KR890002632B1 - Atl 바이러스 항체 측정용 시약의 제조방법 - Google Patents

Atl 바이러스 항체 측정용 시약의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

ATL 바이러스 항체 측정용 시약의 제조방법
본 발명은 ATL 바이러스 항체의 측정방법 및 측정시약에 관한 것이다. "ATL바이러스"란 용어는 성인 T-세포 백혈병 바이러스란 뜻을로서 "ATLV"로서도 생략 표기한다.
본 발명에서 측정될 ATL 바이러스와 ATL바이러스 항체는 다음 문헌에 상세하게 기술되어 있으며 이들 내용이 본 발명에서 참조된다.
1) Miyoshi, I., et al., Gann, 71, 155(1980).
2) Miyoshi, I., et., al., Jap. J. Clin. Oncol., 9(Suppl), 485(1979).
3) Hinuma, Y., et., al., Proc. Nat. Acad. Sci., 78, 6476(1981).
4) Miyoshi, I., et al., Gann, 73, 399(1982).
5) Miyoshi, I., et al., Lancet, 683(1982).
6) Shimoyama, M., et al., Jap. J. Clin. Oncol., 12, 109(1982).
7) Ohkouchi et al., Immunohaematology, 3(5), 267(1983).
ATL 바이러스 항체를 측정할 필요성 및 이 측정에 필요한 ATL 관련항원의 제조방법, 또한 이 항원 이용하는 ATL바이러스 항체의 측정방법과 측정시약에 대하여는 일본 특허공개 공보 No.62527/1984에 상세히 기술되어 있고, 이들 기술내용도 본 발명에서 참조된다.
상기 문헌의 기술내용에 의하면, 수혈공혈자의 상당수가 ATL 바이러스 보유자이고, 수혈이 ATL바이러스 전파에 중요한 역할을 할 가능성이 있다.
따라서 수혈공혈자에 대하여 혈청중의 ATL 바이러스 항체를 측정하고, 이에 의하여 ATL 바이러스 보유자를 선별하여 수혈에 의한 감염을 방지하고, 또한 고감도의 측정방법과 측정시약을 제공할 필요가 있다. 이와같은 조건하에, 일본특허 공개공보 No.58-187861에 기재된 발명은 ATL 관련항원 생성세포를 이용하여 방사면역측정법 또는 효소면역측정법에 의한 ATL 바이러스 항체 측정법을 기술하고 있다
또한 상기한 일본특허 공개공보 No.62527/1984는 ATL 관련항원 생성세포를 계면활성제로 처리함으로써 ATL 관련항원을 제조하고, 이 항원을 사용하는 ATL 바이러스 항체의 측정방법 및 측정시약을 개시한 것이다. ATL 관련항원 생성세포 및 이를 부분 정제하여 얻은 ATL 관련항원에는 ATL 바이러스 항원이외에 여러가지 비특이적인 항원성분이 함유되어 있다.
따라서 이를 이용하여 측정을 행하는 경우 이들은 측정대상인 ATL 바이러스 항체를 검지할 뿐만 아니라 항핵항체(抗核抗體)와 항 T세포막 항체와 같은 기타 비-특이적인 항체성분도 검지한다. 따라서 측정결과는 반드시 ATL 바이러스 항체의 존재를 정확히 나타낸다고 할 수는 없다.
예를들면 전신성 홍반성낭창환자의 혈청을 시료로하여 측정한 경우에 이 시료는 ATL 바이러스 항체에 대하여 본래부터 음성임에도 불구하고, 가끔양성으로 측정결과가 나타난다. 이것은 전신성 홍반성낭창에 수반하여 생성하는 항체성분과 ATL 관련항원중의 비-특이적 성분이 반응한 결과라고 생각된다.
이와같은 문제점을 극복하기 위한 것으로서 일본특허출원 No.144874/1983의 발명이 제시되어 있는바, 이 발명은 적당한 ATL 바이러스 음성세포주, 예를들면 급성 림파 아구성 (Lymphoblastic)백혈병환자로부터의 세포주를 처리하여 얻어지는 항원을 별도로 마련하고, 이 항원을 사용하여 측정한 측정결과를 대조하여 대비판정을 행하는 것을 요지로 하는것으로써. 비-특이 항체에 기인하는 오차를 방지할 수 있다는 것이다.
그러나 전술한 발명은 아직도 의문의 여지가 있다. 즉 ATL 연관항원에 의하여 검지되는 비-특이 항체와 ATL 바이러스 음성세포주 유래의 항원에 의하여 검지된 비-특이 항체가 면역학적으로 동일하다는 보증은 없다. 오히려 이들 두항체는 서로 상이하다고 생각하는 것이 옳다 따라서 후자의 존재, 부존재가 그대로 전자의 존재, 부존재를 반드시 표현하는 것은 아니며, 결국 이 발명에 있어서 ATL 바이러스 항체의 존재판정은 불명료하다
상기한 바와같이 일본특허출원 No.144874/1983이 기술한 ATL 바이러스 항체 측정방법이 상기 항체의 존재를 판정함에 있어 현실적으로 유용하지만, 아직도 의문의 여지가 있다. 이와같은 여건하에 본 발명자들은 ATL 바이러스 항제를 정확히 측정하는 방법을 수립하고져 연구하였다.
본 발명자들의 연구결과, 본 발명자들은 측정에 있어 ATL 바이러스 항원을 피검시료에 가한 시료를 대조시료로서 별도로 제조하고, 피검시료에 대한 측정결과로부터 대조표준시료에 대한 측정결과를 제(除)함으로써 전술한 목적이 달성된다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이른 것이다.
따라서 본 발명의 목적은 성인 T세포 백헐병의 예방과 치료분야에 있어서, 시료중의 ATL 바이러스 항체를 정확히 측정할 수 있는 측정시약을 제공하는 것이다. 본 발명은 이 목적달성을 위하여 측정에 있어서 ATL 바이러스 항원을 피검시료에 가한 시료를 대조시료로 하는 것을 특징으로 하는 ATL 바이러스 측정방법 및 그 시약을 개시하는 것이다 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다
본 발명에 관련하는 ATL 관련항원으로는 소위 성인 T세포 백혈병 관련항원이 있다. 더욱 상세히 말하면 이것은 ATL 관련항원 생성세포중에 항원단백 또는 C-형 바이러스 입자로서 존재하는것이다. 이것은 존재하는 경우 ATL 바이러스 항체와 특이적으로 반응한다. ATL바이러스 관련항원은 성인 T세포 백혈병환자 말초혈액으로부터 채취한 백혈병 세포를 혼합 배양하여 수립된 인간제대(臍帶)백혈구 유래의 MT-2 세포와 같은 학원생성세포주를 계면환성제로 처리함으로써 제조할수 있다. AⅡ 관련항원에 대한 더욱 상세한 설명 및 MT-2를 계면 활성제로 처리하는 방법은 다음 문헌에 기술되어 있고 이를 참조하였다.
7) Yoshida, M., et al., Proc. Nat. Acad. Sci.,79, 2031(1982).
8) Miyoshi, I., et al., Gann, 72, 978(1981).
9) Miyoshi, I., et al., Mature, 294, 770(1981).
10) 일본특허출원 No.169670/1982.
본 발명에 관계되는 ATL 바이러스 항원은 성인 T세포 백혈병의 발병 바이러스 입자로부터 유래하는, 이 바이러스에 고유한 항원이다. ATL 바이러스 항체가 존재하면 이들 사이에 특이적인 항원항체반응을 나타낸다. ATL 바이러스 항원은 ATL 항원생성세포의 배양상청(上淸)으로부터 ATL 바이러스를 농축하여 분리하고, 정제한 다음에 이와 같이하여 얻은 ATL 바이러스를 계면활성제를 사용하여 처리함으로써 제조한다.
예를들면 MT-2 세포의 배양상청을 농축하고 초원심분리하여 ATL 바이러스를 분리하고, 그와같이 회수한 ATL 바이러스를 수크로 오스농도 구배 초원심분리를 행하여 분획하고, 이들중 항원 양성 분획에 대하여 투석을 행하여 정제 ATL 바이러스를 얻는다.
다음에 정제 ATL 바이러스에 데옥시콜산나트륨을 가하여 처리하고 투석하여 ATL 바이러스 항원을 얻는다. ATL 관련항원을 얻기 위한 생성세포와 ATL 바이러스 및 ATL 바이러스 항원을 얻기 위한 생성세포는 반드시 동일할 필요는 없다. 그러나 본 발명에 관련하는 ATL 바이러스 항원은 ATL 관련항원을 이용하여 측정함에 있어서 대조시료를 제조하기 위한 것으로 제조하는 것임으로 상술한 두항원은 동일한 생성세포로부터 제조하는 것이 바람직하다.
ATL 항원생성세포 또는 ATL 바이러스를 처리하여 각각 ATL 연관항원이나 ATL 바이러스 항원을 얻는 방법은 어떠한 방법으로 수행하여도 좋다. 예컨대 데옥시콜산나트륨, 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올, 폴리옥시에틸렌(10)옥틸페닐에테르와 같은 계면활성제로 처리하는 방법을 수행할 수 있다. 계면활성제에 의한 처리에 대한 상세한 것은 일본특허공개 공보 No.62527/1984에 상세히 기록되어 있다.
다음에 본 발명 측정방법에 대하여 상세히 기술하고져 한다.
본 발명 측정방법은 효소면역측정법, 방사면역측정법, 수신적혈구 응집법중에서 선택된 방법에 의하여 수행된다. 이들 방법의 일반적인 과정자체는 잘 공지되어 있다 예로써, 효소면역측정법을 이용하는 경우에 대하여 본 발명 측정법을 설명하면 다음과 같다. 측정계 전체의 구성요소는 고상, ATL 관련항원, ATL 바이러스항원, 피검시료, 표지용 항인간 IgG항체(標識用 抗人間 IgG 抗體), 효소 및 기질이다. 고상으로서는 효소면역측정용 마이크로타이터 플레이트 컵(microtiter plate cup)혹은 유리구(glass beads)를 사용한다. 측정하기에 앞서, ATL 관련항원을 0.15M 인산염 완충 생리 식염액에 용해하고, 예를들면 효소면역측정용 폴리스티렌 컵에 넣고, 4℃하에서 하룻밤 방치하면 고상표면이 ATL 관련항원에 의하여 피복된다. 표지용 항인간 IgG 항체로서는 예를들면 염소 항인간 IgG 항체 또는 마우스(mouse)항인간 Fc모노클로날 항체가 있다. 또효소로서는 예를들면 알칼리 포스파타제, 글루코오스옥시다제, 퍼옥시다제 및 β-갈락토시다제가 있다. 측정에 앞서서, 글루타르알데히드와 같은 결합제를 사용하여 표지용 항체에 효소를 결합시켜서 콘쥬게이트(conjugate)를 형성시켜, 본 발명 측정방법을 위한 시약의 하나를 준비한다.
기질은 사용될 효소에 따라서 적당히 선잭할 수 있다. 예를들면 알칼리 포스파타제가 효소로서 선택되는 경우 p-니트로페닐 포스페이트 또는 유사한 기질을 이용할 수 있다. 측정계 전체의 구성요소중 피검시료 및 ATL 바이러스 항원 이외의 요소에 대하여 본 명세서에 기술한 것은 본 발명의 바람직한 구체예를 설명하기 위한 것이며 이를 한정시키려는 것은 아니다. 피검시료는, 예컨대 수혈용 혈액으로부터 얻어진 피검혈청 으로서 가장 번번히 제공된다.
그러나 본 발명은 그에 한정되지 않고 형태나 출처에 관계없이 어떠한 시료도 사용할 수 있다. 피검시료는 그대로 측정계에 가할 수 있다. 다른 방법으로는, 측정에 앞서서 정상 토끼혈청(NRS)으로 적당한 농도까지 희석시킬 수도 있다. ATL 바이러스 항원도 그대로 측정계중에 가해줄 수 있으나, 정상 토기혈청(NRS)으로 적당한 농도까지 희석하는 것이 바람직하다. 그러나 과도한 희석은 불안정한 결과(측정치)를 초래함으로 피하여야 한다. 따라서 ATL 바이러스 항체 양성혈청을 사용하여 가장 적당한 희석배율을 결정할 필요가 있다.
예를들면 다음에 기술하는 실험실시예 1 에서 제조된 ATL 바이러스 항원의 단백농도는 OD280nm에서 1.23이었다. 이 경우 NRS로 16배로 희석하는 것이 최적이다. 측정은 피검시료 및 대조시료 2종류 시료에 대하여 행한다. 후자 즉 대조시료는 피검시료에 ATL 바이러스 항원을 가하여 조제한다.
그러나 일반적으로 측정을 간편히 하고 오차를 최소화하기 위하여, 각 시료를 적당한 용매, 예를들면 NRS로 적당한 농도까지 희석할 필요가 있다. 이 경우에는 피검시료와 대조시료뿐만 아니라 용매만을 포함하는 대조표준시료도 제조하여 측정하여야 한다. 측정조작은 효소면역측정법의 통상과정에 따라 수행할 수 있다. 따라서, ATL 관련항원으로 피복한 컵에 피검시료, 대조시료, 대조표준시료 각각을 넣고 배양한다.
다음에 효소표지항체, 예를들면 염소 항인간IgG-알칼리 포스파타제 콘쥬게이트를 가하여 배양하고, 다음에 기질, 예를들면 P-니트로페닐 포스페이트를 여기에 가하여 배양한 후 분해된 기질의 양을 분광광도계를 사용하여 측정한다. 마지막으로 피검시료, 대조시료 및 대조표준시료로부터 각각 얻은 측정치 A, B 및 C를 사용하여 억제율(%)을 구한다.
Figure kpo00001
기지량의 ATL 바이러스 항체를 포함하는 시료를 사용하여 억제율(%)을 구하고 억제율(%)의 검량곡선을 그려서 피검시료중의 ATL 바이러스 항체를 측정할 수 있다. 또한 ATL 바이러스 항체 판정기준으로서 억제율이 50%이상인 때에는 ATL 바이러스 항체가 양성이고, 50%미만인 때에는 음성이라고 정하면 피검시료(피검혈청)중의 ATL바이러스, 항체 존재여부를 정확하고 명료하게 판정할 수 있다.
본 발명 측정방법에 의하면 ATL 바이러스 항체에 대하여 양성혈청과 음성혈청을 정확히 판별할 수 잇다. 본 발명은 또한 ATL 관련항원과 ATL 바이러스 항원을 필수 성분으로 함유하는 시약을 제공한다. 본 발명 시약은 상기한 본 발명 방법에서 직접 사용할 수 있으며, 따라서 상기한 방법에서와 동일한 목적을 달성하는 것이다.
본 발명 시약은 효소면역측정법, 방사면역측정법 및 수신적혈구응집법 중 어느것에도 이용할수 있다. 예컨대 본 발명 시약은 다음과 같은 방법으로 효소면역측정법에 실제로 사용할 수 있다.
본 발명 시약은 ATL 관련항원과 ATL 바이러스 항원을 조합시킨 그 자체, 또는 ATL 관련항원과 ATL 관련 항원과 ATL 바이러스 항원, 고상(固相), 표지용항체, 효소 및 기질중에서 임의로 선택된 1내지 4개 요소로 구성되는 세트(set)의 형태이다. 이 세트가 고상을 포함하는 경우 이 고상을 ATL 관련항원으로 피복시킬 수 있다. 세트가 표지될 항체와 효소를 포함하는 경우 이들 두 물질은 콘쥬게이트의 형태, 즉 표지항체일수 있다. 이들 경우도 또한 본발명의 범주에 포함됨을 유의하여야 한다. 이 세트는 또는 측정을 용이하게 하기 위하여 적당한 완충액이나NRS를 포함할 수 있으며, 이도 역시 본 발명 범위에 속한다는 것을 유의하여야 한다. 본 발명을 더욱 설명하기 위하여 다음 실시예를 기술한다.
[실시예 1]
0.15M 인산염 완충 생리식염액(pH7.2)을 2.4×107MT-2 세포에 가하고, 이 혼합물을 원심분리하여 세포를 분리하고 이를 패킹하였다. 여기에 0.2%의 데옥시콜산 나트륨을 함유하는 베로날 완충액( pH7.5, μ=〓0.145) 5ml를 가하고, 얻어진 혼합물을 4℃에서 4시간 동안 교반한 다음 10,000rpm으로 30분간 원심분리하였다. 상청을 투석튜우브에 채우고 0,15M 인산염 완충 생리식염액에 대하여 4℃에서 2일간 투석한 다음 10,000rpm에서 30분간 원심분리하였다. 이와같이 얻어진 상청은 ATL 관련항원을 함유하는 상청으로써 하였고, 그의 OD280nm값은 15/ml이었다.
ATL 관련항원을 함유하는 얻어진 혈청을 0.15M 인산염 완충 생리식염액으로 희석하여 OD280nm값이 0.4되게 하고, 이 용액 150㎕씩을 폴리스티렌 효소면역측정용 컵에 넣었다.
각개의 컵을 4℃에서 하룻밤 방치한다음 액을 배출시키고, 탈이온수로 세척하였다. 이와같이 얻어진 컵을 염소 항인간 IgG 항체/알칼리 포스파타제 콘쥬케이트, p-니트로페닐 포스페이트 및 ATL 바이러스 항원과 합쳐서 세트를 만들었다. 이 세트가 효소면역 측정시약이다. 측정을 더욱 용이하게 하기 위하여 세트에 NRS, 0.9% 염화 나트륨용액 및 1N-NaOH를 더 첨가시켰다. ATL 바이러스 항원은 다음과 같이 제조하였다. MT-2세포 배양상청 3ℓ를 10,000rpm에서 30분간 원심분리하고, 상청을 회수하였다. 회수된 상청을 농축시키고, 농축액을 10,000G하에서 2시간 원심분리하엿다. ATL 바이러스는 침전으로써 수집하였다. 다음에 침전을 0.15M NaCℓ, 0.002M EDTA 및 0.1% NaN3를 함유하는 0.01M 트리스-염산염 완충액(pH7.5) 4ml에 잘 현탁시키고, 얻어진 현탁액을 10,000rpm에서 30분간 원심분리하고, 그 상청을 조제 바이러스 농축액으로서 회수하엿다. 수크로오스 농도 구배액(15내지 60 중량%) 45ml를 니트로셀롤로스 튜우브에서 제조하고, 상기 조제바이러스 농축액 2mℓ을 그 위에 적층하고, 22,000rpm에서 15시간동안 RPS-25-2 로우터(Hitachi)로 초원심분리하였다.
다음에 뉴우브의 저부로부터 용리액 50적(嫡, 약2ml)씩을 회수하였다. 각 분획중의 ATL 바이러스는 인간 ATLA 항체를 억제항체로서 상용하는 효소면역측정법으로 측정하였다. ATL 바이러스 양성 분획을 합쳐서 0.15M NaCl, 0.002M EDTA 및 0.1% NaN3를 함유하는 0.01M 트리스-염산염 완충액(pH7.5)에 대하여 투석하여 1.15g/ml의 ATL 바이러스 용액을 얻었다. 투석완료후 데옥시콜산 나트륨을 여기에 가하여 0.2% 농도가 되게 하고,얻어진 혼합물을 4℃에서 30분간 교반하였다.
다음은 이것을 0.15M NaCl, 0.002M EDTA 및 0.1% NaN3를 함유하는 0.01M트리스-염산염 완충액(pH7.5)에 대하여 투석하여 ATL 바이러스 항원으로 하였다.
이와같이하여 OD280nm에서 1.23의 단백을 함유하는 ATL 바이러스 항원 35ml를 회수하였다.
[실시예 2]
염소 항인간 IgG 항체 또는 마우스 항인간 IgG(Fc)항체를 0.05M 인산염 완충액(PH7.5)에 용해시켜서 단백질농도가 1mg/ml 되게 하였다. 이와같이 얻어진 용액 10μl에 1mCi의125I-Na 50μl를 가하고, 다음에 전술한 인산염 완충액에 클로라 민 T 1.5mg/ml를 가하여 제조한 용액 10μl를 연속하여 가하고, 얻어진 흔합물을 30초간 교반하였다.
다음에 2mg/ml의 수소 메타황산 나트륨을 전술한 인산완충액에 용해시켜 제조한 용액 100μl를 여기에 가하여 반응을 중단시켰다. 전술한 완충액애 10mg/ml의 요드화 칼륨을 용해시켜 제조한 용액 100μl를 반응액에 가하고, 이 혼합물을 즉시 세파덱스 G-50(Sephadex G-50)으로 겔여과하여125I-표지물질을125I로부터 분리시켰다.125I-표지물질은 약 5내지 20μCi/μg의 비방사능을 나타내었다. 이 I-표지물질을 실시예 1 에 기술한 방법으로 제조한 컵과 ATL 바이러스 항원과 조합시켜서 방사면역 측정에서 사용할 수 있는 세트가 되게 하였다.
[실시예 3]
양의 혈액을 튜우브에서 생리식염액을 사용하여 2,000rpm으로 10분간 원심분리하는 것을 5회 반복하여 적혈구를 세정하였다. 이 적혈구에 0.15M 인산염 완충 생리식염액(pH7.5)을 가하여 5%농도가 되게 하였다. 전술한 인산염 완충 생리식염액으로 2.5%농도가 되게 조절한 글루타르알데히드 용액을 상기 적혈구 현탁액에 1/5 용적의 양으로 가하였다. 얻어진 혼합물을 실온에서 교반하면서 약 5시간동안 반응시켜 적헐구를 고정하였다 다음에 이 용액을 원심분리하여 고정 적혈구를 얻고, 이것을 원심분리기를 사용하여 생리식염액으로 수회 더 세척하였다. 고정 적혈구는 다음에 전술한 인산염 완충액으로 5% 현탁액 (부유액)이 되도록 조정하고, 전술한 인산염 완충 생리식염액으로 5mg/dl의 농도로 조정한 탄닌산용액 동일량을 가한 다음 30분간 교반하였다. 이와같이 얻어진 용액을 원심분리하여 탄닌산으로 처리한 고정 적혈구를 얻고, 다음에 이것을 생리식염액을 사용하여 수회 더 원심분리하였다.
전술한 인산염 완충액은 탄닌산으로 처리하여 얻은 고정적헐구에 가하여 5% 적혈구 부유액이 되게 하였다. 이와같이 얻은 적혈구 부유액은, 실시예 1 에서와 같이 제조한 ATL 관련항원을 함유하는 상청을 전술한 인산염 완충 생리식염액으로 희석시킴으로서 조제한 용액 동일량과 혼합시켜 단백질 농도가 약 5mg/ml되게 하고, 이 혼 합물을 실온에서 60분간 교반하여 감작(感作)시켰다.
얻어진 용액을 원심분리하여 감작 적혈구를 얻고, 이것은 다음에 수회 원심분리함으로써 생리식염액으로 세척하였다 이와같이 얻어진 감작 적혈구에 2%의 NRS를 함유하는 인산염 완충 생리식염액을 가하여 7% 현탁액이 되게 하였다. 감작 작혈구를 실시예 1 에서 제조한 것 같은 ATL 바이러스 항원과 조합시켜 수신 적혈구 응집법용 시약을 얻었다.
[실시예 4]
실시예 1에서 제조한 시약세트를 사용하여, 피검헐청을 ATL바이러스 항체 양성 또는 음성으로서 판정하였다. NRS와 실시예 1 에서 나타낸 ATL 바이러스 항원을 NRS로 16배 희석시켜 제조한 ATL 파이러스 항원용액 100μl 씩을 각각 시험관에 취하였다. 피검혈청 20μl씩을 각개 시험관에 넣었다. 전자의 것은 피검시료로 하고, 후자의 것은 대조시료로 하였다. 별도로 NRS를 제조하여 대조표준시료로 하였다. 각개 시료를 잘 교반하고, 37℃ 1시간 또는 4℃에서 하룻밤 방치하였다.
다음에 각개 시료 100μl씩을 실시예 1 에서 나타낸 것과 같은 피복컵에 취하고 37℃에서 60분간 배양하였다. 배양완료후 0.9%의 염화나트름용액을 여기에 가하여 미반응물질을 세척하고, 염소 항인간 IgG/알칼리 포스파타제 콘쥬케이트 용액 100μl를 반응혼합물에 가하였다. 37℃에서 60분간 재배양한 후, 0.9%와 염화나트륨용액을 가하여 미반응 물질을 세척하고 100μl의 p-니트로페닐 인산염 용액을 반응 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 37℃에서 30분간 반응시킨 다음 IN NaOH 100μI를 여기에 가하여 반응을 중단시켰다. 마지막으로 각 시료의 광학밀도(횹광치)를 405nm에서 측정하였다. 피검시료의 광학밀도는 A로서, 대조시료의 광학밀도는 B로서, 대조표준시료의 광학밀도는 C로서 표시하였다. 억제율(%)을 다음식에 따라 A, B 및 C 로 부터 산출하였다.
Figure kpo00002
억제율이 50% 또는 그 이상인 경우 피검헐청은 ATL 바이러스 항체에 대하여 양성이고, 한편 이것이 50%미만인 경우는 음성이다. 본 발명의 효과를 더욱 설명하기 위하여 다음과 같은 실험실시예를 기재한다
[실험실시예 1]
표 1에 나타낸 바와같이 혈청시료 No.1 내지 11을 제조하였다. No.1내지 5와, No.6 내지 11은 면역형광 항체면역측정법에 의하여 ATL 바이러스 항체에 대하여 각각 양성 및 음성으로 확인되었다. 이들 음성헐청중 No.6내지 8은 정상 인간혈청(NHS)이었고, No.9내지 11은 전신성 홍반성낭창 환자로부터 유도한 것이었다.
각개 혈청시료를 실시예 4 에 기술한 방법으로 측정하고, A, B 및 C로부터 억제율(%)을 산출함으로써 실시 예 4 의 방법에 따라 시료가 ATL 바이러스 항체에 대하여 양성인지 음성인지를 판정하였다. 표 1 은 그 결과를 나타낸 것이다. 표 1 로부터 본 발명의 측정방법이 ATL 바이러스 항체를 명료하고 정확하게 판정할 수 있다는 것을 알수 있다. 특히 주목할 만한 사실은 본래 ATL 바이러스 항체에 대하여 음성인 혈청시료 No.9 내지 No.11이 A만을 근거로 하여 판정하는 종래방법에서는 양성으로 오인된 것에 반하여 억제율을 판정기준으로 하는 본 발명 방법으로 정확히 판정하게 되어 표 1 에 나타낸 바와같이 이들과 실제로 양성인 것과를 명확히 구별한다는 것이다. 이 점이 본 발명의 특징적인 이점이다.
[표 1]
Figure kpo00003
※IF판정은 면역형광 항체측정법에 의한 판정을 의미하며, +와-는 상기 판정에 있어서 ATL 바이러스 에 대하여 양성 및 음성을 나타낸다
[실험실시예 2]
ATL 바이러스 항원의 최적 희석율을 구하는 방법을 설명하기 위하여 본 실시예를 기술한다.
실험실시예 1 에서 얻은 ATL바이러스 항원을 100μl의 NRS 2n-배(즉 2내지 128배) 희석시켰다. 별도로 NRS 자체를 제조하고, 각개 시료에 인간 ATL바이러스 항체 양성혈청 20μl를 첨가하고, 이 혼합물을 37℃에서 1시간 또는 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 반응혼합물 100μl를 실시예 1에서 기술한 시약세트의 피복컵에 넣고 실시예 4 에 기술한 과정에 따라 대조시료의 OD값 즉 B를 측정하였다. 희석에서 사용된 각 NRS 의C는 실시예 4 에서 기술한 방법에 따라 구하였다.
표2는 그 결과를 나타내는 것이다. 표 2 의 희석율란의 NRS는, ATL바이러스 항체에 대하여 음성인, 대조표준으로서 사용된 정상 토끼혈청을 나타낸다. 표2로부터 알 수 있는 바와같이 ATL 바이러스 항원에 의한 억제는 16-배로 희석되었을 때 평형을 이루어 안정한 측정치를 얻을 수 있게 한다.
[표2]
Figure kpo00004

Claims (2)

  1. 효소면역측정법, 방사면역측정법 및 수신 적혈구 응집법으로 구성되는 군으로 부터 선택된 방법에 의하여 ATL 관련항원을 이용하여 시료중의 ATL 바이러스 항체를 측정하는 방법에서 시료에 가하여 대조시료로 사용하기 위한 시약의 제조방법에 있어서, MT-2 세포를 계면활성제로 처리하여 ATL 관련항원을 얻고, 또한 MT-2세포의 배양상청을 농축하고 초원심분리하여 ATL바이러스를 분리하고 슈크로스 농도구배 초원심분리를 행하여 분획하고 이들 중 항원 양성 분획에 대하여 투석을 행하여 정제 ATL 바이러스를 얻어서 이것을 데옥시콜산나트륨으로 처리한 후 투석하여 ATL 바이러스 항원을 얻어 여기에 각각 효소표지항체 및 효소의 기질,125I-염소 또는 마우스 항인간 IgG 항체 및 양의 혈액으로 부터의 ATL 관련항원과의 감작 적혈구를 NRS 로 희석한 것을 적정량으로 첨가하는 것으로 이루어지는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 ATL 바이러스 항원을 NRS로 16배 희석하는 것을 특징으로 하는 방법.
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