DE3640412A1 - Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz - Google Patents
Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanzInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung
einer spezifisch bindefähigen Substanz nach dem Prinzip
des Immunoassay, wobei einer der Partner des miteinander
spezifisch bindefähigen Substanzpaares festphasengebunden
vorliegt, sowie ein dazu geeignetes Trägermaterial.
Zur Bestimmung einer spezifisch bindefähigen Substanz
bedient man sich häufig Verfahren nach dem Prinzip des
Immunoassay. Dabei wird einer der Partner eines spezifisch
miteinander bindefähigen Substanzpaares mit dem
für ihn spezifischen Rezeptor, der in an sich bekannter
Weise markiert ist, umgesetzt. Das Konjugat aus diesen
beiden Substanzen kann dann noch mit einem Rezeptor,
der für das Konjugat oder eines der beiden Teile des
Konjugats spezifisch ist, umgesetzt werden. Für diese
immunologischen Verfahren gibt es viele Variationen.
Vorteilhaft ist es dabei, wenn einer der Rezeptoren an
eine Festphase gebunden vorliegt. Dies erleichtert die
Trennung von gebunden und nicht gebunden vorliegenden
Reaktionspartnern. Zur Bestimmung der spezifisch
bindefähigen Substanz wird dann die Menge an an der
Festphase gebundenem markiertem Reaktionspartner oder
an in der Lösung vorliegenden markiertem Reaktionspartner
gemessen und zu der Menge an zu bestimmendem
Reaktionspartner in an sich bekannter Weise in Beziehung
gesetzt.
Als Festphase werden bei den immunologischen Verfahren
üblicherweise Kunststroffröhrchen oder Mikrotiterplatten,
an deren Innenoberlfäche der Reaktionspartner
fixiert ist, oder Kugeln, an deren Außenoberfläche der
Reakionspartner fixiert ist, verwendet. Diese Kunststoffröhrchen,
Mikrotiterplatten oder Kugeln bestehen
üblicherweise aus relativ inertem Kunststoffmaterial,
so daß die Bindung des Reaktionspartners Schwierigkeiten
bereitet. Darüber hinaus muß die Bindung des spezifischen
Reaktionspartners an die jeweilige Oberfläche so erfolgen,
daß er nicht die Fähigkeit zur spezifischen Bindung
der für ihn spezifisch bindefähigen Substanz verliert.
Aus diesem Grunde erfolgt die Bindung des Reaktionspartners
an die Festphase meistens adsorptiv. Es
wurde daher schon vorgeschlagen, die Fixierung des
Reaktionspartners an die Festphase über ein Kupplungsmittel,
daß die Bindung vermittelt, zu bewirken. Dabei
muß auch wieder darauf geachtet werden, daß die Bindung
des Reaktionspartners an das Bindungsmittel nicht die
spezifisch reagierende Region des Moleküls zerstört
bzw. daß der Reaktionspartner so gebunden wird, daß
seine reaktive Stelle von der Festphase weg dem Bindungspartner
zugewandt ist. Weiterhin wird in DE-OS 25 33 701
vorgeschlagen, um eine bessere Bindung zu erzielen, die
einzelnen immunologisch wirksamen Proteine zu vernetzen
und dann an Polystyrolkugeln zu adsorbieren. Als weitere
Möglichkeit ist in dieser Literaturstelle angegeben,
gleichzeitig mit dem Protein mit immunologischen Eigenschaften
ein inertes Protein zu vernetzen, so daß ein
vernetztes Produkt aus inertem und aktivem Protein
entsteht, das dann wiederum an Polystyrolkügelchen
adsorbiert wird. Diese Art der Vernetzung führt jedoch
in Abhängigkeit von den gewählten Reaktionsbedingungen
zu unterschiedlichen, nicht reproduzierbaren Vernetzungen
mit schwankenden Anteilen an nicht vernetztem sowie
unlöslich gewordenem Protein. Durch den unterschiedlichen
Vernetzungsgrad entstehen zudem Produkte mit
unterschiedlichen Bindungseigenschaften. All diese
bekannten Verfahren befriedigen somit noch nicht,
führen noch zu keiner optimalen Haftung der spezifisch
bindefähigen Substanz und sind für die reproduzierbare
Herstellung von beschichteten Festphasen wenig geeignet.
Ziel der Erfindung war es daher, ein Verfahren zu
schaffen, das die Haftung der spezifisch bindefähigen
Substanz an der Festphase reproduzierbar verbessert und
ein dazu geeignetes Trägermaterial zur Verfügung stellt.
Da bei vielen immunologischen Verfahren unter Detergenzienzusatz
gearbeitet wird, um Trübungen zu vermeiden, war
es außerdem Ziel der Erfindung, die Haftung so weit zu
verbessern, daß auch bei Anwesenheit von Detergenzien
sich die gebundene, spezifisch bindfähige Substanz
nicht ablöst.
Dieses Ziel wird erreicht durch ein Verfahren zur
Herstellung einer an ein unlösliches Trägermaterial
gebundenen, spezifisch bindefähigen Substanz, insbesondere
für die Verwendung in einem heterogenen Analysenverfahren,
nach dem Prinzip des Immunoassay, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß man ein lösliches Protein
mit einem Molekulargewicht über etwa 500 000, welches
hydrophober als die spezifisch bindefähige Substanz
ist, an die spezifisch bindefähige Substanz kuppelt und
dann das Konjugat aus Reaktionspartner und Protein an
eine hydrophobe Festphase adsorbiert.
Die auf diese Weise festphasenfixierte spezifisch
bindefähige Substanz zeigt eine verbesserte Haftung.
Die Bindung ist auch gegenüber Detergenzien stabil. Bei
der Erstellung von Eichkurven, die zur Auswertung bei
vielen immunologischen Verfahren notwendig sind, liefert
die erfindungsgemäß festphasengebundene spezifisch
bindefähige Substanz steilere Eichkurven, was zu einer
Erhöhung der Genauigkeit führt.
Als weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist es möglich, die gebundene Menge genauer zu kontrollieren.
Da die Haftung bedeutend besser ist als bei
bisher bekannten Verfahren, ist ferner die Menge an
spezifischem Protein, die eingesetzt werden muß, geringer.
Zur Auswahl von erfindungsgemäß geeigneten löslichen
Proteinen muß das Molekulargewicht sowie die Hydrophobizität
im Vergleich zu dem entsprechenden Wert für die
spezifisch bindefähige Substanz ermittelt werden. Das
Molekulargewicht wird nach den dem Fachmann bekannten
Methoden ermittelt.
Ein Vergleich der Hydrophobizität zwischen löslichem
Protein und spezifisch bindefähiger Substanz kann ebenfalls
nach den dem Fachmann geläufigen Methoden erfolgen.
Geeignete Methoden sind beispielsweise der Vergleich
- - der Fluoreszenzlösung nach Bindung an Farbstoffe (Biochem. Biophys. Acta 624, 576 (1980), 13-20,
- - des Elutionsverhaltens bei der hydrophoben Chromatographie (Biochem. Biophys. Acta, 576 (1979), 269-279),
- - der Oberflächenspannung (Biochem. Biophys. Acta 670 (1981), 64-73),
- - der Reaktionszeiten bei Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC) (Angew. Chemie 98 (1986) 530-548, J. chromat. 296 (1984) 107-114, Anal. Biochem. 137, (1984) 464-472).
Ein Vergleich der Hydrophobizität von erfindungsgemäß
geeigneten Substanzen findet sich in Sep. Sci. Technol.
14, 305-317 (1979). Danach steigt die Hydrophobizität
z. B. in folgender Reihe an:
α-₂-Macroglobulin (MG ∼ 820 000)
Rinderserumalbumin/Humanserumalbumin (MG ∼ 70 000)
Eialbumin,
α₂HS-Glycoprotein (MG ∼ 49 000),
β 1c /b 1A -Globulin,
Immunglobulin (MG∼ 150 000),
Transferrin (MG ∼ 90 000).
Rinderserumalbumin/Humanserumalbumin (MG ∼ 70 000)
Eialbumin,
α₂HS-Glycoprotein (MG ∼ 49 000),
β 1c /b 1A -Globulin,
Immunglobulin (MG∼ 150 000),
Transferrin (MG ∼ 90 000).
Wird also als spezifisch bindefähige Substanz ein
Immunglobulin verwendet, sind beispielsweise
Humanserumalbumin oder α₂HS-Glycoprotein als lösliche
Proteine im Sinne der Erfindung ohne weitere Vorbehandlung
nicht geeignet.
Beide Proteine müssen hier sowohl einer Hydrophobisierung
als auch einer Vernetzung (zur Erhöhung des Molekulargewichts)
unterworfen werden. Bei Transferrin
genügt in diesem Fall eine Vernetzung, bei α₂-Macroglobulin
ist eine Hydrophobisierung ausreichend.
Proteine, die zur Kupplung mit Immunglobulin als spezifisch
bindefähiger Substanz ohne Vorbehandlung geeignet
sind, sind beispielsweise β-Lipoproteine (MG
ca. 3,2 Mio.) oder α₂-Lipoprotein (MG ca. 5-20 Mio.).
Die Hydrophobisierung kann beispielsweise durch Anwendung
von Hitze, Behandlung mit Säuren, denaturienden
Agentien und/oder chaotropen Ionen und/oder durch chemische
Kupplung mit einer hydrophoben Verbindung erfolgen.
Die Erhöhung des Molekulargewichts (Vernetzung) kann
beispielsweise durch Anwendung von Hitze, Behandlung
mit Säuren, denaturierenden Agentien und/oder chaotropen
Ionen und/oder durch Vernetzung mit einem bi- oder
polyfunktionellen Proteinreagenz erfolgen.
Die Vernetzung wird so lange durchgeführt, bis ein
Proteinpolymeres mit einem Molekulargewicht von 500 000
oder mehr erhalten wird. Besonders bevorzugt ist es,
ein Proteinpolymeres mit einem Molekulargewicht von
500 000 bis 20 Mio. zu verwenden.
Die Hydrophobisierung kann dann, wenn auch eine Vernetzung
erfolgen soll, vor, während oder nach der Vernetzung,
jedoch nicht in Gegenwart der spezifischen bindefähigen
Substanz, vorgenommen werden.
Zur Hydrophobisierung durch Erhitzen werden üblicherweise
Temperaturen von 40 bis 95°C in einem Zeitraum
von 1 min bis 10 Stunden angewendet, wie beispielsweise
in Biochem. Biophys. Acta 624 (1980) 13-20 beschrieben.
Als Säuren werden beispielsweise Essigsäure, Propionsäure,
Milchsäure oder Salzsäure angewendet. Übliche
Konzentrationen sind bis 100 mmol/l Einwirkzeiten von
10 min bis 16 Stunden.
Geeignete chaotrope Ionen sind beispielsweise Thiocyanate,
Jodide, Fluoride, Bromide, Perchlorate und Sulfate.
Geeignete denaturierende Agentien sind beispielsweise
Guanidinhydrochlorid oder Harnstoff.
Üblicherweise werden hier Konzentrationen von 10 mmol/l
bis 6 mol/l angewendet.
Zur Derivatisierung mit hydrophoben Verbindungen werden
vorzugsweise lösliche Fettsäuren, Lipoide in nieder-
oder hochmolekularer Form sowie synthetische Polymere,
wie Polypropylenglykol oder lösliche Copolymere von
Polystyrol eingesetzt. Die Derivatisierung erfolgt nach
den dem Fachmann geläufigen Methoden.
Die Vernetzung über bi- oder polyfunktionelle Verbindungen
wird mit an sich bekannten Proteinbindungsreagenzien
durchgeführt. Dies sind Verbindungen, die mindestens
zwei funktionelle Gruppen tragen, die gleich
oder verschieden sein können und die über diese funktionellen
Gruppen mit funktionellen Gruppen von Proteinen
reagieren können. Bevorzugt wird als bi- oder
polyfunktionelle Verbindung Glutardialdehyd verwendet.
Bevorzugt werden ferner Verbindungen verwendet, die aus
einer Alkylkette bestehen, an deren Enden sich Succinimid-,
Maleinimid- und/oder Aldehydgruppen befinden.
Das Protein wird mit der bi- oder polyfunktionellen
Verbindung in an sich bekannter Weise vernetzt, indem
das lösliche Protein und die bi- oder polyfunktionelle
Verbindung umgesetzt werden.
Bevorzugt werden zur Hydrophobisierung und/oder Vernetzung
Proteine mit einem Molekulargewicht von 10 000
bis 700 000 verwendet. Besonders bevorzugt wird Rinderserumalbumin,
Lipase oder Immun-γ-Globulin.
An das Protein wird dann in an sich bekannter Weise die
zu bindende spezifisch bindefähige Substanz gekuppelt.
Geeigente Kupplungsmethoden sind z. B. in Ishikawa, J.
Immunoassay, 4, 209-327 (1983) beschrieben. Als spezifisch
bindefähige Substanzen sind beispielsweise Antikörper,
Antikörperfragmente, Antigene, Haptene, Lectine,
Kohlenhydrate, Avidin oder Biotin geeignet.
Das erhaltene Konjugat aus spezifisch bindefähiger Substanz
und Protein wird dann adsorptiv an der als Festphase
dienenden Kunststoffoberfläche adsorbiert. Die
adsorptive Bindung an die Festphase erfolgt über starke
und schwache Wechselwirkungen, hydrophobe Kräfte,
Dipol-Dipol- oder Ionen-Dipol-Interaktionen. Als hydrophobe
Festphase geeignet, sind Trägermaterialien mit
einer Oberflächenspannung, die kleiner als die Oberflächenspannung
des hydrophoben löslichen Proteins ist,
d. h. hydrophober sind als Protein. Bevorzugt werden
Trägermaterialien mit einer Oberflächenspannung <40 erg/cm²
eingesetzt. Besonders geeignet sind Polystyrol, Polymethacrylat,
Teflon, Polyamid oder Copolymere aus Styrol
und Acrylnitril.
Hydrophobisierte Proteine zeigen eine besonders gute
adsorptive Bindung. Möglicherweise werden durch die
Hydrophobisierung intramolekulare Brückenbindungen des
Proteins geöffnet, so daß hydrophobe Teile des Proteins
an die Oberfläche gelangen und dort besser an der
hydrophoben Kunststoffoberfläche haften, als die hydrophilen
Teile, die im nicht hydrophobisierten Protein in
erster Linie an der Oberfläche zu finden sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für die Bestimmung
einer spezifischen bindefähigen Substanz. Als
Substanzpaare, von denen ein Reaktionspartner an die
Festphase gebunden vorliegt, sind beispielsweise geeignet
Antigen-Antikörper; Lectin-Kohlehydrat; Hapten-Anitkörper,
Avidin(Streptavidin)-Biotin und andere
spezifisch miteinander zur Bindung befähigte Substanzen.
Bevor das Konjugat aus Protein und spezifisch bindefähiger
Substanz an die hydrophobe Festphase adsorbiert
wird, ist es auch möglich, die Festphase physikalisch
oder chemisch vorzubehandeln. So kann beispielsweise
eine Kunststoffoberfläche verquollen werden oder in
anderer an sich bekannter Weise aktiviert werden.
Das erfindungsgemäße Trägermaterial zur Verwendung bei
Festphasen-Immunoassays ist dadurch gekennzeichnet, daß
es aus einer hydrophoben Festphase besteht, an die ein
Protein mit einem Molekulargewicht von über etwa
500 000 adsorbiert ist, an das eine spezifisch bindefähige
Substanz gebunden ist.
Dieses Trägermaterial eignet sich ausgezeichnet zur
Verwendung für Festphasen-Immunoassays, da die spezifisch
bindefähige Substanz sehr gut haftet und auch bei
Zusatz von Detergenzien nicht desorbiert.
Das Trägermaterial liegt beispielsweise in Form von
Röhrchen, Mikrotiterplatten oder Kugeln vor, die beschichtet
sind mit einem vernetzten Protein, an das
eine spezifisch bindefähige Substanz gebunden ist.
An die Festphase ist ein Konjugat, bestehend aus einem
vernetzten Protein und einer spezifisch bindefähigen
Substanz adsorbiert. Das Protein ist bevorzugt Rinderserumalbumin,
Lipase oder ein Immun-γ-Globulin, das in
der angegebenen Weise vernetzt wurde.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren und Trägermaterial
zur Verfügung gestellt, um eine spezifisch bindefähige
Substanz mit guter Haftung und dauerhaft an eine
hydrophobe Festphase zu fixieren. Die Haftung konnte so
weit verbessert werden, daß auch ein Zusatz von Detergenzien
nicht zu einer Ablösung der Substanz führt. Das
erfindungsgemäße Verfahren ist einfach durchzuführen.
Die Erfindung wird durch Beispiele in Verbindung mit
der Zeichnung erläutert. In dieser stellen dar:
Fig. 1 eine Eichkurve für eine TSH-Bestimmung unter
Verwendung von Fab<TSH< unvernetzt (Kurve 1),
Fab<TSH< vernetzt (Kurve 2),
Konjugat Fab<TSH</β-Gal (Kurve 3),
Konjugat Fab<TSH</Thermo-RSA (Kurve 4)
in Luran®-Röhrchen;
Fig. 2 eine Eichkurve für eine TSH-Bestimmung unter
Verwendung von immobilisiertem Streptavidin
und biotinyliertem Ak<TSH<
Streptavidin unvernetzt (Kurve 1),
Streptavidin vernetzt (Kurve 2),
Streptavidin/β-Gal-Konjugat (Kurve 3),
Streptavidin/RSA-Konjugat (Kurve 4),
Streptavidin/Thermo-RSA-Konjugat (Kurve 5),
Streptavidin/Thermo-RSA-Konjugat (Kurve 6).
Kurve 1 bis 5 jeweils Luran®-Röhrchen als
Festphase, Kurve 6 Polystyrol-Röhrchen als
Festphase.
Monoklonale Antikörper (MAK<TSH<) werden nach der
von Galfre und Millstein beschriebenen Methode
(Meth. in Enzymology 73 (1981)) gewonnen. Zur
weiteren Reinigung wird die Ascitesflüssigkeit
einer Ammoniumsulfatfällung und einer Passage über
DEAE-Cellulose unterworfen.
Anschließend wird nach Biochem. Y. 73 (1959)
119-126 eine Papainspaltung durchgeführt. Die
hierbei entstandenen Fab-Fragmente werden von den
nichtverdauten IgG-Molekülen und den Fc-Fragmenten
mittels Gelfiltration über Sephadex G100 und
Ionenaustauscherchromatographie über DEAE-Cellulose
nach Meth. in Enzymology 73 (1981) 418-459
abgetrennt.
50 mg Fab-Fragmente werden in 2 ml 0,05 mol/l
Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) gelöst und 0,4 ml
Disuccinimidylsuberat (Hersteller Pierce), gelöst
in Dioxan (7,4 mg/ml), unter Rühren zugegeben.
Nach 2 Stunden Inkubation bei 25°C wird durch
Zugabe von 0,2 ml 0,1 mol/l Lysinhydrochlorid die
Raktion abgebrochen. Der Reaktionsansatz wird mit
0,2 ml Kaliumphosphatpuffer (s. o.) verdünnt und
zentrifugiert. Der Überstand wird über eine
Ultrogel AcA 202-Säule (LKB, Gräfelfing/BRD)
entsalzt, wobei 11,3 ml mit 45 mg Protein erhalten
werden. Ein Teil dieses Präparates wird an einer
Superose®-6-Säule (Deutsche Pharmacia GmbH) bei
0,5 ml/min Durchflußrate in 0,05 mol/l Kaliumphosphatpuffer
pH 7,0 fraktioniert und die Fraktion
mit Molekulargewicht ca. 500 000-5 Mio. weiterwendet.
Fab-Fragmente und γ-Globulin aus Rind (Serva,
Heidelberg/BRD) werden im Massenverhältnis 1 : 1
vermischt. Die Vernetzung wird, wie unter b) beschrieben,
durchgeführt.
1,25 g γ-Globulin werden in 10 ml 0,05 mol/l
Kaliumphosphatpuffer, pH 7,8, gelöst und in einer
Sorvall-Kühlzentrifuge 10 min bei 5 000 UpM blankzentrifugiert.
Zu dieser Lösung werden 1,75 ml
Disuccinimidylsuberat zugesetzt und mit 2,5 ml
Wasser verdünnt. Nach 4 Stunden Rühren bei 25°C
werden 10 ml 0,1 mol/l Lysin zugesetzt und der
pH-Wert auf 6,8 eingestellt und zentrifugiert. Der
Überstand wird an einer präparativen Gelfiltrationssäule
(TSK 3000, LKB Gräfelfing/BRD) abgetrennt,
über Ultrafiltration eingeengt und bei 4°C
aufbewahrt.
50 mg dieses vernetzten q-Globulins werden in 5 ml
0,05 mol/l Kaliumphosphatpuffer gelöst und der
pH-Wert durch Zugabe von festem Natriumcarbonat
auf 9,5 eingestellt. Dann werden 50 mg N-Acetylhomocysteinthiolacton
(Serva, Heidelberg/BRD) zugegeben
und 5 Stunden bei 25°C unter Stickstoffbegasung
gerührt. Der Ansatz wird anschließend entsalzt
über eine Ultrogel®AcA 202-Säule in einem
Puffer aus 0,1 mol/l Kaliumphosphat (pH 7,0)
0,001 mol/l Magnesiumchlorid und 0,05 mol/l
Natriumchlorid.
Nach a) hergestellte Fab-Fragmente (10 mg in 1 ml
0,01 mol/l Kaliumphosphatpuffer pH 7,0) werden mit
0,002 ml Maleinimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimidester
(Boehringer Mannheim GmbH) in DMSO (33 mg/ml)
2 Stunden bei 25°C aktiviert, anschließend wird
zentrifugiert und über eine AcA 202-Säule entsalzt.
Diese Fragmente werden anschließend mit dem γ-Globulin
vereinigt (Massenverhältnis der Proteine
1 : 1) und 1 Stunde bei 25°C und pH 7,0 inkubiert.
Anschließend wird gegen entsalztes Wasser über
Nacht bei 4°C und einer Proteinkonzentration von
2,5 mg/ml dialysiert.
Dieses Konjugat kann direkt zur Adsorption an eine
Festphase verwendet werden.
1 g RSA-I werden in 100 ml 50 mmol/l Kaliumphosphat
(pH 7,0) gelöst, auf 70°C erhitzt und 4 Stunden
unter leichtem Rühren bei dieser Temperatur gehalten.
Die Lösung wird abgekühlt, filtriert und in einer
Ultrafiltrationszelle (Ausschlußgrenze: 30 000
Dalton) auf eine Konzentration von 50 mg/ml eingestellt.
Anschließend wird gegen das 30fache Volumen
an bidest. H₂O dialysiert und anschließend
lyophilisiert. Das Produkt hat ein Molekulargewicht
von ca. 700 000.
Vor Kupplung an die Fab-Fragmente wird Thermo-RSA
aktiviert. Hierzu werden 68 mg Thermo-RSA in 2 ml
0,1 mol/l Kaliumphosphat (pH 7,8) gelöst und langsam
mit einer Lösung von 3,8 mg S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid
(SAMBA) versetzt. Nach
3 Stunden Reaktionszeit wird gegen 2 l 500 mmol/l
Kaliumphosphat (pH 6,5) bei 4°C dialysiert. Dieses
Thermo-RSA wird mit den nach d) aktivierten Fab-Fragmenten
im Massenverhältnis 1 : 1 1 Stunde bei
25°C und pH 7,0 inkubiert, anschließend gegen entsalztes
Wasser über Nacht bei 4°C und einer
Proteinkonzentration von 2,5 mg/ml dialysiert.
Dieses Produkt wird direkt zur Beschichtung eingesetzt.
Fab-Fragmente werden, wie in d) beschrieben, aktiviert
und an die SH-Gruppen von β-Galactosidase
nach J. Immunoassay 4 (1983) 209-327 gekuppelt.
Die eingesetzte β-Galactosidase hat hierbei ein
Molekulargewicht von 500 000 bis 2 Mio.
Zu einem weiteren Versuch wurde vernetzte β-Galactosidase
(MG∼ 5 Mio.) eingesetzt.
50 mg eines Lyophilisats des Fab-Fragments bzw.
des Konjugats werden in 10 ml bidest. Wasser
gelöst. 1 ml dieser Lösung wird in 1000 ml eines
Beladungspuffers aus 5,25 g/l Natriumdihydrogenphosphat
und 1 g/l Natriumazid verdünnt und 30 min
bei Raumtemperatur gerührt.
In jedes Röhrchen Polystyrol bzw. Luran® (Hersteller
BASF) werden 1,5 ml der Lösung gefüllt und
über Nacht (ca. 22 Stunden) beladen. Danach werden
die Röhrchen vollständig entleert und der nachstehend
beschriebene Funktionstest durchgeführt.
Die nach g beschichteten Polystyrol- bzw. Luran®-Röhrchen
werden in einem TSH-Bestimmungsreagenz
analog TSH-Enzymun®-Test (Boehringer Mannheim
GmbH, Best.-Nr. 736 082) eingesetzt und eine Eichkurve
entsprechend der Testvorschrift vermessen.
Hierbei ergeben sich die in Tabelle 1 bzw. Fig. 1
dargestellten Meßwerte.
Es zeigt sich (Fig. 1), daß mit Fab-Fragmenten,
welche ohne Proteinzusatz immobilisiert wurden,
nur eine sehr flache Eichkurve erhalten werden
kann (Kurven 1 und 2). Durch Kupplung an Proteine
mit einem Molekulargewicht unter 500 000 und geringer
Hydrophobizität ist die Eichkurve steiler
(Kurve 3). Allerdings können immer noch keine
befriedigenden Ergebnisse erreicht werden. Mit den
erfindungsgemäß hergestellten Konjugaten kann
dagegen eine ausreichend steile Eichkurve erreicht
werden (Kurve 4).
Streptavidin (Hersteller: Boehringer Mannheim
GmbH) wird analog Beispiel 1b) vernetzt.
Die Bindung an nichtvernetztes RSA bzw. β-Galactosidase
erfolgt analog Beispiel 1f.
60 mg Streptavidin werden in 6 ml 50 mmol/l
Kaliumphosphat/100 mmol/1 Natriumchlorid (pH 7,0)
gelöst und bei 4°C kaltgestellt. 6,16 mg Maleinimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimidester
werden in
620 µl Dioxan gelöst und in die Streptavidinlösung
eingerührt. Nach einer Reaktionszeit von 2 Stunden
bei 4°C wird gegen 2mal 11 50 mmol/l Kaliumphosphat/100 mmol/1
Natriumchlorid (pH 5) bei 4°C
dialysiert.
66 mg Streptavidin in 10 ml 50 mmol/l Kaliumphosphat
pH 5,0 und 100 mmol/l Natriumchlorid gelöst
und 72 mg aktiviertes Thermo-RSA-SAMBA (Herstellung
nach Beispiel 1e)) in 5 ml 50 mmol/l Kaliumphosphat/100 mmol/l
Natriumchlorid pH 6,5 werden
zugegeben. Nach Vermischen werden 50 µl 1 mol/l
Hydroxylamin pH 7,0 zugegeben, um die Reaktion zu
stoppen. Nach 3 Stunden wird das Reaktionsprodukt
über Gelchromatographie (Superose®6, 50 mmol/l
Kaliumphosphat/100 mmol/l Natriumchlorid pH 7,5)
aufgereinigt. Es wird ein Konjugat mit einem
Molekulargewicht zwischen 1 und 5 Mio. erhalten.
Die Beladung erfolgt, wie in Beispiel 1 g) beschrieben.
Die nach d) beladenen Röhrchen werden in einem
TSH-Enzymun®-Test-Reagenz (4fache Konjugataktivität)
eingesetzt. In Abweichung von der dort beschriebenen
Prozedur wird jedoch anstelle des
immobilisierten Antikörpers ein biotinylierter
MAK<TSH< verwendet. Die Herstellung dieses biotinylierten MAK's
erfolgt nach JACS 100 (1978)
3585-3590. Der Antikörper wird im Test in einer
Konzentration von 4 ng pro Teströhrchen zusammen
mit den anderen Reagenzien eingesetzt.
Die Ergebnisse zeigt Fig. 2. Daraus ist zu ersehen,
daß mit zunehmendem Molekulargewicht und steigender
Hydrophobizität die Steigung der Eichkurve und
damit die erzielbare Genauigkeit zunimmt.
Die Hydrophobizität von verschiedenen Verbindungen
wurden mit einem Flüssigkeitschromatograph (Hewlett
Packard 1090 LUSI) untersucht. Vorsäule war eine BioRad-Biogel®TSK-Phenyl-5PW
(L 5 mm × ID 4,6 mm), Säule:
BioRad-Biogel®TSK-Phenyl-5PW (L 75 mm × ID 7,5 mm,
10 µm, 1000 Å). Als Detektor wurde ein Hitachi
F 1000-Fluorimeter verwendet.
Eluenten/Gradient (Tabelle 2):
- a) 1,5 mol/l (NH₄)₂SO₄-Lösung in 1/100 mol/l KH₂PO₄-Puffer, pH 6,8.
- b) 1/100 mol/l KH₂PO₄-Puffer, pH 6,8.
Arbeitstemperatur:
Kühlraum, +7°C
Kühlraum, +7°C
Probenvorbereitung:
Die Proben wurden unverdünnt eingesetzt. Das Probevolumen betrug 10 µl.
Die Proben wurden unverdünnt eingesetzt. Das Probevolumen betrug 10 µl.
Die zu untersuchenden Verbindungen wurden in einer Konzentration
von 0,2 bis 1,4 mg/ml in 10 mmol/l Kaliumphosphatpuffer
pH 6,8 gelöst.
In Tabelle 3 sind die Retentionszeiten für verschiedene
Proteine bzw. spezifisch bindefähige Substanzen zusammengestellt.
Je länger die Retentionszeit, desto größer
die Hydrophobizität.
ProteinRetentionszeit t p
(min)
ProteinRetentionszeit t p
(min)
Fab TSH41,5
RSA23,2
q-Globulin32,0
β-Galactosidase39,6
β-Galactosidase vernetzt40,2
Streptavidin38,3
Thermo-RSA (Bsp. 1e)nicht eluierbar
γ-Globulin, vernetzt (Bsp. 1a)nicht eluierbar
Besonders geeignet sind die unter diesen Bedingungen
nicht eluierbaren Proteine, die bevorzugt verwendet
werden. Besonders bevorzugt wird Thermo-RSA.
Claims (13)
1. Verfahren zur Herstellung einer an ein unlösliches
Trägermaterial gebundenen, spezifisch bindefähigen
Substanz, insbesondere für die Verwendung in einem
heterogenen Analysenverfahren, nach dem Prinzip
des Immunoassay, dadurch
gekennzeichnet, daß man ein
lösliches Protein mit einem Molekulargewicht über
etwa 500 000, welches hydrophober als die spezifisch
bindefähige Substanz ist, an die spezifisch
bindefähige Substanz kuppelt und dann das Konjugat
aus Reaktionspartner und Protein an eine hydrophobe
Festphase adsorbiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man als
lösliches Protein ein Protein mit einem Molekulargewicht
von 500 000 bis 20 Mio. verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch
gekennzeichnet, daß man das
lösliche Protein aus einem Protein mit einem Molekulargewicht
von 10 000 bis 700 000 durch Vernetzung,
bis ein Molekulargewicht über 500 000 bis
20 Mio. erreicht ist, herstellt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Protein vor Kupplung mit einem bi- oder
polyfunktionellen Proteinreagenz vernetzt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß man ein hydrophobisiertes Protein verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch
gekennzeichnet, daß das Protein
vor Kupplung durch Anwendung von Hitze, Behandlung
mit Säuren, denaturierenden Agentien oder chaotropen
Ionen und/oder durch chemische Kupplung mit einer
hydrophoben Verbindung hydrophobisiert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, daß man als bifunktionelle
Verbindung Disuccinimidylsuberat verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, daß man als bifunktionelle
Verbindung Glutaraldehyd verwendet.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8,
dadurch gekennzeichnet,
daß man als Protein Rinderserumalbumin, Lipase
und/oder Immun-γ-Globuline verwendet.
10. Trägermaterial zur Verwendung bei
Festphasen-Immunoassays, dadurch
gekennzeichnet, daß es aus
einer hydrophoben Festphase besteht, an die ein
hydrophobes Protein mit einem Molekulargewicht von
über etwa 500 000 adsorbiert ist, an das eine
spezifisch bindefähige Substanz gebunden ist.
11. Trägermaterial nach Anspruch 10,
dadurch gekennzeichnet,
daß die hydrophobe Festphase aus Polystyrol,
Polymethacrylat, Polyamid, Teflon oder aus einem
Copolymeren von Styrol und Acrylnitril besteht.
12. Trägermaterial nach Anspruch 10 oder 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Protein hydrophobisiertes Rinderserumalbumin
(Thermo-RSA), hydrophobisierte Lipase oder
hydrophobisiertes Immun-γ-Globulin ist.
13. Trägermaterial nach einem der Ansprüche 10 bis 12,
dadurch gekennzeichnet,
daß die spezifisch bindfähige Substanz ein Antigen
oder ein Antikörper ist.
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