DE69128642T2 - Immunadsorbens zur diagnose von epilepsie und der risikogruppe - Google Patents

Immunadsorbens zur diagnose von epilepsie und der risikogruppe

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Medizin und insbesondere ein Immunosorbens für die Erkennung von Epilepsie und der Risikogruppe, die in der psychoneurologischen Praxis zur Diagnose von Epilepsie und zur Erkennung der Risikogruppe Verwendung findet.
  • Epilepsie ist eine schwere Erkrankung des Gehirns, die ca. 1 bis 4 % der Bevölkerung befällt. Gegenwärtig erfolgt ihre Diagnose auf der Basis der klinischen Untersuchung des Patienten, die elektrophysiologische und Röntgen-Techniken sowie andere Analysemethoden umfaßt. Derartige Methoden ermöglichen jedoch keine zweifelsfreie Bewertung der Störungen der Erregungswege und der damit zusammenhängenden Störungen des zentralen Nervensystems. Außerdem ist die Erkennung einer möglichen Risikogruppe praktisch ausgeschlossen.
  • Zur Verbesserung der Epilpsiediagnose bedient man sich gewöhnlich der biochemischen Analyse der biologischen Flüssigkeiten des Patienten auf Neurotransmitter (Glutamat, γ-Aminobuttersäure, Serotonin, Dopamin u.a.) oder ihre Metabolite. In einer Reihe von Fällen läßt eine solche Analyse jedoch nicht die erwarteten Ergebnisse erzielen und ermöglicht keine zweifelsfreie Beurteilung der Stoffwechselstörungen im Gehirn, keine Erkennung der Risikogruppe (Prädisposition) und auch keine Diagnose in den frühen Stadien der Erkrankung.
  • Besonders wichtig ist die Suche nach zuverlässigen biochemischen Parametern, welche den Zustand von Epileptikern objektiv zu bewerten vermögen, für psychoneurologische Kliniken und die Gesundheitsfürsorge, Kinderfürsorgestellen eingeschlossen. Besonders dringlich ist die Lösung dieses Problems für die Vorhersage und Prophylaxe der Epilepsie bei einem Berufseignungstest im Hinblick auf die Ermittlung von Risikogruppen unter Personen, die bei Arbeiten unter Stressbedingungen eingesetzt werden sollen.
  • In einer Reihe von Veröffentlichungen wird aufgezeigt, daß im Blut von Patienten, die an Epilepsie oder anderen Erkrankungen des ZNS leiden, Autoantikörper gegen Antigene des Gehirns gefunden wurden. Gesamtextrakte von Gehirngewebe oder entsprechende teilweise fraktionierte Extrakte sowie mehrere allgemein bekannte gehirnspezifische Proteine wie S-100 (Immunologia, V. 4, N 2, P. 75, 1974) wurden als Antigene getestet. Die erwähnten Antigene sind für die einzelnen Erkrankungen nicht spezifisch und können nicht für die Epilepsiediagnose verwendet werden.
  • Das vorgeschlagene Immunosorbens für Epilepsie und für die Ermittlung der Risikogruppe ist im wesentlichen neu und bisher in der Literatur nicht beschrieben worden.
  • Hauptaufgabe der Erfindung war die Entwicklung eines Immunosorbens für die Durchführung der Epilepsiediagnose und die Erkennung der Risikogruppe, das spezifisch, beständig und leicht anzuwenden ist.
  • Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines Trypsinverdauungsfragments des glutamatbindenden Membranproteins aus Rinderhirngewebe mit einem Molekulargewicht von 5 bis 14 Kilodalton gelöst, das kovalent oder ionisch an einen Trägerstoff gebunden ist, wodurch eine Aufrechterhaltung seiner immunogenen Eigenschaften gewährleistet wird. Vorzugsweise ist der Trägerstoff aminiertes und nachfolgend mit Glutaraldehyd deriviertes Polystyrol oder Nitrozellulose.
  • Das vorgeschlagene Immunosorbens ermöglicht eine rasche und wirksame Durchführung der Epilepsiediagnose bei einer erheblichen Zahl von Patienten (bis zu 200) gleichzeitig. Außerdem ermöglicht das Immunosorbens die prophylaktische Untersuchung einer großen Bevölkerungszahl zur Feststellung der Risikogruppe und für Berufseignungstests zur Bestimmung der Risikogruppen unter Personen, die bei Arbeiten unter Stressbedingungen eingesetzt werden sollen.
  • Die Verwendung des vorgeschlagenen Immunosorbens für die Epilepsiediagnose beruht auf der Feststellung der Tatsache, daß sich im Blut von Epileptikern der Titer der Autoantikörper gegen glutamatbindendes Membranprotein, das von Säugern produziert wird, erhöht.
  • Das immunogene Fragment des glutamatbindenden Membranproteins, das an einen starren Träger gebunden ist, zeigt spezifisch die Autoantikörper gegen glutamatbindendes Membranprotein in Blutproben von Epileptikern und von zur Risikogruppe gehörenden Individuen. Die Diagnose "Epilepsie" erfolgt auf der Basis des 2- bis 4fachen Überschusses der Autoantikörperkonzentration gegenüber dem Kontrollniveau. Die Reaktion des Immunosorbens auf das Patientenblut bei anderen Erkrankungen des Nervensystems unterscheidet sich dabei nicht erheblich vom Kontrollniveau.
  • Das vorgeschlagene Immunosorbens wurde an einem Epilepsiemodell, und zwar an Ratten der Krushinsky-Molodkina-Linie im Labor getestet, die eine Prädisposition gegenüber audiogenen Krämpfen zeigen. Als Kontrolle wurden normale Wistar-Ratten verwendet.
  • Die Ratten wurden mit 96 db beschallt, was ein absolutes Bild audiogener Krämpfe verursachte. Es wurde aus der Schwanzvene Blut entnommen, gefroren und bei -60ºC bis zur Verwendung gelagert.
  • Die Anwesenheit von Autoantikörpern gegen das glutamatbindende Membranprotein wurde mit Hilfe des vorgeschlagenen Immunosorbens (immunogenes Fragment des glutamatbindenden Membranproteins mit einem Molekulargewicht von 5 bis 14 Kilodalton, gebunden an Polystyrolträgermaterial) unter Verwendung der üblichen Methode der Festphasenimmunoenzymanalyse nachgewiesen. Die Versuche ergaben, daß das glutamatbindende Membranprotein im Blut von Krushinsky-Molodkina-Ratten gegenüber den Kontrollwerten erhöhte Bindungswerte aufwies. Die Wirkung zeigte sich dabei auch im Blut von nichtbeschallten Ratten. Nach der Beschallung stieg die Bindung des glutamatbindenden Membranproteins im Blutserum von Krushinsky-Molodkina-Ratten erheblich an und erreichte 12 bis 14 Tage nach den ersten Anfällen ihr Maximum.
  • Die erzielten Ergebnisse zeigen die Beziehung zwischen einer ererbten Prädisposition für audiogene Anfälle und dem Spiegel der Autoantikörper gegen das glutamatbindende Membranprotein im Blut. Die im Blut von Krushinsky-Mclodkina-Ratten festgestellten Autoantikörper begünstigen einen audiogenen Anfall, wodurch der Autoantikörperspiegel noch weiter ansteigt.
  • Das vorgeschlagene Immunosorbens wurde klinisch an Blutserumproben von über 1000 Patienten mit folgenden Diagnosen getestet: Epilepsie (650 Patienten), epileptiformes Syndrom unbekannter Ätiologie (187 Patienten), Parkinsonismus (148 Patienten) und andere neurologische Erkrankungen wie Schizophrenie (47 Patienten) und Alzheimerkrankheit (14 Patienten); sowie an 2150 gesunden freiwilligen Testpersonen.
  • Für die Untersuchungen wurden Proben des Blutserums der Patienten und der gesunden Testpersonen in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit dem vorgeschlagenen Immunosorbens eingebracht, welches das Fragment des glutamatbindenden Membranproteins aus dem Säugergehirn mit einem Molekulargewicht von 5 bis 14 Kilodalton, kovalent gebunden an mit Glutaraldehyd behandeltem Polystyrol, darstellt. Als positive Kontrolle diente polyklonales Antiserum vonm Kaninchen gegen glutamatbindendes Membranprotein (Titer 1:36000), das in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten gleichzeitig mit den zu untersuchenden Proben bei einer Verdünnung von 1:5000 eingebracht wurde. Das Basisniveau ("Nullniveau") wurde entsprechend den Anlaysenergebnissen des Spenderserums, das durch Immunoausfällung mit einer Rattenhirnmembransuspension erschöpft worden war, eingestellt. Nach dem Aufbringen der Probe wurden die Mikrotiterplatten 1 Stunde bei 37ºC oder über Nacht bei 4ºC inkubiert und der Grad der Bindung an das immunogene Fragment des glutamatbindenden Membranproteins wurde nach der üblichen Methode der Festphasenimmunoenzymanalyse unter Verwendung von an Meerrettichoxidase konjugiertem Protein A ermittelt. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe eines Mehrkanalspektrophotometers bei einer Wellenlänge von 492 nm abgelesen. Die Analysenergebnisse wurden in Form der Standardeinheiten (CU): CU = 100 x E&sub4;&sub9;&sub2; dargestellt, wobei E&sub4;&sub9;&sub2; die Extinktion bei 492 nm bedeutet.
  • Bei einer weiteren Versuchsserie wurde das Gesamt-(nicht fraktionierte)-Synapsenmembransolubilisat sowie Solubilisate von Leber-, Herz- und Nierenmembran sowie das aus dem Gehirn durch Reinigung erhaltene opiatbindende Membranprotein als Antigen verwendet.
  • Eine Zunahme an Autoantikörpern gegen das glutamatbindende Membranprotein wurde im Blut von Patienten mit Epilepsie und epiletptiformem Syndrom unbekannter Ätiologie festgestellt. In diesen Fällen wurden durch Analyse 89 bis 90 % der Patienten ermittelt. Bei Parkinsonismus und anderen Erkrankungen des ZNS als Epilepsie unterscheidet sich der Grad der Bindung an das Immunsorbens nicht von der Kontrolle. Bei Versuchen mit anderen Antigenen wurde eine weit geringere Spezifität festgestellt. Der Grad der Erkennung von Epileptikern mit Hilfe von Gesamtsolubilisat von Synapsemembranen ergab ca. 60 %, bezogen auf den bei den Versuchen mit glutamatbindendem Membranprotein erhaltenen Wert. Für die aus Leber, Herz und Nieren isolierten Membransolubilsate betrug dieser Wert 32, 36 bzw. 21 %. Das gereinigte opiatbindende Membranprotein reagierte praktisch überhaupt nicht mit den Komponenten von Epileptikerserum.
  • Die Korrelationen zwischen dem festgestellten Autoantikörperspiegel gegen glutamatbindendes Membranprotein und der Epilepsiedynamik sowie der Form und der Dauer der epileptischen Erkrankung wurden an 246 Epileptikern im Alter von 16 bis 50 Jahren untersucht. Sämtliche Patienten wurden aufgrund der analytischen Ergebnisse in drei Gruppen eingeteilt: Gruppe I - 120 bis 200 %, Gruppe II 220 bis 320 %, Gruppe III über 320 %, bezogen auf den durchschnittlichen Spenderspiegel. Tabelle 1 zeigt die Verteilung auf Patientengruppen je nach der Anfallhäuf igkeit. Ein minimaler Anstieg des Bindungsspiegels wurde bei Patienten mit sporadischen Anfällen (bis zu einmal pro Jahr) ermittelt und der maximale Anstieg bei täglichen oder serienmäßig vorkommenden Anfällen. Tabelle 1
  • Die Analyse der Autoantikörpertiterdynamik ergab einen allmählichen Anstieg während des Intervalls zwischen zwei aufeinanderfolgenden Anfällen. Eine starke Wirkung konnte am 8. bis 10. Tag vor den Anfällen festgestellt werden und ein maximaler Spiegel zeigte sich unmittelbar nach den Anfällen; er nahm danach wieder ab und erreichte 1 bis 2 Monate nach den Anfällen wieder den Ausgangsspiegel. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 und 3 zusammengefaßt. Die Ergebnisse in Tabelle 2 illustrieren die deutlichen Korrelationen zwischen dem Spiegel der Autoantikörper gegen glutamatbindendes Membranprotein und der Art, wie sich die Anfälle manifestieren. Die meisten Patienten, bei denen der Anfall sich in Form eines starken Anfalls manifestierte, gehörten zur Gruppe II und III, während im Blutserum von Patienten mit partiellen Anfällen der Autoantikörpertiter verhältnismäßig niedrig war (Gruppe I und II). Der Gruppe III gehörten sämtliche Patienten mit Anfällen vom Mischtyp und polymorphen Typ an sowie die meisten Patienten mit der Diagnose "epileptiformes Syndrom unbekannter Atiobgie". Einen hohen Autoantikörperspiegel stellt man im Serum von Patienten mit der genuinen Erkrankungsform fest (Tabelle 3). Tabelle 2 Tabelle 3
  • Die Wirksamkeit des vorgeschlagenen Immunosorbens ist somit offensichtlich. Das vorgeschlagene Immunosorbens ermöglicht eine rasche und wirksame Epilepsiediagnose bei einer erheblichen Zahl von Patienten (bis zu 200 Individuen) gleichzeitig und die Durchführung einer prophylaktischen Untersuchung der Bevölkerung zur Ermittlung der Risikogruppe sowie von Berufseignungstests zur Ermittlung von Risikogruppen unter Personen, die unter Stressbedingungen arbeiten sollen. Der klinische Einsatz des vorgeschlagenen Immunosorbens würde eine Verbesserung der Überwachung des Zustandes von Patienten sowie eine Optimierung der Behandlung ermöglichen.
  • Das vorgeschlagene Jmmunosorbens wird wie folgt hergestellt: Das Fragment des glutamatbindenden Membranproteins aus dem Säugerhirn mit einem Molekulargewicht von 5 bis 14 Kilodalton wird kovalent oder ionisch an das Trägermaterial gebunden, das die Erhaltung seiner immunogenen Eigenschaften gewährleistet. Als Trägermaterial können Polystyrol, Chromatographiepapier, Nitrocellulose und andere Stoffe verwendet werden.
  • Im Falle der Verwendung von Polystyrol wird die Polystyrolmikrotiterplatte nitriert, um auf der Plattenoberfläche freie Nitrogruppen zu erhalten. Diese werden zu Aminogruppen reduziert und mit Glutaraldehyd aktiviert, das als Vernetzer dient. Für die chemische Fixierung des immunogenen Fragments des glutamatbindenden Membranproteins werden die aktivierten Platten mit dem vorgängig isolierten Fragment 16 Stunden lang bei 4ºC inkubiert. Nach der Reduktion der nichtabgebundenen aktiven Gruppen mit 0,1 %-igem (Gewicht/Volumen) Natriumborhydrid und Waschen der Vertiefungen mit 0,9 %-igem (Gewicht/Volumen) NaCl wird die Platte mit einem Konservierungsmittel inkubiert, unter Vakuum getrocknet und dann hermetisch verschlossen. Die konservierten Mikroplatten mit dem vernetzten immunogenen Fragment des glutamatbindenden Membranproteins werden bei 4ºC gelagert.
  • Möglich ist auch die Herstellung des Immunosorbens durch Fixierung des immunogenen Fragments des glutamatbindenden Membranproteins auf Nitrocellulosestreifen durch Ionenreaktion. Zu diesem Zweck trägt man die Lösung des immunogenen Fragments des glutamatbindenden Membranproteins auf die Streifen auf und inkubiert sie 15 Minuten lang, wonach man die nichtabgebundenen aktiven Gruppen der Nitrocellulose mit 0,5 %-igem (Gewicht/Volumen) von Serumalbumin mit 0,05 %-igem (Volumen/Volumen) Detergens Tween 20 blockiert. Die getrockneten Streifen werden dann an einem trockenen Ort bis zu einem Jahr gelagert.
  • Die Fixierung des immunogenen Fragments des glutamatbindenden Membranproteins, die sowohl mit Hilfe der Mikrotiterpiatte als auch mit Hilfe von Nitrocellulosestreifen erreicht wird, verhindert den Verlust an aktiver Konformation und gewährleistet die Aufrechterhaltung seiner immunogenen Eigenschaften.
  • Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend Beispiele angeführt.
    • Beispiel 1
  • Das glutamatbindende Membranprotein wird aus der Hirnrinde von Rindern isoliert. Die einzelnen Cortexportionen (140 g) werden in 500 ml eiskalter Phenylmethylsulfonylfluorid (0,1 mM) enthaltender 0,32 M Saccharoselösung homogenisiert und bei 800 g 10 min zentrifugiert. Der Überstand wird dann durch vier Schichten Nylongaze filtriert und bei 20000 g 30 min zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wird dann erneut in 500 ml eisklatem destillierten Wasser suspendiert und bei 8000 g 30 min zentrifugiert. Das Verfahren wird zweimal wiederholt, wonach der Überstand zusammen mit dem lockeren Niederschlag bei 48000 g 30 min zentrifugiert wird. Die erhaltene Synapsenmembranfraktion wird in einer 1 %-igen (Gewicht/Volumen) Lösung von Natriumdesoxycholat in 30 mM Tris-HCl bei pH 7,4 suspendiert und 1 Stunde bei 4ºC gerührt. Das Solubilisat wird dann durch Zentrifugieren (100000 g während 1,5 Stunden) geklärt und mit Glutamat-Sepharose 48 (Pharmacia, Schweden) gemischt, die vorgängig in 30 mM Tris-HCl (pH 7,4) suspendiert worden war. Die Bindung des Proteins an das Sorbens dauert 16 Stunden bei 4ºC. Nach dem Waschen mit 6 Volumina Puffer mit 0,5 % Natriumdesoxycholat (Gewicht/Volumen) wird das fixierte glutamatbindende Membranprotein mit 1,5 M NaCl-Lösung im selben Puffer eluiert und durch Ultrafiltration eingeengt. Die Ausbeute an glutamatbindendem Membranprotein beläuft sich auf ca. 2 ug/g Gehirngewebe.
  • Zur Gewinnung des immunogenen Fragments des glutamatbindenden Membranproteins werden 200 pg des gereinigten Proteins in 20 ml Trypsinlösung ("Sigma", USA, Typ III, 1 mg/mg glutamatbindendes Membranprotein) 3 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wird dann durch eine entsprechende Menge Trypsininhibitor ("Sigma, USA) gestoppt, wonach das Reaktionsgemisch auf eine HPLC-Ultrasphere C-18-Säule (4,6 x 250 mm) aufgebracht wird. Die Eluierung erfolgt mit Hilfe eines linearen Acetonitrilgradienten (20 - 68 %) bei einer Geschwindigkeit von 1,0 ml/min. Die einzelnen Fraktionen werden entsprechend ihrer UV-Extinktion gesammelt und dann der Immunoenzymanalyse mit monoklonalen glutamatbindendes Membranprotein-Antikörpern unterzogen, um das Vorliegen einer glutamatbindendes Membranprotein-artigen Immunoreaktivität feststellen zu können. Die das immunogene Fragment der das glutamatbindende Memebranprotein enthaltenden Fraktion wird lyophilisiert und für die weitere Analyse verwendet.
  • Das auf diese Weise isolierte immunogene Fragment des glutamatbindenden Membranproteins ist biochemisch als das elektrophoretisch homogene Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 5 bis 14 Kilodalton und immunologisch entsprechend seiner Bindung an monoklonale und polyklonale Antikörper gegen das glutamatbindende Memebranprotein und durch negative Reaktion auf Kontrollantisera gegen andere Proteine (Interferon und Alkaliphosphatase) gekennzeichnet.
  • Für die Herstellung des vorgeschlagenen Immunosorbens werden die Vertiefungen der 96 Vertiefungen aufweisenden Polystyrolmikrotiterplatte mit einem Gemisch aus konz. Schwefel- und Salpetersäure (2:1) beschickt, wonach die Platte bei 4ºC inkubiert wird. Nach dem Waschen mit Wasser werden die Vertiefungen mit Zinnchlorid in konz. Salzsäure (11 g Salz werden in 10 ml der Säure gelöst) gefüllt. Die Nitrogruppenreduktion dauert 1 Stunde bei Raumtemperatur. Danach wird die Platte sorgfältig gewaschen und die Vertiefungen werden mit Glutaraldehyd (2,5 %, Gewicht/Volumen) in 0,1 M Phosphatpuffer mit 0,9 % (Gewicht/Volumen) NaCl beschickt und 3 Stunden bei 50ºC inkubiert. Nach dem Waschen wird in jede Vertiefung das immunogene Fragment des glutamatbindenden Membranfragments (0,1 ug in 0,1 ml) gegeben. Die Proteinbindung an die Platte dauert 16 Stunden bei 4ºC. Die nichtumgesetzten Aldehydgruppen reduziert man mit frisch bereiteter 0,1 % (Gewicht/Volumen) Natriumborhydridlösung während 30 min bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen der Vertiefungen mit demselben Puffer gibt man noch ein Konservierungsmittel zu, und zwar ein Gemisch aus 5 %-iger (Gewicht/Volumen) Saccharose und 1 %-igem (Gewicht/Volumen) Rinderserumalbumin. Nach der Inkubierung während 1,5 Stunden bei Raumtemperatur wird die Platte im Vakuum getrocknet.
  • Man erhält ein Immunosorbens, welches das Fragment des glutamatbindenden Membranproteins mit einem Molekulargewicht von 5 bis 14 Kilodalton darstellt, das an die Polystyrolmikrotiterplatte kovalent gebunden ist.
  • Die Beständigkeit des erhaltenen Immunosorbens wurde durch Immunoenzymanalyse unter Verwendung monoklonaler Antikörper und von polyklonalem Kaninchenantiserum gegen das glutamatbindende Membranprotein getestet. Der Reaktionsgrad blieb 12 Monate lang beständig.
  • Das hergestellte Immunosorbens wird 12 Monate bei 4ºC gelagert.
    • Beispiel 2
  • Das immunogene Fragment des glutamatbindenden Memebranproteins wird nach Trypsininkubation und Chromatographie, wie in Beispiel 1 beschrieben, isoliert. Das Nitrocelluloseblatt (80 x 120 mm²) wird in das Gerät für das Dot-blotting gegeben und die Vertiefungen werden mit der gereinigten Lösung des glutamatbindenden Membranproteins gefüllt. Nach der Inkubierung während 15 min wird die überschüssige Lösung durch Vakuumfiltration entfernt und die Nitrocelluloseblätter in ein wäßriges Medium mit 0,5 ºC (Gewicht/Volumen) Tween 20 gegeben. Nach der Inkubierung bei Raumtemperatur während 1 Stunde werden die Blätter im Vakuum getrocknet.
  • Das erhaltene Immunosorbens ist das immunogene Fragment des glutamatbindenden Memebranproteins mit einem Molekulargewicht von 5 bis 14 Kilodalton, das ionisch an die Nitrocellulose gebunden ist. Es wird an einem trockenen Ort bei Raumtemperatur während 12 Monaten gelagert.
  • Das vorgeschlagene Immunosorbens kann in der medizinischen Praxis für die Epilepsiediagnose und die Ermittlung der entsprechenden Risikogruppe verwendet werden.

Claims (2)

1. Immunosorbens für die Erkennung von Epilepsie und eine Prädisposition für Epilepsie, dadurch gekennzeichnet, daß es das Trypsinverdauungsfragment des glutamitbindenden Membranproteins aus Rinderhirngewebe mit einem Molekulargewicht von 5 bis 14 Kilodalton darstellt, das kovalent oder ionisch an einen Trägerstoff gebunden ist, wodurch die Aufrechterhaltung seiner immunogenen Eigenschaften gewährleistet wird.
2. Immunosorbens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerstoff aminiertes und nachfolgend mit Glutaraldehyd deriviertes Polystyrol oder Nitrozellulose ist.
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