KR101222254B1 - 간세포 성장 인자 활성화를 조정하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 특히 헵신에 의한 프로-HGF 활성화를 조절함으로써, 헵신 활성 및 HGF/c-met 신호전달 경로를 조정하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

헵신, 간세포 성장 인자 (HGF), 프로-HGF, HGF 활성화, HGF/c-met 신호전달 경로, c-met 활성화, 헵신 길항제

Description

간세포 성장 인자 활성화를 조정하기 위한 조성물 및 방법{METHODS AND COMPOSITIONS FOR MUDULATING HEPATOCYTE GROWTH FACTOR ACTIVATION}

관련 출원

본 출원은 2004년 7월 26일 출원된 가출원 번호 60/591,339 (거명에 의해 본원에 포함됨)를 35 USC 119(e) 하에 우선권으로 청구하는, 37 CFR 1.53(b)(1) 하에 출원된 정식 출원이다.

본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 성장 인자 조절 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 HGF/c-met 신호전달 경로의 조정인자, 상기 조정인자의 용도에 관한 것이다.

헵신 (TMRPRSS1으로 또한 공지됨)은 세포 표면에서 발현되는 키모트립신-유사 세린 프로테아제이고, 제II형 막횡단 세린 프로테아제 (TTSP) 족의 구성원이며, 이 족에는 매트립타제(matriptase) (MT-SP1으로 또한 공지됨) 및 엔테로펩티다제(enteropeptidase)가 또한 포함된다 (1). 염색체 19 상에 q11-13.2에 위치한 인간 헵신 유전자 (2)는 짧은 N-말단 세포질 꼬리, 막횡단 영역, 및 스캐빈져(scavenger) 수용체 시스테인-풍부 (SRCR) 도메인 및 프로테아제 도메인으로 구 성되는 세포외 도메인 (Arg45-Leu417)을 포함하는 아미노산 417개의 폴리펩티드 (3)를 코딩한다. 헵신 효소원은 Arg162-Ile163에서의 절단에 의해 자가촉매적으로 활성화되어 (4), 프로테아제 도메인이 SRCR 도메인에 디술피드 연결 (Cys153-Cys277)된 이종이량체성 효소를 형성한다. Cys-Cys 공유 결합에 더하여, 최근 측정된 헵신의 결정 구조는 SRCR 및 프로테아제 도메인이 광범위한 계면 영역을 공유하고, 각각의 도메인이 약 1200 Å 매입된다는 것을 나타냈다 (5). 이러한 계면 영역이 SRCR 도메인의 막-인접 잔기 근처에 위치하기 때문에, 헵신 프로테아제 도메인 및 활성 부위가 세포 표면에 가깝게 놓일 수 있다 (5). 이는 활성 부위가 막 표면 상의 먼 곳에 (60-80 Å) 국소화된 (6-8), 세포 표면에 어셈블링된(assembled) 다른 세린 프로테아제, 예컨대 응고 인자 VIIa (FVIIa)¹, IXa 및 Xa와 근본적으로 상이하다.

헵신의 생리학적 기능은 정의하기 어려웠다. 응고 인자 VII를 제외하고는, 거대분자 기질이 공지되어 있지 않고, 생리학적으로 관련된 억제제가 확인되어 있지 않다. 헵신-형질감염된 세포가 응고 인자 VII를 활성화시킬 수 있다는 것을 설명한 [Kazama et al. (1995)] (9)에 의해 혈액 응고에서의 헵신의 역할이 제안되었다. 그러나, 헵신-결핍 마우스가 생존가능하였고 혈액 응고 장애를 나타내지 않아 (10, 11), 정상적인 지혈에서의 헵신의 중요성이 의심되었다. 그러나, 헵신이 혈액 응고의 일차 개시인자인 조직 인자 (13,14)가 없는 신장 세포 암종 (12)과 같은 병리학적 상황에서 피브린 형성에 기여할 수 있다. 또한, 기타 연구들에서 헵신과 세포 성장 간의 기능적인 연계가 제안되었다. 종양 세포주 및 사용된 실험 조건에 따라, 헵신은 성장 촉진 (15) 또는 성장 저해 활성 (16)을 갖는 것으로 보고되었다. 헵신에 관한 추가적인 정보는, 특히, PCT 공개WO2004/009803; 미국 특허 제6,482,630호; 미국 특허 제6,423,543호; 미국 특허 제5,981,830호; 미국 특허 출원 공개 제2004/0009911 A1호; 미국 특허 출원 공개 제2004/0001801 A1호; 미국 특허 출원 공개 제2003/0223973 A1호; 미국 특허 출원 공개 제2003/0175736 A1호; 미국 특허 출원 공개 제2003/0013097 A1호 (또한 WO02/059373); 미국 특허 출원 공개 제2003/0049645호 (또한 WO02/064839); 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0132156호에서 확인할 수 있다.

최근의 유전자 발현 실험에서는 헵신이 전립선 암에서 가장 고도로 상향조절된 유전자 중 하나로 확인되었다 (17-22). 계내(in-situ) 염색은 전립선 분비선의 상피 세포 상에서의 헵신 발현을 나타냈다 (19). 헵신 발현은 신생물성 형질전환과 상호관련되었고 (19), 질환이 진행된 환자의 종양에서 가장 높고, 양성 증식증에서 가장 낮았다 (18,22). 반면에, 한 연구에서는 헵신 단백질의 낮은 발현이 높은 글리슨(Gleason) 점수 및 대형 종양과 상호관련되었음이 밝혀졌다 (20). 이러한 명백한 모순이, 사용된 방법, 즉 면역조직화학 (20) 대 RNA 정량 (18,22)에 관련되는지 여부는 확실하지 않다. 게다가, 헵신은 난소암 (23) 및 신장 세포 암종에서도 강력하게 상향조절되고, 이 때 이는 상피 세포 유형 (12)과 주로 관련된다.

상피 세포 표면에서, 헵신은 세포외 매트릭스의 성분 및 기타 막 회합(associated) 단백질과 상호작용하도록 이상적으로 놓인다. 헵신에 구조적으로 관련된 TTSP 매트립타제 (MT-SP1과 동의어) (24,25)가 포함되는 키모트립신-유사 세린 프로테아제는 피브린 용해 효소, 매트릭스 메탈로프로테아제 및 잠재(latent) 형태의 성장 인자, 예컨대 간세포 성장 인자 (HGF)를 활성화시키는 것으로 공지되어 있다. HGF는 수용체 타이로신 키나제 Met을 활성화시킴으로써 세포 증식, 이동, 혈관신생, 생존 및 형태발생을 촉진한다 ((26,27)에서 개관됨). 정상적인 생리학에서의 이의 중요성에 더하여, HGF/Met 경로는 침습성 종양 성장 및 종양 전이에 관련되었다 (26). HGF는 세린 프로테아제 플라스미노겐과의 유사성이 높고, N-도메인 및 4개의 크링글(Kringle) 도메인을 함유하는 α-사슬 및 키모트립신-유사 프로테아제에 대한 상동성을 갖는 β-사슬로 구성된다. 이는 세포외 매트릭스 내로 불활성 단일쇄 전구체 (프로(pro)-HGF)로 분비되고, 생물학적으로 수용성인(competent), 디술피드-연결된 α/β 이종이량체를 형성하기 위해 Arg494-Val495에서의 활성화 절단을 필요로 한다 (28-31). 이러한 단계는 프로-HGF 전환 세린 프로테아제, 예컨대 간세포 성장 인자 활성화제 (HGFA) (32), 매트립타제 (33,34), 유로키나제-유형 플라스미노겐 활성화제 (u-PA) (35), XIIa 인자 (36), XIa 인자 및 혈장 칼리크레인(kallikrein) (34)에 의해 매개된다. HGFA 및 매트립타제는 세포 표면에서 발현되는 쿠니츠(Kunitz)-유형 억제제, 예컨대 2개의 간세포 성장 인자 활성화제 억제제 스플라이스(splice) 변이체인 HAI-1 (37,38) 및 HAI-1B (34)에 의해, 그리고 HAI-2 (39)에 의해 억제된다. HAI-2 (태반 비쿠닌(bikunin)으로 또한 공지됨) (40)은 XIa 인자 및 혈장 칼리크레인을 또한 강력하게 억제하는 반면 (41), HAI-1B는 억제 활성이 거의 없거나 없다 (34). 따라서, 세포외 매트릭스에 서의 프로-HGF 풀(pool)의 생물학적 이용가능성은 프로-HGF 전환효소 및 이들의 억제제의 활성에 의해 조절된다.

이의 조절곤란이 발암의 기초가 될 수 있는 다른 성장 인자의 조절인자로서 작용하는 이의 잠재적인 역할과 결부된, 상기 기술된 바와 같은 암 조직에서의 헵신의 발현 프로파일은, 헵신과 이의 기질의 상호작용을 조정하는 것이 효율적인 치료적 접근법인 것으로 입증될 수 있다는 것을 제시한다. 이와 관련하여, 헵신의 생리학적 기질 및/또는 이의 생리학적 조정인자(들)을 확인하는 것이 뚜렷하게 요구된다. 본 발명은 이러한 요구를 만족시키고, 또다른 장점을 제공한다.

특허 출원 및 간행물을 포함하여, 본원에서 언급된 모든 참고문헌은 전체적으로 참고로 도입된다.

발명의 개요

본원에 기술된, 여러 암에서 고도로 과발현되는 세포-표면 단백질인 헵신에 대한 생리학적인 기질은 간세포 성장 인자이고, 간세포 성장 인자 자체는 암 발달의 많은 양상에서 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있다. 헵신은 강력한 생리학적 프로-HGF 전환효소인 HGFA (간세포 성장 인자 활성화제)에 필적하는 활성으로 프로-HGF를 절단하는 것으로 본원에서 제시된다. 헵신에 의해 생성된 2-사슬 (활성화된) HGF는 Met 타이로신 인산화, 세포 증식 자극, 및 세포 이동 자극이 포함되는 정상적인 생물학적 활성을 나타낸다. 또한, 2개의 쿠니츠 도메인 억제제, HAI-1B 및 HAI-2는 헵신 효소 활성의 생리학적 조절인자로서 본원에서 확인된다. 본 발명은 이러한 발견을 적어도 부분적으로 기초로 하는 방법 및 조성물을 제공하고, 이는 하기에 더욱 상세하게 기술된다. 헵신, 및 헵신과 HGF 및/또는 이의 생리학적 억제제의 상호작용은 HGF/Met ("c-met"으로 또한 공지됨) 경로의 비정상적 또는 원치 않는 신호전달과 관련된 병리학적 상태에 대한 예방적 및/또는 치료적 접근법을 고안하는데 있어서 더욱 양호한 미세 조정을 위한 독특하고 유리한 표적일 수 있는 것으로 나타난다. 따라서, 본 발명은 HGF 활성화의 조절에서 수반되는 생리학적 상호작용 분자의 조정을 통해 HGF/c-met 경로를 조정할 수 있는 물질의 확인 및 사용을 위한 방법, 조성물, 키트 및 제조품을 제공한다.

따라서, 한 양상에서, 본 발명은 (a) 후보 물질을 헵신 및 프로-HGF 기질을 포함하는 제1 샘플과 접촉시키고, (b) 샘플 내 프로-HGF 기질 활성화의 양을, 제1 샘플과 유사한 양의 헵신 및 프로-HGF 기질을 포함하지만 상기 후보 물질과 접촉되지 않은 기준 샘플 내의 프로-HGF 기질 활성화의 양과 비교하는 것을 포함하며, 이로써 기준 샘플에 비교한 제1 샘플 내의 프로-HGF 기질 활성화 양의 감소는 후보 물질이 단일쇄 HGF (프로-HGF)의 헵신 활성화를 억제할 수 있음을 나타내는 것인, HGF의 헵신 활성화를 억제하는 후보 억제제 (즉, 길항제) 물질의 스크리닝 (또는 확인) 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 샘플 내의 헵신은 상기 프로-HGF를 활성화시키는데 유효한 양이다. 이러한 방법에서 사용하기에 적절한 프로-HGF 기질은 프로-HGF 상의 헵신 절단 부위의 특징을 모방하는 한 다수의 형태일 수 있다. 프로-HGF 기질의 예로는 야생형 형태의 R494-V495 펩티드 연결을 포함하는 전장 단일쇄 HGF, 및 이러한 펩티드 연결을 포함하는 HGF의 임의의 단편이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 이같은 단편은 임의의 길이일 수 있고, 예를 들어 아미노 산 적어도 (약) 5, 7, 10, 15, 20, 25개의 길이, 또는 아미노산 (약) 4 내지 25개, 5 내지 20개, 7 내지 15 개의 길이일 수 있다. 일반적으로 및 바람직하게는, 프로-HGF 기질은 야생형 헵신에 의해 절단될 수 있는 R494-V495 펩티드 결합을 포함한다. 한 실시양태에서, 프로-HGF 기질은 프로테아제의 컨센서스(consensus) 절단 부위 (즉, 위치 P₁에서의 염기성 잔기, 및 위치 P₁' 및 P₂'에서의 2개의 소수성 아미노산 잔기 - P₁ R494, P₁' V495, P₂' V496)에 맞는 인간 HGF의 절단 부위를 포함한다.

또다른 양상에서, 본 발명은 헵신에 의한 프로-HGF 활성화를 차단하는 물질을 스크리닝하는 방법으로, 헵신 또는 프로-HGF에 결합하고 (필수적이지는 않지만 바람직하게는, 특이적으로), 헵신과 프로-HGF 간의 특이적인 상호작용 (예를 들어, 결합)을 차단하는 물질을 스크리닝하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 물질은 HGF에의 결합에 대해 헵신과 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 이 물질은 헵신에의 결합에 대해 프로-HGF와 경쟁한다. 한 실시양태에서, 이 물질은 프로-HGF (예를 들어, 인간), 예를 들어, 495(Val)에 연결된 아미노산 잔기 494(Arg) 펩티드를 포함하는 인간 HGF의 단편과 관련하여 적어도 약 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 99％ 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 구성되거나, 또는 이것으로 본질적으로 구성된다. 물질이 이같은 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 구성되거나, 또는 이것으로 본질적으로 구성되는 일부 실시양태에서, 단편은 돌연변이되거나 HGF 베타 사슬의 적어도 일부가 결여되어, 야생형 HGF와 비교하여 상기 단편의 c-met 활성화 활성이 감소된다.

당업자에게 명백할 바와 같이, 상기 기술된 것들과 일치하는 스크리닝 분석법은 후보 조정 물질의 제1 셋트를 수득하기 위한 헵신-HGF 복합체 형성 판독을 기초로 하는 제1 스크리닝 단계에 이어서, HGF의 활성화 및/또는 HGF/c-met 경로를 활성화시킬 수 있는 형태로의 HGF의 전환을 조정하는 후보 조정 물질의 제1 셋트의 능력을 기초로 하는 제2 스크리닝 단계를 또한 포함할 수 있다. 적절한 판독은, 효소-기질 복합체 형성 및/또는 HGF/c-met 신호전달 경로와 관련된 생물학적 활성의 지식을 기초로, 당업자에게 명백한 임의의 것일 수 있다. 효소-기질 복합체 형성은, 예를 들어, 일상적인 생화학적 분석법 (예를 들어, 젤 전기영동, 크로마토그래피, NMR 등)을 사용하여 측정할 수 있다. HGF/c-met 생물학적 활성에는 C-met 인산화, C-met 키나제의 기질인 세포성 분자의 인산화, 세포 성장 (증식, 생존 등), 혈관신생, 세포 이동, 세포 형태발생 등이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

한 양상에서, 본 발명은 HGF/c-met 신호전달 경로를 파괴하는 HGF/c-met 길항제를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 프로-HGF의 헵신 절단 (예를 들어, R494-V495 위치에서의 절단)을 억제하는 분자를 제공한다. 이 분자는 프로-HGF의 헵신 절단이 억제되도록 헵신 또는 프로-HGF에 결합하는 것, 프로-HGF의 절단이 억제되도록 헵신-프로-HGF 복합체에 결합하는 것, 및/또는 헵신에 의한 HGF 절단의 효과가 억제되도록 프로-HGF 또는 헵신 (단독으로 또는 복합체 내에 존재)에 결합하는 것 (예를 들어, 헵신에 의한 절단에 이어서 HGF가 방출되는 것을 억제)이 포함되지 만 이에 한정되지 않는 다양한 방식으로 이의 억제 기능을 발휘할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제 분자는 c-met에 대한 HGF 결합을 억제하지 않는다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제 분자는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 기탁 번호(American Type Culture Collection Accession Number) ATCC HB-11894 (하이브리도마(hybridoma) 1A3.3.13) 또는 HB-1 1895 (하이브리도마 5D5.11.6) 하에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 항체와 유사한 억제 및/또는 결합 능력을 갖는 항체 또는 그의 단편이 아니다. 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제 분자는 HGF/c-met 활성화와 관련된 생물학적 활성을 억제한다.

한 양상에서, 본 발명의 길항제는 간세포 성장 인자 활성화제 억제제 (HAI-1, HAI-1B, HAI-2)가 프로-HGF의 헵신 활성화의 강력한 억제제라는 본원에 기술된 발견으로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 헵신에 의한 프로-HGF 활성화의 길항제를 제공하고, 상기 길항제는 인간 HAI-1, HAI-1B 또는 HAI-2의 적어도 일부 (전체 포함)를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 부분은 헵신에 의한 프로-HGF 활성화를 억제할 수 있는 쿠니츠 도메인 (KD) 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 쿠니츠 도메인 서열은 HAI-1 또는 HAI-1B의 쿠니츠 도메인 1 (KD1)이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 인간 HAI-1의 야생형 KD1과 적어도 약 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 97％, 98％, 99％의 서열 동일성을 갖는 변이체 KD1 서열을 포함하고, 이 때 상기 변이체 서열은 인간 프로-HGF의 헵신 절단을 억제하는데 있어서 야생형 KD1에 적어도 필적하는 능력을 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 인간 HAI-1의 야생형 KD1과 약 70％ 내지 99％, 약 75％ 내지 98％, 약 80％ 내지 97％, 85％ 내지 95％의 서열 동일성을 갖는 변이체 KD1 서열을 포함하고, 이 때 상기 변이체 서열은 인간 프로-HGF의 헵신 절단을 억제하는데 있어서 야생형 KD1에 적어도 필적하는 능력을 갖는다. 한 실시양태에서, 상기 쿠니츠 도메인 서열은 HAI-2의 쿠니츠 도메인 중 하나 또는 양쪽 모두이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 야생형 인간 HAI-2의 상응하는 쿠니츠 도메인(들)과 적어도 약 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 97％, 98％, 99％의 서열 동일성을 갖는 변이체 HAI-2 쿠니츠 도메인 서열을 포함하고, 이 때 상기 변이체 서열은 인간 프로-HGF의 헵신 절단을 억제하는데 있어서 야생형 HAI-2에 적어도 필적하는 능력을 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 야생형 인간 HAI-2의 상응하는 쿠니츠 도메인(들)과 약 70％ 내지 99％, 약 75％ 내지 98％, 약 80％ 내지 97％, 85％ 내지 95％의 서열 동일성을 갖는 변이체 HAI-2 쿠니츠 도메인 서열을 포함하고, 이 때 상기 서열은 인간 프로-HGF의 헵신 절단을 억제하는데 있어서 야생형 HAI-2에 적어도 필적하는 능력을 갖는다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 소형 분자, 펩티드, 항체, 항체 단편, 압타머(aptamer), 또는 이의 조합물이거나 이를 포함한다. 본원에 기술된 길항제는 본원에 기술된 헵신, 간세포 성장 인자 활성화제 억제제 및 프로-HGF의 상호작용의 발견을 기초로 당업계에 공지된 기술 (하기에 더욱 상세하게 기술되는 것들 포함)을 사용하여 일상적으로 수득할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 HGF에의 결합에 대해 헵신과 경쟁하지만, 프로-HGF를 헵신 절단 부위에서 절단하는 능력을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 길항제 는 헵신에의 결합에 대해 프로-HGF와 경쟁한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 상기 길항제는 프로-HGF (예를 들어, 인간)에 관해 적어도 약 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％, 99％의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 구성되거나, 이것으로 본질적으로 구성되고, 헵신에 실질적으로 결합할 수 있지만, 헵신 절단 부위 (예를 들어, 야생형 인간 HGF R494-V495 펩티드 연결을 포함하는 P₁ 부위)가 없고/없거나 c-met을 활성화시키는 능력이 없다 (예를 들어, HGF β 사슬이 돌연변이되거나, HGF β 사슬 또는 이의 일부가 결여된다). 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 헵신에 결합할 수 있는 HGF 단편을 포함하거나, 이것으로 구성되거나, 이것으로 본질적으로 구성되고, 이 때 상기 단편은 HGF β 사슬의 적어도 일부가 없어서, 상기 단편의 c-met 활성화 활성이 야생형 HGF에 비해 감소된다.

따라서, 본 발명은 헵신에 실질적으로 결합할 수 있지만, HGF/c-met 조정 활성이 야생형 HGF에 비해 감소된 HGF 돌연변이체, 예를 들어 HGF/c-met 활성의 길항제, 또는 HGF 생물학적 활성 (예를 들어, 세포 성장 자극 활성)에서의 감소를 나타내지만, 이러한 활성이 없지는 않은 HGF 변이체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 야생형 (생체내) HGF의 생물학적 활성을 억제할 수 있다 (이같은 생물학적 활성에는 세포 증식의 자극, 세포 생존의 증강, 혈관신생의 촉진, 세포 이동의 유도/촉진이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다). 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 감소된 세포 성장 (세포 증식, 세포 생존, 혈관신생, 세포 이동이 포함되지만 이에 한정되지 않음) 촉진 활성을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 본원에 기술된 본 발명의 스크리닝 또는 확인 방법에 의해 수득된다.

한 양상에서, 본 발명의 길항제 분자는 독소 예컨대 세포독성제에 연결된다. 이러한 분자/물질은 첨가제/증강제, 예컨대 방사선 및/또는 화학요법제와 조합되어 제형 또는 투여될 수 있다.

한 양상에서, 본 발명은 헵신에 의한 프로-HGF 절단을 증강시킬 수 있는 분자를 제공하고, 이 때 상기 분자는 헵신과의 HAI-1, HAI-1B 및/또는 HAI-2 상호작용을 방해할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 증강제 분자는 소형 분자, 펩티드, 항체, 항체 단편, 압타머, 또는 이의 조합물이거나, 이를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 증강제 분자는 HAI-1, HAI-1B 및/또는 HAI-2의 단편, 또는 이의 변이체를 포함하거나, 이것으로 구성되거나, 또는 이것으로 본질적으로 구성될 수 있고, 이 때 상기 단편은 헵신에 결합할 수 있지만, 프로-HGF의 헵신 절단을 실질적으로 억제하지 않는다. 한 실시양태에서, 상기 분자는 야생형 HAI-1, HAI-1B 및/또는 HAI-2가 헵신에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 증강제 분자는 헵신과 HAI-1, HAI-1B 및/또는 HAI-2를 포함하는 복합체의 형성을 방해하는 항체이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 증강제 분자는 헵신 또는 이의 변이체 (임의의 하기 정의된 것들 포함)이고, 이 때 헵신 또는 이의 변이체는 R494-V495 부위에서의 프로-HGF 절단을 일으킬 수 있다.

본 발명은 HGF/c-met 신호전달 축의 조절곤란과 관련된 질환 상태를 조정하 는데 유용한 방법 및 조성물을 또한 제공한다. 따라서, 한 양상에서, 본 발명은 대상에서 c-met 활성화를 조정하는 방법으로, 대상에게 본 발명의 HGF/c-met 조정인자 분자 (예를 들어, 프로-HGF의 헵신 절단을 억제하는, 본원에 기술된 바와 같은 길항제 분자)를 투여함으로써, c-met 활성화가 조정되는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 분자는 HGF/c-met 활성을 억제하는 HGF/c-met 길항제이다. 한 실시양태에서, 상기 분자는 HGF/c-met 활성을 증가시키는 증강제 분자이다. 한 양상에서, 본 발명은 대상에서 c-met 활성화와 관련된 병리학적 상태를 처치하는 방법으로, 대상에게 본 발명의 c-met 길항제 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 헵신에 의한 프로-HGF 절단 길항제 중 임의의 것)를 투여함으로써 c-met 활성화가 억제되는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

HGF/c-met 신호전달 경로는, 예를 들어, 세포 성장 자극 (예를 들어 세포 증식, 세포 생존, 세포 이동, 세포 형태발생) 및 혈관신생이 포함되는 여러 생물학적 및 생리학적 기능과 관련된다. 따라서, 또다른 양상에서, 본 발명은 c-met 활성화된 세포 성장 (예를 들어 증식 및/또는 생존)을 억제하는 방법으로, 세포 또는 조직을 본 발명의 길항제와 접촉시킴으로써, c-met 활성화와 관련된 세포 증식이 억제되는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 발명은 혈관신생을 억제하는 방법으로, 비정상적인 혈관신생과 관련된 상태의 세포, 조직 및/또는 대상에게 본 발명의 길항제를 투여함으로써, 혈관신생이 억제되는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 발명은 혈관신생을 증강시키는 방법으로, 증가된 혈관신생이 이롭고/이롭거나 준-최적(sub-optimal) 양의 혈관신생과 관련된 상태의 세포, 조직 및/또는 대상에게 본 발명의 증강제 분자를 투여함으로써, 혈관신생이 증강되는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

한 양상에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역 (예컨대 자가면역) 장애 및/또는 혈관신생-관련 장애와 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 처치를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 길항제의 용도를 제공한다. 길항제는 항체, 항체 단편, 소형 분자 (예를 들어, 유기 분자), 폴리펩티드 (예를 들어, 올리고펩티드), 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 예컨대 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드 또는 간섭(interefering) RNA), 압타머, 또는 이의 조합물을 포함하여 본원에 기술된 임의의 형태일 수 있다.

한 양상에서, 본 발명은 상처 치유 (예를 들어, 당뇨병, 외상 등과 관련된 상처)와 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 처치를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 증강제 분자의 용도를 제공한다. 증강제 분자는 항체, 항체 단편, 소형 분자 (예를 들어, 유기 분자), 폴리펩티드 (예를 들어, 올리고펩티드), 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 간섭 RNA), 압타머, 또는 이의 조합물을 포함하여 본원에 기술된 임의의 형태일 수 있다.

한 양상에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역 (예컨대 자가면역) 장애 및/또는 혈관신생-관련 장애 (예를 들어, 상처 치유)와 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 처치를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 핵산의 용도를 제공한다.

한 양상에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역 (예컨대 자가면 역) 장애 및/또는 혈관신생-관련 장애 (예를 들어, 상처 치유)와 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 처치를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 발현 벡터의 용도를 제공한다.

한 양상에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역 (예컨대 자가면역) 장애 및/또는 혈관신생-관련 장애 (예를 들어, 상처 치유)와 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 처치를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 숙주 세포의 용도를 제공한다.

한 양상에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역 (예컨대 자가면역) 장애 및/또는 혈관신생-관련 장애 (예를 들어, 상처 치유)와 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 처치를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 제조품의 용도를 제공한다.

한 양상에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역 (예컨대 자가면역) 장애 및/또는 혈관신생-관련 장애 (예를 들어, 상처 치유)와 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 처치를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 키트의 용도를 제공한다.

한 양상에서, 본 발명은 c-met 활성화된 세포 증식을 억제하는 방법으로, 세포 또는 조직을 유효량의 본 발명의 길항제와 접촉시킴으로써, c-met 활성화와 관련된 세포 증식이 억제되는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

한 양상에서, 본 발명은 대상에서 c-met 활성화의 조절곤란과 관련된 병리학적 상태를 처치하는 방법으로, 대상에게 유효량의 본 발명의 길항제를 투여함으로 써 상기 상태가 처치되는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

한 양상에서, 본 발명은 c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 양쪽 모두를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법으로, 상기 세포를 본 발명의 길항제와 접촉시킴으로써 상기 세포의 성장 억제를 야기하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 세포는 상이한 세포에 의해 (예를 들어, 측분비 효과를 통해) 발현된 HGF에 접촉된다.

한 양상에서, 본 발명은 c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 양쪽 모두를 발현하는 세포를 포함하는 암성(癌性) 종양이 있는 포유동물을 치료적으로 처치하는 방법으로, 상기 포유동물에게 유효량의 본 발명의 길항제를 투여함으로써 상기 포유동물을 효과적으로 처치하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 세포는 상이한 세포에 의해 (예를 들어, 측분비 효과를 통해) 발현된 HGF에 접촉된다.

한 양상에서, 본 발명은 헵신, c-met 및/또는 간세포 성장 인자의 증가된 발현 또는 활성과 관련된 세포 증식성 장애를 처치 또는 예방하기 위한 방법으로, 이같은 처치를 필요로 하는 대상에게 유효량의 본 발명의 길항제를 투여함으로써, 상기 세포 증식성 장애를 효과적으로 처치 또는 예방하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 증식성 장애는 암이다.

한 양상에서, 본 발명은 헵신, c-met 및/또는 간세포 성장 인자의 성장 강화 효과에 적어도 부분적으로 성장이 의존적인 세포의 성장을 억제하는 방법으로, 상기 세포를 유효량의 본 발명의 길항제와 접촉시킴으로써, 상기 세포의 성장을 억제 하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 세포는 상이한 세포에 의해 (예를 들어, 측분비 효과를 통해) 발현된 HGF에 접촉된다.

한 양상에서, 본 발명은 헵신, c-met 및/또는 간세포 성장 인자의 성장 강화 효과에 적어도 부분적으로 성장이 의존적인, 포유동물에서의 종양을 치료적으로 처치하는 방법으로, 상기 세포를 유효량의 본 발명의 길항제와 접촉시킴으로써, 상기 종양을 효과적으로 처치하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 세포는 상이한 세포에 의해 (예를 들어, 측분비 효과를 통해) 발현된 HGF에 접촉된다.

본 발명의 방법들은 임의의 적절한 병리학적 상태, 예를 들어, 헵신 및/또는 HGF/c-met 신호전달 경로의 조절곤란과 관련된 세포 및/또는 조직에 영향을 미치는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 표적화된 세포는 암 세포이다. 예를 들어, 암 세포는 유방암 세포, 결장직장암 세포, 폐암 세포, 유두상 암종 세포 (예를 들어, 갑상선의 유두상 암종 세포), 결장암 세포, 췌장암 세포, 난소암 세포, 자궁경부암 세포, 중추 신경계 암 세포, 전립선 암 세포, 골원성 육종 세포, 신장 암종 세포, 간세포 암종 세포, 방광암 세포, 위 암종 세포, 두경부 편평 암종 세포, 흑색종 세포 및 백혈병 세포로 구성되는 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 표적화된 세포는 과증식성 및/또는 과형성성 세포이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 표적화된 세포는 형성이상성 세포이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 표적화된 세포는 전이성 세포이다.

본 발명의 방법은 추가적인 처치 단계를 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 방법은 표적화된 세포 및/또는 조직 (예를 들어, 암 세포)가 방사선 처리 또는 화학요법제에 노출되는 단계를 추가로 포함한다.

본원에서 기술된 c-met 활성화는 이의 조절곤란이 수많은 병리학적 상태에 이르는 중요한 생물학적 프로세스이다. 따라서, 본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 표적화된 세포 (예를 들어, 암 세포)는 c-met의 활성화가 동일한 조직 기원의 정상 세포에 비해 증강된 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 표적화된 세포의 사멸을 야기한다. 예를 들어, 본 발명의 길항제와의 접촉으로 세포가 c-met 경로를 통해 신호전달을 할 수 없을 수 있고, 그 결과 세포가 사멸한다.

c-met 활성화 (및 따라서 신호전달)의 조절곤란은, HGF (c-met의 동족성 리간드) 및/또는 c-met 자체의 과발현이 예를 들어 포함되는 다수의 세포성 변화로부터 초래될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 양쪽 모두가 동일한 조직 기원의 정상 세포와 비교하여 더욱 풍부하게 발현되는 세포 (예를 들어, 암 세포)를 표적화하는 것을 포함한다. c-met-발현 세포는 다양한 공급원으로부터의 HGF에 의해, 즉 자가분비 또는 측분비 방식으로 조절될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 표적화된 세포는 상이한 세포에서 (예를 들어, 측분비 효과를 통해) 발현된 간세포 성장 인자에 접촉/결합한다. 상기의 상이한 세포는 동일 또는 상이한 조직 기원의 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 표적화된 세포는 표적화된 세포 자체에서 (예를 들어, 자가분비 효과/루프(loop)를 통해) 발현된 HGF에 접촉/결합한다.

한 양상에서, 본 발명은 대상에게 본 발명의 증강제 분자를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에 의해 처치되는 적절한 상태로는 대상에서의 HGF/c-met 활성과 관련된 비정상적으로/바람직하게 않게 낮은 생리학적 수준의 혈관신생과 관련된 임의의 병리학적 상태가 포함된다. 이같은 상태의 예로는 상처 치유, 심장 비대, 심근경색증, 사지 허혈, 말초 동맥 질환 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

한 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 길항제 또는 증강제, 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 담체는 제약상 허용가능한 것이다.

한 양상에서, 본 발명은 본 발명의 길항제 또는 증강제 분자를 코딩하는 핵산을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 폴리펩티드 (예를 들어, 올리고펩티드)이거나 이를 포함하는 길항제 또는 증강제 분자를 코딩한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 항체 또는 그의 단편이거나 이를 포함하는 길항제 또는 증강제 분자를 코딩한다.

한 양상에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.

한 양상에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 벡터는 임의 유형의 것, 예를 들어 재조합 벡터 예컨대 발현 벡터일 수 있다. 임의의 다양한 숙주 세포를 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵생물 세포, 예를 들어, 대장균이다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어 포유류 세포 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다.

한 양상에서, 본 발명은 본 발명의 길항제 또는 증강제 분자의 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 항체 (또는 그의 단편)이거나 이를 포함하는 길항제의 제조 방법으로, 상기 항체 (또는 그의 단편)을 코딩하는 본 발명의 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에서 발현시키고, 상기 항체를 회수하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 또다른 예에서, 본 발명은 폴리펩티드 (예컨대 올리고펩티드)이거나 이를 포함하는 길항제 또는 증강제 분자의 제조 방법으로, 상기 폴리펩티드 (예컨대 올리고펩티드)를 코딩하는 본 발명의 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에서 발현시키고, 상기 폴리펩티드 (예컨대 올리고펩티드)를 회수하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

한 양상에서, 본 발명은 용기; 및 용기 내에 함유된, 하나 이상의 본 발명의 길항제 또는 증강제 분자를 포함하는 조성물을 포함하는 제조품을 제공한다. 한 실시양태에서, 조성물은 본 발명의 핵산을 포함한다. 한 실시양태에서, 길항제 또는 증강제 분자를 포함하는 조성물은 담체를 추가로 포함하고, 이 담체는 일부 실시양태에서 제약상 허용가능한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 제조품은 조성물 (예를 들어, 길항제 또는 증강제 분자)을 대상에게 투여하기 위한 지침서를 추가로 포함한다.

한 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 길항제 또는 증강제 분자를 포함하는 조성물을 포함하는 제1 용기; 및 버퍼를 포함하는 제2 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 한 실시양태에서, 버퍼는 제약상 허용가능한 것이다. 한 실시양태에서, 길항제 또는 증강제 분자를 포함하는 조성물은 담체를 추가로 포함하고, 이 담체는 일부 실시양태에서 제약상 허용가능한 것이다. 한 실시양태에서, 키트는 조성물 (예를 들어, 길항제 또는 증강제 분자)을 대상에게 투여하기 위한 지침서를 추가로 포함한다.

도 1: 헵신 순도 및 VII 인자에 대한 활성. (A) CHO 세포에서 발현된 가용성 헵신은 전체적인 세포외 도메인 (Arg45-Leu417) 및 C-말단 His₈ 태그(tag)를 포함하였다. 정제된 헵신의 염색된 젤 (환원 조건)은 헵신이 자연발생적으로 Arg163-Ile163에서의 절단에 의해 이의 2-사슬 형태로 전환되었음을 나타낸다 (N-말단 서열분석에 의해 확인). (B) 2시간 기간 동안의 PCPS 소포 및 CaCl₂의 존재 하에서의 37℃에서의 헵신 (40 nM)에 의한 VII 인자 효소원의 활성화. FVII 효소원 뿐만 아니라 FVIIa의 경쇄 (l.c.) 및 프로테아제 도메인 (h.c.)이 표시된다. 분자량 마커는 M_r × 10^-3으로 제시된다.

도 2: 헵신에 의한 프로-HGF의 특이적 활성화. ¹²⁵I-표지된 프로-HGF (0.05 ㎎/㎖)를 20 mM 헤페스, pH 7.5, 150 mM NaCl (헤페스(Hepes) 버퍼)에서 헵신 및HGFA의 농도를 감소시키면서 인큐베이션하였다: 효소의 3-배 희석 단계, 레인 2의 40 nM에서 레인 7의 0.16 nM로 감소. (A) 헵신 및 (B) HGFA. 37 ℃에서의 4시간 후, 샘플을 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 분석한 후, x-선 필름에 노출시켰다. 프로-HGF, HGF α-사슬 및 HGF β-사슬 (이중선)의 위치가 표시된다. 레인 1은 반 응 개시 시에 즉시 취해진 분취량이다. (C) t-PA 및 헵신에 의한 플라스미노겐의 활성화. 플라스미노겐 (0.12 ㎎/㎖)을 t-PA (40 nM), 헵신 (40 nM) 또는 버퍼 (대조군)과 함께 헤페스 버퍼에서 인큐베이션하였다. 상이한 시점에 취해진 분취량을 SDS-PAGE (환원 조건)에 의해 분석한 후, 심플리 블루 세이프 스테인(Simply Blue Safe Stain)으로 염색하였다. 레인 1, 버퍼, 0.5시간; 레인 2, t-PA 0.5시간; 레인 3, 헵신, 0.5시간; 레인 4, 버퍼, 5시간; 레인 5, t-PA, 5시간; 레인 6, 헵신, 5시간. 플라스미노겐 (Plg) 및 플라스민 중쇄 (h.c)가 표시된다.

도 3: 헵신 및 HGFA에 의해 활성화된 프로-HGF에 의한 Met의 인산화. (A) 표지되지 않은 프로-HGF (0.3 ㎎/㎖)를 40 nM 헵신 또는 40 nM HGFA로 절단하여 >95％ 전환을 달성하였다. 헵신 절단 (HGF_헵신) 및 HGFA 절단 (HGF_HGFA)에 의해 생산된 HGF를 SDS-PAGE (환원 조건)에 의해 분석하고, 심플리 블루 세이프 스테인으로 염색하였다. (B) Met 수용체의 인산화를 A549 세포를 증가 농도의 HGF_헵신 (원), HGF_HGFA (사각형), 또는 HGF의 절단될 수 없는 단일쇄 형태인 scHGF (다이아몬드)에 노출시킴으로써 KIRA 분석법에서 측정하였다. 활성은 HGF 대조군 제제로 수득된 최대 신호의 백분율로 나타냈다. 값은 3회 실험의 평균 ± SD이다.

도 4: 헵신 (HGF_헵신) 및 HGFA (HGF_HGFA)에 의해 활성화된 프로-HGF로의 세포 증식 및 이동. (A) 증가 농도의 HGF_헵신 (흑색 막대) 및 HGF_HGFA (백색 막대)의 존재 하에서의 BxPC3 세포의 세포 증식. 값은 2회 실험의 평균이다. (B) 트랜스 웰(transwell) 세포 이동 시스템의 하부 챔버에 첨가된 증가 농도의 HGF_헵신 (흑색 막대) 및 HGF_HGFA (백색 막대)에 의해 자극된 세포 이동의 정량. 값은 3회 실험의 평균 ± SD이다. 증식 및 이동 분석법에서의 활성은 각 실험에서 포함된 100 ng/㎖의 대조군 HGF 제제에 노출된 대조군 세포의 백분율로 나타냈다.

도 5: 아미노분해성 분석법에서의 헵신 효소 활성의 억제. 헵신 (0.4 nM)을 억제제와 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이션하고, S2366 (0.2 mM ~ K_m)에 대한 효소 활성을 동력학 마이크로플레이트 판독기 상에서 결정하였다. (□), sHAI-1B; (▼), sHAI-1B(R260A); (●), sHAI-1B(K4O1A); (○), sHAI-2.

도 6: 돌연변이체 형태의 sHAI-1B, 및 sHAI-2에 의한 프로-HGF 활성화의 억제. ¹²⁵I-표지된 프로-HGF (0.05 ㎎/㎖)를 헵신 (15 nM) 및 억제제와 함께 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 반응 분취량을 도 1에 기술된 바와 같이 분석하였다. 15 nM의 헵신이 각각의 샘플 내에 존재하였다. 억제제는 1 μM이었다. 레인 1, t=0에서의 분취량; 2, 억제제 없음; 3, sHAI-1B; 4, sHAI-1B(R260A); 5, sHAI-1B(K401A); 6, sHAI-2. 프로-HGF, HGF α-사슬 및 HGF β-사슬 (이중선)의 위치가 표시된다.

도 7: 천연 인간 헵신의 아미노산 서열의 한 실시양태.

도 8: 천연 인간 헵신의 아미노산 서열의 또다른 실시양태.

본 발명은 HGF/c-met 신호전달 경로의 조정인자를 포함하는 방법, 조성물, 키트 및 제조품을 제공하고, 이같은 조정인자의 사용 방법이 포함된다.

이러한 방법, 조성물, 키트 및 제조품의 상세사항이 본원에서 제공된다.

일반적인 기술

본 발명의 실행은, 달리 언급되지 않는 한, 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이고, 이는 당업계의 기술 내에 속한다. 이같은 기술은 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989)]; ["Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)]; ["Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987)]; ["Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, 및 주기적인 개정판); ["PCR: The Polylmerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994)]; ["A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988)]; ["Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001)]과 같은 문헌에 충분히 설명되어 있다.

정의

본원에서 사용된 용어 "헵신"에는 천연 서열 폴리펩티드, 폴리펩티드 변이체, 및 야생형 헵신과 유사한 방식으로 프로-HGF를 절단할 수 있는 천연 서열 폴리펩티드 및 폴리펩티드 변이체의 단편 (본원에서 추가로 정의됨)이 포함된다. 본원에 기술된 헵신 폴리펩티드는 다양한 공급원, 예컨대 인간 조직 유형 또는 또다른 공급원으로부터 단리되거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조된 것일 수 있다. 용어 "헵신", "헵신 폴리펩티드", "헵신 효소", 및 "헵신 단백질" 또한 본원에 개시된 헵신 폴리펩티드의 변이체를 포함한다.

"천연 서열 헵신 폴리펩티드"는 천연으로부터 유래된 상응하는 헵신 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 천연 서열 헵신 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 서열을 포함한다 (도 7 참조). 한 실시양태에서, 천연 서열 헵신 폴리펩티드는 서열 2의 아미노산 서열을 포함한다 (도 8 참조). 이같은 천연 서열 헵신 폴리펩티드은 천연으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 제조될 수 있다. 용어 "천연 서열 헵신 폴리펩티드"에는 말단절단(truncated) 또는 분비된 천연-발생 형태의 특정 헵신 폴리펩티드 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 천연-발생 변이체 형태 (예를 들어, 별법적으로 스플라이싱된(spliced) 형태), 및 폴리펩티드의 천연-발생 대립유전자 변이체가 특히 포함된다.

"헵신 폴리펩티드 변이체", 또는 이의 변형은 본원에 개시된 임의의 천연 서열 헵신 폴리펩티드와 적어도 약 80％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 본원에 정의된 바와 같은 헵신 폴리펩티드, 일반적으로 활성 헵신 폴리펩티드를 의미한다. 이같은 헵신 폴리펩티드 변이체에는, 예를 들어, 천연 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가 또는 결실된 헵신 폴리펩티드가 포함된다. 통상적으로, 헵신 폴리펩티드 변이체는 본원에 개시된 천연 서열 헵신 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 약 80％의 아미노산 서열 동일성, 별법적으로는 적어도 약 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 통상적으로, 헵신 변이체 폴리펩티드는 길이가 아미노산 적어도 약 10개, 별법적으로는 길이가 아미노산 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600개, 또는 그 이상이다. 선택적으로, 헵신 변이체 폴리펩티드는 천연 헵신 폴리펩티드 서열과 비교하여 1개 이하의 보존성 아미노산 치환, 별법적으로는 천연 헵신 폴리펩티드 서열과 비교하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 보존성 아미노산 치환을 가질 것이다.

펩티드 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 "백분율 (％) 아미노산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭(gap)을 도입하여, 최대 백분율의 서열 동일성을 달성하고, 어떠한 보존성 치환도 서열 동일성의 일부로 간주하지 않은 후의 특정 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 백분율 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교될 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라메터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적을 위해, ％ 아미노산 서열 동일성 값은, 미국 특허 제6,828,146호에 기술된 바와 같이, 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다.

본원에서 사용된 용어 "벡터"는 자신이 연결된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하도록 의도된다. 한가지 유형의 벡터는 "플라스미드"이고, 이는 추가적인 DNA 절편이 내부에 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이고, 이 때 추가적인 DNA 절편은 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있다. 특정 벡터들은 이들이 도입된 숙주 세포 내에서 자가복제할 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기원을 갖는 박테리아 벡터, 및 에피솜 포유류 벡터). 기타 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 삽입될 수 있어, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터들은 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이같은 벡터들은 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히, "재조합 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본원에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 이의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리(assembly) 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비--뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후에, 예컨대 표지와의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 기타 유형의 변형은, 예를 들어, "캡(cap)", 유사체로의 1개 이상의 천연 발생 뉴클레오티드의 치환, 뉴클레오티드간(internucleotide) 변형, 예를 들어, 전하를 띠지 않는 연결 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 전하를 띠는 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형, 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, ply-L-라이신 등)과 같은 펜던트(pendant) 모이어티(moiety)를 갖는 변형, 인터칼레이터(intercalator) (예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등)로의 변형, 킬레이터 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 변형, 알킬화제를 함유하는 변형, 변형된 연결 (예를 들어, 알파 아노머형(anomeric) 핵산 등)로의 변형, 뿐만 아니라 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드(들)을 포함한다. 또한, 당에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실 기가, 예를 들어, 포스포네이트 기, 포스페이트 기로 대체될 수 있거나, 표준 보호 기에 의해 보호될 수 있거나, 또는 추가적인 뉴클레오티드에의 추가적인 연결을 준비하도록 활성화될 수 있거나, 또는 고체 또는 반-고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 아민 또는 탄소수 1 내지 20의 유기 캡핑(capping) 기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 탄소환 당 유사체, 알파-아노머형 당, 에피머형(epimeric) 당 예컨대 아라비노스, 자일로스 또는 릭소오스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환식(非環式) 유사체 및 탈염기성(abasic) 뉴클레오시드 유사체 예컨대 메틸 리보사이드가 예를 들어 포함되는, 당업계에 일반적으로 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사 형태를 또한 함유할 수 있다. 1개 이상의 포스포디에스테르 연결이 대안적인 연결 기로 치환될 수 있다. 이러한 대안적인 연결 기들에는 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), "(O)NR₂ ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH₂ ("포름아세탈") [식중 각각의 R 또는 R'은 독립적으로 H, 또는 에테르 (-O-) 연결을 임의로 함유하는 치환 또는 비치환 알킬 (1-20 C.), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알킬이다]로 대체된 실시양태가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 상기의 기술은 RNA 및 DNA를 포함하여 본원에서 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.

일반적으로, 본원에서 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 길이가 필수적이지는 않지만 일반적으로 뉴클레오티드 약 200개 미만인, 짧은, 일반적으로 단일 가닥인, 일반적으로 합성인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 서로 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기술은 동일하게, 그리고 완전히 올리고뉴클레오티드에 적용가능하다.

본원에서 사용된 용어 "간세포 성장 인자" 또는 "HGF"는, 특별하게 또는 문맥적으로 달리 지적되지 않는 한, HGF/c-met 신호전달 경로를 이같은 프로세스가 발생하도록 하는 조건 하에 활성화시킬 수 있는 임의의 천연 또는 변이체 (천연 발생 또는 합성) HGF 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "야생형 HGF"는 천연 발생 HGF 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 일반적으로 지칭한다. 용어 "야생형 HGF 서열"은 일반적으로 천연 발생 HGF에서 발견되는 아미노산 서열을 지칭한다.

용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 가장 광범위한 의미로 상호교환적으로 사용되고, 모노클로날(monoclonal) 항체 (예를 들어, 전장 또는 무손상 모노클로날 항체), 폴리클로날(polyclonal) 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이적 항체)를 포함하며, 특정 항체 단편 (본원에서 더욱 상세하게 기술됨)을 또한 포함할 수 있다. 항체는 인간 항체이고/이거나, 인간화되고/되거나 친화력이 성숙될 수 있다.

"항체 단편"은 무손상 항체의 일부만을 포함하고, 이 때 이 부분은 무손상 항체 내에 존재할 때 이 부분과 정상적으로 관련된 기능을 하나 이상, 바람직하게는 대부분 또는 전부 유지하는 것이 바람직하다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하고, 따라서 항원에 결합하는 능력이 유지된다. 또다른 실시양태에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 단편은 무손상 항체 내에 존재할 때 Fc 영역과 정상적으로 관련된 생물학적 기능, 예컨대 FcRn 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 상보성 결합 중 하나 이상이 유지된다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 일가 항체이다. 예를 들어, 이같은 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 팔(arm)을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 집단을 이루는 개별적인 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원에 대해 지시되어 고도로 특이적이다. 또한, 여러 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 여러 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.

본원에서의 모노클로날 항체에는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 사슬(들)의 나머지 부분은 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이같은 항체의 단편이 특히 포함된다 (미국 특허 제4,816,567호; [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)]).

비-인간 (예를 들어, 마우스) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 부분에 대해서, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화력 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종의 초가변 영역 (공여자 항체)으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에는, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체의 성능을 더욱 정련시키기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것들에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 또한 인간화 항체는 임의로 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 임의로 포함할 것이다. 추가적인 상세사항은 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)] 참조. 또한 하기의 리뷰 문헌 및 이에 인용된 참고문헌 참조: [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)].

"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하고/하거나 본원에 기술된 바와 같은 인간 항체 제조용 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조된 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특히 제외한다.

"친화력 성숙된" 항체는 이의 하나 이상의 CDR이 변경되어 이러한 변경(들)이 없는 어버이 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화력이 개선된 것이다. 바람직한 친화력 성숙된 항체는 표적 항원에 대한 친화력이 나노놀 또는 심지어 피코몰일 것이다. 친화력 성숙된 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생산된다. [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화력 성숙이 기술되어 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 랜덤 돌연변이유발은 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al. Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기술되어 있다.

"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 자신이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.

본원에서 사용된 "작용제 항체"는 당해 폴리펩티드의 기능적 활성 중 적어도 하나를 모방하는 항체이다.

"장애"는 본 발명의 물질/분자 또는 방법으로의 처치가 이로운 임의의 상태이다. 장애에는 포유동물이 당해 장애에 걸리기 쉽게 하는 병리학적인 상태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환이 포함된다. 본원에서 처치될 장애의 비제한적인 예로는 악성 및 양성 종양; 비-백혈병 및 림프구 악성종양; 뉴런, 신경교, 성상세포, 시상하부 및 기타 샘세포, 대식세포, 상피세포, 간질세포 및 분할강 장애; 및 염증성, 면역성 및 기타 혈관신생-관련 장애가 포함된다.

용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련된 장애를 지칭한다. 한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다.

본원에서 사용된 "종양"은 악성 또는 양성 여부와 상관없이 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성(pre-cancerous) 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본원에서 언급될 때 서로 배타적이지 않다.

용어 "암" 및 "암성"은 조절되지 않은 세포 성장/증식을 전형적으로 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 이를 기술한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이같은 암의 더욱 특별한 예로는 편평세포 암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포 암, 위장관 암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선 암, 외음부 암, 갑상선 암, 간 암종 및 다양한 유형의 경부암이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

본원에서 사용된 "처치"는 처치될 개인 또는 세포의 천연적인 진행을 변경시키기 위한 시도에서의 임상적 개입을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리학의 진행 도중에 수행될 수 있다. 바람직한 처치 효과에는 질환의 발생 또는 재발을 방지하는 것, 증상 경감, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이 방지, 질환 진행 속도를 감소시키는 것, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 개선된 예후가 포함된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환 또는 장애의 발달을 지연시키기 위해 사용된다.

"유효량"은 필요한 투여량에서 그리고 기간 동안 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는데 유효한 양을 지칭한다.

본 발명의 물질/분자, 작용제 또는 길항제의 "치료적 유효량"은 질환 상태, 개인의 연령, 성별 및 체중, 및 개인에서 원하는 응답을 도출해내는 물질/분자, 작용제 또는 길항제의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 또한 치료적 유효량은 물질/분자, 작용제 또는 길항제의 치료적으로 이로운 효과가 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 양이다. "예방적 유효량"은 필요한 투여량에서 그리고 기간 동안 원하는 예방적 결과를 달성하는데 유효한 양을 지칭한다. 필수적이지는 않지만 전형적으로, 예방적 용량은 질환 전에 또는 질환의 초기 단계에 대상에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다.

본원에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 인터칼레이팅제(intercalating agent), 효소 및 그의 단편 예컨대 뉴클레오용해성(nucleolytic) 효소, 항생제, 및 독소 예컨대 소형-분자 독소 또는 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함), 및 하기에 개시되는 다양한 항종양 또는 항암제를 포함하도록 의도된다. 기타 세포독성제가 하기에 기술된다. 종양치사제(tumoricidal agent)는 종양 세포의 파괴를 야기한다.

"화학요법제"는 암의 처치에 유용한 화학 화합물이다 화학요법제의 예로는 알킬화제 예컨대 티오테파 및 CYTOXAN® 시클로스포스파미드; 알킬 술포네이트 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보퀴온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤로멜라민이 포함되는, 에틸렌이민 및 메틸렌이민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로카나비놀 (드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄토테신 (합성 유사체 토포테칸 (HYCAMTIN®), CPT-11 (이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포사이드; 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체인 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 메팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제 예컨대 엔다이인 항생제 (예를 들어, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마1I 및 칼리키아마이신 오메가I1 (예를 들어, [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)] 참조); 다이네마이신 A가 포함되는 다이네마이신; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색단백질 엔다이인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라바이신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 덱토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (ADRIAMYCIN®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사 (DOXIL®) 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질 예컨대 메토트렉세이트, 겜시타빈 (GEMZAR®), 테가푸르 (UFTORAL®), 카페시타빈 (XELODA®), 에포틸론, 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 디데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스유리딘; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신제 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀴온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드 예컨대 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지퀴온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 아나귀딘); 우레탄; 빈데신 (ELDISINE®, FILDESIN®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 (TAXOL®), 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제형 (ABRAXANE™), 및 독세탁셀 (TAXOTERE®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (VELBAN®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (ONVOVIN®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (NAVELBINE®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 임의의 상기 물질들의 제약상 허용가능한 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 임의의 상기 물질들의 배합물, 예컨대 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 병용 요법에 대한 약자인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 배합된 옥살리플라틴 (ELOXATIN™)으로의 처치 요법에 대한 약자인 FOLFOX가 포함된다.

이러한 정의에는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 저하, 차단 또는 억제하는 작용을 하고 종종 전신 또는 온몸 치료의 형태인 항호르몬제가 또한 포함된다. 이들은 자체가 호르몬일 수 있다. 예로는 타목시펜 (NOLVADEX® 타목시펜 포함), 라록시펜 (EVISTA®), 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY1 17018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (FARESTON®)이 예를 들어 포함되는 항-에스트로겐 및 선택적인 에스트로겐 수용체 조정인자 (SERM); 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD); 에스트로겐 수용체 길항제 예컨대 풀베스트란트 (FASLODEX®); 난소를 저해하거나 막는 기능을 하는 작용제, 예를 들어, 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 작용제 예컨대 류프롤리드 아세테이트 (LUPRON® 및 ELIGARD®), 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트리프테렐린; 기타 항-안드로겐 작용제 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 바이칼루타미드; 및 부신에서의 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트 (MEGASE®), 엑세메스탄 (AROMASIN®), 포르메스타니에, 파드로졸, 보로졸 (RIVISOR®), 레트로졸 (FEMARA®), 및 아나스트로졸 (ARIMIDEX®)이 포함된다. 또한, 화학요법제의 이같은 정의에는 비포스포네이트 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, BONEFOS® 또는 OSTAC®), 에티드로네이트 (DIDROCAL®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (ZOMETA®), 알렌드로네이트 (FOSAMAX®), 파미드로네이트 (AREDIA®), 틸루드로네이트 (SKELID®), 또는 리세드로네이트 (ACTONEL®); 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 사이토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서의 유전자의 발현을 억제하는 것들, 예를 들어, PKC-알파, Ralf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신 예컨대 THERATOPE® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신, 및 VAXID® 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예를 들어, LURTOTECAN®); rmRH (예를 들어, ABARELIX®); 라파티닙 디토실레이트 (GW572016로 또한 공지된 ErbB-2 및 EGFR 이중 타이로신 키나제 소형-분자 억제제); COX-2 억제제 예컨대 셀레콕십 (CELEBREX®; 4-(5-(4-메틸페닐)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일) 벤젠술폰아미드; 및 임의의 상기 물질의 제약상 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.

본원에서 사용될 때의 "성장 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 HGF/c-met 활성화에 성장이 의존적인 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S 단계의 HGF/c-met 의존적 세포의 백분율을 현저하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예로는 (S 단계 이외의 단계에서) 세포 주기 진행을 차단하는 작용제, 예컨대 G1 정지 및 M-단계 정지를 유도하는 작용제가 포함된다. 전통적인 M-단계 차단제로는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포이소머라제 II 억제제 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포사이드, 및 블레오마이신이 포함된다. G1을 정지시키는 작용제, 예를 들어, DNA 알킬화제 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 및 ara-C들 또한 S-단계 정지로 넘쳐 흐른다. 추가적인 정보는 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, "Cell cycle regulation, Oncogenes, and antineoplastic drugs", Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), 특히 p.13]에서 발견할 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 모두 주목에서 유래된 항암 약물이다. 유럽형 주목에서 유래된 도세탁셀 (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer)은 파클라탁셀 (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 미세관의 어셈블리를 촉진하고, 탈중합을 방지함으로써 미세관을 안정화시켜, 결과적으로 세포에서의 유사분열을 억제한다.

"독소루비신"은 안트라사이클린 항생제이다. 독소루비신의 완전한 화학명은 (8S-시스)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-8-(히드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타센디온이다.

본 발명의 조성물 및 방법

A. 항체

한 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 치료적 및/또는 진단 작용제로서의 용도를 발견할 수 있는 항체를 제공한다. 예시적인 항체로는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적, 및 이종접합체 항체가 포함된다.

1. 폴리클로날 항체

폴리클로날 항체는 관련 항원 및 애주번트의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 바람직하게 생성된다. 면역화될 종에서 면역원성인 단백질에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다 (특히 합성 펩티드가 사용되는 경우). 예를 들어, 이관능성 또는 유도체화 작용제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통한 접합), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂, 또는 R¹N=C=NR (식중, R 및 R¹은 상이한 알킬기이다)을 사용하여, 항원을 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 접합시킬 수 있다.

예를 들어, 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 접합체 (각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3배 부피의 프로인트 완전 애주번트(Freund's complete adjuvant)와 합하고, 이 용액을 다중 부위에 진피내 주사함으로써, 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 동물들을 면역화시킨다. 1개월 후, 프로인트 완전 애주번트 내의 펩티드 또는 접합체를 원래 양의 1/5 내지 1/10로 다중 부위에 피하 주사하여 동물을 부스팅(boosting)시킨다. 7 내지 14일 후, 동물에서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 혈청을 분석한다. 역가가 정체기(plateau)에 도달할 때까지 동물을 부스팅시킨다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양물에서 단백질 융합체로서 제조될 수 있다. 또한, 백반과 같은 응집제를 적절하게 사용하여 면역 응답을 증강시킨다.

2. 모노클로날 항체

모노클로날 항체는 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제4,816,567호)으로 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터를 상기 기술한 바와 같이 면역화시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유발시킨다. 별법적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 면역화 후, 림프구를 단리한 후, 적절한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포주와 융합시켜, 하이브리도마 세포를 형성시킨다 ([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]).

이렇게 제조된 하이브리도마 세포를 융합되지 않은 어버이 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 바람직하게는 함유하는 적절한 배양 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 어버이 골수종 세포에 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 없는 경우, 하이브리도마용 선택적 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.

바람직한 융합 파트너 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 높은 수준의 안정적인 항체 생산을 지지하며, 융합되지 않은 어버이 세포에 대해 선택하는 선택 배지에 감수성이 있는 것이다. 바람직한 골수종 세포주는 마우스 골수종 세포주, 예컨대 [Salk Institute Cell Distribution Center (San Diego, California USA)]로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것, 및 [American Type Culture Collection (Manassas, Virginia USA)]으로부터 입수가능한 SP-2 및 유도체, 예를 들어 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 기술되어 있다 ([Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; 및 [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).

하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 분석법, 예컨대 방사선면역분석법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)으로 측정한다.

모노클로날 항체의 결합 친화력은, 예를 들어, [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 기술된 스캐차드(Scatchard) 분석법에 의해 측정할 수 있다.

원하는 특이성, 친화력 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 ([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]). 이러한 목적에 적절한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다.

서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 항체 정제 절차, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로스 사용) 또는 이온-교환 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석 등에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.

통상적인 절차 (예를 들어, 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함)를 이용하여 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA를 쉽게 단리하고 서열분석한다. 하이브리도마 세포는 이같은 DNA의 바람직한 공급원으로 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 그 후 이를 형질감염되지 않으면 항체 단백질을 생산하지 않는 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 리뷰 논문에는 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)] 및 [Pluckthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)]이 포함된다.

추가적인 실시양태에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기술된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에는 파지 라이브러리를 사용한 마우스 및 인간 항체의 단리가 각각 기술되어 있다. 후속적인 문헌들에는 사슬 셔플링에 의한 고친화력 (nM 범위) 인간 항체의 생산 ([Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]), 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서의 조합 감염 및 생체내 재조합 ([Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)])이 기술되어 있다. 따라서, 이러한 기술들은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.

또한, 예를 들어, 상동성 마우스 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 (C_H 및 C_L) 서열으로 치환함으로써 (미국 특허 제4,816,567호; 및 [Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 또는 면역글로불린 코딩 서열을 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 전부 또는 일부와 융합시킴으로써, 항체를 코딩하는 DNA를 변형시켜 키메라 또는 융합 항체 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 비-면역글로불린 폴리펩티드 서열이 항체의 불변 도메인을 치환할 수 있거나, 또는 이러한 서열로 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인을 치환하여, 항원에 대한 특이성을 나타내는 한 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 나타내는 또다른 항원-결합 부위를 포함하는 2가 키메라 항체가 생성된다.

3. 인간 및 인간화 항체

본 발명의 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 또한 포함할 수 있다. 인간화 형태의 비-인간 (예를 들어, 마우스) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편 (예컨대 항체의 Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 기타 항원-결합 하위서열(subsequence))이다. 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화력 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)를 포함한다. 일부 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 수입된(imported) CDR 또는 프레임워크에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것들에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것들이다. 또한 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 최적으로 포함할 것이다 ([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]).

비-인간 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "수입" 잔기로 지칭되고, 이는 전형적으로는 "수입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 설치류 CDR 또는 인간 항체의 상응하는 서열에 대한 CDR 서열을 치환함으로써 Winter 및 공동 연구자의 방법 ([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)])에 따라 본질적으로 수행할 수 있다. 따라서, 이같은 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 서열이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.

인간화 항체를 제조하는데 사용되는 인간 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 모두)을 선택하는 것은 항체가 인간 인간 치료 용도를 목적으로 하는 경우 HAMA 응답 (인간 항-마우스 항체) 및 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 V 도메인 서열을 확인하고, 그 내부의 인간 프레임워크 영역 (FR)을 인간화 항체에 대해 허용한다 ([Sims et al., J. Immunol, 151:2296 (1993)]; [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]). 또다른 방법에서는 경쇄 또는 중쇄의 특정 아군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크 영역을 사용한다. 다수의 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 ([Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)]; [Presta et al., J. Immnol., 151:2623 (1993)]).

항원에 대한 높은 친화성 및 기타 유리한 생물학적 성질을 유지하면서 항체가 인간화되는 것이 또한 중요하다. 이러한 목적을 이루기 위해, 바람직한 방법에 따라, 어버이 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용한 어버이 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 프로세스에 의해 인간화 항체를 제조한다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수가능하고, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이러한 디스플레이들의 정밀검사로 후보 면역글로불린 서열의 기능화에서 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 원하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화력이 달성되도록 수용자 및 수입 서열로부터 FR 잔기를 선택하고 조합시킬 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로, 그리고 가장 실질적으로 관여한다.

다양한 형태의 인간화 항체가 구현된다. 예를 들어, 인간화 항체는 항체 단편, 예컨대 Fab일 수 있고, 이는 면역접합체를 생성하기 위해 하나 이상의 세포독성제(들)에 임의로 접합될 수 있다. 별법적으로, 인간화 항체는 무손상 항체, 예컨대 무손상 IgG1 항체일 수 있다.

인간화의 대안으로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역화시키면 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉(trnasgenic) 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (J_H) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전히 억제되는 것으로 기술되었다. 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 이같은 생식계열 돌연변이 마우스에게 전달하면, 항원 접종시 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어, [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,591,669호 (모두 GenPharm); 제5,545,807호; 및 WO 97/17852 참조.

별법적으로, 파지 디스플레이 기술 ([McCafferty et al., Nature 348:552-553 [1990]])을 이용하여 면역화되지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 생산할 수 있다. 이러한 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자는 M13 또는 fd와 같은 섬유상 박테리오파지의 주요 또는 소수 코트 단백질 유전자 내로 인-프레임(in-frame) 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로 디스플레이된다. 섬유상 입자가 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 성질을 기초로 하는 선택으로 이러한 성질을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자가 또한 선택된다. 따라서, 파지는 B-세포의 성질을 일부 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고, 예를 들어, [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]에 개관되어 있다. V-유전자 절편의 다양한 공급원을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소형 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이가 단리되었다. 본질적으로 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)], 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기술된 기술에 따라, 면역화되지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 다양한 어레이의 항원 (자가-항원 포함)에 대한 항체를 단리할 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호 참조.

상기 논의된 바와 같이, 인간 항체는 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 또한 생성될 수 있다 (미국 특허 5,567,610 및 5,229,275 참조).

4. 항체 단편

특정 상황에서는, 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 더 작은 크기의 단편은 신속한 소거를 허용하고, 고체 종양에 대한 개선된 접근에 이를 수 있다.

항체 단편의 생산을 위하여 다양한 기술이 개발되어 왔다. 전통적으로, 이러한 단편들은 무손상 항체의 단백질분해성 분해를 통해 유도되었다 (예를 들어, [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)]; 및 [Brennan et al., Science 229: 81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이러한 단편들은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 대장균에서 발현되고 이로부터 분비되어, 다량의 이러한 단편의 용이한 생산을 허용한다. 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 항체 단편이 단리될 수 있다. 별법적으로, Fab'-SH 단편이 대장균으로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')₂ 단편이 형성될 수 있다 ([Carter et al, Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또다른 접근법에 따르면, F(ab')₂ 단편이 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')₂ 단편이미국 특허 제5,869,046호에 기술되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 기타 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 또다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 1993/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 미국 특허 제5,587,458호 참조. Fv 및 sFv는 불변 영역이 없는 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이다; 따라서, 이들은 생체내 사용 동안 감소된 비특이적 결합에 적절하다. sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에서 이펙터(effector) 단백질의 융합이 산출되도록 sFv 융합 단백질을 구축할 수 있다. [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌] 참조. 또한 항체 단편은, 예를 들어, 미국 특허 제5,641,870호에 기술된 것과 같이, "선형 항체"일 수 있다. 이같은 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.

5. 이중특이적 항체

이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 본원에 기술된 바와 같은 헵신, HGF 및/또는 헵신:HGF 복합체의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 또다른 이같은 항체는 이러한 부분들 상의 결합 부위를 또다른 폴리펩티드에 대한 결합 부위와 조합시킬 수 있다. 별법적으로, 세포성 방어 메카니즘이 헵신 및/또는 HGF-발현 및/또는 결합 세포에 집중 및 국소화되도록, 항체 팔이 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)과 같은 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 또는 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD3)와 같은 백혈구 상의 촉발 분자에 결합하는 팔과 조합될 수 있다. 또한 이중특이적 항체를 사용하여 세포독성제를 헵신, HGF 및/또는 헵신:HGF 복합체를 발현하고/하거나 이에 결합하는 세포에 국소화시킬 수 있다. 이러한 항체들은 폴리펩티드 결합 팔, 및 세포독성제 (예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신(ricin) A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 팔을 갖는다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')₂ 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.

WO 96/16673에는 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRIII 항체가 기술되어 있고, 미국 특허 제5,837,234호에는 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRI 항체가 개시되어 있다. 이중특이적 항-ErbB2/Fcα 항체는 WO 98/02463에 제시되어 있다. 미국 특허 제5,821,337호에는 이중특이적 항-ErbB2/항-CD3 항체가 교시되어 있다.

이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현을 기초로 하고, 여기서 두 사슬은 상이한 특이성을 갖는다 ([Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 편성으로 인해, 이러한 하이브리도마 (쿼드로마(quadroma))는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하고, 이중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 이루어지는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.

다른 접근법에 따르면, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 적어도 일부의 힌지, C_H2 및 C_H3 영역을 포함하는 Ig 중쇄 불변 도메인과의 융합이 바람직하다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (C_H1)이 융합체 중 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체, 및 원한다면 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA들을 별도의 발현 벡터에 삽입하고, 적절한 숙주 세포 내로 공-형질감염시킨다. 이것은 구축에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 동등하지 않은 비율이 최적 수율을 제공하는 실시양태에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 있어서 더욱 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 2개 이상의 폴리펩티드 사슬의 발현으로 높은 수율이 수득되는 경우 또는 비율이 특별한 의미를 갖지 않는 경우, 2개 또는 모든 3개의 폴리펩티드 사슬에 대한 코딩 서열을 단일 발현 벡터에 삽입할 수 있다.

이러한 접근법의 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 팔 내의 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른쪽 팔 내의 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 한쪽 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하여 용이한 분리 방식을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 사슬 조합물로부터의 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 한다는 것이 발견되었다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 생성을 위한 추가적인 상세한 내용은, 예를 들어, [Suresh et al., Methods in Enzymmology, 121:210 (1986)] 참조.

미국 특허 제5,731,168호에 기재된 또다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 경계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 바람직한 경계면은 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 경계면으로부터의 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동(cavity)"이 제2 항체 분자의 경계면 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.

이중특이적 항체에는 가교결합된 또는 "이종접합체" 항체가 포함된다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이같은 항체들은, 예를 들어, 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키기 위해서 (미국 특허 제4,676,980호), 그리고 HIV 감염의 치료를 위해서 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089) 제안되었다. 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 다수의 가교결합 기술과 함께, 적절한 가교결합제는 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키는 기술 또한 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]에는 무손상 항체를 단백질분해적으로 절단시켜 F(ab')₂ 단편을 생성시키는 방법이 기술되어 있다. 이러한 단편을 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원시켜, 인접한 디티올들을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 그 후 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 그 후 Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생산된 이중특이적 항체를 효소의 선택적 고정을 위한 작용제로서 사용할 수 있다.

최근의 진보로 대장균으로부터의 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수가 용이해졌고, 이를 화학적으로 커플링시켜 이중특이적 항체를 형성시킬 수 있다. [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)]에는 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')₂ 분자의 생산이 기술되어 있다. 각각의 Fab' 단편이 대장균으로부터 별도 분비되었고, 시험관내에서 지향성으로 화학적 커플링되어, 이중특이적 항체가 형성되었다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상적인 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다. 재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기술되어 있다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체를 생산하였다. [Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합에 의해 연결하였다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성시킨 후, 다시 산화시켜 항체 이종이량체를 형성시켰다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에 또한 이용될 수 있다. [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 기술된 "디아바디(diabody)" 기술은 이중특이적 항체 단편의 별법적인 제조 메카니즘을 제공하였다. 단편은 동일한 사슬 상의 두 도메인이 쌍을 이루게 하기에는 너무 짧은 링커에 의해 V_L에 연결된 V_H를 포함한다. 따라서, 한 단편의 V_H 및 V_L 도메인이 또다른 단편의 상보적인 V_H 및 V_L 도메인과 쌍을 이루도록 강요됨으로써, 2개의 항원 결합 부위가 형성된다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또다른 전략이 또한 보고되었다. [Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)] 참조.

2가를 초과하는 항체도 구현된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].

6. 이종접합체 항체

이종접합체 항체가 또한 본 발명의 범주에 속한다. 이종접합체 항체는 공유결합에 의해 연결된 2개의 항체로 구성된다. 이같은 항체들은, 예를 들어, 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키기 위해서 (미국 특허 제4,676,980호), 그리고 HIV 감염의 치료를 위해서 (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089) 제안되었다. 가교결합제가 수반되는 것들을 포함하여 합성 단백질 화학에서의 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 이러한 항체를 제조할 수 있는 것으로 구현된다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 사용하여 또는 티오에테르 결합을 형성시킴으로써 면역독소를 구축할 수 있다. 이러한 목적을 위한 적절한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트, 및, 예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 것들이 포함된다.

7. 다가 항체

다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 이가 항체보다 빨리 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다가 항체 (IgM 클래스 이외의 것)일 수 있고 (예를 들어 4가 항체), 이는 항체의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이로 구성된다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역에 대해 아미노 말단인 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서 바람직한 다가 항체는 3 내지 8개, 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 구성된다). 다가 항체는 1개 이상의 폴리펩티드 사슬 (바람직하게는 2개의 폴리펩티드 사슬)을 포함하고, 이 때 폴리펩티드 사슬(들)은 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 VD1-(X1)_n- VD2-(X2)_n-Fc [식중, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 1개의 폴리펩티드 사슬이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다]를 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 VH-CH1-연성 링커-VH-CH1-Fc 영역 사슬; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 사슬을 포함할 수 있다. 바람직하게는 본원에서의 다가 항체는 적어도 2개 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원에서의 다가 항체는, 예를 들어, 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 여기서 구현된 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로, CL 도메인을 추가로 포함한다.

8. 이펙터 기능 조작

이펙터 기능과 관련하여, 예를 들어, 항체의 항원-의존성 세포형 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체-의존성 세포독성 (CDC)가 증강되도록, 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 항체의 Fc 영역에 1개 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성할 수 있다. 별법적으로 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입함으로써, 이러한 영역 내에 사슬간 디술피드 결합이 형성되도록 할 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포형 세포독성 (ADCC)를 가질 수 있다. [Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B. J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)] 참조. [Wolff et al. Cancer Research, 53:2560-2565 (1993)]에 기술된 바와 같은 이종이관능성 가교-링커를 사용하여 항-종양 활성이 증강된 동종이량체 항체를 또한 제조할 수 있다. 별법적으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체를 조작할 수 있고, 이로써 보체 용해 및 ADCC 능력을 증강시킬 수 있다. [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)] 참조. 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어, 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이 항체 (특히, 항체 단편) 내로 샐비지 수용체 결합 에피토프를 혼입시킬 수 있다. 본원에 사용된 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 역할을 하는 IgG 분자 (예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.

9. 면역접합체

본 발명은 세포독성제 예컨대 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사선접합체)에 접합된 항체를 포함하는, 면역접합체, 또는 항체-약물 접합체 (ADC)에 또한 관련된다

세포독성제 또는 세포증식억제제, 즉 암의 처치 중에 종양 세포를 사멸시키거나 억제하는 약물의 국소적 전달을 위해 항체-약물 접합체를 사용하는 것 ([Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614]; [Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172]; 미국 특허 4,975,278)은 이론적으로 종양에의 약물 모이어티의 표적화 전달 및 그곳에서의 세포내 축적을 허용하고, 반면에 접합되지 않은 이러한 약물 작용제의 전신 투여는 제거하려고 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에 허용할 수 없는 수준의 독성을 초래할 수 있다 ([Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05]; [Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506]). 이에 의해 최소 독성으로의 최대 효율이 추구된다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 모두 이러한 전략에 유용한 것으로 보고되었다 ([Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87]). 이러한 방법에서 사용된 약물로는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신이 포함된다 ([Rowland et al., (1986) 상기 문헌]). 항체-독소 접합체에 사용된 독소로는 박테리아 독소 예컨대 디프테리아 독소, 식물 독소 예컨대 리신, 소형 분자 독소 예컨대 겔다나마이신 ([Mandler et al (2000) Jour, of Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581]; [Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028]; [Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791]), 메이탄시노이드 (EP 1391213; [Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623]),및 칼리키아마이신 ([Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928]; [Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336- 3342])이 포함된다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 억제가 포함되는 메카니즘에 의해 이들의 세포독성 및 세포증식억제 효과를 달성할 수 있다. 일부 세포독성 약물은 대형 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합되었을 때 불활성이거나 덜 활성인 경향이 있다.

ZEVALIN® (이브리튜모맵 티욱세탄, Biogen/Idec)은 정상 및 악성 B 림프구의 표면 상에서 발견되는 CD20 항원에 대해 지시된 마우스 IgG1 카파 모노클로날 항체, 및 티오우레아 링커-킬레이터에 의해 결합된 ¹¹¹In 또는 ⁹⁰Y 방사성동위원소로 구성된 항체-방사성동위원소 접합체이다 ([Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77]; [Wiseman et al (2002) B1ood 99(12):4336-42]; [Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63]; [Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69]). ZEVALIN에 B-세포 비-호지킨(non-Hodgkin) 림프종 (NHL)에 대한 활성이 있긴 하지만, 대부분의 환자에서는 투여 결과로 심각한 장기간의 혈구감소증이 초래된다. 칼리키아마이신에 연결된 huCD33 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 MYLOTARG™ (겜투주맵 오조가마이신, Wyeth Pharmaceuticals)은 주사에 의한 급성 골수성 백혈병의 처치에 대해 2000년에 승인되었다 ([Drugs of Future (2000) 25(7):686]; 미국 특허 제4970198호; 제5079233호; 제5585089호; 제5606040호; 제5693762호; 제5739116호; 제5767285호; 제5773001호). 디술피드 링커 SPP를 통해 메이탄시노이드 약물 모이어티 DM1에 연결된 huC242 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 칸투주맵 메르탄신 (Immunogen, Inc.)은 CanAg를 발현하는 암, 예컨대 결장, 췌장, 위장 및 기타 암의 치료를 위한 제II상 시험이 진행되고 있다. 메이탄시노이드 약물 모이어티 DM1에 연결된 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 모노클로날 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologies, Immunogen Inc.)는 전립선 종양의 잠재적인 치료용으로 개발 중이다. 돌라스타틴의 합성 유사체인, 오리스타틴 펩티드인 오리스타틴 E (AE) 및 모노메틸오리스타틴 (MMAE)은 키메라 모노클로날 항체 cBR96 (암종 상의 루이스(Lewis) Y에 특이적) 및 cAC1O (혈액학적 악성종양 상의 CD30에 특이적)에 접합되었고 ([Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784]), 치료용으로 개발 중이다.

이같은 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제는 상기에 기술되어 있다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 다양한 방사성핵종이 방사성접합된(radioconjugated) 항체의 생산에 이용가능하다. 예로는 ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y, 및 ¹⁸⁶Re가 포함된다. 다양한 이관능성 단백질 커플링제 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성제의 접합체를 만들 수 있다. 예를 들어, [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026 참조.

항체와 하나 이상의 소형 분자 독소, 예컨대 칼리케아마이신, 메이탄신, 트리코테센 및 CC1065 및 독소 활성을 갖는 이러한 독소들의 유도체의 접합체 또한 본원에서 구현된다.

메이탄신 및 메이탄시노이드

한 실시양태에서, 본 발명의 항체 (전장 또는 단편)은 1개 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된다.

메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 마이테누스 세라타(Maytenus serrata)에서 최초로 단리되었다 (미국 특허 제3,896,111호). 이어서, 특정 미생물이 메이탄시노이드, 예컨대 메이타시놀 및 C-3 메이타시놀 에스테르를 또한 생산한다는 것이 발견되었다 (미국 특허 제4,151,042호). 합성 메이타시놀 및 이의 유도체 및 유사체는, 예를 들어, 미국 특허 제4,137,230호; 제4,248,870호; 제4,256,746호; 제4,260,608호; 제4,265,814호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,308,268호; 제4,308,269호; 제4,309,428호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,317,821호; 제4,322,348호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,364,866호; 제4,424,219호; 제4,450,254호; 제4,362,663호; 및 제4,371,533호에 개시되어 있고, 이들의 개시내용은 거명에 의해 본원에 명백하게 포함된다.

메이타시노이드 -항체 접합체

이의 치료 지수를 개선시키려는 시도에서, 메이탄신 및 메이탄시노이드가 종양 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항체에 접합되었다. 메이탄시노이드를 함유하는 면역접합체 및 이의 치료 용도는, 예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 개시되어 있고, 이의 개시내용은 거명에 의해 본원에 명백하게 포함된다. [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]에는 인간 결장직장암에 대해 지시된 모노클로날 항체 C242에 연결된 DM1으로 명명된 메이탄시노이드를 포함하는 면역접합체가 기술되어 있다. 이 접합체는 배양된 결장암 세포에 대해 고도로 세포독성인 것으로 발견되었고, 생체내 종양 성장 분석법에서 항종양 활성을 나타냈다. [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에는 메이탄시노이드가 인간 결장암 세포주 상의 항원에 결합하는 마우스 항체 A7 또는 HER-2/neu 종양유전자에 결합하는 또다른 모노클로날 항체 TA.1에 디술피드 링커를 통해 접합된 면역접합체가 기술되어 있다. TA.1-메이탄시노이드 접합체의 세포독성을 세포 당 3 × 10⁵ 개의 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3 상에서 시험관내 테스트하였다. 약물 접합체는 유리 메이탄시노이드 약물과 유사한 정도의 세포독성을 달성하였고, 이는 항체 분자 당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있었다. A7-메이탄시노이드 접합체는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 나타냈다.

항체- 메이탄시노이드 접합체 (면역접합체)

항체-메이탄시노이드 접합체는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 현저하게 손상시키지 않으면서 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결시킴으로써 제조된다. 항체 분자 당 평균 3-4개의 메이탄시노이드가 접합되는 것이 항체의 기능 또는 가용성에 음성적으로 영향을 미치지 않으면서 표적 세포의 세포독성을 증강시키는 것에서 효율을 나타냈지만, 1개의 독소 분자/항체도 네이키드(naked) 항체에 비해 세포독성을 증강시킬 것으로 예상되었다. 메이탄시노이드는 당업계에 주지되어 있고, 공지된 기술에 의해 합성할 수 있거나 또는 천연 공급원으로부터 단리할 수 있다. 적절한 메이탄시노이드는, 예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호 및 기타 특허 및 상기 언급된 비-특허 간행물들에 개시되어 있다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이타시놀, 및 방향족 고리에서 또는 메이타시놀 분자의 기타 위치에서 변형된 메이타시놀 유사체, 예컨대 다양한 메이타시놀 에스테르이다.

예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호 또는 EP 특허 0 425 235 B1, 및 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에 기술된 것들을 포함하여, 항체-메이탄시노이드 접합체의 제조를 위해 다수의 연결기가 당업계에 공지되어 있다. 연결기로는 상기 언급된 특허에 개시된 바와 같은 디술피드 기, 티오에테르 기, 산-불안정 기, 광-불안정 기, 펩티다제-불안정 기, 또는 에스테라제-불안정 기가 포함되고, 디술피드 및 티오에테르 기가 바람직하다.

다양한 이관능성 단백질 커플링제 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 메이탄시노이드의 접합체를 제조할 수 있다. 특히 바람직한 커플링제로는 디술피드 연결을 제공하는 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP) 및 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP) ([Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]])가 포함된다.

링커는, 연결 유형에 따라, 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 통상적인 커플링 기술을 사용하여 히드록실기와의 반응에 의해 에스테르 연결이 형성될 수 있다. 반응은 히드록실 기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실 기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실 기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 연결은 메이타시놀 또는 메이타시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.

칼리키아마이신

또다른 흥미로운 면역접합체는 1개 이상의 칼리키아마이신 분자에 접합된 항체를 포함한다. 칼리키아마이신 족의 항생제는 피코몰 이하의 농도에서 이중-가닥 DNA 파손을 일으킬 수 있다. 칼리키아마이신 족의 접합체의 제조를 위해서는, 미국 특허 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (모두 American Cyanamid Company) 참조. 사용될 수 있는 칼리키아마이신의 구조적 유사체로는 γ₁ ^I, α₂ ^I, α₃ ^I, N-아세틸-γ₁ ^I, PSAG 및 θ^I ₁이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다 ([Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993)], [Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)] 및 상기 언급된 American Cyanamid의 미국 특허들). 항체가 접합될 수 있는 또다른 항-종양 약물은 항-폴레이트제(antifolate)인 QFA이다. 칼리키아마이신과 QFA 모두 세포내 작용 부위를 갖고, 형질 막을 쉽게 통과하지 않는다. 따라서, 항체에 의해 매개된 내재화를 통한 이러한 작용제들의 세포성 흡수는 이들의 세포독성 효과를 크게 증강시킨다.

기타 세포독성제

본 발명의 항체에 접합될 수 있는 기타 항종양제로는 BCNU, 스트렙토조이신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 5,053,394, 5,770,710에 기술된 LL-E33288 복합체로 총체적으로 공지된 족의 작용제, 뿐만 아니라 에스페라마이신 (미국 특허 5,877,296)이 포함된다.

사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 예를 들어, 1993년 10월 28일 공개된 WO 93/21232 참조.

본 발명에서는 뉴클레오용해성 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제 예컨대 데옥시리보뉴클레아제; DNA분해효소)과 항체 간에 형성된 면역접합체가 또한 구현된다.

종양의 선택적인 파괴를 위해, 항체는 고도로 방사성인 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합된 항체의 생산에 이용가능하다. 예로는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 접합체가 검출용으로 사용되는 경우, 이는 섬광 연구용 방사선 원자, 예를 들어 tc^99m 또는 I¹²³, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 이미지화 (자기 공명 이미지화 (mri)로 또한 공지됨)를 위한 스핀 표지, 예컨대 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.

방사성- 또는 기타 표지를 공지된 방식으로 접합체에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 수소 대신 불소-19를 예를 들어 수반하는 적절한 아미노산 전구체를 사용하여 펩티드를 생합성하거나 화학적 아미노산 합성에 의해 합성할 수 있다. tc^99m 또는 I¹²³, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸ 및 In¹¹¹과 같은 표지를 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통해 부착시킬 수 있다. 이트륨-90은 라이신 잔기를 통해 부착될 수 있다. IODOGEN 방법 ([Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57])을 사용하여 요오드-123을 혼입시킬 수 있다. ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에는 기타 방법들이 상세하게 기술되어 있다.

다양한 이관능성 단백질 커플링제 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성제의 접합체를 만들 수 있다. 예를 들어, [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성뉴클레오디드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026 참조. 링커는 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광-불안정 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 ([Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 제5,208,020호)를 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물은 시판 (예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL., U.S.A)로부터 시판)되는 하기의 가교-링커 시약으로 제조된 항체-약물 접합체 (ADC)를 명백하게 구현하지만, 이에 한정되지 않는다: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트). [2003-2004 Applications Handbook and Catalog, pp 467-498] 참조.

항체-약물 접합체의 제조

본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC)에서, 항체 (Ab)는 항체 당 1개 이상의 약물 모이어티 (D), 예를 들어 약 1 내지 약 20개의 약물 모이어티에 링커 (L)을 통해 접합된다. 화학식 I의 ADC는, (1) 항체의 친핵성(nucleophilic) 기와 이가 링커 시약이 반응하여 공유 결합을 통해 Ab-L이 형성된 후, 약물 모이어티 D와 반응하는 것; 및 (2) 약물 모이어티의 친핵성 기가 이가 링커 시약과 반응하여 공유 결합을 통해 D-L이 형성된 후, 항체의 친핵성 기와 반응하는 것을 포함하여, 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 사용하여 여러가지 경로에 의해 제조될 수 있다.

Ab-(L-D)_p

항체 상의 친핵성 기로는 (i) N-말단 아민 기, (ii) 측쇄 아민 기, 예를 들어 라이신, (iii) 측쇄 티올 기, 예를 들어 시스테인, 및 (iv) 항체가 글리코실화된 경우 당 히드록실 또는 아미노 기가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 아민, 티올 및 히드록실 기는 친핵성이고, (i) 활성 에스테르 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할로겐화물; (ii) 알킬 및 벤질 할로겐화물 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 기가 포함되는 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있다. 특정 항체는 환원성 사슬간 디술피드, 즉 시스테인 다리를 갖는다. 항체는 DTT (디티오트레이톨)와 같은 환원제로의 처리에 의해 링커 시약과의 접합에 반응성이도록 될 수 있다. 따라서 각각의 시스테인 다리는, 이론적으로, 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 아민이 티올로 전환되는 라이신과 2-이미노티올란 (트라우트(Traut) 시약)의 반응을 통해 추가적인 친핵성 기가 항체 내로 도입될 수 있다.

본 발명의 항체-약물 접합체는 친전자성 모이어티를 도입하는 항체의 변형에 의해 또한 생산될 수 있고, 이 모이어티는 링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 치환체와 반응할 수 있다. 글리코실화된 항체의 당이, 예를 들어 페리오데이트 산화 시약으로 산화되어, 링커 시약 또는 약물 모어어티의 아민 기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤 기를 형성할 수 있다. 생성된 이민 쉬프(Schiff) 염기 기는 안정적인 연결을 형성할 수 있거나, 또는, 예를 들어 보로히드리드 시약에 의해, 환원되어 안정적인 아민 연결을 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 글리코실화된 항체의 탄수화물 부분과 글락토스 산화효소 또는 소듐 메타-페리오데이트의 반응으로 약물 상의 적절한 기와 반응할 수 있는 단백질 내의 카르보닐 기 (알데히드 및 케톤) 기가 산출될 수 있다 ([Hermanson, Bioconiugate Techniques]). 또다른 실시양태에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질은 소듐 메타-페리오데이트와 반응할 수 있어, 제1아미노산 대신 알데히드의 생산이 초래된다 ([Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146]; US 5362852). 이같은 알데히드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.

마찬가지로, 약물 모이어티 상의 친핵성 기로는 (i) 활성 에스테르 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할로겐화물; (ii) 알킬 및 벤질 할로겐화물 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 기가 포함되는 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있는 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드 기가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

별법적으로, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질을, 예를 들어, 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해, 만들 수 있다. DNA의 길이는 서로 인접한 또는 접합체의 원하는 성질을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리된 접합체의 두 부분을 코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 후, 결합되지 않은 접합체는 혈액순환으로부터 소거제를 사용하여 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어 방사선뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여하는 종양 예비-표적화에서 사용하기 위해 항체가 "수용체" (예컨대 스트렙타비딘)에 접합될 수 있다.

10. 면역리포솜

본원에 개시된 항체는 면역리포솜으로 또한 제형화될 수 있다. "리포솜"은 약물을 포유동물에게 전달하는데 유용한, 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 소포이다. 리포솜의 성분은, 생물학적 막의 지질 배열과 유사하게, 이층 형성으로 일반적으로 배열된다. 항체를 함유하는 리포솜은 당업계에 공지된 방법에 의해, 예컨대 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)]; [Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호에 기술된 바와 같이 제조된다. 순환 시간이 증강된 리포솜이 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.

특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 규정된 세공 크기의 필터를 통해 리포솜을 압출하여 원하는 직경의 리포솜을 수득한다. 디술피드 상호교환 반응을 통해 [Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982)]에 기술된 바와 같이 본 발명의 항체의 Fab' 단편이 리포솜에 접합될 수 있다. 임의로 화학요법제가 리포솜 내에 함유될 수 있다. [Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19):1484 (1989)] 참조.

B. 결합 올리고펩티드

본 발명의 결합 올리고펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 헵신, HGF 및/또는 헵신:HGF 복합체에 결합하는, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 올리고펩티드이다. 결합 올리고펩티드는 공지된 올리고펩티드 합성 방법론을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있거나, 또는 재조합 기술을 사용하여 제조 및 정제할 수 있다. 결합 올리고펩티드는 길이가 일반적으로 적어도 약 5개의 아미노산이고, 별법적으로는 길이가 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개의 아미노산 또는 그 이상이며, 이 때 이같은 올리고펩티드는 본원에 기술된 폴리펩티드에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있다. 결합 올리고펩티드는 주지된 기술을 사용하여 과도한 실험없이 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고펩티드에 대해 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당업계에 주지되어 있는 것으로 인지된다 (예를 들어, 미국 특허 제5,556,762호, 제5,750,373호, 제4,708,871호, 제4,833,092호, 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,571,689호, 제5,663,143호; PCT 공개 WO 84/03506 및 WO84/03564; [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)]; [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)]; [Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)]; [Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)]; [Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988)], [Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6378]; [Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry. 30:10832]; [Clackson, T. et al. (1991) Nature. 352:624]; [Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581]; [Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:8363], 및 [Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668] 참조).

이와 관련하여, 박테리오파지 (파지) 디스플레이는 대형 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 이러한 라이 브러리의 구성원(들)을 확인하도록 하는 주지된 기술들 중 하나이다. 파지 디스플레이는 변이체 폴리펩티드가 박테리오파지 입자의 표면 상의 코트 단백질에 대한 융합 단백질로서 디스플레이되는 기술이다 ([Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science. 249: 386]). 파지 디스플레이의 활용은 선택적으로 무작위화된 단백질 변이체들 (또는 무작위로 클로닝된 cDNA)의 대형 라이브러리가 표적 분자에 높은 친화력으로 결합하는 서열들에 대해 신속하고 효율적으로 분류될 수 있다는 사실에 의존한다. 파지 상의 펩티드 ([Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6378]) 또는 단백질 ([Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry. 30:10832]; [Clackson, T. et al. (1991) Nature. 352:624]; [Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581]; [Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363]) 라이브러리의 디스플레이는 특이적인 결합 성질을 갖는 것에 대해 수만개의 폴리펩티드 또는 올리고펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다 ([Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668]). 무작위 돌연변이체의 파지 라이브러리를 분류하는 것은 다수의 변이체를 구축하고 증식시키기 위한 전략, 표적 수용체를 사용한 친화력 정제 절차, 및 결합 강화 결과를 평가하는 수단을 필요로 한다. 미국 특허 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,571,689호, 및 제5,663,143호.

대부분의 파지 디스플레이 방법에서 필라멘트형 파지가 사용되어 왔지만, 람다형 파지 디스플레이 시스템 (WO 95/34683; 미국 특허 5,627,024), T4 파지 디스플레이 시스템 ([Ren et al., Gene. 215:439 (1998)]; [Zhu et al., Cancer Research. 58(15):3209-3214 (1998)]; [Jiang et al., Infection & Immunity. 65(11):4770-4777 (1997)]; [Ren et al., Gene, 195(2):303-311 (1997)]; [Ren, Protein Sci., 5:1833 (1996)]; [Efimov et al., Virus Genes. 10:173 (1995)]) 및 T7 파지 디스플레이 시스템 ([Smith and Scott, Methods in Enzymology. 217:228-257 (1993)]; 미국 특허 5,766,905)가 또한 공지되어 있다.

기본적인 파지 디스플레이의 많은 기타 개선 및 변형이 현재 개발되어 있다. 이러한 개선은 선택된 표적 분자에의 결합에 대해 펩티드 라이브러리를 스크리닝하고 기능성 단백질을 디스플레이하는 디스플레이 시스템의 능력을 원하는 성질에 대해 이러한 단백질을 스크리닝하는 잠재력과 함께 증강시킨다. 파지 디스플레이 반응을 위한 조합적인 반응 장치가 개발되었고 (WO 98/14277), 파지 디스플레이 라이브러리는 2분자성 상호작용 (WO 98/20169; WO 98/20159) 및 구속된 나선형 펩티드의 성질 (WO 98/20036)을 분석 및 제어하는데 사용되었다. WO 97/35196에는 파지 디스플레이 라이브러리를 리간드가 표적 분자에 결합할 한 용액 및 친화성 리간드가 표적 분자에 결합하지 않을 제2용액에 접촉시켜 결합 리간드를 선택적으로 단리하는, 친화성 리간드를 단리하는 방법이 기술되어 있다. WO 97/46251에는 무작위 파지 디스플레이 라이브러리를 친화성-정제된 항체로 바이오패닝(biopanning)하고, 이어서 결합 파지를 단리한 후, 마이크로플레이트 웰을 사용하여 고친화성 결합 파지를 단리하는 마이크로패닝(micropanning) 프로세스가 이어지는 방법이 기술되어 있다. 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus) 단백질을 친화성 태그로 사용하는 것이 또한 보고되었다 ([Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187]). WO 97/47314에 는 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있는 조합 라이브러리를 사용하여 효소 특이성을 구별하기 위해 기질 공제 라이브러리를 사용하는 것이 기술되어 있다. 파지 디스플레이를 사용하여 세제에서 사용하기에 적절한 효소를 선택하는 방법이 WO 97/09446에 기술되어 있다. 특이적인 결합 단백질을 선택하는 추가적인 방법은 미국 특허 제5,498,538호, 제5,432,018호, 및 WO 98/15833에 기술되어 있다.

펩티드 라이브러리를 생성시키고 이러한 라이브러리를 사용하는 방법은 미국 특허 제5,723,286호, 제5,432,018호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,498,530호, 제5,770,434호, 제5,734,018호, 제5,698,426호, 제5,763,192호, 및 제5,723,323호에 또한 개시되어 있다.

C. 소형 결합 분자

바람직하게는 소형 결합 분자는 본원에서 정의된 바와 같은 헵신, HGF 및/또는 헵신:HGF 복합체에 결합하는, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 본원에서 정의된 바와 같은 올리고펩티드 또는 항체 이외의 유기 분자이다. 소형 유기 결합 분자는 공지된 방법론을 사용하여 확인 및 화학적으로 합성할 수 있다 (예를 들어, PCT 공개 WO00/00823 및 WO00/39585 참조). 소형 결합 분자는 일반적으로 크기가 약 2000 달톤 미만이고, 별법적으로는 크기가 약 1500, 750, 500, 250 또는 200 달톤 미만이며, 이 때 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩티드에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있는 이같은 유기 소형 분자는 주지된 기술을 사용하여 과도한 실험 없이 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 분자에 대해 소형 유기 분자 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당업계에 주지되어 있는 것으로 인지된다 (예를 들어, PCT 공개 WOOO/00823 및 WOOO/39585 참조). 소형 유기 결합 분자는, 예를 들어, 알데히드, 케톤, 옥심, 히드라존, 세미카르바존, 카르바지드, 일차 아민, 이차 아민, 삼차 아민, N-치환 히드라진, 히드라지드, 알콜, 에테르, 티올, 티오에테르, 디술피드, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 우레아, 카르바메이트, 카르보네이트, 케탈, 티오케탈, 아세탈, 티오아세탈, 아릴 할로겐화물, 아릴 술포네이트, 알킬 할로겐화물, 알킬 술포네이트, 방향족 화합물, 헤테로고리형 화합물, 아닐린, 알켄, 알킨, 디올, 아미노 알콜, 옥사졸리딘, 옥사졸린, 티아졸리딘, 티아졸린, 엔아민, 술폰아미드, 에폭시드, 아리지딘, 이소시아네이트, 술포닐 클로라이드, 디아조 화합물, 산 클로라이드 등일 수 있다.

D. 원하는 성질을 갖는 항체, 결합 올리고펩티드 및 소형 결합 분자에 대한 스크리닝

본 발명의 항체, 올리고펩티드 및 소형 분자를 생성시키는 기술은 상기에 기술되어 있다. 원한다면, 특정 생물학적 특징을 갖는 항체, 올리고펩티드 또는 기타 소형 분자를 추가로 선택할 수 있다.

본 발명의 항체, 올리고펩티드 또는 기타 소형 분자의 성장 억제 효과를 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 헵신 및/또는 프로-HGF를 내인성으로 또는 각각의 유전자(들)로의 형질감염 후에 발현하는 세포를 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 적절한 종양 세포주, 및 헵신 및/또는 HGF 폴리펩티드-형질감염된 세포를 다양한 농도의 본 발명의 모노클로날 항체, 올리고펩티드 또는 기타 소형 분자로 수일 (예를 들어 2-7일) 동안 처리하고, 크리스탈 바이올렛 또는 MTT로 염색하 거나 또는 일부 기타 비색 분석법에 의해 분석할 수 있다. 증식을 측정하는 또다른 방법은 본 발명의 항체, 결합 올리고펩티드 또는 소형 결합 분자의 존재 또는 부재 하에 처리된 세포에 의한 ³H-티미딘 흡수를 비교하는 것에 의한 것이다. 처리 후, 세포를 수확하고, DNA 내로 혼입된 방사능의 양을 섬광 계수기에서 정량한다. 적절한 양성 대조군은 선택된 세포주를 이러한 세포주의 성장을 억제하는 것으로 공지된 성장 억제 항체로 처리하는 것을 포함한다. 생체 내에서의 종양 세포의 성장 억제는 당업계에 공지된 다양한 방식으로 결정할 수 있다. 종양 세포는 헵신 및/또는 프로-HGF 폴리펩티드를 과발현하는 것일 수 있다. 항체, 결합 올리고펩티드 또는 소형 유기 결합 분자는, 한 실시양태에서, 약 0.5 내지 30 ㎍/㎖의 항체 농도에서, 시험관내 또는 생체내에서의 헵신 및/또는 HGF-발현 종양 세포의 세포 증식을 처리되지 않은 종양 세포와 비교하여 약 25-100％, 더욱 바람직하게는 약 30-100％, 더욱 더 바람직하게는 약 50-100％ 또는 70-100％만큼 억제할 것이다. 성장 억제는 세포 배양액 내에서 약 0.5 내지 30 ㎍/㎖ 또는 약 0.5 nM 내지 200 nM의 항체 농도에서 측정될 수 있고, 이 때 성장 억제는 종양 세포를 항체에 노출시킨 후 1-10일째에 결정한다. 체중 1 ㎏ 당 약 1 ㎍ 내지 약 100 ㎎으로 항체를 투여했을 때 항체의 최초 투여로부터 약 5일 내지 3개월 이내에, 바람직하게는 약 5 내지 30일 이내에 종양 크기가 감소되거나 종양 세포 증식이 감소된다면 항체는 성장 억제성이다.

세포 사멸을 유도하는 항체, 결합 올리고펩티드 또는 소형 유기 결합 분자를 선택하기 위해, 프로피듐 요오다이드 (PI), 트립판 블루 또는 7AAD 흡수에 의해 예를 들어 지시되는 막 통합성의 상실을 대조군과 비교하여 평가할 수 있다. PI 흡수 분석법은 보체 및 면역 이펙터 세포의 부재 하에 수행될 수 있다. 헵신 및/또는 프로-HGF 폴리펩티드-발현 종양 세포를 단독 배지 또는 적절한 항체 (예를 들어, 약 10 ㎍/㎖), 결합 올리고펩티드 또는 소형 유기 결합 분자를 함유하는 배지와 함께 인큐베이션한다. 세포를 3일 기간 동안 인큐베이션한다. 각각의 처리 후, 세포를 세정하고, 세포 덩어리의 제거를 위해 35 mm 여과기가 캡핑된(capped) 12 × 75 개의 튜브 (튜브당 1 ㎖, 처리 군 당 3개의 튜브) 내로 분취하였다. 이어서, 튜브에 PI (1O ㎍/㎖)를 수여하였다. FACSCAN® 유동 세포계측기 및 FACSCONVERT® CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용하여 샘플을 분석할 수 있다. PI 흡수에 의해 결정 시 통계적으로 유의한 수준의 세포 사상을 유도하는 항체, 결합 올리고펩티드 또는 소형 유기 결합 분자를 세포 사멸-유도 항체, 결합 올리고펩티드 또는 소형 유기 결합 분자로 선택할 수 있다.

당해 항체에 결합된 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 항체, 올리고펩티드 또는 기타 소형 유기 분자를 스크리닝하기 위해, [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Land (1988)]에 기술된 것과 같은 통상적인 가교-차단 분석법을 수행할 수 있다. 이러한 분석법은 테스트 항체, 올리고펩티드 또는 기타 소형 유기 분자가 공지된 항체와 동일한 부위 또는 에피토프에 결합하는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 별법적으로 또는 추가적으로, 에피토프 맵핑(mapping)을 당업계에 공지된 방법에 의해 수행할 수 있 다. 예를 들어, 항체 서열을 예컨대 알라닌 스캐닝에 의해 돌연변이시켜 접촉 잔기를 확인할 수 있다. 돌연변이 항체를 먼저 폴리클로날 항체와의 결합에 대해 테스트하여, 적절한 폴딩(folding)을 확실하게 한다. 상이한 방법에서, 폴리펩티드의 상이한 영역에 상응하는 펩티드를 테스트 항체, 또는 테스트 항체 및 특징화되거나 공지된 에피토프를 갖는 항체와의 경쟁 분석법에서 사용할 수 있다.

E. 항체 의존성 효소 매개 전구약물 요법 ( ADEPT )

또한 본 발명의 항체는 전구약물 (예를 들어, 펩티딜 화학요법제, WO 81/01145 참조)을 활성 항암 약물로 전환시키는 전구약물-활성화 효소에 항체를 접합시킴으로써 ADEPT에서 사용될 수 있다. 예를 들어, WO 88/07378 및 미국 특허 제4,975,278호 참조.

ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 성분으로는 전구약물을 이의 더욱 활성인 세포독성 형태로 전환시키는 방식으로 전구약물에 작용할 수 있는 임의의 효소가 포함된다.

본 발명의 방법에 유용한 효소에는 포스페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리성 포스파타제; 술페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 비독성 5-플루오로사이토신을 항암 약물 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 사이토신 디아미나제; 펩티드-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예컨대 세라티아 프로테아제, 테르몰리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예컨대 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환기를 함유하는 전구약물을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티 다제; 글리코실화 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-갈라토시다제 및 뉴라미니다제와 같은 탄수화물-절단 효소; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸기로 아민 질소에서 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제와 같은 페니실린 아미다제가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 별법적으로, 당업계에 "아브자임(abzyme)"으로 또한 공지된, 효소 활성을 갖는 항체를 이용하여 본 발명의 전구약물을 유리 활성 약물로 전환시킬 수 있다 (예를 들어, [Massey, Nature 328:457-458 (1987)] 참조). 아브자임을 종양 세포 집단에 전달하기 위해 본원에 기술된 바와 같이 항체-아브자임 접합체를 제조할 수 있다.

본 발명의 효소는 상기 논의된 이종이관능성 가교결합 시약을 이용하는 것과 같이 당업계에 주지된 기술에 의해 항체에 공유 결합될 수 있다. 별법적으로, 본 발명의 효소의 적어도 기능적으로 활성인 부분에 연결된 본 발명의 항체의 적어도 항원-결합 영역을 포함하는 융합 단백질을 당업계에 주지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 구축할 수 있다 (예를 들어, [Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)] 참조).

F. 항체 변이체

본원에 기술된 항체에 더하여, 항체 변이체가 제조될 수 있다는 것이 구현된다. 항체 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 코딩 DNA 내로 도입함으로써, 및/또는 원하는 항체의 생산에 의해 제조할 수 있다. 당업자는 아미노산 변화로 항체 의 번역후 프로세스가 변경될 수 있다는 것, 예컨대 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것 또는 막 고정 특성을 변경시키는 것을 인식할 것이다..

본원에 기술된 항체에서의 변이는, 미국 특허 제5,364,934호에 예를 들어 기재된 보존성 및 비-보존성 돌연변이에 대한 임의의 기술 및 지침을 사용하여, 예를 들어 이루어질 수 있다. 변이는 항체를 코딩하는 1개 이상의 코돈의 치환, 결실, 삽입일 수 있고, 결과적으로 천연 서열 항체 또는 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 서열이 변화된다. 임의로, 변이는 항체의 1개 이상의 도메인에서의 1개 이상의 아미노산의 임의의 다른 아미노산으로의 치환에 의한 것이다. 원하는 활성에 불리하게 영향을 미치지 않으면서 어느 아미노산 잔기가 삽입, 치환 또는 결실될지를 결정하는데 있어서의 안내는 항체의 서열을 공지된 상동성 단백질 분자의 서열과 비교하고 상동성이 높은 영역에서 이루어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화시킴으로써 발견될 수 있다. 아미노산 치환은 1개의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또다른 아미노산으로 대체하는 것, 예컨대 류신을 세린으로 대체하는 것, 즉 보존성 아미노산 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 약 1 내지 5개의 아미노산 범위 내일 수 있다. 허용된 변이는 서열 내의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 만들고 생성된 변이체를 어버이 서열에 의해 나타나는 활성에 대해 테스트함으로써 결정될 수 있다.

항체 및 폴리펩티드 단편이 본원에서 제공된다. 이같은 단편은, 예를 들어, 전장 천연 항체 또는 단백질과 비교했을 때, N-말단 또는 C-말단에서 말단절단될 수 있거나, 또는 내부 잔기가 결여될 수 있다. 특정 단편은 항체 또는 폴리펩티드 의 원하는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결여된다.

항체 및 폴리펩티드 단편은 다수의 통상적인 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조할 수 있다. 원하는 펩티드 단편을 화학적으로 합성할 수 있다. 별법적인 접근법에는 효소에 의한 소화에 의해, 예를 들어, 특정 아미노산 잔기에 의해 한정되는 부위에서 단백질을 절단하는 것으로 공지된 효소로 단백질을 처리함으로써, 또는 DNA를 적절한 제한 효소로 절단하고 원하는 단편을 단리함으로써 항체 또는 폴리펩티드 단편을 생성시키는 것이 수반된다. 또다른 적절한 기술에는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 원하는 항체 또는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편을 단리하고 증폭시키는 것이 수반된다. DNA 단편의 원하는 말단을 한정짓는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머에서 사용된다. 바람직하게는, 항체 및 폴리펩티드 단편은 본원에 개시된 천연 항체 또는 폴리펩티드와 1개 이상의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 공유한다.

특정 실시양태에서, 당해 보존성 치환이 바람직한 치환이라는 표제 하에 하기 표에서 제시된다. 이같은 치환으로 생물학적 활성이 변하게 되면, 표에서 예시적 치환으로 명명된 또는 아미노산 클래스와 관련하여 하기에 추가로 기술되는 바와 같은 더욱 실질적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물을 스크리닝하게 된다.

본래의 잔기	예시적 치환	바람직한 치환
Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Asp; Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gln (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신	Leu
Leu (L)	노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신	Leu

항체 또는 폴리펩티드의 생물학적 성질에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 시트 또는 나선 형상과 같은, 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조; (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성; 또는 (c) 측쇄의 부피(bulk)를 유지하는 것에 대한 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 수행된다. 아미노산은 측쇄 성질에서의 유사성에 따라 하기와 같이 분류될 수 있다 ([A. L. Lehninger, Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]):

(1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

(2) 무전하 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), GIn (Q)

(3) 산성: Asp (D), Glu (E)

(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H)

별법적으로, 천연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 성질을 기초로 하기 군으로 분류될 수 있다:

(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환은 이들 클래스 중의 하나의 구성원을 또다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 것이다. 이같은 치환된 잔기 또한 보존성 치환 부위 내로, 더욱 바람직하게는 나머지 (보존되지 않은) 부위 내로 도입될 수 있다.

변이는 당업계에 공지된 방법 예컨대 올리고뉴클레오티드-매개 (부위-지정) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝, 및 PCR 돌연변이유발을 사용하여 이루어질 수 있다. 부위-지정 돌연변이유발 ([Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986)]; [Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)]), 카세트 돌연변이유발 ([Wells et al., Gene, 34:315 (1985)]), 제한 선택 돌연변이유발 ([Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA. 317:415 (1986)]) 또는 기타 공지된 기술을 클로닝된 DNA 상에 수행하여, 항체 또는 폴리펩티드 변이체 DNA를 생산할 수 있다.

스캐닝 아미노산 분석법은 인접 서열과 함께 1개 이상의 아미노산을 확인하는데 또한 사용될 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이같은 아미노산에는 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인이 포함된다. 베타-탄소 너머의 측쇄를 제거하고, 변이체의 주쇄 구조를 덜 변형시킬 것 같기 때문에, 이러한 군 중에서 알라닌이 전형적으로 바람직한 스캐닝 아미노산이다 ([Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]). 가장 통상적인 아미노산이기 때문에, 알라닌이 또한 전형적으로 바람직하다. 게다가, 알라닌은 매입된 위치 및 노출된 위치 모두에서 빈번하게 발견된다 ([Creighton, Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.)]; [Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]). 알라닌 치환으로 적절한 양의 변이체가 산출되지 않으면, 이소테릭(isoteric) 아미노산이 사용될 수 있다.

항체 또는 폴리펩티드의 적당한 구조를 유지하는데 수반되지 않은 임의의 시스테인 잔기가, 일반적으로 세린으로, 또한 치환되어 분자의 산화적 안정성이 개선되고 비정상적인 가교결합이 방지될 수 있다. 역으로, 시스테인 결합(들)이 항체 또는 폴리펩티드에 부가되어 이의 안정성이 개선될 수 있다 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).

특히 바람직한 유형의 치환 변이체에는 어버이 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기가 치환되는 것이 수반된다. 일반적으로, 추가적인 개발용으로 선택된 생성된 변이체(들)는 이들이 유래되는 어버이 항체에 비해 생물학적 성질이 개선될 것이다. 이같은 치환 변이체를 생성시키는 간편한 방법은 파지 디스플레이를 이용한 친화력 성숙을 수반한다. 간략하게, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6 내지 7개 부위)를 돌연변이시켜 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성시킨다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 각각 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합체로서 섬유상 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 기술된 바와 같은 이의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화력)에 대해 스크리닝한다. 변형에 대한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 별법적으로 또는 추가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 항원 폴리펩티드 사이의 접촉 위치를 확인하는 것이 유리할 수 있다. 이같은 접촉 잔기와 이웃 잔기는 본원에서 상술된 기술에 따른 치환에 대한 후보물이다. 일단 이같은 변이체가 생성되면, 변이체 패널을 본원에 기술된 바와 같이 스크리닝하고, 한가지 이상의 관련 분석법에서 탁월한 성질을 갖는 항체를 추가적인 개발용으로 선택할 수 있다.

항체의 아미노산 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법에는 천연 공급원으로부터의 단리 (천연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 버젼의 항체의 올리고뉴클레오티드-매개 (부위-지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

G. 항체 및 폴리펩티드의 변형

항체 및 폴리펩티드의 공유결합 변형은 본 발명의 범주 내에 포함된다. 공유결합 변형의 한 유형은 항체 또는 폴리펩티드의 표적화된 아미노산 잔기를 항체 또는 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 작용제로의 유도체화는, 예를 들어, 항체 또는 폴리펩티드를 항체를 정제하기 위한 방법에서 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 가교시키거나, 또는 역으로 사용하기에 유용하다. 통상적으로 사용되는 가교제에는, 예를 들어, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어, 4-아지도살리실산과의 에스테르, 디숙신이미딜 에스테르 예컨대 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)가 포함되는 동종이관능성(homobifunctional) 이미도에스테르, 이관능성 말레이미드 예컨대 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 작용제가 포함된다.

기타 변형으로는 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 라이신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실 기의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노 기의 메틸화 ([T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)]), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실 기의 아미드화가 포함된다.

본 발명의 범주 내에 포함된 항체 또는 폴리펩티드의 또다른 유형의 공유결 합 변형은 항체 또는 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴을 변경시키는 것을 포함한다. "천연 글리코실화 패턴의 변경"은 천연 서열 항체 또는 폴리펩티드에서 발견된 1개 이상의 탄수화물 모이어티를 결실시키는 것 (근원적인 글리코실화 부위를 제거함으로써 또는 화학적 및/또는 효소적 수단에 의해 글리코실화를 결실시킴으로써), 및/또는 천연 서열 항체 또는 폴리펩티드에 존재하지 않는 1개 이상의 글리코실화 부위를 부가하는 것을 의미하도록 본원에서 의도된다. 또한, 이 문구는 존재하는 다양한 탄수화물 모이어티의 성질 및 비율에서의 변화가 수반되는 천연 단백질의 글리코실화에서의 정성(定性)적인 변화를 포함한다.

항체 및 기타 폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (식중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이러한 트리펩티드 서열 중 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중의 하나가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신 또한 사용될 수 있다.

항체 또는 폴리펩티드에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 항체 또는 폴리펩티드가 하나 이상의 상기 기술된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 이루어진다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 또한 변경은 원래의 항체 또는 폴리펩티드의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우). 항체 또는 폴리펩티드 아미노산 서열은 DNA 수준에서의 변화를 통해, 특히 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 원하는 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되도록 미리 선택된 염기에서 돌연변이시킴으로써 임의로 변경될 수 있다.

항체 또는 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 또다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의해 커플링시키는 것에 의한 것이다. 이같은 방법은 당업계에, 예를 들어, WO 87/05330 (1987년 9월 11일 공개), 및 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기술되어 있다.

항체 또는 폴리펩티드 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해, 또는 글리코실화에 대한 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이성 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, [Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)] 및 [Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981)]에 기술되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소에 의한 절단은 [Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987)]에 기술된 바와 같은 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용함으로써 달성할 수 있다.

항체 또는 폴리펩티드의 또다른 유형의 공유결합 변형은 항체 또는 폴리펩티드를, 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 기재된 방식으로, 다양한 비-단백질성 중합체 중 하나, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에 연결시키는 것을 포함한다. 또한 항체 또는 폴리펩티드는 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 예를 들어 제조된 마이크로캡슐 (예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐) 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이같은 기술은 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

또한 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 또다른 이종형 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 항체 또는 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다.

한 실시양태에서, 이같은 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 항체 또는 폴리펩티드의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 항체 또는 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 놓인다. 이같은 에피토프 태그가 부착된 형태의 항체 또는 폴리펩티드의 존재를 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그의 제공은 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 또다른 유형의 친화성 매트릭스를 사용하여 친화성 정제에 의해 항체 또는 폴리펩티드를 쉽게 정제할 수 있도록 한다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들의 각각의 항체가 당업계 에 주지되어 있다. 예로는 폴리-히스티딘 (폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (폴리-his-gly) 태그; 인플루엔자 HA 태그 폴리펩티드 및 이의 항체 12CA5 ([Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]); c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E1O, G4, B7 및 9E10 항체 ([Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]); 및 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 이의 항체 ([Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)])가 포함된다. 기타 태그 폴리펩티드로는 Flag-펩티드 ([Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]); KT3 에피토프 펩티드 ([Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]); 알파-튜불린 에피토프 펩티드 ([Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]); 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 ([Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)])이 포함된다.

별법적인 실시양태에서, 키메라 분자는 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 영역과 항체 또는 폴리펩티드의 융합체를 포함할 수 있다. 이가 형태의 키메라 분자 ("이뮤노어드헤신(immunoadhesin)"으로 또한 지칭됨)에 대해서, 이같은 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역에 대한 것일 수 있다. 바람직하게는 Ig 융합체는 Ig 분자 내의 하나 이상의 가변 영역 대신에 가용성 (막횡단 도메인이 결실되거나 불활성화된) 형태의 항체 또는 폴리펩티드의 치환을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 면역글로불린 융합체는 IgG₁ 분자의 힌지, CH₂ 및 CH₃, 또는 힌지, CH₁, CH₂ 및 CH₃ 영역을 포함한다. 면역글로불린 융합체의 생산을 위해서는, 미국 특허 제5,428,130호 (1995년 6월 27일 허여)를 또한 참조.

H. 항체 및 폴리펩티드의 제조

하기의 기술은 주로 항체- 및 폴리펩티드-코딩 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양하는 것에 의한 항체 및 폴리펩티드의 생산에 관한 것이다. 물론, 당업계에 주지된 별법적인 방법을 사용하여 항체 및 폴리펩티드를 제조할 수 있다는 것으로 생각된다. 예를 들어, 적절한 아미노산 서열, 또는 이의 일부를 고체-상 기술을 사용하여 직접적인 펩티드 합성에 의해 생산할 수 있다 [예를 들어, [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)]; [Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)] 참조]. 수동 기술을 사용하여 또는 자동화에 의해 시험관내 단백질 합성을 수행할 수 있다. 자동화된 합성은, 예를 들어, [Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA)]를 사용하여 제조사의 지시에 따라 달성할 수 있다. 항체 또는 폴리펩티드의 다양한 부분을 별도로 화학적으로 합성하고, 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합하여, 원하는 항체 또는 폴리펩티드를 생산할 수 있다.

1. 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 의 단리

항체 또는 폴리펩티드 mRNA를 지니고 이를 검출가능한 수준으로 발현할 것으로 여겨지는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 수득할 수 있다. 따라서, 인간 항체 또는 폴리펩티드 DNA를 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 수득할 수 있다. 항체- 또는 폴리펩티드-코딩 유전자를 게놈 라이브러리로부터 또는 공지된 합성 절차 (예를 들어, 자동화된 핵산 합성)에 의해 또한 수득할 수 있다.

당해 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질을 확인하기 위해 고안된 프로브 (예컨대 적어도 약 20-80개 염기의 올리고뉴클레오티드)로 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. cDNA 또는 게놈 라이브러리를 선택된 프로브로 스크리닝하는 것은 예컨대 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기술된 바와 같은 표준 절차를 사용하여 수행할 수 있다. 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 단리하기 위한 별법적인 수단은 PCR 방법론 ([Sambrook et al., 상기 문헌]; [Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)])을 사용하는 것이다.

cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당업계에 주지되어 있다. 프로브로 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 잘못된 양성이 최소화되도록 길이가 충분하여야 하고, 충분히 명백하여야 한다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드가 스크리닝될 라이브러리 내의 DNA에의 혼성화 시 검출될 수 있도록 표지된다. 표지 방법은 당업계에 주지되어 있고, ³²P-표지된 ATP와 같은 방사선표지, 비오틴화 또는 효소 표지가 포함된다. 중간 정도의 엄격도 및 높은 엄격도가 포함되는 혼성화 조건은 [Sambrook et al., 상기 문헌]에서 제공된다.

이같은 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열을 GenBank와 같은 공공 데이타베이스 또는 기타 사설 서열 데이타베이스에 기탁되어 이용가능한 기타 공지된 서열에 대해 비교 및 정렬할 수 있다. 분자의 한정된 영역 내의 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서의 동일성)을 당업계에 공지되고 본원에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 결정할 수 있다.

cDNA로 역-전사되지 않았을 수 있는 mRNA의 전구체 및 프로세싱 중간체를 검출하기 위해, 최초로 본원에 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하여, 그리고, 필요하다면 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기술된 통상적인 프라이머 확장 절차를 사용하여, 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 단백질 코딩 서열을 갖는 핵산을 수득할 수 있다.

2. 숙주 세포의 선택 및 형질전환

숙주 세포를 항체 또는 폴리펩티드 생산용으로 본원에 기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환시키고, 프로모터 유도, 형질전환체 선택 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다. 배양 조건, 예컨대 배지, 온도 pH 등은 과도한 실험 없이 당업자가 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양의 생산성을 최대화시키기 위한 원리, 프로토콜, 및 실제적인 기술은 [Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)] 및 [Sambrook et al., 상기 문헌]에서 발견할 수 있다.

진핵생물 세포 형질감염 및 원핵생물 세포 형질전환 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, CaCl₂, CaPO₄, 리포솜-매개 및 전기천공이 포함된다. 사용된 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이같은 세포에 적절한 표준 기술을 사용하여 수행된다. [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기술된 바와 같은 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리, 또는 전기천공이 원핵생물에 일반적으로 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)으로의 감염은, [Shaw et al., Gene, 23:315 (1983)] 및 WO 89/05859 (1989년 6월 29일 공개)에 기술된 바와 같이, 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 이같은 세포벽이 없는 포유류 세포에 대해서는, [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전 방법을 사용할 수 있다. 포유류 세포 숙주 시스템 형질감염의 일반적인 양상은 미국 특허 제4,399,216호에 기술되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 [Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977)] 및 [Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 76:3829 (1979)]의 방법에 따라 전형적으로 수행된다. 그러나, DNA를 세포 내로 도입하는 기타 방법, 예컨대 핵 미세주사, 전기천공, 무손상 세포로의 박테리아 원형질체 융합, 또는 다가양이온, 예를 들어, 폴리브렌, 폴리오르니틴을 또한 사용할 수 있다. 포유류 세포를 형질전환시키기 위한 다양한 기술에 대해서는, [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)] 및 [Mansour et al., Nature, 336:348-352] 참조.

본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현시키는데 유용한 숙주 세포에는 원핵생물, 효모, 또는 고급 진핵생물 세포가 포함된다. 적절한 원핵생물에는 유박테리아(eubacteria), 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 생물, 예를 들어, 장내세균 예컨대 대장균이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 다양한 대장균 균주, 예컨대 대장균 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); 대장균 X1776 (ATCC 31,537); 대장균 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)가 공개적으로 입수가능하다. 기타 적절한 원핵생물 숙주 세포에는 장내세균 예컨대 에쉐리키아(Escherichia), 예를 들어, 대장균, 엔테로박테르(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실리(Bacilli) 예컨대 바실리 서브틸리스(B. subtilis) 및 바실리 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, DD 266,710 (1989년 4월 12일 공개)에 개시된 바실리 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas) 예컨대 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 포함된다. 이러한 예들은 제한적이기 보다는 예시적인 것이다. 균주 W3110은 재조합 DNA 생성물 발효에 통상적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 어버이 숙주이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해성 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주에 내인성인 단백질을 코딩하는 유전자에서의 돌연변이를 일으키도록 변형될 수 있고, 이같은 숙주의 예로는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 대장균 W3110 균주 1A2; 완전한 유전자형 tonA ptr3를 갖는 대장균 W3110 균주 9E4; 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan^r 을 갖는 대장균 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244); 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan^r 을 갖는 대장균 W3110 균주 37D6; 비-카나마이신 저항성 degP 결핍 돌연변이가 있는 균주 37D6인 대장균 W3110 균주 40B4; 및 미국 특허 제4,946,783호 (1990년 8월 7일 허여)에 개시된 돌연변이 원형질막주위공간 프로테아제를 갖는 대장균 균주가 포함된다. 별법적으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어, PCR 또는 기타 핵산 중합효소 반응이 적절하다.

특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우에, 예컨대 치료용 항체가 세포독성제 (예를 들어, 독소)에 접합되고 면역접합체 자체가 종양 세포 파괴에서 유효성을 나타내는 경우, 전장 항체, 항체 단편, 및 항체 융합 단백질을 박테리아에서 생산할 수 있다. 전장 항체는 순환에서의 반감기가 더 길다. 대장균에서의 생산은 더욱 빠르고, 더욱 비용 효율적이다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 생산에 대해서는, 예를 들어, 발현 및 분비를 최적화시기키 위한 신호 서열 및 번역 개시 영역 (TIR)이 기술되어 있는 미국 특허 5,648,237 (Carter 등), 미국 특허 5,789,199 (Joly 등), 및 미국 특허 5,840,523 (Simmons 등) 참조 (상기 특허들은 거명에 의해 본원에 포함됨). 발현 후, 항체는 대장균 세포 페이스트로부터 가용성 분획 내에 단리되고, 이소타입에 따라, 예를 들어, 단백질 A 또는 G 컬럼을 통해 정제할 수 있다. 최종 정제는 CHO 세포에서 예를 들어 발현된 항체를 정제하는 방법과 유사하게 수행할 수 있다.

원핵생물에 더하여, 진핵생물 미생물 예컨대 섬유상 진균 또는 효모가 항체- 또는 폴리펩티드-코딩 벡터에 대한 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)는 통상적으로 사용되는 저급 진핵생물 숙주 미생물이다. 기타 미생물에는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) ([Beach and Nurse, Nature. 290:140 [1981]]; EP 139,383 (1985년 5월 2일 공개)); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 제4,943,529호; [Fleer et al., Bio/Technology. 9:968-975 (1991)]), 예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; [Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2):737-742 [1983]]), 클루이베로마이세스 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 클루이베로마이세스 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 클루이베로마이세스 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 클루이베로마이세스 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 클루이베로마이세스 드라소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906; [Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)]), 클루이베로마이세스 테르모톨레란스(K. Thermotolerans), 및 클루이베로마이세스 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070; [Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]]); 칸디다(Candida); 트리코데르마 리시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) ([Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76:5259-5263 [1979]]); 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 예컨대 슈완니오마이세스 오시 덴탈리스(anniomyces occidentalis) (EP 394,538 (1990년 10월 31일 공개)); 및 섬유상 진균, 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) (WO 91/00357 (1991년 1월 10일 공개)), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주 예컨대 아스페르길루스 니둘란스(A. nidulans) ([Ballance et al., Biochem. Biophvs. Res. Commun., 112:284-289 [1983]]; [Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]]; [Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:1470-1474 [1984]]) 및 아스페르길루스 니게르(A. niger) ([Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]])이 포함된다. 메틸영양성(methylotropic) 효모가 본원에서 적절하고, 한세눌라(Hansenula), 칸디다, 클로엑케라(Kloeckera), 피치아, 사카로마이세스, 토룰롭시스(Torulopsis), 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 구성되는 속으로부터 선택된 메탄올 상에서 성장할 수 있는 효모가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 부류의 효모의 대표적인 특정 종의 목록은 [C. Anthony, Biochemistry of Methylotrophs. 269 (1982)]에서 발견할 수 있다.

글리코실화된 항체 또는 폴리펩티드의 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 곤충 세포 예컨대 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9, 뿐만 아니라 식물 세포, 예컨대 면, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 세포 배양물이 포함된다. 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스테르(Drosophila melanogaster) (과일파리), 및 봄빅스 모 리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 수많은 배큘로바이러스(baculoviral) 균주 및 변이체, 및 상응하는 증식허용성 곤충 숙주 세포가 확인되어 있다. 다양한 형질감염용 바이러스 균주, 예를 들어, 오토그래파 칼리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수가능하고, 이같은 바이러스들은, 특히 스포롭테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해, 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로 사용될 수 있다.

그러나, 척추동물 세포가 가장 흥미롭고, 배양물 (조직 배양물)에서의 척추동물 세포의 증식은 통상적인 절차가 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 또는 현탁액 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 베이비 햄스터 신장 세포주 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포 (TM4, [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트(buffalo rat) 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 ([Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)이다.

숙주 세포를 항체 또는 폴리펩티드 생산용으로 상기 기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터 유도, 형질전환체 선택 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다.

3. 복제가능한 벡터의 선택 및 사용

항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)을 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입한다. 다양한 벡터가 공개적으로 입수가능하다. 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자, 또는 파지일 수 있다. 다양한 절차에 의해 적절한 핵산 서열이 벡터 내로 삽입될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 기술을 이용하여 DNA를 적절한 제한 효소 부위(들) 내로 삽입한다. 일반적으로 벡터 성분은 1개 이상의 신호 서열, 복제 기원, 1개 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 1개 이상의 이러한 성분을 함유하는 적절한 벡터의 구축은 당업자에게 공지된 표준 결찰 기술을 사용한다.

폴리펩티드는 직접적으로뿐만 아니라, 신호 서열 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에서 특정 절단 부위를 갖는 기타 폴리펩티드일 수 있는 이종형 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생산될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 또는 벡터 내로 삽입되는 항체- 또는 폴리펩티드-코딩 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열-안정성 엔테로톡신(enterotoxin) II 리더(leader)로 구성되는 군으로부터 예를 들어 선택된 원핵생물 신호 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은, 예를 들어, 효모 역전효소(invertase) 리더, 알파 인자 리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더 포함, 후자는 미국 특허 제5,010,182호에 기술되어 있음), 또는 산 포스파타제 리더, 칸디다 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (EP 362,179 (1990년 4월 4일 공개)), 또는 WO 90/13646 (1990년 11월 15일 공개)에 기술된 신호일 수 있다. 포유류 세포 발현에서, 포유류 신호 서열, 예컨대 동일한 또는 관련된 종의 분비된 폴리펩티드로부터의 신호 서열, 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더를 사용하여 단백질의 분비를 지시할 수 있다.

발현 벡터 및 클로닝 벡터 모두 벡터가 1개 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제할 수 있도록 하는 핵산 서열을 함유한다. 이같은 서열은 다양한 박테리아, 효모, 및 바이러스에 대해 주지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기원이 대부분의 그람-음성 박테리아에 대해 적절하고, 2μ 플라스미드 기원이 효모에 적절하며, 다양한 바이러스 기원 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)이 포유류 세포 내에서의 벡터의 클로닝에 유용하다.

발현 및 클로닝 벡터는 선택가능 마커로 또한 명명된 선택 유전자를 전형적으로 함유할 것이다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 저항성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지에서 이용가능하지 않은 결정적인 영양소를 공급하는 단백질을 코딩하고, 예를 들어, 바실리의 경우 D-알라닌을 코딩하는 유전자이다.

포유류 세포에 대한 적절한 선택가능 마커의 예는 항체- 또는 폴리펩티드-코딩 핵산을 받아들이기에 충분한 세포의 확인을 가능하게 하는 것, 예컨대 DHFR 또는 티미딘 키나제이다. 야생형 DHFR이 사용되는 경우 적절한 숙주 세포는 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]에 기술된 바와 같이 제조 및 증식된 DHFR 활성이 결핍된 CHO 세포주이다. 효모에서 사용하기에 적절한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 ([Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)]; [Kingsman et al., Gene. 7:141 (1979)]; [Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]). trp1 유전자는 선택 마커를 제공한다 효모의 돌연변이 균주, 예를 들어, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다 ([Jones, Genetics. 85:12 (1977)]).

발현 및 클로닝 벡터는 항체- 또는 폴리펩티드-코딩 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 mRNA 합성을 지시하는 프로모터를 일반적으로 함유한다. 다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터는 주지되어 있다. 원핵생물 숙주와 사용하기에 적절한 프로모터로는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 ([Chang et al., Nature, 275:615 (1978)]; [Goeddel et al., Nature. 281:544 (1979)]), 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 ([Goeddel, Nucleic acids Res., 8:4057 (1980)]; EP 36,776), 및 하이브리드 프로모터 예컨대 tac 프로모터 ([deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:21-25 (1983)])가 포함된다. 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터 또한 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동적으로 연결된 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) (S.D.) 서열을 함유할 것이다.

효모와 함께 사용하기에 적절한 프로모터 서열에는 3-포스포글리세레이트 키나제 ([Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)]) 또는 기타 당분해성 효소 ([Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)]; [Holland, Biochemistry. 17:4900 (1978)]), 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이성화효소, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이성화효소, 포스포글루코스 이성화효소, 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 포함된다.

성장 조건에 의해 전사가 제어되는 추가적인 장점을 갖는 유도성 프로모터인기타 효모 프로모터는 알콜 탈수소효소 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해성 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 및 말토스 및 갈락토스 활용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에서 사용하기 위한 적절한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기술되어 있다.

포유류 숙주 세포에서의 벡터로부터의 항체 또는 폴리펩티드 전사는, 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스 (UK 2,211,504 (1989년 7월 5일 공개)), 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이(Simian) 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터, 이종성 포유류 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 그리고 열-충격 프로모터로부터 수득된 프로모터에 의해 제어되고, 단, 이같은 프로모터는 숙주 세포 시스템과 상용성이다.

인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 고급 진핵생물에 의한 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사가 증가될 수 있다. 인핸서는 프로모터 상에 작용하여 이의 전사를 증가시키는, 일반적으로 약 10 내지 300 bp의 시스-작용 요소이다. 많은 인핸서 서열이 포유류 유전자에 대해 현재 공지되어 있다 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질, 및 인슐린). 그러나, 전형적으로, 진핵생물 세포 바이러스로부터의 인핸서가 사용될 것이다. 예로는 복제 기원의 후기 측면의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후기 측면의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 인핸서는 항체 또는 폴리펩티드 코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.

진핵생물 숙주 세포 (효모, 진균류, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 기타 다세포 생물로부터의 유핵 세포)에서 사용된 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 또한 함유할 것이다. 이같은 서열은 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5', 그리고 종종 3' 비번역 영역으로부터 통상적으로 입수가능하다. 이러한 영역은 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다.

재조합 척추동물 세포 배양에서의 항체 또는 폴리펩티드 합성에 대해 개조하 기에 적절한 또다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)]; [Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979)]; EP 117,060; 및 EP 117,058에 기술되어 있다.

4. 숙주 세포 배양

본 발명의 항체 또는 폴리펩티드를 생산하는데 사용된 숙주 세포를 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 햄(Ham) F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) ((DMEM), Sigma)와 같은 시판되는 배지가 숙주 세포의 배양에 적절하다. 또한, [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기술된 임의의 배지를 숙주 세포용 배양 배지로 사용할 수 있다. 필요하다면 임의의 이러한 배지에 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 버퍼 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 일반적으로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원을 보충할 수 있다. 임의의 기타 필요한 보충물이 당업자에게 공지된 적절한 농도로 또한 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현용으로 선택된 숙주 세포와 함께 기존에 사용된 것들이고, 당업자에게 명백할 것이다.

5. 유전자 증폭/발현 검출

본원에서 제공된 서열을 기초로, 적절하게 표지된 프로브를 사용하여, 유전자 증폭 및/또는 발현을 샘플에서 직접적으로, 예를 들어, 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량하는 노던 블롯팅 ([Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77:5201-5205 (1980)]), 도트 블롯팅 (DNA 분석), 또는 계내 혼성화에 의해 측정할 수 있다. 별법적으로, DNA 듀플렉스, RNA 듀플렉스, 및 DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스 또는 DNA-단백질 듀플렉스를 포함하여 특정 듀플렉스를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 이어서, 표면 상에 듀플렉스가 형성되면 듀플렉스에 결합된 항체의 존재를 검출할 수 있도록, 항체를 표지시킬 수 있고, 듀플렉스가 표면에 결합하는 분석을 수행할 수 있다.

별법적으로, 유전자 발현을 면역학적 방법, 예컨대 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학적 염색 및 세포 배양물 또는 체액의 분석에 의해 수행하여, 유전자 생성물의 발현을 직접적으로 정량할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및/또는 샘플액의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 임의의 동물에서 제조될 수 있다. 간편하게, 천연 서열 폴리펩티드에 대해 또는 본원에서 제공된 DNA 서열을 기초로 하는 합성 펩티드에 대해, 또는 폴리펩티드 DNA에 융합되고 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대해 항체를 제조할 수 있다.

6. 항체 및 폴리펩티드의 정제

항체 및 폴리펩티드의 형태물들을 배양 배지로부터 또는 숙주 세포 용해질로부터 회수할 수 있다. 막-결합된 경우, 적절한 세제 용액 (예를 들어 Triton-X 100)을 사용하여 또는 효소적 절단에 의해 막으로부터 이를 방출시킬 수 있다. 항체 및 폴리펩티드의 발현에 사용된 세포를 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예컨대 동결-해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제에 의해 파괴시킬 수 있다.

항체 및 폴리펩티드를 재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 하기의 절차는 예시적인 적절한 정제 절차이다: 이온-교환 컬럼 상에서의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온-교환 수지 예컨대 DEAE 상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱(chromatofocusing); SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, Sephadex G-75를 사용한 젤 여과; IgG와 같은 오염물을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼; 및 에피토프-태그가 부착된 형태의 항체 및 폴리펩티드의 결합을 위한 금속 킬레이트화 컬럼. 다양한 단백질 정제 방법이 이용가능하고, 이같은 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)]; [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기술되어 있다. 선택된 정제 단계(들)은, 예를 들어, 사용된 생산 방법의 성질 및 생산된 특정 항체 또는 폴리펩티드에 좌우될 것이다.

재조합 기술을 사용할 때, 항체가 세포내에서 생산되거나, 원형질막 주위공간 내에서 생산되거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되는 경우, 첫번째 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 입상물질 잔해물을, 예를 들어, 원심분리 또는 초여과에 의해 제거한다. [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 대장균의 원형질막 주위공간으로 분비된 항체를 단리하는 절차가 기술되어 있다. 간략하게, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분 동안 해동시킨다. 세포 잔해물을 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 일반적으로 이같은 발현 시스템으로부터의 상층액을 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 초여과 유닛을 사용하여 먼저 농축시킨다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제 예컨대 PMSF가 임의의 상기 단계에서 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.

세포로부터 제조된 항체 조성물을, 예를 들어, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있고, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 좌우된다. 단백질 A를 사용하여 인간 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제할 수 있다 ([Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다 ([Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)]). 친화성 리간드가 부탁되는 매트릭스는 거의 대부분 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스 예컨대 제어형(controlled) 다공성 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 유속이 더 빠르게 하고, 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 처리 시간이 짧게 한다. 항체가 C_H3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)가 정제에 유용하다. 회수될 항체에 따라 기타 단백질 정제 기술 예컨대 이온-교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대 폴리아스파르트산 컬럼) 상에서의 SEPHAROSE™ 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전이 또한 이용가능하다.

임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 당해 항체 및 오염물을 함유하는 혼합물을 pH 약 2.5-4.5의 용출 버퍼를 사용하는 저(低)-pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시킬 수 있고, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염)에서 수행된다.

I. 제약 제형

본 발명에 따라 사용된 항체, 결합 올리고펩티드, 소형 유기 또는 무기 결합 분자 및/또는 폴리펩티드의 치료용 제형은 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 원하는 정도의 순도를 갖는 항체, 폴리펩티드, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자를 임의의 제약상 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 ([Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합함으로써 보관용으로 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 아세테이트, 트리스, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 버퍼; 아스코르브산 및 메티오닌이 포함되는 산화방지제; 방부제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀, 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만)의 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린이 포함되는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 트레할로스 및 염화나트륨과 같은 진정제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 폴리소르베이트와 같은 계면활성제; 나트륨과 같은 염-형성 카운터 이온; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제가 포함된다. 제형은 5-200 ㎎/㎖, 바람직하게는 10-100 ㎎/㎖의 농도로 항체를 포함할 수 있다.

본원에서의 제형은 처치될 특정 적응증에 필요한 경우 2가지 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 역효과를 일으키지 않는 보완적인 활성을 갖는 것들을 또한 함유할 수 있다. 예를 들어, 항체, 결합 올리고펩티드, 또는 소형 유기 또는 무기 결합 분자에 더하여, 추가적인 항체, 예를 들어 동일한 폴리펩티드 상의 상이한 에피토프에 결합하는 제2항체 또는 일부 다른 표적 예컨대 특정 암의 성장에 영향을 미치는 성장 인자에 대한 항체를 단일 제형 내에 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 조성물은 화학요법제, 세포독성제, 사 이토카인, 성장 억제제, 항-호르몬제, 및/또는 심장보호제를 또한 포함할 수 있다. 이같은 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적절하게 존재한다.

또한 활성 성분들은 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 예를 들어 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이같은 기술은 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적절한 예로는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.

생체내 투여에 사용될 제형은 반드시 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.

J. 항체, 결합 올리고펩티드 및 소형 유기/무기 결합 분자로의 처치

암에서의 폴리펩티드 (헵신 및/또는 HGF) 발현을 결정하기 위해, 다양한 검출 분석법을 이용가능하다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 과발현을 면역조직화학 (IHC)에 의해 분석할 수 있다. 파라핀에 매입된, 종양 생검으로부터의 조직 절편에 IHC 분석법을 수행하여, 하기와 같은 폴리펩티드 염색 강도 기준에 맞출 수 있다:

0점 - 염색이 관찰되지 않거나, 막 염색이 10％ 미만의 종양 세포에서 관찰됨.

+1점 - 희미한/겨우 인식할 수 있는 막 염색이 10％를 초과하는 종양 세포에서 관찰됨. 세포는 막의 일부에서만 염색된다.

+2점 - 약함 내지 중간 정도의 완전한 막 염색이 10％를 초과하는 종양 세포에서 관찰됨.

+3점 - 중간 정도 내지 강한 완전한 막 염색이 10％를 초과하는 종양 세포에서 관찰됨.

폴리펩티드 발현에 대해 0 또는 +1점인 종양들은 폴리펩티드를 과발현하지 않는 것으로 특징화될 수 있는 반면, +2 또는 +3점의 종양들은 폴리펩티드를 과발현하는 것으로 특징화될 수 있다.

별법적으로 또는 추가적으로, FISH 분석법 예컨대 INFORM® (Ventana (Arizona) 판매) 또는 PATHVISION® (Vysis (Illinois) 판매)를 포르말린에 고정된, 파라핀-매입된 종양 조직 상에 수행하여, 종양에서의 폴리펩티드 과발현 정도 (존재하는 경우)를 결정할 수 있다

폴리펩티드 과발현 또는 증폭을 생체내 검출 분석법을 사용하여, 예를 들어, 검출될 분자에 결합하고 검출가능한 표지 (예를 들어, 방사선 동위원소 또는 형광 표지)로 태그가 부착된 분자 (예컨대 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기 분자)를 투여하고, 표지의 국소화에 대해 환자를 외부적으로 스캐닝함으로써 평가할 수 있다

상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 항체, 올리고펩티드 및 소형 유기 분자는 다양한 비-치료적 용도를 갖는다. 본 발명의 항체, 올리고펩티드 및 소형 무기/유기 분자는 폴리펩티드-발현 암의 병기에 유용할 수 있다 (예를 들어, 방사선이미지화에서). 항체, 올리고펩티드 및 소형 유기 분자는 세포로부터의 폴리펩티드의 정제 또는 면역침전에, 시험관 내, 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯에서의 폴리펩티드의 검출 및 정량에, 그리고 다른 세포의 정제 단계에서의 한 단계로서 혼합된 세포 집단으로부터 폴리펩티드-발현 세포를 사멸시키고 제거하는데 또한 유용할 수 있다.

현재, 암의 단계에 따라, 암 처치에는 하기 요법들 중 하나 또는 이의 조합이 수반된다: 암성 조직을 제거하기 위한 수술, 방사선 요법, 및 화학요법. 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기 분자 요법은 화학요법의 독성 및 부작용을 잘 견디지 못하는 노인 환자에서, 그리고 방사선 요법의 유용성이 제한된 전이 질환에서 특히 바람직하다. 종양을 표적으로 하는 본 발명의 항체, 올리고펩티드 및 소형 유기/무기 분자는 질환의 초기 진단시 또는 재발 동안 폴리펩티드-발현 암을 경감시키는 데 유용하다. 치료적 용도를 위해, 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자를 단독으로, 또는, 예를 들어, 호르몬, 항-혈관신생제, 또는 방사선표지된 화합물과의 병용 요법으로, 또는 수술, 냉동요법, 및/또는 방사선요법과의 병용 요법으로 사용할 수 있다. 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자 처치는 다른 형태의 통상적인 요법과 함께, 연속적으로 통상적인 요법 전 또는 후에 투여될 수 있다. 화학요법 약물 예컨대 TAXOTERE® (도세탁셀), TAXOL® (파클리탁셀), 에스트라무스틴 및 미톡산트론은, 특히, 위험도가 낮은 환자에서, 암의 처치에 사용된다. 암의 처치 또는 경감을 위한 본 발명의 방법에서, 암 환자에게 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자를 1가지 이상의 상기 화학요법제로의 처치와 함께 투여할 수 있다. 특히, 파클리탁셀 및 변형 유도체 (예를 들어, EP0600517 참조)와의 병용 요법이 구현된다. 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자는 치료적 유효 용량의 화학요법제와 함께 투여될 것이다. 또다른 실시양태에서, 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자는 화학요법제, 예를 들어, 파클리탁셀의 활성 및 효능을 증강시키는 화학요법과 함께 투여된다. [Physicians' Desk Reference (PDR)]에는 다양한 암의 처치에서 사용되어온 이러한 작용제들의 투여량이 개시되어 있다. 치료적으로 효과적인 이러한 상기 언급된 화학요법 약물들의 투여 요법 및 투여량은 치료될 특정 암, 질환의 정도 및 당업계의 의사에게 친숙한 기타 요인에 따라 좌우될 것이고, 의사가 이를 결정할 수 있다.

한 특정 실시양태에서, 세포독성제에 접합된 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자를 포함하는 접합체가 환자에게 투여된다. 바람직하게는, 단백질에 결합된 면역접합체가 세포에 의해 내재화되어, 자신이 결합된 암세포를 사멸시키는 면역접합체의 치료 효능이 증가된다. 바람직한 실시양태에서, 세포독성제는 암 세포 내의 핵산을 표적으로 하거나 이를 방해한다. 이같은 세포독성제의 예는 상기에 기술되어 있고, 메이탄시노이드, 칼리키아마이신, 리보뉴클레아제 및 DNA 엔도뉴클레아제가 포함된다.

항체, 올리고펩티드, 소형 유기/무기 분자 또는 이의 독소 접합체는 공지된 방법, 예컨대 정맥내 투여에 따라, 예를 들어, 볼루스(bolus)로서 또는 장기간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 윤활액내, 경막내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 의해 인간 환자에게 투여된다. 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기 분자의 정맥내 또는 피하 투여가 바람직하다.

다른 치료 요법이 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자의 투여와 병용될 수 있다. 병용 투여에는 별도의 제형 또는 단일 제약 제형을 사용하는 동시-투여, 및 임의 순서의 연속 투여가 포함되고, 이 때 연속 투여에서 양쪽 (또는 모든) 활성 작용제가 동시에 이들의 생물학적 활성을 발휘하면서 시간 간격이 존재하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 이같은 병용 투여의 결과로 상승적인 치료효과가 초래된다.

항체 또는 항체들, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자의 투여를 특정 암과 관련된 또다른 종양 항원에 대해 지시된 항체의 투여와 병용하는 것이 또한 바람직할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 본 발명의 치료적 처치 방법에는 여러 화학요법제의 칵테일의 동시 투여를 포함하여 항체 (또는 항체들), 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자 및 1가지 이상의 화학요법제 또는 성장 억제제의 병용 투여가 수반된다. 화학요법제에는 에스트라무스틴 포스페이트, 프레드니무스틴, 시스플라틴, 5-플루오로우라실, 멜팔란, 시클로포스파미드, 히드록시우레아 및 히드록시우레아탁산 (예컨대 파클리탁셀 및 독세탁셀) 및/또는 안트라사이클린 항생제가 포함된다. 이같은 화학요법제들의 제제 및 투여 스케쥴은 제조업자의 지시에 따라 또는 숙련된 개업의에 의해 경험적으로 결정된 바와 같이 사용될 수 있다. 이같은 화학요법의 제제 및 투여 스케쥴은 또한 [Chemotherappy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에 기술되어 있다.

항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자를 항-호르몬 화합물; 예를 들어, 항-에스트로겐 화합물 예컨대 타목시펜; 항-프로게스테론 예컨대 오나프리스톤 (EP 616 812 참조); 또는 항-안드로겐 예컨대 플루타미드와 이같은 분자들에 대해 공지된 투여량으로 병용할 수 있다. 처치될 암이 안드로겐 의존성 암인 경우, 환자에게 항-안드로겐 요법을 미리 제공하고, 암이 안드로겐 비의존성이 된 후, 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자 (및 임의로 본원에 기술된 바와 같은 기타 작용제)를 환자에게 투여할 수 있다.

때때로, 심장보호제 (요법과 관련된 심근 기능장애를 예방 또는 감소시키기 위해) 또는 1가지 이상의 사이토카인을 환자에게 또한 동시-투여하는 것이 유리할 수 있다. 상기의 치료 요법에 더하여, 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자 요법 전에, 이러한 요법과 동시에 또는 이러한 요법 후에 환자에게 암 세포의 수술 제거 및/또는 방사선 요법을 적용할 수 있다. 임의의 상기 동시-투여 작용제에 대한 적절한 투여량은 현재 사용되는 것들이고, 작용제와 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자의 조합 작용 (상승작용)으로 인해 낮아질 수 있다.

질환의 예방 또는 치료를 위해, 투여량 및 투여 방식은 공지된 기준에 따라 의사에 의해 선택될 것이다. 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자의 적절한 투여량은 상기 정의된 바와 같은 처치될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 진행, 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 기존의 요법, 환자의 임상 병력 및 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자에 대한 응답, 및 의사의 재량에 따라 좌우될 것이다. 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자는 한번에 또는 일련의 처치에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 바람직하게는, 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자는 정맥내 주입에 의해 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 체중 1 ㎏ 당 약 1 ㎍ 내지 약 50 ㎎의 항체 (예를 들어, 약 0.1-15 ㎎/kg/용량)가, 예를 들어, 1회 이상의 별도의 투여에 의해 또는 연속적인 주입에 의한 환자에게의 투여를 위한 초기의 후보 투여량일 수 있다. 투여 요법은 약 4 ㎎/kg의 초기 로딩(loading) 용량을 투여한 후, 약 2 ㎎/kg의 항체를 유지 용량으로 매주 투여하는 것을 포함할 수 있다. 그러나, 다른 투여량 요법이 유용할 수 있다. 전형적인 1일 투여량은, 상기 언급된 인자들에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 100 ㎎/kg 이상 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여에 대해서는, 상태에 따라, 원하는 질환 증상 억제가 발생할 때까지 처치가 지속된다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 방법 및 분석법에 의해 쉽게 모니터링될 수 있고, 의사 또는 기타 당업자에게 공지된 기준을 기초로 한다.

환자에게 항체 단백질을 투여하는 것 이외에, 본 출원에서는 항체를 유전자 요법에 의해 투여하는 것이 구현된다. 항체를 코딩하는 핵산의 이같은 투여는 "치료적 유효량의 항체의 투여"라는 표현에 포함된다. 예를 들어, 세포내 항체를 생성시키기 위한 유전자 요법의 용도에 관한 WO96/07321 (1996년 3월 14일 공개) 참조.

핵산 (임의로 벡터 내에 함유됨)을 환자의 세포 내로 넣는 것에 관하여 2가지 주요 접근법이 있다: 생체내 및 생체외. 생체내 전달을 위해서는, 일반적으로 항체가 필요한 부위에, 핵산을 환자에게 직접적으로 주사한다. 생체외 처치를 위해서는, 환자의 세포를 제거하고, 핵산을 이러한 단리된 세포 내로 도입하고, 변형된 세포를 환자에게 직접적으로 투여하거나, 또는, 예를 들어, 다공성 막 내에 캡슐화시켜 이를 환자 내로 이식한다 (예를 들어, 미국 특허 제4,892,538호 및 제5,283,187호 참조). 핵산을 살아있는 세포로 도입하는데 이용가능한 다양한 기술이 있다. 이 기술은 핵산이 배양된 세포 내로 시험관내에서 전달되는지 또는 의도된 숙주의 세포에 생체내 전달되는지 여부에 따라 달라진다. 핵산을 포유동물 세포 내로 시험관내 전달하는데 적절한 기술에는 리포솜, 전기천공, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전 방법 등의 사용이 포함된다. 유전자의 생체외 전달을 위한 통상적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.

현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술로는 바이러스 벡터 (예컨대 아데노바 이러스, 단순 포진 I형 바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스) 및 지질계 시스템 (유전자의 지질-매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol이다)이 포함된다. 현재 공지된 유전자 마킹(marking) 및 유전자 요법 프로토콜의 개관에 대해서는, [Anderson et al., Science, 256:808-813 (1992)] 참조. 또한 WO 93/25673 및 이에 인용된 참고문헌 참조.

본 발명의 항체는 본원에서의 "항체"의 정의에 포함되는 다른 형태일 수 있다. 따라서, 항체에는 전장 또는 무손상 항체, 항체 단편, 천연 서열 항체 또는 아미노산 변이체, 인간화, 키메라 또는 융합 항체, 면역접합체, 및 이의 기능성 단편이 포함된다. 융합 항체에서, 항체 서열은 이종성 폴리펩티드 서열에 융합된다. 항체는 Fc 영역에서 변형되어 원하는 이펙터 기능을 제공할 수 있다. 본원에서의 섹션들에서 더욱 상세하게 논의된 바와 같이, 적절한 Fc 영역과 함께, 세포 표면 상에 결합된 네이키드 항체는, 예를 들어, 항체-의존성 세포형 세포독성 (ADCC)을 통해, 또는 보체 세포독성에서 보체를 사용하는 것에 의해 세포독성, 또는 일부 다른 메커니즘을 유도할 수 있다. 별법적으로, 이펙터 기능을 제거하거나 감소시키는 것이 바람직한 경우, 부작용 또는 치료 합병증을 최소화시키도록, 다른 특정한 Fc 영역을 사용할 수 있다.

한 실시양태에서, 이 항체는 본 발명의 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것에 대해 경쟁하거나, 이러한 에피토프에 실질적으로 결합한다. 생체내 종양 표적 및 임의의 세포 증식 억제 또는 세포독성 특성을 특히 포함하여, 본 발명의 항체의 생물학적 특성을 갖는 항체가 또한 구현된다.

상기 항체의 생산 방법이 본원에서 상세하게 기술된다.

이러한 항체, 올리고펩티드 및 소형 유기/무기 분자는 헵신 및/또는 HGF-발현 암의 처치, 또는 포유동물에서의 암의 1가지 이상의 증상의 경감에 유용하다. 본 발명의 방법은 이러한 암과 관련된 전이 종양의 증상의 처치 및/또는 경감에서 길항제를 사용하는 것을 포함한다. 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자 길항제는 포유동물에서 폴리펩티드(들) (헵신 및/또는 HGF)을 발현하는 암 세포의 적어도 일부에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자는, 폴리펩티드에의 결합 시, 시험관내에서 또는 생체 내에서, 폴리펩티드를 발현하고/하거나 이에 응답성인 종양 세포의 파괴 또는 사멸, 또는 이같은 종양 세포의 성장 억제에 효과적이다. 이같은 항체에는 네이키드 항체 (어떠한 작용제에도 접합되지 않음)가 포함된다. 세포독성 또는 세포 성장 억제 성질을 갖는 네이키드 항체는 종양 세포 파괴에서 이들을 더욱 강력하게 하는 세포독성제에 추가로 연결될 수 있다. 세포독성 성질은, 예를 들어, 항체를 세포독성제와 접합시켜, 본원에 기술된 바와 같은 면역접합체를 형성시킴으로써, 항체에 부여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포독성제 또는 성장 억제제는 소형 분자이다. 일부 실시양태에서, 독소 예컨대 칼리키아마이신 또는 메이탄시노이드 및 이의 유사체 또는 유도체가 사용된다.

본 발명은 본 발명의 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자, 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 암의 처치를 위한 목적으로, 조성물은 이같은 처치를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있고, 이 때 조성물은 면역접합체로서 또는 네이키드 항체로서 존재하는 1개 이상의 항체를 포함할 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 조성물은 화학요법제를 포함하여 세포독성제 또는 성장 억제제와 같은 다른 치료제와 조합된 이러한 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자를 포함할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자, 및 담체를 포함하는 제형을 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 제형은 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 치료용 제형이다.

본 발명의 또다른 양상은 항체를 코딩하는 단리된 핵산이다. H 및 L 사슬 모두 및 특히 초가변 영역 잔기, 천연 서열 항체 뿐만 아니라 항체의 변이체, 변형물 및 인간화 버젼을 코딩하는 사슬을 코딩하는 핵산이 구현된다.

본 발명은 치료적 유효량의 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 암을 처치하거나 암의 1가지 이상의 증상을 경감시키는데 유용한 방법을 또한 제공한다. 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자의 치료용 조성물은 단기간 (급성) 또는 만성으로, 또는 의사가 지시하는 대로 간헐적으로 투여될 수 있다. 폴리펩티드 (헵신 및/또는 HGF)를 발현하고/하거나 이에 응답성인 세포의 성장을 억제하고, 이를 사멸시키는 방법이 또한 제공된다.

본 발명은 적어도 1개 이상의 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자를 포함하는 키트 및 제조품을 또한 제공한다. 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자를 함유하는 키트는, 예를 들어, 세포 사멸 분석법, 세포로부터의 폴리펩티드의 정제 또는 면역침전을 위한 용도가 확인된다. 예를 들어, 폴리펩티드 의 단리 및 정제를 위해, 키트는 비드 (예를 들어, 세파로스 비드)에 커플링된 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자를 함유할 수 있다. 시험관 내에서, 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 폴리펩티드의 검출 및 정량을 위한 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자를 함유하는 키트가 제공될 수 있다. 검출에 유용한 이같은 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자에 형광 또는 방사선표지와 같은 표지가 제공될 수 있다.

K. 제조품 및 키트

본 발명의 또다른 실시양태는 폴리펩티드 (헵신 및/또는 HGF) 발현 암, 예컨대 전립선암 또는 난소암의 처치에 유용한 물질을 함유하는 제조품이다. 제조품은 용기, 및 용기 상에 있는 또는 용기와 조합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적절한 용기로는, 예를 들어, 병, 바이알(vial), 주사기 등이 포함된다. 용기는 다양한 재료 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 암 상태의 처치에 효과적인 조성물을 담고 있고, 멸균 접근 포트(port)를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하주사 바늘이 관통가능한 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 1가지 이상의 작용제는 본 발명의 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 암의 처치에 사용되는다는 것을 나타낸다. 표지 또는 포장 삽입물은 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자 조성물을 암 환자에게 투여하기 위한 지침을 추가로 포함할 것이다. 추가적으로, 제조품은 제약상 허용가능한 버퍼, 예컨대 정균처리된 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포 함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 기타 버퍼, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업용 및 사용자의 관점에서 바람직한 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다.

다양한 목적, 예를 들어, 폴리펩티드-발현 또는 세포 사멸 분석법, 세포로부터의 폴리펩티드의 정제 또는 면역침전에 유용한 키트가 또한 제공된다. 폴리펩티드의 단리 및 정제를 위해, 키트는 비드 (예를 들어, 세파로스 비드)에 커플링된 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자를 함유할 수 있다. 시험관 내에서, 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 폴리펩티드의 검출 및 정량을 위한 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자를 함유하는 키트가 제공될 수 있다. 제조품과 같이, 키트는 용기, 및 용기 상에 있는 또는 용기와 조합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 용기에는 1가지 이상의 본 발명의 항체, 올리고펩티드 또는 소형 유기/무기 분자를 포함하는 조성물이 담긴다. 희석제 및 버퍼, 대조군 항체를 예를 들어 함유하는 추가적인 항체가 포함될 수 있다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물의 설명서 뿐만 아니라 의도된 시험관내 또는 검출 용도를 위한 지침을 제공할 것이다.

L. 폴리펩티드 및 폴리펩티드-코딩 핵산 - 특정 형태 및 용도

본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (또는 이의 보체)는 분자 생물학에서의 다양한 용도, 뿐만 아니라 요법용의 용도 등을 갖는다. 폴리펩티드-코딩 핵산은 본원에 기술된 재조합 기술에 의한 폴리펩티드의 제조에 또한 유용할 것이고, 이 때 이러한 폴리펩티드들은, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 항 체의 제조에서의 용도가 발견될 수 있다.

전장 천연 서열 폴리펩티드 유전자, 또는 이의 일부를 cDNA 라이브러리에 대한 혼성화 프로브로 사용하여, 본원에 개시된 천연 폴리펩티드 서열에 대해 원하는 서열 동일성을 갖는 다른 cDNA (예를 들어, 폴리펩티드의 천연-발생 변이체 또는 다른 종으로부터의 폴리펩티드를 코딩하는 것들)를 단리할 수 있다. 임의로, 프로브의 길이는 약 20 내지 약 50개의 염기일 것이다. 혼성화 프로브는 전장 천연 뉴클레오티드 서열의 적어도 부분적으로 신규인 영역 (과도한 실험 없이 결정될 수 있음)으로부터 또는 천연 서열 폴리펩티드의 프로모터, 인핸서 요소 및 인트론을 포함하는 게놈 서열로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 스크리닝 방법은 약 40개 염기의 선택된 프로브를 합성하기 위해 공지된 DNA 서열을 사용하여 폴리펩티드 유전자의 코딩 영역을 단리하는 것을 포함할 것이다. 방사선뉴클레오티드 예컨대 ³²P 또는 ³⁵S, 또는 아비딘/비오틴 커플링 시스템을 통해 프로브에 커플링된 알칼리성 포스파타제와 같은 효소적 표지를 포함하는 다양한 표지에 의해 혼성화 프로브를 표지시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 유전자의 서열에 상보적인 서열을 갖는 표지된 프로브를 사용하여 인간 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA를 스크리닝하여, 이같은 라이브러리의 어떤 구성원에 프로브가 혼성화하는지를 결정한다. 혼성화 기술은 하기의 실시예에서 추가로 상세하게 기술된다. 본원에 기술된 방법을 이용하여, 본 출원에 개시된 임의의 EST 서열을 프로브로 유사하게 사용할 수 있다.

폴리펩티드-코딩 핵산의 기타 유용한 단편에는 표적 폴리펩티드 mRNA (센스) 또는 폴리펩티드 DNA (안티센스) 서열에 결합할 수 있는 단일 가닥 핵산 서열 (RNA 또는 DNA)을 포함하는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 본 발명에 따르면, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 헵신, 프로-HGF 또는 결합 단편을 코딩하는 DNA의 코딩 영역의 단편을 포함한다. 이같은 단편은 일반적으로 약 14개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 14 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 소정의 단백질을 코딩하는 cDNA 서열을 기초로 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 유도하는 능력은, 예를 들어, [Stein and Cohen, Cancer Res. 48:2659, 1988] 및 [van der Krol et al., BioTechniques, 6:958, 1988]에 기술되어 있다.

안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 서열의 결합으로 듀플렉스의 증강된 분해, 전사 또는 번역의 조기 종결 등이 포함되는 다양한 수단 중 하나에 의해 또는 기타 수단에 의해 표적 서열의 전사 또는 번역을 차단하는 듀플렉스가 형성된다. 이같은 방법은 본 발명에 포함된다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 포유동물에서 암의 유도에 역할이 있을 수 있는 단백질의 발현을 차단할 수 있다. 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 당-포스포디에스테르 골격 (또는 다른 당 연결, 예컨대 WO 91/06629에 기재된 것들)을 갖는 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 이 때 이같은 당 연결은 내인성 뉴클레아제에 대해 저항성이다. 저항성 당 연결이 있는 이같은 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 안정적이지만 (즉, 효소 분해에 대해 저항성일 수 있음), 표적 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 서열 특이성이 유지된다.

안티센스 결합에 대한 바람직한 유전자내 부위에는 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 번역 개시/시작 코돈 (5'-AUG / 5'-ATG) 또는 종결/정지 코돈 (5'-UAA, 5'-UAG 및 5-UGA / 5'-TAA, 5'-TAG 및 5'-TGA)이 혼입된 영역이 포함된다. 이러한 영역은 번역 개시 또는 종결 코돈으로부터의 임의의 방향 (즉, 5' 또는 3')에서의 약 25 내지 약 50개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA 또는 유전자의 부분을 지칭한다. 안티센스 결합에 대한 다른 바람직한 영역에는 인트론; 엑손; 인트론-엑손 이음부; 번역 개시 코돈과 번역 종결 영역 사이의 영역인 오픈 리딩 프레임 (ORF) 또는 "코딩 영역"; 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 mRNA의 가장 5'쪽의 잔기에 연결된 N7-메틸화 구아노신 잔기를 포함하고, 5' 캡 구조 자체뿐만 아니라 캡에 인접한 최초의 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA의 5' 캡; 번역 개시 코돈으로부터 5' 방향이고, 따라서 5' 캡 부위와 mRNA의 번역 개시 코돈 사이의 뉴클레오티드 또는 유전자 상의 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA의 부분인 5' 비번역 영역 (5'UTR); 및 번역 종결 코돈으로부터 3' 방향이고, 따라서 번역 종결 코돈과 mRNA의 3' 말단 사이의 뉴클레오티드 또는 유전자 상의 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA의 부분인 3' 비번역 영역 (3'UTR)이 포함된다.

폴리펩티드의 발현 억제에 유용한 바람직한 안티센스 화합물에는 변형된 골격 또는 비-천연 뉴클레오시드간(internucleoside) 연결을 함유하는 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 변형된 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드에는 골격 내에 인 원자가 유지된 것들 및 골격 내에 인 원자를 갖지 않는 것들이 포함된다. 본 명세서의 목적을 위해서, 그리고 당업계에서 종종 지칭되는 바와 같이, 뉴클레오시드간 골격에 인 원자를 갖지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드 또한 올리고뉴클레오시드인 것으로 간주될 수 있다. 바람직한 변형된 올리고뉴클레오티드 골격에는, 예를 들어, 정상적인 3'-5' 연결을 갖는, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리-에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트가 포함되는 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트가 포함되는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트 및 보라노-포스페이트, 이들의 2'-5' 연결 유사체, 및 1개 이상의 뉴클레오티드간 연결이 3'-3', 5'-5' 또는 2'-2' 연결인, 극성이 역전된 것들이 포함된다. 극성이 역전된 바람직한 올리고뉴클레오티드는 가장 3'쪽의 뉴클레오티드간 연결에서 단일 3'-3' 연결, 즉 탈염기성(abasic) (핵염기가 손실되거나, 대신 히드록실 기를 가짐)일 수 있는 단일한 역전된 뉴클레오시드 잔기를 포함한다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리 산 형태가 또한 포함된다. 인-함유 연결의 제조가 교시된 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 제3,687,808호; 제제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131 호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 제5,194,599호; 제5,565,555호; 제5,527,899호; 제5,721,218호; 제 5,672,697호 및 제5,625,050호 (각각 거명에 의해 본원에 포함됨)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

인 원자를 포함하지 않는 바람직한 변형된 올리고뉴클레오티드 골격은 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자성 또는 헤테로고리형 뉴클레오시드간 연결에 의해 형성된 골격을 갖는다. 여기에는 모르폴리노 연결 (뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨); 실록산 골격; 술피드, 술폭시드 및 술폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 리보아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 술파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 골격; 술포네이트 및 술폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 혼합된 N, O, S 및 CH₂ 성분 부분을 갖는 기타 골격을 갖는 것들이 포함된다. 이같은 올리고뉴클레오시트의 제조가 교시된 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 제5,792,608호; 제5,646,269호 및 제5,677,439호 (각각 거명에 의해 본원에 포함됨)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

또다른 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드에서는, 뉴클레오티드 단위의 당 및 뉴클레오시드간 연결, 즉 골격 모두가 새로운 기로 대체된다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 우수한 혼성화 성질을 갖는 것으로 나타난 올리고뉴클레오티드 모방물인 한 이같은 올리고머성 화합물은 펩티드 핵산 (PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-골격은 아미드 함유 골격, 특히 아미노에틸글리신 골격으로 대체된다. 핵염기는 유지되고, 직접적으로 또는 간접적으로 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 결합된다. PNA 화합물의 제조가 교시된 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호 (각각 거명에 의해 본원에 포함됨)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. PNA 화합물의 추가적인 교시는 [Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500]에서 발견할 수 있다.

바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드에는 포스포로티오에이트 골격 및/또는 헤테로원자 골격, 특히 상기 언급된 미국 특허 제5,489,677호에 기술된 -CH₂-NH-O-CH₂-, -CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-[메틸렌 (메틸이미노) 또는 MMI 골격으로 공지됨], -CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-, -CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂- 및 -O-N(CH₃)-CH₂-CH₂- [식중 천연 포스포디에스테르 골격은 -O-P-O-CH₂-로 표시된다], 및 상기 언급된 미국 특허 제5,602,240호의 아미드 골격이 혼입된다. 상기 언급된 미국 특허 제5,034,506호의 모르폴리노 골격 구조를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또한 바람직하다.

변형된 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 치환된 당 모이어티를 또한 함유할 수 있다. 바람직한 올리고뉴클레오티드는 하기의 것들 중 하나를 2' 위치에서 포함한다: OH; F; O-알킬, S-알킬, 또는 N-알킬; O-알케닐, S-알케닐, 또는 N-알케닐; O-알키닐, S-알키닐 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬 [식중 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환 또는 비치환 C₁ 내지 C₁₀ 알킬 또는 C₂ 내지 C₁₀ 알케닐 및 알키닐이다]. O[(CH₂)_nO]_mCH₃, O(CH₂)_nOCH₃, O(CH₂)_nNH₂, O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_nONH₂, 및 O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂ [식중 n 및 m은 1 내지 약 10이다]가 특히 바람직하다. 또다른 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기의 것들 중 하나를 2' 위치에서 포함한다: C₁ 내지 C₁₀ 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, CF₃, OCF₃, SOCH₃, SO₂, CH₃, ONO₂, NO₂, N₃, NH₂, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 기, 리포터 기, 인터칼레이터, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 성질을 개선시키기 위한 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약역학적 성질을 개선시키기 위한 기, 및 유사한 성질을 갖는 기타 치환기. 바람직한 변형에는 2'-메톡시에톡시 (2'-0-CH₂CH₂OCH₃, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로 또한 공지됨) ([Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504]), 즉 알콕시알콕시 기가 포함된다. 추가적인 바람직한 변형에는 하기의 실시예에 기술된, 2'-DMAOE로 또한 공지된 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, O(CH₂)₂ON(CH₃)₂ 기, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로 또한 당업계에 공지됨), 즉, 2'-0-CH₂-O-CH₂-N(CH₂)가 포함된다.

추가적인 바람직한 변형에는 2'-히드록실 기가 당 고리의 3' 또는 4' 탄소 원자에 연결됨으로써 이고리형 당 모이어티가 형성된 잠금(locked) 핵산 (LNA)이 포함된다. 바람직하게는 연결부는 2' 산소 원자와 4' 탄소를 연결하는 메틸렌 (-CH₂-)_n 기 [식중 n은 1 또는 2이다]이다. LNA 및 이의 제조는 WO 98/39352 및 WO 99/14226에 기술되어 있다.

또다른 바람직한 변형에는 2'-메톡시 (2'-0-CH₃), 2'-아미노프로폭시 (2'- OCH₂CH₂CH₂ NH₂), 2'-알릴 (2'-CH₂-CH=CH₂), 2'-0-알릴 (2'-0-CH₂-CH=CH₂) 및 2'-플루오로 (2'-F)가 포함된다. 2'-변형은 아라비노 (상부) 위치 또는 리보 (하부) 위치에 있을 수 있다. 바람직한 2'-아라비노 변형은 2'-F이다. 유사한 변형이 올리고뉴클레오티드 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상의 당의 3' 위치에서, 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 또한 이루어질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 펜토프라노실 당 대신 시클로부틸 모이어티와 같은 당 모방물을 또한 가질 수 있다. 이같은 변형된 당 구조의 제조가 교시된 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 제5,792,747호; 및 제5,700,920호 (각각 거명에 의해 전체적으로 본원에 포함됨)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

올리고뉴클레오티드는 핵염기 (당업계에서 간단히 "염기"로 종종 지칭됨) 변형 또는 치환을 또한 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 "변형되지 않은" 또는 "천연" 핵염기에는 퓨린 염기인 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기인 티미딘 (T), 사이토신 (C) 및 우라실 (U)이 포함된다. 변형된 핵염기에는 기타 합성 및 천연 핵염기 예컨대 5-메틸사이토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 사이토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티미딘 및 2-티오사이토신, 5-할로우라실 및 사이토신, 5-프로피닐 (-C≡C-CH₃ 또는 -CH₂-C≡CH) 우라실 및 사이토신 및 피리미딘 염기의 기타 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 사이토신 및 티미딘, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 기타 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌이 포함된다. 추가적인 변형된 핵염기에는 삼고리형 피리미딘 예컨대 페녹사진 사이티딘 (1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤즈옥사진-2(3H)-온), 페노티아진 사이티딘 (1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프(clamp) 예컨대 치환된 페녹사진 사이티딘 (예를 들어 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤즈옥사진-2(3H)-온), 카 르바졸 사이티딘 (2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 사이티딘 (H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)이 포함된다. 변형된 핵염기에는 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로고리로 대체된 것들, 예를 들어 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈이 또한 포함될 수 있다. 추가적인 핵염기에는 미국 특허 제3,687,808호에 개시된 것들, [The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pp 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것들, 및 [Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991 , 30, 613]에 개시된 것들이 포함된다. 이러한 핵염기들 중 특정한 것들은 본 발명의 올리고머성 화합물의 결합 친화력을 증가시키는데 특히 유용하다. 여기에는 5-치환 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환 퓨린 (2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신 포함)이 포함된다. 5-메틸사이토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정성을 0.6-1.2℃만큼 증가시키는 것으로 나타났고 ([Sanghvi et al, 안티센스 Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278]), 바람직한 염기 치환이며, 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합되는 경우 더욱 특히 바람직하다. 변형된 핵 염기의 제조가 교시된 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 제3,687,808호, 뿐만 아니라 미국 특허 제4,845,205호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,594,121호; 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,645,985호; 제5,830,653 호; 제5,763,588호; 제6,005,096호; 제5,681,941호 및 제5,750,692호 (각각 거명에 의해 본원에 포함됨)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

안티센스 올리고뉴클레오티드의 또다른 변형은 올리고뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포성 분포 또는 세포성 흡수를 증강시키는 하나 이상의 모이어티 또는 접합체에 화학적으로 연결시킨다. 본 발명의 화합물은 1차 또는 2차 히드록실 기와 같은 기능성 기에 공유 결합된 접합체 기를 포함할 수 있다. 본 발명의 접합체 기에는 인터칼레이터, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에테르, 올리고머의 약역학적 성질을 증강시키는 기, 및 올리고머의 약동학적 성질을 증강시키는 기가 포함된다. 전형적인 접합체 기에는 콜레스테롤, 지질, 양이온 지질, 인지질, 양이온성 인지질, 비오틴, 페나진, 폴레이트, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오로세인, 로다민, 쿠마린 및 염료가 포함된다. 약역학적 성질을 증강시키는 기에는, 본 발명의 문맥에서, 올리고머 흡수를 개선시키고/시키거나, 분해에 대한 올리고머 저항성을 증강시키고/시키거나, RNA와의 서열-특이적 혼성화를 강화시키는 기가 포함된다. 약동학적 성질을 증강시키는 기에는, 본 발명의 문맥에서, 올리고머 흡수, 분포, 대사 또는 배출을 개선시키는 기가 포함된다. 접합체 모이어티에는 지질 모이어티 예컨대 콜레스테롤 모이어티 ([Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556]), 담즙산 ([Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060]), 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올 ([Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309]; [Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770]), 티오콜레스테롤 ([Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538]), 지방족 사슬, 예를 들어, 도데탄디올 또는 운데실 잔기 ([Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118]; [Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330]; [Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54]), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트 ([Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654]; [Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783]), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 ([Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973]), 또는 아다만탄 아세트산 ([Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654]), 팔미틸 모이어티 ([Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237]), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 활성 약물 물질, 예를 들어, 아스피린, 와르파린, 페닐부타존, 이부프로펜, 수프로펜, 펜부펜, 케토프로펜, (S)-(+)-프라노프로펜, 카르프로펜, 단실사르코신, 2,3,5-트리요오도벤조산, 플루페남산, 폴린산, 벤조티아디아지드, 클로로티아지드, 디아제핀, 인도메티신, 바르비투레이트, 세팔로스포린, 술파 약물, 항당뇨병제, 항균제 또는 항생제에 또한 접합될 수 있다. 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 및 이의 제조는 미국 특허 출원 일련번호 제09/334,130호 (1999년 6월 15일 출원) 및 미국 특허 출원 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호; 제 5,580,731호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호; 제5,391,723호; 제5,416,203호; 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호 (각각 거명에 의해 본원에 포함됨)에 기술되어 있다.

소정의 화합물 내의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없고, 실제로 2개 이상의 상기 언급된 변형들이 단일 화합물에 또는 심지어 올리고뉴클레오티드 내의 단일 뉴클레오시드에 혼입될 수 있다. 본 발명에는 키메라 화합물인 안티센스 화합물이 또한 포함된다. "키메라" 안티센스 화합물 또는 "키메라"는, 본 발명의 문맥에서, 각각 1개 이상의 단량체 단위 (즉 올리뉴클레오티드 화합물의 경우에는 뉴클레오티드)로 이루어진 2개 이상의 화학적으로 상이한 영역을 함유하는 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 저항성, 증가된 세포성 흡수, 및/또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화력이 올리고뉴클레오티드에 부여되도록 올리고뉴클레오티드가 변형된 1개 이상의 영역을 전형적으로 함유한다. 올리고뉴클레오티드의 추가적인 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로서 작용할 수 있다. 예를 들어, RNA분해효소 H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제이다. 따라서, RNA분해효소 H의 활성화로 RNA 표적이 절단됨으로써, 유전자 발현의 올리고뉴클레오티드 억제의 효능이 크게 증강된다. 결과적으로, 키메라 올리고뉴클레오티드가 사용될 때, 동일한 표적 영역에 혼성화하는 포스포로티오에이트 데옥시올리고뉴클레오티드와 비교하여, 더 짧은 올리고뉴클레오티드로 필적하는 결과가 종종 수득될 수 있다. 본 발명의 키메라 안티센스 화합물은 2개 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및/또는 올리고뉴클레오티드 모방물 (상기 기술된 바와 같음)의 복합 구조물로서 형성될 수 있다. 바람직한 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드에는 3' 말단에서 1개 이상의 2' 변형 당 (바람직하게는 2'-O-(CH₂)₂-O-CH₃)이 혼입되어, 뉴클레아제 저항성을 부여하고, 4개 이상의 인접한 2'-H 당을 갖는 영역이 혼입되어 RNA분해효소 H 활성을 부여한다. 이같은 화합물은 당업계에서 하이브리드 또는 갭머(gapmer)로 또한 지칭된다. 바람직한 갭머는 4개 이상의 인접한 2'-H 당을 갖는 영역 1개 이상에 의해 분리된 5' 말단 및 3'-말단에서 2' 변형 당 (바람직하게는 2'-O-(CH₂)₂-0-CH₃)의 영역을 갖고, 바람직하게는 포스포로티오에이트 골격 연결이 혼입된다. 이같은 하이브리드 구조물의 제조가 교시된 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 제5,013,830호; 제5,149,797호; 제5,220,007호; 제5,256,775호; 제 5,366,878호; 제5,403,711호; 제5,491,133호; 제5,565,350호; 제5,623,065호; 제5,652,355호; 제5,652,356호; 및 제5,700,922호 (각각 거명에 의해 전체적으로 본원에 포함됨)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 따라 사용된 안티센스 화합물은 주지된 고체 상 합성 방법을 통해 편리하게, 그리고 통상적으로 제조될 수 있다. 이같은 합성을 위한 장치는 Applied Biosystems (Foster City, Calif.)가 예를 들어 포함되는 여러 사업자가 판매한다. 당업계에 공지된 이같은 합성을 위한 임의의 기타 수단을 추가적으로 또는 별법적으로 사용할 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체와 같은 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 유사한 기술을 사용하는 것은 주지되어 있다. 본 발명의 화합물은 섭취, 분포 및/또는 흡수를 보조하기 위해 다른 분자, 분자 구조물 또는 화합물들의 혼합물, 예를 들어, 리포솜, 수용체 표적화 분자, 경구, 직장, 국소 또는 기타 제형과 부가혼합되거나, 이에 캡슐화되거나, 접합되거나 또는 다른 방식으로 조합될 수 있다. 이같은 섭취, 분포 및/또는 흡수 보조 제형의 제조가 교시된 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 제5,108,921호; 제5,354,844호; 제5,416,016호; 제5,459,127호; 제5,521,291호; 제5,543,158호; 제5,547,932호; 제5,583,020호; 제5,591,721호; 제4,426,330호; 제4,534,899호; 제5,013,556호; 제5,108,921호; 제5,213,804호; 제5,227,170호; 제5,264,221호; 제5,356,633호; 제5,395,619호; 제5,416,016호; 제5,417,978호; 제5,462,854호; 제5,469,854호; 제5,512,295호; 제5,527,528호; 제5,534,259호; 제5,543,152호; 제5,556,948호; 제5,580,575호; 및 제5,595,756호 (각각 거명에 의해 본원에 포함됨)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 또다른 예에는 유기 모이어티, 예컨대 WO 90/10048에 기술된 것들, 및 표적 핵산 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화력을 증가시키는 또다른 모이어티, 예컨대 폴리-(L-라이신)에 공유결합적으로 연결된 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 또한, 인터칼레이팅제, 예컨대 엘립티신, 및 알킬화제 또는 금속 착물이 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 부착되어, 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 결합 특이성을 변형시킬 수 있다.

CaPO₄-매개 DNA 형질감염, 전기천공이 예를 들어 포함되는 임의의 유전자 전달 방법에 의해, 또는 유전자 전달 벡터 예컨대 엡스테인-바(Epstein-Barr) 바이러스를 사용함으로써, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 표적 핵산 서열을 함유하는 세포 내로 도입할 수 있다. 바람직한 절차에서, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 적절한 레트로바이러스 벡터 내로 삽입한다. 표적 핵산 서열을 함유하는 세포를 재조합 레트로바이러스 벡터와 생체내에서 또는 생체외에서 접촉시킨다. 적절한 레트로바이러스 벡터에는 마우스 레트로바이러스 M-MuLV, N2 (M-MuLV로부터 유래된 레트로바이러스), 또는 DCT5A, DCT5B 및 DCT5C로 명명된 이중 카피 벡터로부터 유래된 것들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다 (WO 90/13641 참조).

WO 91/04753에 기술된 바와 같은 리간드 결합 분자와의 접합체의 형성에 의 해 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 세포 내로 또한 도입할 수 있다. 적절한 리간드 결합 분자에는 세포 표면 수용체, 성장 인자, 기타 사이토카인, 또는 세포 표면 수용체에 결합하는 기타 리간드가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 리간드 결합 분자의 접합은 이의 상응하는 분자 또는 수용체에 결합하는 리간드 결합 분자의 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않거나, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 접합체 버젼이 세포 내로 진입하는 것을 차단하지 않는다.

별법적으로, WO 90/10448에 기술된 바와 같은 올리고뉴클레오티드-지질 복합체의 형성에 의해 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 표적 핵산 서열을 함유하는 세포 내로 도입할 수 있다. 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드-지질 복합체는 내인성 지질분해효소에 의해 세포 내에서 바람직하게 해리된다.

안티센스 또는 센스 RNA 또는 DNA 분자의 길이는 적어도 약 5개의 뉴클레오티드이고, 별법적으로는, 길이가 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 1 10, 1 15, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 또는 1000개의 뉴클레오티드이며, 이 때 이러한 문맥에서 용어 "약"은 언급된 뉴클레오티드 서열 길이 ± 이러한 언급된 길이의 10％를 의미한다.

프로브를 PCR 기술에서 또한 사용하여, 밀접하게 관련된 폴리펩티드 코딩 서열의 확인을 위한 서열의 풀(pool)을 생성시킬 수 있다.

또한 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 사용하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 맵핑 및 유전적 장애가 있는 개인의 유전학적 분석을 위한 혼성화 프로브를 구축할 수 있다. 본원에서 제공된 뉴클레오티드 서열을 공지된 기술, 예컨대 계내 혼성화, 공지된 염색체 마커에 대한 연관 분석, 및 라이브러리와의 혼성화 스크리닝을 사용하여 염색체 및 염색체의 특정 영역에 맵핑할 수 있다.

폴리펩티드와의 상호작용에 수반되는 다른 단백질 또는 분자를 확인하기 위한 분석법에서 폴리펩티드를 사용할 수 있다. 이같은 방법에 의해, 수용체/리간드 결합 상호작용의 억제제를 확인할 수 있다. 이같은 결합 상호작용에 수반되는 단백질을 결합 상호작용의 펩티드 또는 소형 분자 억제제를 스크리닝하는데 또한 사용할 수 있다. 천연 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 리드(lead) 화합물 또는 폴리펩티드의 수용체를 확인하기 위해 스크리닝 분석법을 고안할 수 있다. 이같은 스크리닝 분석법에는 화학물질 라이브러리에 대한 고처리량 스크리닝이 적용될 수 있는 분석법이 포함되며, 이들을 특히 소형 분자의 약물 후보물질의 확인에 적합하게 할 것이다. 구현되는 소형 분자는 합성 유기 또는 무기 화합물을 포함한다. 상기 분석법은 단백질-단백질 결합 분석법, 생화학적 스크리닝 분석법, 면역분석법 및 세포 기재 분석법이 포함되는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고, 이들은 당업계에 잘 특징화되어 있다.

또한, 폴리펩티드 또는 이의 변형된 형태를 코딩하는 핵산을 사용하여 치료적으로 유용한 시약의 개발 및 스크리닝에 유용한 트랜스제닉 동물 또는 "녹 아웃(knock out)" 동물을 생성시킬 수 있다. 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스 또는 래트)은 트랜스진(transgene)을 함유하는 세포를 보유하는 동물인데, 트랜스진은 태아기, 예를 들어, 배아 단계에서 상기 동물 또는 상기 동물의 조상에 도입된다. 트랜스진은 세포의 게놈 내로 통합된 DNA이며, 이 세포로부터 트랜스제닉 동물이 발육된다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 이 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있고, 이 게놈 서열을 사용하여 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 발현하는 세포를 함유하는 트랜스제닉 동물을 생성시킬 수 있다. 트랜스제닉 동물, 특히, 마우스 또는 래트와 같은 동물을 생성시키는 방법은 당업계에 통상적이게 되었으며, 예를 들어, 미국 특허 제4,736,866호 및 제4,870,009호에 기술되어 있다. 전형적으로, 특정 세포가 조직-특이적 인핸서를 갖춘 폴리펩티드 트랜스진 혼입에 표적화될 것이다. 배아 단계에서 동물의 배선에 도입된 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스진의 한 카피를 포함하는 트랜스제닉 동물을 사용하여 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 증가된 발현의 효과를 조사할 수 있다. 이같은 동물을, 예를 들어, 이의 과발현과 관련된 병리학적 상태로부터의 보호를 제공할 것으로 생각되는 시약에 대한 테스터 동물로서 사용할 수 있다. 본 발명의 이러한 국면에 따라, 동물을 시약으로 처치하고, 트랜스진을 보 유하는 처치되지 않은 동물에 비해 병리학적 상태의 발생이 저하된 것은 병리학적 상태에 대한 잠재적인 치료적 개입을 가리킬 것이다.

별법적으로, 폴리펩티드의 비-인간 상동체를 사용하여, 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 유전자와 동물의 배아 줄기 세포에 도입된 폴리펩티드를 코딩하는 변경된 게놈 DNA 사이의 상동성 재조합의 결과로서 폴리펩티드를 코딩하는 결손 또는 변경된 유전자를 갖는 유전자 "녹 아웃" 동물을 구축할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA의 일부는 결실되거나, 통합을 모니터링하는데 사용될 수 있는 선택가능 마커를 코딩하는 유전자와 같은 또다른 유전자로 대체될 수 있다. 전형적으로, 벡터 내에는 수천개 염기의 변경되지 않은 플랭킹(flanking) DNA (5' 및 3' 말단 모두에서)가 포함된다 [예를 들어, 상동성 재조합 벡터의 기술에 대해서 [Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)] 참조]. 벡터를 배아 줄기 세포주 내로 도입하고 (예를 들어, 전기천공에 의해), 도입된 DNA가 내인성 DNA와 상동성 재조합된 세포를 선택한다 [예를 들어, [Li et al., Cell, 69:915 (1992)] 참조]. 그 후, 선택된 세포를 동물 (예를 들어, 마우스 또는 래트)의 배반포 내로 주사하여, 군집 (aggregation) 키메라를 형성시킨다 [예를 들어, [Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152] 참조]. 그 후, 키메라 배아를 적합한 가임신 대리모 동물 내로 이식하고, 배아를 분만시켜, "녹 아웃" 동물을 생성시킬 수 있다. 생식 세포 내에 상동성 재조합된 DNA를 보유하는 자손을 표준 기술로 확인하여, 동물의 모든 세포가 상동성 재조합된 DNA를 함유하는 동물을 번식시키는데 사용할 수 있다. 녹아웃 동물은, 예를 들어, 특정 병리학적 상태에 대해 방어하는 능력 및 폴리펩티드의 부재로 인한 병리학적 상태의 발달을 특징으로 할 수 있다.

폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 유전자 요법에서 또한 사용할 수 있다. 유전자 요법 용도에서, 유전자는 예를 들어, 결손 유전자의 대체를 위해, 치료적으로 효과적인 유전자 생성물의 생체내 합성을 달성하기 위하여 세포 내로 도입된다. "유전자 요법"에는 단일 처치에 의해 지속적인 효과가 달성되는 통상적인 유전자 요법, 및 치료적으로 효과적인 DNA 또는 mRNA의 1회 또는 반복 투여가 수반되는 유전자 치료제의 투여 모두가 포함된다. 안티센스 RNA 및 DNA를 생체 내에서 특정 유전자의 발현을 차단하기 위한 치료제로서 사용할 수 있다. 세포막에 의한 제한된 흡수로 인한 낮은 세포내 농도에도 불구하고, 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드가 이들이 억제제로 작용하는 세포 내로 수입될 수 있다는 것이 이미 밝혀져 있다 ([Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:4143-4146 (1986)]). 예를 들어, 음으로 대전된 포스포디에스테르 기를 전하를 띠지 않는 기로 치환함으로써, 올리고뉴클레오티드를 변형시켜 이의 흡수를 증대시킬 수 있다.

핵산을 살아있는 세포로 도입하는데 이용가능한 다양한 기술이 있다. 이 기술은 핵산이 배양된 세포 내로 시험관내에서 전달되는지 또는 의도된 숙주의 세포에 생체내 전달되는지 여부에 따라 달라진다. 핵산을 포유동물 세포 내로 시험관내 전달하는데 적절한 기술에는 리포솜, 전기천공, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱 스트란, 인산칼슘 침전 방법 등의 사용이 포함된다. 현재 바람직한 생체내 유전자 전달 기술에는 바이러스 (통상적으로는 레트로바이러스) 벡터로의 형질감염 및 바이러스 코트 단백질-리포솜 매개 형질감염이 포함된다 ([Dzau et al., Trends in Biotechnology, 11:205-210 (1993)]). 일부 경우에는, 표적 세포를 표적화하는 작용제, 예컨대 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포솜이 사용되는 경우, 세포내이입과 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질, 예를 들어, 특정 세포 유형에 대해 굴성인 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환시 내재화가 일어나는 단백질에 대한 항체, 세포내 국소화를 표적으로 하고 세포내 반감기를 증강시키는 단백질을 표적화 및/또는 흡수 촉진에 사용할 수 있다. 수용체-매개 세포내이입 기술은, 예를 들어, [Wu et al., J. Biol. Chem, 262, 4429-4432 (1987)] 및 [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3410-3414 (1990)]에 기술되어 있다. 유전자 마킹 및 유전자 요법 프로토콜에 관한 개관에 대해서는 [Anderson et al., Science, 256, 808-813 (1992)]을 참조.

본원에 기술된 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 분자는 염색체 확인에 유용하다. 이와 관련하여, 신규 염색체 마커를 확인하는 것이 지속적으로 요구되는데, 이는 실제 서열 데이타를 기초로 하는 비교적 적은 염색체 마킹 시약만이 현재 이용가능하기 때문이다. 본 발명의 각각의 핵산 분자는 염색체 마커로 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 및 핵산 분자는 조직 유형결정을 위해 진단용으로 사 용될 수 있는데, 이 때 폴리펩티드가 다른 조직에 비해 한 조직에서, 바람직하게는 동일한 조직 유형의 정상 조직에 비해 질환 조직에서, 차별적으로 발현될 수 있다. 핵산 분자는 PCR, 노던 분석, 서던 분석 및 웨스턴 분석용 프로브의 생성에 사용될 것이다.

본 발명은 폴리펩티드의 효과를 방지하는 것들 (길항제)을 확인하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법을 포함한다. 길항제 약물 후보물에 대한 스크리닝 분석법은 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 결합하거나 이와 복합체를 형성하거나, 또는 다르게는 세포로부터 폴리펩티드의 발현을 억제하는 것을 예를 들어 포함하여 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포 단백질의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하기 위해 고안된다. 이같은 스크리닝 분석법에는 화학물질 라이브러리의 고처리량 스크리닝이 적용될 수 있는 분석법이 포함되며, 이들을 특히 소형 분자의 약물 후보물질의 확인에 적합하게 할 것이다.

분석법은 단백질-단백질 결합 분석법, 생화학적 스크리닝 분석법, 면역분석법 및 세포 기재 분석법이 포함되는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고, 이들은 당업계에 잘 특징화되어 있다.

길항제에 관한 모든 분석법은 공통점은 약물 후보물질과 본원에서 확인된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 이러한 두 성분이 상호작용하도록 하기에 충분한 조건 및 시간 동안 접촉시켜야한다는 것이다.

결합 분석법에서, 상호작용은 결합이고, 형성된 복합체는 반응 혼합물에서 단리 또는 검출될 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 약물 후보물질을 공유결합 또는 비-공유결합 부착에 의해 고체 상, 예를 들어, 미량역가 플레이트 상에 고정한다. 비-공유결합 부착은 고체 표면을 폴리펩티드의 용액으로 코팅하고 건조시킴으로써 일반적으로 달성된다. 별법적으로, 고정될 폴리펩티드에 특이적인 고정된 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체를 사용하여 폴리펩티드를 고체 표면에 앵커링(anchoring)시킬 수 있다. 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 고정되지 않은 성분을 고정된 성분, 예를 들어, 앵커링된 성분을 함유하는 코팅된 표면에 첨가함으로써 분석법이 수행된다. 반응이 완결되었을 때, 반응하지 않은 성분을, 예를 들어, 세정에 의해, 제거하고, 고체 표면 상에 앵커링된 복합체를 검출한다. 원래의 고정되지 않은 성분에 검출가능한 표지가 있는 경우, 표면 상에 고정된 표지의 검출은 복합체가 형성되었음을 가리킨다. 원래의 고정되지 않은 성분에 표지가 없는 경우, 예를 들어, 고정된 복합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여, 복합체 형성을 검출할 수 있다.

후보 화합물이 폴리펩티드와 상호작용하지만 이에 결합하지는 않는 경우, 후보 화합물과 폴리펩티드의 상호작용을 단백질-단백질 상호작용의 검출에 대해 주지된 방법에 의해 분석할 수 있다. 이같은 분석법에는 전통적인 접근법, 예를 들어, 가교결합, 동시-면역침전, 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 동시-정제가 포함된다. 또한, [Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5789-5793 (1991)]에 개시된 바와 같이 Fields 및 공동 작업자 ([Fields and Song, Nature (London), 340:245-246 (1989)]; [Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)])에 의해 기술된, 효모를 기초로로 하는 유전자 시스템 을 사용함으로써 단백질-단백질 상호작용을 모니터링할 수 있다. 다수의 전사 활성화제, 예컨대 효모 GAL4는 물리적으로 분리된 2개의 모듈형 도메인으로 구성되는데, 한 도메인은 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 나머지 도메인은 전사-활성화 도메인으로 기능한다. 상기 간행물들에 기술된 효모 발현 시스템 (일반적으로, "2-하이브리드 시스템"으로 지칭함)은 이러한 성질의 이점을 이용하며, 2종의 하이브리드 단백질을 사용하는데, 이 중 하나에서는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인에 융합되고, 다른 하나에서는 후보물질 활성화 단백질이 활성화 도메인에 융합된다. GAL4-활성화된 프로모터의 제어 하에서의 GAL1-lacZ 리포터 유전자 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 따라 좌우된다. 상호작용하는 폴리펩티드들을 함유하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 발색 기질로 검출된다. 2-하이브리드 기술을 사용하여 2개의 특정 단백질들 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위한 완성형 키트 (MATCHMAKER™)가 Clontech에서 시판된다. 또한, 이 시스템을 확장시켜, 특정 단백질 상호작용에 수반되는 단백질 도메인을 맵핑할 수 있을 뿐 아니라, 이러한 상호작용에 중대한 아미노산 잔기를 정확하게 알아낼 수 있다.

본원에서 확인된 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 다른 세포내 또는 세포외 성분의 상호작용을 방해하는 화합물을 하기와 같이 테스트할 수 있다: 일반적으로, 유전자 생성물과 세포내 또는 세포외 성분을 함유하는 반응 혼합물을 두 생성물의 상호작용 및 결합을 허용하는 조건 및 시간 하에 제조한다. 결합을 억제하는 후보 화합물의 능력을 테스트하기 위해, 테스트 화합물의 존재 및 부재 하에 반응을 진 행시킨다. 또한, 양성 대조군으로서 기능하는 플라시보를 제3의 반응 혼합물에 첨가할 수 있다. 혼합물 내에 존재하는 테스트 화합물과 세포내 또는 세포외 성분 사이의 결합 (복합체 형성)을 상기 기술된 바와 같이 모니터링한다. 대조군 반응(들)에서는 복합체가 형성되지만 테스트 화합물을 함유하는 반응 혼합물에서는 복합체가 형성되지 않는 것은 테스트 화합물이 테스트 화합물과 이의 반응 파트너의 상호작용을 방해하는 것을 나타낸다.

길항제를 분석하기 위해, 폴리펩티드를 특정 활성에 대해 스크리닝될 화합물과 함께 세포에 첨가할 수 있고, 폴리펩티드의 존재하에 당해 활성을 억제하는 화합물의 능력은 이 화합물이 폴리펩티드에 대한 길항제임을 가리킨다. 별법적으로, 경쟁 억제 분석법에 적절한 조건하에 폴리펩티드 및 잠재적인 길항제를 막에 결합된 폴리펩티드 수용체 또는 코딩된 수용체와 조합함으로써 길항제를 검출할 수 있다. 수용체에 결합된 폴리펩티드 분자의 수를 이용하여 잠재적인 길항제의 효과를 측정할 수 있도록, 예컨대 방사선에 의해, 폴리펩티드를 표지시킬 수 있다. 당업자에게 공지된 여러 방법, 예를 들어, 리간드 패닝(panning) 및 FACS 분류법에 의해 수용체를 코딩하는 유전자를 확인할 수 있다. [Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)]. 바람직하게는, 폴리아데닐화된 RNA를 폴리펩티드에 대해 응답성인 세포로부터 제조하고, 이러한 RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리를 풀로 나누어, 폴리펩티드에 대해 응답성이 아닌 COS 세포 또는 다른 세포를 형질감염시키는데 사용하는 발현 클로닝법이 사용된다. 유리 슬라이드 상에서 성장시킨 형질감염된 세포를 표지된 폴리펩티드에 노출시킨다. 요오드 화 또는 부위-특이적 단백질 키나제에 관한 인식 부위의 포함이 포함되는 다양한 수단에 의해 폴리펩티드가 표지될 수 있다. 슬라이드를 고정시키고 인큐베이션한 후에 자기방사법으로 분석한다. 양성 풀을 확인하여 서브-풀을 제조하고, 상호작용성 서브-풀링 및 재스크리닝 방법을 이용하여 다시 형질감염시킴으로써, 추정 수용체를 코딩하는 단일 클론이 드디어 산출된다.

수용체를 확인하는 별법적인 접근법으로서, 표지된 폴리펩티드를 수용체 분자를 발현하는 세포막 또는 추출물 제제와 광친화력에 의해 연결시킬 수 있다. PAGE에 의해 가교결합된 물질을 분해하고 X-선 필름에 노출시킨다. 수용체를 함유하는 표지된 복합체를 절단하고, 펩티드 단편으로 분해하여, 단백질 미세서열분석 (microsequencing)을 수행할 수 있다. 미세서열분석으로부터 수득된 아미노산 서열은 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 추정 수용체를 코딩하는 유전자를 확인하기 위한 동의성(degenerate) 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 고안하는데 사용될 수 있다.

또다른 길항제 분석법에서, 수용체를 발현하는 포유동물의 세포 또는 막 제제를 후보 화합물의 존재하에 표지된 폴리펩티드와 함께 인큐베이션한다. 그 후, 이러한 상호작용을 증강시키거나 차단하는 화합물의 능력을 측정할 수 있다.

잠재적인 길항제의 더욱 구체적인 예로는 면역글로불린과 폴리펩티드의 융합체에 결합하는 올리고뉴클레오티드, 및, 특히, 폴리- 및 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단일쇄 항체, 항-이디오타입 항체, 및 이같은 항체 또는 단편의 키메라 또는 인간화 버젼, 뿐만 아니라 인간 항체 및 항체 단편이 포함되는 항체가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 별법적으로, 잠재적인 길항제는 밀접하게 관련된 단백질, 예를 들어, 수용체를 인식하지만 영향을 미치지 않아서 폴리펩티드의 작용을 경쟁적으로 억제하는 돌연변이된 형태의 폴리펩티드일 수 있다.

또다른 잠재적인 폴리펩티드 길항제는 안티센스 기술을 사용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 구축물이고, 이 때, 예를 들어, 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적화된 mRNA와 혼성화하여 단백질 번역을 방지함으로써 mRNA의 번역을 직접적으로 차단하는 작용을 한다. 안티센스 기술을 사용하여 삼중-나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 유전자 발현을 제어할 수 있는데, 이 방법들 모두는 DNA 또는 RNA에 대한 폴리뉴클레오티드의 결합을 기초로 한다. 예를 들어, 본원에서의 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 코딩 부분을 사용하여, 약 10 내지 40개 염기쌍 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 고안할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 수반되는 유전자의 영역에 대해 상보적이도록 고안됨으로써 (삼중-나선 - [Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979)]; [Cooney et al,, Science, 241:456 (1988)]; [Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)] 참조), 전사 및 폴리펩티드의 생산을 방지한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 mRNA와 혼성화하여, mRNA 분자의 폴리펩티드로의 번역을 차단한다 (안티센스 - [Okano, Neurochem., 56:560 (1991)]; [Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)] 참조). 또한, 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체내에서 발현되어 폴리펩티드의 생산을 억제할 수 있도록 상기 기술된 올리고뉴클레오티드를 세 포에 전달할 수 있다. 안티센스 DNA를 사용하는 경우, 전사-개시 부위, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10 위치와 +10 위치 사이로부터 유래된 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.

잠재적인 길항제에는 폴리펩티드의 활성 부위, 수용체 결합 부위, 또는 성장 인자 결합 부위 또는 기타 관련 결합 부위에 결합함으로써, 폴리펩티드의 정상적인 생물학적 활성을 차단하는 소형 분자가 포함된다. 소형 분자의 예로는 소형 펩티드 또는 펩티드-유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드, 및 합성 비-펩티드 유기 또는 무기 화합물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소 RNA 분자이다. 리보자임은 상보적인 표적 RNA에의 서열-특이적 혼성화에 이은 엔도뉴클레아제에 의한 절단에 의해 작용한다. 공지된 기술에 의해 잠재적인 RNA 표적 내의 특이적인 리보자임 절단 부위를 확인할 수 있다. 보다 상세한 내용은, 예를 들어, [Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994)] 및 PCT 공개 WO 97/33551 (1997년 9월 18일 공개됨) 참조.

전사 억제에 사용된 삼중-나선 형성에서의 핵산 분자는 단일-가닥이어야 하고, 데옥시뉴클레오티드로 구성되어야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 훅스틴(Hoogsteen) 염기쌍형성 규칙을 통해 삼중-나선 형성을 촉진하도록 고안되는데, 이는 듀플렉스의 한쪽 가닥 상의 퓨린 또는 피리미딘의 상당한 크기의 신축을 일반적으로 필요로 한다. 보다 상세한 내용은, 예를 들어, 상기의 PCT 공개 WO 97/33551 참조.

이러한 소형 분자들은 상기 논의된 임의의 한가지 이상의 스크리닝 분석법에 의해 및/또는 당업자에게 주지된 임의의 다른 스크리닝 기술에 의해 확인할 수 있다.

단리된 폴리펩티드-코딩 핵산을 당업계에 주지되고 본원에 기술된 바와 같은 기술을 사용하여 폴리펩티드를 재조합적으로 생산하는데 사용할 수 있다. 이어서, 생산된 폴리펩티드를 당업계에 주지되고 본원에 기술된 바와 같은 기술을 사용하여 항체를 생성시키는데 사용할 수 있다.

본원에서 확인된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 뿐만 아니라 상기 논의된 스크리닝 분석법에 의해 확인된 또다른 분자를 암이 포함되는 다양한 장애의 처치를 위해 제약 조성물의 형태로 투여할 수 있다.

폴리펩티드가 세포내 폴리펩티드이고 전체 항체가 억제제로 사용되는 경우, 내재화 항체가 바람직하다. 그러나, 리포펙션 또는 리포솜을 사용하여 항체 또는 항체 단편을 세포 내로 전달할 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우에는, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소의 억제 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변 영역 서열을 기초로, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력이 유지된 펩티드 분자를 고안할 수 있다. 이같은 펩티드는 화학적으로 합성되고/되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993)] 참조.

본원의 제형은 처치될 특정 적응증에 필요한 경우 2가지 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 역효과를 일으키지 않는 보완적인 활성을 갖는 것들을 또한 함유할 수 있다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 조성물은 이의 기능을 증강시키는 작용제, 예를 들어, 세포독성제, 사이토카인, 화학요법제, 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 이같은 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적절하게 존재한다.

하기의 예들은 예시적인 목적으로만 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다.

시약

발색성 기질 S2366을 DiaPharma Group, Inc. (West Chester, OH)로부터, Lys-플라스미노겐을 Haematologic Technologies Inc. (Essex Junction, VT)로부터, 그리고 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA)를 Genentech, Inc. (South San Francisco, CA)로부터 수득하였다. 혈청의 부재 하에 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현되고 HiTrap Sepharose SP 크로마토그래피에 의해 정제된 프로-HGF는 David Kahn (Genentech)이 제공하였다. 잔기 Val373-Arg407을 포함하는 HGFA는 배큘로바이러스 발현 시스템에서 발현시키고, (34)에 기술된 바와 같이 정제하였다. 인간 293 세포에서 발현된, 정제된 인간 재조합 FVII는 Mark O'Connell (Genentech)이 기증하였고, 최근에 기술되었다 (42). 본질적으로 (43)에 기술된 바와 같이 디올레오일 1,2-디아실-sn-글리세로-3-(포스포-L-세린) (PS) 및 올레오일 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포콜린 (PC) (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL)을 사용하여 PCPS 소포 (7:3 몰비)를 제조하였다. 분자량 마커는 SeeBlue Plus2 및 MultiMark 표준물 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이었다.

헵신의 발현 및 정제

I.M.A.G.E. 협회 (ATCC, Manassas, VA)로부터 수득된 전장 헵신의 cDNA를 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 NotI (New England Biolabs Inc. Beverly, MA)으로 소화시키고, 진핵생물 발현 벡터 pRK5E 내로 삽입하였다. 인간 HGF의 신호 서열 (아미노산 Met1-Gly31)을 코딩하는 cDNA와 인간 헵신의 세포외 도메인 (Arg45-Leu417: [Somoza et al., 2003] (5)에 따른 번호매김 시스템)을 코딩하는 cDNA의 융합에 의해, His-태그가 부착된 분비된 헵신 cDNA를 구축하였다. 또한, His₈ 태그를 Leu417 뒤에서 C-말단에 부가하고, 최종 cDNA 구축물을 진핵생물 발현 벡터 pCMV.PD5 내로 삽입하였다. 본질적으로 야생형 sHAI-1B의 생산에 대해 기술된 바와 같이 (34), 헵신을 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 일시적 발현 시스템에서 발현시키고, 니켈-니트릴로트리아세트산 (Ni-NTA) 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

sHAI -1B, sHAI -1B 돌연변이체 및 sHAI -2의 발현 및 정제

기존에 기술된 바와 같이 (34), 전체 세포외 도메인을 포함하는 가용성 형태의 HAI-1B (sHAI-1B)를 CHO 세포 일시적 발현 시스템에서 발현시키고 정제하였다. 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여, KD1 (Arg260) 및 KD2 (Lys401)의 P₁ 잔기들을 각각 Ala로 변화시키고, 생성된 단백질 sHAI-1B(R260A) 및 sHAI-1B(K401A)를 (34)에 기술된 바와 같이 발현시키고 정제하였다.

전장 HAI-2를 제2 가닥에 대한 Sal I 부위와 함께 올리고 dT/Not I 부위를 프라이머 및 어댑터로 사용하여 인간 태아 폐 RNA로부터 유래된 cDNA 라이브러리 (BD Biosciences Clontech, Palto Alto, CA)로부터 수득하였다. cDNA를 Sal I 및 Not I으로 소화시켰다; 2.8 kb를 초과하는 cDNA를 pRK5D에 결찰시켰다. 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 인간 폐 cDNA/pRK5D 라이브러리의 단일 가닥 DNA를 생성시켰다. 역 프라이머 (5'-TTTCTTGAGGCACTCCTCCTTG-3')를 단일 가닥 cDNA 풀에 어닐링(anealing)시키고, T7 또는 T4 DNA 중합효소를 사용하여 확장시켰다. 대장균을 합성된 이중 가닥 DNA로 형질전환시키고, 콜로니들을 표준 필터 혼성화 방법을 사용하여 스크리닝하였다. 삽입물 크기를 PCR 및 XbaI 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 분석하였다. HAI-2 전장 클론을 확인하고, DNA 서열분석에 의해 확실히 하였다. HAI-2의 세포외 도메인 (Ala28-Lys197; [Kawaguchi et al., 1997] (39)에 따른 번호매김 시스템)을 코딩하는 cDNA를 구축하고, Gly 스페이서와 함께 C-말단 His₈ 태그를 부가함으로써 가용성 형태의 HAI-2 (sHAI-2)를 생산하였다. 그 후 수득된 cDNA를 pVL1393로부터 유래된 배큘로바이러스 발현 벡터 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) 내로 삽입하였다. 본질적으로 HGF β-사슬의 생산에 대해 기술된 바와 같이 (44), sHAI-2를 배큘로바이러스 발현 시스템에서 발현시키고 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 단백질 농도는 정량적 아미노산 분석법에 의해 결정하였다.

FVII 및 플라스미노겐 활성화 분석법

0.11 ㎎/㎖ 농도의 FVII를 0.5 mM PCPS 소포 및 5 mM CaCl₂의 존재 하에 37 ℃에서 30 mM 트리스-HCl, pH 8.4, 30 mM 이미다졸, 200 mM NaCl (트리스 버퍼) 내의 230 nM 헵신에 의해 활성화시켰다. 상이한 시점에서 취해진 반응 분취량을 SDS-PAGE (환원 조건)에 의해 4-20％ 구배 젤 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 분석하였다. 젤을 심플리 블루 세이프 스테인 (Invitrogen)으로 염색하였다.

0.12 ㎎/㎖의 플라스미노겐을 20 mM 헤페스 pH 7.5, 150 mM NaCl (헤페스 버퍼) 내의 40 nM 헵신 또는 40 nM t-PA (양성 대조군)과 함께 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 상이한 시점에서 취해진 반응 분취량을 FVII 활성화 분석법에 기술된 바와 같이 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.

헵신 및 HGFA 에 의한 프로- HGF 활성화

프로-HGF (0.3 ㎎/㎖)을 헤페스 버퍼 내에서 40 nM 헵신 또는 40 nM HGFA와 함께 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 추가적으로 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 소화된 물질인 HGF_헵신 및 HGF_HGFA의 SDS-PAGE에 의한 분석은 >95％의 프로-HGF가 2-사슬 HGF로 전환되었음을 가리켰다.

프로-HGF 활성화 분석법 및 프로-HGF의 ¹²⁵I-표지화는 (34,45)에 기술된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 헤페스 버퍼 내의 0.05 ㎎/㎖의 ¹²⁵I-표지된 프로-HGF를 증가 농도 (0.16-40 nM)의 헵신 또는 HGFA와 함께 37℃에서 인큐베이션하였다. 4시간 후, 분취량을 제거하고, SDS-PAGE (4-20％ 구배 젤) (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)에 의해 분석하였다. 억제 연구를 위해, 헵신 (15 nM)을 헤페스 버퍼 내에서 1 μM의 sHAI-1B, sHAI-1B(K401A), sHAI-1B(R260A), 또는 sHAI-2와 함께 37℃에서 인큐베이션하였다. 4시간 후, 샘플들을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 심플리 블루 세이프 스테인 (Invitrogen)으로 염색하였다.

효소 억제 분석법

분석 조건은 발색성 기질 S2366 (L-피로글루타밀-L-프롤릴-L-아르기닌-p-니트로아닐린 히드로클로라이드)를 사용하는 [Somoza et al. 2003] (5)에 기술된 것들과 유사하였다. 헵신 (최종 농도 0.4 nM)을 트리스 버퍼 내의 증가 농도의 억제제와 함께 30 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 기질 S2366을 첨가하고, 405 nm에서의 흡광도의 변화를 동력학 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale CA) 상에서 측정하였다. 이러한 최종 반응 혼합물 내의 헵신 및 S2366의 농도는 각각 0.4 nM 및 0.2 mM였다 (결정된 K_m = 0.2 mM). 억제 활성은 억제되지 않은 효소 활성의 활성 분율 (v_i/v₀)으로 표시하였다. 50％ 억제를 제공하는 억제제 농도 (IC₅₀)는 4-파라메터 회귀 곡선 피팅 프로그램 (Kaleidagraph, Synergy Software, Reading, PA)에 데이타를 피팅(fitting)시킴으로써 계산하였다. 3회 이상의 독립적인 실험을 각각의 억제제에 대해 수행하였다.

세포 증식 및 이동 분석법

[European Collection of Cell Cultures (CAMR, Centre for Applied Microbiology and Research, Salisbury, Wiltshire, UK)]로부터 수득된 인간 췌장 선암종 세포주 BxPC3로 증식 분석법을 수행하였다. 세포를 10％ FCS (Sigma, St. Louis, MO), 10 mM 헤페스, 2 mM 글루타민, 페니실린-스트렙토마이신 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 250 ㎍/㎖ G418 (Invitrogen)을 함유하는 RPMI 배지에서 성장시켰다. 전면성장된 세포 층들을 PBS에 이어서 10 mM EDTA/PBS로 세정하고, 트립신과의 인큐베이션 후 분리시켰다. 세포들을 성장 배지에 재현탁시키고, 96-웰 백색 바닥 MT 플레이트 (Cultur Plate™, Packard/PerkinElmer, Boston, MA) 내로 파종하였다 (10,000-15,000 개의 세포/웰). 24시간 후, 성장 배지를 RPMI-0.1％ BSA로 교체하였다. 추가적인 24시간 후, 배지를 제거하고, RPMI-0.1％ BSA 내의 다양한 농도의 HGF_헵신 및 HGF_HGFA를 첨가하고, 세포들을 72시간 동안 성장시켰다. 그후, CellTiter-Glo 발광 키트 (Promega, Madison, WI)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 세포 증식을 정량하였다. 발광은 Tropix TR717 마이크로플레이트 발광측정기 (Berthold 75323, Bad Wildbad, Germany) 상에서 측정하였다. 배경값 (HGF 부재하의 증식)을 공제한 후, HGF_헵신 및 HGF_HGFA의 활성을 100 ng/㎖의 HGF 대조군 제제 (Genentech의 Dr. Ralph Schwall로부터 수득)에 의한 BxPC3 증식의 백분율로 나타냈다.

유방암 세포주 MDA-MB435 (HTB-129, ATCC, Manassas, VA)로의 세포 이동 분석법을 (44)에 기술된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 무혈청 배지 내의 세포 현탁액 (0.6-0.8 × 10⁶ 개의 세포/㎖) 0.2 ㎖를 10 ㎍/㎖의 토끼 꼬리 콜라겐 유형 I (Upstate, Lake Placid, NY)로 예비 코팅된 24-웰 트랜스웰 플레이트 (8 ㎛ 구멍 크기) (HTS Multiwell™ Insert System, Falcon, Franklin Lakes, NJ)의 상부 챔버에 첨가하였다. HGF 제제를 무혈청 배지 내의 하부 챔버에 첨가하였다. 13-14시간 인큐베이션 후, 막의 위쪽에 있는 세포들을 제거하고, 아래쪽으로 이동한 세포들을 4％ 파라포름알데히드에 고정시킨 후, 0.5％ 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. 세포들을 10％ 아세트산에 용해시키고, Molecular Devices 마이크로플레이트 판독기 상에서 A₅₆₀을 측정하였다. HGF 돌연변이체의 프로-이동성 활성은 HGF 부재 하에서의 기본적인 이동을 공제한 후 HGF 대조군 제제의 백분율로 나타냈다.

Met 수용체 인산화 분석법

키나제 수용체 활성화 분석법 (KIRA)을 (44)에 기술된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 폐암종 A549 세포 (CCL-185, ATCC, Manassas, VA)를 96웰 플레이트에 웰 당 세포 50,000개의 밀도로 파종하였다. 하룻밤 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 성장 배지를 제거하고, 세포들을 0.1％ FBS를 함유하는 배지에서 30 내지 60분 동안 혈청이 부족하게 하였다. 0.1％ FBS를 함유하는 배지 내의 증가 농도의 HGF_헵신 및 HGF_HGFA을 첨가하였다. 대조군으로서, 절단 부위가 돌연변이(Arg494Glu)된 절단될 수 없는 단일쇄 형태의 HGF (scHGF)를 사용하였다 (44). 10분 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 배지를 제거하고, 세포를 프로테아제 억제제 칵테일이 보충된 용해 버퍼 (Cell Signaling Technologies, Beverly, MA)로 용해시켰다. BV-TAG-표지된 4G10 항체 및 비오틴화 항-Met 항체를 세포 용해질에 첨가하 였다. 1.5 내지 2시간 동안 인큐베이션한 후, 스트렙타비딘 자기 비드 (Dynabeads, Bio Veris)를 첨가하고, 45분 동안 인큐베이션하였다. 물질 (항-Met 항체/Met/항-포스포타이로신 항체)이 결합된 비드를 외부에서 적용되는 자석에 의해 포획하였다. 세정 단계 후, 광원에 의해 생성된 화학발광 신호를 Bio Veris 기기 상에서 상대적인 발광 단위로 측정하였다. 각각의 실험에 대해, HGF_헵신, HGF_HGFA 또는 scHGF에 의한 Met 인산화는 HGF 대조군 제제로 수득된 최대 신호의 백분율로 나타냈다.

결과

헵신에 의한 프로- HGF 의 단백질분해성 프로세싱

전체 세포외 도메인 (Arg45-Leu417; [Somoza et al., 2003] (5)에 따른 번호매김 시스템) 및 C-말단 His₈ 태그를 포함하는 가용성 형태의 헵신이 CHO 세포에서 발현되었다. 정제 공정 동안, 헵신 효소원은 이의 2-사슬 형태로 자발적으로 전환되었고 (도 1A), 이는 거의 대부분 자가-활성화로 인한 것이었다 (4). 약 30 kDa의 프로테아제 도메인 (¹⁶³IVGGRDTSLGR¹⁷³)의 N-말단 서열분석으로, 활성 효소가 되게 하는, 예상된 Arg162-Ile163 펩티드 결합에서의 절단이 확인되었다. 헵신은 FVII 효소원을 2-사슬 FVIIa로 활발하게 전환시켰고 (도 1B), 이는 FVII 활성화를 결정하기 위해 세포 표면에서 발현된 헵신을 사용하는 [Kasama et al., 1995] (9)에 의해 보고된 실험과 일치하였다. 프로-HGF에 대한 헵신 활성을 ¹²⁵I-표지된 프로-HGF 의 2-사슬 HGF로의 전환을 측정함으로써 시험하였다. 결과는 프로-HGF가 농도-의존적인 방식으로 헵신에 의해 절단되었음을 나타냈다 (도 2A). 헵신 활성은 HGFA의 활성에 필적하였고 (도 2B), 두 효소 모두 4-13 nM에서 프로-HGF의 완전한 전환을 달성하였다. 동일한 분석 시스템에서, 프로-HGF 활성화제 XIa 인자, XIIa 인자 및 혈장 칼리크레인은 완전한 프로-HGF 전환을 위해 약 5-6배 더 높은 농도를 필요로 하였다 (45). 약 36 kDa 및 약 39 kDa HGF β-사슬의 N-말단 서열분석으로 동일한 서열 (⁴⁹⁵VVNGIPTRTNIG⁵⁰⁶)이 제공되었고, 이는 헵신이 프로-HGF를 예상된 Arg494-Val495 펩티드 결합에서 프로세싱하였음을 나타낸다. XIa 인자 및 혈장 칼리크레인과는 달리, 헵신으로는, 장기간의 반응 기간 후에도, HGF α2-사슬 단편 (Arg424-His425 사이에서의 절단에 의해 생산됨) (45)이 생산되지 않았다. 또한, 헵신 (40 nM)은 5시간 반응 동안 플라스미노겐을 활성화시키는 능력이 없었다 (도 2C). 비교해봤을 때, t-PA는 플라스미노겐을 효율적으로 프로세싱하였고, 약50％의 효소원이 0.5 시간 후에 이미 절단되었다 (도 2C).

헵신 소화에 의해 생성된 HGF 의 생물학적 활성

표지되지 않은 프로-HGF (0.3 ㎎/㎖)이 각각 40 nM 헵신 또는 40 nM HGFA로 완전히 (>95％) HGF로 전환되어 (도 3A), HGF_헵신 및 HGF_HGFA이 각각 제공되었다. A549 폐암종 세포로의 키나제 수용체 분석법 (KIRA)에서, 두 HGF 제제 모두 Met 인산화에서 유사한 농도-의존성 증가를 유도하여, 250 ng/㎖에서 최대 활성에 도달하였다 (도 3B). 기존에 제시된 바와 같이 (44), 절단 부위가 변화 (R494E)된 절단 될 수 없는 단일쇄 형태의 HGF (scHGF)는 활성이 없었다 (도 3B). 대조군 실험은 헵신 또는 HGFA 단독으로는 효과가 없었음을 나타냈다 (데이타는 제시되지 않음). 또한, HGF_헵신은 BxPC3 췌장암 세포의 증식을 효율적으로 촉진하였다. 활성은 5-100 ng/㎖의 시험된 범위에서 HGF_HGFA의 활성에 필적하였다 (도 4A). 유사한 결과가 콜라겐-코팅된 트랜스웰 이동 시스템을 사용한 MDA-MB435 세포로의 세포 이동 분석법에서 수득되었다. 세포 증식 분석법에서 발견된 바와 같이, HGF_헵신의 프로-이동성 효과는 농도-의존적이었고, HGF_HGFA의 활성과 구별할 수 없었다 (도 4B).

sHAI -1B 및 sHAI -2에 의한 헵신 효소 활성의 억제

26개의 시판되는 발색성 기질의 초기 스크린은 [Somoza et al., 2003] (5)에 의해 보고된 기질인 S2366이 최고 속도로 헵신에 의해 가수분해되었음을 나타냈다 (데이타는 제공되지 않음). S2366을 기질로 사용하여, 고도로 정제된 가용성 형태의 야생형 HAI-1B (sHAI-1B) 및 HAI-2 (sHAI-2)의 억제 활성을 측정하였다. 또한, P₁ 잔기 (KD1에서의 Arg260 및 KD2에서의 Lys401)가 알라닌으로 대체됨으로써 각각의 쿠니츠 도메인이 불활성화된 2개의 sHAI-1B 돌연변이체 sHAI-1B(R260A) 및 sHAI-1B(K401A)를 생산하였다 (34). 결과는 sHAI-1B 및 sHAI-2 모두 각각 21.1 ± 2.7 nM 및 1.3 ± 0.3 nM의 IC₅₀ 값으로 헵신 효소 활성을 강력하게 억제하였음을 나타냈다 (도 5). 또한, 기능성이 아닌 KD2를 함유하는 돌연변이체 sHAI-1B(K4O1A)는 야생형 sHAI-1B와 동등하게 강력한 반면, sHAI-1B(R260A)는 활성이 >47배 감소하였다 (도 5). 수득된 IC₅₀ 값들이 표 1에 요약된다.

쿠니츠 도메인 억제제에 의한 헵신의 억제
억제제	IC50 (nM)
sHAI-1B 야생형 sHAI-1B(K401A) sHAI-1B(R260A) sHAI-2	21.1 ± 2.7 18.2 ± 3.7 > 1000 1.3 ± 0.3

헵신 -매개 프로- HGF 활성화의 억제

거대분자 기질 프로세싱을 방해하는 sHAI-1B 및 sHAI-2의 능력을 ¹²⁵I-프로-HGF 활성화 분석법에서 측정하였다. 수득된 결과는 아미노분해성 분석법에서 결정된 이들의 억제 활성과 완전히 일치하였다. 1 μM sHAI-2, 야생형 sHAI-1B 및 sHAI-1B(K401A)의 농도에서, 프로-HGF 절단이 완전히 억제되었다 (도 6). 반면에, 1 μM sHAI-1B(R260A)는 억제를 나타내지 않았고, 프로-HGF 활성화가 완전한 전환으로 진행되었다 (도 6).

토론

HGF/Met 신호전달 경로는 종양 침범 및 전이를 포함하여 인간 생리학 및 병리학에서 중요한 역할을 한다. 활성 HGF의 국소적인 이용가능성은 세포외 환경 내의 불활성 프로-HGF의 프로세싱을 조절하는 키모트립신-유사 세린 프로테아제 및 이들의 동족 억제제에 의해 제어된다. 따라서, 암에서의 이러한 '상류' 프로-HGF 전환효소 경로의 교란은 프로-HGF 프로세싱을 가속화시킴으로써 종양 성장을 촉진할 수 있다. 본원에서, 본 발명가들은 전립선암 및 난소암에서 고도로 상향조절된 세린 프로테아제인 헵신이 프로-HGF의 강력한 활성화제라는 것을 설명하였다. 따라서, 헵신은 HGF/Met 신호전달 경로를 활성화시킴으로써 종양 성장을 달성하는데 중요한 역할을 할 것이고, 이는 전립선암 (46-48) 뿐만 아니라 난소암 (49,50)에서 관련되었다.

헵신은, XIa 인자 및 혈장 칼리크레인에 의해 인식되는 부위인 크링글 도메인 4 내의 Arg424-His425에서의 어떠한 추가적인 절단도 없이, Arg494-Val495 펩티드 결합에서 프로-HGF를 단백질분해적으로 절단한다 (45). 헵신에 의해 생성된 2-사슬 HGF는 완전히 기능성이어서, HGFA에 의해 생성된 HGF에 필적하는 활성으로 Met 수용체 인산화를 유도하고 세포 증식 및 이동을 촉진한다. 불활성 프로-HGF이 활성 성장 인자로 헵신-매개 전환되는 분자적 메카니즘은 효소원이 키모트립신-유사 세린 프로테아제의 단백질분해성 전환에 의해 효소로 전환되는 것과 유사하다. 이는 Arg494-Val495에서의 절단으로 프로테아제-유사 HGF β-사슬이 구조적으로 변화되고 Met 수용체 결합 부위가 완전하게 성숙된다는 것을 나타내는, 프로-HGF 활성화의 구조적 결과에 대한 최근의 연구에 의해 지지된다 (44,51). HGF의 '활성 부위 영역' 및 '활성화 도메인'의 중심에 있는 이러한 Met 결합 부위는 세린 프로테아제의 기질 프로세싱 영역과 상당히 유사하다 (44,51). 따라서, 헵신에 의한 프로-HGF 절단으로 HGF β 상에서 구조적인 재배열이 이루어지고, 이는 생산성 HGF/Met 신호전달 복합체가 형성되도록 한다. 헵신이 프로-HGF의 구조적으로 가장 근접한 상동체인 플라스미노겐을 절단하지 않았기 때문에, 프로-HGF에 대한 헵신의 단백질분해성 활성은 매우 특이적인 것으로 나타난다. 헵신은 다른 세린 프로테아제 기질, 예컨대 프로트롬빈, 단백질 C, X 인자 및 IX 인자에 대한 단백질분해성 활성이 없었다 (9).

HGF 무반응(null) 마우스로의 연구는 HGF/met 경로가 정상적인 배아 발생 및 생존에 필수적이라는 것을 나나탠다 (52,53). 반면에, 헵신 유전자가 결핍된 마우스는 정상적으로 발육되고, 이는 헵신이 배형성 동안 주요 HGF 활성화제가 아니라는 것을 가리킨다. 헵신과 유사하게, 다른 공지된 프로-HGF 전환효소인 매트립타제 (54), XI 인자 (55), 프리칼리크레인 (56) 및 u-PA (57)는 배아 치사적이지 않다. 배형성 및 생후 생리학에서의 중요성으로 인해, HGF 활성은 다중 프로-HGF 전환효소 시스템에 의해 협동 방식으로 조절될 수 있다. 만약 그렇다면, 조합된 프로-HGF 전환효소 유전자 결핍은 HGF 무반응 마우스와 유사한 발육 결함을 초래할 것이다. 별법적으로, 배형성 동안 HGF 프로세싱을 조절하는 프로-HGF 전환효소는 아직 확인되지 않았다.

HAI-1B, HAI-1 및 HAI-2는 상피 세포 표면 억제제이고, 다수의 정상 조직 및 종양에서 발현된다 (34,58-63). 따라서, 이들은 상피 세포에서 발현된 TTSP 및 가능하게는 세포 표면에 회합된 기타 세린 프로테아제의 효소 활성을 조절하도록 이상적으로 국소화된다. 실제로, HAI-1 스플라이스 변이체 HAI-1 및 HAI-1B는 TTSP 매트립타제 (MT-SP1)를 강력하게 억제하고, HAI-1과 매트립타제의 복합체가 인간 모유에서 발견되었다 (38). 본원에서, 본 발명가들은 sHAI-1B 및 sHAI-2가 또한 헵신 효소 활성의 강력한 억제제라는 것을 설명하였다. 또한, P₁ 잔기-지시 돌연변이유발 실험은, 돌연변이체 sHAI-1B(R260A)가 프로-HGF 분석법에서 불활성이었고, 아미노분해성 분석법에서 야생형 및 KD2 돌연변이체 활성의 < 1 ％이었기 때문에, 헵신의 억제가 sHAI-B의 KD1에 의해 전적으로 매개된다는 것을 나타냈다. 따라서, 헵신, 매트립타제 및 HGFA는 필적할만한 프로-HGF 전환 활성을 가질 뿐만 아니라 (34), KD1-특이적 방식으로 동등한 효능 (16-30 nM)으로 sHAI-1B에 의해 또한 억제된다 (34,64). 스플라이스 변이체 HAI-1과 HAI-1B는 KD1에 대해 C-말단에 위치한 아미노산 16개의 존재 여부만이 상이하다. 전립선 및 난소 종양이 포함되는 조직에서의 이들의 발현 패턴은 동일하고, 현재까지 효능 및 표적 프로테아제 패턴에서의 현저한 차이는 발견되지 않았다. 따라서, 두 스플라이스 변이체의 생체내 기능은 동등한 것으로 간주된다. HAI-2 쿠니츠 도메인의 기능은 본 연구에서 특정하게 다루어지지 않았다. 대부분의 이의 표적 효소에 대해, HAI-2는 N- 및 C-말단 쿠니츠 도메인 모두를 사용한다 (41,65).

시험관 내에서의 헵신과 HAI-1B 및 HAI-2의 기능적 회합은, 생체 내에서의 상피 세포 표면에의 이들의 국소화와 함께, 이들이 생리학적으로 관련된 효소-억제제 시스템을 구성할 수 있음을 제안한다. 예를 들어, 2가지 HAI-1 스플라이스 변이체 및 HAI-2는 정상 전립선 및 전립선 암 세포주에서 발현되고 (34,59,61), HAI-1 항원은 전립선 선상피의 분비 세포층에 국소화되었다 (59). 흥미롭게, 전립선 종양에서의 헵신 발현은 동일한 상피 구획에 국소화되었고 (19,20), 이는 HAI-1 및 가능하게는 HAI-2가 생체 내에서 헵신과 회합한다는 아이디어를 지지한다. [Welsh et al., 2001] (17)에 의해 보고된 유전자 발현 결과에 따르면, 헵신 발현은 전립선 암에서 강하게 상향조절되는 반면 (17-22), HAI-1 및 HAI-2는 단지 약간만 (약 1.5배) 증가한다. 결과적으로, 종양에서의 헵신 효소 활성이 부적절하게 제어될 수 있고, 증강된 프로-HGF 프로세싱 및 종양 진행에 이를 수 있다. 프로-HGF 전환효소/억제제 시스템의 유사한 불균형이 난소암에서의 매트립타제/HAI-1 (62,63), 결장직장암에서의 HGFA/HAI-1 (66,67) 및 신장 세포 암종에서의 HGFA/HAI-1 (68)에 대해 기술되어 있다. 일부 이러한 암에서의 헵신의 상향조절된 발현은 특정 전환효소/억제제 시스템이 다중 효소를 포함하고, 따라서 증가된 효소/억제제 비율이 악성종양에 대한 결과를 확대시킬 수 있음을 제안한다.

결과적으로, 제시된 결과들은 헵신이 프로-HGF를 효율적으로 활성화시킨다는 것을 제시하고, 따라서 종양 상피 표면 상의 헵신과 불활성 성장 인자 전구체를 함유하는 세포외 매트릭스 간의 기능성 연계를 나타낸다. HAI-1B 및 HAI-2가 전립선 암 및 난소암에서 상향조절되는 헵신의 강력한 억제제라는 발견은 암 처치에 대한 새로운 접근법을 제공한다. 예를 들어, HAI-1B 또는 HAI-2의 기능성 쿠니츠 도메인은 파지 디스플레이 기술을 사용하여 더욱 특이적이고/이거나 더욱 강력한 효소 억제제를 생성시키기 위한 발판으로 작용할 수 있고, 상기 기술은 다른 쿠니츠 도메인 발판에 성공적으로 적용되었다 (69,70).

각주/약자

¹VIIA 인자, FVIIa; 헤페스 버퍼, 20 mM 헤페스 pH 7.5, 150 mM NaCl; 트리스 버퍼, 30 mM 트리스-HCl, pH 8.4, 30 mM 이미다졸, 200 mM NaCl; 프로-HGF, 단일쇄 간세포 성장 인자; HGF, 2-사슬 간세포 성장 인자; HGFA, 간세포 성장 인자 활성화제; HAI-1, 간세포 성장 인자 활성화제 억제제-1; HAI-1B, 간세포 성장 인자 활성화제 억제제-1의 스플라이스 변이체; HAI-2, 간세포 성장 인자 활성화제 억제제-2; KD1 및 KD2, HAI-1B의 N- 및 C-말단 쿠니츠 도메인; sHAI-1B, 세포외 도메인을 포함하는 가용성 형태의 HAI-1B; sHAI-2, 세포외 도메인을 포함하는 가용성 형태의 HAI-2; HGF_헵신, 헵신으로의 프로-HGF 활성화에 의해 생산된 HGF; HGF_HGFA, HGFA로의 프로-HGF 활성화에 의해 생산된 HGF; scHGF, 돌연변이된 절단 부위 (Arg494Glu)를 갖는 절단될 수 없는 단일쇄 HGF; u-PA, 유로키나제-유형 플라스미노겐 활성화제; t-PA, 조직-유형 플라스미노겐 활성화제; Ni-NTA, 니켈-니트로트리아세트산.

참고문헌의 일부 목록

<110> Kirchhofer, Daniel K. Moran, Paul M. Peek, Mark D. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING HEPATOCYTE GROWTH FACTOR ACTIVATION <130> P2157R1 <140> US 11/189,230 <141> 2005-07-25 <150> US 60/591,339 <151> 2004-07-26 <160> 2 <210> 1 <211> 417 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Gln Lys Glu Gly Gly Arg Thr Val Pro Cys Cys Ser Arg 1 5 10 15 Pro Lys Val Ala Ala Leu Thr Ala Gly Thr Leu Leu Leu Leu Thr 20 25 30 Ala Ile Gly Ala Ala Ser Trp Ala Ile Val Ala Val Leu Leu Arg 35 40 45 Ser Asp Gln Glu Pro Leu Tyr Pro Val Gln Val Ser Ser Ala Asp 50 55 60 Ala Arg Leu Met Val Phe Asp Lys Thr Glu Gly Thr Trp Arg Leu 65 70 75 Leu Cys Ser Ser Arg Ser Asn Ala Arg Val Ala Gly Leu Ser Cys 80 85 90 Glu Glu Met Gly Phe Leu Arg Ala Leu Thr His Ser Glu Leu Asp 95 100 105 Val Arg Thr Ala Gly Ala Asn Gly Thr Ser Gly Phe Phe Cys Val 110 115 120 Asp Glu Gly Arg Leu Pro His Thr Gln Arg Leu Leu Glu Val Ile 125 130 135 Ser Val Cys Asp Cys Pro Arg Gly Arg Phe Leu Ala Ala Ile Cys 140 145 150 Gln Asp Cys Gly Arg Arg Lys Leu Pro Val Asp Arg Ile Val Gly 155 160 165 Gly Arg Asp Thr Ser Leu Gly Arg Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu 170 175 180 Arg Tyr Asp Gly Ala His Leu Cys Gly Gly Ser Leu Leu Ser Gly 185 190 195 Asp Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Pro Glu Arg Asn Arg 200 205 210 Val Leu Ser Arg Trp Arg Val Phe Ala Gly Ala Val Ala Gln Ala 215 220 225 Ser Pro His Gly Leu Gln Leu Gly Val Gln Ala Val Val Tyr His 230 235 240 Gly Gly Tyr Leu Pro Phe Arg Asp Pro Asn Ser Glu Glu Asn Ser 245 250 255 Asn Asp Ile Ala Leu Val His Leu Ser Ser Pro Leu Pro Leu Thr 260 265 270 Glu Tyr Ile Gln Pro Val Cys Leu Pro Ala Ala Gly Gln Ala Leu 275 280 285 Val Asp Gly Lys Ile Cys Thr Val Thr Gly Trp Gly Asn Thr Gln 290 295 300 Tyr Tyr Gly Gln Gln Ala Gly Val Leu Gln Glu Ala Arg Val Pro 305 310 315 Ile Ile Ser Asn Asp Val Cys Asn Gly Ala Asp Phe Tyr Gly Asn 320 325 330 Gln Ile Lys Pro Lys Met Phe Cys Ala Gly Tyr Pro Glu Gly Gly 335 340 345 Ile Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Cys Glu 350 355 360 Asp Ser Ile Ser Arg Thr Pro Arg Trp Arg Leu Cys Gly Ile Val 365 370 375 Ser Trp Gly Thr Gly Cys Ala Leu Ala Gln Lys Pro Gly Val Tyr 380 385 390 Thr Lys Val Ser Asp Phe Arg Glu Trp Ile Phe Gln Ala Ile Lys 395 400 405 Thr His Ser Glu Ala Ser Gly Met Val Thr Gln Leu 410 415 <210> 2 <211> 476 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Gln Lys Glu Gly Gly Arg Thr Val Pro Cys Cys Ser Arg 1 5 10 15 Pro Lys Val Ala Ala Leu Thr Ala Gly Thr Leu Leu Leu Leu Thr 20 25 30 Ala Ile Gly Ala Ala Ser Trp Ala Ile Val Ala Val Leu Leu Arg 35 40 45 Ser Asp Gln Glu Pro Leu Tyr Pro Val Gln Val Ser Ser Ala Asp 50 55 60 Ala Arg Leu Met Val Phe Asp Lys Thr Glu Gly Thr Trp Arg Leu 65 70 75 Leu Cys Ser Ser Arg Ser Asn Ala Arg Val Ala Gly Leu Ser Cys 80 85 90 Glu Glu Met Gly Phe Leu Arg Ala Leu Thr His Ser Glu Leu Asp 95 100 105 Val Arg Thr Ala Gly Ala Asn Gly Thr Ser Gly Phe Phe Cys Val 110 115 120 Asp Glu Gly Arg Leu Pro His Thr Gln Arg Leu Leu Glu Val Ile 125 130 135 Ser Val Cys Asp Cys Pro Arg Gly Arg Phe Leu Ala Ala Ile Cys 140 145 150 Gln Gly Glu Ile Leu Lys Leu Arg Thr Leu Ser Phe Arg Pro Leu 155 160 165 Gly Arg Pro Arg Pro Leu Lys Leu Pro Arg Met Gly Pro Cys Thr 170 175 180 Phe Arg Pro Pro Arg Ala Gly Pro Ser Leu Gly Ser Gly Asp Leu 185 190 195 Gly Ser Ser Pro Leu Ser Pro Pro Pro Ala Asp Pro Cys Pro Thr 200 205 210 Asp Cys Gly Arg Arg Lys Leu Pro Val Asp Arg Ile Val Gly Gly 215 220 225 Arg Asp Thr Ser Leu Gly Arg Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg 230 235 240 Tyr Asp Gly Ala His Leu Cys Gly Gly Ser Leu Leu Ser Gly Asp 245 250 255 Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Pro Glu Arg Asn Arg Val 260 265 270 Leu Ser Arg Trp Arg Val Phe Ala Gly Ala Val Ala Gln Ala Ser 275 280 285 Pro His Gly Leu Gln Leu Gly Val Gln Ala Val Val Tyr His Gly 290 295 300 Gly Tyr Leu Pro Phe Arg Asp Pro Asn Ser Glu Glu Asn Ser Asn 305 310 315 Asp Ile Ala Leu Val His Leu Ser Ser Pro Leu Pro Leu Thr Glu 320 325 330 Tyr Ile Gln Pro Val Cys Leu Pro Ala Ala Gly Gln Ala Leu Val 335 340 345 Asp Gly Lys Ile Cys Thr Val Thr Gly Trp Gly Asn Thr Gln Tyr 350 355 360 Tyr Gly Gln Gln Ala Gly Val Leu Gln Glu Ala Arg Val Pro Ile 365 370 375 Ile Ser Asn Asp Val Cys Asn Gly Ala Asp Phe Tyr Gly Asn Gln 380 385 390 Ile Lys Pro Lys Met Phe Cys Ala Gly Tyr Pro Glu Gly Gly Ile 395 400 405 Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Cys Glu Asp 410 415 420 Ser Ile Ser Arg Thr Pro Arg Trp Arg Leu Cys Gly Ile Val Ser 425 430 435 Trp Gly Thr Gly Cys Ala Leu Ala Gln Lys Pro Gly Val Tyr Thr 440 445 450 Lys Val Ser Asp Phe Arg Glu Trp Ile Phe Gln Ala Ile Lys Thr 455 460 465 His Ser Glu Ala Ser Gly Met Val Thr Gln Leu 470 475

Claims (7)

1. (a) 후보 물질을 헵신 및 프로-HGF 기질을 포함하는 제1 샘플과 접촉시키고, (b) 샘플 내 프로-HGF 기질 활성화의 양을, 제1 샘플과 유사한 양의 헵신 및 프로-HGF 기질을 포함하지만 상기 후보 물질과 접촉되지 않은 기준 샘플 내의 프로-HGF 기질 활성화의 양과 비교하는 것을 포함하며, 이로써 기준 샘플에 비교한 제1 샘플 내의 프로-HGF 기질 활성화 양의 감소는 후보 물질이 단일쇄 HGF (프로-HGF)의 헵신 활성화를 억제할 수 있음을 나타내는 것인, HGF의 헵신 활성화를 억제하는 후보 억제제 물질의 확인 방법.
2. 제1항에 있어서, 샘플 내의 헵신이 상기 프로-HGF를 활성화시키는데 유효한 양인 방법.
3. 제1항에 있어서, 프로-HGF 기질이 야생형 형태의 R494-V495 펩티드 연결을 포함하는 HGF 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드인 방법.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제

Images