FI104499B - Erittäviä E. coli-kantoja - Google Patents

Description

104499

Erittäviä E. coli-kantoia. - Sekreterande E. coli-stammar.

Tämä keksintö koskee E. coli-mutanttikantoja, joita on transformoitu yhdistelmä-DNA-vektoreilla, ja jotka voivat erittää kasvatusväliaineeseen heterogeenisiä yhdistelmä-DNA-proteiine-ja, ja menetelmiä tällaisten kantojen tuottamiseksi ja tunnistamiseksi. Keksintö koskee myös menetelmiä tällaisten transfor-manttien käyttämiseksi tuottamaan heterologisia yhdistelmä-DNA-proteiineja oikein laskostetuissa, biologisesti aktiivisissa muodoissa.

Keksinnön tausta

Yhdistelmä-DNA-teknologian menetelmät ovat mahdollistaneet biologisesti tärkeiden polypeptidien ja proteiinien suhteellisten suurten määrien tuottamisen. Suureen osaan tästä työstä on käytetty Escherichia coli-bakteeria isäntäorganismina yhdis-telmä-DNA-vektoreiden ekspressioon, mutta tämän bakteerin käytöllä on merkittäviä rajoituksia. Fysikaalisesta rakenteestaan johtuen E!, coli-bakteerit. jotka ekspressöivät yhdistelmä-DNA-polypeptidejä tai -proteiineja, on yleensä rikottava fysikaalisesti, kemiallisesti tai entsymaattisesti ennen kuin yhdiste lmä-DNA- tuotteet voidaan eristää.

1 · i E. colille ia muille gram-negatiivisille bakteereille on tun- . “ nusomaista keskussytoplasmalla, jossa proteiinit syntetisoitu-« · *,V vat, ja monimutkainen solumembraanirakenne. Niissä on ulkoinen membraani, johon on sitoutunut joukko lipidiliittyneitä oligo-. sakkarideja. Kun patogeeniset gram-negatiiviset bakteerit ini'·': fektoivat eläimen, näitä pintaoligosakkarideja kohtaan spesi- fisten vasta-aineiden tuotanto voi olla tärkeää taudin kulun ,·. : määrittämisessä.

• · · f · « I · ,

Ulkomembraanin sisäpuolella on sisämembraani, joka on solun tärkein permeabiliteetin este. Tämä membraani sisältää proteiineja, jotka sallivat määrättyjen ravinteiden ja muiden kemikaa- 104499 2 lien kulkea solun sisälle ja ulos, jättäen toiset ulkopuolelle.

Uikomembräänin ja sisämembraanin välissä on periplasminen tila tai periplasma. Tämä alue on kontaktissa ulkomembraanin kanssa ja sisältää peptidoglykaania, erittäin verkkoutunutta seinämä-mäistä proteiinien ja oligosakkaridien kompleksia, joka antaa solulle jäykkyyttä.

Useimmat E. colin syntetisoimat proteiinit jäävät sytoplasmaan, mutta jotkin esiintyvät periplasmassa. Proteiinit, jotka kulkeutuvat sytoplasmasta periplasmaan, sisältävät "signaalipep-tidejä", jotka ovat liittyneet kovalenttisesti peptidisidoksel-la proteiinien aminoterminaalisiin päihin, ja jotka helpottavat kuljetusta plasmamembraanin läpi. Esimerkkejä joistain peri-plasmisista proteiineista E. colissa ovat j3-laktamaasi, alkali-nen fosfataasi ja määrätyt nukleaasit, peptidaasit ja proteaa-sit. Periplasmisten proteiinien signaalipeptidit katkaistaan yleensä jossain pisteessä kuljetusprosessin aikana, jolloin periplasmaan jäävät jäljelle proteiinien "kypsät” muodot.

Yhdistelmä-DNA-proteiinien valmistuksen.aikana E. colia käyttäen heterologisten tai vieraiden geenien ekspressiötuotteet akkumuloituvat yleensä solulimaan. Tällaiset proteiinit saos-tyuvat usein muodostaen ei-liukoisia "inkluusio"- eli "refrak-;:· tiilikappaleita". Tälalisissa kappaleissa yhdistelmä-DNA-pro-teiinit eivät ole natiivissa muodossaan, eivätkä ne ole biolo- :V; gisesti aktiivisia [Mitraki et ai·, Bio/Technology 7. (1989) • ♦ 690], Tällaisten proteiinien eristämiseksi käyttökelpoisessa .·. ; muodossa bakteerit on rikottava, ja ei-liukoisessa fraktiossa • · · olevat proteiinit on liuotettava käyttämällä detergenttiä tai • · ♦ ’ kaotrooppista ainetta, kuten ureaa tai guaniinihydrokloridia.

Koska näin liuotetut proteiinit eivät ole natiiveissa konfor- • * · *· ’*· maatioissaan, ne on laskostettava uudelleen oikein käyttämällä suhteellisen monimutkaisia proseduureja, kuten sellaisia, jotka on kuvannut Builder et ai. (EP-patenttihakemus 114506).

3 104499

Eräässä pyrkimyksessä yhdistelmä-DNA-menetelmien käyttämiseksi heterologisten proteiinien valmistamiseksi, jotka eivät akkumu-loidu soluliman inkluusiokappaleisiin Villa-Komaroff et ai. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) 3727] insertöi rotan preproinsiliinigeenin E. colin /3-laktamaasigeeniin. Kuten jo mainittiin, b-laktamaasi on periplasminen entsyymi, joka pre-kursorimuodossaan kantaa- signaalipeptidin. Fuusioitujen /3-lak-tamaasi/preproinsuliini-geenien ekspressiöstä tulokseksi saatu fuusioproteiini kulkeutui periplasmaan edellä kuvatulla kul-jetusmenetelmällä.

Selmalla lailla Gilbert et ai. (EP-patenttihakemus 006694) on kuvannut geenimanipuloidut fuusioproteiinit ekspressöimällä DNA-sekvenssejä, jotka sisältävät geenin, joka koodittaa haluttua vierasta proteiinia, jotka DNA-sekvenssit on fuusioitu DNA-sekvenssiin, joka koodittaa periplasmisen proteiinin signaali-peptidiä.

Hyödyntämällä luonnollisia kuljetusprosesseja hieman pitemmälle Silhavy et ai. (US-patenttijulkaisu 4336336) on kuvannut menetelmän fuusioproteiinien tuottamiseksi,· jotka kulkeutuvat bak- 4 teerin ulkomembraaniin. Tähän menetelmään liittyy sytoplasmisen bakteeriproteiinia koodittavan geenin fuusio geenin kanssa ei-sytoplasmista kantajaproteiinia varten, tuottaen täten fuusio-proteiinin, joka kulkeutuu ulkomembraanille. Silhavy et ai. esittää myös, että tätä menetelmää voitaisiin käyttää inser-toimaan vieraan geenin (esimerkiksi geenin, joka koodittaa • · eukarioottista proteiinia) jo konstruoituun fuusiogeeniin.

• · • · · • · · '·;·* Missään edellä olevista prosesseista halutut yhdistelmä-DNA-• · · proteiinit eivät kuitenkaan kulkeudu solujen ulkomembraanien ulkopuolelle. Kussakin tapauksessa solut on yhä rikottava pro- • · · ’· *· teiinien talteensaamiseksi. Tuloksena vapautuu suunnaton joukko bakteeriproteiineja, tehden haluttujen proteiinien eristämisen työläämmäksi ja monimutkaisemmaksi. Lisäksi, kun prosessit tuottavat tuotteita, jotka ovat fuusioituneet bakteeriproteii-neihin, tuotteet on yleensä lohkaistava halutun proteiinin 4 104499 tuottamiseksi. Tämä prosessi voi olla monomutkainen, ja siihen Voi liittyä denaturoivien olosuhteiden käyttö, tehden täyden biologisen aktiivisuuden omaavien proteiinien talteenoton vaikeaksi.

Läheisemmässä menneisyydessä Sakaguchi et ai. [Agric. Bio.

Chem. 52 (1988) 2669] on kuvannut ompA-signaalisekvenssiä koodattavan DNA-sekvenssin fuusioimisen geeniin, joka koodittaa granulosyytti-makrofagi-koloniaa stimuloivan tekijän (GM-CSFG) E. coli-ekspressiövektorissa. E. coli HB101:een transformoin-nin ja ekspression jälkeen keksittiin, että jonkin verran GM-CSFtää erittyi kasvatusväliaineeseen.

On tuotettu erilaisia E. coli-mutantteja, jotka päästävät erilaisia periplasmisia entsyymejä kasvatusväliaineeseen. Esimerkiksi Lopes et äl· [J· Bacteriol. 109 (1972) 520] käsitteli E. coli-soluja mutageenillä, kuten nitrosoguanidiinillä "periplas-misten vuotavien" mutanttien tuottamiseksi, jotka erittivät ribonukleaasi I:tä, endonukleaasi I:tä ja alkalista fosfataa-sia. Selmalla lailla Anderson et ai. [J. Bacteriol. 140 (1979) 351] ja Lazzaroni et ai. [J. Bacteriol. 145 (1981) 1351] ovat käyttäneet immuunisaostusta tai SDS-polyakryyliamidigeelielekt-roforeesia eritettyjen periplasmisten proteiinien havaitsemiseksi periplasmisten vuotavien mutanttien tutkimuksissa.

Tällaisten mutanttien vuotamisen uskotaan heijastavan puutetta . bakteerin ulkomembraanin normaal(e)issa komponent(e)issa, mikä • · · * *. lisää permeabiliteettia. Mitään vuotavista mutanteista ei tehty [ [ kohteena yhdistelmä-DMNA-proteiinien kasvatusväliaineeseen • · e *· erittymisen saavuttamiseksi. Sen sijaan niiden konstruktio on :.* * ilmeisesti suoritettu jotta tutkittaisiin bakteerikuoren rakennetta ja toimintaa ja erilaisten entsyymien sijaintia membraa- » · *· '·: nirakenteen sisällä.

• · « Läheisemmässä menneisyydessä Zinder et ai (US-patenttijulkaisu 4595658) on kuvannut menetelmän bakteereissa syntetisoitujen proteiinien ulkoistamisen helpottamiseksi. Tähän menetelmään « < 104499 5 liittyy f1-bakteriofagin koko geeni III:n tai sen osan lisäämi- Λ sen plasmidiin tai bakteerikromosomiin. Geenin ekspressiolla tuotetun fl-bakteriofagi geeni III-proteiinin sanotaan sekoittavan ulompaa bakteerimembraania, mistä on tuloksena periplas-misten proteiinien vuotaminen solusta.

Zinder et ai. kuvaa edelleen, että heidän vuotavia mutanttejaan voidaan käyttää tuottamaan geenimanipuloituja fuusioproteiineja menetelmällä, jossa haluttua proteiinia koodittava geeni fuusioidaan DNA-sekvenssiin, joka koodittaa johtajaa, joka pystyy kuljettamaan proteiinin periplasmatilaan. Zinder et ai., ei kuitenkaan esitä kuinka tällaisia fuusioita voitaisiin suorittaa, eikä esimerkkiä sen osoiottamiseksi, että menetelmä voisi todella toimia oletetulla tavalla. Kaikki mitä itse asiassa esitetään on, että mutanttien luonnollinen /3-laktamaasi vuoti soluista ympäröivään väliaineeseen.

Koska virheellinen ketjun laskoutuminen ja proteiinin denaturoituminen liittyvät sytoplasman sisällä kypsyviin yhdistelmä-DNA-proteiineihin, eikä niitä yleensä esiinny proteiineilla, jotka viedään solusta ulos, on olemassa tarvetta luotettavalle tavalle tehdä ja käyttää erittäviä E. coli-kantoia.

Keksinnön yhteenveto

« I I

Tämä keksintö aikaansaa E. coli-bakteereita, jotka voivat erit-tää kasvatusväliaineeseen biologisesti aktiivisia heterologisia • · · geenituotteita, käsittäen: • · 104499 6 -taa haluttua heterologista proteiinia, joka bakteeri kykenee ekspressöimään molempia DNA-sekvenssejä.

Edelleen tämä keksintö aikaansaa menetelmiä haluttujen hetero-logisten proteiinien tuottamiseksi, käsittäen: (a) E· coli-bakteerin kasvattamisen, joka bakteeri pystyy erittämään kasvatusväliaineeseen biologisesti aktiivisia heterolo-gisia proteiineja, käsittäen: (i) E. coli-bakteerin. jolle on tunnusomaista resistenssi bakteriofagi T7-infektiolle ja kyky erittää kasvatusväliaineeseen oleellisia määriä periplasmisia proteiineja, ja (ii) yhdistelmä-DNA-vektorin, joka sisältää ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka koodittaa signaalipeptidiä, joka voi välittää proteiinin kuljetuksen periplasmiseen tilaan, ja joka on toimintakykyisestä liittynyt toiseen DNA-sekvenssiin, joka koodittaa haluttua heterologista proteiinia, olosuhteissa, joissa bakteeri ekspressöi DNA-sekvenssejä ja erittää kasvatusväliaineeseen heterologista proteiinia; ja (b) eritetyn proteiinin eristämisen kasvatusväliaineesta.

• ·

Yhä edelleen tämä keksintö aikaansaa tapoja tehdä ja tunnistaa E. coli-bakteereita, jotka voivat erittää kasvatusväliaineeseen :\j biologisesti aktiivisia heterologisia geenituotteita, käsit- täen: .·. : (a) E. coli-bakteerien alistamisen riittävälle määrälle muta- • · · ~ ' ’ * geenistä ainetta mutaatiomuutosten tuottamiseksi bakteerien DNA:ssa; (b) vaiheessa (a) tuotettujen mutanttien kloonien valinnan resistenssin suhteen bakteriofagi T7-infektiota vastaan ja 7 104499 kyvyllä erittää kasvatusväliaineeseen oleellisia määriä peri--plasmisia proteiineja; (c) 1 tai usean vaiheessa (b) valitun kloonin transformoinnin yhdistelmä-DNA-vektorilla, joka sisältää ensimmäisen DNA-sek-venssin, joka koodittaa signaalipeptidiä, joka voi välittää proteiinin kuljetuksen periplasmiseen tilaan, ja joka on toi-mintakykyisesti liittynyt toiseen DNA-sekvenssiin, joka koodittaa haluttua heterologista proteiinia, joka yhdistelmä-DNA-vektori voi ohjata molemman DNA-sekvenssin ekspressiota bakteereissa; ja (d) transformoitujen kloonien analysoimisen määrittämään kloonit, jotka erittävät kasvatusväliaineeseen oleellisia määriä heterologista proteiinia.

Edullisessa suoritusmuodossa transformoitujen kloonien analyysi suoritetaan mewnetelmällä, joka käsittää: (a) ensimmäisen nitroselluloosamembraanin saattamisen kontaktiin transformoitujen bakteerien dispergoidun viljelmän kanssa, olosuhteissa, joissa osa viljelmässä olevista kolonioista siirtyy membraanin yhdelle puolelle; (b) saatetaan vaiheen (a) ensimmäisen membraanin toinen puoli kontaktiin toisen nitroselluloosamembraanin kanssa, joka on 1 kontaktissa kasvatusväliaineen kanssa, tuottaen membraaniko- • · · koonpanon; • · • r :/·ί (c) membraanikokoonpanon inkuboinnin olosuhteissa, joissa siir- rettyjen bakteerien erittämä biologisesti aktiivinen proteiini kulkeutuu ensimmäisen membraanin läpi toiseen membraaniin; • · ♦ • ♦· • · (d) membraanien erottamisen ja vaiheen (c) toisen membraanin t i ' saattamisen kontaktiin ensimmäisen vasta-aineen kanssa, joka on proteiinille spesifinen, olosuhteissa, joissa muodostuu spesi-

• I I

fisiä vasta-aine/proteiini-komplekseja; • * • i · « · * , 104499

O

(e) vaiheen (d) toisen membraanin pesemisen sitoutumattomien "materiaalien poistamiseksi; (f) pestyn membraanin säätämisen kontaktiin leimatun toisen vasta-aineen kanssa, joka on ensimmäiselle vasta-aineelle spesifinen, olosuhteissa, joissa tapahtuu näkyvä reaktio kun memb-raanilla on läsnä ensimmäinen vasta-aine/proteiini-komplekseja, näkyvien keskusten tuottamiseksi; ja näkyvien keskusten asettamisen vierekkäin viljelmässä olevien bakteerikolonioiden kanssa, tunnistaen siten bakteerit, jotka voivat erittää kasvatusväliaineeseen oleellisia proteiinimää-riä.

Edullisesti ensimmäinen vasta-aine sitoutuu spesifisesti biologisesti aktiiviseen proteiiniin, muttei proteiinin denaturoituihin (ts., väärin laskostuneisiin) muotoihin.

Kuvien lyhyt kuvaus Tämä keksintö voidaan ymmärtää helpommin oheisten kuvien avulla, joissa:

Kuva 1 on valokuva analyyttisestä mikroselluloosamembraanista, jossa näkyy näkyviä keskuksia, joissa oli läsnä erittynyttä » »« < ;·. interleukiini-4:ää. Interleukiini-4 visualisoitiin käsittele- t i · mällä ensin membraani monenarvoisella antiseerumilla, joka on • · · proteiinille spesifinen, ja sitten leimatulla antiseerumilla, • · . , joka on spesifistä anti-interleukiini-4-antiseerumille. Nuolen- I 4 » pää osaoittaa erityisen intensiiviseen pisteeseen, joka edustaa V 1 erittävää koloniaa, joka valittiin kloonaukseen ja edelleen arviointiin.

• · • 9 · » · · • · : i Kuva 2 on kaavamainen esitys plasmidi pRGT857-ll:n konstruk tiosta.

• Ill 1 I I

« « · 9 104499

Keksinnön kuvaus

Useita yhdistelmä-DNA-teknologian menetelmiä, joita ammattimiehet rutiininomaisesti käyttävät, ovat kuvanneet Cohen et ai. [US-patenttijulkaisu 4237224], Collins et ai. [US-patenttijulkaisu 4304863] ja Maniatis et ai. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory]. Nämä ja kaikki muut tässä mainitut viitteet liitetään täten tähän viitteeksi.

Tämä keksintö perustuu hämmästyttävään keksintöön, että E. coli voidaan modifioida erittämään heterologisia proteiineja suoraan kasvatusväliaineeseen. Tässä käytettäessä käsite "heterologiset proteiinit" tarkoittaa proteiineja, joita E. coli ei tavallisesti valmista, kuten nisäkäsproteiineja. Tästä keksinnöstä johtuen tavallinen poistuu solujen rikkomisen ja/tai detergen-teillä tai kaotrooppisilla aineilla uuttamisen vaatimus hetero-logisten proteiinien eristämisessä.

Tämä tulos on saavutettu 2 pääasiallisella kehityksellä. Ensiksikin, yhdistelmä-DNA-metodologiaa on sovellettu tuottamaan haluttuja heterologisia proteiineja, jotka on fuusioitu signaa-lipeptideihin, jotka voivat välittää proteiinin kuljetuksen periplasmiseen tilaan tai sen ulkopuolelle. Toiseksi, baktee- ( , rien membraaneja on modifioitu mutaatiomuutoksilla bakteeri- DNA:ssa proteiinien läpäistävissä oleviksi.

• · » · » • · · • ·

Erittäviä bakteereja ja keksinnön mukaisia menetelmiä käyttä-,·, ; mällä tuotetut proteiinit ovat täysin biologisesti aktiivisia, « I* !..* ja niiden uskotaan olevan oikein laskostetussa konformaatiossa.

« · < • · c ’ Sen vuoksi jäävät pois manipulaatiot, joita yleensä vaaditaan biologisesti aktiivisten yhdistelmä-DNA-proteiinien saamiseksi *· *! E. colista tekniikan tason menetelmiä käyttämällä.

• * • i t , ·; Keksinnön mukaisesti voidaan käyttää laajaa joukkoa E. coli-

« < < I

kantoja, mukaan lukien ei-rajoittavasti C600, W3110, AB1157, P678, C511, HB101, MM294, JM83 ja TBl. Alla olevassa esimer- • • « « a » · i l0 104499 kissa muutettiin kaupallisesti saatavissa oleva kanta MM294 ennen mutageneesiä streptomysiiniresistentiksi kannaksi, jota merkitään 294S, täysin keksinnöstä riippumattomista syistä. Sijalla olisi kuitenkin voitu käyttää kantaa MM294 tai useita saatavilla olevista £. coli-kannoista.

Bakteerien mutaatio voidaan suorittaa millä hyvänsä tekniikan tasolla tunnetuista vakiomenetelmistä. Alla olevassa esimerkissä mutageenisenä aineena käytettiin ultraviolettivaloa, mutta yhtä hyvin voidaan käyttää kemiallisia aineita. Esimerkiksi N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosoguanidiiniä voidaan käyttää tavalla, jonka on kuvannut Lopes fit al·.· # yllä, tai Lazzaroni et ai., yllä.

Tämän keksinnön mukaisesti käytettäville E. coli-mutanteille on tunnusomaista 2 oleellista kriteeriä — resistenssi bakteriofagi T7-infektiota vastaan ja kyky erittää oleellisia määriä periplasmista proteiinia kasvatusväliaineeseen, jossa mutant-teja kasvatetaan. T7-intektioresistenssianalyysi voidaan suorittaa mukavasti tavalla, jonka on kuvannut Branes et ai. [J. Bacteriol. 154 (1983) 1462] joka tapa kuvataan alla.

Analyysi lisääntyneestä permeabiliteetistä periplasmisia proteiineja kohtaan voidaan suorittaa käyttämällä merkkiaineena tunnettuja periplasmisia proteiineja ja sopivalla helposti ;Y: visualisoitavalla määrityksellä valittua proteiinia kohtaan.

• · ....j Alla olevassa esimerkissä ribonukleaasi I-eritys periplasmasta .·. : havaittiin tarkkailemalla eritetyn entsyymin kykyä tuottaa • · · .·;·! "halo” eli kirkas vyöhyke hiiva-RNA:ta tuottavassa agarissa.

Jos käytetään ampisilliiniresistenttiä E. coli-kantaa, voidaan määritys eritettyä /3-laktamaasia varten suorittaa tavalla, • « * ** jonka on kuvannut Zinder et _al., yllä, ja vastaavilla.

• · · • · · ··· Tämän keksinnön mukaisilla menetelmillä voidaan tuottaa lukui- .···. siä heterologisia proteiineja. Vaikka alla käytetään keksinnön kuvaamiseen humaani-interleukiini-4:ää, voidaan periaatteessa : *’ tehdä mikä hyvänsä proteiini, jota varten voidaan saada pro- n 104499 teiinia koodittava DNA-sekvenssi. Tällaisia DNA-sekvenssejä Λ voidaan tehdä helposti esimerkiksi soveltamalla vakiokloonaus-menetelmiä cDNArn tekemiseksi mRNArsta, joka on eristetty soluista, joiden tiedetään tuottavan proteiinia. Voidaan testata tällaisesta cDNA:sta muodostettuja kirjastoja ja koettaa vakio-menetelmiä käyttämällä.

Tosi asiassa, humaani-GM-CSF ja liukoinen gamma-interferonire-septori on myös tuotettu keksinnön mukaisia erittäviä kantoja käyttämällä. Molemmilla oli suuri biologisesn aktiivisuuden taso.

Vaadittavan metodologian on kuvanneet esimerkiksi Okayama et ai. [Mol. Cell. Biol. 2 (1982) 161? Meth. Enzymol. _154 (1987) 3], Margolskee et ai. [Mol. Cell. Biol, ji (1988) 2837] ja Gubler et ai. [Gene 25 (1983) 263]. cDNA-kloonausmenetelmiä koskevaa katsausta varten katso Kimmel et ai., Meth. Enzymol. 152 (1987) 307. Geenien valmistukseen voidaan myös käyttää kemiallisia vakiotekniikkoja, jos geenien nukleotidisekvenssit ovat tunnetut.

E_. colin sytoplasmassa syntetisoidut proteiinit on fuusioitava signaalipeptidiin aminoterminaalisessa päässä periplasmaan · kuljetusta varten. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää useita :\ E. colin periplasma- tai ulkomembrraaniproteiinien tunnetuista .V. signaalipeptideistä. Esimerkiksi Talmadge et ai., Proc. Natl.

m\m\ Acad. Sei. USA 77. (1980) 3369] on kuvannut nimellä pKT287 • · . . kuvatun vektorin konstruoimisen, joka sisältää pBR322:n bla- geenin. Ensimmäiset 23 bla:n koodittamaa aminohappoa käsittävät • · · *·’ * /3-laktamaasisignaalisekvenssin. Jos geeni insertoidaan lukuvaiheeseen pKT287:n Pst I-kohtaan, muodostuu ekspression aikana • · *.**: fuusioproteiinia, joka sisältää signaalipeptidin. Plasmidi • « · · pKT287 kuvataan käsikitjassas Maniatis et ai., yllä, sivu 428.

• · · *!!! Samalla lailla Silhavy on valmistanut plasmidin, jota merkitään pMH621, ja joka sisältää geenin, joka koodittaa E. coli ompF-: ’·· signaalipeptisiä (Maniatis et ai., yllä, s. 429-430). Haluttua φ « ♦ · · 12 104499 proteiinia koodattavan heterologisen DNA-sekvenssin insertio pMH621:n Bglll-kohtaan tuottaa fuusioproteiinin, joka sisältää ompF-signaalipeptidin. Alla olevassa esimerkissä käytettiin toista omp-signaalipeptidiä, ompA-peptidiä.

OMpA ja ompF ovat E. Colin ulkomembraaniproteiinin signaalipep-tidejä. Näiden signaalipeptidien aminohappoosekvenssit on kuvannut Politt et ai. teoksessa Bacterial Outer Membranes as Model Systems, 1987, M. Inouye (toimittaja), John Wiley & Sons, New York, s. 117-139. Watson [Nucleic Acids Res. 12 (1984) 12] on esittänyt, että nyt tunnetaan primääriset rakenteet yli 277 prokarioottisesta ja eukarioottisesta signaalisekvenssistä. Oligonukleotidit, joilla on sellaiset prokarioottiset signaali-sekvenssit, voidaan syntetisoida kemiallisesti käytettäviksi tässä keksinnössä käyttäen fosfotriesteriä tai muita tunnettuja menetelmiä, edullisesti kiintofaasijärjestelmässä, ja insertoi-da sopivaan ekspressiovektoriin.

Vaikka bakteriaaliset signaalipeptidit poikkeavat aminohappo- sekvensseiltään, niillä on ilmeisesti 3 yleistä aluetta. Amino- terminaalisessa päässä on useiden hydrofiilisten tähteiden alue, joka sisältää 1 tai useita lysiini- tai arginiinitähtei- tä. Tämän emäksisen alueen jälkeen on keskustan hydrofobinen ydin, joka sisältää noin 8-15 hydrofobista tähdettä, jossa vallitsevia ovat Leu, Ala ja Vai. Hydrofobisesta alueesta kar- boksyyliterminaaliseen päähän on alue, joka lohkaistaan käsit- telyn aikana kypsän proteiinin tuottamiseksi periplasmassa tai . ulkomembraanissa. Lohkaisu tapauhtuu tavallisesti kohdassa noin • · * 4-8 tähdettä hydrofobisesta alueesta.

• · · • · ·

Alla olevassa esimerkissä ompA-signaalipeptidin lohkaisu on • « sellainen, että tuotetaan proteiini, jolla on kypsän humaani- • · · V '· interleukiini-4 :n täysi aminohapposekvenssi ilman vierasta aminoterminaalista Met-tähdettä, joka usein lisätään proteiineihin sytoplasmaekspression aikana E. colissa.

13 104499 DNA-sekvenssit, jotka koodittavat E. coli-sianaalipeptidiä ja haluttua heterologista proteiinia, voidaan liittää toimintaky-kyisesti lukuvaiheistukseen useisiin tunnettuihin vektoreihin, jotka pystyvät autonomiseen replikaatioon ja ekspressioon E. colissa, mukaan lukien ei-rajoittavasti pBR322, pUC8, pUC9, pUC19, pAH3, pKGT269-2 ja pRGT857-ll. Nämä 2 DNA-sekvenssiä voidaan sitoa yhteen ja insertoida vektoriin, tai voidaan ensin valmistaa vektori, joka sisältää sekvenssin, joka koodittaa signaalipeptidiä. Mikä hyvänsä heterologinen DNA-sekvenssi voidaan sitten insertoida signaalipeptidikohtaan halutun fuu-siosekvenssin tuottamiseksi. Edullisesti valmistetaan 3 vektoria, jotka koodittavat signaalipeptidiä niin, että mikä hyvänsä määrätty insertoitu heterologinen geeni on oikeassa luku-vaiheistuksessa yhdessä näistä.

Voi myös olla mahdollista käyttää heterologisen geenin luonnollista nukleotidisekvenssiä signaalipeptidin koodittamiseen. Esimerkiksi Talmadge et ai. [Nature 294 (1981) 176] on kuvannut, että normaalisti proinsuliiniin liittyvä signaalisekvenssi toimii myös J3. colissa proinsuliinin erittymisen sallimiseksi.

Keksinnön mukaisesti käytetyt yhdistelmä-DNA-vektorit ovat edullisesti säädeltävissä olevan promoottori/operaattori (po)-järjestelmän kontrollin alaisia, kuten hyvin tunnetun trp-, lac- tai lamdapL-promoottorin. Tekniikan tasolla tunnetaan useita po-järjestelmiä, jotka ovat termisesti herkkien repres- • » * sorien kontrollin alaisia; inkubointilämpötilan kohottaminen • · . , vapauttaa repression ja sallii kontrolloidun ekspression. Muita * · · *·voidaan kontrolloida kemiallisilla induktoreilla [esimerkiksi • M fc • · · *·* ‘ indolyylietikkahappo (trp) ja isopropyyli-/3-D-tiogalaktosidi (IPTG, lac)].

• « • · · • · · • ·

Vaikka keksinnön kuvaamiseksi alla kuvataan erityisiä yhdis-telmä-DNA-plasmideja, on korostettava, että ne ovat ainoastaan edustavia useista yhdistelmä-DNA-plasmideista, joita voitaisiin

I I

käyttää sijalla.

14 104499

Konstruktion jälkeen yhdistelmä-DNA-vektorit voidaan transformoida mutanttibakteereihin vakiomenetelmillä (katso Maniatis g£_ ai., yllä, s. 250), ja transformantit voidaan kloonata sopivassa väliaineessa.

Sen määrittäminen, erittääkö määrätty transformanttiklooni biologisesti aktiivista proteiinia, voidaan tehdä vakio immuno-kemiallisia tai biomääritysmenetelmiä käyttämällä. Tasaeriä kasvatusväliaineesta, johon lymfokiiniä kuten interleukiini-2 tai interleukiini-4 on erittynyt, voidaan määrittää T-solun kasvuaktiivisuuden suhteen tavalla, jonka on kuvannut esimerkiksi Devos et ai. [Nucleic Acids Res. 11 (1983) 4307]. Tällaisten määritysten loppupisteet voivat olla radioisotooppisia tai kolorimetrisiä mittauksia [Mosmann, J. Immunol. Meth. 65 (1983) 55]. Interferonibiomääritykset voidaan suorittaa kuvatulla tavalla, esimerkiksi DeChiara et ai. (US-patenttijulkaisu 4816566), va vastaavilla.

Nopeampi erittävien kloonien seulonta voidaan suorittaa iiranuno-saostuksella tai ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)-määrityksellä. Vasta-aineita haluttua proteiinia vastaan voidaan valmistaa vakiomenetelmiä käyttämällä. Edullisia ovat monoklonaaliset vasta-aineet, jotka voidaan valmistaa helposti tavalla, jonka ovat kuvanneet Kohler ja Milstein [Nature ,25ϋ (1975) 495; Eur. J. Immunol. jL (1976) 511].

• « *.v Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistuksessa haluttua pro- teiinia käytetään immunisoimaan eläimiä, kuten hiiriä, rottia, • · '·/·· hevosia, lampaita, porsaita, kaneja ja vastaavia, jotta saatai-siin vasta-ainetta tuottavia somaattisia soluja myeloomasolui-hin fuusioitavaksi.

• · • · · • · ·

Somaattiset solut, joilla on potentiaalia tuottaa vasta-ainei- • · · ta, erityisesti B-solut, ovat sopivia myeloomasolulinjan kanssa I I I * fuusioitaviksi. Nämä somaattiset solut voivat olla peräisin alsuettujen eläinten imusolmukkeista, pernoista ja ääreisveres-tä. Tämän keksinnön esimerkinomaisessa suoritusmuodossa käyte- • · · is 104499

Jtään rotan pernasoluja, osaksi koska nämä solut tuottavat suhteellisen suuren %-osuuden stabiileja fuusioita hiiren myeloo-malinjojen kanssa. Olisi kuitenkin mahdollista käyttää tilalla hiiri-, kani-, sammakko- tai muita soluja.

Lymfosyyttisistä kasvaimista on kehitetty spesialisoituneita myeloomasoluja käytettäväksi hybridoomaa tuottavissa fuusiopro-seduureissa [Kohler ja Milstein, Eur. J. Immunol. 6 (1976) 511; Shulman et ai., Nature 276 (1978) 269; Volk et ai., J. Virol.

42 (1982) 220]. Nämä solulinjat on kehitetty ainakin 3 syystä. Ensimmäinen on helpottaa fuusioitujen hybridoomien valintaa fuusioimattomista ja samalla lailla epämääräisen ajan lisääntyvistä myeloomasoluista. Tavallisesti tämä toteutetaan käyttämällä myoloomia, joilla on entsyymipuutteita, jotka tekevät ne kykenemättömiksi kasvamaan määrätyissä sekeltiivisissä väliaineissa, jotka ylläpitävät hybridoomien kasvua. Toinen syy syntyy lymfosyyttisten kasvainsolujen myötäsyntyisestä kyvystä tuottaa omia vasta-aineitaan. Monoklonaalisten tekniikkojen käytön tarkoitus on saada fuusioituja hybridisolulinjoja, joilla on rajoittamattomat elinkaaret, ja jotka tuottavat haluttua yksittäistä vasta-ainetta hybridooman somattisen solukomponen-tin geneettisen kontrollinen alaisena. Jotta vältettäisiin kasvainsoluvasta-aineiden muodostuminen hybridoomilla, käytetään myeloomasolulinjoja, jotka ovat kykenemättömiä tuottamaan

• I

keveitä tai raskaita immunoglubuliiniketjuja, tai joilta puut- :V: tuu vasta-aineeneritysmekanismit. Kolmas syy näiden solulinjo- ·;··; jen valintaan on niiden sopivuus ja tehokkuus fuusiota varten.

• · 4 t » • · o • «

Useita myeloomasolulinjoja voidaan käyttää fuusioitujen solu- 4 · » hybridien tuottamiseen, mukaan lukien esimerkiksi P3X63-Ag8, P3/NSl-Ag4-l, Sp2/0-Agl4 ja S194/5.XXO.Bu.1. P3X63-Ag8- ja P3/NSl-Ag4-l-solulinjat on kuvattu julkaisussa: Kohler ja • * · *·[ Milstein; Eur. J. Immunol. JL(1976) 511. Shulman et ai. [Nature ..;i‘ 276 (1978) 269] kehitti Sp2/0-Ag-14-solulinjan. S194/5.XXO.-

Bu.l-linjan on kuvannut Trowbridge [J. Exp. Med. 148 (1979) • 9 » ..j 313]. Tämän keksinnön esimerkissä käytettiin P3X63-Ag8.653- " linjaa (ATCC CRL 1580).

• · * ie 104499 «

Menetelmiin vasta-aineita tuottavien perna- tai imusolmukesolu-jen ja myeloomasolujen hybridien muodostamiseksi liittyy tavallisesti somaattisten solujen sekoittaminen myeloomasolujen kanssa 10:1-suhteessa (vaikka suhde voi vaihdella noin 20:l:stä noin l:l:een), vastaavasti, aineen tai aineiden (kemiallisten, viraalisten tai sähköisten) läsnä ollessa, jotka edistävät solumembraanien fuusiota. Fuusiomenetelmiä ovat kuvanneet Kohler ja Milstein, yllä, Gefter et ai. [Somatic Cell Genet.

(1977) 231] ja Volk et ai. (J. Virol. 42_ (1982) 220]. Fuusiota edistävät aineet, joita nämä tutkijat käyttivät, olivat Sendai-virus ja polyetyleeniglykoli (PEG). Tämän keksinnön esimerkin fuusioproseduurissa käytetään PEG:tä.

Koska fuusioproseduurit tuottavat eläviä hybridejä hyvin alhaisella taajuudella (esimerkiksi kun pernoja käytetään somaattisten solujen lähteenä, vain 1 hybridi saadaan karkeasti ottaen- jokaista 1 x 10^ pernasolua kohden), on välttämätöntä, että on keino fuusioituneiden soluhybridien valintaan jäljelle jäävistä fuusioimattomista soluista, erityisesti fuusioimat-tomista myeloomasoluista. On myös välttämätöntä, että on keino haluttujen vasta-ainetta tuottavien hybridoomien tunnistamiseen tuloksena olevista muista fuusioiduista soluhybrideistä.

* i «

♦ M

f*·,. Yleensä fuusioitujen soluhybridien valinta suoritetaan kasvat- • .y. tamalla soluja väliaineissa, jotka ylläpitävät hybridoomien ,...· kasvua, mutta estävät fuusioimattomien myeloomasolujen kasvun, • · . jotka normaalisti jatkaisivat jakautumista määräämättömän ajan. Fuusiossa käytetyt somaattiset solut eivät ylläpidä pitkäai- I I * *·* ’ kaista elinkykyä in vitro-kasvatuksessä, eivätkä siten ole ongelma. Tämän keksinnön esimerkissä käytettiin myeloomasoluja, • · ·.**: joilta puuttuu hypoksantiinifosforibosyylitransferääsi (HPRT- • · · *.* '· negatiivinen). Valinta näitä soluja vastaan suoritetaan hypok-santiini/aminopteriini/tymidiini (HAT)-väliaineessa, väliai-,···, neessa, jossa fuusioidut soluhybridit jäävät eloon johtuen t 1 pernasolujen HPRT-positiivisesta genotyypistä. On myös mahdol- • * i '·' lista käyttää erilaisia geneettisiä puutteita (lääkeherkkyyksiä

» I 1 « I I

17 104499 ja vastaavia) omaavia myeloomasoluja, jotka voidaan valita väliaineita vastaan, jotka ylläpitävät genotyyppisesti kompetenttien hybridien kasvua.

Fuusioitujen soluhybridien selektiiviseen kasvatukseen vaaditaan useita viikkoja. Varhaisessa vaiheessa tämän ajanjakson aikana on välttämätöntä tunnistaa ne hybridit, jotka tuottavat haluttua vasta-ainetta niin, että ne voidaan seuraavaksi kloonata ja kasvattaa. Yleensä suunnilleen 10 % saaduista hybrideistä tuottaa haluttua vasta-ainetta, vaikka alue noin 1 -noin 30 % ei ole epätavallinen. Vasta-ainetta tuottavien hybridien havaitseminen voidaan toteuttaa millä hyvänsä useista vakiomääritysmenetelmistä, mukaan lukien "ELISA" (enzyme-linked immunoassay)- ja radioimmunomääritystekniikoilla, jotka on kuvattu kirjallisuudessa [katso esimerkiksi Kennet et aj,. (toimittajat), Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, s. 376-384, Plenum Press, New York (1980)].

Kun halutut fuusioidut soluhybridit kerran on valittu ja kloonattu yksittäisiin vasta-ainetta tuottayiin solulinjoihin, jokainen solulinja voidaan lisätä kummalla hyvänsä 2 vakiota-vasta. Hybridoomasolujen suspensio voidaan injisoida kudokseltaan yhteensopivaan (histocompatible) eläimeen. Sitten inji-soitu eläin kehittää kasvaimia, jotka erittävät fuusioidun soluhybridin tuottamaa spesifistä monoklonaalista vasta-ainet-:V: ta. Eläimen kehonesteet, kuten seerumi tai vatsaonteloneste voidaan laskea pois jotta saataisiin vasta-aineita suuressa : konsentraatiossa. Vaihtoehtoisesti yksittäisiä solulinjoja • · voidaan kasvattaa in vitro laboratoriokasvatusastioissa. Kas- II» vatusväliaine, joka sisältää suuria konsentraatioita yhtä ai-. . noaa spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta, voidaan kerätä • I i / dekantoimalla, suodattamalla tai sentrifugoimalla.

Edullisesti käytetään monoklonaalisia vasta-aineita, jotka sitoutuvat spesifisesti halutun proteiinin oikein laskostunee-seen, biologisesti aktiiviseen muotoon muttei proteiinin dena-

• I

104499 18 turoituneisiin muotoihin. Tällaisia vasta-aineita voidaan saada 'tuottamalla suuri joukko hybridoomaklooneja, jotka erittävät vasta-aineita proteiinia vastaan, ja seulomalla sitten hybri-doomien väliaineet sekä aktiivisella että denaturoidulla proteiinilla, jotta löydettäisiin haluttuja vasta-aineita tuottavat hybridoomat. Proteiinin inaktiivinen muoto voidaan valmistaa helposti käsittelemällä proteiinin näyte natriumdodekyy-lisulfaatilla (SDS) proteiinin denaturoimiseksi.

Vain aktiivisen proteiinin tunnistavien vasta-aineiden käyttö poistaa enemmän aikaa vievien määritysten biomääritysten tarpeen. Vasta-aineita, joilta puuttuu sellainen spesifisyys, voidaan kuitenkin käyttää nopeaan seulontaan. Klooneista, joiden havaitaan olevan positiivisia tällaisessa seulonnassa, voidaan sitten määrittää bioaktiivisuus.

Edullisessa suoritusmuodossa erittävän kloonin seulonta suoritetaan nitroselluloosakokoonpanoa käyttämällä. Ensimmäinen nitroselluloosamembraani saatetaan kontaktiin transformanttien dispergoidun viljelmän pinnan kanssa. Tämä membraani, jolle osa viljelmässä olevista kolonioista siirtyy kontaktista johtuen, sijoitetaan sitten suoraan toisen nitroselluloosamembraanin päällä kontaktiin kasvatusväliaineen kanssa membraanikokoon-panon muodostamiseksi. Sitten kokoonpanoa inkuboidaan kasvatus-väliaineella olosuhteissa, joissa siirrettyjen mitanttibaktee-risolujen erittämä heterologinen proteiini kulkee ensimmäisen I·,.' membraanin läpi ja toiseen membraaniin. Membraanit erotetaan • ♦ · inkuboinnin jälkeen, ja toisella membraanilla oleva proteiini . . havainnoidaan käyttämällä spesifisiä vasta-aineita, jotka si- • · ♦ toutuvat proteiiniin vasta-aine/proteiini-komplekseja muodos-*·1 1 taen.

• « !.1·· Sen jälkeen kun toinen membraani pestään sitoutumattomien mate-riaalien poistamiseksi, proteiini/vasta-aine-kompleksit havaita käyttämällä leimattuja toisia vasta-aineita, jotka on suunnattu membraanilla olevia ensimmäisiä vasta-aineita vastaan. Esimer- • · kiksi jos proteiinille spesifiset vasta-aineet ovat hiiren mo- • I · 19 104499 noklonaalisia vasta-aineita, käytetään leimattuja anti-hiiri-“immunoglobuliinivasta-aineita. Nämä toiset vasta-aineet voidaan leimata yhdisteellä, joka fluoresoi erityisellä aallonpituudella, kuten rodamiini, tai edullisesti, entsyymillä, joka katalysoi näkyvää kemiallista reaktiota. Erilaiset peroksidaasit, glukoosioksidaasi, /3-galaktosidaasi ja alkalinen fosfataasi ovat entsyymejä, joita voidaan käyttää tähän tarkoitukseen. Käyttämällä leimattuja toisia vasta-aineita ilmenee näkyviä kohtia, joissa erittynyt proteiini on läsnä membraanilla.

Edustava membraani, joka sisältää sellaisia kohtia, esitetään kuvassa 1, jossa nuolenpää osoittaa intensiivisempää pistettä, joka edustaa edelleen arviointia varten valittua koloniaa.

Kun sitoutuneen proteiinin asemat toisella membraanilla on tehty näkyviksi, viljelmä ja toinen membraani asetetaan vierekkäin niin, että näkyvät kohdat ovat päällekkäin proteiinia erittävien transformanttikolonioiden kanssa. Näin tunnistetut erittävät koloniat poistetaan sitten viljelmästä ja alaviljel-lään sitten sopivassa kasvatusväliaineessa tai fermentointilie-messä.

Joissain tapauksissa voi membraanikokoonpanossa olla toivottavaa käyttää kolmatta nitroselluloosamembraania. Tämä memb-raani sijoitetaan toisen membraanin ja kasvatusväliaineen vä-.··. liin niin, että siirrettyjen kolonioiden erittämä proteiini kulkee edellä mainitun inkuboinnin aikana sekä toiseen että • · · • · · * kolmanteen membraaniin. Proteiinikohtien immunokemiallinen ] j havaitseminen kolmannella membraanilla yllä kuvatulla tavalla, « · » *· '·' minkä jälkeen seuraa membraanien erottaminen, toimii varmis- • · · * taen, että mitkään toisella membraanilla havaitut negatiiviset reaktiot eivät ole vääriä negatiivisia. Edullisesti toisen : membraanin analyysissä käytetyt ensimmäiset vasta-aineet ovat :T: spesifisiä vain proteiinin biologisesti aktiiviselle, oikein laskostuneelle muodolle, kun taas kolmannella membraanilla “li käytetyt ensimmäiset vasta-aineet sitoutuvat kumpaan hyvänsä 1

• · I

« · 20 104499 proteiinimuotoon riippumatta siitä, oliko se denaturoitunutta vai ei.

Koska alistus mutageeniselle aineelle on saattanut aiheuttaa ekspressioplasmidissa samoin kuin bakteeri-DNAsssa mutaatiomuu-toksia, on edullista "parantaa" valitut kloonit poistamalla niistä ensin plasmidit ja'korvaamalla ne sellaisilla, joita ei ole koskaan alistettu mutageeniselle aineelle. Tämä parantaminen voidaan toteuttaa helposti vakiomenetelmiä käyttämällä.

Plasmidi voidaan poistaa esimerkiksi kasvattamalla soluja ak-ridiinioranssin läsnä ollessa, kuten kuvaa Watanabe et ai. [J. Bacteriol. jH. (1961) 679]. Toinen menetelmä on yksinkertaisesti kasvattaa soluja transformanttien eristämiseen käytetyn valin-tamerkkiaineen puuttuessa. Alla olevassa esimerkissä transformoidut solut kykenivät kasvamaan ampisilliinin läsnä ollessa vain koska plasmidi ohjasi antibioottia hajottavan entsyymin ekspressiota. Ampisilliinin ollessa läsnä kasvatusväliaineessa oli valitsevaa painetta muuten herkkiin isäntäsoluihin plas-midin säilyttämiseksi; ilman ampisilliinia plasmidi oli tarpeeton solun eloon jäämiselle, ja menetettiin siten spontaanisti.

Vaikka alla kuvataan keksinnön kuvaamiseksi yksityiskohtaisesti ;·' vain harvoja JS. colin erittäviä klooneja, tuottavat käytetyt menetelmät rutiininomaisesti olennaisia lukumääriä käyttökel- * *. poisia erittäviä mutantteja. Noin 10iJ· mutageeniselle aineelle alistetusta solusta muodostuu noin 300 - 500 koloniaa, jotka • * · ’· jäävät eloon T7-infektiosta. Näistä resistenteistä kolonioista V * noin 1/3 - 1/2 erittää myös kasvatusväliaineeseen oleellisia periplasmisten proteiinien määriä.

• ♦ • · » • ·· • ·

Keksinnön mukaiset erittävät kannat arvioidaan edullisesti edelleen varmistamaan, että ne ovat stabiileja pitkitetylle kasvatukselle eivätkä haluttua heterologista proteiinia ylei- ♦ « sestä soluhajoamisesta johtuen.

« < «

« I

• · « • · 21 104499

Jotta varmistettaisiin, että valitut kannat ovat stabiileja, niitä kasvatetaan edullisesti aliviljelmissä sukupolvien joukon ajan ja tarkkaillaan hajoamisten todisteiden, kuten spontaanin sulamisen suhteen. Todiste siitä, ettei haluttu heterologinen proteiini ilmene kasvatusväliaineeseen siitä johtuen, että solut yksinkertaisesti hajoavat, saadaan edullisesti analysoimalla väliaine edustavan E. coli-sytoplasmaproteiinin läsnäolon suhteen. Jos solut ovat rakenteellisesti eheitä, ei tällaisten proteiinien olennaisia määriä tietenkään pitäisi olla läsnä väliaineessa. Tällainen analyysi voidaan suorittaa mille hyvänsä sytoplasmaproteiinille, jolle sopiva määritys on saatavilla, kuten glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi.

Useissa tapauksissa jopa vielä tehokkaampia erittäviä kantoja voidaan tuottaa alikloonaamalla ja viljelemällä kantoja, jotka on saatu edellä olevilla menetelmillä ja alistamalla solut 1 tai usealle lisämutageneesikierrokselle, kloonaamalla ja valitsemalla.

Tunnistettuja eristäviä E., coli-kantoja kasvatetaan olosuhteissa, joissa sekä ekspressöityvät DNA-sekvenssi, joka koodittaa signaalipeptidiä, että sekvenssi, joka koodittaa haluttua hete-rologista proteiinia. Sitten bakteerisolut erotetaan kasvatus-väliaineesta, ja proteiini eristetään väliaineesta vakiotek-niikkoja käyttämällä. Menetelmiin, joita voidaan käyttää proteiinin eristämiseen, luetaan mukaan esimerkiksi happo- tai < . suolasaostus, ioninvaihtokromatografia, metallikelaattikromato- • · · ** *, grafia, geelisuodatus, HPLC (high performance liquid chromatography) , preparatiivinen kiekkogeeli- tai verhoelektroforeesi, • « · *· ” isoelektrinen fokusointi, fraktiointi orgaanisella liuottimena

IM

V * alhaisessa lämpötilassa, vastavirtadistribuutio ja immunoaffi- niteettikromatografia.

« 9 « » » • · · • *

Keksinnön mukaisia erittäviä kantoja ja menetelmiä käyttämällä * ' saadun heterologisen proteiinin sekä määrä että laatu voi olla ··;· ylivoimainen tekniikan tason menetelmillä käyttämällä saatuihin « 4 verrattuna. Esimerkiksi Lundell et ai. [J. Ind. Microbiol., 104499 22 painossa] on fuusioinut ompA-signaalipeptidiä koodittavan DNA-*sekvenssin humaani-interleukiini-4-geeniin yhdistelmä-DNA-vek-torissa. DNA:n ekspression indusoinnin jälkeen IPTGillä muta-toimattomassa E., coli-kannassa 294 Lundell et ai. havaitsi, että noin 30 - 50 % käsitellystä interleukiini-4:stä erittyi kasvatusväliaineeseen.

Vastakohtana keksinnön mukaisilla mutanttikannoilla erittyy oleellisesti kaikki käsitelty interleukiini-4 väliaineeseen. Lisäksi eritetyn, kasvatusväliaineesta talteen kerätyn interleukiini-4: n seuraava analyysi on osoittanut, että sen fysiko-kemialliset ja biologiset ominaisuudet ovat erilaiset kuin keksinnön mukaisilla menetelmillä valmistetun lymfokiinin.

Ensiksikin, E. coli-kanta 294:stä talteen saadun interleukiini- 4-aktiivisuuden määrä oli paljon pienempi kuin määrä, joka saatiin suunnilleen yhtä suuresta lukumäärästä yhtä keksinnön mukaisista erittävistä kannoista. Toiseksi, hyvin aktiiviselle interleukiini-4:lie spesifinen monoklonaalinen vasta-aine ei tunnustanut Lunde et ai.-järjestelmällä tuotettua interleukiini-4 :ää (katso vasta-aineen 11B4 käyttöä alla). Kolmanneksi, Lundel et ai.-järjestelmän väliaineesta talteen saatu inter-leukiini-4 ei sitoutunut kromatografiakolonneihin, jotka pysyttivät interleukiini-4:ää, jonka keksinnön mukaiset mutantti-E. coli-kannat olivat erittäneet. Ei-mutantti-bakteereiden vapaut- 4 I I | «'·, tämän interleukiini-4:n alhaisempi aktiivisuusmäärä ja erilai-set fysikaaliset ominaisuudet viittaavat siihen, että tämä * · proteiini voi olla ollut erilaisessa, vähemmän aktiivisessa • ♦ • . konformaatiomuodossa.

• · c • · c « « 991 • · «

ESIMERKKI

• · *. 1: Alla olevassa esimerkissä %-osuudet kiinteistä kiinteissä seok-

Ml V : sissa, nesteistä nesteseoksessa, ja kiinteistä nesteseoksissa i ovat paino/paino-, tilavuus/tilavuus- ja paino/tilavuus-pohjal- • 1 « t ,··1, ta, vastaavasti, ellei toisin ilmoiteta. Solukasvatuksen aikana

• r I

• 4 « •

· I

• t 1 104499 23 ylläpidettiin steriilejä olosuhteita. Kaikki optisen tiheyden (O.D.) aallonpituudet ovat yksikössä nm.

Humaani-interleukiini-4:n vastaisten vasta-aineiden valmistus

Koiraspuolinen Lewis-rotta immunisoitiin vatsaontelonsisäisesti (i.p.) 1 mlilla humaani-interleukiini-4-liuosta, joka oli emul-goitu 1 ml:n kanssa täydellistä Freund'n adjuvanttia (CFA). Liuos sisälsi glykosyloitua yhdistelmä-DNA-humaani-interleukii-ni-4:ää, joka oli ekspressöity COS-soluissa, ja jolla oli spesifinen aktiivisuus 2 x 10^ yksikköä/mg, konsentraatiolla 14 pg/ml 10 mM Trsi-HCl:ssä, 0,5 M NaCl, pH 7,4.

2 viikkoa alkuimmunisoinnin jälkeen rotta injisoitiin jälleen i.p. 1 mlilla humaani-interleukiini-4-liuosta, joka oli emul-goitu 1 ml:n kanssa CFA:ta. 3 kuukautta toisen injektion jälkeen rotta sai tehostusannoksen laskimonsisäisesti 1 ml:11a humaani-interleukiini-4-liuosta, joka sisälsi 15 μg proteiinia. 4 päivää tehostusinjektion jälkeen rotta tapettiin, veri kerättiin ja perna poistettiin fuusiota varten.

Pernasolut fuusioitiin hiiri-P3X63-Ag8.653-myeloomasolujen (ATCC CRL 1580) kanssa, 1:1-suhteessa PEG:tä käyttämällä. Solu- suspensio (3,5 x 10® solua/ml) HAT-väliaineessa levitettiin 40 96-kaivoiselle levylle. 10 päivää myöhemmin hybridoomasuper- natanteista testattiin kyky sitoutua humaani-interleukiini- *. . 4:ään, joka oli immobilisoitu suoraan mikrotiitterilevyille • · · (epäsuora ELISA), tai humaani-interleukiini-4:ään, joka oli • · · « · sidottu kani-anti-humaani-interleukiinin-4:n immobilisoituun • · * · · *: polyklonaaliseen IgG-fraktioon. Sitoutunut vasta-aine havain- • · · ·' noitiin peroksidaasikonjugoidulla vuohi-anti-rotta-immunoglobu- liinilla vakiotyöohjeen mukaisesti. Hybridoomat, jotka erit- tivät vasta-aineita, jotka reagoivat interleukiini-4 :n kanssa, kloonattiin rajoittavalla laimennuksella. IC1.11B4.6 oli yksi ", tällainen näillä proseduureilla valittu hybridooma.

·;;; IC1. llB4.6:sta olevien vasta-aineiden (merkitään vasta-aine • ( *·;·' 11B4) määritettiin olevan IgG2a-isotyyppiä, ja sen keksittiin I * • · • · ·

• · I

104499 24 ^olevan biologisesti aktiiviselle humaani-interleukiini-4:lle spesifistä.

Tämä spesifisyys osoitettiin saattamalla monoklonaalisen 11B4-vasta-aineen reagoimaan immunisoivan interleukiini-4:n ja in-terleukiini-4:n kanssa, joka oli alistettu denaturoivalle SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesille tavalla, jonka on kuvannut Laemmli, Nature 227 (1970) 680. Vasta-aine tunnisti vain aiemman interleukiini-4:n, ja lymfokiinin esikäsittely niin vähällä kuin 0,04 %:lla SDS:ää huoneenlämpötilassa 5 min ajan oli riittävä poistamaan tunnistuksen vasta-aineella.

Hybridoomaa varastoitiin -70 °C:ssa kasvatusväliaineessa 10 % DMSO:n (dimetyylisulfoksidin) kanssa, ja kasvatettiin käyttämällä nisäkässolunkasvatusvakiotekniikkaa (RPMI 1640, väliaine, jossa oli 10 % naudan sikiön seerumia, ja joka oli täydennetty 1 mM glutamiinilla ja 50 mM 2-merkaptoetanolilla).

Tuotettiin monenarvoista antiseerumia SDS-denaturoitua yhdis-telmä-DNA-humaani-interleukiini-4:ää vastaan alistamalla lymfokiinin näyte SDS-polyakryyliamidigeel-ielektroforeesille yllä kuvatulla tavalla, leikkaamalla pois vyöhykkeen geelistä, ja immunisoimalla kanin saadulla proteiinilla vakiotekniikkoja käyttäen. Interleukiini-4 oli tuotettu E. coli-ekspressiojärjestelmässä tavalla, jonka on kuvannut Kiiranenade et ai. [Eur.

li] J. Biochem. 173 (1988) 109].

• · • » « *·*·* pRGT857-ll-plasmidin muodostaminen • MU — « «, • f *.**: Humaani-IL-4-ekspressioplasmidien pAH3 ja pKGT269-2 ja plas- r midin pUC 19 (kuva 2) konstruoiminen on kuvattu julkaisuissa Lundell gt ai. [J. Ind. Microbiology, painossa] ja Yanisch-Perron et ai. f Gene 33 (1985) 103].

Plasmidi-DNA:n pienimittakaavainen eristys kylläisistä yli yön viljelmistä suoritettiin proseduurilla, jonka on kuvannut Maniatis et ai., yllä, s. 368. Tämä proseduuri sallii pienen 25 104499 DNA-määrän eristyksen bakteeriviljelmästä analyyttisiin tarkoi- Φ tuksiin. Suutempxa plasmidi-DNA-määrxä valmistettiin tavalla, jonka on kuvannut Maniatis et ai., yllä, s. 90. Spesifiset restriktioentsyymifragmentit, jotka on johdettu plasmidi-DNA:n pilkkomisella, eristettiin preparatiivisella elektroforeesilla 0,8-% agaroosissa. Geelejä ajettiin jännitteellä 150 V 4 tunnin ajan tris-boraatti-puskurissa (Maniatis et ai., yllä, s. 156) ja värjättiin sitten etidiumbromidilla DNA:n visualisoimiseksi. Leikattiin sopivat geelisektiot ja elektroeluoitiin jännitteellä 150 V 60 min ajan. Sitten DNA konsentroitiin saostamalla 2 tilavuudella etanolia.

Restriktioentsyymit, DNA-polymeraasi I (Klenow-fragmentti) ja T4 DNA-ligaasi olivat tuotteita yhtiöstä Biolabs, Beverly, MA, ja menetelmät ja olosuhteet näiden entsyymien käytölle olivat oleellisesti valmistajan menetelmiä ja olosuhteita.

T4 DNA-liittämistä suoritettiin ainakin 24 tunnin ajan 4 ®C:ssa. Yksisäikeisten DNA-päiden Klenow-tylppäpäistäminen suoritettiin puskurissa, joka sisälsi 10 mM Tris-HCl, pH 7,2, 2,5 mM dGTP, dATP, dCTP ja TTP ja 10 mM MgCl2.

SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi suoritettiin oleellisesti tavalla, jonka on kuvannut Laemmli, yllä. Käytettiin 15 % SepragelsR-geeliä (Integrated Separation Systems, Hyde Park, MA), ja kokonaislysaattiproteiini visualisoitiin värjäämällä : ** koomassiebriljantinsinisellä R-250 (Bio-Rad Laboratories).

• · *.V Interleukiini-4 visualisoitiin immunokemiallisesti käyttämällä "1’·1 spesifisiä vasta-aineita alla kuvatulla tavalla, sen jälkeen :\j kun elektroforeettisesti erotetut proteiinit oli siirretty nitroselluloosa-arkeille käyttämällä Hoefer Scientific-malli TE 50 TransforR-elektroforeesiyksikköä.

• · • · · Tässä esimerkissä käytetyn pRGT857-;ll:n konstruoimiseksi pAH3 sulatettiin Aval:llä. Tämän entsyymin luoma 5’-uloke täytettiin E. coli-polymeraasi I:n Klenow-fragmentilla, ja DNA sulatettiin PvuI:llä. 5,8 ke fragmentti, joka sisälsi interleukiini-4- ja « · • · • I · · • 1 · • · • · 26 1 0 4 4 9 9 laci-alueet, liitettiin pUC 19:n 1,4 ke PvuII-PvuI-fragment-tiin, joka sisälsi pUC-replikaatioalun. E. coli 294:n transfor-moinnin jälkeen eristettiin ampisilliiniresistentti interleu-kiini-4-ekspressioplasmidi, joka sisälsi pUC-replikaatioalun ja jota merkitään pRGT839-2 (kuva 2).

Sitten plasmidit pRGT839-2 ja pKGT269-2 sulatettiin molemmat Aatllsila ja Pvulsllä. pRGT839-2:n 6,7 ke fragmentti, joka sisälsi IL-4- ja laci-alueet. liitettiin pKGT269-2:sta olevaan 1 ke fragmenttiin, joka koodittaa kloramfenikoliresistenssiä. Liittämisseosta käytettiin suoraan transformoimaan Ej coli 294 sää. Eristettiin transformantti, joka sisälsi plasmidin pRGT857-l1.

Erittävien E. coli-kantojen valmistus ia valinta TYE-lientä [20 g/1 Bactotryptonia (Difco), 10 g/1 Bacro Yeast Extract-uutetta (Difco) ja 5 g/1 NaClsää] käytettiin bakteerikantojen rutiininomaiseen kasvatukseen, levyillesiirrostusko-keisiin ja joihinkin fermentointeihin. Useimmat fermentoinnit suoritettiin modifioidussa GC-väliaineessa [20 g/1 glyserolia, 30 g/1 kasaminohappoja (Difco), 30 g/1 hiivauutetta (Difco), 5 g/1 K^PO^ ja 1 g/1 MgS0417H20) 30 eC:ssa johtoseinällisissä ravistelupulloissa. Vaadittaessa lisättiin toisinaan ampisil-liinia tai kloramfenikolia (saatu yhtiöstä Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) konsentraatioissa 100 μg/ml ja 10 pq/ml, vas- ♦ ♦ 2 taavasti.

• · • · · 2 • · « • ·

Varastokantoja varastoitiin -20 °Csssa 40-% glyserolissa. Siir-rostusviljelmät valmistettiin lisäämällä 0,1 ml glyserolivaras-: tokantaa putkiin, jotka sisälsivät 10 ml TYE-lientä. Yön yli 30 °C:ssa inkuboinnin jälkeen soluja käytettiin siirrostamaan 100 ml TYE-väliainetta 500-ml johtoseinällisissä Erlenmeyer-ravis- » « telupulloissa (Bellco, Vineland, NJ) optiseen tiheyteen Aggo “ 0,2. Pulloja inkuboitiin 30 °C:ssa ravistaen nopeudella 250 ···! r/min New Brunswick Controlled Environment-inkubaat tor ir avis- ·...· telijassa. Optisen tiheyden Aggg “ IfO saavuttamisen jälkeen • · • · · 27 104499 lisättiin IPTG:tä 0,25 mmooliin, ja fermentointia jatkettiin 4 -tai 18 tuntia.

Eri E. coli-kantojen transformointi suoritettiin tavalla, joka kuvataan teoksessa Maniatis ai., yllä, s. 250.

Tuotettiin E. coli;n streptomysiiniresistentti muoto, jota merkitään 294S transdusoimalla kanta MM294 bakteriofagilla Pl emi, clrlOO [Miller, Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory], jota oli kasvatettu E. coli pAMl63:lla [Johnson, Gen. Res. 30 (1977) 273]. E. coli-kanta MM294 voidaan saada laitoksesta American Type Culture Collection tulonumerolla ATCC 33625.

J2. coli 294S:ää säteilytettiin steriilissä vedessä 40 s ajan etäisyydellä 25,4 cm germisidistä UV-lamppua käyttäen. Tämä käsittely tuotti 99,9-% solukuoleman, määritettynä siirrosta-malla levyille, joilla oli rikasta TYE-lientä, joka sisälsi tryptoni:hiivauute:natriumkloridia (20:10:5). Mutatoitu solu-suspensio laimennettiin 1:5 rikkaalla TYE-liemellä lopulliseen tilavuuteen noin 50 ml, ja inkuboitiin 3 tuntia 37 eC:ssa pimeässä ravistellen 250-ml pullossa.

Mutanttien valitsemiseksi, joilla on muuttunut ulkomembraani, inkuboinnin jälkeen lisättiin villityyppibakteriofagia T7 kon-sentraatiossa 10® täplän muodostavaa yksikköä/ml. Puolloa ra-j'.t> vietettiin 37 °C:ssa kunnes havaittiin solujen sulaminen (noin 30 min) , minkä jälkeen T7-resistentit solut kerättiin sentrifu- « · « goimalla nopeudella 10000 x g 10 min ajan 4 °C:ssa, ja sitten • · pelletti suspendoitiin uudelleen 1 ml:aan tuoretta lientä.

• «* • · « « · • « « ’·* * Solut levitettiin TYE [tryptoni:hiivauute:natriumkloridi (20:10:5)]-agarlevyille ja inkuboitiin 37 °C:ssa. 24 tunnin • · ·.*·: jälkeen kukin levy sisälsi noin 30 - 50 koloniaa. Näistä kolo- • Il * V nioista tutkittiin edelleen ulkomembraanin vaurio. Yksi käytet ty menetelmä oli tarkkailla kaikkea ribonukleaasi I:n vuotamis- i ta väliaineeseen.

t % • i I · ( • at • «a • a 104499 28 T7-bakteriofagiresistenttien kloonien yksittäisiä kolonioita *siveltiin pitkin tuoreita TYE-agarlevyjä, jotka oli päällystetty 4 ml:11a TYE-agaria, joka sisälsi 1 % hiiva-RNA:ta (sigma Chemical) pH-arvossa 7. Yön yli 37 cC:ssa inkuboinnin jälkeen levyt huuhdottiin runsaalla IN HCl-määrällä. "Halon" kokoa käytettiin määritettäessä kantoja, joista pääsi ribonukleaasi-aktiivisuutta väliaineeseen [Weingand et ai., J. Bacteriol. 125 (1976) 340].

Ulkomembraanin vaurion toinen ilmaisin E^. colissa on kasvun puuttuminen MacConkey-agarilla [Hancock, Ann. Rev. Microbiol.

38 (1984) 237]. Eristettiin 2 noin 30:stä T7-resistentistä koloniasta, jotka osoittautuivat olevan erityisen herkkiä Mac-Conkey-agarille ja kykenevän vapauttamaan oleellisia periplas-misen ribonukleaasi I:n määriä, ja merkittiin RL7 ja RZ21.

E., coli RL7 ja RZ21 transformoitiin plasmidilla pAH3 (kuva 2) tuottamaan kannat RZ21/pAH3 ja RL7/pAH3. Flasmidi pAH3 tuottaa signaalipeptidiä, joka ohjaa interleukiini-4:n kuljetusta sisemmän solumembraanin läpi periplasmaan. Molempia transformant-teja fermentoitiin modifioidussa GC-väliaineessa. Käytetyt väliaineet molemmista transformanteista seulottiin vuotamisen suhteen "Western blot"-analyysillä käyttämällä kanin polyklo-naalista antiseerumia humaani-interleukiini-4sää vastaan.

Kannan tuottamiseksi, joka erittää suurempia interleukiini-4- * määriä, RZ21/pAH3 mutatoitiin UV-säteilyllä kuten edellä. Kun :Y: oli kasvatettu pimeässä ainakin 2 tunnin ajan, säteilytetyt • « ·,···? solut siirrostettiin TYE-agarlevyille, jotka oli täydennetty : ampisilliinilla (100 ^g/ml), ja inkuboitiin yön yli 30 eC:ssa.

* ·

Koloniat seulottiin 2-membraani-immunomäärityksellä (käyttä- ♦ · ♦ mällä polyklonaalista antiseerumia) interleukiini-4:n lisäänty-. . nyttä vapautumista varten, ilmaistuna intensiivisemmällä värin- » t · kehityksellä erittävien kolonioiden alla.

• < « « · · • ’·* Mutatoidut solut laimennettiin ja levitettiin (0,1 ml/levy) TYE-agarlevyille (halkaisija 142 mm), jotka sisälsivät 100

> I I

• * • » • · · t · • · · * < · • · 29 104499 pg/ml ampisilliinia. Kun oli inkuboitu 30 °C:ssa yön yli, levyt sisälsivät noin 500 - 2000 koloniaa halkaisijaltaan noin 1 mm.

Sitten levyt peitettiin 137-mm nitroselluloosakiekolla (Schleicher and Schuell), jonka huokoskoko oli 0,45 pm. Kiekko lisättiin varovasti 1 reunalta vähitellen tapahtuvan ja tasaisen kostumisen sallimiseksi. Kiekko kuorittiin välittömästi takaisin yhdellä liikkeellä niin, että osa kolonioista nousi agarlevyltä nitroselluloosakiekolle* Kiekko sijoitettiin toisen nitroselluloosakiekon päälle, joka oli aikaisemmin sijoitettu steriilin agarlevyn pinnalle. Sitten kiekkoja inkuboitiin yön yli 30 °C:ssa.

Inkuvoinnin jälkeen pohjakiekko erotettiin kolonian kantavasta kiekosta. Suodattimia inkuboitiin 10 mM Trisrssä, pH 8, 150 mM NaCl ja 0,05 % (tilavuus/tilavuus) Tween-20 (polyoksietyleeni-sorbitaanimonolauraatti; Bio-Rad, entsyymi-immunomäärityspuh-taus) (TBST), joka sisälsi 1 % BSA:ta (naudan seerumialbumiini) huoneenlämpötilassa 60 min ajan. Sitten suodattimia inkuboitiin ensimmäisen vasta-aineen kanssa, joka oli joko kanin polyklo-naalista antiseerumia (1ϊ1500-laimennos TBST/BSA:ssa; käytettiin kokonais-interleukiini-4:n määritykseen) tai monoklonaa-lista antiseerumia (vasta-aine 11B4) (hybridoomakasvatussuper-natantin 1:10-laimennos TBST:BSA:ssa; käytettiin natiivissa konformaatiossaan olevan interleukiini-4:n määrittämiseen) huoneenlämpötilassa 30 min ajan.

I

• · • ·«

Suodattimet pestiin kolmesti TBST:ssä ja inkuboitiin 30 s ajan • · · **·* alkalinen fosfataasi-liitetyn toisen vasta-aineen kanssa, joka oli spesifinen ensimmäiselle käytetylle vasta-aineelle. Suodat- *. *: timet pestiin kolmesti TBST:llä ja värjättiin alkalinen fos- • ·♦ : fataasi-substraatilla (ProtoBlot System yhtiöstä Promega

Biotec). Ilmaantuneita näkyviä kohtia verrattiin sitten vierek-:*·.? käin alkuperäisten levyjen kanssa, ja valittiin koloniat, joil la oli lisääntynyt humaani-interleukiini-4-spesifinen värjäytyminen .

30 1 0 4 4 9 9

Valitut koloniat parannettiin plasmidista siirtämällä jatkuvasti ei-selektiivisille (ampisilliinittomalle) väliaineille, minkä jälkeen seurasi sively ei-selektiivisille TYE-levyille. Kolonioista, jotka arvosteltiin negatiivisiksi kasvulle ampisilliinilevyillä, tarkastettiin plasmidien puuttuminen, ja transformoitiin sitten uudelleen pAH3:lla.

RZ21:sta johdettuja klooneja, jotka sisälsivät pAH3:n, kasvatettiin TYErssä 100 pg/ml:n kanssa ampisilliinia. Nämä kloonit seulottiin lisääntyneen lymfokiininerityksen suhteen täplä-"immunoblotting"-menetelmällä kokonaisliemistä, jotka saatiin 10-ml putkifermentoinneista. Koloniat arvioitiin kuten edellä käyttämällä monoklonaalista llB4-vasta-ainetta humaani-interleukiini-4:lie ja alkalinen fosfataasi-konju-goitua vuohi-anti-rotta-IgG:tä

Yhtä kantaa, joka tuotettiin mutatoimalla RZ21:tä edelleen ja joka valittiin paljon tuottavana kantana, merkittiin RS631.

Humaani-interleukiini-4-tuotannon vertailu mutatoimattomalla ja kerran tai kahdesti mutatoidulla E. colilla

Keksinnön mukaisten kantojen lisääntyneen erittämiskyvyn ja ‘ toistetun mutageneesin ja valinnan tehon osoittamiseksi muta-. , toimatonta kantaa 294S ja kerran (kanta RZ21) ja kahdesti • i # *· *· mutatoitua (kanta RS631) E. colia, joka sisälsi plasmidin *·' pAH3, fermentoitiin edellä kuvatulla tavalla 20:10:5 TYE-

väliaineessa. Sitten ekspressio indusoitiin lisäämällä 1 mM

» * · j IPTG:tä. 6 tuntia induktion jälkeen määritettiin interleu- • · · : kiini-4-määrä, joka vapautui inkuboimalla 1 tunnin ajan : 37 °C:ssa eri transformanttien lOx solukonsentraatiota 20:10:5 • · ♦ tiii· TYE-väliaineessa, joka sisälsi 2 mM EDTA:ta. Väliaineessa oleva interleukiini-4 määritettiin menetelmällä, jonka on ·...' kuvannut Yokota et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 5894, taulukossa 1 esitetyin tuloksin.

104499 31

Taulukko 1

Interleukiini-4-tuotanto bioaktiivisuus1 E. coli-kanta fvksikköä/ml) 294S/pAH3 2005 RZ21/pAH3 21798 RS631/pAH3 97010 * Aktiivisuusarvot on korjattu O.D.ggo"arvoon 30,0 niin, että verrataan yhtäsuurella solujen lukumäärällä. 1 pgilla puhdasta humaani-interleukiini-4:llä on käytetyssä määrityksessä aktiivisuus noin 20000 yksikköä.

Taulukon 1 tiedot osoittavat, että.kerran mutatoitu erittävä kanta RZ21 tuotti väliaineessa yli 10 kertaisesti mutatoimat-toman kannan 294S tuottaman interleukiini-4-määrän. Kahdesti mutatoitu kanta RS631 puolestaan tuotti väliaineessa lähes 5 kertaa enemmän aktiivisuutta kuin kanta RZ21.

Kulttuuritalletukset

Mutantti-E. coli-kannat RZ21, RS631 ja RL7 on talletettu kan-sainväliseen talletuslaitokseen American Type Culture Collec-tion (ATCC) tulonumeroilla ATCC 53951, 53953 ja 53954, vastaa- • · vasti. E. coli-kanta 294S, joka sisältää plasmidit pAH3 ja .·. : pKGT269-2, on talletettu talletuslaitokseen ATCC tulonumeroilla * · · .·;·1 ATCC 68136 ja 68137, vastaavasti. Hybridooma IC1.11B4.6, joka • · · tuottaa monoklonaalista 11B4-vasta-ainetta, on tallennettu . . laitokseen ATCC tulonumerolla ATCC HB 9809. Kaikki nämä tai-♦ · · *; 1·' letukset on tehty kansainvälisen Budapest-sopimuksen mukaisesti • « « · Voidaan tehdä keksinnön useita modifikaatioita ja variaatioita sen hengestä ja suoja-alasta poikkeamatta, kuten ammattimies 104499 32 ymmärtää. Tässä kuvatut erityiset suoritusmuodot esitetään vain * esimerkkinä, ja keksintöä rajoittavat vain oheiset patenttivaatimukset.

* I

• · • · · « · • · · • « • · • · · • · · • « • · · • · · • · · 1 · • · ·

Claims (10)

1. E. coli-bakteeri. joka voi erittää kasvatusväliaineeseen biologisesti aktiivista heterologista geenituotetta, tunnettu siitä, että se käsittää: 5 (a) E. coli-bakteerin. jolle on tunnusomaista resistenssi bakteriofagi T7-infek-tiolle ja kyky erittää kasvatusväliaineeseen ainakin noin 10 kertaa enemmän periplasmisia proteiineja kuin tällaista resistenssiä ilman oleva solu, josta bakteeri oli peräisin, ja 10 (b) yhdistelmä-DNA-vektorin, joka käsittää ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka koodittaa signaalipeptidiä, joka pystyy välittämään proteiinin kuljetuksen peri-plasmiseen tilaan, ja joka on toiminnallisesti liittynyt toiseen DNA-sekvenssiin, joka koodittaa haluttua heterologista proteiinia, 15 joka bakteeri voi ekspressoida molempia sekvenssejä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen bakteeri, tunnettu siitä, että toinen DNA-sekvenssi koodittaa humaani-interleukiini-4:ää. 20

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen bakteeri, tunnettu siitä, että yhdis- # · · · telmä-DNA-vektori on plasmidi pRGT857-11, jolle on tunnusomaista kuvassa 2 esitetty restriktioendonukleaasikartta. • · • 9

4. Menetelmä halutun heterologisen proteiinin tuottamiseksi, tunnettu siitä, • · että: • :T: (a) kasvatetaan E. coli-bakteeria. joka pystyy erittämään kasvatusväliainee- seen biologisesti aktiivista heterologista proteiinia, käsittäen 30 « « •;.· · (i) E. coli-bakteerin. jolle on tunnusomaista resistanssi bakteriofagi T7-infektiol- .':.φ le ja kyky erittää kasvatusväliaineeseen ainakin noin 10 kertaa enemmän peri- • · · 1 « • · 104499 plasmisia proteiineja kuin tällaista resistenssiä ilman oleva solu, josta bakteeri johdettiin, ja (ii) yhdistelmä-DNA-vektorin, joka käsittää ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka 5 koodittaa signaalipeptidiä, joka pystyy välittämään proteiinin kuljetuksen peri-plasmiseen tilaan, ja joka on toiminnallisesti liittynyt toiseen DNA-sekvenssiin, joka koodittaa haluttua heterologista proteiinia olosuhteissa, joissa bakteeri ekspressoi molempia DNA-sekvenssejä ja erittää 10 heterologista proteiinia kasvatusväliaineeseen; ja (b) eristetään eritetty proteiini kasvatusväliaineesta.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen 15 DNA-sekvenssi koodittaa humaani-interleukiini-4:ää.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA-vektori on plasmidi pRGT857-11, jolle on tunnusomaista kuvassa 2 esitetty restriktioendonukleaasikartta. 20 .:.

7. Menetelmä E. coli-bakteerin tuottamiseksi ja tunnistamiseksi, joka bakteeri : , pystyy erittämään kasvatusväliaineeseen biologisesti aktiivista heterologista geenituotetta, tunnettu siitä, että: • · • · 25 (a) alistetaan E. coli-bakteereja riittävälle määrälle mutageenistä ainetta mu- • t :1·1: taatiomuutosten tuottamiseksi bakteerien DNA:ssa; :T: (b) valitaan vaiheessa (a) tuotettujen mutanttien kloonit bakteriofagi T7-infek- : T tioresistenssin suhteen ja kyvyn suhteen erittää kasvatusväliaineeseen ainakin 30 noin 10 kertaa enemmän periplamisia proteiineja kuin tällaista resistenssiä ilman oleva solu, josta kloonit johdettiin; • « « 104499 (c) transformoidaan yhtä tai useampaa vaiheessa (b) valituista klooneista yhdistelmä-DNA-vektorilla, joka sisältää ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka koodittaa signaalipeptidiä, joka pystyy välittämään proteiinin kuljetuksen peri-plasmiseen tilaan, ja joka on toimintakykyisesti liittynyt toiseen DNA-sekvens- 5 siin, joka koodittaa haluttua heterologista proteiinia, joka yhdistelmä-DNA-vektori pystyy ohjaamaan molempien DNA-sekvessien ekspressiota bakteereissa; ja (d) analysoidaan transformoidut kloonit, jotta määritettäisiin mitkä kloonit erittä-10 vät heterologista proteiinia.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transformoitujen kloonien analyysi suoritetaan menetelmällä, joka käsittää: 15 (a) ensimmäisen nitroselluloosamembraanin saattamisen kontaktiin transfor moitujen bakteerien dispergoidun viljelmän kanssa olosuhteissa, joissa osa viljelmässä olevista kolonioista siirtyy membraanin yhdelle puolelle; (b) vaiheen (a) membraanin toisen puolen saattamisen kontaktiin toisen nitro-20 selluloosamembraanin kanssa, joka on kontaktissa kasvatusväliaineen kanssa, .;. membraanikokoonpanon tuottamiseksi; (c) membraanikokoonpanon inkuboinnin olosuhteissa, joissa siirrettyjen bak- • · teerien erittämä biologisesti aktiivinen proteiini kulkee ensimmäisen membraa-25 nin läpi toiseen membraaniin; • e • ·· • · e • · · (d) membraanien erottamisen ja vaiheen (c) toisen membraanin saattamisen kontaktiin proteiinille spesifisen ensimmäisen vasta-aineen kanssa olosuhteis-sa, joissa muodostuu spesifisiä vasta-aine/proteiini-komplekseja; 30 (e) vaiheen (d) toisen membraanin peseminen sitoutumattomien materiaalien . , poistamiseksi; · · 104499 (f) pestyn membraanin saattaminen kontaktiin ensimmäiselle vasta-aineelle spesifisen leimatun toisen vasta-aineen kanssa olosuhteissa, joissa tapahtuu näkyvä reaktio, kun ensimmäinen vasta-aine/proteiini-komplekseja on läsnä membraanilla, näkyvien kohtien tuottamiseksi; ja 5 (g) näkyvien kohtien vertaamisen viljelmässä olevien bakteerikolonioiden kanssa, tunnistaen täten proteiinia erittävät bakteerit.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että membraa-10 nikokoonpano käsittää edelleen toisen membraanin ja kasvatusväliaineen välissä kolmannen membraanin, jolla bakteerikolonioiden erittämä proteiini havaitaan kuten vaiheissa (d) - (f).

10. E. coli-bakteeri, tunnettu siitä, että se on RZ21, RS631 tai RL7, joka 15 on tallennettu kansainväliseen tallennuslaitokseen American Type Culture Collection tulonumeroilla ATCC53951, 53953 ja 53954, vastaavasti • · • · · • · · « · • r • « · • »· • r ··· • · f • · · • · · • · · • · · • · · 104499