KR940009281B1

KR940009281B1 - α-hANP를 인지하는 단클론성 항체 및 α-hANP의 면역분석용 시약

Info

Publication number: KR940009281B1
Application number: KR1019880011311A
Authority: KR
Inventors: 히로오 이무라; 가즈와 나까오; 에이지 이시까와; 마사오 고노; 껭 이오우에
Original assignee: 시오노기 세이야꾸 가부시끼가이샤; 요시또시 가즈오
Priority date: 1987-09-01
Filing date: 1988-09-01
Publication date: 1994-10-06
Also published as: ES2061664T3; NO883854L; NO883854D0; DK174151B1; NO174005B; DK484588A; EP0306309A2; HK1003795A1; EP0306309A3; ATE97959T1; DE3885975D1; DK484588D0; NO174005C; EP0306309B1; KR890005519A; DE3885975T2; CA1335082C

Abstract

내용 없음.

Description

α-hANP를 인지하는 단클론성 항체 및 α-hANP의 면역분석용 시약

제1도는 α-hANP, α-rANP 및 α-hANP 단편과 본 발명의 단클론성 항체와의 교차 반응성을 나타낸다.

제2도는 EIA에 의한 α-hANP의 표준곡선(○) 및 혈장의 희석곡선(●, ▲, ■)을 나타낸다.

제3도는 한단계 EIA에 의한 α-hANP의 표준곡선(○) 및 혈장의 희석곡선(●, ▲, ■)을 나타낸다.

본 발명은 α-hANP를 인지하는 단클론성 항체 및 상기 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 Met[12]를 함유하는 α-hANP의 고리구조중 N-말단 반쪽 부근을 인지하는 단클론성 항체, 및 상기 단 클론성 항체를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다. 또한 본 발명은 α-hANP의 N-말단 측면 또는 C-말단 측면을 인지하는 고체상에 고정된 항체 및 상기 고정 항체에 의해 인지된 측면과는 다른 측면을 인지하는 효소-표지화 항체를 함유하는 α-hANP의 효소 면역 분석(이하 EIA로 약칭함)용 시약에 관한 것이다.

심방 나트륨 이뇨성 폴리펩티드(ANP)는 아트리움 코르디스(atrium cordis)의 근육세포에 의해 생산된 과립내에 존재하고, 강력한 이뇨 및 나트륨 이뇨 작용을 갖는다. 이 종류의 폴리펩티드는 인간 뿐만 아니라 쥐에서도 발견되는데, 각각 hANP 및 rANP로 불린다. 각각의 hANP 및 rANP는 3타입-α, β 및 γ로 더 분류된다. α-hANP의 28아미노산 잔기로 구성된다. N-말단으로부터 각각 7번째 및 23번째 위치의 Cys[7] 및 Cys[23]은 이황화 결합을 형성하고, 그들 사이의 서열은 고리구조를 형성한다[Biochem. Biophys. Res. Commun.(이하 BBRC로 약칭함) 118, 131∼139. 1984].

α-rANP는 α-hANP와 오직 N-말단으로부터 12번째 위치의 잔기 한개만이 다른데, α-rANP에서는 Ile이고 α-hANP에서는 Met이다(BBRC 117, 839-1983). β-hANP는 α-hANP의 역평행 이량체이다(일본국 특허 공개 제184098/1985호). γ-hANP는 126아미노산 잔기로 이루어지는데, C-말단의 99∼126 아미노산은 α-hANP에 해당한다. ANP의 측정 방법으로는, 항혈청을 사용하는 방사선 면역 분석법이 이미 공지되어 있다(Science 228, 323∼325, 1985 ; Nature 314, 264∼266, 1985 ; BBRC 124, 815∼821, 1984 ; BBRC 124, 663∼668, 1984 ; BBRC 125, 315∼323, 1984). 이중에서 항혈청 CR-3이 ANP의 C-말단 단편[17-28]을 인지한다고 공지되어 있다.

α-hANP를 인지하는 단클론성 항체로는, 11A-A11이 공지되어 있다. 상기 항체는, 항원으로서 아트리오펩틴 Ⅱ(쥐 ANP의 일종)을 사용하여 수득하는데, 그의 에피토프는 Cys@7]과 Ser[25] 사이에 위치하고 이황화 결합은 포함한다. 그러므로, 에피토프는 ANP 고리 구조의 일부인 것으로 여겨진다. 그러나 상기 항체의 친화력은 Met[12, 인간] 및 Ile[12, 쥐]간의 차이와 관련되어 있지 않으며, 항체는 rANP 및 hANP를 인지한다(Life Science 38, 1991∼1997, 1986).

ANP의 통상적인 면역 분석법에서는, 혈장 시료에서 ANP를 추출해야만 한다. 그러므로, 추출없이 고감도의 분석이 가능할 정도의 고 친화력을 갖는 단클론성 항체가 강력히 요구되고 있다. ANP를 인지하는 단클론성 항체로는, 전술한 11A-A11이 있다. 그러나, 이 항체는 hANP 뿐만 아니라 rANP도 인지한다. 반면에, 전술한 대로, ANP에 대한 항혈청 CR-3은 ANP의 C-말단 측면을 인지한다. 그러므로, ANP의 N-말단 측면을 특이적으로 인지하는 항체를 수득할 수 있다면, 이 두종류의 항체를 사용하는 샌드위치 면역 분석법을 행할 수 있다. 이러한 이유에서 hANP의 N-말단 측면을 특이적으로 인지하고 고 친화력을 갖는 단클론성 항체가 강력히 요구되고 있다.

hANP에 대한 면역 분석법으로서, 이제까지는 방사선 동위체를 사용하는 방사선 면역 분석법(이하 RIA로 약칭함) 및 효소를 사용하는 효소 면역 분석법(EA)이 공지되어 있었다. RIA에서는, 필요한 장치 및 시설의 문제로 그것을 피하는 경향이 있었다. 그러므로 어디에서나 사용할 수 있는 고감도 EIA의 개발이 요구되었다. 효소-표지화방법으로, 이제까지는 가교제로서 글루타르알데히드를 일반적으로 사용해 왔다. 그러나, 요즈음에는 중합화 및 저수율의 문제 때문에 거의 사용하지 않는다. 글루타르알데히드 대신에 가교제로서 최근에는 N,N′-O-페닐렌디말레이미드 및 N-(4-카르복시시클로헥실메틸)말레이미드의 N-히드록시숙신이미도에스테르와 같은 시약이 공지되어 있다[J. Immunoassay 4, 209∼327(1983)]. 그러나, hANP의 분석법에 적용될 수 있다고는 보고되어 있지 않다. 그러므로, hANP에 대한 고감도 면역 분석법이 개발되었다고 말하기는 힘들다.

본 발명은 Met[12]를 함유하는 α-hANP의 고리구조중 N-말단 반쪽 구분을 인지하는 단클론성 항체 및 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다. 또한 본 발명은 α-hANP의 N-말단 측면 또는 C-말단측면을 인지하는 고체상에 고정된 항체 및 상기 고정항체에 의해 인지되는 측면과는 다른 측면을 인지하는 효소-표지화 항체를 함유하는 α-hANP의 효소 면역 분석용 시약에 관한 것이다.

통상적인 RIA법으로 α-hANP를 측정할 때에는, 혈장시료로부터 α-hANP를 추출해야만 한다. 그러나, 본 발명의 단클론성 항체를 사용하는 α-hANP의 면역분석용 시약을 사용하며, α-hANP를 추출하지 않고 시험 시료에서 α-hANP를 직접 측정할 수 있다.

또한, 고체상에 고정된 항체를 우선 α-hANP와 반응시킨후 표지항체를 더 반응시키는 두단계 방법 뿐만 아니라 α-hANP 및 표지항체를 고체상에 고정된 항체와 동시에 반응시키는 한단계 방법으로 측정할 수 있다. 그러므로 α-hANP를 쉽게 측정할 수 있다. α-hANP의 이러한 측정방법과 함께 심장병, 신장병, 고혈압중(본태성 또는 이차성), 부종질병(간경변, 신증, 급발작 부종등) 및 체액의 불균형중에 수반되는 탈수등을 쉽게 정확하게 진단 및 제조할 수 있다.

본 발명가들은 hANP의 N-말단 측면을 특이적으로 인지하는 고감도 단클론성 항체를 개발하기 위해 열심히 연구하였다. 그 결과, α-hANP의 고리구조의 N-말단 측면을 인지하는 단클론성 항체를 수득하였다. 또한, 이 항체를 사용하여, α-의 고감도 분석법을 수립하였다.

(1) 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마의 제조

α-hANP의 28아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩티드이고 분자량은 비교적 낮다. 결과적으로 항체-생산을 유도하는 능력(면역유발성)은 낮다. 이러한 이유에서, 그것을 항원으로 사용하기 위해 소혈청 알부민 또는 소 티로글로불린과 결합시킨다. 수득된 결합체를 프로인트 완전 보조액과 같은 적당한 보조제와 유화시킨후, 생쥐를 면역시키는데 사용한다.

상기 유체를 생쥐에게 몇주 간격으로 수차례 복강내, 피하 또는 정맥내 접종시켜 면역화시킨다. 최종 면역후 3∼5일후, 비장을 꺼내 항체-생산 세포로 사용한다. 동시에, 하이브리도마를 만들기 위해 항체-생산세포와 융합시킬 모세포로서, 히포크산틴-구아닌-포스포리보실 트랜스퍼라제-결핍(HGPRT^-) 또는 티미딘 키나제-결핍(TK^-)과 같은 적당한 마커를 갖는 골수종 세포주를 제거한후, 골수종 세포주를 항체-생산세포와 융합시켜 하이브리도마를 제조한다.

하이브리도마를 제조하기 위한 배양 배지로서, 이글 MEM, 둘베코 변형배지 및 RPMI-1640과 같은 배지가 있는데, 필요에 따라 일반적으로 약 15％ 소태아 혈청(FCS)를 가하여 사용한다.

우선, 모세포로서 골수종 및 비장 세포를 1 : 6.5의 비율로 제조한다. 융합제로는, 고 융합도 때문에 일반적으로 50％ 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 사용한다. 융합주는 HAT 선택법으로 선택한다. 생산된 하이브리도마를 배양 상층액을 사용하는 막 형광 항체기술, 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA법) 또는 면역 조직 염색법과 같은 공지된 방법으로 스크리닝한다. 이리하여, 목적 면역 글로불린을 생산하는 하이브리도마클론을 선택한다. 하이브리도마를 단클론으로 제조하기 위해, 정상 비장세포를 공급층으로 96-웰 마이크로웰에 10⁵세포/웰로 담아, 하이브리도마가 1세포/웰로 되도록 하고 다시 자라나는 클론을 스크리닝한다. 이러한 서브클로닝을 반복하여 단클론성 하이브리도마를 얻는다.

(2) 단클론성 항체의 제조

본 발명의 단클론성 항체를 제조하기 위해, 상기 수득된 하이브리도마를 시험관내 및 생체내 배양한다. 시험관내 배양할 때에는, 상술한 통상 배지에 FCS를 가하여 사용할 수 있다. 배지에서 3∼5일 동안 배양한후, 배양 상층액에서 단클론성 항체를 수득한다. 생체내 배양의 경우에는, 하이브리도마를 포유류의 복강에 접종시킨다. 7∼14일후, 복수를 수집하여 단클론성 항체를 수득한다. 시험관내 배양과 비교하여, 생체내 배양에서는 훨씬 다량의 항체가 효과적으로 제조된다. 그러므로, 생체내 배양이 바람직하다.

배양상층액 또는 복수에서 수득된 단클론성 항체는 황산암모늄 분별법, DEAE 세파로오스 컬럼등과 같은 공지된 방법을 적당히 조합하여 정제한다. 예를 들면, 실시예에서 언급된 방법으로 정제한다.

하기 실시예에서 제시된대로, 본 발명에서 수득된 단클론성 항체 KY-ANP-I은 α-hANP를 특이적으로 인지하고, rANP에 대해서는 거의 친화력을 보이지 않는다. 그 에피토프는 α-hANP의 고리 구조중 N-말단 반쪽, 특히 Cys[7]에서 Gly[16]에 걸친 일부분일 것으로 추측된다. 또한, 그것은 rANP와 매우 약하게 반응하기 때문에, 그 에피토프는 Met[12]를 함유하는 부분일 것으로 추측된다.

상기 에피토프가 α-hANP 뿐만 아니라 β-hANP 및 γ-hANP에 공통적인 부분이므로, 상기 항체는 또한 β-hANP 및 γ-hANP와의 반응성을 나타낸다.

또한, 이 항체는 α-hANP와 고 친화력(Ka=3.1×10¹⁰M^-1)을 나타낸다. 제1도의 α-hANP의 표준곡선에 제시했듯이, 10％ 및 50％ 억제농도(IC₁₀및 IC₅₀)은 각각 10pg/시험관 및 100pg/시험관이다.

본 발명의 단클론성 항체 KY-ANP-I를 생산하는 하이브리도마 KY-ANP-I은 부다페스트 조약하에 영국 SP4 OJG, 살리스버리, 포톤 다운에 위치한 PHLS 센터 포 어플라이드 마이크로바이올로지 ＆ 리서치, 유러피안 컬렉션 오브 애니멀 셀 컬쳐(PHLS Centre for Applied Microbiology ＆ Research, European Collection of Animal Cell Culture : ECACC)에 1987년 8월 20일부터 수탁번호 87082001로 기탁되어 있다.

(3) 항체의 담체에 대한 결합

항체를 담체에 결합시키기 위한 고체상으로는 시판되고, 항원 항체 반응용 담체로 면역 분석법에서 일반적으로 사용되는 유리 또는 플라스틱 비이드, 볼, 튜브 또는 플레이트와 같은 것을 사용할 수 있다. α-hANP의 N-말단 측면 또는 C-말단 측면을 인지하는 항체를 이 담체중 어느것에 흡착시킨다. 보통 pH6∼10, 바람직하게는 중성 부근의 인산염 완충액내 실온에서 밤새도록 흡착시킨다. 항체를 흡착시킨 담체는 아지드화 나트륨과 같은 방부제의 존재하에서 냉각 보존시킨다.

단클론성 항체 및 다클론성 항체 모두 상기와 동일한 방법으로 담체에 흡착시킬 수 있다.

(4) 토끼 항 α-hANP[17-28] 혈청

토끼를 카르보디이미드법으로 제조된 α-hANP[17-28]-소 티로글로불린 결합체로 수차례 면역화시키고, 최종 면역후 10∼14일째에, 혈액을 수집하여 토끼 항-α-hANP[17-28] 혈청을 제조한다.

(5) 효소-표지화 항체의 제조

[토끼 IgG, F(ab′)₂및 Fab′]

상기대로 제조된 항혈청을 황산나트륨으로 분별시킨후, DEAE-셀룰로오스 컬럼을 통과시켜, IgG를 수득한다. 수득된 IgG를 펩신으로 소화시켜 F(ab′)₂를 제조한후, 2-메르캅토에틸아민으로 환원시켜 항-α-hANP[17-28]Fab′를 수득한다. IgG로부터 Fab′를 제조하는 방법은 문헌[J. Immunoassay 4, 209∼327(1983)]에 상세히 기술되어 있는데, 동일한 방법을 본 발명에서 사용할 수 있다.

[항체의 효소-표지화]

항체를 표지화시킬 효소로, 알칼린 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 퍼옥시다제, 글루코오스 옥시다제등을 사용할 수 있다. 본 발명에서는, 고추냉이 퍼옥시다제를 바람직하게 사용한다. 가교제로서 N,N′-O-페닐렌 디말레이미드, N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥사노에이트, N-숙신이미딜 6-말레이미도헥사노에이트, N′-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트, 4,4′-디티오디피리딘 및 다른 것들이 이미 공지되어 있다. 이 가교제와 효소 및 항체와의 반응은 각 시약의 특성에 따라 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 조건에 따라, Fab′, Fab 및 F(ab′)₂와 같은 항체 단편을 항체로 사용한다. 본 발명에서 가교제로는, N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥사노에이트, 또는 N-숙신이미딜 6-말레이미도헥사노에이트를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 다클론성 또는 단클론성 항체냐에 상관없이, 동일한 방법으로 효소-표지화 항체를 수득할 수 있다. 그러므로, 상술한 두 가교제를 사용하여 수득된 효소-표지화 항체는 하기 일반식(Ⅰ)로 나타낼 수 있다 :

[식중, A는 α-hANP의 N-말단 측면 또는 C-말단 측면을 인지하는 항체 또는 그의 단편을 나타내고, B는 표지효소를 나타내며, R은 4-메틸렌 시크로헥실 또는 펜타메틸렌을 나타낸다.]

이렇게 수득된 효소-표지화 항체는 고감도 면역분석계를 얻을 수 있도록 친화력 크로마토그래피로 정제하는 것이 바람직하다. 정제된 효소-표지화 항체를 티메로살 또는 글리세롤과 같은 안정제와 함께, 또는 동결 건조후 냉암소에 저장한다.

상기대로 제조된 면역분석 시약을 사용하여 α-hANP를 측정할때 다음과 같이 항체를 조합한다 : α-hANP의 N-말단 측면을 인지하는 항체를 고정시킨 경우에는, C-말단 측면을 인지하는 항체를 효소-표지화시킨다. 항체를 고정화시킬때, 일반적으로 비교적 다량의 항체가 필요하다. 그러므로, 고정시키기 위해, 다량으로 안정하게 수득될 수 있는 단클론성 항체가 적당하다(예를 들면, 본 발명의 KY-ANP-I). 그러나, 또한 항혈청에서 제조된 다클론성 항체를 편리하게 사용할 수 있다. 효소-표지화하는 항체로는, 고정 항체에 의해 인지되는 것과 다른 부위를 인지하는 한, 단클론성 항체 또는 다클론성 항체를 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 KY-ANP-I를 고정항체로 사용하는 경우에, 상술한 항혈청 CR-3 또는 실시예에서 언급된 항혈청 F36을 효소-표지화 항체로 사용할 수 있다. 또한 이 조합을 역으로 사용할 수 있다. 물론 α-hANP의 C-말단 측면을 인지하는 단클론성 항체 및 α-hANP의 N-말단 측면을 인지하는 항 혈청을 본 발명에서 사용할 수 있다.

[실시예]

[하이브리도마의 제조]

합성 α-hANP(1.5㎎) 및 소 티로글로불린(5.4㎎)을 2㎖의 증류수에 용해시킨다. 이 용액에 1㎖의 증류수에 용해시킨 30㎎의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 용액을 실온에서 10분동안에 걸쳐 적가한후, 혼합물을 실온에서 24시간동안 교반한다. 이 용액을 3ℓ의 증류수에 3일 동안 6회 투석한다. 투석액을 5분획으로 나누어 -20℃에서 저장한다(BBRC 124, 815∼821, 1984).

나뉜 분획(300㎍의 α-hANP 함유)으로 저장된 상기 용액에 증류수를 가하여 1.2㎖로 만든후, 1.2㎖의 프로인트 완전 보조액에 현탁시킨다. 이중, 약 2㎖를 10BAl/c 암컷 생쥐(생쥐당 200㎕)에 복강내 및 피하 주사한다. 3주후 생쥐를 같은 방법으로 추가 면역한다. 추가 면역 5주후에, 혈액중 항체를 측정하고, 가장 우수한 면역 반응을 보이는 2마리의 생쥐에 꼬리 정맥을 통해 50㎍의 α-hANP를 함유하는 상기 용액으로 더 추가 면역시킨다. 4일후, 2마리의 생쥐로 터 비장세포를 세포융합을 위해 수집한다.

수집된 비장세포(1.3×10⁷세포) 및 골수종세포×63 -Ag 8.653(2×10⁷세포)를 둘베코 배지(DMEM) 내에서 혼합하고, 혼합물을 1500rpm, 4℃에서 5분동안 원심분리한다. 수득된 펠렛을 37℃로 가온하여 녹인후, 1㎖의 50％ PEG 4000(PEG 1g/DMEM 1㎖)을 1분동안 적가한다. 혼합물을 37℃에서 2분동안 방치한후, 10㎖의 DMEM을 37℃에서 5분동안 적가하여 용액을 희석한다. 4℃에서 15％ FCS를 함유하는 DMEM으로 원심분리 세척한다.

수득된 세포를 96-웰 플레이트에 담고, HAT 배지에서 2주동안 배양하고, HT 배지에서 1주동안 더 배양한다. 총 768웰 중에서 약 30％(212/768)에서 하이브리도마가 증식되고, 그중 4％(8/212)가 α-hANP 항체를 생산하는 것으로 밝혀졌다.

가장 높은 항체 역가를 보이는 웰내의 세포를 한계 희석법으로 클로닝한다. 즉 공급 세포로서, BALB/c 생쥐 흉선 세포를 10⁶세포/웰로 웰에 가하고 여기에 하이브리도마를 1세포/웰로 담아 배양시킨다. 이 방법을 2회 행한다.

이러한 클로닝으로, 가장 다량의 항체를 안정하게 생산하는 클론을 선택하고, KY-ANP-I으로 명명한다.

면역 생쥐에서 수득된 항혈청 및 하이브리도마 배양액중 상층액내의 항체 역가를 하기와 같이 측정한다 : 면역 생쥐의 항혈청 또는 하이브리도마 배양액중 상층액을 시료로 취한다. 상기 시료의 100㎕ 희석용액, 300㎕의 분석 완충액(RIA 완충액) 및 100㎕의¹²⁵I-α-hANP(10000cpm)의 혼합물을 4℃에서 24시간동안 계속 반응시킨후, 용액을 1㎖의 덱스트란-피복-탄과 혼합하고, 혼합물을 4℃에서 5분동안 반응시킨다. 혼합물을 3000rpm, 4℃에서 30분동안 원심분리하고, 그 상층액의 방사능을 γ-계수관으로 측정하여, 묽은 시료 용액내의 항체 역가를 계산한다.

상술한¹²⁵-α-hANP를 클로라민 T방법으로 제조한다. 즉, α-hANP(1㎍)를 Na¹²⁵I(1mCi)와 혼합하고, 10㎕의 클로라민 T(5.25㎎/㎖)를 가하고 10초후 20㎕의 소듐 피로설파이트(4.5㎎/㎖)를 가한다. 여기에 1㎖의 2％ 젤라틴을 더 가한후, Sep-Pak C 18(Waters 제품)로 정제한다.

[단클론성 항체의 제조]

BALB/c 생쥐를 한번에 생쥐당 0.5㎖의 프리스탄을 복강내 주사함으로써 1∼2주 간격으로 2회 전처리한다. 각각의 상기 생쥐에 200㎕의 DMEM에 현탁시킨 5×10⁶세포의 하이브리도마 KY-ANP-I를 복강내 주사한다. 수득된 복수를 단백질 A-세파로오스 CL-AB 컬럼으로 정제하여 단클론성 항체 KY-ANP-I를 수득한다.

[KY-ANP-I의 특성]

이 단클론성 항체의 이소타입은 오우크레를로니 방법으로 IgG₁임을 결정한다. 방사 결합 분석에 기초한 스캐챠드 플롯을 만들어 그 친화력을 얻는데, 결과는 Ka=3.1×10¹⁰M^-1이다.

RIA에 의해 각종 ANP-관련 펩티드와의 교차 반응성을 측정함으로써 그 에피토프를 결정하는데, 그 결과를 제1도에 나타낸다. 그것은 α-ANP[17-28] 및 α-ANP[1-6]과 거의 반응하지 않으므로, 에피토프는 α-ANP[7-16]에 포함되어 있을 것으로 추측된다. 한편, 그것은 α-hANP[8-22] 또는 α-rANP와는 매우 약하게 반응한다. 그러므로, 에피토프가 고리 구조를 가져야 하고 에피토프는 Met을 함유할 것으로 추측된다. 본 발명의 단클론성 항체에 의해 인지되는 에피토프는 α-hANP의 고리구조중 거의 N-말단 반쪽이라고 결론 지을 수 있다.

한편, KY-ANP-I와 α-hANP 및 α-hANP와의 반응성을 상술한 항체 역가 측정 방법으로 조사한다. 결과적으로, KY-ANP-I는 α-hANP 뿐만아니라 α-hANP도 인지하고, 또한 그것은 β-hANP와 80％ 교차 반응성으로 반응 한다고 밝혀졌다.

[항 α-hANP[17-28]소 티로글로불린 혈청의 제조]

α-hANP[17-28]을 공지된 카르보디이미드 방법[BBRC 117, 695, 1984)으로 티로글로불린에 결합시킨다. 3.1㎎의 α-hANP[17-28]을 함유하는 0.5㎖의 수용액에 19㎎의 소 티로글로불린을 함유하는 0.7㎖의 수용액을 가한다. 여기에 40㎎의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드를 함유하는 1㎖의 수용액을 가하고, 혼합물을 빙냉하에서 2시간 동안 교반한다. 반응 용액을 2ℓ의 증류수로 4℃에서 3회 투석한 후, 동결건조시켜 21㎎의 결합체를 수득한다. α-hANP[17-28]의 소 티로글로불린에 대한 결합 몰비는 아미노산 분석법으로 얻었는데 30이다.

[면역화 및 혈액 수집]

0.25㎖의 생리 식염수에 0.25㎎의 상기 α-hANP[17-28]-소 티로글로불린 결합체를 용해시킨다. 이것을 동량의 프로인트 완전 보조액에 현탁시키고, 용액을 토끼의 등 20부위 이상에 피하 주사한다. 이 방법을 3주 간격으로 6회 행하고, 최종 주사 10일후에, 토끼를 경동맥에서 사혈시켜 항혈청 F36을 수득한다.

[토끼 IgG의 제조]

1㎖의 항 α-hANP(F36)에 0.18g의 황산 나트륨을 교반하면서 천천히 가하고, 첨가물질을 완전히 용해시키고, 22∼25℃에서 계속 교반한다. 혼합물을 10000rpm, 22∼25℃에서 10분동안 원심분리한다. 침전물을 1㎖의 인산 나트륨 완충액(pH6.3 ; 17.5m㏖/ℓ)에 용해시킨 후, 동일 완충액으로 투석한다. 상층액을 동일 완충액(pH6.3 ; 17.5m㏖/ℓ)으로 평형화시킨 DEAE 셀룰로오스 컬럼을 통과시킨다. 상층액 내의 10㎎의 단백질을 통과시키는데 요구되는 DEAE 셀룰로오스의 습윤 부피는 1㎖이다. 280㎚에서의 흡광 계수 1.5g^-1ℓ㎝^-1및 IgG의 분자량 150000을 이용하여 계산된 수득된 IgG의 양은 7㎎이다(J. Immunoassay 4, 209∼327(1983).

[F(ab′)₂의 제조]

10㎎의 토끼 IgG를 5℃에서 1㎖의 아세트산나트륨 완충액(pH4.5, 0.1m㏖/ℓ)으로 투석한다. 투석된 IgG 용액에 0.05㏖(1/20부피)의 염화나트륨 수용액(2㏖/ℓ)을 가한다. 여기에 돼지의 위점막에서 유래된 펩신(0.2㎎/10㎎ IgG)을 용해시킨다. 혼합물을 37℃에서 15∼24시간 동안 반응시킨다. 그런후, 혼합물을 수산화나트륨 수용액(1㏖/ℓ)을 사용하여 pH8로 조정한 후, 혼합물을 세파덱스 G-150 컬럼(1.0∼1.5㎖용 1.5×45㎝, 2.0∼2.5㎖용 2.0×45㎝)에 넣고 붕산나트륨 완충액(pH8.0, 0.1㏖/ℓ)으로 용출시킨다. 280㎚에서의 흡광계수 1.48g^-1ℓ㎝^-1및 F(ab′)₂의 분자량 92000을 이용하여 계산된 수득된 F(ab′)₂의 양은 6㎎이다(J. Immunoassay, 4, 209∼327(1983)).

[Fab′의 제조]

3㎎의 F(ab′)₂을 0.45㎖의 인산나트륨 완충액(pH6.0, 0.1m㏖/ℓ)에 용해시킨다. 여기에 사용 직전에 제조한 5m㏖/ℓ의 EDTA를 함유하는 2-메르캅토에틸아민/인산나트륨 완충액(pH6.0, 0.1㏖/ℓ)을 가한다. 혼합물을 37℃에서 1.5시간동안 반응시킨다. 반응 혼합물을 세파덱스 G-25 컬럼(1×30㎝)에 넣고 인산나트륨 완충액(pH6.0, 0.1㏖/ℓ ; 5㏖/ℓ의 EDTA 함유)으로 용출시킨다. 280㎚에서의 흡광계수 1.48g^-1ℓ㎝^-1및 F(ab′)₂의 분자량 46,000을 이용하여 계산한, 수득된 Fab′의 양은 2.5㎎이다(J. Immunoassay, 4, 209-327(1983)).

[퍼옥시다제-표지화 항-α-hANP[17-28]Fab′의 제조]

2㎎의 고추냉이 퍼옥시다제(50n㏖)을 0.3㏖의 인산나트륨 완충액(pH7.0, 0.1㏖/ℓ)에 용해시킨다. 여기에 0.65㎎(2100n㏖)의 N-숙신이미딜 6-말레이미도헥사노에이트 및 0.03㎖의 N,N-디메틸포름아미드의 혼합물을 가하고, 혼합물을 30℃에서 0.5∼1시간 동안 교반하여 반응시킨다. 반응 혼합물을 원심분리하여 과량의 시약을 침전으로 제거한다. 상충액을 세파덱스 G-25 컬럼(1.0×45㎝)에 통과시키고, 각 분획의 부피가 0.5∼1.0㎖로 되도록 30∼40㎖/시간의 유속으로 인산나트륨 완충액(pH6.0, 0.1㏖/ℓ)을 사용하여 용출시킨다. 바닥에 미세 메쉬 여과지를 갖는 세파덱스 G-50 컬럼(fine, Pharmacia 제품)(1.0×6.4㎝, 5㎖)을 상기 완충액으로 평형화시키고 시험관에서 100g×g로 2분동안 원심분리한다. 상기 반응 생성물(0.5㎖)을 컬럼에 넣고 동일한 방법으로 원심분리한다. 수득된 분획을 미량농축기(CENTRICON 30, Amicon Corp. 제품)로 2,000×g, 4℃에서 원심분리하여 농축시킨다.

인산나트륨 완충액(pH6.0, 0.1㏖/ℓ)에 이렇게 제조된 1.8㎎(45n㏖)의 말레이미드 퍼옥시다제 결합제를 용해시킨다. 여기에 5m㏖/ℓ EDTA를 함유하는 0.2∼0.4㎖의 인산나트륨 완충액(pH6.0, 0.1㏖/ℓ)에 용해시킨 약 2.0㎎(43n㏖)의 Fab′ 용액을 가하고 혼합물을 4℃에서 20시간동안 또는 30℃에서 1시간동안 반응 시킨다. 반응 혼합물내의 말레이미드 퍼옥시다제 Fab′ 결합체의 최종 농도를 50∼100μ㏖/㎖로 한다. 이 반응 혼합물을 울트로겔 AcA 44컬럼(1.5×45㎝)에 통과시키고, 각 분획의 부피가 약 1.0㎖로 되도록 0.3∼0.5㎖/분의 유속으로 인산 나트륨 완충액(pH6.5, 0.1㎖/ℓ)을 사용하여 용출시킨다. 이리하여, 약 2.5㎎의 목적퍼옥시다제-표지화 항-α-hANP[17-28]Fab′을 수득한다(J. Immunoassay, 4, 209∼327(1983)).

[α-hANP[17-28]-비특이적 토끼 IgG 결합체]

0.2㎖의 인산나트륨 완충액(0.1㏖/ℓ, pH7.0)에 용해시킨 α-hANP[17-28](0.5㎎) 용액을 N,N′-디메틸포름아미드에 용해시킨 105m㏖/ℓ N-숙신이미딜 6-말레이미도헥사노에이트 0.01㎖와 30℃에서 30분동안 반응시킨다. 반응 생성물을 5m㏖/ℓ EDTA를 함유하는 0.1㏖/ℓ 인산 나트륨 완충액(pH6.0)을 사용하여 세파덱스 G-10컬럼(1.0×45㎝)에 겔 여과시킨다. α-hANP[17-28]에 도입된 말레이미드기의 평균값은 0.6/분자이다.

0.1㏖/ℓ 인산나트륨 완충액(0.6㎖, pH7.5)에 용해시킨 비특이적 토끼 IgG(10㎎) 용액을 N,N′-디메틸포름아미드에 용해시킨 210m㏖/ℓ S-아세틸메르캅토숙신산 무수물(0.03㎖) 용액과 30℃에서 30분 동안 반응시킨다. 이 반응혼합물에 0.1㏖/ℓ 트리스 히드로클로라이드 완충액(0.1㏖, pH7.0), 0.1㏖/ℓ EDTA(0.02㎖) 및 1㏖/ℓ 히드록실아민 히드로클로라이드(0.1㎖, pH7.0)을 가하고, 혼합물을 30℃에서 5분동안 반응시킨다. 반응 생성물을 5m㏖/ℓ EDTA를 함유하는 0.1㏖/ℓ 인산 나트륨 완충액(pH6.0)을 사용하여 세파덱스 G-25 컬럼(1.0×45㎝)에 겔여과시킨다. 비특이적 토끼 IgG에 도입된 티올기의 평균값은 11/분자이다.

상기 말레이미드-α-hANP[17-28]의 부분 표본(2.0㎖)을 5m㏖/ℓ EDTA를 함유하는 0.1㏖/ℓ 인산나트륨 완충액(pH6.0, 0.25㎖)에서 수득된 메르캅토숙시닐화 비특이적 토끼 IgG(2.4㎎)과 30℃에서 30분동안 반응시킨다. 반응 생성물에 0.1㎖의 N-에틸말레이미드 0.01m㏖/ℓ를 가하여 잔류 메르캅트기를 차단시킨다. 혼합물을 0.1㏖/ℓ 인산 나트륨 완충액(pH7.0)을 사용하여 세파덱스 G-25 컬럼(1.0×45㎝)에 겔여과시킨다. 티올기의 환원에서 계산된 비특이적 토끼 IgG와 결합된 α-hANP[17-28]의 평균 분자수는 8.7/분자이다.

[고추냉이 퍼옥시다제-표지화 항-α-hANP[17-28]Fab′의 정제]

α-hANP[17-28]-비특이적 토끼 IgG 결합체(2㎎), 소 티로글로불린(10㎎) 및 생쥐 혈청 단백질(20㎎)을 각각 브롬화 시아노겐-활성화 세파로오스 4B(1g)과 결합시킨다. 1g/ℓ 젤라틴 및 50㎎/ℓ 티메로살을 함유하는 0.1㏖/ℓ 인산나트륨 완충액(pH6.5 0.8㎖)에 용해시킨 고추냉이 퍼옥시다제-표지화 항-hANP[17-28] Fab′(7.8㎎)을 1g/ℓ 젤라틴 및 0.1㏖/ℓ 염화나트륨을 함유하는 10m㏖/ℓ 인산나트륨 완충액(pH7.5)을 사용하여 0.5㎖/시간의 유속으로 하나는 소 티로글로불린-세파로오스 4B 컬럼(0.55×4.0㎝)이고 다른 하나는 생쥐 혈청 단백질-세파로오스 4B 컬럼(0.55×4.0㎝)인 2개의 컬럼을 통과시킨다. 그런후, 3.2m㏖/ℓ 염산(pH2.5)을 사용하여 α-hANP[17-28]-비특이적 토끼 IgG-세파로오스 4B 컬럼(0.35×2.0㎝)으로 더 정제한다. 0.35㎎의 정제된 표지화 물질을 함유하는 용출액(1㎖)를 0.1㎖의 1㏖/ℓ 인산 나트륨 완충액(pH7.0) 및 0.01㎖의 100g/ℓ 젤라틴과 즉시 혼합한다. 퍼옥시다제 활성에서 계산된 표지화 물질의 양은 약 0.35㎎이다.

[단클론성 항-α-hANP-피복 폴리스티렌 볼의 제조]

50개의 폴리스티렌 볼(직경 3.2mm, Precision Plastic Ball Co., Chicago, U.S.A)을 1㎖의 0.1M 인산 나트륨 완충액(pH7.0)에 넣고, 100㎍/㎖의 단클론성 항-α-hANP-IgG₁(KY-ANP-I)을 가하고, 혼합물을 실온에서 밤새도록 방치한다. 폴리스티렌볼을 인산나트륨 완충액(pH7.0)으로 세척한후, 아지드화 나트륨을 0.1％로 가한다. 이렇게 제조된 폴리스티렌 볼을 냉장고에서 보존한다.

[혈장의 수집]

밤새도록 굶긴 건강한 남성 피검자(26∼32세)의 주전 동맥에서 오전 9 : 00에 앙와위로 혈액을 수집한다. 40㎎의 푸로세미드를 정맥내 주사하고 한시간 동안 보행하게 한후 동일한 방법으로 동일한 피검자로 부터 다시 혈액을 수집한다. 혈액을 냉각 플라스틱 주사기로 채취하여 아프로티닌 및 EDTA를 넣은 냉각 일회용 실리콘화 유리관에 옮긴다. 그런후 원심분리하여(500×g) 혈장을 분리한다. 아프로티닌 및 EDTA의 최종 농도는 각각 1,000칼리크레인 불활성화제단위(KIU)/㎖ 및 1㎎/㎖이다.

[샌드위치법에 의한 α-hANP의 효소면역 분석법]

하나의 단클론성 항 α-hANP IgG₁(KY-ANP-I)-피복폴리스티렌 볼을 α-hANP의 표준용액 또는 혈장(총부피 0.15㎖)에 담고, 4℃에서 24시간동안 방치한다. α-hANP 표준 용액을 10mM 인산나트륨 완충액(pH7.0 : 1㎎/㎖ 젤라틴, 0.3M 염화나트륨, 0.2mM 시스틴, 1mM EDTA, 1㎎/㎖ 아지드화 나트륨 및 1000KIU/㎖ 아프로티닌을 함유)으로 희석하여 최종 부피가 0.15㎖로 되게 한다. 혈장(50㎕)을 0.1㎖의 10mM 인산나트륨 완충액(pH7.0 : 1㎎/㎖ 젤라틴, 0.4M 염화나트륨, 0.3mM 시스틴, 1.5mM EDTA, 1.5㎎/㎖ 아지드화 나트륨 및 1,000KIU/㎖ 아프로티닌을 함유)과 혼합한다.

반응 생성물에서 액체 분획을 제거한후, 폴리스티렌 볼을 2㎖의 10mM 인산 나트륨 완충액(pH7.0 : 0.1M 염화 나트륨 함유)으로 2회 세척한다. 볼을 친화력 크로마토그래피로 정제한 50㎎의 토끼 항-α-hANP[17-28]Fab′-퍼옥시다제 결합체 및 0.15㎖의 10mM 인산 나트륨 완충액(pH8.0 : 1㎎/㎖ 젤라틴, 0.2mM 시스틴 및 1mM EDTA를 함유)과 혼합하고, 혼합물을 4℃에서 24시간 동안 방치한다. 액체분획을 제거한후, 폴리스티렌 볼을 상기와 동일한 방법으로 2회 세척하고 또다른 시험관으로 옮긴다. 결합체 퍼옥시다제의 활성을 결정하기 위해, 기질로 사용되는 3-(4-히드록시페닐)-프로피온산과 30℃에서 60분동안 반응 시킨후, 형광 강도를 측정한다. 형광 강도는 기준인 200㎎/㎖ 퀴닌/50mM 황산을 기준으로 측정한다.

[특이성]

본 발명에 의한 EIA에서, α-hANP의 표준 희석 곡선은 α-hANP[4-28], α-hANP[5-28] 및 α-hANP[7-28]의 희석 곡선과 동일한데, 이는 어떠한 N-말단 변형의 효과도 없음을 시사한다. 한편, C-말단 아미노산의 삭제는 반응성을 상당히 감소시킨다. 그러나, 말단 단편 : α-hANP[17-28] 및 α-hANP[1-6]은 아무런 반응을 나타내지 않는다. β-hANP 및 α-rANP와의 교차 반응은 몰 기준으로 각각 4.7％ 및 0.01％이다. 이 결과는 사용된 항체의 특이성과 일치한다 : 폴리스티렌 볼에 고정된 생쥐 단클론성 IgG₁은 α-hANP의 고리구조중 N-말단 반쪽에 특이적인 반면에, 퍼옥시다제에 결합된 토끼 Fab′는 α-hANP[17-28]에 특이적이다.

[혈장의 영향]

혈장 및 α-hANP없이 측정된 결합 옥시다제 활성(비특이적 결합)은 1p㏖의 단클론성 항-α-hANP IgG₁(KY-ANP-I)으로 전처리된 혈장의 존재하에서 측정된 퍼옥시다제 활성화 동일하다. 4.3∼332pg/㎖ ANP를 함유하는 혈장에 가해진 α-hANP(10∼200pg/㎖)의 회수율은 81∼94％이다. 혈장의 희석 곡선은 시험관당 혈장의 부피가 1∼50㎕의 범위일때 혈장없이 수득된 α-hANP의 표준 곡선과 평행이다. 따라서 혈장의 부피가 50㎕ 이하일 때에는 혈장의 간섭이 거의 관찰되지 않는다. 결과는 제2도에 제시된다.

[EIA의 감도]

α-hANP의 검출 한계는 30fg(10a㏖/시험관이다. 50㎕의 혈장을 사용하면, 혈장 α-hANP의 최소 검출 한계는 0.6pg/㎖(0.2f㏖/㎖)이다. EIA의 이 감도는 통상적인 RIA의 감도보다 10∼10²배 정도로 훨씬 더 높다.

[EIA의 재현성]

본 발명의 재현성은 혈장내 용해된 5∼158pg/㎖의 범위에 걸쳐 5다른 단계로 정의된다. 분석내 및 분석간 재현성의 변이상수는 각각 3.2∼9.4％(n=20) 및 5.4∼12.0％이다.

RIA의 경우와 비교된 EIA에 의한 기초 및 혈액 부피-수축상태의 건강한 피검자의 혈장 α-hANP 수준

건강한 피검자에 대해 EIA로 결정한 기초혈장 α-hANP 수준은 24.5±5.9pg/㎖이다. 푸로세미드(40㎎)을 정맥내 투여하고 한시간 보행한 후의 혈액부피-수축상태에서의 혈장 α-hANP 수준은 15.3±3.7pg/㎖로 감소한다. RIA로 동시에 결정한 혈장 α-hANP 수준은 각각 28.2±5.7pg/㎖ 및 18.3±3.2pg/㎖이다. 하기는 EIA(y) 및 RIA(x)에 의한 α-hANP의 측정치 간의 관계를 나타낸다 :

y=0.78x+1.3,

r=0.92, n=24

상기 분석치에서 명백히 볼수 있듯이, 본 발명의 방법에 의한 EIA는 매우 민감하여 혈액부피-수축 상태에서 조차 추출없이 혈장 α-hANP 농도를 측정할 수 있다.

[심장병 환자의 혈장 α-hANP 수준]

심장병 환자의 혈장 α-hANP 수준을 본 발명의 α-hANP 측정시약으로 측정하여 하기 표 1에 제시한다.

[표 1]

주 : 환자번호 1∼3은 심각한 심장병 환자이다.

[EIA에서의 한단계 방법의 적용]

본 발명에서의 EIA도 역시 한단계 방법으로 행할 수 있다. 제3도는 한단계 방법에 이한 α-hANP의 표준 곡선 및 희석 곡선을 나타낸다. 이 방법에서, hANP, 효소-표지화 항체, 및 항체-피복 폴리스티렌볼을 동시에 잘 혼합하고, 4℃에서 24시간동안 반응시킨다. 퍼옥시다제(POD) 활성은 30℃에서 30분동안 측정한다. 다른 조건은 두단계 방법의 조건과 동일하다.

Claims

α-hANP의 고리 구조중 N-말단 반쪽을 인지하는 단클론성 항체.
제1항에 있어서, α-hANP[7-16]에 포함되고 Met[12]를 함유하는 어떤 부분이든 인지하는 단클론성 항체.
제1항에 있어서, 하이브리도마 KY-ANP-I(ECACC 87082001)에 의해 생산된 단클론성 항체 KY-ANP-I인 단클론성 항체.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 고체상에 고정된 단클론성 항체.
제4항에 있어서, 고체상이 유리 비이드 또는 폴리스티렌 볼인 단클론성 항체.
제1항 내지 제3항중 어느 한항의 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마.
제6항에 있어서, 하이브리도마 KY-ANP-I(ECACC 87082001)인 하이브리도마.
하나는 α-hANP의 N-말단 측면을 인지하고 다른 하나는 α-hANP의 C-말단 측면을 인지하며, 하나는 고체상에 고정되고 다른 하나는 효소로 표지화된 두 종류의 항체를 함유함을 특징으로 하는 α-hANP의 면역 분석용 시약.
제8항에 있어서, 항체가 가교제를 통해 효소에 결합된 면역 분석용 시약.
제8항에 있어서, 효소가 퍼옥시다제인 면역 분석용 시약.
제8항에 있어서, 가교제가 N-숙신이미딜 4-(n-말레이미도메틸)시클로헥사노에이트 또는 N-숙신이미딜 6-말레이미도헥사노에이트인 면역 분석용 시약.
제8항에 있어서, α-hANP의 N-말단 측면을 인지하는 단클론성 항체가 제1항 내지 제3항중 어느 한 항의 항체인 면역 분석용 시약.
제8항에 있어서, α-hANP의 C-말단 측면을 인지하는 항체가 항-α-hANP[17-28] 항체인 면역 분석용 시약.
제13항에 있어서, 항-α-hANP[17-28] 항체가 토끼 항-α-hANP[17-28] 혈청에서 수득되는 면역 분석용 시약.
제8항에 있어서, 고체상이 유리 비이드 또는 폴리스티렌 볼인 면역 분석용 시약.