KR940004673B1

KR940004673B1 - 감자 잎말림 바이러스병 정밀진단용 단크론항체

Info

Publication number: KR940004673B1
Application number: KR1019900020471A
Authority: KR
Inventors: 천정욱; 유화영; 이은종
Original assignee: 농촌진흥청; 박정윤
Priority date: 1990-12-13
Filing date: 1990-12-13
Publication date: 1994-05-27
Also published as: KR920012917A

Abstract

내용 없음.

Description

감자 잎말림 바이러스병 정밀진단용 단크론항체

제1도는 감자 잎말림 바이러스 입자의 전자현미경 사진이고.

제2도는 간접 ELISA법에 의한 감자 잎말림 바이러스 특이항체 분비 세포주의 선발을 보여주는 사진이다.

본 발명은 감자 잎말림 바이러스병 정밀잔단용 단크론 항체에 관한 것이다.

감자 잎마림 바이러스병은 감자생산 및 종서의 품질퇴화에 가장 큰 제한요인이 되고 있어 우리나라뿐 아니라 전세계적으로 문제가 되고 있다.

최근 5년(1986-1990년)간 우리나라 감자 농가포장의 감염실태를 살펴보면 그 감염율이 20-60%에 이르고 있다.

이와 같은 감자 잎말림 바이러스병이 문제가 되고 있는 근본 원인은 병원바이러스가 진딧물이나 종서를 통하여 급속도로 퍼질뿐 아니라 후대에까지 계속 전염되며, 바이러스의 생물학적 특성상 현재로서는 약제방제가 불가능하기 때문이다.

그로인해 바이러스병의 방제는 바이러스의 감염유무를 정확히 진단, 바이러스에 감염되지 않은 무병주를 보급하는 것이 선결과제이다. 특히 바이러스 농도가 극히 낮은 조직배양식물체의 정밀한 조기 진단을 위해 정확도는 물론 민감도가 높은 진단용 항체를 개발해내는 것은 식물 바이러스중 그 농도가 가장 낮은 감자 잎말림 바이러스의 경우 그 중요성은 더욱 크다.

지금까지 감자 잎말림 바이러스는 그 크기가 가장 작고 농도도 가장 낮은 독성 때문에 연구가 어려워 진단용 항체를 외국에서 고가로 수입해서 쓰고 있는 실정이다.

수입에 따르는 제반문에 즉 수송도중 변질, 적기공그의 불원활등만이 아니라 수입항체는 다크론성 이므로 그 정확도가 민감도에 한계가 있어, 바이러스 감염유무를 조기에 정밀진단하기가 매우 어려운 설정이다.

따라서, 본 발명자들은 농업기술연구소 병리과에서 감자 잎말림 바이러스병 정밀진단체계를 확립하기 위하여 1988년부터 3년간 연구를 수행, 감자 잎말림 바이러스 진단효과가 뛰어난 단크론 항체를 개발, 생산하게 되었다.

본 명에 따라 제공되는 감자 잎말림 바이러스 항원의 정제방법, 감자 임팔림 바이러스-특이적 항체를 분비하는 융합세포주 및 그를 이용한 항체의 생산방법 및 항체의 특성을 하기 비제한적인 실시예에 의해 설명하였다.

[실시예 1]

감자 잎말림 바이러스 항원의 정제

(1) 항원준비

본 발명을 위해 사용된 항원은 감자 잎말림 바이러스이며 정제방법은 다음과 같다.

1. 이병 감자엽 500그람을 1리터 0.1몰 소듐 시트레이트 완충액으로 마쇄

2. 4겹의 가제로 불순물 여과

3. 여과시킨 시료용액을 0.1몰 인산완충액으로 피에치(pH) 7.0으로 조절

4. 클로로포름과 부탄올을 1:1로 혼합한 유기용매액을 사용, 현탁액으로 만듬

5. 10분간 원심분리(5,000회/분)후 상부의 액체층만 분리하여 그 체적의 8퍼센트에 해당하는 피이지(PEG, 분자량 6,000)를 넣고, 소듐 클로라이드를 0.2몰이 되도록 첨가.

6. 다시 15분가 원심분리(15,000회/분)후 침전문을 100밀리리터 인산 완충액에 용해시킨다.

7. 재원심후 침전물을 2밀리리터 인산완충액에 용해시킨후 10-40% 서당밀도 원심분리를 하여 항원 바이러스를 순화했다.

8. 정제된 바이러스 입자를 전자현미경으로 관찰후 항원으로 사용 하였다.

본 발명자들은 감자 잎말림 바이러스 순화시에 일반적으로 사용되는 고가의 세포벽 분해효소를 전혀 사용하지 않고, 원심분리 과정도 기존의 방법에 비해 간단하게 줄었으며, 서당밀도 원심분리로 오히려 순도가 더욱 높은 항원바이러스를 분리하였으며, 효소를 사용하지 않음으로 항원 정제경비를 절감하였다.

(2) 동물면역

면역에 사용된 동물은 생후 6주된 밥씨마우스(BALB/c) 암컷이며 항원 바이러스를 3회 복강주사했고 주사량 1회에 50마이크로그람이었으며 주사간격은 1회와 2회에는 3주일, 2회와 3회에는 1주일이었다.

[실시예 2]

감자 잎말림 바이러스-특이적 항체 분비 융합세포주

(1) 세포융합

항원인 감자 잎말림 바이러스에 의해 자극된 밥씨마우스의 임파구 세포와 종양세포인 엔에스-1(NS-1)세포를 피이지(PEG 분자량1,500)로 융합하여 임파구 세포와 종양세포의 유전적인 성질을 동시에 지닌 하이브리도마(hyrdoma)를 만들었으며 세포융합 방법은 하기와 같다.

1. 임파구세포와 종양세포를 30:1비율로 알피엠아이-1640(RPMI-1640) 배양액을 혼합하였다.

2. 10분간 저속원심(1,000회/분)하여 두세포를 원심분리관 밑바닥에 가라 앉혔다.

3. 배양액을 제거하여 침전물에 50퍼센트 피이지 1밀리리터를 45초 동안 한방울씩 넣었다.

4. 섭씨 37도에서 75초간 정치한 후 2밀리리터의 배양액을 60초간 넣어주었다.

5. 37도에서 60초간 정치한후 2밀리리터의 배양액을 60초간 넣어주었다.

6. 37도에서 60초간 정치한후 20밀리리터 배양액을 120초동안 넣어 주었다.

7. 20밀리리터 배양액을 넣어준후 10동안 저속원심분리 하였다.

8. 상부의 배양액을 제거한후 침전물을 에치에이티(HAT) 배양액으로 혼합한후 5개의 배양플레이트에 한플레이트당 19.2밀리리터가 되게 분주하였다.

9. 분주된 융합제포는 5% 탄산가스가 공급되는 37도 항온기에서 배양하였다.

잎말림 바이러스와 반응하는 특이항체 분비 융합세포주의 선발 : 잎말림 바이러스에 대해 특이항체를 분비하는 융합 세포주를 간접 일라이저(Indirect-ELISA)법에 의해 선발한 결과 240개 세포주 중에서 212개 세포주가 잎말림 바이러스에 대한 특이 항체를 분비하였다.

(2) 융합세포주의 단주화 및 재선발

선발된 212개 융합세포주 중에서 10개 세포주를 선택, 한계 희석벅에 의해 단주화 하였으며 그 방법은 아래와 같다.

1. 200개의 융합세포를 생후 3-4주된 밥씨마우스 한마리의 흉선세포와 배양액 38.4밀리리터로 혼합하였다.

2. 혼합액을 두개의 배양플레이트에 분주하여 각각의 세포를 단주화하였다.

3. 단주화된 세포를 5퍼센트 탄산가스가 공급되는 37도 항온기에서 배양하였다.

배양 10일째부터 세포의 성장상태를 검경, 재선발을 시작하였으며, 재선발에 사용된 간접일라이저 방법은 하기와 같다.

1. 일라이저 플레이트에 바이라스와 건전대조구를 60마이크로리터씩 첨가

2. 37도에서 2시간(혹은 실온에서 3시간)정치후 0.02몰 피에치 7.4 인산완충액으로 6회 세정

3. 1/2-스트랭스(1/2-strength) 카보네이트-바이카보네이트 완충액에 0.1퍼센트 비에스에이(BSA)를 융해시킨후 일라이저 플레이트에 200마이크로리터씩 첨가.

4. 2번 과정 반복

5. 항체 분비 유무를 검사하고자하는 세포의 배양액을 60마이크로리터씩 첨가.

6. 2번 과정 반복

7. 마우스 이뮤노글린부린-지(immunoglobulin-G)에 반응하는 항체를 첨가한다.

8. 2번 과정 반복

9. 기질을 반응시킨다.

10. 37도에서 1시간(혹은 실온에서 2시간) 반응후 발색반응을 보거나 파장 405 나노미터(nm)에서 광흡수치를 측정한다.

11. 대조구를 무색으로, 잎말림 바이러스에 대해 노란색으로 발색하는 세포주를 선발한다(제2도 참조)

(3) 특이항체분비 융합세포주 저장보존.

본 연구소에서 연구개발하여 액체질소통에 저장, 보존하고 있는 감자 잎말림 바이러스에 대한 10개 특이항체 분비 융합세포주의 라인(hybridoma lines)은 다음 표 1과 같다.

[표 1]

[실시예 3]

진단용 단크론 항체생산 및 그 특성

32개 단크론항체 분비 세포주중 두개를 선정, 그 배양액으로부터 염석법, 투석법, 음이온교환수지법등을 이용하여 임말림바이러스 진단용 단크론항체를 생산하였으며 그 우수한 특성을 하기와 같이 상세히 설명한다.

(1)배양액의 항체 희석 임계점

배양액의 항체 희석 임계점은 바이러스의 경우 1024배에 달했으며 이병감자엽 조즙액의 경우 128배 혹은 256배까지 희석했을때도 진단이 가능하였다(표 2참조).

[표 2]

(2)단크론항체의 민감도

본 연구소에서 개발한 단크론항체에 효소 알카라인 포스파테이스 (Alkalinephosphatase)를 연결하여 직접 일라이저법(Direct-ELISA)으로 그 민감도를 측정한 결과는 하기와 같다.

[표 3]

주 : 나노그람(ng); 1/10⁰그람

피피엠(ppm); 1/10⁶그람

상기 (표 3)에서 보는 바와 같이 일반적으로 다크론항체의 바이러스 진단시 필요한 항원의 량이 1피리엠인데 반해 본 발명의 단크론 항체는 0.003 피피엠으로 그 민감도가 높아 진단효율이 높음은 물론 비특이적 반응도 낮아 그 정확도가 매우 높다. 하기 (표 4)에서 상세히 설명한다.

[표 4]

본 발명의 진단용 단크론 항체는 상기(표 4)에서 보는 바와 같이 건전 대조구가 -0.051/0.023을 나타냄으로써 비특이적 반응을 보이지 않아 진단의 정확성을 높일 수 있다.

본 발명의 단크론 항체로 잎말림 바이러스를 진단할 경우, 진단용 항체 수입시 발생하는 수송도중 변질 문제가 없고, 원할한 적기 공급이 가능할 뿐 아니라, 자체생상 원가는 수입가의 1/10-1/15로 낮출 수 있어 90% 이상의 경비절감 효과를 가진다.

Claims

감자 잎말림병에 이병된 감자엽을 마쇄하고, pH 7.0으로 조절한 후 원심분리하고, 상층액에 PEG와 소듐 클로라이드를 가한 후 다시 원심분리를 2회 행하고, 10-40% 서당 밀도 원심분리를 행함을 특징으로 하는 감자 잎말림 바이러스 항원의 정제방법.
제1항에서 준비된 항원인 감자 잎말림 바이러스에 의해 자극된 BALB/C 마우스의 임파구와 NS-1세포로부터 만들어진 감자 잎말림 바이러스에 대한 특이항체를 분비하는 융합세포주(1C7-F12).
제2항의 융합 세포주가 생산하는 단크론항체.