KR960013134B1

KR960013134B1 - 분비성 이.콜라이 균주, 이에 대한 플라스미드, 이의 제조 및 동정 방법 및 이를 이용하여 이질성 단백질을 제조하는 방법.

Info

Publication number: KR960013134B1
Application number: KR1019920701013A
Authority: KR
Inventors: 에이. 런 챨스; 케이. 나룰라 세트원트; 엘. 리임 리챠드
Original assignee: 쉐링 코포레이션; 에릭 에스. 딕커
Priority date: 1989-10-31
Filing date: 1989-10-31
Publication date: 1996-09-30
Also published as: FI921874A; HU9201411D0; HU214828B; JP2660095B2; NO305253B1; HUT64597A; HK185296A; AU651059B2; DE68916444T2; FI921874A0; DE68916444D1; NO921674D0; FI104499B; JPH04505548A; AU4644789A; EP0497757B1; EP0497757A1; WO1991006655A1; NO921674L

Abstract

없음.

Description

분비성 이. 콜라이 균주, 이에 대한 플라스미드, 이의 제조 및 동정 방법 및 이를 이용하여 이질성 단백질을 제조하는 방법

본 발명은 첨부된 도면을 참조함으로써 보다 쉽게 이해할 수 있을 것이다.

제1도는 분비된 인터루킨-4가 존재하는 곳에서 가시성 부분을 나타내 보이고 있는 분석용 니트로셀룰로스 막의 사진이다. 이 인터루킨-4는, 먼저 막을 단백질에 특이적인 다가 항 혈청으로 처리한 후 항-인터루킨-4 항 혈청에 특이적인 표지된 항 혈청으로 처리하여 가시화시킨다. 화살표로 지시한 부분은 분비성 콜로니를 나타내는 특히 강한 스포트로서 이는 클로닝과 추가의 연구를 위해 선정되었다.

제2도는 플라스미드 pRGT857-11의 작제도이다

본 발명은 재조합 벡터로 형질 전환되고 이질성 재조합 단백질을 배양 배지로 분비할 수 있는 돌연변이체 이. 콜라이(E.coil) 균주 및 이의 제조 및 동정 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 정확하게 폴딩(folding)된 생물학적으로 할성인 형태의 이질성 재조합 단백질을 제조하기 위해 상기 형질 전환체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

발명의 배경

재조합 DNA 기술은 생물학적으로 중요한 폴립펩티드와 단백질의 대량 생산을 가능케 해왔다. 대부분의 이런 일을 위해, 재조합 벡터의 발현을 위한 숙주 생물체로서, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coil) 박테리아가 사용되어 왔다. 이 박테리아의 이용에는 심각한 제한점이 있다. 이들 박테리아의 물리적 구조로 인해, 재조합 폴리펩티드 또는 단백질에 대한 유전자를 발현하게 되는 이.콜라이 박테리아는 재조합 생성물이 분리될 수 있기 전에 반드시 일반적으로 물리적, 화학적 또는 효소적 수단에 의해 파괴시켜야만 한다.

이.콜라이 및 기타 그람 음성 박테리아는 단백질이 합성되는 중심 세포질과 복합적인 세포막 구조로 특징 지워진다. 수많은 지질-결합한 올리고 사카라이드가 결합된 외막도 존재한다. 동물체에 병원성 그람 음성 박테리아가 감염되게 되면, 이들 표면 올리고 사카라이드에 특이적인 항체의 생산이 질병의 추세를 결정하는데 중요하다.

외막의 안쪽에 원형 질막이 존재하며, 이는 세포의 주요한 투과 장벽이다. 이 막은 다른 것들은 차단하면서 특정의 영양소 및 다른 화학 물질이 세포의 안팎으로 소통하게 하는 단백질을 함유한다.

외막과 원형 질막 사이를 주변 세포질 공간(periplasmic space) 또는 주변 세포질(periplasm)로 부른다. 이 영역은 외막과 접해 있으며, 세포에 견고성을 주게 되는 고도로 교차-결합된 단백질과 올리고 사카라이드의 벽-모양 복합물인 펩티도 글리칸을 함유한다.

이.콜라이에 의해 합성되는 대부분의 단백질은 세포질내에 잔류하게 되나, 일부는 이 주변 세포질내에서 발견된다. 세포질로부터 주변 세포질로 수송되는 단백질은 펩티드 결합을 통해 단백질의 아미노 말단에 공유적으로 결합된 시그날 펩티드를 함유하는데, 이는 원형 질막을 통한 수송을 촉진한다. 이.콜라이내의 몇몇 주변 세포질 단백질의 예로는 β-락타마제, 알칼린 포스파타제 및 특정의 뉴클레아제, 펩티다제 및 프로테아제가 있다. 주변 세포질 단백질의 시그날 펩티드는 일반적으로 수송 과정에서 특정 부위에서 절단되어 주변 세포질 중에 성숙한형태의 단백질을 남기게 된다.

이.콜라이를 사용하여 재조합 단백질을 제조하는 동안, 이질성 또는 외래 유전자의 발현 생성물은 일반적으로 세포질내에 축적되게 된다. 이런 단백질은 종종 불용성의 봉입체 또는 굴절체(refractile body) 형태로서 침전되게 된다. 이러한 형태의 재조합 단백질은 이들의 천연 배위 형태가 아니고, 생물학적으로 활성이 없다[참조 : Mitraki et al., Bio/Technology 7 : 690(1989)]. 유용한 형태로 이런 단백질을 분리하기 위해서는, 박테리아를 반드시 파괴시키고 불용성 분획중의 단백질을 청정제나 카오트로픽제(예 : 우레아 또는 구아니딘 하이드로 클로라이드)를 사용하여 가용화시켜야만 한다. 이렇게 가용화한 단백질은 이들의 천연 배위가 아니기 때문에, 이들은 반드시 문헌[참조 : Builder et al., 유럽 특허 출원 공개 제114 506호]에 기술한 것과 같은 비교적 복잡한 방법을 사용하여 리폴딩(refold)시켜야만 한다.

세포질 봉입체내에 축적되지 않은 이질성 단백질을 제조하기 위해 재조합 DNA 방법을 사용하고자 하는 노력에서, Villa-Komaroff 등[참조 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 : 3727(1978)]은 래트 예비 프로 인슐린 유전자를 이.콜라이 β-락타마제 유전자로 삽입시켰다. 이미 주시된 바와 같이 β-락타마제는 이의 전구체 형태로 시그날 펩티드를 지니고 있는 주변 세포질 효소이다. 융합된 β-락타마제/예비 프로 인슐린 유전자의 발현으로부터 생성된 융합 단백질은 상기한 수송 기작으로 주변 세포질로 수송된다.

유사하게, 길버트 등[참조 : Gilbert et al., 유럽 특허 출원 공개 제006 694호]은 주변 세포질 단백질의 시그날 펩티드를 암호화 하는 DNA 서열에 융합된 목적하는 외래 단백질을 암호화 하는 유전자를 함유하는 DNA 서열의 발현으로 유전자 조작된 융합 단백질의 제조를 기술하고 있다.

더 나아가, 본래의 수송 과정을 좀더 확장시키면, 실라비(Silhavy) 등(미합중국 특허 제4,336,336호)은 박테리아의 외막으로 수송되는 융합 단백질의 제조 방법을 기술한 바 있다. 이 방법은 세포질성 박테리아 단백질을 암호화 하는 유전자와 비-세포질성 담체 단백질 암호화 유전자를 융합시켜, 외막으로 운반되는 융합 단백질을 제조하는 것을 포함하고 있다. 실라비 등은 또한 이 방법이 외래 유전자(예를 들어, 진핵성 단백질을 암호화 하는 유전자)를 이미 작제한 융합 유전자내로 삽입하는데 사용될 수 있음을 기술하고 있다.

그러나, 전술한 방법중의 어느 것에서도, 목적하는 재조합 단백질이 세포의 외막 밖으로 수송되지는 않는다. 각각의 경우에서, 단백질을 회수하기 위해서는 세포를 반드시 파괴시켜야만 한다. 결국, 수많은 박테리아성 단백질도 방출되게 되어, 목적하는 단백질의 분리를 더 힘들고 복잡하게 만든다. 게다가, 이 방법이 박테리아성 단백질에 융합된 생성물을 생성할 경우, 생성물은 일반적으로 목적하는 단백질을 제조하기 위해 반드시 분해시켜야만 한다. 이 방법은 복잡할 수 있으며 변성 조건을 사용할 수도 있고, 완전한 생물학적 활성을 갖는 단백질의 회수를 어렵게 한다.

보다 최근에, Sakaguchi 등[참조 : Sakaguchi et al., Agric. Biol. Chem. 52 : 2669(1988)]은 ompA 시그날 서열을 암호화 하는 DNA 서열을, 이.콜라이 발현 벡터중의 과립구-대식 세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF ; granulocyte-macrophage colony stimulating factor)를 암호화 하는 유전자와 융합시키는 것을 보고한 바 있다. 이.콜라이 HB 101내로 형질 전환시키고 발현시킨 후, 일부의 GM-CSF가 배양 배지로 분비된 것을 발견하였다.

여러가지의 주변 세포질 효소를 배양 배지로 누출시키는 이.콜라이 돌연변이체가 보고된 바 있다. 예를 들어, Lopes 등[참조 : Lopes et al., J.Bacteriol. 109 : 520(1972)]은 이.콜라이 세포를 니트로 소구아니딘과 같은 돌연변이원(mutagen)으로 처리하여, 리보 뉴클레아제 I, 엔도 뉴클레아제 I 및 알칼린 포스파타제를 분비하는 주변 세포질 누출성(periplasmic leaky) 돌연변이체를 제조하였다. 유사하게, 앤더슨(Anderson) 등[참조 : Anderson et al., J.Bacteriol. 140 : 351(1979)]과 라자노니(Lazzaroni) 등[참조 : Lazzaroni et al., J.Bacteriol. 145 : 1351(1981)]은 주변 세포질 누출성 돌연변이체의 연구에서 분비된 주변 세포질 단백질을 검출하기 위해 면역 침전 또는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동을 사용한 바 있다.

이런 돌연변이체의 누출성(leakiness)은 투과성을 증가시키게 되는 박테리아 외막의 정상적 성분(들)에서 결핍을 반영하는 것이라고 여겨진다. 이런 누출성 돌연변이체의 어느 것도 배양 배지내로 재조합 단백질 분비를 수득할 목적으로 제조되지는 않았다. 대신, 이들의 작제는 박테리아 외피의 구조와 기능 및 막 구조내의 여러가지 효소의 위치를 연구하기 위해 수행된 것으로 보인다.

최근에, 진더(Zinder) 등[참조 : Zinder et al., 미합중국 특허 제4,595,658호]은 박테리아에서 합성되는 단백질의 외부화를 촉진하기 위한 방법을 기술한 바 있다. 이 방법은 f1 박테리오 파아지의 유전자 III 전체 또는 일부분을 플라스미드 또는 박테리아 염색체로 도입하는 것을 포함하고 있다. 유전자 발현으로 생성되는 f1 박테리오 파아지 유전자 III 단백질은 외부 박테리아막을 교란하여 세포로부터 주변 세포질 단백질을 누출시키는 것으로 보인다.

Zinder 등은 또한 누출성 돌연변이체가, 목적하는 단백질을 암호화 하는 유전자를 주변 세포질 공간으로 단백질을 수송할 수 있는 리더 서열을 암호화 한 DNA 서열과 융합시키는 방법으로, 유전자 조작된 융합 단백질을 생산하는데 사용될 수 있음을 기술하였다.

그러나, Zinder 등은 어떻게 이러한 융합이 수행될 수 있는지에 대한 언급을 하지 않고 있으며, 이론과 같이 실제적으로 작동하는 방법에 대한 어떠한 예도 나타내지 않고 있다. 실제적으로 나타낸 모든 것은 돌연변이체의 천연 β-락타마제가 세포로부터 주변 배지로 누출된다는 것 뿐이다.

부적절한 쇄 폴딩과 단백질 변성이 세포질내에서의 재조합 단백질 성숙과 관련되어 있으며, 세포 밖으로 방출된 단백질에서는 일반적으로 발생하지 않기 때문에, 이.콜라이 분비성 균주를 제작 및 활용하는 신뢰성 있는 방법이 요구되고 있다.

발명의 요약

본 발명은,

(a) 박테리오 파아지 T7에 의한 감염에 대한 내성과 실질적인 양의 주변 세포질 단백질을 배양 배지로 분비할 수 있는 것으로 특징지워지며,

(b) 주변 세포질 공간으로 단백질의 수송을 매기할 수 있는 시그날 펩티드를 암호화 하는 제1 DNA 서열이 작동적으로 결합된 목적하는 이질성 단백질을 암호화 하는 제2 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는, 배양 배지내로 생물학적으로 활성인 이질성 유전자 생성물을 분비할 수 있고 상기 두 DNA 서열 모두를 발현시킬 수 있는 이.콜라이 박테리아를 제공한다.

본 발명은 또한,

(a) (i) 박테리오 파아지 T7에 의한 감염에 대해 내성이고 실질적인 양의 주변 세포질 단백질을 배양 배지내로 분비할 수 있는 것으로 특징지워지고,

(ii) 목적하는 이질성 단백질을 암호화 하는 제2 DNA 서열에 자동적으로 결합된, 주변 세포질 공간으로 단백질의 수송을 매개할 수 있는 시그날 펩티드를 암호화 하는 제1 DNA 서열을 포함하는 제조합 벡터를 함유하는, 생물학적으로 활성인 이질성 단백질을 배양 배지내로 분비할 수 있는 이.콜라이 박테리아를, 박테리아가 두 DNA 서열을 발현하고 배양 배지내로 이질성 단백질을 분비하는 조건하에서 배양시키며,

(b) 배양 배지로부터 분비된 단백질을 분리시킴을 포함하여, 목적하는 이질성 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한,

(a) 박테리아의 DNA에서 돌연변이성 변화를 생성시키기 위해 충분한 양의 돌연변이 유발 물질로 이.콜라이 박테리아를 처리하고,

(b) 박테리오 파아지 T7에 의한 감염에 내성을 가지며 주변 세포질 단백질의 실질적인 양을 배양 배지내로 분비할 수 있는, 상기(a)에서 제조된 돌연변이체 클론을 선별하며,

(c) 목적하는 이질성 단백질을 암호화 하는 제2 DNA 서열에 작동적으로 결합된, 주변 세포질 공간으로 단백질 수송을 매개할 수 있는 시그날 펩티드를 암호화 하는 제1 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터로 단계(b)에서 선별한 하나 이상의 클론을 형질 전환시키고(이 재조합 벡터는 박테리아내에서 두 DNA 서열의 발현을 지시할 수 있다),

(d) 어떤 클론이 배양 배지로 실질적인 양의 이질성 단백질을 분비하는지를 결정하기 위해 형질 전환된 클론을 분석함을 포함하여, 배양 배지내로 생물학적으로 활성인 이질성 유전자 생성물을 분비할 수 있는 이.콜라이 박테리아의 제조 및 동정 방법을 제공한다.

바람직한 양태에서, 형질 전환된 클론의 분석은,

(a) 배양물중의 콜로니의 일부가 막의 한쪽 측면으로 이동되도록 하는 조건하에서, 제1 니트로셀룰로스 막을 형질 전환된 박테리아의 분산된 배양물과 접촉시키고,

(b) 단계(a)의 제1 막은 다른쪽 면을 생장 배지와 접해 있는 제2의 니트로셀룰로스 막과 접촉시켜 막의 조합체를 형성하며,

(c) 이동된 박테리아에 의해 분비되는 생물학적으로 활성인 단백질이 제1막을 통해 제2막으로 통과할 수 있는 조건하에서, 막 조합체를 배양하고,

(d) 막을 분리시키고 단계(c)의 제2막을, 특이적인 항체-단백질 복합체를 형성하는 조건하에서, 단백질에 특이적인 제1항체와 접촉시키며,

(e) 비결합 물질을 제거하기 위해 단계(d)의 제2막을 세척하고,

(f) 가시성 부분을 생성시키기 위해, 막상에 제1항체--단백질 복합체가 존재할 경우 가시성 반응이 발생하는 조건하에서, 세척한 막을 제1항체의 특이적인 표지된 제2항체와 접촉시키며,

(g) 가시성 부분을 배양물 중의 박테리아 콜로니와 함께 정렬시켜 배양 배지로 단백질의 실질적인 양을 분비할 수 있는 박테리아를 동정함을 포함하는 방법으로 수행한다.

바람직하게, 제1항체는 생물학적으로 활성인 단백질에는 특이적으로 결합하나 변성된(즉, 부적절하게 겹쳐진) 형태의 단백질과는 결합하지 않는다.

당해 분야의 숙련가들이 보편적으로 사용하는 많은 재조합 DNA-기술은 문헌들[참조 : Cohen et al., 미합중국 특허 제4,237,224호, Collins et al., 미합중국 특허 제4,304,863호 및 Maniatis et al., Molecular Coning : A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory]에 기술되어 있다. 이들 및 본원에 인용된 모든 문헌은 본원에서 참고로 인용되고 있다.

본 발명은, 이.콜라이를 배양 배지내로 이질성 단백질을 직접 분비시킬 수 있도록 변형시킬 수 있다는 놀라운 발견에 기초한 것이다.

본원에서 사용하는 이질성 단백질이란 이.콜라이에 의해서는 통상적으로 생산되지 않은, 포유 동물 단백질과 같은 단백질을 의미한다. 본 발명으로 인해, 이질성 단백질 분리에 있어서, 세포의 파괴 및/또는 청정제 또는 카오프로픽제를 사용한 추출과 같은 통상적 필요성이 배제되어 있다.

이런 결과는 두가지 주요한 개발로 성취된 바 있다. 먼저, 재조합 DNA 방법론은, 주변 세포질 공간으로 또는 그 이상으로 단백질의 수송을 중재할 수 있는 시그날 펩티드에 융합된 목적하는 이질성 단백질을 제조하는데 적용되었고, 다음으로, 박테리아의 막은 단백질에 대해 투과성이되도록 박테리아 DNA에서의 돌연변이성 변화로서 변형시켰다.

본 발명의 분비성 박테리아와 방법을 사용하여 제조한 단백질은 완전한 생물학적 활성을 가지며 정확하게 폴딩된 형태로 존재할 것으로 여겨진다. 따라서, 일반적으로 선행 기술의 방법을 사용하여 이.콜라이로부터 생물학적으로 활성인 재조합 단백질을 수득하는데 요구되는 조작이 필요없게 된다.

C600, W3110, AB1157,P678,C511, HB101, MM294, JM83 및 TB1을 포함하는 광범위한 이.콜라이 균주가 본 발명에서 사용될 수 있으나 이로써 제한되는 것은 아니다. 하기 실시예에서, 시판되는 균주인 MM294를, 본 발명에서 전적으로 무관한 이유는, 돌연변이 발생 이전에는 294S로 지정된, 스트렙토마이신 내성 균주로 전환시켰다. 그러나, 균주 MM294 또는 다수의 다른 입수 용이한 이.콜라이 균주가 대신 사용될 수도 있다.

박테리아의 돌연변이화는 당해 분야에 공지된 어떠한 표준 방법으로라도 수행할 수 있다. 하기 실시예에서, 돌연변이 유발제로서 자외선 조사가 사용되었으며 화학적 제제도 사용되었다. 예를 들어, 로페스(Lopes) 등(상기 참조) 또는 라자로니(Lazzaroni) 등(상기 참조)이 기술한 바와 같이, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘이 사용될 수도 있다.

본 발명에 적합한 이.콜라이 돌연변이체는 두가지 필수적인 기준으로 특징지워진다-박테리오 파아지 T7에 의한 감염에 대한 내성 및 이 돌연변이체가 성장하고 있는 배양 배지내로 실질적인 양의 주변 세포질 단백질을 분비할 수 있는 능력. T7에 의한 감염에 대한 내성 분석은 문헌[참조 : Branes et al., J.Bacteriol. 154 : 1462(1983)] 및 하기 기술한 바와 같이 통상적으로 수행한다.

주변 세포질 단백질에 대한 증가된 투과성의 분석은 마커로서 공지된 어떠한 주변 세포질 단백질과 선정된 단백질에 대한 적절한 용이하게 가시화할 수 있는 분석을 사용하여 수행할 수 있다. 하기 실시예에서, 주변 세포질로부터 리보 뉴클레아제 I의 분비는 분비된 효소가, 효모 RNA를 함유하는 아가중에서 광륜(halo) 또는 투명대(clear zone)를 형성하는 분비된 효소의 능력을 관찰하여 검출한다. 만일 암피실린-내성 이.콜라이 균주가 사용되었다면, 분비된 β-락타마제에 대한 분석은 Zinder 등(상기 참조)이 기술한 바와 같이 수행한다.

수많은 이질성 단백질이 본 발명의 방법으로 제조될 수 있다. 물론 하기에서 본 발명을 설명하기 위해 사람 인터루킨-4가 사용되긴 했으나, 원칙적으로 수득할 수 있는 단백질을 암호화 하는 DNA 서열에 대한 어떠한 단백질이라도 제조할 수가 있다. 이같은 DNA 서열에 대한 어떠한 단백질이라도 제조할 수가 있다. 이같은 DNA 서열은, 특정의 단백질을 생성하는 것으로 공지된 세포로부터 분리한 mRN로부터 cDNA를 제조하기 위한 표준 클로닝 방법을 적용함으로써 용이하게 제조할 수 있다. 이와 같은 cDNA 로부터 작제된 라이브러리는 표준 방법을 사용하여 제조 및 프로브화 할 수 있다.

실제로, 사람 GM-CSF 및 가용성 γ 인터페론 수용체 또한 본 발명의 분비성 균주를 사용하여 제조한 바 있다. 둘다는 고도의 생물학적 활성을 나타낸다.

필요로 되는 방법론은 문헌에 기술되어 있다[참조 : Okayma et al., Mol. Cell. Biol.2 : 161(1982), Meth. Enzymol. 154 :3 (1987), Margolskee et al., Mol. Cell. Biol.8 : 2837(1988) and Gubler et al., Gene 25 : 263(1983)]. cDNA 클로닝 방법에 대해서라면 Kimmel 등[참조 : Kimmel et al.,, Meth. Enzymol. 152 : 307(1987)]을 참조하라. 만일 유전자의 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있다면, 표준 화학적 합성법 또한 이용될 수 있다.

이.콜라이의 세포질내에서 합성된 단백질을 주변 세포질로 수송하기 위해서는 아미노 말단에서 시그날 펩티드와 융합시켜야만 한다. 이런 목적을 위해서, 이.콜라이 주변 세포질 또는 외막 단백질의 많은 공지된 시스날 펩티드가 사용될 수 있다. 예를 들어, Talmadge 등[참조 : Talmadge et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA 77 : 1369(1980)]은 pBR322의 bla 유전자를 함유하는 pKT287로 나타내는 벡터의 작제를 기술한 바 있다. bla에 의해 암호화된 처음의 23개 아미노산은 β-락타마제 시그날 서열을 포함한다. 만일, 유전자가 pKT287의 Pst I 부위에서 프레임내로 삽입된다면, 시그날 펩티드를 함유하는 융합 단백질이 발현 도중에 생성될 수 있다. 플라스미드 pKT287은 Maniatis 등(상기 참조 ; p.428)에 의해 설명되고 있다.

유사하게, Silhavy는, 이.콜라이 ompF 시그날 펩티드를 암호화 하는 유전자를 함유하는 pMH621로 지정된 플라스미드를 작제한 바 있다[참조 : Maniatis et al., 상기 참조, pp429-430]. pMH621의 Bgl II 부위에서 목적하는 단백질을 암호화 하는 이질성 DNA 서열의 삽입은 ompF 시그날 펩티드를 함유하는 융합 단백질을 생성하게 된다. 하기 실시예에서 다른 omp 시그날 펩티드인 ompA 펩티드가 사용되었다.

ompA와 ompF는 이.콜라이 외막 단백질에 대한 시그날 펩티드이다. 이들 시그날 펩티드에 대한 아미노산 서열이 Pollitt 등[참조 : Pollitt et al., Bacterial Outer Membranes as Model Systems, 1987, M. Inouye(ed), John Wiley Sons, New York. pp. 117-139]에 의해 기술된 바 있다. Watson[참조 : Watson, Nucleic Acids Res. 12 : 5145(1984)]은 277종 이상의 원핵 및 친핵성 시그날 서열이 현재 알려져 있다고 보고한 바 있다. 상기와 같은 원핵성 시그날 서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드는, 바람직하게는 고상 시스템 중에서, 본 발명에 사용하기 이해 포스포디에스테르 또는 다른 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 적절한 발현 벡터내로 삽입할 수 있다.

비록 아미노산 서열이 상이하기 하지만, 박테리아 시그날 펩티드는 세개의 공통적인 영역을 갖는 것으로 보인다. 아미노 말단에서, 하나 또는 그 이상의 라이신 또는 아르기닌 잔기를 함유하는 다수의 친수성 잔기 영역이 존재한다. 이 기본 영역에 이어지는 것은, 주로 Leu, Ala 및 Val이 풍부한, 약 8 내지 15개의 소수성 잔기를 함유하는 중심적 소수성 코어이다. 이 소수성 영역의 카복실쪽은 주변 세포질 또는 외막에서 성숙한 단백질을 제조하는 프로세싱 과정중 분해되어 버리는 영역이다. 분해는 일반적으로 소수성 영역으로부터 약 4 내지 8개 잔기의 위치에서 발생한다.

하기 실시에에서, ompA 시그날 펩티드의 분해는, 이.콜라이내에서 세포질성 발현중에 종종 단백질에 가해지는 외래성 아미노 말단의 Met 잔기를 갖지 않는, 성숙한 사람 인터루킨-4의 완전한 아미노산 서열을 갖는 단백질이 생성되도록 수행한다.

이.콜라이 시그날 펩티드와 목적하는 이질성 단백질을 암호화 하는 DNA 서열은, 이.콜라이내에서 독립적으로 복제 및 발현할 수 있는 많은 공지된 벡터의 프레임중에 작동적으로 결합할 수 있으며, 이에는 pBR322, pBR325, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pAH3, pKGT269-2 및 pRGT857-11이 있으나, 이로써 제한되는 것은 아니다. 두 DNA 서열은 서로 결합시킬 수 있으며 이후에 벡터내로 삽입할 수 있거나, 또는 시그널 펩티드를 암호화 하는 서열을 함유하는 벡터를 먼저 제조할 수도 있다. 그후, 어떤 이질성 DNA 서열이라도 시그날 펩티드 위치에 삽입시켜 목적하는 융합 서열을 생성시킬 수 있다. 바람직하게는, 시그날 펩티드를 암호화 하는 3개의 벡터가 제조되므로, 삽입된 어떤 주어진 이질성 유전자라도 이들중 하나의 정확한 판독 프레임중에 있게 된다.

또한, 시그날 펩티드를 암호화 하기 위해 이질성 유전자의 천연 뉴클레오티드 서열을 활용하는 것이 가능하다. 예를 들어, Talmadge 등[참조 : Nature 294 : 176(1981)은 정상적으로 프로 인슐린과 관련된 시그날 서열 또한 이.콜라이내에서 프로 인슐린 분비를 허용하도록 하는 작용을 나타낼 수도 있다고 보고한 바 있다.

바람직하게는, 본 발명에 사용된 재조합 벡터는, 널리 공지된 trp. lac 또는 λpL 프로모터에서와 같이, 조절성 프로모터/오퍼레이터(po) 시스템의 조절하에 있다. 열에 대해 민감한 리프레서의 조절하에 있는 다수의 po 시스템이 당해 분야에 공지되어 있다 : 배양 온도의 상승은 억제 작용을 완화시켜 조절된 발현을 가능케 한다. 다른 것들은 화학적 유도[예를 들어, 인돌릴 아세트산(trp) 및 이소프로필-β-D-티오 갈락토 사이드(IPTG, lac)]을 써서 조절할 수 있다.

물론 본 발명을 설명하고자, 특정의 재조합 플라스미드가 하기에 기술되고 있으나, 이는 대신 사용될 수 있는 다수의 재조합 플라스미드중 단지 대표적인 것임을 강조해 두고자 한다.

작제에 이어, 재조합 벡터는 표준 방법(상기 Maniatis et al., 250 참조)을 써서 돌연변이 박테리아내로 형징 전환시킬 수 있으며, 형질 전환체는 적절한 배지중에서 클론될 수 있다.

특정의 형질 전환체 클론이 생물학적으로 활성인 단백질을 분비하는지에 대한 여부의 충격은 표준 면역 화학 또는 생검 방법으로 실시할 수 있다. 인터루킨-2 또는 인터루킨-4와 같은 림포카인이 분비된 배양 배지의 분취량을 Devos 등[참조 : Devos et al., Nucleic Acids Res. 11 : 4307(1983)]이 기술한 것과 같이 T세포 성장 인자 활성에 대해 분석할 수 있다. 이런 분석의 궁극점은 방사성 동위 또는 비색 측정이다[참조 : Mosmann, J. Immunol. Meth. 65 : 55(1983)]. 인터페론 생검은 DeChiara 등[참조 : DeChiara et al., 미합중국 특허 제4,816,566호]에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다.

보다 신속한 분비성 클론의 스크리닝은 면역 침전법 또는 효소-결합 면역 흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay : ELISA)으로 수행할 수 있다. 목적하는 단백질에 대한 항체는 표준 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 문헌[참조 : Kohler 및 Milstein, Nature 256 : 495(1975), Eur. J. Immunol. 6 : 511(1976)]에 기술한 바와 같이 용이하게 제조할 수 있는 모노클로날 항체가 바람직하다.

모노클로날 항체 제조에 있어서, 골수종 세포에 융합시키기 위한 항체-생성 체세포를 수득하기 위해, 동물체 예를 들어, 래트, 마우스, 말, 양, 래빗 등을 면역화 시키는데, 목적하는 단백질을 사용한다.

항체 생산 잠재력을 갖는 체세포, 특히 B 세포가 골수종 세포주와 융합하는데 적합하다. 이들 체세포들은 임파절, 지라 및 프라임된 동물체의 말초 혈액으로부터 유래할 수 있다. 본 발명의 예로 든 양태에서, 부분적으로 래트의 지라 세포가 사용되었는데, 이는 이들 세포가 마우스 골수종 라인을 사용하여 비교적 높은 퍼센트의 안정한 융합물을 생성시키기 때문이다. 그러나, 마우스, 래빗, 개구리 또는 다른 세포를 대신 사용하는 것도 가능하다.

하이브리도마-생산 융합 방법에 사용하기 위해 특수화된 골수종 세포주를 임파구 종양으로부터 발생시킨 바 있다[참조 : Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6 : 511(1976) ; Shulman et al., Nature 276 : 269(1978) ; Volk et al., J. Virol. 42 : 220(1982)]. 이들 세포주는 적어도 세가지 이유로 개발되었다. 그 첫번째는 융합된 하이브리도마를 비융합된, 유사하게 무한정적으로 자가 증식하는 골수종 세포로부터의 선별을 촉진하기 위한 것이다. 통상적으로, 이것은, 하이브리도마의 생육은 보장해주지만 효소가 결핍되어 특정의 선택성 배지에서는 생장할 수 없는 골수종을 써서 성취시킬 수 있다. 두번째 이유는 임파구 조양 세포가 그들 고유의 항체를 생성한다고 하는 임파구 종양 세포의 선천적인 능력으로부터 기인한다. 모노클로날 기술을 사용하는 목적은 하이브리도마의 체세포 성분의 유전적 조절하에서 목적하는 단일 항체를 생성하는 무한정의 생명을 갖는 융합된 하이브리드 세포주를 수득하기 위한 것이다. 하이브리도마에 의한 종양 세포 항체 생성을 배제하기 위해, 면역 글로불린 경쇄 또는 중쇄를 생성할 수 없거나 또는 항체 분비 메카니즘이 결여된 골수종 세포주가 사용된다. 이들 세포주 선별의 세번째 이유는 융합에 있어서 이들의 안정성 및 효율이다.

P3X63-Ag8, P3/NS1-Ag4-1, Sp2/0-Ag14 및 S194/5.XXO.Bu.1을 포함하여 융합된 세포 하이브리드를 제조하기 위해 많은 골수종 세포주가 사용될 수 있다. P3X63-Ag8, P3/NS1-Ag4-1 세포주가 Kohler 및 Milstein[Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6 : 511(1976)]에 의해 기술된 바 있다. Shulman 등은[참조 : Shulman et al., Nature 276 : 269(1978)] Sp2/0-Ag14 골수종 라인을 개발하였다. S194/5.XXO.Bu.1 라인은 Trowbridge[참조 : Trowbridge, J. Exp. Med. 148 : 313(1979)]가 보고한 바 있다. 본 발명의 실시예에서는 P3X63-Ag8.653 라인(ATCC CRL 1580)이 사용되었다.

항체 생성 지라 또는 임파절 세포와 골수종 세포의 하이브리드 생성 방법은 통상적으로, 세포막의 융합을 촉진하는 제제 또는 제제들(화학적, 바이러스 또는 전지적) 존재하에, 각각 10 : 1 비율(물론 이 비율이 약 20 : 1 내지 약 1 : 1 사이에서 다양할 수 있지만)로 체세포와 골수종 세포를 혼합함을 포함한다. 융합 방법은 Kohler와 Milstein(상기 참조), Gefter 등[참조 : Gefter et al., Somatic Cell Genet. 3 : 231(1977)]과 Volk 등[참조 : Volk et al., J. Virol. 42 : 220(1982)]이 기술한 바 있다. 이들 연구자들이 사용한 융합-촉진제는 센다이 바이러스와 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 본 발명의 융합 방법은 PEG를 사용하고 있다.

융합 방법이 대단히 낮은 빈도(예를 들면, 체세포원으로서 지라가 사용될 때, 매 1×10⁵지라 세포당 대략적으로 겨우 하나의 하이브리드가 수득됨)로 생하이브리드를 생성하기 때문에, 잔류 미융합 세포, 특히 미융합 골수종 세포로부터 융합된 세포 하이브리드를 선별하는 수단을 갖는 것이 필수적이다. 또한, 다른 생성된 융합된 세포 하이브리드 중에서 목적하는 항체-생성 하이브리도마를 검출하는 방법도 필요하다.

일반적으로, 융합된 세포 하이브리드의 선별은 하이브리도마의 생육은 보장하지만, 정상적으로는 무한정적으로 계속 분열하게 되는, 미융합된 골수종 세포의 생장은 억제하는 배지내에서 세포를 배양함으로써 성취한다. 융합에 사용되는 체세포는 시험관내 배양에서는 긴 생존성을 유지하지 못하기 때문에 문제를 일으키진 않는다. 본 발명의 실시예에서, 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제가 결합된(HPRT-음성) 골수종 세포가 사용된다. 이들 세포에 대한 선별은, 지라 세포의 HPRT-양성 유전자형으로 인해 융합된 세포 하이브리드가 생존하게 되는 배지인 하이포크산틴/아미노프테린/티미딘(HAT) 배지 중에서 실시한다. 유전형적으로 컴피턴트한 하이브리드의 생장을 보장하는 배지 중에서 선별될 수 있는, 상이한 유전적 결여(약제 감수성 등)를 갖는 골수종 세포의 사용 또한 가능하다.

융합된 세포 하이브리드를 선별적으로 배양하는데는 수주일이 필요하다. 이 기간의 초기에, 목적하는 항체를 생성하는 하이브리드를 동정하고, 이로써 궁극적으로 이들을 클로닝 및 증식시키는 것이 필요하다. 일반적으로, 수득된 하이브리드의 10% 내외가 목적하는 항체를 생성하기 하지만, 약 1 내지 약 30%가 생성하는 것도 흔치 않은 것은 아니다. 항체-생성 하이브리드의 검출은, 효소-결합 면역 분석 및 방사선 면역 분석 기술등 문헌[참조 : Kennet et al., (editors), Monoclonal Antibodies and Hybridomas : A New Dimension in Biological Analyses, pp. 376-384, Plenum Press, New-York(1980)]에 기술된 바 있는 여러가지 표준 분석 방법중의 어느 한가지에 의해 성취할 수 있다.

한번 목적하는 융합된 세포 하이브리드가 선별되고 각각의 항체-생성 세포주내로 클로닝되면, 각각의 세포주는 다음의 두가지 표준 방법중의 하나로 증식시킬 수 있다. 하이브리도마 세포의 현탁액을 조직 친화성 동물체내로 주입할 수 있다. 주입된 동물체는, 융합된 세포 하이브리드에 의해 생성되는 특이적 모노클로날 항체를 분비하는 종양을 생성하게 된다. 고농도로 모노클로날 항체를 수득하기 위해 혈청 또는 복수액과 같은 동물체의 체액을 도출시킬 수 있다. 달리는 각각의 세포주를 실험실용 배양 용기내에서 시험관내 증식시킬 수도 있다. 고농도의 단일 특이적 모노클로날 항체를 함유하는 배양 배지는 분주(decantation), 여과 또는 원심 분리로 채취할 수 있다.

바람직하게는, 정확하게 폴딩된 생물학적으로 활성인 형태의 목적 단백질과는 특이적으로 결합하나 변성된 단백질 형태와는 결합하지 않는, 모노클로날 항체가 사용된다. 이같은 항체는 단백질에 대해 항체를 분비하는 다수의 하이브리도마 클론을 생성시키고, 목적하는 항체를 생성하는 하이브리도마를 찾기 위해 활성 및 변성 단백질 둘다를 가지는 하이브리도마의 배지를 스크리닝하여 수득할 수 있다. 단백질의 불활성 형은 단백질 샘플을 나트륨 도데실 설페이트(SDS)로 처리하여 단백질을 변성시켜 용이하게 제조할 수 있다.

활성 단백질만을 인지하는 항체를 사용하는 것은 보다 번거로운 생검 필요성을 배제시켜준다. 그러나, 이런 특이성이 결핍된 항체도 신속한 스크리닝을 위해 사용할 수 있다. 이런 스크리닝에서 양성으로 판정된 클론은 생물 활성에 대해 분석한다.

바람직한 양태에서, 분비성 클론 스크리닝은 니트로 셀룰로스 막 조합체를 써서 수행한다. 제1 니트로셀룰로스 막은 형질-전환체의 분산된 배양물 표면과 접촉하도록 한다. 접촉으로 막 위에 배양물 중의 콜로니 일부분이 전이된 이 막은 그후 성장 배지와 접해 있는 제2 니트로셀룰로스 막에 직접 부착시켜 막 조합체를 형성시킨다. 그후 이 조합체를, 전이된 돌연변이 박테리아 세포가 분비하는 이질성 단백질을 제1 막으로부터 제2 막쪽으로 이동하도록 하는 조건하에서 생장 배지상에서 배양한다. 배양후 막들을 분리시키고, 제2 막상의 단백질은 단백질과 결합하여 항체-단백질 복합물을 형성하는 특이적 항체를 써서 검출한다.

미결합 물질을 제거하기 위해 제2막을 세척한 후, 단백질-항체 복합체는, 막상의 제1항체에 대해 유도되는 표지된 제2 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 단백질에 대해 특이적인 항체가 쥐의 모노클로날 항체라면, 표지된 항-마우스 면역 글로블린 항체가 사용된다. 이 제2 항체는 특정의 파장에서 형광을 나타내는 화합물, 예를 들어 로드 아민으로 표지할 수 있거나 또는 바람직하게는 가시성 화학 반응을 촉매하는 효소로 표지할 수 있다. 이런 목적으로 사용할 수 있는 효소들은, 다양한 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제, β-갈락토시다제 및 알칼린 포스파타제이다. 표지된 제2항체의 사용을 통해, 분비된 단백질이 막상에 존재할때 가시성 좌우(visible foci)가 나타나게 될 것이다.

이러한 좌우를 함유하는 대표적인 막이 제1도에 나타나 있으며, 여기에서 보다 짙은 스포트로 나타낸 화살표는 추가의 연구를 위해 선정된 콜로니를 나타낸다.

제2 막상에 결합한 단백질의 위치를 가시화한 후, 배양물과 제2막을 정렬하여 가시성 좌위를 단백질을 분비하는 형질 전환체 콜로니와 포갠다. 이로써 동정된 분비 콜로니는 그후 배양물로부터 제거하고 적절한 생장 배지 또는 발효 욕에서 아배양한다.

일부의 경우에서, 막 조합체에서 제3의 니트로 셀룰로스 막을 사용하는 것이 바람직하다. 이 막은 제2막과 생장 배지 사이에 위치시켜 상기한 배양 동안에 전이된 콜로니가 분비하는 단백질이 제2 및 제3막 양쪽으로 이동하도록 한다. 막 분리후 상기한 바와 같은 제3막상에서의 단백질 좌위의 면역 화학적 검출은 제2막에서 관찰되는 어떠한 음성적 반응이 잘못된 음성 반응이 아님을 확증시켜 주는 것이 된다. 바람직하게는 제2막의 분석에 사용된 제1항체는 생물학적으로 활성인, 정확하게 폴딩된 형태의 단백질에만 특이적이나, 이와 달리, 제3막상에서 사용된 제1항체는, 변성 여부와 무관하게 어떠한 단백질 형태와도 결합한다.

돌연변이 유발제에 대한 노출이 발현 플라스미드 뿐만 아니라 박테리아 DNA 중에서 돌연변이성 변화를 유발하기 때문에, 먼저 이들로부터 플라스미드를 제거하고 그후 이를 돌연변이 유발체에 노출된 바 없는 플라스미드로 대체시켜 선정된 클론을 조치하는 것이 바람직하다. 이런 조치를 취하는 것은 표준 방법을 써서 용이하게 성취할 수 있다.

예를 들어, 이 플라스미드는 Watanbe 등[참조 : Watanbe et al., J. Bacteriol. 87 : 679(1961)]이 기술한 바와 같이 세포를 아크리딘 오랜지의 존재하에 배양하여 축출할 수 있다. 다른 방법은 형질 전환체를 분리 하는데 사용하는 선택 마커없이 세포를 단순하게 배양하는 것이다. 하기 실시예에서, 형질 전환된 세포는 암피실린만이 존재할 경우 생장할 수 있는데, 이는 플라스미드가 이 항생체를 분해하도록 하는 효소의 발현을 지시하기 때문이다. 배양 배지중에 암피실린이 있게 되면, 플라스미드를 유지하기 위해 감수성인 숙주 세포에 대해서 선택적 압력이 가해지나, 암피실린이 없게 되면 세포 생존을 위해 플라스미드가 필요로 되지는 않으며 자연적으로 소실되게 된다.

비록 본 발명을 설명하기 위해 소수의 분비성 이.콜라이 클론만을 상세히 기술하고 있으나, 사용된 방법은 일상적으로 다수의 유용한 분비 돌연변이체를 생성한다. 돌연변이 유발제에 노출된 약 10¹¹세포로부터, 약 300~500개의 T7에 의한 감염으로부터 생존하게 되는 콜로니가 형성된다. 이들 내성 콜로니중, 약 1/3 내지 약 1/2은 배양 배지내로 실질적인 양의 주변 세포질 단백질을 분비할 것이다.

바람직하게, 본 발명의 분비성 균주는 이들이 지속되는 배양에 대해 안정하고 일반적인 세포성 퇴화로 인한 목적하는 이질성 단백질을 누출시키지 않는지를 확인하기 위해 더 조사한다.

선정된 균주가 안정한지를 확증하기 위해, 바람직하게는 이들을 수 대(代)에 걸쳐 아배양하고 자발적인 용균 현상과 같은 퇴화의 증거를 관찰한다. 세포가 단순하게 퇴화되었기 때문에 목적하는 이질성 단백질이 배양 배지중에서 관찰되지 않는다는 점의 입증은 바람직하게는 배지를 대표적인 이.콜라이 세포질성 단백질의 존재에 대해 분석하여 수득한다. 만일 세포가 구조적으로 온전하다면, 이런 단백질의 실질적인 양은 물론 배지중에 존재하지 않아야 한다. 이같은 분석은 통상적인 분석이 용이한 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제와 같은 어떠한 세포질성 단백질에 대해서도 수행할 수 있다.

많은 경우에서, 전술한 방법으로 수득한 균주를 아클로닝 및 배양하고 세포를 1회 또는 그 이상의 돌연변이 발생 처리, 클로닝 및 선별시켜, 훨씬 유용한 분비성 균주를 제조할 수 있다.

동정된 이.콜라이 분비성 균주는 시그날 펩티드와 목적하는 이질성 단백질을 암호화 하는 서열을 둘다 발현되도록 하는 조건하에서 배양한다. 그후 박테리아 세포를 배양 배지로부터 분리시키고 표준 방법을 사용하여 배지로부터 단백질을 분리한다. 이러한 단백질을 분리하는데 사용되는 방법에는 예를 들어, 염 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 금속 킬레이트 크로마토그래피, 겔 여과, 고성능 액체 크로마토그래피, 예비 디스크 겔 또는 전기 영동, 등전점 포커싱, 저온 유기 용매 분획화, 역류 분배 및 면역 친화 크로마토그래피가 있다.

분비성 균주 및 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 이질성 단백질의 질과 양 모두는 선행 기술의 방법을 사용하여 얻은 결과보다 월등하다. 예를 들어, 간행중인 Lundell등[참조 : Lundell et al., J. Ind. Microbiol.]의 문헌에서는 ompA 시그날 펩티드를 암호화 하는 DNA 서열을 재조합 벡터내에서 사람 인터루킨-4 유전자에 융합시킨 것을 기술하고 있다. 비돌연변이성 이.콜라이 균주 294내에서 ITPG로 DNA의 발현을 유동함으로써, Lundell 등은 약 30~50%의 프로세싱된 인터루킨-4가 배양 배지중에 분비되는 것을 발견하였다.

이와 달리, 필수적으로 프로세싱된 전체의 인터루킨-4가 본 발명의 돌연변이 균주에 의해 배지로 분비되었다. 게다가, Lundell 등의 배양 배지로부터 회수한 분비된 인터루킨-4의 분석은 이의 물리 화학적 및 생물학적 특성이 본 발명의 방법으로 제조한 림포카인과는 상이한 것이 밝혀졌다.

첫째, 이.콜라이 균주 294로부터 회수한 인터루킨-4 활성의 양은, 본 발명의 분비성 균주의 대략적으로 동일한 수의 세포로부터 수득한 양보다 훨씬 적었다. 둘째, Lundell 등의 시스템으로 제조한 인터루킨-4는 고도로 활성인 인터루킨-4에 특이적인 모노클로날 항체에 의해 인지되지 않는다(하기의 항체 11B4의 용도를 참조하다). 세째로, Lundell 등의 시스템의 배지로부터 회수한 인터루킨-4는, 본 발명의 돌연변이 이.콜라이 균주에 의해 분비되는 인터루킨-4를 보유하는, 크로마토그래피 컬럼에 결합하지 않는다. 비돌연변이성 박테리아로부터 방출되는 인터루킨-4의 적은 양의 활성 및 물리적 특성은 이 단백질이 상이하면 덜 활성인 배위 형태를 갖고 있음을 암시하고 있다.

하기 실시예에서, 고체 혼합물중 고체, 액체중, 액체중 고체 %는 달리 언급이 없는한, 각각, wt/wt, vol/vol 및 wt/vol 기준이다.

세포 배양 동안 무균 조건을 유지시켰다. 모든 흡광도 파장(O.D. 파장)은 나노미터 단위이다.

사람 인터루킨-4에 대한 항체 제조

수컷 루이스 래트를 1ml의 완전한 프룬트 첨가제(CFA : Complete Freund's adjuvant)로 유화시킨 1ml의 사람 인터루킨-4 용액으로 복강내(i.p.)면역시킨다. 이 용액은 10mM 트리스-HCl, 0.5M NaCl(pH 7.4)중의 14㎍/ml의 농도에서 2×10⁷단위/mg의 비활성을 갖는 COS 세포에서 발현된 글리코실화된 재조합 사람 인터루킨-4를 함유한다.

초기 면역화 2주후, 1ml의 CFA로 유화시킨 사람 인터루킨-4 용액 1ml를 래트에 복강내 주입시킨다. 두 번재 주입 3개월 후 래트를, 15㎍의 단백질을 함유하는 사람 인터루킨-4 용액 1ml로 정맥내 부스팅시킨다. 부스터 주입 4일후, 래트를 폐사시키고 혈액을 채취하며 융합을 위해 지라를 적출한다.

지라 세포를 PEG를 사용하여, 1 : 1 비율로 마우스 P3X63-Ag 8.653 골수종 세포(ATCC CRL 1580)와 융합시킨다. HAT 배지중의 세포 현탁액(3.5×10⁵세포/ml)을 40개의 96-웰 플레이트에 분배시킨다. 10일 후 하이브리도마 상등액을, 미세 역가 플레이트상에 직접 고정시킨 사람 인터루킨-4(간접 ELISA) 또는 래빗 항-사람 인터루킨-4의 고정시킨 폴리클로날 IgG 분획에 결합된 사람 인터루킨-4에 대한 이들의 결합 능력에 대해 시험한다. 표준 원안에 따라, 결합전 항체는 퍼옥시다제-접합된 염소 항-래트 면역 글로블린으로 검출한다. 제안 희석으로 인터루킨-4와 반응하는 항체를 분비하는 하이브리도마를 클로닝한다. 이 방법으로 선택된 하이브리도마 중의 하나가 ICI.11B4.6이다. ICI.11B4.6로부터의 항체(항체 11B4로 표기)가 IgG2a 동위형인 것으로 결정되었으며, 생물학적으로 활성인 사람 인터루킨-4에 대해 특이적인 것으로 밝혀졌다.

이런 특이성은 11B4 모노클로날 항체를 면역화 인터루킨-4 및 문헌[참조 : Laemmli, Nature 227 : 680(1970)]에 기술한 바와 같이 변성화 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 처리한 인터루킨-4와 반응시켜 확립한다. 항체는 전자 인터루킨-4만을 인지하며, 림포카인을 실온에서 5분간 0.04%의 낮은 SDS로 전처리하면, 이 항체에 의한 인지를 충분히 소멸시킬 수 있다.

이 하이브리도마를 배지중에 10% DMSO(디메틸설폭사이드)와 함께 -70℃에서 보관하고, 표준 포유 동물 세포 배양법을 사용하여 배양한다(RPM1 1640, 10%의 태송아지 혈청을 함유하며 1mM 글루타민 및 50mM 2-머캅토 에탄올을 보충한 배지).

SDS-변성 배조합 사람 인터루킨-4에 대한 다가 항체를 상기와 같이 림포카인 샘플을 SDS 폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동시키고, 겔로부터 밴드를 절단해내며, 표준 방법을 써서 회수한 단백질로 래빗을 면역화시켜 제조한다. 인터루킨-4는 문헌[참조 : Kimmenade et al., Eur. J. Biochem. 173 : 109(1988)]에 기술한 바와 같이 이.콜라이 발현 시스템 중에서 제조한 바 있다.

플라스미드 pRGT857-11의 작제

사람 IL-4 발현 플라스미드 pAH3 및 pKGT269-2 및 플라스미드 pUC19(제2도)의 작제는 문헌에 기술된 바 있다[참조 : Lundell et al., J. Ind. Microbiology, 발간중 및 Yanisch-Perron et al., Gene 33 : 103(1985)].

포화된 밤샘 배양물로부터 소규모의 플라스미드 DNA 분리는 문헌[참조 : Maniatis et al., 상기 참조 : 368p.]에 따른 방법으로 수행한다. 이 방법은 분석 목적의 소량의 DNA를 박테리아 배양물로부터 분리하도록 한다. 대량의 플라스미드 DNA는 Maniatis 등(상기 참조, 90페이지)의 방법에 따라 제조한다. 플라스미드 DNA의 분해로부터 유래한 특이적 제한 효소 단편은 0.8% 아가로스 중에서 예비 전기 영동으로 분리한다. 트리스-붕산염 완충액 중에서, 겔을 150볼트에서 4시간 전개시킨 후(참조 : Maniatis 등, 상기 156페이지 참조) 에티디움 브로마이드로 염색하여 DNA를 가시화 한다. 적절한 겔 분획을 적출해내고 150볼트에서 60분간 전기 용출시킨다. 그후 DNA를 2용적의 에탄올을 써서 침전시켜 농축한다.

제한 효소, DNA 폴리머라제 I (클레나우 단편) 및 T4 DNA 리가제는 마이애미 비벌리 뉴잉글랜드 바이오랩스에서 시판하는 것이며 이들 효소의 사용에 대한 방법 및 조건은 전적으로 제조자에 따른다.

T4 DNA 결합은 4℃에서 적어도 24시간 수행한다. 단쇄 DNA 말단의 클레나우 평활 말단화는 10mM 트리스-HCl, pH 7.5, 2.5mM dGTP, dATP, dCTP 및 dTTP 와 10mM MgCl₂를 함유하는 완충액 중에서 수행한다.

Laemmli(상기 참조)이 기술한 바와 같이 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동을 수행한다. 15% Sepragels(MA, 하이드 파크의 인티그레이티드 세퍼레인션 시스템사 제조)을 사용하고 전체 용해물 단백질은 쿠마시브릴리안트 블루(Coomassie Brilliant Blue) R-250(바이오-라드 래보러토리즈 제조)로 염색시켜 가시화한다. 인터루킨-4는 하기 기술한 바와 같이 특이적 항체를 사용하여, 전기 영동으로 분리시킨 단백질을, Hoefer Scientific Model TE 50 Transphor 전기 영동 단위를 사용하여 전이시킨 후 면역 화학적으로 가시화 한다.

본 실시예에서 사용되는 pRGT857-11을 작제하기 위하여 pAH₃은 Aval로 분해시킨다. 이 효소로 생성된 5' 오버행을 이.콜라이 폴리머라제 I의 클레나우 단편으로 충전시키고 DNA를 Pvu I으로 분해시킨다. 인터루킨-4 및 laci 영역을 지니는 5.8kbp 단편을, 복제의 pUC 기원을 지니는 pUC19의 1.4kbp PvuII-Pvu I 단편에 결합시킨다.

이.콜라이 294를 형질 전환시킨 후, 복제의 pUC 기원을 지니는 pRGT839-2로 나타낸는 암피실린-내성 인터루킨-4 발현 플라스미드를 분리한다(제2도 참조).

그후 플라스미드 pRGT839-2 및 pKGT269-2를 Aat II 및 Pvu I 으로 분해한다. IL-4 및 laci 영역을 지니는 pRGT839-의 6.7kbp 단편을 클로람 페니콜 내성을 암호화 하는 pKGT269-2로부터의 1kbp 단편에 결합시킨다. 이 결합 혼합물을 이.콜라이 294를 형질 전환시키는데 바로 사용한다. 플라스미드 pRGT857-11을 함유하는 형질 전환제를 분리한다.

분비성 이.콜라이 균주의 제조 및 선별

일상적 박테리아 균주 배양, 플레이팅 실험 및 일부의 발효를 위해 TYE 브로쓰[20g/ι 박토 트립톤(디프코), 10g/ι박토 이스트 추출물(디프코 제조) 및 5g/ιNaCl로 구성]를 사용한다. 대부분의 발효는, 30℃에서 베플링된 진탕 플라스크내에서 변형시킨 GC 배지[20g/ι글리세롤, 30g/ι카사미노산(디프코), 30g/ι 효모 추출물(디프코), 5g/ιKH₂PO₄및 1g/ι MgSO₄7H₂0]중에서 수행한다. 목적하는 바와 같이, 암피실린 또는 클로람 페니콜(몬타나 성루이스, 시그마 케미칼 캄파니로부터 입수)을 종종 각각 100㎍/ml 및 10mg/ml의 농도로 가한다.

스톡 균주는 40% 글리세롤중 -20℃에 저장한다. 접종 배양물은 0.1ml의 글리세롤 스톡을 10ml의 TYE 브로쓰를 함유하는 튜브에 넣어 제조한다. 30℃에서 밤새 배양한 후, 세포는 500ml의 베플링된 삼각 진탕 플라스크(벨코 제조)중의 100ml TYE 배지를 A₆₆₀=0.2까지 접종시키는데 사용한다. 이 플라스크는 30℃에서, Brunswick Controlled Environment Incubator Shaker 중에서 250rpm에서 진탕 배양한다. A₆₆₀=1.0에 이르게 되면 0.25mM까지 IPTG를 가하고 4 또는 18시간 동안 발효를 지속시킨다.

다양한 이.콜라이 균주의 형질 전환을 Maniatis(상기 250페이지 참조)가 기술한 바와 같이 수행한다.

294S로 나타내는 이.콜라이의 스트렙토마이신-내성은, 이.콜라이 PAM163내에서 생육시킨 바 있는[참조 : Johnson, Gen, Res. 30 : 273(1977)]박테리오 파아지 P1 cm1, clr 100[참조 : Miller, Ewperiments in Molecular Genetcs, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory]으로 균주 MM294를 형질 도입시켜 제조한다. 이.콜라이 균주 MM294는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁 번호 ATCC 33625호로 기탁되어 입수 용이하다.

이.콜라이 294S를 멸균수 주에서 40초간 10인치 거리에서 살균용 자외선 램프로 조사시킨다. 이 처리로, 트립톤 : 효모 추출물 : 염화나트륨(20 : 10 : 5)을 함유하는 완전 TYE 브로쓰상에서 플레이팅하여 측정하는 바와 같이 99.9%의 세포 치사를 달성할 수 있다. 돌연변이된 세포 현탁액을 최종 용액 50ml까지 완전 TYE 브로쓰로 약 1 : 5로 희석하여 37℃의 어둠속에서 250ml 플라스크내에서 진탕 배양한다.

변형된 외막을 갖는 돌연변이체를 선별하기 위해 야생형 박테리오 파아지 T7을 가하고 단위 ml당 10⁸플라그 형성 단위의 농도까지 배양한다. 이 플라스크를 37℃에서 세포 용해가 관찰될 때까지(약 30분간) 진탕시키고, 이후 4℃에서 10000×g로 10분간 원심 분리시켜 T7-내성 세포를 수거하고 펠렛을 1ml의 신선한 브로쓰내에 재현탁시킨다.

세포를 TYE[트립톤 : 효모 추출물 : 염화나트륨(20 : 10 : 5)] 아가 플레이트상에 도포시키고 37℃에서 배양한다. 24시간 후, 각 플레이트는 약 30~50개의 콜로니를 함유한다. 이들 콜로니를 외막 손상에 대해 더 조사한다. 사용된 한가지 방법은 배지내로 리보 뉴클레아제 1 누출의 증가를 관찰하는 것이다.

T7 박테리오 파아지-내성 클론의 단일 콜로니를, 1% 효모 RNA를 함유하는 pH7의 4ml TYE 아가(시그마 케미칼 제조)로 처리한 신선한 TYE 아가 플레이트에 스트리킹 한다. 37℃에서 밤새 배양한 후, 플레이트를 1N HCl로 충분히 적셔준다. 배지내로 리보 뉴클레아제 활성을 누출시키는 균주를 결정하기 위해 광륜(halo) 크기를 이용한다[참조 : Weigand et al., J. Bacteriol. 125 : 340(1976)].

이.콜라이에서 외막 손상의 다른 지시자는 MacConkey 아가상에서의 성장 실패이다[참조 : Hancock, Ann, Rev. Microbiol. 38 : 237(1984)]. 특히 약 30개의 T7-내성 콜로니중 MacConkey 아가에 감수성이며 실질적인 양의 주변 세포질 리보 뉴클레아제 I을 분비할 수 있는 것으로 밝혀진 2개를 분리하여 RL7 및 RZ21로 명명하였다.

이.콜라이 RL7 및 RZ21을 플라스미드 pAH3(제2도 참조)로 형질 전환시켜 균주 RZ21/pAH3 및 RL7/pAH3를 생성시킨다. 플라스미드 pAH3는 시그날 펩티드를 생성하며 이는 인터루킨-4를 내측 세포막에서 주변 세포질로 수송하도록 한다. 두 형질 전환체를 변형시킨 GC 배지중에서 발효시킨다. 두 형질 전환체로 부터 소모된 배지를 사람 인터루킨 -4에 대한 래빗 폴리클로날 항 혈철을 사용하여, 웨스턴 블롯 분석으로 누출성에 대해 스크리닝 한다.

대량의 인터루킨-4를 분비하는 균주를 제조하기 위해 자외선 조사를 써서 앞서와 같이 RZ21/pAH3를 돌연변이시킨다. 어둠속에서 적어도 2시간 성장시킨 후, 조사시킨 세포를, 암피실린(100㎍/ml)을 보충한 TYE 아가 플레이트상에 플레이팅 시키고 30℃에서 밤새 배양한다. 분비성 콜로니하에서 발생되는 보다 짙은 색 발생에 의해 나타나는 바와 같이, 콜로니를 증가된 인터루킨-4 방출에 대해 2-막 면역 분석(폴리클로날 항 혈청 사용)으로 스크리닝 한다.

돌연변이 세포를 희석시키고 100㎍/ml의 암피실린을 함유하는 TYE 아가 플레이트(142mm 직경)상에 도포(플레이트당 0.1ml)한다. 30℃에서 밤새 배양한 후, 플레이트는 직경 약 1mm에 약 500~2000개의 콜로니를 함유하게 된다. 그후 이 플레이트를 0.45μ의 공극 크기를 갖는 137mm 니트로셀룰로스 디스크(Schleicher and Schulle 제조)로 덮는다. 이 디스크를 한쪽 모서리로부터 점차 고른 습윤이 일어나도록 적용시킨다. 이 디스크를 단번에 벗겨내어 콜로니의 일부가 아가 플레이트에서 니트로 셀룰로스 디스크상으로 이동하도록 한다. 이 디스크를 앞서 무균 아가 플레이트 표면상에 둔 바 있는 다른 니트로 셀룰로스 디스크 상단에 위치시킨다. 그후 이 디스크를 30℃에서 밤새 배양한다.

배양후, 기부 디스크를 콜로니-함유 디스크와 분리시킨다. 필터를 실온에서 60분간 10mM 트리스(pH 8), 150mM NaCl 및 1% BSA(소혈청 알부민)을 함유하는 0.05%(v/v) 트웬-20(폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노라우레이트 ; 바이오-라드, 효소 면역 분석 순도 등급)(TBST) 중에서 배양한다. 그후 필터를 실온에서 30분간 래빗 폴리클로날 항 혈청(TBST/BSA중 1 : 1500 희석 ; 총 인터루킨-4의 측정용으로 사용) 또는 모노클로날 항 혈청(항체 11B4)(TBST/BSA중 하이브리도마 배양물 상등액의 1 : 10 희석물 ; 인터루킨-4의 본래의 배위를 결정하는데 사용)중 하나인 제1항체와 배양한다.

필터를 TBST중에서 3회 세척하고, 30분간, 사용된 제1항체에 특이적인 알칼린 포스파타제-결합된 제2항체와 배양한다. 필터를 TBST 3회 세척하고 알칼린 포스파타제 기질(프로메가 바이오테크의 ProtoBlot System)으로 염색한다. 생성된 가시성 좌위를 최초 플레이트와 정렬시키고, 증가된 사람 인터루킨-4 -특이적 염색을 나타내는 콜로니를 선별한다.

선별된 콜로니를 비-선택성(암피실린 결핍) 배지중에서 연속 전이시키고 비선택성 TYE 플레이트상에 스트리킹시켜 플라스미드를 제거시킨다. 암피실린 플레이트상의 생장에 대해 음성을 나타내는 콜로니를 플라스미드 부재에 대해 체크한 후 pAH3로 재형질 전환시킨다.

pAH3를 갖고 있는 RZ21 유래한 클론을 100㎍/ml의 암피실린을 갖는 TYE 중에서 배양한다. 이들 콜로니를, 10ml 튜브 발효물로부터 수득한 전체 브로쓰를 도트 면역 블롯팅하여 림포카인의 증가된 방출에 대해 스크리닝 한다. 콜로니는 상기와 같이 11B4 모노클로날 항체를 사용하여 사람 인터루킨-4 및 알칼린 포스파타제-접합된 염소-항-래트 IgG에 대해 측정한다.

RZ21의 추가 돌연변이로 생성되고 고생성 균주로 선정된 균주를 RS631로 나타낸다.

비돌연변이된 이.콜라이 및 단일-및 이중 돌연변이된 이.콜라이에 의한 사람 인터루킨-4 생성물의 비교

본 발명 균주의 증가된 분비능 및 반복된 돌연변이 발생 및 선택의 효과를 입증하기 위해, 비돌연변이 균주 294S 및 단일-(균주 RZ21) 및 이중-돌연변이된(균주 RS631), 플라스미드 pAH3를 갖는 이.콜라이를, 20 : 10 : 5 TYE 배지중에서 상기한 바와 같이 발효시킨다.

그후 1mM IPTG를 가하여 발현을 유도한다. 6시간의 후유도후, 37℃에서 1시간 동안 2mM EDTA를 함유하는 20 : 10 : 5 TYE 배지 중에서 다양한 형질 전환체의 10X 세포 농도의 배양으로 방출된 인터루킨-4의 양을 측정한다. 배지중의 인터루킨-4는 문헌의 방법으로 측정하며[참조 : Yokota, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 5894(1986)], 결과는 표 1과 같다.

[표 1]

* 활성도 값은 O.D.660의 30.0에 대해 보정하여 동일한 숫자의 세포가 분비하는 것과 비교한다. 1㎍의 순수한 사람 인터루킨-4는 사용된 분석에서 약 20,000 단위의 활성을 갖는다.

표 1의 데이터는 단일-돌연변이된 분비성 균주 RZ21이 배지 중에서 비돌연변이된 균주 294S에 비해 10배 이상의 인터루킨-4의 양을 생성함을 나타내 보이고 있다. 또한 이중-돌연변이된 균주 R631은 RZ21 보다 배지내에서 약 5 배이 이상의 활성을 나타낸다.

배양물 기탁

돌연변이 이.콜라이 균주 RZ21, RS631 및 RL7은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁 번호 ATCC 53951, 53953 및 53954로 각각 기탁되어 있다. 플라스미드 pAH3 및 pKGT269-2를 갖는 이.콜라이 균주 294S는 ATCC에 기탁 번호 ATCC 69136 및 69137로 각각 기탁되어 있다. 이들 모든 기탁은 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 따라 수행한 것이다.

당해 분야의 숙련가에게 자명한 바와 같이, 본 발명의 목적과 범주로부터 이탈함이 없이, 본 발명에 대한 다수의 변경 및 개질이 가해질 수 있다. 본원의 실시예는 단지 예로 든 것에 불과하며, 본 발명은 단지 청구범위에 의해서만 한정된다.

Claims

(a) 박테리오 파아지 T7에 의한 감염에 대한 내성과, 이런 내성을 갖게 된 세포가 유래되는 내성이 결핍된 세포 보다 약 10배 이상의 주변 세포질(periplasmic) 단백질을 배양 배지내로 분비할 수 있는 것으로 특징지워지며, (b) 주변 세포질 공간(periplasmic space)으로 단백질의 수송을 매기할 수 있는 시그날 펩티드를 암호화 하는 제1 DNA 서열이 작동적으로 연결되며 목적하는 이질성 단백질을 암호화 하는 제2 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터를 함유하여, 상기 두 DNA 서열을 모두 발현시킬 수 있는, 배양 배지내로 생물학적으로 활성인 이질성 유전자 생성물을 분비할 수 있는 이.콜라이 박테리아.
(a) (i) 박테리오 파아지 T7에 의한 감염에 대한 내성과, 이런 내성을 갖게 된 세포가 유래되는 내성이 결칩된 세포 보다 약 10배 이상의 주변 세포질 단백질을 배양 배지내로 분비할 수 있는 것으로 특징지워지며, (ii) 주변 세포질 공간으로 단백질의 수송을 매개할 수 있는 시그날 펩티드를 암호화 하는 제1 DNA 서열과 이에 작동적으로 연결되며 목적하는 이질성 단백질을 암호화 하는 제2 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터를 함유하는, 생물학적으로 활성인 이질성 단백질을 배양 배지내로 분비할 수 있는 이.콜라이 박테리아를, 두 DNA 서열을 발현하고 배양 배지내로 이질성 단백질을 분비하는 조건하에서 배양하는 단계, 및 (b) 배양 배지로부터 분비된 단백질을 분리시키는 단계들을 포함하여, 목적하는 이질성 단백질을 제조하는 방법.
(a)박테리아의 DNA에서 돌연변이성 변화를 생성시키기 위해 충분한 양의 돌연변이 유발 물질로 이.콜라이 박테리아를 처리하는 단계, (b) 박테리오 파아지 T7에 의한 감염에 내성을 가지며 이런 내성을 갖게 된 세포가 유래되는 내성이 결핍된 세포 보다 주변 세포질 단백질을 약 10배 이상 배양 배지내로 분비할 수 있는 능력을 지닌, 단계(a)에서 생성된 돌연변이체 클론을 선별하는 단계, (c)주변 세포질 공간으로 단백질 수송을 매개할 수 있는 시그날 펩티드를 암호화 하는 제1 DNA 서열과 이에 작동적으로 연결되며 목적하는 이질성 단백질을 암호화하는 제 2 DNA 서열을 포함하며, 박테리아내에서 이들 2가지 DNA 서열의 발현을 지시할 수 있는 재조합 벡터로 단계(b)에서 선별한 하나 이상의 클론을 형질 전환시키는 단계, 및(d) 어떤 클론이 이질성 단백질을 분비하는지를 결정하기 위해 형질 전환된 클론을 분석하는 단계들을 포함하는, 배양 배지내로 생물학적으로 활성인 이질성 유전자 생성물을 분비할 수 있는 이.콜라이 박테리아를 제조 및 동정하는 방법.
제2도에 나타낸 제한 엔드 뉴클레아제 지도에 의해 특성화 되는 플라스미드 pRGT857-11.
아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 각각 기탁 번호 ATCC 53951, 53953 및 53954 로 기탁된 이.콜라이 박테리아 RZ21, RS631 또는 RL7.