FI100437B - Glykosyloituneen hemoglobiinin määritys - Google Patents

Description

100437

Glykosy loi tiineen hemoglobiinin määritys Tämä keksintö koskee ligandisitoutumismääritystä, joka soveltuu, glykosyloituneen hemoglobiinin määrittämi-5 seen spesifisesti. Tarkemmin ilmaistuna keksinnön kohteena on menetelmä glykosyloituneen hemoglobiinin määrittämiseksi näytteestä, menetelmässä käytettäviä reagensseja ja testipakkauksia sekä menetelmän tai testivälineistön käyttö diabetes mellituksen in vitro diagnosointiin tai 10 seurantaan.

Kehon nesteisiin liuenneina olevat proteiinit ovat jatkuvasti alttiina glykosylaatioprosesseille. Glukoosi reagoi proteiinien kanssa, joka reaktio ei ole entsymaat-tinen, muodostaen glykoproteiineja ja monissa tapauksissa 15 glykoproteiinien muodostumisen taso on verrannollinen glukoosin pitoisuuteen kyseisessä kehon nesteessä. Sellaisten proteiinien tapauksessa, joita ei ole alun perin syntetisoitu glykoproteiineina, glykosyloituneessa muodossa olevan proteiinin osuus riippuu siten proteiinin elinajasta 20 eliössä ja siitä glukoosipitoisuudesta, jolle proteiini on joutunut alttiiksi.

Toisin kuin veren, plasman tai virtsan glukoosipi-toisuuden mittaukset, jotka antavat tietoa ainoastaan glukoosipitoisuudesta näytteenottohetkellä, glykosyloitunees-25 sa muodossa olevan proteiinin määrä antaa viitteen eliön glukoosipitoisuuden säätelystä pitempien ajanjaksojen kuluessa.

Erytrosyyttien (punaisten verisolujen) keskimääräinen elinikä on noin 120 vuorokautta, ja ne sisältävät suu-30 ria määriä hemoglobiinia. Glykosyloituneessa muodossa olevan erytrosyyttihemoglobiinin osuus on siten hyvä taudin säätelyn mitta potilailla, joilla on diabetes mellitus, ja riippuu glukoosin pitoisuuksista potilaan veressä verinäytteen ottoa edeltäneiden viikkojen aikana.

35 Käytännön kliinisessä työssä on käytetty lukuisia eri menetelmiä glykosyloituneen hemoglobiinin osuuden mittaamiseen veren glukoosin pitkäaikaissäätelyn arvioimisek- 2 100437 si kvantitatiivisesti potilailla, joilla on diabetes mel-litus. Tärkeimpiä kliinisessä käytössä olevia menetelmiä ovat: 1. Glykosyloituneen ja glykosyloitumattoman he-5 moglobiinin erotus ioninvaihtokromatografian avulla. Tämä oli ensimmäinen menetelmä, joka esitettiin, ja on yhä yleisimmin käytetty kliininen menetelmä. Menetelmän puutteina ovat suuret kustannukset ja aikaa vievät valmistusmenetelmät erotusten toteutuksen hitauden ohella, ja tulo loksiin vaikuttavat pienetkin lämpötilan vaihtelut.

2. Boronihappojohdannaisten käyttö glykosyloituneen hemoglobiinifraktion eristämiseksi spesifisesti. On pitkään tiedetty, että boronihapporyhmät sitoutuvat hiili-hydraattiosiin, jotka sisältävät cis-dioliryhmiä 15 [J. Boeseken, Advances in Carbohydrate Chemistry 4 (1949) 210; J. Solms ja H. Deuel, Chimica 11 (1957) 311], ja tätä ominaisuutta on käytetty affiniteettikromatografisen erotuksen perustana. Siis esimerkiksi boronihapporyhmät on immobilisoitu kemiallisesti kiteiden faasien, kuten aga-20 roosin, pinnalle glykoproteiihien, hiilihydraattien ja nukleotidien eristämistä varten [J. Hageman ja G. Kuehn, Anal. Biochem. 80 (1977) 547]. On myös käytetty sellaista ainetta sisältäviä pylväitä glykosyloituneen hemoglobiini-fraktion suuruuden määrittämiseksi (P. D. G. Dean et ai., 25 GB-hakemusjulkaisu 2 024 829). Sellaisten pylväiden val mistus on kuitenkin aikaa vievää ja kallista ja ne ovat hitaita käyttää: Hemolysaatti on laskettava pylvään läpi, eri jakeet täytyy erottaa ja jakeiden tilavuuksien on oltava korjattuja, ennen kuin voidaan mitata eri jakeiden j 30 hemoglobiinisisältö ja laskea glykosyloituneessa muodossa olevan hemoglobiinin osuus.

3. Elektroforeettinen erotus. Hemoglobiinin glyko-sylaatio muuttaa proteiinin sähköistä varausta, ja tätä seikkaa voidaan käyttää glykosyloituneen ja glykosyloitu- 35 mattoman jakeen erottamiseen elektroforeettisesti, jonka jälkeen eri jakeiden suuruus voidaan määrittää esimerkiksi 3 100437 heijastusmittauksella. Tämäkin menetelmä on aikaa vievä ja kallis.

Erytrosyyteissä tapahtuvan hemoglobiinin glykosy-laation lisäksi myös proteiinien glykosyloituminen seeru-5 missä on nopeampaa potilailla, jotka sairastavat diabetes mellitusta. Koska eri seerumiproteiineilla on erilainen puoliintumisaika elimistössä ja useimmat näistä puoliintu-misajoista ovat huomattavasti lyhyempiä kuin hemoglobiinilla, glykosyloituneiden seerumiproteiinien mittauksia 10 käytetään kuitenkin vain taudin säätelyn retrospektiiviseen seurantaan lyhyellä tai keskipitkällä aikavälillä. Erilaisia kolorimetrisiä menetelmiä glykosyloituneiden seerumiproteiinien määrittämiseksi kvantitatiivisesti käytetään yleisesti sokeritaudin säätelyn ilmaisimina 15 [Johnsen, Metcalf ja Baker, Clinical Chimica Acta 127 (1982) 87 - 95]. Glykosyloituneiden seerumiproteiinien kvantitatiivisen määrityksen kliininen merkitys on kuitenkin rajoitettu, koska useimmilla seerumiproteiineilla on lyhyt elinaika, mikä pätee yhtäläisesti glykosyloitunee-20 seen muotoon. Tekniseltä kannalta katsottuna seerumipro-teiineihin sitoutuneiden hiilihydraattien kvantitatiivinen määritys edellyttää seerumin keräystä ja preparointia, joiden toteutus on aikaa vievää ja työlästä (laskimopunk-tio, 2 tunnin saostus, sentrifugointi ja dekantointi) ver-25 rattuna sokeritautipotilaiden veren glukoosin määrittämiseen, joka voidaan toteuttaa pelkästään ottamalla pieni verinäyte hiussuonesta.

Yksikään tekniikan tasoa edustavista menetelmistä glykosyloituneen hemoglobiinin määrittämiseksi kvantita-[ 30 tiivisesti ei ole vakiintunut ehdottomaksi standardimene telmäksi. Yksi syy siihen on, että erilaisin tunnetuin menetelmin eristetyt jakeet eivät vastaa tarkasti toisiaan [Measurement of Glycosylated Hemoglobins Using Affinity Chromatography, Bouriotis et al., Diabelologia 21 (1981) 35 579 - 580]. Ioninvaihtomenetelmissä jaetta, jolle on an nettu nimi HbAlc, kutsutaan usein "glykosyloituneeksi he- 4 100437 moglobiiniksi"; tämä jae voi kuitenkin sisältää myös gly-kosyloitumattomia hemoglobiineja ja monet glykosyloituneet hemoglobiinit eluoituvat eri jakeiden mukana.

Affiniteettikromatografia, jossa käytetään immobi-5 lisoituja boronihapporyhmiä, eristää yleisemmän jakeen lisäksi, jossa glykosyloituminen on tapahtunut β-ketjun aminopäähän, sellaiset hemoglobiinit, joissa glykosyloituminen on tapahtunut eri aminohapporyhmiin, muiden muassa esimerkiksi hemoglobiinin, jossa lysiiniryhmät ovat glyko li) syloituneet. Myös glykosyloitumattomat hemoglobiinit voi vat kuitenkin tulla sidotuiksi tässä menetelmässä käytettävään kiinteään faasiin eikä kaikki glykosyloitunut hemoglobiini ehkä sitoudu, jos glykosyyliryhmät sijaitsevat molekyylin sisällä eivätkä ole käytettävissä kiinteään 15 faasiin sitomiseen. Siksi käytettävillä eri menetelmillä glykosyloituneiden hemoglobiinien määrittämiseksi kvantitatiivisesti on erilaiset referenssialuearvot.

Eräs lisäongelma on se, että monissa menetelmissä glukoosin korkea taso häiritsee glykosyloituneen jakeen 20 kvantitatiivista määritystä.

Mainitun glykosyloituneen hemoglobiinifraktion lisäksi, jossa glukoosi on sitoutunut kovalenttisesti hemoglobiiniin, on olemassa toinen hemoglobiinifraktio, jossa glukoosi on sitoutunut löysemmin. Näitä glykosyloituneita 25 hemoglobiineja kutsutaan usein "labiileiksi" glykohemoglo- biineiksi, koska niiden muodostuminen voidaan kääntää päinvastaiseksi pesemällä erytrosyytit tai inkuboimalla erytrosyyttejä hiilihydraatittomassa liuoksessa tai saattamalla glykosyloitunut hemoglobiini alttiiksi pH:lie 5 30 [Bisse, Berger ja Fluckinger, Diabetes 31 (1982) 630 -633]. Boronihappoesterin geometrinen rakenne, joka muodostuu reaktiossa glykosyloituneen hemoglobiinin kanssa, saavutetaan kuitenkin pääasiallisesti irreversiibelisti gly-kosyloituneilla muodoilla eikä labiililla esiglykosyloitu-35 neella muodolla.

Il 5 100437

Mitä tulee vaihtoehtoisiin määrityömuotoihin, im-muunimääritystekniikoissa sekä proteiinien ja solujen im-muunipuhdistuksessa käytetään yleisesti vasta-aineiden im-mobilisointia kiinteille faaseille. Vasta-aineita voidaan 5 käyttää myös homogeenisissa immuunimäärityksissä, so. määrityksissä, joissa liuoksessa on läsnä sekä vasta-aineita että antigeenejä ja vasta-aine-antigeenireaktio voidaan mitata suoraan (esimerkiksi nefelometrisin tai turbidimet-risin menetelmin) tai epäsuorasti (fluoresenssin tai ent-10 syymin aktivaation tai inhibition avulla). On tehty lukuisia yrityksiä käyttää glykosyloituneen hemoglobiinin suhteen spesifisiä monoklonaalisia tai polyklonaalisia vasta-aineita mutta rajoitetulla menestyksellä. Syynä tähän on pääasiassa se, että suurin osa glykosyloituneen hemoglo-15 biinin hiilihydraattiryhmistä ovat läsnä sellaisissa kemiallisissa muodoissa, jotka eivät ole helposti käytettävissä monoklonaalisiin vasta-aineisiin sitoutumiseen. Siksi on usein välttämätöntä denaturoida glykosyloitunut hemoglobiini sellaisen sitoutumisen aikaansaamiseksi esimer-20 kiksi adsorptiolla polystyreenipintoihin [F. Engbaeck et ai., Clinical Chemistry 35 (1989) 93 - 97] tai kemiallisesti (Knowles et ai., US-patenttijulkaisu 4 658 022, 1987).

J. B. Burnett et ai. [Biochemical and Biophysical 25 Research Communication 96 (1980) 157 - 162] ovat syntetisoineet fluoresoivan boronihappomolekyylin, N-(5-dimetyy-liamino-l-naftaleenisulfonyyli)-3-aminobentseeniboroniha-pon, jonka on osoitettu sitoutuvan solukalvoihin solujen fluoresenssimikroskopiaa varten.

30 Schleicher on kuvannut DE-hakemusjulkaisussa 3 720 736, joka on julkaistu 5. tammikuuta 1989, boroni-happojen fluoresoivia ja värillisiä diatsokonjugaatteja, jotka soveltuvat näytteessä läsnä olevien glykosyloitunei-den proteiinien kokonaismäärän määritykseen. Schleicherin 35 menetelmä perustuu johonkin seuraavista kolmesta periaat- 6 100437 teestä näytteen sisältämien glykoproteiinien kokonaismäärän mittaamiseksi: 1. boronihappokonjugaatin absorptiohuipun siirtymään konjugaätin ollessa sitoutunut glykoproteiinien gly- 5 kosyloituneisiin osiin tai 2. fluoresenssin polarisaation muutokseen, kun fluoresoivat boronihappokonjugaatit sitoutuvat läsnä olevien kokonaisglykoproteiinien glykosyloituneisiin osiin, tai 10 3. kokonaisglykoproteiiniin sitoutuneen, värillisen tai fluoresoivan boronihappokonjugaatin määrän mittaamiseen sen jälkeen, kun ylimääräinen sitoutumaton boronihappokon jugaatti on poistettu esimerkiksi aktiivihiiltä käyttäen.

15 Mitään Schleicherin (ibid) kuvaamista menetelmistä ei voida kuitenkaan käyttää jonkin määrätyn glykopro-teiinin määrittämiseen kvantitatiivisesti seoksesta, jossa on mukana muita glykoproteiineja, eikä varsinkaan gly-kosyloituneen hemoglobiinin määrittämiseen spesifisesti 20 potilaista otetuista hemolysoiduista näytteistä. Lisäksi

Schleicherin esittämillä reagensseilla on melko alhainen absorptiokerroin ja niiden absorptiohuiput ovat lähellä hemoglobiinin huippuja, mikä tekee glykosyloituneen hemoglobiinin detektion vaikeaksi tai mahdottomaksi jopa 25 silloin, kun se esiintyy puhtaassa muodossa. Schleicher ei tosin mainitse mitään menetelmänsä käyttämisestä glykosyloituneen hemoglobiinin analysointiin mutta ehdottaa sitä sen sijaan glykosyloituneiden seerumiproteiinien kokonaismäärän ja ihmisen seerumista eristetyn glykosyloituneen 30 albumiinin analysointiin.

On myös tutkittu glykoproteiinien kanssa reaktioky-kyisiä lektiinejä, joskaan toistaiseksi ei ole identifioitu sellaisia lektiinejä, jotka reagoisivat spesifisesti glykosyloituneen hemoglobiinin kanssa ja olisivat käyttö-

II

7 100437 kelpoisia glykosyloituneiden hemoglobiinien kvantitatiivisessa määrityksessä.

Erästä glykosyloituneen hemoglobiinin määritystä, joka perustuu glykosyloituneen jakeen leimaamiseen boro-5 nihappojohdannaisia käyttäen ja hemoglobiinin erottamisen näytteestä immobilisoituja, hemoglobiiniin sitoutuvia proteiineja käyttäen kuvataan US-patenttijulkaisussa 4 861 728 (Wagner), joka on julkaistu tämän patenttihakemuksen ensimmäisen prioriteettipäivämäärän jälkeen. 10 FR-hakemusjulkaisu 2 464 475 (Amicon) kuvaa glykoproteii- nimääritystä, joka soveltuu glykosyloituneen hemoglobiinin määrittämiseen näytteestä ja jossa käytetään boronihappo-perustaisia reagensseja glykosyloituneen jakeen erottamiseen näytteestä, jonka jakeen suuruus sitten määritetään. 15 Kaivataan siis parempaa menetelmää glykosyloituneen hemoglobiinin määrittämiseksi, joka menetelmä on spesifinen, nopea ja yksinkertainen käyttää ja mukautuu helposti käytettäväksi kliinisissä laboratorioissa.

Olemme nyt todenneet, että yhdistämällä sekä glyko-20 syloituneen että glykosyloitumattoman jakeen erottaminen näytteestä ja boronihappojohdannaisten spesifinen kyky tunnistaa hiilihydraatti pelkästään glykosyloituneen jakeen detektoimiseksi, voidaan saada aikaan tehokas ja spesifinen määritys.

25 Yhdeltä kannalta katsottuna tämä keksintö tarjoaa siis menetelmän glykosyloituneen hemoglobiinin määrittämiseksi näytteestä, joka menetelmä käsittää (a) mahdollisesti näytteen hemolyysin mahdollisen soluihin sitoutuneen hemoglobiinin vapauttamiseksi, 30 (b) mainitun näytteen tai mainitusta näytteestä alla esitetyn vaiheen c mukaisesti talteen saadun hemoglobiinin saattamisen kosketuksiin signaalin muodostavien molekyylien kanssa, jotka koostuvat yhden tai useamman dihydroksiboryyliryhmän tai sen/niiden suolojen konjugaa- 8 100437 tista, jossa ryhmä(t) tai suola(t) on liitetty signaalin muodostavaan merkkiaineeseen, (c) glykosyloituneen ja glykosyloitumattoman hemoglobiinin ja niihin mahdollisesti sitoutuneiden molekyy- 5 lien erottamisen näytteestä tai edellä esitetyn vaiheen b mukaisesta reaktioseoksesta ja (d) mainittujen signaalin muodostavien molekyylien, jotka ovat sitoutuneet erotettuun hemoglobiiniin, ja/tai mahdollisten hemoglobiiniin sitoutumattomien signaalin 10 muodostavien molekyylien määrityksen.

Sen lisäksi, että määritetään glykosyloituneen hemoglobiinin taso näytteessä, saattaa keksinnön mukaisen menetelmän toteutuksessa myös olla toivottavaa määrittää läsnä olevien glykosyloituneen ja glykosyloitumattoman 15 hemoglobiinin taso ja laskea glykosyloituneen ja kokonaishemoglobiinin suhde.

Hemoglobiininerotusvaihe ei edellytä koko näytteen sisältämän hemoglobiinimäärän (glykosyloituneen ja glykosyloitumattoman) erottamista. Riittää, että erotetaan vain 20 osa glykosyloituneesta ja glykosyloitumattomasta jakeesta, kunhan menetelmä on asianmukaisesti tarkistettu. Sellaiset tarkistukset ovat rutiinitoimenpiteitä kliinisissä laboratoriomäärityksissä .

Tässä käytettynä sanan "määritys" on tarkoitus sul-25 kea sisäänsä kvantitatiivinen määritys sekä siinä merkityksessä, että saadaan absoluuttinen arvo glykosyloituneen tai kokonaishemoglobiinin määrälle näytteessä, että siinä merkityksessä, että saadaan myös kerroin, suhdeluku, prosenttiluku tai muu samantapainen osoitus glykosyloituneen . 30 hemoglobiinin tasosta esimerkiksi suhteessa näytteen koko- naishemoglobiinipitoisuuteen.

On huomattava, että keksinnön mukaisessa uudessa menetelmässä vältetään glykosyloituneen hemoglobiinijakeen erotus glykosyloitumattomasta jakeesta ja että se perustuu 35 sen sijaan sekä glykosyloituneen että glykosyloitumattoman 11 9 100437 hemoglobiinin erottamiseen näytteestä. Signaalin muodostavien boronihappojohdannaisten immobilisointi ei siis ole tarpeen, koska niitä ei käytetä erotussysteemin osana, ja on itse asiassa edullista, että niitä ei immobilisoida.

5 Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää gly- kosyloituneen hemoglobiinin määrän määrittämiseen sekä terveistä yksilöistä että sellaisista potilaista, jotka sairastavat tai joiden epäillään sairastavan diabetes mel-litusta, peräisin olevista verinäytteistä, verihemolysaa-10 teista ja veriuutteista. Erityisen käyttökelpoinen se on hemoglobiinin määrittämisessä verestä tai hemolysaatista tai muista sellaisista seoksista, jotka sisältävät glyko-syloituneen hemoglobiinin lisäksi muita glykosyloituneita proteiineja ja/tai glykoproteiineja ja/tai hiilihydraatte-15 ja. Näytteet voivat olla kuivassa, nestemäisessä tai pakastetussa muodossa ennen analyysia. Hemolysaatit voidaan valmistaa keksinnön mukaisella menetelmällä tehtävää analyysia varten esimerkiksi käyttämällä hemolysointiin ja glykosyloituneen hemoglobiinin hiilihydraattiryhmien al-20 tistamiseen sitoutumisreaktioille erilaisia reagensseja. Tämä käsittely voidaan tehdä ennen muiden tämän menetelmän toteuttamiseksi välttämättömien reagenssien käyttöä tai siihen yhdistettynä. Häiriöiden pienentämiseksi näytteet ... voidaan haluttaessa käsitellä läsnä olevan vapaan glukoo- 25 sin ja/tai labiilien glykohemoglobiinien tason alentamiseksi esimerkiksi glukoosioksidaasia tai sellaista puskuriliuosta käyttäen, jonka pH on alle 6.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä signaalin muodostavien molekyylien tai konjugaattien reaktio hemoglobiini-30 en kanssa voi tapahtua joko ennen hemoglobiinin erottamista näytteestä tai sen jälkeen. Valittava järjestys riippuu siitä kemiallisesta välineistöstä tai niistä instrumenteista, jota/joita menetelmän toteuttamiseen on tarkoitus käyttää, sekä siitä, kumpi havaitaan käytännöllisemmäksi.

10 100437

Eräässä keksinnön edullisessa suoritusmuodossa signaalin muodostavan molekyylin sitominen tai hemoglobiinin eristys tapahtuvat samanaikaisesti homogeenisessa liuoksessa, josta hemoglobiini saostetaan ja eristetään sentri-5 fugoimalla tai suodattamalla. Reaktio- ja erotusolosuhteet on kuitenkin valittava glykosyyliryhmä-boronihappoliitty-misvakioiden asettamat rajoitukset huomioon ottaen, jotka vakiot melko alhaisia ( 103 - 105 mol"1·!).

Mainituista signaalin muodostavista molekyyleista 10 saatavan signaalin voimakkuuden perusteella voidaan määrittää hemoglobiineihin sitoutuneiden tai niiden mukana erottuneiden signaalin muodostavien molekyylien pitoisuus. Kuten edellä mainittiin, mitään "absoluuttista" standardia glykosyloituneen hemoglobiinin määrittämiseksi ei ole vie-15 lä olemassa. Tämän uuden menetelmän kalibrointi tekniikan tasoa edustavien menetelmien suhteen tai korrelointi niiden kanssa voidaan kuitenkin haluttaessa saavuttaa käyttämällä hemoglobiinistandardiliuoksia, jotka sisältävät gly-kosyloitunutta hemoglobiinia tunnettuina pitoisuuksina, 20 jotka on määritetty yhdellä tai useammalla tekniikan tasoa edustavalla menetelmällä.

Signaalin muodostavat molekyylit ja konjugaatit voivat hyvin sisältää fenyyliboronihapporyhmiä liittyneinä signaalin muodostavaan merkkiaineeseen joko suoraan, amii-25 ni- tai amidisidoksella, väliryhmän kautta tai millaisella, tällä alalla tunnetulla kemiallisella sidoksella tahansa, joka jättää dihydroksiboryyliryhmät vapaiksi reagoimaan hemoglobiinien glykosyyliosien cis-dioliryhmien kanssa. Haluttavasta boronihapporyhmien pKa-arvosta riip-30 puen fenyylirengas voi olla lisäksi substituoitu esimerkiksi nitro-, formyyli- tai alkoksyyliryhmillä tai muilla pKa-arvoon vaikuttavilla substituenteilla, jotka eivät estä steerisesti sitoutumista glykosyloituneiden hemoglobiinien cis-dioliryhmiin.

11 100437 Tämän keksinnön mukaisten signaalin muodostavien molekyylien syntetisointiin käytettävät boronihapporyhmät on tarkoituksenmukaista valmistaa aminofenyyliboronihappo-ryhmistä, esimerkiksi m-aminofenyyliboronihapporyhmistä, ja liittäminen mainittujen signaalin muodostavien molekyylien tai konjugaattien merkkiaine- eli signaalinmuodosta-vaan osaan toteutetaan tyypillisesti diatsoniumionin muodostuksen tai silanisoinnin avulla tai käyttämällä kytken-täaineita, kuten esimerkiksi glutaaridialdehydejä, karbo-di-imidejä, syanogeenihalogenideja, sukkiini-imidejä tai joitakin muita yleisessä kemian alan kirjallisuudessa esitettyjä kytkentäaineita. Signaalin muodstava merkkiaine liitetään sillä tavalla, että boronihapporyhmä jää vapaaksi reagoimaan analysoitavan glykosyloituneen hemoglobiinin cis-dioliryhmien kanssa, ja voi olla etukäteen "aktivoitu" sen tekemiseksi reaktiiviseksi dihydroksiboryyliryhmien amiini- tai muiden reaktiivisten osien suhteen, esimerkiksi dimetyyliaminoatsobentseeni-isotiosyanaatin tai dime-tyyliaminonaftaleenisulfonyylikloridin suhteen. Keksinnön mukaisia signaalin muodostavia molekyylejä voi olla myös muunnettu edelleen vesiliukoisuuden parantamiseksi.

Keksinnön mukaisesti käytettäväksi soveltuva signaalin muodostava dihydroksiboryylireagenssi on edullisesti immobilisoimattomassa muodossa ja sisältää boronihappo-ryhmiä liittyneinä suoraan tai epäsuorasti kemiallisiin rakenteisiin (merkkiaineisiin), jotka kykenevät suoraan tai epäsuorasti muodostamaan signaaleja, joita voidaan käyttää kemiallisiin tai fysikaalisiin kvantitatiivisiin määrityksiin. Signaalin muodostava merkkiaine voi sisältää yhtä tai useampaa entsyymiä, edullisesti entsyymejä, jotka eivät sisällä hiilihydraatti-cis-dioliryhmiä tai joista on poistettu cis-dioliryhmiä sisältävät jakeet. Vaihtoehtoisesti signaalin muodostava merkkiaine voi koostua osaksi tai kokonaan värillisistä tai fluoresoivista ryhmistä. Alalla tunnetaan suuri määrä merkkiaineina käytettäviksi 12 100437 soveltuvia värillisiä, fluoresoivia ja pigmentillisiä yhdisteitä, joita voidaan käyttää. Sopivia esimerkkejä ovat antrakinonit, atsoväriaineet, atsiiniväriaineet, kuten esimerkiksi oksatsiinit ja tiatsiinit, triatsiinit, luon-5 nossa esiintyvät pigmentit, kuten esimerkiksi porfyriinit, fykobiliproteiinit, kuten esimerkiksi fykoerytriinit ja fykosyaniinit, klorofyllit sekä niiden analogit ja johdannaiset, karotenoidit, akridiinit, ksanteenit, mukaan luettuina fluoreseiinit ja rodamiinit, indigoväriaineet, tio-10 ksanteenit, kumariinit, polymetiinit, mukaan luettuina di-ja triaryylimetiinit ja niiden johdannaiset, sekä ftalo-syaniinit ja metalliftalosyaniinit, jotka ovat mahdollisesti sitoutuneet väliryhmien kautta, jotka ovat sijoittuneet signaalin muodostavan merkkiaineen ja boronihapporyh-15 mien väliin, jotka boronihapporyhmät jätetään vapaiksi reagoimaan analysoitavien glykoproteiinien cis-diolien kanssa.

Tässä keksinnössä käytettävän reagenssin signaalin muodostavana merkkiaineosana voidaan käyttää myös monen-20 laisia radioaktiivisia yhdisteitä, joiden joukkoon kuuluvat jodi-125:llä leimatut yhdisteet. Sellaisia leimattuja yhdisteitä voidaan saada aikaan kätevästi leimaamalla fe-nyyliboronihappojen hiilirengas 125I:llä tai konjugoimalla aminof enyyliboronihappo 125I: llä leimattuihin reagensseihin, 25 esimerkiksi tunnettuun Bolton-Hunter-reagenssiin. Katsauksen sellaisiin radioaktiivisen leimauksen tekniikkoihin on esittänyt Bolton artikkelissa Biochem. J. 133 (1973) 529 -539. Tämän keksinnön mukaisen menetelmän toteutuksessa ovat melko korkeat reagoivien aineiden pitoisuudet välttä-30 mättömiä, joten monissa tämän keksinnön suoritusmuodoissa 125I:llä leimatut konjugaatit voidaan sekoittaa rakenteeltaan samanlaisten tai erilaisten, ei-radioaktiivisten boori- tai boronihappojen kanssa sopivaa tasoa olevan määri-tysreagenssien radioaktiivisuuden saavuttamiseksi.

Il 13 100437

Vaihtoehtoisesti boronihapporyhmät voidaan konju-goida luonnollisiin tai synteettisiin yhdisteisiin, jotka kykenevät tuottamaan kemiluminesoivan signaalin, joka voidaan määrittää tunnetulla tavalla (M. J. Cormier et a.1., 5 Chemiluminescence and Bioluminescence, Plenum Press, New York, 1973). Sopivia kemiluminesoivia yhdisteitä ovat lu-siferiini, oksaalihappoesterit, 1,2-dioksietaani, luminoli tai sen johdannaiset, mutta ne eivät rajoitu näihin. Mikäli se tarkoituksenmukaista, kemiluminesoivan signaalin 10 tuottamiseen signaalin muodostavista molekyyleistä voidaan käyttää vetyperoksidia, entsyymejä, esimerkiksi lusiferaa-sia, tai muita kemikaaleja.

Voimakkaasti anionisia signaalin muodostavia konju-gaatteja ei ole edullista käyttää keksinnön mukaisessa 15 menetelmässä, koska niillä on taipumus sitoutua näytteessä ehkä läsnä oleviin seerumiproteiineihin, kuten esimerkiksi ihmisen seerumialbumiiniin (HSA). Eräs erikoisen sopiva esimerkki, jota voidaan käyttää, on konjugaatti, joka saadaan fluoreseiini-isotiosyanaatin reaktiolla aminofenyyli-20 boronihapon kanssa, jolloin syntyy konjugaatti, joka sisältää vapaan karboksyyliryhmän. Muita sopivia konjugaat-teja ovat fluoreseiiniin esimerkiksi l-etyyli-3-(3-dime-tyyliaminopropyyli)karbodi-imidin (EDC) avulla konjugoitu aminofenyyliboronihappo ja aminofenyyliboronihappoon kon-25 jugoitu fluoreseiini-isotiosyanaatti, joka sisältää suojattuja karboksyyliryhmiä tai josta karboksyylihappo-osa on poistettu. Voidaan myös käyttää rodamiini B:tä, joka on konjugoitu esimerkiksi karbodi-imidin avulla fenyyliboro-nihappoon, mutta tällä konjugaatilla on melko huono liu-30 koisuus useimpiin sellaisiin liuoksiin, jotka ovat kiinnostavia keksinnön mukaisella menetelmällä tehtäviä määrityksiä ajatellen. Eräs erikoisen edullinen signaalin muodostava molekyyli, jonka keksinnön tekijä on konjugoinut aminofenyyliboronihappoon ja jonka liukoisuusominaisuudet 35 ovat osoittautuneet erinomaisiksi ja epäspesifinen sitou- 14 100437 tuminen proteiineihin vähäiseksi, on N-(resorufiini-4-kar-bonyyli)piperidiini-4-karboksyylihaponN-hydroksisukkiini-imidiesteri (josta tästä eteenpäin käytetään lyhennettä RESOS). Mainittu vähäinen sitoutuminen proteiineihin saat-5 taa johtua anionisten ryhmien pienemmästä määrästä verrattuna sellaisiin konjugaatteihin kuin FITC-aminofenyylibo-ronihappokonj ugaatti.

Boronihapporyhmiä -B-(0H)2 kutsutaan usein sähköisesti neutraalissa muodossaan dihydroksiboryyliryhmiksi, 10 ja ne muodostavat anioneja sitomalla hydroksyyli-ioneja -B-(OH)3- ja voivat sellaisina muodostaa suoloja. Menetelmässä käytettävät ja tämän keksinnön tarjoamat reagenssit voivat sisältää ryhmiä, joissa esiintyy yksi tai useampia näistä boronihapon muodoista reagenssikoostumuksen pH:sta 15 ja elektrolyyttisisällöstä riippuen. Juuri anionisessa muodossaan boronihapporyhmät sitoutuvat glykosyloituneiden hemoglobiinien cis-dioliryhmiin. Boronihapporyhmien anio-nivahvuus on kuitenkin riittävän alhainen, jotta se ei aiheuta ongelmia sitoutumisessa proteiineihin, kuten esi- 20 merkiksi HSA:han.

Moolimassaltaan suurten signaalin muodostavien bo-ronihappokonjugaattien käyttöä tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä on edullista välttää useimpien glykosyloituneiden hemoglobiinien glykosyloituneen osan rajoitetun 25 saavutettavuuden vuoksi; huomattavassa osassa veren gly- kosyloituneesta .hemoglobiinista glykosylaatio tapahtuu β-ketjun N-päätteiseen valiiniaminohappoon, joka ei ole helposti vesiliukoisten suurimoolimassaisten molekyylien saavutettavissa, kuten edellä mainitussa US-patenttijul-30 kaisussa 4 658 022 on kuvattu. Tässä patenttijulkaisussa ’ esitetään hyvin huomattavan denaturoinnin käyttämistä gly kosyloituneen ryhmän saattamiseksi alttiiksi vasta-ainesi-toutumisreaktioille.

Keksinnön mukaisen menetelmän yhden suoritusmuodon 35 mukaisesti kokonaishemoglobiini voidaan erottaa näytteestä li 15 100437 hemoglobiinin suhteen spesifisten, immobilisoitujen, sitoutuvien proteiinien avulla, kuten esimerkiksi vasta-aineiden tai haptoglobiinin avulla, jotka kytketään sellaisiin pintoihin kuin suodattimet, kalvot, helmet, geelit, 5 mikromaljaliuskat, putket tai levyt joko hydrofobisella vuorovaikutuksella tai kemiallisella kytkennälä, joka tehdään joko suoraan tai sekundaaristen vasta-aineiden avulla. Tämä ei kuitenkaan ole yleensä edullista, koska boro-nihapon ja hiilihydraattien cis-dioliryhmien väliset liit-10 tymisvakiot ovat alueella 103 - 105 mol'1·! [Evans et ai., Anal. Biochem. 95 (1979) 383; C. Zittle, Advan. Enzym. 12 (1951) 493], ja koska sitoutuvan proteiinin tehollinen pitoisuus immobilisoituna on siten melko alhainen, boroniha-pon sitoutuminen cis-dioliryhmiin pienenee myös vastaavas-15 ti. Sen kompensoimiseksi vaaditaan siten suuri sitomiska-pasiteetti ja se on teknisesti vaikea saavuttaa. Tämä rajoittaa myös sellaisten kiinteiden faasien käyttöä, joilla on pieni sitomiskapasiteetti, kuten esimerkiksi polysty-reenipintojen käyttöä. Kiinteiden faasien sitomiskapasi-20 teettia voidaan kuitenkin suurentaa käyttämällä geelejä, mikrohelmiä tai muita tunnettuja kiinteitä faaseja, joilla on suuri pinta-ala tilavuusyksikköä kohden, mutta sellaiset kiinteät faasit voivat olla melko epäkäytännöllisiä kliinistä rutiinikäyttöä ajatellen. Käytettäessä hemoglo-25 biinin erottamiseen immobilisoituja, hemoglobiiniin spesi fisesti sitoutuvia proteiineja signaalin muodostavat molekyylit on edullista leimata muulla kuin alkalisella fosfa-taasientsyymillä.

Keksinnön edullisemmissa suoritusmuodoissa hemoglo-30 biinien (ja niihin sitoutuneiden signaalin muodostavien molekyylien) erotus toteutetaan seostamalla hemoglobiinit kokonaisuudessaan selektiivisesti homogeenisista liuoksista esimerkiksi käyttämällä sopivia saostusreagensseja mahdollisesti kromatografia-, sentrifugointi- tai suodatus-35 systeemiin yhdistettyinä.

16 100437

Hemoglobiinien erotus voidaan siten toteuttaa immo-bilisoimattomien, hemoglobiiniin spesifisesti sitoutuvien proteiinien avulla, kuten esimerkiksi spesifisten monoklo-naalisten tai polyklonaalisten vasta-aineiden, haptoglo-5 biinien, jotka voivat olla mitä ihmisen hemoglobiineihin sitoutuvaa lajia tahansa, tai minkä muiden sellaisten proteiinien avulla tahansa, jotka sitoutuvat hemoglobiiniin ja muodostavat sakan tai poistavat hemoglobiinin muulla tavoin liuoksesta. Sakan muodostamiseen hemoglobiinin 10 kanssa voidaan siis käyttää eri epitooppien suhteen reaktiivisia monoklonaalisia vasta-aineita tai polyklonaalisia vasta-aineita. Saostuminen voidaan saada aikaan myös sekundaaristen vasta-aineiden avulla tai haptoglobiinien ja haptoglobiinin kanssa reaktiokykyisten vasta-aineiden yh-15 distelmien avulla. Edullisesti voidaan käyttää vasta-aineita, jotka eivät sisällä cis-dioliryhmiä tai joista on poistettu cis-diolin sisältävät osat, tai niiden immuuni-reaktiivisia fragmentteja.

Tämän menetelmän puutteena on kuitenkin se, että 20 koska signaalin muodostavia molekyylejä sisältävän boroni-hapon ja glykosyloituneiden hemoglobiinien glykosyloitu-neiden ryhmien välinen liittymisvakio on ainoastaan suuruusluokkaa 103 - 10s mol*1·!, melko suuret reagoivien aineiden pitoisuudet ovat välttämättömiä, jolloin seurauk-25 sena on melko suuri vasta-aineiden tai haptoglobiinin kulutus testiä kohden.

Keksinnön edullisissa suoritusmuodoissa hemoglobiinin saostus spesifisesti homogeenisesta liuoksesta toteutetaan metallikationeja tai orgaanisia liuottimia käyttä-. 30 en. Tämän etuna on se, että voidaan käyttää hyvin suuria • hemoglobiinipitoisuuksia, sakka voidaan erottaa helposti esimerkiksi sentrifugoimalla tai suodattamalla ja reagens-sit ovat halpoja ja tehokkaita.

Eräässä sellaisessa suoritusmuodossa käytetään hy-35 väksi sitä seikkaa, että hemoglobiini on veteen erittäin 17 100437 hyvin liukeneva proteiini, ja keksinnön tekijä on saanut hemoglobiinin saostumaan liuoksesta spesifisesti tai lähes spesifisesti käyttämällä tiettyjä orgaanisia liuottimia, esimerkiksi alkoholeja, kuten etanolia ja/tai butanolia, 5 ketoneja, kuten asetonia, eettereitä, esimerkiksi syklisiä eettereitä, kuten dioksaania ja tetrahydrofuraania, amidi-liuottimia, kuten dimetyyliformamidia tai dietyyliformami-dia, sulfoksidiliuottimia, kuten dimetyylisulfoksidia, hiilivetyliuottimia, kuten tolueenia, ja halogeenihiilive-10 tyliuottimia, kuten kloroformia. Tehtäessä saostus kokove-rinäytteestä, joka oli laimennettu niin, että se sisälsi noin 6,5 mg hemoglobiinia ja 1,5 mg HSA:ta/ml, lisäämällä siihen butanolin (50 til-%) ja etanolin (50 til-%) seosta niin, että butanolin loppupitoisuudeksi tuli 9 til-%, 94 % 15 hemoglobiinista ja vain 1 % HSA:sta saostui. Sellaine^sa-ostus saatiin aikaan cis-dioliryhmiin sitoutuneiden boro-nihapporyhmien irtoamatta.

Hemoglobiinin spesifinen saostus voidaan toteuttaa myös käyttämällä proteiineihin sitoutuvia ja niistä aggre-20 gaatteja muodostavia metallikationeja. Sopivia kationeja ovat sinkki, kupari sekä nikkeli, koboltti ja kadmium, jotka kolme viimeksi mainittua eivät ole yhtä edullisia. Hemoglobiinin saostusta kuparikelaatteja tai kuparisul-faattia käyttäen kuvaavat Van Dam et ai. artikkelissa Bio-25 technical Appi. Biocehm. 11 (1989), nro 5, 492 - 502, mutta sen käyttöä hemoglobiinin määrityksessä ei ehdoteta. Tämän merkittävänä etuna on se, että kaikki näin saostettu hemoglobiini voidaan liuottaa helposti uudelleen jotakin liukoisuutta edistävää kompleksinmuodostajaa lisäämällä. 30 Sinkki-ioneja käyttämällä kyetään saavuttamaan hemoglobiinin jokseenkin spesifinen saostuminen kokoverihemolysaa-teista, mikä on odottamaton havainto. Esimerkiksi käyttämällä sinkki-ionipitoisuutta 2,5-4 mmol/1, kun läsnä on 6,5 mg hemoglobiinia ja 1,5 mg HSA:ta/ml, saavutetaan he-35 moglobiinin spesifinen tai lähes spesifinen saostuminen.

18 100437

Sinkki-ionien pitoisuuden ollessa yli 4 mmol/1 tapahtui kuitenkin HSA:n huomattavaa rinnakkaissaostumista. Tätä valaisevat tulokset, jotka on esitetty alla: 5 Zn-pitoisuus Saostunut Saostunut (mmol/1) Hb (%) HSA (%) 2,6 87 6 3,9 87 15 6,5 91 92 10

Ionipitoisuus pitää kuitenkin säätää huolellisesti, jotta ei häiritä käytettäviä signaalin muodostavia boroni-happojohdannaisia. Saostunut hemoglobiini voidaan haluttaessa pestä tai suodattaa ylimääräisten kationien poista-15 miseksi ennen reaktiota signaalin muodostavien boronihap-pokonjugaattien kanssa. Tämä reaktiojärjestys on erityisen edullinen käytettäessä melko anionisia signaalin muodostavia boronihappokonjugaatteja, koska ylimääräisten sinkki-ionien aniosten konjugaattien välinen suorasta sitoutumi-20 sesta voi olla seurauksena epätoivottavaa häiriötä. Sinkin lisäksi voidaan käyttää muitakin metallikationeja edellyttäen, että ne eivät saostu itsestään saostusreaktiossa käytettävässä puskuriliuoksessa ja että niillä on samanlainen kyky saostaa hemoglobiini spesifisesti kuin sinkki-25 ioneilla.

Sen mahdollisuuden johdosta, että metalli-ionit voivat osallistua hydrolyysi- tai muihin reaktioihin tes-tiliuoksen sisältämien muiden reagenssien kanssa, on ryhdyttävä varotoimenpiteisiin sen varmistamiseksi, että me-30 tallikationit pysyvät liukoisina ja hemoglobiinin saostukseen käytettävissä olevina.

Jotkut tässä selityksessä kuvatuista signaalin muodostavista boronihappokonjugaateista sisältävät ryhmiä, jotka kykenevät luovuttamaan metallikationeille elektroni-35 parin ja toimimaan siten kompleksinmuodostajina. Tätä ky ti 19 100437 kyä muodostaa ligandi-metallikomplekseja voidaan käyttää reaktioiden säätelyyn, pitämään metalli-ionit liuenneina, estämään kompleksien muodostuminen metallin ja signaalin muodostavien boronihappojohdannaisten välillä ja varmista-5 maan metalli-ionien saatavuus ja riittävän suuret pitoisuudet, niin että saavutetaan hemoglobiinin toivottu saostuminen testiliuoksessa.

Koska on tarpeen ottaa huomioon sekä ligandipitoi-suus että eri metallikompleksien stabiilisuusvakiot, voi-10 daan käyttää sopivia puskurisuoloja estämään liukenemattomien metallikompleksien (joita kutsutaan tästä eteenpäin Me-komplekseiksi) muodostuminen.

Puskurisuolat, jotka muodostavat heikkoja yksiham-paisia Me-komplekseja, ovat siten edullisia ja yksi esi-15 merkki sellaisesta puskurista on ammoniumasetaatti yhdistettynä sinkin kanssa, jolloin muodostuu liukoisia Zn(Ac)-ja Zn(NH4)-komplekseja.

Lisäämällä puskuriin lujemmin kompleksoituvia aineita, kuten esimerkiksi monihampaisia kelaatin muodosta-20 via ligandeja, voidaan kontrolloida kaikkia mainittuja reaktioita testiliuoksessa. Kompleksinmuodostaja lisätään mooliselta pitoisuudeltaan sopivana vaadittavien moolisuh-teiden saavuttamiseksi eri komplekseissa ja tasapainon säilyttämiseksi muiden lisäaineiden kanssa, jotta varmis-25 tetaan, että kaikki reaktiot tapahtuvat optimaalisesti.

Kompleksinmuodostaja tulisi lisäksi valita kulloinkin käytettävä metallikationi huomioon ottaen, jotta varmasti vältetään kaikki mahdollisesti epätoivottavat sivuvaikutukset, kuten esimerkiksi metalli-ionin kompleksoituminen 30 liian lujasti.

Kelaatti-Me-kompleksin stabiilisuusvakion on oltava riittävän suuri, jotta se kykenee kilpailemaan testiliuoksessa mahdollisesti esiintyvien muiden kompleksinmuodostajien kanssa, esimerkiksi signaalin muodostavan boronihap-35 pokonjugaatin kanssa, mutta se ei saa olla niin luja, että 20 100437 metallikationin käytettävyys saostusaineena pienenee tai estyy.

Voidaan käyttää monia kelaatin muodostavia ligande-ja etyleeni-, propyleeni- tai butyleenidiamiini tai niiden 5 analogit, glysiini, aspartaatti, nitrilolaktaatti, histi-diini ja pikolinaatti mukaan luettuina. Voidaan myös käyttää monia muita luonnollisia tai synteettisiä kelaatinmuo-dostajia, kuten esimerkiksi hiilihydraatteja, orgaanisia happoja, joissa on useampia kuin yksi koordinoiva ryhmä, 10 aminohappoja, peptidejä, fenoliyhdisteitä ja vastaavia, mutta jotkut näistä, so. salisylaatit, oksalaatit, hiilihydraatit, kuten esimerkiksi sorbitoli, ja tartraatti, eivät ole edullisia, koska ne kykenevät muodostamaan komplekseja boronihapon kanssa ja kilpailevat siten glykosy-15 loituneen hemoglobiinin kanssa sitoutumisesta signaalin muodostavaan boorihappokonjugaattiin.

Voidaan myös käyttää monihampaisia kelaatin muodostavia ligandeja, kuten esimerkiksi EDTA:ta (etyleenidi-amiinitetraetikkahappoa), CDTActa (trans-1,2-diaminosyklo-20 heksaani-N,N,N',N'-tetraetikkahappoa, EGTAita (etyleeni- glykoli-o,o'-bis(2-aminoetyyli)-N,N,Ν',N'-tetraetikkahappoa, DTPArta (dietyleenitriamiinipentaetikkahappoa) jne., mutta joissakin tapauksessa ne saattavat olla epäedullisempia, koska ne kykenevät kompleksoitumaan lujasti metal-25 li-ionien kanssa, jolloin seurauksena on hemoglobiinin saostumisen pieneneminen voimakkaasti. Yksi esimerkki edullisesta yhdistelmästä on sinkki-ioneja sisältävä ammo-niumasetaattipuskuri.

Tämän keksinnön eri suoritusmuodoissa saattavat eri ; 30 kompleksinmuodostajat olla edullisia. Sellaisia komplek sinmuodostajia kuin EDTA ja DTPA voi hyvin käyttää, mutta niiden pitoisuus täytyy säätää tarkasti, kun niitä yhdistetään hemoglobiinin saostamiseen saostamiseen käytettävien metallikationien kanssa. Sitruunahappo ja oksaalihappo 35 ovat epäedullisempia boronihapporyhmien kanssa ilmenevien li 21 100437 vuorovaikutusten vuoksi. Muita esimerkkejä, joita voidaan käyttää, ovat hepariini ja fluoridi-ionit.

Sakat, jotka saadaan homogeenisista liuoksista esimerkiksi mainitulla orgaanisten liuottimien tai metallika-5 tionien käytöllä, voidaan erottaa kokonaan tai osaksi sentrifugoimalla tai suodattamalla tai muilla alalla tunnetuilla tekniikoilla.

Hemoglobiinin erottamiseen voidaan käyttää myös suodatinkalvoja tai TLC-systeemejä, mahdollisesti yhdessä 10 vasta-aineiden tai niiden immuunireaktiivisten fragmenttien tai haptoglobiinien kanssa, jotka on immobilisoitu niille hemoglobiinin sitomista varten, esimerkiksi kasto-tikku- tai monikerroskalvomuodossa.

Eräs edullisista menetelmistä on hemoglobiinin ero-15 tus sentrifugoimalla, jota seuraa sakan erotus supernatan-tista. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää hyvin suodatusta, ja se voidaan tehdä joko kohtisuorasti suodatinpintaan nähden suodattimen läpi tai tangentiaalisesti tai säteit-täisesti suodattimen sisällä yksi- tai kaksisuuntaisessa 20 erotusmenetelmässä.

Voidaan myös käyttää ohutkerroskromatografiamene-telmiä esimerkiksi laittamalla näyte sopivalle kromatogra-fiaväliaineelle, esimerkiksi testiliuskalle ja geelille, ja laittamalla reagenssit ja pesuliuokset suoraan siihen 25 kohtaan, johon näyte laitettiin, tai suorittamalla eluointi.

Toisissa suoritusmuodoissa hemoglobiini voidaan saostaa liuoksesta suoraan suodatus- tai muun kiinteässä olomuodossa olevan kromatografiaväliaineen pinnalle tai 30 sisään, jossa tapauksessa sakka voidaan kerrostaa kiinteän faasin pinnalle tai sisään muodostuksensa jälkeen tai samalla, kun se muodostetaan. Reagenssit voidaan levittää kiinteässä olomuodossa olevaan huokoiseen väliaineeseen ennen saostusvaihetta, sen kanssa samanaikaisesti tai sen 35 jälkeen. Esimerkiksi reagenssit, kuten saostusaineet, sig- 22 100437 naalin muodostavat boronihapporeagenssit, hemolyysin aikaansaavat aineet, kompleksinmuodostajat tai muut reagens-sit, tuodaan siis kiinteässä olomuodossa olevan väliaineen sisään tai pinnalle edullisesti kuivassa muodossa. Sellai-5 set reagensseja sisältävät kiinteäfaasikromatografiaväli- aineet muodostavat keksinnön lisäaspekteja. Kiinteässä olomuodossa olevat väliaineet voidaan haluttaessa pestä tai saostusalueen läpi voidaan laske eluenttiliuos.

Alalla tunnetaan yleisesti monia reagensseja ja 10 menetelmiä, joita voidaan käyttää kokoverinäytteen sisältämien erytrosyyttien hemolysointiin ja hyvän kemiallisen kosketuksen varmistamiseen glykosyloituneiden hemoglobiinien ja signaalin muodostavien boronihappokonjugaattien välillä, mukaan luettuina hypotoninen hemolyysi, deter-15 genttien, kuten ionittomien polyetyleeniglykoliesteri- tai polyoksietyleenisorbitoliesterijohdannaisten, esimerkiksi "Tritonin" ja "Tweenin", kolaattien, natriumdodekyylisul-faattien ja guanidiinin käyttö, kuumennus, ultraäänikäsit-tely ja mitkä tahansa niiden yhdistelmät.

20 Signaalin muodostavat boronihappokonjugaatit voi daan saattaa kosketuksiin tai sekoittaa verihemolysaatti-näytteiden tai sellaisista näytteistä eristettyjen hemoglobiinien kanssa määrityspuskuriliuoksessa hemolyysikä-sittelyvaiheen jälkeen tai sen kanssa samanaikaisesti.

25 Voidaan käyttää monia määrityspuskuriliuoksia, ja niihin kuuluvat fosfaattipuskurit ja muut sellaiset puskuriliuokset, jotka kykenevät pitämään reaktioseoksen pH:n sopivana. Edullinen pH-alue määritykseen on 7,5 - 10,0, mutta toivottava pH riippuu lisäaineista, käytettävistä ; 30 puskurisuoloista ja käytettävän boronihappojohdannaisen pKa-arvosta. On olemassa joitakin merkkejä siitä, että amiinin sisältävät puskurit saatavat vahvistaa dihydroksi-boryyli-cis-diolivuorovaikutusta eli alentaa boraatin näennäistä pKa-arvoa. Tästä syystä sellaiset puskurit kuin 35 seriini, glysiini, Hepes [4-(2-hydroksietyyli)-l-piperat- 11 23 100437 siinietaanisulfonihappo], ammoniumasetaatti, morfOliini ja tauriini ovat edullisia. Dihydroksiboryyli- ja cis-dioli-ryhmien välisen vuorovaikutuksen edistämiseksi edelleen voidaan käyttää lisäaineita, kuten esimerkiksi divalentti-5 siä kationeja, detergenttejä ja kaotrooppisia aineita, varauksista aiheutuvien hylkimisten vähentämiseksi, kohde-molekyylien liukenevuuden edistämiseksi, hydrofobisten vuorovaikutusten rajoittamiseksi ja glykosyloituneen hemoglobiinin dioliryhmien saavutettavuuden parantamiseksi. 10 Eräitä puskureitam kuten Trisiä ja etanoliamiineja, tulisi kuitenkin välttää siitä syystä, että nämä puskurit kykenevät muodostamaan komplekseja boraatin kanssa ja estämään diolien sitoutumisen. Eräät puskuri-lisäaineyhdistelmät, kuten fosfaatti-sinkkiyhdistelmä, ovat myös epäedullisia 15 liukenemattomien yhdisteiden, kuten Zn3(P04)2:n, mahdollisen muodostumisen vuoksi.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä voidaan toteuttaa lämpötila-alueella 4-37 °C, ilman että saavutettavissa tuloksissa ilmenee mitään merkittäviä eroja.

20 Keksinnön mukainen menetelmä sisältää mainittujen signaalin muodostavien molekyylien määrityksen eli kvanti-fioinnin (so. signaalinlukuvaiheen) ja mahdollisesti myös sekä glykosyloituneessa että glykosyloitumattomassa muodossa esiintyvän kokonaishemoglobiinin määrityksen. Riip-25 puen siitä, mitä tämän keksinnön mukaisen menetelmän suoritusmuotoa käytetään, signaali voidaan lukea hemoglobiiniin sitoutuneista signaalin muodostavista molekyyleistä tai hemoglobiiniin sitoutumattomista signaalin muodostavista molekyyleistä. Käytännöllisintä on määrittää aikai-30 semmin eristettyihin hemoglobiineihin sitoutuneet signaalin muodostavat molekyylit.

Hemoglobiiniin sitoutuneiden tai hemoglobiinin mukana erottuneiden signaalin muodostavien molekyylien määritys toteutetaan konventionaalisen kemiallisen välineis-35 tön avulla, jota käytetään tavanomaisesti entsyymiaktiivi- 24 100437 suuden, fluoresenssin, radioaktiivisen säteilyn tai optisen tiheyden (absorbanssin) mittaamiseen, signaalin muodostavan merkkiaineen kemiallisesta luonteesta riippuen. Kiinteäfaasipinnan väri tai fluoresenssi voidaan mitata 5 helposti heijastusmittauksella, joka on yleisesti käytössä kliinisessä kemiassa. Kastotikku- tai suodatinmenettelyä tai muuta käytännöllistä kiinteäfaasimenettelyä käytettäessä hemoglobiinit ja/tai fluoresoivat tai värilliset signaalin muodostavat konjugaatit voidaan määrittää suoraan 10 pinnasta. Vaihtoehtoisesti saostettu tai immobilisoitu hemoglobiini ja/tai signaalin muodostavat boronihappokon-jugaatit voidaan liuottaa uudelleen ja mitata liuoksesta.

Samalla tavalla voidaan sellaiset signaalin muodostavat boronihappokonjugaatit, joilla on entsymaattista 15 aktiivisuutta, määrittää immobilisoidussa, liuotetussa tai uudelleen liuotetussa muodossa alalla tunnetun entsymomet-risen tekniikan avulla. Sama pätee radioaktiivisiin boro-nihappokonjugaatteihin, jotka voidaan määrittää tunnettuja radiometrisiä menetelmiä käyttäen.

20 Sekä erottuneen glykosyloituneen että glykosyloitu- mattoman hemoglobiinin pitoisuus voidaan määrittää mittaamalla absorptio relevanteilla aallonpituuksilla ennen ero-tusvaihetta tai sen jälkeen tai vaihtoehtoisesti voidaan mitata erotetun jakeen hemoglobiinisisältö. Viimeksi mai-25 nittu voidaan toteuttaa liuottamalla hemoglobiini absor-banssimittausten jälkeen uudelleen tai mittaamalla heijastus eristetyistä jakeista, tarvittaessa kiinteällä faasilla. Mikäli on tarkoitus määrittää kvantitatiivisesti fluoresoivat signaalin muodostavat molekyylit hemoglobiinin 30 läsnä ollessa, hemoglobiinin absorboimien aallonpituuksien ulkopuolella olevien aallonpituuksien eksitaatio ja emissio on edullista. Samoin, jos käytetään värillistä signaalin muodostavaa molekyyliä, hemoglobiinin absorboimien aallonpituuksien ulkopuolella oleva absorptioaallonpituus 35 on edullinen, kuten kuvio 1 osoittaa, jossa kuviossa on 11 25 100437 esitetty hemoglobiinin (1) sekä RESOS-aminofenyyliboroni-happokonjugaatin ja hemoglobiinin seoksen (2) absorptio-spektri. Hemoglobiinista aiheutuva osittainen häiriö voidaan kuitenkin hyväksyä ja korjata useammilla kuin yhdellä 5 aallonpituudella tehtyihin mittauksiin perustuvien laskelmien avulla.

Eräässä tämän keksinnön suoritusmuodossa hemoglobiini ja sitoutuneet signaalin muodostavat boronihapot eristetään mikrohelmille ja/tai suodattimena tai muulle 10 kiinteälle faasille, jotka seuraa hemoglobiinin ja signaalin muodostavien boronihappokonjugaattien kvantitatiivinen määritys reflektrometrisesti joko valonabsorptiomittausten tai fluoresenssimittausten avulla.

Toisissa tämän keksinnön suoritusmuodoissa käyte-15 tään näytteitä tai tiettyjä osuuksia hemolysaatista, joista on poistettu useita tai useimmat tai kaikki muut boro-nihapporyhmien tai niiden suolojen kanssa reaktiokykyiset proteiinit. Erytrosyytit voidaan esimerkiksi pestä ennen hemolyysiä plasmaproteiinien poistamiseksi, ennen kuin 20 näytteistä analysoidaan glykosyloituneet hemoglobiinit.

Vaihtoehtoisesti kokoverihemolysaatti voidaan käsitellä kiinteäfaasi-ioninvaihtoerottimella kaikkien sellaisten proteiinien poistamiseksi, joiden isoelektrinen piste on alempi ja/tai korkeampi kuin hemoglobiinilla. Tämä puhdis-25 tus voi haluttaessa olla osa tämän keksinnön mukaisen menetelmän täytäntöönpanoon tarkoitettua laitteistoa tai välineistöä.

Eräässä tämän keksinnön erikoissuoritusmuodossa mitataan se signaalin muodostavan molekyylin tai konjugaa-: 30 tin määrä, joka on sitoutunut hemoglobiini kilpailevan yh disteen ollessa läsnä ja puuttuessa. Kilpaileva yhdiste voi olla mikä tahansa cis-diolin sisältävä molekyyli, esimerkiksi sorbitoli tai mannitoli, tai boronihapon sisältävä molekyyli, jolla ei ole signaalinmuodostusaktiivi-35 suutta.

100437 ΔΌ

Toisessa tämän keksinnön erikoissuoritusmuodossa mitataan signaalin muodostavien molekyylien määrä reaktio-seoksessa ja/tai erotetussa jakeessa ennen hemoglobiinin erotusta ja sen jälkeen, jolloin käy mahdolliseksi laskea 5 se osuus signaalin muodostavista molekyyleistä, jonka sitoutuminen hemoglobiiniin poisti.

Koska tämä keksintö perustuu melko pieneen sitoutu-mislujuuteen (cis-dioliosien ja boronihapporyhmien välinen liittymisvakio 103 - 105 mol'1·!), glykosyloituneen hemoglo-10 biinin ja signaalin muodostavien boronihappokonjugaattien välillä ei tapahdu suoraa stökiometrista sitoutumista. Sitä paitsi tämä keksintö tarjoaa menetelmän, jossa hemoglobiinin kaikki glykosyyliryhmät ovat helposti käytettävissä sitoutumisreaktioihin; saavutetaan siis suurempia 15 sitoutuneiden boronihappokonjugaattien ja hemoglobiinin suhteita kuin on tekniikan tasoa edustavilla menetelmillä tavallisesti saavutettava glykosyloituneen hemoglobiinija-keen suhde kokonaishemoglobiiniin.

Veressä läsnä olevat vapaat hiilihydraatit saatta-20 vat saattavat pienessä määrin kilpailla boronihapporyhmis-tä. Näitä ilmiöitä vähentää signaalin muodostavien boronihappokonjugaattien käyttäminen ylimäärin. 20-kertainen moolinen ylimäärä on sopiva, mutta myös suurempia tai pienempiä suhteita voidaan käyttää riippuen siitä, mitä tämän 25 keksinnön suoritusmuotoa käytetään. Taustasignaali luon nollisesti esiintyy, ja se riippuu käytettyjen erotusme-nettelytapojen tehokkuudesta. Jos käytetään hyvin tehokasta erotussysteemiä, voidaan käyttää suurta ylimäärää. Mikäli ei käytetä erittäin suuria reagoivien aineiden pitoi-: 30 suuksia, glykosyloituneiden hemoglobiinien pitoisuus tuli si laskea mittauksista käyttämällä vertailunäytteitä, joissa glykosyloituneiden hemoglobiinien pitoisuus on tunnettu ja/tai tarkkaan tietoon liittymisvakioista perustuen. Sellaisten vertailunäytteiden käyttö on hyvin yleis- ti 27 100437 tä kliinisissä laboratorioissa harjoitettavassa lääketieteessä.

Tämä keksintö tarjoaa myös kuvatun menetelmän täytäntöönpanoon soveltuvia reagensseja, jotka sisältävät 5 yhden tai useamman boronihapporyhmän, joka on vapaa reagoimaan glykosyloituneiden hemoglobiinien glykosyloitunei-den ryhmien kanssa, liittyneenä/liittyneinä signaalin muodostaviin merkkiaineisiin, joilla voi olla entsymaattista aktiivisuutta tai jotka voivat olla värillisiä, fluoresoi-10 via, kemiluminesoivia tai radioaktiivisia, kuten edellä kuvattiin. Erityisen edullisia ovat koostumukset, jotka sisältävät lievästi anionisia signaalin muodostavia ryhmiä. Keksinnön mukaisille reagensseille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 19 tai 20 esitetään.

15 Eräältä kannalta katsottuna tämä keksintö tarjoaa vielä analyysiin liittyvän testivälineistön, joka on tarkoitettu keksinnön mukaisen menetelmän täytäntöönpanoon ja käsittää (a) reagenssin, joka sisältää signaalin muodostavan 20 molekyylin, joka koostuu yhden tai useamman dihydroksibo- ryyliryhmän tai sen/niiden suolojen konjugaatista, jossa ryhmä(t) tai suola(t) on liitetty signaalin muodostavaan merkkiaineeseen, ja (b) keinon glykosyloituneen tai glykosyloitumatto- 25 man hemoglobiinin erottamiseksi näytteestä mahdollisesti yhdistettyinä puskurisuoloihin tai -liuoksiin.

Seuraavat esimerkit ja valmistukset esitetään pelkästään keksinnön valaisemiseksi sitä mitenkään rajoittamatta: 30 Esimerkit

Valmistukset

Valmistusesimerkki 1 1. N-(resorufiini-4-karbonyyli)piperidiini-4-kar-boksyylihapon N-hydroksisukkiini-imidiesterin (RESOS) kon-35 jugaatti aminofenyyliboronihapon kanssa f 28 100437

Liuos A: 2 mg RESOS:ää liuotettiin 0,5 ml:aan dime-tyylisulfoksidia.

Liuos B: m-aminofenyyliboronihapon hemisulfaatti-suola liuotettiin 0,1 M natriumkarbonaattipuskuriin (pH 5 8,0) niin, että liuoksen väkevyydeksi tuli 15 mg/ml. pH

säädettiin arvoon 8,0.

0,5 ml liuosta A lisättiin 2 ml:aan liuosta B. Seosta inkuboitiin huoneen lämpötilassa 12 tuntia. Puhdistus tehtiin HPLC:n avulla. Konjugaatin rakenne on esitetty 10 kuviossa 2.

Valmistusesimerkki 2 2. Fluoreseiini-isotiosyanaatin (FITC) konjugaatti aminofenyyliboronihapon kanssa

Liuos A: 3,9 ml FITC:tä liuotettiin 1 ml:aan dime-15 tyylisulfoksidia.

Liuos B: m-aminofenyyliboronihapon hemisulfaatti- suola liuotettiin 0,2 M karbonaattipuskuriin (pH 9,5) niin, että liuoksen väkevyydeksi tuli 1,86 mg/ml.

1 ml liuosta A lisättiin hitaasti ja tasaisesti 20 sekoittaen 10 ml:aan liuosta B. Seksen annettiin reagoida huoneen lämpötilassa vähintään 2 tuntia, ja FITC-aminofe- nyyliboronihappokonjugaatti puhdistettiin HPLC:n avulla. Konjugaatin rakenne on esitetty kuviossa 3.

Valmistusesimerkki 3 25 3. Jodi-125:llä leimattu boronihappokonjugaatti

A: Aminofenyyliboronihapon (APBA, 10 mg/ml 50 mM

Na-fosfaatissa, pH 7,5) annettiin reagoida Bolton-Hunter-reagenssin (BH, 14,2 g/ml DMS0:ssa) kanssa. BH:ta lisättiin hitaasti APBA:hän, kunnes niiden tilavuusosuudet oli-; 30 vat yhtä suuret. Liuosta inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1 tunti.

B: Reaktiotuote erotettiin käänteisfaasipylväässä käyttäen eluoinnissa metanolin gradienttia vedessä, joka sisälsi 0,1 % trifluorietikkahappoa (TFA).

Il 29 100437 C: Eristetty BH-APBA-reaktiotuote leimattiin [125I]Nai: 11a kloramiini-T-menetelmällä. 0,5 ml BH-APBA-fraktiosta lisättiin 0,1 ml:aan 0,25 M Na-fosfaattia (pH 7,5) ja pH säädettiin arvoon 7,5. Lisättiin 10 μΐ 5 [125I]NaI:a (100 pCi) vastavalmistetun liuoksen lisäksi,

joka sisälsi 0,3 ml kloramiini-T:tä (10 mg/ml) 0,25 M

Na-fosfaatissa (pH 7,5), ja seosta inkuboitiin 1 minuutti.

D: Reaktio pysäytettiin lisäämällä 0,3 ml liuosta, joka sisälsi natriumvetysulfiittia (24 mg/ml) 0,25 M Na-10 fosfaatissa (pH 7,5).

E: Leimattu BH-APBA eristettiin käänteisfaasikroma-tografian avulla käyttäen eluoinnissa metanolin gradient-tia vedessä, joka sisälsi 0,1 % TFA:a.

Valmistusesimerkki 4 15 4. Boronihapon konjugaatti alkalisen fosfataasin kanssa 10 g alkalista fosfataasia, josta on poistettu boronihapon kanssa reaktiokykyiset entsyymimolekyylit laskemalla se immobilisoituja fenyyliboronihapporyhmiä sisältä-20 vän agaroosipylvään läpi, sekoitetaan karbonaattipuskuris- sa (pH 8,5) 30-kertaisen moolisen ylimäärän kanssa bis-(sulfosukkiini-imidyyli)suberaattia ja jätetään reagoimaan huoneen lämpötilaan 120 minuutiksi, jonka jälkeen lisätään 100-kertainen moolinen ylimäärä monoetanoliamiinia. 4 tun-25 tia myöhemmin entsyymikonjugaatit puhdistetaan geelikroma- tografian avulla.

Hemoglobiinin lähes spesifistä saostusta kokoveri-hemolysaateista havainnollistavia esimerkkejä

Metallikationit: 30 Liuos A: Kokoverihemolysaatti, joka on laimennettu 50 mM ammoniumasetaattiin (pH 8,0) niin, että lopullinen pitoisuus on 6,4 mg hemoglobiinia/ml.

Liuos B: Cu(S04) liuotettuna veteen niin, että liuoksen Cu2*-ionipitoisuus on 10 mmol/1.

30 100437

Liuos C: Zn(Cl)2 liuotettuna veteen niin, että liuoksen Zn2*-ionipitoisuus on 10 mmol/1.

Valmistusesimerkki 5 40 μΐ liuosta B lisättiin 200 pl:aan liuosta A.

5 Seosta inkuboitiin huoneen lämpötilassa 5 minuuttia ja hemoglobiinisakka erotettiin sentrifugoimalla.

Valmistusesimerkki 6 40 μΐ liuosta C lisättiin 200 pl:aan liuosta A. Seosta inkuboitiin huoneen lämpötilassa 5 minuuttia ja 10 hemoglobiinisakka erotettiin sentrifugoimalla.

Esimerkkejä menetelmän täytäntöönpanosta

Esimerkki 1

Kaikissa seuraavissa esimerkeissä menetelmästä menetelmää on verrattu klassiseen ioninvaihto-HPLC-menetel-15 mään, joka on artikkelin J. 0. Jeppson et ai.. Clinical Chemistry 32 (1988), nro 10, 1867 - 1872 mukainen (ja jota kutsutaan tästä eteenpäin lyhyesti "ioninvaihtomenetelmäk-si").

Kokoverinäyte hemolysoitiin ja laimennettiin hemo-20 lysoivaan määrityspuskuriin, joka oli 100 mM Hepes, joka sisälsi 0,05 % Triton X-l00:aa (pH 9,0), suunnilleen väkevyyteen 8 mg hemoglobiinia/ml. Lisättiin butanolin (50 til-%) ja etanolin (50 til-%) seosta ja edellä kuvattua FITC-aminofenyyliboronihappokonjugaattia niin, että 25 butanolin loppupitoisuudeksi saatiin 9 til-% ja konjugaa-tin pitoisuudeksi 1,6 x 10'4 mol/1. Muodostui sakka ja se erotettiin supernatantista sentrifugoimalla. Sakka liuotettiin uudelleen 0,05 M suolahappoon, joka sisälsi 5 % dimetyylisulfoksidia, ja hemoglobiinin pitoisuus mitattiin 30 absorptiospektroskoopian avulla ja FITC-aminofenyyliboro- nihappokonjugaatin pitoisuus todettiin fluoresenssimit-tauksin. Hemoglobiinin ja FITC-aminofenyyliboronihappokon-jugaatin pitoisuus laskettiin interpoloimalla kalibrointi-käyrät, jotka saatiin käyttämällä vertailuliuoksia, joissa 35 hemoglobiinin ja glykosyloituneen hemoglobiinin pitoisuu- 31 100437 det olivat tunnettuja, ja laskettiin glykosyloituneen hemoglobiinin prosenttiosuus hemoglobiinien kokonaismäärästä.

Seuraava valaisee tuloksia, jotka saavutettiin nou-5 dattamalla kuvattua menetelmää.

Glykosyloituneen hemoglo- Konjugaatin ja hemoglobii- biinin osuus (%) nin moolisuhde (ioninvaihtomenetelmä) 10 4,8 0,284 7,8 0,344 11,7 0,431

Esimerkki 2 15 Kokoverinäyte hemolysoitiin ja laimennettiin hemo- lysoivaan määrityspuskuriin suunnilleen väkevyyteen 8 mg hemoglobiinia/ml, ja lisättiin FITC-aminofenyyliboronihap-pokonjugaattia niin, että sen loppupitoisuudeksi tuli 2 x 10"4 mol/1. Näytettä inkuboitiin 30 minuuttia, ja lisättiin 20 butanolin (50 til-%) ja etanolin (50 til-%) seosta niin, että butanolin loppupitoisuudeksi tuli 9 til-%. Muodostui sakka ja se erotettiin supernatantista sentrifugoimalla. Sakka liuotettiin 0,05 M suolahappoon, joka sisälsi 5 % dimetyylisulfoksidia, ja hemoglobiinin ja konjugaatin pi-25 toisuus mitattiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

FITC-aminofenyyliboronihappokonjugaatin spesifisyyden vahvistamiseksi menetelmä pantiin täytäntöön esimerkissä 2 kuvatulla tavalla, mutta lisättiin mukaan sorbitolia kompetitiivisena pitoisuutena (0,01 mol/1). Tämä 30 johti konjugaatin vähäiseen epäspesifiseen sitoutumiseen hemoglobiiniin, eikä tuloksissa ilmennyt mitään eroa näytteiden, joissa glykosyloituneen hemoglobiinin pitoisuus oli suuri, ja näytteiden, glykosyloituneen hemoglobiinin pitoisuus oli pieni, välillä, mitä valaistaan alla.

32 100437

Ilman sorbitolin lisäystä saavutetut tulokset:

Glykosyloituneen hemoglobii- Konjugaatin ja hemoglobiinin osuus (%) nin moolisuhde 5 (ioninvaihtomenetelmä) 4,4 0,259 7.1 0,340 11.4 0,473 10 Sorbitolia lisäten saavutetut tulokset:

Glykosyloituneen hemoglobii- Konjugaatin ja hemoglobiinin osuus (% ) nin moolisuhde (ioninvaihtomenetelmä) 15 4,4 0,078 7.1 0,066 11.4 0,083

Esimerkki 3 20 Menetelmä pantiin täytäntöön esimerkissä 1 kuvatul la tavalla, mutta sen sijaan, että sakka olisi erotettu sentrifugoimalla, saostunut näyte erotettiin suodattamalla. Kokoverinäyte hemolysoitiin ja laimennettiin hemoly-soivaan määrityspuskuriin, joka oli 100 mM Hepes, joka 25 sisälsi 0,05 % Triton X-100:aa (pH 9,0), suunnilleen väkevyyteen 8 mg hemoglobiinia/ml. Lisättiin butanolin (50 til-%) ja etanolin (50 til-%) seosta ja FITC-aminofe-nyyliboronihappokonjugaattia niin, että butanolin loppu-pitoisuudeksi saatiin 9 til-% ja konjugaatin pitoisuudeksi 30 1,6 x 10"4 mol/1. Muodostui sakka ja se eristettiin suo dattamalla, jota seurasi eristetttyjen hemoglobiinin ja FITC-aminofenyyliboronihappokonjugaatin kvantitatiivinen määritys.

33 100437

On saavutettu seuraavat tulokset:

Glykosyloituneen hemoglobii- Konjugaatin ja hemoglobiinin osuus ( % ) nin moolisuhde 5 (ioninvaihtomenetelmä) 5,2 0,160 11,7 0,226

Esimerkki 4 10 Kokoverinäyte hemolysoitiin ja laimennettiin he- molysoivaan määrityspuskuriin, joka oli 100 mM Hepes, joka sisälsi 0,05 % Triton X-100:aa (pH 9,0), suunnilleen väkevyyteen 8 mg hemoglobiinia/ml. Lisättiin butanolin (50 til-%) ja etanolin (50 til-%) seosta ja edellä kuvat-15 tua RESOS-aminofenyyliboronihappokonjugaattia niin, että butanolin loppupitoisuudeksi saatiin 9 til-% ja konjugaatin pitoisuudeksi 1,6 x 10'4 mol/1. Muodostui sakka ja se erotettiin supernatantista sentrifugoimalla. Sakka liuotettiin uudelleen 0,05 M suolahappoon, joka sisälsi 5 % 20 dimetyylisulfoksidia, ja hemoglobiinin ja RESOS-aminofe- nyyliboronihappokonjugaatin pitoisuus määritettiin absorp-tiomittauksin. Hemoglobiinin ja RESOS-aminofenyyliboroni-happokonjugaatin pitoisuus laskettiin interpoloimalla ka-librointikäyrät, jotka saatiin käyttämällä vertailuliuok-25 siä, joissa hemoglobiinin ja glykosyloituneen hemoglobii nin pitoisuudet olivat tunnettuja, ja laskettiin glykosyloituneen hemoglobiinin prosenttiosuus.

Kuvattua menetelmää noudatettaessa on saavutettu seuraavat tulokset: 30

Glykosyloituneen hemoglobii- Konjugaatin ja hemoglobiinin osuus (%) nin moolisuhde (ioninvaihtomenetelmä) 4,9 0,212 35 11,2 0,294 34 100437

Esimerkki 5

Menetelmä pantiin täytäntöön esimerkissä 4 kuvatulla tavalla, mutta sen sijaan, että sakka olisi erotettu sentrifugoimalla, se eristettiin suodattamalla. Kokoveri-5 näyte hemolysoitiin ja laimennettiin hemolysoivaan määri-tyspuskuriin, joka oli 100 mM Hepes, joka sisälsi 0,05 % Triton X-100:aa (pH 9,0), suunnilleen väkevyyteen 8 mg hemoglobiinia/ml. Lisättiin butanolin (50 til-%) ja etanolin (50 til-%) seosta ja RESOS-aminofenyyliboronihappokon-10 jugaattia niin, että butanolin loppupitoisuudeksi saatiin 9 til-% ja RESOS-aminofenyyliboronihappokonjugaatin pitoisuudeksi 1,6 x 10'4 mol/1. Muodostui sakka ja se eristettiin suodattamalla, jota seurasi eristetttyjen hemoglobiinin ja FITC-aminofenyyliboronihappokonjugaatin kvantita-15 tiivinen määritys.

On saavutettu seuraavat tulokset:

Glykosyloituneen hemoglobii- Konjugaatin ja hemoglobiinin osuus (%) nin moolisuhde 20 (ioninvaihtomenetelmä) 4,9 0,195 13,0 0,367

Esimerkki 6 25 Kokoverinäyte hemolysoitiin ja laimennettiin hemo lysoivaan määrityspuskuriin, joka oli 0,25 M ammonium-asetaatti, joka sisälsi 0,05 % Triton X-100:aa (pH 9,0), suunnilleen väkevyyteen 8 mg hemoglobiinia/ml. Hemoly-soidun hemoglobiinin liuokseen lisättiin RESOS-aminofe-30 nyyliboronihappokonjugaattia (1,6 x 10'4 mol/1) liuoksessa, joka oli 30 mM ZnCl2:n suhteen ja 50 mM glysiinin suhteen, ja muodostui sakka. Sakka erotettiin supernatantista sentrifugoimalla, jota seurasi sakan liuotus uudelleen 0,25 M ammoniumasetaattipuskuriin, joka sisälsi 30 mmol 35 EDTA:ta/ml (pH 9,0). Hemoglobiinin ja RESOS-aminofenyyli-

II

35 100437 boronihappokonjugaatin pitoisuus määritettiin absorptio-spektroskopian avulla.

Tulokset olivat seuraavat: 5 Glykosyloituneen hemoglobii- Konjugaatin ja hemoglobiinin osuus (% ) nin moolisuhde (ioninvaihtomenetelmä) 4,9 0,384 13,0 0,449 10

Esimerkki 7

Menetelmä pantiin täytäntöön esimerkissä 6 kuvatulla tavalla, mutta saostunut hemoglobiini erotettiin suodattamalla, jota seurasi eristettyjen hemoglobiinin ja 15 RESOS-aminofenyyliboronihappokonjugaatin kvantitatiivinen määritys.

Esimerkki 8

Hepes-puskurilla laimennettu hemolysoitu veri lisättiin jodi-125:llä leimattuun boronihappokonjugaattiin 20 (ks. edeltä). Hemoglobiinin pitoisuus oli 8 mg/ml.

30 minuutin inkuboinnin jälkeen lisättiin 25 μΐ etanoli-butanoliseosta (1:1) ja saostunut hemoglobiini erotettiin sentrifugoimalla.

Sakka liuotettiin lisäämällä HCl-DMSO-vesiseosta, 25 ja mitattiin hemoglobiinisisältö ja radioaktiivisuus.

Radioaktiivisuuden ja hemoglobiinin suhteen ja glykosyloituneen hemoglobiinin pitoisuuden välillä havaittiin vallitsevan merkittävän korrelaation.

Esimerkki 9 30 Kokoverinäyte hemolysoitiin ja laimennettiin hemo- lysoivaan määrityspuskuriin, joka oli 100 mM Hepes, joka sisälsi 0,05 % Triton X-100:aa (pH 9,0), suunnilleen väkevyyteen 8 mg hemoglobiinia/ml. Lisättiin RESOS-aminofenyy-liboronihappokonjugaattia niin, että sen loppupitoisuudek-35 si tuli 2 x 10'4 mol/1, ja CuS04: a niin, että sen loppupi- 36 100437 toisuudeksi tuli 2 mmol/1, ja muodostui sakka. Sakka erotettiin supernatantista sentrifugoimalla. Sakka liuotettiin uudelleen 0,05 M suolahappoon, joka sisälsi 5 % dime-tyylisulfoksidia, ja hemoglobiinin ja RESOS-aminofenyyli-5 boronihappokonjugaatin pitoisuus mitattiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

Tulokset olivat seuraavat:

Glykosyloituneen hemoglobii- Konjugaatin ja hemoglobii-10 nin osuus (%) nin moolisuhde (ioninvaihtomenetelmä) 4,6 0,524 12,0 0,617 15 Esimerkki 10

Kokoverinäyte hemolysoitiin ja laimennettiin hemo-lysoivaan määrityspuskuriin, joka oli 0,25 M ammoniumase-taatti, joka sisälsi 0,05 % Triton X-100:aa, suunnilleen väkevyyteen 8 mg hemoglobiinia/ml. Lisättiin FITC-aminofe-20 nyyliboronihappokonjugaattia niin, että sen pitoisuudeksi saatiin 2 x 1014 mol/1. Lisättiin isopropanolia, niin että sen loppupitoisuudeksi tuli 33 til-%, ja muodostui sakka. Sakka erotettiin supernatantista sentrifugoimalla. Sakka liuotettiin uudelleen 0,05 M suolahappoon, joka sisälsi 25 5 % dimetyylisulfoksidia, ja hemoglobiinin ja FITC-amino- fenyyliboronihappokonjugaatin pitoisuus mitattiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

Tulokset olivat seuraavat: 30 Glykosyloituneen hemoglobii- Konjugaatin ja hemoglobiinin osuus ( %) nin moolisuhde (ioninvaihtomenetelmä) 4,8 0,260 12,5 0,398 37 100437

Esimerkki 11

Menetelmä pantiin täytäntöön esimerkissä 10 kuvatulla tavalla, mutta sakka muodostettiin lisäämällä tetra-hydrofuraania niin, että sen loppupitoisuudeksi tuli 5 50 til-%.

Tulokset olivat seuraavat:

Glykosyloituneen hemoglobi- Konjugaatin ja homoglobii- nin osuus (%) nin moolisuhde 10 (ioninvaihtomenetelmä) 4.8 0,255 12,5 0,429

Esimerkki 12 15 Menetelmä pantiin täytäntöön esimerkissä 10 ku vatulla tavalla, mutta sakka muodostettiin lisäämällä N,N-dimetyyliformamidia niin, että sen loppupitoisuudeksi tuli 15 til-%.

Tulokset olivat seuraavat: 20

Glykosyloituneen hemoglobii- Konjugaatin ja hemoglobiinin osuus (%) nin moolisuhde (ioninvaihtomenetelmä) 4.8 0,197 25 12,5 0,211 1

Claims (26)

38 100437

1. Menetelmä glykosyloituneen hemoglobiinin määrittämiseksi näytteestä, tunnettu siitä, että 5 menetelmä käsittää (a) mahdollisesti näytteen hemolyysin mahdollisen soluihin sitoutuneen hemoglobiinin vapauttamiseksi, (b) mainitun näytteen tai mainitusta näytteestä alla esitetyn vaiheen (c) mukaisesti talteen saadun he- 10 moglobiinin saattamisen kosketuksiin signaalin muodostavien molekyylien kanssa, jotka koostuvat yhden tai useamman dihydroksiboryyliryhmän tai sen/niiden suolojen konju-gaatista, jossa ryhmä(t) tai suola(t) on liitetty signaalin muodostavaan merkkiaineeseen, 15 (c) glykosyloituneen ja glykosyloitumattoman he moglobiinin ja niihin mahdollisesti sitoutuneiden molekyylien erottamisen näytteestä tai edellä esitetyn vaiheen (b) mukaisesta reaktioseoksesta ja (d) mainittujen signaalin muodostavien molekyylien, 20 jotka ovat sitoutuneet erotettuun hemoglobiiniin, ja/tai mahdollisten hemoglobiiniin sitoutumattomien signaalin muodostavien molekyylien määrityksen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheet (b) ja (c) toteute- 25 taan samanaikaisesti.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi näytteestä erotettujen glykosyloituneen ja glykosyloitumattoman hemoglobiinin määrän määrityksen.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen me netelmä, tunnettu siitä, että mainitut glykosy-loitunut ja glykosyloitumaton hemoglobiini erotetaan selektiivisesti homogeenisesta liuoksesta saostamalla.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että näin muodostunut sakka erote taan kromatografia- tai suodatusväliaineen avulla. 39 100437

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saostusvaihe toteutetaan huokoisen kiinteän faasin, kuten esimerkiksi kromatografia-tai suodatusväliaineen, pinnalla tai sisällä.

7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu kromatografia- tai suodatusväliaine sisältää yhtä tai useampaa reagenssia, jona/joina tulevat kysymykseen hemoglobiinin saostus-aineet, patenttivaatimuksessa 1 määritellyt signaalin muo- 10 dostavat molekyylit, hemolyysin aikaansaavat aineet ja kompleksinmuodostaj at.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 4-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hemoglobiini saos-tetaan sinkki-ioneja ja/tai kupari-ioneja ja/tai muita 15 hemoglobiinin spesifisesti saostavia metallikationeja lisäämällä.

9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hemoglobiini seostetaan orgaanista liuotinta tai orgaanisten liuottimien 20 seosta sellaisena pitoisuutena lisäämällä, että se kykenee saostamaan hemoglobiinin jokseenkin spesifisesti.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittuna liuottimena tulevat kysymykseen veteen sekoittuvat alkoholit, ketonit, 25 eetterit, amidiliuottimet, sulfoksidiliuottimet, hiilive-tyliuottimet, halogeenihiilivetyliuottimet ja niiden seokset.

11. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hemoglobiini saos- : 30 tetaan hemoglobiiniin spesifisesti sitoutuvia proteiineja lisäämällä.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hemoglobiini saostetaan antihemoglobiinivasta-aineiden tai haptoglobiinien tai 35 niiden fragmenttien avulla sekundaaristen vasta-aineiden 40 100437 tai antihaptoglobiinivasta-aineiden tai niiden fragmenttien ollessa mahdollisesti läsnä.

13. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hemoglobiini erote- 5 taan hemoglobiiniin spesifisesti sitoutuvien proteiinien avulla, jotka on immobilisoitu kiinteälle faasille.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut signaalin muodostavat molekyylit leimataan muulla kuin alkalisella fosfataa- 10 sientsyymimerkkiaineella.

15. Jonkin patenttivaatimuksista 1-14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toteutetaan kom-petitiivisen aineen, kuten esimerkiksi diolin sisältävän yhdisteen tai dihydroksiboryyliryhmän sisältävän yhdisteen 15 ollessa läsnä.

16. Jonkin patenttivaatimuksista 1-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut signaalin muodostavat molekyylit ovat kemiluminesoivia, fluoresoivia, värillisiä tai radioaktiivisia tai niillä on ent- 20 syymiaktiivisuutta.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut signaalin muodostavat molekyylit sisältävät merkkiainetta, jona tulevat kysymykseen antrakinonit, atsoväriaineet, oksatsiinit, tiat- 25 siinit, triatsiinit, porfyriinit, fykobiliproteiinit, klo rofyllit sekä niiden johdannaiset ja analogit, karotenoi-dit, akridiinit, ksanteenit, indigoväriaineet, tioksantii-nit, kumariinit, polymetiinit sekä niiden johdannaiset, ftalosyaniinit ja metalliftalosyaniinit.

18. Jonkin patenttivaatimuksista 1-17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdestä tai useammista käytetyistä muista reagoivista aineista kuin testattavat näytteet on poistettu dihydroksiboryyliryhmien kanssa reaktiokykyiset molekyylit. Il 41 100437

19. Patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä käytettävä reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää signaalin muodostavia molekyylejä, jotka koostuvat yhden tai useamman dihydroksiboryyliryhmän tai 5 sen/niiden suolojen konjugaatista, jossa ryhmä(t) tai suo-lait) on liitetty radioaktiiviseen tai kemiluminesoivaan signaalin muodostavaan merkkiaineeseen.

20. Patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä käytettävä reagenssi, tunnettu siitä, että se si- 10 sältää signaalin muodostavia molekyylejä, jotka koostuvat yhden tai useamman dihydroksiboryyliryhmän tai sen/niiden suolojen konjugaatista, jossa ryhmä(t) tai suola(t) on liitettyN-(resorufiini-4-karbonyyli)piperidiini-4-karbok-syylihapon N-hydroksisukkiini-imidiesteriin (RESOS) tai 15 muihin oksatsiineihin.

21. Patenttivaatimuksen 1 mukaiseen analyysimenetelmään tarkoitettu testivälineistö, tunnettu siitä, että se käsittää (a) reagenssin, joka sisältää signaalin muodostavan 20 molekyylin, joka koostuu yhden tai useamman dihydroksibo ryyliryhmän tai sen/niiden suolojen konjugaatista, jossa ryhmä(t) tai suola(t) on liitetty signaalin muodostavaan merkkiaineeseen, ja (b) keinon glykosyloituneen ja glykosyloitumattoman 25 hemoglobiinin erottamiseksi näytteestä mahdollisesti yh distettyinä puskurisuoloihin tai -liuoksiin.

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen testivälineistö, tunnettu siitä, että mainittuna homoglobii-ninerotuskeinona (b) tulevat kysymykseen sinkki-ionit 30 ja/tai kupari-ionit ja/tai muut hemoglobiinin spesifisesti seostavat metallikationit, hemoglobiinin saostamaan kykenevät orgaaniset liuottimet sekä sellaisten liuottimien seokset ja hemoglobiiniin spesifisesti sitoutuvat proteiinit sekä niiden fragmentit, mahdollisesti kiinteälle kan-35 toaineelle immobilisoituina. 42 100437

23. Patenttivaatimuksen 21 mukainen testivälineistö, tunnettu siitä, että se sisältää hemoglobiinin erottavana reagenssina sinkki-ioneja tai muita hemoglobiinin saostavia metalli-ioneja ja lisäksi kompleksin- 5 muodostajaa.

24. Jonkin patenttivaatimuksista 21 - 23 mukainen testivälineistö, tunnettu siitä, että mainittu reagenssi (a) ja/tai mainittu hemoglobiininerotuskeino (b) ovat kiinteässä olomuodossa olevan kromatografia- tai suo- 10 datusväliaineen sisällä tai pinnalla.

25. Patenttivaatimuksen 21 mukainen testivälineistö, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi kiinteässä olomuodossa olevaa kromatografia- tai suodatus-väliainetta saostuneen hemoglobiinin erottamiseksi.

26. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-18 mu kaisen menetelmän tai minkä tahansa patenttivaatimuksista 21 - 25 mukaisen analyysiin tarkoitetun testausvälineistön käyttö diabetes mellituksen in vitro diagnosointiin tai seurantaan. Il 43 100437