KR910004141B1 - 고상화 c 펩타이드 항체, 그 제조방법 및 동 물질을 이용하는 면역 측정법 - Google Patents

고상화 c 펩타이드 항체, 그 제조방법 및 동 물질을 이용하는 면역 측정법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

고상화 C 펩타이드 항체, 그 제조방법 및 동 물질을 이용하는 면역 측정법
도면은 본 발명 실시예에 의하여 얻어진 표준 곡선과 대조 실험에 의하여 얻어진 표준 곡선을 대비하여 나타낸것임.
본 발명은 포괄적으로는 전단용 면역학적 분석법, 보다 상세히는 혈액, 뇨, 또는 기타 체액내의 프로인슐린 C-펩타이드의 단일-항체 면역 분석시 이용되는 고상화 항체에 관한 것이다.
최근 면역학적 분석법 분야에 있어서, 고상화 항체기 가용성 항체들에 비해 취급이 용이한 점에 기인하여, 그의 이용이 점차 증가하는 추세이다.
종래 항체를 불용성 고체 지지체에 결합시키는 방법으로서, 고상화 목적과 조건들에 따라 물리적 흡착법 또는 화학적 반응 방법들이 이용되어 왔다. 상기 화학적 방법들중에서는, 카르보디이미드로 대표되는 축합제를 사용하는 방법이 가장 널리 이용되어 왔다.
고상화된 제 2 항체는 이중 항체법에서 광범위하게 이용되어 왔다. 그러나, 이때 상기 고상화 제 2 항체의 기능이 유리 항원으로부터의 항원-항체 결합체의 침전 또는 분리에 국한됨으로 인해 항체의 고상화에는 몇가지 문제점들이 따른다. 따라서, 항체는 반드시 고특이성 및 감수성을 필요로하지는 않는다.
이와는 달리, 단일 항체법에서 이용하는 고상화 항체는 고도의 감수성 및 특이성을 갖을 것이 요구된다.
그로 인해, 해결되어야할 많은 문제점들이 존재함에도 불구하고, 상기 고상화 항체의 제조방법의 개발이 시급히 요청되고 있다. 따라서, 일단 우수한 품질의 고상화 항체를 수득할 수 있게될 경우, 조작이 간편하고 훨씬 더 짧은 분석시간이 소요되는 단일 항체법이 이중 항체법 보다 널리 이용될 것이다. 그 이외에도, 고상화의 결과로서 항체들의 반응성, 특이성 및 감수성이 향상될 것으로 예상된다.
카르보디이미드와 같은 결합제를 이용하여 항체를 물에 용해되지 않는 지지체와 결합시키고자할 경우, 항체는 항체분자간 또는 분자내 올리고머(oligomer)화를 일으켜 균일하지 못한 생성물을 형성한다. 또한, 때때로 항체의 변성을 수반하며, 그 결과로서 항체의 기능을 변질시킬 우려도 있다. 따라서, 고상화를 이용하여 항체의 특이성들을 향상시키고자 기대하기는 매우 어렵게 생각되어 왔다.
현재 시행중인 이중 항체법 대신에 단일 항체법을 이용하여 C-펩타이드를 측정하려는 시도가 행해져왔으나 상술한 카르보디이미드법으로 제조한 고상화 항체를 이용할 경우, 만족스런 결과를 전혀 얻을 수 없었다.
종래의 이중 항체법은 통상적으로 첫 번째 반응을 진행시키기 위한 오랜 배양시간 및 제 2 항체와의 반응을 진행시키기 위한 또다른 반응시간을 요구한다. 게다가 조작이 용이하지 않으며, 한계치의 C-펩타이드를 측정할 수 있을 정도로 충분히 민감하지 못하다.
고상화 항체와 관련지어 지금까지는 면역학적 분석시 그의 손쉬운 조작 및 편리성에 대해서만 지나치게 강조한 반면, 항체 특성의 향상 가능성에 관하여는 언급된 바가 없다. 대부분의 특허(공개공보) 및 그에따라 발표된 공보에는 고상화 방법 또는 고상화용 물질들에 대해서만 기술하고 있다. 그들중 어느 것도 고상화를 항체 자체의 특성들을 향상시키기 위한 유효 수단으로 다루고 있지 않다.
따라서, 향상된 반응성 및 감수성이 부여된 고상화 단일 항체를 이용한 단일 항체법의 제공이 각광 받을 것으로 기대된다.
본 발명의 목적은 상술한 문제점들을 보강한 고상화 항체를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 향상된 특성들을 소유하는 동시에 면역학적 분석시 취급이 용이한 고상화 항체를 개발하고자 노력한 결과 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 헤테로 이작용기성(heterobifunctional) 교차결합제를 이용하여 물에 용해되지 않는 지지체상에 고상화시킨 항체를 제공하며, 상기 항체는 인체 프로인슐린 C-펩타이드에 대한 특이성 및 티올기를 갖는 면역 글로블린으로서 부분적으로 환원된 상태이다. 이때, 고체 지지체가 아미노기들을 갖고, 교차 결합체는 2개의 결합, 즉, 1개의 티올기와의 결합 및 아미노기와의 또 다른 결합을 형성할 수 있을 때 가장 바람직하다.
본 발명의 또 다른 목적은 인체 프로인슐린 C-펩타이드에 대해 특이성을 갖는 부분 환원형 면역글로불린을 헤테로 이작용기성 교차결합제를 이용하여 물에 용해되지 않는 고체 지지체와, 고체 지지체상에 존재하는 아미노기들을 면역글로불린에 존재하는 티올기들과 교차결합제의 아미노-관여 및 티올-관여 작용기들을 이용하여 단계적으로 반응시킴으로써, 결합시켜 면역글로불린과 고체 지지체를 결합시킴을 특징으로하는 고상화 항체의 제조방법을 제공하는 것이다.
고상화 방법의 개발을 연구하던중, 본 발명자들은 항-인체 프로인슐린 C-펩타이드 항체를 특정하게 알맞은 조건들하에 부분적으로 환원시켜 제한된 수의 티올기들을 방출시키고, 이어서 이들 티올기들을 아미노화 고체 지지체의 표면에 존재하는 아미노기들과 교차결합시킬 경우, 수득된 고상화 항체는 고상화 이전의 항체와 비교하여 현저히 증가된 반응성 및 감수성을 갖는다는 것을 알아냈다. 또한, 본 발명자들은 이하에 기술하는 바와 같이 고상화 반응 및 공정의 재생산성을 증가시킬 수 있는 최적 조건들을 알아내고자 면밀히 실험하였다. 물에 용해되지 않는 고체 지지체로서는, 자체내에 고유하게 아미노기를 갖는 임의의 담체를 사용할 수 있으며, 그의 예로는 아미노벤질 폴리아크릴아미도, 유리 입자들의 아미노알킬실란 부가물 등을 들 수 있다.
본 발명에서는, 고체 지지체로서 아미노기들을 갖는 미립자형 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 것이 적당하다. 아미노기의 지지체로의 도입은 폴리아크릴아미드 지지체의 부분 가수분해를 수행하고, 이어서 직쇄 알킬렌디아민을 지지체상의 유리 카르복실기에 결합시킴으로써 행해진다. 상기 직쇄 알킬렌디아민으로서는 헥사메틸렌디아민이 바람직하다.
미립자형 폴리아크릴아미드 겔의 입자크기는 고상화 항체 제조시 중요하게 작용한다. 지나치게 큰 입자들은 용기의 바닥에 침강하는 경향을 나타내고, 반면에 지나치게 작은 입자들은 분리하기가 어렵다. 따라서, 통상적으로 입자크기 0.11㎛~101㎛, 바람직하기로는 1~51㎛를 갖는 이뮤노비드 매트릭스(IM.MUNOBERD Matrix, 바이오-래드(Bio-Rad) 실험사의 상표명, 리치몬드, 미합중국)를 사용한다.
헤테로 이작용기성 교차결합제로는 2개의 기, 즉 아미노기에 대해 반응성을 갖는 1개의 기 및 티올기에 대해 반응성 갖는 또 다른 1개의 기를 갖는 것들을 사용하여야 하며, 이들 시약의 일부 예로는 4-플루오로-3-니트로페닐아지드, ε-클로로아세틸-리신 N-카르복시무수물(NCA), ε-클로로아세틸-리신 N-히드록시숙신이미드 에스테르, ε-브로모아세틸리신 N-히드록시숙신이미드 에스테르, m-말레이미도벤조산 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 4-요오도아세틸아미노벤조산 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실산 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 4-(P-말레이미도페닐)락트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실산 N-히드록시술포숙신이미드 에스테르, 4-(P-말레이미도페닐)락트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 등을 들 수 있다. 이들중, m-말레이미도벤조산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS)가 헤테로 이작용기성 교차결합제로 바람직하다.
본 발명에 따른 고상화 항체를 제조하기 위해서는, 먼저, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)를 이용하여 헥사메틸렌디아민을 부분 가수분해된 미립자형 폴리아크릴아미드 겔에 결합시켜 아미노기를 지지체상에 도입한다. 이어서, 이들 아미노기들을 헤테로 이작용기성 교차결합제와 결합시켜 티올기들과의 후속반응을 위해 고체 지지체들을 활성화시킨다.
한편으로, 고상화시키고자하는 항체, 즉 인체 프로인슐린 C-펩타이드에 대해 특이성을 갖는 부분 환원형 면역글로불린을 제조하기 위해, 먼저 항-인체 프로인슐린 C-펩타이드 항혈청을 리간드로서 인체 프로인슐린 C-펩타이드 또는 그의 단편을 사용하는 면역친화도 컬럼상에서 정제하고, 이어서 메르캅토에틸아민을 사용하여 부분 환원 반응을 수행함으로써 제한된 수의 티올기들을 유리시킨다. 토끼의 면역글로불린 G가 약한 환원 반응을 일으킬 수 있는 단일 이황화 결합을 갖는다는 점에서 바람직하다. 상기 이황화 결합은 2개의 H-쇄와 결합하고 있어도 무방하다.
고상화의 최종단계는 환원시킨 항체와 활성화시킨 고체 지지체를 반응시키는 것으로서, 그로부터 목적하는 고상화 항체가 수득된다.
고상화 항체를 이용하여 얻은 표준 곡선을 고상화시키지 않은 본래의 항체를 이용하는 종래의 이중 항체법으로부터 얻은 표준 곡선과 비교한 결과, 종래의 방법에 비해 분석 민감도가 현저히 증가됨이 입증되었다.
이하에서는, 실시예를 기술하여 본 발명을 보다 상세히 설명하는 동시에 종래의 방법과 비교하고자 한다.
[실시예 1]
항체의 정제
인체 프로인슐린 C-펩타이드에 대해 특이성을 갖는 토끼 항혈청 (0.5ml)을 면역흡착제[인체 프로인슐린 C-펩타이드 또는 그의 단편(예, C-펩타이드(7-24)과 결합시킨 세파로스 4B(상포)]를 채운 컬럼(용량:1.8ml)에 충전하고, 이어서 상기 컬럼을 15배 부피의 50mM 트리스-HC1 완충액(pH 7.5)으로 세정한다.
이어서, 특이적으로 결합된 면역글로불린을 6mM HCI로 용출시켜 정제 항체(IgG)가 수득된다.
[실시예 2]
항체의 항원
정제 항체 0.5mg을 함유하는 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 6.0) 540㎕를 40mM 메르캅토에틸아민 60㎕와 혼합하고, 상기 혼합물을 37°C에서 60분동안 방치하여 반응을 진행시킨다. 세파덱스 G-25매디움(상표)컬럼상에서 겔 여과하여 과량의 메르캅토에틸아민을 반응 혼합물로부터 제거함으로써 환원된 항체가 수득된다.
수록된 상기 환원된 항체는 IgG 1분자당 평균적으로 2개의 티올기를 갖는 것으로 나타났다.
[실시예 3]
물에 용해되지 않는 고체 지지체의 아미노화
1~7.51㎛의 입자크기 분포를 갖는 이뮤노비이드 매트릭스 200mg과 3mM 인산염 완충액(pH 6.3) 20ml내에 용해시킨 헥사메틸렌디아민(2.25몰)의 혼합물을 4℃에서 1시간동안 교반한다.
이어서 EDC[1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드]염산염 40mg을 첨가하고, 1N HCI을 가하여 혼합물의 pH 값을 5.0으로 약 30분동안 유지시킨 다음, 4℃에서 2시간동안 반응을 진행시킨다. 상술한 과정을 고체 지지체상의 카르복시기들이 완전히 소실될 때까지 반복한다.
[실시예 4]
말레이미도벤조일화(MB) 지지체의 제조
아미노화된 불용성 고체 지지체 20mg을 10μ몰의 MBS(m-말레이미드벤조산 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 고체 지지체의 아미노기들을 기준으로 하여 약 5-배몰 과량임)와 30°C의 0.1M 인산염 완충액(pH 7.0; 최종부피 1.6ml)내에서 1시간동안 반응시킨다.
0.1M 인산나트륨 완충액(pH 6.0 및 5mM EDTA를 함유하는 테트라히드로푸란(THF; 1:1)의 혼합물로 3회, 및 이어서 5mM EDTA를 함유하는 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 6)으로 3회 세정하여 미반응 MBS를 제거함으로써 MB 지지체의 현탁액이 최종부피 2.25ml로 수득된다.
[실시예 5]
항체의 고상화
상술한 바와 같이 수득된 MB 지지체의 현탁액 0.5ml를 0.D(280nm x 1ml에서의 흡수성) = 0.1에 상응하는 양의 상술한 환원된 항체에 가한다.
5mM EDTA를 함유하는 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 6.0)을 사용하여 최종부피를 1ml로 조정한 후, 생성된 혼합물을 4°C에서 20시간동안 반응을 진행시킨다. 물에 용해되지 않는 고체 지지체상의 반응하지 않고 잔류하는 MB 기들을 이들 미반응 기들의 3배량에 달하는 2-메르캅토에탄올로 30°C에서 20분동안 처리하여 불활성화시킨다.
고상화 항체를 50mM 인산염/NaCl 완충액(pH 7.5)으로 5회, 및 이어서 0.9% NaCl, 0.5% BSA, 0.01M EDTA 및 0.05% 소듐 아지드를 함유하는 0.01M 인산염 완충액(pH 7.5)(이하에서는, 간단히 "완충액"으로 기재함, 이는 시오노기 세이야꾸 가부시끼가이샤가 시판중인 "C-펩타이드 테스트 시오노기"키트의 성분과 동일함)으로 5회 세정한 후, 상기 완충액을 가하여 적정부피로 조정한 다음, 4°C에서 보관한다.
[실시예 6]
활성 및 감수성 측정
상술한 "C-펩타이드 테스트 시오노기"를 구성하는 시약들을 이용하여 하기 용액 및 현탁액을 제조한다.
a. 인체 C-펩타이드 표준용액(0.2~50ng/ml).
b. 요오도티로신화[125I] 인체 C-펩타이드 용액.
c. 상술한 단계(5)에서 수득한 고상화 항체 현탁액.
각각 0.1ml의 a,b 및 c를 함께 혼합하고, 강하게 교반하여 반응을 개시시킨다. 이어서 혼합물을 실온에서 3시간동안 방치한다. B/F 분리를 위해, 혼합물을 원심분리(2,000gx7분)한 후, 상층액을 흡인제거한다.
불용성 잔류물의 방사능을 종래의 방법을 이용하여 측정한다. C-펩타이드의 농도를 변화시키면서 실험을 실시하여 고상화 항체의 활성 및 감수성을 측정, 평가한다.
[비교 실험(종래의 분석방법)]
인체 프로인슐린 C-펩타이드에 대해 특이성을 갖는, 실시예의 단계(1)에서 출발물질로 사용한 토끼의 항혈청 0.1ml를 상기 a 및 b 각각 0.1ml 및 완충액 0.5ml를 함유하는 용액과 혼합한다. 상기 혼합물을 20℃에서 20시간동안 방치한다(첫번째 반응).
상기 혼합물에 항-토끼 면역글로불린 항체-결합 겔 현탁액 0.1ml를 가한다. 이어서 혼합물을 20℃에서 1시간동안 방치(두번째 반응)한 다음, 원심분리(1,500gx5분) 한다. 후속 과정들은 실시예의 단계(6)에 기술한 것과 유사하다.
상술한 2가지 공정들(본 발명에 따른 공정 및 종래방법에 따른 공정)로부터 수득된 표준 곡선들을 비교하여, 결과는 첨부하는 도면에 나타낸다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 단일 항체법을 이용한 프로인슐린 C-펩타이드의 측정을 가능하게 한다.
본 발명에 따르면, 종래의 이중-항체법과 비교하여 측정에 소요되는 시간이 7~8배 짧고, 또한 측정의 민감성이 2~4배 높다.
결과로서, 고상화 항체, 인체 프로인슐린 C-펩타이드 표준용액, 인체 프로인슐린 C-펩타이드의 방사성 표지 유도체 및 완충액을 구성 성분으로하는 체액내의 인체 프로인슐린 C-펩타이드 측정용 방사면역 분석시험 키트를 수득할 수 있다.

Claims (13)

  1. 헤테로 이작용기성 교차결합제에 의해 수-불용성 고체 지지체상에 고상화된 항체로서, 상기 항체가 인체 프로인슐린 C-펩타이드에 대해 특이적이며 동시에 티올기들을 갖는 부분 환원형 면역글로불린임을 특징으로 하는 고상화 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 수-불용성 고체 지지체가 아미노기들을 갖는 것임을 특징으로 하는 고상화 항체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 헤테로 이작용기성 교차결합제가 2개의 결합, 즉 면역글로불린의 티올기와의 1개의 결합 및 고체 지지체의 아미노기와의 또 다른 1개의 결합을 형성할 수 있는 것임을 특징으로 하는 고상화 항체.
  4. 제 1 항에 있어서, 고체 지지체가 아미노기들을 갖는 미립자형 폴리아크릴아미드 겔임을 특징으로 하는 고상화 항체.
  5. 제 4 항에 있어서, 미립자형 폴리아크릴아미드 겔이 가수분해 및 직쇄 알킬렌디아민과 결합된 것으로서 유리 아미노기들을 갖는 것임을 특징으로 하는 고상화 항체.
  6. 제 1 항에 있어서, 헤테로 이작용기성 교차결합제가 m-말레이미도벤조산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS)임을 특징으로 하는 고상화 항체.
  7. 인체 프로인슐린 C-펩타이드에 대해 특이적인 부분 환원형 면역글로불린을 헤테로 이작용기성 교차 결합제를 이용하여 수-불용성 고체 지지체와 결합시킴에 있어서, 고체 지지체상에 존재하는 아미노기들 및 면역글로불린상에 존재하는 티올기들을 교차결합제의 아미노-관여 및 티올-관여 작용기들과 각각 반응시켜, 면역글로불린과 고체 지지체간의 결합을 형성시킴을 특징으로 하는 고상화 항체의 제조방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 수-불용성 고체 지지체가 아미노기들을 갖는 미립자형 폴리아크릴아미드 겔임을 특징으로 하는 고상화 항체의 제조방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 수-불용성 고체 지지체가 직쇄 알킬렌디아민과 결합시킴으로써 도입된 유리 아미노기들을 갖는 부분 가수분해된 미립자형 폴리아크릴아미드 겔임을 특징으로 하는 고상화 항체의 제조방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 헤테로 이작용기성 교차결합제가 m-말레이미도벤조산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS)임을 특징으로 하는 고상화 항체의 제조방법.
  11. 제 7 항에 있어서, 상기 부분 환원형 면역글로불린이 인체 프로인슐린 C-펩타이드에 대해 특이적인 항혈청을, 리간드로서 인체 프로인슐린 C-펩타이드 또는 그의 단편을 사용하는 면역친화도 컬럼상에서 정제한 후 부분 환원시켜 수득된 면역글로불린임을 특징으로 하는 고상화 항체의 제조방법.
  12. 인체 프로인슐린 C-펩타이드에 대해 특이적인 부분 환원형 면역글로불린을 아미노기들을 갖는 수-불용성 고체 지지체와 헤테로 이작용기성 교차결합제를 이용하여 결합시킴으로써 수득되는 고상화 항체를 이용함을 특징으로 하는 단일 항체법을 이용한 인체 프로인슐린 C-펩타이드의 면역분석법.
  13. 인체 프로인슐린 C-펩타이드에 대해 특이적인 부분 환원형 면역글로불린을 아미노기를 갖는 수-불용성 고체 지지체와 헤테로 이작용기성 교차 결합제를 이용하여 결합시킴으로서 수득된 고상화 항체, 인체 프로인슐린 C-펩타이드 표준 용액, 인체 프로인슐린 C-펩타이드의 방사성 표지 유도체 및 완충액으로 구성됨을 특징으로 하는 체액내의 인체 프로인슐린 C-펩타이드 분석용 분석시험용 키트.
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