RU2021616C1 - Способ определения антител - Google Patents
Способ определения антител Download PDFInfo
- Publication number
- RU2021616C1 RU2021616C1 SU4849911A RU2021616C1 RU 2021616 C1 RU2021616 C1 RU 2021616C1 SU 4849911 A SU4849911 A SU 4849911A RU 2021616 C1 RU2021616 C1 RU 2021616C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibodies
- lymphocytes
- cells
- lymphocyte
- incubation
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и может быть использовано при определении количества лимфоцитов - продуцентов специфических антител у больных различными инфекционными заболеваниями. Целью изобретения является повышение точности способа за счет выявления антител на поверхности лимфоцита, продуцирующих антитела. Для этого исследуемые лимфоциты инкубируют со специфическим антигеном. После образования комплексов клетки фиксируют ацетоном на предметных стеклах. Затем с помощью перекиси водорода ингибируют эндогенную пероксидазную активность, после чего проводят инкубацию с конъюгатом и субстратом последовательно. Реакция считается положительной, когда у лимфоцитов мембрана принимает коричневую окраску. С помощью данного способа можно определять продукцию антител единичными клетками. Столь низкий уровень иммуноглобулина нельзя определять с помощью общеизвестного иммуноферментного твердофазного анализа.
Description
Изобретение относится к медицине. С его помощью можно определять количество лимфоцитов - продуцентов специфических антител у больных различными инфекционными заболеваниями. Это дает возможность проводить не только диагностику, но и определять количество лимфоцитов, продуцирующих специфические антитела, тем самым появляется возможность охарактеризовать иммунологический статус этих больных. Также при использовании предложенного способа можно определять чистоту гибридомных линий, продуцирующих моноклональные антитела, что является важным при преклонировании культур.
Известен способ определения антител с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Этот способ основан на том, что для исследования уровня специфических иммуноглобулинов в сыворотке или супернатанте проводят сенсибилизацию твердой фазы антигеном, добавлением исследуемого материала к этому антигену и определением результатов иммунной реакции с помощью конъюгата. Однако, данный способ недостаточно точен для характеристики иммунного ответа у больных и реконвалесцентов, поскольку не дает ясного результата в присутствии иммунных комплексов в крови, наличии неспецифических реакций, а также при невысоком уровне выработки специфических антител. ИФА, вместе с тем, не позволяет определять процентное соотношение гибридомных клеток, продуцирующих моноклональные антитела. Тем самым не дает ясного представления о сроках переклонирования.
Способ осуществляется следующим образом. Лимфоцитарную культуру, подлежащую исследованию, трехкратно промывают в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) (NaCl 0,15 М, Tris-HCl рН 7,4) ресуспендированием с последующим центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. После этого клетки в концентрации 5000000 клеток в миллилитре инкубируют в растворе с антигеном 2 ч при 37оС. Антиген используют в разведении, в 10 раз меньшем рабочей концентрации, применяемой в твердофазном иммуноферментном анализе для сорбции на твердую фазу (1/100-1/500). Далее клетки трехкратно промывают ЗФР, используя указанный режим центрифугирования, а затем ресуспендирование проводят в ЗФР с 30%-ной сывороткой крупного рогатого скота в концентрации 2000000 клеток в миллилитре. Полученную суспензию вносят по 25 мкл на предметные стекла и высушивают при комнатной температуре. После полного высыхания препарат фиксируют в ацетоне при -20оС 30 мин и промывают ЗФР 5 мин. Фиксированные препараты хранят при 15-20оС.
Следующим этапом является проведение клеточного иммуноферментного анализа. Для предотвращения нежелательного воздействия эндогенной пероксидазы лимфоцитов на субстрат, проводится блокирование активности этого фермента. В связи с этим, фиксированные клетки инкубируют 30 мин в 7,5%-ном растворе перекиси водорода на метаноле при 20оС. После трехкратной отмывки препарата ЗФР, проводят инкубацию с раствором субстрата (3 мг диаминобензидина, 100 мкл 0,5%-ной перекиси водорода, растворенных в 6 мл ЗФР) от 10 мин до 1 ч, контролируя под световым микроскопом появление специфического окрашивания мембран лимфоцитов в коричневый цвет.
В качестве примера можно привести использование предложенного способа для изучения количества клеток, продуцирующих антиНВ core антитела у больных острым гепатитом В. 6 мл крови больного забирают в пробирки с 2 мл гепарина, разведенного 1/50 в среде 199. Затем гепаринизированную кровь в объеме 6 мл наслаивают в центрифужных пробирках на раствор фиколл-верографина (36 г порошка фиколла разводят в 400 мл дистиллированной воды. Этот раствор смешивают с 83,29 мл 76%-ного верографина с последующим добавлением 91,71 мл дистиллированной воды. Плотность приготовленного раствора должна составлять 1,077). После этого приготовленный материал центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин в горизонтальном роторе. Затем при помощи пастеровской пипетки забирают отделившиеся лимфоциты, которые выглядят в виде опалесцирующего кольца на поверхности плотности фиколл-верографина. Далее необходимо провести манипуляции, указанные выше. Концентрация core антигена при этом должна быть не менее 5 мг/мл. Результаты опыта показывают, что у больных с острым гепатитом В с титром антиНВ core антител 1/100000 в ИФА около 3% лимфоцитов имеют отношение к продукции специфических антител.
Claims (1)
- СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ, включающий добавление к исследуемому материалу специфического антигена с последующим инкубированием и регистрацией реакции с помощью иммуноферментной метки, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет выявления антител на поверхности лимфоцитов, в качестве исследуемого материала используют лимфоциты, далее после инкубации лимфоцитов с антигеном, клетки фиксируют в ацетоне и добавляют перекись водорода.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU4849911 RU2021616C1 (ru) | 1990-04-16 | 1990-04-16 | Способ определения антител |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU4849911 RU2021616C1 (ru) | 1990-04-16 | 1990-04-16 | Способ определения антител |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2021616C1 true RU2021616C1 (ru) | 1994-10-15 |
Family
ID=21526838
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU4849911 RU2021616C1 (ru) | 1990-04-16 | 1990-04-16 | Способ определения антител |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2021616C1 (ru) |
-
1990
- 1990-04-16 RU SU4849911 patent/RU2021616C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Nakane, Kawaoi A. Histochem Citochem 1974, 22, p 1084-1091. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4536479A (en) | Use of anti-idiotype antibodies in immunoassays | |
US4828981A (en) | Immunoassays for determining Dirofilaria immitis infection using antiidiotype monoclonal antibody reagents | |
US4332783A (en) | Process for immunologic determination tests | |
US4748110A (en) | Immunoassay for HTLV-III antigens | |
US4943525A (en) | Simultaneous immunoassay for the determination of antigens and antibodies | |
FI89175B (fi) | Foerfarande och produkter foer paovisande av humant t-celleukemivirus | |
US5900359A (en) | Method for determination of oxidized lipoproteins and use thereof | |
JP3673522B2 (ja) | 抗アネキシンvモノクローナル抗体並びにその利用及びそれを産生するハイブリドーマ細胞系 | |
Kelen et al. | Rapid detection of Australia/SH antigen and antibody by a simple and sensitive technique of immunoelectronmicroscopy | |
CA1340973C (en) | Immunometric assay kit and method applicable to whole cells | |
Porstmann et al. | A rapid and sensitive enzyme immunoassay for Cu/Zn superoxide dismutase with polyclonal and monoclonal antibodies | |
Winchester et al. | Immunofluorescent studies on antibodies directed to a buried membrane structure present in lymphocytes and erythrocytes | |
KR100500793B1 (ko) | C형간염바이러스감염증진단약 | |
EP0454509B1 (fr) | Procédé de mise en évidence d'agglutination érythrocytaire destiné aux analyses de compatibilités sanguines | |
JP2824794B2 (ja) | 固相法により赤血球抗体を探索し、同定する方法 | |
WO2013097616A1 (zh) | 一种鉴定抗体敏感性和克隆细胞株的方法及试剂盒 | |
RU2021616C1 (ru) | Способ определения антител | |
US5990274A (en) | Cyclosporine derivatives and uses thereof | |
Headings et al. | Identification of specific hemoglobins within individual erythrocytes | |
EP0308242B1 (en) | Agglutination assay | |
JPH0328766A (ja) | Hiv抗体の検出方法およびそれに用いるアッセイキット | |
US4757000A (en) | Process for assaying ATL virus antibody and reagent therefor | |
US5137807A (en) | Method for determining beta-subunit of human prolyl 4-hydroxylase by immunoassay to detect hepatic disease | |
US5017472A (en) | Microflotation devices used for immunoassays and cell/molecular fractionation | |
CA1287801C (en) | Method for determining human collagen peptides by way of enzyme immunoassay |