KR960010697B1 - 글리코실화된 헤모글로빈의 분석법 - Google Patents

글리코실화된 헤모글로빈의 분석법 Download PDF

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Description

글리코실화된 헤모글로빈의 분석법
본 발명은 글리코실화된 헤모글로빈의 특정 평가를 위한 리간드 결합 분석법에 관련된 것이다.
체액내에서 용액 형태인 단백질은 계속적으로 글리코실화 과정을 겪는다. 글루코오스는 비효소 반응에 의해 단백질과 반응하여 당단백질을 형성하며, 많은 경우에 당단백질이 형성되는 정도는 체액내에 있는 글루코오스의 농도에 비례한다.
따라서, 처음부터 당단백질로 합성되지 않는 단백질의 경우, 글리코실화된 형태로 존재하는 단백질의 분획은
-유기체내에서 단백질의 수명 및
-단백질과 접촉한 글루코오스의 농도
를 나타내는 기능을 한다.
혈액, 혈장 또는 뇨에서 글루코오스 농도를 측정(이는 시료 채취시의 글루코오스 농도에 대한 정보만을 제공한다)하는 것과는 달리, 글리코실화된 형태로 존재하는 단백질의 양은 긴 시간 동안 유기체가 글루코오스 농도를 조절하는 것에 대한 지표를 제공한다.
적혈구는 약 120일 정도의 평균 수명을 가지며, 많은 양의 혜로글로빈을 포함한다 따라서, 글리코실화된 형태의 적혈구 헤모글로빈의 분획은 당뇨병을 앓고 있는 환자에게 있어서 병을 조절하는 좋은 표준이 되며, 혈액시료 채취 수 주 전에 환자의 혈액에 있는 글루코오스의 농도에 대한 함수 관계를 나타낸다.
임상 실습에서는 당뇨병을 가진 환자의 혈중 글루코오스의 장기 조절을 정량적으로 평가하기 위해 수많은 다른 방법들이 글리코실화된 헤모글로빈 분획을 측정하기 위해 사용되어 왔다. 임상적으로 사용되는 주된 방법은 다음과 같다.
1. 이온교환 크로마토그래피에 의한 글리코실화된 헤모글로빈과 글리코실화되지 않은 헤모글로빈의 분리
이 방법은 최초로 제안된 방법일 뿐만 아니라 여전히 통상적으로 사용되는 임상 방법이다. 비용이 많이 들고, 분리 수행시 시간이 많이 소모되는 것에 따라 시간 소모가 많은 제조 방법이라는 것이 단점이며. 적은 온도 변화도 결과에 영향을 미친다.
2. 글리코실화된 헤모글로빈 분획을 특이적으로 단리하기 위한 붕소산 유도체의 사용
붕소산 부분이 시스 디올 잔기를 갖는 탄수화물 부분에 결합한다는 것은 오래전에 알려져 있었다.(Boeseken J., Advances in carbohydrate chemistry 4, 189-210, 1949, Solills J. and Deuel H.,Chimica 11, 311, 1957). 이러한 성질은 친화성 크로마토그래피에 의한 분리를 가능하게 하는 기초로 사용될 수 있다.
따라서, 예를들면, 붕소산 잔기는, 당단백질, 탄수화물 및 뉴클레오타이드의 단리를 위해 아가로우즈 같은 고체 상에 화학적으로 고정되었다(Hegemon, J and Kuehn, G., Anal Biochem 80 : 547, 1977). 그러한 물질의 컬럼을 또한 헤모글로빈의 글리코실화된 분획은 정량하는데 사용되어 왔다(Dean P.D.G. al.영국 특허 출원 GB-A-2024829). 그러한 컬럼은 제조에 시간과 비용이 많이 들며 작동이 느리다 : 용혈체(haemolysate)가 컬럼을 통과하도록 하여야 하며, 다른 분획들의 혜모글리빈 함량을 측정하여 글리코실화된 형태로 있는 헤모글리빈의 분획을 계산할 수 있기 전에 다른 분획들을 수집하여야 하며 분획의 부피를 수정하여야 한다.
3. 전기 영동에 의한 분리
헤모글로빈의 글리코실화는 단백질의 전하를 변화시키며, 이것은 글리코실화된 분획과 글리코실화되지 않는 분획들을 전기영동에 의해 분리하여 사용할 수 있게 하고, 상이한 분획들을 예를들면 반사 측정법에 의해 정량할 수 있게 한다. 이 방법 역시 시간과 비용이 많이 드는 방법이다.
적혈구 내의 혜모글로빈의 글리코실화 외에, 혈청 내의 단백질의 글리코실화 또한 당뇨병이 있는 환자에게서 높은 비율로 발생한다. 그러나, 상이한 혈청 단백질들은 체내에서 서로 다른 반감기를 가지고 있고 이러한 반감기 대부분이 헤모글로빈의 반감기보다 상당히 짧기 때문에, 글리코실화된 혈청 단백질을 측정하는 것은 병의 조절을 소급적으로 지켜보는 중간 기간을 짧게 하는 데만 사용된다. 글리코실화된 혈청 단백질의 정량을 위한 여러가지 비색법이 당뇨병 조절의 지표로서 널리 사용된다(Johnson, Metcal Baker, Clinical Chimica Acta 127(1982)87-95). 그러나, 대부분의 혈청 단백질들의 반감기가 짧고 이러한 사실은 글리코실화된 형태의 경우에도 마찬가씨이기 때문에, 글리코실화된 혈청 단백질의 정량의 임상학적 가치는 제한되어 왔다. 더구나, 기술적인 면에서 보면, 당뇨병 환자의 혈당량 결정 (모세혈관 헐액의 미세 시료 채취만으로도 가능하다)과 비교해 볼때, 혈청 단백질에 결합된 탄수화물의 정량은 시간이 많이 소모되며 귀찮은 혈청의 수집 및 준비(정맥 구멍 재기, 2시간 동안 응고, 원심 분리 및 기우려 따르기)가 필요하다.
글리코실화된 헤모글로빈의 정량에 대한 선행기술 중 어느 것도 완전한 표준방법으로 확립된 것은 없다. 예를들면, 장치의 서로 다른 방법들로 단리시킨 분획들은 정확하게 일치하지 않는다(Measurement of Glycosylated Hemoglobins using affinity chromatographyBouriotis et al, Diabetologia 21 : 579-580,1981). 이온 교환법에서, HbAlc라고 명명된 분획은 흔히 글리코실화된 혜모글로빈으로 분리지만, 이 분획 역시 글리코실화되지 않은 헤모글로빈을 포함할 수 있으며 여러 글리코실화된 헤모글로빈이 다른 분획들에서 용출되기도 한다.
고정된 붕소산 잔기를 사용하는 친화성 크로마토그래피는, 예를들면 β-사슬의 아미노 말단에서 글리코실화된 좀더 일반적인 분획 외에 리신 잔기에서 글리코실화된 헤모글로빈을 포함하는 여러가지 잔기에서 글리코실화된 헤모글로빈을 단리한다. 그러나, 글리코실화되지 않은 헤모글로빈도 이 방법에서 사용된 고체상에 비특이적으로 결합하게 되기도 하고. 글리코실 핵이 분자 내에 위치해 있어 고체 상에 결합한 수가 없다면 모든 글리코실화된 헤모글로빈이 결합할 수 있는 것도 아니다. 따라서 글리코실화된 헤모글로빈의 정량을 위해 사용된 여러 가지 방법들은 서로 다른 범위의 기준치를 갖는다.
또다른 문제는, 여러 방법에서는 높은 글루코오스 농도가 글리코실화된 분획의 정량에 방해가 된다는 것이다.
글루코오스가 헤모글로빈에 공유 결합되어 있는 상기 글리코실화된 헤모글로빈 분획외에, 글루코오스가 좀더 느슨하게 결합되어 있는 또다른 글리코실화된 분획이 있다. 이러한 글리코실화된 헤모글로빈은, 이들의 형태가 적혈구를 세척하거나 탄수화물이 없는 용액에서 적혈구를 배당함으로써, 또는 글리코실화된 헤모글로빈을 pH 5상태에 노출시킴으로써 바뀌어질 수 있기 때문에, 흔히 불안정한글리코헤모글로빈이라 불린다(Bisse, Berber Fluckinger, Diabetes 31 . 630-633, 1982). 그러나, 글리코실화된 헤모글로빈으로 형성된 붕소산 에스테르의 기하학적 구조는 주로 비가역적으로 글리코실화된 형태로 얻어지며, 불안정한 프리글리코실화된(preglycosylated) 형태로 얻어지지는 않는다.
다른 형태의 분석법에 대하여는, 고체상 위에 항체를 고정시키는 방법이 면역학적 분석 기술 및 단백질과 세포의 면역학적 정제에 주로 사용된다. 항체는 또한 균질한 면역 분석법, 예를들면 항원과 항체 둘다가 용액 내에 존재하고 항원/항체 반응이 직접적으로 (예를들면, 혼탁법 또는 비탁법) 또는 간접적으로 (형광법 또는 효소 활성화 또는 효소 억제화에 의하여) 측정될 수 있는 방법에서 사용된다. 글리코실화된 혜모글로빈에 특이한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 사용하는 수많은 시도가 행해졌으나 거의 성공하지 못했다. 그 이유는 주로 글리코실화된 헤모글로빈의 탄수화물 잔기의 대부분이 모노클로날 항체와 결합하는데 있어서 쉽게 결합할 수 없는 화학적 형태로 존재하기 때문이다. 따라서, 때때로 그러한 결합을 이루기 위해, 예를들면 폴리스티렌 표면에의 흡착(Engbaeck F. al : Clinical Chemistry 35 : 93-97, 1989) 또는 화학적 변성(Knowles 7 al : U.S.Patent 4,658,022, 1987)에 의한 방법 등으로 글리코실화된 헤모글리빈을 변성시키는 것이 필요하다.
버네트(Burnett J. B.) 등 (Biochemical and Biophysical Research Commun ication, vol. 96, p. 157-162, 1980)은 형광 붕소산 분자인 N-(5-디메틸아미노-1-나프탈렌 술포닐)-3-아미노벤젠 붕소산을 합성하였는데, 이 물질은 세포막에 결합한다는 것이 세포의 형광 현미경 검사에 의해 증명되었다.
1989년 1월 5일에 공고된 독일 특허 출원 DE 3720736에서 슐라이허는 시료내에 있는 총 글리코실화된 단백질의 정량을 위한 붕소산의 형광 및 착색된 다이조 접합체(conjugate)를 설명하였다. 슐라이허 방법은 시료 내에 있는 총 당단백질의 측정에 대한 다음의 세가지 원리, 즉
1. 존재하는 당단백질의 글리코실화된 부분에 결합되었을때 붕소산 접합체의 최대 흡수치의 이동, 또는
2. 존재하는 총 당단백질의 글리코실화된 부분에 형광 붕소산 접합체가 결합하였을때 형광의 편광 변화, 또는
3. 여분의 결합되지 않은 붕소산 접합체를 제거한 후에 (예를들면 활성탄을 사용) 존재하는 총 당단백질에 결합된 창색 또는 형광성 붕소산 접합체의 양을 측정중 하나의 원리에 의한다.
그러나, 슐라이허 (상동)가 설명한 방법중의 어느것도 다른 당단백질과의 혼합물에서 특정 당단백질의 정량, 특히 환자에게서 채취한 용혈체 시료에서 글리코실화된 혜모글로빈을 정확히 측정하는 것에는 사용될 수 없다. 게다가, 슐라이허가 설명한 시약들은 낮은 흡수 계수를 가지고 있고 그들의 최대 흡수치가 헤모글로빈의 최대 흡수치와 비슷하여 글리코실화된 헤모글로빈이 설사 순수한 형태로 존재한다 할지라도 글리코실화된 혜모글로빈을 검출하는 것이 어렵거나 불가능하다.
사실 슐라이허는 글리코실화된 헤모글로빈의 분석에 그의 방법을 사용하는 것에 대해서는 전혀 언급하지 않고, 대신에 사람의 혈청에서 추출해낸 글리코실화된 혈청 단백질 글리코실화된 알부민의 총량에 대한 분석만을 제안하고 있다.
글리코실화된 헤모글로빈에 특별히 반응성이 있고 글리코실화된 헤모글로빈의 정량에 유용한 렉틴이 확인된 적이 없으나, 당단백질에 반응성이 있는 렉틴도 또한 조사되었다.
붕소산 유도체를 사용하여 글리코실화된 분획을 라벨링하고 고정된 헤모글로빈-결할 단백질을 사용하여 시료로부터 헤모글로빈을 분리하는 것에 기초한 글리코실화된 헤모글로빈에 대한 분석법이, 본건 출원의 최초의 우선일 후에 공고된 와그너의 미합중국 특허 제4861728호에 기재되어 있다. 프랑스 공화국 특허 공보FR-A-2464475(Amicon)에, 시료에서 글리코실화된 헤모글로빈을 측정하는데에 적합한 당단백질 분석법이 소개되어 있는데, 이 방법은 붕소산에 기초한 시약을 사용하여 시료로부터 글리코실화된 분획을 분리하고 이 분획을 정량하는 방법이다.
따라서, 특이성이 있으며 빠르고 사용하기에 간단하면서 임상실험실에서 적합하게 사용하도록 할 수 있는 글리코실화된 헤모글로빈을 분석하는 개량된 방법에 대한 요구가 존재한다.
본 발명자들은 오직 글리코실화된 분획간을 검출하기 위해서 시료로부터 글리코실화된 것과 글리코실화되지 않은 혜모글로빈 분획 모두를 분리해 내는 방법을 붕소산 유도체가 가지고 있는 독특한 탄수화물 인지 특성과 결합시킴으로써 효과적이며 특이성 있는 분석이 달성될 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서 한면에서는, 본 발명운
(a)임의로 시료를 용혈시켜 세포 결합된 헤모글로빈을 유리시키는 단계 ;
(b)상기 시료 또는 하기 (c) 단계에 따라 상기 시료로부터 회수된 헤모글로빈을, 하나 이상의 디하이드록시보릴 잔기 또는 이의 염의 접합체를 포함하고 시그날 형성 라벨에 연결된 시그날 형성 분자들과 접촉시키는 단계 ;
(c)시료 또는 (b)단계의 반응 혼합물로부터 글리코실화된 혜모글로빈 및 글리코실화되지 않은 헤모글로빈과 이들에 결합된 다른 분자들을 분리시키는 단계 ; 및
(d)분리된 헤모글로빈에 결합되어 있는 상기 시그날 형성 분자, 및(또는) 헤모글로빈이 결합되지 않은 시그날 형성 분자를 측정하는 단계로 이루어진 시료 내에 있는 글리코실화된 혜모글로빈의 측정 방법을 제공한다.
시료 내에 있는 글리코실화된 혜모글로빈의 농도를 측정하는 것 외에, 본 발명의 방법을 실시하는데 있어서 존재하는 글리코실화된 헤모글로빈과 글리코실화되지 않은 혜모글로빈의 농도를 평가하고 총 헤모글로빈에 대한 글리코실화된 헤모글로빈의 비율을 계산하는 것도 또한 바람직하다.
혜모글로빈을 분리시키는 단계는 시료내에 존재하는 전량의 헤모글로빈(글리코실화된 것과 되지 않은 것)을 분리할 것을 요하지 않는다. 그 방법을 적절히 검정할 수 있는 한 분리될 글리코실화된 분획과 글리코실화되지 않은 분획의 비율만으로도 충분하다. 그러한 검정은 임상실험실 분석법에서는 통상적인 것이다.
여기에서 사용된 평가라는 용어는 시료 내에 있는 글리코실화된 혜모글로빈 또는 총 헤모글로빈의 양에 대한 절대치를 얻는다는 의미에서의 정량, 및 예를들어 시료의 총 헤모글로빈 농도에 대한 글리코실화된 헤모글로빈의 농도를 나타내는 지표, 비율, 백분율 또는 이와 유사한 표시를 얻는다는 의미에서의 정량 둘 다를 포함하려는 것이다.
본 발명의 신규 방법은 글리코실화되지 않은 헤모글로빈 분획으로부터 글리코실화된 것을 분리시키는 공정을 피하는 대신, 시료로부터 글리코실화된 헤모글로빈과 글리코실화되지 않은 것 모두를 분리해 내는 것으로 이해될 것이다. 결과적으로 시그날 형성 붕소산 유도체는 분리계의 일부로서 사용되지 않기 때문에 이들을 고정시킬 필요가 없게 되고 오히려 고정되지 않은 것이 바람직하다.
본 발명에 의한 방법은 당뇨병이 있는 또는 당뇨병의 의심이 있는 환자 또는 건강한 사람들로부터 얻은 혈액. 혈액 용혈체 또는 혈액 추출물 시료 중에 있는 글리코실화된 헤모글로빈의 양을 평가하는데 사용될 수 있다. 특히 혈액 또는 용혈체, 또는 글리코실화된 혜모글로빈 외에 다른 글리코실화된 단백질 및(또는) 당단백질 및(또는) 탄수화물을 함유하는 기타 혼합물 내에 있는 헤모글로빈을 평가하는데 유용하다. 시료는 분석하기 전에 건조된 형태 또는 액체상 또는 동결된 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 방법으로 분석하기 위한 용혈체는 예를들면 용혈시켜 글리코실화된 헤모글로빈의 탄수화물 부분을 결합 반응에 노출시키는 서로 다른 종류의 시약들을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 처리는 본 발명을 수행하는데 필요한 다른 시약들을 사용하기 전에 또는 이들을 병용하여 행할 수 있다. 임의로는 간섭을 줄이기 위해 예를들면, 글루코오스 옥시다아제 또는 pH 이하인 완충 용액을 사용하여 시료들을 처리하여 그 안에 존재하는 유리된 글루코오스 및(또는) 불안정한 글리코헤모글로빈의 농도를 감소시킬 수도 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 시그날 형성 분자 또는 접합체를 혜모글로빈과 반응시키는 것은 헤모글로빈을 시료로부터 분리하기 전이나 또는 분리한 후에 할 수 있다. 그러한 순서는 본 방법을 수행하는데 사용되는 화학 장치 및 기구에 따라, 그리고 어느 쪽이 좀더 실용적이냐에 따라 결정된다.
본 발명의 바람직한 한 실시태양에서, 시그날 형성 분자의 결합 및 혜모글로빈의 단리른 균질한 용액에서 동시에 발생하는데 이러한 균질 용액에서 원심분리 또는 여과법에 의해 헤모글로빈이 침전 및 단리된다. 그러나, 반응 및 분리조건은 상대적으로 낮은 글리코실 잔기-붕소산 결합 상수(103-105mol-1·ℓ)의 제한내에서 선택되어야만 한다.
상기 시그날 형성 분자로부터 얻은 시그날의 강도로부터, 헤모글로빈에 결합된 또는 분리된 시그날 형성 분자의 농도를 결정할 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 글리코실화된 헤모글로빈저 정량에 대한 완전한 표준 방법은 아직 존재하지 않는다. 그러나, 필요하다면 선행기술의 방법들에 대한 본 신규 방법의 검정 또는 상관 관계를 선행기술 방법(들)에 의해 결정된 글리코실화된 헤모글로빈의 농도를 이는 헤모글로빈의 표준용액을 사용하여 얻을 수 있다.
시그날 형성 분자 및 접합체는 편리하게는 아민 또는 아미드 결합, 공간을 주는 잔기(spacing moiety)에 의해 직접적으로 또는 당업계에 알려진 어떤 종류의 화학적 결합에 의해 시그날 형성 라벨에 연결된 페닐붕소산 잔기를 포함할 수 있으며, 이는 디하이드록시보릴 잔기가 혜모글로빈의 글리코실 부분의 시스-디올잔기와 자유롭게 반응할 수 있도록 해준다. 요구되는 붕소산 잔기의 pKa 값에 따라 페닐 고리는 예를들면 니트로, 포르밀 또는 알콜시기, 또는 pKa 값에 영향을 줄수 있는 다른 치환체로 더 치환될 수 있다. 그러나, 페닐 고리가 글리코실화된 헤모글로빈의 시그-디올 잔기에 대한 결합을 입체적으로 방해하지는 않아야 한다.
본 발명에 의한 시그날 형성 분자의 합성에 사용된 붕소산 잔기는 편리하게는 아미노페닐, 예를들면 m-아미노페닐, 붕소산 잔기로부터 합성되며, 상기 시그날 형성 분자 또는 접합체의 라벨 또는 시그날 형성 부분에 대한 연결은 전형적으로 디아조늄 이온 형성, 실란화에 의해, 글루타르디알데하이드, 카르보디이미드, 할로겐화 시안, 숙신아미드 같은 커플링제 또는 일반적인 화학 문헌에 있는 다른 커플링제를 사용하여 형성한다. 시그날 형성 라벨은 붕소산 잔기가 글리코실화된 헤모글로빈 분석체의 시스-디올과 자유롭게 반응하도록 해주는 방식으로 부착되고, 디하이드록시보릴 잔기, 예를들면 디메틸아미노아조-벤젠 이소티오시아네이트 및 디메틸아미노-나프팔렌 설포닐 클로라이드 상에 있는 아민 또는 다른 반응성 부분과 반응성이 있도록 미리 활성화시킬 수 있다. 본 발명의 시그날 형성 분자는 또한 수용성을 증가시키기 위해 더 변형될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 시그날 형성 디하이드록시보릴 시약은 바람직하게는 고정되지 않은 형태로 존재하고, 직접적 또는 간접적으로 시그날을 형성할 수 있는 화학구조(라벨)에 직접적 또는 간접적으로 연결된 붕소산 잔기를 포함하며, 이러한 시그날을 화학적 또는 물리적 정량을 위한 목적에 사용될 수 있다. 시그날 형성 라벨은 효소, 바람직하게는 탄수화물 시스-디올 부분을 갖지 않거나 시스-디올 잔기를 갖는 분획이 없는 효소를 포함할 수 있다. 이와는 달리, 시그날 형성라벨은 부분적으로 또는 전체적으로 착색 또는 형광성 부분으로 구성되기도 한다. 라벨로서 사용하기에 적합하 착색 화합물, 형광 물질 또는 안료 화합물이 당업계에 많이 알려져 있고 사용될 수 있다. 적절한 예에는 안트라퀴논, 아조 염료, 아진 염료. 예를들어 옥사진 및 티아진, 트리아진 천연 안료, 예를들어 포피린, 피코에리드린 및 피코시아닌을 포함하는 피코빌리 단백질, 클로로필 및 이들의 유사체와 유도체, 카로티노이드, 아크리니딘, 플루오레세인 및 로다민을 포함하는 크산텐, 인디고-염료, 티오크산텐, 쿠마린, 디- 및 트리-아릴메틴을 포함하는 폴리메틴, 및 이들의 유도체, 및 프탈로시아닌 및 금속 프탈로시아닌이며, 임의로는 시그날 형성 라벨과 붕소산 잔기 사이에 스페이싱 부분(spacing moiety)에 의해 연결되어 있는데, 이러한 것은 붕소산 잔기가 분석될 당단백질의 시스-디올과 자유롭게 반응하도록 해준다.
다양한 방사성 화합물들도 본 발명에서 사용된 시그날 형성 랴벨 시약의 한 부분으로서 사용될 수 있는데 그중에 요오드-125-표시된(iodine-125-labell
ed)화합물이 있다. 그러한 표지된 화합물들은 페닐 붕소산의 탄소 고리를 I-125로 표시화하거나 또는 아미노페닐 붕소산을 I-125-표시된 시약 (예를들면, 잘알려진 볼톤-힌터시약(Bolton-Hunter reagent))에 접합시킴으로써 편리하게 얻을 수 있다.
그러한 표지기술(labelling technique)에 대한 검토는 볼턴이 Biochem. J 133 : 529-539, 1973 저널에서 소개하고 있다. 본 발명에 따른 방법을 수행함에 있어서, 다소 고농도의 반응물들이 필요하다. 따라서, 본 발명의 많은 실시태양들에서는 적절한 수준으로 분석 시약들의 방사성을 얻기 위해 I-125-표지된 접합체를 동일 또는 상이한 구조를 가진 비방사성 붕산(boric acid) 또는 붕소산과 혼합시킬 수 있다.
또 다른 방법으로는, 붕소산 잔기를 공지의 방법(Cormier, M.J. et at ; Chemil uminescence and Biloluminescence, Plenum Press, New York 1973)으로 분석되는 화학 발광성 시그날을 생성할 수 있는 천연 또는 합성 화합물에 접합시킬 수도 있다. 적절한 화학 발광성 화합물로는 루시페린, 옥살산에스테르,1,2-디옥스에탄, 루미놀 또는 이들의 유도체들을 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다. 적절하다면 과산화수소, 루시페라제 같은 효소, 또는 다른 화학 물질들도 사용된 시그날-생성 분자로부터 화학 발광성 시그날을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
강음이온성 시그날 형성 접합체는 본 발명의 방법에서 사용하기에 바람직하지 않다. 왜냐하면 이들은 시료내에 존재할 수 있는 인간 혈청 알부민(HSA) 같은 혈청 단백질에 결합하는 성향을 가지고 있기 때문이다. 사용하기에 특히 적합한 예로는 형광체 이소티오시아네이트와 아미노페닐 붕소산을 반응시켜 얻은 적합체인데, 이는 유리 카르복실 부분과 접합체를 이룬다. 다른 적당한 접합체로는 1-에틸-3- (3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC)에 의해 형광체에 접합시킨 아미노페닐 붕소산, 차폐된 카르복실기를 갖거나 카르복실산 부분이 제거된 형광체 이소티오시아네이트를 아미노페닐붕소산에 접합시킨 것이 있다. 카르보디이미드에 의해 아미노페닐붕소산에 접합된 로다민 B도 사용될 수 있으나, 이 접합체는 본 발명에 의한 방법에서 분석을 위해 주로 사용되는 대부분의 용액에서 매우 낮은 용해도를 갖는다. N-(레조루핀-4-카르보닐) 피페리딘 -4-카르복실산- N - 히드록시숙신이미드-에스테르 (이하, 레소스로 약칭한다)가 특히 바람직한 시그날 형성 분자인데, 이 물질은 본 발명자가 아미노페닐붕소산에 접합시킨 것으로서, 우수한 용해도를 나타내며 또한 단백질에 대한 비특이적 결합이 낮은 것으로 나타났다. 이러한 낮은 단백질 결합은 FITC-아미노페닐 붕소산 접합체 등의 접합체와 비교하여 볼때 음이온기의 수가 감소된 것에 기인할 수 있다.
붕소산 잔기, -B- (OH)2는 전기적으로 중성인 형태에서는 흔히 디하이드록시보릴 잔기로 명명되면, 하이드록실 이온이 결합하여 음이온, -B-(OH)3-을 형성하며 그러한 형태의 염을 형성하기도 한다. 본 발명에 의해 제공되고 사용된 시약들은, pH 및 시약 조성물의 전해질 함량에 따라 이러한 형태의 붕소산을 하나 이상 가진 잔기들을 포함할 수 있다. 붕소산이 글리코실화된 헤모글로빈의 시스-디올 잔기에 결합하는 것은 음이온 형태에서 이루어진다. 그러나, 붕소산 잔기의 음이온 강도는 충분히 약하여 HSA 같은 단백질에 결합하는 등의 문제를 일으키지는 않는다.
본 발명의 방법에서, 붕소산과 접합된 고분자량의 시그날 형성 접합체는 대부분의 글리코실화된 헤모글로빈의 글리코실화된 부분에 접근하는데 제한이 따르기 때문에 사용을 피하는 것이 좋다 ; 혈액내에 있는 글리코실화된 헤모글로빈의 상당량의 분획은 베타 사슬의 N-말단의 발린 아미노산에서 글리코실화되는데 이곳은 앞에서 언급한 미합중국 특허 제4,658,022에서 설명한 바와 같이 수용성 고분자량의 분자가 접근하기 쉽지 않은 곳이다. 이 특허에서는 글리코실화된 잔기를 항체 결합 반응시키기 위해서 상당히 변성시켜야 한다는 것을 교시하고 있다.
본 발명에 따른 방법의 한 실시태양에 의하면, 예를들어 소수성 상호 작용, 또는 직접 또는 2차 항체를 통한 화학적 커플링으로 필터, 막, 비드(bead), 겔, 마이크로타이터 스트립(microtitre strip), 튜브 또는 판 같은 포면에 커플링된 항체 또는 합토글로빈 등과 같이 헤모글로빈에 특이성이 있는 고정화 결합 단백질에 의해 시료로부터 총헤모글로빈을 분리한다. 그러나, 붕소산과 탄수화물의 시스-디올 잔기 사이의 결합상수가 103내지 105mol-1·ℓ의 범위내에 있기 때문에 (Evans al : Anal. Biochem. 95 383. 1979, ZittleC, Advan, Enzym, 12 : 493, 1951) 일반적으로 이 방법은 바람직하지 못하다. 결과적으로, 결합 단백질의 유효 농도가 고정되었을때 더 낮아지기 때문에 붕소산이 시스-디올기에 결합하는 것도 그에 따라서 감소하게 된다. 따라서, 이를 보완하기 위해 높은 결합 능력이 필요한데 이는 기술적인 면에서 볼때 성취하기가 어렵다. 이러한 점이 또한 폴리스티렌 표면과 같은 낮은 결합능을 가진 고체상을 사용하는 것을 제한하는 요인이다.
그러나, 고체상 결합능은 단위 부피당 큰 표면적을 갖는 겔, 미세비스 또는 다른 공지의 고체상을 사용하여 증가시킬 수 있으나, 그러한 고체상은 통상적인 임강 용도로는 덜 실용적이다. 헤모글로빈 분리를 위해 고정된 헤모글로빈 특이성 결합단백질이 사용되었을때 시그날 형성 분자는 알칼리 포스파타제 효소 라벨 이외의 것으로 표지하는 것이 바람직하다.
본 발명의 좀더 바람직한 실시태양에서는, 헤모글로빈(및 이에 결합된 시그날 형성 분자)의 분리는 균질 용액에서 총 헤모글로빈을 선택적으로 침전시켜(예를들면, 적절한 침전 시약을 사용하되 임의로 크로마토그래피, 원심분리 또는 여과계와 결합시켜서) 수행한다.
따라서, 혜모글로빈의 분리는 특이성 있는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 인간 헤모글로빈에 결합하는, 어떠한 종으로부터의 합토글로빈. 또는 헤모글로빈을 결합하여 침전을 형성하거나 그렇지 않으면 용액으로부터 헤모글로빈을 제거하는 어떤 다른 단백질 같은 고정되지 않은 특이성 헤모글로빈 결합 단백질에 의해 효과적으로 행할 수 있다. 따라서, 서로 다른 에피톱스에 반응성 있는 모노클로날 항체나 폴리클로날 항체는 헤모글로빈과 침전을 형성하는데 사용할 수 있다. 침전은 2차 항테에 의하여 또는 합토글로빈과 반응성이 있는 항체와 함께 합토글로빈을 사용하여 얻을 수 있다. 시스-디올 부분이 없거나 시스-디올을 포함하는 부분이 없는 항체, 또는 이들의 면역활성이 있는 단편들이 사용하기에 바람직하다.
그러나, 이 방법의 한 단점은 붕소산을 함유하는 시그날 형성 분자와 글리코실화된 헤모글로빈의 글리코실화된 잔기의 결합 상수가 단지 103내지 105mol-1·ℓ 범위 내에 있기 때문에 반응물들이 고농도로 필요하게 되어 테스트당 항체나 합토글로빈이 많이 소모되게 된다는 점이다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 금속 양이온 또는 유기 용매를 사용하여 균질 용액으로부터 특이적 헤모글로빈을 침전시킨다. 이것은 고농도의 헤모글로빈을 사용할 수 있고, 원심 분리나 여과에 의해 침전을 쉽게 분리시킬 수 있으며 시약들이 싸고 효과적이라는 잇점이 있다.
이러한 실시태양은 헤모글로빈이 수용성이 매우 큰 단백질이라는 사실을 이용한 것이고, 발명자는 에탄올 및(또는) 부탄을 같은 알콜, 아세톤 같은 케톤, 에테르 예를들면 디옥산 및 테트라하이드로퓨란 같은 사이클릭 에테르, 디메틸포름아미드 또는 디에틸포름아마드 같은 아미드 용매. 디메틸설폭사이드 같은 설폭사이드 용매, 톨루엔 같은 탄화수소 용매 및 클로로포름 같은 할로겐화된 탄화수소 용매 같은 유기 용매를 사용하여 특징적인 또는 거의 특징적인 헤모글로빈 침전을 얻었다. 완전 혈액 시료를 침전시키고 약 6.5mg의 헤모글로빈 및 1.5mg HSA/ml가 되게 하기 위해 에탄올 중의 50% 부탄올(v/v)용액을 첨가하여 최종농도가 9% 부탄올이 될때까지 희석시켰을때, 혜모글로빈은 94%가 침전되었고 HSA는 오직 1% 만이 침전되었다. 상기 침전은 시스-디올 부분에 결합된 붕소산 잔기의 손실없이 얻어졌다.
헤모글로빈의 특이적 침전은 또한 단백질에 결합하여 이를 응집시키는 금속 양이온을 사용하여서도 수행할 수 있다. 적당한 양이온으로는 아연, 구리 및 덜 바람직하지만 니켈, 코발트 및 카드뮴이 있다. 구리 킬레이트 또는 황산구리를 사용한 헤모글로빈 침전법이 반 담(Van Dam) 등의 문헌[Biotechnical. Appl.Biochem., 11(5), 492-502, (1989)]에 개시되어 있으나, 헤모글로빈 분석에 적용할 수 있다는 제시는 없다. 이 방법은 침전된 헤모글로빈을 가용 착화제를 첨가하여 쉽게 재용시킬 수 있다는 중요한 잇점을 가지고 있다. 아연 이온을 사용하여, 완전혈액 용혈체로부터 헤모글로빈을 상당히 특징적으로 침전시킬 수 있었는데 이는 예기치 못한 관찰이었다. 예를들어보면, 6.5mg의 헤모글로빈과 1.5mg HSA/ml의 존재 하에 2.5∼4mM 농도의 아연 이온을 사용하여 특징적 또는 거의 특징적인 헤모글로빈 침전을 얻었다. 그러나, 4mM 이상의 아연 이온 농도에서는, HSA의 공침 (coprecipitation)이 발생하였다. 아래에 그 결과를 나타내었다.
그러나, 사용된 시그날 형성 붕소산 유도체를 방해하지 않도록 이온 농도는 주의 깊게 조절되어야 한다. 필요하다면, 임의로는 침전된 헤모글로빈을 시그날 형성 붕소산 접합체와 반응시키기 전에 과잉의 양이온을 제거하기 위해 세척 또는 여과시킬 수 있다. 이러한 반응 순서는 음이온성 시그날 형성 붕소산 접합체가 사용되었을때 특히 바람직한데, 과잉의 아연 이온과 음이온성 접합체 사이의 직접적인 결합은 불필요한 방해가 야기될 수 있기 때문이다. 아연 외에 다른 금속 양이 온도 침전 반응에 사용되는 완충 용액에서 그들 자신끼리 침전하지 않고 아연 이온과 같은 특이한 헤모글로빈 침전 능력을 가지고 있다면 사용될 수 있다.
금속 이온이 시험 용액에서 다른 시약들과 가수분해 또는 다른 반응들에 관여할 가능성이 있기 때문에, 금속 양이온이 물에 녹아 있어 헤모글로빈을 침전시키는데 이용될 수 있도록 주의를 하는 것이 필요하다.
본 명세서에 설명된 몇몇 시그날-붕소산 접합체는 금속 양이온에게 전자쌍을 줄 수 있는 기를 포함하고 있어 착화제로 작용한다. 리간드-금속 착화합물을 형성하는 이러한 능력은, 시험 용액에서 원하는 헤모글로빈 침전을 헝성하기 위해, 금속 이온을 용액에 남아 있게 하고. 금속과 붕소산 시그날 형성 유도체 사이의 착화합물 형성을 방해하고, 금속 이온의 이용성 및 충분히 높은 농도를 확보해 주어 반응을 조절하는데 사용될 수 있다.
서로 다른 금속 착화합물들의 리간드 농도 및 안정 상수 둘다를 고려할 필요가 있기 때문에, 불용성의 금속 착화합물(이하, Ma-착화합물이라 한다)의 형성을 막기위해 적절한 완충 염을 사용할 수 있다.
따라서, 약한 한자리 Me-착화합물을 형성하는 완충염이 바람직하고, 그러한 완충염의 예로는 잘녹는 Zn(Ac) 및 Zn(NH) 착화합물을 형성하는, 아연과 결합된 암모늄 아세테이트가 있다.
여러자리 킬레이팅 리간드 같은 좀더 강력한 착화제를 완충액에 첨가하여 상기 모든 반응들을 시험 용액내에서 조절할 수 있다. 착화제를 적절한 몰농도로 첨가하여 여러가지 착화합물에서 필요한 몰비를 얻고 모든 반응들이 적정하게 수행되도록 하기 위해 다른 첨가제들과 균형을 맞춘다. 더구나, 금속 이온이 너무 강하게 착화합물을 형성하는 것과 같은 바람직하지 못한 잠재적인 부작용을 피하기 위하여, 착화제를 사용될 특정 금속 양이온과 함께 선택해야 한다.
킬레이트-Me-착화합물의 안정도 상수는 시험 용액 내에서 다른 가능한 착화합제, 예를들면 시그날-붕소산 접합체와 경쟁하기에 충분할 만큼 높아야만 하지만, 침전제로서의 금속 양이온의 이용성을 감소시키거나 방해할 만큼 너무 강하지는 않아야 한다.
에틸렌-, 프로필렌-, 또는 부틸렌-디아민 또는 이들의 유사체, 글리신, 아스파테이트. 니트릴아세테이트, 히스티딘 및 피콜리네이트 같은 많은 킬레이팅 리간드들이 사용될 수 있다. 여러가지 다른 천연 또는 합성 킬레이터, 예를들면 탄수화물, 하나 이상의 배위 그룹을 가진 유기산, 아미노산, 펩타이드, 페놀류 및 그와 유사한 것 또한 사용될 수 있으나, 이들 중의 몇몇은 붕소산과 착화합물을 형성하여 (예를들어, 살리실레이트, 옥살레이트, 소르비톨 및 타르트레이트 같은 탄수화물), 시그날-붕소산 접합체에 결합하는데 있어서 글리코실화된 혜모글로빈과 결쟁하기 때문에 바람직하지는 못하다.
EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산) , CDTA (트란△-1,2-디아미노 사이클로헥산- N, N, N',N'-테트라아세트산) , EGTA(에틸렌글리콜-0-0'-비스(2-아미노-에틸) - N,N,N',N'-테트라아세트산),DTPA(디에틸렌트리아민펜타아세트산)등과 같은 여러자리 킬레이팅 리간드들도 역시 사용될 수 있으나, 어떤 상황에서는 이들이 금속이온과 매우 강하게 착화합물을 형성하여 헤모글로빈 침전을 현격히 감소시키기 때문에 바람직하지 못하다. 아연 이온 및 글리신을 포함하는 암모늄 아세테이트 완충액이 바람직한 예이다.
본 발명의 서로 다른 실시태양에서는 서로다른 착화제들이 바람직할 수 있다 EDTA 및 DTPA 같은 착화제가 편리하게 사용되나, 헤모글로빈을 침전시키는데 금속 양이온과 결합하여 사용될때 이들의 농도를 주의깊게 조절해야만 한다. 시트르산 및 옥살산은 붕소산 잔기와의 상호 작용 때문에 바람직하지 못하다. 헤파린 및 불소 이온도 역시 사용될 수 있다.
상기에서 언급한 유기 용매 또는 금속 양이온을 사용하여 균질 용액에서 침전시킨 침전물은 원심 분리 또는 여과에 의해 또는 당업계에 잘 알려진 다른 기술들을 사용하여 전체 또는 부분적으로 분리시킬 수 있다.
계량봉 또는 다층 필름 포맷의 여과막 또는 TLC-시스템 역시, 임의로 그의 항체 또는 면역 활성 단편, 또는 헤모글로빈을 결합하기 위해 고정된 합토글로빈에 의한 헤모글로빈의 분리에 사용될 수 있다.
원심 분리한 후 상청액으로부터 침전물을 분리시키는 방법으로 헤모글로빈을 분리시키는 것이 바람직한 방법 중의 하나이다. 또다른 방법으로는 여과법이 편리하게 사용될 수 있는데 필터를 통과하면서 필터 표면에 수직하게, 또는 필터 내에서 접선 또는 방사선 방향으로 1차원 또는 2차원 분리 방법으로 수행될 수 있다.
박막 크로마토그래피 방법도 사용될 수 있다. 예를들면, 시험 시트립 또는 겔 같은 적절한 크로마토그래피 매질에 시료를 넣고, 시약 및 세척 용액을 시료 넣은 위치에 직접 또는 용출에 의해 적용시킬 수 있다.
도라는 실시태양에서는, 헤모글로빈이 용액으로부터 필터 또는 다른 고체상 크로마토그래피 매질 위 또는 내로 직접 침전될 수 있는데, 이 경우 침전물은 고체상 위에 또는 내로 침전물의 생성 후에 또는 생성과 동시에 용착된다. 시약은 침전 단계 전, 후 또는 동시에 다공성의 고체상 매질에 적용될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 침전제, 시그날 형성 붕소산 시약, 용혈제, 착화제 또는 다른 시약 등의 시약들을, 바람직한 조합으로, 바람직하게는 건조된 형태로 고체상 매질내 또는 위에서 수행시킬 수 있다. 그러한 시약들이 수행되는 고체상 크로마토그래피 매질이 본 발명의 또 다른 면을 형성한다. 고체상 매질은 임의로 세척될 수 있고 용출 용액은 침전 영역을 통과하여 용출된다.
완전 혈액 시료에서 적혈구를 용혈시키고 글리코실화된 헤모글로빈과 시그날형성 붕소산 접합체 사이에 좋은 화학적 접촉을 갖도록 하기 위해 저장성 용혈법, 비이온성 폴리에틸렌 글리콜 에스테르 또는 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 유도체(예를 들면, 트리톤 및 트윈), 콜레이트, 소듐도데실설페이트, 구아니딘 같은 세척제의 사용, 가열, 음파 파쇄, 또는 이들의 조합 등을 포함하는 수많은 시약 및 방법들이 당업계에 알려져 있고 사용되고 있다.
시그날 형성 붕소산 접합체를 분석용 완충 용액에서 혈액 용혈체 시료, 또는 그러한 시료로부터 단리시킨 헤모글로빈과 접촉 또는 흔합하고, 이어서 또는 동시에 용혈 처리 단계를 수행한다.
수많은 분석용-완충액들이 사용될 수 있는데 그 중에서 적당한 pH로 반응 혼합물의 pH를 유지시킬 수 있는 포스페이트 완충액 및 다른 완충 용액들이 있다.
분석하기에 바람직한 pH 범위는 7.5 내지 10.0이나, 첨가제, 사용된 완충염 및 사용된 붕소산 유도체의 pka값에 따라 바람직한 pH는 달라진다. 아민을 포함하는 완충액은 디하이드록시보릴-시스디올 상호 작용을 강화하거나, 또는 붕산염의 표면적인 pka 값을 낮추는데 작용한다는 몇몇 증거가 있다. 이러한 사실에 의할때, 세린, 글리신, 헤페스(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진-에탄설폰산), 암모늄 아세테이트, 모르폴린 및 타우린 같은 완충액들이 바람직하다. 디하이드록시보릴 및 시스-디올 잔기 사이의 상호 작용을 더 촉진시키기 위해, 2가 양이온, 세척제, 카오트로픽제와 같은 첨가제를 사용한 전기적 척력을 감소시키고 표적 분자를 용해시키고 소수성 상호 작용을 제한하고 글리코실화된 헤모글로빈에서 디올의 접근을 증가시킨다. 그러나, 트리스 및 에탄올아민 같은 어떤 완충액은 이러한 완충 화합물이 붕산염을 착화시켜 디올이 결합하는 것을 막을 수 있기 때문에 피해야만 한다. 포스페이트-아연 같은 특정의 완충액/첨가제 조합은 Zn(PO)같은 불용성 화합물을 형성할 가능성이 있기 때문에 역시 좋지 못하다.
본 발명에 따른 방법은 4-37℃의 온도 범위 내에서 수행될 수 있는데 이 범위 내에서는 얻어지는 결과에 큰 차이가 없다.
본 발명에 따른 방법은 상기 시그날 형성 분자, 임의로는 글리코실화된 것과 되지 않은 형태로 존재하는 총 헤모글로빈의 평가 또는 정량(예를 들면, 시그날판독 단계)믈 포함한다. 본 발명의 방법 중 어떤 실시태양에 따른 방법을 사용했느냐에 따라, 시그날이 헤모글로빈이 결합된 시그날 형성 분자로부터 또는 남아 있는 헤모글로빈이 결합되지 않은 시그날 형성 분자로부터 판독될지가 결정된다. 가장 실용적인 것은 먼저 단리시킨 헤모글로빈에 결합된 시그날 형성 분자를 평가하는 것이다.
헤모글로빈에 결합되거나 이와 분리된 시그날 형성 분자의 평가는, 시그날 형성 라벨의 화학적 성질에 따라 효소 활성, 형광성, 방사성 또는 광학밀도(흡광도)를 측정하는데 흔히 사용되는 통상의 화학 장치를 사용하여 할 수 있다. 고체상 표면에서의 색깔 또는 형광성은 반사 측정법(reflectometry)에 의해 쉽게 측정될 수 있는데 이는 임상화학에서는 일반적으로 사용되는 것이다. 계량봉 또는 필터 포맷 또는 다른 실용적 고체상 포맷 상에서 헤모글로빈 및(또는) 형광성의 또는 착색된 시그날 형성 접합체는 그 표면상에서 직접 평가될 수 있다. 또 다른 방법으로는, 침전되거나 고정된 헤모글로빈 및(또는) 시그날 형성 붕소산 접합체는 용액에서 다시 용해시켜 측정할 수 있다.
유사한 방법으로는, 효소 활성을 갖는 시그날 형성 붕소산 접합체는 당업계에 잘 알려진 효소학적(enzymometric) 기술을 사용하여 고정화된 또는 용해된 또는 재용해된 형태에서 평가될 수 있다. 방사성 붕소산 접합체 또한 잘 알려진 방사성 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
분리된 글리코실화된 헤모글로빈 및 글리코실화되지 않은 헤모글로빈 둘다의 농도는 분리단계 전 또는 후에 반응 혼합물에서 관련되는 파장에서의 홉수에 의해서 결정할 수 있는데 또다른 방법으로는 분리된 분획에서의 헤모글로빈의 함량을 측정할 수 있다. 후자의 방법은, 필요하다면 고체상에서, 헤모글로빈을 재용해 시킨 후 흡광도를 측정하거나 또는 단리된 분획의 반사측정법에 의해서 얻을 수 있다. 형광성 시그날 형성분자가 헤모글로빈 존재 하에서 정량된다면, 헤모글로빈의 흡수 파장 바깥쪽의 파장에서 여기 및 방출시키는 것이 바랍직하다. 유사하게, 착색된 시그날 형성 분자가 사용된다면, 헤모글로빈(1)과 레소스-아미노페닐 붕소산 접합체와 헤모글로빈의 혼합물(2)의 흡수 스펙트럼과 함께 제1도에 나타난 바와같이 헤모글로빈의 흡수 파장 바깥쪽의 흡수 파장이 바람직하다. 그러나, 헤모글로빈으로부터의 부분적인 방해는 용납될 수 있고, 한 파장 이상에서의 측정을 토대로 계산에 의해 보정될 수 있다.
본 발명에 따른 한 실시태양에서는, 헤모글로빈 및 결합된 시그날 형성 붕소산 접합체가 미세비드 및(또는) 필터 또는 다른 고체상 위에서 단리되고 이어서 흡광도 측정 또는 형광성 측정에 의해 혜모글로빈 및 시그날 형성 붕소산 접합체의 반사 측정법에 의한 정량이 행해진다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서는, 붕소산 잔기나 이들의 염에 반응성이 있는 몇몇 또는 대부분 또는 모든 다른 단백질에 대해 고갈된 용혈체의 시료 또는 분액을 사용한다. 예를 들면, 시료내에서 글리코실화된 헤모글로빈을 분석하기 전에 플라즈마 단백질을 제거하기 위해 용혈전에 적혈구를 세척할 수 있다. 또다른 방법으로는 헤모글로빈 보다 아래 및(또는) 위의 등전점을 가진 모든 단밸질을 제거하기 위해 전체 혈액의 용혈체를 이온 교환 고체상 분리기에 노출시킬 수 있다. 이러한 정제법은 임의로는 본 발명에 의한 방법을 수행하기 위한 기구나 키트의 한부분이 될 수 있다.
본 발명에 따른 특정 실시태양에서, 경쟁 화합물의 존재 또는 부재하에서 헤모글로빈에 결합된 시그날 형성 분자 또는 접합체의 양을 측정한다. 경쟁 화합물은 시스-디올을 포함하는 분자일 수 있는데 예를 들면 소르비톨 또는 만니톨, 또는 시그날 형성 활성이 없는 붕소산을 포함하는 분자가 될 수 있다.
본 발명의 또다른 특별한 실시태양에서는, 헤모글로빈 분리 전 및 후에 반응 혼합물 및(또는) 분리된 분획에 존재하는 시그날 형성 분자의 양을 특정하는데, 이는 혜모글로빈에 결합함으로써 제거된 시그날 형성분자의 분획을 계산하는 것을 가능하게 해준다.
본 발명이 낮은 결합 강도(시스-디올 부분과 붕소산 잔기 사이의 결합 상수가 10 내지 10 mol ,ℓ)에 의존하므로, 글리코실화된 헤모글로빈과 시그날 형성붕소산 접합체 사이의 직접적인 화학량론적 결합은 발생하지 않는다. 더구나, 본 발명은 헤모글로빈의 모든 글리코실 핵이 결합 반응에 의해 쉽게 접근되는 방법을 제공하고 따라서 결합된 붕소산 접합체 대 헤모글로빈의 비율이 선행기술의 방법에 의해 통상 얻어지는 총 헤모글로빈에 대한 글리코실화된 헤모글로빈 분획보다 더 높게 얻어진다.
미세한 정도로, 혈액내의 자유로운 탄수화물이 붕소산 잔기에 대해 경쟁할 수가 있다. 이러한 효과는 시그날 형성 붕소산 접합체를 과량으로 사용함으로써 감소된다. 물 농도 20배 이상 되도록 과잉으로 사용하는 것이 편리하기는 하나, 본 발명이 사용된 실시태양에 따라 더 높거나 더 낮은 비율로도 사용할 수 있다.
물론 사용된 분리 기술의 효율성에 따라 바탕 시그날이 있을 것이다. 매우 효율적인 분리 시스템이 사용된다면 더 많은 과잉량을 사용할 수 있다. 매우 높은 반응물 농도를 사용할 수 없다면, 글리코실화된 헤모글로빈의 농도는 글리코실화된 헤모글로빈의 농도를 알고(알거나) 결합 상수를 정확히 아는 기준물을 사용하여 측정한 것으로부터 계산하여야 한다. 그러한 기준물의 사용은 임상 실험용 의약에서는 매우 흔한 것이다.
본 발명은 또한 설명된 방법을 수행하기 위한 시약 조성물을 제공하는데, 이 시약은 위에서 설명한 것처럼, 효소 활성을 갖거나 색을 띄거나 형광성, 화학 발광성 또는 방사성인 시그날 형성 라벨에 연결된 글리코실화된 헤모글로빈의 글리코실화된 잔기와 자유롭게 반응할 수 있는 하나 이상의 붕소산 잔기로 이루어진 분자들로 이루어진다. 약한 음이온성 시그날 형성 잔기를 갖는 조성물이 특히 바람직하다.
또다른 면에서, 본 발명은 (a) 식날 형성 라벨에 연결된, 하나 이상의 디하이드록시보릴 잔기 접합체 또는 이들의 염으로 이루어진 시그날 형성 분자를 포함하는 시약 ; (b) 시료로부터 헤모글로빈을 분리하기 위한 수단 ; 임의로는 완충염 또는 완충용액과 조합하는 것으로 이루어진, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 분석용 시험 키트를 제공한다.
다음의 실시예 및 제조법들이 본 발명을 예시하나 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예 -제법
제조예 1
1. N - (레조루핀 -4-카르보릴)피페리딘 -4-카르복실산-N-하이드록시숙신이미드에스테르(레소스)와 아미노페닐 붕소산의 접합체
용액 A : 0.5ml 디메틸설폭사이드에 2mg 레소스를 용해시켰다.
용액 B : pH 8.0인 0.1M 탄산 나트륨 완충액에 m-아미노페닐 붕소산의 헤미설페이트 염을 15mg/m1로 용해시켤다. pH를 8.0으로 조정하였다.
2ml 용액 B에 0 5ml 용액 A를 첨가했다. 혼합물을 실온에서 12시간 동안 숙성시켰다. HPLC에 의해 정제하였으며, 접합체의 구조를 제2도에 나타내었다.
제조예 2
2. 형광 이소티오시아네이트(FITC)와 아미노페닐붕소산과의 접합체
용액 A : 1ml의 디메틸설폭사이드에 3.9mg의 FITC를 용해시켰다.
용액 B : m-아미노페닐 붕소산의 헤미설페이트 염을 pH 9.5의 0.2M 탄산염 완충액에 1.86mg/m1로 용해시켰다.
10ml 용액 B에 1ml용액 A를 일정 속도로 교반하면서 천천히 가해주었다.
혼합물은 실온에서 최소한 2시간 이상 반응시켰다. FITC-아미노페닐 붕소산 접합체는 HPLC로 정제하였으며, 접합체의 구조를 제3도에 나타내었다.
제조예 3
3.요오드-125로 표지화된 붕소산 접합체
A : pH 7.5인 50mM 인산나트륨에 녹아 있는 10mg/m1의 아미노페닐붕소산(APBA)를 DMSO에 녹아있는 14.2mg/ml의 볼턴-헌터(BH) 시약과 반응시켰다. BH를 천건히 APBA에 가해서 같은 용적부로 하였다. 용액을 실온에서 1시간 동안 숙성시켰다.
B : 반응 생성물은 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 수용액에 메탄올 농도 구배를 가진 역상 컬럼을 통해 분리하였다
C : 단리된 BH-APBA 반응생성물은 클로라민-T 방법에 의해 I-NaI로 표지화시켰다. BH-APBA분획 0.5ml를 pH 7.5인 0.1ml의 0.25M 인산나트륨에 가해서 pH는 7.5로 맞추었다. 10㎕의 I-NaI,100uCi를 pH 7.5인 0.25M 인산나트륨에 용해되어 있는 새로 제조한 0.3ml의 클로라민-T(10mg/m1)에 가했다. 그리고 혼합물을 1분 동안 숙성시켰다.
D : pH 7.5인 0.25M 인산나트륨에 녹인 0.3ml의 아황산수소나트륨(24mg/
ml)를 가하여 반응을 정지시켰다.
E : 표지화된 BH-APBA는 0.1% TFA 수용액 하의 메탄올 농도 구배를 가진 역상 크로마토그래피에 의해 분리시켰다
제조예 4
4. 붕소산과 알칼리 포스파타제의 접합체
페닐 붕소산 잔기를 고정화시킨 아가로즈 컬럼을 통과시켜 붕소산에 대해 반응성을 가지는 효소 분자를 제거시킨 l0mg 알칼리 포스파타제를 pH 8.5인 탄산염 완충액에 녹아 있는 30배 몰과량의 비스-(설폭숙신이미딜) 수베르레이트와 혼합시킨다. 그후 이를 실온에서 120분 동안 반응하도록 방치시킨 뒤 100배 몰 과량의 모노에탄올아민을 가한다. 4시간 경과 후 효소 접합체를 겔크로마토스래피에 의해 정제한다.
완전 혈액 용혈체로부터 헤모글로빈의 거의 특징적인 침전을 예시하는 실시예
금속-양이온 : 용액 A : pH 8.0인 50mM 암모늄 아세테이트에 완전 혈액 용혈체를 최종 농도가 6.4mg 혜모글로빈/ml가 되도록 희석하였다.
용액 B : Cu(SO)를 물에 10mM Cu 의 농도로 용해시켰다.
용액 C : Zn(Cl)를 물에 10mM Zn 의 농도로 용해시켰다.
제조예 5
40㎕ 용액 B를 200㎕ 용액 A에 가했다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 숙성시키고 헤모글로빈 침전물을 원심 분리에 의해 분리했다
제조예 6
40㎕ 용액 C를 200㎕ 용액 A에 가했다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 숙성시키고 헤모글로빈 침전물은 원심분리에 의해 분리했다.
본 발명 방법의 실시예
이하 본 발명 방법의 모든 실시예에서 본 발명의 방법을 젭슨(Jeppson, J.0.)등의 문헌(Clinical Chemistry 32/10, 1867-1872, 1988)에 따른 전통적인 이온 교환 HPLC 방법 (이하 이온 교환방법으로 약칭한다)과 비교하였다.
완전 혈액 시료를 용혈시키고 용혈 분석 완충액인 pH 9.0의 0.05% 트리톤 X-100을 포함하는 100mM헤페스에 회석시켜 약 8mg 헤모글로빈/ml로 하였다. 에탄올 중의 50%(v/v) 부탄올과 위에서 설명한 FITC-아미노페닐 붕소산 접합체의 혼합물을 가하여 최종 부탄을 농도를 9%(v/v)로, 접합체 농도를 1.6×10 M로 했다.
침전이 생겼고, 생성된 침전물은 원심 분리에 의해 상청액으로부터 분리하였다.
침전물은 5% 디메틸설폭사이드를 포함하는 0.05M 염산에 다시 용해시키고, 헤모글로빈의 농도는 흡수분광법에 의하여 측정하였다. 그리고 FITC-아미노페닐 붕소산 접합체의 농도는 형광 측정법에 의해 측정하였다. 헤모글로빈과 FITC-아미노페닐 붕소산 접합체의 농도는 헤모글로빈과 글리코실화된 헤모글로빈의 농도를 알고 있는 표준 용액을 사용하여 얻은 검량 곡선에 내삽시켜 계산했으며, 총 헤모글로빈에 대한 글리코실화된 헤모글로빈의 퍼센트를 계산하였다.
설명된 방법을 수행함으로써 얻어진 결과를 다음에 나타낸다.
실시예 2
완전 혈액 시료를 용혈시키고 용혈 분석-완충액에 희석시켜 약 8mg 헤모글로빈/ml로 만든 후 FITC-이미노페닐 붕소산 접합체를 최종 농도 2×10 M이 되도록 가하였다. 시료를 30분 동안 숙성시켰고, 에탄올 중의 50%(v/v) 부탄올을 가하여 최종 농도를 9%(v/v 부탄올로 만들었다. 침전물이 생성되었고 침전물은 원심분리법에 의해 상청액에서 분리시켰다. 침전물은 5% 디메틸설폭사이드를 포함한 0.05M 염산에 용해시켰고 헤모글로빈과 접합체의 농도는 실시예 1에서 처럼 측정하였다.
FITC-아미노페닐 붕소산 접합체의 특이성을 입증하기 위하여 실시예 2에서 설명한 것과 같은 방법을 행하였다. 그러나 경합 농도로 0.1M의 소르비톨을 가하였다. 이 결과는 헤모글로빈에 대한 접합체의 낮고 비특이적인 결합을 보여주었고, 아래에 나타난 바와 같이, 글리코실화된 헤모글로빈이 높은 함량으로 포함된 시료나 저함량으로 포함된 시료 사이에 차이가 없음을 보여주었다.
소르비톨을 첨가하지 않고 얻은 결과 :
소르비톨을 첨가하여 얻은 결과 :
실시예 3
실험 방법은 실시예 1에서와 같이 행하였다. 그러나 원심 분리에 의해 침전물을 분리하는 대신에 침전된 시료는 여과에 의하여 분리하였다. 완전 혈액의 시료를 용혈시켰고 용혈 분석 -완충 용액인, pH 9.0이고 0.05% 트리톤 X-100을 포함한 100mM 헤페스에 회석시켜 약 8mg 헤모글로빈/ml로 하였다. 에탄올 중의 50%(v/v)부탄올과 FITC-아미노페닐 붕소산 접합체의 혼합물을 가하여 최종 부탄올 농도를 9%(v/v)로 하고 FITC-아미노페닐 붕소산 접합체 농도는 1.6×10 M로 하였다.
침전물이 생성되었고, 침전물을 여과에 의해 단리한 후 단리된 헤모글로빈 및 FITC-아이노페닐 붕소산 접합체를 정량하였다.
결과는 아래와 같이 얻어졌다.
실시예 4
완전 혈액의 시료를 용혈시키고 pH 9.0인, 0.05% 트리톤 X-100을 포함한 100mM 헤페스 용혈 분석 완충 용액에 희석시켜 약 8mg 헤모글로빈/ml로 했다. 에탄올중의 50%(v/v) 부탄올과 레소스-아미노페닐 붕소산 접합체의 혼합물을 가하여 최종 부탄올 농도를 9%(v/v)로 하고 접합체 농도는 1.6×10 M로 하였다. 침전이 생성되었고, 침전은 원심 분리에 의해 상청액에서 분리시켰다. 침전은 5% 디메틸설폭사이드를 포함한 0.05M 염산에 다시 용해시키고, 헤모글로빈과 레소스-아미노페닐 붕소산 접합체의 농도는 흡수측 정법에 의하여 측정하였다. 헤모글로빈의 농도와 레소스-아미노페닐 붕소산 접합체의 농도는 기지 농도의 헤모글로빈과 글리코실화된 헤모글로빈의 표준 용액을 사용하여 얻은 검량 곡선에로서 내삽법에 의하여 계산하였다. 그리고 글리코실화된 헤모글로빈의 퍼센트를 계산했다.
위와 같은 방법을 행했을 때 얻어지는 결과는 다음과 같다.
실시예 5
실험 방법은 실시예 4에서 설명한 대로 행하였다. 그러나 원심분리에 의해 침전을 분리하는 대신에 침전은 여과에 의해 분리하였다. 완전 혈액의 시료를 용혈시키고 pH 9.0인, 0.005% 트리톤 X-100을 포함하는 100mM 헤페스인 용혈 분석 완충액에 희석시켜 약 8mg 헤모글로빈/ml로 하였다. 에탄올 중의 50%(v/v) 부탄올과 레소스-아미노페닐 붕소산 혼합물을 가하여 최종 농도를 9%(v/v) 부탄올로 하고 레소스-아미노페닐 붕소산 접합체의 농도는 1.6×10 M로 하였다. 침전물이 생성되었고 이것을 여과에 의하여 단리한 후 단리된 헤모글로빈 및 레소스-아미노페닐 붕소산 접합체를 정량하였다.
다음과 같은 결과가 얻어졌다.
실시예 6
완전 혈액의 시료를 용해시키고, pH 9.0인 0.05% 트리톤 X-100를 포함한 0.25M 암모늄 아세테이트인 용혈 분석 완충액에 희석시켜 약 8mg 헤모글로빈/ml로 하였다. 30mM ZnCl용액에 레소스-아미노페닐붕소산 접합체 농도를 1.6×10 M로 한 것과 50mM 글리신을 용혈된 혜모글로빈 용액에 가하여 침전을 생성시켰다.
침전물은 원심 분리에 의해 상청액에서 분리시키고 30mM EDTA를 포함한 pH 9.0의 0.25M 암모늄 아세테이트 완충 용액에 침전을 다시 용해시켰다. 헤모글로빈과 레소스-아미노페닐 붕소산 접합체의 농도는 흡수 분광법에 의하여 측정하였다.
결과는 다음과 같았다.
실시예 7
실험 방법은 실시예 6에서 설명된 것처럼 행하였으나 침전된 헤모글로빈은 여과에 의해 분리하여 헤모글로빈과 레소스-아미노페닐 붕소산 접합체를 정량하였다.
실시예 8
헤페스 완충액에 포함되어 있는 용혈된 혈액을 요오드-125로 표지화된 붕소산 접합체에 가하였다(상기참조), 헤모글로빈 농도는 80mg/ml였다.
30분 숙성 후, 에탄올 : 부탄올(1:1)의 용액 22㎕를 가했고, 침전된 헤모글로빈은 원심분리에 의해 분리하였다.
침전은 HC1/DMS0/물을 첨가하여 녹였고, 헤모글로빈 함유량과 방사성을 측정하였다.
방사성/헤모글로빈 비율과 글리코실화된 헤모글로빈 함유량 사이에 의미있는 상관 관계가 있음이 발견되었다.
실시예 9
완전 혈액의 시료를 용혈시키고 0.05% 트리톤 X-100을 포함한 pH 9.0의 100mM 헤페스인 용혈 분석완충액에 회석시켜 약 8mg 헤모글로빈/ml로 했다. 레소스-아미노페닐 붕소산 접합체를 가하여 최종 농도를 2×10 M로 하고, CuSO를 가하여 최종 농도를 2mM로 하였을 때 침전이 생성되었다. 침전물을 원심분리에 의해 상청액으로부터 제거하였다. 침전을 5% 디메틸설폭사이드를 포함한 0.05M 염산에 다시 녹이고, 헤모글로빈과 레소스-아미노페닐 붕소산 접합체의 농도를 실시예 1에서 설명한 것처럼 측정했다.
실시예 10
완전 혈액의 시료를 용혈시키고 0.05% 트리톤 X-100을 포함하는 0.25M 암모늄 아세테이트인 용혈 분석 완충 용액에 희석시켜 약 8mg 헤모글로빈/ml로 만들었다. FITC-아미노페닐 붕소산 접합체를 가하여 2×10 M의 농도로 만들었다. 이소프로판올을 가하여 최종 함유량을 33%(v/v)로 하여, 침전물을 생성시켰다. 침전물을 원심 분리에 의해 상청액으로부터 분리시켰다. 침전물을 5% 디메틸설폭사이드를 포함하고 있는 0.05M 염산에 다시 녹였고, 헤모글로빈과 FITC-아미노페닐 붕소산 결합체의 농도는 실시예 1에서 설명한 것처럼 측정하였다.
결과는 아래와 같다.
실시예 11
방법은 실시예 10에서 설명한대로 행하였으나, 침전은 테트라하이드로푸란을 최종 함유량이 50%(v/v)이 되도록 첨가하여 생성시켰다.
결과는 다음과 같다.
실시예 12
방법은 실시예 10에서처럼 행하였으나, 침전은 N,N-디메틸포름아미드를 최종 함유량이 15%(v/v) 되도록 가하여 생성시켰다.
결과는 다음과 같다.

Claims (30)

  1. (a) 시료 또는 하기 단계(b)에 따라 시료로부터 회수된 헤모글로빈을 시그날 형성 라벨에 연결된 하나 이상의 디하이드록시보릴 잔기 또는 그의 염의 접합체를 포함하는 시그날 형성 분자와 접촉시키는 단계 ; (b) 시료로부터 또는 상기 단계(a)에서의 반응 혼합물로부터 글리코실화된 헤모글로빈 및 글리코실화 되지 않은 헤모글로빈, 및 그에 결합된 분자를 분리시키는 단계, 및 (C) 분리된 헤모글로빈에 결합된 상기 시그날 형성 분자 또는 헤모글로빈이 결합되지 않은 시그날 형성 분자 또는 이들 모두를 측정하는 단계로 이루어진, 시료 중의 글리코실화된 헤모글로빈의 측정 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 시그날 형성 분자가 고정화되지 않은 방법.
  3. 제1항 또는 2항에 있어서, 단계(a)와 단계(b)가 동시에 행해지는 방법.
  4. 제1항 또는 2항에 있어서, 시료로부터 분리된 글리코실화된 헤모글로빈과 글리코실화되지 않은 헤모글로빈의 양을 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  5. 제1항 또는 2항에 있어서, 상기 글리코실화된 헤모글로빈과 글리코실화되지 않은 헤모글로빈을 균일한 용액으로부터 선택적인 침전법에 의해 분리시키는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 생성된 침전을 크로마토그래피 또는 여과 매질에 의해 분리시키는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 침전 단계를 크로마토그래피 같은 다공성의 고체상 또는 여과 매질 상에서 또는 내에서 행하는 방법.
  8. 제1항 또는 2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 또는 여과 매질이 헤모글로빈 침전제, 제1항에 정의한 시그날 형성 분자. 용혈제 또는 착화제에서 선택된 하나 이상의 시약을 함유하는 방법.
  9. 제1항 또는 2항에 있어서, 헤모글로빈을 아연 이온 또는 구리 이온 또는 기타 특이성 있는 헤모글로빈 침전용 금속 양이온들의 첨가에 의해 침전시키는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 금속 착화제를 첨가시키는 것을 더 포함하는 방법.
  11. 제1항 또는 2항에 있어서, 헤모글모빈을 특징적으로 침전시킬 수 있는 농도의 유기 용매 또는 유기용매의 혼합물을 첨가하여 헤모글로빈을 침전시키기는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 용매가 물과 혼화되기 쉬운 알콜, 케톤, 에테르, 아미드 용매, 설폭사이드 용매, 탄화수소 용매, 할로겐화 용매 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 방법.
  13. 제1항 또는 2항에 있어서, 헤모글로빈을 헤모글로빈-특이적 결합 단백질을 첨가하여 침전시키는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 헤모글로빈을 항-헤모글로빈 항체 또는 합토글로빈 또는 그의 단편에 의해 침전시키는 방법.
  15. 제1항 또는 2항에 있어서, 헤모글로빈을 고체상에 고정화된 헤모글로빈에 특이적인 결합 단백질에 의해 분리하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 시그날 형성 분자를 알카리 포스페이트 효소 라벨 이외의 것으로 표지화시키는 방법.
  17. 제1항 또는 2항에 있어서, 디올 함유 화합물 또는 디하이드록시보릴잔기 함유 화합물과 같은 경합제 존재 하에서 행해지는 방법.
  18. 제1항 또는 2항에 있어서, 용혈이 저장 분해에 의해, 세제 또는 구아니딘의 첨가, 가열, 초음파 분해 또는 이들의 조합 방법에 의해 행해지는 방법.
  19. 제1항 또는 2항에 있어서, 상기 시그날 형성 분자가 화학 발광, 형광, 착색성 또는 방사성이거나 효소 활성을 가지는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 시그날 형성 분자가 안트라퀴논, 아조 염료, 옥사진, 티아진, 트리아진, 포피린, 피코빌리프로테인, 클로로필 및 그의 유도체 및 유사체, 카로티노이드, 아크리니딘, 크산텐, 인디고-염료, 티오크산틴, 쿠마린, 폴리메틴 및 그의 유도체, 프탈로시아닌 및 금속 프탈로시아닌으로 이루어진 군에서 선택된 라벨로 이루어진 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 시그날 형성 분자를 N-(레조루핀-4-카르보닐)-피페리딘-4-카르복실산-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(레소스) 또는 다른 옥사진으로 표지화시키는 방법.
  22. 제1항 또는 2항에 있어서, 시험하는 시료 이외의 사용된 하나 이상의 반응물이 디하이드록시보릴 잔기에 반응성이 있는 분자를 포함하지 않는 방법.
  23. 방자성 또는 화학 발광성의 시그날 형성 라벨에 연결된 하나 이상의 디하이드록시보릴 잔기 또는 그의 염의 접합체를 포함하는 시그날 형성 분자를 함유하는 시료 중의 글리코실화된 헤모글로빈 측정용 시약.
  24. N-(레조루핀-4-카르보닐)-피페리딘-4-카르복실산-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(레소스) 또는 다른 옥사진에 연결된 하나 이상의 디하이드록시보릴 잔기 또는 그의 염의 접합체를 포함하는 시그날 형성 분자를 함유하는 시료 중의 글리코실화된 헤모글로빈 측정용 시약.
  25. (a) 시그날 형성 라벨에 연결된 하나 이상의 디하이드록시보릴잔기 또는 그의 염의 접합체를 포함하는 시그날 형성 분자 함유 시약 ; 및 (b) 시료로부터 헤모글로빈을 분리하기 위한 수단으로 이루어진 분석용 시험 키트
  26. 제25항에 있어서, 상기 헤모글로빈 분리 수단(b)가 아연 이온 또는 구리 이온 또는 다른 헤모글로빈 특이적 침전용 금속 양이온, 헤모글로빈을 침전시킬 수 있는 유기 용매 또는 유기 용매의 혼합물, 또는 헤모글로빈 특이적 결합 단백질 또는 그의 단편으로부터 선택되는 시험 키트.
  27. 제25항에 있어서, 헤모글로빈 분리 시약으로 아연 또는 다른 헤모글로빈 침전용 금속 이온을 포함하거나, 착화제를 더 포함하는 시험 키트.
  28. 제25항 내지 27항 중의 어느 하나의 항에 있어서, 상기 시약(a) 또는 상기 헤모글로빈 분리 수단(b) 또는 이들 모두가 고체상 크로마토그래피 또는 여과 매질 내 또는 위에 있는 시험 키트.
  29. 제25항에 있어서, 침전된 헤모글로빈을 분리하기 위하여 고체상 크로마토그래피 또는 여과매질을 더 포함하는 시험 키트.
  30. 제1항에 있어서, 단계(a) 이전에 시료를 용혈시켜 세포 결합 헤모글로빈을 유리시키는 추가의 단계를 포함하는 방법.
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