KR20230148824A - 핵산을 전달하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 간세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는 세포의 유전적 변형을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 조성물 및 방법은 지질 나노입자를 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질, 적어도 하나의 구조 지질, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 PEG화 지질을 포함한다.
Description
관련 출원
본 출원은, 2021년 2월 23일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/152,517호, 2021년 3월 4일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/156,649호, 2021년 3월 22일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/164,174호, 및 2021년 6월 7일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/197,946호의 우선권과 이익을 주장한다. 전술한 특허 출원 각각의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 동 서열 목록은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 2022년 2월 23일에 생성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 “POTH-066_001WO_SeqList.txt”이며, 크기는 약 320,338 바이트이다.
기술분야
본 개시는 일반적으로, 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하는 신규한 지질 나노입자(“LNP”), 이들 LNP를 제조하는 방법, 및 유전자 요법 및 세포 기반 요법 응용예를 위한 이들 LNP의 용도에 관한 것이다.
핵산을 세포에 전달하고 생체 내, 생체 외, 및 시험관 내에서 세포를 유전적으로 변형시키기 위한 조성물 및 방법에 대한 오랫동안 그 필요성을 느껴왔지만 충족되지 않은 필요성이 당업계에서 존재해 왔다. AAV를 포함하는 바이러스 벡터의 사용과 같이, 널리 수용되는 유전자 전달 및 유전자 변형 기술은 환자에서 급성 독성 및 유해한 부작용을 야기할 수 있다. 본 개시는 생체 내에서, 생체 외에서, 및 시험관 내에서 간세포를 포함하는 다양한 세포에 다양한 핵산을 전달하기 위한 개선된 조성물, 방법, 및 키트를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 개시는 개선된 지질 나노입자 조성물 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 이들 지질 나노입자 조성물 및 방법은 특정 유형의 핵산(예: RNA)을 높은 효율 및 낮은 독성으로 간 세포에 전달할 수 있게 한다. 또한, 본 개시의 지질 나노입자 조성물은 개선된 저장 안정성을 나타내는데, 이는 임상적 및 상업적 환경에서 유리하다. 따라서, 본 개시의 조성물 및 방법은 유전자 요법 및 세포 기반 치료제의 생산을 포함하는 다양한 수의 분야에 광범위하게 적용 가능하다.
일부 양태에서, 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하는 신규한 지질 나노입자(“LNP”)가 제공된다. 일 양태에서, 생환원성 이온화 가능한 양이온 지질은 Coatsome SS-OP이다.
일 양태에서, 본 개시의 조성물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
일 양태에서, 적어도 하나의 핵산을 적어도 하나의 세포에 전달하는 방법으로서, 적어도 하나의 세포를 본 개시의 적어도 하나의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일 양태에서, 적어도 하나의 세포를 유전적으로 변형시키는 방법으로서, 적어도 하나의 세포를 본 개시의 적어도 하나의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일 양태에서, 적어도 하나의 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 본 개시의 적어도 하나의 조성물의 적어도 하나의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일 양태에서, 적어도 하나의 핵산을 적어도 하나의 세포에 전달하는 방법으로서, 적어도 하나의 세포를 본 개시의 적어도 하나의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일 양태에서, 본 개시의 방법에 따라 변형된 세포가 제공된다.
상기 양태 중 어느 하나는 임의의 다른 양태와 조합될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서, 단수 형태는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수도 포함하며; 예를 들어, 단수 용어(“a”, “an” 및 “the”)는 단수 또는 복수인 것으로 이해되고, 용어 또는(“or”)은 포괄하는 것으로 이해된다. 예로서, “요소(an element)”는 하나 이상의 요소를 의미한다. 명세서 전반에 걸쳐, 단어 “포함(comprising 또는 이의 변형된 표현인 comprises 또는 comprising)”은 언급된 요소, 정수, 또는 단계, 또는 요소, 정수, 또는 단계의 군을 포함하는 것을 의미하지만, 임의의 다른 요소, 정수, 또는 단계, 또는 요소, 정수, 또는 단계의 군을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다. 약(about)은 언급된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 이내인 것으로서 이해될 수 있다. 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 본원에서 제공된 모든 수치 값은 용어 “약”에 의해 수식된다.
본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 물질은 아래에 기술된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참조 문헌은 그 전체가 참조로서 통합된다. 본원에 인용된 참조 문헌이 청구된 발명의 종래 기술인 것으로 인정되지는 않는다. 상충되는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선한다. 또한, 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하도록 의도되지 않는다. 본 개시의 다른 특징 및 장점은 다음의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
전술한 특징 및 추가의 특징은 첨부 도면을 함께 고려했을 때 다음의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 더욱 명확하게 이해될 것이다.
도 1은 본 개시의 LNP가 투여된 성체 마우스에서 인간 FVIII의 발현을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 2는 본 개시의 LNP가 투여된 마우스에서 인간 FIX의 발현을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 3은 0.1 mg/mL 및 4℃의 온도에서 7일의 인큐베이션 과정에 걸쳐 본 개시의 다양한 LNP 조성물의 평균 직경 및 다분산 지수(PDI)를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 4는 본 개시의 LNP가 투여된 마우스에서 인간 FVIII의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 개시의 LNP가 투여된 비인간 영장류(NHP)에서 인간 에리트로포이에틴(hEPO)의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 6은 본 개시의 LNP가 투여된 NHP에서 간 효소의 수준을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 7은 인간 OTC(hOTC) 트랜스포존 AAV 바이러스 벡터 입자가 투여된 마우스 및 본 개시의 SPB LNP와 함께 인간 OTC(hOTC) 트랜스포존 AAV 바이러스 벡터 입자가 투여된 마우스의 생존율을 보여주는 그래프이다.
도 8은 본 개시의 SPB LNP와 함께 인간 OTC(hOTC) 트랜스포존 AAV 바이러스 벡터 입자가 투여된 마우스에서 통합된 바이러스 카피수(VCN) 및 hOTC mRNA 수준을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 9은 본 개시의 SPB LNP와 함께 인간 OTC(hOTC) 트랜스포존 AAV 바이러스 벡터 입자가 투여된 마우스의 생존율 및 이들 마우스에서 오로트산의 수준을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 1은 본 개시의 LNP가 투여된 성체 마우스에서 인간 FVIII의 발현을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 2는 본 개시의 LNP가 투여된 마우스에서 인간 FIX의 발현을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 3은 0.1 mg/mL 및 4℃의 온도에서 7일의 인큐베이션 과정에 걸쳐 본 개시의 다양한 LNP 조성물의 평균 직경 및 다분산 지수(PDI)를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 4는 본 개시의 LNP가 투여된 마우스에서 인간 FVIII의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 개시의 LNP가 투여된 비인간 영장류(NHP)에서 인간 에리트로포이에틴(hEPO)의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 6은 본 개시의 LNP가 투여된 NHP에서 간 효소의 수준을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 7은 인간 OTC(hOTC) 트랜스포존 AAV 바이러스 벡터 입자가 투여된 마우스 및 본 개시의 SPB LNP와 함께 인간 OTC(hOTC) 트랜스포존 AAV 바이러스 벡터 입자가 투여된 마우스의 생존율을 보여주는 그래프이다.
도 8은 본 개시의 SPB LNP와 함께 인간 OTC(hOTC) 트랜스포존 AAV 바이러스 벡터 입자가 투여된 마우스에서 통합된 바이러스 카피수(VCN) 및 hOTC mRNA 수준을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 9은 본 개시의 SPB LNP와 함께 인간 OTC(hOTC) 트랜스포존 AAV 바이러스 벡터 입자가 투여된 마우스의 생존율 및 이들 마우스에서 오로트산의 수준을 보여주는 일련의 그래프이다.
본 개시는 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하는 신규한 지질 나노입자(LNP) 조성물, 상기 조성물을 제조하는 방법, 및 상기 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 비제한적인 예에서, 본 개시의 조성물 및 방법은 유전자 요법의 맥락에서 유전자 전달에 사용될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 본 개시의 조성물 및 방법은 세포 기반 치료제의 맥락에서 사용될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 본 개시의 조성물 및 방법은 치료 단백질(분비된 치료 단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않음)의 발현을 유도하기 위해 핵산을 전달하는 데 광범위하게 사용될 수 있다. 비제한적인 예에서, 본 개시의 조성물 및 방법은 특정 간 장애의 치료를 위해, 생체 내, 생체 외, 또는 시험관 내에서 핵산을 간 세포에 전달하는 데 광범위하게 사용될 수 있다.
본 개시의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질은 생분해성이므로, 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질은 동물 내에서 분해되어 대사될 수 있다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 이러한 생분해성은 양이온성 지질과 관련된 세포독성을 유리하게 감소시킨다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 양태에서, LNP 조성물에 사용하기 위한 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질은 ssPalmO-Ph-P4C2일 수 있다. 당업자가 이해할 수 있듯이, ssPalmO-Ph-P4C2는 다음의 구조를 갖는다:
(식 I).
당업자가 이해할 수 있듯이, ssPalmO-Ph-P4C2는 Coatsome® SS-OP, ssPalmO-Phe-P4C2, ssPalmO-Phenyl-P4C2, ssPalmO-Phe, 및 ssPalmO-Ph로도 지칭될 수 있다. 따라서, ssPalmO-Ph-P4C2, Coatsome® SS-OP, ssPalmO-Phe-P4C2, ssPalmO-Phenyl-P4C2, ssPalmO-Phe, 및 ssPalmO-Ph는 식 I에 제시된 화학 구조를 갖는 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질을 지칭하도록 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다.
이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, ssPalmO-Ph-P4C2의 3개의 특정 분절이 이의 생분해를 용이하게 한다. 먼저, 각각의 피페르딘 고리의 3차 아민은 산성 pH-반응성 양이온-하전 단위이다. 세포내섭취 후에, 3차 아민 모이어티는 산성 세포내 엔도솜 구획에 반응하여 양으로 하전된 상태가 된다. 이들은 이제 막과 상호 작용하여 막을 불안정하게 할 수 있고, 이는 엔도솜 이탈로 이어진다. 세포기질(cytosol)에 있을 때, 이황화 결합은 글루타티온에 의해 환원되기 쉽고, 이로 인해 2개의 유리 설프하이드릴기가 생성될 수 있다. 그렇게 생성된 고농도의 유리 티올은 추가로 친핵성 반응을 초래하고, 입자는 티오에스테르화를 통해 스스로 분해/파괴되어 페이로드를 세포기질에 방출한다. 이는 입자 내 반응물 농축에 의해 가속된 HyPER 또는 가수분해로서 정의되며, 일반적으로 양이온성 지질의 잠재적 독성 부작용을 잠재적으로 제거한다.
본 개시의 조성물-지질 나노입자
본 개시는 적어도 하나의 양이온성 지질 및 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 구조 지질을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 인지질을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 PEG화 지질을 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 본 개시는 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 양이온성 지질, 적어도 하나의 핵산 분자, 적어도 하나의 구조 지질, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 PEG화 지질을 포함한다.
생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질
일부 양태에서, 양이온성 지질은 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질일 수 있다. 따라서, 본 개시는 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질”은, 적어도 하나의 삼차 아민, 적어도 하나의 이황화 기, 티오에스테르화에 의해 절단하기 쉬운 결합을 포함하는 적어도 하나의 기를 포함하고, 적어도 2개의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬을 추가로 포함하는 양이온성 지질을 지칭하도록 가장 넓은 의미로 사용된다. 예시적인 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질은 Akita 등의 문헌[(2020) Biol. Phar. Bull. 43:1617 - 1625]에 기술된 것들을 포함하되 이에 한정되지는 않으며, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
일부 양태에서, 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질은 적어도 2개의 3차 아민을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 3차 아민은 치환된 피페리디닐기일 수 있다. 일부 양태에서, 각각의 3차 아민은 치환된 피페리디닐기일 수 있다. 일부 양태에서, 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질은 적어도 하나의 이황화 결합을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 이황화 결합의 황 원자는 알킬렌기를 통해 피페리디닐 고리의 질소에 연결되어, 이황화 결합의 측면에 위치하는 2개의 삼차 아민기를 형성한다. 일부 양태에서, 알킬렌기 중 적어도 하나는 에틸렌기이다. 일부 양태에서, 알킬렌기의 각각은 에틸렌기이다.
일부 양태에서, 티오에스테르화에 의해 절단되기 쉬운 결합을 포함하는 적어도 하나의 기는 페닐 에스테르기일 수 있다. 일부 양태에서, 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질은 적어도 2개의 페닐 에스테르기를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 2개의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬 중 적어도 하나는 불포화 탄화수소 사슬이다. 일부 양태에서, 적어도 2개의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬의 각각은 불포화 탄화수소 사슬이다. 일부 양태에서, 불포화 탄화수소 사슬은 옥타데센일 수 있다. 일부 양태에서, 옥타데센은 (Z)-옥타데스-9-엔일 수 있다. 일부 양태에서, (Z)-옥타데스-9-엔 기는 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질의 페닐 에스테르 기에 연결될 수 있다.
본 개시의 방법에 유용한 예시적인 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질 및 이러한 지질의 제조 방법은 WO/2016/121942로서 공개된 국제 특허 출원 제PCT/JP2016/052690호 및 WO/2019/188867로서 공개된 국제 특허 출원 제PCT/JP2019/012302호에 개시된 것들을 포함하며, 이들 문헌 각각의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 따라서, 본 개시는 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 적어도 하나의 지질 나노입자는 WO/2016/121942 및 WO/2019/188867에 제시된 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질 중 어느 하나를 포함한다.
따라서, 본 개시는 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질, 적어도 하나의 핵산 분자, 적어도 하나의 구조 지질, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 PEG화 지질을 포함한다.
일부 양태에서, 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질은 식 I에 제시된 구조를 갖는 ssPalmO-Ph-P4C2일 수 있다(Akita 등의 문헌[(2020) Biol. Phar. Bull. 43:1617 - 1625]을 참조하고, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
본원에 기술된 바와 같이, 적어도 하나의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하는 본 개시의 LNP 조성물은 유리하게는, 비-생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하는 LNP 조성물과 비교했을 때 동물에서 상당히 감소된 독성을 나타낸다. 특히, 본 개시의 LNP 조성물을 투여하는 것은 놀랍게도 어떠한 체중 감소도 유발하지 않는다. 실제로, 본 개시의 LNP 조성물은, LNP를 투여한 동물의 체중이 실제로 증가할 정도로 비독성이며, 심지어 LNP가, 비-생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하는 LNP 조성물의 치사량을 초과하는 양으로 투여된 경우에도 비독성이다.
LNP 성분
일부 양태에서, 본 개시의 LNP는 약 2.5 mol%, 또는 약 5 mol%, 또는 약 7.5 mol%, 또는 약 10 mol%, 또는 약 12.5 mol%, 또는 약 15 mol%, 또는 약 17.5 mol%, 또는 약 20 mol%, 또는 약 22.5 mol%, 또는 약 25 mol%, 또는 약 27.5 mol%, 또는 약 30 mol%, 또는 약 32.5 mol%, 또는 약 35 mol%, 또는 약 37.5 mol%, 또는 약 40 mol%, 또는 약 42.5 mol%, 또는 약 45 mol%, 또는 약 47.5 mol%, 또는 약 50 mol%, 또는 약 52.5 mol%, 또는 약 55 mol%, 또는 약 57.5 mol%, 또는 약 60 mol%, 또는 약 62.5 mol%, 또는 약 65 mol%, 또는 약 67.5 mol%, 또는 약 70 mol%의 적어도 하나의 생환원성 이온화가능한 양이온성 지질을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시의 LNP는 적어도 약 2.5 mol%, 또는 적어도 약 5 mol%, 또는 적어도 약 7.5 mol%, 또는 적어도 약 10 mol%, 또는 적어도 약 12.5 mol%, 또는 적어도 약 15 mol%, 또는 적어도 약 17.5 mol%, 또는 적어도 약 20 mol%, 또는 적어도 약 22.5 mol%, 또는 적어도 약 25 mol%, 또는 적어도 약 27.5 mol%, 또는 적어도 약 30 mol%, 또는 적어도 약 32.5 mol%, 또는 적어도 약 35 mol%, 또는 적어도 약 37.5 mol%, 또는 적어도 약 40 mol%, 또는 적어도 약 42.5 mol%, 또는 적어도 약 45 mol%, 또는 적어도 약 47.5 mol%, 또는 적어도 약 50 mol%, 또는 적어도 약 52.5 mol%, 또는 적어도 약 55 mol%, 또는 적어도 약 57.5 mol%, 또는 적어도 약 60 mol%, 또는 적어도 약 62.5 mol%, 또는 적어도 약 65 mol%, 또는 적어도 약 67.5 mol%, 또는 적어도 약 70 mol%의 적어도 하나의 생환원성 이온화가능한 양이온성 지질을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시의 LNP는 약 2.5 mol%, 또는 약 5 mol%, 또는 약 7.5 mol%, 또는 약 10 mol%, 또는 약 12.5 mol%, 또는 약 15 mol%, 또는 약 17.5 mol%, 또는 약 20 mol%, 또는 약 22.5 mol%, 또는 약 25 mol%, 또는 약 27.5 mol%, 또는 약 30 mol%, 또는 약 32.5 mol%, 또는 약 35 mol%, 또는 약 37.5 mol%, 또는 약 40 mol%, 또는 약 42.5 mol%, 또는 약 45 mol%, 또는 약 47.5 mol%, 또는 약 50 mol%, 또는 약 52.5 mol%, 또는 약 55 mol%, 또는 약 57.5 mol%, 또는 약 60 mol%, 또는 약 62.5 mol%, 또는 약 65 mol%, 또는 약 67.5 mol%, 또는 약 70 mol%의 적어도 하나의 구조 지질을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시의 LNP는 적어도 약 2.5 mol%, 또는 적어도 약 5 mol%, 또는 적어도 약 7.5 mol%, 또는 적어도 약 10 mol%, 또는 적어도 약 12.5 mol%, 또는 적어도 약 15 mol%, 또는 적어도 약 17.5 mol%, 또는 적어도 약 20 mol%, 또는 적어도 약 22.5 mol%, 또는 적어도 약 25 mol%, 또는 적어도 약 27.5 mol%, 또는 적어도 약 30 mol%, 또는 적어도 약 32.5 mol%, 또는 적어도 약 35 mol%, 또는 적어도 약 37.5 mol%, 또는 적어도 약 40 mol%, 또는 적어도 약 42.5 mol%, 또는 적어도 약 45 mol%, 또는 적어도 약 47.5 mol%, 또는 적어도 약 50 mol%, 또는 적어도 약 52.5 mol%, 또는 적어도 약 55 mol%, 또는 적어도 약 57.5 mol%, 또는 적어도 약 60 mol%, 또는 적어도 약 62.5 mol%, 또는 적어도 약 65 mol%, 또는 적어도 약 67.5 mol%, 또는 적어도 약 70 mol%의 적어도 하나의 구조 지질을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시의 LNP는 약 2.5 mol%, 또는 약 5 mol%, 또는 약 7.5 mol%, 또는 약 10 mol%, 또는 약 12.5 mol%, 또는 약 15 mol%, 또는 약 17.5 mol%, 또는 약 20 mol%, 또는 약 22.5 mol%, 또는 약 25 mol%, 또는 약 27.5 mol%, 또는 약 30 mol%, 또는 약 32.5 mol%, 또는 약 35 mol%, 또는 약 37.5 mol%, 또는 약 40 mol%, 또는 약 42.5 mol%, 또는 약 45 mol%, 또는 약 47.5 mol%, 또는 약 50 mol%, 또는 약 52.5 mol%, 또는 약 55 mol%, 또는 약 57.5 mol%, 또는 약 60 mol%, 또는 약 62.5 mol%, 또는 약 65 mol%, 또는 약 67.5 mol%, 또는 약 70 mol%의 적어도 하나의 인지질을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시의 LNP는 적어도 약 2.5 mol%, 또는 적어도 약 5 mol%, 또는 적어도 약 7.5 mol%, 또는 적어도 약 10 mol%, 또는 적어도 약 12.5 mol%, 또는 적어도 약 15 mol%, 또는 적어도 약 17.5 mol%, 또는 적어도 약 20 mol%, 또는 적어도 약 22.5 mol%, 또는 적어도 약 25 mol%, 또는 적어도 약 27.5 mol%, 또는 적어도 약 30 mol%, 또는 적어도 약 32.5 mol%, 또는 적어도 약 35 mol%, 또는 적어도 약 37.5 mol%, 또는 적어도 약 40 mol%, 또는 적어도 약 42.5 mol%, 또는 적어도 약 45 mol%, 또는 적어도 약 47.5 mol%, 또는 적어도 약 50 mol%, 또는 적어도 약 52.5 mol%, 또는 적어도 약 55 mol%, 또는 적어도 약 57.5 mol%, 또는 적어도 약 60 mol%, 또는 적어도 약 62.5 mol%, 또는 적어도 약 65 mol%, 또는 적어도 약 67.5 mol%, 또는 적어도 약 70 mol%의 적어도 하나의 인지질을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시의 LNP는 약 0.25 mol%, 또는 약 0.5 mol%, 또는 약 0.75 mol%, 또는 약 1.0 mol%, 또는 약 1.25 mol%, 또는 약 1.5 mol%, 또는 약 1.75 mol%, 또는 약 2.0 mol%, 또는 적어도 약 또는 약 2.5 mol%, 또는 약 5 mol%의 적어도 하나의 PEG화 지질을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시의 LNP는 적어도 약 0.25 mol%, 또는 적어도 약 0.5 mol%, 또는 적어도 약 0.75 mol%, 또는 적어도 약 1.0 mol%, 또는 적어도 약 1.25 mol%, 또는 적어도 약 1.5 mol%, 또는 적어도 약 1.75 mol%, 또는 적어도 약 2.0 mol%, 또는 적어도 약 또는 적어도 약 2.5 mol%, 또는 적어도 약 5 mol%의 적어도 하나의 PEG화 지질을 포함할 수 있다.
구조 지질
일부 양태에서, 구조 지질은 스테로이드일 수 있다. 일부 양태에서, 구조 지질은 스테롤일 수 있다. 일부 양태에서, 구조 지질은 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 구조 지질은 에르고스테롤을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 구조 지질은 피토스테롤일 수 있다.
인지질
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “인지질”은, 가장 넓은 의미로는, 인산염 및 2개의 소수성 지방산 사슬을 포함하는 극성 (친수성) 헤드기(headgroup)를 포함하는 임의의 양친매성 분자를 지칭하도록 사용된다.
본 개시의 지질 나노입자의 일부 양태에서, 인지질은 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)을 포함할 수 있다.
본 개시의 지질 나노입자의 일부 양태에서, 인지질은 DOPC(1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린)을 포함할 수 있다.
본 개시의 지질 나노입자의 일부 양태에서, 인지질은 DSPC(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린)을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 인지질은 DDPC
(1,2-디데칸오일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DEPA-NA (1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스페이트 (나트륨 염)), DEPC (1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DEPE (1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DEPG-NA (1,2-디에루코일-sn-글리세로-3[포스포-rac-(1-글리세롤) (나트륨 염)), DLOPC (1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DLPA-NA (1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스페이트 (나트륨 염)), DLPC (1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DLPE (1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DLPG-NA (1,2-디라우로일-sn-글리세로-3[포스포-rac-(1-글리세롤) (나트륨 염)), DLPG-NH4 (1,2-디라우로일-sn-글리세로-3[포스포-rac-(1-글리세롤) (암모늄 염)), DLPS-NA (1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포세린 (나트륨 염)), DMPA-NA (1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스페이트 (나트륨 염)), DMPC (1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DMPE (1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DMPG-NA (1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3[포스포-rac-(1-글리세롤) (나트륨 염)), DMPG-NH4 (1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3[포스포-rac-(1-글리세롤) (암모늄 염)), DMPG-NH4/NA (1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3[포스포-rac-(1-글리세롤) (나트륨/암모늄 염)), DMPS-NA (1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포세린 (나트륨 염)), DOPA-NA (1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스페이트 (나트륨 염)), DOPC (1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DOPE (1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DOPG-NA (1,2-디올레일-sn-글리세로-3[포스포-rac-(1-글리세롤) (나트륨 염)), DOPS-NA (1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포세린 (나트륨 염)), DPPA-NA (1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스페이트 (나트륨 염)), DPPC (1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DPPE (1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DPPG-NA (1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3[포스포-rac-(1-글리세롤) (나트륨 염)), DPPG-NH4 (1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3[포스포-rac-(1-글리세롤) (암모늄 염)), DPPS-NA (1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포세린
(나트륨 염)), DSPA-NA (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스페이트 (나트륨 염)), DSPC (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DSPE (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DSPG-NA (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3[포스포-rac-(1-글리세롤) (나트륨 염)), DSPG-NH4 (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3[포스포-rac-(1-글리세롤) (암모늄 염)), DSPS-NA (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포세린 (나트륨 염)), EPC (Egg-PC), HEPC
(수소화된 난 PC), HSPC (수소화된 대두 PC), LYSOPC MYRISTIC (1-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린), LYSOPC PALMITIC (1-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린), LYSOPC STEARIC (1-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 우유 스핑고미엘린 (MPPC; 1-미리스토일-2-팔미토일-sn-글리세로 3-포스포콜린), MSPC (1-미리스토일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린), PMPC (1-팔미토일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린), POPC (1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린), POPE (1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), POPG-NA (1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3[포스포-rac-(1-글리세롤)] (나트륨 염)), PSPC (1-팔미토일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린), SMPC (1-스테아로일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린), SOPC (1-스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린), SPPC (1-스테아로일-2-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
PEG화 지질
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “PEG화 지질”은 변형된 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자인 (예를 들어 이에 공유 결합된) 임의의 지질을 지칭하도록 사용된다. 일부 양태에서, PEG화 지질은 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(이하 DMG-PEG2000으로 지칭됨)을 포함할 수 있다.
핵산
일부 양태에서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 지질 나노입자는 복수의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자 또는 복수의 핵산 분자는 지질 나노입자로 제형화될 수 있다.
일부 양태에서, 핵산 분자는 합성 핵산 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 합성 비-자연 발생 핵산 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 비-자연 발생 핵산 분자는 적어도 하나의 비-자연 발생 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 비-자연 발생 뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 비-자연 발생 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 변형된 핵산 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 변형된 핵산 분자는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 변형된 핵산일 수 있다.
일부 양태에서, 지질 나노입자는 지질 및 핵산을 특정 (중량/중량) 비로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 지질 및 핵산을 약 5:1 내지 약 15:1, 또는 약 10:1 내지 약 20:1, 또는 약 15:1 내지 약 25:1, 또는 약 20:1 내지 약 30:1, 또는 약 25:1 내지 약 35:1 또는 약 30:1 내지 약 40:1, 또는 약 35:1 내지 약 45:1, 또는 약 40:1 내지 약 50:1, 또는 약 45:1 내지 약 55:1, 또는 약 50:1 내지 약 60:1, 또는 약 55:1 내지 약 65:1, 또는 약 60:1 내지 약 70:1, 또는 약 65:1 내지 약 75:1, 또는 약 70:1 내지 약 80:1, 또는 약 75:1 내지 약 85:1, 또는 약 80:1 내지 약 90:1, 또는 약 85:1 내지 약 95:1, 또는 약 90:1 내지 약 100:1, 또는 약 95:1 내지 약 105:1, 또는 약 100:1 내지 약 110:1, 또는 약 105:1 내지 약 115:1, 또는 약 110:1 내지 약 120:1, 또는 약 115:1 내지 약 125:1, 또는 약 120:1 내지 약 130:1, 또는 약 125:1 내지 약 135:1, 또는 약 130:1 내지 약 140:1, 또는 약 135:1 내지 약 145:1, 또는 약 140:1 내지 약 150:1의 지질:핵산의 (중량/중량) 비로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 지질 나노입자는 지질 및 핵산을 약 5:1, 또는 약 10:1, 또는 약 15:1, 또는 약 20:1, 또는 약 25:1, 또는 약 30:1, 또는 약 35:1, 또는 약 40:1, 또는 약 45:1, 또는 약 50:1, 또는 약 55:1, 또는 약 60:1, 또는 약 65:1, 또는 약 70:1, 또는 약 75:1, 또는 약 80:1, 또는 약 85:1, 또는 약 90:1, 또는 약 95:1, 또는 약 100:1, 또는 약 105:1, 또는 약 110:1, 또는 약 115:1, 또는 약 120:1, 또는 약 125:1, 또는 약 130:1, 또는 약 135:1, 또는 약 140:1, 또는 약 145:1, 또는 약 150:1, 또는 약 200:1의 지질:핵산 (중량/중량) 비로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 지질 나노입자는 지질 및 핵산을 약 10:1, 또는 약 17.5:1, 또는 약 25:1의 지질:핵산의 (중량/중량) 비로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 핵산 분자는 RNA 분자일 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, RNA 분자는 mRNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, mRNA 분자는 당업계에 공지된 임의의 방법 및/또는 캡핑 모이어티를 사용하여 캡핑될 수 있다. mRNA 분자는 m7G(5’)ppp(5’)G 모이어티로 캡핑될 수 있다. m7G(5’)ppp(5’)G 모이어티는 본원에서 “Cap0”으로도 지칭된다. mRNA 분자는 CleanCap® 모이어티로 캡핑될 수 있다. CleanCap® 모이어티는 m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)(CleanCap® AG) 모이어티를 포함할 수 있다. CleanCap® 모이어티는 m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG) (CleanCap® GG) 모이어티를 포함할 수 있다. mRNA 분자는 역결합 방지 캡 유사체(ARCA®) 모이어티로 캡핑될 수 있다. ARCA® 모이어티는 m7(3’-O-메틸)G(5’)ppp(5’)G 모이어티를 포함할 수 있다. mRNA 분자는 CleanCap® 3’OMe 모이어티(CleanCap®+ARCA®)로 캡핑될 수 있다.
일부 양태에서, mRNA 분자는 적어도 하나의 변형된 핵산을 포함할 수 있다.
변형된 핵산은 5-메톡시우리딘(5moU), N 1-메틸슈도우리딘(me1Ψ), 슈도우리딘(Ψ), 5-메틸시티딘(5-MeC)을 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.
일부 양태에서, 핵산 분자는 DNA 분자일 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, DNA 분자는 DNA 플라스미드와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 원형 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 나노입자는 DNA 플라스미드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, DNA 분자는 선형화된 DNA 플라스미드와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 선형화된 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, DNA 분자는 개뼈 DNA(DoggyBone DNA) 분자일 수 있다. 일부 양태에서, DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다.
DNA 플라스미드는 길이가 적어도 약 0.25 kb, 또는 적어도 약 0.5 kb, 또는 적어도 약 0.75 kb, 또는 적어도 약 1.0 kb, 또는 적어도 약 1.25 kb, 또는 적어도 약 1.5 kb, 또는 적어도 약 1.75 kb, 또는 적어도 약 2.0 kb, 또는 적어도 약 2.25 kb, 또는 적어도 약 2.5 kb, 또는 적어도 약 2.75 kb, 또는 적어도 약 3.0 kb, 또는 적어도 약 3.25 kb, 또는 적어도 약 3.5 kb, 또는 적어도 약 3.75 kb, 또는 적어도 약 4.0 kb, 또는 적어도 약 4.25 kb, 또는 적어도 약 4.5 kb, 또는 적어도 약 4.75 kb, 또는 적어도 약 5.0 kb, 또는 적어도 약 5.25 kb, 또는 적어도 약 5.5 kb, 또는 적어도 약 5.75 kb, 또는 적어도 약 6.0 kb, 또는 적어도 약 6.25 kb, 또는 적어도 약 6.5 kb, 또는 적어도 약 6.75 kb, 또는 적어도 약 7.0 kb, 또는 적어도 약 7.25 kb, 또는 적어도 약 7.5 kb, 또는 적어도 약 7.75 kb, 또는 적어도 약 8.0 kb, 또는 적어도 약 8.25 kb, 또는 적어도 약 8.5 kb, 또는 적어도 약 8.75 kb, 또는 적어도 약 9.0 kb, 또는 적어도 약 9.25 kb, 또는 적어도 약 9.5 kb, 또는 적어도 약 9.75 kb, 또는 적어도 약 10.0 kb, 또는 적어도 약 10.25 kb, 또는 적어도 약 10.5 kb, 또는 적어도 약 10.75 kb, 또는 적어도 약 11.0 kb, 또는 적어도 약 11.25 kb, 또는 적어도 약 11.5 kb, 또는 적어도 약 11.75 kb, 또는 적어도 약 12 kb, 또는 적어도 약 12.25 kb, 또는 적어도 약 12.5 kb, 또는 적어도 약 12.75 kb, 또는 적어도 약 13.0 kb, 또는 적어도 약 13.25 kb, 또는 적어도 약 13.5 kb, 또는 적어도 약 13.75 kb, 또는 적어도 약 14.0 kb, 또는 적어도 약 14.25 kb, 또는 적어도 약 14.5 kb, 또는 적어도 약 14.75 kb, 또는 적어도 약 15.0 kb일 수 있다.
LNP 조성물
일부 양태에서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자, 적어도 하나의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질, 및 적어도 하나의 구조 지질을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자, 적어도 하나의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질, 및 적어도 하나의 PEG화 지질을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질은 ssPalmO-Ph-P4C2일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 구조 지질은 2개의 구조 지질의 혼합물일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 PEG화 지질은 2개의 PEG화 지질의 혼합물일 수 있다.
일부 양태에서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자, 적어도 하나의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질, 적어도 하나의 구조 지질, 적어도 하나의 PEG화 지질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질은 ssPalmO-Ph-P4C2일 수 있다.
일부 양태에서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자, 적어도 하나의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질, 적어도 하나의 구조 지질, 및 적어도 하나의 PEG화 지질을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질은 ssPalmO-Ph-P4C2일 수 있다.
일부 양태에서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자, 적어도 하나의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질, 적어도 하나의 구조 지질, 적어도 하나의 인지질, 적어도 하나의 PEG화 지질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질은 ssPalmO-Ph-P4C2일 수 있다.
일부 양태에서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자, 적어도 하나의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질, 적어도 하나의 구조 지질, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 PEG화 지질을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질은 ssPalmO-Ph-P4C2일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 28 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 60 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 10:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 29.5 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 0.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 32.92 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 32.92 mol%의 콜레스테롤, 약 32.92 mol%의 DOPE, 및 약 1.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 55:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 10 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 29.5 mol%의 콜레스테롤, 약 60 mol%의 DOPE, 및 약 0.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 28 mol% 내지 29 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 1.25 mol% 내지 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 28 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 28.75 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 1.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 27.84 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 56.25 mol%의 콜레스테롤, 약 13.46 mol%의 DOPE, 및 약 2.45 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 88:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 27.9 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 51.51 mol%의 콜레스테롤, 약 18.59 mol%의 DOPE, 및 약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 26.4 mol%의 콜레스테롤, 약 11.6 mol%의 DOPE, 및 약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 70:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 30.37 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 37.27 mol%의 콜레스테롤, 약 30.36 mol%의 DOPE, 및 약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol% 내지 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 30 mol% 내지 40 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol% 내지 10 mol%의 DOPE, DSPC, 또는 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w) 내지 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 32.5 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 32.5 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 30 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 30 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 40 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 40 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 37.5 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 37.5 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 32.5 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 32.5 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 30 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 30 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 40 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 40 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 37.5 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 37.5 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 32.5 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 32.5 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 30 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 30 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 40 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 40 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 37.5 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 37.5 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 49 mol% 내지 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 32 mol% 내지 44 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPC, 및 약 1.5 mol% 내지 약 3.0 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하며, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비는 약 40:1(w/w) 내지 약 100:1(w/w)이다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol% 내지 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 30 mol% 내지 40 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하며, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비는 약 75:1(w/w) 내지 약 100:1(w/w)이다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 40 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하며, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비는 약 75:1(w/w) 내지 약 100:1(w/w)이다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는
약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 37.5 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하며, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비는 약 75:1(w/w) 내지 약 100:1(w/w)이다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 30 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하며, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비는 약 75:1(w/w) 내지 약 100:1(w/w)이다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 49.4 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 44 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPC, 및 약 1.6 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 60:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 32.8 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DSPC, 및 약 2.2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 60:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 34 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 40:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 41.8 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 52.2 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 60:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 핵산 분자는 DNA 분자이다. 따라서, 본 개시는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자를 제공하고, 상기 지질 나노입자는 약 22.71 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 55.21 mol%의 콜레스테롤, 약 20.89 mol%의 DOPE, 및 약 1.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다(WO/2020/154645 참조). 일부 양태에서, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 50 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 38.6 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 1.4 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다(WO/2020/154645 참조). 일부 양태에서, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 200:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 34.69 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 39.74 mol%의 콜레스테롤, 약 24.69 mol%의 DOPE, 및 약 1.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 50:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 50 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 20 mol%의 콜레스테롤, 약 29.5 mol%의 DOPE, 및 약 0.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 50 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 20 mol%의 콜레스테롤, 약 28.7 mol%의 DOPE, 및 약 1.3 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 50:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol% 내지 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 30 mol% 내지 40 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol% 내지 10 mol%의 DOPE, DSPC, 또는 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w) 내지 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 32.5 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 32.5 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 30 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 30 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 40 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 40 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 37.5 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 37.5 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 32.5 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 32.5 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 30 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 30 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 40 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 40 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 37.5 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 37.5 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DSPC, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 32.5 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 32.5 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 30 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 30 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 40 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 40 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 37.5 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 37.5 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 공유적 폐쇄 말단형 DNA일 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 48 mol% 내지 약 61 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 31 mol% 내지 약 53 mol%의 콜레스테롤, 약 4 mol% 내지 약 11 mol%의 인지질, 및 약 0.5 mol% 내지 약 3 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 RNA 분자는 mRNA일 수 있다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 또는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPE일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPC일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DSPC일 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 30:1(w/w) 내지 약 110:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 40:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 60:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 41.8 mol% 내지 약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 32.8 mol% 내지 약 52.2 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol% 내지 약 10 mol%의 인지질, 및 약 1 mol% 내지 약 2.2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 RNA 분자는 mRNA일 수 있다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 또는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPE일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPC일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DSPC일 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 30:1(w/w) 내지 약 110:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 40:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 60:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 인지질, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 RNA 분자는 mRNA일 수 있다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 또는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPE일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPC일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DSPC일 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 30:1(w/w) 내지 약 110:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 40:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 60:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 49.4 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 44 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 인지질, 및 약 1.6 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 RNA 분자는 mRNA일 수 있다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 또는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPE일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPC일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DSPC일 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 30:1(w/w) 내지 약 110:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 40:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 60:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 32.8 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 인지질, 및 약 2.2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 RNA 분자는 mRNA일 수 있다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 또는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPE일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPC일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DSPC일 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 30:1(w/w) 내지 약 110:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 40:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 60:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 34 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 인지질, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 RNA 분자는 mRNA일 수 있다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 또는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPE일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPC일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DSPC일 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 30:1(w/w) 내지 약 110:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 40:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 60:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 41.8 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 52.2 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 인지질, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 RNA 분자는 mRNA일 수 있다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 또는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPE일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPC일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DSPC일 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 30:1(w/w) 내지 약 110:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 40:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 60:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 인지질, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 RNA 분자는 mRNA일 수 있다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 또는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPE일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPC일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DSPC일 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 30:1(w/w) 내지 약 110:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 40:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 60:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 53 mol% 내지 약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 34 mol% 내지 약 41 mol%의 콜레스테롤, 약 4 mol% 내지 약 11 mol%의 인지질, 및 약 0.5 mol% 내지 약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 RNA 분자는 mRNA일 수 있다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 또는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPE일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPC일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DSPC일 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 70:1(w/w) 내지 약 105:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol% 내지 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol% 내지 약 40 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol% 내지 약 10 mol%의 인지질, 및 약 0.5 mol% 내지 약 1.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 RNA 분자는 mRNA일 수 있다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 또는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPE일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPC일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DSPC일 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 70:1(w/w) 내지 약 105:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 인지질, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 RNA 분자는 mRNA일 수 있다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 또는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPE일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPC일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DSPC일 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 70:1(w/w) 내지 약 105:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 인지질, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 RNA 분자는 mRNA일 수 있다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 또는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPE일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPC일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DSPC일 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 70:1(w/w) 내지 약 105:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 40 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 인지질, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 RNA 분자는 mRNA일 수 있다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 또는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPE일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPC일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DSPC일 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 70:1(w/w) 내지 약 105:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2, 약 37.5 mol%의 콜레스테롤, 약 5 mol%의 인지질, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 RNA 분자는 mRNA일 수 있다. 일부 양태에서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 또는 DNA 나노플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPE일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DOPC일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질은 DSPC일 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 70:1(w/w) 내지 약 105:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)일 수 있다. 일부 양태에서, 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)일 수 있다.
본 개시의 일부 양태에서, 지질 나노입자 또는 복수의 지질 나노입자는 약 2℃ 내지 약 6℃, 또는 약 4℃에서 적어도 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일 또는 약 14일 동안 안정할 수 있다. 본 개시의 일부 양태에서, 지질 나노입자는 약 4℃에서 적어도 약 7일 동안 안정할 수 있다.
본 개시의 일부 양태에서, 지질 나노입자 또는 복수의 지질 나노입자는 약 2℃ 내지 약 6℃, 또는 약 4℃에서 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일 또는 약 14일 동안 안정할 수 있다. 본 개시의 일부 양태에서, 지질 나노입자 또는 복수의 지질 나노입자는 약 4℃에서 약 7일 동안 안정할 수 있다.
일부 양태에서, 지질 나노입자 또는 복수의 지질 나노입자는, (지질 나노입자의 경우) 직경이 또는 (복수의 지질 나노입자의 경우) 평균 직경이 약 0.5%, 또는 약 1%, 또는 약 5%, 또는 약 10%, 또는 약 15%, 또는 약 20%, 또는 약 25%, 또는 약 30%, 또는 약 35%, 또는 약 40%, 또는 약 45%, 또는 약 50% 이하로 변하는 경우, 안정하다고 말할 수 있다. 지질 나노입자의 직경 또는 복수의 나노입자의 평균 직경은 당업자가 이해할 수 있듯이, 당업계에 공지된 임의의 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 양태에서, 복수의 지질 나노입자는 복수의 지질 나노입자 또는 다분산성 지수(PDI)가 약 0.5%, 또는 약 1%, 또는 약 5%, 또는 약 10%, 또는 약 15%, 또는 약 20%, 또는 약 25%, 또는 약 30%, 또는 약 35%, 또는 약 40%, 또는 약 45%, 또는 약 50% 이하로 변하는 경우, 안정하다고 말할 수 있다. 복수의 지질 나노입자의 PDI는 당업자가 이해할 수 있듯이, 당업계에 공지된 임의의 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
본 개시의 C12-200 LNP
본 개시는 또한, 적어도 하나의 핵산 분자, 적어도 하나의 지질, 적어도 하나의 구조 지질, 적어도 하나의 인지질, 적어도 하나의 PEG화 지질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 지질 나노입자를 제공한다.
인지질은 1,1‘-((2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸) (2-하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아자네디일)비스(도데칸-2-올)로도 지칭되는 C12-200일 수 있다(이하 “C12-200”로서 지칭함)(미국 특허 제8,450,298호, 제8,969,353호, 제9,556,110호, 및 제10,189,802호 참조. 또한 미국 특허 공개 제2019-0177289호도 참조).
따라서, 본 개시의 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 25 mol% 내지 약 45 mol%의 C12-200, 약 32 mol% 내지 약 52 mol%의 적어도 하나의 구조 지질, 약 10 mol% 내지 약 30 mol%의 적어도 하나의 인지질, 약 0.1 mol% 내지 약 13 mol%의 적어도 하나의 PEG화 지질을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 30 mol% 내지 약 40 mol%의 C12-200, 약 37 mol% 내지 약 47 mol%의 적어도 하나의 구조 지질, 약 15 mol% 내지 약 25 mol%의 적어도 하나의 인지질, 및 약 0.1 mol% 내지 약 8 mol%의 적어도 하나의 PEG화 지질을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 32.5 mol% 내지 약 37.5 mol%의 C12-200, 약 39.5 mol% 내지 약 44.5 mol%의 적어도 하나의 구조 지질, 약 17.5 mol% 내지 약 22.5 mol%의 적어도 하나의 인지질, 및 약 0.5 mol% 내지 약 5.5 mol%의 적어도 하나의 PEG화 지질을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 35 mol%의 C12-200, 약 42 mol%의 적어도 하나의 구조 지질, 약 20 mol%의 적어도 하나의 인지질, 및 약 3 mol%의 적어도 하나의 PEG화 지질을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 35 mol%의 C12-200, 약 41.84 mol%의 적어도 하나의 구조 지질, 약 20 mol%의 적어도 하나의 인지질, 및 약 3.16 mol%의 적어도 하나의 PEG화 지질을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 전술한 지질 나노입자는 지질 및 핵산을 약 60:1 내지 약 100:1, 또는 약 70:1 내지 약 90:1, 또는 약 75:1 내지 약 85:1의 지질:핵산 (중량/중량) 비로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 전술한 지질 나노입자는 지질 및 핵산을 약 80:1의 지질:핵산 (중량/중량) 비로 포함할 수 있다. 인지질은 DOPE일 수 있다. 인지질은 DPSC일 수 있다. 인지질은 DOPC일 수 있다. 구조 지질은 콜레스테롤일 수 있다. PEG화 지질은 DMG-PEG2000일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 DNA 분자 또는 RNA 분자이다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 DNA 분자(예를 들어 개뼈 DNA 분자)이다. 따라서, 본 개시는 약 35 mol%의 C12-200, 약 42 mol%의 적어도 하나의 구조 지질, 약 20 mol%의 적어도 하나의 인지질, 및 약 3 mol%의 적어도 하나의 PEG화 지질을 포함하는 지질 나노입자를 제공하며, 여기서 적어도 하나의 핵산은 적어도 하나의 DNA 분자를 포함한다. 본 개시는 또한 약 35 mol%의 C12-200, 약 41.84 mol%의 적어도 하나의 구조 지질, 약 20 mol%의 적어도 하나의 인지질, 및 약 3.16 mol%의 적어도 하나의 PEG화 지질을 포함하는 지질 나노입자를 제공하며, 여기서 적어도 하나의 핵산은 적어도 하나의 DNA 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자이다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 DNA 분자는 DNA 나노플라스미드이다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 35 mol%의 적어도 하나의 적정 가능한 양이온성 지질, 약 42 mol%의 적어도 하나의 구조 지질, 약 20 mol%의 적어도 하나의 인지질, 및 약 3 mol%의 적어도 하나의 PEG화 지질을 포함할 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 핵산은 DNA 분자(예를 들어 개뼈 DNA 분자, DNA 나노플라스미드)이고, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 80:1 (중량/중량)이다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자는 약 35 mol%의 적어도 하나의 적정 가능한 양이온성 지질, 약 41.84 mol%의 적어도 하나의 구조 지질, 약 20 mol%의 적어도 하나의 인지질, 및 약 3.16 mol%의 적어도 하나의 PEG화 지질을 포함할 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 핵산은 DNA 분자(예를 들어 개뼈 DNA 분자, DNA 나노플라스미드)이고, 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 80:1 (중량/중량)이다. 일부 양태에서, 전술한 지질 나노입자는 적어도 하나의 DNA 분자(예: 개뼈 DNA 분자, DNA 나노플라스미드)를 적어도 하나의 간 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. 인지질은 DOPE일 수 있다. 인지질은 DPSC일 수 있다. 인지질은 DOPC일 수 있다. 구조 지질은 콜레스테롤일 수 있다. PEG화 지질은 DMG-PEG2000일 수 있다.
본 개시의 대안적인 LNP 구현예
1. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 23 mol% 내지 약 33 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 55 mol% 내지 약 65 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol% 내지 약 15 mol%의 DOPE; 및
약 0.01 mol% 내지 약 7 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하는, 조성물.
2. 구현예 1에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 25.5 mol% 내지 약 30.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 57.5 mol% 내지 약 62.5 mol%의 콜레스테롤;
약 7.5 mol% 내지 약 12.5 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 4.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 27 mol% 내지 약 29 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 59 mol% 내지 약 61 mol%의 콜레스테롤;
약 9 mol% 내지 약 11 mol%의 DOPE; 및
약 1 mol% 내지 약 3 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 28 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 60 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 5:1(w/w) 내지 약 15:1(w/w)인, 조성물.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 10:1(w/w)인, 조성물.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 95:1(w/w) 내지 약 105:1(w/w)인, 조성물.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
9. 구현예 1 내지 8에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 28 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 60 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 10:1(w/w)인, 조성물.
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 28 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 60 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
11. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 55 mol% 내지 약 65 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 24.5 mol% 내지 약 34.5 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol% 내지 약 15 mol%의 DOPE; 및
약 0.01 mol% 내지 약 5.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하는, 조성물.
12. 구현예 11에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 57.5 mol% 내지 약 62.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 27 mol% 내지 약 32 mol%의 콜레스테롤;
약 7.5 mol% 내지 약 12.5 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 3 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
13. 구현예 11 또는 구현예 12에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 59 mol% 내지 약 61 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 28.5 mol% 내지 약 30.5 mol%의 콜레스테롤;
약 9 mol% 내지 약 11 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 1.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
14. 구현예 11 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 29.5 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 0.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
15. 구현예 11 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 95:1(w/w) 내지 약 105:1(w/w)인, 조성물.
16. 구현예 11 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
17. 구현예 11 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 60 mol%의 Coatsome SS-OP;
약 29.5 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 0.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
18. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 27.92 mol% 내지 약 37.92 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 27.92 mol% 내지 약 37.92 mol%의 콜레스테롤;
약 27.92 mol% 내지 약 37.92 mol%의 DOPE; 및
약 0.01 mol% 내지 약 6.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하는, 조성물.
19. 구현예 18에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 30.42 mol% 내지 약 35.42 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 30.42 mol% 내지 약 35.42 mol%의 콜레스테롤;
약 30.42 mol% 내지 약 35.42 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 3.75 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
20. 구현예 18 또는 구현예 19에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 31.92 mol% 내지 약 32.92 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 31.92 mol% 내지 약 32.92 mol%의 콜레스테롤;
약 31.92 mol% 내지 약 32.92 mol%의 DOPE; 및
약 0.25 mol% 내지 약 2.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
21. 구현예 18 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 32.92 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 32.92 mol%의 콜레스테롤;
약 32.92 mol%의 DOPE; 및
약 1.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
22. 구현예 18 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 50:1(w/w) 내지 약 60:1(w/w)인, 조성물.
23. 구현예 18 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 55:1(w/w)인, 조성물.
24. 구현예 18 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 32.92 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 32.92 mol%의 콜레스테롤;
약 32.92 mol%의 DOPE; 및
약 1.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 55:1(w/w)인, 조성물.
25. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 5 mol% 내지 약 15 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 24.5 mol% 내지 약 34.5 mol%의 콜레스테롤;
약 55 mol% 내지 약 65 mol%의 DOPE; 및
약 0.01 mol% 내지 약 5.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하는, 조성물.
26. 구현예 25에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 7.5 mol% 내지 약 12.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 27 mol% 내지 약 32 mol%의 콜레스테롤;
약 57.5 mol% 내지 약 62.5 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 3 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
27. 구현예 25 또는 구현예 26에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 9 mol% 내지 약 11 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 28.5 mol% 내지 약 30.5 mol%의 콜레스테롤;
약 59 mol% 내지 약 61 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 1.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
28. 구현예 25 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 10 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 29.5 mol%의 콜레스테롤;
약 60 mol%의 DOPE; 및
약 0.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
29. 구현예 25 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 95:1(w/w) 내지 약 105:1(w/w)인, 조성물.
30. 구현예 25 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1인, 조성물.
31. 구현예 25 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 10 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 29.5 mol%의 콜레스테롤;
약 60 mol%의 DOPE; 및
약 0.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
32. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 55 mol% 내지 약 65 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 23 mol% 내지 약 33 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol% 내지 약 15 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 7 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하는, 조성물.
33. 구현예 32에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 57.5 mol% 내지 약 62.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 25.5 mol% 내지 약 30.5 mol%의 콜레스테롤;
약 7.5 mol% 내지 약 12.5 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 4.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
34. 구현예 32 또는 구현예 33에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 59 mol% 내지 약 61 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 27 mol% 내지 약 29 mol%의 콜레스테롤;
약 9 mol% 내지 약 11 mol%의 DOPE; 및
약 1 mol% 내지 약 3 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
35. 구현예 32 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 28 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
36. 구현예 32 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 95:1(w/w) 내지 약 105:1(w/w)인, 조성물.
37. 구현예 32 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
38. 구현예 32 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 28 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
39. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 55 mol% 내지 약 65 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 23.75 mol% 내지 약 33.75 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol% 내지 약 15 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 6.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하는, 조성물.
40. 구현예 39에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 57.5 mol% 내지 약 62.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 26.25 mol% 내지 약 31.25 mol%의 콜레스테롤;
약 7.5 mol% 내지 약 12.5 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 3.75 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
41. 구현예 39 또는 구현예 40에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 59 mol% 내지 약 61 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 27.75 mol% 내지 약 29.75 mol%의 콜레스테롤;
약 9 mol% 내지 약 11 mol%의 DOPE; 및
약 0.25 mol% 내지 약 2.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
42. 구현예 39 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 28.75 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 1.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
43. 구현예 39 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 95:1(w/w) 내지 약 105:1(w/w)인, 조성물.
44. 구현예 39 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
45. 구현예 39 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 28.75 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 1.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
46. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 17.71 mol% 내지 약 27.71 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 50.21 mol% 내지 약 60.21 mol%의 콜레스테롤;
약 23.83 mol% 내지 약 33.83 mol%의 DOPE; 및
약 0.01 mol% 내지 약 6.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하는, 조성물.
47. 구현예 46에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 20.21 mol% 내지 약 25.21 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 52.71 mol% 내지 약 57.71 mol%의 콜레스테롤;
약 26.33 mol% 내지 약 31.33 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 3.75 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
48. 구현예 46 또는 구현예 47에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 21.71 mol% 내지 약 23.71 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 54.21 mol% 내지 약 56.21 mol%의 콜레스테롤;
약 27.83 mol% 내지 약 29.83 mol%의 DOPE; 및
약 0.25 mol% 내지 약 2.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
49. 구현예 46 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 22.71 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 55.21 mol%의 콜레스테롤;
약 28.83 mol%의 DOPE; 및
약 1.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
50. 구현예 46 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 95:1(w/w) 내지 약 105:1(w/w)인, 조성물.
51. 구현예 46 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
52. 구현예 46 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 22.71 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 55.21 mol%의 콜레스테롤;
약 28.83 mol%의 DOPE; 및
약 1.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
53. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 45 mol% 내지 약 55 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 33.6 mol% 내지 약 43.6 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol% 내지 약 15 mol%의 DOPE; 및
약 0.01 mol% 내지 약 6.4 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하는, 조성물.
54. 구현예 53에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 47.5 mol% 내지 약 52.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 36.1 mol% 내지 약 41.1 mol%의 콜레스테롤;
약 7.5 mol% 내지 약 12.5 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 3.9 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
55. 구현예 53 또는 구현예 54에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 49 mol% 내지 약 51 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 37.6 mol% 내지 약 39.6 mol%의 콜레스테롤;
약 9 mol% 내지 약 11 mol%의 DOPE; 및
약 0.4 mol% 내지 약 2.4 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
56. 구현예 53 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 50 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 38.6 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 1.4 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
57. 구현예 53 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 195:1(w/w) 내지 약 205:1(w/w)인, 조성물.
58. 구현예 53 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 200:1(w/w)인, 조성물.
59. 구현예 53 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 50 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 38.6 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 1.4 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 200:1(w/w)인, 조성물.
60. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 29.69 mol% 내지 약 39.69 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 34.74 mol% 내지 약 44.74 mol%의 콜레스테롤;
약 19.69 mol% 내지 약 29.69 mol%의 DOPE; 및
약 0.01 mol% 내지 약 6.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하는, 조성물.
61. 구현예 60에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 32.19 mol% 내지 약 37.19 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 37.24 mol% 내지 약 42.24 mol%의 콜레스테롤;
약 22.19 mol% 내지 약 27.19 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 3.75 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
62. 구현예 60 또는 구현예 61에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 33.69 mol% 내지 약 35.69 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 38.74 mol% 내지 약 40.74 mol%의 콜레스테롤;
약 23.69 mol% 내지 약 25.69 mol%의 DOPE; 및
약 0.25 mol% 내지 약 2.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
63. 구현예 60 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 34.69 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 39.74 mol%의 콜레스테롤;
약 24.69 mol%의 DOPE; 및
약 1.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
64. 구현예 60 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 45:1(w/w) 내지 약 55:1(w/w)인, 조성물.
65. 구현예 60 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 50:1(w/w)인, 조성물.
66. 구현예 60 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 34.69 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 39.74 mol%의 콜레스테롤;
약 24.69 mol%의 DOPE; 및
약 1.25 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 50:1(w/w)인, 조성물.
67. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 45 mol% 내지 약 55 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 15 mol% 내지 약 25 mol%의 콜레스테롤;
약 24.5 mol% 내지 약 34.5 mol%의 DOPE; 및
약 0.01 mol% 내지 약 5.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하는, 조성물.
68. 구현예 67에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 47.5 mol% 내지 약 52.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 17.5 mol% 내지 약 22.5 mol%의 콜레스테롤;
약 27 mol% 내지 약 32 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 3 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
69. 구현예 67 또는 구현예 68에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 49 mol% 내지 약 51 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 19 mol% 내지 약 21 mol%의 콜레스테롤;
약 28.5 mol% 내지 약 30.5 mol%의 DOPE; 및
약 0.25 mol% 내지 약 1.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
70. 구현예 67 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 50 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 20 mol%의 콜레스테롤;
약 29.5 mol%의 DOPE; 및
약 0.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
71. 구현예 67 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 95:1(w/w) 내지 약 105:1(w/w)인, 조성물.
72. 구현예 67 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
73. 구현예 67 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 50 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 20 mol%의 콜레스테롤;
약 29.5 mol%의 DOPE; 및
약 0.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
74. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 49 mol% 내지 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 30 mol% 내지 약 40 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol% 내지 약 15 mol%의 DOPE; 및
약 0.01 mol% 내지 약 6 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하는, 조성물.
75. 구현예 74에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 51.5 mol% 내지 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 32.5 mol% 내지 약 37.5 mol%의 콜레스테롤;
약 7.5 mol% 내지 약 12.5 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 3.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
76. 구현예 74 또는 구현예 75에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 53 mol% 내지 약 55 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 59 mol% 내지 약 61 mol%의 콜레스테롤;
약 9 mol% 내지 약 11 mol%의 DOPE; 및
약 0.5 mol% 내지 약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
77. 구현예 74 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
78. 구현예 74 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 95:1(w/w) 내지 약 105:1(w/w)인, 조성물.
79. 구현예 74 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
80. 구현예 74 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
81. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 22.84 mol% 내지 약 32.84 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 51.25 mol% 내지 약 61.25 mol%의 콜레스테롤;
약 8.46 mol% 내지 약 18.46 mol%의 DOPE; 및
약 0.01 mol% 내지 약 7.45 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하는, 조성물.
82. 구현예 81에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 25.34 mol% 내지 약 30.34 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 53.75 mol% 내지 약 58.75 mol%의 콜레스테롤;
약 10.96 mol% 내지 약 15.96 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 4.95 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
83. 구현예 81 또는 구현예 82에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 26.84 mol% 내지 약 28.84 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 55.25 mol% 내지 약 57.25 mol%의 콜레스테롤;
약 12.46 mol% 내지 약 13.46 mol%의 DOPE; 및
약 1.45 mol% 내지 약 3.45 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
84. 구현예 81 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 27.84 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 56.25 mol%의 콜레스테롤;
약 13.46 mol%의 DOPE; 및
약 2.45 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
85. 구현예 81 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 83:1(w/w) 내지 약 93:1(w/w)인, 조성물.
86. 구현예 81 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 88:1(w/w)인, 조성물.
87. 구현예 81 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 27.84 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 56.25 mol%의 콜레스테롤;
약 13.46 mol%의 DOPE; 및
약 2.45 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 88:1(w/w)인, 조성물.
88. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 22.9 mol% 내지 약 32.9 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 46.51 mol% 내지 약 mol%의 콜레스테롤;
약 13.59 mol% 내지 약 23.59 mol%의 DOPE; 및
약 0.01 mol% 내지 약 7 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하는, 조성물.
89. 구현예 88에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 25.4 mol% 내지 약 30.4 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 49.01 mol% 내지 약 mol%의 콜레스테롤;
약 16.09 mol% 내지 약 21.09 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 4.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
90. 구현예 88 또는 구현예 89에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 26.9 mol% 내지 약 28.9 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 50.51 mol% 내지 약 52.51 mol%의 콜레스테롤;
약 17.59 mol% 내지 약 19.59 mol%의 DOPE; 및
약 1 mol% 내지 약 3 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
91. 구현예 88 내지 90 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 27.9 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 51.51 mol%의 콜레스테롤;
약 18.59 mol%의 DOPE; 및
약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
92. 구현예 88 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 95:1(w/w) 내지 약 105:1(w/w)인, 조성물.
93. 구현예 88 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
94. 구현예 88 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 27.9 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 51.51 mol%의 콜레스테롤;
약 18.59 mol%의 DOPE; 및
약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
95. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 55 mol% 내지 약 65 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 21.4 mol% 내지 약 31.4 mol%의 콜레스테롤;
약 6.6 mol% 내지 약 16.6 mol%의 DOPE; 및
약 0.01 mol% 내지 약 7 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하는, 조성물.
96. 구현예 95에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 57.5 mol% 내지 약 62.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 23.9 mol% 내지 약 28.9 mol%의 콜레스테롤;
약 9.1 mol% 내지 약 14.1 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 4.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
97. 구현예 95 또는 구현예 96에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 59 mol% 내지 약 61 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 25.4 mol% 내지 약 27.4 mol%의 콜레스테롤;
약 10.6 mol% 내지 약 12.6 mol%의 DOPE; 및
약 1 mol% 내지 약 3 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
98. 구현예 95 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 26.4 mol%의 콜레스테롤;
약 11.6 mol%의 DOPE; 및
약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
99. 구현예 95 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 65:1(w/w) 내지 약 75:1(w/w)인, 조성물.
100. 구현예 95 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 70:1(w/w)인, 조성물.
101. 구현예 95 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 26.4 mol%의 콜레스테롤;
약 11.6 mol%의 DOPE; 및
약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 70:1(w/w)인, 조성물.
102. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 25.37 mol% 내지 약 35.37 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 32.27 mol% 내지 약 42.27 mol%의 콜레스테롤;
약 25.36 mol% 내지 약 35.36 mol%의 DOPE; 및
약 0.01 mol% 내지 약 7 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하는, 조성물.
103. 구현예 102에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 27.87 mol% 내지 약 32.87 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 34.77 mol% 내지 약 39.77 mol%의 콜레스테롤;
약 27.86 mol% 내지 약 32.86 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 4.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
104. 구현예 102 또는 구현예 103에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 29.37 mol% 내지 약 31.37 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 36.27 mol% 내지 약 38.27 mol%의 콜레스테롤;
약 29.36 mol% 내지 약 31.36 mol%의 DOPE; 및
약 1 mol% 내지 약 3 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
105. 구현예 102 내지 104 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 30.37 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 37.27 mol%의 콜레스테롤;
약 30.36 mol%의 DOPE; 및
약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
106. 구현예 102 내지 105 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 95:1(w/w) 내지 약 105:1(w/w)인, 조성물.
107. 구현예 102 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
108. 구현예 102 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 30.37 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 37.27 mol%의 콜레스테롤;
약 30.36 mol%의 DOPE; 및
약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
109. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 45 mol% 내지 약 55 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 15 mol% 내지 약 25 mol%의 콜레스테롤;
약 23.7 mol% 내지 약 33.7 mol%의 DOPE; 및
약 0.01 mol% 내지 약 6.3 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하는, 조성물.
110. 구현예 109에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 47.5 mol% 내지 약 52.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 17.5 mol% 내지 약 22.5 mol%의 콜레스테롤;
약 26.2 mol% 내지 약 31.2 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 4 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
111. 구현예 109 또는 구현예 110에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 49 mol% 내지 약 51 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 19 mol% 내지 약 21 mol%의 콜레스테롤;
약 27.7 mol% 내지 약 29.7 mol%의 DOPE; 및
약 0.25 mol% 내지 약 2.3 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
112. 구현예 109 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 50 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 20 mol%의 콜레스테롤;
약 28.7 mol%의 DOPE; 및
약 1.3 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
113. 구현예 109 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 45:1(w/w) 내지 약 55:1(w/w)인, 조성물.
114. 구현예 109 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 50:1(w/w)인, 조성물.
115. 구현예 109 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 50 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 20 mol%의 콜레스테롤;
약 28.7 mol%의 DOPE; 및
약 1.3 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 50:1(w/w)인, 조성물.
116. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 49 mol% 내지 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 30 mol% 내지 약 40 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol% 내지 약 15 mol%의 인지질; 및
약 0.01 mol% 내지 약 6 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
117. 구현예 116에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 51.5 mol% 내지 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 32.5 mol% 내지 약 37.5 mol%의 콜레스테롤;
약 7.5 mol% 내지 약 12.5 mol%의 인지질; 및
약 0.1 mol% 내지 약 3.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
118. 구현예 116 또는 구현예 117에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 53 mol% 내지 약 55 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 34 mol% 내지 약 36 mol%의 콜레스테롤;
약 9 mol% 내지 약 11 mol%의 인지질; 및
약 0.25 mol% 내지 약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
119. 구현예 116 내지 118 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 인지질; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
120. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 54 mol% 내지 약 64 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 30 mol% 내지 약 40 mol%의 콜레스테롤;
약 0.1 mol% 내지 약 10 mol%의 인지질; 및
약 0.01 mol% 내지 약 6 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
121. 구현예 120에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 56.5 mol% 내지 약 61.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 32.5 mol% 내지 약 37.5 mol%의 콜레스테롤;
약 2.5 mol% 내지 약 7.5 mol%의 인지질; 및
약 0.1 mol% 내지 약 3.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
122. 구현예 120 또는 구현예 121에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 58 mol% 내지 약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 34 mol% 내지 약 36 mol%의 콜레스테롤;
약 4 mol% 내지 약 6 mol%의 인지질; 및
약 0.25 mol% 내지 약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
123. 구현예 120 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 인지질; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
124. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 49 mol% 내지 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol% 내지 약 45 mol%의 콜레스테롤;
약 0.1 mol% 내지 약 10 mol%의 인지질; 및
약 0.01 mol% 내지 약 6 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
125. 구현예 124에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 51.5 mol% 내지 약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 37.5 mol% 내지 약 42.5 mol%의 콜레스테롤;
약 2.5 mol% 내지 약 7.5 mol%의 인지질; 및
약 0.1 mol% 내지 약 3.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
126. 구현예 124 또는 구현예 125에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 53 mol% 내지 약 55 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 39 mol% 내지 약 41 mol%의 콜레스테롤;
약 4 mol% 내지 약 6 mol%의 인지질; 및
약 0.25 mol% 내지 약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
127. 구현예 124 내지 126 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 40 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 인지질; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
128. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 51.5 mol% 내지 약 61.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 32.5 mol% 내지 약 42.5 mol%의 콜레스테롤;
약 0.1 mol% 내지 약 10 mol%의 인지질; 및
약 0.01 mol% 내지 약 6 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
129. 구현예 128에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 54 mol% 내지 약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol% 내지 약 40 mol%의 콜레스테롤;
약 2.5 mol% 내지 약 7.5 mol%의 인지질; 및
약 0.1 mol% 내지 약 3.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
130. 구현예 128 또는 구현예 129에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 55.5 mol% 내지 약 57.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 36.5 mol% 내지 약 38.5 mol%의 콜레스테롤;
약 4 mol% 내지 약 6 mol%의 인지질; 및
약 0.25 mol% 내지 약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
131. 구현예 128 내지 130 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 37.5 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 인지질; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
132. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 44.4 mol% 내지 약 54.4 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 39 mol% 내지 약 49 mol%의 콜레스테롤;
약 0.1 mol% 내지 약 10 mol%의 인지질; 및
약 0.01 mol% 내지 약 6.6 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
133. 구현예 132에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 46.9 mol% 내지 약 51.9 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 41.5 mol% 내지 약 46.5 mol%의 콜레스테롤;
약 2.5 mol% 내지 약 7.5 mol%의 인지질; 및
약 0.1 mol% 내지 약 4.1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
134. 구현예 132 또는 구현예 133에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 48.4 mol% 내지 약 50.4 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 43 mol% 내지 약 45 mol%의 콜레스테롤;
약 4 mol% 내지 약 6 mol%의 인지질; 및
약 0.6 mol% 내지 약 2.6 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
135. 구현예 132 내지 134 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 49.4 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 44 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 인지질; 및
약 1.6 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
136. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 55 mol% 내지 약 65 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 27.8 mol% 내지 약 37.8 mol%의 콜레스테롤;
약 0.1 mol% 내지 약 10 mol%의 인지질; 및
약 0.01 mol% 내지 약 7.2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
137. 구현예 136에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 57.5 mol% 내지 약 62.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 30.3 mol% 내지 약 35.3 mol%의 콜레스테롤;
약 2.5 mol% 내지 약 7.5 mol%의 인지질; 및
약 0.1 mol% 내지 약 4.7 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
138. 구현예 136 또는 구현예 137에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 59 mol% 내지 약 61 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 31.8 mol% 내지 약 33.8 mol%의 콜레스테롤;
약 4 mol% 내지 약 6 mol%의 인지질; 및
약 1.2 mol% 내지 약 2.2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
139. 구현예 136 내지 138 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 32.8 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 인지질; 및
약 2.2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
140. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 55 mol% 내지 약 65 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 29 mol% 내지 약 39 mol%의 콜레스테롤;
약 0.1 mol% 내지 약 10 mol%의 인지질; 및
약 0.01 mol% 내지 약 6 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
141. 구현예 140에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 57.5 mol% 내지 약 62.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 31.5 mol% 내지 약 36.5 mol%의 콜레스테롤;
약 2.5 mol% 내지 약 7.5 mol%의 인지질; 및
약 0.1 mol% 내지 약 3.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
142. 구현예 140 또는 구현예 141에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 59 mol% 내지 약 61 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 33 mol% 내지 약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 4 mol% 내지 약 6 mol%의 인지질; 및
약 0.25 mol% 내지 약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
143. 구현예 140 내지 142 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 34 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 인지질; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
144. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 36.8 mol% 내지 약 46.8 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 47.2 mol% 내지 약 57.2 mol%의 콜레스테롤;
약 0.1 mol% 내지 약 10 mol%의 인지질; 및
약 0.01 mol% 내지 약 6 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
145. 구현예 144에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 39.3 mol% 내지 약 44.3 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 49.7 mol% 내지 약 54.7 mol%의 콜레스테롤;
약 2.5 mol% 내지 약 7.5 mol%의 인지질; 및
약 0.1 mol% 내지 약 3.5 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
146. 구현예 144 또는 구현예 145에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 40.8 mol% 내지 약 42.8 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 51.2 mol% 내지 약 53.2 mol%의 콜레스테롤;
약 4 mol% 내지 약 6 mol%의 인지질; 및
약 0.25 mol% 내지 약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
147. 구현예 144 내지 146 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 41.8 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 52.2 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 인지질; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
148. 구현예 116 내지 147 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 핵산 분자는 RNA 분자인, 조성물.
149. 구현예 148에 있어서, RNA 분자는 mRNA 분자인, 조성물.
150. 구현예 149에 있어서, mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함하는, 조성물.
151. 구현예 116 내지 147 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 핵산 분자는 DNA 분자인, 조성물.
152. 구현예 151에 있어서, DNA 분자는 개뼈 DNA 분자인, 조성물.
153. 구현예 151에 있어서, DNA 분자는 DNA 나노플라스미드인, 조성물.
154. 구현예 116 내지 153 중 어느 하나에 있어서, 인지질은 DOPE인, 조성물.
155. 구현예 116 내지 153 중 어느 하나에 있어서, 인지질은 DOPC인, 조성물.
156. 구현예 116 내지 153 중 어느 하나에 있어서, 인지질은 DSPC인, 조성물.
157. 구현예 116 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 55:1(w/w) 내지 약 110:1(w/w)인, 조성물.
158. 구현예 116 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 20:1(w/w)인, 조성물.
159. 구현예 116 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 40:1(w/w)인, 조성물.
160. 구현예 116 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 60:1(w/w)인, 조성물.
161. 구현예 116 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)인, 조성물.
162. 구현예 116 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 80:1(w/w)인, 조성물.
163. 구현예 116 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
164. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
165. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
166. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DSPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
167. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 DOPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
168. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 DSPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
169. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 40 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 DOPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
170. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 40 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 DSPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
171. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 37.5 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 DSPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
172. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 37.5 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 DOPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
173. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)인, 조성물.
174. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)인, 조성물.
175. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 DOPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)인, 조성물.
176. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
177. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 60:1(w/w)인, 조성물.
178. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 60:1(w/w)인, 조성물.
179. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 49.4 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 44 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 DOPC; 및
약 1.6 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 60:1(w/w)인, 조성물.
180. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 32.8 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 DSPC; 및
약 2.2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 60:1(w/w)인, 조성물.
181. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 34 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 DOPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 40:1(w/w)인, 조성물.
182. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 41.8 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 52.2 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 DSPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 60:1(w/w)인, 조성물.
183. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DSPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 60:1(w/w)인, 조성물.
184. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, mRNA는 5-메틸시티딘(5-MeC)인 시티딘 잔기를 포함하는, 조성물.
185. 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는:
약 30 mol% 내지 약 40 mol%의 C12-200;
약 36.84 mol% 내지 약 46.84 mol%의 콜레스테롤;
약 15 mol% 내지 약 25 mol%의 DOPE; 및
약 0.01 mol% 내지 약 8.16 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
186. 구현예 185에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 32.5 mol% 내지 약 37.5 mol%의 C12-200;
약 39.34 mol% 내지 약 44.34 mol%의 콜레스테롤;
약 17.5 mol% 내지 약 22.5 mol%의 DOPE; 및
약 0.1 mol% 내지 약 5.66 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
187. 구현예 185 또는 구현예 186에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 34 mol% 내지 약 36 mol%의 C12-200;
약 40.84 mol% 내지 약 42.84 mol%의 콜레스테롤;
약 19 mol% 내지 약 21 mol%의 DOPE; 및
약 2.16 mol% 내지 약 4.16 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
188. 구현예 185 내지 187 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는:
약 35 mol%의 C12-200;
약 41.84 mol%의 콜레스테롤;
약 20 mol%의 DOPE; 및
약 3.16 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는, 조성물.
189. 구현예 185 내지 188 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하는, 조성물.
190. 구현예 189에 있어서, DNA 분자는 개뼈 DNA 분자인, 조성물.
191. 구현예 190에 있어서, DNA 분자는 DNA 나노플라스미드인, 조성물.
192. 구현예 185 내지 191 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 70:1(w/w) 내지 약 90:1(w/w)인, 조성물.
193. 구현예 185 내지 191 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 20:1(w/w)인, 조성물.
194. 구현예 185 내지 191 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 40:1(w/w)인, 조성물.
195. 구현예 185 내지 191 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 60:1(w/w)인, 조성물.
196. 구현예 185 내지 191 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)인, 조성물.
197. 구현예 185 내지 191 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 80:1(w/w)인, 조성물.
198. 구현예 185 내지 191 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물.
본 개시의 약학적 조성물
일부 양태에서, 본 개시는 본 개시의 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시는 본 개시의 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 본 개시의 적어도 하나의 제1 나노입자 및 본 개시의 적어도 하나의 제2 나노입자를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 여기서 적어도 하나의 제1 나노입자는 적어도 하나의 트랜스포자아제(transposase)를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 제2 나노입자는 적어도 하나의 트랜스포존(transposon)을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시는 본 개시의 적어도 하나의 나노입자에 의해 접촉된 적어도 하나의 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 본 개시의 적어도 하나의 나노입자를 사용해 유전적으로 변형된 적어도 하나의 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 본 개시의 임의의 방법을 사용해 유전적으로 변형된 적어도 하나의 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 개시의 방법
본 개시는 적어도 하나의 핵산을 적어도 하나의 세포에 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 하나의 세포를 본 개시의 적어도 하나의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 개시는 적어도 하나의 핵산을 적어도 하나의 세포에 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 하나의 세포를 본 개시의 적어도 하나의 나노입자와 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 개시의 모든 방법, 조성물, 및 키트에 있어서, 적어도 하나의 세포는 간 세포(liver cell)일 수 있다. 간 세포는 간세포(hepatocyte), 간 성상 세포, 쿠퍼 세포, 또는 간 굴모양 혈관 내피 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.
본 개시의 임의의 방법의 일부 양태에서, 세포는 생체 내, 생체 외, 또는 시험관 내 세포일 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시의 방법 중 어느 하나는 생체 내, 생체 외, 또는 시험관 내에서 적용될 수 있다.
본 개시는 적어도 하나의 세포를 유전적으로 변형시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 하나의 세포를 본 개시의 적어도 하나의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 개시는 적어도 하나의 세포를 유전적으로 변형시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 하나의 세포를 본 개시의 적어도 하나의 지질 나노입자와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 세포를 유전적으로 변형시키는 단계는, 세포가 달리 정상적으로는 발현하지 않을 적어도 하나의 단백질을 세포가 발현하도록; 또는 세포가 적어도 하나의 단백질을 달리 정상적으로 발현하게 될 수준보다 더 높은 수준으로 세포가 적어도 하나의 단백질을 발현하도록; 또는 세포가 달리 정상적으로 발현하게 될 수준보다 더 낮은 수준으로 세포가 적어도 하나의 단백질을 발현하도록, 적어도 하나의 외인성 핵산을 세포에게 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 세포를 유전적으로 변형시키는 단계는, 적어도 하나의 외인성 핵산이 적어도 하나의 세포의 게놈 내로 통합되도록 적어도 하나의 외인성 핵산을 세포에 전달하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 세포를 본 개시의 적어도 하나의 지질 나노입자와 접촉시키면, 적어도 하나의 세포를 적어도 하나의 대조군 지질 나노입자와 접촉시킴으로써 유도된 외인성 단백질의 발현 수준과 비교하여 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배, 또는 적어도 약 6배, 또는 적어도 약 7배, 또는 적어도 약 8배, 또는 적어도 약 9배, 또는 적어도 약 10배, 또는 적어도 약 15배, 또는 적어도 약 20배, 또는 적어도 약 25배, 또는 적어도 약 30배, 또는 적어도 약 50배 증가한 수준으로 적어도 하나의 외인성 단백질을 발현하는 적어도 하나의 세포를 생성할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 복수의 세포를 수득할 수 있으며, 여기서 복수의 세포 중 적어도 약 1%, 또는 적어도 약 2%, 또는 적어도 약 3%, 또는 적어도 약 4%, 또는 적어도 약 5%, 또는 적어도 10%, 또는 적어도 15%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 25%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 35%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 45%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 55%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%는 본 개시의 나노입자를 통해 복수의 세포에 전달된 적어도 하나의 핵산에 암호화된 적어도 하나의 단백질을 발현한다.
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 복수의 세포를 수득할 수 있으며, 여기서 복수의 세포 중 적어도 약 1%, 또는 적어도 약 2%, 또는 적어도 약 3%, 또는 적어도 약 4%, 또는 적어도 약 5%, 또는 적어도 10%, 또는 적어도 15%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 25%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 35%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 45%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 55%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%는 간세포, 간 성상 세포, 쿠퍼 세포, 또는 간 굴모양 혈관 내피 세포이다.
일부 양태에서, 본 개시의 지질 나노입자로 제형화된 핵산 분자는 적어도 하나의 게놈 편집 조성물을 포함할 수 있다.
유전자 편집 조성물은, DNA 결합 도메인을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 뉴클레아제 단백질 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 암호화하는 서열은 DNA 서열, RNA 서열, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시의 지질 나노입자로 제형화된 게놈 편집 조성물은 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있으며, 여기서 융합 단백질은 뉴클레아제-불활성화 Cas(dCas) 단백질 또는 이의 뉴클레아제 도메인, 및 엔도뉴클레아제 단백질 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시의 지질 나노입자로 제형화된 게놈 편집 조성물은 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있으며, 여기서 융합 단백질은 (i) 불활성화된 Cas9(dCas9) 단백질 또는 불활성화된 이의 뉴클레아제 도메인, (ii) Clo051 단백질 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 핵 국소화 신호(NLS)를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 융합 단백질은 적어도 2개의 NLS를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 DNA, RNA, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 RNA를 포함할 수 있다. 예시적인 dCas9-Clo051 융합 단백질(당업계에서는 “Cas-CLOVER” 단백질로서 지칭됨) 및 상기 dCas9-Clo051 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 미국 특허 공개 제2022/0042038호에 상세히 기술되어 있으며, 동 문헌의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. Cas-CLOVER를 포함하는 유전자 편집 조성물, 및 유전자 편집을 위해 이들 조성물을 사용하는 방법은 미국 특허 공개 제2017/0107541호, 제2017/0114149호, 제2018/0187185호, 및 미국 특허 제10,415,024호에 기술되어 있으며, 이들 각각의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
일부 양태에서, Cas-CLOVER 단백질은 서열번호 31과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, Clo051 단백질 또는 뉴클레아제 도메인은 서열번호 32와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 불활성화된 Cas9(dCas9) 단백질 또는 불활성화된 이의 뉴클레아제 도메인은 서열번호 33과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시의 지질 나노입자로 제형화된 게놈 편집 조성물은 적어도 하나의 가이드 분자를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 가이드 분자는 가이드 RNA(gRNA) 분자일 수 있다.
따라서, 본 개시는 본원에 기술된 지질 나노입자 조성물 중 어느 하나를 제공하며, 여기서 지질 나노입자는 적어도 하나의 게놈 편집 조성물을 포함하고, 적어도 하나의 게놈 편집 조성물은: a) 다음을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자: (i) 불활성화된 Cas9(dCas9) 단백질 또는 불활성화된 이의 뉴클레아제 도메인, (ii) Clo051 단백질 또는 이의 뉴클레아제 도메인; 및 b) 적어도 하나의 gRNA 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 NLS를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 게놈 편집 조성물은 적어도 2개의 gRNA 분자 종을 포함할 수 있다.
본 개시는 대상체에서 적어도 하나의 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 본 개시의 적어도 하나의 조성물의 적어도 1회 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시는 대상체에서 적어도 하나의 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 본 개시의 적어도 하나의 나노 입자에 의해 접촉된 세포의 적어도 1회 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시는 대상체에서 적어도 하나의 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시의 조성물 및/또는 방법을 사용해 유전적으로 변형된 세포의 적어도 1회 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 질환은 대사성 간 장애(MLD)일 수 있다. MLD는 N-아세틸글루타메이트 합성효소 (NAGS) 결핍증, 카르바모일포스페이트 합성효소 I 결핍증 (CPSI 결핍증), 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 (OTC) 결핍증, 아르기니노숙시네이트 합성효소 결핍증(ASSD) (시트룰린 혈증 I), 시트린 결핍증 (시트룰린혈증 II), 아르기니노숙시네이트 리아제 결핍증(아르기니노숙신산뇨증), 아르기나제 결핍증(아르기닌 혈증), 오르니틴 전위효소 결핍증(HHH 증후군), 메틸말론산혈증(MMA) 진행성 가족성 간내 담즙정체 1형(PFIC1), 진행성 가족성 간내 담즙정체 1형(PFIC2), 진행성 가족성 간내 담즙정체 1형(PFIC3), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 질환은 혈우병일 수 있다. 일부 양태에서, 혈우병은 A형 혈우병이다. 일부 양태에서, 혈우병은 B형 혈우병이다. 일부 양태에서, 혈우병은 C형 혈우병이다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 질환은 LDL-콜레스테롤의 증가를 특징으로 하는 질환 및/또는 장애일 수 있다. 따라서, 본 개시는 LDL-콜레스테롤의 감소를 필요로 하는 대상체에서 이를 감소시키는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시의 지질 나노입자로 제형화된 핵산 분자는 적어도 하나의 이식 유전자 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 이식 유전자 서열은 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 이식 유전자 서열은 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 이식 유전자 서열은 적어도 하나의 트랜스포존을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 적어도 하나의 프로모터 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 치료 단백질은 적어도 하나의 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 적어도 하나의 역위 말단 반복(ITR)을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 제1 ITR 및 적어도 제2 ITR을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 적어도 하나의 절연 서열(insulator sequence)을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 제1 절연 서열 및 적어도 제2 절연 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 적어도 하나의 5’ UTR 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 적어도 하나의 3’ UTR 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 제1 3’ UTR 서열 및 적어도 제2 3’ UTR 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 적어도 하나의 폴리A 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 트랜스포존은 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 서열 및 3’ UTR 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 5’에서 3’ 방향으로, 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 서열 및 3’ UTR 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 서열 및 이어서 3’ UTR 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 트랜스포존은 제1 ITR, 제1 절연 서열, 적어도 하나의 프로모터 서열, 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 서열, 3’ UTR 서열, 폴리A 서열, 제2 절연 서열, 및 제2 ITR을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 5’에서 3’ 방향으로, 제1 ITR, 제1 절연 서열, 적어도 하나의 프로모터 서열, 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 서열, 3’ UTR 서열, 폴리A 서열, 제2 절연 서열, 및 제2 ITR을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 제1 ITR, 이어서 제1 절연 서열, 이어서 적어도 하나의 프로모터 서열, 이어서 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 서열, 이어서 3’ UTR 서열, 이어서 폴리A 서열, 이어서 제2 절연 서열, 및 이어서 제2 ITR을 포함할 수 있다.
전술한 트랜스포존의 일부 양태에서, 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 서열은 FVIII-BDD 폴리펩티드를 암호화하는 서열일 수 있으며, 여기서 FVIII-BDD 폴리펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, FVIII-BDD 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 서열번호 22의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
전술한 트랜스포존의 일부 양태에서, 3’ UTR 서열은 서열번호 27의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 비제한적인 예에서, 트랜스포존은 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 서열 및 3’ UTR 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 서열은 FVIII-BDD 폴리펩티드를 암호화하는 서열이고, FVIII-BDD 폴리펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하고, 3’ UTR 서열은 서열번호 27의 핵산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 트랜스포존은 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 서열, 제1 3’ UTR 서열, 및 제2 3’ UTR 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 5’에서 3’ 순서로, 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 서열, 제1 3’ UTR 서열, 및 제2 3’ UTR 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 서열, 이어서 제1 3’ UTR, 및 이어서 제2 3’ UTR 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 트랜스포존은 제1 ITR, 제1 절연 서열, 적어도 하나의 프로모터 서열, 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 서열, 제1 3’ UTR 서열, 제2 3’ UTR 서열, 폴리A 서열, 제2 절연 서열, 및 제2 ITR을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 5’에서 3’ 방향으로, 제1 ITR, 제1 절연 서열, 적어도 하나의 프로모터 서열, 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 서열, 제1 3’ UTR 서열, 제2 3’ UTR 서열, 폴리A 서열, 제2 절연 서열, 및 제2 ITR을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 제1 ITR, 이어서 제1 절연 서열, 이어서 적어도 하나의 프로모터 서열, 이어서 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 서열, 이어서 제1 3’ UTR 서열, 이어서 제2 3’ UTR 서열, 이어서 폴리A 서열, 이어서 제2 절연 서열, 및 이어서 제2 ITR을 포함할 수 있다.
전술한 트랜스포존의 일부 양태에서, 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 서열은 FVIII-BDD 폴리펩티드를 암호화하는 서열일 수 있으며, 여기서 FVIII-BDD 폴리펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, FVIII-BDD 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 서열번호 22의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
전술한 트랜스포존의 일부 양태에서, 제1 3’ UTR 서열은 AES 3’ UTR 서열일 수 있으며, 여기서 AES 3’ UTR 서열은 서열번호 25의 핵산 서열을 포함한다.
전술한 트랜스포존의 일부 양태에서, 제2 3’ UTR 서열은 mtRNR1 3' UTR 서열일 수 있으며, 여기서 mtRNR1 3' UTR 서열은 서열번호 26의 핵산 서열을 포함한다.
따라서, 비제한적인 예에서, 트랜스포존은 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 서열, 제1 3’ UTR 서열, 및 제2 3’ UTR 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 치료 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 서열은 FVIII-BDD 폴리펩티드를 암호화하는 서열이고, FVIII-BDD 폴리펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하고, 제1 3’ UTR 서열은 서열번호 25의 핵산 서열을 포함하고, 제2 3’ UTR 서열을 서열번호 26의 핵산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 트랜스포존은 서열번호 28과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 트랜스포존은 서열번호 34와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 트랜스포존은 서열번호 35와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 치료 단백질은 메틸말로닐-CoA 뮤타아제(MUT1) 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 치료 단백질은 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 치료 단백질은 인자 VIII (FVIII) 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, FVIII 폴리펩티드는 B-도메인이 결여된 FVIII 폴리펩티드(이하 FVIII-BDD 폴리펩티드로서 지칭됨)일 수 있다. 당업자가 이해할 수 있듯이, 인자 VIII-BDD 폴리펩티드는 시험관 내 및 생체 내에서 생물학적 활성을 보유한다(Kessler 등의 문헌[Haemophilia, 2005, 11(2): 84-91]).
일부 양태에서, FVIII-BDD 폴리펩티드는 서열번호 21과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, FVIII-BDD 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 22 또는 36으로 제시된 서열 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 치료 단백질은 인자 IX (FIX) 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, FIX 폴리펩티드는 R338L 돌연변이를 포함할 수 있다. 당업자가 이해할 수 있듯이, R338L 돌연변이는 Padua 돌연변이로서 지칭될 수 있다(VandenDriessche 및 Chuah의 문헌[Molecular Therapy, 2018, Vol. 26, Issue 1, P14-16]을 참조하고, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
본 개시는 대상체에서 적어도 하나의 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다: a) 트랜스포존(적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함함)을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물의 적어도 1회 치료적 유효량; 및 b) 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물의 적어도 1회 치료적 유효량.
전술한 방법의 일부 양태에서, 트랜스포존을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물은 본 개시의 적어도 하나의 LNP를 포함하는 조성물일 수 있으며, 여기서 LNP는 트랜스포존을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 트랜스포존은 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 본 개시는 대상체에서 적어도 하나의 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다: a) 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 본 개시의 LNP의 적어도 1회 치료적 유효량; 및 b) 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물의 적어도 1회 치료적 유효량.
전술한 방법의 일부 양태에서, 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물은 본 개시의 적어도 하나의 LNP를 포함하는 조성물일 수 있으며, 여기서 LNP는 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함한다. 따라서, 본 개시는 대상체에서 적어도 하나의 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다: a) 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물의 적어도 1회 치료적 유효량; 및 b) 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 본 개시의 LNP의 적어도 1회 치료적 유효량.
추가로, 본 개시는 대상체에서 적어도 하나의 질환을 치료하는 방법을 또한 제공하며, 상기 방법은 다음을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다: a) 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 본 개시의 LNP의 적어도 1회 치료적 유효량; 및 b) 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 본 개시의 LNP의 적어도 1회 치료적 유효량.
전술한 방법의 일부 양태에서, 적어도 하나의 트랜스포존을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물은, 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 아데노 연관 바이러스(AAV) 바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물일 수 있다. 따라서, 본 개시는 대상체에서 적어도 하나의 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다: a) 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 AAV 바이러스 벡터의 적어도 1회 치료적 유효량; 및 b) 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물의 적어도 1회 치료적 유효량.
추가로, 본 개시는 대상체에서 적어도 하나의 질환을 치료하는 방법을 또한 제공하며, 상기 방법은 다음을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다: a) 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 AAV 바이러스 벡터 입자의 적어도 1회 치료적 유효량; 및 b) 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 본 개시의 LNP의 적어도 1회 치료적 유효량.
전술한 방법의 일부 양태에서, 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물은 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 AAV 바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물일 수 있다. 따라서, 본 개시는 대상체에서 적어도 하나의 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다: a) 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 핵산 분자을 포함하는 조성물의 적어도 1회 치료적 유효량; 및 b) 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 AAV 바이러스 벡터 입자의 적어도 1회 치료적 유효량.
추가로, 본 개시는 대상체에서 적어도 하나의 질환을 치료하는 방법을 또한 제공하며, 상기 방법은 다음을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다: a) 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 본 개시의 LNP의 적어도 1회 치료적 유효량; 및 b) 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 AAV 바이러스 벡터의 적어도 1회 치료적 유효량.
비제한적인 예에서, OTC인 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 AAV 바이러스 벡터 입자는 서열번호 1~6 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
비제한적인 예에서, 인자 FIII인 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 AAV 바이러스 벡터 입자는 서열번호 8~14 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
비제한적인 예에서, 인자 IX인 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 AAV 바이러스 벡터 입자는 서열번호 15~20 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
비제한적인 예에서, 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 AAV 바이러스 벡터 입자는 서열번호 7과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
전술한 방법의 일부 양태에서, 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물; 및 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물이 동시에 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물; 및 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물이 순차적으로 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물; 및 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물이 시간적으로 근접하게 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “시간적 근접(temporal proximity)”은 하나의 치료 조성물(예를 들어 트랜스포존을 포함하는 조성물)의 투여가 다른 치료 조성물(예를 들어 트랜스포자아제를 포함하는 조성물)의 투여 전 또는 후의 일정 기간 내에 이루어져, 하나의 치료제의 치료 효과가 다른 하나의 치료제의 치료 효과와 중첩되는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 하나의 치료제의 치료 효과는 다른 하나의 치료제의 치료 효과와 완전히 중첩된다. 일부 구현예에서, “시간적 근접”은 하나의 치료제의 투여가 다른 치료제의 투여 전 또는 투여 후의 일정 기간 내에 이루어져, 하나의 치료제와 다른 하나의 치료제 간에 상승 효과가 생기는 것을 의미한다. “시간적 근접”은 다음을 포함하되 이에 한정되지 않는 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다: 치료제가 투여될 대상체의 나이, 성별, 체중, 유전적 배경, 의학적 상태, 질병 이력, 및 치료 이력; 치료 또는 완화 대상 질환 또는 병태; 달성하고자 하는 치료 결과; 치료제의 투여량, 투여 빈도, 및 투여 지속 기간; 치료제의 약동학 및 약력학; 및 치료제가 투여되는 경로(들). 일부 구현예에서, “시간적 근접”은 15분 이내, 30분 이내, 2시간 이내, 4시간 이내, 6시간 이내, 8시간 이내, 12시간 이내, 18시간 이내, 24시간 이내, 36시간 이내, 2일 이내, 3일 이내, 4일 이내, 5일 이내, 6일 이내, 1주 이내, 2주 이내, 3주 이내, 4주 이내, 6주 이내, 또는 8주 이내를 의미한다. 일부 구현예에서, 하나의 치료제의 다회 투여가 또 다른 치료제의 1회 투여와 시간적으로 근접하게 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 시간적 근접은 치료 사이클 동안 또는 투여 요법 내에서 변경될 수 있다.
비제한적인 예에서, 본 개시는 대상체에서 대사성 간 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다: a) 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하는 본 개시의 LNP의 적어도 1회 치료적 유효량; 및 b) 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하는 본 개시의 LNP의 적어도 1회 치료적 유효량. 일부 양태에서, 대사성 간 장애는 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 결핍일 수 있고, 적어도 하나의 치료 단백질은 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 대사성 간 장애는 메틸말론산혈증(MMA)일 수 있고, 적어도 하나의 치료 단백질은 메틸말로닐-CoA 돌연변이 효소(MUT1) 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
비제한적인 예에서, 본 개시는 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다: a) 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하는 본 개시의 LNP의 적어도 1회 치료적 유효량; 및 b) 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하는 본 개시의 LNP의 적어도 1회 치료적 유효량. 일부 양태에서, 혈우병은 A형 혈우병일 수 있고, 적어도 하나의 치료 단백질은 인자 VIII을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 혈우병은 B형 혈우병일 수 있고, 적어도 하나의 치료 단백질은 인자 IX를 포함할 수 있다.
비제한적인 예에서, 본 개시는 대상체에서 대사성 간 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다: a) 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 AAV 바이러스 벡터 입자의 적어도 1회 치료적 유효량; 및 b) 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하는 본 개시의 LNP의 적어도 1회 치료적 유효량. 일부 양태에서, 대사성 간 장애는 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 결핍일 수 있고, 적어도 하나의 치료 단백질은 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 대사성 간 장애는 메틸말론산혈증(MMA)일 수 있고, 적어도 하나의 치료 단백질은 메틸말로닐-CoA 돌연변이 효소(MUT1) 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
비제한적인 예에서, 본 개시는 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다: a) 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 AAV 바이러스 벡터 입자의 적어도 1회 치료적 유효량; 및 b) 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하는 본 개시의 LNP의 적어도 1회 치료적 유효량. 일부 양태에서, 혈우병은 A형 혈우병일 수 있고, 적어도 하나의 치료 단백질은 인자 VIII을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 혈우병은 B형 혈우병일 수 있고, 적어도 하나의 치료 단백질은 인자 IX를 포함할 수 있다.
본 개시는 LDL-콜레스테롤 증가를 특징으로 하는 질환 및/또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 게놈 편집 조성물을 포함하는 본 개시의 적어도 하나의 LNP를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 게놈 편집 조성물은 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하고, 융합 단백질은 (i) 불활성화된 Cas9(dCas9) 단백질 또는 불활성화된 이의 뉴클레아제 도메인, (ii) Clo051 단백질 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 융합 단백질은 Cas-CLOVER 단백질일 수 있다. 일부 양태에서, 게놈 편집 조성물은 pcsk9 유전자를 표적으로 하는 가이드 RNA(gRNA) 분자의 적어도 하나의 종을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 게놈 편집 조성물은 pcsk9 유전자를 표적으로 하는 적어도 2개의 gRNA 분자를 추가로 포함할 수 있다. pcsk9 유전자를 표적으로 하는 gRNA 분자는 서열번호 29~30 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
본 개시는 LDL-콜레스테롤 감소를 필요로 하는 대상체에서 이를 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 게놈 편집 조성물을 포함하는 본 개시의 적어도 하나의 LNP를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 게놈 편집 조성물은 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하고, 융합 단백질은 (i) 불활성화된 Cas9(dCas9) 단백질 또는 불활성화된 이의 뉴클레아제 도메인, (ii) Clo051 단백질 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 융합 단백질은 Cas-CLOVER 단백질일 수 있다. 일부 양태에서, 게놈 편집 조성물은 pcsk9 유전자를 표적으로 하는 가이드 RNA(gRNA) 분자의 적어도 하나의 종을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 게놈 편집 조성물은 pcsk9 유전자를 표적으로 하는 적어도 2개의 gRNA 분자를 추가로 포함할 수 있다. pcsk9 유전자를 표적으로 하는 gRNA 분자는 서열번호 29~30 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
본 개시의 치료 방법의 일부 양태에서, 본 개시의 적어도 하나의 조성물 및/또는 나노입자를 대상체에게 투여하면 대상체의 적어도 하나의 기관 및/또는 조직에서 외인성 단백질(예를 들어 치료 단백질, 트랜스포자아제 등)이 발현될 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시의 적어도 하나의 조성물 및/또는 나노입자를 투여하면 조직 및/또는 기관의 세포의 적어도 약 10%, 또는 적어도 15%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 35%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 55%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%에서 외인성 단백질이 발현된다.
일부 양태에서, 본 개시의 적어도 하나의 조성물 및/또는 나노입자를 투여하면 조직 및/또는 기관의 세포의 특정 하위 집합 또는 하위 집합의 적어도 약 10%, 또는 적어도 15%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 35%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 55%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%에서 외인성 단백질이 발현된다.
일부 양태에서, 본 개시의 적어도 하나의 조성물 및/또는 나노입자를 투여하면 조직 및/또는 기관에서 적어도 약 1일, 또는 적어도 약 2일, 또는 적어도 약 3일, 또는 적어도 약 4일, 또는 적어도 약 5일, 또는 적어도 약 6일, 또는 적어도 약 7일, 또는 적어도 약 8일, 또는 적어도 약 9일, 또는 적어도 약 10일 동안 외인성 단백질이 발현된다.
일부 양태에서, 본 개시의 적어도 하나의 조성물 및/또는 나노입자를 투여하면 조직 및/또는 기관의 세포의 특정 하위 집합 또는 하위 집합에서 적어도 약 1일, 또는 적어도 약 2일, 또는 적어도 약 3일, 또는 적어도 약 4일, 또는 적어도 약 5일, 또는 적어도 약 6일, 또는 적어도 약 7일, 또는 적어도 약 8일, 또는 적어도 약 9일, 또는 적어도 약 10일 동안 외인성 단백질이 발현된다.
일부 양태에서, 본 개시의 적어도 하나의 조성물 및/또는 나노입자를 투여하면 조직 및/또는 기관에서 약 1일 이하, 약 2일 이하, 약 3일 이하, 약 4일 이하, 약 5일 이하, 약 6일 이하, 또는 약 7일 이하, 또는 약 8일 이하, 또는 약 9일 이하, 또는 약 10일 이하 동안 외인성 단백질이 발현된다.
일부 양태에서, 본 개시의 적어도 하나의 조성물 및/또는 나노입자를 투여하면 조직 및/또는 기관의 세포의 특정 하위 집합 또는 하위 집합에서 약 1일 이하, 약 2일 이하, 약 3일 이하, 약 4일 이하, 약 5일 이하, 약 6일 이하, 또는 약 7일 이하, 또는 약 8일 이하, 또는 약 9일 이하, 또는 약 10일 이하 동안 외인성 단백질이 발현된다.
일부 양태에서, 본 개시의 조성물을 투여한 후 내인성 단백질을 발현하는 세포의 백분율은 대조군 나노입자를 포함하는 조성물을 투여한 후 내인성 단백질을 발현하는 세포의 백분율과 비교했을 때 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배, 또는 적어도 약 6배, 또는 적어도 약 7배, 또는 적어도 약 8배, 또는 적어도 약 9배, 또는 적어도 약 10배, 또는 적어도 약 15배, 또는 적어도 약 20배, 또는 적어도 약 25배, 또는 적어도 약 30배, 또는 적어도 약 50배 증가할 수 있다.
일부 양태에서, 조직 및/또는 기관은 간일 수 있다. 일부 양태에서, 세포의 특정 하위 집합 또는 하위 집합은 간세포, 간 성상 세포, 쿠퍼 세포, 간 굴모양 혈관 내피 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.
일부 양태에서, 본 개시의 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물을 투여하는 것은 적어도 하나의 대조군 지질 나노입자를 포함하는 조성물을 투여하는 것보다 독성이 덜하다.
일부 양태에서, 독성의 감소는 본 개시의 적어도 하나의 지질 나노입자를 투여한 후 적어도 하나의 간 효소 수준의 증가가 약화되는 것으로서 나타날 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 간 효소는 아스파르테이트 아미노전이효소(AST), 알라닌 아미노전이효소(ALT), 및 알칼리 인산분해효소(ALP) 중 하나 이상일 수 있다.
일부 양태에서, 독성의 감소는 본 개시의 적어도 하나의 지질 나노입자를 투여한 후 적어도 하나의 전염증성 사이토카인 수준의 증가가 약화되는 것으로서 나타날 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 전염증성 사이토카인은 인터류킨-6(IL-6), 인터페론 감마(INF-G), 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-a) 중 하나 이상일 수 있다.
일부 양태에서, 독성의 감소는 본 개시의 적어도 하나의 지질 나노입자를 투여한 후 체중의 감소가 약화되는 것으로서 나타날 수 있다.
일부 양태에서, 대조군 지질 나노입자는, 양이온성 지질이 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질이 아니라는 것을 제외하면 그 외에는 동일한 지질 나노입자이다.
일부 양태에서, 대조군 지질 나노입자는 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하지 않는 지질 나노입자이다.
일부 양태에서, 대조군 지질 나노입자는 ssPalmO-Ph-P4C2를 포함하지 않는 지질 나노입자이다.
일부 양태에서, 대조군 지질 나노입자는, 양이온성 지질이 ssPalmO-Ph-P4C2가 아닌 지질이라는 것을 제외하면 그 외에는 동일한 지질 나노입자이다.
일부 양태에서, 대조군 지질 나노입자는 더 많은 양의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하지 않는 지질 나노입자이다.
일부 양태에서, 대조군 지질 나노입자는 더 적은 양의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하지 않는 지질 나노입자이다.
일부 양태에서, 대조군 지질 나노입자는 이전에 당업계에 개시된 지질 나노입자 조성물을 포함한다.
일부 양태에서, 대조군 지질 나노입자는 본 개시의 지질 나노입자와 동일한 투여량으로 대상체에게 투여된다.
일부 양태에서, 본 개시의 지질 나노입자는 미세유체-혼합 플랫폼을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 양태에서, 미세유체-혼합 플랫폼은 비-난류 미세유체 혼합 플랫폼일 수 있다.
일부 양태에서, 미세유체 혼합 플랫폼은, 미세유체 장치를 사용하여 나노입자의 지질 성분을 포함하는 혼화성 용매상을 지질 나노입자 화물(예를 들어 핵산, DNA, mRNA 등)을 포함하는 수성상과 합침으로써 본 개시의 지질 나노입자를 생산할 수 있다. 일부 양태에서, 혼화성 용매상 및 수성상은 2개의 상의 즉각적인 혼합을 허용하지 않는 층상 흐름 조건 하에 미세유체 장치에서 혼합된다. 2개의 상이 층상 흐름 하에 미세유체 채널을 이동하므로, 채널 내 미세 특징부가 혼합을 조절하고 균질화하여 본 개시의 지질 나노입자를 생산할 수 있게 한다.
일부 양태에서, 미세유체 혼합 플랫폼은 NanoAssemblr® Spark (Precision NanoSystems), the NanoAssemblr® Ignite™ (Precision NanoSystems), the NanoAssemblr® Benchtop (Precision NanoSystems), the NanoAssemblr® Blaze (Precision NanoSystems), 또는 the NanoAssemblr® GMP System(Precision NanoSystems)을 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.
일부 양태에서, 본 개시의 지질 나노입자는 미세유체-혼합 플랫폼을 사용하여 생산될 수 있고, 여기서 미세유체 혼합 플랫폼은 적어도 약 2.5 ml/분, 또는 적어도 약 5 ml/분, 또는 적어도 약 7.5 ml/분, 또는 적어도 약 10 ml/분, 또는 적어도 약 12.5 ml/분, 또는 적어도 약 15 ml/분, 또는 적어도 약 17.5 ml/분, 또는 적어도 약 20 ml/분, 또는 적어도 약 22.5 ml/분, 또는 적어도 약 25 ml/분, 또는 적어도 약 27.5 ml/분, 또는 적어도 약 30 ml/분의 속도로 혼합한다.
일부 양태에서, 본 개시의 지질 나노입자는 T-믹서를 사용하여 생산될 수 있고, 여기서 T-믹서는 적어도 약 2.5 ml/분, 또는 적어도 약 5 ml/분, 또는 적어도 약 7.5 ml/분, 또는 적어도 약 10 ml/분, 또는 적어도 약 12.5 ml/분, 또는 적어도 약 15 ml/분, 또는 적어도 약 17.5 ml/분, 또는 적어도 약 20 ml/분, 또는 적어도 약 22.5 ml/분, 또는 적어도 약 25 ml/분, 또는 적어도 약 27.5 ml/분, 또는 적어도 약 30 ml/분의 속도로 혼합한다.
일부 양태에서, 본 개시의 지질 나노입자는 미세유체-혼합 플랫폼을 사용하여 생산될 수 있고, 여기서 미세유체 혼합 플랫폼은 약 10:1, 또는 약 9:1, 또는 약 8:1, 또는 약 7:1, 또는 약 6:1, 또는 약 5:1, 또는 약 4:1, 또는 약 3:1, 또는 약 2:1, 또는 약 1:1, 또는 약 1:2, 또는 약 1:3, 또는 약 1:4, 또는 약 1:5, 또는 약 1:6, 또는 약 1:7, 또는 약 1:8, 또는 약 1:9, 또는 약 1:10의 용매상:수성상(v/v)의 비율로 혼화성 용매상과 수성상을 혼합한다.
일부 양태에서, 본 개시의 지질 나노입자는 T-믹서를 사용하여 생산될 수 있고, 여기서 T-믹서는 약 10:1, 또는 약 9:1, 또는 약 8:1, 또는 약 7:1, 또는 약 6:1, 또는 약 5:1, 또는 약 4:1, 또는 약 3:1, 또는 약 2:1, 또는 약 1:1, 또는 약 1:2, 또는 약 1:3, 또는 약 1:4, 또는 약 1:5, 또는 약 1:6, 또는 약 1:7, 또는 약 1:8, 또는 약 1:9, 또는 약 1:10의 용매상:수성상(v/v)의 비율로 혼화성 용매상과 수성상을 혼합한다.
piggyBac ITR 서열
일부 양태에서, 핵산 분자는 piggyBac ITR 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 제1 piggyBac ITR 서열 및 제2 piggyBac ITR 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, piggyBac ITR 서열은 당업계에 공지된 임의의 piggyBac ITR 서열을 포함할 수 있다.
본 개시의 방법의 일부 양태에서, 제1 piggyBac ITR 서열 및/또는 제2 piggyBac ITR 서열과 같은 piggyBac ITR 서열은 슬리핑 뷰티 트랜스포존(Sleeping Beauty transposon) ITR, 헬레이저 트랜스포존(Helraiser transposon) ITR, Tol2 트랜스포존 ITR, TcBuster 트랜스포존 ITR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
절연 서열 (Insulator Sequences)
일부 양태에서, 절연 서열은 서열번호 146~147로 제시된 서열 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
프로모터 서열
일부 양태에서, 핵산 분자는 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 프로모터 서열은 당업계에 공지된 임의의 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 프로모터 서열은 당업계에 공지된 임의의 간-특이적 프로모터 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 프로모터 서열은 하이브리드 간 프로모터(HLP)를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 프로모터 서열은 LP1 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 프로모터 서열은 백혈구 특이적 발현의 pp52(LSP1) 긴 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 프로모터 서열은 티록신 결합 글로불린(TBG) 프로모터를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 프로모터 서열은 wTBG 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 프로모터 서열은 간 결합 다발(HCB) 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 프로모터 서열은 2xApoE-hAAT 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 프로모터 서열은 백혈구 특이적 발현의 pp52(LSP1) + 키메라 인트론 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 프로모터 서열은 거대세포바이러스(CMV) 프로모터를 포함할 수 있다.
이식 유전자 서열
일부 양태에서, 이식 유전자 서열은 메틸말로닐-CoA 돌연변이효소(MUT1) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, MUT1 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 40~51로 제시된 서열 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 이식 유전자 서열은 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, MUT1 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 56~59로 제시된 서열 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 이식 유전자 서열은 iCAS9 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 이식 유전자 서열은 인자 VIII(FVIII) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, FVIII 폴리펩티드는 B-도메인이 결여된 FVIII 폴리펩티드(이하 FVIII-BDD 폴리펩티드로서 지칭됨)일 수 있다.
일부 양태에서, 이식 유전자 서열은 FVIII-BDD 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 이식 유전자 서열은 FVIII-BDD 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 FVIII-BDD 폴리펩티드는 서열번호 21과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 양태에서, FVIII-BDD 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 22로 제시된 서열 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 이식 유전자 서열은 인자 IX(FIX) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, FIX 폴리펩티드는 R338L 돌연변이를 포함할 수 있다. 당업자가 이해할 수 있듯이, R338L 돌연변이는 Padua 돌연변이로서 지칭될 수 있다. 일부 양태에서, FIX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 65의 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 이식 유전자 서열은 당업계에 공지된 방법에 따라 코돈 최적화될 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 이식 유전자 서열은 동일한 폴리뉴클레오티드에 존재하는 적어도 하나의 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
치료 단백질
일부 양태에서, 치료 단백질은 메틸말로닐-CoA 뮤타아제(MUT1) 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, MUT1 폴리펩티드는 서열번호 52~55 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 치료 단백질은 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, OTC 폴리펩티드는 서열번호 60~63 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 치료 단백질은 인자 VIII (FVIII) 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, FVIII 폴리펩티드는 B-도메인이 결여된 FVIII 폴리펩티드(이하 FVIII-BDD 폴리펩티드로서 지칭됨)일 수 있다.
일부 양태에서, 치료 단백질은 인자 IX (FIX) 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, FIX 폴리펩티드는 R338L 돌연변이를 포함할 수 있다. 당업자가 이해할 수 있듯이, R338L 돌연변이는 Padua 돌연변이로서 지칭될 수 있다. 일부 양태에서, FIX 폴리펩티드는 서열번호 64 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
3’ UTR 서열
일부 양태에서, 3’ UTR 서열은 AES 3’ UTR 서열일 수 있다. AES 3’ UTR 서열은 서열번호 25과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 3’ UTR 서열은 mtRNR1 3’ UTR 서열일 수 있다. mtRNR1 3’ UTR 서열은 서열번호 26과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 3’ UTR 서열은 서열번호 27과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
폴리A 서열
일부 양태에서, 핵산 분자는 폴리A 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리A 서열은 당업계에 공지된 임의의 폴리A 서열을 포함할 수 있다.
자가 절단 펩티드 서열
일부 양태에서, 핵산 분자는 자가 절단 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 자가 절단 펩티드 서열은 당업계에 공지된 임의의 자가 절단 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 자가 절단 펩티드 서열은 당업계에 공지된 2A 자가 절단 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 자가 절단 펩티드의 비제한적인 예는 T2A 펩티드, GSG-T2A 펩티드, E2A 펩티드, GSG-E2A 펩티드, F2A 펩티드, GSG-F2A 펩티드, P2A 펩티드, 또는 GSG-P2A 펩티드를 포함한다.
일부 양태에서, 자가 절단 펩티드 서열은 T2A 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 자가 절단 펩티드 서열은 GSG-T2A 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 자가 절단 펩티드 서열은 E2A 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 자가 절단 펩티드 서열은 GSG-E2A 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 자가 절단 펩티드 서열은 F2A 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 자가 절단 펩티드 서열은 GSG-F2A 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 자가 절단 펩티드 서열은 P2A 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 자가 절단 펩티드 서열은 GSG-P2A 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
전위 시스템
일부 양태에서, 핵산 분자는 제1 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존 또는 나노트랜스포존을 포함할 수 있으며, 여기서 제1 핵산 서열은: (a) 제1 역위 말단 반복(ITR) 또는 제1 ITR을 암호화하는 서열, (b) 제2 ITR 또는 제2 ITR을 암호화하는 서열, 및 (c) ITR 내 서열 또는 ITR 내 서열을 암호화하는 서열을 포함한다(ITR 내 서열은 트랜스포존 서열 또는 트랜스포존을 암호화하는 서열을 포함함).
일부 양태에서, 핵산 분자는 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존 또는 나노트랜스포존을 포함할 수 있으며, 여기서 제1 핵산 서열은: (a) 제1 역위 말단 반복(ITR) 또는 제1 ITR을 암호화하는 서열, (b) 제2 ITR 또는 제2 ITR을 암호화하는 서열, 및 (c) ITR 내 서열 또는 ITR 내 서열을 암호화하는 서열을 포함하고(ITR 내 서열은 트랜스포존 서열 또는 트랜스포존을 암호화하는 서열을 포함함), 제2 핵산 서열은 ITR 내 서열 또는 ITR 내 서열을 암호화하는 서열을 포함하고, ITR 내 서열의 길이는 700 뉴클레오티드 이하이다.
본 개시의 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 2개의 시스 조절 절연 요소가 측면에 위치한 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 DNA 트랜스포존일 수 있다. 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 트랜스포자아제를 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드를 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포자아제를 암호화하는 서열은 DNA 서열 또는 RNA 서열일 수 있다. 바람직하게는, 트랜스포자아제를 암호화하는 서열은 mRNA 서열이다.
본 개시의 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 piggyBac™(PB) 트랜스포존일 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존이 PB 트랜스포존인 경우, 트랜스포자아제는 piggyBac™(PB) 트랜스포자아제, piggyBac-유사(PBL) 트랜스포자아제, 또는 Super piggyBac™(SPB 또는 sPB) 트랜스포자아제이다. 바람직하게는, SPB 트랜스포자아제를 암호화하는 서열은 mRNA 서열이다.
PB 트랜스포존 및 PB, PBL, 및 SPB 트랜스포자아제의 비제한적인 예는 미국 특허 제6,218,182호; 미국 특허 제6,962,810호; 미국 특허 제8,399,643호, 및 PCT 공개 제WO 2010/099296호에 상세히 기술되어 있다.
PB, PBL, 및 SPB 트랜스포자아제는 트랜스포존의 단부에 있는 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복 서열(ITR)을 인식하고, 염색체 부위 내의 서열 5’-TTAT-3’(TTAT 표적 서열)에 있는 ITR 사이에, 또는 염색체 부위 내의 서열 5’-TTAA-3’(TTAA 표적 서열)에 있는 ITR 사이에 그 내용을 삽입한다. PB 또는 PBL 트랜스포존의 표적 서열은 5’-CTAA-3’, 5’-TTAG-3’, 5’-ATAA-3’, 5’-TCAA-3’, 5’AGTT-3’, 5’-ATTA-3’, 5’-GTTA-3’, 5’-TTGA-3’, 5’-TTTA-3’, 5’-TTAC-3’, 5’-ACTA-3’, 5’-AGGG-3’, 5’-CTAG-3’, 5’-TGAA-3’, 5’-AGGT-3’, 5’-ATCA-3’, 5’-CTCC-3’, 5’-TAAA-3’, 5’-TCTC-3’, 5’TGAA-3’, 5’-AAAT-3’, 5’-AATC-3’, 5’-ACAA-3’, 5’-ACAT-3’, 5’-ACTC-3’, 5’-AGTG-3’, 5’-ATAG-3’, 5’-CAAA-3’, 5’-CACA-3’, 5’-CATA-3’, 5’-CCAG-3’, 5’-CCCA-3’, 5’-CGTA-3’, 5’-GTCC-3’, 5’-TAAG-3’, 5’-TCTA-3’, 5’-TGAG-3’, 5’-TGTT-3’, 5’-TTCA-3’5’-TTCT-3’, 및 5’-TTTT-3’을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. PB 또는 PBL 트랜스포존 시스템은 ITR 사이에 포함될 수 있는 관심 유전자에 대해 페이로드 한계를 갖지 않는다.
하나 이상의 PB, PBL, 및 SPB 트랜스포자아제에 대한 예시적인 아미노산 서열은 미국 특허 제6,218,185호; 미국 특허 제6,962,810호, 및 미국 특허 제8,399,643호에 개시되어 있다.
PB 또는 PBL 트랜스포자아제는 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 2개 이상에서, 3개 이상에서, 또는 각각에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 트랜스포자아제는, 위치 30에서의 아미노산 치환이 발린(V)에서 이소류신(I)으로의 치환일 수 있고, 위치 165에서 아미노산 치환이 세린(S)에서 글리신(G)으로의 치환일 수 있고, 위치 282에서 아미노산 치환이 발린(V)에서 메티오닌(M)으로의 치환일 수 있고, 위치 538에서의 아미노산 치환이 리신(K)에서 아스파라긴(N)으로의 치환일 수 있는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 SPB 트랜스포자아제일 수 있다.
트랜스포자아제가 위치 30, 165, 282, 및/또는 538에서 전술한 돌연변이를 포함하는 소정의 양태에서, PB, PBL, 및 SPB 트랜스포자아제는 PCT 공개 제WO 2019/173636호 및 PCT/US2019/049816에 보다 상세하게 기술된 것과 같이 위치 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570, 및 591 중 하나 이상에서의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다.
PB, PBL, 또는 SPB 트랜스포자아제는 PCT 공개 제WO 2019/173636호 및 PCT/US2019/049816에 보다 상세히 기술된 것과 같이 곤충, 척추동물, 갑각류, 또는 피낭동물(urochordate)로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 바람직한 양태에서, PB, PBL, 또는 SPB 트랜스포자아제는 단리되거나 곤충 양배추은무늬밤나방(Trichoplusia ni)(GenBank 수탁 번호 AAA87375) 또는 누에나방(Bombyx mori)(GenBank 수탁 번호 BAD11135)로부터 단리되거나 유래된다.
과활성 PB 또는 PBL 트랜스포자아제는 이들이 유래된 자연 발생 변이체보다 더 활성인 트랜스포자아제이다. 바람직한 양태에서, 과활성 PB 또는 PBL 트랜스포자아제는 누에나방(Bombyx mori) 또는 서양발톱 개구리(Xenopus tropicalis)로부터 단리되거나 유래된다. 과활성 PB 또는 PBL 트랜스포자아제의 예는 미국 특허 제6,218,185호; 미국 특허 제6,962,810호, 미국 특허 제8,399,643호, 및 WO 2019/173636에 개시되어 있다. 과활성 아미노산 치환의 목록은 미국 특허 제10,041,077호에 개시되어 있다.
일부 양태에서, PB 또는 PBL 트랜스포자아제는 통합 결핍이다. 통합 결핍 PB 또는 PBL 트랜스포자아제는 상응하는 트랜스포좀을 잘라낼 수 있지만, 상응하는 야생형 트랜스포자아제보다 낮은 빈도로 잘린 트랜스포좀을 통합하는 트랜스포자아제이다. 통합 결핍 PB 또는 PBL 트랜스포자아제의 예는 미국 특허 제6,218,185호; 미국 특허 제6,962,810호, 미국 특허 제8,399,643호, 및 WO 2019/173636에 개시되어 있다. 통합 결핍 아미노산 치환의 목록은 미국 특허 제10,041,077호에 개시되어 있다.
일부 양태에서, PB 또는 PBL 트랜스포자아제는 핵 국소화 신호에 융합된다. 핵 국소화 신호에 융합된 PB 또는 PBL 트랜스포자아제의 예는 미국 특허 제6,218,185호; 미국 특허 제6,962,810호, 미국 특허 제8,399,643호, 및 WO 2019/173636에 개시되어 있다.
일부 양태에서, sPB 단백질은 서열번호 37~39 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 사이의 임의의 백분율만큼) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
본 개시의 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 슬리핑 뷰티 트랜스포존일 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존이 슬리핑 뷰티 트랜스포존인 경우, 트랜스포자아제는 (예를 들어 미국 특허 제9,228,180호에 개시된 것과 같은) 슬리핑 뷰티 트랜스포자아제이거나 과활성 슬리핑 뷰티(SB100X) 트랜스포자아제이다.
본 개시의 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 헬레이저 트랜스포존일 수 있다. 예시적인 헬레이저 트랜스포존은 Helibat1을 포함한다. 일부 양태에서, 트랜스포존이 헬레이저 트랜스포존인 경우, 트랜스포자아제는 (예를 들어 WO 2019/173636에 개시된 것과 같은) 헬리트론(Helitron) 트랜스포자아제이다.
본 개시의 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 Tol2 트랜스포존일 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존이 Tol2 트랜스포존인 경우, 트랜스포자아제는 (예를 들어 WO 2019/173636에 개시된 것과 같은) Tol2 트랜스포자아제이다.
본 개시의 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 TcBuster 트랜스포존일 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존이 TcBuster 트랜스포존인 경우, 트랜스포자아제는 (예를 들어 WO 2019/173636에 개시된 것과 같은) TcBuster 트랜스포자아제 또는 과활성 TcBuster 트랜스포자아제이다. TcBuster 트랜스포자아제는 자연 발생 아미노산 서열 또는 비-자연 발생 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. TcBusster 트랜스포자아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 자연 발생 핵산 서열 또는 비-자연 발생 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 돌연변이체 TcBusster 트랜스포자아제는 PCT 공개 제WO 2019/173636호 및 PCT/US2019/049816에 보다 상세하게 기술된 것과 같은 야생형 TcBusster 트랜스포자아제와 비교했을 때 하나 이상의 서열 변이를 포함한다.
본원에 개시된 세포 전달 조성물(예를 들어 트랜스포존)은 치료 단백질 또는 치료제를 암호화하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 치료 단백질의 예는 PCT 공개 제WO 2019/173636호 및 PCT/US2019/049816에 개시된 것들을 포함한다.
본 개시의 세포 및 변형된 세포
본 개시의 세포 및 변형된 세포는 포유류 세포일 수 있다. 바람직하게는, 세포 및 변형된 세포는 인간 세포이다. 일 양태에서, 본 개시의 LNP 조성물을 사용하여 변형시키고자 하는 세포는 간세포, 간 성상 세포, 쿠퍼 세포, 또는 간 굴모양 혈관 내피 세포이다. 일 구현예에서, LNP 조성물은 트랜스포자아제를 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자를 포함하고, 변형된 세포는 생체 내에서 생성된다. 일 구현예에서, LNP 조성물은 트랜스포손을 암호화하는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하고, 변형된 세포는 생체 내에서 생성된다. 일 구현예에서, 트랜스포존은 간-특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 치료 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 개시의 세포 및 변형된 세포는 체세포일 수 있다. 본 개시의 세포 및 변형된 세포는 분화세포일 수 있다. 본 개시의 세포 및 변형된 세포는 자가 세포 또는 동종이계 세포일 수 있다. 동종이계 세포는 대상체에게 투여된 후 생착에 대한 이상반응을 방지하도록 조작된다. 동종이계 세포는 임의의 유형의 세포일 수 있다. 동종이계 세포는 줄기 세포이거나 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 동종이계 세포는 분화된 체세포일 수 있다.
제형, 투여량, 및 투여 방식
본 개시는 본원에 기술된 조성물의 제형, 투여량, 및 투여 방법을 제공한다.
개시된 조성물 및 약학적 조성물은 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친유성 용매, 보존제, 보조제 등과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 보조물 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 보조물이 바람직하다. 이러한 멸균 용액의 비제한적인 예 및 제조 방법은 당업계에, 예컨대 Gennaro (Ed.)의 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990] 및 문헌[“Physician's Desk Reference”, 52nd ed., Medical Economics (Montvale, N.J.) 1998]에서(이에 한정되지는 않음) 잘 알려져 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 당 기술분야에 잘 알려져 있거나 본원에 기술된 바와 같은 조성물의 투여 방식, 용해도, 및/또는 안정성에 적합한 것으로 일상적으로 선택될 수 있다.
예를 들어, 개시된 본 개시의 LNP 조성물은 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 조성물에서, 희석제는 인산염 완충 식염수(“PBS”)일 수 있다. 일부 조성물에서, 희석제는 아세트산나트륨일 수 있다.
사용에 적합한 약학적 부형제 및 첨가제의 비제한적인 예는 단독으로 또는 조합으로 존재할 수 있고, 단독으로 또는 조합으로 1~99.99 중량% 또는 부피%로 존재할 수 있는 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 및 탄수화물(예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 및 올리고당류를 포함하는 당류; 알디톨, 알돈산, 에스테르화 당류 등과 같은 유도체화된 당류; 및 다당류 또는 당 중합체)을 포함한다. 단백질 부형제의 비제한적인 예는 인간 혈청 알부민(HSA), 재조합 인간 알부민(rHA), 젤라틴, 카제인 등과 같은 혈청 알부민을 포함한다. 완충제의 역할을 할 수도 있는 대표적인 아미노산/단백질 성분은 알라닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 리신, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파탐 등을 포함한다. 하나의 바람직한 아미노산은 글리신이다.
조성물은 완충제 또는 pH 조절제를 포함할 수도 있고; 일반적으로, 완충제는 유기산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 완충제는 구연산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산, 또는 프탈산의 염과 같은 유기산 염; 트리스, 트로메타민 하이드로클로라이드, 또는 인산염 완충제를 포함한다. 바람직한 완충액은 구연산염과 같은 유기산 염이다.
공지되고 개발된 많은 방식이 본원에 개시된 조성물 또는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 데 사용될 수 있다. 투여 방식의 비제한적인 예는 볼루스, 구강, 주입, 관절내, 기관지내, 복강내, 낭내, 관절내, 강내, 복내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 병변내, 근육내, 심근내, 비강내, 안구내, 골내(intraosseous, intraosteal), 골반내, 심낭내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활액막내, 흉곽내, 자궁내, 종양내, 정맥내, 방광내, 경구, 비경구, 직장, 설하, 피하, 경피, 또는 질 수단을 포함한다.
본 개시의 조성물은 비경구(피하, 근육내, 또는 정맥내)로 사용하거나 특히 액체 용액 또는 현탁액의 형태로 임의의 다른 투여용으로 사용하도록; 특히 크림 및 좌제의 형태와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 반고형 형태로 질 또는 직장 투여용으로 사용하도록; 정제 또는 캡슐의 형태와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 구강 또는 설하 투여용으로 사용하도록; 또는 분말, 비강 점액, 또는 에어로졸, 또는 특정 제제의 형태와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 비강내 투여용으로 사용하도록; 또는 경피 투여용으로, 예컨대 겔, 연고, 로션, 현탁액으로서 사용하거나, 피부 구조를 변형시키거나 경피 패치 내 약물 농도를 증가시키기 위한, 디메틸 설폭시드와 같은 화학적 인핸서(Junginger 등의 문헌[“Drug Permeation Enhancement;” Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994)])와 함께 패치 전달 시스템으로 사용하도록; 또는 전기천공과 같이 일시적인 수송 경로를 생성하거나, 이온영동과 같이 피부를 통해 충진된 약물의 이동성을 증가시키는 전기장의 응용예에 사용하거나, 초음파영동과 같은 초음파의 응용예에 사용하도록(미국 특허 제4,309,989호 및 제4,767,402호) 제조될 수 있다(상기 간행물 및 특허는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
비경구 투여의 경우, 본원에 개시된 임의의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 비경구 비히클과 함께 용액, 현탁액, 유화액, 입자, 분말, 또는 동결 건조된 분말로서 제형화되거나, 약학적으로 허용 가능한 비경구 비히클이 별도로 제공될 수 있다. 비경구 투여용 제형은 일반적인 부형제로서 멸균수 또는 염수, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물성 오일, 수소화 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 방법에 따라 적절한 유화제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 제조될 수 있다. 주사용 제제는 비독성, 비-경구 투여형 희석제, 예컨대 수성 용액, 멸균 주사 용액, 또는 용매 중 현탁액일 수 있다. 사용 가능한 비히클 또는 용매로서, 물, 링거 용액, 등장성 염수 등이 허용되고; 일반적인 용매 또는 현탁 용매로서 멸균 비휘발성 오일이 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 천연 또는 합성 또는 반합성 지방유 또는 지방산; 천연 또는 합성 또는 반합성 모노- 또는 디- 또는 트리-글리세리드를 포함하는 임의의 종류의 비휘발성 오일 및 지방산이 사용될 수 있다. 비경구 투여는 당업계에 공지되어 있으며, 이에는 종래의 주사 수단; 미국 특허 제5,851,198호에 기술된 것과 같은 가스 가압식 바늘없는 주사 장치; 및 미국 특허 제5,839,446호에 기술된 것과 같은 레이저 천공 장치가 포함된다.
폐 투여의 경우, 바람직하게는, 본원에 기술된 조성물 또는 약학적 조성물은 폐의 하기도 또는 부비강에 도달하기에 효과적인 입자 크기로 전달된다. 조성물 또는 약학적 조성물은 흡입에 의한 치료제 투여용으로 당업계에 공지된 다양한 흡입 또는 비강 장치 중 어느 하나에 의해 전달될 수 있다. 환자의 부비강 또는 폐포에 에어로졸화된 제형을 전달할 수 있는 이들 장치는 계량 흡입기, 네뷸라이저(예를 들어 제트 네뷸라이저, 초음파 네뷸라이저), 건조 분말 발생기, 분무기 등을 포함한다. 이러한 모든 장치는 본원에 기술된 조성물 또는 약학적 조성물을 에어로졸로 분배하기 위한 투여에 적합한 제형을 사용할 수 있다. 이러한 에어로졸은 용액(수성 및 비수성 둘 다) 또는 고형 입자로 구성될 수 있다. 추가로, 본원에 기술된 조성물 또는 약학적 조성물을 포함하는 스프레이는 적어도 하나의 단백질 스캐폴드의 현탁액 또는 용액을 압력 하에 노즐을 통해 통과시킴으로써 생성될 수 있다. 계량 흡입기(MDI)의 경우, 추진제, 본원에 기술된 조성물 또는 약학적 조성물, 및 임의의 부형제 또는 다른 첨가제가 액화 압축 가스를 포함하는 혼합물로서 캐니스터(canister)에 담긴다. 계량 밸브가 작동하면 혼합물이 에어로졸로서 방출된다. 폐 투여, 제형, 및 관련 장치에 대한 보다 상세한 설명은 PCT 공개 제WO 2019/049816호에 개시되어 있다.
점막 표면을 통한 흡수의 경우, 조성물은 미크론 미만 단위의 복수의 입자, 점막 접착성 거대분자, 생활성 펩티드, 및 수성 연속상을 포함하는 유화액을 포함하는데, 이는 유화액 입자의 점막 부착을 달성함으로써 점막 표면을 통한 흡수를 촉진한다(미국 특허 제5,514,670호). 본 개시의 유화액을 도포하기에 적합한 점막 표면은 각막, 결막, 구강, 설하, 비강, 질, 폐, 위, 장, 및 직장 투여 경로를 포함할 수 있다. 질 또는 직장 투여용 제형, 예를 들어 좌제는 예를 들어 폴리알킬렌글리콜, 바셀린, 코코아 버터 등을 부형제로서 함유할 수 있다. 비강 투여용 제형은 고형분일 수 있고, 예를 들어 락토오스를 부형제로서 함유할 수 있거나, 수성 또는 유성의 점비(nasal drops) 용액일 수 있다. 구강 투여의 경우, 부형제는 당류, 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 전젤리나틴화 전분 등을 포함한다(미국 특허 제5,849,695호). 점막 투여 및 제형에 대한 보다 상세한 설명은 PCT 공개 제WO 2019/049816호에 개시되어 있다.
경피 투여의 경우, 본원에 개시된 조성물 또는 약학적 조성물은 전달 장치, 예컨대 리포좀 또는 중합 나노입자, 미세입자, 마이크로캡슐, 또는 미소구체(달리 명시되지 않는 한 집합적으로 미세입자로서 지칭됨)에 캡슐화된다. 폴리하이드록시산(예: 폴리락트산, 폴리글리콜산, 및 이들의 공중합체), 폴리오르토에스테르, 폴리무수화물, 및 폴리포스파젠과 합성 중합체; 및 콜라겐, 폴리아미노산, 알부민 및 기타 단백질, 알긴산염, 및 기타 다당류와 같은 천연 중합체; 및 이들의 조합으로 만들어진 미세입자를 포함하여, 다수의 적합한 장치가 알려져 있다(미국 특허 제5,814,599호). 경피 투여, 제형, 및 적절한 장치에 대한 보다 상세한 설명은 PCT 공개 제WO 2019/049816호에 개시되어 있다.
개시된 화합물은 장기간에 걸쳐, 예를 들어 1회 투여로부터 1주 내지 1년의 기간 동안 대상체에게 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 다양한 서방성, 데포, 또는 임플란트 투여 형태가 사용될 수 있다.
적절한 투여량은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 Wells (eds.) 등의 문헌[Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000)]; PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000); Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, Pa., 2001; Shannon, Wilson, Stang(ed.)의 문헌[Health Professional's Drug Guide 2001, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, N.J.] 참조. 바람직한 투여량은 임의로 약 0.1~99 및/또는 100~500 mg/kg/투여의 투여량, 또는 이의 임의의 범위, 값, 또는 분율을 포함하거나; 1회 또는 다회 투여당 약 0.1~5000 μg/ml의 혈청 농도를 달성하는 투여량, 또는 이의 임의의 범위, 값, 또는 분율을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 조성물 또는 약학적 조성물에 대한 바람직한 투여량 범위는 약 1 mg/kg(대상체의 체중), 최대 약 3, 약 6, 또는 약 12 mg/kg이다.
대안적으로, 투여되는 투여량은 특정 제제의 약력학적 특성, 및 이의 투여 방식 및 투여 경로; 수용자의 연령, 건강, 및 체중; 증상의 성질 및 정도; 동시 치료의 종류, 치료 빈도, 및 원하는 효과와 같은 알려진 인자에 따라 달라질 수 있다.
비제한적인 예로서, 인간 또는 동물의 치료는 1~40일 중 적어도 하나, 또는 대안적으로 또는 추가적으로, 1~52주 중 적어도 하나, 또는 대안적으로 또는 추가적으로, 1~20년 중 적어도 하나, 또는 이들의 임의의 조합에 걸쳐, 단일 투여, 주입, 또는 투여를 사용해, 본원에 개시된 조성물 또는 약학적 조성물의 1회 투여량 또는 주기적 투여량으로서 매일 약 0.1 내지 100 mg/kg 또는 이의 임의의 범위, 값, 또는 분율의 투여량을 제공하는 것일 수 있다.
조성물의 투여를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 조성물이 본원에 개시된 것과 같은 변형된 세포인 양태에서, 세포는 약 1x103 내지 1x1015개의 세포; 1x103 내지 1x1015개의 세포, 약 1x104 내지 1x1012개의 세포; 약 1x105 내지 1x1010개의 세포; 약 1x106 내지 1x109개의 세포; 약 1x106 내지 1x108개의 세포; 약 1x106 내지 1x107개의 세포; 또는 약 1x106 내지 25x106개의 세포로 투여될 수 있다. 일 양태에서, 세포는 약 5x106 내지 25x106개의 세포로 투여된다.
개시된 조성물 및 약학적 조성물의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 제형, 투여량, 및 투여 방법에 대한 보다 상세한 설명은 PCT 공개 제WO 2019/04981호에 개시되어 있다.
본 개시는, 개시된 조성물 및 약학적 조성물을 사용하여, 예를 들어 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 대상체를 조성물 또는 약학적 조성물의 치료적 유효량과 접촉시키거나 이를 투여함으로써, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 대상체에서 당업계에 알려져 있거나 본원에 기술된 것과 같은 질환 또는 장애를 치료함에 있어서 개시된 조성물 또는 약학적 조성물의 용도를 제공한다. 일 양태에서, 대상체는 포유동물이다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다. 용어 “대상체” 및 “환자”는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
본 개시의 임의의 용도 또는 방법은 이러한 조절, 치료 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 대상체에게 본원에 개시된 임의의 조성물 또는 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 임의로, 이러한 질환 또는 장애를 치료하기 위한 공동 투여 또는 병용 요법을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 본원에 개시된 임의의 조성물 또는 약학적 조성물을 투여하는 것은 적어도 하나의 화학요법제(예: 알킬화제, 유사분열 억제제, 방사성의약품) 이전에, 이와 동시에, 및/또는 이후에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 투여 후 대상체에서 이식편 대 숙주(GvH) 및/또는 숙주 대 이식편(HvG) 질환이 발생하기 않는다. 일 양태에서, 투여는 전신 투여이다. 전신 투여는 당업계에 공지되어 있고 본원에서 상세히 기술되는 임의의 수단일 수 있다. 바람직하게는, 전신 투여는 정맥내 주사 또는 정맥내 주입에 의한 것이다. 일 양태에서, 투여는 국소 투여이다. 국소 투여는 당업계에 공지되어 있고 본원에서 상세히 기술되는 임의의 수단일 수 있다. 바람직하게는, 국소 투여는 종양내 주사 또는 주입, 척수내 주사 또는 주입, 뇌실내 주사 또는 주입, 안구내 주사 또는 주입, 또는 골내 주사 또는 주입에 의한 것이다.
일부 양태에서, 치료적 유효 투여량은 단일 투여량이다. 일부 양태에서, 단일 투여량은 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 또는 그 사이에 임의의 수의 투여량 중 하나이며, 이들은 동시에 제조된다. 조성물이 자가 세포 또는 동종이계 세포인 일부 양태에서, 투여량은 세포가 질환 또는 장애를 치료하기에 충분한 시간 동안 생착하고/하거나 지속하기에 충분한 양이다.
본원에 기술된 치료 방법의 일부 양태에서, 치료는 변경되거나 종료될 수 있다. 구체적으로, 치료에 사용되는 조성물이 세포자멸사 유도성 폴리펩티드를 포함하는 양태에서, 세포자멸사는 세포를 유도제와 접촉시킴으로써 세포에서 선택적으로 유도될 수 있다. 치료는, 예를 들어 회복의 징후 또는 질환 중증도/진행의 감소 징후, 질환 관해/중단의 징후, 및/또는 이상 사례의 발생에 반응하여 변경되거나 종료될 수 있다. 일부 양태에서, (예를 들어 질환의 징후 또는 증상이 다시 나타나거나 중증도 및/또는 이상 사례의 증가가 해결될 때) 상기 방법은 세포 요법의 변형을 억제하기 위해 유도제의 억제제를 투여하여 세포 요법의 기능 및/또는 효능을 회복시키는 단계를 포함한다.
핵산 분자
치료 단백질을 암호화하는 본 개시의 핵산 분자는 mRNA, hnRNA, tRNA, 또는 임의의 다른 형태와 같은 RNA의 형태이거나; 클로닝에 의해 수득되거나 합성으로 생산된 cDNA 및 게놈 DNA를 포함하되 이에 한정되지 않는 DNA의 형태이거나; 이들의 임의의 조합일 수 있다. DNA는 삼중-가닥, 이중-가닥, 또는 단일-가닥, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. DNA 또는 RNA의 적어도 하나의 가닥의 임의의 부분은 센스 가닥으로도 알려진 코딩 가닥이거나, 안티센스 가닥으로도 지칭되는 비-코딩 가닥일 수 있다.
본 개시의 단리된 핵산 분자는, 개방 해독 프레임(ORF)을 포함하고, 임의로 하나 이상의 인트론, 예를 들어 치료 단백질의 적어도 하나의 명시된 효소적 활성 부분(이에 한정되지는 않음)을 갖는 핵산 분자; 치료 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 전술한 것들과 실질적으로 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 유전자 코드의 축퇴로 인해, 본원에 기술된 것과 같은 및/또는 당업계에 공지된 것과 같은 치료 단백질을 여전히 암호화하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 물론, 유전자 코드는 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 본 개시의 특정 단백질 스캐폴드를 암호화하는 이러한 축퇴 핵산 변이체를 생성하는 것이 당업자에게는 일상적인 일일 것이다. 예를 들어 Ausubel, 등의 전술한 문헌을 참조하고, 이러한 핵산 변이체는 본 개시에 포함된다.
본원에 표시된 바와 같이, 치료 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 본 개시의 핵산 분자는 다음을 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다: 치료 단백질의 효소적으로 활성인 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 것들 그 자체; 전체 치료 단백질 또는 이의 일부에 대한 코딩 서열; 치료 단백질에 대한 코딩 서열, 예컨대 적어도 하나의 신호 리더 또는 융합 펩티드의 코딩 서열로서, 적어도 하나의 인트론과 같은 전술한 추가 코딩 서열을 갖거나 갖지 않고, 비-코딩 5’ 및 3’ 서열, 예컨대 전사, mRNA 가공(스플라이싱 및 폴리아데틸화 신호를 포함함)(예를 들어 mRNA의 리보솜 결합 및 안정성)에 있어서 역할을 하는 전사된 비번역 서열을 포함하되 이에 한정되지 않는 추가의 비-코딩 서열을 갖는, 코딩 서열; 추가 아미노산, 예컨대 추가 기능을 제공하는 것들을 코딩하는 추가의 코딩 서열. 따라서, 치료 단백질을 암호화하는 서열은 융합된 마커 서열, 예컨대 융합된 치료 단백질의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 암호화하는 서열에 융합될 수 있다.
핵산의 작제
당업계에 잘 알려진 바와 같이, 본 개시의 단리된 핵산은 다음을 사용해 제조될 수 있다: (a) 재조합 방법, (b) 합성 기술, (c) 정제 기술, 및/또는 (d) 이들의 조합.
핵산은 본 개시의 폴리뉴클레오티드 이외의 서열을 편리하게 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하는 다중 클로닝 부위가 핵산 내에 삽입되어 폴리뉴클레오티드의 단리에 도움을 줄 수 있다. 또한, 번역 가능한 서열이 삽입되어 본 개시의 번역된 폴리뉴클레오티드의 단리에 도움을 줄 수 있다. 예를 들어, 헥사-히스티딘 마커 서열은 본 개시의 단백질을 정제하기 위한 편리한 수단을 제공한다. 코딩 서열을 제외한 본 개시의 핵산은 임의로, 본 개시의 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어댑터, 또는 링커이다.
추가 서열이 이러한 클로닝 및/또는 발현 서열에 첨가되어, 클로닝 및/또는 발현에 있어서 이들 서열을 최적화하거나, 폴리뉴클레오티드의 단리에 도움을 주거나, 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 것을 개선할 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터, 및 링커의 용도는 당업계에 잘 알려져 있다. (예를 들어 Ausubel의 전술한 문헌; 또는 Sambrook의 전술한 문헌 참조).
핵산을 작제하기 위한 재조합 방법
본 개시의 단리된 핵산 조성물, 예컨대 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 또는 이들의 임의의 조합은 당업자에게 공지된 임의의 수의 클로닝 방법론을 사용하여 생물학적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 양태에서, 엄격한 조건 하에 본 개시의 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 프로브가 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 원하는 서열을 식별하는 데 사용된다. RNA의 단리, 및 cDNA 및 게놈 라이브러리의 작제는 당업자에게 잘 알려져 있다. (예를 들어 Ausubel의 전술한 문헌; 또는 Sambrook의 전술한 문헌 참조).
핵산 스크리닝 및 단리 방법
cDNA 또는 게놈 라이브러리는 본 개시의 폴리뉴클레오티드의 서열에 기초하여 프로브를 사용하여 스크리닝될 수 있다. 프로브는 동일하거나 상이한 유기체에서 상동성 유전자를 단리하기 위해 게놈 DNA 또는 cDNA 서열과 혼성화하는 데 사용될 수 있다. 당업자는 다양한 정도의 혼성화 엄격도가 검정에 사용될 수 있고, 혼성화 배지 또는 세척 배지 중 하나가 엄격할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 혼성화를 위한 조건이 엄격해질수록, 이중체가 형성될 프로브와 표적 간의 상보성 정도가 더 커야 한다. 엄격도의 정도는 온도, 이온 강도, pH, 및 포름아미드와 같은 부분 변성 용매의 존재 중 하나 이상에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 혼성화의 엄격도는 반응물 용액의 극성을 변화시킴으로써, 예를 들어 포름아미드의 농도를 0% 내지 50%의 범위 내에서 조작함으로써 편리하게 변화된다. 검출 가능한 결합에 요구되는 상보성(서열 동일성)의 정도는 혼성화 배지 및/또는 세척 배지의 엄격도에 따라 달라질 것이다. 상보성의 정도는 100%, 또는 70~100%, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값이 최적일 것이다. 그러나, 프로브 및 프라이머에서의 작은 서열 변이는 혼성화 배지 및/또는 세척 배지의 엄격도를 감소시킴으로써 보상될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
RNA 또는 DNA의 증폭 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 본원에 제시된 교시 및 지침을 기준으로, 과도한 실험 없이 본 개시에 따라 사용될 수 있다.
알려진 DNA 또는 RNA 증폭 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 관련 증폭 과정(예를 들어 Mullis 등의 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 제4,800,159호, 제4,965,188호; Tabor 등의 미국 특허 제4,795,699호 및 제4,921,794호; Innis의 미국 특허 제5,142,033호; Wilson 등의 미국 특허 제5,122,464호; Innis의 미국 특허 제5,091,310호; Gyllensten등의 미국 특허 제5,066,584호; Gelfand등의 미국 특허 제4,889,818호; Silver등의 미국 특허 제4,994,370호; Biswas의 미국 특허 제4,766,067호; Ringold의 미국 특허 제4,656,134호 참조) 및 이중 가닥 DNA 합성을 위해 표적에 대한 안티센스 RNA를 템플릿으로서 사용하는 RNA 매개 증폭(Malek등의 미국 특허 제5,130,238호 및 이에 포함된 상표명 NASBA)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다(상기 참조 문헌의 전체 내용은 참조로서 본원에 통합됨). (예를 들어 Ausubel의 전술한 문헌; 또는 Sambrook의 전술한 문헌 참조).
예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술을 사용하여 본 개시의 폴리뉴클레오티드 및 관련 유전자의 서열을 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 직접 증폭시킬 수 있다. PCR 및 다른 시험관 내 증폭 방법은, 예를 들어 발현 대상 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 클로닝하는 데 유용하거나, 샘플에서 원하는 mRNA의 존재를 검출하기 위한 프로브로서 사용하기 위한 핵산을 제조하는 데 유용하거나, 다른 목적에 유용할 수 있다. 시험관 내 증폭 방법을 통해 당업자를 지시하기에 충분한 예시적인 기술은 Berger의 전술한 문헌, Sambrook의 전술한 문헌, 및 Ausubel의 전술한 문헌을 비롯하여 Mullis 등의 미국 특허 제4,683,202호 (1987); 및 Innis 등의 문헌[PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990)]에서 확인할 수 있다. 게놈 PCR 증폭을 위한 상업적으로 이용 가능한 키트는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 Advantage-GC 게놈 PCR 키트(Clontech) 참조. 또한, 예를 들어, T4 유전자 32 단백질(Boehringer Mannheim)을 사용해 긴 PCR 산물의 수율을 개선할 수 있다.
핵산을 작제하기 위한 합성 방법
본 개시의 단리된 핵산은 공지된 방법에 의한 직접적인 화학적 합성에 의해 제조할 수도 있다(예를 들어, Ausubel 등의 전술한 문헌 참조). 화학적 합성은 일반적으로 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생성하는데, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 상보적 서열과의 혼성화함으로써, 또는 단일 가닥을 템플릿으로서 사용하여 DNA 중합효소와 중합화함으로써 이중 가닥 DNA로 변환될 수 있다. 당업자는 DNA의 화학적 합성이 약 100개 이상의 염기로 이루어진 서열로 제한될 수 있지만, 더 긴 서열은 더 짧은 서열을 연결함으로써 수득될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
재조합 발현 카세트
본 개시는 본 개시의 핵산을 포함하는 재조합 발현 카세트를 추가로 제공한다. 본 개시의 핵산 서열, 예를 들어 본 개시의 단백질 스캐폴드를 암호화하는 cDNA 또는 게놈 서열은 적어도 하나의 원하는 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 재조합 발현 카세트를 작제하는데 사용될 수 있다. 재조합 발현 카세트는 일반적으로, 의도된 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드의 전사를 유도하게 될 전사 개시 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 본 개시의 폴리뉴클레오티드를 포함하게 된다. 이종 프로모터 및 비-이종 (내인성) 프로모터 둘 다가 본 개시의 핵산의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드의 발현을 상향 또는 하향 조절하기 위해, 프로모터, 인핸서, 또는 다른 요소의 역할을 하는 단리된 핵산이 본 개시의 폴리뉴클레오티드의 비-이종 형태의 적절한 위치(상류, 하류, 또는 인트론 내)에 도입될 수 있다. 예를 들어, 내인성 프로모터는 돌연변이, 결실, 및/또는 치환에 의해 생체 내에서 시험관 내에서 변경될 수 있다.
발현 벡터 및 숙주 세포
본 개시는 또한, 당업계에 잘 알려진 것과 같은, 본 개시의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터; 재조합 벡터에 의해 유전적으로 조작된 숙주 세포; 및 재조합 기술에 의한 적어도 하나의 치료 단백질의 생산에 관한 것이다. 예를 들어 Sambrook 등의 전술한 문헌; Ausubel 등의 전술한 문헌을 참조하고, 이를 각각은 그 전체가 참조에 의해 본원에 통합된다.
폴리뉴클레오티드는 숙주에서의 전파를 위해 선택성 마커를 함유하는 벡터에 임의로 결합될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 인산칼슘 침전물과 같은 침전물 내에 도입되거나, 충전된 지질과의 복합체 내에 도입된다. 벡터가 바이러스인 경우, 적절한 포장 세포주를 사용하여 시험관 내에서 포장한 다음 숙주 세포 내로 형질도입할 수 있다.
DNA 삽입체는 적절한 프로모터에 작동 가능하게 연결되어야 한다. 발현 작제물은 전사 개시, 종결을 위한 부위를 추가로 함유하고, 및 전사된 영역에서는 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 추가로 함유하게 된다. 작제물에 의해 발현된 성숙한 전사체의 코딩 부분은 바람직하게는 번역될 mRNA의 단부에 적절히 위치된 종결 코돈의 시작부분에서 (예를 들어, UAA, UGA, 또는 UAG에서; 포유류 또는 진핵 세포 발현에는 UAA 및 UAG가 바람직함) 개시하는 번역을 포함할 것이다.
발현 벡터는 바람직하지만 임의로 적어도 하나의 선택성 마커를 포함할 것이다. 이러한 마커는, 예를 들어 암피실린, 제오신(Sh bla 유전자), 퓨로마이신(pac 유전자), 하이그로마이신 B(hygB 유전자), G418/게네티신(neo 유전자), DHFR(디하이드로폴레이트 환원효소를 암호화하여 메토트렉세이트에 내성을 부여함), 마이코페놀산, 또는 글루타민 합성효소(GS, 미국 특허 제5,122,464호; 제5,770,359호; 제5,827,739호), 블라스티시딘(bsd 유전자), 진핵 세포 배양물 뿐만 아니라 암피실린에 대한 내성 유전자, 제오신(Sh bla 유전자), 퓨로마이신(pac 유전자), 하이그로마이신 B(hygB 유전자), G418/게네티신(neo 유전자), 카나마이신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 카르베니실린, 블레오마이신, 에리트로마이신, 폴리믹신 B, 또는 대장균 및 기타 박테리아 또는 원핵생물에서의 배양에 대한 테트라사이클린 내성 유전자를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다(상기 특허는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 전술한 숙주 세포에 대한 적절한 배양 배지 및 조건은 당업계에 공지되어 있다. 적절한 벡터는 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다. 숙주 세포 내로 벡터 작제물을 도입하는 것은 인산 칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질-매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염, 또는 다른 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 방법은, Sambrook의 전술한 문헌, 1~4장 및 16~18장; Ausubel의 전술한 문헌, 1, 9, 13, 15, 16장에서와 같이 당업계에 기술되어 있다.
발현 벡터는 바람직하지만 임의로, 본 개시의 조성물 및 방법에 의해 변형된 세포의 단리를 위한 적어도 하나의 선택 가능한 세포 표면 마커를 포함할 것이다. 본 개시의 선택 가능한 세포 표면 마커는 표면 단백질, 당단백질, 또는 세포 또는 세포의 하위 집합을 또 다른 세포의 정의된 하위 집합과 구별하는 단백질의 군을 포함한다. 바람직하게는, 선택 가능한 세포 표면 마커는 본 개시의 조성물 또는 방법에 의해 변형된 세포를 본 개시의 조성물 또는 방법에 의해 변형되지 않은 세포로부터 구별한다. 이러한 세포 표면 마커는, 예를 들어 “지정 클러스터” 또는 “분류 결정인자” 단백질(종종 “CD”로 약칭됨), 예컨대 CD19, CD271, CD34, CD22, CD20, CD33, CD52, 또는 이들의 임의의 조합의 절단된 형태 또는 전장 형태를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 세포 표면 마커는 자살 유전자 마커 RQR8을 추가로 포함한다(Philip B 등의 문헌[Blood. 2014 Aug 21; 124(8):1277-87]).
발현 벡터는 바람직하지만 임의로, 본 개시의 조성물 및 방법에 의해 변형된 세포의 단리를 위한 적어도 하나의 선택 가능한 약물 내성 마커를 포함할 것이다. 본 개시의 선택 가능한 약물 내성 마커는 야생형 또는 돌연변이체 Neo, DHFR, TYMS, FRANCF, RAD51C, GCS, MDR1, ALDH1, NKX2.2, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 개시의 적어도 하나의 단백질 스캐폴드는 융합 단백질과 같은 변형된 형태로 발현될 수 있고, 분비 신호뿐만 아니라 추가적인 이종 기능성 영역도 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 아미노산, 특히 하전된 아미노산의 영역이 단백질 스캐폴드의 N-말단에 첨가되어 정제하는 동안, 또는 이어서 취급하고 보관하는 동안 숙주 세포에서의 안정성 및 지속성을 개선할 수 있다. 또한, 펩티드 모이어티가 본 개시의 단백질 스캐폴드에 첨가되어 정제를 용이하게 할 수 있다. 이러한 영역은 단백질 스캐폴드 또는 이의 적어도 하나의 단편을 최종 제조하기 전에 제거될 수 있다. 이러한 방법은 Sambrook의 전술한 문헌, 17.29~17.42장 및 18.1~18.74장; Ausbel의 전술한 문헌, 16, 17, 및 18장과 같은 많은 표준 실험실 매뉴얼에 기술되어 있다.
당업자는 본 개시의 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 발현에 이용 가능한 다수의 발현 시스템에 대해 정통하다. 대안적으로, 본 개시의 핵산은, 본 개시의 단백질 스캐폴드를 암호화하는 내인성 DNA를 함유하는 숙주 세포에서 (조작에 의해) 켜짐(turning on)으로써 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,580,734호, 제5,641,670호, 제5,733,746호, 및 제5,733,761호에 기술되어 있으며, 이들은 그 전체가 참조에 의해 본원에 통합된다.
단백질 스캐폴드, 이의 특정 부분, 또는 변이체의 생산에 유용한 세포 배양물은 당업계에 공지된 바와 같은 박테리아, 효모, 및 포유류 세포이다. 포유류 세포 현탁액 또는 바이오리액터가 사용될 수도 있지만, 포유류 세포 시스템은 종종 세포 단층의 형태이다. 온전한 당질화 단백질을 발현할 수 있는 다수의 적절한 숙주 세포주가 당업계에서 개발되었고, 여기에는 COS-1(예: ACC CRL 1650), COS-7(예: ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21(예: ATCC CRL-10), CHO(예: ATCC CRL 1610), 및 BSC-1(예: ATCC CRL-26) 세포주, Cos-7 세포, CHO 세포, hep G2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, 293 세포, HeLa 세포이 있으며, 이는 예를 들어 미국 균주 은행(American Type Culture Collection, Manassas, Va.; www.atcc.org)으로부터 쉽게 이용할 수 있다. 바람직한 숙주 세포는 골수종 세포 및 림프종 세포와 같은 림프 기원의 세포를 포함한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 P3X63Ag8.653 세포(ATCC 수탁 번호 CRL-1580) 및 SP2/0-Ag14 세포(ATCC 수탁 번호 CRL-1851)이다. 바람직한 양태에서, 재조합 세포는 P3X63Ab8.653 또는 SP2/0-Ag14 세포이다.
이들 세포에 대한 발현 벡터는 다음과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 발현 조절 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 복제 기점; 프로모터(예를 들어, 후기 또는 초기 SV40 프로모터, CMV 프로모터 (미국 특허 제5,168,062호; 제5,385,839호), HSV tk 프로모터, pgk(포스포글리세레이트 키나아제) 프로모터, EF-1 알파 프로모터(미국 특허 제5,266,491호), 적어도 하나의 인간 프로모터; 인핸서, 및/또는 가공 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위(예를 들어, SV40 거대 T Ag 폴리A 첨가 부위), 및 전사 종결자 서열. 예를 들어, Ausubel 등의 전술한 문헌; Sambrook 등의 전술한 문헌을 참조한다. 본 개시의 핵산 또는 단백질의 생산에 유용한 다른 세포는 알려져 있고/있거나, 예를 들어, 미국 균주 은행의 세포주 및 하이브리도마 카달로그(www.atcc.org)로부터 이용할 수 있다.
진핵 숙주 세포가 사용되는 경우, 폴리아데닐화 서열 또는 전사 종결자 서열이 일반적으로 벡터에 통합된다. 종결자 서열의 예는 소 성장 호르몬 유전자 유래의 폴리아데닐화 서열이다. 전사물의 정확한 스플라이싱을 위한 서열이 포함될 수도 있다. 스플라이싱 서열의 예는 SV40의 VP1 인트론이다(Sprague 등의 문헌[J. Virol. 45:773-781 (1983)]). 추가로, 당업계에 알려진 것과 같이, 숙주 세포에서 복제를 조절하기 위한 유전자 서열이 벡터 내에 통합될 수 있다.
아미노산 코드
본 개시의 단백질 스캐폴드를 구성하는 아미노산은 종종 약칭된다. 아미노산 명칭은, 당업계에서 잘 이해되는 바와 같이, 아미노산을 한 글자 코드, 세 글자 코드, 명칭, 또는 3개의 뉴클레오티드 코돈(들)으로 지정함으로써 표시될 수 있다(Alberts, B. 등의 문헌[Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994] 참조). 본 개시의 치료 단백질은 본원에 명시된 바와 같이, 자발적 또는 돌연변이 및/또는 인간 조작에 의한 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 추가를 포함할 수 있다. 기능에 필수적인, 본 개시의 치료 단백질 내 아미노산은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 부위-유도성 돌연변이 유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이 유발에 의해 식별될 수 있다(예를 들어, Ausubel의 전술한 문헌, 8, 15장; Cunningham 및 Wells의 문헌[Science 244:1081-1085 (1989)]). 후자의 절차는 분자 내의 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 그런 다음, 생성된 돌연변이체 분자를 적어도 하나의 중화 활성과 같은 (이에 한정되지는 않음) 생물학적 활성에 대해 시험한다. 치료 단백질의 활성을 유지하는 데 중요한 부위는 결정화, 핵 자기 공명, 또는 광친화성 표지화 등과 같은 구조 분석에 의해 식별될 수도 있다(Smith 등의 문헌[J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992)] 및 de Vos 등의 문헌[Science 255:306-312 (1992)]).
당업자가 이해할 수 있듯이, 본 개시는 본 개시의 적어도 하나의 생물학적 활성 치료 단백질을 포함한다. 생물학적 활성 치료 단백질은 고유(비합성), 내인성, 또는 관련되고 알려진 단백질 스캐폴드의 특이적 활성의 적어도 20%, 30%, 또는 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 60%, 또는 70%, 및 가장 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 또는 95%~99% 이상의 특이적 활성을 갖는다. 효소적 활성 및 기질 특이성의 측정치를 검정하고 정량화하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 유기 모이어티의 공유 부착에 의해 변형되는, 본원에 기술된 것과 같은 치료 단백질 및 단편에 관한 것이다. 이러한 변형은 약동학적 특성이 개선된 (예를 들어, 생체 내 혈청 반감기가 늘어난) 단백질 스캐폴드 단편을 생성할 수 있다. 유기 모이어티는 선형 또는 분지형 친수성 중합체기, 지방산기, 또는 지방산 에스테르기일 수 있다. 특정 양태에서, 친수성 중합체기는 약 800 내지 약 120,000 달톤의 분자량을 가질 수 있고, 폴리알칸 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG)), 탄수화물 중합체, 아미노산 중합체, 또는 폴리비닐 펄리돈일 수 있고, 지방산기 또는 지방산 에스테르기는 약 8 내지 약 40개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
본 개시의 변형된 치료 단백질 및 단편은 항체에 직접 또는 간접적으로 공유 결합되는 하나 이상의 유기 모이어티를 포함할 수 있다. 본 개시의 단백질 스캐폴드 또는 단편에 결합되는 각각의 유기 모이어티는 독립적으로 친수성 중합체기, 지방산기, 또는 지방산 에스테르기일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “지방산”은 모노-카르복시산 및 디-카르복시산을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "친수성 중합체 기"는 옥탄에서보다는 물에서 더 가용성인 유기 중합체를 지칭한다. 예를 들어, 폴리리신은 옥탄에서보다는 물에서 더 가용성이다. 따라서, 폴리리신의 공유 부착에 의해 변형된 치료 단백질이 본 개시에 포함된다. 본 개시의 치료 단백질을 변형시키기에 적합한 친수성 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 예를 들어 폴리알칸 글리콜(예를 들어, PEG, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜(mPEG), PPG 등), 탄수화물(예: 덱스트란, 셀룰로오스, 올리고당, 다당류 등), 친수성 아미노산 중합체(예를 들어, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리아스파르테이트 등), 폴리알칸 산화물(예를 들어, 폴리에틸렌 산화물, 폴리프로필렌 산화물 등), 및 폴리비닐 피롤리돈을 포함한다. 바람직하게는, 본 개시의 치료 단백질을 변형시키는 친수성 중합체는 별도의 분자 엔티티로서 약 800 내지 약 150,000 달톤의 분자량을 갖는다. 예를 들어, PEG5000 및 PEG20,000이 사용될 수 있다(아래 첨자는 중합체의 달톤 단위 평균 분자량임). 친수성 중합체 기는 1개 내지 약 6개의 알킬기, 지방산기, 또는 지방산 에스테르기로 치환될 수 있다. 지방산기 또는 지방산 에스테르기로 치환된 친수성 중합체는 적절한 방법을 사용함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 아민기를 포함하는 중합체는 지방산 또는 지방산 에스테르의 카르복실레이트에 결합될 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르 상의 활성화된 카르복실레이트(예를 들어, N,N-카르보닐 디이미다졸에 의해 활성화됨)는 중합체 상의 하이드록실기에 결합될 수 있다.
본 개시의 치료 단백질을 변형시키기에 적합한 지방산 및 지방산 에스테르는 포화되거나, 하나 이상의 불포화 단위를 함유할 수 있다. 본 개시의 단백질 스캐폴드를 변형시키기에 적합한 지방산은, 예를 들어 n-도데카노에이트 (C12, 라우린산염), n-테트라데카노에이트 (C14, 미리스트산염), n-옥타데카노에이트 (C18, 스테아린산염), n-에이코사노에이트 (C20, 아라키데이트), n-도코사노에이트 (C22, 베헤네이트), n-트리아콘타노에이트 (C30), n-테트라콘타노에이트 (C40), 시스-Δ9-옥타데카노에이트 (C18, 올레산염), 모든 시스-Δ5,8,11,14-에이코사테트라에노에이트 (C20, 아라키도네이트), 옥탄디온산, 테트라데칸디온산, 옥타데칸디온산, 도코산디온산 등을 포함한다. 적절한 지방산 에스테르는 선형 또는 분지형 저급 알킬기를 포함하는 디카르복시산의 모노-에스테르를 포함한다. 저급 알킬기는 1 내지 약 12개, 바람직하게는 1 내지 약 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
변형된 치료 단백질 및 단편은 적절한 방법을 사용해, 예컨대 하나 이상의 개질제와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 본원에서 사용된 것과 같이, 용어 "개질제"는 활성화기를 포함하는 적절한 유기기(예를 들어, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)를 지칭한다. “활성화기”는, 적절한 조건 하에서, 제2 화학기와 반응하여 개질제와 제2 화학기 사이에서 공유 결합을 형성할 수 있는 화학적 모이어티 또는 작용기이다. 예를 들어, 아민-반응성 활성화기는 토실레이트, 메실레이트, 할로(클로로, 브로모, 플루오로, 요오드), N-하이드록시숙신이미딜 에스테르(NHS) 등과 같은 친전자성기를 포함한다. 티올과 반응할 수 있는 활성화기는, 예를 들어 말레이미드, 요오드아세틸, 아크릴롤릴, 피리딜 디설파이드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올(TNB-티올) 등을 포함한다. 알데히드 작용기는 아민- 또는 하이드라지드-함유 분자에 결합될 수 있고, 아지드기는 3가 인기(phosphorous group)와 반응하여 포스포라미데이트 또는 포스포르이미드 연결을 형성할 수 있다. 활성화기를 분자 내로 도입하는 적절한 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Hermanson, G. T.의 문헌[Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)] 참조). 활성화기는 유기기(예를 들어, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)에 직접 결합되거나, 링커 모이어티, 예를 들어 하나 이상의 탄소 원자가 산소, 질소, 또는 황과 같은 헤테로원자로 치환될 수 있는 2가 C1-C12 기를 통해 결합될 수 있다. 적절한 링커 모이어티는, 예를 들어 테트라에틸렌 글리콜, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH-, 및 -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-를 포함한다. 링커 모이어티를 포함하는 개질제는, 예를 들어 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)가 존재하는 가운데 모노-Boc-알킬디아민(예: 모노-Boc-에틸렌디아민, 모노-Boc-디아미노헥산)을 지방산과 반응시켜 유리 아민과 지방산 카르보디이미드(EDC) 사이에서 아미드 결합을 형성함으로써 생산될 수 있다. Boc 보호기를 트리플루오로아세트산(TFA)으로 처리하여 생성물로부터 제거하여, 기술된 바와 같이 다른 카르복실레이트에 결합될 수 있는 일차 아민을 노출시키거나, 말레산 무수물과 반응시키고 생성된 생성물을 고리화시켜 지방산의 활성화된 말레이미도 유도체를 생산할 수 있다. (예를 들어, Thompson 등의 WO 92/16221을 참조하며, 이의 전체 교시는 참조로서 본원에 통합된다.)
본 개시의 변형된 치료 단백질은 단백질 스캐폴드 또는 단편을 개질제와 반응시킴으로써 생산될 수 있다. 예를 들어, PEG의 NHS 에스테르와 같은 아민-반응성 개질제를 사용함으로써 유기 모이어티를 비-부위 특이적 방식으로 단백질 스캐폴드에 결합시킬 수 있다. 본 개시의 단백질 스캐폴드의 특정 부위에 결합된 유기 모이어티를 포함하는 변형된 치료 단백질 및 단편은 적절한 방법, 예컨대 역방향 단백질분해(Fisch 등의 문헌[Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992)]; Werlen 등의 문헌[Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994)]; Kumaran 등의 문헌[Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997)]; Itoh 등의 문헌[Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas 등의 문헌[Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)]), 및 Hermanson, G. T.의 문헌[Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)]에 기술된 방법을 사용해 제조될 수 있다.
정의
본 개시 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 단수 형태(“a”, “an” 및 “the”)는 문맥상 달리 명시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, “방법(a method)”에 대한 언급은 복수의 이러한 방법들을 포함하고, “투여량(a dose)”에 대한 언급은 하나 이상의 투여량 및 당업자에게 알려진 이와 동등한 양 등을 포함한다.
용어 “약” 또는 “대략”은 당업자에 의해 결정했을 때 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 이내를 의미하며, 이는 값이 측정되거나 결정되는 방법, 예를 들어 측정 시스템의 한계에 따라 부분적으로 달라지게 된다. 예를 들어, “약”은 하나 이상의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, “약”은 주어진 값의 최대 20%, 또는 최대 10%, 또는 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 상기 용어는 값의 수배 이내, 바람직하게는 5배 이내, 더 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 명세서와 및 청구범위에 기술되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 “약”은 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 이내를 의미하는 것으로 가정해야 한다.
본원에 개시된 화합물은 명시된 구성 없이 (예를 들어, 명시된 입체화학 없이) 제시될 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 제시는 화합물의 모든 이용 가능한 이성질체, 호변이성질체, 위치이성질체, 및 입체이성질체를 포괄하고자 하는 것이다. 일부 구현예에서, 명시된 구성 없이 본원의 화합물을 제시하는 것은 화합물의 이용 가능한 이성질체, 호변이성질체, 위치이성질체, 및 입체이성질체, 또는 이들의 임의의 혼합물을 각각 지칭하고자 하는 것이다.
본원에 기술된 화합물은 화합물 자체뿐만 아니라, 해당되는 경우, 이들의 염 및 이들의 용매화물도 포함한다는 것을 이해해야 한다. 염은, 예를 들어 본원에 개시된 치환된 화합물 상의 음이온과 양으로 하전된 기(예: 아미노) 사이에서 형성될 수 있다. 적절한 음이온은 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 황산염, 이황산염, 설팜산염, 질산염, 인산염, 구연산염, 메탄설폰산염, 트리플루오로아세트산염, 글루탐산염, 글루쿠론산염, 글루타르산염, 말산염, 말레인산염, 숙신산염, 푸마르산염, 타르타르산염, 토실산염, 살리실산염, 젖산염, 나프탈렌설폰산염, 및 아세트산염(예를 들어, 트리플루오로아세트산염)을 포함한다.
본 개시는 단리되거나 실질적으로 정제된 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 조성물을 제공한다. “단리된” 또는 “정제된” 폴리뉴클레오티드 또는 단백질, 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분은, 자연 발생 환경에서 발견되는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 정상적으로 수반하거나 이와 상호 작용하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없다. 따라서, 단리되거나 정제된 폴리뉴클레오티드 또는 단백질은, 이들이 재조합 기술에 의해 생산될 때는 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없고, 또는 이들이 화학적으로 합성될 때는 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질이 실질적으로 없다. 최적으로 “단리된” 폴리뉴클레오티드는 이 폴리뉴클레오티드가 유래된 유기체의 게놈 DNA에서 자연적으로 폴리뉴클레오티드의 측면에 위치하는 서열(즉, 폴리뉴클레오티드의 5’ 및 3’ 단부에 위치한 서열)이 없다(최적의 단백질 암호화 서열). 예를 들어, 다양한 양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 이 폴리뉴클레오티드가 유래된 세포의 게놈 DNA에서 자연적으로 폴리뉴클레오티드의 측면에 위치하는 뉴클레오티드 서열의 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 또는 0.1 kb 미만을 함유할 수 있다. 세포 물질이 실질적으로 없는 단백질은 (건조 중량 기준으로) 약 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 1% 미만의 오염 단백질을 갖는 단백질 제제를 포함한다. 본 개시의 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분이 재조합적으로 생산되는 경우, 최적으로 배양된 배지는 (건조 중량 기준으로) 약 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 1% 미만의 화학적 전구체 또는 비-관심 단백질 화학물질을 나타낸다.
본 개시는 개시된 DNA 서열 및 이들 DNA 서열에 의해 암호화된 단백질의 단편 및 변이체를 제공한다. 본 개시 전체에 걸쳐 사용된 바와 같이, 용어 “단편”은 DNA 서열의 일부 또는 아미노산 서열의 일부를 지칭하므로, 이에 의해 암호화된 단백질의 일부도 지칭한다. 코딩 서열을 포함하는 DNA 서열의 단편은, 고유 단백질의 생물학적 활성을 보유함으로써 DNA 인식 활성 또는 본원에 기술된 것과 같은 표적 DNA 서열에 대한 결합 활성도 보유하는 단백질 단편을 암호화할 수 있다. 대안적으로, 혼성화 프로브로서 유용한 DNA 서열의 단편은 생물학적 활성을 보유하거나 프로모터 활성을 보유하지 않는 단백질은 일반적으로 암호화하지 않는다. 따라서, DNA 서열의 단편은 적어도 20개의 뉴클레오티드 내지 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드 내지 최대 본 개시의 전장 폴리뉴클레오티드의 범위일 수 있다.
본 개시의 핵산 또는 단백질은 단량체 단위 및/또는 반복 단위를 표적 벡터에서 사전 조립하는 단계를 포함하는 모듈식 접근법에 의해 작제될 수 있는데, 이어서 사전 조립된 단량체 단위 및/또는 반복 단위는 최종 목표 벡터 내로 조립될 수 있다. 본 개시의 폴리펩티드는 본 개시의 반복 단량체를 포함할 수 있고, 반복 단위를 표적 벡터에서 사전 조립하는 모듈식 접근법에 의해 작제될 수 있는데, 이어서 사전 조립된 반복 단량체는 최종 목표 벡터 내로 조립될 수 있다. 본 개시는 이러한 방법에 의해 생산된 폴리펩티드뿐만 아니라 이들 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열도 제공한다. 본 개시는 이러한 모듈식 접근법에 의해 생산된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 숙주 유기체 및 세포를 제공한다.
“결합(binding)”은 거대분자들 간의 (예를 들어, 단백질과 핵산 간의) 서열-특이적, 비-공유 상호작용을 지칭한다. 전체로서의 상호작용이 서열 특이적인 한, 모든 성분의 결합 상호작용이 서열 특이적어야 하는 (예를 들어, DNA 백본에서 인산염 잔기와 접촉해야 하는) 것은 아니다.
용어 “포함(comprising)”은 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만 다른 것을 배제하지는 않음을 의미하도록 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하는 데 사용될 때의 “본질적으로 이루어지는(consisting essentially of)”은, 의도된 목적을 위해 사용될 때 조합에 본질적으로 유의한 다른 요소를 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 본원에서 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 이루어지는 조성물은 미량 오염물 또는 불활성 담체를 배제하지는 않을 것이다. "이루어지는(consisting of)”은 다른 성분의 미량 요소 및 실질적인 방법 단계를 배제하는 것을 의미한다. 이들 전이 용어 각각에 의해 정의된 양태는 본 개시의 범주에 포함된다.
용어 “에피토프”는 폴리펩티드의 항원 결정자를 지칭한다. 에피토프는, 에피토프에 대해 고유한 공간적 형태에 놓인 3개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일반적으로, 에피토프는 적어도 4, 5, 6, 또는 7개의 이러한 아미노산으로 이루어지며, 보다 일반적으로는 적어도 8, 9, 또는 10개의 이러한 아미노산으로 이루어진다. 아미노산의 공간적 형태를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “발현”은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 공정 및/또는 전사된 mRNA가 후속하여 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 공정을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래되는 경우, 발현은 진핵 세포에서 mRNA를 스플라이싱하는 것을 포함할 수 있다.
“유전자 발현”은 유전자에 담긴 정보를 유전자 산물로 변환하는 것을 지칭한다. 유전자 산물은 유전자의 직접 전사 산물(예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, shRNA, 마이크로 RNA, 구조 RNA, 또는 임의의 다른 유형의 RNA)이거나 mRNA의 번역에 의해 생산된 단백질일 수 있다. 유전자 산물은 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화, 및 편집과 같은 프로세스에 의해 변형된 RNA, 및 예를 들어 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화, 및 당질화에 의해 변형된 단백질도 포함한다.
유전자 발현의 “조절(modulation 또는 regulation)”은 유전자의 활성에 있어서의 변화를 지칭한다. 발현 조절은 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.
용어 “작동 가능하게 연결된” 또는 이와 동등한 표현은 둘 이상의 분자가 상호 작용하여 하나의 분자 또는 두 분자 모두, 또는 이들의 조합에 의한 기능에 영향을 미칠 수 있도록 서로에 대해 위치하는 것을 의미한다.
비공유 결합된 성분 및 비공유 결합된 성분을 제조하고 사용하는 방법이 개시된다. 다양한 구성 요소는 본원에 기술된 바와 같이 다양한 상이한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 비공유 연결된(즉, 작동 가능하게 연결된) 단백질은 당 기술분야에서 하나 이상의 문제를 회피하는 일시적인 상호작용을 허용하도록 사용될 수 있다. 단백질과 같이 비공유 결합된 성분의 결합 및 해리 능력은, 원하는 활성에 이러한 결합이 요구되는 상황 하에서 기능적 결합만을 가능하게 하거나 주로 기능적 결합을 가능하게 한다. 연결은 원하는 효과를 허용하기에 충분한 지속시간 동안의 연결일 수 있다.
유기체의 게놈 내의 특정 유전자좌로 단백질을 유도하기 위한 방법이 개시된다. 상기 방법은 DNA 국소화 성분을 제공하는 단계 및 작동자 분자를 제공하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 DNA 국소화 성분 및 작동자 분자는 비공유 연결을 통해 작동 가능하게 연결될 수 있다.
용어 “scFv”는 단쇄 가변 단편을 지칭한다. scFv는 링커 펩티드와 연결된 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 링커 펩티드는 약 5 내지 40개 아미노산 또는 약 10 내지 30개 아미노산 또는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40개 아미노산 길이일 수 있다. 단쇄 가변 단편은 완전한 항체 분자에서 발견되는 불변 Fc 영역이 결여되어 있으며, 따라서 항체를 정제하는 데 사용되는 공통 결합 부위(예: 단백질 G)가 결여되어 있다. 상기 용어는, 세포의 세포질에서 안정하고, 세포 내 단백질에 결합할 수 있는 항체인 인트라바디(intrabody)인 scFv를 포함한다.
용어 “단일 도메인 항체”는 특이적 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 단일 단량체 가변 항체 도메인을 갖는 항체 단편을 의미한다. 단일 도메인 항체는 일반적으로 약 110개 아미노산 길이의 펩티드 사슬로서, 중쇄 항체 또는 공통 IgG의 하나의 가변 도메인(VH)을 포함하며, 일반적으로 전체 항체로서 항원에 대해 유사한 친화도를 갖지만, 내열성이 높고, 세제에 대해 안정하며, 우레아 농도가 높다. 예는 카멜리드 항체 또는 어류 항체로부터 유래된 것들이다. 대안적으로, 단일 도메인 항체는 4개의 사슬을 갖는 흔한 쥣과 동물 또는 인간 IgG로부터 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “특이적 결합(specifically bind 및 specific binding)”은 항체, 항체 단편, 또는 나노바디가 상이한 항원의 균질한 혼합물에 존재하는 특정 항원에 우선적으로 결합하는 능력을 지칭한다. 일부 양태에서, 특이적 결합 상호작용은 샘플에서 바람직한 항원과 바람직하지 않은 항원을 구별할 것이다. 일부 양태에서, 약 10배 내지 100배 이상(예: 약 1000배 또는 10,000배 초과). “특이성”은 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편, 예컨대 나노바디가 상이한 항원 표적보다는 하나의 항원 표적에 우선적으로 결합하는 능력을 지칭하며, 반드시 높은 친화도를 의미하지는 않는다.
“표적 부위” 또는 “표적 서열”은, 결합에 대한 충분한 조건이 존재하는 경우, 결합 분자가 결합하게 될 핵산의 일부를 정의하는 핵산 서열이다.
용어 “핵산” 또는 “올리고뉴클레오티드” 또는 “폴리뉴클레오티드”는 함께 공유 연결된 적어도 2개의 뉴클레오티드를 지칭한다. 단일 가닥의 묘사는 상보적 가닥의 서열도 정의한다. 따라서, 핵산은 도시된 단일 가닥의 상보적 가닥을 포함할 수도 있다. 본 개시의 핵산은 동일한 단백질과 동일한 구조를 유지하거나 이를 암호화하는 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 보체를 포함한다.
본 개시의 프로브는 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 서열에 혼성화될 수 있는 단일 가닥 핵산을 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시의 핵산은 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화되는 프로브를 지칭할 수 있다.
본 개시의 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 본 개시의 핵산은 분자의 대부분이 단일 가닥인 경우에도 이중 가닥 서열을 함유할 수 있다. 본 개시의 핵산은 분자의 대부분이 이중 가닥인 경우에도 단일 가닥 서열을 함유할 수 있다. 본 개시의 핵산은 게놈 DNA, cDNA, RNA, 또는 이의 하이브리드를 포함할 수 있다. 본 개시의 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드의 조합을 함유할 수 있다. 본 개시의 핵산은 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 크산틴 하이포크산틴, 이소시토신, 및 이소구아닌을 포함하는 염기의 조합을 포함할 수 있다. 본 개시의 핵산은 비-천연 아미노산 변형을 포함하도록 합성될 수 있다. 본 개시의 핵산은 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 개시의 핵산은 그 전체 서열 또는 이의 임의의 부분이 비-자연 발생일 수 있다. 본 개시의 핵산은 자연 발생하지 않는 하나 이상의 돌연변이, 치환, 결실, 또는 삽입을 함유할 수 있으며, 이는 전체 핵산 서열을 비-자연 발생으로 만든다. 본 개시의 핵산은 하나 이상의 복제되거나, 역위되거나, 반복된 서열을 함유할 수 있고, 그렇게 생성된 서열은 자연적으로 발생하지 않으며, 이는 전체 핵산 서열을 비-자연 발생으로 만든다. 본 개시의 핵산은 자연 발생하지 않는 변형된, 인공, 또는 합성 뉴클레오티드를 함유할 수 있으며, 이는 전체 핵산 서열을 비-자연 발생으로 반든다.
유전자 코드의 중복성을 고려하여, 복수의 뉴클레오티드 서열은 임의의 특정 단백질을 암호화할 수 있다. 모든 이러한 뉴클레오티드 서열이 본원에서 고려된다.
본 개시 전체에 걸쳐 사용된 바와 같이, 용어 “작동 가능하게 연결된”은 유전자와 공간적으로 연결된 프로모터에 의해 유전자의 발현이 조절되는 것을 지칭한다. 프로모터는 프로모터에 의해 조절하는 유전자의 5’(상류) 또는 3’(하류)에 위치할 수 있다. 프로모터와 유전자 사이의 거리는 프로모터가 유래되는 유전자 내에서 모로모터와 프로모터에 의해 조절되는 유전자 사이의 거리와 대략 동일할 수 있다. 프로모터와 유전자 사이의 거리의 변화는 프로모터 작용의 손실 없이 수용될 수 있다.
본 개시에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 “프로모터”는 세포에서 핵산을 발현시키거나, 핵산의 발현을 활성화하거나 향상시킬 수 있는 합성 분자 또는 자연에서 유래된 분자를 지칭한다. 프로모터는 발현을 추가로 향상시키고/시키거나 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변경시키기 위해 하나 이상의 특이적 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 원위 인핸서 또는 억제자 요소를 포함할 수도 있는데, 이들은 전사의 시작 부위로부터 많게는 수천 염기쌍만큼 이격되어 위치할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충, 및 동물을 포함하는 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 발생하는 세포, 조직, 또는 기관에 대해, 또는 발현이 발생하는 발달 단계에 대해, 또는 생리학적 스트레스, 병원균, 금속 이온, 또는 유도제와 같은 외부 자극에 반응하여 유전자 성분의 발현을 구성적으로 또는 차별적으로 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예는 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 작동자-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, EF-1 알파 프로모터, CAG 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터, 및 CMV IE 프로모터를 포함한다.
본 개시의 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 “실질적으로 상보적”은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 영역에 걸쳐 제1 서열이 제2 서열의 보체와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 것을 지칭하거나, 2개의 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화되는 것을 지칭한다.
본 개시의 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 “실질적으로 동일한”은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 영역에 걸쳐 제1 서열과 제2 서열이 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 것을 지칭하거나, 핵산과 관련해서는 제1 서열이 제2 서열의 보체와 실질적으로 상보적인 경우를 지칭한다.
본 개시의 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 “변이체”는 핵산을 기술한 데 사용될 때 (i) 기준 뉴클레오티드 서열의 일부분 또는 단편; (ii) 기준 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부분의 보체; (iii) 기준 핵산 또는 이의 보체와 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 기준 핵산, 이의 보체, 또는 이와 실질적으로 동일한 서열에 대한 엄격한 조건 하에 혼성화되는 핵산을 지칭한다.
본 개시의 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 “벡터”는 복제 기점을 함유하는 핵산 서열을 지칭한다. 벡터는 바이러스 벡터, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체, 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가-복제성 염색체 외 벡터일 수 있고, 바람직하게는 DNA 플라스미드이다. 벡터는 아미노산과 DNA 서열, RNA 서열, 또는 DNA 및 RNA 서열 모두와의 조합을 포함할 수 있다.
본 개시의 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 “변이체”는 펩티드 또는 폴리펩티드를 기술하는 데 사용될 때, 아미노산의 삽입, 결실, 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 변이체는 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 기준 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수도 있다.
아미노산의 보존적 치환, 즉, 아미노산을 유사한 특성(예를 들어, 친수성, 하전된 영역의 정도 및 분포)을 가진 상이한 아미노산으로 치환하는 것은 통상적으로 경미한 변화를 수반하는 것으로 당업계에서 인식된다. 이들 경미한 변화는 당업계에서 이해되는 바와 같이, 아미노산의 친수성 지수를 고려함으로써 부분적으로 식별될 수 있다. Kyte 등의 문헌[J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982)]. 아미노산의 친수성 지수는 이의 소수성 및 전하에 대한 감안에 기초한 것이다. 유사한 친수성 지수를 가진 아미노산이 치환될 수 있고, 여전히 단백질 기능을 유지할 수 있다. 일 양태에서, ±2의 친수성 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 생성하게 되는 치환을 밝혀내는 데 사용될 수도 있다. 펩티드의 맥락에서 아미노산의 친수성을 고려하면 해당 펩티드의 최대 국소 평균 친수성을 계산할 수 있는데, 이는 항원성 및 면역원성과 잘 상관되는 것으로 보고된 유용한 척도이다. 미국 특허 제4,554,101호를 참조하고, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환하면 면역원성과 같은 생물학적 활성을 보유하는 펩티드를 생성할 수 있다. 치환은 서로 ±2 이내의 친수성 값을 갖는 아미노산들로 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값 둘 다는 해당 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 이러한 관찰과 일관되게, 생물학적 기능과 양립 가능한 아미노산 치환은 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 기타 특성에 의해 밝혀진 것과 같이 아미노산, 특히 이들 아미노산의 측쇄의 상대적인 유사성에 의존하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “보존적” 아미노산 치환은 아래 표 A, B 또는 C에 제시된 것과 같이 정의될 수 있다. 일부 양태에서, 융합 폴리펩티드 및/또는 이러한 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 본 개시의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 변형에 의해 도입된 보존적 치환을 포함한다. 아미노산은 물리적 특성 및 2차 및 3차 단백질 구조에 대한 기여에 따라 분류될 수 있다. 보존적 치환은 하나의 아미노산이 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환되는 것이다. 예시적인 보존적 치환은 표 1에 제시되어 있다.
보존적 치환 I | ||
측쇄 특성 | 아미노산 | |
지방족 | 비극성 | G A P I L V F |
극성 - 하전되지 않음 | C S T M N Q | |
극성 - 하전됨 | D E K R | |
방향족 | H F W Y | |
기타 | N Q D E |
대안적으로, 보존적 아미노산은 표 2에 제시된 것과 같이 Lehninger의 문헌[Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY, N.Y. (1975), pp. 71-77]에 기술된 것과 같이 그룹화될 수 있다.
보존적 치환 II | ||
측쇄 특성 | 아미노산 | |
비극성 (소수성) | 지방족: | A L I V P |
방향족: | F W Y | |
황 함유: | M | |
경계선: | G Y | |
하전되지 않음-극성 | 하이드록실: | S T Y |
아미드: | N Q | |
설프하이드릴: | C | |
경계선: | G Y | |
양으로 하전됨 (염기성): | K R H | |
음으로 하전됨 (산성): | D E |
대안적으로, 예시적인 보존적 치환은 표 3에 제시되어 있다.
보존적 치환 III | |
원래 잔기 | 예시적인 치환 |
Ala (A) | Val Leu Ile Met |
Arg (R) | Lys His |
Asn (N) | Gln |
Asp (D) | Glu |
Cys (C) | Ser Thr |
Gln (Q) | Asn |
Glu (E) | Asp |
Gly (G) | Ala Val Leu Pro |
His (H) | Lys Arg |
Ile (I) | Leu Val Met Ala Phe |
Leu (L) | Ile Val Met Ala Phe |
Lys (K) | Arg His |
Met (M) | Leu Ile Val Ala |
Phe (F) | Trp Tyr Ile |
Pro (P) | Gly Ala Val Leu Ile |
Ser (S) | Thr |
Thr (T) | Ser |
Trp (W) | Tyr Phe Ile |
Tyr (Y) | Trp Phe Thr Ser |
Val (V) | Ile Leu Met Ala |
본 개시의 폴리펩티드는 아미노산 잔기의 하나 이상의 삽입, 결실, 또는 치환, 또는 이들의 임의의 조합뿐만 아니라 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 또는 치환 이외의 변형도 갖는 폴리펩티드를 포함하도록 의도된다는 것을 이해해야 한다. 본 개시의 폴리펩티드 또는 핵산은 하나 이상의 보존적 치환을 함유할 수 있다.
본 개시의 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 “둘 이상의(more than one)” 전술한 아미노산 치환은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이상의 인용된 아미노산 치환을 지칭한다. 용어 “둘 이상의”는 2, 3, 4, 또는 5개의 인용된 아미노산 치환을 지칭할 수 있다.
본 개시의 폴리펩티드 및 단백질은 그 전체 서열 또는 이의 임의의 부분이 비-자연 발생일 수 있다. 본 개시의 폴리펩티드 및 단백질은 자연 발생하지 않는 하나 이상의 돌연변이, 치환, 결실, 또는 삽입을 함유할 수 있으며, 이는 전체 아미노산 서열을 비-자연 발생으로 만든다. 본 개시의 폴리펩티드 및 단백질은 하나 이상의 복제되거나, 역위되거나, 반복된 서열을 함유할 수 있고, 그렇게 생성된 서열은 자연적으로 발생하지 않으며, 이는 전체 아미노산 서열을 비-자연 발생으로 만든다. 본 개시의 폴리펩티드 및 단백질은 자연 발생하지 않는 변형된, 인공, 또는 합성 아미노산을 함유할 수 있으며, 이는 전체 아미노산 서열을 비-자연 발생으로 반든다.
본 개시의 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, “서열 동일성”은 2개을 서열을 블라스팅(bl2seq)하기 위한 독립 실행형 BLAST 엔진 프로그램을 디폴트 파라미터 설정으로 사용함으로써 결정될 수 있는데, 상기 프로그램은 국립 생명공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI) ftp 사이트에서 검색할 수 있다(Tatusova 및 Madden의 문헌[FEMS Microbiol Lett., 1999, 174, 247-250]; 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 용어 “동일한” 또는 “동일성”은 둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 사용될 때, 서열 각각의 특정 영역에 걸쳐 잔기의 명시된 백분율이 동일한 것을 지칭한다. 백분율은 2개의 서열을 최적으로 정렬하고, 명시된 영역에 걸쳐 2개의 서열을 비교하고, 양 서열에서 동일한 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치하는 위치의 수를 얻고, 일치하는 위치의 수를 명시된 영역 내 총 위치의 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다. 2개의 서열의 길이가 상이하거나, 정렬에 의해 하나 이상의 시차가 있는 단부가 생성되고, 명시된 비교 영역이 단일 서열만을 포함하는 경우, 단일 서열의 잔기는 계산의 분모에는 포함되지만 분자에는 포함되지 않는다. DNA와 RNA를 비교할 때, 티민(T)과 우라실(U)은 동등한 것으로 간주될 수 있다. 동일성은 수동으로 수행되거나, BLAST 또는 BLAST 2.0과 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다.
본 개시의 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 “내인성”은 표적 유전자 또는 표적 유전자가 도입되는 숙주 세포와 자연적으로 연관된 핵산 또는 단백질 서열을 지칭한다.
본 개시의 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 “외인성”은 표적 유전자 또는 표적 유전자가 도입되는 숙주 세포와 자연적으로 연관되지 않는 핵산 또는 단백질을 지칭하며, 여기에는 자연 발생 핵산(예: DNA 서열)의 다수의 비-자연 발생 사본, 또는 비-자연 발생 게놈 위치에 위치된 자연 발생 핵산 서열이 포함된다.
본 개시는 DNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 작제물을 숙주 세포 내로 도입하는 방법을 제공한다. “도입(introducing)”이란, 작제물을 숙주 세포의 내부에 접근시키는 방식으로 폴리뉴클레오티드 작제물을 세포에 제시하는 것을 의미한다. 본 개시의 방법은, 폴리뉴클레오티드 작제물을 단 하나의 숙주 세포 내부에 접근시킨다는 점에 있어서, 폴리뉴클레오티드 작제물을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 특정 방법에 의존하지는 않는다. 폴리뉴클레오티드 작제물을 박테리아, 식물, 진균, 및 동물 내로 도입하기 위한 방법은 당업계에 알려져 있으며, 이에는 안정한 형질전환 방법, 일시적 형질전환 방법, 및 바이러스 매개 방법이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
실시예 1 - LNP 조성물용 mRNA의 제조
DNA 플라스미드 pRT-HA-SPB-CC-AG는 아미노산 98~106(“HA-SPB”)에 상응하는 5’-헤마글루티닌 태그를 포함하는 Super piggyBac 트랜스포자아제를 암호화한다. 이러한 플라스미드를 시험관내 전사 반응을 위한 템플릿으로서 사용하여, 5’-CAP를 추가로 포함하는 HA-SPB를 암호화하는 mRNA를 생산하였다.
요약하자면, 1.5 ml 1X CutSmart 완충액, 100 μl의 총부피의 200 단위의 제한 효소 SpeI(New England Biolabs, Cat # R3133l)가 담긴 에펜도르프 튜브에 약 10 ug의 초나선 pRT-HA-SPB-CC-AG를 첨가하였다. 완전한 분해를 위해 37℃에서 밤새 인큐베이션하여 플라스미드 DNA를 선형화하였다.
선형화된 플라스미드를 제조사의 지침에 따라 DNA QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen, Cat # 28104)를 사용하여 정제하고, 정제된 DNA를 40 μl의 뉴클레아제 무함유수에 용리시켰다. 용리물의 DNA 농도는 제조사의 지침에 따라 NanoDrop 마이크로부피 분광광도계(ThermoFisher)를 사용하여 결정하였다.
정제된 플라스미드를 DNA 템플릿으로서 사용하여, 제조사의 지침에 따라 시험관 내 전사 mMESSAGE mMACHINE T7 전사 키트(ThermoFisher, Cat # AM1344)를 사용하여 mRNA를 생산하였다. 요약하자면, 뉴클레오티드 GTP, ATP, UTP, 및 5MeC (5-메틸시티딘-5’-삼인산) (TriLink #N=1014) 및 CleanCap 시약 AG (m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG; Trilink #N-7113)의 100 mM 스톡을 제조하였다. ATP, UTP, 및 5MeC는 각각 15 μL씩, GTP 및 CleanCap Reagent AG는 각각 12 μL씩 첨가하여 100 μL의 총 부피를 만들었다.
약 1.67 μg의 선형 pRT-HA-SPB-CC-AG DNA, 20 μl의 10X T7 전사 완충액, 및 20 μl의 T7 RNA 중합효소 혼합물을 1.5 ml의 에펜도르프 튜브(최종 부피 200 μl)에 첨가하고, 튜브를 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. TURBO DNase 효소(ThermoFisher)의 10 μl의 분취물을 첨가하고, 튜브를 37℃에서 15분 동안 추가로 인큐베이션하여 DNA 템플릿을 분해시켰다.
mMESSAGE mMACHINE T7 전사 키트(ThermoFisher Cat # AM1344)에 제공된 시약 및 절차를 사용하여 5’-CleanCap®-HA-SPB mRNA의 3’ 말단에 폴리(A) 꼬리를 첨가하였다.
제조사의 지침에 따라 RNeasy Midi 정제 키트(Qiagen, Cat # 75144)를 사용하여 5’-CleanCap®-HA-SPB-poly(A)-5MeC mRNA를 정제하였다. 요약하자면, 35 μl의 2-메르캅토에탄올을 사용해 3.5 ml의 완충액 RLT 용액을 새롭게 제조하고, 2.5 ml의 100% 에탄올과 합치고, 300 μl의 뉴클레아제 무함유수를 사용해 칼럼으로부터 최종 mRNA 산물을 용리시켰다. 이 공정으로부터의 평균 mRNA 산출물은 약 600~800 μg이다.
실시예 2 - mRNA를 포함하는 본 개시의 LNP의 제조 및 생체 내 스크리닝
A. 제조
다음은 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질 및 mRNA를 포함하는 복수의 다중-성분 LNP 조성물을 제형화하기 위한 예시적인 방법을 제공하는 비제한적인 실시예이다.
LNP를 제형화하기 위해, 다양한 백분율의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질 ssPalmO-Ph-P4C2, 인지질 DOPE, 구조 지질, 콜레스테롤(Chol), 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG2000; Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA)를 합쳐서 LNP 조성물을 제조하였다.
200-프루프 HPLC-등급 에탄올에서 지질을 가용화하여 25 mg/ml의 스톡 용액을 개별적으로 제조하고, 제형화하기 전까지 스톡 용액을 -80℃에서 보관하였다. 제형화 시점에, 지질 스톡 용액을 실온으로 잠시 평형화시킨 다음, 50~55℃의 온도 범위로 유지되는 핫 플레이트 상에 두었다. 이어서, 뜨거운 지질 모액을 합쳐서 원하는 최종 몰 백분율을 수득하였다. LNP 조성물의 하위 집합은 표 4a 및 표 4b에 나타나 있다.
LNP에 혼입할 5’-CleanCap-5MeC-f루시페라아제 mRNA(TriLink Biotech)의 1 mg/ml 용액을 150 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.2)에 첨가하여 스톡 용액을 형성하고 얼음 위에 두었다. 제조사의 지침에 따라 NanoAssemblr® 기기(Precision Nanosystems, Vancouver, BC, Canada)를 사용하여 미세유체 칩 내부의 수성 mRNA 상과 지질 상을 혼합하여 캡슐화된 mRNA를 포함하는 LNP 조성물을 형성하였다. mRNA 캡슐화를 위한 나노조립 공정 파라미터는 표 5에 나타나 있다.
총 유속 (ml/분) | 지질 상:수성(RNA) 상 (v/v) |
20 | 1:3 |
그런 다음, 생성된 mRNA LNP 조성물을 분자량 컷오프(MWCO)가 8~10kDa인 Repligen Float-A-Lyzer 투석 장치(Spectrum Chemical Mfg. Corp, CA, USA)에 옮기고, 인산염 완충 식염수(PBS)(투석액:투석 완충액 부피 = 적어도 1:200 v/v), pH 7.4로 4℃에서 밤새(또는 대안적으로 실온에서 적어도 4시간 동안) 투석에 의해 처리하여 25% 에탄올을 제거하고, 완전한 완충액 교환을 달성하였다. 일부 실험에서, LNP를 초원심분리기의 Amicon® Ultra-4 원심분리 필터 유닛, MWCO-30kDa(Millipore Sigma, USA)에 넣고 약 4100 x g로 회전시켜 추가로 농축시켰다. 그런 다음, 다시 사용할 때까지 mRNA LNP를 4℃에서 보관하였다.
LNP의 평균 입자 크기는 직경으로 대략 70 nm였다.
B. 생체 내 스크리닝
표 4에 나타낸 LNP 조성물과 함께 제형화한 0.5 mg/kg의 5’-CleanCap-5MeC-f루시페라아제 mRNA(TriLink Biotech)를 성체 암컷 BALB/C 마우스(n=2마리/군)에게 정맥 내 투여하였다. 일 군의 마우스는 음성 대조군으로서 비히클(PBS, Thermo Fisher Scientific, USA)로 치료하였다.
마우스를 마취시킨 뒤 4시간차에, 제조사의 지침에 따라 IVIS Lumina 생체 내 이미징 시스템(Perkin Elmer)을 사용하여 마취시킨 마우스의 생체발광 이미징(BLI)에 의해 치료된 마우스 및 대조군 마우스 내 루시페라아제의 발현 위치와 발현 정도를 결정하였다. 요약하자면, 산소 중 이소플루란을 사용해 마우스를 마취시키고, 가열된 스테이지에 반듯이 눕혔다. 그런 다음, 마우스에게 D-루시페린(Perkin-Elmer #122799)을 IP 투여하고, BLI를 수행하였다. 결과는 표 6에 나타나 있다.
LNP ID |
평균 간 루시퍼라아제 플럭스
(p/s) |
3 | 2.8 x 109 |
9 | 8.3 x 1010 |
11 | 1.4 x 109 |
13 | 3.3 x 1010 |
24 | 5 x 109 |
28 | 2.7 x 1010 |
29 | 9.1 x 109 |
0 | 1.3 x 109 |
표 6에 나타낸 바와 같이, LNP 조성물 3, 9, 11, 13, 24, 28, 및 29는 생체 내에서 주로 간 세포에 mRNA를 전달하고, 이어서 암호화된 단백질을 발현시킬 수 있었다. 또한, LNP 조성물 3, 9, 11, 13, 24, 28, 및 29를 투여한 결과 LNP 조성물 0의 투여와 비교했을 때 간 루시페라아제 신호가 크게 개선되었다. LNP 조성물 0은 당업계에서 사용되는 LNP 조성물과 가장 유사한 LNP 조성물이다(Tanaka 등의 문헌[Advanced Functional Materials (2020) Vol: 30, 34]). 따라서, 본 개시의 LNP 조성물은 당업계에서 사용되는 표준 LNP 조성물과 비교했을 때 뛰어난 유전자 전달 활성을 나타낸다.
또한, 표 4a의 LNP 조성물로 치료한 마우스의 체중을 정맥 내 투여 전 및 투여 후 24시간차에 평가하고, 베이스라인 체중과 치료 후 체중을 비교하였다. 표 7의 LNP 조성물 각각으로 치료한 각 마우스 군에 대한 평균 체중 변화율은 표 7에 나타나 있다.
LNP ID | 체중 변화율 (%) 24시간 |
3 | +5.9 |
9 | +4.6 |
11 | +0.25 |
13 | +3.6 |
24 | +1.1 |
28 | -3.15 |
29 | +0.6 |
표 7에 나타낸 바와 같이, 본 개시의 LNP 조성물은 대부분의 치료된 마우스에서 내약성이 양호하였는데, 이들 대부분은 원래 체중을 유지하거나 체중이 약간 증가하기도 하였다.
실시예 3 - LNP를 이용해 생체 내에서 간에 mRNA 전달하기
A. 간 세포에 sPB mRNA 전달하기
다음은 본 개시의 조성물이 생체 내에서 간 세포(간세포 포함)에 mRNA를 전달하는 데 사용될 수 있음을 입증하는 비제한적인 실시예이다.
본 실시예에서, HA-태그된 SPB 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 5MeC-mRNA 분자를 약 28 mol%의 Coatsome SS-OP, 약 60 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는 본 개시의 지질 나노입자에 캡슐화하였다. 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(중량/중량)이었고 총 지질은 10 mM이었다. mRNA 분자를 CleanCap®을 사용하여 추가로 캡핑하였다. 음성 염색 대조군으로서, HA-태그되지 않은 sPB 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 mRNA를 사용하였다.
mRNA를 포함하는 지질 나노입자를 성체 암컷 BALB/C 마우스에게 투여하였다. 나노입자를 1 mg/kg의 양을 단일 투여량으로 하여 정맥 내 투여하였다. 치료 4시간 후에 마우스를 인도적으로 안락사시키고, 마우스의 간을 가공하였는데, 예를 들어 간에서 문맥을 통해 약 10 mL의 HBSS + 2.5 mM EDTA를 플러싱하여 간으로부터 혈액을 제거하고, HA 태그에 대한 면역염색을 비롯하여 ELISA 및 웨스턴 블롯을 사용해 분석하였다.
HA 염색은 치료된 마우스의 전체 간의 전반에 걸쳐 간세포에서 관찰되었는데, 시험한 한 마리의 마우스의 전체 간세포 중 대략 62% 및 또 다른 마우스의 전체 간 세포 중 66%가 sPB 발현에 대해 양성이었다. 추가로, sPB의 생체 내 발현은 주요 간엽, 중앙엽, 좌측두엽, 및 우측두엽 각각에 걸쳐 균일하게 검출되었다. 따라서, 본 개시의 나노입자 조성물은 생체 내에서 전체 간 전반에 걸쳐 간세포에 mRNA를 효과적으로 전달한 다음, 이어서 전달된 mRNA는 단백질로 번역된다.
B. 간 세포에 대한 mRNA의 투여량 의존적 LNP 전달 및 내약성
다음은 본 개시의 지질 나노입자 조성물이 생체 내에서 간 세포에 mRNA를 전달하는 데 사용될 수 있고, 암호화된 단백질의 발현은 넓은 투여량 범위에 걸쳐 내약성이 양호함을 입증하는 비제한적인 실시예이다.
성체 암컷 BALB/C 마우스(n=3마리/군)에게 실시예 1에 따라 제조된 LNP 조성물 내에 제형화된 HA-태그된 sPB 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 0.5, 1.0, 2.0, 또는 3.0 mg/kg mRNA 분자를 정맥 내 투여하였다. 일 군의 마우스는 음성 대조군으로서 미치료 상태로 두었다.
치료 4시간 후에 일 군의 마우스를 희생시키고, HA 태그에 대한 면역염색을 비롯하여 ELISA 및 웨스턴 블롯을 사용해 마우스의 간을 분석하였다. 결과는 표 8에 나타나 있다.
투여량 (mg/kg) | HA-태그 sPB 단백질 (ng) |
0.5 | 0.8 |
1.0 | 1.5 |
2.0 | 1.9 |
3.0 | 2.4 |
표 8에 나타낸 바와 같이, 0.5~3 mg/kg의 HA-태그된 sPB mRNA의 단일 투여량으로 치료한 마우스에서 선형 투여량 반응이 관찰되었다.
또 다른 실험에서, HA-태그된 sPB 단백질 발현의 지속시간을 시간 경과에 따라 측정하였다. 성체 암컷 BALB/C 마우스(n=3마리/군)에게 실시예 2에 따라 제조된 LNP 조성물 9 내에 제형화된 HA-태그된 sPB 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 0.5, 1.0, 또는 3.0 mg/kg mRNA 분자를 정맥 내 투여하였다. 일 군의 마우스는 음성 대조군으로서 미치료 상태로 두었다.
치료 후 4시간차에 각 농도의 일 군의 마우스를 희생시키고, 24간차에 각 농도의 일 군의 마우스를 희생시키고, 7일차에 각 농도의 일 군의 마우스를 희생시키고, HA 태그에 대한 면역염색을 비롯하여 ELISA를 사용해 마우스의 간을 분석하였다. 결과는 표 9에 나타나 있다.
투여량 (mg/kg) | 시간 (시간) | HA-태그 sPB 단백질 (ng) |
0.5 | 4 | 0.8 |
1.0 | 4 | 1.5 |
3.0 | 4 | 2.4 |
0.5 | 24 | 0.2 |
1.0 | 24 | 0.8 |
3.0 | 24 | 1.2 |
0.5 | 168 | 0.1 |
1.0 | 168 | 0.1 |
3.0 | 168 | 0.2 |
표 9에 나타낸 바와 같이, HA-태그된 sPB 단백질의 발현은 시험된 각 농도에서 시간 경과에 따라 감소하였고, 7일차에는 sPB 발현이 거의 베이스라인 수준으로 감소하였다.
추가로, LNP 투여 후 24시간 및 7일차에 시험된 농도 각각에 대해 혈청에 존재하는 3개의 간 효소의 수준을 잠재적 간독성의 척도로서 평가하였다. 요약하자면, 24시간차 및 7일차에 혈액을 채취하고, 각각의 샘플을 20분 동안 응고시키고, 13K rpm으로 3분 동안 원심분리하여 원하지 않는 세포와 잔해를 제거하였다. 수송을 위해 젖은 얼음 위에 샘플을 두고, 분석하기 전까지 -80℃에서 보관하였다. 효소 수준은 표준화된 검정(Idexx)을 사용하여 결정하였다.
24시간차 및 7일차에 간 효소 아스파르테이트 아미노전이효소(AST), 알라닌 아미노전이효소(ALT), 및 알칼리 인산분해효소(ALP)의 수준은 표 10a 내지 표 10c에 각각 나타나 있다.
표 10a 내지 표 10c에 나타낸 바와 같이, 본 개시의 LNP 조성물을 생체 내 투여한 결과, 24시간차에 혈청 내 AST 및 ALT 수준이 아주 약간(< 2X ) 투여량 의존적으로 증가하였지만; 7일차에 3개의 효소 수준 모두가 베이스라인으로 복귀하였는데, 이는 간 효소 상승의 정도가 낮음을 입증한다.
혈청 간 효소에 추가하여, LNP 투여 후 4시간차에 시험된 농도 각각에 대해 혈청에 존재하는 3가지 전염증성 사이토카인의 수준을 평가하였다. 요약하자면, 간 효소 분석에 대해 기술된 것과 같이 혈청 샘플을 제조하고, 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트(예: R&D Systems Quantikine ELISA 키트)를 사용하여 각 사이토카인의 혈청 농도를 결정하였다. 4시간차에 전염증성 사이토카인 인터류킨-6(IL-6), 인터페론 감마(INF-G), 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-a)의 수준은 표 11a 내지 11c에 각각 나타나 있다.
표 11a 내지 표 11c에 나타낸 바와 같이, 본 개시의 LNP 조성물을 생체 내 투여한 결과, 반응 정도 전반에 걸쳐 혈청 전염증성 사이토카인의 투여량 의존적 증가는, 비-생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질의 관점에서 보통이었다.
또 다른 실험에서, 실시예 2의 LNP 조성물 9를 비-생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질 C12-200을 포함하는 LNP 입자와 비교하였다. 성체 암컷 BALB/C 마우스(n=3마리/군)에게 LNP 조성물 내에 제형화된 HA-태그된 sPB 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 0.5, 1.0, 또는 3.0 mg/kg mRNA 분자를 정맥 내 투여하였다. 일 군의 마우스는 음성 대조군으로서 미치료 상태로 두었다. SB 양성 간세포의 백분율, ALT 간 효소 측정치, 및 IL-6 사이토카인 방출 측정치를 각 군별로 치료된 동물들 간에 비교하였으며, 1 mg/kg 투여량(C12-200 LNP 조성물의 경우 MTD 투여량)에서 각각에 대한 값은 표 12에 보고되어 있다.
LNP 조성물 | % + 간세포 | ALT 농도 (U/L) |
IL-6 농도 (pg/ml) |
9 | 64.4 | 28.33 | 0.97 |
C12-200 | 72.5 | 241.33 | 928.3 |
표 12에 나타낸 바와 같이, LNP 조성물 9는 간세포에 SB mRNA를 전달하는 데 있어서 유사한 효능을 나타냈지만, 동시에 C12-200 LNP와 비교하여 감소된 IL-6 사이토카인 방출 및 감소된 ALT 간 효소로 나타난 것과 같이, C12-200 LNP 조성물과 비교했을 때 유의하게 감소된 독성 프로파일을 나타냈다.
C. 생체 내에서 본 개시의 LNP 조성물은 높은 특이성으로 RNA를 간에 전달한다.
세 번째 실험에서, 성체 암컷 BALB/C 마우스의 일 군(n=3마리/군)에게 실시예 1에 따라 제조된 나노입자 조성물 내에 제형화된 1 mg/kg의 HA-태그된 sPB mRNA를 정맥 내 투여하고, 제2 군은 대조군으로서 미치료 상태로 두었다. 투여 4시간 후에, 각 군의 마우스를 인도적으로 안락사시키고, 다음 4개의 조직 유형을 채취하였다: 간, 비장, 폐, 및 신장.
채취한 조직을 가공하였는데, 예를 들어 문맥을 통해 약 10 mL의 HBSS + 2.5 mM EDTA를 플러싱하여 간으로부터 혈액을 제거하였다. 단백질 추출 완충액은 프로테아제 억제제(HALT, ThermoFisher # 78439)를 T-PER(ThermoFisher #78510)에 1:50(v:v)의 비율로 첨가하여 제조하였다. 단백질 추출 완충액을 실온에서 최대 1시간 동안 보관하였다. RNAse-무함유 에펜도르프 튜브(Invitrogen #Am12425)에서, 조직 샘플을 단백질 추출 완충액에 조직 1 g 당 9 mL의 비율로 첨가하였다. 하나의 텅스텐 카바이드 비드(3 mm; Qiagen #69997)를 용액에 첨가하고, 튜브를 조직 파괴자(Qiagen TissueLyzer II) 내의 미리 냉각시킨 어댑터 블록 내에 두었다. 샘플을 25 Hz에서 5분 동안 진탕하여 용리시켰다. 샘플을 4℃에서 14.8k로 10분 동안 원심분리하여 정화하였다. 상청액을 수집하고 펠릿을 폐기하였다.
총 단백질은 상업적으로 이용 가능한 키트(BCA 검정 키트, Pierce # 23225)를 사용하여 BCA 검정에 의해 측정하였다. 간 용리물을 200X로 희석하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 562 nm에서 흡광도를 판독하였다. 결과는 표 13에 나타나 있다.
조직 | HA-태그 sPB 단백질 (ng) |
간 | 2.4 |
비장 | 0.1 |
폐 | 0 |
신장 | 0 |
표 13에 나타낸 바와 같이, HA 태그된 sPB의 발현은 치료된 동물의 간에서 거의 전적으로 검출되었고, 비장에서는 최소한의 발현이 검출되었고, 폐와 신장에서는 발현이 검출되지 않았는데, 이는 본 개시의 LNP 조성물이 생체 내에서 mRNA를 간에 우선적으로 전달한 다음, 간의 간세포에서 암호화된 폴리펩티드를 발현시키는 능력이 있음을 입증한다.
실시예 3에 제시된 결과는, 본 개시의 LNP 조성물이 생체 내에서 mRNA를 간에 효과적으로 전달할 수 있고, 그런 다음 전달된 mRNA는 간 세포 내에서 발현되며, 단백질 발현은 넓은 범위에 걸쳐 투여된 투여량에 의해 조절될 수 있음을 입증한다. 또한, 본 개시의 LNP 조성물은 내약성이 양호하며, 낮은 수준의 독성을 나타낸다.
실시예 4 - DNA를 포함하는 본 개시의 LNP 조성물의 제조
다음은 DNA 나노플라스미드(원형 DNA)가 본 개시의 LNP 조성물에 혼입될 수 있음을 입증하는 비제한적인 실시예이다.
본 개시의 LNP 조성물은 DNA, PiggyBac 트랜스포존을 암호화하는 나노플라스미드(PiggyBac 트랜스포존은 CMV 프로모터에 의해 조절되는 루시페라아제를 포함함)(이하 pB-nanofluc2로 지칭됨), Coatsome SS-OP, 인지질 DOPE, 구조 지질 콜레스테롤(Chol), 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG2000)을 표 14에 표시된 백분율로 포함한다:
LNP
ID |
Coatsome SS-OP | DOPE | 콜레스테롤 | DMG-PEG2000 | 지질 배합물 (mM) |
지질:DNA
(w/w) |
D1 | 22.71 | 20.83 | 55.21 | 1.25 | 15 | 100:1 |
D2 | 50 | 10 | 38.6 | 1.4 | 10 | 200:1 |
D3 | 34.69 | 24.69 | 39.74 | 1.25 | 10 | 50:1 |
D4 | 50 | 29.5 | 20 | 0.5 | 10 | 100:1 |
D5 | 50 | 28.7 | 20 | 1.3 | 10 | 50:1 |
성체 BALB/C 마우스에게 표 14에 열거된 LNP 조성물 D1~D5 각각을 1.0 mg/kg(총 DNA)(n=4마리)으로 투여하였다. 마우스를 마취시킨 뒤 4시간차에, 제조사의 지침에 따라 IVIS Lumina 생체 내 이미징 시스템(Perkin Elmer)을 사용하여 마취시킨 마우스의 생체발광 이미징(BLI)에 의해 치료된 마우스 및 대조군 마우스 내 루시페라아제의 발현 위치와 발현 정도를 결정하였다. 요약하자면, 산소 중 이소플루란을 사용해 마우스를 마취시키고, 가열된 스테이지에 반듯이 눕혔다. 그런 다음, 마우스에게 D-루시페린(Perkin-Elmer #122799)을 IP 투여하고, BLI를 수행하였다. 결과는 표 15에 나타나 있다.
LNP ID |
평균 간 루시퍼라아제 플럭스
(p/s) |
D1 | 2.5e7 |
D2 | 2.0e7 |
D3 | 1.5e7 |
D4 | 1.0e7 |
D5 | 1.8e7 |
표 15에 나타낸 바와 같이, 모든 LNP 조성물은 간 세포에 DNA를 전달하여, 암호화된 이식 유전자를 간 세포에서 발현할 수 있었다.
실시예 5 - 혈우병 치료를 위한 본 개시의 LNP
다음은 본 개시의 조성물 및 방법이 혈우병, 보다 구체적으로는 A형 혈우병을 치료하는 데 사용될 수 있음을 입증하는 비제한적인 실시예이다.
성체 마우스
실험 0일차에, 암컷 성체(8~9주령) 야생형 BALB/c마우스에게 먼저 0.5 mg/kg의 FVIII 트랜스포존 LNP를 투여한 다음, 7일차에 3.0 mg/kg의 HA-SPB LNP를 투여하였다. 0일차 및 7일차 모두에 대한 총 주사량은 마우스당 200 μL였다. 투여 후, 마우스를 속박하고, 29게이지 인슐린 주사기를 사용해 꼬리 정맥을 통해 정맥 내 주사하였다.
FVIII 트랜스포존 LNP는 트랜스포존을 포함하는 나노플라스미드 DNA를 포함하는 C12-200-함유 LNP인데, 여기서 트랜스포존은, 제1 piggyBac 역위 말단 반복(ITR), 이어서 제1 절연 서열, 이어서 트랜스티레틴(TTR) 인핸서/프로모터 및 미세 마우스 바이러스(MVM) 인트론 서열, 이어서 B-도메인이 결여된 인간 인자 VIII(FVIII)(이하 FVIII-BDD로서 지칭됨)를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열, 이어서 SV40 폴리A, 이어서 제2 절연 서열, 이어서 제2 piggyBac ITR을 포함하는 발현 카세트로 이루어진다. 트랜스포존의 서열은 서열번호 35로 제시되어 있다. FVIII 트랜스포존 LNP는 C12-200, DOPE, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2000을 0.35:0.2:0.4184:0.0316의 몰비로 포함하고, 지질:DNA 비율은 80:1(w/w)이었다.
HA-SPB LNP는 활성 SPB를 암호화하는 mRNA를 포함하는 본 개시의 ssPalmO-Ph-P4C2-함유 LNP였다. mRNA 내의 모든 시티딘 잔기는 5-메틸시티딘(5-MeC)이었다. HA-SPB LNP는 ssPalmO-Ph-P4C2, DOPE, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2000을 28:10:60:2의 몰비로 포함하고, 지질:RNA 비율은 100:1(w/w)이었다.
0일차에 처음 주입한 후 6일차 및 13일차에, 안와 뒷쪽 출혈에 의해 혈장을 채취하였다. 요약하자면, 코팅되지않은 평범한 파스퇴르 피펫을 사용하여 안구후 동굴모양 정맥을 파괴하여 전혈을 채취하고, 3.2% 완충된 구연산나트륨과 9:1의 부피비로 혼합하였다. 이 혼합물을 22℃에서 15분 동안 15,000 g로 원심분리하고, 혈장 상청액을 수집하고 -80℃에서 보관하였다. 제조사의 지침에 따라 Affinity Biologicals™, Inc. VisuLize™ 인자 FVIII 항원 플러스 키트를 사용하여 샘플 내 인간 FVIII 단백질 수준을 분석하였다.
이 분석의 결과는 도 1에 도시되어 있다. 도 1은, 6일차에 HA-SPB LNP를 투여한 후 13일차에 정상 인간 FVIII의 1~5%에 상응하는 수준의 인간 FVIII 단백질 수준이 샘플에서 관찰되었음을 보여준다.
본 실시예에서 제시된 결과는, 본 개시의 LNP가 성체 마우스의 생체 내에서도 높은 수준의 FVIII 발현을 유도하는 데 사용될 수 있고, 따라서 본 개시의 조성물 및 방법이 혈우병 A를 치료하는 데 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 6 - 혈우병 치료를 위한 본 개시의 LNP
다음은 본 개시의 조성물 및 방법이 혈우병, 보다 구체적으로는 B형 혈우병을 치료하는 데 사용될 수 있음을 입증하는 비제한적인 실시예이다.
유년기 마우스
3주령의 유년기 C57BL/6 마우스를 미치료 상태로 두거나, 다음 2가지 치료 중 하나를 투여하였다:
치료 #1:인자 IX 트랜스포존 AAV 바이러스 벡터 입자
치료 #2: 인자 IX 트랜스포존 AAV 바이러스 벡터 입자와 SPB LNP의 병용.
인자 IX 트랜스포존 AAV 바이러스 벡터 입자는 piggyBac 트랜스포존을 포함하는 AAV 바이러스 벡터 입자였는데, 여기서 piggyBac 트랜스포존은 R338L 돌연변이를 갖는 인간 인자 IX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하였다.
SPB LNP는 활성 SPB를 암호화하는 mRNA를 포함하는 본 개시의 ssPalmO-Ph-P4C2-함유 LNP였다. SPB LNP는 ssPalmO-Ph-P4C2, DOPE, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2000을 28:10:60:2의 몰비로 포함하고, 지질:RNA 비율은 100:1(w/w)이었다.
치료 투여 후 3주차에, ELISA 실험을 수행하여 마우스의 혈장 내 인간 인자 IX 폴리펩티드의 양을 결정하였다. 이들 ELISA 실험의 결과는 도 2에 도시되어 있다. 도 2는, 본 개시의 LNP를 포함하는 치료 #2를 투여한 후, 정상 인간 인자 IX의 약 40~85%에 상응하는 수준의 인간 인자 IX 단백질 수준이 샘플에서 관찰되었음을 보여준다.
본 실시예에 제시된 결과는, 본 개시의 LNP가 생체 내에서 높은 수준의 인자 IX 발현을 유도하는 데 사용될 수 있고, 따라서 본 개시의 조성물 및 방법이 B형 혈우병을 치료하는 데 사용될 수 있음을 입증한다. 보다 구체적으로, 본 개시의 LNP는 건강한 개체에서 관찰된 인자 IX 수준으로 생체 내에서 인자 IX 발현의 수준을 유도하는 데 사용될 수 있다.
실시예 7 - mRNA를 포함하는 본 개시의 LNP의 제조, 생체 내 스크리닝, 및 안정성 검사
A. 제조
다음은 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질 및 mRNA를 포함하는 복수의 다중 성분 LNP 조성물을 제형화하기 위한 예시적인 방법을 제공하는 비제한적인 실시예이다.
LNP를 제형화하기 위해, 다양한 백분율의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질 ssPalmO-Ph-P4C2, 인지질 DOPE, 구조 지질, 콜레스테롤(Chol), 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG2000; Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA)를 합쳐서 LNP 조성물을 제조하였다.
200-프루프 HPLC-등급 에탄올에서 지질을 가용화하여 25 mg/ml의 스톡 용액을 개별적으로 제조하고, 제형화하기 전까지 스톡 용액을 -80℃에서 보관하였다. 제형화 시점에, 지질 스톡 용액을 실온으로 잠시 평형화시킨 다음, 50~55℃의 온도 범위로 유지되는 핫 플레이트 상에 두었다. 이어서, 뜨거운 지질 모액을 합쳐서 원하는 최종 몰 백분율을 수득하였다. LNP 조성물의 하위 집합은 표 16에 나타나 있다:
LNP ID |
ssPalmO-Ph-P4C2
(mol%) |
DOPE
(mol%) |
Chol
(mol%) |
PEG-DMG
(mol%) |
총 지질 (mM) | 지질:RNA (w/w) |
2.1 | 19.00% | 16.00% | 60.00% | 5.00% | 15 | 40 |
2.2 | 24.00% | 17.00% | 55.00% | 4.00% | 23 | 96 |
2.3 | 26.93% | 18.63% | 50.67% | 3.77% | 25 | 100 |
2.4 | 20.93% | 21.79% | 52.64% | 4.64% | 15 | 77 |
2.5 | 24.67% | 11.68% | 58.79% | 4.86% | 24 | 70 |
2.6 | 54.00% | 10.00% | 35.00% | 1.00% | 25 | 100 |
2.7 | 26.02% | 20.44% | 50.00% | 3.54% | 25 | 49 |
2.8 | 21.00% | 19.00% | 55.00% | 5.00% | 25 | 40 |
2.9 | 28.00% | 10.00% | 60.00% | 2.00% | 10 | 100 |
2.10 | 27.84% | 13.46% | 56.25% | 2.45% | 19 | 88 |
2.11 | 27.90% | 18.59% | 51.51% | 2.00% | 15 | 100 |
2.12 | 26.28% | 22.65% | 50.01% | 1.06% | 17 | 40 |
2.13 | 21.00% | 17.00% | 60.00% | 2.00% | 15 | 40 |
2.14 | 60.00% | 11.60% | 26.40% | 2.00% | 15 | 70 |
2.15 | 22.00% | 21.00% | 55.00% | 2.00% | 15 | 40 |
2.16 | 30.37% | 30.36% | 37.27% | 2.00% | 15 | 100 |
LNP에 혼입될 5meC 5’-CleanCap-5MeC-SPB-HA mRNA(특이적 실시예 1에서 제조됨)의 1 mg/ml 용액을 150 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.2) 또는 말레인산염(pH 5.0)에 첨가하여 스톡 용액을 형성하고 얼음 위에 유지시켰다. mRNA는 HA-태그된 SBP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하였다. 제조사의 지침에 따라 NanoAssemblr® 기기(Precision Nanosystems, Vancouver, BC, Canada)를 사용하여 미세유체 칩 내부의 수성 mRNA 상과 지질 상을 혼합하여 캡슐화된 mRNA를 포함하는 LNP 조성물을 형성하였다. 사용된 완충액, 완충액 농도, 및 유속을 포함하여, LNP 조성물 각각을 mRNA 캡슐화하기 위한 나노조립 공정 파라미터는 표 17에 나타나 있다:
LNP ID | 완충액 | 완충액 농도 (mM) | 유속 (ml/분) |
2.1 | 아세트산나트륨 (pH 5.2) | 10 | 20 |
2.2 | 아세트산나트륨 (pH 5.2) | 150 | 20 |
2.3 | 아세트산나트륨 (pH 5.2) | 10 | 20 |
2.4 | 아세트산나트륨 (pH 5.2) | 100 | 20 |
2.5 | 아세트산나트륨 (pH 5.2) | 50 | 20 |
2.6 | 말레인산염 (pH 5) | 50 | 4 |
2.7 | 아세트산나트륨 (pH 5.2) | 150 | 20 |
2.8 | 아세트산나트륨 (pH 5.2) | 10 | 20 |
2.9 | 아세트산나트륨 (pH 5.2) | 150 | 20 |
2.10 | 아세트산나트륨 (pH 5.2) | 100 | 20 |
2.11 | 말레인산염 (pH 5) | 100 | 12 |
2.12 | 아세트산나트륨 (pH 5.2) | 150 | 20 |
2.13 | 아세트산나트륨 (pH 5.2) | 10 | 20 |
2.14 | 말레인산염 (pH 5) | 150 | 4 |
2.15 | 아세트산나트륨 (pH 5.2) | 10 | 20 |
2.16 | 말레인산염 (ph 5) | 150 | 4 |
그런 다음, 생성된 mRNA LNP 조성물을 분자량 컷오프(MWCO)가 8~10kDa인 Repligen Float-A-Lyzer 투석 장치(Spectrum Chemical Mfg. Corp, CA, USA)에 옮기고, 인산염 완충 식염수(PBS)(투석액:투석 완충액 부피 = 적어도 1:200 v/v), pH 7.4 또는 6.5로 4℃에서 밤새(또는 대안적으로 실온에서 적어도 4시간 동안) 투석에 의해 처리하여 25% 에탄올을 제거하고, 완전한 완충액 교환을 달성하였다. 일부 실험에서, LNP를 초원심분리기의 Amicon® Ultra-4 원심분리 필터 유닛, MWCO-100 kDa 또는 50 kDa(Millipore Sigma, USA)에 넣고 약 4000 x g로 회전시켜 추가로 농축시켰다. 그런 다음, 다시 사용할 때까지 mRNA LNP를 4℃에서 보관하였다.
B. 생체 내 스크리닝
성체 암컷 BALB/C 마우스(n=2마리/군)에게 표 16에 나타낸 HA-SBP mRNA를 포함하는 1.0 mg/kg의 LNP 조성물을 정맥 내 투여하였다. 일 군의 마우스는 음성 대조군으로서 비히클(PBS, Thermo Fisher Scientific, USA)로 치료하였다.
투여 후 4시간 시점에 마우스를 안락사시키고 이들의 간을 채취하였다. HA-SBP의 발현은 ELISA에 의해 평가하였다. 이 분석의 결과는 표 18에 나타나 있다:
LNP ID | 마우스 1 간 발현 | 마우스 2 간 발현 | 평균 |
2.1 | 0.03 | 0.04 | 0.04 |
2.2 | 0.01 | 0 | 0.01 |
2.3 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
2.4 | 0 | 0.1 | 0.05 |
2.5 | 0 | 0 | 0 |
2.6 | 1.21 | 0.76 | 0.98 |
2.7 | 0.02 | 0.08 | 0.05 |
2.8 | 0.04 | 0 | 0.02 |
2.9 | 0.01 | NA | 0.01 |
2.10 | 1.06 | 0.47 | 0.76 |
2.11 | 1.04 | 1.49 | 1.27 |
2.12 | 0.17 | 0.16 | 0.16 |
2.13 | 0.06 | 0.08 | 0.07 |
2.14 | 0.76 | 0.62 | 0.69 |
2.15 | 0.21 | 0.12 | 0.17 |
2.16 | 1.09 | 1.04 | 1.07 |
PBS (비히클) | 0 | 0 | 0 |
표 18에 나타낸 바와 같이, LNP ID 2.6, LNP ID 2.10, LNP ID 2.11, LNP 2.14, 및 LNP 2.16은 mRNA를 생체 내에서 (구체적으로는 간 세포에) 전달할 수 있었으며, 암호화된 단백질의 후속 발현이 있었다.
C. 안정성 시험
LNP ID 2.6, LNP ID 2.10, LNP ID 2.11, LNP 2.14, 및 LNP 2.16의 분취물을 각각 0.1 mg/mL씩 4℃에서 7일 동안 보관하여 LNP 조성물의 보관 안정성을 평가하였다. LNP 조성물 각각에 대한 평균 직경 및 다분산 지수(PDI)는 인큐베이션의 7일 인큐베이션을 시작할 때(0일차), 및 인큐베이션의 1일차, 4일차, 및 7일차에 분석하였다. 이 분석의 결과는 도 3에 도시되어 있다. 도 3에 도시된 바와 같이, LNP ID 2.6, LNP ID 2.10, LNP ID 2.11, LNP 2.14, 및 LNP 2.16 각각에 대한 크기 및 PDI는 7일 인큐베이션 과정에 걸쳐 안정하였는데, 이는 이들 조성물이 향상된 저장 안정성을 나타낸다는 것을 나타내며, 이는 임상 및 상업적 환경에서 유리하다.
종합하면, 본 실시예에 기술된 결과는 본 개시의 LNP 조성물이 생체 내에서 간 세포를 포함하는 세포에 mRNA를 효과적으로 전달할 수 있고, 이들 조성물이 연장된 기간에 걸쳐 표준 보관 온도에서 안정함을 입증한다.
실시예 8 - mRNA를 포함하는 본 개시의 LNP의 제조 및 생체 내 스크리닝
A. 제조
다음은 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질 및 mRNA를 포함하는 복수의 다중 성분 LNP 조성물을 제형화하기 위한 예시적인 방법을 제공하는 비제한적인 실시예이다.
LNP를 제형화하기 위해, 다양한 백분율의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질 ssPalmO-Ph-P4C2, 인지질 (DOPE, DSPC, 또는 DOPC), 구조 지질, 콜레스테롤(Chol), 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG2000; Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA)를 합쳐서 LNP 조성물을 제조하였다.
200-프루프 HPLC-등급 에탄올에서 지질을 가용화하여 25 mg/ml의 스톡 용액을 개별적으로 제조하고, 제형화하기 전까지 스톡 용액을 -80℃에서 보관하였다. 제형화 시점에, 지질 스톡 용액을 실온으로 잠시 평형화시킨 다음, 50~55℃의 온도 범위로 유지되는 핫 플레이트 상에 두었다. 이어서, 뜨거운 지질 모액을 합쳐서 원하는 최종 몰 백분율을 수득하였다. LNP 조성물의 하위 집합은 표 19에 나타나 있다.
LNP ID |
ssPalmO-Ph-P4C2
(mol%) |
인지질
(mol%) |
Chol
(mol%) |
PEG-DMG
(mol%) |
총 지질 (mM) |
지질:RNA
(w/w) |
3.1 | 54 | 10% DOPE | 35 | 1 | 25 | 100 |
3.2 | 54 | 10% DOPC | 35 | 1 | 25 | 100 |
3.3 | 54 | 10% DOPE | 35 | 1 | 25 | 60 |
3.4 | 54 | 10% DOPC | 35 | 1 | 25 | 60 |
3.5 | 49.4 | 5% DOPC | 44 | 1.6 | 25 | 60 |
3.6 | 60 | 5% DSPC | 32.8 | 2.2 | 25 | 60 |
3.7 | 60 | 5% DOPC | 34 | 1 | 25 | 40 |
3.8 | 41.8 | 5% DSPC | 52.2 | 1 | 25 | 60 |
3.9 | 54 | 10% DSPC | 35 | 1 | 25 | 60 |
3.10 | 54 | 10% DSPC | 35 | 1 | 25 | 100 |
LNP에 혼입할 5’-CleanCap-5MeC-f루시페라아제 mRNA(TriLink Biotech)의 1 mg/ml 용액을 150 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.2)에 첨가하여 스톡 용액을 형성하고 얼음 위에 두었다. 제조사의 지침에 따라 NanoAssemblr® 기기(Precision Nanosystems, Vancouver, BC, Canada)를 사용하여 미세유체 칩 내부의 수성 mRNA 상과 지질 상을 혼합하여 캡슐화된 mRNA를 포함하는 LNP 조성물을 형성하였다. mRNA 캡슐화를 위한 나노조립 공정 파라미터는 표 20에 나타나 있다.
총 유속 (ml/분) | 지질 상:수성(RNA) 상 (v/v) |
20 | 1:3 |
그런 다음, 생성된 mRNA LNP 조성물을 분자량 컷오프(MWCO)가 8~10kDa인 Repligen Float-A-Lyzer 투석 장치(Spectrum Chemical Mfg. Corp, CA, USA)에 옮기고, 25 mM 아세트산나트륨(투석액:투석 완충액 부피 = 적어도 1:200 v/v), pH 5.5로 4℃에서 밤새(또는 대안적으로 실온에서 적어도 4시간 동안) 투석에 의해 처리하여 25% 에탄올을 제거하고, 완전한 완충액 교환을 달성하였다. 일부 실험에서, LNP를 초원심분리기의 Amicon® Ultra-4 원심분리 필터 유닛, MWCO-30kDa(Millipore Sigma, USA)에 넣고 약 4100 x g로 회전시켜 추가로 농축시켰다. 수크로오스를 mRNA LNP에 5%(w/v)의 최종 농도로 첨가한 다음, 추가로 사용할 때까지 4℃에서 보관하거나 -80℃로 냉동시켰다.
LNP의 평균 입자 크기는 직경으로 대략 84~121 nm였다.
B. 생체 내 스크리닝
표 19에 나타낸 LNP 조성물과 함께 제형화한 0.5 mg/kg의 5’-CleanCap-5MeC-f루시페라아제 mRNA(TriLink Biotech)를 성체 암컷 BALB/C 마우스(n=2마리/군)에게 정맥 내 투여하였다. 일 군의 마우스는 음성 대조군으로서 비히클(PBS, Thermo Fisher Scientific, USA)로 치료하였다.
마우스를 마취시킨 뒤 4시간차에, 제조사의 지침에 따라 IVIS Lumina 생체 내 이미징 시스템(Perkin Elmer)을 사용하여 마취시킨 마우스의 생체발광 이미징(BLI)에 의해 치료된 마우스 및 대조군 마우스 내 루시페라아제의 발현 위치와 발현 정도를 결정하였다. 요약하자면, 산소 중 이소플루란을 사용해 마우스를 마취시키고, 가열된 스테이지에 반듯이 눕혔다. 그런 다음, 마우스에게 D-루시페린(Perkin-Elmer #122799)을 IP 투여하고, BLI를 수행하였다. 결과는 표 21에 나타나 있다.
LNP ID |
평균 간 루시퍼라아제 플럭스
(p/s) |
3.1 | 5.04E+10 |
3.2 | 1.88E+10 |
3.3 | 1.64E+10 |
3.4 | 1.36E+10 |
3.5 | 6.72E+09 |
3.6 | 3.84E+09 |
3.7 | 3.71E+09 |
3.8 | 3.70E+09 |
3.9 | 3.37E+09 |
3.10 | 2.56E+09 |
표 21에 나타낸 바와 같이, LNP 조성물 3.1~3.10은 주로 간 세포에 mRNA를 전달하고, 이어서 암호화된 단백질을 발현시킬 수 있었다.
실시예 9 - mRNA를 포함하는 본 개시의 LNP의 제조 및 생체 내 스크리닝
A. 제조
다음은 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질 및 mRNA를 포함하는 복수의 다중 성분 LNP 조성물을 제형화하기 위한 예시적인 방법을 제공하는 비제한적인 실시예이다.
LNP를 제형화하기 위해, 다양한 백분율의 생환원성 이온화 가능한 양이온성 지질 ssPalmO-Ph-P4C2, 인지질 (DOPE, DSPC, 또는 DOPC), 구조 지질, 콜레스테롤(Chol), 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG2000; Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA)를 합쳐서 LNP 조성물을 제조하였다.
200-프루프 HPLC-등급 에탄올에서 지질을 가용화하여 25 mg/ml의 스톡 용액을 개별적으로 제조하고, 제형화하기 전까지 스톡 용액을 -80℃에서 보관하였다. 제형화 시점에, 지질 스톡 용액을 실온으로 잠시 평형화시킨 다음, 50~55℃의 온도 범위로 유지되는 핫 플레이트 상에 두었다. 이어서, 뜨거운 지질 모액을 합쳐서 원하는 최종 몰 백분율을 수득하였다. LNP 조성물의 하위 집합은 표 22에 나타나 있다.
LNP ID |
ssPalmO-Ph-P4C2
(mol%) |
인지질
(mol%) |
Chol
(mol%) |
PEG-DMG
(mol%) |
총 지질 (mM) |
지질:RNA
(w/w) |
4.1 | 54 | 10% DOPE | 35 | 1 | 25 | 100 |
4.2 | 54 | 10% DOPC | 35 | 1 | 25 | 100 |
4.3 | 54 | 10% DSPC | 35 | 1 | 25 | 100 |
4.4 | 59 | 5% DOPC | 35 | 1 | 25 | 100 |
4.5 | 59 | 5% DSPC | 35 | 1 | 25 | 100 |
4.6 | 54 | 5% DOPC | 40 | 1 | 25 | 100 |
4.7 | 54 | 5% DSPC | 40 | 1 | 25 | 100 |
4.8 | 56.5 | 5% DOPC | 37.5 | 1 | 25 | 100 |
4.9 | 56.5 | 5% DSPC | 37.5 | 1 | 25 | 100 |
4.10 | 54 | 10% DOPE | 35 | 1 | 25 | 75 |
4.11 | 54 | 10% DOPC | 35 | 1 | 25 | 75 |
4.12 | 59 | 5% DOPC | 35 | 1 | 25 | 75 |
LNP에 혼입할 5’-CleanCap-5MeC-f루시페라아제 mRNA(TriLink Biotech)의 1 mg/ml 용액을 150 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.2)에 첨가하여 스톡 용액을 형성하고 얼음 위에 두었다. 제조사의 지침에 따라 NanoAssemblr® 기기(Precision Nanosystems, Vancouver, BC, Canada)를 사용하여 미세유체 칩 내부의 수성 mRNA 상과 지질 상을 혼합하여 캡슐화된 mRNA를 포함하는 LNP 조성물을 형성하였다. mRNA 캡슐화를 위한 나노조립 공정 파라미터는 표 23에 나타나 있다.
총 유속 (ml/분) | 지질 상:수성(RNA) 상 (v/v) |
20 | 1:3 |
그런 다음, 생성된 mRNA LNP 조성물을 분자량 컷오프(MWCO)가 8~10kDa인 Repligen Float-A-Lyzer 투석 장치(Spectrum Chemical Mfg. Corp, CA, USA)에 옮기고, 25 mM 아세트산나트륨(투석액:투석 완충액 부피 = 적어도 1:200 v/v), pH 5.5로 4℃에서 밤새(또는 대안적으로 실온에서 적어도 4시간 동안) 투석에 의해 처리하여 25% 에탄올을 제거하고, 완전한 완충액 교환을 달성하였다. 일부 실험에서, LNP를 초원심분리기의 Amicon® Ultra-4 원심분리 필터 유닛, MWCO-30kDa(Millipore Sigma, USA)에 넣고 약 4100 x g로 회전시켜 추가로 농축시켰다. 수크로오스를 mRNA LNP에 5%(w/v)의 최종 농도로 첨가한 다음, 추가로 사용할 때까지 4℃에서 보관하거나 -80℃로 냉동시켰다.
LNP의 평균 입자 크기는 직경으로 대략 80~103 nm였다.
B. 생체 내 스크리닝
표 22에 나타낸 LNP 조성물의 하위 집합과 함께 제형화한 0.5 mg/kg의 5’-CleanCap-5MeC-f루시페라아제 mRNA(TriLink Biotech)를 성체 암컷 BALB/C 마우스(n=2마리/군)에게 정맥 내 투여하였다. 일 군의 마우스는 음성 대조군으로서 비히클(PBS, Thermo Fisher Scientific, USA)로 치료하였다.
또 다른 실험에서, 표 22에 나타낸 LNP 조성물의 하위 집합과 함께 제형화한 1 mg/kg의 5’-CleanCap-5MeC-f루시페라아제 mRNA(TriLink Biotech)를 성체 암컷 BALB/C 마우스(n=3~4마리/군)에게 정맥 내 투여하였다. 일 군의 마우스는 음성 대조군으로서 비히클(PBS, Thermo Fisher Scientific, USA)로 치료하였다.
마우스를 마취시킨 뒤 4시간차에, 제조사의 지침에 따라 IVIS Lumina 생체 내 이미징 시스템(Perkin Elmer)을 사용하여 마취시킨 마우스의 생체발광 이미징(BLI)에 의해 치료된 마우스 및 대조군 마우스 내 루시페라아제의 발현 위치와 발현 정도를 결정하였다. 요약하자면, 산소 중 이소플루란을 사용해 마우스를 마취시키고, 가열된 스테이지에 반듯이 눕혔다. 그런 다음, 마우스에게 D-루시페린(Perkin-Elmer #122799)을 IP 투여하고, BLI를 수행하였다. 0.5 mg/kg 투여량 실험에 대한 결과는 표 24에 나타나 있고, 1 mg/kg 투여량 실험에 대한 결과는 표 25에 나타나 있다.
LNP ID |
평균 간 루시퍼라아제 플럭스
(p/s) |
4.1 | 3.42E+10 |
4.2 | 3.33E+10 |
4.3 | 1.53E+10 |
4.4 | 3.58E+10 |
4.5 | 1.26E+10 |
4.6 | 2.17E+10 |
4.7 | 1.37E+10 |
4.8 | 2.82E+10 |
4.9 | 1.42E+10 |
LNP ID |
평균 간 루시퍼라아제 플럭스
(p/s) |
4.1 | 1.05E+11 |
4.10 | 1.27E+11 |
4.2 | 1.51E+11 |
4.11 | 7.51E+10 |
4.4 | 1.07E+11 |
4.12 | 1.05E+11 |
표 24 및 25에 나타낸 바와 같이, 본 개시의 LNP 조성물은 생체 내에서 주로 간 세포에 mRNA를 전달하고, 이어서 암호화된 단백질을 발현시킬 수 있었다.
또한, 표 22의 LNP 조성물의 하위 집합으로 치료한 마우스의 체중을 정맥 내 투여 전 및 투여 후 24시간차에 평가하고, 베이스라인 체중과 치료 후 체중을 비교하였다. 표 22의 LNP 조성물 각각으로 치료한 각 마우스 군에 대한 평균 체중 변화율은 표 26에 나타나 있다.
LNP ID | 체중 변화율 (%) 24시간 |
4.1 | -7.3 |
4.10 | -2.2 |
4.2 | +2.7 |
4.11 | -1.7 |
4.4 | -5.4 |
4.12 | -4.7 |
표 26에 나타낸 바와 같이, 본 개시의 LNP 조성물은 대부분의 치료된 마우스에서 내약성이 양호하였는데, 이들 대부분은 원래 체중을 유지하거나 체중이 약간 증가하기도 하였다.
실시예 10 - 본 개시의 LNP 조성물은 면역 반응 및 독성을 감소시킨다.
A. 본 개시의 LNP에 대한 면역 반응
다음은 본 개시의 특이적 LNP 조성물을 시험관 내 투여한 결과, 인간 혈청 중 C3a의 혈청 수준에 의해 측정했을 때, 보체 활성화가 감소하였음을 입증하는 비제한적인 실시예이다.
LNP 조성물을 실시예 8에 기술된 바와 같이 제조하되, 표 27에 나타낸 몰 백분율로 제조하였다. HA-태그된 SPB를 암호화하는 서열을 포함하는 RNA 분자를 LNP 조성물로 캡슐화하였다.
LNP ID |
ssPalmO-Ph-P4C2
(mol%) |
인지질
(mol%) |
Chol
(mol%) |
PEG-DMG
(mol%) |
총 지질 (mM) |
지질:RNA
(w/w) |
5.0 | 54 | 10% DOPE | 35 | 1 | 25 | 100 |
5.2 | 54 | 10% DOPC | 35 | 1 | 25 | 100 |
5.3 | 54 | 10% DSPC | 35 | 1 | 25 | 100 |
정상 인간 혈청(NHS)을 37℃에서 해동하고, 100 μL를 1.5 mL 원심분리 튜브에 분취하였다. 그런 다음, NHS를 0.1 mg/mL의 LNP 조성물 16 μL로 치료하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 1:5000으로 희석하고, C3a ELISA 키트(Quidel)를 사용하여 분석하였다.
본 개시의 LNP 조성물로 치료한 샘플에서의 C3a의 수준을 벤치마크 포스포에탄올아민(PE)-계열 인지질을 포함하는 LNP 조성물로 치료한 샘플에서의 C3a의 수준과 비교하였으며, 그 값은 표 28에 보고되어 있다.
LNP 조성물 | C3a 농도 (ng/mL) |
5.0 | 10,566.7 |
5.2 | 4955.6 |
5.3 | 4633.4 |
표 28에 나타낸 바와 같이, 본 개시의 LNP 조성물 5.2 및 5.3은, 감소된 C3a 혈청 수준에 의해 나타난 것과 같이, 벤치마크 LNP 조성물과 비교했을 때 유의하게 감소된 면역 반응 프로파일을 나타냈다.
B. 독성 프로파일
또 다른 평가에서, LNP 투여 후 4시간 및 24시간 시점에 혈청에 존재하는 4개의 간 효소의 수준을 잠재적 간독성의 척도로서 평가하였다. LNP 조성물을 실시예 9에 기술된 바와 같이 제조하되, 표 29에 나타낸 몰 백분율로 제조하였다. 실시예 9에 기술된 바와 같이, LNP 조성물은 5’-CleanCap-5MeC-f루시페라아제 mRNA(TriLink Biotech)를 캡슐화하였다.
LNP ID |
ssPalmO-Ph-P4C2
(mol%) |
인지질
(mol%) |
Chol
(mol%) |
PEG-DMG
(mol%) |
총 지질 (mM) |
지질:RNA
(w/w) |
5.0 | 54 | 10% DOPE | 35 | 1 | 25 | 100 |
5.1 | 54 | 10% DOPE | 35 | 1 | 25 | 75 |
5.2 | 54 | 10% DOPC | 35 | 1 | 25 | 100 |
5.4 | 54 | 10% DOPC | 35 | 1 | 25 | 75 |
5.5 | 59 | 5% DOPC | 35 | 1 | 25 | 100 |
5.6 | 59 | 5% DOPC | 35 | 1 | 25 | 75 |
요약하자면, 4시간차 및 24시간차에 혈액을 채취하고, 각각의 샘플을 20분 동안 응고시키고, 13K rpm으로 3분 동안 원심분리하여 원하지 않는 세포와 잔해를 제거하였다. 수송을 위해 젖은 얼음 위에 샘플을 두고, 분석하기 전까지 -80℃에서 보관하였다. 효소 수준은 표준화된 검정(IDEXX)을 사용하여 결정하였다.
24시간차에 간 효소 아스파르테이트 아미노전이효소(AST), 알라닌 아미노전이효소(ALT), 알칼리 인산분해효소(ALP), 및 크레아틴 키나아제(CK)의 수준은 표 30a 내지 표 30d에 각각 나타나 있다. 본 개시의 LNP 조성물로 치료한 샘플에서의 각각의 간 효소 수준을 벤치마크 포스포에탄올아민(PE)-계열 인지질을 포함하는 LNP 조성물로 치료한 샘플에서의 각각의 간 효소 수준과 비교하였으며, 그 값은 표 30a 내지 표 30d에 보고되어 있다.
표 30a 내지 표 30d에 나타낸 바와 같이, 본 개시의 특이적 LNP 조성물은, 감소된 혈청 간 효소 수준에 의해 나타난 것과 같이, 벤치마크 LNP 조성물과 비교했을 때 유의하게 감소된 독성 프로파일을 나타냈다.
실시예 11 - LNP를 이용해 생체 내에서 간에 DNA 전달하기
다음은 본 개시의 LNP 조성물이 생체 내에서 간 세포에 DNA를 전달하는 데 사용될 수 있고, 암호화된 단백질을 발현시킬 수 있음을 입증하는 비제한적인 실시예이다.
반딧불이 루시페라아제(이하 “Fluc”; TriLink)를 암호화하는 DNA를 포함하는 본 개시의 LNP 조성물은, ssPalmO-Ph-P4C2, 인지질 DOPC, 구조 지질 콜레스테롤(Chol), 및 1,2-디리스미토일-sn-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG2000)을 표 31에 제시된 몰 백분율로 합쳐서 실시예 9에 기술된 바와 같이 제조하였다.
LNP ID | ssPalmO-Ph-P4C2 | DOPC | 콜레스테롤 | DMG-PEG2000 | 지질 배합물 (mM) |
지질:DNA
(w/w) |
D6 | 54 | 10 | 35 | 1 | 25 | 100:1 |
성체 BALB/C 마우스에게 표 31에 열거된 LNP 조성물을 0.5 mg/kg(총 DNA)(n=4마리)으로 투여하였다. 마우스를 마취시킨 뒤 4시간차에, 제조사의 지침에 따라 IVIS Lumina 생체 내 이미징 시스템(Perkin Elmer)을 사용하여 마취시킨 마우스의 생체발광 이미징(BLI)에 의해 치료된 마우스 및 대조군 마우스 내 루시페라아제의 발현 위치와 발현 정도를 결정하였다. 요약하자면, 산소 중 이소플루란을 사용해 마우스를 마취시키고, 가열된 스테이지에 반듯이 눕혔다. 그런 다음, 마우스에게 D-루시페린(Perkin-Elmer #122799)을 IP 투여하고, BLI를 수행하였다. 결과는 표 32에 나타나 있다.
LNP ID |
평균 간 루시퍼라아제 플럭스
(p/s) |
D6 | 1.35E+07 |
표 32에 나타낸 바와 같이, 본 개시의 LNP 조성물은 간 세포에 DNA를 전달하여, 암호화된 이식 유전자를 간 세포에서 발현할 수 있었다.
실시예 12 - 혈우병 치료를 위한 본 개시의 LNP
다음은 본 개시의 조성물 및 방법이 혈우병, 보다 구체적으로는 A형 혈우병을 치료하는 데 사용될 수 있음을 입증하는 비제한적인 실시예이다.
신생아, 야생형 BALB/c 마우스(n=5~6마리)에게 0.25 mg/kg FVIII 트랜스포존 LNP를 다음 중 하나와 공동으로 전달하였다: 1) 기능적 SPB를 캡슐화하는 1 mg/kg의 LNP(“기능적 SPB”); 또는 2) 촉매적으로 결핍된 SPB를 캡슐화하는 0.5 mg/kg의 LNP(“결핍 SPB”).
FVIII 트랜스포존 LNP는 트랜스포존을 포함하는 나노플라스미드 DNA를 포함하는 본 개시의 ssPalmO-Ph-P4C2-함유 LNP였는데, 여기서 트랜스포존은, 제1 piggyBac 역위 말단 반복(우측 ITR), 이어서 제1 절연 서열, 이어서 SERPINA1 인핸서의 3개의 탠덤 사본, 이어서 트랜스티레틴(TTR) 인핸서/프로모터 및 미세 마우스 바이러스(MVM) 인트론 서열, 이어서 변형된 인간 인자 VIII(FVIII)을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열, 이어서 AES 미번역 영역(UTR), 이어서 mTRNR1 UTR, 이어서 SV40-후기 폴리아데닐화 및 절단 신호 서열, 이어서 제2 절연 서열, 이어서 제2 piggyBac 역위 말단 반복(좌측 ITR)을 포함하는 발현 카세트를 포함하였다. 트랜스포존의 서열은 서열번호 34로 제시되어 있다. FVIII 트랜스포존 LNP는 ssPalmO-Ph-P4C2, DOPE, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2000을 54:10:35:1의 몰비로 포함하고, 지질:DNA 비율은 100:1(w/w)이었다.
기능적 SPB LNP는 활성 SPB를 암호화하는 mRNA, 및 ssPalmO-Ph-P4C2, DOPE, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2000을 54:10:35:1의 몰비로 포함하는 본 개시의 ssPalmO-Ph-P4C2-함유 LNP이고, 지질:RNA 비율은 100:1(w/w)이었다. 결핍 SPB LNP는 촉매적으로 결핍된 SPB를 암호화하는 mRNA, 및 C12-200, DOPE, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2000을 33.5:32:33.5:1의 몰비로 포함하는 본 개시의 C12-200-함유 LNP였다. 기능적 SPB 또는 결핍 SPB 중 어느 하나를 암호화하는 mRNA 내의 모든 시티딘 잔기는 5-메틸시티딘(5-MeC)이었다.
LNP를 투여하기 전에, 신생아 새끼를 짧은 시간(약 3분) 동안 얼음 위에 놓아 마취를 유도하였다. 공동 전달 투여를 위해, DNA-LNP 및 mRNA-LNP 둘 다를 튜브에서 함께 혼합하고, 30 μL를 단일 29 게이지 인슐린 주사기에 흡인하고, 안면 정맥을 통해 정맥 내(IV) 전달하였다. 새끼를 37℃의 가열 패드 상에서 정상 체온으로 되돌린 후 모체에게 돌려보냈다. 치료 후 2, 4, 6, 및 8주차에, 치료한 마우스로부터 혈장을 채취하였다. 혈장 채취를 위해, 치료한 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, 약 150 μL의 전혈을 안구 뒷쪽에서 채취하고, 전혈을 10% 부피의 3.2% 구연산나트륨과 혼합하고, 20℃에서 15,000 g로 15분 동안 원심분리하고, 혈장 상청액을 채취하였다. Visualize™ 인자 VIII 항원 플러스 키트(Afkinity Biologicals™ Inc.)를 사용하여 hFVIII 항원 수준을 측정하였다.
이 분석의 결과는 도 4에 도시되어 있다. 도 4는 SPB LNP의 투여 후 최대 8주까지 샘플에서 초-치료 인간 FVIII 단백질 수준이 관찰되었음을 보여준다.
본 실시예에서 제시된 결과는, 본 개시의 LNP가 생체 내에서 높은 수준의 FVIII 발현을 유도하는 데 사용될 수 있고, 따라서 본 개시의 조성물 및 방법이 혈우병 A를 치료하는 데 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 13 - 생체 내에서 본 개시의 LNP 조성물은 높은 특이성으로 RNA를 간에 전달한다.
본 실험은 본 개시의 LNP 조성물이 Cas-CLOVER mRNA를 간에 전달하고, gRNA 쌍에 의해 psk9 유전자에 대해 표적화시키고, 이어서 생체 내에서 psk9 유전자를 유전자 편집할 수 있게 하는 능력을 보여준다. Pcsk9 단백질은 간세포에 의해 분비되고 LDL 수용체에 결합하여, 이의 내재화 및 리소좀 분해를 유도하여, LDL-콜레스테롤의 순환 수준을 증가시킨다.
본 실험에서, 성체 암컷 BALB/C 마우스의 각 군(n=2마리/군)에게 5’-CleanCap-5MeC-Cas-CLOVER(서열번호 31)를 암호화하는 mRNA 및 마우스 pcsk9 유전자의 제1 엑손에 대해 표적화된 한 쌍의 gRNA(서열번호 29~30)를 정맥 내 공동 투여하였다. mRNA 및 gRNA 분자는 ssPalmO-Ph-P4C2, DOPE, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2000을 54:10:35:1의 몰비로 포함하는 본 개시의 LNP 조성물(표 33 내지 36에서 LNP 조성물 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 및 6.5로서 지칭됨) 내에 제형화하였다. mRNA 내의 모든 시티딘 잔기는 5-메틸시티딘(5-MeC)이었다.
표 33에 나타낸 총 RNA 투여량을 포함하는 본 개시의 LNP 조성물을 각 군의 마우스에게 투여하였다. 일 군의 마우스에게, 벤치마크 C12-200 LNP 조성물에 공동으로 캡슐화된 Cas-CLOVER mRNA 및 한 쌍의 pcsk9 gRNA의 투여량을 투여하였다. 일 군의 마우스는 음성 대조군으로서 비히클(PBS, Thermo Fisher Scientific, USA)로 치료하였다.
LNP 조성물 | 총 RNA (mRNA 및 gRNA) 투여량 (mg/kg) | mRNA/gRNA 비 |
C12-200 | 1 | 1:1 |
6.1 | 0.5 | 1:1 |
6.2 | 1 | 1:1 |
6.3 | 1.5 | 1:1 |
6.4 | 2 | 1:1 |
6.5 | 3 | 1:1 |
투여 후 7일차에, 각 군의 마우스의 다음 4가지 조직 유형으로부터 DNA를 단리하였다: 간, 비장, 폐, 및 신장. 요약하자면, 안락사 후 조직을 절제하여, 액체 질소에서 급속 냉동시키고, 용리 완충액과 혼합하고(200 uL의 용리 완충액 + 10uL 단백분해효소 K 중 15 mg의 조직), Triple-Pure 지르코늄 비드(Fisher Scientific)를 사용하여 TissueLyser II(Qiagen)에서 분쇄하였다. 그런 다음, 균질화된 조직을 56℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 제조사(New England Biolabs)의 의 지침에 따라 Monarch Genomic DNA 정제 키트를 사용하여 컬럼 정제하였다. 50 uL의 용리 완충액(10 mM 트리스-Cl, pH 8.5)에서 최종 DNA 용리를 수행하였다. DNA 샘플의 농도 및 순도는 Nanodrop을 사용하여 260 및 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 평가하였다. 또한, LDL-C 정량화를 위해 혈액 샘플을 채취하였다. 요약하자면, 안락사 후 2ml 주사기와 25G 바늘을 사용하여 심장 천자를 통해 500uL의 혈액을 채취하고, 마이크로원심분리 튜브에 옮기고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하고, 15분 동안 1500g로 원심분리하여 세포 분획을 혈청으로부터 분리하였다. 혈청 분획(200 uL)을 새로운 튜브에 옮기고 추가 분석 시까지 -80℃에서 보관하였다.
또한, 표 33의 LNP 조성물로 치료한 마우스의 체중을 투여 후 7일 동안 평가하고, 베이스라인 체중과 치료 후 체중을 비교하였다. 표 33의 LNP 조성물 각각으로 치료한 각 마우스 군을 대상으로 치료 후 7일차의 평균 체중 변화율은 표 34에 나타나 있다.
LNP ID | 체중 변화율 (%) 7일차 |
벤치마크 C12-200 LNP | 3.25% |
6.1 | 4.11% |
6.2 | 0.51% |
6.3 | 4.38% |
6.4 | 3.09% |
6.5 | 3.86% |
표 34에 나타낸 바와 같이, 본 개시의 LNP 조성물은 대부분의 치료된 마우스에서 내약성이 양호하였는데, 이들 대부분은 원래 체중을 유지하거나 체중이 약간 증가하기도 하였다.
마우스에게 전달된 Cas-CLOVER mRNA에 의한 유전자 편집을 차세대 시퀀싱(NGS)에 의해 측정하였다. 요약하자면, Pcsk9 엑손 1의 측면에 위치하고 Illumina 부분 어댑터를 함유하는 프라이머로 게놈 DNA 샘플을 먼저 증폭시켰다. 생성된 앰플리콘은 Illumina P5과 P7 서열 및 고유 인덱스 서열(New England Biolabs)을 함유하는 프라이머로 두 번째 PCR 반응을 수행하였다. 최종 앰플리콘을 등몰 농도로 풀링하고, Miseq 마이크로 키트 v2 300-사이클(Illumina)에 로딩하고, 앰플리콘 시퀀싱에 대한 표준 Illumina 절차에 따라 Miseq 벤치탑 시퀀서에서 시퀀싱을 수행하였다. 그런 다음, CRISPResso2를 사용하여 시퀀싱 데이터를 분석하여 각 샘플에서 삽입/결실(인델)의 빈도를 결정하였다. NGS의 결과는 pcsk9 유전자에서 발견된 인델의 백분율로서 표 35에 제공되어 있다.
LNP ID | Pcsk9 인델 (%) |
C12-200 | 45.11% |
6.1 | 12.38% |
6.2 | 20.66% |
6.3 | 49.19% |
6.4 | 63.27% |
6.5 | 63.78% |
표 35에 나타낸 바와 같이, pcsk9 유전자의 후속 유전자 편집에 의해 나타난 것과 같이, 본 개시의 LNP 조성물은 Cas-CLOVER mRNA를 간에 성공적으로 전달하였으며, 총 RNA 투여량이 1.5 mg/kg 이상인 경우에, 인델 비율은 벤치마크 C12-200 조성물과 같거나 더 양호하였다.
마우스에서 pcsk9 단백질의 혈청 수준도 투여 후 7일차에 측정하였으며, 그 결과는 표 36에 나타나 있다. 요약하자면, 제조사의 지침에 따라 마우스 Pcsk9 ELISA 키트(Biolegend)를 사용하여 각 혈청 샘플에서 Pcsk9를 결정하였다. 모든 혈청 샘플을 3회 검정하였고, 결과는 PBS-치료 마우스의 Pcsk9 수준 대비 Pcsk9 수준의 감소율로서 표현하였다.
LNP ID | Pcsk9 환원 |
C12-200 | 78.23% |
6.1 | 11.47% |
6.2 | 38.73% |
6.3 | 75.96% |
6.4 | 82.66% |
6.5 | 81.09% |
종합하면, 표 35 및 36의 결과는 본 개시의 LNP 조성물에 의해 생체 내 전달된 Cas-CLOVER mRNA가 간에서 pcsk9 유전자를 편집하는 데 효과적임을 보여준다. 벤치마크 대비 높은 인델 비율(%) 및 베이스라인 대비 낮은 pcsk9 단백질 발현 수준에 의해 나타난 것과 같이, 유전자 편집 효능은 2 mg/kg의 총 RNA일 때 최대이다.
실시예 14 - 본 개시의 LNP는 비인간 영장류에 mRNA를 전달한다.
다음은 본 개시의 조성물이 비인간 영장류(NHP)에게 mRNA를 생체 내 전달하는 데 사용될 수 있고, 전달된 mRNA가 NHP에서 내약성이 양호함을 입증하는 비제한적인 실시예이다.
제1 연구에서, 인간 에리트로포이에틴(hEPO) 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 mRNA 분자를 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2 SS-OP, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는 본 개시의 지질 나노입자(도 5에서 Poseida mRNA LNP로서 지칭됨)에 캡슐화하였다.
hEPO mRNA가 캡슐화된 본 개시의 LNP를 2마리의 원숭이에게 투여하고, 벤치마크 지질 나노입자 조성물인 MC3을 1마리의 원숭이에게 투여하였다. 원숭이에게 상승 투여량의 LNP를 투여하였는데, 0.25 mg/kg의 투여량을 1일차에 투여하고 0.5 mg/kg의 투여량을 21일차에 투여하였다. 다음 시점에 각각 주입한 후 1주일 동안 혈액을 샘플링하였다: 0시간차, 1시간차, 4시간차, 12시간차, 24시간차, 48시간차, 72시간차, 및 168시간차. 모든 채혈은 비공복 상태에서 이루어졌고, 채혈량은 2 mL씩이었다.
1일차 투여(0.25 mg/kg 투여량) 후 채혈된 혈액 샘플에서 인간 에리트로포이에틴(hEPO)의 수준을 표준화된 검정을 사용하여 결정하였다. 요약하자면, 표준화된 방법을 사용해 전혈을 혈청으로 가공하였다. NHP에 최적화된 ELISA 키트(R&D Systems)를 사용해 혈청에서 hEPO를 검출하였다. 도 5는, 주입 후 168시간에 걸쳐, 본 개시의 LNP로 치료한 원숭이의 샘플에서의 hEPO 수준이 벤치마크 조성물로 치료한 원숭이의 샘플에서의 hEPO 수준보다 더 높았음을 보여준다. 도 5에 도시된 바와 같이, 본 개시의 LNP를 투여한 후의 피크 EPO 수준은 주입 후 약 12시간에 도달하였으며; 또한 도 5에 도시된 바와 같이, 피크 EPO 수준은 168시간에 걸쳐 벤치마크 LNP를 투여한 후의 피크 hEPO 수준의 3배만큼 높았다.
이 연구의 결과는 혈청에서 측정된 hEPO의 수준 증가에 의해 입증된 바와 같이 mRNA가 생체 내에서 NHP에 전달되었음을 보여준다.
또 다른 연구에서, 본 개시의 LNP로 치료한 랫트 및 NHP의 혈청에서 2가지 간 효소의 수준을 잠재적 간독성의 척도로서 측정하였다. 본 연구의 실험에서, HA-태그된 SPB를 암호화하는 서열을 포함하는 5MeC-mRNA 분자를 약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2 SS-OP, 약 35 mol%의 콜레스테롤, 약 10 mol%의 DOPE, 및 약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하는 본 개시의 지질 나노입자에 캡슐화하였다.
제1 실험에서, 0, 0.25, 0.5, 및 1 mg/kg의 농도로 본 개시의 LNP를 투여한 후 4시간, 24시간, 및 7일차에 성체 랫트의 혈청에 존재하는 간 효소인 아스파르테이트 아미노전이효소(AST) 및 알라닌 아미노전이효소(ALT)의 수준을 평가하였다. 랫트(n=3마리)에게 본 개시의 LNP 또는 비히클(PBS)을 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주입하고, 4시간차, 24시간차, 및 7일차에 혈액을 채취하였다.
별도의 실험에서, 0, 0.1, 및 0.25 mg/kg의 농도로 본 개시의 LNP를 투여한 후 0시간, 24시간, 및 7일차에 암컷 시노몰구스 원숭이의 혈청에 존재하는 AST 및 ALT의 수준을 평가하였다. 원충이(n=2~3마리)에게 본 개시의 LNP 또는 비히클(PBS)을 주입하고, 0시간차, 24시간차, 및 7일차에 혈액을 채취하였다.
혈청 샘플을 채취한 후, 각각의 샘플을 20분 동안 응고시키고, 13K rpm으로 3분 동안 원심분리하여 원하지 않는 세포와 잔해를 제거하였다. 수송을 위해 젖은 얼음 위에 샘플을 두고, 분석하기 전까지 -80℃에서 보관하였다. 효소 수준은 표준화된 검정을 사용하여 결정하였다.
본 연구의 2개의 상이한 실험의 시험 대상체에서 7일 후의 AST 및 ALT에 대한 수준은 도 6에 도시되어 있다. 도 6에 도시된 바와 같이, 본 개시의 LNP 조성물을 생체 내 투여한 결과, 7일 후 랫트 및 NHP 둘 다의 혈청 내 AST 및 ALT 수준에 있어서 유의미한 증가가 없었다.
실시예 15 - 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 결핍증의 치료를 위한 본 개시의 LNP
다음은 본 개시의 조성물 및 방법이 OTC 결핍증을 치료하는 데 사용될 수 있음을 입증하는 비제한적인 실시예이다.
1일령 B6EiC3Sn 수컷 OTCD 새끼(n=4~9마리)에게 다음 치료를 투여하였다:
치료 #1:인간 OTC (hOTC ) 트랜스포존 AAV 바이러스 벡터 입자
치료 #2: 인자 OTC (hOTC) 트랜스포존 AAV 바이러스 벡터 입자와 SPB LNP의 병용.
인자 OTC (hOTC) 트랜스포존 AAV 바이러스 벡터 입자는 piggyBac 트랜스포존을 포함하는 AAV 바이러스 벡터 입자였는데, 여기서 piggyBac 트랜스포존은 인간 OTC 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하였다.
SPB LNP는 활성 SPB를 암호화하는 mRNA를 포함하는 본 개시의 ssPalmO-Ph-P4C2-함유 LNP였다. SPB LNP는 ssPalmO-Ph-P4C2, DOPE, 콜레스테롤, 및 DMG-PEG2000을 54:10:35:1의 몰비로 포함하고, 지질:RNA 비율은 100:1(w/w)이었다.
잔여 내인성 마우스 OTC가 제거된 OTCD 마우스에서, 내인성 마우스 OTC를 표적으로 하는 shRNA를 암호화하는 서열을 포함하는 별도의 AAV8 바이러스 벡터 입자를 사용하여 중증 질환을 유도하였는데; 이 모델에서는, 인간 OTC 이식 유전자를 사용한 성공적인 유전자 요법만이 중증 OTCD를 구제할 수 있다.
두 치료 모두를 위해, 마우스에게 상승 투여량의 hOTC 트랜스포존 AAV 바이러스 벡터를 투여하였는데; 치료 #2 군의 마우스에게도 0.5 mg/kg의 SPB LNP를 투여하였다. 도 7은 치료 투여 후 47일차에, 중증 OTC 질환 유도 후 전체 투여량 범위에 걸쳐 심각한 OTCD 사망율이 나타난 AAV 단독 치료와 비교했을 때, 치료 #2 군에서 OTC 결핍 마우스의 100% 생존율이 관찰되었음을 보여준다.
추가로, 치료 #2 군의 마우스의 간에서 통합된 바이러스 복제수(VCN) 및 hOTC mRNA의 수준을 액적 디지털 PCR(ddPCR) 및 실시간 qPCR에 의해 각각 측정하였다. 요약하자면, DNA Rapidlyse 키트(Macherey-Nagel)을 사용하여 분말화된 간 조직으로부터 DNA를 단리하고, hOTC 이식유전자의 3’ UTR 및 piggyBac ITR 외부의 AAV 백본을 표적화하는 별도의 프라이머를 사용하는 QX200 Auto DG 액적 디지털 PCR 시스템(Biorad)으로 벡터 사본을 분석하여 에피솜 벡터 사본과 통합 벡터 사본을 구별하였다. HMBS(하이드록시메틸빌란 합성효소) 유전자에 대한 프라이머를 사용하여 마우스 세포의 수를 정규화하였다. mRNA 정량화를 위해, RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 사용해 분말화된 간 조직으로부터 mRNA를 단리하고, cDNA로 변환시킨 후(고용량 RNA-cDNA 키트, ThermoFisher로), hOTC 및 mActb(베타-액틴)를 표적으로 하는 특이적 프라이머 세트를 사용하는 실시간 정량 qPCR(Applied Biosystems QuantStudio 6)에 의해 유전자 발현을 분석하였다. 도 8은 통합 VCN 및 hOTC mRNA 수준 모두에서 AAV 투여량 의존적 증가를 보여주는데, 이는 hOTC 트랜스포존 AAV 바이러스 벡터 입자와 본 개시의 SPB LNP와 병용 투여가 기능적 OTC 유전자를 간에 성공적으로 통합하였음을 입증한다.
또 다른 연구에서, OTCD에서 증가하는 바이오마커인 오로트산의 수준을 치료된 마우스의 소변에서 측정하였다. 요약하자면, 1일령 B6EiC3Sn 수컷 새끼(유전자형 확인은 21일령이 되어야만 가능함)(최저 투여량군의 경우 n = 3마리, 나머지 그룹의 경우 6~8마리)에게 2E13 vg/kg의 hOTC 트랜스포존 AAV 바이러스 벡터 입자를 SPB LNP의 투여량을 증량시키면서 병용 투여하였다. 오로트산 수준을 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광분석(LC-MS/MS)에 의해 측정하였다. 요약하자면, 희석한 소변 샘플을 역상 HPLC 컬럼으로 분석하고, 이어서 Micromass Quattro를 음성 이온화 모드에서 사용해 MS/MS를 검출하였다. 친수성 상호작용 LC-MS/MS를 사용해 소변에서 크레아티닌 수준을 측정하여 결과를 정규화하고, 양성 이온화 모드에서 데이터를 수집하였다. 도 9는, 중증 OTC 질환을 유도한 후 치료 투여 후 47일차에, 오로트산의 투여량 의존적 감소와 함께 SPB LNP의 전체 투여량 범위에 걸쳐 마우스의 100% 생존율이 관찰되었음을 보여준다.
본 실시예에서 제시된 결과는, 본 개시의 LNP가 생체 내에서 높은 수준의 인간 OTC 폴리펩티드 발현을 유도하는 데 사용될 수 있고, 따라서 본 개시의 조성물 및 방법이 OTCD를 치료하는 데 사용될 수 있음을 입증한다. 또한, 본 개시의 LNP는 OTC 유전자를 간 내로 성공적으로 통합시키고, 오로트산에 의해 측정된 것과 같이, 질환 표현형을 해결하는 데 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Poseida Therapeutics, Inc.
<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR DELIVERY OF NUCLEIC ACIDS
<130> POTH-066/001WO 325002-2570
<150> US 63/152,517
<151> 2021-02-23
<150> US 63/164,174
<151> 2021-03-22
<150> US 63/197,946
<151> 2021-06-07
<150> US 63/156,649
<151> 2021-03-04
<160> 65
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4596
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequences
<400> 1
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggccgcga agactcttaa ccctagaaag ataatcatat tgtgacgtac 180
gttaaagata atcatgcgta aaattgacgc atgtgtttta tcggtctgta tatcgaggtt 240
tatttattaa tttgaataga tattaagttt tattatattt acacttacat actaataata 300
aattcaacaa acaatttatt tatgtttatt tatttattaa aaaaaaacaa aaactcaaaa 360
tttcttctat aaagtaacaa aacttttatc aaatacctgc agcccggggg atgcagaggg 420
acagcccccc cccaaagccc ccagggatgt aattacgtcc ctcccccgct agggggcagc 480
agcgagccgc ccggggctcc gctccggtcc ggcgctcccc ccgcatcccc gagccggcag 540
cgtgcgggga cagcccgggc acggggaagg tggcacggga tcgctttcct ctgaacgctt 600
ctcgctgctc tttgagcctg cagacacctg gggggatacg gggaaaagtt gactgtgcct 660
ttcgatcgag tactcctagg cgcgtgtttg ctgcttgcaa tgtttgccca ttttagggtg 720
gacacaggac gctgtggttt ctgagccagg gggcgactca gatcccagcc agtggactta 780
gcccctgttt gctcctccga taactggggt gaccttggtt aatattcacc agcagcctcc 840
cccgttgccc ctctggatcc actgcttaaa tacggacgag gacagggccc tgtctcctca 900
gcttcaggca ccaccactga cctgggacag tgaatcgcaa agcttattgg acgtcgctta 960
gcggtaccgc caccatgctg ttcaacctgc gcatcctgct gaacaacgcc gccttcagaa 1020
acggccacaa cttcatggtt cgaaacttca gatgcggcca gcctctccag aacaaggtgc 1080
agctgaaagg cagggacctg ctgaccctga agaacttcac cggcgaagag atcaagtaca 1140
tgctgtggct gtccgccgac ctgaagttca gaatcaagca gaagggcgag tacctgcctc 1200
tgctccaggg aaagtctctg ggcatgatct tcgagaagcg gagcaccaga accagactga 1260
gcaccgagac aggctttgcc ctgctcggag gacacccctg ctttctgaca acccaggaca 1320
tccacctggg cgtgaacgag agcctgaccg atacagccag agtgctgtcc tctatggccg 1380
atgccgtgct ggctagagtg tataagcaga gcgacctgga caccctggct aaagaggcca 1440
gcattcccat catcaacggc ctgtccgacc tgtatcaccc catccagatc ctggccgact 1500
acctgacact gcaagagcac tacagcagcc tgaagggact gaccctgtct tggatcggcg 1560
acggcaacaa catcctgcac agcattatga tgagcgccgc caagttcgga atgcacctcc 1620
aggccgctac acccaagggc tatgaacctg atgccagcgt gacaaagctg gccgagcagt 1680
acgccaaaga gaacggcaca aagctgctgc tgaccaacga tcccctggaa gctgctcacg 1740
gcggcaatgt gctgatcacc gatacctgga tcagcatggg ccaagaggaa gagaagaaga 1800
agcggctgca agccttccag ggctaccaag tgaccatgaa gacagccaag gtggccgcca 1860
gcgattggac ctttctgcac tgcctgcctc ggaagcctga agaggtggac gacgaggtgt 1920
tctacagccc tagaagcctg gtgttccccg aggccgagaa cagaaagtgg accatcatgg 1980
ctgtgatggt gtctctgctg accgactact cccctcagct ccagaagcct aagttctaat 2040
gaagatctca tatgccttta attaaacact agttctatag tgtcacctaa attcccttta 2100
gtgagggtta atggccgtag gccgccagaa ttgggtccag acatgataag atacattgat 2160
gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt 2220
gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat 2280
tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg aggttttttc ggactctagg 2340
acctgcgcat gcgcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgttttc cccgtatccc 2400
cccaggtgtc tgcaggctca aagagcagcg agaagcgttc agaggaaagc gatcccgtgc 2460
caccttcccc gtgcccgggc tgtccccgca cgctgccggc tcggggatgc ggggggagcg 2520
ccggaccgga gcggagcccc gggcggctcg ctgctgcccc ctagcggggg agggacgtaa 2580
ttacatccct gggggctttg ggggggggct gtccctctca ccgcggtgga gctccagctt 2640
ttgttcgaat tggggccccc cctcgagggt atcgatgata tctataacaa gaaaatatat 2700
atataataag ttatcacgta agtagaacat gaaataacaa tataattatc gtatgagtta 2760
aatcttaaaa gtcacgtaaa agataatcat gcgtcatttt gactcacgcg gtcgttatag 2820
ttcaaaatca gtgacactta ccgcattgac aagcacgcct cacgggagct ccaagcggcg 2880
actgagatgt cctaaatgca cagcgacgga ttcgcgctat ttagaaagag agagcaatat 2940
ttcaagaatg catgcgtcaa ttttacgcag actatctttc tagggttaat ctagctagcc 3000
ttaagggcgc tttcctggac tacttcagac gaacttcgta gggcgcataa gtctcgacca 3060
cgcaatgacg cagcgatgct tgaaaaaaac accgctttca aggcggctgg acgaagaccg 3120
caagacaccc tccacctcac ctagcctgta tctctgcaat agcctaatta cttcggaatc 3180
tcctgtcgta attccttaga taaacggcaa ttaggtgaca ctctaaatct gtgtggaacc 3240
ggcttccaaa cactctacca cctctattag tgacacagag agaatccttg agtggcttct 3300
aggtatattg aacaacttca tcacgaattg agcagtgatc atggttctac gtatcaacca 3360
atattaacca ctgtgctctg tagcattgct aaatcgggct gtctgtttca ccatagatcg 3420
tgaggccatg cccacgggca ttagaactta gcctgtttag cgataatccc aacaatgagc 3480
tgggatatga cgagaagtat ttagcaacct tttcgtgatc ggctacgtaa aacctcatat 3540
tacggcatgt acctgatcat tgacctcagg ccatacgcat gtgggagaat agagggaata 3600
gcacgatata ctgcctccct tatcttcctc aggttgaggc gcaatgatta tcactgctac 3660
gggcacagtg ttactatcgg gatcagggac tgtgtctgta cccggttcta ccacgccgta 3720
gctcccacat tgtcgccgta ctggtagtaa cctaccagta ctacagggac aggtcagatt 3780
attcttagaa tgcctgtgta tagtttagag ccatagattg ccgagaaacg aagagagtgt 3840
atcacggcga tttacggagt caagatagca acacatagga gtaccaaatc aataagtgta 3900
gtagagttac aagtcgctcc cgagaatcag gtgatacttc tcaatcgtcg gaaacctgta 3960
acgattagac cgcgtattag ttccatctaa tgatattgcc aagtactaaa cctcaatcac 4020
ataacaacgc atcaggctag cgacatcata ggagtcctgc aacatacgca ggcgtccagc 4080
gtcataaacg caggtgatga gtgccttatg caatctgggg cacaccaata cgagaatacc 4140
acgtcgttag ggccagcctg cgcttggtac gtgatcgagg agtatcgtct tgtgcacaca 4200
aacaaaatag actgggtccc aagcgcactt agacaaggca ttgtactact caagtgttgg 4260
atgtgaggaa tgatacaatc gaaccccgtc gttcggtcaa caatttggct agagctgtgt 4320
tgatacacag cggacgggag ttacggggac agtcctccga gctggccagc aagatgcagc 4380
tgacgcctgc accggaagta atccggaggc cggccaggcc tcctgcgagg gggcgcctcg 4440
agaccttgcg gccgcaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc 4500
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<210> 2
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequences
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequences
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<223> Synthetic Sequences
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<210> 12
<211> 6234
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequences
<400> 12
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acgcatgtgg gagaatagag ggaatagcac gatatactgc ctcccttatc ttcctcaggt 4020
tgaggcgcaa tgattatcac tgctacgggc acagtgttac tatcgggatc agggactgtg 4080
tctgtacccg gttctaccac gccgtagctc ccacattgtc gccgtcacgt cgttagggcc 4140
agcctgcgct tggtacgtga tcgaggagta tcgtcttgtg cacacaaaca aaatagactg 4200
ggtcccaagc gcacttagac aaggcattgt actactcaag tgttggatgt gaggaatgat 4260
acaatcgaac cccgtcgttc ggtcaacaat ttggctagag ctgtgttgat acacagcgga 4320
cgggagttac ggggacagtc ctccgagctg gccagcaaga tgcagctgac gcctgcaccg 4380
gaagtaatcc ggaggccggc caggcctcct gcgagggggc gcctcgagac cttgcggccg 4440
caggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag 4500
gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 4560
cgagcgcgca gctgcctgca gg 4582
<210> 20
<211> 4137
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequences
<400> 20
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggccgcga agactcttaa ccctagaaag ataatcatat tgtgacgtac 180
gttaaagata atcatgcgta aaattgacgc atgtgtttta tcggtctgta tatcgaggtt 240
tatttattaa tttgaataga tattaagttt tattatattt acacttacat actaataata 300
aattcaacaa acaatttatt tatgtttatt tatttattaa aaaaaaacaa aaactcaaaa 360
tttcttctat aaagtaacaa aacttttatc gaatacctgc agcccggggg atgcagaggg 420
acagcccccc cccaaagccc ccagggatgt aattacgtcc ctcccccgct agggggcagc 480
agcgagccgc ccggggctcc gctccggtcc ggcgctcccc ccgcatcccc gagccggcag 540
cgtgcgggga cagcccgggc acggggaagg tggcacggga tcgctttcct ctgaacgctt 600
ctcgctgctc tttgagcctg cagacacctg gggggatacg gggaaaagtt gactgtgcct 660
ttcgatcgaa ctcgtcgact aggcgcggtc tgtctgcaca tttcgtagag cgagtgttcc 720
gatactctaa tctccctagg caaggttcat attgacttag gttacttatt ctccttttgt 780
tgactaagtc aataatcaga atcagcaggt ttggagtcag cttggcaggg atcagcagcc 840
tgggttggaa ggagggggta taaaagcccc ttcaccagga gaagccgtca cacagatcca 900
caagctcctg ctagcaggta agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg 960
gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactg acactgacat ccactttttc tttttctcca 1020
caggaattcc taggccacca tgcagcgcgt gaacatgatt atggccgagt ctcccggcct 1080
gatcaccatc tgtctgctgg gctatctgct gagcgccgag tgcaccgtgt ttctggatca 1140
cgagaacgcc aacaagatcc tgaacagacc caagcggtac aacagcggca aactggaaga 1200
gttcgtgcag ggtaacctgg aacgcgagtg catggaagag aagtgcagct tcgaagaggc 1260
cagagaggtg ttcgagaaca ccgagagaac caccgagttc tggaagcagt acgtggacgg 1320
cgatcagtgc gagagcaacc cttgtctgaa tggcggcagc tgcaaggatg acatcaacag 1380
ctacgagtgc tggtgcccct tcggcttcga gggcaagaat tgcgagctgg atgtgacctg 1440
caacatcaag aacggcagat gcgagcagtt ctgcaagaac agcgccgaca acaaggtcgt 1500
gtgctcctgc acagagggct acagactggc cgagaatcag aagtcctgcg agcccgctgt 1560
gccctttcca tgtggcagag tgtctgtgtc ccagaccagc aagctgacca gagccgagac 1620
agtgttcccc gatgtggact acgtgaacag caccgaggcc gagacaatcc tggacaacat 1680
cacccagagc acccagtcct tcaacgactt caccagagtc gtcggcggcg aggatgctaa 1740
gcctggacag tttccttggc aagtggtgct gaacggcaag gtggacgctt tttgtggcgg 1800
ctccatcgtg aacgagaagt ggatcgtgac cgccgctcac tgtgtggaaa ccggcgtgaa 1860
gattacagtg gtggccgggg agcacaacat cgaggaaaca gagcacaccg agcagaaacg 1920
gaacgtgatc agaatcatcc ctcaccacaa ctacaacgcc gccatcaaca agtacaacca 1980
cgacattgcc ctgctcgagc tggacgaacc cctggtcctg aactcttacg tgacccctat 2040
ctgtatcgcc gacaaagagt acaccaacat ctttctgaag ttcggcagcg gctacgtgtc 2100
cggctgggga agagttttcc acaagggcag atcagccctg gtgctgcagt acctgagagt 2160
gcccctggtg gatagagcca catgcctgct gagcaccaag ttcaccatct acaacaacat 2220
gttctgcgcc ggcttccacg aaggcggcag agattcttgt cagggcgatt ctggcggccc 2280
tcacgtgaca gaagtcgagg gcacatcttt tctgaccggc atcatcagct ggggcgaaga 2340
gtgtgccatg aaggggaagt acggcatcta taccaaggtg tccagatacg tgaactggat 2400
caaagaaaag accaagctca ccggatccgg agaaggacgg ggaagcctgc ttacatgcgg 2460
agatgtggag gagaatcctg gtcccatggt ctttaccctg gaagatttcg tcggcgactg 2520
gcggcagaca gccggctata atctggacca ggtgctggaa caaggcggag tgtccagcct 2580
gttccagaat ctgggagtgt ccgtgacacc catccagcgg attgtgctgt ctggcgagaa 2640
cggcctgaag atcgacatcc acgtgatcat cccttacgag ggcctgagcg gcgatcagat 2700
gggacagatc gagaagattt tcaaggtggt gtaccccgtg gacgaccacc acttcaaagt 2760
gatcctgcac tacggcaccc tggtcatcga tggcgtgacc cctaacatga tcgactactt 2820
cggcagaccc tacgagggaa tcgccgtgtt cgacggcaag aaaatcaccg tgaccggcac 2880
actgtggaac gggaacaaga tcatcgacga gcggctgatc aaccccgatg gcagcctgct 2940
gttcagagtg accattaacg gcgtgacagg ctggcggctg tgcgaaagga ttctggcctg 3000
atgatctaga gatctcatat gcctttaatt aaacactagt tctatagtgt cacctaaatt 3060
ccctttagtg agggttaatg gccgtaggcc gccagaattg ggtccagaca tgataagata 3120
cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga 3180
aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac aagttaacaa 3240
caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag gtgtgggagg ttttttcgga 3300
ctctaggacc tgcgcatgcg cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgttttcccc 3360
gtatcccccc aggtgtctgc aggctcaaag agcagcgaga agcgttcaga ggaaagcgat 3420
cccgtgccac cttccccgtg cccgggctgt ccccgcacgc tgccggctcg gggatgcggg 3480
gggagcgccg gaccggagcg gagccccggg cggctcgctg ctgcccccta gcgggggagg 3540
gacgtaatta catccctggg ggctttgggg gggggctgtc cctctcaccg cggtggagct 3600
ccagcttttg ttcgaattgg ggccccccct cgagggtatc gatgatatct ataacaagaa 3660
aatatatata taataagtta tcacgtaagt agaacatgaa ataacaatat aattatcgta 3720
tgagttaaat cttaaaagtc acgtaaaaga taatcatgcg tcattttgac tcacgcggtc 3780
gttatagttc aaaatcagtg acacttaccg cattgacaag cacgcctcac gggagctcca 3840
agcggcgact gagatgtcct aaatgcacag cgacggattc gcgctattta gaaagagaga 3900
gcaatatttc aagaatgcat gcgtcaattt tacgcagact atctttctag ggttaatcta 3960
gctagcctta agggcgcctc gagaccttgc ggccgcagga acccctagtg atggagttgg 4020
ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 4080
gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcagg 4137
<210> 21
<211> 1457
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 21
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu
755 760 765
Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln
770 775 780
Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu
785 790 795 800
Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe
805 810 815
Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp
820 825 830
Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln
835 840 845
Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
850 855 860
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His
865 870 875 880
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile
885 890 895
Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser
900 905 910
Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
915 920 925
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val
930 935 940
Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp
945 950 955 960
Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu
965 970 975
Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His
980 985 990
Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe
995 1000 1005
Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn
1010 1015 1020
Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
1025 1030 1035
Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr
1040 1045 1050
Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1055 1060 1065
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe
1070 1075 1080
Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met
1085 1090 1095
Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met
1100 1105 1110
Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
1115 1120 1125
Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser
1130 1135 1140
Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg
1145 1150 1155
Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
1160 1165 1170
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser
1175 1180 1185
Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro
1190 1195 1200
Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1205 1210 1215
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1220 1225 1230
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1235 1240 1245
Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn
1250 1255 1260
Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro
1265 1270 1275
Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly
1280 1285 1290
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
1295 1300 1305
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1310 1315 1320
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1325 1330 1335
Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu
1340 1345 1350
Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val
1355 1360 1365
Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys
1370 1375 1380
Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu
1385 1390 1395
Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
1400 1405 1410
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr
1415 1420 1425
Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala
1430 1435 1440
Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr
1445 1450 1455
<210> 22
<211> 4371
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 22
atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgcc 60
accaggagat actacctggg ggctgtggag ctgagctggg actacatgca gtctgacctg 120
ggggagctgc ctgtggatgc caggttcccc cccagagtgc ccaagagctt ccccttcaac 180
acctctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttca ctgaccacct gttcaacatt 240
gccaagccca ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccca ccatccaggc tgaggtgtat 300
gacactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccacc ctgtgagcct gcatgctgtg 360
ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgaccagac cagccagagg 420
gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccaca cctatgtgtg gcaggtgctg 480
aaggagaatg gccccatggc ctctgacccc ctgtgcctga cctacagcta cctgagccat 540
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag 600
ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagt tcatcctgct gtttgctgtg 660
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gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtga atggctatgt gaacaggagc 780
ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtact ggcatgtgat tggcatgggc 840
accacccctg aggtgcacag catcttcctg gagggccaca ccttcctggt caggaaccac 900
aggcaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctga ctgcccagac cctgctgatg 960
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aagtacaaga aggtcaggtt catggcctac actgatgaaa ccttcaagac cagggaggcc 1380
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ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccctacaaca tctaccccca tggcatcact 1500
gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cccaaggggg tgaagcacct gaaggacttc 1560
cccatcctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactg tgactgtgga ggatggcccc 1620
accaagtctg accccaggtg cctgaccaga tactacagca gctttgtgaa catggagagg 1680
gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgct acaaggagtc tgtggaccag 1740
aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcc tgttctctgt gtttgatgag 1800
aacaggagct ggtacctgac tgagaacatc cagaggttcc tgcccaaccc tgctggggtg 1860
cagctggagg accctgagtt ccaggccagc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtg 1920
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ttcagccaga accccccagt gctgaagagg caccagaggg agatcaccag gaccaccctg 2340
cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gacaccatct ctgtggagat gaagaaggag 2400
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caggagttca ctgatggcag cttcacccag cccctgtaca gaggggagct gaatgagcac 2640
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ctggccccca tgatcatcca tggcatcaag acccaggggg ccaggcagaa gttcagcagc 3660
ctgtacatca gccagttcat catcatgtac agcctggatg gcaagaagtg gcagacctac 3720
aggggcaaca gcactggcac cctgatggtg ttctttggca atgtggacag ctctggcatc 3780
aagcacaaca tcttcaaccc ccccatcatt gccagataca tcaggctgca ccccacccac 3840
tacagcatca ggagcaccct gaggatggag ctgatgggct gtgacctgaa cagctgcagc 3900
atgcccctgg gcatggagag caaggccatc tctgatgccc agatcactgc cagcagctac 3960
ttcaccaaca tgtttgccac ctggagcccc agcaaggcca ggctgcacct gcagggcagg 4020
agcaatgcct ggaggcccca ggtcaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag 4080
aagaccatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtga agagcctgct gaccagcatg 4140
tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatggcc accagtggac cctgttcttc 4200
cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aaccaggaca gcttcacccc tgtggtgaac 4260
agcctggacc cccccctgct gaccagatac ctgaggattc acccccagag ctgggtgcac 4320
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggccc aggacctgta c 4371
<210> 23
<211> 232
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 23
gagggacagc ccccccccaa agcccccagg gatgtaatta cgtccctccc ccgctagggg 60
gcagcagcga gccgcccggg gctccgctcc ggtccggcgc tccccccgca tccccgagcc 120
ggcagcgtgc ggggacagcc cgggcacggg gaaggtggca cgggatcgct ttcctctgaa 180
cgcttctcgc tgctctttga gcctgcagac acctgggggg atacggggaa aa 232
<210> 24
<211> 231
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 24
ttttccccgt atccccccag gtgtctgcag gctcaaagag cagcgagaag cgttcagagg 60
aaagcgatcc cgtgccacct tccccgtgcc cgggctgtcc ccgcacgctg ccggctcggg 120
gatgcggggg gagcgccgga ccggagcgga gccccgggcg gctcgctgct gccccctagc 180
gggggaggga cgtaattaca tccctggggg ctttgggggg gggctgtccc t 231
<210> 25
<211> 136
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 25
ctggtactgc atgcacgcaa tgctagctgc ccctttcccg tcctgggcac cccgagtctc 60
ccccgacccc gggtcccagg tatgctccca cctccacctg ccccactcac cacctctgct 120
agttccagac acctcc 136
<210> 26
<211> 139
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 26
caagcacgca gcaatgcagc tcaaaacgct tagcctagcc acacccccac gggaaacagc 60
agtgattaac ctttagcaat aaacgaaagt ttaactaagc tatactaacc ccagggttgg 120
tcaatttcgt gccagccac 139
<210> 27
<211> 278
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 27
ctggtactgc atgcacgcaa tgctagctgc ccctttcccg tcctgggcac cccgagtctc 60
ccccgacccc gggtcccagg tatgctccca cctccacctg ccccactcac cacctctgct 120
agttccagac acctcccaag cacgcagcaa tgcagctcaa aacgcttagc ctagccacac 180
ccccacggga aacagcagtg attaaccttt agcaataaac gaaagtttaa ctaagctata 240
ctaaccccag ggttggtcaa tttcgtgcca gccacacc 278
<210> 28
<211> 6828
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 28
ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg cgtaaaattg 60
acgcatgtgt tttatcggtc tgtatatcga ggtttattta ttaatttgaa tagatattaa 120
gttttattat atttacactt acatactaat aataaattca acaaacaatt tatttatgtt 180
tatttattta ttaaaaaaaa acaaaaactc aaaatttctt ctataaagta acaaaacttt 240
tatcgaatac ctgcagcccg ggggatgcag agggacagcc cccccccaaa gcccccaggg 300
atgtaattac gtccctcccc cgctaggggg cagcagcgag ccgcccgggg ctccgctccg 360
gtccggcgct ccccccgcat ccccgagccg gcagcgtgcg gggacagccc gggcacgggg 420
aaggtggcac gggatcgctt tcctctgaac gcttctcgct gctctttgag cctgcagaca 480
cctgggggga tacggggaaa agttgactgt gcctttcgat cgaaccatgg gaattgtacc 540
gcgggggagg ctgctggtga atattaacca aggtcacccc agttatcgga ggagcaaaca 600
ggggctaagt ccaccggggg aggctgctgg tgaatattaa ccaaggtcac cccagttatc 660
ggaggagcaa acaggggcta agtccaccgg gggaggctgc tggtgaatat taaccaaggt 720
caccccagtt atcggaggag caaacagggg ctaagtccac ggatcccact gggaggatgt 780
tgagtaagat ggaaaactac tgatgaccct tgcagagaca gagtattagg acatgtttga 840
acaggggccg ggcgatcagc aggtagctct agaggatccc cgtctgtctg cacatttcgt 900
agagcgagtg ttccgatact ctaatctccc taggcaaggt tcatatttgt gtaggttact 960
tattctcctt ttgttgacta agtcaataat cagaatcagc aggtttggag tcagcttggc 1020
agggatcagc agcctgggtt ggaaggaggg ggtataaaag ccccttcacc aggagaagcc 1080
gtcacacaga tccacaagct cctgaagagg taagggttta agggatggtt ggttggtggg 1140
gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca ctttttttca ggttggacgc 1200
gtcgccacca tgcagattga gctgagcacc tgcttcttcc tgtgcctgct gaggttctgc 1260
ttctctgcca ccaggagata ctacctgggg gctgtggagc tgagctggga ctacatgcag 1320
tctgacctgg gggagctgcc tgtggatgcc aggttccccc ccagagtgcc caagagcttc 1380
cccttcaaca cctctgtggt gtacaagaag accctgtttg tggagttcac tgaccacctg 1440
ttcaacattg ccaagcccag gcccccctgg atgggcctgc tgggccccac catccaggct 1500
gaggtgtatg acactgtggt gatcaccctg aagaacatgg ccagccaccc tgtgagcctg 1560
catgctgtgg gggtgagcta ctggaaggcc tctgaggggg ctgagtatga tgaccagacc 1620
agccagaggg agaaggagga tgacaaggtg ttccctgggg gcagccacac ctatgtgtgg 1680
caggtgctga aggagaatgg ccccatggcc tctgaccccc tgtgcctgac ctacagctac 1740
ctgagccatg tggacctggt gaaggacctg aactctggcc tgattggggc cctgctggtg 1800
tgcagggagg gcagcctggc caaggagaag acccagaccc tgcacaagtt catcctgctg 1860
tttgctgtgt ttgatgaggg caagagctgg cactctgaaa ccaagaacag cctgatgcag 1920
gacagggatg ctgcctctgc cagggcctgg cccaagatgc acactgtgaa tggctatgtg 1980
aacaggagcc tgcctggcct gattggctgc cacaggaagt ctgtgtactg gcatgtgatt 2040
ggcatgggca ccacccctga ggtgcacagc atcttcctgg agggccacac cttcctggtc 2100
aggaaccaca ggcaggccag cctggagatc agccccatca ccttcctgac tgcccagacc 2160
ctgctgatgg acctgggcca gttcctgctg ttctgccaca tcagcagcca ccagcatgat 2220
ggcatggagg cctatgtgaa ggtggacagc tgccctgagg agccccagct gaggatgaag 2280
aacaatgagg aggctgagga ctatgatgat gacctgactg actctgagat ggatgtggtg 2340
aggtttgatg atgacaacag ccccagcttc atccagatca ggtctgtggc caagaagcac 2400
cccaagacct gggtgcacta cattgctgct gaggaggagg actgggacta tgcccccctg 2460
gtgctggccc ctgatgacag gagctacaag agccagtacc tgaacaatgg cccccagagg 2520
attggcagga agtacaagaa ggtcaggttc atggcctaca ctgatgaaac cttcaagacc 2580
agggaggcca tccagcatga gtctggcatc ctgggccccc tgctgtatgg ggaggtgggg 2640
gacaccctgc tgatcatctt caagaaccag gccagcaggc cctacaacat ctacccccat 2700
ggcatcactg atgtgaggcc cctgtacagc aggaggctgc ccaagggggt gaagcacctg 2760
aaggacttcc ccatcctgcc tggggagatc ttcaagtaca agtggactgt gactgtggag 2820
gatggcccca ccaagtctga ccccaggtgc ctgaccagat actacagcag ctttgtgaac 2880
atggagaggg acctggcctc tggcctgatt ggccccctgc tgatctgcta caaggagtct 2940
gtggaccaga ggggcaacca gatcatgtct gacaagagga atgtgatcct gttctctgtg 3000
tttgatgaga acaggagctg gtacctgact gagaacatcc agaggttcct gcccaaccct 3060
gctggggtgc agctggagga ccctgagttc caggccagca acatcatgca cagcatcaat 3120
ggctatgtgt ttgacagcct gcagctgtct gtgtgcctgc atgaggtggc ctactggtac 3180
atcctgagca ttggggccca gactgacttc ctgtctgtgt tcttctctgg ctacaccttc 3240
aagcacaaga tggtgtatga ggacaccctg accctgttcc ccttctctgg ggagactgtg 3300
ttcatgagca tggagaaccc tggcctgtgg attctgggct gccacaactc tgacttcagg 3360
aacaggggca tgactgccct gctgaaagtc tccagctgtg acaagaacac tggggactac 3420
tatgaggaca gctatgagga catctctgcc tacctgctga gcaagaacaa tgccattgag 3480
cccaggagct tcagccagaa ccccccagtg ctgaagaggc accagaggga gatcaccagg 3540
accaccctgc agtctgacca ggaggagatt gactatgatg acaccatctc tgtggagatg 3600
aagaaggagg actttgacat ctacgacgag gacgagaacc agagccccag gagcttccag 3660
aagaagacca ggcactactt cattgctgct gtggagaggc tgtgggacta tggcatgagc 3720
agcagccccc atgtgctgag gaacagggcc cagtctggct ctgtgcccca gttcaagaag 3780
gtggtgttcc aggagttcac tgatggcagc ttcacccagc ccctgtacag aggggagctg 3840
aatgagcacc tgggcctgct gggcccctac atcagggctg aggtggagga caacatcatg 3900
gtgaccttca ggaaccaggc cagcaggccc tacagcttct acagcagcct gatcagctat 3960
gaggaggacc agaggcaggg ggctgagccc aggaagaact ttgtgaagcc caatgaaacc 4020
aagacctact tctggaaggt gcagcaccac atggccccca ccaaggatga gtttgactgc 4080
aaggcctggg cctacttctc tgatgtggac ctggagaagg atgtgcactc tggcctgatt 4140
ggccccctgc tggtgtgcca caccaacacc ctgaaccctg cccatggcag gcaggtgact 4200
gtgcaggagt ttgccctgtt cttcaccatc tttgatgaaa ccaagagctg gtacttcact 4260
gagaacatgg agaggaactg cagggccccc tgcaacatcc agatggagga ccccaccttc 4320
aaggagaact acaggttcca tgccatcaat ggctacatca tggacaccct gcctggcctg 4380
gtgatggccc aggaccagag gatcaggtgg tacctgctga gcatgggcag caatgagaac 4440
atccacagca tccacttctc tggccatgtg ttcactgtga ggaagaagga ggagtacaag 4500
atggccctgt acaacctgta ccctggggtg tttgagactg tggagatgct gcccagcaag 4560
gctggcatct ggagggtgga gtgcctgatt ggggagcacc tgcatgctgg catgagcacc 4620
ctgttcctgg tgtacagcaa caagtgccag acccccctgg gcatggcctc tggccacatc 4680
agggacttcc agatcactgc ctctggccag tatggccagt gggcccccaa gctggccagg 4740
ctgcactact ctggcagcat caatgcctgg agcaccaagg agcccttcag ctggatcaag 4800
gtggacctgc tggcccccat gatcatccat ggcatcaaga cccagggggc caggcagaag 4860
ttcagcagcc tgtacatcag ccagttcatc atcatgtaca gcctggatgg caagaagtgg 4920
cagacctaca ggggcaacag cactggcacc ctgatggtgt tctttggcaa tgtggacagc 4980
tctggcatca agcacaacat cttcaacccc cccatcattg ccagatacat caggctgcac 5040
cccacccact acagcatcag gagcaccctg aggatggagc tgatgggctg tgacctgaac 5100
agctgcagca tgcccctggg catggagagc aaggccatct ctgatgccca gatcactgcc 5160
agcagctact tcaccaacat gtttgccacc tggagcccca gcaaggccag gctgcacctg 5220
cagggcagga gcaatgcctg gaggccccag gtcaacaacc ccaaggagtg gctgcaggtg 5280
gacttccaga agaccatgaa ggtgactggg gtgaccaccc agggggtgaa gagcctgctg 5340
accagcatgt atgtgaagga gttcctgatc agcagcagcc aggatggcca ccagtggacc 5400
ctgttcttcc agaatggcaa ggtgaaggtg ttccagggca accaggacag cttcacccct 5460
gtggtgaaca gcctggaccc ccccctgctg accagatacc tgaggattca cccccagagc 5520
tgggtgcacc agattgccct gaggatggag gtgctgggct gtgaggccca ggacctgtac 5580
tgatgaaacg ttagatctgg taccgatcac atatgccttt aattaaacac tggtactgca 5640
tgcacgcaat gctagctgcc cctttcccgt cctgggcacc ccgagtctcc cccgaccccg 5700
ggtcccaggt atgctcccac ctccacctgc cccactcacc acctctgcta gttccagaca 5760
cctcccaagc acgcagcaat gcagctcaaa acgcttagcc tagccacacc cccacgggaa 5820
acagcagtga ttaaccttta gcaataaacg aaagtttaac taagctatac taaccccagg 5880
gttggtcaat ttcgtgccag ccacacccta gttctatagt gtcacctaaa ttccctttag 5940
tgagggttaa tggccgtagg ccgccagaat tgggtccaga catgataaga tacattgatg 6000
agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg 6060
atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt 6120
gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttcg gactctagga 6180
cctgcgcatg cgcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgttttcc ccgtatcccc 6240
ccaggtgtct gcaggctcaa agagcagcga gaagcgttca gaggaaagcg atcccgtgcc 6300
accttccccg tgcccgggct gtccccgcac gctgccggct cggggatgcg gggggagcgc 6360
cggaccggag cggagccccg ggcggctcgc tgctgccccc tagcggggga gggacgtaat 6420
tacatccctg ggggctttgg gggggggctg tccctctcac cgcggtggag ctccagcttt 6480
tgttcgaatt ggggcccccc ctcgagggta tcgatgatat ctataacaag aaaatatata 6540
tataataagt tatcacgtaa gtagaacatg aaataacaat ataattatcg tatgagttaa 6600
atcttaaaag tcacgtaaaa gataatcatg cgtcattttg actcacgcgg tcgttatagt 6660
tcaaaatcag tgacacttac cgcattgaca agcacgcctc acgggagctc caagcggcga 6720
ctgagatgtc ctaaatgcac agcgacggat tcgcgctatt tagaaagaga gagcaatatt 6780
tcaagaatgc atgcgtcaat tttacgcaga ctatctttct agggttaa 6828
<210> 29
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 29
ccugggcacc agcgccggug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 30
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 30
gaugcucgcc cucccguccc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 31
<211> 1591
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 31
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Gly Ile Lys Ser Asn Ile
1 5 10 15
Ser Leu Leu Lys Asp Glu Leu Arg Gly Gln Ile Ser His Ile Ser His
20 25 30
Glu Tyr Leu Ser Leu Ile Asp Leu Ala Phe Asp Ser Lys Gln Asn Arg
35 40 45
Leu Phe Glu Met Lys Val Leu Glu Leu Leu Val Asn Glu Tyr Gly Phe
50 55 60
Lys Gly Arg His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ile Val Tyr
65 70 75 80
Ser Thr Thr Leu Glu Asp Asn Phe Gly Ile Ile Val Asp Thr Lys Ala
85 90 95
Tyr Ser Glu Gly Tyr Ser Leu Pro Ile Ser Gln Ala Asp Glu Met Glu
100 105 110
Arg Tyr Val Arg Glu Asn Ser Asn Arg Asp Glu Glu Val Asn Pro Asn
115 120 125
Lys Trp Trp Glu Asn Phe Ser Glu Glu Val Lys Lys Tyr Tyr Phe Val
130 135 140
Phe Ile Ser Gly Ser Phe Lys Gly Lys Phe Glu Glu Gln Leu Arg Arg
145 150 155 160
Leu Ser Met Thr Thr Gly Val Asn Gly Ser Ala Val Asn Val Val Asn
165 170 175
Leu Leu Leu Gly Ala Glu Lys Ile Arg Ser Gly Glu Met Thr Ile Glu
180 185 190
Glu Leu Glu Arg Ala Met Phe Asn Asn Ser Glu Phe Ile Leu Lys Tyr
195 200 205
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly
210 215 220
Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro
225 230 235 240
Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys
245 250 255
Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu
260 265 270
Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys
275 280 285
Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys
290 295 300
Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu
305 310 315 320
Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp
325 330 335
Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys
340 345 350
Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu
355 360 365
Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly
370 375 380
Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu
385 390 395 400
Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser
405 410 415
Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg
420 425 430
Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly
435 440 445
Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe
450 455 460
Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys
465 470 475 480
Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp
485 490 495
Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile
500 505 510
Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro
515 520 525
Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu
530 535 540
Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys
545 550 555 560
Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp
565 570 575
Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu
580 585 590
Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu
595 600 605
Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His
610 615 620
Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp
625 630 635 640
Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu
645 650 655
Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser
660 665 670
Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp
675 680 685
Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile
690 695 700
Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu
705 710 715 720
Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu
725 730 735
Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu
740 745 750
Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn
755 760 765
Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile
770 775 780
Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn
785 790 795 800
Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys
805 810 815
Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val
820 825 830
Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu
835 840 845
Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys
850 855 860
Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn
865 870 875 880
Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys
885 890 895
Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp
900 905 910
Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln
915 920 925
Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala
930 935 940
Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val
945 950 955 960
Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala
965 970 975
Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg
980 985 990
Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu
995 1000 1005
Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu
1010 1015 1020
Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln
1025 1030 1035
Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile
1040 1045 1050
Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val
1055 1060 1065
Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro
1070 1075 1080
Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu
1085 1090 1095
Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr
1100 1105 1110
Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe
1115 1120 1125
Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val
1130 1135 1140
Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn
1145 1150 1155
Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys
1160 1165 1170
Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
1175 1180 1185
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala
1190 1195 1200
Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser
1205 1210 1215
Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met
1220 1225 1230
Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr
1235 1240 1245
Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr
1250 1255 1260
Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn
1265 1270 1275
Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala
1280 1285 1290
Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys
1295 1300 1305
Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu
1310 1315 1320
Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp
1325 1330 1335
Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr
1340 1345 1350
Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys
1355 1360 1365
Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg
1370 1375 1380
Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly
1385 1390 1395
Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr
1400 1405 1410
Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser
1415 1420 1425
Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys
1430 1435 1440
Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys
1445 1450 1455
Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln
1460 1465 1470
His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe
1475 1480 1485
Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu
1490 1495 1500
Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala
1505 1510 1515
Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro
1520 1525 1530
Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr
1535 1540 1545
Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser
1550 1555 1560
Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly
1565 1570 1575
Gly Asp Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ser Ser
1580 1585 1590
<210> 32
<211> 199
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 32
Glu Gly Ile Lys Ser Asn Ile Ser Leu Leu Lys Asp Glu Leu Arg Gly
1 5 10 15
Gln Ile Ser His Ile Ser His Glu Tyr Leu Ser Leu Ile Asp Leu Ala
20 25 30
Phe Asp Ser Lys Gln Asn Arg Leu Phe Glu Met Lys Val Leu Glu Leu
35 40 45
Leu Val Asn Glu Tyr Gly Phe Lys Gly Arg His Leu Gly Gly Ser Arg
50 55 60
Lys Pro Asp Gly Ile Val Tyr Ser Thr Thr Leu Glu Asp Asn Phe Gly
65 70 75 80
Ile Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Glu Gly Tyr Ser Leu Pro Ile
85 90 95
Ser Gln Ala Asp Glu Met Glu Arg Tyr Val Arg Glu Asn Ser Asn Arg
100 105 110
Asp Glu Glu Val Asn Pro Asn Lys Trp Trp Glu Asn Phe Ser Glu Glu
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Val Lys Lys Tyr Tyr Phe Val Phe Ile Ser Gly Ser Phe Lys Gly Lys
130 135 140
Phe Glu Glu Gln Leu Arg Arg Leu Ser Met Thr Thr Gly Val Asn Gly
145 150 155 160
Ser Ala Val Asn Val Val Asn Leu Leu Leu Gly Ala Glu Lys Ile Arg
165 170 175
Ser Gly Glu Met Thr Ile Glu Glu Leu Glu Arg Ala Met Phe Asn Asn
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Ser Glu Phe Ile Leu Lys Tyr
195
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<211> 1369
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 33
Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly
1 5 10 15
Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys
20 25 30
Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly
35 40 45
Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys
50 55 60
Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe
85 90 95
Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His
100 105 110
Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His
115 120 125
Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser
130 135 140
Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met
145 150 155 160
Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp
165 170 175
Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn
180 185 190
Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys
195 200 205
Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu
210 215 220
Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu
225 230 235 240
Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp
245 250 255
Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp
260 265 270
Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu
275 280 285
Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile
290 295 300
Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met
305 310 315 320
Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp
340 345 350
Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln
355 360 365
Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly
370 375 380
Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys
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Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly
405 410 415
Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu
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Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro
435 440 445
Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met
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485 490 495
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Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr
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Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys
530 535 540
Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val
545 550 555 560
Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser
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Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn
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Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr
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Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys
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Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp
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Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly
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Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn
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Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe
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Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val
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Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys
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Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr
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Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe
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Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe
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Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg
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Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr
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1295 1300 1305
Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe
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Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly
1340 1345 1350
Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Gly
1355 1360 1365
Ser
<210> 34
<211> 7336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 34
tgtacataga ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg 60
cgtaaaattg acgcatgtgt tttatcggtc tgtatatcga ggtttattta ttaatttgaa 120
tagatattaa gttttattat atttacactt acatactaat aataaattca acaaacaatt 180
tatttatgtt tatttattta ttaaaaaaaa acaaaaactc aaaatttctt ctataaagta 240
acaaaacttt tatcgaatac ctgcagcccg ggggatgcag agggacagcc cccccccaaa 300
gcccccaggg atgtaattac gtccctcccc cgctaggggg cagcagcgag ccgcccgggg 360
ctccgctccg gtccggcgct ccccccgcat ccccgagccg gcagcgtgcg gggacagccc 420
gggcacgggg aaggtggcac gggatcgctt tcctctgaac gcttctcgct gctctttgag 480
cctgcagaca cctgggggga tacggggaaa agttgactgt gcctttcgat cgaaccatgg 540
gaattgtacc gcgggggagg ctgctggtga atattaacca aggtcacccc agttatcgga 600
ggagcaaaca ggggctaagt ccaccggggg aggctgctgg tgaatattaa ccaaggtcac 660
cccagttatc ggaggagcaa acaggggcta agtccaccgg gggaggctgc tggtgaatat 720
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gggaggatgt tgagtaagat ggaaaactac tgatgaccct tgcagagaca gagtattagg 840
acatgtttga acaggggccg ggcgatcagc aggtagctct agaggatccc cgtctgtctg 900
cacatttcgt agagcgagtg ttccgatact ctaatctccc taggcaaggt tcatatttgt 960
gtaggttact tattctcctt ttgttgacta agtcaataat cagaatcagc aggtttggag 1020
tcagcttggc agggatcagc agcctgggtt ggaaggaggg ggtataaaag ccccttcacc 1080
aggagaagcc gtcacacaga tccacaagct cctgaagagg taagggttta agggatggtt 1140
ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca ctttttttca 1200
ggttggacgc gtcgccacca tgcagattga gctgagcacc tgcttcttcc tgtgcctgct 1260
gaggttctgc ttctctgcca ccaggagata ctacctgggg gctgtggagc tgagctggga 1320
ctacatgcag tctgacctgg gggagctgcc tgtggatgcc aggttccccc ccagagtgcc 1380
caagagcttc cccttcaaca cctctgtggt gtacaagaag accctgtttg tggagttcac 1440
tgaccacctg ttcaacattg ccaagcccag gcccccctgg atgggcctgc tgggccccac 1500
catccaggct gaggtgtatg acactgtggt gatcaccctg aagaacatgg ccagccaccc 1560
tgtgagcctg catgctgtgg gggtgagcta ctggaaggcc tctgaggggg ctgagtatga 1620
tgaccagacc agccagaggg agaaggagga tgacaaggtg ttccctgggg gcagccacac 1680
ctatgtgtgg caggtgctga aggagaatgg ccccatggcc tctgaccccc tgtgcctgac 1740
ctacagctac ctgagccatg tggacctggt gaaggacctg aactctggcc tgattggggc 1800
cctgctggtg tgcagggagg gcagcctggc caaggagaag acccagaccc tgcacaagtt 1860
catcctgctg tttgctgtgt ttgatgaggg caagagctgg cactctgaaa ccaagaacag 1920
cctgatgcag gacagggatg ctgcctctgc cagggcctgg cccaagatgc acactgtgaa 1980
tggctatgtg aacaggagcc tgcctggcct gattggctgc cacaggaagt ctgtgtactg 2040
gcatgtgatt ggcatgggca ccacccctga ggtgcacagc atcttcctgg agggccacac 2100
cttcctggtc aggaaccaca ggcaggccag cctggagatc agccccatca ccttcctgac 2160
tgcccagacc ctgctgatgg acctgggcca gttcctgctg ttctgccaca tcagcagcca 2220
ccagcatgat ggcatggagg cctatgtgaa ggtggacagc tgccctgagg agccccagct 2280
gaggatgaag aacaatgagg aggctgagga ctatgatgat gacctgactg actctgagat 2340
ggatgtggtg aggtttgatg atgacaacag ccccagcttc atccagatca ggtctgtggc 2400
caagaagcac cccaagacct gggtgcacta cattgctgct gaggaggagg actgggacta 2460
tgcccccctg gtgctggccc ctgatgacag gagctacaag agccagtacc tgaacaatgg 2520
cccccagagg attggcagga agtacaagaa ggtcaggttc atggcctaca ctgatgaaac 2580
cttcaagacc agggaggcca tccagcatga gtctggcatc ctgggccccc tgctgtatgg 2640
ggaggtgggg gacaccctgc tgatcatctt caagaaccag gccagcaggc cctacaacat 2700
ctacccccat ggcatcactg atgtgaggcc cctgtacagc aggaggctgc ccaagggggt 2760
gaagcacctg aaggacttcc ccatcctgcc tggggagatc ttcaagtaca agtggactgt 2820
gactgtggag gatggcccca ccaagtctga ccccaggtgc ctgaccagat actacagcag 2880
ctttgtgaac atggagaggg acctggcctc tggcctgatt ggccccctgc tgatctgcta 2940
caaggagtct gtggaccaga ggggcaacca gatcatgtct gacaagagga atgtgatcct 3000
gttctctgtg tttgatgaga acaggagctg gtacctgact gagaacatcc agaggttcct 3060
gcccaaccct gctggggtgc agctggagga ccctgagttc caggccagca acatcatgca 3120
cagcatcaat ggctatgtgt ttgacagcct gcagctgtct gtgtgcctgc atgaggtggc 3180
ctactggtac atcctgagca ttggggccca gactgacttc ctgtctgtgt tcttctctgg 3240
ctacaccttc aagcacaaga tggtgtatga ggacaccctg accctgttcc ccttctctgg 3300
ggagactgtg ttcatgagca tggagaaccc tggcctgtgg attctgggct gccacaactc 3360
tgacttcagg aacaggggca tgactgccct gctgaaagtc tccagctgtg acaagaacac 3420
tggggactac tatgaggaca gctatgagga catctctgcc tacctgctga gcaagaacaa 3480
tgccattgag cccaggagct tcagccagaa ccccccagtg ctgaagaggc accagaggga 3540
gatcaccagg accaccctgc agtctgacca ggaggagatt gactatgatg acaccatctc 3600
tgtggagatg aagaaggagg actttgacat ctacgacgag gacgagaacc agagccccag 3660
gagcttccag aagaagacca ggcactactt cattgctgct gtggagaggc tgtgggacta 3720
tggcatgagc agcagccccc atgtgctgag gaacagggcc cagtctggct ctgtgcccca 3780
gttcaagaag gtggtgttcc aggagttcac tgatggcagc ttcacccagc ccctgtacag 3840
aggggagctg aatgagcacc tgggcctgct gggcccctac atcagggctg aggtggagga 3900
caacatcatg gtgaccttca ggaaccaggc cagcaggccc tacagcttct acagcagcct 3960
gatcagctat gaggaggacc agaggcaggg ggctgagccc aggaagaact ttgtgaagcc 4020
caatgaaacc aagacctact tctggaaggt gcagcaccac atggccccca ccaaggatga 4080
gtttgactgc aaggcctggg cctacttctc tgatgtggac ctggagaagg atgtgcactc 4140
tggcctgatt ggccccctgc tggtgtgcca caccaacacc ctgaaccctg cccatggcag 4200
gcaggtgact gtgcaggagt ttgccctgtt cttcaccatc tttgatgaaa ccaagagctg 4260
gtacttcact gagaacatgg agaggaactg cagggccccc tgcaacatcc agatggagga 4320
ccccaccttc aaggagaact acaggttcca tgccatcaat ggctacatca tggacaccct 4380
gcctggcctg gtgatggccc aggaccagag gatcaggtgg tacctgctga gcatgggcag 4440
caatgagaac atccacagca tccacttctc tggccatgtg ttcactgtga ggaagaagga 4500
ggagtacaag atggccctgt acaacctgta ccctggggtg tttgagactg tggagatgct 4560
gcccagcaag gctggcatct ggagggtgga gtgcctgatt ggggagcacc tgcatgctgg 4620
catgagcacc ctgttcctgg tgtacagcaa caagtgccag acccccctgg gcatggcctc 4680
tggccacatc agggacttcc agatcactgc ctctggccag tatggccagt gggcccccaa 4740
gctggccagg ctgcactact ctggcagcat caatgcctgg agcaccaagg agcccttcag 4800
ctggatcaag gtggacctgc tggcccccat gatcatccat ggcatcaaga cccagggggc 4860
caggcagaag ttcagcagcc tgtacatcag ccagttcatc atcatgtaca gcctggatgg 4920
caagaagtgg cagacctaca ggggcaacag cactggcacc ctgatggtgt tctttggcaa 4980
tgtggacagc tctggcatca agcacaacat cttcaacccc cccatcattg ccagatacat 5040
caggctgcac cccacccact acagcatcag gagcaccctg aggatggagc tgatgggctg 5100
tgacctgaac agctgcagca tgcccctggg catggagagc aaggccatct ctgatgccca 5160
gatcactgcc agcagctact tcaccaacat gtttgccacc tggagcccca gcaaggccag 5220
gctgcacctg cagggcagga gcaatgcctg gaggccccag gtcaacaacc ccaaggagtg 5280
gctgcaggtg gacttccaga agaccatgaa ggtgactggg gtgaccaccc agggggtgaa 5340
gagcctgctg accagcatgt atgtgaagga gttcctgatc agcagcagcc aggatggcca 5400
ccagtggacc ctgttcttcc agaatggcaa ggtgaaggtg ttccagggca accaggacag 5460
cttcacccct gtggtgaaca gcctggaccc ccccctgctg accagatacc tgaggattca 5520
cccccagagc tgggtgcacc agattgccct gaggatggag gtgctgggct gtgaggccca 5580
ggacctgtac tgatgaaacg ttagatctgg taccgatcac atatgccttt aattaaacac 5640
tggtactgca tgcacgcaat gctagctgcc cctttcccgt cctgggcacc ccgagtctcc 5700
cccgaccccg ggtcccaggt atgctcccac ctccacctgc cccactcacc acctctgcta 5760
gttccagaca cctcccaagc acgcagcaat gcagctcaaa acgcttagcc tagccacacc 5820
cccacgggaa acagcagtga ttaaccttta gcaataaacg aaagtttaac taagctatac 5880
taaccccagg gttggtcaat ttcgtgccag ccacacccta gttctatagt gtcacctaaa 5940
ttccctttag tgagggttaa tggccgtagg ccgccagaat tgggtccaga catgataaga 6000
tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt 6060
gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac 6120
aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttcg 6180
gactctagga cctgcgcatg cgcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgttttcc 6240
ccgtatcccc ccaggtgtct gcaggctcaa agagcagcga gaagcgttca gaggaaagcg 6300
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gggggagcgc cggaccggag cggagccccg ggcggctcgc tgctgccccc tagcggggga 6420
gggacgtaat tacatccctg ggggctttgg gggggggctg tccctctcac cgcggtggag 6480
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aaaatatata tataataagt tatcacgtaa gtagaacatg aaataacaat ataattatcg 6600
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tagctagcct taagggcgct ggtctcatga cgcgtagccc gcctaatgag cgggcttttt 6900
tttggcttgt tgtccacaac cgttaaacct taaaagcttt aaaagcctta tatattcttt 6960
tttttcttat aaaacttaaa accttagagg ctatttaagt tgctgattta tattaatttt 7020
attgttcaaa catgagagct tagtacgtga aacatgagag cttagtacgt tagccatgag 7080
agcttagtac gttagccatg agggtttagt tcgttaaaca tgagagctta gtacgttaaa 7140
catgagagct tagtacgtac tatcaacagg ttgaactgct gatccacgtt gtggtagaat 7200
tggtaaagag agtcgtgtaa aatatcgagt tcgcacatct tgttgtctga ttattgattt 7260
ttggcgaaac catttgatca tatgacaaga tgtgtatcta ccttaactta atgattttga 7320
taaaaatcat taggta 7336
<210> 35
<211> 7058
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 35
tgtacataga ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg 60
cgtaaaattg acgcatgtgt tttatcggtc tgtatatcga ggtttattta ttaatttgaa 120
tagatattaa gttttattat atttacactt acatactaat aataaattca acaaacaatt 180
tatttatgtt tatttattta ttaaaaaaaa acaaaaactc aaaatttctt ctataaagta 240
acaaaacttt tatcgaatac ctgcagcccg ggggatgcag agggacagcc cccccccaaa 300
gcccccaggg atgtaattac gtccctcccc cgctaggggg cagcagcgag ccgcccgggg 360
ctccgctccg gtccggcgct ccccccgcat ccccgagccg gcagcgtgcg gggacagccc 420
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gaattgtacc gcgggggagg ctgctggtga atattaacca aggtcacccc agttatcgga 600
ggagcaaaca ggggctaagt ccaccggggg aggctgctgg tgaatattaa ccaaggtcac 660
cccagttatc ggaggagcaa acaggggcta agtccaccgg gggaggctgc tggtgaatat 720
taaccaaggt caccccagtt atcggaggag caaacagggg ctaagtccac ggatcccact 780
gggaggatgt tgagtaagat ggaaaactac tgatgaccct tgcagagaca gagtattagg 840
acatgtttga acaggggccg ggcgatcagc aggtagctct agaggatccc cgtctgtctg 900
cacatttcgt agagcgagtg ttccgatact ctaatctccc taggcaaggt tcatatttgt 960
gtaggttact tattctcctt ttgttgacta agtcaataat cagaatcagc aggtttggag 1020
tcagcttggc agggatcagc agcctgggtt ggaaggaggg ggtataaaag ccccttcacc 1080
aggagaagcc gtcacacaga tccacaagct cctgaagagg taagggttta agggatggtt 1140
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gaggttctgc ttctctgcca ccaggagata ctacctgggg gctgtggagc tgagctggga 1320
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cctgctggtg tgcagggagg gcagcctggc caaggagaag acccagaccc tgcacaagtt 1860
catcctgctg tttgctgtgt ttgatgaggg caagagctgg cactctgaaa ccaagaacag 1920
cctgatgcag gacagggatg ctgcctctgc cagggcctgg cccaagatgc acactgtgaa 1980
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tgcccagacc ctgctgatgg acctgggcca gttcctgctg ttctgccaca tcagcagcca 2220
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ggatgtggtg aggtttgatg atgacaacag ccccagcttc atccagatca ggtctgtggc 2400
caagaagcac cccaagacct gggtgcacta cattgctgct gaggaggagg actgggacta 2460
tgcccccctg gtgctggccc ctgatgacag gagctacaag agccagtacc tgaacaatgg 2520
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gttctctgtg tttgatgaga acaggagctg gtacctgact gagaacatcc agaggttcct 3060
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ctacaccttc aagcacaaga tggtgtatga ggacaccctg accctgttcc ccttctctgg 3300
ggagactgtg ttcatgagca tggagaaccc tggcctgtgg attctgggct gccacaactc 3360
tgacttcagg aacaggggca tgactgccct gctgaaagtc tccagctgtg acaagaacac 3420
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gatcaccagg accaccctgc agtctgacca ggaggagatt gactatgatg acaccatctc 3600
tgtggagatg aagaaggagg actttgacat ctacgacgag gacgagaacc agagccccag 3660
gagcttccag aagaagacca ggcactactt cattgctgct gtggagaggc tgtgggacta 3720
tggcatgagc agcagccccc atgtgctgag gaacagggcc cagtctggct ctgtgcccca 3780
gttcaagaag gtggtgttcc aggagttcac tgatggcagc ttcacccagc ccctgtacag 3840
aggggagctg aatgagcacc tgggcctgct gggcccctac atcagggctg aggtggagga 3900
caacatcatg gtgaccttca ggaaccaggc cagcaggccc tacagcttct acagcagcct 3960
gatcagctat gaggaggacc agaggcaggg ggctgagccc aggaagaact ttgtgaagcc 4020
caatgaaacc aagacctact tctggaaggt gcagcaccac atggccccca ccaaggatga 4080
gtttgactgc aaggcctggg cctacttctc tgatgtggac ctggagaagg atgtgcactc 4140
tggcctgatt ggccccctgc tggtgtgcca caccaacacc ctgaaccctg cccatggcag 4200
gcaggtgact gtgcaggagt ttgccctgtt cttcaccatc tttgatgaaa ccaagagctg 4260
gtacttcact gagaacatgg agaggaactg cagggccccc tgcaacatcc agatggagga 4320
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ctggatcaag gtggacctgc tggcccccat gatcatccat ggcatcaaga cccagggggc 4860
caggcagaag ttcagcagcc tgtacatcag ccagttcatc atcatgtaca gcctggatgg 4920
caagaagtgg cagacctaca ggggcaacag cactggcacc ctgatggtgt tctttggcaa 4980
tgtggacagc tctggcatca agcacaacat cttcaacccc cccatcattg ccagatacat 5040
caggctgcac cccacccact acagcatcag gagcaccctg aggatggagc tgatgggctg 5100
tgacctgaac agctgcagca tgcccctggg catggagagc aaggccatct ctgatgccca 5160
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tatcgatgat atctataaca agaaaatata tatataataa gttatcacgt aagtagaaca 6300
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ccgcctaatg agcgggcttt tttttggctt gttgtccaca accgttaaac cttaaaagct 6660
ttaaaagcct tatatattct tttttttctt ataaaactta aaaccttaga ggctatttaa 6720
gttgctgatt tatattaatt ttattgttca aacatgagag cttagtacgt gaaacatgag 6780
agcttagtac gttagccatg agagcttagt acgttagcca tgagggttta gttcgttaaa 6840
catgagagct tagtacgtta aacatgagag cttagtacgt actatcaaca ggttgaactg 6900
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cttgttgtct gattattgat ttttggcgaa accatttgat catatgacaa gatgtgtatc 7020
taccttaact taatgatttt gataaaaatc attaggta 7058
<210> 36
<211> 4374
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 36
atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgcc 60
accaggagat actacctggg ggctgtggag ctgagctggg actacatgca gtctgacctg 120
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gactttgaca tctacgacga ggacgagaac cagagcccca ggagcttcca gaagaagacc 2460
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tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagcccttca gctggatcaa ggtggacctg 3600
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ctgtacatca gccagttcat catcatgtac agcctggatg gcaagaagtg gcagacctac 3720
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aagcacaaca tcttcaaccc ccccatcatt gccagataca tcaggctgca ccccacccac 3840
tacagcatca ggagcaccct gaggatggag ctgatgggct gtgacctgaa cagctgcagc 3900
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ttcaccaaca tgtttgccac ctggagcccc agcaaggcca ggctgcacct gcagggcagg 4020
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<210> 37
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 37
Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln Ser
1 5 10 15
Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Val Ser Asp His
20 25 30
Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile Asp
35 40 45
Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu Asp
50 55 60
Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn Arg
65 70 75 80
Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His Cys
85 90 95
Trp Ser Thr Ser Lys Ser Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu Asn
100 105 110
Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile Tyr
115 120 125
Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile Ser
130 135 140
Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg Glu
145 150 155 160
Ser Met Thr Ser Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile Tyr
165 170 175
Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn His
180 185 190
Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr Val
195 200 205
Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu Arg
210 215 220
Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val Phe
225 230 235 240
Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile Gln
245 250 255
Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu Gly
260 265 270
Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Val Tyr Ile Pro Asn Lys Pro Ser
275 280 285
Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys Tyr
290 295 300
Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn Gly
305 310 315 320
Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val His
325 330 335
Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile Pro
340 345 350
Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val Gly
355 360 365
Thr Val Arg Ser Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn Ser
370 375 380
Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro Leu
385 390 395 400
Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu Leu
405 410 415
Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys Pro
420 425 430
Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr Leu
435 440 445
Asp Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg Trp
450 455 460
Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn Ser
465 470 475 480
Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val Gln
485 490 495
Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Ser Leu Thr Ser Ser
500 505 510
Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu Arg
515 520 525
Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Lys Glu Val Pro Gly Thr Ser Asp
530 535 540
Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr Tyr
545 550 555 560
Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Asn Ala Ser Cys Lys Lys Cys
565 570 575
Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser Cys
580 585 590
Phe
<210> 38
<211> 605
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 38
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Ser Leu
1 5 10 15
Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln Ser Asp Asp Glu Leu
20 25 30
Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Val Ser Asp His Val Ser Glu Asp
35 40 45
Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile Asp Glu Val His Glu
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His Cys Trp Ser Thr Ser
100 105 110
Lys Ser Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu Asn Ile Val Arg Ser
115 120 125
Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile Tyr Asp Pro Leu Leu
130 135 140
Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile Ser Glu Ile Val Lys
145 150 155 160
Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg Glu Ser Met Thr Ser
165 170 175
Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile Tyr Ala Phe Phe Gly
180 185 190
Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn His Met Ser Thr Asp
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Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr Val Ser Val Met Ser
210 215 220
Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu Arg Met Asp Asp Lys
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Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val Phe Thr Pro Val Arg
245 250 255
Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile Gln Asn Tyr Thr Pro
260 265 270
Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu Gly Phe Arg Gly Arg
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Cys Pro Phe Arg Val Tyr Ile Pro Asn Lys Pro Ser Lys Tyr Gly Ile
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Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys Tyr Met Ile Asn Gly
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Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile Pro Leu Ala Lys Asn
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Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn Ser Arg Ser Arg Pro
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Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys Pro Gln Met Val Met
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Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg Trp Pro Met Ala Leu
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Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn Ser Phe Ile Ile Tyr
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
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100 105 110
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275 280 285
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340 345 350
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<223> Synthetic Sequence
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<400> 44
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 45
ctgcgggcca agaatcaact gttcctgctg tcccctcact acctgcggca agtgaaagag 60
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<212> DNA
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<223> Synthetic Sequence
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<212> DNA
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<223> Synthetic Sequence
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ctgagagcca aaaaccagct gttcctgctg agcccccact atctgagaca ggtcaaagaa 60
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Gly Asn Ile Leu Ala Leu Ala Val Asp Ala Ser Arg Ala Arg Cys Thr
545 550 555 560
Val Gly Glu Ile Thr Asp Ala Leu Lys Lys Val Phe Gly Glu His Lys
565 570 575
Ala Asn Asp Arg Met Val Ser Gly Ala Tyr Arg Gln Glu Phe Gly Glu
580 585 590
Ser Lys Glu Ile Thr Ser Ala Ile Lys Arg Val His Lys Phe Met Glu
595 600 605
Arg Glu Gly Arg Arg Pro Arg Leu Leu Val Ala Lys Met Gly Gln Asp
610 615 620
Gly His Asp Arg Gly Ala Lys Val Ile Ala Thr Gly Phe Ala Asp Leu
625 630 635 640
Gly Phe Asp Val Asp Ile Gly Pro Leu Phe Gln Thr Pro Arg Glu Val
645 650 655
Ala Gln Gln Ala Val Asp Ala Asp Val His Ala Val Gly Val Ser Thr
660 665 670
Leu Ala Ala Gly His Lys Thr Leu Val Pro Glu Leu Ile Lys Glu Leu
675 680 685
Asn Ser Leu Gly Arg Pro Asp Ile Leu Val Met Cys Gly Gly Val Ile
690 695 700
Pro Pro Gln Asp Tyr Glu Phe Leu Phe Glu Val Gly Val Ser Asn Val
705 710 715 720
Phe Gly Pro Gly Thr Arg Ile Pro Lys Ala Ala Val Gln Val Leu Asp
725 730 735
Asp Ile Glu Lys Cys Leu Glu Lys Lys Gln Gln Ser Val
740 745
<210> 56
<211> 1062
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 56
atgctgttca acctgcgcat cctgctgaac aacgccgcct tcagaaacgg ccacaacttc 60
atggttcgaa acttcagatg cggccagcct ctccagaaca aggtgcagct gaaaggcagg 120
gacctgctga ccctgaagaa cttcaccggc gaagagatca agtacatgct gtggctgtcc 180
gccgacctga agttcagaat caagcagaag ggcgagtacc tgcctctgct ccagggaaag 240
tctctgggca tgatcttcga gaagcggagc accagaacca gactgagcac cgagacaggc 300
tttgccctgc tcggaggaca cccctgcttt ctgacaaccc aggacatcca cctgggcgtg 360
aacgagagcc tgaccgatac agccagagtg ctgtcctcta tggccgatgc cgtgctggct 420
agagtgtata agcagagcga cctggacacc ctggctaaag aggccagcat tcccatcatc 480
aacggcctgt ccgacctgta tcaccccatc cagatcctgg ccgactacct gacactgcaa 540
gagcactaca gcagcctgaa gggactgacc ctgtcttgga tcggcgacgg caacaacatc 600
ctgcacagca ttatgatgag cgccgccaag ttcggaatgc acctccaggc cgctacaccc 660
aagggctatg aacctgatgc cagcgtgaca aagctggccg agcagtacgc caaagagaac 720
ggcacaaagc tgctgctgac caacgatccc ctggaagctg ctcacggcgg caatgtgctg 780
atcaccgata cctggatcag catgggccaa gaggaagaga agaagaagcg gctgcaagcc 840
ttccagggct accaagtgac catgaagaca gccaaggtgg ccgccagcga ttggaccttt 900
ctgcactgcc tgcctcggaa gcctgaagag gtggacgacg aggtgttcta cagccctaga 960
agcctggtgt tccccgaggc cgagaacaga aagtggacca tcatggctgt gatggtgtct 1020
ctgctgaccg actactcccc tcagctccag aagcctaagt tc 1062
<210> 57
<211> 1062
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 57
atgctgttca acctgcgaat cctgctgaac aatgccgctt ttcggaacgg gcacaatttc 60
atggtgagga actttcgctg cggacagccc ctccagaaca aggtccagct gaagggcagg 120
gacctgctga ccctgaaaaa tttcacaggg gaggaaatca agtacatgct gtggctgtca 180
gccgatctga agttccggat caagcagaag ggcgaatatc tgcctctgct ccagggcaaa 240
agcctgggga tgatcttcga aaagcgcagt actcggacca gactgtcaac agagactgga 300
ttcgcactgc tgggaggaca cccatgtttt ctgaccacac aggacattca tctgggagtg 360
aacgagtccc tgaccgacac agcacgcgtc ctgagctcca tggctgatgc agtgctggct 420
cgagtctaca aacagtctga cctggatacc ctggccaagg aagcttctat cccaatcatt 480
aatggcctga gtgacctgta tcaccccatc cagattctgg ccgattacct gaccctccag 540
gagcattatt ctagtctgaa agggctgaca ctgagctgga ttggggacgg aaacaatatc 600
ctgcactcca ttatgatgag cgccgccaag tttggaatgc acctccaggc tgcaacccca 660
aaaggctacg aacccgatgc ctccgtgaca aagctggcag aacagtatgc caaagagaac 720
ggcactaagc tgctgctcac caatgaccct ctggaggccg ctcacggagg caacgtgctg 780
atcactgata cctggattag tatgggacag gaggaagaga agaagaagcg gctccaggcc 840
ttccagggct accaggtgac aatgaaaact gctaaggtcg cagccagcga ctggaccttt 900
ctgcattgcc tgcccagaaa gcctgaagag gtggacgatg aggtcttcta ctcacccaga 960
agcctggtgt ttcctgaagc tgagaatagg aagtggacaa tcatggcagt gatggtcagc 1020
ctgctgactg attattcccc tcagctccag aaaccaaagt tc 1062
<210> 58
<211> 1059
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 58
ctgttcaacc tgcgcatcct gctgaacaac gccgccttca gaaacggcca caacttcatg 60
gttcgaaact tcagatgcgg ccagcctctc cagaacaagg tgcagctgaa aggcagggac 120
ctgctgaccc tgaagaactt caccggcgaa gagatcaagt acatgctgtg gctgtccgcc 180
gacctgaagt tcagaatcaa gcagaagggc gagtacctgc ctctgctcca gggaaagtct 240
ctgggcatga tcttcgagaa gcggagcacc agaaccagac tgagcaccga gacaggcttt 300
gccctgctcg gaggacaccc ctgctttctg acaacccagg acatccacct gggcgtgaac 360
gagagcctga ccgatacagc cagagtgctg tcctctatgg ccgatgccgt gctggctaga 420
gtgtataagc agagcgacct ggacaccctg gctaaagagg ccagcattcc catcatcaac 480
ggcctgtccg acctgtatca ccccatccag atcctggccg actacctgac actgcaagag 540
cactacagca gcctgaaggg actgaccctg tcttggatcg gcgacggcaa caacatcctg 600
cacagcatta tgatgagcgc cgccaagttc ggaatgcacc tccaggccgc tacacccaag 660
ggctatgaac ctgatgccag cgtgacaaag ctggccgagc agtacgccaa agagaacggc 720
acaaagctgc tgctgaccaa cgatcccctg gaagctgctc acggcggcaa tgtgctgatc 780
accgatacct ggatcagcat gggccaagag gaagagaaga agaagcggct gcaagccttc 840
cagggctacc aagtgaccat gaagacagcc aaggtggccg ccagcgattg gacctttctg 900
cactgcctgc ctcggaagcc tgaagaggtg gacgacgagg tgttctacag ccctagaagc 960
ctggtgttcc ccgaggccga gaacagaaag tggaccatca tggctgtgat ggtgtctctg 1020
ctgaccgact actcccctca gctccagaag cctaagttc 1059
<210> 59
<211> 1059
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 59
ctgttcaacc tgcgaatcct gctgaacaat gccgcttttc ggaacgggca caatttcatg 60
gtgaggaact ttcgctgcgg acagcccctc cagaacaagg tccagctgaa gggcagggac 120
ctgctgaccc tgaaaaattt cacaggggag gaaatcaagt acatgctgtg gctgtcagcc 180
gatctgaagt tccggatcaa gcagaagggc gaatatctgc ctctgctcca gggcaaaagc 240
ctggggatga tcttcgaaaa gcgcagtact cggaccagac tgtcaacaga gactggattc 300
gcactgctgg gaggacaccc atgttttctg accacacagg acattcatct gggagtgaac 360
gagtccctga ccgacacagc acgcgtcctg agctccatgg ctgatgcagt gctggctcga 420
gtctacaaac agtctgacct ggataccctg gccaaggaag cttctatccc aatcattaat 480
ggcctgagtg acctgtatca ccccatccag attctggccg attacctgac cctccaggag 540
cattattcta gtctgaaagg gctgacactg agctggattg gggacggaaa caatatcctg 600
cactccatta tgatgagcgc cgccaagttt ggaatgcacc tccaggctgc aaccccaaaa 660
ggctacgaac ccgatgcctc cgtgacaaag ctggcagaac agtatgccaa agagaacggc 720
actaagctgc tgctcaccaa tgaccctctg gaggccgctc acggaggcaa cgtgctgatc 780
actgatacct ggattagtat gggacaggag gaagagaaga agaagcggct ccaggccttc 840
cagggctacc aggtgacaat gaaaactgct aaggtcgcag ccagcgactg gacctttctg 900
cattgcctgc ccagaaagcc tgaagaggtg gacgatgagg tcttctactc acccagaagc 960
ctggtgtttc ctgaagctga gaataggaag tggacaatca tggcagtgat ggtcagcctg 1020
ctgactgatt attcccctca gctccagaaa ccaaagttc 1059
<210> 60
<211> 354
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 60
Met Leu Phe Asn Leu Arg Ile Leu Leu Asn Asn Ala Ala Phe Arg Asn
1 5 10 15
Gly His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe Arg Cys Gly Gln Pro Leu Gln
20 25 30
Asn Lys Val Gln Leu Lys Gly Arg Asp Leu Leu Thr Leu Lys Asn Phe
35 40 45
Thr Gly Glu Glu Ile Lys Tyr Met Leu Trp Leu Ser Ala Asp Leu Lys
50 55 60
Phe Arg Ile Lys Gln Lys Gly Glu Tyr Leu Pro Leu Leu Gln Gly Lys
65 70 75 80
Ser Leu Gly Met Ile Phe Glu Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg Leu Ser
85 90 95
Thr Glu Thr Gly Phe Ala Leu Leu Gly Gly His Pro Cys Phe Leu Thr
100 105 110
Thr Gln Asp Ile His Leu Gly Val Asn Glu Ser Leu Thr Asp Thr Ala
115 120 125
Arg Val Leu Ser Ser Met Ala Asp Ala Val Leu Ala Arg Val Tyr Lys
130 135 140
Gln Ser Asp Leu Asp Thr Leu Ala Lys Glu Ala Ser Ile Pro Ile Ile
145 150 155 160
Asn Gly Leu Ser Asp Leu Tyr His Pro Ile Gln Ile Leu Ala Asp Tyr
165 170 175
Leu Thr Leu Gln Glu His Tyr Ser Ser Leu Lys Gly Leu Thr Leu Ser
180 185 190
Trp Ile Gly Asp Gly Asn Asn Ile Leu His Ser Ile Met Met Ser Ala
195 200 205
Ala Lys Phe Gly Met His Leu Gln Ala Ala Thr Pro Lys Gly Tyr Glu
210 215 220
Pro Asp Ala Ser Val Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Ala Lys Glu Asn
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Leu Leu Thr Asn Asp Pro Leu Glu Ala Ala His Gly
245 250 255
Gly Asn Val Leu Ile Thr Asp Thr Trp Ile Ser Met Gly Gln Glu Glu
260 265 270
Glu Lys Lys Lys Arg Leu Gln Ala Phe Gln Gly Tyr Gln Val Thr Met
275 280 285
Lys Thr Ala Lys Val Ala Ala Ser Asp Trp Thr Phe Leu His Cys Leu
290 295 300
Pro Arg Lys Pro Glu Glu Val Asp Asp Glu Val Phe Tyr Ser Pro Arg
305 310 315 320
Ser Leu Val Phe Pro Glu Ala Glu Asn Arg Lys Trp Thr Ile Met Ala
325 330 335
Val Met Val Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ser Pro Gln Leu Gln Lys Pro
340 345 350
Lys Phe
<210> 61
<211> 353
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 61
Leu Phe Asn Leu Arg Ile Leu Leu Asn Asn Ala Ala Phe Arg Asn Gly
1 5 10 15
His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe Arg Cys Gly Gln Pro Leu Gln Asn
20 25 30
Lys Val Gln Leu Lys Gly Arg Asp Leu Leu Thr Leu Lys Asn Phe Thr
35 40 45
Gly Glu Glu Ile Lys Tyr Met Leu Trp Leu Ser Ala Asp Leu Lys Phe
50 55 60
Arg Ile Lys Gln Lys Gly Glu Tyr Leu Pro Leu Leu Gln Gly Lys Ser
65 70 75 80
Leu Gly Met Ile Phe Glu Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg Leu Ser Thr
85 90 95
Glu Thr Gly Phe Ala Leu Leu Gly Gly His Pro Cys Phe Leu Thr Thr
100 105 110
Gln Asp Ile His Leu Gly Val Asn Glu Ser Leu Thr Asp Thr Ala Arg
115 120 125
Val Leu Ser Ser Met Ala Asp Ala Val Leu Ala Arg Val Tyr Lys Gln
130 135 140
Ser Asp Leu Asp Thr Leu Ala Lys Glu Ala Ser Ile Pro Ile Ile Asn
145 150 155 160
Gly Leu Ser Asp Leu Tyr His Pro Ile Gln Ile Leu Ala Asp Tyr Leu
165 170 175
Thr Leu Gln Glu His Tyr Ser Ser Leu Lys Gly Leu Thr Leu Ser Trp
180 185 190
Ile Gly Asp Gly Asn Asn Ile Leu His Ser Ile Met Met Ser Ala Ala
195 200 205
Lys Phe Gly Met His Leu Gln Ala Ala Thr Pro Lys Gly Tyr Glu Pro
210 215 220
Asp Ala Ser Val Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Ala Lys Glu Asn Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Leu Leu Thr Asn Asp Pro Leu Glu Ala Ala His Gly Gly
245 250 255
Asn Val Leu Ile Thr Asp Thr Trp Ile Ser Met Gly Gln Glu Glu Glu
260 265 270
Lys Lys Lys Arg Leu Gln Ala Phe Gln Gly Tyr Gln Val Thr Met Lys
275 280 285
Thr Ala Lys Val Ala Ala Ser Asp Trp Thr Phe Leu His Cys Leu Pro
290 295 300
Arg Lys Pro Glu Glu Val Asp Asp Glu Val Phe Tyr Ser Pro Arg Ser
305 310 315 320
Leu Val Phe Pro Glu Ala Glu Asn Arg Lys Trp Thr Ile Met Ala Val
325 330 335
Met Val Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ser Pro Gln Leu Gln Lys Pro Lys
340 345 350
Phe
<210> 62
<211> 354
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 62
Met Leu Ser Asn Leu Arg Ile Leu Leu Asn Asn Ala Ala Leu Arg Lys
1 5 10 15
Gly His Thr Ser Val Val Arg His Phe Trp Cys Gly Lys Pro Val Gln
20 25 30
Asn Lys Val Gln Leu Lys Gly Arg Asp Leu Leu Thr Leu Lys Asn Phe
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Thr Gly Glu Glu Ile Lys Tyr Met Leu Trp Leu Ser Ala Asp Leu Lys
50 55 60
Phe Arg Ile Lys Gln Lys Gly Glu Tyr Leu Pro Leu Leu Gln Gly Lys
65 70 75 80
Ser Leu Gly Met Ile Phe Glu Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg Leu Ser
85 90 95
Thr Glu Thr Gly Phe Ala Leu Leu Gly Gly His Pro Cys Phe Leu Thr
100 105 110
Thr Gln Asp Ile His Leu Gly Val Asn Glu Ser Leu Thr Asp Thr Ala
115 120 125
Arg Val Leu Ser Ser Met Ala Asp Ala Val Leu Ala Arg Val Tyr Lys
130 135 140
Gln Ser Asp Leu Asp Thr Leu Ala Lys Glu Ala Ser Ile Pro Ile Ile
145 150 155 160
Asn Gly Leu Ser Asp Leu Tyr His Pro Ile Gln Ile Leu Ala Asp Tyr
165 170 175
Leu Thr Leu Gln Glu His Tyr Ser Ser Leu Lys Gly Leu Thr Leu Ser
180 185 190
Trp Ile Gly Asp Gly Asn Asn Ile Leu His Ser Ile Met Met Ser Ala
195 200 205
Ala Lys Phe Gly Met His Leu Gln Ala Ala Thr Pro Lys Gly Tyr Glu
210 215 220
Pro Asp Ala Ser Val Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Ala Lys Glu Asn
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Leu Leu Thr Asn Asp Pro Leu Glu Ala Ala His Gly
245 250 255
Gly Asn Val Leu Ile Thr Asp Thr Trp Ile Ser Met Gly Gln Glu Glu
260 265 270
Glu Lys Lys Lys Arg Leu Gln Ala Phe Gln Gly Tyr Gln Val Thr Met
275 280 285
Lys Thr Ala Lys Val Ala Ala Ser Asp Trp Thr Phe Leu His Cys Leu
290 295 300
Pro Arg Lys Pro Glu Glu Val Asp Asp Glu Val Phe Tyr Ser Pro Arg
305 310 315 320
Ser Leu Val Phe Pro Glu Ala Glu Asn Arg Lys Trp Thr Ile Met Ala
325 330 335
Val Met Val Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ser Pro Gln Leu Gln Lys Pro
340 345 350
Lys Phe
<210> 63
<211> 353
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 63
Leu Ser Asn Leu Arg Ile Leu Leu Asn Asn Ala Ala Leu Arg Lys Gly
1 5 10 15
His Thr Ser Val Val Arg His Phe Trp Cys Gly Lys Pro Val Gln Asn
20 25 30
Lys Val Gln Leu Lys Gly Arg Asp Leu Leu Thr Leu Lys Asn Phe Thr
35 40 45
Gly Glu Glu Ile Lys Tyr Met Leu Trp Leu Ser Ala Asp Leu Lys Phe
50 55 60
Arg Ile Lys Gln Lys Gly Glu Tyr Leu Pro Leu Leu Gln Gly Lys Ser
65 70 75 80
Leu Gly Met Ile Phe Glu Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg Leu Ser Thr
85 90 95
Glu Thr Gly Phe Ala Leu Leu Gly Gly His Pro Cys Phe Leu Thr Thr
100 105 110
Gln Asp Ile His Leu Gly Val Asn Glu Ser Leu Thr Asp Thr Ala Arg
115 120 125
Val Leu Ser Ser Met Ala Asp Ala Val Leu Ala Arg Val Tyr Lys Gln
130 135 140
Ser Asp Leu Asp Thr Leu Ala Lys Glu Ala Ser Ile Pro Ile Ile Asn
145 150 155 160
Gly Leu Ser Asp Leu Tyr His Pro Ile Gln Ile Leu Ala Asp Tyr Leu
165 170 175
Thr Leu Gln Glu His Tyr Ser Ser Leu Lys Gly Leu Thr Leu Ser Trp
180 185 190
Ile Gly Asp Gly Asn Asn Ile Leu His Ser Ile Met Met Ser Ala Ala
195 200 205
Lys Phe Gly Met His Leu Gln Ala Ala Thr Pro Lys Gly Tyr Glu Pro
210 215 220
Asp Ala Ser Val Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Ala Lys Glu Asn Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Leu Leu Thr Asn Asp Pro Leu Glu Ala Ala His Gly Gly
245 250 255
Asn Val Leu Ile Thr Asp Thr Trp Ile Ser Met Gly Gln Glu Glu Glu
260 265 270
Lys Lys Lys Arg Leu Gln Ala Phe Gln Gly Tyr Gln Val Thr Met Lys
275 280 285
Thr Ala Lys Val Ala Ala Ser Asp Trp Thr Phe Leu His Cys Leu Pro
290 295 300
Arg Lys Pro Glu Glu Val Asp Asp Glu Val Phe Tyr Ser Pro Arg Ser
305 310 315 320
Leu Val Phe Pro Glu Ala Glu Asn Arg Lys Trp Thr Ile Met Ala Val
325 330 335
Met Val Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ser Pro Gln Leu Gln Lys Pro Lys
340 345 350
Phe
<210> 64
<211> 461
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 64
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr
1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu
20 25 30
Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn
35 40 45
Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys
50 55 60
Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn
65 70 75 80
Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln
85 90 95
Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile
100 105 110
Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys
115 120 125
Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe
130 135 140
Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe
165 170 175
Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala
180 185 190
Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu
195 200 205
Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe
210 215 220
Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp
225 230 235 240
Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile
245 250 255
Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly
260 265 270
Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu
275 280 285
His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn
290 295 300
Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu
305 310 315 320
Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile
325 330 335
Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr
340 345 350
Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val
355 360 365
Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Leu
370 375 380
Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His
385 390 395 400
Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val
405 410 415
Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly
420 425 430
Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser
435 440 445
Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr
450 455 460
<210> 65
<211> 1383
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 65
atgcagcgcg tgaacatgat tatggccgag tctcccggcc tgatcaccat ctgtctgctg 60
ggctatctgc tgagcgccga gtgcaccgtg tttctggatc acgagaacgc caacaagatc 120
ctgaacagac ccaagcggta caacagcggc aaactggaag agttcgtgca gggtaacctg 180
gaacgcgagt gcatggaaga gaagtgcagc ttcgaagagg ccagagaggt gttcgagaac 240
accgagagaa ccaccgagtt ctggaagcag tacgtggacg gcgatcagtg cgagagcaac 300
ccttgtctga atggcggcag ctgcaaggat gacatcaaca gctacgagtg ctggtgcccc 360
ttcggcttcg agggcaagaa ttgcgagctg gatgtgacct gcaacatcaa gaacggcaga 420
tgcgagcagt tctgcaagaa cagcgccgac aacaaggtcg tgtgctcctg cacagagggc 480
tacagactgg ccgagaatca gaagtcctgc gagcccgctg tgccctttcc atgtggcaga 540
gtgtctgtgt cccagaccag caagctgacc agagccgaga cagtgttccc cgatgtggac 600
tacgtgaaca gcaccgaggc cgagacaatc ctggacaaca tcacccagag cacccagtcc 660
ttcaacgact tcaccagagt cgtcggcggc gaggatgcta agcctggaca gtttccttgg 720
caagtggtgc tgaacggcaa ggtggacgct ttttgtggcg gctccatcgt gaacgagaag 780
tggatcgtga ccgccgctca ctgtgtggaa accggcgtga agattacagt ggtggccggg 840
gagcacaaca tcgaggaaac agagcacacc gagcagaaac ggaacgtgat cagaatcatc 900
cctcaccaca actacaacgc cgccatcaac aagtacaacc acgacattgc cctgctcgag 960
ctggacgaac ccctggtcct gaactcttac gtgaccccta tctgtatcgc cgacaaagag 1020
tacaccaaca tctttctgaa gttcggcagc ggctacgtgt ccggctgggg aagagttttc 1080
cacaagggca gatcagccct ggtgctgcag tacctgagag tgcccctggt ggatagagcc 1140
acatgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgcgc cggcttccac 1200
gaaggcggca gagattcttg tcagggcgat tctggcggcc ctcacgtgac agaagtcgag 1260
ggcacatctt ttctgaccgg catcatcagc tggggcgaag agtgtgccat gaaggggaag 1320
tacggcatct ataccaaggt gtccagatac gtgaactgga tcaaagaaaa gaccaagctc 1380
acc 1383
Claims (29)
- 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물로서, 지질 나노입자는
약 53 mol% 내지 약 60 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 34 mol% 내지 약 41 mol%의 콜레스테롤;
약 4 mol% 내지 약 11 mol%의 DOPC, DSPC, 또는 DOPE; 및
약 0.5 mol% 내지 약 2 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 70:1 내지 약 105:1(w/w)인, 조성물. - 제1항에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물. - 제1항에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)인, 조성물. - 제1항에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 40 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 DOPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물. - 제1항에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는
약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 37.5 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 DOPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물. - 제1항에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는
약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 DOPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물. - 제1항에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는
약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 DOPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)인, 조성물. - 제1항에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DSPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물. - 제1항에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 40 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 DSPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물. - 제1항에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는
약 56.5 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 37.5 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 DSPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물. - 제1항에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는
약 59 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 5 mol%의 DSPC; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물. - 제1항에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물. - 제1항에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 75:1(w/w)인, 조성물. - 제1항에 있어서, 적어도 하나의 지질 나노입자는
약 54 mol%의 ssPalmO-Ph-P4C2;
약 35 mol%의 콜레스테롤;
약 10 mol%의 DOPE; 및
약 1 mol%의 DMG-PEG2000을 포함하되,
적어도 하나의 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하고, 적어도 하나의 나노입자 내 지질 대 핵산의 비율은 약 100:1(w/w)인, 조성물. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 분자는 mRNA 분자이고, 바람직하게는 상기 mRNA 분자는 5’-CAP를 추가로 포함하는, 조성물.
- 제1항 내지 제13항 또는 제15항에 있어서, 상기 적어도 하나의 RNA 분자는 적어도 하나의 트랜스포자아제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 바람직하게는 상기 트랜스포자아제는 piggyBac™(PB) 트랜스포자아제, piggyBac-유사(PBL) 트랜스포자아제, Super piggyBac™(SPB) 트랜스포자아제 폴리펩티드, 슬리핑 뷰티 트랜스포자아제, 과활성 슬리핑 뷰티(SB100X) 트랜스포자아제, 헬리트론 트랜스포자아제, Tol2 트랜스포자아제, TcBuster 트랜스포자아제, 또는 돌연변이체 TcBuster 트랜스포자아제인, 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 DNA 분자는 원형 DNA 분자, 개뼈(DoggyBone) DNA 분자, DNA 플라스미드, DNA 나노플라스미드, 또는 선형화된 DNA 분자이고, 바람직하게는 상기 DNA 분자는 개뼈 DNA 분자 또는 DNA 나노플라스미드인, 조성물.
- 제14항 또는 제17항에 있어서, 상기 적어도 하나의 DNA 분자는 적어도 하나의 트랜스포존을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
- 제14항, 제17항, 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 트랜스포존을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 트랜스포존은 적어도 하나의 치료 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
- 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치료 단백질은 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC), 메틸말로닐-CoA 뮤타아제(MUT1), 인자 VIII, 또는 인자 IX인, 조성물.
- 적어도 하나의 핵산을 적어도 하나의 세포에 전달하는 방법으로서, 상기 적어도 하나의 세포를 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 적어도 하나의 세포를 유전적으로 변형시키는 방법으로서, 상기 적어도 하나의 세포를 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 적어도 하나의 세포는 적어도 하나의 간 세포이고, 바람직하게는 상기 적어도 하나의 간 세포는 간세포(hepatocyte), 간 성상 세포, 쿠퍼 세포, 또는 간 굴모양 혈관 내피 세포인, 방법.
- 적어도 하나의 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물의 적어도 1회 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 적어도 하나의 질환 또는 장애는 간 질환 또는 장애이고, 바람직하게는 상기 간 질환 또는 장애는 대사성 간 장애이고, 바람직하게는 대사성 간 장애는:
i) 요소 회로 장애; 또는
ii) N-아세틸글루타메이트 합성효소 (NAGS) 결핍증, 카르바모일포스페이트 합성효소 I 결핍증 (CPSI 결핍증), 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 (OTC) 결핍증, 아르기니노숙시네이트 합성효소 결핍증(ASSD) (시트룰린 혈증 I), 시트린 결핍증 (시트룰린혈증 II), 아르기니노숙시네이트 리아제 결핍증(아르기니노숙신산뇨증), 아르기나제 결핍증(아르기닌 혈증), 오르니틴 전위효소 결핍증(HHH 증후군), 진행성 가족성 간내 담즙정체 1형(PFIC1), 진행성 가족성 간내 담즙정체 1형(PFIC2), 진행성 가족성 간내 담즙정체 1형(PFIC3), 또는 이들의 임의의 조합인, 방법. - 제25항에 있어서, 상기 적어도 하나의 질환 또는 장애는 혈우병이고, 바람직하게는 상기 혈우병은 A형 혈우병, B형 혈우병, C형 혈우병, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
- 제1항 내지 제13항, 제15항, 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 RNA 분자는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 융합 단백질은 (i) 불활성화된 Cas9(dCas9) 단백질 또는 불활성화된 이의 뉴클레아제 도메인, (ii) Clo051 단백질 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 포함하는, 조성물.
- 제28항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 하나의 가이드 RNA 분자를 추가로 포함하는, 조성물.
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