 (es) * 2006-06-22 2015-05-29 Genentech, Inc. Métodos y composiciones para modular la activación por hepsina del activador de plasminógeno de tipo urocinasa
EP2044124A2 (en) 2006-06-22 2009-04-08 Genentech, Inc. Methods and compositions for targeting hepsin
WO2008102452A1 (ja) * 2007-02-22 2008-08-28 Kringle Pharma Inc. Ｈｇｆ製剤
US20110206704A1 (en) * 2009-10-19 2011-08-25 Genentech, Inc. Methods and compositions for modulating hepatocyte growth factor activator
RU2559533C2 (ru) 2009-10-22 2015-08-10 Дженентек, Инк. Антитела против гепсина и способы их применения
WO2011050194A1 (en) * 2009-10-22 2011-04-28 Genentech, Inc. Methods and compositions for modulating hepsin activation of macrophage-stimulating protein
WO2011161189A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-hepsin antibodies and methods of use
KR20120100027A (ko) 2011-03-02 2012-09-12 한국생명공학연구원 엔도사이토시스 모티프 및 단백질 도입 도메인을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2013070771A1 (en) * 2011-11-07 2013-05-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Administration of factor xi antisense oligonucleotides
US10260089B2 (en) 2012-10-29 2019-04-16 The Research Foundation Of The State University Of New York Compositions and methods for recognition of RNA using triple helical peptide nucleic acids
ES2887079T3 (es) 2014-04-28 2021-12-21 Eisai R&D Man Co Ltd Preparación de HGF liofilizada
WO2016144654A1 (en) 2015-03-09 2016-09-15 Washington University Inhibitors of growth factor activation enzymes
JP7118508B2 (ja) * 2016-02-23 2022-08-16 ザ リージェンツ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ コロラド，ア ボディ コーポレイト 神経損傷を治療するペプチドベースの方法
US11548926B2 (en) * 2016-03-17 2023-01-10 Eisai R&D Management Co., Ltd. Method for producing an active hepatocyte growth factor (HGF)
US20220220176A1 (en) * 2019-01-28 2022-07-14 Toray Industries, Inc. Polyethylene glycol-modified form of hepatocyte growth factor or active fragment thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1198675A (zh) * 1995-08-29 1998-11-11 住友制药株式会社 含有hgf基因的药物

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
AU2353384A (en) 1983-01-19 1984-07-26 Genentech Inc. Amplification in eukaryotic host cells
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5206161A (en) 1991-02-01 1993-04-27 Genentech, Inc. Human plasma carboxypeptidase B
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
EP0752248B1 (en) 1992-11-13 2000-09-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US6037136A (en) * 1994-10-24 2000-03-14 Cold Spring Harbor Laboratory Interactions between RaF proto-oncogenes and CDC25 phosphatases, and uses related thereto
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US7282198B2 (en) * 1997-03-19 2007-10-16 The University Of Arkansas For Medical Sciences Immunotherapeutic methods targeted towards stratum corneum chymotryptic enzyme
US5981830A (en) * 1997-05-30 1999-11-09 Schering Aktiengesellschaft Knockout mice and their progeny with a disrupted hepsin gene
US6423543B1 (en) * 2000-12-20 2002-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of hepsin expression
WO2002059373A2 (en) 2001-01-23 2002-08-01 Irm, Llc Genes overexpressed in prostate disorders as diagnostic and therapeutic targets
US20030049645A1 (en) * 2001-02-14 2003-03-13 David Mu Amplified cancer gene hepsin
US6482630B2 (en) * 2001-03-29 2002-11-19 Applera Corporation Isolated human protease proteins, nucleic acid molecules encoding human protease proteins, and uses thereof
US7229774B2 (en) * 2001-08-02 2007-06-12 Regents Of The University Of Michigan Expression profile of prostate cancer
US20040009911A1 (en) * 2002-01-31 2004-01-15 Irm, Llc Hepsin substrates and prodrugs
US20040001801A1 (en) * 2002-05-23 2004-01-01 Corvas International, Inc. Conjugates activated by cell surface proteases and therapeutic uses thereof
AU2003260316A1 (en) 2002-07-23 2004-02-09 Bayer Healthcare Ag Regulation of human hepsin
US20040132156A1 (en) * 2002-10-04 2004-07-08 Schering Aktiengesellschaft Modified hepsin molecules having a substitute activation sequence and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1198675A (zh) * 1995-08-29 1998-11-11 住友制药株式会社 含有hgf基因的药物

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Daniel Kirchhofer et al..Tissue Expression, Protease Specificity, and Kunitz DomainFunctions of Hepatocyte Growth Factor Activator Inhibitor-1B(HAI-1B), a New Splice Variant of HAI-1.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY278 38.2003,278(38),36341-36349.
Daniel Kirchhofer et al..Tissue Expression, Protease Specificity, and Kunitz DomainFunctions of Hepatocyte Growth Factor Activator Inhibitor-1B(HAI-1B), a New Splice Variant of HAI-1.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY278 38.2003,278(38),36341-36349. *
Takeshi Shimomura et al..Hepatocyte Growth Factor Activator Inhibitor, a Novel Kunitz-type Serine Protease Inhibitor.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY272 10.1997,272(10),6370-6376. *
TakeshiShimomuraetal..HepatocyteGrowthFactorActivatorInhibitor a Novel Kunitz-type Serine Protease Inhibitor.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY272 10.1997

Also Published As

Publication number Publication date
RU2405041C2 (ru) 2010-11-27
RU2007106862A (ru) 2008-09-10
JP5226308B2 (ja) 2013-07-03
NZ551908A (en) 2009-10-30
US20060084120A1 (en) 2006-04-20
CN101023182A (zh) 2007-08-22
JP2012196217A (ja) 2012-10-18
ES2532610T3 (es) 2015-03-30
IL179917A0 (en) 2007-05-15
KR20070037499A (ko) 2007-04-04
AU2005269463A1 (en) 2006-02-09
EP1774022B1 (en) 2014-12-31
US7432044B2 (en) 2008-10-07
MX2007001064A (es) 2007-04-12
KR101222254B1 (ko) 2013-01-16
JP2008507295A (ja) 2008-03-13
WO2006014928A1 (en) 2006-02-09
ZA200700745B (en) 2008-07-30
AU2005269463B2 (en) 2011-08-18
BRPI0512482A (pt) 2008-03-11
CA2570323A1 (en) 2006-02-09
HK1100294A1 (zh) 2007-09-14
CA2570323C (en) 2014-08-26
EP1774022A1 (en) 2007-04-18
US20100209956A1 (en) 2010-08-19
US20090075317A1 (en) 2009-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101023182B (zh) 调节肝细胞生长因子活化的方法和组合物
US20090054631A1 (en) Compositions and methods for treatment of non-hodgkin's lymphoma
US20130022611A1 (en) Methods and compositions for modulating hepsin activation of urokinase-type plasminogen activator
US20130034570A1 (en) Methods and compositions for modulating prostasin
CN102711826B (zh) 用于调控巨噬细胞刺激性蛋白的hepsin活化的方法和组合物
CN101208431A (zh) 用于肿瘤诊断和治疗的组合物和方法
AU2011250759B2 (en) Methods and compositions for modulating hepatocyte growth factor activation
CN101790539A (zh) 细胞应激应答的缓解

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130417

Termination date: 20200725

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee