JP2525569B2

JP2525569B2 - カンジタ菌の同定方法

Info

Publication number: JP2525569B2
Application number: JP20178785A
Authority: JP
Inventors: 義村深沢; けいこ加賀谷; 洋三宮川; 吉夫徐; 功河野; 美千代本島
Original assignee: 株式会社ヤトロン
Priority date: 1985-09-13
Filing date: 1985-09-13
Publication date: 1996-08-21
Anticipated expiration: 2011-08-21
Also published as: JPS6262000A

Description

【発明の詳細な説明】「産業上の利用分野」この発明はカンジダ菌（Candida species）の同定方
法に関し、更に詳しくは、カンジダ属菌体表面抗原に対
する新規モノクローナル抗体の１以上を被検試料と接触
させて、得られる凝集反応の結果を利用するカンジダ菌
の同定方法に関するものである。

真菌は元来病原性が弱く、免疫能が正常に機能してい
る患者には感染しにくいが、免疫能を低下させる誘因が
あれば感染、発病に至る。たとえば血液疾患（特に急性
白血病やリンパ腫）、腫瘍、坑免疫療法、副腎皮質ホル
モン剤の使用時等のように患者の免疫能を低下させる病
気あるいは治療法の場合に真菌による感染症を併発す
る。従って、真菌の迅速なかつ簡単な同定法は臨床上重
要な意味を持っている。また、発酵醸造工程中発生する
有害な真菌類と醸造酵母とを迅速かつ正確に識別する方
法が発酵産業界において要求されている。カンジダ菌は
上記のような問題をもつ真菌類の中でも代表的なものの
一つである。

「従来の技術」従来、カンジダ菌の分類および同定は形態学的および
生化学的な性質をもとに行われていたが、これらは操作
が煩雑な上に高度な熟練を必要とした。

他方、既に、土屋^1,2）らおよび深沢^3,4.5）らは種々
の酵母種の血清学的同定法の詳細な研究を行ない、酵母
の血清学的特異性は抗原決定基である細胞壁マンナンの
構造に密接な関連があることを明らかにした。実際、上
記の研究業績を基礎とした「カンジダ同定用因子抗体キ
ット」（株式会社ヤトロン製）が1970年より市販されて
いる。このキットは次のような方法で製造されている。
すなわち、ラビットに種々なカンジダ菌で免疫を行い、
得た抗血清を免疫に用いた菌種とは異なる菌体で吸収し
て、菌特異的な因子抗体を得る。現在、このような因子
抗体を用いて、種々なカンジダの因子抗原が明らかにな
っている。

このカンジダ属の血清学的同定法は、上記の従来の方
法に比べて、より迅速にかつより簡単にカンジダ属の同
定が可能であるけれども、多種類の特異性をもつ抗体の
混合物から煩雑な吸収操作によって作成された因子抗体
は生産コストおよび製品管理の点で様々な困難をもつ。
すなわち、多数の動物に体する免疫操作、多種大量の免
疫原（菌）の培養、大量の採血かつ煩雑な吸収操作等で
ある。

他方センダイウイルスおよびポリエチレングリコール
による細胞融合の基本原理、さらに抗体産生細胞とミエ
ローマ細胞との融合によって特異的な抗体を産生するハ
イブリドーマが得られることは、岡田⁶⁾、KaoとMichayl
uk⁷⁾、K hler⁸⁾らの報告によって知られており、また前
述のごとく、カンジダの血清学的同定法は、土屋らの報
告、深沢らの報告および市販カンジダ同定用因子抗体キ
ットに見られるごとく公知の事実であるが、本願発明以
前には、上記のカンジダ同定用ポリクローナル因子抗体
と同じ性質をもつモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマが形成され得るか否かは、未だ知られていなか
った。

１）Tsuchiya,T.et al.1965.Mycopathol.Mycol.Appl.2
6:1 ２）Tsuchiya,T.et al.1974.Mycopathol.Mycol.Appl.5
3:77 ３）Fukazawa Y.et al.1980.P.127−136.In Presusser,
H.（ed）,Medicalmycology,Zentralbl.Bacteriol.Supp
l.8,Gustav Fischer Verlarg,Stuttfart.New York. ４）Fukazawa Y.et al.1976.P.213−21.In Iwata,K.（e
d）,Yeasts and yeast−like microorganisms in medic
al science,University of Tokyo Press,Tokyo. ５）Okada,Y.11962.Exp.Cell Res.26.98 ６）Kao,K.N.and Michayluk M.R.1974.Planta,115,355 ７）K hler et al.1975.Nature 256,495 「発明が解決しようとする問題点」本発明者等は、鋭意研究の結果、カンジダ菌に対する
抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合せしめることによ
り、カンジダ菌に対する抗体を産生し、しかも長期継代
培養可能なハイブリドーマを得、該ハイブリドーマより
分泌されるモノクローナル抗体を採取し、これを利用す
ることによって、従来のポリクローナル因子抗体と同等
の特異性を持ち、しかもそれに比べて高い力価をもつ抗
カンジダモノクローナル因子抗体が得られることを見い
出し、本発明を完成するに至った。従って本発明は、抗
カンジダ同定用因子モノクローナル抗体を得、これを用
いてカンジダ菌を制度良く分類及び同定する方法を提供
することを目的とする。

「問題点を解決するための手段」すなわち、本発明はカンジダ菌（Candida species）
に対する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させ、
選別することによって得られるハイブリドーマから、産
生・分泌されるカンジダ菌に対するモノクローナル抗体
を採取し、これを用いて被検試料のカンジダ菌を同定す
るもので、下記の（１）の請求項から構成されている。

（１）下記のＡ群の〜に記載するカンジダ菌（Cand
ida species）を含む被検試料と、下記のＢ群に記載す
る、、、、、、、、及びのモノクロ
ーナル抗体の１以上とを接触させて得られる陰性（−）
〜陽性（＋）の凝集反応結果から、前記、、、
、、、及びのカンジダ菌の１以上を分類、識別
することを特徴とするカンジダ菌の同定方法。

＜Ａ群＞ Candida albicans（serotype A） Candida albicans（serotype B） Candida guilliermondi Candida glabrata Candida kefry Candida krusei Candida parapsilosis Candida tropicalis Candida stellatoidea ＜Ｂ群＞前記Ａ群の、、、、、及びとは反応する
が、前記、、及びとは反応しないモノクローナル
抗体。

前記Ａ群の、、、、、及びとは反応する
が、、、及びとは反応しないモノクローナル抗
体。

前記Ａ群の、、及びとは反応するが、前記、
、、、、及びとは反応しないモノクローナル
抗体。

前記Ａ群の、及びとは反応するが、前記、、
、、、、及びとは反応しないモノクローナル
抗体。

前記Ａ群のとのみ反応し、他とは反応しないモノク
ローナル抗体。

本発明のカンジダ属に対するモノクローナル抗体は、
抗カンジダ抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合する
ことによって得られる抗カンジダモノクローナル抗体産
生性ハイブリドーマから産生されるものである。

ここで、ハイブリドーマの製造に用いられる抗カンジ
ダ抗体産生細胞としては、次に記載する〜の菌種の
生菌、グルタルアルデヒド処理菌、マイトマイシン処理
菌或は熱処理菌等をマウスなどの動物に免疫し、免疫後
その脾臓等を採取することによって得られる脾臓細胞が
用いられる。

Candida albicans（serotype A） Candida albicans（serotype B） Candida guilliermondi Candida glabrata Candida kefry Candida krusei Candida parapsilosis Candida tropicalis Candida stellatoidea 免疫に用いられる動物としては、マウス特にBalb/C系
マウスが好適に用いられる。

なお、免疫の際の免疫原投与法は皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、及び筋肉注射等のいずれで
もよいが、腹腔内注射が好ましい。免疫は適当な間隔、
好ましくは１〜２週間をおいて繰り返し行なう。毎免
疫、１週間後に免疫した動物血清中の抗カンジダ抗体価
を測定し、抗体価が充分高くなった、好ましくは凝集力
価反応320倍希釈以上になった動物から抗体産生細胞を
得て用いれば、抗カンジダ抗体産生ハイブリドーマを得
る確立は著しく高くなる。

細胞融合には最終免疫後、３日目のマウス由来の抗体
産生細胞を用いるのが好ましい。なお、このようにして
得られる抗カンジダ抗体産生細胞は、還流法等によって
バラバラにほぐして使用することが好ましい。

この抗カンジダ抗体産生細胞との融合に用いるミエロ
ーマ細胞としては、マウス由来の骨髄腫細胞、P3−X63
−Ag8、Sp 2/0−Ag14、P3−NS1/1−Ag4−１またはX63−
Ag8.653が有効に使用される。

これらの両細胞を融合する場合は、ミエローマ細胞に
対し抗カンジダ抗体産生細胞を細胞数２倍以上の割合で
ダルベッコ改変イーグル培地（以下DMEと表示）等の適
当な培地中で混合し、遠心して上清を除去した後、ポリ
エチレングリコールで融合する方法が好適に採用され
る。なおこの場合、ポリエチレングリコールは、分子量
1000,1540,2000,4000または6000のものを用いるのが好
ましい。ポリエチレングリコールは40〜50％の水溶液と
して使用し、反応は37〜38℃、１〜２分間とすることが
好ましい。反応後は必要に応じて上記のDME培地で遠心
法によって洗浄した後、好適にはウシ胎児血清を10〜15
％含むDME培地等の適宜な培地を加えて１日程度培養す
ることが好ましい。

この細胞融合によって得られる反応物中に目的とする
ハイブリドーマのほか、未融合の抗カンジダ抗体産生細
胞とミエローマ細胞が混在しているため、ハイブリドー
マを選択的に培養する必要がある。この目的のためにウ
シ胎児血清10〜15％を含むDME培地にアミノプテリン、
ヒポキサンチン、チミジンを加えたHAT培地が有効に用
いられる。これによりハイブリドーマのみを選択的に生
育、増殖させることができる。一方、未融合の抗カンジ
ダ抗体産生細胞とミエローマ細胞は死滅する。この場
合、HAT培地をアミノプテリンを除いたHT培地に徐々に
変換することができる。

このようにして生育、増殖したハイブリドーマは、10
〜15％ウシ胎児血清を含むDME培地にヒポキサンチン、
チミジンを添加したHT培地で３〜６日間程度培養し、そ
の後10〜15％ウシ胎児血清を含むDME培地等のハイブリ
ドーマ用培地で培養することが好ましい。

得られたハイブリドーマ群からカンジダに対するモノ
クローナル産生性ハイブリドーマを選別する方法として
種々な方法がある。たとえば、ラジオイムノアッセイ
（RIA）、エンザイムイムノアッセイおよび間接蛍光抗
体法等の方法である。この場合ELISA（Enzyme Linked I
mmunosorbent Assay）は感度も十分に高く、かつ簡単で
あるので好適に採用される。

上記の方法で選別したハイブリドーマは、一般には２
個以上のクローンを含むことが多く、完全に同一の性質
を有する細胞の集団ではない。また、たとえ最初は同一
の性質を有する細胞の集団であっても培養中に、その集
団の中から抗体を産生しないクローンが出現することが
度々ある。そこで個々のクローンを分離するために、ハ
イブリドーマのクローニングを行うことが必要である。
クローン化の方法としては、限界希釈法、軟寒天法、フ
ィブリンゲル法等を用いることができる。この場合、限
界希釈法が好適に採用される。また、培地としては10〜
15％ウシ胎児血清血清を含むDME培地にヒポキサンチ
ン、チミジンを加えたHT培地または10〜15％ウシ胎児血
清血清を含むDME培地を用いることが可能である。

抗体の製造にあたっては、カンジダ菌に対する抗体を
産生するハイブリドーマをインビトロで増殖培養するこ
とができ、またハイブリドーマをマウス腹腔等に投与し
てインビボで増殖することもできる。

なお、このようにして得られたカンジダに対するモノ
クローナル抗体産生性ハイブリドーマは10％ジメチルス
ルホキシドを含むウシ胎児血清で液体窒素中に凍結保存
することが可能である。

本発明の抗体は、粗製抗体液、すなわち抗カンジダ抗
体産生性ハイブリドーマ培養上清液、あるいはマウス腹
腔液のまま使用することもできる。さらに、硫安アンモ
ニウム分画やイオン交換クロマトグラフィあるいはプロ
テインＡや抗原カラムなどによるアフィニティクロマト
グラフィにより精製して使用することも可能である。

以上のような方法で得られた粗製抗体あるいは精製抗
体は、後述の実施例に示すように、前述のカンジダ同定
用因子ポリクローナル抗体と同じ性質を持つモノクロー
ナル抗体である。

次に、本発明に使用するカンジダ同定用モノクローナ
ル抗体の製造方法について述べる。

「実施例１」抗Candida albicans serotype A抗体産生ハイブリドー
マCA−４、CA−５およびCA−６の樹立と抗体の産生（１）抗体産生細胞（免疫原）および細胞壁マンナン
の精製 Candida albicana M−1012株（serotype A）を27℃、
48時間サブロ培地で培養後、遠心分離（1000×g,4℃,10
分間）によって菌体を集める。この菌体を脱イオン水で
遠心法によって３回洗浄後、100℃２時間熱処理を行
う。菌は２×10⁸個/mlの濃度に調整し、免疫原菌浮遊溶
液として以下の操作に用いた。

他方、菌細胞壁マンナンの抽出は次の操作で行う。熱
処理した菌体を遠心分離によって集め、菌体体積の５倍
量の２％水酸化カリウム溶液に懸濁させることによって
マンナンの抽出し⁸⁾、銅錯塩にして精製した⁹⁾。このよ
うにして得たマンナンは、抗カンジダ抗体産生性ハイブ
リドーマを選別するためのELISA用抗原として使用す
る。

８）Fukazawa,Y.et al.1980.Int.J.Syst.Bacteriol.30:
196 ９）Gorin,P.A.J,and Spencer,J.F.T.1968.Can.J.Chem.
46:2299 （２）細胞融合上記の免疫原菌体浮遊液0.2mlをBalb/c系マウス腹腔
内に投与することにより免疫を行った。血中抗体価が十
分に上昇するまで、１〜２週間間隔で免疫する。血中抗
体価は、上記の精製マンナンをコートしたポリスチレン
プレートを用いたELISA法により測定した。

抗体価の上昇したマウスに１回追加免疫し、３日後の
脾臓を無菌的に摘出した。次に、10〜15％胎児血清を含
むDME培地5mlを入れたシャーレに脾臓を入れ、脾臓を10
〜15％胎児血清を含むDME培地で還流して脾細胞を流出
させた後、この脾細胞懸濁液をナイロンメッシュに通
す。この脾細胞を50ml遠心チューブに集めて500×g,10
分間遠心する。こうして得た細胞ペレットに３〜5mlの
ヘモライズイング溶液（155mM NH₄Cl,10mM KHCO₃,1mM
Na₂EDTA pH7.0）を加え、懸濁させる。０℃で５〜10
分間放置すると溶血が起る。10〜20mlの10〜15％胎児血
清を含むDME培地を加えてから遠心分離する。このよう
にして得た細胞ペレットをDME培地で遠心法によって洗
浄し、生きた脾細胞の数をカウントする。

一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞SP2/0−A
g14約２×10⁷個に１×10⁸個の上記脾細胞を加え、DME培
地中でよく混和し、遠心分離を行った（500×g,10分
間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、
38℃に保温しておいた40％ポリエチレングリコール4000
溶液を0.5mlを滴下し、遠心チューブを、手で１分間穏
やかに回転することによってポリエチレングリコール溶
液と細胞ペレットを混合させた。次に、38℃に保温して
おいたDME培地を、30秒毎に1mlずつ加えてチューブを穏
やかに回転させる。この操作を10回繰り返した後、20〜
30mlの15％胎児血清を含むDME培地を加えて、遠心分離
（500×g,10分間）を行った。

上清を除去した後、細胞ペレットを10〜15％胎児血清
を含むHAT培地で、遠心法で２回洗浄後、40mlの上記HAT
培地に懸濁する。この細胞懸濁液を96ウェル細胞培養プ
レートの各ウェルに200μずつ分注し、37℃、５％炭
酸ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開始した。培養
後、２〜３日間隔で各ウェル培地を約100μ除き、新
たに上記のHAT培地を100μ加えることによりHAT培地
中で増殖するハイブリドーマを選択した。10日目頃から
HT培地（10〜15ウシ胎児血清を含むDME培地に10^-4Mヒポ
キサンチン、1.6×10^-5Mチミジンを加えたもの）に交換
し、ハイブリドーマの増殖を観察するとともに、約14日
目に、下述のELISA法により、抗カンジダ抗体産生性ハ
イブリドーマをスクリーニングした。

（３）ハイブリドーマの樹立ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無はELISA
法により測定した。96ウェルELISA用プレート（Microti
ter plate,日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに、
先に精製した細胞壁マンナンを50mM炭酸水素ナトリウム
緩衝液で50μg/mlの濃度に調整した溶液を50μずつ分
注し、37℃で24時間放置した。次に0.05％Tween20−sal
ine溶液で３回洗浄した後、各ウェルに培養上清を50μ
加え、室温で１時間反応させた。次に200倍希釈した
ペルオキシダーゼ結合抗マウスグロブリン抗体（ダコ
社、デンマーク）50μを各ウェルに加えた。

反応終了後、0.05％Tween20−salineで各ウェルを３
回洗浄し、0.5mMアミノアンチピリン、10mM石炭酸、お
よび0.005％過酸化水素水を含む溶液250μを各ウェル
に加え、室温で30分間反応させ、各ウェルの492nmにお
ける吸光度を測定した。その結果、192ウェル中３ウェ
ルに抗体産生が認められた。

上記ELISA法によって認められた培養上清中の抗カン
ジダ抗体が、免疫原であるCandida albicana J1012（se
rotype A）と凝集反応を起こすか否かを検討した。凝集
板の各ウェルに免疫原として使用した菌懸濁液（１×10
⁹個/ml）を20μ加える。次に培養上清液を80μ加え
た後、よく混和して１分間放置する。１分後、各ウェル
の凝集程度を観察する。ELISA法によって抗体産生が認
められたウェルの培養上清は、すべて上記の菌と凝集反
応を起こした。

抗体産生が認められたウェル中のハイブリドーマは24
ウェルプレートに写し、HT培地で４〜５日間培養した
後、再度ELISA法と凝集反応法とにより抗体産生の有無
を確認してから限界希釈法によってクローニングした。
限界希釈法は、HT培地でハイブリドーマが５個/mlとな
るように希釈した細胞浮遊液を予め正常Balb/c系マウス
の腹腔細胞がウェルあたり２×10⁴個分注してある96ウ
ェルプレートの各ウェルに100μずつ分注した。２週
間後、ELISA法と凝集反応法によって抗体産性ハイブリ
ドーマのクローンをスクリーニングした。その結果、各
ハイブリドーマにつき、20〜40個の抗体産生クローンが
得られる。これらのクローンの中から、増殖のよい、抗
体分泌能が高い、しかも安定なクローンを選び、前述の
同様の方法で再度クローン化を行い、抗Candida albica
ns serotype A抗体産生ハイブリドーマCA−４、CA−５
およびCA−６を樹立した。

（４）抗体の産生プリスタン（2,6,14−テトラメチルペンタデカン）0.
5mlを10〜12週齢のBalb/c系マウスの腹腔内に投与後、1
4〜20日目のマウス腹腔内にインビドロで増殖させたハ
イブリドーマCA−４、CA−５またはCA−６をマウス一匹
あたり２×10⁶個接種した。接種後２〜３週間目に腹水
を採取し、遠心分離（100×g,10分間）により腹水上清
を得た。各ハイブリドーマにつき一匹のマウスから約10
〜15mlの腹水上清が得られた。その抗体量は、CA−4,5m
g/ml、CA−5,4.8mg/ml、およびCA−6,10mg/mlであっ
た。

（５）抗体の特異性およびクラスハイブリドーマCA−４、CA−５、CA−６の産生分泌す
る抗体が抗原細胞Candida albicana M1012（serotype
A）の他、同種異株、同属異属の細胞と凝集反応を起こ
すか否か及び、さらにその力価を検討した。結果を表１
及び表２に示す。

各抗体のクラスはオクテロニー法によって決定した。
この場合、抗マウス1gG抗体、抗マウス1gA、及び抗マウ
ス1gM抗体はペルフリーズ社（アメリカ）のものを使用
した。その結果、得られた３種の抗体はすべて1gMであ
った。

「実施例２」抗Candida albicana B792（serotype B）抗体産生ハイ
ブリドーマCB−４およびCB−13の樹立、及び抗体の産生（１）抗体産生細胞および細胞壁マンナンの調製 Candida albicans B−792（serotype B）を27℃、48
時間サブロ培地で培養後、遠心分離（1000×g,10分間）
によって菌体を集める。この菌体を脱イオン水で遠心法
によって３回洗浄後、100℃で２時間熱処理を行う。菌
は２×10⁸個/mlの濃度に調整し、免疫原浮遊液として以
下の操作に用いた。一方、細胞壁マンナンの抽出は次の
操作で行った。熱処理した菌を遠心分離によって集め、
菌体体積の５倍量の２％水酸化カリウム溶液に懸濁させ
ることによって抽出し、銅錯塩にして精製した。このよ
うにして抽出、精製したマンナンは抗カンジダ抗体産生
性ハイブリドーマを選別するためのELISA用抗原として
使用する。

（２）細胞融合抗体産生細胞及びミエローマ細胞の調製、細胞融合
は、前記実施例１の（２）と同様の方法で行った。

（３）ハイブリドーマの樹立融合細胞培養上清中の産生抗体の有無はELISA法とス
ライド凝集反応法によって前記実施例１の（３）と同様
の方法で行った。その結果抗Candida albicans B792（s
erotype B）抗体産生ハイブリドーマCB−４およびCB−1
3を樹立した。

（４）抗体の産生前記実施例１の（４）に記載の方法で行いBalb/c系マ
ウス１匹あたり約10〜15mlの腹水上清を得た。

（５）抗体の特異性およびクラス前記実施例１の（５）に記載の方法でハイブリドーマ
CB−４およびCB−13の産生分泌する抗体の特異性、免疫
グロブリンのクラスおよび力価を調べた。その結果を表
１及び表２に示す。

「実施例３」抗Candida guilliermondi抗体産生性ハイブリドーマCG
−９の樹立、及び抗体の産生（１）免疫原および細胞壁マンナンの調製 Candida guilliermondiを27℃48時間サブロ培地で培
養後、遠心分離（1000×ｇ、10分間）によって菌体を集
める。この菌体を脱イオン水で遠心法によって３回洗浄
後、100℃で２時間熱処理を行う。菌は２×10⁷個/mlの
濃度に調整し、免疫原浮遊液として以下の実験に用い
た。一方、細胞壁マンナンの抽出は次の操作で行った。
熱処理した菌を遠心分離によって集め、菌体体積の５倍
量の２％水酸化カリウム溶液に懸濁させることによって
抽出し、銅錯塩にして精製した。このようにして抽出、
精製したマンナンは、抗カンジダ抗体産生性ハイブリド
ーマを選別するためのELISA用抗原として使用する。

（２）細胞融合抗体産生細胞およびミエローマ細胞の調整、細胞融合
は前記実施例１の（２）と同様の方法で行った。

（３）ハイブリドーマの樹立融合細胞培養上清中の産生抗体の有無はELISA法とス
ライド凝集反応法によって前記実施例１の（３）と同様
の方法で行った。その結果、抗Candida guilliermondi
抗体産生性ハイブリドーマCG−９を樹立した。

（４）抗体の産生前記実施例１の（４）に記載の方法で行い、Balb/c系
マウス１匹あたり約10〜15mlの腹水上清を得た。

（５）抗体の特異性およびクラス前記実施例１の（５）に記載の方法でハイブリドーマ
CG−９の産生分泌する抗体の特異性、免疫グロブリンの
クラスおよび力価を調べた。その結果を表１及び表２に
示す。

「実施例４」抗Candida glabrate抗体産生性ハイブリドーマCGL−34
の樹立、及び抗体の産生（１）免疫原および細胞壁マンナンの調製 Candida glabrataを27℃48時間サブロ培地で培養後、
遠心分離（1000×g,10分間）によって菌体を集める。こ
の菌体を脱イオン水で遠心法によって３回洗浄後、100
℃で２時間熱処理を行う。菌は２×10⁷個/mlの濃度に調
整し、免疫原浮遊液として以下の実験に用いた。一方、
細胞壁マンナンの抽出は次の操作で行った。熱処理した
菌を遠心分離によって集め、菌体体積の５倍量の２％水
酸化カリウム溶液に懸濁させることによって抽出し、銅
錯塩にして精製した。このようにして抽出、精製したマ
ンナンは抗カンジダ抗体産生性ハイブリドーマを選別す
るためのELISA用抗原として使用する。

（３）ハイブリドーマの樹立融合細胞培養上清中の産生抗体の有無はELISA法とス
ライド凝集反応法によって前記実施例１の（３）と同様
の方法で行った。その結果、抗Candida glabrata抗体産
生性ハイブリドーマCGL−34を樹立した。

（５）抗体の特異性およびクラス前記実施例１の（５）に記載の方法でハイブリドーマ
CGL−34の産生分泌する抗体の特異性、免疫グロブリン
のクラスおよび力価を調べた。その結果を表１及び表２
に示す。

［実施例５］抗Candida kefry抗体産生性ハイブリドーマCK−８の樹
立、及び抗体の産生（１）免疫原および細胞壁マンナンの調製 Candida kefryを27℃48時間サブロ培地で培養後、遠
心分離（1000×g,10分間）によって菌体を集める。この
菌体を脱イオン水で遠心法によって３回洗浄後、100℃
で２時間熱処理を行う。菌は２×10⁷個/mlの濃度に調整
し、免疫原浮遊液として以下の実験に用いた。一方、細
胞壁マンナンの抽出は次の操作で行った。熱処理した菌
を遠心分離によって集め、菌体体積の５倍量の２％水酸
化カリウム溶液に懸濁させることによって抽出し、銅錯
塩にして精製した。このようにして抽出、精製したマン
ナンは抗カンジダ抗体産生性ハイブリドーマを選別する
ためのELISA用抗原として使用する。

（３）ハイブリドーマの樹立融合細胞培養上清中の産生抗体の有無はELISA法とス
ライド凝集反応法によって前記実施例１の（３）と同様
の方法で行った。その結果、抗Candida kefry抗体産生
性ハイブリドーマCK−８を樹立した。

（５）抗体の特異性およびクラス前記実施例１の（５）に記載の方法でハイブリドーマ
CK−８の産生分泌する抗体の特異性、免疫グロブリンの
クラスおよび力価を調べた。その結果を表１及び表２に
示す。

「実施例６」抗Candida krusei抗体産生性ハイブリドーマCKR−11の
樹立、及び抗体の産生（１）免疫原および細胞壁マンナンの調製 Candida kruseiを27℃48時間サブロ培地で培養後、遠
心分離（1000×g,10分間）によって菌体を集める。この
菌体を脱イオン水で遠心法によって３回洗浄後、100℃
で２時間熱処理を行う。菌は２×10⁷個/mlの濃度に調整
し、免疫原浮遊液として以下の実験に用いた。一方、細
胞壁マウスの抽出は次の操作で行った。熱処理した菌を
遠心分離によって集め、菌体体積の５倍量の２％水酸化
カリウム溶液に懸濁させることによって抽出し、銅錯塩
にして精製した。このようにして抽出、精製したマンナ
ンは抗カンジダ抗体産生性ハイブリドーマを選別するた
めのELISA用抗原として使用する。

（２）細胞融合抗体産生細胞及びミエローマ細胞の調整、細胞融合
は、前記実施例１の（２）と同様の方法で行った。

（３）ハイブリドーマの樹立融合細胞培養上清中の産生抗体の有無はELISA法とス
ライド凝集反応法によって前記施例１の（３）と同様の
方法で行った。その結果、抗Candida krusei抗体産生性
ハイブリドーマCKR−11を樹立した。

（４）抗体の産生前記施例１の（４）に記載の方法で行い、Balb/c系マ
ウス１匹あたり約10〜15mlの腹水上清を得た。

（５）抗体の特異性およびクラス前記施例１の（５）に記載の方法でハイブリドーマCK
R−11の産生分泌する抗体の特異性、免疫グロブリンの
クラスおよび力価を調べた。その結果を表１及び表２に
示す。

「実施例７」抗Candida parapsilosis抗体産生性ハイブリドーマCP−
13の樹立、及び抗体の産生（１）免疫原および細胞壁マンナンの調製 Candida parapsilosisを27℃48時間サブロ培地で培養
後、遠心分離（1000×g,10分間）によって菌体を集め
る。この菌体を脱イオン水で遠心法によって３回洗浄
後、100℃で２時間熱処理を行う。菌は２×10⁷個/mlの
濃度に調整し、免疫原浮遊液として以下の実験に用い
た。一方、細胞壁マンナンの抽出は次の操作で行った。
熱処理した菌を遠心分離によって集め、菌体体積の５倍
量の２％水酸化カリウム溶液に懸濁させることによって
抽出し、銅錯塩にして精製した。このようにして抽出、
精製したマンナンは抗カンジダ抗体産生性ハイブリドー
マを選別するためのELISA用抗原として使用する。

（２）細胞融合抗体産生細胞およびミエローマ細胞の調整、細胞融合
は前記施例１の（２）と同様の方法で行った。

（３）ハイブリドーマの樹立融合細胞培養上清中の産生抗体の有無はELISA法とス
ライド凝集反応法によって前記施例１の（３）と同様の
方法で行った。その結果、抗Candida parapsilosis抗体
産生性ハイブリドーマCP−13を樹立した。

（５）抗体の特異性およびクラス前記施例１の（５）に記載の方法でハイブリドーマCP
−13の産生分泌する抗体の特異性、免疫グロブリンのク
ラスおよび力価を調べた。その結果を表１及び表２に示
す。

これらのモノクローナル抗体のカンジダ菌に対する特
異性を整理して示すと次のとおりである。

モノクローナル抗体CA−4,CB−4:前記Ａ群の、、
、、、及びとは反応するが、前記、、及び
とは反応しない。

モノクローナル抗体CA−5:前記Ａ群の、、、
、、及びとは反応するが、、、及びとは反
応とは反応しない。

モノクローナル抗体CA−6:前記Ａ群の、、及び
とは反応するが、前記、、、、、及びとは
反応しない。

モノクローナル抗体CB−13:前記Ａ群の、及びと
は反応するが、前記、、、、、、及びと
は反応しない．モノクローナル抗体CG−9:前記Ａ群のとのみ反応
し、他とは反応しない。

モノクローナル抗体CGL−34:前記Ａ群のとのみ反応
し、他とは反応しないモノクローナル抗体。

モノクローナル抗体CK−8:前記Ａ群のとのみ反応
し、他とは反応しない。

モノクローナル抗体CKR−11:前記Ａ群ののみ反応
し、他とは反応しないモノクローナル抗体。

モノクローナル抗体CP−13:前記Ａ群のとのみ反応
し、他とは反応しないモノクローナル抗体。

次に、上記の方法により得られたカンジダ菌同定用モ
ノクローナル抗体を使用して、カンジダ菌（Candida sp
ecies）を同定する方法について述べる。

（１）同定可能なカンジダ菌は、次の９種類である。

Candida albicans（serotype A） Candida albicans（serotype B） Candida guilliermondi Candida glabrata Candida kefry Candida krusei Candida parapsilosis Candida tropicalis Candida stellatoidea （２）カンジダ菌の分離法例えば、ヒトから採取した材料（血液、唾液、膣の粘
液、痰等）中のカンジダ菌を同定するには、まず材料か
らカンジダ菌を分離する。一般的には、ストレプトマイ
シン含有（50μ/ml）サブロー寒天平板培地を用いて、
分離されたコロニーがその形態より酵母菌様であること
を確認した後、サブロー寒天斜面培地で純培養を行な
う。凝集反応には25℃で48時間もしくは37℃で18時間純
培養した菌を使用する。純培養培地は、例えばグルコー
ス2.0％、ペプトン1.0％、酵母エキス0.5％、及び寒天
1.5％を含むサブロー寒天培地を使用する。

（３）スライド凝集反応の実施法本願発明で得た各モノクローナル抗体を、目的に応じ
て希釈したものをスライド板に２滴（約60μ）滴下す
る。生理食塩水を陰性コントロールとして使用する。先
の方法で純培養した菌をエーゼで少量採り、スライド板
上で前記モノクローナル抗体液及び生理食塩水とよく混
合し、１分間揺動後、それぞれの液の凝集の有無を観察
し、判定する。

前記カンジダ菌のうち、、、、、、、及
びは、表１のモノクローナル抗体（、、、、
、、、、）を使用した凝集反応の有無からそ
のまま同定することができる。

また、前記〜のモノクローナル抗体を全て使用し
なくても、、、、及びのみを使用した凝集反応
の有無から、前記カンジダ菌のうち、、、、、
、、及びについては、同定することができる。

「発明の効果」以上のように、本願発明によれば、カンジダに対する
特異性が高いモノクローナル抗体を容易に得られること
ができるとともに、正確かつ簡便にカンジダ菌（Candid
a species）の同定をすることができるという効果を有
する。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:91） 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者本島美千代佐倉市井野1103―55 (56)参考文献特開昭59−187794（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−155135（ＪＰ，Ａ) Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，43［３］（1984）Ｐ．966−972 Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，43［３］（1984）Ｐ．1012−1018 Ａｂｓｔ．Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，84 （1984）ＡｂｓｔｒａｃｔＦ41 Ａｂｓｔ．Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，85 （1985）Ｐ．366

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記のＡ群の〜に記載するカンジダ菌
（Candida species）を含む被検試料と、下記のＢ群に
記載する、、、、、、、、及びのモ
ノクローナル抗体の１以上とを接触させて得られる陰性
（−）〜陽性（＋）の凝集反応結果から、前記、、
、、、、及びのカンジダ菌の１以上を分類、
識別することを特徴とするカンジダ菌の同定方法。＜Ａ群＞ Candida albicans（serotype A） Candida albicans（serotype B） Candida guilliermondi Candida glabrata Candida kefry Candida krusei Candida parapsilosis Candida tropicalis Candida stellatoidea ＜Ｂ群＞前記Ａ群の、、、、、及びとは反応する
が、前記、、及びとは反応しないモノクローナル
抗体。前記Ａ群の、、、、、及びとは反応する
が、、、及びとは反応しないモノクローナル抗
体。前記Ａ群の、、及びとは反応するが、前記、
、、、、及びとは反応しないモノクローナル
抗体。前記Ａ群の、及びとは反応するが、前記、、
、、、、及びとは反応しないモノクローナル
抗体。前記Ａ群のとのみ反応し、他とは反応しないモノク
ローナル抗体。前記Ａ群のとのみ反応し、他とは反応しないモノク
ローナル抗体。前記Ａ群のとのみ反応し、他とは反応しないモノク
ローナル抗体。前記Ａ群のとのみ反応し、他とは反応しないモノク
ローナル抗体。前記Ａ群のとのみ反応し、他とは反応しないモノク
ローナル抗体。