JP6508996B2 - β−ANPによる心不全の検出方法 - Google Patents
β−ANPによる心不全の検出方法 Download PDFInfo
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Description
(1)試料中のβ−ANPと総ANPとの比を求めることを特徴とする、心不全の検出方法。
(2)請求項1に記載の方法において、β−ANPと総ANPとの比が、総ANPに対するβ−ANPの比(β−ANP/総ANP)である方法。
(3)β−ANPを特異的に測定する試薬および総ANPを測定する試薬を含むことを特徴とする、心不全の検出キット。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本実験に使用した検体としては、健常者10例、心不全患者(急性心不全患者)60例の血漿を用いた。急性心不全患者は、(1)入院時、(2)入院後1〜2日後、(3)入院後5〜8日後、(4)退院時の治療経過にあわせて採血した。健常者10例は、男性5例、女性5例で、年齢は40.3±13.5歳(mean±SD)を用いた。急性心不全患者60例は、男性43例、女性17例で、年齢は70.7±12.5歳(mean±SD)を用いた。急性心不全患者60例の入院時および退院時におけるニューヨーク心臓協会(NYHA)による分類、体重、平均血圧、心臓超音波検査(左室内径短縮率)を表1に示す。血漿BNP濃度は市販のCLEIAキット(ルミパルスG1200、富士レビオ社)を用いてEDTA・アプロチニン血漿を測定した。血清NT−proBNP濃度は市販の電気化学発光免疫測定法キット(エクルーシス試薬NT−proBNP II、ロシュ社)を用いて測定した。血漿レニン活性は、ラジオイムノアッセイ二抗体法を用いてEDTA血漿を測定した。血漿アルドステロン濃度は、ラジオイムノアッセイ固相法を用いてEDTA血漿を測定した。サイクリックGMPは、サクシニル化したEDTA血漿をラジオイムノアッセイ法を用いて測定した。血清尿素窒素濃度、血清クレアチニン濃度は、汎用生化学自動分析装置(Labospect 008、日立製作所)を用いて測定した。
ヒト正常血漿は市販品(EDTA−2Na、コージンバイオ社 12271440)を使用した。血漿抽出物の調製には固相抽出カートリッジ(Sep−Pak C18 Plus、Waters社 WAT020515)を用いた。具体的には、固相抽出カートリッジを5mLの60% アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)溶液にて洗浄し、5mLの0.1%TFA溶液にて平衡化した後、300μLの血漿を添加した。5mLの10% アセトニトリル/0.1% TFA溶液にて2回洗浄した後、6mLの40% アセトニトリル/0.1% TFA溶液にて溶出した。溶出液を濃縮した後、凍結乾燥し、反応液に溶解して測定に用いた。
[実験用試薬等]
・固相化用緩衝液:50mM炭酸−重炭酸緩衝液(pH9.5)
・PEG化試薬溶液:5μM methyl−PEG12−NHS ester(Thermo Scientific社 22685)、PBS(pH7.4)
・ブロッキング溶液:25mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、2% BlockAce(DSファーマバイオメディカル社 UK−B80)、5% ウマ血清、20% スクロース
・洗浄液:25mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、0.05% Triton X−100、0.05% NaN3
・反応液:25mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、0.5mM EDTA−2Na、5% BSA、0.05% Triton X−100、500KIU/mL アプロチニン(和光純薬社)、0.05% NaN3
・検出抗体希釈用緩衝液:25mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、0.4% BlockAce、0.05% NaN3
・化学発光基質:CDP−Star with Emerald II(Applied Biosystems社 T2216)
[ALP標識#32−3の調製]
β−ANPのジスルフィド結合を含むアミノ酸配列を認識するマウスモノクローナル抗体#32−3(図2参照)のALP標識にはAlkaline Phosphatase Labeling Kit−NH2(同仁化学社 L12)を用いた。標識および標識抗体の精製は製造業者のマニュアルに従い行った。なおマウスモノクローナル抗体#32−3の製法は、後述の参考例に記載した。
本CLEIA法では、ヒトα−ANPの13〜17残基目をエピトープとするウサギポリクローナル抗体#131−7(Anal. Biochem., 461;10−16,2014)(図2参照)を固相化抗体として用いた。ウサギポリクローナル抗体#131−7の製法は、後述の参考例に記載した。固相化プレートの作製では、プレートへの非特異的吸着および固相化抗体のFc領域への血漿由来成分の結合を低減するため、従来のCLEIA法と比較して、固相化抗体のFc領域を標的としたポリエチレングリコール修飾(PEG化)を追加した方法(Anal. Biochem., 461;10−16,2014)を採用した。具体的には、固相化用緩衝液に溶解した#131−7(3μg/mL、150μL)を96穴プレート(Fluoro−Nunc Maxi−Sorp、Nunc社 437796)に添加し、4℃で24時間インキュベートした。抗体溶液を除去し、PEG化試薬溶液(100μL)を添加し、室温で30分間インキュベートした。PEG化試薬溶液を除去し、ブロッキング溶液(200μL)を添加し、室温で2時間インキュベートした。ブロッキング溶液を除去した#131−7固相化プレートをデシケーターにより乾燥させ、酸素吸収剤(アズワン社 1−6655−02)およびゼオライト乾燥剤(アズワン社 1−6655−03)と同封して密閉し、使用時まで−20℃にて保存した。
マイクロプレートウォッシャー(バイオテック社 AMW−8R)を用いて#131−7固相化プレートを洗浄液(350μL)で3回洗浄した。反応液(50μL)を各ウェルに添加した後、標準β−ANP溶液(反応液に溶解した定量済の合成β−ANP溶液、ペプチド研究所)またはヒト血漿抽出物溶液(50μL)を添加し、マイクロプレートシェーカー(日伸理化社 N−704)を用いて振盪撹拌しながら4℃で24時間インキュベートした。上記と同様に3回洗浄した後、検出抗体希釈用緩衝液で0.2ng/mLに希釈したALP標識#32−3溶液(100μL)を添加し、マイクロプレートシェーカーを用いて振盪撹拌しながら室温で1時間インキュベートした。上記と同様に4回洗浄した後、化学発光基質(100μL)を添加し、室温で20分間インキュベートした。マイクロプレートルミノメーター(SpectraMax L、Molecular Devices社)により1秒間に生ずる発光量を測定した。各試料は異なる2ウェルで個別に測定し、その平均値より定量値を算出した。
総ANPの測定は、市販のCLEIAキット(MI02 シオノギ ANP、シオノギ製薬社)を用いて測定した。
健常者10例、急性心不全患者60例のβ−ANPと総ANPを測定した。その測定結果からβ−ANP/総ANPの比を算出した。
健常者、急性心不全患者におけるβ−ANP/総ANPを表1(60例;入院時と退院時の比較)と図4(47例;1回目〜4回目の経時的変動)に示す。
(5−1)モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製とモノクローナル抗体の産生
[抗原の調製]
固相法で合成、精製した還元型ヒトα−ANP(シグマジェノシス社製、2.1mg)を、ジスルフィド結合を形成しない状態で、マレイミド活性化キーホールリンペットヘモシアニン(3mg、Thermo Scientific社 77605)と結合した。これを透析し、生理的食塩水で1mg/mLの溶液とした。
抗原溶液100μLとアジュバント100μL(Freund complete adjuvant,三菱化学ヤトロン社 RM606−1)を十分に混合して安定したエマルジョンにして、4週齢のC3H系マウス(4匹)の足の裏に各50μLずつ免疫した。これを合計5回、3日おきに実施した。最終免疫の3日後にマウス両足からリンパ節を収集し、リンパ節内の細胞を回収した。リンパ節由来細胞と増殖させたミエローマ細胞(P3U1)を2:1〜10:1の割合で混和し、遠心して回収後、50%ポリエチレングリコールを加えて細胞を融合させた。
1次スクリーニングは標準的なELISA法(Methods in Immunodiagnosis 2nd Edition, Rose and Bigazzi, eds., John Wiley and Sons, 1980; Campbell, et al., Methods and Immunology, W. A. Benjamin, Inc., 1964; Oellerich, M., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22:895−904, 1984; 羊土社 タンパク質実験ノート(下)岡田雅人編集 改訂第4版 2011年11月1日発行)で実施した。抗原を1μg/mLに希釈後、96穴プレート(NUNC 468667)に分注し、4℃で一晩、静置した。抗原溶液を除去後、Blocking Bufferを100μL/wellで分注し、ブロッキングを行った。培養上清50μLを各ウェルに添加して反応させた。洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼで標識した抗マウスIgGヤギ抗体と反応後、発色剤を添加し、450nmの吸光度を測定した。ヘモシアニンに対する吸光度が0.2以下で、抗原に対する特異的な吸光度を0.2以上有するクローンを陽性として選択した。
ヒトα−ANP(ペプチド研究所製)を還元後、カルボキシアミドメチル(CAM)化し、RP−HPLCで精製した。精製したCAM−α−ANPをラクトペルオキシダーゼ法によりヨード125(125I)で標識し、RP−HPLCで精製することにより、1分子の125Iで標識されたペプチドを調製した。以下の反応には、RIA用標準バッファー(RIAバッファー、50 mMリン酸緩衝液、80mM NaCl、25mM EDTA、0.05% NaN3、0.5% N−エチルマレイミド処理済BSA(SIGMA−Aldrich社 A7888)、0.5% Triton X−100、pH7.4)(Katafuchi T, et al., J. Biol. Chem., 278:12046−12054, 2003)を使用した。
上記5種のクローンを増殖し、対数増殖期の状態でハイブリドーマを分散させ、培地で希釈後、96穴プレートに播種した。1〜2週間後にハイブリドーマのシングルコロニーの形成が確認された段階で、各ウェルから培養上清をサンプリングし、上述の「ハイブリドーマの1次スクリーニング」に記載した方法に従い、活性を評価した。抗原に対する特異的な吸光度の強いクローンを各3種、合計15種を選択した。
CAM−α−ANPに加えて、α−ANP、β−ANP(ペプチド研究所製)をそれぞれラクトペルオキシダーゼ法により125Iで標識後、RP−HPLCで精製し、1分子の125Iで標識されたペプチドを調製した(125I−α−ANP、125I−β−ANP)。
腹水採取用にはヌードマウスを使用し、アジュバントとしてプリスタンを腹腔に注射して1週間後のマウスを用いた。選定したクローン(#32−3)を増殖、培養し、PBSにて懸濁し、上記のマウスに1匹当たり約1×106細胞を腹腔に注射した。2週間後ごろになると腹水がたまるので、経過をよく観察して腹水を複数回にわたり回収した。回収する容器には、予め保存用抗凝固剤(ACD液)を添加して凝固を抑制した。遠心により血球成分や不要物を除去し、上清を凍結保存した。
[精製モノクローナル抗体#32−3の調製]
腹水の上清画分からのモノクローナル抗体の精製にはAffi Gel Protein A(BioRad社 153−6153)を用いたプロテインA結合アフィニティーカラムを使用した。アフィニティーカラムへのサンプルの結合、洗浄、溶出は製造業者のマニュアルに従った。溶出液を500μLごとに、予め1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)160μLを加えた1.5mL容チューブに回収した。精製モノクローナル抗体を含む画分を、PBS中で4℃、オーバーナイトにて透析した。精製した溶液中のタンパク質量をBCA Protein Assay Kit(Pierce社 23227)を用いて定量した。
ポリクローナル抗体#131−7は、A. Sasaki, et al. Hypertension 10;308−312, 1987に記載の方法で調製した。得られたウサギ抗血清にキャリアタンパク質として使用したサイログロブリン(Sigma−Aldrich社 T1001、17mg/mL抗血清)およびアジュバント(M. Butyricum、DIFCO社 526−02651、10mg/mL抗血清)を加え、ローテーターにより撹拌しながら4℃、一晩インキュベートした後、遠心分離(4℃、13,000×g、15分間)し、上清を回収した。上清は直ちに上述のプロテインA結合アフィニティーカラムによる精製に供した。アフィニティーカラムへのサンプルの結合、洗浄、溶出は製造業者のマニュアルに従った。溶出液を500μLごとに、予め1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)160μLを加えた1.5mL容チューブに回収した。精製ポリクローナル抗体を含む画分を、PBS中で4℃、一晩、透析した。精製した溶液中のタンパク質量をBCA Protein Assay Kitを用いて定量した。このようにして精製ポリクローナル抗体#131−7を得た。これはヒトα−ANPの13〜17残基目をエピトープとするウサギポリクロ―ナル抗体である(Nagai C, Minamino N., Anal. Biochem., 461:10−16, 2014)。
ヒトα−ANPおよびβ−ANPに対する精製モノクローナル抗体#32−3の親和定数はRIA法を用いて算出した。具体的には、RIAバッファーを用いて精製モノクローナル抗体の5倍希釈系列液(200μL)を作製し、試験管内にて125Iで標識したα−ANPおよびβ−ANP(20,000cpm、100μL)と混合し、4℃で40時間インキュベートした。抗体に結合した125I−α−ANPまたは125I−β−ANPの放射活性量を上述のポリエチレングリコール分離法で分離し、測定した。125I−α−ANPまたは125I−β−ANPの結合量が50%となる抗体濃度をKd値として算出したところ、モノクローナル抗体#32−3はヒトα−ANPに対して1.34×10−8M、ヒトβ−ANPに対して1.69×10−11MのKd値を示し、この抗体がβ−ANPを選択的に認識することが実証された。
Claims (3)
- 心不全を検出するために、β−ANPのジスルフィド結合を含むアミノ酸配列を認識する抗体を用いて試料中のβ−ANPを測定し、試料中のβ−ANPと総ANPとの比を求める方法。
- 請求項1に記載の方法において、β−ANPと総ANPとの比が、総ANPに対するβ−ANPの比(β−ANP/総ANP)である方法。
- β−ANPのジスルフィド結合を含むアミノ酸配列を認識する抗体を用いたβ−ANPを特異的に測定する試薬および総ANPを測定する試薬を含むことを特徴とする、心不全の検出キット。
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