KR20210105947A - 나노트랜스포존 조성물 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

(a) 제1 역위 말단 반복(ITR), (b) 제2 ITR 및 (c) 인트라-ITR 서열을 포함하는 제1 핵산 서열로서, 인트라-ITR 서열은 트랜스포존 서열을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및 인터-ITR 서열을 포함하는 제2 핵산 서열로서, 인터-ITR 서열의 길이는 종점을 포함하여 1 내지 600개의 뉴클레오타이드인 것인 제2 핵산 서열을 포함하는 조성물이 개시된다. 바람직하게는, 조성물은 나노트랜스포존이다.

Description

나노트랜스포존 조성물 및 사용 방법

관련 출원에 대한 상호참조

본 출원은 2018년 12월 20일에 출원된 U.S.S.N. 제62/783,133호; 2019년 3월 7일에 출원된 U.S.S.N. 제62/815,335호 및 2019년 3월 8일에 출원된 U.S.S.N. 제62/815,845호의 우선권 및 이익을 주장한다. 이들 각 출원의 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.

서열 목록의 참조에 의한 포함

2019년 12월 19일에 생성되고 295 MB 크기인 "POTH-047_001WO Seq Listing_ST25.txt"라는 명칭의 파일의 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.

본 개시내용의 분야

본 개시내용은 분자 생물학, 및 보다 구체적으로, 나노트랜스포존(nanotransposon), 나노트랜스포존을 포함하는 세포 조성물, 이의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.

유전자 요법에서 사용하기 위한 개선된 전위(transposition)의 조성물 및 방법에 대한 당업계의 오랜 충족되지 않은 요구가 있었다. 본 개시내용은 특히 유전자 요법을 위해 세포를 변형시키는 방법으로서 인간 세포에서 사용하기 위해 전위의 효능을 개선하기 위한 트랜스포존(transposon) 서열을 갖는 벡터에 대한 비자연발생 구조 개선을 포함하는 나노트랜스포존 조성물, 이들 조성물의 제조 방법 및 사용 방법을 제공한다.

본 개시내용은 (a) 제1 역위 말단 반복(inverted terminal repeat, ITR), (b) 제2 ITR 및 (c) 인트라-ITR(intra-ITR) 서열을 포함하는 제1 핵산 서열로서, 인트라-ITR 서열은 트랜스포존(transposon) 서열을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및 인터-ITR(inter-ITR) 서열을 포함하는 제2 핵산 서열로서, 인터-ITR 서열의 길이는 종점을 포함하여 1 내지 600개의 뉴클레오타이드인 것인 제2 핵산 서열을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 양태에서, 인터-ITR 서열의 길이는 종점을 포함하여 1 내지 100개의 뉴클레오타이드이다. 조성물은 트랜스포존일 수 있거나 나노트랜스포존일 수 있다. 바람직한 양태에서, 트랜스포존은 piggyBac 트랜스포존이다.

제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열은 복제 원점 서열을 추가로 포함할 수 있다. 복제 원점 서열의 길이는 1 내지 450개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 복제 원점 서열은 R6K 복제 원점을 포함할 수 있다.

제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열은 제1 선택 마커를 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 제1 선택 마커의 길이는 1 내지 200개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 제1 선택 마커는 수크로스 선택 마커일 수 있다. 바람직한 양태에서, 수크로스 선택 마커는 RNA-OUT 선택 마커이다

제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열은 재조합 부위, 절제 부위, 결찰 부위, 또는 이의 조합을 포함하지 않을 수 있다. 제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열은 외래 DNA를 코딩하는 서열을 포함하지 않을 수 있다.

제1 핵산 서열은 적어도 하나의 외인성 서열 및 포유동물 세포에서 외인성 서열을 발현할 수 있는 프로모터를 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 제1 핵산 서열은 인슐레이터(insulator)를 코딩하는 적어도 하나의 서열을 추가로 포함할 수 있다. 제1 핵산 서열은 폴리아데노신(polyA) 서열을 추가로 포함할 수 있다. 포유동물 세포에서 외인성 서열을 발현할 수 있는 프로모터를 코딩하는 서열은 인간 세포에서 외인성 서열을 발현할 수 있다. 프로모터는 항시성 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다.

적어도 하나의 외인성 서열은 비자연발생 항원 수용체를 코딩하는 서열, 치료적 폴리펩타이드를 코딩하는 서열, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 비자연발생 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. CAR은 (a) 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인(ectodomain), (b) 막관통 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 엔도도메인(endodomain)을 포함할 수 있다. 항원 인식 영역은 적어도 하나의 단일 사슬 가변 단편(scFv), 단일 도메인 항체, 센티린(Centyrin), 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 단일 도메인 항체는 VHH 또는 VH일 수 있다.

항원 인식 영역은 적어도 하나의 항-BCMA 센티린을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항-BCMA 센티린은 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함한다. 항원 인식 영역은 적어도 하나의 항-BCMA VH를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항-BCMA VH는 서열번호: 97의 아미노산 서열을 포함한다. 항원 인식 영역은 적어도 하나의 항-PSMA 센티린을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항-PSMA 센티린은 서열번호: 94의 아미노산 서열을 포함한다.

엑토도메인은 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. CAR은 항원 인식 영역 및 막관통 도메인 사이에 힌지 영역을 추가로 포함한다. 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 공자극 도메인은 CD3ζ 공자극 도메인, 4-1BB 공자극 도메인, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 공자극 도메인은 CD3ζ 공자극 도메인 및 4-1BB 공자극 도메인을 포함할 수 있고, 4-1BB 공자극 도메인은 막관통 도메인 및 CD3ζ 공자극 도메인 사이에 위치한다. 적어도 하나의 외인성 서열은 유도성 아폽토시스 촉진(proapoptotic) 폴리펩타이드를 코딩하는 서열, 제2 선택 마커를 코딩하는 서열, 키메라 자극 수용체(CSR)를 코딩하는 서열, 트랜스포사제(transposase) 효소를 코딩하는 서열, 자가 절단 펩타이드를 코딩하는 서열, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 제2 선택 마커는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 뮤테인 효소를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.

본 개시내용은 또한 본원에 개시된 바와 같은 조성물(예컨대, 트랜스포존 또는 나노트랜스포존)을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 개시내용은 또한 본원에 개시된 바와 같은 조성물(예컨대, 트랜스포존 또는 나노트랜스포존)을 포함하는 세포를 제공한다. 본 개시내용은 또한 복수의 집단이 본원에 개시된 바와 같은 CAR 또는 조성물(예컨대, 트랜스포존 또는 나노트랜스포존)을 발현하도록 변형된 복수의 집단을 제공한다. 일 양태에서, 복수의 변형된 세포는 복수의 변형된 면역 세포이다. 일 양태에서, 복수의 변형된 세포는 복수의 변형된 T-세포이다. 일 양태에서, 복수의 변형된 T-세포의 적어도 50%는 CD45RA 및 CD62L을 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하지만 CD45RO를 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하지 않는다.

본 개시내용은 또한 본원에 개시된 바와 같은 CAR 또는 조성물(예컨대, 트랜스포존 또는 나노트랜스포존)을 포함하고 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 개시내용은 또한 본원에 개시된 바와 같은 조성물(예컨대, 트랜스포존 또는 나노트랜스포존), CAR, 세포, 세포 집단 또는 약학 조성물 중 어느 것의 치료적 유효량을 투여함으로써 이를 필요로 하는 대상체에서 증식 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 증식 장애는 암이다. 암은 BCMA 양성 암 또는 PSMA 양성 암일 수 있다. 암은 원발성 종양, 전이성 암, 다중 내성 암(multiply resistant cancer), 진행성 종양 또는 재발성 암일 수 있다. 암은 고형 종양 또는 혈액암일 수 있다. 암은 폐암, 뇌암, 두경부암, 유방암, 피부암, 간암, 췌장암, 위암, 결장암, 직장암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 피부암, 식도암, 림프종, 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 급성 림프성 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML), 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myelocytic leukemia, CML), 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 털세포 백혈병(hairy cell leukemia), 골수이형성 증후군(myelodyplastic syndrome, MDS), 호지킨병, 비호지킨 림프종, 또는 다발성 골수종일 수 있다.

특허 또는 출원 파일은 컬러로 제작된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)이 있는 본 특허 또는 특허 출원의 사본은 요청하고 필요한 비용을 지불하면 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 piggyBac 전체 플라스미드 및 piggyBac 나노트랜스포존(NT)의 맵을 비교하는 한 쌍의 개략도이다.
도 2는 인간 범(pan) T 세포에서 piggyBac NT를 이용한 개선된 전위를 도시하는 그래프이다.
도 3은 piggyBac NT 및 piggyBac 짧은 NT의 맵을 비교하는 한 쌍의 개략도이다.
도 4는 인간 범 T 세포에서 piggyBac 전위가 인터-ITR 서열을 감소시킴으로써(예컨대, ITR에 측접하는 거리를 감소시킴으로써) 향상된다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 5는 인간 범 T 세포에서 항-BCMA 키메라 항원 수용체(CAR) NT 및 항-PSMA CAR NT를 이용하여 증가된 전위를 보여주는 한 쌍의 그래프이다.
도 6은 항-BCMA CAR NT 또는 항-PSMA CAR NT를 사용하여 생산된 인간 CAR-T 세포가 표적 종양 세포를 사멸시킬 수 있다는 것을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 7은 항-BCMA CAR NT 또는 항-PSMA CAR NT를 사용하여 생산된 인간 CAR-T 세포가 표현형 조성에서 대등하다는 것을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 8은 항-BCMA CAR NT 또는 항-PSMA CAR NT를 사용하여 생산된 인간 CAR-T 세포가 유사한 통합된 카피 수를 갖는다는 것을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 9는 단량체성 NT 순도가 인간 범 T 세포에서 전위 효율과 관련된다는 것을 입증하는 겔 전기영동 분석의 사진이다.
도 10은 단량체성 NT 순도가 인간 범 T 세포에서 전위 효율과 관련된다는 것을 보여주는 한 쌍의 그래프이다.
도 11은 쥣과 이종이식편 모델을 사용하여 스트레스 용량에서 전장 플라스미드(FLP) 대 NT에 의해 전달될 때 P-PSMA-101 트랜스포존의 임상전 평가를 보여주는 개략도이다.
도 12는 FLP 대 NT에 의해 전달될 때 P-PSMA-101 트랜스포존이 처리된 마우스의 종양 부피 평가를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 13은 BCMA 센티린 CAR(CARTyrin)을 코딩하는 P-BCMA-101 piggyBac NT를 도시하는 개략도이다. 나노트랜스포존은 ITR #1, 인슐레이터 #1, EF1알파 프로모터, BMCA CARTyrin, SV40 PA, 인슐레이터 #2, 및 ITR #2를 코딩한다. 서열은 또한 나노트랜스포존 요소 RNA-OUT 및 R6K 원점을 코딩한다.
도 14는 PSMA CARTyrin을 코딩하는 P-PSMA-101 piggyBac NT를 도시하는 개략도이다. 나노트랜스포존은 ITR #1, 인슐레이터 #1, EF1알파 프로모터, PSMA CARTyrin, SV40 PA, 인슐레이터 #2, 및 ITR #2를 코딩한다. 서열은 또한 나노트랜스포존 요소 RNA-OUT 및 R6K 원점을 코딩한다.
도 15는 BCMA VH CAR(VCAR)을 코딩하는 P-BCMA-ALLO1 piggyBac 나노트랜스포존을 도시하는 개략도이다. 나노트랜스포존은 ITR #1, 인슐레이터 #1, EF1알파 프로모터, BMCA VCAR, SV40 PA, 인슐레이터 #2, 및 ITR #2를 코딩한다. 서열은 또한 나노트랜스포존 요소 RNA-OUT 및 R6K 원점을 코딩한다.
임의의 상호참조되거나 관련된 특허 또는 출원을 포함하는 본원에 인용된 모든 문서는 명시적으로 배제되거나 제한되지 않는 한 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 임의의 문서의 인용은 그것이 본원에 개시되거나 청구된 임의의 발명에 대한 선행 기술이라는 것을 인정하거나, 단독으로 또는 임의의 다른 참고문헌 또는 참고문헌들과 조합하여 이러한 임의의 발명을 교시, 제시 또는 개시한다는 것을 인정하는 것이 아니다. 또한, 이 문서에서의 용어의 임의의 의미 또는 정의가 참조로 포함된 문서에서의 동일한 용어의 임의의 의미 또는 정의와 충돌하는 경우, 이 문서에서 상기 용어에 할당된 의미 또는 정의가 우선할 것이다.

본 개시내용은 나노트랜스포존(nanotransposon), 나노트랜스포존을 포함하는 조성물 및 세포, 나노트랜스포존을 제조하는 방법 및 본원에 기재된 나노트랜스포존, 조성물 및 세포를 사용하는 방법을 제공한다.

본 개시내용의 나노트랜스포존은 나노트랜스포존의 인터-ITR 서열을 최소화하여 제1 및 제2 ITR 서열을 가능한 가깝게 함으로써 전위 효능 및 효율을 증가시키도록 설계된다. 본 개시내용의 나노트랜스포존 및 나노트랜스포존을 포함하는 조성물은 모든 세포 유형에서 효과적이지만, 이들은 인간 세포에서 사용하기에 특히 효과적이다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 개시내용의 나노트랜스포존은 전위를 증가시키고, 결과적으로 인간 세포로의 유전자 전달을 복수의 세포에서 충분히 높은 백분율의 세포로 증가시키는 데 사용될 수 있다.

이론에 구속되기를 바라지 않지만, 인터-ITR 서열 또는 거리를 최소화함으로써, 상응하는 트랜스포사제(transposase)가 두 ITR 서열을 더 합칠 수 있어 나노트랜스포존로부터 인트라-ITR 서열의 절제를 증가시키고/또는 인트라-ITR 서열을 표적 부위로 통합시키는 것을 증가시킬 수 있다. 또한, 본 개시내용의 바람직한 양태에서, 나노트랜스포존, 이의 백본 및/또는 인터-ITR 서열은 외래 DNA 서열을 포함하지 않는다. 외래 DNA의 부족은 특히 비-나노트랜스포존과 비교할 때 전위 효능 및 효율을 추가로 개선한다.

본 개시내용의 조성물

본 개시내용은 (a) 제1 역위 말단 반복(ITR) 또는 제1 ITR을 코딩하는 서열, (b) 제2 ITR 또는 제2 ITR을 코딩하는 서열, 및 (c) 인트라-ITR 서열 또는 인트라-ITR을 코딩하는 서열을 포함하는 제1 핵산 서열로서, 인트라-ITR 서열은 트랜스포존 서열 또는 트랜스포존을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및 인터-ITR 서열 또는 인터-ITR을 코딩하는 서열을 포함하는 제2 핵산 서열로서, 인터-ITR 서열의 길이는 700개 이하의 뉴클레오타이드인 것인 제2 핵산 서열을 포함하는 조성물을 제공한다. 제2 핵산 서열은 또한 본원에서 백본 영역 또는 비통합 영역으로 지칭된다. 일 양태에서, 조성물은 원형 DNA 또는 선형 DNA이다. 일 양태에서, 조성물은 플라스미드 또는 벡터이다. 일 양태에서, 조성물은 트랜스포존이다. 바람직한 양태에서, 조성물은 나노트랜스포존이다.

일부 양태에서, 인터-ITR 서열의 길이는 650개 이하의 뉴클레오타이드, 600개 이하의 뉴클레오타이드, 550개 이하의 뉴클레오타이드, 500개 이하의 뉴클레오타이드, 450개 이하의 뉴클레오타이드, 400개 이하의 뉴클레오타이드, 350개 이하의 뉴클레오타이드, 300개 이하의 뉴클레오타이드, 250개 이하의 뉴클레오타이드, 200개 이하의 뉴클레오타이드, 150개 이하의 뉴클레오타이드, 100개의 이하의 뉴클레오타이드, 50개 이하의 뉴클레오타이드, 25개 이하의 뉴클레오타이드, 또는 10개 이하의 뉴클레오타이드이다. 일부 양태에서, 제2 핵산 서열의 길이는 700개 이하의 뉴클레오타이드, 650개 이하의 뉴클레오타이드, 600개 이하의 뉴클레오타이드, 550개 이하의 뉴클레오타이드, 500개 이하의 뉴클레오타이드, 450개 이하의 뉴클레오타이드, 400개 이하의 뉴클레오타이드, 350개 이하의 뉴클레오타이드, 300개 이하의 뉴클레오타이드, 250개 이하의 뉴클레오타이드, 200개 이하의 뉴클레오타이드, 150개 이하의 뉴클레오타이드, 100개 이하의 뉴클레오타이드, 50개 이하의 뉴클레오타이드, 25개 이하의 뉴클레오타이드, 또는 10개 이하의 뉴클레오타이드이다.

본 개시내용은 (a) 제1 역위 말단 반복(ITR) 또는 제1 ITR을 코딩하는 서열, (b) 제2 ITR 또는 제2 ITR을 코딩하는 서열, 및 (c) 인트라-ITR 서열 또는 인트라-ITR을 코딩하는 서열을 포함하는 제1 핵산 서열로서, 인트라-ITR 서열은 트랜스포존 서열 또는 트랜스포존을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및 인터-ITR 서열 또는 인터-ITR을 코딩하는 서열을 포함하는 제2 핵산 서열로서, 인터-ITR 서열의 길이는 종점을 포함하여 1 내지 700개의 뉴클레오타이드인 것인 제2 핵산 서열을 포함하는 조성물을 제공한다. 제2 핵산 서열은 또한 본원에서 백본 영역 또는 비통합 영역으로 지칭된다. 일 양태에서, 조성물은 원형 DNA 또는 선형 DNA이다. 일 양태에서, 조성물은 플라스미드 또는 벡터이다. 일 양태에서, 조성물은 트랜스포존이다. 바람직한 양태에서, 조성물은 나노트랜스포존이다.

일부 양태에서, 인터-ITR 서열의 길이는 1 내지 650개의 뉴클레오타이드, 1 내지 600개의 뉴클레오타이드, 1 내지 550개의 뉴클레오타이드, 1 내지 500개의 뉴클레오타이드, 1 내지 450개의 뉴클레오타이드, 1 내지 400개의 뉴클레오타이드, 1 내지 350개의 뉴클레오타이드, 1 내지 300개의 뉴클레오타이드, 1 내지 250개의 뉴클레오타이드, 1 내지 200개의 뉴클레오타이드, 1 내지 150개의 뉴클레오타이드, 1 내지 100개의 뉴클레오타이드, 1 내지 50개의 뉴클레오타이드, 1 내지 25개의 뉴클레오타이드 또는 1 내지 10개의 뉴클레오타이드이고, 각 범위는 종점을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 핵산 서열의 길이는 1 내지 650개의 뉴클레오타이드, 1 내지 600개의 뉴클레오타이드, 1 내지 550개의 뉴클레오타이드, 1 내지 500개의 뉴클레오타이드, 1 내지 450개의 뉴클레오타이드, 1 내지 400개의 뉴클레오타이드, 1 내지 350개의 뉴클레오타이드, 1 내지 300개의 뉴클레오타이드, 1 내지 250개의 뉴클레오타이드, 1 내지 200개의 뉴클레오타이드, 1 내지 150개의 뉴클레오타이드, 1 내지 100개의 뉴클레오타이드, 1 내지 50개의 뉴클레오타이드, 1 내지 25개의 뉴클레오타이드 또는 1 내지 10개의 뉴클레오타이드이고, 각 범위는 종점을 포함한다.

일부 양태에서, 인터-ITR 서열의 길이는 1 내지 25개의 뉴클레오타이드, 1 내지 50개의 뉴클레오타이드, 25 내지 50개의 뉴클레오타이드, 50 내지 100개의 뉴클레오타이드, 100 내지 150개의 뉴클레오타이드, 150 내지 200개의 뉴클레오타이드, 200 내지 250개의 뉴클레오타이드, 250 내지 300개의 뉴클레오타이드, 300 내지 350개의 뉴클레오타이드, 350 내지 400개의 뉴클레오타이드, 400 내지 450개의 뉴클레오타이드, 450 내지 500개의 뉴클레오타이드, 500 내지 550개의 뉴클레오타이드, 550 내지 600개의 뉴클레오타이드, 600 내지 650개의 뉴클레오타이드, 650 내지 700개의 뉴클레오타이드이고, 각 범위는 종점을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 핵산 서열의 길이는 1 내지 25개의 뉴클레오타이드, 1 내지 50개의 뉴클레오타이드, 25 내지 50개의 뉴클레오타이드, 50 내지 100개의 뉴클레오타이드, 100 내지 150개의 뉴클레오타이드, 150 내지 200개의 뉴클레오타이드, 200 내지 250개의 뉴클레오타이드, 250 내지 300개의 뉴클레오타이드, 300 내지 350개의 뉴클레오타이드, 350 내지 400개의 뉴클레오타이드, 400 내지 450개의 뉴클레오타이드, 450 내지 500개의 뉴클레오타이드, 500 내지 550개의 뉴클레오타이드, 550 내지 600개의 뉴클레오타이드, 600 내지 650개의 뉴클레오타이드, 650 내지 700개의 뉴클레오타이드이고, 각 범위는 종점을 포함한다.

본 개시내용의 짧은 나노트랜스포존(NTS)을 포함하는 일부 양태에서, 인터-ITR 서열의 길이는 1 내지 10개의 뉴클레오타이드, 10 내지 20개의 뉴클레오타이드, 20 내지 30개의 뉴클레오타이드, 30 내지 40개의 뉴클레오타이드, 40 내지 50개의 뉴클레오타이드, 50 내지 60개의 뉴클레오타이드, 60 내지 70개의 뉴클레오타이드, 70 내지 80개의 뉴클레오타이드, 80 내지 90개의 뉴클레오타이드, 또는 90 내지 100개의 뉴클레오타이드이고, 각 범위는 종점을 포함한다. 본 개시내용의 짧은 나노트랜스포존(NTS)을 포함하는 일부 양태에서, 핵산 서열의 길이는 1 내지 10개의 뉴클레오타이드, 10 내지 20개의 뉴클레오타이드, 20 내지 30개의 뉴클레오타이드, 30 내지 40개의 뉴클레오타이드, 40 내지 50개의 뉴클레오타이드, 50 내지 60개의 뉴클레오타이드, 60 내지 70개의 뉴클레오타이드, 70 내지 80개의 뉴클레오타이드, 80 내지 90개의 뉴클레오타이드, 또는 90 내지 100개의 뉴클레오타이드이고, 각 범위는 종점을 포함한다.

일부 양태에서, 인트라-ITR 서열의 길이는 100개 이상의 뉴클레오타이드, 500개 이상의 뉴클레오타이드, 1000개 이상의 뉴클레오타이드, 1500개 이상의 뉴클레오타이드, 2000개 이상의 뉴클레오타이드, 2500개 이상의 뉴클레오타이드, 3000개 이상의 뉴클레오타이드, 3500개 이상의 뉴클레오타이드, 4000개 이상의 뉴클레오타이드, 4500개 이상의 뉴클레오타이드, 5000개 이상의 뉴클레오타이드, 5500개 이상의 뉴클레오타이드, 6000개 이상의 뉴클레오타이드, 6500개 이상의 뉴클레오타이드, 7000개 이상의 뉴클레오타이드, 7500개 이상의 뉴클레오타이드, 8000개 이상의 뉴클레오타이드, 8500개 이상의 뉴클레오타이드, 9000개 이상의 뉴클레오타이드, 9500개 이상의 뉴클레오타이드, 10000개 이상의 뉴클레오타이드(10 킬로베이스(kb)), 50000개 이상의 뉴클레오타이드(50 kb), 100000개 이상의 뉴클레오타이드(100 kb), 150000개 이상의 뉴클레오타이드(150 kb), 200000개 이상의 뉴클레오타이드(200 kb), 250000개 이상의 뉴클레오타이드(250 kb), 300000개 이상의 뉴클레오타이드(300 kb), 350000개 이상의 뉴클레오타이드(350 kb), 400000개 이상의 뉴클레오타이드(400 kb), 450000개 이상의 뉴클레오타이드(450 kb), 500000개 이상의 뉴클레오타이드(50 kb), 또는 이들 사이의 임의의 수의 뉴클레오타이드이다. 일부 양태에서, 제2 핵산 서열의 길이는 100개 이상의 뉴클레오타이드, 500개 이상의 뉴클레오타이드, 1000개 이상의 뉴클레오타이드, 1500개 이상의 뉴클레오타이드, 2000개 이상의 뉴클레오타이드, 2500개 이상의 뉴클레오타이드, 3000개 이상의 뉴클레오타이드, 3500개 이상의 뉴클레오타이드, 4000개 이상의 뉴클레오타이드, 4500개 이상의 뉴클레오타이드, 5000개 이상의 뉴클레오타이드, 5500개 이상의 뉴클레오타이드, 6000개 이상의 뉴클레오타이드, 6500개 이상의 뉴클레오타이드, 7000개 이상의 뉴클레오타이드, 7500개 이상의 뉴클레오타이드, 8000개 이상의 뉴클레오타이드, 8500개 이상의 뉴클레오타이드, 9000개 이상의 뉴클레오타이드, 9500개 이상의 뉴클레오타이드, 10000개 이상의 뉴클레오타이드(10 킬로베이스(kb)), 50000개 이상의 뉴클레오타이드(50 kb), 100000개 이상의 뉴클레오타이드(100 kb), 150000개 이상의 뉴클레오타이드(150 kb), 200000개 이상의 뉴클레오타이드(200 kb), 250000개 이상의 뉴클레오타이드(250 kb), 300000개 이상의 뉴클레오타이드(300 kb), 350000개 이상의 뉴클레오타이드(350 kb), 400000개 이상의 뉴클레오타이드(400 kb), 450000개 이상의 뉴클레오타이드(450 kb), 500000개 이상의 뉴클레오타이드(50 kb), 또는 이들 사이의 임의의 수의 뉴클레오타이드이다.

조성물은 복제 원점 서열 또는 복제 서열을 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 제1 핵산 서열 또는 제2 핵산 서열은 복제 원점 서열 또는 복제 서열을 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 제1 핵산 서열은 복제 원점 서열 또는 복제 서열을 코딩하는 서열을 포함한다.

일부 양태에서, 복제 원점 서열의 길이는 450개 이하의 뉴클레오타이드, 400개 이하의 뉴클레오타이드, 350개 이하의 뉴클레오타이드, 300개 이하의 뉴클레오타이드, 250개 이하의 뉴클레오타이드, 200개 이하의 뉴클레오타이드, 150개 이하의 뉴클레오타이드, 100개 이하의 뉴클레오타이드, 50개 이하의 뉴클레오타이드, 25개 이하의 뉴클레오타이드, 또는 10개 이하의 뉴클레오타이드이다. 일부 양태에서, 복제 원점 서열의 길이는 1 내지 450개의 뉴클레오타이드, 1 내지 400개의 뉴클레오타이드, 1 내지 350개의 뉴클레오타이드, 1 내지 300개의 뉴클레오타이드, 1 내지 250개의 뉴클레오타이드, 1 내지 200개의 뉴클레오타이드, 1 내지 150개의 뉴클레오타이드, 1 내지 100개의 뉴클레오타이드, 1 내지 50개의 뉴클레오타이드, 1 내지 25개의 뉴클레오타이드, 또는 1 내지 10개의 뉴클레오타이드이고, 각 범위는 종점을 포함한다.

복제 원점 서열은 R6K 복제 원점을 포함할 수 있다. R6K 복제 원점은 R6K 감마 복제 원점을 포함할 수 있다. 복제 원점 서열은 미니 복제 원점을 포함할 수 있다. 미니 복제 원점은 R6K 미니 복제 원점을 포함할 수 있다. R6K 미니 복제 원점은 R6K 감마 미니 복제 원점을 포함할 수 있다. R6K 감마 미니 복제 원점의 길이는 281개의 뉴클레오타이드(281개의 염기쌍)이고, 서열번호: 15의 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다.

조성물은 제1 선택 마커 또는 제1 선택 마커를 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 제1 핵산 서열 또는 제2 핵산 서열은 제1 선택 마커 또는 제1 선택 마커를 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 제1 핵산 서열은 제1 선택 마커 또는 제1 선택 마커를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 제1 선택 마커의 길이는 450개 이하의 뉴클레오타이드, 200개 이하의 뉴클레오타이드, 150개 이하의 뉴클레오타이드, 100개 이하의 뉴클레오타이드, 50개 이하의 뉴클레오타이드, 25개 이하의 뉴클레오타이드, 또는 10개 이하의 뉴클레오타이드이다. 일부 양태에서, 제1 선택 마커의 길이는 1 내지 200개의 뉴클레오타이드, 1 내지 150개의 뉴클레오타이드, 1 내지 100개의 뉴클레오타이드, 1 내지 50개의 뉴클레오타이드, 1 내지 25개의 뉴클레오타이드, 또는 1 내지 10개의 뉴클레오타이드이고, 각 범위는 종점을 포함한다.

제1 선택 마커는 수크로스 선택 마커, 형광 마커, 세포 표면 마커, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 제1 선택 마커는 수크로스 선택 마커를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 바람직한 양태에서, 수크로스 선택 마커는 RNA-OUT 선택 마커를 포함한다. RNA-OUT 선택 마커의 길이는 139개의 뉴클레오타이드(139개의 염기쌍)이고 서열번호: 16의 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다.

제1 ITR을 코딩하는 서열 또는 제2 ITR을 코딩하는 서열은 TTAA, TTAT, 또는 TTAX 인식 서열을 포함할 수 있다. 제1 ITR을 코딩하는 서열 또는 제2 ITR을 코딩하는 서열은 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

제1 ITR을 코딩하는 서열 또는 제2 ITR을 코딩하는 서열은 서열번호: 24와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 구성될 수 있다. 제1 ITR을 코딩하는 서열 또는 제2 ITR을 코딩하는 서열은 서열번호: 25와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 구성될 수 있다. 제1 ITR을 코딩하는 서열 또는 제2 ITR을 코딩하는 서열은 서열번호: 26과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 구성될 수 있다. 제1 ITR을 코딩하는 서열 또는 제2 ITR을 코딩하는 서열은 서열번호: 27과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 구성될 수 있다. 제1 ITR을 코딩하는 서열 또는 제2 ITR을 코딩하는 서열은 서열번호: 2와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 구성될 수 있다. 제1 ITR을 코딩하는 서열 또는 제2 ITR을 코딩하는 서열은 서열번호: 14와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 구성될 수 있다.

일 양태에서, 제1 ITR을 코딩하는 서열은 서열번호: 24의 핵산 서열을 포함하고, 제2 ITR을 코딩하는 제2 서열은 서열번호: 25의 핵산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 제1 ITR을 코딩하는 서열은 서열번호: 24의 핵산 서열을 포함하고, 제2 ITR을 코딩하는 제2 서열은 서열번호: 26의 핵산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 제1 ITR을 코딩하는 서열은 서열번호: 24의 핵산 서열을 포함하고, 제2 ITR을 코딩하는 제2 서열은 서열번호: 27의 핵산 서열의 핵산 서열을 포함한다.

제1 핵산 서열은 적어도 하나의 외인성 서열 및 포유동물 세포에서 외인성 서열을 발현할 수 있는 적어도 하나의 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 프로모터는 인간 세포에서 외인성 서열을 발현할 수 있다. 바람직한 양태에서, 조성물의 트랜스포존 서열은 적어도 하나의 외인성 서열 및 포유동물 세포에서 외인성 서열을 발현할 수 있는 적어도 하나의 프로모터를 포함한다.

프로모터는 항시성 프로모터일 수 있다. 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 프로모터는 세포-유형 또는 조직-유형 특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터는 EF1a 프로모터(서열번호: 4), CMV 프로모터, MND 프로모터, SV40 프로모터, PGK1 프로모터, Ubc 프로모터, CAG 프로모터, H1 프로모터, 또는 U6 프로모터일 수 있다. 바람직한 양태에서, 프로모터는 EF1a 프로모터이다. 일 양태에서, 제1 핵산 서열은 포유동물 세포에서 제1 외인성 서열을 발현할 수 있는 제1 프로모터를 코딩하는 제1 서열, 및 포유동물 세포에서 제2 외인성 서열을 발현할 수 있는 제2 프로모터를 코딩하는 제2 서열을 포함하고, 제1 프로모터는 항시성 프로모터이고, 제2 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일 양태에서, 제1 프로모터를 코딩하는 제1 서열 및 제2 프로모터를 코딩하는 제2 서열은 반대 방향으로 배향된다.

적어도 하나의 외인성 서열은 비자연발생 항원 수용체를 코딩하는 서열, 치료적 폴리펩타이드를 코딩하는 서열, 또는 이의 조합을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 비자연발생 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR), T 세포 수용체(TCR), 키메라 자극 수용체(CSR), HLA 부류 I 조직적합성 항원, 알파 사슬 E 재조합 폴리펩타이드(HLA-E), 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 재조합 폴리펩타이드, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. TCR, CSR, HLA-E 및 B2M은 본원에 상세히 기재되어 있다. 바람직한 양태에서, 비자연발생 항원 수용체는 CAR을 포함한다.

적어도 하나의 외인성 서열은 유도성 아폽토시스 촉진(proapoptotic) 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 추가로 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드는 본원에 상세히 기재되어 있다.

적어도 하나의 외인성 서열은 제2 선택 마커를 코딩하는 서열을 추가로 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 제2 선택 마커는 세포 생존력 및 생존에 필수적인 유전자 생성물을 코딩할 수 있다. 제2 선택 마커는 선택적인 세포 배양 조건에 의해 도전될 때 세포 생존력 및 생존에 필수적인 유전자 생성물을 코딩할 수 있다. 선택적인 세포 배양 조건은 세포 생존력 또는 생존에 유해한 화합물을 포함할 수 있고, 유전자 생성물은 화합물에 대한 내성을 부여한다. 선택 유전자의 비제한적인 예는 neo(네오마이신에 대한 내성을 부여함), DHFR(디하이드로폴레이트 환원효소를 코딩하고 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여함), TYMS(티미딜레이트 합성효소를 코딩함), MGMT(O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라아제를 코딩함), 다중약물 내성 유전자(MDR1), ALDH1(알데하이드 탈수소효소 1 패밀리, 구성원 A1을 코딩함), FRANCF, RAD51C(RAD51 Paralog C를 코딩함), GCS(글루코실세라미드 신타아제를 코딩함), NKX2.2(NK2 Homeobox 2를 코딩함), 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.

제2 선택 마커는 검출가능한 마커일 수 있다. 검출가능한 마커는 형광 마커, 세포 표면 마커 또는 대사 마커일 수 있다. 바람직한 양태에서, 제2 선택 마커는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 뮤테인 효소를 코딩하는 서열을 포함한다. DHFR 뮤테인 효소는 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. DHFR 뮤테인 효소는 서열번호: 53 또는 서열번호: 11의 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다. DHFR 뮤테인 효소의 아미노산 서열은 위치 80, 113, 또는 153 중 하나 이상에서 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. DHFR 뮤테인 효소의 아미노산 서열은 위치 80에서 페닐알라닌(F) 또는 류신(L)의 치환, 위치 113에서 류신(L) 또는 발린(V)의 치환, 및 위치 153에서 발린(V) 또는 아스파르트산(D)의 치환 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

적어도 하나의 외인성 서열은 적어도 하나의 자가 절단 펩타이드를 코딩하는 서열을 추가로 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 예를 들어, 자가 절단 펩타이드는 CAR 및 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드 사이에 위치할 수 있거나, 자가 절단 펩타이드는 CAR 및 제2 선택 마커 사이에 위치할 수 있다.

적어도 하나의 외인성 서열은 적어도 2개의 자가 절단 펩타이드를 코딩하는 서열을 추가로 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 예를 들어, 제1 자가 절단 펩타이드는 CAR의 상류 또는 바로 상류에 위치하고, 제2 자가 절단 펩타이드는 CAR의 하류 또는 바로 하류에 위치에 위치하거나; 또는 제1 자가 절단 펩타이드 및 제2 자가 절단 펩타이드는 CAR 측면에 위치한다. 예를 들어, 제1 자가 절단 펩타이드는 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드의 상류 또는 바로 상류에 위치하고, 제2 자가 절단 펩타이드는 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드의 하류 또는 바로 하류에 위치하거나; 또는 제1 자가 절단 펩타이드 및 제2 자가 절단 펩타이드는 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드 측면에 위치한다. 예를 들어, 제1 자가 절단 펩타이드는 제2 선택 마커의 상류 또는 바로 상류에 위치하고, 제2 자가 절단 펩타이드는 제2 선택 마커의 하류 또는 바로 하류에 위치하거나; 또는 제1 자가 절단 펩타이드 및 제2 자가 절단 펩타이드는 제2 선택 마커 측면에 위치한다.

자가 절단 펩타이드의 비제한적인 예는 T2A 펩타이드, GSG-T2A 펩타이드, E2A 펩타이드, GSG-E2A 펩타이드, F2A 펩타이드, GSG-F2A 펩타이드, P2A 펩타이드, 또는 GSG-P2A 펩타이드를 포함한다. T2A 펩타이드는 서열번호: 54와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. GSG-T2A 펩타이드는 서열번호: 55와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. GSG-T2A 폴리펩타이드는 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 56과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다. E2A 펩타이드는 서열번호: 57과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. GSG-E2A 펩타이드는 서열번호: 58과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. F2A 펩타이드는 서열번호: 59와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. GSG-F2A 펩타이드는 서열번호: 60과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. P2A 펩타이드는 서열번호: 61과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. GSG-P2A 펩타이드는 서열번호: 62와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다.

적어도 하나의 외인성 서열 및 포유동물 세포에서 외인성 서열을 발현할 수 있는 적어도 하나의 프로모터를 포함하는 제1 핵산 서열은 인슐레이터(insulator)를 코딩하는 적어도 하나의 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일 양태에서, 제1 핵산 서열은 제1 인슐레이터를 코딩하는 제1 서열 및 제2 인슐레이터를 코딩하는 제2 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 또는 제2 인슐레이터를 코딩하는 서열은 서열번호: 3 또는 서열번호: 13과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다.

적어도 하나의 외인성 서열 및 포유동물 세포에서 외인성 서열을 발현할 수 있는 적어도 하나의 프로모터를 포함하는 제1 핵산 서열은 폴리아데노신(polyA) 서열을 추가로 포함할 수 있다. 적어도 하나의 외인성 서열, 포유동물 세포에서 외인성 서열을 발현할 수 있는 적어도 하나의 프로모터 및 인슐레이터를 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함하는 제1 핵산 서열은 폴리아데노신(polyA) 서열을 추가로 포함할 수 있다. polyA 서열은 바이러스 polyA 서열로부터 단리되거나 유래될 수 있다. polyA 서열은 (SV40) polyA 서열로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 또는 제2 인슐레이터를 코딩하는 서열은 서열번호: 12와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다.

일 양태에서, 조성물은 외래 DNA를 코딩하는 서열을 포함하지 않는다. 일 양태에서, 제1 핵산 서열은 외래 DNA를 코딩하는 서열을 포함하지 않는다. 일 양태에서, 제2 핵산 서열은 외래 DNA를 코딩하는 서열을 포함하지 않는다. 일 양태에서, 조성물은 외래 DNA를 코딩하는 서열을 포함한다. 일 양태에서, 제1 핵산 서열은 외래 DNA를 코딩하는 서열을 포함한다. 일 양태에서, 제2 핵산 서열은 외래 DNA를 코딩하는 서열을 포함한다. 외래 DNA는 외인성 서열이 발현될 포유동물 세포와 동일한 유기체로부터 유래되거나 수득되지 않은 DNA 서열이다. 예를 들어, 외래 DNA는 포유동물이 아닌 바이러스로부터의 DNA일 수 있거나; 또는 외래 DNA는 포유동물이 아닌 파충류로부터의 DNA일 수 있다. 또 다른 양태에서, 외래 DNA는 하나의 포유동물로부터 유래될 수 있지만, 상기 포유동물은 외인성 서열이 발현될 포유동물과 상이하다. 예를 들어, 외래 DNA는 인간이 아닌 랫트로부터 유래된다.

일 양태에서, 조성물은 재조합 부위, 절제 부위, 결찰 부위, 또는 이의 조합을 포함하지 않는다. 일 양태에서, 조성물은 재조합 사건, 절제 사건, 결찰 사건, 또는 이의 조합의 생성물을 포함하지 않는다. 일 양태에서, 조성물은 재조합 사건, 절제 사건, 결찰 사건, 또는 이의 조합으로부터 유래되지 않는다.

일 양태에서, 제1 핵산 서열은 재조합 부위, 절제 부위, 결찰 부위, 또는 이의 조합을 포함하지 않는다. 일 양태에서, 제1 핵산 서열은 재조합 사건, 절제 사건, 결찰 사건, 또는 이의 조합의 생성물을 포함하지 않는다. 일 양태에서, 제1 핵산 서열은 재조합 사건, 절제 사건, 결찰 사건, 또는 이의 조합으로부터 유래되지 않는다.

일 양태에서, 제2 핵산 서열은 재조합 부위, 절제 부위, 결찰 부위, 또는 이의 조합을 포함하지 않는다. 일 양태에서, 제2 핵산 서열은 재조합 사건, 절제 사건, 결찰 사건, 또는 이의 조합의 생성물을 포함하지 않는다. 일 양태에서, 제2 핵산 서열은 재조합 사건, 절제 사건, 결찰 사건, 또는 이의 조합으로부터 유래되지 않는다.

재조합 부위는 재조합 사건으로부터 비롯되는 서열을 포함할 수 있거나, 재조합 사건의 생성물인 서열을 포함할 수 있거나, 또는 재조합효소의 활성(예컨대, 재조합효소 부위)을 포함할 수 있다.

키메라 항원 수용체(CAR)

본 개시내용은 또한 CAR을 포함하는 조성물(예컨대, 나노트랜스포존)을 제공하며, CAR은 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인; 막관통 도메인, 및 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. CAR은 항원 인식 도메인 및 막관통 도메인 사이에 힌지 영역을 추가로 포함할 수 있다.

항원 인식 영역은 적어도 하나의 단일 사슬 가변 단편(scFv), 센티린, 단일 도메인 항체, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 적어도 하나의 단일 도메인 항체는 VHH이다. 일 양태에서, 적어도 하나의 단일 도메인 항체는 VH이다.

scFv

본 개시내용의 조성물(예컨대, 트랜스포존 또는 나노트랜스포존)은 CAR을 포함할 수 있고; 일부 양태에서, CAR의 항원 인식 영역은 특정 표적 단백질/항원을 인식하고 이에 결합하기 위한 하나 이상의 scFv 조성물을 포함할 수 있다. 항원 인식 영역은 적어도 2개의 scFv를 포함할 수 있다. 항원 인식 영역은 적어도 3개의 scFv를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 본 개시내용의 CAR은 2개의 구별되는 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 scFv를 포함하는 이중특이적 CAR이다.

scFv 조성물은 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. scFv는 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이며, VH 및 VL 도메인은 짧은 펩타이드 링커를 이용하여 연결된다. scFv는 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고 원래의 면역글로불린의 특이성을 유지할 수 있다. 일부 양태에서, 링커 폴리펩타이드는 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 링커 폴리펩타이드는 서열번호: 34의 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩될 수 있다.

센티린

본 개시내용의 조성물(예컨대, 트랜스포존 또는 나노트랜스포존)은 CAR을 포함할 수 있고; 일부 양태에서, CAR의 항원 인식 영역은 특정 표적 단백질/항원을 인식하고 이에 결합하기 위한 하나 이상의 센티린 조성물을 포함할 수 있다. 항원에 특이적으로 결합하는 센티린은 세포(예컨대, 세포독성 면역 세포)의 특이성을 특정 항원으로 향하게 하는 데 사용될 수 있다. 센티린을 포함하는 CAR은 본원에서 CARTyrin으로 지칭된다.

본 개시내용의 센티린은 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있고, 스캐폴드는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 개시내용의 센티린은 적어도 하나의 피브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인의 공통 서열을 포함하는 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있고, 스캐폴드는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 적어도 하나의 피브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인은 인간 단백질로부터 유래될 수 있다. 인간 단백질은 테나신-C(Tenascin-C)일 수 있다. 공통 서열은 서열번호: 84와 적어도 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되거나, 또는 공통 서열은 서열번호: 85와 적어도 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 공통 서열은 서열번호: 86과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다.

공통 서열은 (a) 공통 서열의 위치 13-16에 아미노산 잔기 TEDS(서열번호: 87)를 포함하거나 구성되는 A-B 루프; (b) 공통 서열의 위치 22-28에 아미노산 잔기 TAPDAAF(서열번호: 88)를 포함하거나 구성되는 B-C 루프; (c) 공통 서열의 위치 38-43에 아미노산 잔기 SEKVGE(서열번호: 89)를 포함하거나 구성되는 C-D 루프; (d) 공통 서열의 위치 51-54에 아미노산 잔기 GSER(서열번호: 90)를 포함하거나 구성되는 D-E 루프; (e) 공통 서열의 위치 60-64에 아미노산 잔기 GLKPG(서열번호: 91)를 포함하거나 구성되는 E-F 루프; (f) 공통 서열의 위치 75-81에 아미노산 잔기 KGGHRSN(서열번호: 92)을 포함하거나 구성되는 F-G 루프; 또는 (g) (a)-(f)의 임의의 조합 내의 하나 이상의 위치에서 변형될 수 있다. 본 개시내용의 센티린은 적어도 5개의 피브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인, 적어도 10개의 피브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인 또는 적어도 15개의 피브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인의 공통 서열을 포함할 수 있다.

용어 "항체 모방체"는 표적 서열에 특이적으로 결합하고 자연발생 항체와 구별되는 구조를 갖는 유기 화합물을 기술하는 것으로 의도된다. 항체 모방체는 단백질, 핵산, 또는 소분자를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 항체 모방체가 특이적으로 결합하는 표적 서열은 항원일 수 있다. 항체 모방체는, 비제한적으로, 우수한 용해도, 조직 침투, 열 및 효소에 대한 안정성(예컨대, 효소 분해에 대한 내성), 및 더 낮은 생산 비용을 포함하여 항체보다 우수한 특성을 제공할 수 있다. 예시적인 항체 모방체는, 비제한적으로, 아피바디(affibody), 아필린(afflilin), 아피머(affimer), 아피틴(affitin), 알파바디(alphabody), 안티칼린(anticalin), 및 아비머(avimer)(결합력 다량체(avidity multimer)로도 알려짐), DARPin(Designed Ankyrin Repeat Protein), 피노머(Fynomer), 쿠니츠(Kunitz) 도메인 펩타이드, 및 모노바디를 포함한다.

본 개시내용의 아피바디 분자는 임의의 디설파이드 다리가 없는 하나 이상의 알파 나선을 포함하거나 구성되는 단백질 스캐폴드를 포함한다. 바람직하게는, 본 개시내용의 아피바디 분자는 3개의 알파 나선을 포함하거나 구성된다. 예를 들어, 본 개시내용의 아피바디 분자는 면역글로불린 결합 도메인을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 아피바디 분자는 단백질 A의 Z 도메인을 포함할 수 있다.

본 개시내용의 아필린 분자는, 예를 들어, 감마-B 크리스탈린 또는 유비퀴틴의 노출된 아미노산의 변형에 의해 생산된 단백질 스캐폴드를 포함한다. 아필린 분자는 항원에 대한 항체의 친화성을 기능적으로 모방하지만, 항체를 구조적으로 모방하지 않는다. 아필린을 제조하는 데 사용된 임의의 단백질 스캐폴드에서, 용매 또는 적절하게 접힌 단백질 분자 내의 가능한 결합 파트너에 접근가능한 아미노산은 노출된 아미노산으로 간주된다. 이들 노출된 아미노산 중 어느 하나 이상은 표적 서열 또는 항원에 특이적으로 결합하도록 변형될 수 있다.

본 개시내용의 아피머 분자는 특이적 표적 서열에 대해 높은 친화성 결합 부위를 제공하는 펩타이드 루프를 나타내도록 조작된 매우 안정한 단백질을 포함하는 단백질 스캐폴드를 포함한다. 본 개시내용의 예시적인 아피머 분자는 시스타틴 단백질 또는 이의 3차 구조에 기초한 단백질 스캐폴드를 포함한다. 본 개시내용의 예시적인 아피머 분자는 역평행 베타-시트 위에 놓인 알파-나선을 포함하는 공통 3차 구조를 공유할 수 있다.

본 개시내용의 아피틴 분자는 인공 단백질 스캐폴드를 포함하고, 이의 구조는, 예를 들어, DNA 결합 단백질(예컨대, DNA 결합 단백질 Sac7d)로부터 유래될 수 있다. 본 개시내용의 아피틴은 항원의 전체 또는 일부일 수 있는 표적 서열에 선택적으로 결합한다. 본 개시내용의 예시적인 아피틴은 DNA 결합 단백질의 결합 표면 상에 하나 이상의 아미노산 서열을 무작위화하고 생성된 단백질을 리보솜 디스플레이 및 선택에 적용함으로써 제조된다. 본 개시내용의 아피틴의 표적 서열은, 예를 들어, 게놈에서 또는 펩타이드, 단백질, 바이러스, 또는 박테리아의 표면 상에서 발견될 수 있다. 일부 양태에서, 아피틴 분자는 효소의 특정 억제제로서 사용될 수 있다. 본 개시내용의 아피틴 분자는 내열성 단백질 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다.

본 개시내용의 알파바디 분자는 또한 세포-침투 알파바디(Cell-Penetrating Alphabody, CPAB)로 지칭될 수 있다. 본 개시내용의 알파바디 분자는 다양한 표적 서열(항원 포함)에 결합하는 작은 단백질(전형적으로 10 kDa 미만)을 포함한다. 알파바디 분자는 세포내 표적 서열에 도달하고 결합할 수 있다. 구조적으로, 본 개시내용의 알파바디 분자는 단일 사슬 알파 나선(자연발생 코일형 코일 구조와 유사함)을 형성하는 인공 서열을 포함한다. 본 개시내용의 알파바디 분자는 표적 단백질에 특이적으로 결합하도록 변형된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있다. 분자의 결합 특이성에 관계없이, 본 개시내용의 알파바디 분자는 정확한 접힘 및 열안정성을 유지한다.

본 개시내용의 안티칼린 분자는 단백질 또는 소분자 내의 표적 서열 또는 부위에 결합하는 인공 단백질을 포함한다. 본 개시내용의 안티칼린 분자는 인간 리포칼린으로부터 유래된 인공 단백질을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 안티칼린 분자는, 예를 들어, 단클론 항체 또는 이의 단편 대신에 사용될 수 있다. 안티칼린 분자는 단클론 항체 또는 이의 단편보다 우수한 조직 침투 및 열안정성을 입증할 수 있다. 본 개시내용의 예시적인 안티칼린 분자는 대략 20 kDa의 질량을 갖는 약 180개의 아미노산을 포함할 수 있다. 구조적으로, 본 개시내용의 안티칼린 분자는 루프에 의해 쌍으로 연결된 역평행 베타-가닥 및 부착된 알파 나선을 포함하는 배럴(barrel) 구조를 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 안티칼린 분자는 루프에 의해 쌍으로 연결된 8개의 역평행 베타-가닥 및 부착된 알파 나선을 포함하는 배럴 구조를 포함한다.

본 개시내용의 아비머 분자는 표적 서열(항원일 수도 있음)에 특이적으로 결합하는 인공 단백질을 포함한다. 본 개시내용의 아비머는 동일한 표적 내 또는 구별되는 표적 내의 다수의 결합 부위를 인식할 수 있다. 본 개시내용의 아비머가 하나 초과의 표적을 인식하는 경우, 아비머는 이중특이적 항체의 기능을 모방한다. 인공 단백질 아비머는 각각 대략 30-35개의 아미노산의 2개 이상의 펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 이들 펩타이드는 하나 이상의 링커 펩타이드를 통해 연결될 수 있다. 아비머의 하나 이상의 펩타이드의 아미노산 서열은 막 수용체의 A 도메인으로부터 유래될 수 있다. 아비머는 선택적으로 디설파이드 결합 및/또는 칼슘을 포함할 수 있는 견고한 구조를 갖는다. 본 개시내용의 아비머는 항체에 비해 더 큰 열 안정성을 입증할 수 있다.

본 개시내용의 DARPin(Designed Ankyrin Repeat Protein)은 표적 서열에 대해 높은 특이성 및 높은 친화성을 갖는 유전적으로 조작된, 재조합, 또는 키메라 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 DARPin은 안키린 단백질로부터 유래되고, 선택적으로, 안키린 단백질의 적어도 3개의 반복 모티프(반복적인 구조 단위로도 지칭됨)를 포함한다. 안키린 단백질은 높은 친화성 단백질-단백질 상호작용을 매개한다. 본 개시내용의 DARPin은 큰 표적 상호작용 표면을 포함한다.

본 개시내용의 피노머는 인간 Fyn SH3 도메인로부터 유래되고 항체와 동일한 친화성 및 동일한 특이성으로 표적 서열 및 분자에 결합하도록 조작된 작은 결합 단백질(약 7 kDa)을 포함한다.

본 개시내용의 쿠니츠 도메인 펩타이드는 쿠니츠 도메인을 포함하는 단백질 스캐폴드를 포함한다. 쿠니츠 도메인은 프로테아제 활성을 억제하기 위한 활성 부위를 포함한다. 구조적으로, 본 개시내용의 쿠니츠 도메인은 디설파이드가 풍부한 알파+베타 폴드를 포함한다. 이 구조는 소 췌장 트립신 억제제에 의해 예시된다. 쿠니츠 도메인 펩타이드는 특이적 단백질 구조를 인식하고 경쟁적 프로테아제 억제제로서 작용한다. 본 개시내용의 쿠니츠 도메인은 에칼란티드(Ecallantide)(인간 지질단백질 연관 응고 억제제(LACI)로부터 유래됨)를 포함할 수 있다.

본 개시내용의 모노바디는 단일 사슬 항체와 크기가 비슷한 작은 단백질(약 94개의 아미노산을 포함하고 약 10 kDa의 질량을 가짐)이다. 이러한 유전적으로 조작된 단백질은 항원을 포함하는 표적 서열에 특이적으로 결합한다. 본 개시내용의 모노바디는 하나 이상의 구별되는 단백질 또는 표적 서열을 특이적으로 표적화할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 모노바디는 인간 피브로넥틴의 구조를 모방하고, 보다 바람직하게는, 피브로넥틴의 10번째 세포외 유형 III 도메인의 구조를 모방하는 단백질 스캐폴드를 포함한다. 피브로넥틴의 10번째 세포외 유형 III 도메인뿐만 아니라 이의 모노바디 모방체는 배럴을 형성하는 7개의 베타 시트 및 항체의 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 상응하는 각 측면에 3개의 노출된 루프를 함유한다. 항체의 가변 도메인의 구조와 달리, 모노바디는 금속 이온에 대한 임의의 결합 부위뿐만 아니라 중심 디설파이드 결합이 없다. 다중특이적 모노바디는 루프 BC 및 FG를 변형시킴으로써 최적화될 수 있다. 본 개시내용의 모노바디는 아드넥틴(adnectin)을 포함할 수 있다.

VHH

본 개시내용의 조성물(예컨대, 트랜스포존 또는 나노트랜스포존)은 CAR을 포함할 수 있고; 일부 양태에서, CAR의 항원 인식 영역은 특정 표적 단백질/항원을 인식하고 이에 결합하는 적어도 하나의 단일 도메인 항체(SdAb)를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 단일 도메인 항체는 VHH이다. VHH는 낙타과에서 발견되는 중쇄 항체이다. 항원에 특이적으로 결합하는 VHH는 세포(예컨대, 세포독성 면역 세포)의 특이성을 특정 항원으로 향하게 하는 데 사용될 수 있다. 항원 인식 영역은 적어도 2개의 VHH를 포함할 수 있다. 항원 인식 영역은 적어도 3개의 VHH를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 본 개시내용의 CAR은 2개의 구별되는 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 VHH를 포함하는 이중특이적 CAR이다. VHH를 포함하는 CAR은 본원에서 VCAR로 지칭된다.

본 개시내용의 적어도 하나의 VHH 단백질 또는 VCAR은 당업계에 잘 알려진 바와 같이 세포주, 혼합된 세포주, 불멸화된 세포 또는 불멸화된 세포의 클론 집단에 의해 선택적으로 생산될 수 있다. 예컨대, 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y.(1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY(1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y.,(1997-2001)]을 참고한다.

VHH 단백질로부터의 아미노산은 면역원성을 감소시키거나 결합, 친화성, 온-속도, 오프-속도, 결합력, 특이성, 반감기, 안정성, 용해도 또는 당업계에 공지된 바와 같은 임의의 다른 적합한 특징을 감소, 향상 또는 변형시키기 위해 변경, 부가 및/또는 결실될 수 있다.

선택적으로, VHH 단백질은 항원에 대한 높은 친화성 및 다른 유리한 생물학적 특성을 유지하면서 조작될 수 있다. 이 목표를 달성하기 위해, VHH 단백질은 부모 및 조작된 서열의 3차원 모델을 사용하여 부모 서열 및 다양한 개념적 조작된 생성물의 분석 과정에 의해 선택적으로 제조될 수 있다. 3차원 모델이 일반적으로 이용가능하며, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 예시하고 표시하며 가능한 면역원성을 측정할 수 있는 컴퓨터 프로그램(예컨대, 캘리포니아 몬로비아의 Xencor사의 Immunofilter 프로그램)을 이용할 수 있다. 이러한 디스플레이의 검사는 후보 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 그의 항원에 결합하는 후보 VHH 단백질의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, 표적 항원(들)에 대한 친화성과 같은 원하는 특징이 달성되도록 부모 및 참조 서열로부터 잔기가 선택되고 조합될 수 있다. 대안적으로, 또는 상기 절차에 부가적으로, 다른 적합한 조작 방법이 사용될 수 있다. 유사한 단백질 또는 단편에의 특이적 결합에 대해 VHH를 스크리닝하는 것은 뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA 디스플레이) 또는 펩타이드 디스플레이 라이브러리, 예를 들어, 시험관내 디스플레이를 사용하여 편리하게 달성될 수 있다. 어떤 단백질, 항체, 및 다른 길항제가 본 개시내용의 VHH 또는 VCAR과 표적 단백질에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 에피토프 영역을 공유하는지 결정하기 위해 본 개시내용의 VHH 또는 VCAR을 이용하여 경쟁적 분석이 수행될 수 있다. 당업자에게 쉽게 알려진 바와 같은 이러한 분석은 단백질 상의 제한된 수의 결합 부위에 대한 길항제 또는 리간드 사이의 경쟁을 평가한다.

VH

본 개시내용의 조성물(예컨대, 트랜스포존 또는 나노트랜스포존)은 CAR을 포함할 수 있고; 일부 양태에서, CAR의 항원 인식 영역은 특정 표적 단백질/항원을 인식하고 이에 결합하기 위해 적어도 하나의 단일 도메인 항체(SdAb)를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 단일 도메인 항체는 VH이다. VH는 일반적인 IgG로부터 유래된 단일 도메인 결합제이다. 항원에 특이적으로 결합하는 VH는 세포(예컨대, 세포독성 면역 세포)의 특이성을 특이적 항원으로 향하게 하는 데 사용될 수 있다. 항원 인식 영역은 적어도 2개의 VH를 포함할 수 있다. 항원 인식 영역은 적어도 3개의 VH를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 본 개시내용의 CAR은 2개의 구별되는 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 VH를 포함하는 이중특이적 CAR이다.

VH는 인간 서열로부터 단리되거나 유래될 수 있다. VH는 인간 CDR 서열 및/또는 인간 프레임워크 서열 및 비인간 또는 인간화된 서열(예컨대, 랫트 Fc 도메인)을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, VH는 완전히 인간화된 VH이다. 일부 양태에서, VH는 자연발생 항체도 아니고 자연발생 항체의 단편도 아니다. 일부 양태에서, VH는 단클론 항체의 단편이 아니다. 일부 양태에서, VH는 UniDab 항체(TeneoBio)이다. 일부 양태에서, VH는 Fc 도메인 또는 이의 일부를 제거하도록 변형된다. 일부 양태에서, VH의 프레임워크 서열은, 예를 들어, 발현을 개선하거나, 면역원성을 감소시키거나 기능을 개선하도록 변형된다.

VH는 VH를 생산하기 위해 UniRat(TeneoBio) 시스템 및 "NGS 기반 발견"을 사용하여 완전히 조작될 수 있다. 이 방법을 사용하면, 특정 VH는 자연 발생하지 않으며 완전 조작된 시스템을 사용하여 생성된다.　VH는 숙주(예를 들어, 마우스, 랫트 또는 인간)로부터 직접 단리되거나 세포 또는 세포주의 단일 클론(하이브리도마)으로부터 직접 단리된 자연발생 단클론 항체(mAb)로부터 유래되지 않는다. 이러한 VH는 후속적으로 상기 세포주로부터 클로닝되지 않았다. 대신, VH 서열은 랫트 Fc 도메인을 갖는 인간 가변 영역(VH 도메인)을 포함하는 전이유전자(transgene)로서 UniRat 시스템을 사용하여 완전 조작되고, 따라서 경쇄가 없는 인간/랫트 키메라이며 표준 mAb 형식과 다르다. 천연 랫트 유전자는 넉아웃되고 랫트에서 발현되는 유일한 항체는 랫트 Fc(UniAbs)에 연결된 VH 도메인을 갖는 전이유전자로부터 유래된다. 이들은 UniRat에서 발현되는 독점적인 Ab이다. 차세대 시퀀싱(NGS) 및 생물정보학은 면역 후 UniRat에 의해 생성된 중쇄 항체의 전체 항원 특이적 레퍼토리를 확인하는 데 사용된다. 그리고 나서, 항체 레퍼토리 서열 정보를 다양한 기능에 대해 시험관내에서 스크리닝될 수 있는 완전 인간 중쇄 항체의 큰 집합으로 변환하기 위해 고유한 유전자 조립 방법이 사용된다. 일부 양태에서, 완전히 인간화된 VH는 인간 VH 도메인을 시험관내에서 인간 Fc와 융합함으로써(비자연발생 재조합 VH 항체를 생성하기 위해) 생성된다. 일부 양태에서, VH는 완전히 인간화되지만, 이들은 경쇄가 없는 인간/랫트 키메라(인간 VH, 랫트 Fc)로서 생체내에서 발현된다. 경쇄가 없는 인간/랫트 키메라(인간 VH, 랫트 Fc)로서 생체내에서 발현되는 완전히 인간화된 VH는 약 80kDa(대 150 kDa)이다.

본 개시내용의 CAR은 10^-9 M 이하, 10^-10 M 이하, 10^-11 M 이하, 10^-12 M 이하, l10^-13 M 이하, 10^-14 M 이하, 및 10^-15 M 이하의 K_D로부터 선택된 적어도 하나의 친화성으로 인간 항원에 결합할 수 있다. K_D는, 비제한적으로, 표면 플라즈몬 공명을 포함하는 임의의 수단에 의해 결정될 수 있다.

일 양태에서, 개시된 CAR의 항원 인식 영역은 적어도 하나의 항-BCMA 센티린을 포함한다. 항-BCMA 센티린은 서열번호: 29와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 항-BCMA 센티린은 서열번호: 28과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다.

항-BCMA 센티린을 포함하는 CAR은 본원에서 BCMA CARTyrin으로 지칭된다. 바람직한 양태에서, BCMA CARTyrin은 서열번호: 30과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. BCMA CARTyrin은 서열번호: 9와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다.

BCMA CARTyrin을 포함하는 본 개시내용의 조성물(예컨대, 나노트랜스포존)은 서열번호: 17과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. BCMA CARTyrin을 포함하는 본 개시내용의 조성물(예컨대, 나노트랜스포존)은 서열번호: 1과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다. BCMA CARTyrin을 포함하는 본 개시내용의 조성물(예컨대, 나노트랜스포존)은 본원에서 P-BCMA-101-트랜스포존(도 13에 예시된 바와 같음)으로 지칭된다.

일 양태에서, 개시된 CAR의 항원 인식 영역은 적어도 하나의 항-PSMA 센티린을 포함한다. 항-PSMA 센티린은 서열번호: 94와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 항-PSMA 센티린은 서열번호: 93과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다.

항-PSMA 센티린을 포함하는 CAR은 본원에서 PSMA CARTyrin으로 지칭된다. 바람직한 양태에서, PSMA CARTyrin은 서열번호: 95와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. PSMA CARTyrin은 서열번호: 19와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다.

PSMA CARTyrin을 포함하는 본 개시내용의 조성물(예컨대, 나노트랜스포존)은 서열번호: 20과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. PSMA CARTyrin을 포함하는 본 개시내용의 조성물(예컨대, 나노트랜스포존)은 서열번호: 18과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다. PSMA CARTyrin을 포함하는 본 개시내용의 조성물(예컨대, 나노트랜스포존)은 본원에서 P-PSMA-101 트랜스포존(도 14에 예시된 바와 같음)으로도 지칭된다.

일 양태에서, 개시된 CAR의 항원 인식 영역은 적어도 하나의 항-BCMA VH를 포함한다. 항-BCMA VH는 서열번호: 97과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 항-BCMA VH는 서열번호: 96과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다.

항-BCMA VH를 포함하는 CAR은 본원에서 BCMA VCAR로 지칭된다. 바람직한 양태에서, BCMA VCAR은 서열번호: 98과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. BCMA VCAR은 서열번호: 22와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다.

BCMA VCAR을 포함하는 본 개시내용의 조성물(예컨대, 나노트랜스포존)은 서열번호: 23과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. BCMA VCAR을 포함하는 본 개시내용의 조성물(예컨대, 나노트랜스포존)은 서열번호: 21과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다. BCMA VCAR을 포함하는 본 개시내용의 조성물(예컨대, 나노트랜스포존)은 본원에서 P-BCMA-ALLO1-트랜스포존(도 15에 예시된 바와 같음)으로도 지칭된다.

엑토도메인은 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 신호 펩타이드는 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 신호 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 신호 펩타이드는 인간 CD8 알파(CD8α) 신호 펩타이드(SP) 또는 이의 일부를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 인간 CD8α SP는 서열번호: 31과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 바람직하게는, 인간 CD8α SP는 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다.

인간 CD8α SP는 서열번호: 32와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다. 바람직하게는, 인간 CD8α SP는 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다.

힌지 도메인 또는 힌지 영역은 인간 CD8α, IgG4, CD4 서열, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 힌지는 인간 CD8 알파(CD8α) 힌지 또는 이의 일부를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 인간 CD8a 힌지는 서열번호: 35와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 바람직하게는, 인간 CD8α 힌지 도메인은 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다.

인간 CD8α 힌지는 서열번호: 36과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다. 바람직하게는, 인간 CD8α 힌지 도메인은 서열번호: 36의 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다.

막관통 도메인은 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 막관통 도메인을 코딩하는 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 바람직하게는, 막관통 도메인은 인간 CD8 알파(CD8α) 막관통 도메인, 또는 이의 일부를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. CD8a 막관통 도메인은 서열번호: 37과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 바람직하게는, 인간 CD8α 막관통 도메인은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다.

CD8α 막관통 도메인은 서열번호: 38과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다. 바람직하게는, CD8α 막관통 도메인은 서열번호: 38의 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다.

적어도 하나의 공자극 도메인은 인간 4-1BB, CD28, CD3 제타(CD3ζ), CD40, ICOS, MyD88, OX-40 세포내 도메인, 또는 임의의 이의 조합을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 바람직하게는, 적어도 하나의 공자극 도메인은 CD3ζ, 4-1BB 공자극 도메인, 또는 이의 조합을 포함한다.

4-1BB 세포내 도메인은 서열번호: 39와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 바람직하게는, 4-1BB 세포내 도메인은 서열번호: 39의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다.

4-1BB 세포내 도메인은 서열번호: 40과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다. 바람직하게는, 4-1BB 세포내 도메인은 서열번호: 40의 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다.

CD3ζ 세포내 도메인은 서열번호: 41과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 바람직하게는, CD3ζ 세포내 도메인은 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다.

CD3ζ 세포내 도메인은 서열번호: 42와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다. 바람직하게는, CD3ζ 세포내 도메인은 서열번호: 42의 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다.

트랜스포존 및 벡터 조성물

전위 시스템

본 개시내용은 (a) 제1 역위 말단 반복(ITR) 또는 제1 ITR을 코딩하는 서열, (b) 제2 ITR 또는 제2 ITR을 코딩하는 서열, 및 (c) 인트라-ITR 서열 또는 인트라-ITR을 코딩하는 서열을 포함하는 제1 핵산 서열로서, 인트라-ITR 서열은 트랜스포존 서열 또는 트랜스포존을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및 인터-ITR 서열 또는 인터-ITR을 코딩하는 서열을 포함하는 제2 핵산 서열로서, 인터-ITR 서열의 길이는 700개 이하의 뉴클레오타이드인 것인 제2 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존 또는 나노트랜스포존을 제공한다.

본 개시내용의 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 단백질 스캐폴드(예컨대, 적어도 하나의 scFv, 단일 도메인 항체 또는 센티린을 포함하는 CAR)를 포함한다. 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 2개의 시스-조절성 인슐레이터 요소 측면에 있는 단백질 스캐폴드(예컨대, 적어도 하나의 scFv, 단일 도메인 항체 또는 센티린을 포함하는 CAR)를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드 DNA 트랜스포존일 수 있다. 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 DNA 서열 또는 RNA 서열일 수 있다. 바람직하게는, 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.

본 개시내용의 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 piggyBac™(PB) 트랜스포존일 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존이 PB 트랜스포존인 경우, 트랜스포사제는 piggyBac™(PB) 트랜스포사제 piggyBac-유사(PBL) 트랜스포사제 또는 Super piggyBac™(SPB) 트랜스포사제이다. 바람직하게는, SPB 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.

PB 트랜스포존 및 PB, PBL 및 SPB 트랜스포사제의 비제한적인 예는 미국 특허 제6,218,182호; 미국 특허 제6,962,810호; 미국 특허 제8,399,643호 및 PCT 공개 WO 제2010/099296호에 상세히 기재되어 있다.

PB, PBL 및 SPB 트랜스포사제는 트랜스포존의 말단에 있는 트랜스포존 특이적 역위 말단 반복 서열(ITR)을 인식하고, 염색체 부위 내의 서열 5'-TTAT-3'(TTAT 표적 서열) 또는 염색체 부위 내의 서열 5'-TTAA-3'(TTAA 표적 서열)에 있는 ITR 사이에 내용물을 삽입한다. PB 또는 PBL 트랜스포존의 표적 서열은 5'-CTAA-3', 5'-TTAG-3', 5'-ATAA-3', 5'-TCAA-3', 5'AGTT-3', 5'-ATTA-3', 5'-GTTA-3', 5'-TTGA-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTAC-3', 5'-ACTA-3', 5'-AGGG-3', 5'-CTAG-3', 5'-TGAA-3', 5'-AGGT-3', 5'-ATCA-3', 5'-CTCC-3', 5'-TAAA-3', 5'-TCTC-3', 5'TGAA-3', 5'-AAAT-3', 5'-AATC-3', 5'-ACAA-3', 5'-ACAT-3', 5'-ACTC-3', 5'-AGTG-3', 5'-ATAG-3', 5'-CAAA-3', 5'-CACA-3', 5'-CATA-3', 5'-CCAG-3', 5'-CCCA-3', 5'-CGTA-3', 5'-GTCC-3', 5'-TAAG-3', 5'-TCTA-3', 5'-TGAG-3', 5'-TGTT-3', 5'-TTCA-3'5'-TTCT-3' 및 5'-TTTT-3'를 포함하거나 구성될 수 있다. PB 또는 PBL 트랜스포존 시스템은 ITR 사이에 포함될 수 있는 관심 유전자에 대한 탑재력(payload) 제한이 없다.

하나 이상의 PB, PBL 및 SPB 트랜스포사제에 대한 예시적인 아미노산 서열이 미국 특허 제6,218,185호; 미국 특허 제6,962,810호 및 미국 특허 제8,399,643호에 개시되어 있다. 바람직한 양태에서, PB 트랜스포사제는 서열번호: 63과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 구성된다.

PB 또는 PBL 트랜스포사제는 서열번호: 63의 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 2개 이상, 3개 이상 또는 각각에 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 구성될 수 있다. 트랜스포사제는 서열번호: 63의 서열의 아미노산 서열을 포함하거나 구성되는 SPB 트랜스포사제일 수 있고, 위치 30에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에 대한 발린(V)의 치환일 수 있고, 위치 165에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에 대한 세린(S)의 치환일 수 있고, 위치 282에서의 아미노산 치환은 메티오닌(M)에 대한 발린(V)의 치환일 수 있고, 위치 538에서의 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에 대한 리신(K)의 치환일 수 있다. 바람직한 양태에서, SPB 트랜스포사제는 서열번호: 64와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 구성된다.

트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에 상기 기재된 돌연변이를 포함하는 특정 양태에서, PB, PBL 및 SPB 트랜스포사제는 서열번호: 63 또는 서열번호: 64의 서열의 위치 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 및 591 중 하나 이상에 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있고, 이는 PCT 공개 WO 제2019/173636호 및 제PCT/US2019/049816호에 더 상세히 기재되어 있다.

PB, PBL 또는 SPB 트랜스포사제는 PCT 공개 WO 제2019/173636호 및 제PCT/US2019/049816호에 더 상세히 기재된 바와 같이 곤충, 척추동물, 갑각류 또는 미삭류(urochordate)로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 바람직한 양태에서, PB, PBL 또는 SPB 트랜스포사제는 곤충 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)(GenBank 등록번호 AAA87375) 또는 봄빅스 모리(Bombyx mori)(GenBank 등록번호 BAD11135)로부터 단리되거나 유래된다.

과활성 PB 또는 PBL 트랜스포사제는 그것이 유래된 자연발생 변이체보다 더 활성인 트랜스포사제이다. 바람직한 양태에서, 과활성 PB 또는 PBL 트랜스포사제는 봄빅스 모리 또는 제노푸스 트로피칼리스(Xenopus tropicalis)로부터 단리되거나 유래된다. 과활성 PB 또는 PBL 트랜스포사제의 예가 미국 특허 제6,218,185호; 미국 특허 제6,962,810호, 미국 특허 제8,399,643호 및 WO 제2019/173636호에 개시되어 있다. 과활성 아미노산 치환의 목록이 미국 특허 제10,041,077호에 개시되어 있다.

일부 양태에서, PB 또는 PBL 트랜스포사제는 통합 부족(integration deficient)이다. 통합 부족 PB 또는 PBL 트랜스포사제는 그의 상응하는 트랜스포존을 절제할 수 있지만 상응하는 야생형 트랜스포사제보다 낮은 빈도로 절제된 트랜스포존을 통합하는 트랜스포사제이다. 통합 부족 PB 또는 PBL 트랜스포사제의 예는 미국 특허 제6,218,185호; 미국 특허 제6,962,810호, 미국 특허 제8,399,643호 및 WO 제2019/173636호에 개시되어 있다. 통합 부족 아미노산 치환의 목록은 미국 특허 제10,041,077호에 개시되어 있다.

일부 양태에서, PB 또는 PBL 트랜스포사제는 핵 국소화 신호에 융합된다. 핵 국소화 신호에 융합된 PB 또는 PBL 트랜스포사제의 예는 미국 특허 제6,218,185호; 미국 특허 제6,962,810호, 미국 특허 제8,399,643호 및 WO 제2019/173636호에 개시되어 있다.

본 개시내용의 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 트랜스포존일 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존이 슬리핑 뷰티 트랜스포존인 경우, 트랜스포사제는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제(예를 들어, 미국 특허 제9,228,180호에 개시된 바와 같음) 또는 과활성 슬리핑 뷰티(SB100X) 트랜스포사제이다. 바람직한 양태에서, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제는 서열번호: 65와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 구성된다. 바람직한 양태에서, 과활성 슬리핑 뷰티(SB100X) 트랜스포사제는 서열번호: 66과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 구성된다.

본 개시내용의 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 Helraiser 트랜스포존일 수 있다. 예시적인 Helraiser 트랜스포존은 서열번호: 67과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나 구성되는 Helibat1을 포함한다. 일부 양태에서, 트랜스포존이 Helraiser 트랜스포존인 경우, 트랜스포사제는 Helitron 트랜스포사제(예를 들어, WO 제2019/173636호에 개시된 바와 같음)이다. 바람직한 양태에서, Helitron 트랜스포사제는 서열번호: 68과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 구성된다.

본 개시내용의 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 Tol2 트랜스포존일 수 있다. 역위 반복, 서브말단 서열 및 Tol2 트랜스포사제를 포함하는 예시적인 Tol2 트랜스포존은 서열번호: 69와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산을 포함하거나 구성된다. 일부 양태에서, 트랜스포존이 Tol2 트랜스포존인 경우, 트랜스포사제는 Tol2 트랜스포사제(예를 들어, WO 제2019/173636호에 개시된 바와 같음)이다. 바람직한 양태에서, Tol2 트랜스포사제는 서열번호: 70과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 구성된다.

본 개시내용의 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 TcBuster 트랜스포존일 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존이 TcBuster 트랜스포존인 경우, 트랜스포사제는 TcBuster 트랜스포사제 또는 과활성 TcBuster 트랜스포사제(예를 들어, WO 제2019/173636호에 개시된 바와 같음)이다. TcBuster 트랜스포사제는 자연발생 아미노산 서열 또는 비자연발생 아미노산 서열을 포함하거나 구성될 수 있다. 바람직한 양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 서열번호: 71과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 구성된다. TcBuster 트랜스포사제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 자연발생 핵산 서열 또는 비자연발생 핵산 서열을 포함하거나 구성될 수 있다. 바람직한 양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 서열번호: 72와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산을 포함하거나 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다.

일부 양태에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사제는 PCT 공개 WO 제2019/173636호 및 제PCT/US2019/049816호에 더 상세히 기재된 바와 같이 야생형 TcBuster 트랜스포사제와 비교하여 하나 이상의 서열 변이를 포함한다.

본원에 개시된 세포 전달 조성물(예컨대, 트랜스포존)은 치료적 단백질 또는 치료제를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 치료적 단백질의 예는 PCT 공개 WO 제2019/173636호 및 제PCT/US2019/049816호에 개시된 것을 포함한다.

벡터 시스템

일부 양태에서, 본 개시내용의 조성물(예컨대, 나노트랜스포존)은 또 다른 트랜스포존 또는 나노트랜스포존과 조합되어 또는 벡터와 조합되어 이용될 수 있다. 본 개시내용의 벡터는 바이러스 벡터 또는 재조합 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 또는 임의의 이의 조합으로부터 단리되거나 유래된 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV)로부터 단리되거나 유래된 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 재조합 AAV(rAAV)를 포함할 수 있다. 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 본 개시내용의 scFv 또는 CAR을 코딩하는 서열 옆에 cis로 위치한 2개 이상의 역위 말단 반복(ITR) 서열을 포함한다. 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는, 비제한적으로 모든 혈청형(예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 및 AAV9)을 포함한다. 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는, 비제한적으로, 자가 상보적 AAV(scAAV) 및 하나의 혈청형의 게놈 및 또 다른 혈청형(예컨대, AAV2/5, AAV-DJ 및 AAV-DJ8)의 캡시드를 함유하는 AAV 하이브리드를 포함한다. 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는, 비제한적으로, rAAV-LK03을 포함한다.

본 개시내용의 벡터는 나노입자일 수 있다. 나노입자 벡터의 비제한적인 예는 핵산(예컨대, RNA, DNA, 합성 뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 이의 임의의 조합), 아미노산(L-아미노산, D-아미노산, 합성 아미노산, 변형된 아미노산, 또는 이의 임의의 조합), 중합체(예컨대, 폴리머좀), 마이셀, 지질(예컨대, 리포좀), 유기 분자(예컨대, 탄소 원자, 시트, 섬유, 튜브), 무기 분자(예컨대, 인산 칼슘 또는 금) 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 나노입자 벡터는 세포막을 통해 수동적으로 또는 능동적으로 수송될 수 있다.

본원에 개시된 세포 전달 조성물(예컨대, 트랜스포존, 벡터)은 치료적 단백질 또는 치료제를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 치료적 단백질의 예는 PCT 공개 WO 제2019/173636호 및 제PCT/US2019/049816호에 개시된 것을 포함한다.

본 개시내용의 세포 및 변형된 세포

본 개시내용의 세포 및 변형된 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 바람직하게는, 세포 및 변형된 세포는 인간 세포이다. 본 개시내용의 세포 및 변형된 세포는 면역 세포일 수 있다. 본 개시내용의 면역 세포는 림프성 선조 세포(lymphoid progenitor cell), 자연 살해(NK) 세포, T 림프구(T-세포), 줄기 기억 T 세포(T_SCM 세포), 중심 기억 T 세포(T_CM), 줄기 세포 유사 T 세포, B 림프구(B-세포), 항원 제시 세포(APC), 사이토카인 유도 사멸(CIK) 세포, 골수성 선조 세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단핵구, 대식세포, 혈소판, 적혈구(erythrocyte), 적혈구(RBC), 거핵구 또는 파골세포를 포함할 수 있다.

면역 전구체 세포는 하나 이상의 유형의 면역 세포로 분화할 수 있는 임의의 세포를 포함할 수 있다. 면역 전구체 세포는 자가 재생하여 면역 세포로 발달할 수 있는 다능성 줄기 세포를 포함할 수 있다. 면역 전구체 세포는 조혈 줄기 세포(HSC) 또는 이의 후손을 포함할 수 있다. 면역 전구체 세포는 면역 세포로 발달할 수 있는 전구체 세포를 포함할 수 있다. 면역 전구체 세포는 조혈 선조 세포(HPC)를 포함할 수 있다.

조혈 줄기 세포(HSC)는 다능성, 자가 재생 세포이다. 림프성 및 골수성 계통의 모든 분화된 혈액 세포는 HSC로부터 발생한다. HSC는 성인 골수, 말초 혈액, 동원된 말초 혈액, 복막 투석 유출물 및 제대혈에서 발견될 수 있다.

HSC는 1차 또는 배양된 줄기 세포로부터 단리되거나 유래될 수 있다. HSC는 배아 줄기 세포, 다능성(multipotent) 줄기 세포, 다능성(pluripotent) 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 또는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 단리되거나 유래될 수 있다.

면역 전구체 세포는 HSC 또는 HSC 후손 세포를 포함할 수 있다. HSC 후손 세포의 비제한적인 예는 다능성 줄기 세포, 림프성 선조 세포, 자연 살해(NK) 세포, T 림프구 세포(T-세포), B 림프구 세포(B-세포), 골수성 선조 세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단핵구 및 대식세포를 포함한다.

개시된 방법에 의해 생산된 HSC는, 성체 줄기 세포로부터 단리되거나 유래되는 동안 그리고 단일 계통에 수임되는 동안, 배아 줄기 세포의 특징을 공유하는 "원시(primitive)" 줄기 세포의 특징을 보유할 수 있다. 예를 들어, 개시된 방법에 의해 생산된 "원시" HSC는 분열 후에 이들의 "줄기성(stemness)"을 유지하고 분화하지 않는다. 결과적으로, 입양 세포 요법으로서, 개시된 방법에 의해 생산된 "원시" HSC는 그들의 수를 보충할뿐만 아니라 생체내에서 확장된다. 개시된 방법에 의해 생산된 "원시" HSC는 단일 용량으로서 투여될 때 치료적으로 효과적일 수 있다.

원시 HSC는 CD34+일 수 있다. 원시 HSC는 CD34+ 및 CD38-일 수 있다. 원시 HSC는 CD34+, CD38- 및 CD90+일 수 있다. 원시 HSC는 CD34+, CD38-, CD90+ 및 CD45RA-일 수 있다. 원시 HSC는 CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA-, 및 CD49f+일 수 있다. 원시 HSC는 CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA-, 및 CD49f+일 수 있다

원시 HSC, HSC, 및/또는 HSC 후손 세포는 외인성 서열(예컨대, 키메라 항원 수용체 또는 치료적 단백질)을 발현하기 위해 개시된 방법에 따라 변형될 수 있다. 변형된 원시 HSC, 변형된 HSC, 및/또는 변형된 HSC 후손 세포는, 비제한적으로, 변형된 T 세포, 변형된 자연 살해 세포 및/또는 변형된 B-세포를 포함하는 변형된 면역 세포를 생산하기 위해 전방 분화될 수 있다.

변형된 면역 또는 면역 전구체 세포는 NK 세포일 수 있다. NK 세포는 림프성 선조 세포로부터 분화하는 세포독성 림프구일 수 있다. 변형된 NK 세포는 변형된 조혈 줄기 및 선조 세포(HSPC) 또는 변형된 HSC로부터 유래될 수 있다. 일부 양태에서, 활성화되지 않은 NK 세포는 CD3-고갈된 백혈구채집술(CD14/CD19/CD56+ 세포 함유)로부터 유래된다.

변형된 면역 또는 면역 전구체 세포는 B 세포일 수 있다. B 세포는 세포 표면 상에 B 세포 수용체를 발현하는 림프구의 유형이다. B 세포 수용체는 특정 항원에 결합한다. 변형된 B 세포는 변형된 조혈 줄기 및 선조 세포(HSPC) 또는 변형된 HSC로부터 유래될 수 있다.

본 개시내용의 변형된 T 세포는 변형된 조혈 줄기 및 선조 세포(HSPC) 또는 변형된 HSC로부터 유래될 수 있다. 전통적인 생물학적 제제 및 화학치료제와 달리, 개시된 변형된-T 세포는 항원 인식시 빠르게 재생하는 능력을 가지고 있어, 잠재적으로 반복 치료의 필요를 제거한다. 이를 달성하기 위해, 일부 양태에서, 변형된-T 세포는 초기 반응을 유도할뿐만 아니라 생존가능한 기억 T 세포의 안정적인 집단으로서 환자에서 지속되어 잠재적인 재발을 방지한다. 대안적으로, 일부 양태에서, 원하지 않는 경우, 변형된-T 세포는 환자에서 지속되지 않는다.

항원 독립적(tonic) 신호전달을 통해 T 세포 고갈을 유발하지 않는 항원 수용체 분자의 개발뿐만 아니라 초기 기억 T 세포, 특히 줄기 세포 기억(T_SCM) 또는 줄기 세포-유사 T 세포를 함유하는 변형된 T 세포 생성물의 개발에 집중적인 노력이 이뤄졌다. 본 개시내용의 줄기 세포-유사 변형된 T 세포는 중심 기억(T_CM) T 세포 또는 T_CM 유사 세포, 효과기 기억(T_EM) 및 효과기 T 세포(T_E)를 유도하는 자가 재생을 위한 가장 큰 능력 및 다능성 능력을 나타내어 더 나은 종양 박멸 및 장기간 변형된 T 세포 생착(engraftment)을 생성한다. 선형 분화 경로는 이러한 세포인 나이브 T 세포(T_N) > T_SCM > T_CM > T_EM > T_E > T_TE를 생성하는 것을 담당할 수 있으며, 여기서 T_N은 T_SCM을 직접 발생시키는 부모 전구체 세포이며, 이는 이후에 차례로 T_CM 등을 발생시킨다. 본 개시내용의 T 세포의 조성물은 각각의 부모 T 세포 서브세트 중 하나 이상을 포함할 수 있고, T_SCM 세포가 가장 풍부하다(예컨대, T_SCM > T_CM > T_EM > T_E > T_TE).

면역 세포 전구체는 초기 기억 T 세포, 줄기 세포 유사 T-세포, 나이브 T 세포(T_N), T_{SCM ,} T_{CM ,} T_{EM ,} T_{E ,} 또는 T_TE로 분화될 수 있거나 분화할 수 있다. 면역 세포 전구체는 본 개시내용의 원시 HSC, HSC, 또는 HSC 후손 세포일 수 있다. 면역 세포는 초기 기억 T 세포, 줄기 세포 유사 T-세포, 나이브 T 세포(T_N), T_{SCM ,} T_{CM ,} T_{EM ,} T_{E ,} 또는 T_TE일 수 있다.

본 개시내용의 방법은 변형된 T 세포 집단을 변형 및/또는 생산할 수 있으며, 집단 내의 복수의 변형된 T 세포 중 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 백분율은 초기 기억 T 세포의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 변형된 초기 기억 T 세포 집단은 복수의 변형된 줄기 세포-유사 T 세포를 포함한다. 변형된 초기 기억 T 세포 집단은 복수의 변형된 T_SCM 세포를 포함한다. 변형된 초기 기억 T 세포 집단은 복수의 변형된 T_CM 세포를 포함한다.

본 개시내용의 방법은 변형된 T 세포 집단을 변형 및/또는 생산할 수 있으며, 집단 내의 복수의 변형된 T 세포 중 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 백분율은 줄기 세포-유사 T 세포의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 변형된 줄기 세포-유사 T 세포 집단은 복수의 변형된 T_SCM 세포를 포함한다. 변형된 줄기 세포-유사 T 세포 집단은 복수의 변형된 T_CM 세포를 포함한다.

일부 양태에서, 집단 내의 복수의 변형된 T 세포 중 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적 포ㅎ어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 또는 이들 사이의 임의의 백분율은 줄기 기억 T 세포(T_SCM) 또는 T_SCM-유사 세포의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하며; 하나 이상의 세포 표면 마커(들)는 CD45RA 및 CD62L을 포함한다. 세포 표면 마커는 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 세포 표면 마커는 CD45RA, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 집단 내의 복수의 변형된 T 세포 중 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 중심 기억 T 세포(T_CM) 또는 T_CM-유사 세포의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하며; 하나 이상의 세포 표면 마커(들)는 CD45RO 및 CD62L을 포함한다. 세포 표면 마커는 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 개시내용의 방법은 변형된 T 세포 집단을 변형 및/또는 생산할 수 있으며, 집단 내의 복수의 변형된 T 세포 중 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 백분율은 나이브 T 세포(T_N)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 세포 표면 마커는 CD45RA, CCR7 및 CD62L 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 개시내용의 방법은 변형된 T 세포 집단을 변형 및/또는 생산할 수 있으며, 집단 내의 복수의 변형된 T 세포 중 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 백분율은 효과기 T-세포(변형된 T_EFF)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 세포 표면 마커는 CD45RA, CD95, 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 개시내용의 방법은 변형된 T 세포 집단을 변형 및/또는 생산할 수 있으며, 집단 내의 복수의 변형된 T 세포 중 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 백분율은 줄기 세포-유사 T 세포, 줄기 기억 T 세포(T_SCM) 또는 중심 기억 T 세포(T_CM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현한다.

집단의 복수의 변형된 세포는 전이유전자 또는 전이유전자를 코딩하는 서열(예컨대, CAR)을 포함하고, 집단의 복수의 세포 중 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 전이유전자 또는 전이유전자를 코딩하는 서열을 포함하며, 변형된 세포 집단 중 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 CD34를 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하거나 또는 변형된 세포 집단 중 적어도 약 70% 내지 약 99%, 약 75% 내지 약 95% 또는 약 85% 내지 약 95%는 CD34를 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현한다(예컨대, 세포 표면 마커 표현형 CD34+를 발현한다).

집단의 복수의 변형된 세포는 전이유전자 또는 전이유전자를 코딩하는 서열(예컨대, CAR)을 포함하고, 집단의 복수의 세포 중 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 전이유전자 또는 전이유전자를 코딩하는 서열을 포함하며, 변형된 세포 집단 중 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 CD34를 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 포함하고 CD38을 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하지 않거나, 또는 변형된 세포 집단 중 적어도 약 45% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80% 또는 약 65% 내지 약 75%는 CD34를 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하고 CD38을 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하지 않는다(예컨대, 세포 표면 마커 표현형 CD34+ 및 CD38-를 포함한다).

집단의 복수의 변형된 세포는 전이유전자 또는 전이유전자를 코딩하는 서열(예컨대, CAR)을 포함하고, 집단의 복수의 세포 중 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 전이유전자 또는 전이유전자를 코딩하는 서열을 포함하며, 변형된 세포 집단중 적어도 0.1%, 적어도 0.2%, 적어도 0.3%, 적어도 0.4%, 적어도 0.5%, 적어도 0.6%, 적어도 0.7%, 적어도 0.8%, 적어도 0.9%, 적어도 1%, 적어도 1.5%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 CD34 및 CD90을 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하고 CD38을 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하지 않거나, 또는 변형된 세포 집단 중 적어도 약 0.2% 내지 약 40%, 약 0.2% 내지 약 30%, 약 0.2% 내지 약 2% 또는 0.5% 내지 약 1.5%는 CD34 및 CD90을 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하고 CD38을 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하지 않는다(예컨대, 세포 표면 마커 표현형 CD34+, CD38- 및 CD90+를 포함한다).

집단의 복수의 변형된 세포는 전이유전자 또는 전이유전자를 코딩하는 서열(예컨대, CAR)을 포함하고, 집단의 복수의 세포 중 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 전이유전자 또는 전이유전자를 코딩하는 서열을 포함하며, 변형된 세포 집단 중 적어도 0.1%, 적어도 0.2%, 적어도 0.3%, 적어도 0.4%, 적어도 0.5%, 적어도 0.6%, 적어도 0.7%, 적어도 0.8%, 적어도 0.9%, 적어도 1%, 적어도 1.5%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 CD34 및 CD90을 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하고 CD38 및 CD45RA를 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하지 않거나, 또는 변형된 세포 집단 중 적어도 약 0.2% 내지 약 40%, 약 0.2% 내지 약 30%, 약 0.2% 내지 약 2% 또는 0.5% 내지 약 1.5%는 CD34 및 CD90을 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하고 CD38 및 CD45RA를 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하지 않는다(예컨대, 세포 표면 마커 표현형 CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA-를 포함한다).

집단의 복수의 변형된 세포는 전이유전자 또는 전이유전자를 코딩하는 서열(예컨대, CAR)을 포함하고, 집단의 복수의 세포 중 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 전이유전자 또는 전이유전자를 코딩하는 서열을 포함하며, 변형된 세포 집단 중 적어도 0.01%, 적어도 0.02%, 적어도 0.03%, 적어도 0.04%, 적어도 0.05%, 적어도 0.06%, 적어도 0.07%, 적어도 0.08%, 적어도 0.09%, 적어도 0.1%, 적어도 0.2%, 적어도 0.3%, 적어도 0.4%, 적어도 0.5%, 적어도 0.6%, 적어도 0.7%, 적어도 0.8%, 적어도 0.9%, 적어도 1%, 적어도 1.5%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 CD34, CD90 및 CD49f를 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하고 CD38 및 CD45RA를 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하지 않거나, 또는 변형된 세포 집단 중 적어도 약 0.02% 내지 약 30%, 약 0.02% 내지 약 2%, 약 0.04% 내지 약 2% 또는 약 0.04% 내지 약 1%는 CD34, CD90 및 CD49f를 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하고 CD38 및 CD45RA를 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하지 않는다(예컨대, 세포 표면 마커 표현형 CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA- 및 CD49f+를 포함한다).

집단의 복수의 변형된 세포는 전이유전자 또는 전이유전자를 코딩하는 서열(예컨대, CAR)을 포함하고, 집단의 복수의 세포 중 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 전이유전자 또는 전이유전자를 코딩하는 서열을 포함하며, 변형된 세포 집단 중 적어도 0.01%, 적어도 0.02%, 적어도 0.03%, 적어도 0.04%, 적어도 0.05%, 적어도 0.06%, 적어도 0.07%, 적어도 0.08%, 적어도 0.09%, 적어도 0.1%, 적어도 0.2%, 적어도 0.3%, 적어도 0.4%, 적어도 0.5%, 적어도 0.6%, 적어도 0.7%, 적어도 0.8%, 적어도 0.9%, 적어도 1%, 적어도 1.5%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 CD34 및 CD90을 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하고 CD45RA를 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하지 않거나, 또는 변형된 세포 집단 중 적어도 약 0.2% 내지 약 5%, 약 0.2% 내지 약 3% 또는 약 0.4% 내지 약 3%는 CD34 및 CD90을 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하고 CD45RA를 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하지 않는다(예컨대, 세포 표면 마커 표현형 CD34+, CD90+ 및 CD45RA-를 포함한다).

면역 세포 또는 면역 전구체 세포(예컨대, 개시된 변형된 T-세포)를 생산 및/또는 확장하는 조성물 및 방법 및 면역 세포 또는 면역 전구체 세포(예컨대, 개시된 변형된 T-세포)의 세포 생존력 및/또는 줄기 유사 표현형의 수준을 유지 또는 향상시키기 위한 완충제가 본원의 다른 곳에 개시되어 있으며 미국 특허 제10,329,543호 및 PCT 공개 WO 제2019/173636호에 더 상세히 개시되어 있다.

본 개시내용의 세포 및 변형된 세포는 체세포일 수 있다. 본 개시내용의 세포 및 변형된 세포는 분화된 세포일 수 있다. 본 개시내용의 세포 및 변형된 세포는 자가조직 세포 또는 동종이계 세포일 수 있다. 동종이계 세포는 대상체에게 투여 후 생착에 대한 부작용을 방지하도록 조작된다. 동종이계 세포는 임의의 유형의 세포일 수 있다. 동종이계 세포는 줄기 세포일 수 있거나 또는 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 동종이계 세포는 분화된 체세포일 수 있다.

키메라 항원 수용체를 발현하는 방법

본 개시내용은 세포의 표면 상에 CAR을 발현시키는 방법을 제공한다. 방법은 (a) 세포 집단을 수득하는 단계; (b) 세포 집단에서 적어도 하나의 세포의 세포막을 가로질러 CAR을 전달하기에 충분한 조건 하에 세포 집단을 CAR 또는 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 조성물에 접촉시켜, 변형된 세포 집단을 생성하는 단계; (c) CAR을 코딩하는 서열의 통합에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 (d) 세포 표면 상에 CAR을 발현하는 변형된 세포 집단으로부터 적어도 하나의 세포를 확장 및/또는 선택하는 단계를 포함한다.

일부 양태에서, 세포 집단은 백혈구 및/또는 CD4+ 및 CD8+ 백혈구를 포함할 수 있다. 세포 집단은 최적화된 비율로 CD4+ 및 CD8+ 백혈구를 포함할 수 있다. CD4+ 대 CD8+ 백혈구의 최적화된 비율은 생체내에서 자연적으로 발생하지 않는다. 세포 집단은 종양 세포를 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 세포 집단에서 적어도 하나의 세포의 세포막을 가로질러 CAR 또는 CAR을 코딩하는 서열, 트랜스포존, 또는 벡터를 전달하기에 충분한 조건은 지정된 전압에서 전기의 하나 이상의 펄스의 적용, 완충제, 및 하나 이상의 추가 인자(들) 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 양태에서, CAR을 코딩하는 서열의 통합에 적합한 조건은 완충제 및 하나 이상의 추가 인자(들) 중 적어도 하나를 포함한다.

완충제는 PBS, HBSS, OptiMEM, BTXpress, Amaxa Nucleofector, 인간 T 세포 핵감염(nucleofection) 완충제 또는 임의의 이의 조합을 포함할 수 있다. 하나 이상의 추가 인자(들)는 (a) 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터루킨 또는 임의의 이의 조합; (b) 염, 미네랄, 대사산물 또는 임의의 이의 조합; (c) 세포 배지; (d) 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 하나 이상의 아폽토시스 경로(들) 또는 이의 조합의 억제제; 및 (e) 하나 이상의 핵산을 변형 또는 안정화시키는 시약을 포함할 수 있다. 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터루킨 또는 이의 임의의 조합은 IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-감마, IL-1 알파/IL-1F1, IL-1 베타/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, IL-17A/F 이종이량체, IL-17F, IL-18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 베타, IL-32 감마, IL-33, LAP(TGF-베타 1), 림포톡신-알파/TNF-베타, TGF-베타, TNF-알파, TRANCE/TNFSF11/RANK L 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 염, 미네랄, 대사산물 또는 이의 임의의 조합은 HEPES, 니코틴아미드, 헤파린, 피루브산 나트륨, L-글루타민, MEM 비필수 아미노산 용액, 아스코르브산, 뉴클레오사이드, FBS/FCS, 인간 혈청, 혈청-대체물, 항생제, pH 조절제, Earle의 염, 2-머캅토에탄올, 인간 트랜스페린, 재조합 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, 뉴클레오펙터 PLUS 보충제, KCL, MgCl₂, Na₂HPO₄, NAH₂PO₄, 나트륨 락토비오네이트(Sodium lactobionate), 만니톨, 나트륨 석시네이트, 염화 나트륨, Na, 글루코스, Ca(NO₃)_{2 ,} Tris/HCl, K₂HPO_{4 ,} KH₂PO_{4 ,} 폴리에틸렌이민, 폴리-에틸렌-글리콜, 폴록사머 188, 폴록사머 181, 폴록사머 407, 폴리-비닐피롤리돈, Pop313, Crown-5, 또는 임의의 이의 조합을 포함할 수 있다. 세포 배지는 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, CellGro DC 배지, CTS OpTimizer T 세포 확장 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 확장 배지, ImmunoCult-XF T 세포 확장 배지 또는 임의의 이의 조합을 포함할 수 있다. 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 하나 이상의 아폽토시스 경로(들) 또는 이의 조합의 억제제는 TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, 유형 1 인터페론, 전염증성 사이토카인, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, Caspase1, Pro-IL1B, PI3K, Akt, Wnt3A의 억제제, 글리코겐 신타아제 키나아제-3β(GSK-3β)의 억제제(예컨대 TWS119), 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 이러한 억제제의 예는 바필로마이신(Bafilomycin), 클로로퀸(Chloroquine), 퀴나크린(Quinacrine), AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z-IETD-FMK 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하나 이상의 핵산을 변형 또는 안정화시키는 시약은 pH 변형제, DNA 결합 단백질, 지질, 인지질, CaPO4, NLS 서열을 갖거나 갖지 않는 순 중성 전하 DNA 결합 펩타이드, TREX1 효소 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.

확장 및 선택 단계는 동시에 또는 순차적으로 발생할 수 있다. 확장은 선택하기 전에 발생할 수 있다. 확장은 선택 후에 발생할 수 있고, 선택적으로, 추가(즉, 두 번째) 선택이 확장 후에 발생할 수 있다. 동시 확장 및 선택은 동시에 발생할 수 있다. 확장 및/또는 선택 단계는 종점을 포함하여 10 내지 14일 동안 진행될 수 있다.

확장은 변형된 세포 집단의 적어도 하나의 세포를 항원과 접촉시켜 CAR을 통해 적어도 하나의 세포를 자극함으로써 확장된 세포 집단을 생성하는 것을 포함할 수 있다. 항원은 기질의 표면 상에 제시될 수 있다. 기질은, 비제한적으로 표면, 웰, 비드 또는 이들의 복수, 및 매트릭스를 포함하는 임의의 형태를 가질 수 있다. 기질은 상자성 또는 자성 구성요소를 추가로 포함할 수 있다. 항원은 기질의 표면 상에 제시될 수 있고, 기질은 자성 비드이며, 변형되고 확장된 세포 집단으로부터 자성 비드를 제거하거나 분리하기 위해 자석이 사용될 수 있다. 항원은 세포 또는 인공 항원 제시 세포의 표면 상에 제시될 수 있다. 인공 항원 제시 세포는, 비제한적으로, 종양 세포 및 줄기 세포룰 포함할 수 있다.

트랜스포존 또는 벡터가 선택 유전자를 포함하는 일부 양태에서, 선택 단계는 변형된 세포 집단의 적어도 하나의 세포를 선택 유전자가 내성을 부여하는 화합물과 접촉시켜, 선택 유전자를 발현하는 세포를 선택에서 생존하는 것으로서 확인하고 선택 유전자를 발현하지 못하는 세포를 선택 단계에서 생존하지 못하는 것으로 확인하는 것을 포함한다.

본 개시내용은 본원에 기재된 방법의 변형된, 확장된 및 선택된 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.

세포의 표면 상에 CAR을 발현하기 위한 방법의 보다 상세한 설명은 PCT 공개 WO 제2019/049816호 및 제PCT/US2019/049816호에 개시되어 있다.

본 개시내용은 세포 또는 세포 집단으로서, 세포는 (a) 유도성 프로모터를 코딩하는 서열 및 전이유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 유도성 전이유전자 구조체, 및 (b) 항시성 프로모터를 코딩하는 서열 및 외인성 수용체를 코딩하는 서열, 예컨대 CAR을 포함하는 수용체 구조체를 포함하는 조성물을 포함하고, (a)의 구조체 및 (b)의 구조체를 세포의 게놈 서열 내로 통합시에 외인성 수용체는 발현되며, 외인성 수용체는 리간드 또는 항원의 결합시에 유도성 전이유전자 (a)의 발현을 조절하는 유도성 프로모터를 직접 또는 간접적으로 표적화하는 세포내 신호를 전달하여 유전자 발현을 변형시킨다.

조성물은 유전자 발현을 감소시킴으로써 유전자 발현을 변형시킬 수 있다. 조성물은 유전자 발현을 일시적으로 변형시킴으로써(예컨대, 리간드가 외인성 수용체에 결합하는 동안) 유전자 발현을 변형시킬 수 있다. 조성물은 유전자 발현을 급성으로 변형시킬 수 있다(예컨대, 리간드가 외인성 수용체에 가역적으로 결합함). 조성물은 유전자 발현을 만성적으로 변형시킬 수 있다(예컨대, 리간드가 외인성 수용체에 비가역적으로 결합함).

외인성 수용체는 세포의 게놈 서열과 관련하여 내인성 수용체를 포함할 수 있다. 예시적인 수용체는, 비제한적으로, 세포내 수용체, 세포 표면 수용체, 막관통 수용체, 리간드 게이트된 이온 채널, 및 G-단백질 결합된 수용체를 포함한다.

외인성 수용체는 비자연발생 수용체를 포함할 수 있다. 비자연발생 수용체는 합성, 변형된, 재조합, 돌연변이체 또는 키메라 수용체일 수 있다. 비자연발생 수용체는 T-세포 수용체(TCR)로부터 단리되거나 유래된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 비자연발생 수용체는 스캐폴드 단백질로부터 단리되거나 유래된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 비자연발생 수용체가 막관통 도메인을 포함하지 않는 것을 포함하는 일부 양태에서, 비자연발생 수용체는 비자연발생 수용체와 접촉 후 세포내 신호를 전달하는 제2 막관통, 막 결합된 및/또는 세포내 수용체와 상호작용한다. 비자연발생 수용체는 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 비자연발생 수용체는 세포내 신호를 전달하는 세포내 수용체와 상호작용할 수 있다. 비자연발생 수용체는 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 비자연발생 수용체는 키메라 리간드 수용체(CLR)일 수 있다. CLR은 키메라 항원 수용체(CAR)일 수 있다.

유도성 프로모터를 코딩하는 서열은 NFkB 프로모터를 코딩하는 서열, 인터페론(IFN) 프로모터를 코딩하는 서열 또는 인터루킨-2 프로모터를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IFN 프로모터는 IFNγ 프로모터이다. 유도성 프로모터는 사이토카인 또는 케모카인의 프로모터로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 사이토카인 또는 케모카인은 IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL10, IL12, IL13, IL17A/F, IL21, IL22, IL23, 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ), 콜로니 자극 인자 2(GM-CSF), 인터페론 감마(IFNγ), 종양 괴사 인자 알파(TNFα), LTα, 퍼포린(perforin), 그랜자임 C(Granzyme C, Gzmc), 그랜자임 B(Gzmb), C-C 모티프 케모카인 리간드 5(CCL5), C-C 모티프 케모카인 리간드 4(Ccl4), C-C 모티프 케모카인 리간드 3(Ccl3), X-C 모티프 케모카인 리간드 1(Xcl1) 또는 LIF 인터루킨 6 패밀리 사이토카인(Lif)을 포함할 수 있다.

유도성 프로모터는 세포 분화, 활성화, 고갈 및 기능에 관여하는 표면 단백질을 포함하는 유전자의 프로모터로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 일부 양태에서, 유전자는 CD69, CD71, CTLA4, PD-1, TIGIT, LAG3, TIM-3, GITR, MHCII, COX-2, FASL 또는 4-1BB를 포함한다.

유도성 프로모터는 CD 대사 및 분화에 관여하는 유전자의 프로모터로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 유도성 프로모터는 Nr4a1, Nr4a3, Tnfrsf9(4-1BB), Sema7a, Zfp36l2, Gadd45b, Dusp5, Dusp6 및 Neto2의 프로모터로부터 단리되거나 유래될 수 있다.

일부 양태에서, 유도성 전이유전자 구조체는 억제성 체크포인트 신호, 전사 인자, 사이토카인 또는 사이토카인 수용체, 케모카인 또는 케모카인 수용체, 세포 사멸 또는 아폽토시스 수용체/리간드, 대사 감지 분자, 암 요법에 민감성을 부여하는 단백질, 및 종양유전자 또는 종양 억제 유전자의 하류에 신호전달 구성요소를 포함하거나 이의 발현을 유도한다. 이의 비제한적인 예가 PCT 공개 WO 제2019/173636호 및 PCT 출원 제PCT/US2019/049816호에 개시되어 있다.

무장화된(Armored) 세포

본 개시내용의 변형된 세포(예컨대, CAR T-세포)는 그들의 치료 잠재력을 향상시키기 위해 추가로 변형될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 변형된 세포는 이들을 면역학적 및/또는 대사 체크포인트에 덜 민감하게 만들도록 추가로 변형될 수 있다. 이러한 유형의 변형은 세포를 "무장화"시키고, 이는 변형 후에 본원에서 "무장화된" 세포(예컨대, 무장화된 T-세포)로 지칭될 수 있다. 무장화된 세포는, 예를 들어 종양 면역억제 미세환경 내에서 자연적으로 세포에 전달되는 특정 체크포인트 신호를 차단 및/또는 희석함으로써(예컨대, 체크포인트 억제) 생산될 수 있다.

본 개시내용의 무장화된 세포는 임의의 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포, 조혈 선조 세포, 말초 혈액(PB) 유래 T 세포(G-CSF-동원된 말초 혈액으로부터 단리되거나 유래된 T 세포 포함), 또는 제대혈(UCB) 유래 T 세포로부터 유래될 수 있다. 무장화된 세포(예컨대, 무장화된 T-세포)는 키메라 리간드 수용체(단백질 스캐폴드, 항체, ScFv, 또는 항체 모방체를 포함하는 CLR)/키메라 항원 수용체(단백질 스캐폴드, 항체, ScFv, 또는 항체 모방체를 포함하는 CAR), CARTyrin(센티린을 포함하는 CAR), 및/또는 VCAR(낙타과 VHH 또는 단일 도메인 VH를 포함하는 CAR) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 무장화된 세포(예컨대, 무장화된 T-세포)는 본원에 개시된 바와 같은 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 무장화된 세포(예컨대, 무장화된 T-세포)는 외인성 서열을 포함할 수 있다. 외인성 서열은 치료적 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 치료적 단백질은 핵, 세포질, 세포내, 막관통, 세포 표면 결합된, 또는 분비된 단백질일 수 있다. 무장화된 세포(예컨대, 무장화된 T-세포)에 의해 발현된 예시적인 치료적 단백질은 무장화된 세포의 활성을 변형시키거나 제2 세포의 활성을 변형시킬 수 있다. 무장화된 세포(예컨대, 무장화된 T-세포)는 선택 유전자 또는 선택 마커를 포함할 수 있다. 무장화된 세포(예컨대, 무장화된 T-세포)는 합성 유전자 발현 카세트(본원에서 유도성 전이유전자 구조체로도 지칭됨)를 포함할 수 있다.

본 개시내용의 변형된 세포(예컨대, CAR T-세포)는 무장화된 세포(예컨대, 무장화된 CAR T-세포)를 생산하기 위해 억제성 체크포인트 신호의 수용체(들)를 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시키도록 추가로 변형될 수 있다. 억제성 체크포인트 신호의 수용체는 세포 표면 상에 또는 세포의 세포질 내에서 발현된다. 억제성 체크포인트 신호의 수용체를 코딩하는 유전자의 발현을 침묵시키거나 감소시키는 것은 무장화된 세포의 표면 상에 또는 세포질 내에 억제성 체크포인트 수용체의 단백질 발현의 손실을 초래한다. 따라서, 억제성 체크포인트 수용체를 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현이 침묵되거나 감소된 무장화된 세포는 체크포인트 신호에 내성, 비수용성 또는 둔감하다. 억제성 체크포인트 신호에 대한 무장화된 세포의 내성 또는 감소된 민감성은 이러한 억제성 체크포인트 신호의 존재하에 무장화된 세포의 치료 잠재력을 향상시킨다. 억제성 체크포인트 신호(및 면역억제를 유도하는 단백질)의 비제한적인 예는 PCT 공개 WO 제2019/173636호에 개시되어 있다. 침묵될 수 있는 억제성 체크포인트 신호의 바람직한 예는, 비제한적으로, PD-1 및 TGFβRII를 포함한다.

본 개시내용의 변형된 세포(예컨대, CAR T-세포)는 무장화된 세포(예컨대, 무장화된 CAR T-세포)를 생산하기 위해 체크포인트 신호전달에 관여하는 세포내 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시키도록 추가로 변형될 수 있다. 변형된 세포의 활성은 체크포인트 신호전달 경로에 관여하는 임의의 세포내 신호전달 단백질을 표적화함으로써 향상될 수 있으며, 이에 의해 하나 이상의 체크포인트 경로에 대한 체크포인트 억제 또는 간섭을 달성할 수 있다. 체크포인트 신호전달에 관여하는 세포내 신호전달 단백질의 비제한적인 예는 PCT 공개 WO 제2019/173636호에 개시되어 있다.

본 개시내용의 변형된 세포(예컨대, CAR T-세포)는 무장화된 세포(예컨대, 무장화된 CAR T-세포)를 생산하기 위해 요법의 효능을 방해하는 전사 인자를 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시키도록 추가로 변형될 수 있다. 변형된 세포의 활성은 요법의 효능을 방해하는 전사 인자의 발현을 침묵시키거나 감소시킴으로써(또는 기능을 억제함으로써) 향상되거나 조절될 수 있다. 발현을 침묵시키거나 감소시키기 위해 또는 이의 기능을 억제하기 위해 변형될 수 있는 전사 인자의 비제한적인 예는, 비제한적으로, PCT 공개 WO 제2019/173636호에 개시된 예시적인 전사 인자를 포함한다.

본 개시내용의 변형된 세포(예컨대, CAR T-세포)는 무장화된 세포(예컨대, 무장화된 CAR T-세포)를 생산하기 위해 세포 사멸 또는 세포 아폽토시스 수용체를 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시키도록 추가로 변형될 수 있다. 사멸 수용체 및 그의 내인성 리간드의 상호작용은 아폽토시스의 개시를 초래한다. 세포 사멸 및/또는 세포 아폽토시스 수용체 및/또는 리간드의 발현, 활성, 또는 상호작용의 방해는 변형된 세포를 사멸 신호에 대해 덜 수용성이게 만들어, 결과적으로 무장화된 세포를 종양 환경에 더 효과적이게 만든다. 세포 사멸 및/또는 세포 아폽토시스 수용체 및 리간드의 비제한적인 예는 PCT 공개 WO 제2019/173636호에 개시되어 있다. 변형될 수 있는 세포 사멸 수용체의 바람직한 예는 Fas(CD95)이다.

본 개시내용의 변형된 세포(예컨대, CAR T-세포)는 무장화된 세포(예컨대, 무장화된 CAR T-세포)를 생산하기 위해 대사 감지 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시키도록 추가로 변형될 수 있다. 변형된 세포에 의한 면역억제 종양 미세환경(산소, pH, 글루코스 및 다른 분자의 낮은 수준을 특징으로 함)의 대사 감지의 방해는 T-세포 기능의 연장된 보유를 초래하여, 결과적으로 세포당 더 많은 종양 세포가 사멸되게 한다. 대사 감지 유전자 및 단백질의 비제한적인 예는 PCT 공개 WO 제2019/173636호에 개시되어 있다. 바람직한 예인 HIF1a 및 VHL은 저산소 환경에 있는 동안 T-세포 기능에서 역할을 한다. 무장화된 T-세포는 HIF1a 또는 VHL을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현이 침묵되거나 감소될 수 있다.

본 개시내용의 변형된 세포(예컨대, CAR T-세포)는 무장화된 세포(예컨대, 무장화된 CAR T-세포)를 생산하기 위해, 단클론 항체를 포함하는 암 요법에 대한 민감성을 부여하는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시키도록 추가로 변형될 수 있다. 따라서, 무장화된 세포는 암 요법(예컨대, 화학요법, 단클론 항체 요법, 또는 또 다른 항종양 치료)의 존재 하에 있는 동안 기능할 수 있고 우수한 기능 또는 효능을 입증할 수 있다. 암 요법에 대한 민감성을 부여하는 데 관여하는 단백질의 비제한적인 예가 PCT 공개 WO 제2019/173636호에 개시되어 있다.

본 개시내용의 변형된 세포(예컨대, CAR T-세포)는 무장화된 세포(예컨대, 무장화된 CAR T-세포)를 생산하기 위해 성장 이점 인자를 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시키도록 추가로 변형될 수 있다. 종양유전자의 발현을 침묵시키거나 감소시키는 것은 세포에 성장 이점을 부여할 수 있다. 예를 들어, CAR T-세포 제조 공정 동안 TET2 유전자의 발현을 침묵시키거나 감소시키는 것(예컨대, 발현을 방해하는 것)은 이러한 확장 능력이 부족한 비무장화된 CAR T-세포와 비교하여 유의한 확장 능력 및 후속적인 종양 제거를 갖는 무장화된 CAR T-세포의 생성을 초래한다. 이 전략은 안전 스위치(예컨대, 본원에 기재된 iC9 안전 스위치)에 결합될 수 있으며, 이는 대상체로부터의 역반응 또는 무장화된 CAR T-세포의 통제되지 않은 성장의 사건에서 무장화된 CAR T-세포의 표적화된 방해를 허용한다. 성장 이점 인자의 비제한적인 예는 PCT 공개 WO 제2019/173636호에 개시되어 있다.

본 개시내용의 변형된 세포(예컨대, CAR T-세포)는 본 개시내용의 무장화된 T-세포를 생산하기 위해 변형된/키메라 체크포인트 수용체를 발현하도록 추가로 변형될 수 있다.

변형된/키메라 체크포인트 수용체는 null 수용체, 유인(decoy) 수용체 또는 우성 음성 수용체를 포함할 수 있다. null 수용체, 유인 수용체 또는 우성 음성 수용체는 변형된/키메라 수용체/단백질일 수 있다. null 수용체, 유인 수용체 또는 우성 음성 수용체는 세포내 신호전달 도메인의 발현을 위해 절단될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, null 수용체, 유인 수용체 또는 우성 음성 수용체는 효과적인 신호전달에 결정적이거나 필요한 하나 이상의 아미노산 위치에서 세포내 신호전달 도메인 내에서 돌연변이될 수 있다. null 수용체, 유인 수용체 또는 우성 음성 수용체의 절단 또는 돌연변이는 체크포인트 신호를 세포 또는 세포 내로 운반 또는 전달하는 수용체의 능력을 상실시킬 수 있다.

예를 들어, 종양 세포의 표면 상에 발현된 PD-L1 수용체로부터의 면역억제 체크포인트 신호의 희석 또는 차단은 무장화된 세포(예컨대, 무장화된 CAR T-세포)의 표면 상에 변형된/키메라 PD-1 null 수용체를 발현시킴으로써 달성될 수 있으며, 이는 무장화된 세포의 내인성 PD-1 수용체를 통해 면역억제 체크포인트 신호의 전달을 감소시키거나 억제하기 위해 또한 무장화된 세포의 표면 상에 발현된 내인성(비변형된) PD-1 수용체과 효과적으로 경쟁한다. 이러한 비제한적인 예에서, 종양 세포 상에서 발현되는 PD-L1에의 결합에 대해 2개의 상이한 수용체 사이의 경쟁은 효과적인 체크포인트 신호전달의 수준을 감소시키거나 약화시켜 PD-1 null 수용체를 발현하는 무장화된 세포의 치료 잠재력을 향상시킨다.

변형된/키메라 체크포인트 수용체는 막관통 수용체, 막 연관된 또는 막 연결된 수용체/단백질 또는 세포내 수용체/단백질인 null 수용체, 유인 수용체 또는 우성 음성 수용체를 포함할 수 있다. 예시적인 null, 유인, 또는 우성 음성 세포내 수용체/단백질은, 비제한적으로, 억제성 체크포인트 신호, 전사 인자, 사이토카인 또는 사이토카인 수용체, 케모카인 또는 케모카인 수용체, 세포 사멸 또는 아폽토시스 수용체/리간드, 대사 감지 분자, 암 요법에 대해 민감성을 부여하는 단백질, 및 종양유전자 또는 종양 억제 유전자의 하류에 신호전달 구성요소를 포함한다. 사이토카인, 사이토카인 수용체, 케모카인 및 케모카인 수용체의 비제한적인 예는 PCT 공개 WO 제2019/173636호에 개시되어 있다.

변형된/키메라 체크포인트 수용체는 스위치 수용체를 포함할 수 있다. 예시적인 스위치 수용체는 변형된/키메라 수용체/단백질을 포함하며, 여기서 천연 또는 야생형 세포내 신호전달 도메인은 단백질에 대해 비천연이고/거나 야생형 도메인이 아닌 상이한 세포내 신호전달 도메인로 전환되거나 대체된다. 예를 들어, 억제성 신호전달 도메인을 자극 신호전달 도메인으로 대체하는 것은 면역억제 신호를 면역자극 신호로 전환할 것이다. 대안적으로, 억제성 신호전달 도메인을 상이한 억제성 도메인으로 대체하는 것은 억제성 신호전달의 수준을 감소시키거나 향상시킬 수 있다. 스위치 수용체의 발현 또는 과발현은 면역억제 종양 미세환경 내에서 발현된 동족 체크포인트 수용체에의 결합에 대해 내인성 야생형 체크포인트 수용체(스위치 수용체가 아님)와의 경쟁을 통해 동족 체크포인트 신호의 희석 및/또는 차단을 초래할 수 있다. 무장화된 세포(예컨대, 무장화된 CAR T-세포)는 하나 이상의 스위치 수용체의 발현을 초래하고, 결과적으로 무장화된 세포의 활성을 변경시키는 스위치 수용체를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 무장화된 세포(예컨대, 무장화된 CAR T-세포)는 체크포인트 수용체, 전사 인자, 사이토카인 수용체, 사멸 수용체, 대사 감지 분자, 암 요법, 종양유전자, 및/또는 종양 억제 단백질 또는 유전자의 하류에 있는 세포내에서 발현된 단백질을 표적화하는 스위치 수용체를 발현할 수 있다.

예시적인 스위치 수용체는, 비제한적으로, 억제성 체크포인트 신호, 전사 인자, 사이토카인 또는 사이토카인 수용체, 케모카인 또는 케모카인 수용체, 세포 사멸 또는 아폽토시스 수용체/리간드, 대사 감지 분자, 암 요법에 대해 민감성을 부여하는 단백질, 및 종양유전자 또는 종양 억제 유전자의 하류에 있는 신호전달 구성요소를 포함하는, 단백질을 포함할 수 있거나 또는 이로부터 유래될 수 있다.

본 개시내용의 변형된 세포(예컨대, CAR T-세포)는 무장화된 T-세포를 생산하기 위해 조건부 유전자 발현을 매개하는 CLR/CAR을 발현하도록 추가로 변형될 수 있다. 무장화된 T-세포의 핵에서 CLR/CAR 및 조건부 유전자 발현 시스템의 조합은 동족 리간드(들)와 CLR의 조합 또는 동족 항원(들)과 CAR의 조합시 조건부로 활성화되는 합성 유전자 발현 시스템을 구성한다. 이 시스템은 예를 들어 종양 환경에서 또는 내부에서 리간드 또는 항원 결합의 부위에서 합성 유전자 발현을 감소시키거나 제한함으로써 변형된 T-세포의 치료 잠재력을 '무장화' 또는 향상시키는 데 도움을 줄 수 있다.

유전자 편집 조성물 및 방법

변형된 세포는 전이유전자를 세포 내로 도입함으로써 생산된다. 도입 단계는 비전위 전달 시스템을 통한 핵산 서열, 전이유전자, 및/또는 게놈 편집 구조체의 전달을 포함할 수 있다.

핵산 서열, 전이유전자 및/또는 게놈 편집 구조체를 생체외에서, 생체내에서, 시험관내에서 또는 원위치에서 세포 내로 도입하는 것은 국소 전달, 흡착, 흡수, 전기천공, 회전감염, 공동배양, 형질감염, 기계적 전달, 음파 전달, 진동 전달, 자기감염 또는 나노입자 매개 전달 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 핵산 서열, 전이유전자 및/또는 게놈 편집 구조체를 생체외에서, 생체내에서, 시험관내에서 또는 원위치에서 세포 내로 도입하는 것은 리포솜 형질감염, 인산 칼슘 형질감염, 퓨진(fugene) 형질감염, 및 덴드리머(dendrimer) 매개 형질감염을 포함할 수 있다. 기계적 형질감염에 의해 핵산 서열, 전이유전자, 및/또는 게놈 편집 구조체를 생체외에서, 생체내에서, 시험관내에서 또는 원위치에서 세포 내로 도입하는 것은 세포 압착(squeezing), 세포 충격(bombardment), 또는 유전자 총 기술을 포함할 수 있다. 나노입자 매개 형질감염에 의해 핵산 서열, 전이유전자 및/또는 게놈 편집 구조체를 세포 내로 도입하는 것은 리포솜 전달, 마이셀에 의한 전달, 및 폴리머좀에 의한 전달을 포함할 수 있다.

핵산 서열, 전이유전자 및/또는 게놈 편집 구조체를 생체외에서, 생체내에서, 시험관내에서 또는 원위치에서 세포 내로 도입하는 것은 비바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 비바이러스 벡터는 핵산을 포함할 수 있다. 비바이러스 벡터는 플라스미드 DNA, 선형 이중 가닥의 DNA(dsDNA), 선형 단일 가닥 DNA(ssDNA), DoggyBone™ DNA, 나노플라스미드, 미니서클 DNA, 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN), DDNA 올리고뉴클레오타이드, 단일 가닥 mRNA(ssRNA), 및 이중 가닥 mRNA(dsRNA)를 포함할 수 있다. 비바이러스 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 트랜스포존을 포함할 수 있다.

핵산 서열, 전이유전자 및/또는 게놈 편집 구조체를 생체외에서, 생체내에서, 시험관내에서 또는 원위치에서 세포 내로 도입하는 것은 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 비통합 비염색체 벡터일 수 있다. 비통합 비염색체 벡터의 비제한적인 예는 아데노 관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스, 및 헤르페스 바이러스를 포함한다. 바이러스 벡터는 통합 염색체 벡터일 수 있다. 통합 염색체 벡터의 비제한적인 예는 아데노 관련 벡터(AAV), 렌티바이러스, 및 감마-레트로바이러스를 포함한다.

핵산 서열, 전이유전자 및/또는 게놈 편집 구조체를 생체외에서, 생체내에서, 시험관내에서 또는 원위치에서 세포 내로 도입하는 것은 벡터의 조합을 포함할 수 있다. 벡터 조합의 비제한적인 예는 바이러스 및 비바이러스 벡터, 복수의 비바이러스 벡터, 또는 복수의 바이러스 벡터를 포함한다. 벡터 조합의 비제한적인 예는 DNA 유래된 벡터 및 RNA 유래된 벡터의 조합, RNA 및 역전사효소의 조합, 트랜스포존 및 트랜스포사제의 조합, 비바이러스 벡터 및 엔도뉴클레아제의 조합, 및 바이러스 벡터 및 엔도뉴클레아제의 조합을 포함한다.

게놈 변형은 핵산 서열을 안정적으로 통합하거나, 핵산 서열을 일시적으로 통합하거나, 핵산 서열의 부위 특이적 통합을 생산하거나, 또는 핵산 서열의 편향된 통합을 생산하기 위해 핵산 서열, 전이유전자 및/또는 게놈 편집 구조체를 생체외에서, 생체내에서, 시험관내에서 또는 원위치에서 세포 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 전이유전자일 수 있다.

게놈 변형은 핵산 서열을 안정적으로 통합하기 위해 핵산 서열, 전이유전자 및/또는 게놈 편집 구조체를 생체외에서, 생체내에서, 시험관내에서 또는 원위치에서 세포 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 안정적인 염색체 통합은 무작위 통합, 부위 특이적 통합, 또는 편향된 통합일 수 있다. 부위 특이적 통합은 지원받지 않거나 지원받을 수 있다. 지원된 부위 특이적 통합은 부위-지정 뉴클레아제와 함께 전달된다. 부위-지정 뉴클레아제는 게놈 통합의 부위의 상류 및 하류 영역에 대해 백분율 상동성을 함유하는 5' 및 3' 뉴클레오타이드 서열 연장을 갖는 전이유전자를 포함한다. 상동성 뉴클레오타이드 연장을 갖는 전이유전자는 상동성 재조합, 미세상동성 매개 말단 결합, 또는 비상동성 말단 결합에 의한 게놈 통합을 가능하게 한다. 부위 특이적 통합은 안전한 하버(harbor) 부위에서 발생할 수 있다. 게놈 안전한 하버 부위는 새로 삽입된 유전 요소가 확실히 기능하고(예를 들어, 발현의 치료적으로 효과적인 수준에서 발현됨) 숙주 유기체에 위험을 유발하는 숙주 게놈에 해로운 변경을 유발하지 않도록 하는 방식으로 새로운 유전 물질의 통합을 수용할 수 있다. 잠재적인 게놈 안전한 하버의 비제한적인 예는 인간 알부민 유전자의 인트론 서열, 아데노 관련 바이러스 부위 1(AAVS1), 염색체 19 상의 AAV 바이러스의 통합의 자연발생 부위, 케모카인(C-C 모티프) 수용체 5(CCR5) 유전자의 부위 및 마우스 Rosa26 유전자좌의 인간 오르토로그의 부위를 포함한다.

부위 특이적 전이유전자 통합은 표적 유전자의 발현을 방해하는 부위에서 발생할 수 있다. 표적 유전자 발현의 방해는 인트론, 엑손, 프로모터, 유전 요소, 인핸서, 억제자, 시작 코돈, 정지 코돈, 및 반응 요소에서의 부위 특이적 통합에 의해 발생할 수 있다. 부위 특이적 통합에 의해 표적화되는 표적 유전자의 비제한적인 예는 TRAC, TRAB, PDI, 임의의 면역억제 유전자, 및 동종거부에 관여하는 유전자를 포함한다.

부위 특이적 전이유전자 통합은 표적 유전자의 발현을 향상시키는 부위에서 발생할 수 있다. 표적 유전자 발현의 향상은 인트론, 엑손, 프로모터, 유전 요소, 인핸서, 억제자, 시작 코돈, 정지 코돈, 및 반응 요소에서의 부위 특이적 통합에 의해 발생할 수 있다.

효소는 전이유전자의 전달 또는 통합을 촉진하기 위해 숙주 게놈에 가닥 파손(strand break)을 생성하는 데 사용될 수 있다. 효소는 단일 가닥 파손 또는 이중 가닥 파손를 생성할 수 있다. 파손 유도 효소의 비제한적인 예는 트랜스포사제, 인테그라아제, 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas9, 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), Cas-CLOVER™, 및 CPF1을 포함한다. 파손-유도 효소는 DNA로 코딩되어, mRNA로 코딩되어, 단백질로서, 또는 가이드 RNA(gRNA)와의 핵단백질 복합체로서 세포에 전달될 수 있다.

부위 특이적 전이유전자 통합은 벡터 매개 통합 부위 편향에 의해 제어될 수 있다. 벡터 매개 통합 부위 편향은 선택된 렌티바이러스 벡터에 의해 또는 선택된 감마-레트로바이러스 벡터에 의해 제어될 수 있다.

부위 특이적 전이유전자 통합 부위는 비안정적인 염색체 삽입일 수 있다. 통합된 전이유전자는 침묵, 제거, 절제, 또는 추가로 변형될 수 있다. 게놈 변형은 전이유전자의 비안정적인 통합일 수 있다. 비안정적인 통합은 일시적인 비염색체 통합, 반안정적인 비염색체 통합, 반지속적인 비염색체 삽입, 또는 비안정적인 염색체 삽입일 수 있다. 일시적인 비염색체 삽입은 에피-염색체 또는 세포질일 수 있다. 일 양태에서, 전이유전자의 일시적인 비염색체 삽입은 염색체 내로 통합되지 않으며, 변형된 유전 물질은 세포 분열 동안 복제되지 않는다.

게놈 변형은 전이유전자의 반안정적인 또는 지속적인 비염색체 통합일 수 있다. DNA 벡터는 분열하는 세포의 핵에서 자율 복제를 허용하는 비바이러스 벡터의 에피솜 보유를 위해 핵 매트릭스 단백질에 결합하는 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(S-MAR) 모듈을 코딩한다.

게놈 변형은 전이유전자의 비안정적인 염색체 통합일 수 있다. 통합된 전이유전자는 침묵, 제거, 절제, 또는 추가로 변형될 수 있다.

전이유전자 삽입에 의한 게놈 변형은 상동성 재조합(HR), 미세상동성 매개 말단 결합(MMEJ), 비상동성 말단 결합(NHEJ), 트랜스포사제 효소 매개 변형, 인테그라아제 효소 매개 변형, 엔도뉴클레아제 효소 매개 변형, 또는 재조합 효소 매개 변형에 의한 숙주 세포-지시 이중 가닥 파손 복구(상동 지시 복구)를 통해 발생할 수 있다. 전이유전자 삽입에 의한 게놈 변형은 CRISPR-Cas9, TALEN, ZFNs, Cas-CLOVER™, 및 cpf1을 통해 발생할 수 있다.

새로운 또는 기존 뉴클레오타이드/핵산을 삽입하는 것을 포함하는 유전자 편집 시스템에서, 삽입 도구(예컨대, DNA 주형 벡터, 전위가능한 요소(트랜스포존 또는 레트로트랜스포존)는 절단 효소(예컨대, 뉴클레아제, 재조합효소, 인테그라아제 또는 트랜스포사제)와 함께 세포에 전달되어야 한다. 재조합효소를 위한 이러한 삽입 도구의 예는 DNA 벡터를 포함할 수 있다. 다른 유전자 편집 시스템은 삽입 벡터와 함께 인테그라아제의 전달, 트랜스포존/레트로트랜스포존과 함께 트랜스포사제의 전달 등을 필요로 한다. 절단 효소로서 사용될 수 있는 예시적인 재조합효소는 CRE 재조합효소이다. 삽입 도구에서 사용될 수 있는 인테그라아제의 비제한적인 예는 AAV, 감마 레트로바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하는 많은 바이러스로부터 취한 바이러스 기반 효소를 포함한다. 삽입 도구에서 사용될 수 있는 예시적인 트랜스포존/레트로트랜스포존은 본원에 더 상세히 기재되어 있다.

생체외, 생체내, 시험관내 또는 원위치 게놈 변형을 갖는 세포는 생식계열 세포 또는 체세포일 수 있다. 변형된 세포는 인간, 비인간, 포유동물, 랫트, 마우스, 또는 개 세포일 수 있다. 변형된 세포는 분화되거나, 미분화되거나, 또는 불멸화될 수 있다. 변형된 미분화된 세포는 줄기 세포일 수 있다. 변형된 미분화된 세포는 유도된 다능성 줄기 세포일 수 있다. 변형된 세포는 면역 세포일 수 있다. 변형된 세포는 T 세포, 조혈 줄기 세포, 자연 살해 세포, 대식세포, 수지상 세포, 단핵구, 거핵구, 또는 파골세포일 수 있다. 변형된 세포는 세포가 정지상태이거나, 활성화된 상태이거나, 휴지상태이거나, 간기(interphase)이거나, 전기(prophase)이거나, 중기(metaphase)이거나, 후기(anaphase)이거나, 또는 말기(telophase)인 동안 변형될 수 있다. 변형된 세포는 신선하거나, 동결건조되거나, 부피가 크거나, 하위집단으로 분류되거나, 전혈로부터 유래되거나, 백혈구채집술로부터 유래되거나, 또는 불멸화된 세포주로부터 유래될 수 있다. 백혈구채집술 생성물 또는 혈액으로부터 세포를 단리하기 위한 상세한 설명은 PCT 공개 WO 제2019/173636호 및 제PCT/US2019/049816호에 개시되어 있다.

본 개시내용은 유전자 편집 조성물 및/또는 유전자 편집 조성물을 포함하는 세포를 제공한다. 유전자 편집 조성물은 DNA 결합 도메인을 코딩하는 서열 및 뉴클레아제 단백질 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 뉴클레아제 단백질을 코딩하는 서열 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 서열은 DNA 서열, RNA 서열, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 뉴클레아제 또는 이의 뉴클레아제 도메인은 CRISPR/Cas 단백질, 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 및 엔도뉴클레아제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

뉴클레아제 또는 이의 뉴클레아제 도메인은 뉴클레아제 불활성화된 Cas(dCas) 단백질 및 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있다. 엔도뉴클레아제는 Clo051 뉴클레아제 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. 유전자 편집 조성물은 융합 단백질을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 뉴클레아제 불활성화된 Cas9(dCas9) 단백질 및 Clo051 뉴클레아제 또는 Clo051 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. 유전자 편집 조성물은 가이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 가이드 서열은 RNA 서열을 포함한다.

본 개시내용은 효과기에 작동가능하게 연결된 작은 Cas9(Cas9)를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 DNA 국소화 구성요소 및 효과기 분자를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 또는 구성되는 융합 단백질을 제공하며, 효과기는 작은 Cas9(Cas9)를 포함한다. 본 개시내용의 작은 Cas9 구조체는 유형 IIS 엔도뉴클레아제를 포함하는 효과기를 포함할 수 있다. 활성 촉매 부위를 갖는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9는 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함한다.

본 개시내용은 효과기에 작동가능하게 연결된 불활성화된 작은 Cas9(dSaCas9)를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 DNA 국소화 구성요소 및 효과기 분자를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 또는 구성되는 융합 단백질을 제공하며, 효과기는 작은 불활성화된 Cas9(dSaCas9)를 포함한다. 본 개시내용의 작은 불활성화된 Cas9(dSaCas9) 구조체는 유형 IIS 엔도뉴클레아제를 포함하는 효과기를 포함할 수 있다. dSaCas9는 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하고, 이는 촉매 부위를 불활성화시키는 D10A 및 N580A 돌연변이를 포함한다

본 개시내용은 효과기에 작동가능하게 연결된 불활성화된 Cas9(dCas9)를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 DNA 국소화 구성요소 및 효과기 분자를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 또는 구성되는 융합 단백질을 제공하며, 효과기는 불활성화된 Cas9(dCas9)를 포함한다. 본 개시내용의 불활성화된 Cas9(dCas9) 구조체는 유형 IIS 엔도뉴클레아제를 포함하는 효과기를 포함할 수 있다.

dCas9는 스트렙토코커스 피오제네스( Streptoccocus pyogenes)로부터 단리되거나 유래될 수 있다. dCas9는 아미노산 위치 10 및 840에 치환을 갖는 dCas9를 포함할 수 있고, 이는 촉매 부위를 불활성화시킨다. 일부 양태에서, 이러한 치환은 D10A 및 H840A이다. dCas9는 서열번호: 45 또는 서열번호: 46의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

예시적인 Clo051 뉴클레아제 도메인은 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 또는 구성된다.

예시적인 dCas9-Clo051(Cas-CLOVER) 융합 단백질은 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 예시적인 dCas9-Clo051 융합 단백질은 서열번호: 49의 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩될 수 있다. dCas9-Clo051 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.

예시적인 dCas9-Clo051(Cas-CLOVER) 융합 단백질은 서열번호: 50의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 예시적인 dCas9-Clo051 융합 단백질은 서열번호: 51의 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩될 수 있다. dCas9-Clo051 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.

유전자 편집 조성물을 포함하는 세포는 유전자 편집 조성물을 안정하게 또는 일시적으로 발현할 수 있다. 바람직하게는, 유전자 편집 조성물은 일시적으로 발현된다. 가이드 RNA는 게놈 DNA 서열 내의 표적 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 게놈 DNA 서열 내의 표적 서열은 게놈 DNA 서열의 안전 하버 부위 내의 표적 서열일 수 있다.

Cas-CLOVER를 포함하는 유전자 편집 조성물, 및 유전자 편집을 위해 이들 조성물을 사용하는 방법은 미국 특허 공개 제2017/0107541호, 제2017/0114149호, 제2018/0187185호 및 미국 특허 제10,415,024호에 상세히 기재되어 있다.

유전자 편집 도구는 또한 하나 이상의 폴리(히스티딘) 기반의 마이셀을 사용하여 세포에 전달될 수 있다. 폴리(히스티딘)(예컨대, 폴리(L-히스티딘))은 불포화된 질소 상에 고립 전자쌍을 제공하는 이미다졸 고리로 인해 pH에 민감한 중합체이다. 즉, 폴리(히스티딘)은 양성자화-탈양성화를 통해 양쪽성 특성을 갖는다. 특히, 특정 pH에서, 폴리(히스티딘) 함유 삼블록 공중합체는 표면 상에 양으로 하전된 폴리(히스티딘) 단위를 갖는 마이셀로 조립되어, 음으로 하전된 유전자 편집 분자(들)와의 복합체화를 가능하게 할 수 있다. pH 의존적 방식으로 단백질 및/또는 핵산을 결합 및 방출하는 이러한 나노입자는 원하는 유전자 변형을 수행하기 위해 효율적이고 선택적인 메커니즘을 제공할 수 있다. 특히, 이 마이셀 기반 전달 시스템은 충전된 물질에 대해 실질적인 유연성뿐만 아니라 큰 탑재 용량, 및 나노입자 탑재물의 표적화된 방출을 제공한다. 일 예에서, 이중 가닥 DNA의 부위 특이적 절단은 폴리(히스티딘) 기반 마이셀을 사용한 뉴클레아제의 전달에 의해 가능하게 된다. 특정 이론에 구속되기를 바라지 않지만, 다양한 삼블록 공중합체에 의해 형성된 마이셀에서, 소수성 블록은 응집하여 코어를 형성하고, 이는 말단에 친수성 블록 및 폴리(히스티딘) 블록을 남겨 하나 이상의 주변 층을 형성한다고 여겨진다.

일 양태에서, 본 개시내용은 친수성 블록, 소수성 블록, 및 하전된 블록으로 만들어진 삼블록 공중합체를 제공한다. 일부 양태에서, 친수성 블록은 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO)일 수 있고, 하전된 블록은 폴리(L-히스티딘)일 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 삼블록 공중합체는 PEO-b-PLA-b-PHIS이며, 각 블록 내의 반복 단위의 가변적인 수는 설계에 따라 다양하다.

삼블록 공중합체를 제조하기 위한 중간체로 사용될 수 있는 이블록 공중합체는 비제한적으로 폴리(락티드)(PLA), 폴리(글리콜리드)(PLGA), 폴리(락틱-co-글리콜산)(PLGA), 폴리(ε-카프로락톤)(PCL), 및 폴리(트리메틸렌 카르보네이트)(PTMC)를 포함하는 다양한 소수성 지방족 폴리(무수물), 폴리(핵산), 폴리(에스테르), 폴리(오르토 에스테르), 폴리(펩타이드), 폴리(포스파젠) 및 폴리(당류)에 결합된 PEG와 화학적으로 동의어인 친수성 생체적합성 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO)를 가질 수 있다. 100% 페길화된 표면으로 구성된 중합체성 마이셀은 개선된 시험관내 화학적 안정성, 증가된 생체내 생체이용률, 및 연장된 혈액 순환 반감기를 보유한다.

삼블록 공중합체를 포함하는 것을 포함하는 중합체성 비히클, 폴리머좀 및 폴리(히스티딘) 기반 마이셀, 및 이를 제조하는 방법은 미국 특허 제7,217,427호; 제7,868,512호; 제6,835,394호; 제8,808,748호; 제10,456,452호; 미국 공개 제2014/0363496호; 제2017/0000743호; 및 제2019/0255191호; 및 PCT 공개 WO 제2019/126589호에 더 상세히 기재되어 있다.

유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드

본원에 개시된 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드는 기존 유도성 폴리펩타이드보다 우수한데, 본 개시내용의 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드가 면역원성이 훨씬 낮기 때문이다. 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드이므로 비자연발생이다. 또한, 숙주 인간 면역 시스템이 "비자기"로 인식하여 결과적으로 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드, 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드를 포함하는 세포 또는 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 또는 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드를 포함하는 세포를 받는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 비인간 서열을 포함하지 않는 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드를 생성하기 위해 조합된 서열.

본 개시내용은 리간드 결합 영역, 링커, 및 아폽토시스 촉진 펩타이드를 포함하는 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드를 제공하며, 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 양태에서, 비인간 서열은 제한 부위를 포함한다. 특정 양태에서, 리간드 결합 영역은 다량체성 리간드 결합 영역일 수 있다. 특정 양태에서, 아폽토시스 촉진 펩타이드는 카스파아제 폴리펩타이드이다. 카스파아제 폴리펩타이드의 비제한적인 예는 카스파아제 1, 카스파아제 2, 카스파아제 3, 카스파아제 4, 카스파아제 5, 카스파아제 6, 카스파아제 7, 카스파아제 8, 카스파아제 9, 카스파아제 10, 카스파아제 11, 카스파아제 12, 및 카스파아제 14를 포함한다. 바람직하게는, 카스파아제 폴리펩타이드는 카스파아제 9 폴리펩타이드이다. 카스파아제 9 폴리펩타이드는 절단된 카스파아제 9 폴리펩타이드일 수 있다. 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드는 비자연발생일 수 있다. 카스파아제가 카스파아제 9 또는 절단된 카스파아제 9인 경우, 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드는 또한 "iC9 안전 스위치"로서 지칭될 수 있다.

유도성 카스파아제 폴리펩타이드는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 카스파아제 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 양태에서, 유도성 카스파아제 폴리펩타이드는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 절단된 카스파아제 9 폴리펩타이드를 포함하고, 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드는 비인간 서열을 포함하지 않는다.

리간드 결합 영역은 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드를 포함하는 리간드 결합 영역의 아미노산 서열은 서열의 위치 36에 변형을 포함할 수 있다. 변형은 위치 36에서 페닐알라닌(F)에 대한 발린(V)의 치환(F36V)일 수 있다. FKBP12 폴리펩타이드는 서열번호: 73과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. FKBP12 폴리펩타이드는 서열번호: 74와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩될 수 있다.

링커 영역은 서열번호: 75와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있거나 또는 링커 영역은 서열번호: 76과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩될 수 있다. 일부 양태에서, 링커를 코딩하는 핵산 서열은 제한 부위를 포함하지 않는다.

절단된 카스파아제 9 폴리펩타이드는 서열의 위치 87에 아르기닌(R)을 포함하지 않는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 절단된 카스파아제 9 폴리펩타이드는 서열의 위치 282에 알라닌(A)을 포함하지 않는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 절단된 카스파아제 9 폴리펩타이드는 서열번호: 77과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있거나 또는 절단된 카스파아제 9 폴리펩타이드는 서열번호: 78과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩될 수 있다.

특정 양태에서, 폴리펩타이드가 절단된 카스파아제 9 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드는 서열번호: 79와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있거나 또는 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드는 서열번호: 5, 서열번호: 6, 또는 서열번호: 80과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다.

유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드는 세포에서 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드의 발현을 개시 및/또는 조절할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 프로모터의 전사 조절하에 세포에서 발현될 수 있다.

유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드의 활성화는, 예를 들어, 조건부로 제어된 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산하기 위해 유도제에 의해 매개되는 화학적으로 유도된 이량체화(CID)를 통해 달성될 수 있다. 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드는 유도성일뿐만 아니라 이들 폴리펩타이드의 유도는 불안정한 이량체화제의 분해 또는 단량체성 경쟁적 억제제의 투여로 인해 가역적이다.

특정 양태에서, 리간드 결합 영역이 위치 36에서 페닐알라닌(F)에 대한 발린(V)의 치환(F36V)을 갖는 FKBP12 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 유도제는 AP1903, 합성 약물(CAS 인덱스 명칭: 2-피페리딘카르복실산, 1-[(2S)-1-옥소-2-(3,4,5-트리메톡시페닐)부틸]-, 1,2-에탄디일비스[이미노(2-옥소-2,1-에탄디일)옥시-3,1-페닐렌[(1R)-3-(3,4-디메톡시페닐)프로필리덴]]에스테르, [2S-[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R*]]]]]-(9Cl) CAS 등록 번호: 195514-63-7; 분자식: C78H98N4O20; 분자량: 1411.65)); AP20187(CAS 등록 번호: 195514-80-8 및 분자식: C82H107N5O20) 또는 AP20187 유사체, 예를 들어, AP1510을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 유도제 AP20187, AP1903 및 AP1510은 상호교환적으로 사용될 수 있다.

유도성 아폽토시스 촉진 펩타이드 및 이들 펩타이드를 유도하는 방법은 미국 특허 공개 WO 제2019/0225667호 및 PCT 공개 WO 제2018/068022호에 상세히 기재되어 있다.

키메라 자극제 수용체 및 재조합 HLA -E 폴리펩타이드

임의의 환자에 투여하기에 "보편적으로" 안전한 입양 세포 조성물은 동종이식편반응성(alloreactivity)의 유의한 감소 또는 제거를 필요로 한다. 이를 위해, 본 개시내용의 세포(예컨대, 동종이계 세포)는 T-세포 수용체(TCR) 및/또는 주 조직적합성 복합체(MHC)의 부류의 발현 또는 기능을 방해하도록 변형될 수 있다. TCR은 이식편 대 숙주(GvH) 반응을 매개하는 반면, MHC는 숙주 대 이식편(HvG) 반응을 매개한다. 바람직한 양태에서, TCR의 임의의 발현 및/또는 기능은 대상체에게 사망을 유발할 수 있는 T-세포 매개 GvH를 방지하기 위해 제거된다. 따라서, 바람직한 양태에서, 본 개시내용은 순수한 TCR-음성 동종이계 T-세포 조성물을 제공한다(예컨대, 조성물의 각 세포는 검출불가능하거나 존재하지 않을 정도의 낮은 수준으로 발현된다).

MHC 부류 I(MHC-I, 특이적으로, HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C)의 발현 및/또는 기능은 HvG를 방지하고, 결과적으로 대상체에서 세포의 생착을 개선하기 위해 감소되거나 제거되다. 개선된 생착은 세포의 더 긴 지속성을 초래하고, 따라서, 대상체에게 더 큰 치료적 창을 제공한다. 구체적으로, MHC-I의 구조적 요소인 베타-2-마이크로글로불린(B2M)의 발현 및/또는 기능이 감소되거나 제거된다.

상기 전략은 추가 도전을 유도한다. T 세포에서 T 세포 수용체(TCR) 넉아웃(KO)은 TCR 복합체의 일부인 CD3-제타(CD3z 또는 CD3ζ)의 발현 손실을 초래한다. TCR-KO T-세포에서 CD3ζ의 손실은 비제한적으로, 작용제 항-CD3 mAb를 포함하는 표준 자극/활성화 시약을 사용하여 이들 세포를 최적으로 활성화시키고 확장시키는 능력을 극적으로 감소시킨다. TCR 복합체의 임의의 한 구성요소의 발현 또는 기능이 중단되면, TCR-알파(TCRα), TCR-베타(TCRα), CD3-감마(CD3γ), CD3-엡실론(CD3ε), CD3-델타(CD3δ), 및 CD3-제타(CD3ζ)를 포함하는 복합체의 모든 구성요소가 손실된다. CD3ε 및 CD3ζ 둘 모두는 T 세포 활성화 및 확장에 필요하다. 작용제 항-CD3 mAb는 전형적으로 CD3ε 및 아마도 복합체 내의 또 다른 단백질을 인식하며, 이는 차례로 CD3ζ에 신호를 전달한다. CD3ζ는 최적의 활성화 및 확장을 위해 T 세포 활성화를 위한 1차 자극(2차 공-자극 신호와 함께)을 제공한다. 정상적인 조건 하에, 완전한 T-세포 활성화는 면역 반응을 증가시키는 하나 이상의 공-자극 수용체(예컨대, CD28, CD2, 4-1BBL)에 의해 매개되는 제2 신호와 함께 TCR의 결합에 좌우된다. 그러나, TCR이 존재하지 않는 경우, T 세포 확장은 작용제 항-CD3 mAb를 포함한 표준 활성화/자극 시약을 사용하여 자극될 때 심각하게 감소된다. 사실, T 세포 확장은 작용제 항-CD3 mAb를 포함한 표준 활성화/자극 시약을 사용하여 자극될 때 정상 확장 수준의 단지 20-40%로 감소된다.

따라서, 본 개시내용은 (a) 활성화 구성요소를 포함하는 엑토도메인으로서, 활성화 구성요소는 제1 단백질로부터 단리되거나 유래되는 것인 엑토도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 적어도 하나의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 적어도 하나의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리되거나 유래되고, 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않은 것인 엔도도메인을 포함하는 비자연발생 키메라 자극 수용체(CSR)을 제공한다.

활성화 구성요소는 하나 이상의 T-세포 수용체(TCR)의 구성요소, TCR 복합체의 구성요소, TCR 공-수용체의 구성요소, TCR 공-자극 단백질의 구성요소, TCR 억제 단백질의 구성요소, 사이토카인 수용체, 및 활성화 구성요소의 작용제가 결합하는 케모카인 수용체의 일부를 포함할 수 있다. 활성화 구성요소는 CD2 세포외 도메인 또는 작용제가 결합하는 이의 일부를 포함할 수 있다.

신호 전달 도메인은 하나 이상의 인간 신호 전달 도메인의 구성요소, T-세포 수용체(TCR), TCR 복합체의 구성요소, TCR 공-수용체의 구성요소, TCR 공-자극 단백질의 구성요소, TCR 억제 단백질의 구성요소, 사이토카인 수용체, 및 케모카인 수용체를 포함할 수 있다. 신호 전달 도메인은 CD3 단백질 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. CD3 단백질은 CD3ζ 단백질 또는 이의 일부를 포함할 수 있다.

엔도도메인은 세포질 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 세포질 도메인은 제3 단백질로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 제1 단백질 및 제3 단백질은 동일할 수 있다. 엑토도메인은 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 신호 펩타이드는 제4 단백질로부터 유래될 수 있다. 제1 단백질 및 제4 단백질은 동일할 수 있다. 막관통 도메인은 제5 단백질로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 제1 단백질 및 제5 단백질은 동일할 수 있다.

일부 양태에서, 활성화 구성요소는 자연발생 분자에 결합하지 않는다. 일부 양태에서, 활성화 구성요소는 자연발생 분자에 결합하지만 CSR은 활성화 구성요소가 자연발생 분자에 결합할 때 신호를 전달하지 않는다. 일부 양태에서, 활성화 구성요소는 비자연발생 분자에 결합하지 않는다. 일부 양태에서, 활성화 구성요소는 자연발생 분자에 결합하지 않지만 비자연발생 분자에 결합한다. CSR은 활성화 구성요소가 비자연발생 분자에 결합할 때 신호를 선택적으로 전달할 수 있다.

바람직한 양태에서, 본 개시내용은 (a) 신호 펩타이드 및 활성화 구성요소를 포함하는 엑토도메인으로서, 신호 펩타이드는 CD2 신호 펩타이드 또는 이의 일부를 포함하고 활성화 구성요소는 작용제가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 것인 엑토도메인; (b) 막관통 도메인으로서, 막관통 도메인은 CD2 막관통 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 것인 막관통 도메인; 및 (c) 세포질 도메인 및 적어도 하나의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 세포질 도메인은 CD2 세포질 도메인 또는 이의 일부를 포함하고 적어도 하나의 신호 전달 도메인은 CD3ζ 단백질 또는 이의 일부를 포함하는 것인 엔도도메인을 포함하는 비자연발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공한다. 일부 양태에서, 비자연 CSR은 서열번호: 81과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 양태에서, 비자연발생 CSR은 서열번호: 81의 아미노산 서열을 포함한다.

본 개시내용은 또한 엑토도메인이 변형을 포함하는 비자연발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공한다. 변형은 활성화 구성요소 또는 제1 단백질의 야생형 서열과 비교하여 활성화 구성요소 또는 제1 단백질의 아미노산 서열의 돌연변이 또는 절단을 포함할 수 있다. 활성화 구성요소의 아미노산 서열의 돌연변이 또는 절단은작용제가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 이의 일부의 돌연변이 또는 절단을 포함할 수 있다. CD2 세포외 도메인의 돌연변이 또는 절단은 자연발생 CD58과의 결합을 감소 또는 제거할 수 있다. 일부 양태에서, 돌연변이 또는 절단을 포함하는 CD2 세포외 도메인은 서열번호: 82와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 양태에서, 돌연변이 또는 절단을 포함하는 CD2 세포외 도메인은 서열번호: 82의 아미노산 서열을 포함한다.

바람직한 양태에서, 본 개시내용은 (a) 신호 펩타이드 및 활성화 구성요소를 포함하는 엑토도메인으로서, 신호 펩타이드는 CD2 신호 펩타이드 또는 이의 일부를 포함하고 활성화 구성요소는 작용제가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하며 작용제가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 이의 일부는 돌연변이 또는 절단을 포함하는 것인 엑토도메인; (b) 막관통 도메인으로서, 막관통 도메인은 CD2 막관통 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 것인 막관통 도메인; 및 (c) 세포질 도메인 및 적어도 하나의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 세포질 도메인은 CD2 세포질 도메인 또는 이의 일부를 포함하고 적어도 하나의 신호 전달 도메인은 CD3ζ 단백질 또는 이의 일부를 포함하는 것인 엔도도메인을 포함하는 비자연발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공한다. 일부 양태에서, 비자연 CSR은 서열번호: 83과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 양태에서, 비자연발생 CSR은 서열번호: 83의 아미노산 서열을 포함한다.

본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존 또는 벡터를 제공한다.

본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 CSR을 포함하는 세포를 제공한다. 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 제공한다. 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 세포를 제공한다.

본원에 개시된 변형된 세포는 동종이계 세포 또는 자가조직 세포일 수 있다. 일부 바람직한 양태에서, 변형된 세포는 동종이계 세포이다. 일부 양태에서, 변형된 세포는 자가조직 T-세포 또는 변형된 자가조직 CAR T-세포이다. 일부 바람직한 양태에서, 변형된 세포는 동종이계 T-세포 또는 변형된 동종이계 CAR T-세포이다.

본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 CSR을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 본원에 개시된 변형된 세포를 포함하는 조성물 또는 본원에 개시된 복수의 변형된 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 개시내용은 (a) T-세포 수용체(TCR)를 코딩하는 내인성 서열의 변형으로서, 변형은 TCR의 발현 또는 활성의 수준을 감소시키거나 제거하는 것인 변형; 및 (b) (i) 활성화 구성요소를 포함하는 엑토도메인으로서, 활성화 구성요소는 제1 단백질로부터 단리되거나 유래되는 것인 엑토도메인; (ii) 막관통 도메인; 및 (iii) 적어도 하나의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 적어도 하나의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리되거나 유래되는 것인 엔도도메인을 포함하는 키메라 자극 수용체(CSR)로서; 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않은 것인 키메라 자극 수용체(CSR)를 포함하는 변형된 T 림프구(T-세포)를 제공한다.

변형된 T-세포는 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 변형된 T-세포는 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 내인성 서열의 변형을 추가로 포함할 수 있고, 변형은 주 조직 적합성 복합체(MHC) 부류 I(MHC-I)의 발현 또는 활성의 수준을 감소시키거나 제거한다.

변형된 T-세포는 HLA 부류 I 조직적합성 항원, 알파 사슬 E(HLA-E) 폴리펩타이드를 포함하는 비자연발생 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. HLA-E 폴리펩타이드를 포함하는 비자연발생 폴리펩타이드는 B2M 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. HLA-E 폴리펩타이드를 포함하는 비자연발생 폴리펩타이드는 B2M 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. HLA-E 폴리펩타이드를 포함하는 비자연발생 폴리펩타이드는 링커를 추가로 포함할 수 있고, 링커는 B2M 폴리펩타이드 및 HLA-E 폴리펩타이드 사이에 위치한다. HLA-E 폴리펩타이드를 포함하는 비자연발생 폴리펩타이드는 펩타이드 및 B2M 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. HLA-E 폴리펩타이드를 포함하는 비자연발생 폴리펩타이드는 B2M 신호 펩타이드 및 펩타이드 사이에 위치한 제1 링커, 및 B2M 폴리펩타이드 및 HLA-E를 코딩하는 펩타이드 사이에 위치한 제2 링커를 추가로 포함할 수 있다.

변형된 T-세포는 비자연발생 항원 수용체, 치료적 폴리펩타이드를 코딩하는 서열, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 비자연발생 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함할 수 있다.

CSR은 변형된 T-세포에서 일시적으로 발현될 수 있다. CSR은 변형된 T-세포에서 안정적으로 발현될 수 있다. HLA-E 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드는 변형된 T-세포에서 일시적으로 발현될 수 있다. HLA-E 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드는 변형된 T-세포에서 안정적으로 발현될 수 있다. 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드는 변형된 T-세포에서 일시적으로 발현될 수 있다. 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드는 변형된 T-세포에서 안정적으로 발현될 수 있다. 비자연발생 항원 수용체 또는 치료적 단백질을 코딩하는 서열은 변형된 T-세포에서 일시적으로 발현될 수 있다. 비자연발생 항원 수용체 또는 치료적 단백질을 코딩하는 서열은 변형된 T-세포에서 안정적으로 발현될 수 있다.

비제한적으로 본원에 상세히 기재된 바와 같은 dCas9-Clo051을 포함하는 RNA 가이드된 융합 단백질을 포함하는 유전자 편집 조성물은 내인성 T-세포 수용체의 발현을 표적화하고 감소시키거나 제거하는 데 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 유전자 편집 조성물은 내인성 T-세포 수용체를 코딩하는 유전자, 유전자의 일부, 또는 유전자의 조절 요소(예컨대, 프로모터)를 표적화하고 결실시킨다. TCR-알파(TCR-α)를 표적화하고 결실시키고, TCR-베타(TCR-β)를 표적화하고 결실시키며, 베타-2-마이크로글로불린(β2M)을 표적화하고 결실시키기 위한 가이드 RNA(gRNA) 주형의 생성을 위한 프라이머(T7 프로모터, 게놈 표적 서열, 및 gRNA 스캐폴드 포함)의 비제한적인 예가 PCT 출원 제PCT/US2019/049816호에 개시되어 있다.

비제한적으로, dCas9-Clo051을 포함하는 RNA 가이드된 융합 단백질을 포함하는 유전자 편집 조성물은 내인성 MHCI, MHCII, 또는 MHC 활성화제의 발현을 표적화하고 감소시키거나 제거하는 데 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 유전자 편집 조성물은 내인성 MHCI, MHCII, 또는 MHC 활성화제의 하나 이상의 구성요소를 코딩하는 유전자, 유전자의 일부, 또는 유전자의 조절 요소(예컨대, 프로모터)를 표적화하고 결실시킨다. MHC 활성화제를 표적화하고 결실시키기 위한 가이드 RNA(gRNA)의 비제한적인 예가 PCT 출원 제PCT/US2019/049816호에 개시되어 있다.

비자연발생 키메라 자극 수용체, TCR-알파(TCR-α), TCR-베타(TCR-β), 및/또는 베타-2-마이크로글로불린(β2M)을 코딩하는 내인성 서열의 유전적 변형, 및 HLA 부류 I 조직적합성 항원, 알파 사슬 E(HLA-E) 폴리펩타이드를 포함하는 비자연발생 폴리펩타이드의 상세한 설명이 PCT 출원 제PCT/US2019/049816호에 개시되어 있다.

제제, 투여량 및 투여

본 개시내용은 본원에 기재된 조성물의 제제, 투여량 및 투여 방법을 제공한다.

개시된 조성물 및 약학 조성물은, 비제한적으로, 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친유성 용매, 보존제, 보조제 등과 같은 임의의 적합한 보조제 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 보조제가 바람직하다. 이러한 멸균 용액의 비제한적인 예 및 이의 제조 방법은 비제한적으로 문헌[Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co.(Easton, Pa.) 1990 및 "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics(Montvale, N.J.) 1998]에서와 같이 당업계에 널리 알려져 있다. 당업계에 널리 알려져 있거나 본원에 기재된 바와 같은 단백질 스캐폴드, 단편 또는 변이체 조성물의 투여 방식, 용해도 및/또는 안정성에 적합한 약학적으로 허용가능한 담체가 일상적으로 선택될 수 있다.

사용하기에 적합한 약제학적 부형제 및 첨가제의 비제한적인 예는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 지질, 및 탄수화물(예컨대, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 및 올리고당을 포함하는 당류; 유도체화된 당류, 예컨대 알디톨(alditol), 알돈산(aldonic acid), 에스테르화 당류 등; 및 다당류 또는 당 중합체)을 포함하고, 이는 단독으로 또는 조합하여 존재할 수 있고, 이는 단독으로 또는 조합하여 1-99.99 중량% 또는 부피%를 포함한다. 단백질 부형제의 비제한적인 예는 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민(HSA), 재조합 인간 알부민(rHA), 젤라틴, 카세인 등을 포함한다. 완충 용량에서도 기능할 수 있는 대표적인 아미노산/단백질 구성요소는 알라닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 리신, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파르탐 등을 포함한다. 하나의 바람직한 아미노산은 글리신이다.

사용하기에 적합한 탄수화물 부형제의 비제한적인 예는 단당류, 예컨대 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등; 이당류, 예컨대 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로바이오스 등; 다당류, 예컨대 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예컨대, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 소르비톨(glucitol), 미오이노시톨 등을 포함한다. 바람직하게는, 탄수화물 부형제는 만니톨, 트레할로스, 및/또는 라피노스이다.

조성물은 또한 완충제 또는 pH-조절제를 포함하고; 전형적으로, 완충제는 유기 산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 완충제는 유기 산 염, 예컨대 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 카르본산, 타르타르산, 석신산, 아세트산, 또는 프탈산의 염; 트리스, 트로메타민 하이드로클로라이드, 또는 포스페이트 완충제를 포함한다. 바람직한 완충제는 유기 산 염, 예컨대 시트레이트이다.

추가로, 개시된 조성물은 중합체성 부형제/첨가제, 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 피콜(중합체성 당), 덱스트레이트(예컨대, 사이클로덱스트린, 예컨대 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 향미제, 항균제, 감미제, 항산화제, 정균제, 계면활성제(예컨대, 폴리소르베이트, 예컨대 "TWEEN 20" 및 "TWEEN 80"), 지질(예컨대, 인지질, 지방산), 스테로이드(예컨대, 콜레스테롤), 및 킬레이트제(예컨대, EDTA)를 포함할 수 있다.

본원에 개시된 조성물 또는 약학 조성물의 치료적 유효량을 투여하기 위해 많은 공지되고 개발된 방식이 사용될 수 있다. 투여 방식의 비제한적인 예는 볼루스, 협측, 주입, 관절내, 기관지내, 복내(intraabdominal), 피막내, 연골내, 강내, 복내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 병변내, 근육내, 심근내, 비강내, 안내, 골내(intraosseous), 골내(intraosteal), 골반내, 심낭내, 복강내(intraperitoneal), 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 종양내, 정맥내, 방광내, 경구, 비경구, 직장, 설하, 피하, 경피 또는 질 수단을 포함한다.

본 개시내용의 조성물은 비경구(피하, 근육내 또는 정맥내) 또는 임의의 다른 투여의 사용을 위해, 특히 액체 용액 또는 현탁액의 형태로; 질 또는 직장 투여에 사용하기 위해, 특히 반고체 형태, 예컨대, 비제한적으로, 크림 및 좌제로; 협측, 또는 설하 투여를 위해, 예컨대, 비제한적으로, 정제 또는 캡슐 형태로; 또는 비강내로, 예컨대, 비제한적으로, 분말, 점비제 또는 에어로졸 또는 특정 제제의 형태로; 또는 경피로, 예컨대 비제한적으로 피부 구조를 변형시키거나 경피 패치에서 약물 농도를 증가시키기 위해 디메틸 설폭사이드와 같은 화학적 강화제를 갖거나(Junginger, et al. In "Drug Permeation Enhancement;" Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90(Marcel Dekker, Inc. New York 1994,), 또는 피부에 단백질 및 펩타이드를 함유하는 제제의 적용(WO 제98/53847호), 또는 전기천공과 같은 일시적인 수송 경로를 생성하거나, 또는 이온영동(iontophoresis)과 같이 피부를 통해 하전된 약물의 이동성을 증가시키는 전하의 적용, 또는 초음파영동(sonophoresis)과 같은 초음파의 적용(미국 특허 제4,309,989호 및 제4,767,402gh)(상기 간행물 및 특허는 전체가 참조로 본원에 포함됨)을 가능하게 하는 산화제를 갖는 겔, 연고, 로션, 현탁액 또는 패치 전달 시스템으로 제조될 수 있다.

비경구 투여를 위해, 본원에 개시된 임의의 조성물은 약학적으로 허용가능한 비경구 비히클과 함께 회합되거나 또는 별도로 제공되는 용액, 현탁액, 유화액, 입자, 분말, 또는 동결건조 분말로서 제제화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 일반적인 부형제로서 멸균수 또는 식염수, 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 수소화된 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 주사를 위한 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 방법에 따라 적절한 유화제 또는 가습제 및 현탁제를 사용하여 제조될 수 있다. 주사를 위한 제제는 용매 중의 비독성, 비경구 투여가능한 희석제, 예컨대 수성 용액, 멸균 주사가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용가능한 비히클 또는 용매로서, 물, 링거액, 등장 식염수 등이 허용되고; 일반 용매 또는 현탁 용매로서, 멸균 비휘발성 오일이 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 천연 또는 합성 또는 반합성 지방유 또는 지방산; 천연 또는 합성 또는 반합성 모노- 또는 디- 또는 트리-글리세라이드를 포함하는 임의의 종류의 비휘발성 오일 및 지방산이 사용될 수 있다. 비경구 투여는 당업계에 공지되어 있으며, 비제한적으로, 일반적인 주사 수단, 미국 특허 제5,851,198호에 기재된 바와 같은 가스 압력 무바늘 주사 장치, 및 미국 특허 제5,839,446호에 기재된 바와 같은 레이저 천공기 장치를 포함한다.

경구 투여를 위한 제제는 장벽의 투과성을 인공적으로 증가시키기 위한 보조제(예컨대, 레소르시놀 및 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 및 n-헥사데실폴리에틸렌 에테르)의 공동 투여뿐만 아니라 효소 분해를 억제하기 위한 효소 억제제(예컨대, 췌장 트립신 억제제, 디이소프로필플루오로포스페이트(DFF) 및 트라실롤)의 공동 투여에 의존한다. 단백질 및 단백질 스캐폴드를 포함하는 친수성 제제 및 경구, 협측, 점막, 비강, 폐, 질 막관통, 또는 직장 투여용으로 의도된 적어도 2개의 계면활성제의 조합의 전달을 위한 제제가 미국 특허 제6,309,663호에 기재되어 있다. 경구 투여를 위한 고체 유형 제형의 활성 성분 화합물은 수크로스, 락토스, 셀룰로오스, 만니톨, 트레할로스, 라피노스, 말티톨, 덱스트란, 전분, 아가, 아르기네이트, 키틴, 키토산, 펙틴, 트라가칸트 검, 아라비아 검, 젤라틴, 콜라겐, 카세인, 알부민, 합성 또는 빈합성 중합체, 및 글리세라이드를 포함하는 적어도 하나의 첨가제와 혼합될 수 있다. 이러한 투여 형태는 또한 다른 유형(들)의 첨가제, 예컨대, 불활성 희석제, 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 파라벤, 보존제, 예컨대 소르브산, 아스코르브산, 알파-토코페롤, 항산화제, 예컨대 시스테인, 붕해제, 결합제, 증점제, 완충제, 감미제, 향미제, 방향제 등을 포함할 수 있다.

정제 및 환제는 장용 코팅 제제로 추가로 가공될 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 제제는 의약용으로 허용가능한 유화액, 시럽, 엘릭시르, 현탁액 및 용액 제제를 포함한다. 이러한 제제는 상기 분야에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예컨대, 물을 함유할 수 있다. 리포좀은 또한 인슐린 및 헤파린에 대한 약물 전달 시스템으로서 기술되었다(미국 특허 제4,239,754호). 보다 최근에는, 혼합된 아미노산의 인공 중합체의 미소구체(프로티노이드(proteinoid))가 의약품을 전달하는 데 사용되었다(미국 특허 제4,925,673호). 또한, 미국 특허 제5,879,681호 및 미국 특허 제5,871,753호에 기재되고 생물학적 활성제를 경구로 전달하는 데 사용된 담체 화합물은 당업자에 공지되어 있다.

폐 투여를 위해, 바람직하게는, 본원에 기재된 조성물 또는 약학 조성물은 폐 또는 부비동의 하기도에 도달하기에 효과적인 입자 크기로 전달된다. 조성물 또는 약학 조성물은 흡입에 의한 치료제의 투여를 위해 당업계에 공지된 다양한 흡입 또는 비강 장치에 의해 전달될 수 있다. 환자의 부비동 또는 폐포에 에어로졸화된 제제를 침착시킬 수 있는 이러한 장치는 계량 흡입기, 분무기(예컨대, 제트 분무기, 초음파 분무기), 건조 분말 생성기, 분무기 등을 포함한다. 이러한 모든 장치는 본원에 기재된 조성물 또는 약학 조성물을 에어로졸에 분배하기 위해 투여에 적합한 제제를 사용할 수 있다. 이러한 에어로졸은 용액(수성 및 비수성 모두) 또는 고체 입자로 구성될 수 있다. 추가로, 본원에 기재된 조성물 또는 약학 조성물을 포함하는 스프레이는 적어도 하나의 단백질 스캐폴드의 현탁액 또는 용액을 압력 하에 노즐을 통과시킴으로써 생산될 수 있다. 계량 흡입기(MDI)에서, 추진제, 본원에 기재된 조성물 또는 약학 조성물, 및 임의의 부형제 또는 다른 첨가제가 액화 압축 가스를 포함하는 혼합물로서 캐니스터(canister)에 포함된다. 계량 밸브의 구동은, 바람직하게는 약 10 μm 미만, 바람직하게는, 약 1 μm 내지 약 5 μm, 및, 가장 바람직하게는, 약 2 μm 내지 약 3 μm 크기 범위의 입자를 함유하는 에어로졸로서 혼합물을 방출한다. 폐 투여, 제제 및 관련 장치의 보다 상세한 설명은 PCT 공개 WO 제2019/049816호에 개시되어 있다.

점막 표면을 통한 흡수를 위해, 조성물은 복수의 서브마이크론 입자, 점막접착성 거대분자, 생활성 펩타이드, 및 유화액 입자의 점막접착을 달성함으로써 점막 표면을 통한 흡수를 촉진하는 수성 연속상을 포함하는 유화액을 포함한다(미국 특허 제5,514,670호). 본 개시내용의 유화액의 적용에 적합한 점막 표면은 각막, 결막, 협측, 설하, 비강, 질, 폐, 위, 장, 및 직장 투여 경로를 포함할 수 있다. 질 또는 직장 투여를 위한 제제, 예컨대, 좌제는 부형제, 예를 들어, 폴리알킬렌글리콜, 바셀린, 코코넛 버터 등을 함유할 수 있다. 비강내 투여를 위한 제제는 고체일 수 있고, 부형제로서, 예를 들어, 락토스를 함유할 수 있거나 점비제의 수성 또는 유성 용액일 수 있다. 협측 투여를 위해, 부형제는 당류, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 전호화된 전분 등을 포함한다(미국 특허 제5,849,695호). 점막 투여 및 제제의 보다 상세한 설명이 PCT 공개 WO 제2019/049816호에 개시되어 있다.

경피 투여를 위해, 본원에 개시된 조성물 또는 약학 조성물은 리포좀 또는 중합체성 나노입자, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 또는 미소구체(달리 언급되지 않는 한 집합적으로 마이크로입자로서 지칭됨)와 같은 전달 장치에 캡슐화된다. 합성 중합체, 예컨대 폴리하이드록시산, 예컨대 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 이의 공중합체, 폴리오르토에스테르, 폴리무수물, 및 폴리포스파젠, 및 천연 중합체, 예컨대 콜라겐, 폴리아미노산, 알부민 및 다른 단백질, 알지네이트 및 다른 다당류, 및 이의 조합으로 제조된 마이크로입자를 포함하는 많은 적합한 장치가 알려져 있다(미국 특허 제5,814,599호). 경피 투여, 제제 및 적합한 장치의 보다 상세한 설명이 PCT 공개 WO 제2019/049816호에 개시되어 있다.

개시된 화합물을 장기간에 걸쳐, 예를 들어, 단일 투여로부터 1주 내지 1년의 기간 동안 대상체에게 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 다양한 서방성, 데포 또는 임플란트 투여 형태가 이용될 수 있다. 예를 들어, 투여 형태는 체액에서 낮은 정도의 용해도를 갖는 화합물의 약학적으로 허용가능한 무독성 염, 예를 들어, (a) 다가산(polybasic acid), 예컨대 인산, 황산, 시트르산, 타르타르산, 탄닌산, 파모산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌 모노- 또는 디-설폰산, 폴리갈락투론산 등을 갖는 산 부가 염; (b) 다가 금속 양이온, 예컨대 아연, 칼슘, 비스무스, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등을 갖는 염 또는 예컨대, N,N'-디벤질-에틸렌디아민 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 유기 양이온을 갖는 염; 또는 (c) (a) 및 (b)의 조합, 예컨대, 아연 탄네이트 염을 함유할 수 있다. 추가로, 개시된 화합물 또는, 바람직하게는, 방금 기재된 것과 같은 비교적 불용성인 염은, 예컨대, 주사에 적합한 참기름을 이용하여 겔, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 겔로 제제화될 수 있다. 특히 바람직한 염은 아연 염, 아연 탄네이트 염, 파모에이트 염 등이다. 주사를 위한 서방성 데포 제제의 또 다른 유형은 느리게 분해하는 무독성, 비항원성 중합체, 예컨대 미국 특허 제3,773,919호에 기재된 바와 같은 폴리락트산/폴리글리콜산 중합체에서 캡슐화를 위해 분산된 화합물 또는 염을 함유할 수 있다. 화합물 또는, 바람직하게는, 상기 기재된 것과 같은 비교적 불용성인 염은 또한 특히 동물에서 사용하기 위해 콜레스테롤 매트릭스 실라스틱(silastic) 펠렛으로 제제화될 수 있다. 추가적인 서방성, 데포 또는 임플란트 제제, 예컨대, 기체 또는 액체 리포좀은 문헌에 공지되어 있다(미국 특허 제5,770,222호 및 "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).

적합한 투여량은 당업계에 잘 알려져 있다. 예컨대, 문헌[Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000); Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, Pa., 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, N.J]을 참고한다. 바람직한 용량은 선택적으로 약 0.1-99 및/또는 100-500 mg/kg/투여, 또는 이의 임의의 범위, 값 또는 분수를 포함할 수 있거나, 또는 단일 또는 다중 투여당 약 0.1-5000 μg/ml 혈청 농도, 또는 이의 임의의 범위, 값 또는 분수를 달성할 수 있다. 본원에 개시된 조성물 또는 약학 조성물을 위한 바람직한 투여량 범위는 대상체의 체중의 약 1 mg/kg, 최대 약 3, 약 6 또는 약 12 mg/kg이다.

대안적으로, 투여되는 투여량은 공지된 인자, 예컨대 특정 제제의 약력학적 특징, 및 그의 투여 방식 및 경로; 수여자의 연령, 건강, 및 체중; 증상의 성질 및 정도, 동시 치료의 종류, 치료 빈도, 및 원하는 효과에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 활성 성분의 투여량은 체중의 킬로그램당 약 0.1 내지 100 밀리그램일 수 있다. 일반적으로, 투여당 또는 지속 방출 형태에서 킬로그램당 0.1 내지 50, 및 바람직하게는, 0.1 내지 10 밀리그램이 원하는 결과를 얻는 데 효과적이다.

비제한적인 예로서, 인간 또는 동물의 치료는 단일, 주입 또는 반복 용량을 사용하여, 본원에 개시된 조성물 또는 약학 조성물의 1회 또는 주기적 투여량으로서 매일 약 0.1 내지 100 mg/kg 또는 이의 임의의 범위, 값 또는 분수, 1-40일 중 적어도 하나, 또는 대안적으로 또는 추가적으로, 1-52주 중 적어도 하나, 또는, 대안적으로 또는 추가적으로, 1-20년 중 적어도 하나, 또는 이의 임의의 조합으로 제공될 수 있다.

내부 투여에 적합한 투여 형태는 일반적으로 단위 또는 용기당 약 0.001 밀리그램 내지 약 500 밀리그램의 활성 성분을 함유한다. 이러한 약학 조성물에서, 활성 성분은 일반적으로 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.5-99.999 중량%의 양으로 존재할 것이다.

유효량은 단일(예컨대, 볼루스), 다중 또는 연속 투여당 약 0.001 내지 약 500 mg/kg의 양을 포함할 수 있거나, 본원에 기재되거나 관련 분야에서 알려진 바와 같이, 공지된 방법을 사용하여 수행되고 결정된 바와 같이, 단일, 다중, 또는 연속 투여당 0.01-5000 μg/ml 혈청 농도, 또는 이 안의 임의의 효과적인 범위 또는 값의 혈청 농도를 달성하는 양을 포함할 수 있다.

이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 조성물이 본원에 개시된 바와 같은 변형된 세포인 양태에서, 세포는 약 1x10³ 내지 1x10¹⁵ 세포; 약 1x10⁴ 내지 1x10¹² 세포; 약 1x10⁵ 내지 1x10¹⁰ 세포; 약 1x10⁶ 내지 1x10⁹ 세포; 약 1x10⁶ 내지 1x10⁸ 세포; 약 1x10⁶ 내지 1x10⁷ 세포; 또는 약 1x10⁶ 내지 25x10⁶ 세포로 투여될 수 있다. 일 양태에서, 세포는 약 5x10⁶ 내지 25x10⁶ 세포로 투여된다.

약학적으로 허용가능한 부형제, 제제, 투여량 및 개시된 조성물 및 약학 조성물의 투여 방법의 보다 상세한 설명이 PCT 공개 WO 제2019/049816호에 개시되어 있다.

본 개시내용의 조성물을 사용하는 방법

본 개시내용은 전위 효율을 개선하기 위한 개시된 조성물의 용도를 제공한다. 구체적으로, 방법은 세포 또는 복수의 세포를 (a) 제1 역위 말단 반복(ITR) 또는 제1 ITR을 코딩하는 서열, (b) 제2 ITR 또는 제2 ITR을 코딩하는 서열, 및 (c) 인트라-ITR 서열 또는 인트라-ITR을 코딩하는 서열을 포함하는 제1 핵산 서열로서, 인트라-ITR 서열은 트랜스포존 서열 또는 트랜스포존을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및 인터-ITR 서열 또는 인터-ITR을 코딩하는 서열을 포함하는 제2 핵산 서열로서, 인터-ITR 서열의 길이는 700개 이하의 뉴클레오타이드이고, 세포 또는 복수의 세포 내의 전위 효율은 700개 뉴클레오타이드보다 큰 제2 핵산 서열 또는 인터-ITR 서열을 포함하는 동일한 조성물과 비교하여 개선되는 것인 제2 핵산 서열을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 전위 효율은 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 90% 개선된다.

본 개시내용은 개시된 조성물 및 약학 조성물을 사용하여, 예컨대 세포, 조직, 장기, 동물, 또는 대상체에게 조성물 또는 약학 조성물의 치료적 유효량을 투여하거나 이와 접촉시켜, 당업계에 공지되거나 본원에 기재된 바와 같이 세포, 조직, 장기, 동물, 또는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 개시된 조성물 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다. 일 양태에서, 대상체는 포유동물이다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

본 개시내용은 세포, 조직, 장기, 동물 또는 대상체에서 적어도 하나의 악성 질환 또는 장애를 조절하거나 치료하기 위한 방법을 제공한다. 바람직하게는, 악성 질환은 암이다. 악성 질환 또는 장애의 비제한적인 예는 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 급성 림프성 백혈병(acute lymphocytic leukemia), B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML), 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myelocytic leukemia, CML), 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 털세포 백혈병(hairy cell leukemia), 골수이형성 증후군(myelodyplastic syndrome, MDS), 호지킨병, 악성 림프종, 비호지킨 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 카포시 육종, 결장직장 암종, 췌장 암종, 비인두 암종, 악성 조직구증, 부신생물 증후군/악성 고칼슘혈증, 고형 종양, 방광암, 유방암, 결장직장암, 자궁내막암, 두부암, 경부암, 유전성 비용종증 암, 호지킨 림프종, 간암, 폐암, 비소 세포 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암종, 고환암, 선암종, 육종, 악성 흑색종, 혈관종, 전이성 질환, 암 관련 골 흡수, 암 관련 골 통증 등을 포함한다.

바람직한 양태에서, 악성 질환 또는 장애의 치료는 입양 세포 요법을 포함한다. 예를 들어, 일 양태에서, 본 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위해 선택되고/거나 확장된 단백질 스캐폴드(예컨대, 본 개시내용의 조성물을 이용하여 세포에 전달된 scFv, 단일 도메인 항체, 센티린)를 포함하는 적어도 하나의 개시된 단백질 스캐폴드 및/또는 CAR을 발현하는 변형된 세포를 제공한다. 변형된 세포는 실온 및 체온을 포함하는 임의의 온도에서 보관하기 위해 제제화될 수 있다. 변형된 세포는 동결보존 및 후속 해동을 위해 제제화될 수 있다. 변형된 세포는 멸균 포장으로부터 대상체에게 직접 투여하기 위해 약학적으로 허용가능한 담체에서 제제화될 수 있다. 변형된 세포는 최소 수준의 세포 기능 및 CAR 발현을 보장하기 위해 세포 생존력 및/또는 CAR 발현 수준의 지표와 함께 약학적으로 허용가능한 담체에서 제제화될 수 있다. 변형된 세포는 추가 확장을 억제하고/거나 세포 사멸을 방지하기 위해 하나 이상의 시약과 함께 규정된 밀도로 약학적으로 허용가능한 담체에서 제제화될 수 있다.

임의의 방법은 본원에 개시된 임의의 조성물 또는 약학 조성물의 유효량을 이러한 조절, 치료 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 장기, 동물 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 선택적으로 이러한 질환 또는 장애를 치료하기 위한 공-투여 또는 조합 요법을 추가로 포함할 수 있고, 본원에 개시된 임의의 조성물 또는 약학 조성물의 투여는 적어도 하나의 화학치료제(예컨대, 알킬화제, 유사분열 억제제, 방사성의약품)의 전, 동시에 및/또는 후에 투여하는 것을 추가로 포함한다.

일부 양태에서, 대상체는 투여 후에 이식편 대 숙주(GvH) 및/또는 숙주 대 이식편(HvG)을 발생시키지 않는다. 일 양태에서, 투여는 전신이다. 전신 투여는 당업계에 공지되고 본원에 상세히 기재된 임의의 수단일 수 있다. 바람직하게는, 전신 투여는 정맥내 주사 또는 정맥내 주입에 의한 것이다. 일 양태에서, 투여는 국소이다. 국소 투여는 당업계에 공지되고 본원에 상세히 기재된 임의의 수단일 수 있다. 바람직하게는, 국소 투여는 종양내 주사 또는 주입, 척수내 주사 또는 주입, 뇌실내 주사 또는 주입, 안내 주사 또는 주입, 또는 골내 주사 또는 주입에 의한다.

일부 양태에서, 치료적 유효 용량은 단일 용량이다. 일부 양태에서, 단일 용량은 동시에 제조된 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 또는 이들 사이의 임의의 수의 용량 중 하나이다. 일부 양태에서, 조성물이 자가조직 세포 또는 동종이계 세포인 경우, 용량은 세포가 질환 또는 장애를 치료하기에 충분한 시간 동안 생착 및/또는 지속하기에 충분한 양이다.

일 예에서, 본 개시내용은 단백질 스캐폴드를 포함하는 조성물 또는 단백질 스캐폴드(예컨대, scFv, 단일 도메인 항체, 센티린)를 포함하는 CAR을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 항체 또는 CAR은 종양 세포 상의 항원에 특이적으로 결합한다. 조성물이 변형된 세포 또는 세포 집단을 포함하는 양태에서, 세포 또는 세포 집단은 자가조직 또는 동종이계일 수 있다.

본원에 기재된 치료 방법의 일부 양태에서, 치료는 변형되거나 종료될 수 있다. 구체적으로, 치료에 사용되는 조성물이 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드를 포함하는 양태에서, 아폽토시스는 세포를 유도제와 접촉시킴으로써 세포에서 선택적으로 유도될 수 있다. 치료는, 예를 들어, 회복의 징후 또는 질환 중증도/진행의 감소 징후, 질환 완화/중단의 징후, 및/또는 부정적인 사건의 발생에 대한 응답으로 변형되거나 종료될 수 있다. 일부 양태에서, 방법은 유도제의 억제제를 투여하여 세포 요법의 변형을 억제함으로써 세포 요법의 기능 및/또는 효능을 회복시키는 단계를 포함한다(예를 들어, 질병의 징후 또는 증상이 다시 나타나거나 중증도의 증가 및/또는 부정적인 사건이 해결되는 경우).

단백질 스캐폴드 생산, 스크리닝 및 정제

본 개시내용의 적어도 하나의 단백질 스캐폴드(예컨대, 단클론 항체, 키메라 항체, 단일 도메인 항체, VHH, VH, 단일 사슬 가변 단편(scFv), 센티린, 항원-결합 단편(Fab) 또는 Fab 단편)는 선택적으로 당업계에 널리 알려진 바와 같은 세포주, 혼합된 세포주, 불멸화된 세포 또는 불멸화된 세포의 클론 집단에 의해 생산될 수 있다. 예컨대, 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)]을 참고한다.

단백질 스캐폴드로부터의 아미노산은 면역원성을 감소시키거나 결합, 친화성, 온-속도, 오프-속도, 결합력, 특이성, 반감기, 안정성, 용해도 또는 당업계에 공지된 바와 같은 임의의 다른 적합한 특징을 감쇠, 향상 또는 변형시키기 위해 변경, 부가 및/또는 결실될 수 있다.

선택적으로, 단백질 스캐폴드는 항원에 대한 높은 친화성 및 다른 유리한 생물학적 특성을 유지하도록 조작될 수 있다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 스캐폴드 단백질은 선택적으로 부모 및 조작된 서열의 3차원 모델을 사용하여 부모 서열 및 다양한 개념적 조작된 생성물의 분석 과정에 의해 제조될 수 있다. 3차원 모델이 일반적으로 이용가능하며, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 예시하고 표시하며 가능한 면역원성을 측정할 수 있는 컴퓨터 프로그램(예컨대, 캘리포니아 몬로비아의 Xencor사의 Immunofilter 프로그램)이 이용가능하다. 이러한 디스플레이의 검사는 후보 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 그의 항원에 결합하는 후보 단백질 스캐폴드의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, 표적 항원(들)에 대한 친화성과 같은 원하는 특징이 달성되도록 부모 및 참조 서열로부터 잔기가 선택되고 조합될 수 있다. 대안적으로, 또는 상기 절차에 부가적으로, 다른 적합한 조작 방법이 사용될 수 있다.

단백질 스캐폴드를 유사한 단백질 또는 단편에 대한 특이적 결합에 대해 스크리닝하는 것은 뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA 디스플레이) 또는 펩타이드 디스플레이 라이브러리, 예를 들어, 시험관내 디스플레이를 사용하여 편리하게 달성될 수 있다. 이러한 방법은 원하는 기능 또는 구조를 갖는 개별 구성원에 대한 많은 펩타이드 집합의 스크리닝을 포함한다. 디스플레이된 뉴클레오타이드 또는 펩타이드 서열은 3 내지 5000개 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 길이, 빈번하게는 5-100개의 아미노산 길이, 및 종종 약 8 내지 25개의 아미노산 길이일 수 있다. 펩타이드 라이브러리를 생성하기 위한 직접적인 화학적 합성 방법 외에도, 몇 가지 재조합 DNA 방법이 기재되었다. 한 가지 유형은 박테리오파아지 또는 세포의 표면 상에 펩타이드 서열의 디스플레이를 포함한다. 각 박테리오파아지 또는 세포는 특정 디스플레이된 펩타이드 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 이러한 방법은 PCT 특허 공개 WO 제91/17271호, WO 제91/18980호, WO 제91/19818호, 및 WO 제93/08278호에 기재되어 있다.

펩타이드의 라이브러리를 생성하기 위한 다른 시스템은 시험관내 화학적 합성 및 재조합 방법 모두의 양태를 갖는다. PCT 특허 공개 WO 제92/05258호, WO 제92/14843호, 및 WO 제96/19256호를 참고한다. 또한, 미국 특허 제5,658,754호; 및 제5,643,768호를 참고한다. 펩타이드 디스플레이 라이브러리, 벡터, 및 스크리닝 키트는 Invitrogen(Carlsbad, Calif.), 및 Cambridge Antibody Technologies(Cambridgeshire, UK)와 같은 공급업체로부터 상업적으로 이용가능하다. 예컨대, Enzon에 양도된 미국 특허 제4,704,692호, 제4,939,666호, 제4,946,778호, 제5,260,203호, 제5,455,030호, 제5,518,889호, 제5,534,621호, 제5,656,730호, 제5,763,733호, 제5,767,260호, 제5856456호; Dyax에 양도된 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,571,698호, 제5,837,500호, Affymax에 양도된 제5,427,908호, 제5,580,717호; Cambridge Antibody Technologies에 양도된 제5,885,793호; Genentech에 양도된 제5,750,373호, 상기 Xoma, Colligan에 양도된 제5,618,920호, 제5,595,898호, 제5,576,195호, 제5,698,435호, 제5,693,493호, 제5,698,417호; 상기 Ausubel; 또는 상기 Sambrook을 참고한다.

본 개시내용의 단백질 스캐폴드는 광범위한 친화성(KD)으로 인간 또는 다른 포유동물 단백질에 결합할 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 개시내용의 적어도 하나의 단백질 스캐폴드는 높은 친화성으로, 예를 들어, 당업자에 의해 실시되는 바와 같이 표면 플라즈몬 공명 또는 Kinexa 방법에 의해 결정된 바와 같이, 약 10^-7 M 이하의 KD, 예컨대 비제한적으로, 0.1-9.9(또는 이 안의 임의의 범위 또는 값) X 10^-8, 10^-9, 10^-10, 10^-11, 10^-12, 10^-13, 10^-14, 10^-15 또는 이 안의 임의의 범위 또는 값으로 표적 단백질에 선택적으로 결합할 수 있다.

항원에 대한 단백질 스캐폴드의 친화성 또는 결합력은 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다(예를 들어, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); 및 본원에 기재된 방법 참조). 특정 단백질 스캐폴드-항원 상호작용의 측정된 친화성은 상이한 조건(예컨대, 염 농도, pH) 하에 측정되는 경우 달라질 수 있다. 따라서, 친화성 및 다른 항원-결합 매개변수(예컨대, KD, Kon, Koff)의 측정은 바람직하게는 단백질 스캐폴드 및 항원의 표준화된 용액, 및 본원에 기재된 완충제와 같은 표준화된 완충제로 이루어진다.

경쟁 분석은 어떤 단백질, 항체, 및 다른 길항제가 표적 단백질에의 결합에 대해 단백질 스캐폴드와 경쟁하는지 및/또는 에피토프 영역을 공유하는지 결정하기 위해 단백질 스캐폴드를 이용하여 수행될 수 있다. 당업자에게 쉽게 공지된 이러한 분석은 단백질 상의 제한된 수의 결합 부위에 대한 길항제 또는 리간드 사이의 경쟁을 평가한다. 단백질 및/또는 항체는 경쟁 전 또는 후에 고정되거나 불용화되고, 표적 단백질에 결합된 샘플은, 예를 들어, 경사분리(decanting)에 의해(단백질/항체가 사전에 불용화된 경우) 또는 원심분리에 의해(단백질/항체가 경쟁적 반응 후에 침전된 경우) 결합되지 않은 샘플로부터 분리된다. 또한, 경쟁적 결합은 표적 단백질에 대한 단백질 스캐폴드의 결합 또는 결합 부족에 의해 기능이 변경되는지 여부, 예컨대, 단백질 스캐폴드가, 예를 들어, 표지의 효소 활성을 억제하거나 강화하는지 여부에 의해 결정될 수 있다. ELISA 및 다른 기능 분석이 당업계에 잘 알려진 바와 같이 사용될 수 있다.

핵산 분자

단백질 스캐폴드를 코딩하는 본 개시내용의 핵산 분자는 mRNA, hnRNA, tRNA 또는 임의의 다른 형태와 같은 RNA의 형태, 또는 비제한적으로, 클로닝에 의해 수득되거나 합성적으로 생산된 cDNA 및 게놈 DNA를 포함하는 DNA의 형태, 또는 임의의 조합일 수 있다. DNA는 삼중 가닥, 이중 가닥 또는 단일 가닥, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. DNA 또는 RNA의 적어도 하나의 가닥의 임의의 부분은 센스 가닥으로도 알려진 코딩 가닥일 수 있거나, 안티센스 가닥으로도 지칭되는 비코딩 가닥일 수 있다.

본 개시내용의 단리된 핵산 분자는 선택적으로, 하나 이상의 인트론, 예컨대, 비제한적으로, 적어도 하나의 단백질 스캐폴드의 적어도 하나의 특정 부분과 함께, 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 핵산 분자; 표적 단백질에 결합하는 단백질 스캐폴드 또는 루프 영역에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 유전적 코드의 축퇴성으로 인해, 본원에 기재된 바와 같은 및/또는 당업계에 공지된 바와 같은 단백질 스캐폴드를 여전히 코딩하는 상기 기재된 것과 실질적으로 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 물론, 유전적 코드는 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 본 개시내용의 특정 단백질 스캐폴드를 코딩하는 이러한 축퇴성 핵산 변이체를 생성하는 것은 당업자에게 일상적일 것이다. 예컨대, 상기 문헌[Ausubel, et al.]을 참고하며, 이러한 핵산 변이체는 본 개시내용에 포함된다.

본원에 표시된 바와 같이, 단백질 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 본 개시내용의 핵산 분자는, 비제한적으로, 그 자체로 단백질 스캐폴드 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 것; 전체 단백질 스캐폴드 또는 이의 일부에 대한 코딩 서열; 단백질 스캐폴드, 단편 또는 일부에 대한 코딩 서열뿐만 아니라 전사, 스플라이싱을 포함하는 mRNA 가공 및 폴리아데닐화 신호(예를 들어, mRNA의 리보솜 결합 및 안정성)에서 역할을 하는 전사된 비번역된 서열과 같은 비코딩 5' 및 3' 서열을 비제한적으로 포함하는 추가의 비코딩 서열과 함께, 적어도 하나의 인트론과 같은 전술한 추가의 코딩 서열을 갖거나 갖지 않는 적어도 하나의 신호 리더 또는 융합 펩타이드에 대한 코딩 서열과 같은 추가의 서열; 추가의 기능을 제공하는 것과 같은 추가의 아미노산을 코딩하는 추가의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 단백질 스캐폴드를 코딩하는 서열은 마커 서열, 예컨대 단백질 스캐폴드 단편 또는 일부를 포함하는 융합된 단백질 스캐폴드의 정제를 촉진하는 펩타이드를 코딩하는 서열에 융합될 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드에 선택적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드

본 개시내용은 선택적 혼성화 조건 하에서 본원에 개시된 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 단리된 핵산을 제공한다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드는 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 단리, 검출, 및/또는 정량화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 기탁된 라이브러리에서 부분적인 또는 전장 클론을 확인, 단리 또는 증폭하는 데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 인간 또는 포유동물 핵산 라이브러리로부터 단리되거나 이에 상보적인 게놈 또는 cDNA 서열일 수 있다.

바람직하게는, cDNA 라이브러리는 적어도 80% 전장 서열, 바람직하게는, 적어도 85% 또는 90% 전장 서열, 및, 더욱 바람직하게는, 적어도 95% 전장 서열을 포함한다. cDNA 라이브러리는 희귀 서열의 표현을 증가시키기 위해 정규화될 수 있다. 낮거나 중간 정도의 엄격성 혼성화 조건은 전형적으로 상보적인 서열에 비해 감소된 서열 동일성을 갖는 서열과 함께 사용되지만 이에 국한되지 않는다. 중간 정도 및 높은 엄격성 조건은 더 큰 동일성의 서열에 대해 선택적으로 사용될 수 있다. 낮은 엄격성 조건은 약 70% 서열 동일성을 갖는 서열의 선택적 혼성화를 허용하며 이종상동성(orthologous) 또는 유사(paralogous) 서열을 확인하는 데 사용될 수 있다.

선택적으로, 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 단백질 스캐폴드의 적어도 일부를 코딩할 것이다. 폴리뉴클레오타이드는 본 개시내용의 단백질 스캐폴드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대한 선택적 혼성화에 사용될 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 예컨대, 상기 Ausubel; 상기 Colligan을 참고하며, 각각은 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.

핵산의 제작

본 개시내용의 단리된 핵산은 당업계에 널리 공지된 바와 같이 (a) 재조합 방법, (b) 합성 기술, (c) 정제 기술, 및/또는 (d) 이의 조합을 사용하여 제조될 수 있다.

핵산은 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 외의 서열을 편리하게 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하는 다중 클로닝 부위는 폴리뉴클레오타이드의 단리를 돕기 위해 핵산 내로 삽입될 수 있다. 또한, 번역가능한 서열은 본 개시내용의 번역된 폴리뉴클레오타이드의 단리를 돕기 위해 삽입될 수 있다. 예를 들어, 헥사-히스티딘 마커 서열은 본 개시내용의 단백질을 정제하기 위한 편리한 수단을 제공한다. 코딩 서열을 제외한 본 개시내용의 핵산은 선택적으로 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어댑터, 또는 링커이다.

클로닝 및/또는 발현에서 기능을 최적화하기 위해, 폴리뉴클레오타이드의 단리를 돕기 위해, 또는 폴리뉴클레오타이드의 세포 내로의 도입을 개선하기 위해 추가의 서열이 이러한 클로닝 및/또는 발현 서열에 첨가될 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터, 및 링커의 사용은 당업계에 널리 알려져 있다(예컨대, 상기 Ausubel; 또는 상기 Sambrook 참고).

핵산을 제작하기 위한 재조합 방법

본 개시내용의 단리된 핵산 조성물, 예컨대 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 또는 이의 임의의 조합은 당업자에게 공지된 많은 클로닝 방법을 사용하여 생물학적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 양태에서, 엄격한 조건 하에 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드에 선택적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드 프로브가 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 원하는 서열을 확인하는 데 사용된다. RNA의 단리, 및 cDNA 및 게놈 라이브러리의 제작은 당업자에게 널리 알려져 있다(예컨대, 상기 Ausubel; 또는 상기 Sambrook 참고).

핵산 스크리닝 및 단리 방법

cDNA 또는 게놈 라이브러리는 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드의 서열에 기초한 프로브를 사용하여 스크리닝될 수 있다. 프로브는 게놈 DNA 또는 cDNA 서열과 혼성화하여 동일하거나 상이한 유기체에서 상동 유전자를 단리하는 데 사용될 수 있다. 당업자는 다양한 정도의 혼성화 엄격성이 분석에서 사용될 수 있음을 이해할 것이며; 혼성화 또는 세척 매질은 엄격할 수 있다. 혼성화 조건이 더욱 엄격해짐에 따라, 이합체 형성이 일어나기 위해서는 프로브 및 표적 사이에 더 큰 상보성 정도가 있어야 한다. 엄격성 정도는 온도, 이온 강도, pH 및 포름아미드와 같은 부분적으로 변성하는 용매의 존재 중 하나 이상에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 혼성화 엄격성은, 예를 들어, 포름아미드의 농도를 0% 내지 50%의 범위 내로 조작하는 것을 통해 반응 용액의 극성을 변경함으로서 편리하게 달라진다. 검출가능한 결합에 필요한 상보성(서열 동일성)의 정도는 혼성화 매질 및/또는 세척 매질의 엄격성에 따라 달라질 것이다. 상보성 정도는 최적으로 100%, 또는 70-100%, 또는 이 안의 임의의 범위 또는 값일 것이다. 그러나, 프로브 및 프라이머 내의 사소한 서열 변이는 혼성화 및/또는 세척 매질의 엄격성을 감소시킴으로써 보상될 수 있음을 이해해야 한다.

RNA 또는 DNA의 증폭 방법은 당업계에 널리 알려져 있으며, 본원에 제시된 교시 및 지침에 기초하여 과도한 실험 없이 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다.

DNA 또는 RNA 증폭의 공지된 방법은, 비제한적으로, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 관련 증폭 과정(예컨대, Mullis, et al의 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 제4,800,159호, 제4,965,188호; Tabor, et al의 제4,795,699호 및 제4,921,794호; Innis의 제5,142,033호; Wilson, et al의 제5,122,464호; Innis의 제5,091,310호; Gyllensten, et al의 제5,066,584호; Gelfand, et al의 제4,889,818호; Silver, et al의 제4,994,370호; Biswas의 제4,766,067호; Ringold의 제4,656,134호 참고) 및 이중 가닥의 DNA 합성을 위한 주형으로서 표적 서열에 대한 안티센스 RNA를 사용하는 RNA 매개 증폭(Malek, et al의 미국 특허 제5,130,238호, 상표명 NASBA를 가짐)을 포함하며, 이들 문헌의 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다(예컨대, 상기 Ausubel; 또는 상기 Sambrook 참고)

예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술은 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 직접 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 및 관련 유전자의 서열을 증폭하는 데 사용될 수 있다. PCR 및 다른 시험관내 증폭 방법은 또한, 예를 들어, 발현될 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 클로닝하는데, 샘플에서 원하는 mRNA의 존재를 검출하기 위한 프로브로서 사용하기 위한 핵산을 제조하는데, 핵산 시퀀싱을 위해, 또는 다른 목적을 위해 유용할 수 있다. 시험관내 증폭 방법을 통해 숙련자를 지시하기에 충분한 기술의 예는 문헌[상기 Berger, 상기 Sambrook, 및 상기 Ausubel 뿐만 아니라 Mullis, et al., 미국 특허 제4,683,202 (1987); 및 Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif.(1990)]에서 발견된다. 게놈 PCR 증폭을 위한 상업적으로 이용가능한 키트는 당업계에 알려져 있다. 예컨대, Advantage-GC 게놈 PCR 키트(Clontech)를 참고한다. 추가로, 예컨대, T4 유전자 32 단백질(Boehringer Mannheim)이 긴 PCR 생성물의 수율을 개선하는 데 사용될 수 있다.

핵산을 제작하기 위한 합성 방법

본 개시내용의 단리된 핵산은 또한 공지된 방법에 의해 직접 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다(예컨대, 상기 Ausubel, et al 참고). 화학적 합성은 일반적으로 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드를 생산하며, 이는 상보적 서열과의 혼성화에 의해, 또는 주형으로서 단일 가닥을 사용하는 DNA 중합효소를 이용한 중합에 의해 이중 가닥의 DNA로 전환될 수 있다. 당업자는 DNA의 화학적 합성이 약 100개 이상의 염기의 서열로 제한될 수 있지만, 더 긴 서열이 더 짧은 서열의 결찰에 의해 수득될 수 있음을 인식할 것이다.

재조합 발현 카세트

본 개시내용은 본 개시내용의 핵산을 포함하는 재조합 발현 카세트를 추가로 제공한다. 본 개시내용의 핵산 서열, 예를 들어, 본 개시내용의 단백질 스캐폴드를 코딩하는 cDNA 또는 게놈 서열은 적어도 하나의 원하는 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 재조합 발현 카세트를 제작하는 데 사용될 수 있다. 재조합 발현 카세트는 전형적으로 의도된 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 전사를 지시할 전사 개시 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 것이다. 이종 및 비이종(즉, 내인성) 프로모터 모두가 본 개시내용의 핵산의 발현을 지시하는 데 사용될 수 있다.

일부 양태에서, 프로모터, 인핸서, 또는 다른 요소로서 작용하는 단리된 핵산이 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 상향 또는 하향 조절하기 위해 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드의 비이종 형태의 적절한 위치에(상류, 하류 또는 인트론 내에) 도입될 수 있다. 예를 들어, 내인성 프로모터는 돌연변이, 결실 및/또는 치환에 의해 생체내 또는 시험관내에서 변경될 수 있다.

발현 벡터 및 숙주 세포

본 개시내용은 또한 본 개시내용의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 재조합 벡터로 유전적으로 조작된 숙주 세포, 및 당업계에 널리 공지된 바와 같은 재조합 기술에 의한 적어도 하나의 단백질 스캐폴드의 생산에 관한 것이다. 예컨대, 상기 Sambrook, et al; 상기 Ausubel, et al을 참고하며, 이들 각각은 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다.

폴리뉴클레오타이드는 숙주에서 증식을 위한 선택 마커를 함유하는 벡터에 선택적으로 연결될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 인산 칼슘 침전물과 같은 침전물에, 또는 하전된 지질과의 복합체에 도입된다. 벡터가 바이러스인 경우, 그것은 적절한 패키징 세포주를 사용하여 시험관내에서 패키징된 다음 숙주 세포 내로 형질도입될 수 있다.

DNA 삽입물은 적절한 프로모터에 작동가능하게 연결되어야 한다. 발현 구조체는 전사 개시, 종결을 위한 부위 및, 전사된 영역에서, 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 추가로 함유할 것이다. 구조체에 의해 발현되는 성숙한 전사체의 코딩 부분은 바람직하게는 시작에서 번역 개시 및 번역될 mRNA의 말단에 적절하게 위치한 종결 코돈(예컨대, UAA, UGA 또는 UAG)을 포함할 것이며, UAA 및 UAG가 포유동물 또는 진핵 세포 발현에 바람직하다.

발현 벡터는 바람직하게는 그러나 선택적으로 적어도 하나의 선택 마커를 포함할 것이다. 이러한 마커는, 예컨대, 비제한적으로, 암피실린, 제오신(Sh bla 유전자), 푸로마이신(pac 유전자), 하이그로마이신 B(hygB 유전자), G418/제네티신(neo 유전자), DHFR(디하이드로폴레이트 환원효소를 코딩하고 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여함), 미코페놀산, 또는 글루타민 합성효소(GS, 미국 특허 제5,122,464호; 제5,770,359호; 제5,827,739호), 블라스티시딘(bsd 유전자), 진핵 세포 배양에 대한 내성 유전자뿐만 아니라 암피실린, 제오신(Sh bla 유전자), 푸로마이신(pac 유전자), 하이그로마이신 B(hygB 유전자), G418/제네티신(neo 유전자), 카나마이신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 카르베니실린, 블레오마이신, 에리트로마이신, 폴리믹신 B, 또는 E. coli 및 다른 박테리아 또는 원핵생물에서 배양하기 위한 테트라사이클린 내성 유전자를 포함한다(상기 특허는 전체적으로 참조로 본원에 포함됨). 전술한 숙주 세포를 위한 적절한 배양 배지 및 조건은 당업계에 공지되어 있다. 적합한 벡터는 당업자에게 쉽게 명백할 것이다. 숙주 세포 내로 벡터 구조체의 도입은 인산 칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질 매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염 또는 다른 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법은 상기 Sambrook, 1-4 및 16-18장; 상기 Ausubel, 1, 9, 13, 15, 16장과 같이 당업계에 기재되어 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 그러나 선택적으로 본 개시내용의 조성물 및 방법에 의해 변형된 세포의 단리를 위한 적어도 하나의 선택가능한 세포 표면 마커를 포함할 것이다. 본 개시내용의 선택가능한 세포 표면 마커는 세포 또는 세포의 서브세트를 세포의 또 다른 정의된 서브세트와 구별하는 표면 단백질, 당단백질, 또는 단백질의 그룹을 포함한다. 바람직하게는 선택가능한 세포 표면 마커는 본 개시내용의 조성물 또는 방법에 의해 변형된 세포를 본 개시내용의 조성물 또는 방법에 의해 변형되지 않은 세포와 구별한다. 이러한 세포 표면 마커는, 예컨대, 비제한적으로, CD19, CD271, CD34, CD22, CD20, CD33, CD52, 또는 임의의 이의 조합의 절단된 또는 전장 형태와 같은 "지정 클러스터(cluster of designation)" 또는 "분류 결정자(classification determinant)" 단백질(종종 "CD"로 약칭됨)을 포함한다. 세포 표면 마커는 자살 유전자 마커 RQR8을 추가로 포함한다(Philip B et al. Blood. 2014 Aug 21; 124(8):1277-87).

발현 벡터는 바람직하게는 그러나 선택적으로 본 개시내용의 조성물 및 방법에 의해 변형된 세포의 단리를 위한 적어도 하나의 선택가능한 약물 내성 마커를 포함할 것이다. 본 개시내용의 선택가능한 약물 내성 마커는 야생형 또는 돌연변이체 Neo, DHFR, TYMS, FRANCF, RAD51C, GCS, MDR1, ALDH1, NKX2.2, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

본 개시내용의 적어도 하나의 단백질 스캐폴드는 융합 단백질과 같은 변형된 형태로 발현될 수 있고, 분비 신호뿐만 아니라 추가의 이종 기능 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가의 아미노산, 특히 하전된 아미노산의 영역은 정제 동안, 또는 후속 취급 및 저장 동안 숙주 세포에서 안정성 및 지속성을 개선하기 위해 단백질 스캐폴드의 N-말단에 추가될 수 있다. 또한, 펩타이드 모이어티는 정제를 촉진하기 위해 본 개시내용의 단백질 스캐폴드에 첨가될 수 있다. 이러한 영역은 단백질 스캐폴드 또는 이의 적어도 하나의 단편의 최종 제조 전에 제거될 수 있다. 이러한 방법은 상기 Sambrook, 17.29-17.42 및 18.1-18.74장; 상기 Ausubel, 16, 17 및 18장과 같이 많은 표준 실험실 매뉴얼에 기재되어 있다.

당업자는 본 개시내용의 단백질을 코딩하는 핵산의 발현에 이용가능한 수많은 발현 시스템을 잘 안다. 대안적으로, 본 개시내용의 핵산은 본 개시내용의 단백질 스캐폴드를 코딩하는 내인성 DNA를 함유하는 숙주 세포에서 켜짐으로써(조작에 의해) 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 이러한 방법은, 예컨대, 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있는 미국 특허 제5,580,734호, 제5,641,670호, 제5,733,746호, 및 제5,733,761호에 기재된 바와 같이 당업계에 널리 알려져 있다.

단백질 스캐폴드, 이의 특정 부분 또는 변이체의 생산에 유용한 세포 배양의 예시는 당업계에 알려진 바와 같은 박테리아, 효모, 및 포유동물 세포이다. 포유동물 세포 시스템은 종종 세포의 단층 형태일 것이지만 포유동물 세포 현탁액 또는 생물반응기가 또한 사용될 수 있다. 온전한 글리코실화된 단백질을 발현할 수 있는 많은 적합한 숙주 세포주가 당업계에서 개발되었고, 이는 COS-1(예컨대, ATCC CRL 1650), COS-7(예컨대, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21(예컨대, ATCC CRL-10), CHO(예컨대, ATCC CRL 1610) 및 BSC-1(예컨대, ATCC CRL-26) 세포주, Cos-7 세포, CHO 세포, hep G2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, 293 세포, HeLa 세포 등을 포함하며, 이는 예를 들어, American Type Culture Collection, Manassas, Va.(www.atcc.org)로부터 쉽게 이용가능하다. 바람직한 숙주 세포는 림프계 기원의 세포, 예컨대 골수종 및 림프종 세포를 포함한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 P3X63Ag8.653 세포(ATCC 등록번호 CRL-1580) 및 SP2/0-Ag14 세포(ATCC 등록번호 CRL-1851)이다. 바람직한 양태에서, 재조합 세포는 P3X63Ab8.653 또는 SP2/0-Ag14 세포이다.

이들 세포를 위한 발현 벡터는 하기 발현 제어 서열, 예컨대, 비제한적으로, 복제 원점; 프로모터(예컨대, 후기 또는 초기 SV40 프로모터, CMV 프로모터(미국 특허 제5,168,062호; 제5,385,839호), HSV tk 프로모터, pgk(phosphoglycerate kinase) 프로모터, EF-1 알파 프로모터(미국 특허 제5,266,491호), 적어도 하나의 인간 프로모터; 인핸서, 및/또는 가공 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위(예컨대, SV40 대형 T Ag 폴리 A 부가 부위), 및 전사 종결자 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 Ausubel et al; 상기 Sambrook, et al을 참고한다. 본 개시내용의 핵산 또는 단백질의 생산에 유용한 다른 세포는 공지되어 있고/거나, 예를 들어, American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas(www.atcc.org) 또는 다른 공지된 또는 상업적인 출처로부터 이용가능하다.

진핵 숙주 세포가 사용되는 경우, 폴리아데닐화 또는 전사 종결자 서열이 전형적으로 벡터 내로 혼입된다. 종결자 서열의 예는 소 성장 호르몬 유전자로부터의 폴리아데닐화 서열이다. 전사체의 정확한 스플라이싱을 위한 서열도 포함될 수 있다. 스플라이싱 서열의 예는 SV40으로부터의 VP1 인트론이다(Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781(1983)). 추가로, 숙주 세포에서 복제를 제어하기 위한 유전자 서열이 당업계에 공지된 바와 같이 벡터 내로 혼입될 수 있다.

단백질 스캐폴드 정제

단백질 스캐폴드는, 비제한적으로, 단백질 A 정제, 황산 암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 잘 알려진 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")가 또한 정제에 사용될 수 있다. 예컨대, 각각 전체가 참조로 본원에 포함된 문헌[Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), 예컨대, 1, 4, 6, 8, 9, 10장]을 참고한다.

본 개시내용의 단백질 스캐폴드는 정제된 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물, 및, 예를 들어, E. coli, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물을 포함한다. 재조합 생산 절차에 사용된 숙주 세포에 따라, 본 개시내용의 단백질 스캐폴드는 글리코실화될 수 있거나 글리코실화되지 않을 수 있다. 이러한 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼, 예컨대 상기 Sambrook, 섹션 17.37-17.42; 상기 Ausubel, 10, 12, 13, 16, 18 및 20장, 상기 Colligan, Protein Science, 12-14장에 기재되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.

아미노산 코드

본 개시내용의 단백질 스캐폴드를 구성하는 아미노산은 종종 약칭된다. 아미노산 지정은 당업계에서 널리 이해되는 바와 같이 아미노산을 그의 단일 글자 코드, 그의 세 글자 코드, 이름, 또는 3개의 뉴클레오타이드 코돈(들)에 의해 지정함으로써 표시될 수 있다(Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994 참고). 본 개시내용의 단백질 스캐폴드는 본원에 명시된 바와 같이 자발적 또는 돌연변이 및/또는 인간 조작으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 기능에 필수적인 본 개시내용의 단백질 스캐폴드 내의 아미노산은 부위 지정 돌연변이유발 또는 알라닌 스캐닝 돌연변이유발과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 확인될 수 있다(예컨대, 상기 Ausubel, 8, 15장; Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085(1989)). 후자의 절차는 분자 내의 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 이후, 생성된 돌연변이체 분자는, 비제한적으로, 적어도 하나의 중화 활성과 같은 생물학적 활성에 대해 시험된다. 단백질 스캐폴드 결합에 중요한 부위는 또한 결정화, 핵 자기 공명 또는 광친화성 표지화와 같은 구조적 분석에 의해 확인될 수 있다(Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904(1992) 및 de Vos, et al., Science 255:306-312(1992)).

당업자가 인식하는 바와 같이, 본 개시내용은 본 개시내용의 적어도 하나의 생물학적 활성 단백질 스캐폴드를 포함한다. 생물학적 활성 단백질 스캐폴드는 천연(비합성), 내인성 또는 관련되고 알려진 단백질 스캐폴드의 비활성의 적어도 20%, 30%, 또는 40%, 및, 바람직하게는, 적어도 50%, 60%, 또는 70%, 및, 가장 바람직하게는, 적어도 80%, 90%, 또는 95%-99% 이상의 비활성을 갖는다. 효소 활성 및 기질 특이성의 측정값을 분석하고 정량화하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 유기 모이어티의 공유 부착에 의해 변형된 본원에 기재된 바와 같은 단백질 스캐폴드 및 단편에 관한 것이다. 이러한 변형은 개선된 약동학적 특성(예컨대, 증가된 생체내 혈청 반감기)를 갖는 단백질 스캐폴드 단편을 생산할 수 있다. 유기 모이어티는 선형 또는 분지형 친수성 중합체성 그룹, 지방산 그룹, 또는 지방산 에스테르 그룹일 수 있다. 특정 양태에서, 친수성 중합체성 그룹은 약 800 내지 약 120,000 달톤의 분자량을 가질 수 있고, 폴리알칸 글리콜(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG)), 탄수화물 중합체, 아미노산 중합체 또는 폴리비닐 피롤리돈일 수 있으며, 지방산 또는 지방산 에스테르 그룹은 약 8 내지 약 40개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.

본 개시내용의 변형된 단백질 스캐폴드 및 단편은 항체에 직접 또는 간접적으로 공유 결합된 하나 이상의 유기 모이어티를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 단백질 스캐폴드 또는 단편에 결합된 각각의 유기 모이어티는 독립적으로 친수성 중합체성 그룹, 지방산 그룹 또는 지방산 에스테르 그룹일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "지방산"은 모노-카르복실산 및 디-카르복실산을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "친수성 중합체성 그룹"은 옥탄보다 물에서 더 잘 용해되는 유기 중합체를 지칭한다. 예를 들어, 폴리리신은 옥탄보다 물에서 더 잘 용해된다. 따라서, 폴리리신의 공유 부착에 의해 변형된 단백질 스캐폴드는 본 개시내용에 의해 포함된다. 본 개시내용의 단백질 스캐폴드를 변형시키는 데 적합한 친수성 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 예를 들어, 폴리알칸 글리콜(예컨대, PEG, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜(mPEG), PPG 등), 탄수화물(예컨대, 덱스트란, 셀룰로오스, 올리고당, 다당류 등), 친수성 아미노산의 중합체(예컨대, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리아스파르테이트 등), 폴리알칸 옥사이드(예컨대, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드 등) 및 폴리비닐 피롤리돈을 포함한다. 바람직하게는, 본 개시내용의 단백질 스캐폴드를 변형하는 친수성 중합체는 별도의 분자 엔티티로서 약 800 내지 약 150,000 달톤의 분자량을 갖는다. 예를 들어, PEG5000 및 PEG20,000이 사용될 수 있으며, 여기서 아래 첨자는 중합체의 평균 분자량 달톤이다. 친수성 중합체성 그룹은 1 내지 약 6개의 알킬, 지방산 또는 지방산 에스테르 그룹으로 치환될 수 있다. 지방산 또는 지방산 에스테르 그룹으로 치환되는 친수성 중합체는 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 아민 그룹을 포함하는 중합체는 지방산 또는 지방산 에스테르의 카르복실레이트에 결합될 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르 상의 활성화된 카르복실레이트(예컨대, N,N-카르보닐 디이미다졸로 활성화됨)는 중합체 상의 하이드록실 그룹에 결합될 수 있다.

본 개시내용의 단백질 스캐폴드를 변형하는 데 적합한 지방산 및 지방산 에스테르는 포화될 수 있거나 하나 이상의 불포화 단위를 함유할 수 있다. 본 개시내용의 단백질 스캐폴드를 변형하는 데 적합한 지방산은, 예를 들어, n-도데카노에이트(C12, 라우레이트), n-테트라데카노에이트(C14, 미리스테이트), n-옥타데카노에이트(C18, 스테아레이트), n-에이코사노에이트(C20, 아라키데이트), n-도코사노에이트(C22, 베헤네이트), n-트리아콘타노에이트(C30), n-테트라콘타노에이트(C40), cis-△9-옥타데카노에이트(C18, 올레에이트), 모든 시스-△5,8,11,14-에이코사테트라에노에이트(C20, 아라키도네이트), 옥탄디오산, 테트라데칸디오산, 옥타데칸디오산, 도코산디오산 등을 포함한다. 적합한 지방산 에스테르는 선형 또는 분지형 저급 알킬 그룹을 포함하는 디카르복실산의 모노-에스테르를 포함한다. 저급 알킬 그룹은 1 내지 약 12, 바람직하게는, 1 내지 약 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.

변형된 단백질 스캐폴드 및 단편은 적합한 방법을 사용하여, 예컨대 하나 이상의 변형제와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 "변형제"는 활성화 그룹을 포함하는 적합한 유기 그룹(예컨대, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)을 지칭한다. "활성화 그룹"은 적절한 조건 하에 제2 화학 그룹과 반응하여 변형제 및 제2 화학 그룹 사이에 공유 결합을 형성할 수 있는 화학적 모이어티 또는 작용기이다. 예를 들어, 아민 반응성 활성화 그룹은 친전자성 그룹, 예컨대 토실레이트, 메실레이트, 할로(클로로, 브로모, 플루오로, 아이오도), N-하이드록시석신이미딜 에스테르(NHS) 등을 포함한다. 티올과 반응할 수 있는 활성화 그룹은, 예를 들어, 말레이미드, 아이오도아세틸, 아크릴로일, 피리딜 디설파이드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올(TNB-티올) 등을 포함한다. 알데하이드 작용기는 아민 함유 또는 히드라지드 함유 분자에 결합될 수 있고, 아지드 그룹은 3가 포스포러스 그룹과 반응하여 포스포르아미데이트 또는 포스포르이미데이트 연결을 형성할 수 있다. 분자에 활성화 그룹을 도입하는 적합한 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif.(1996) 참고). 활성화 그룹은 유기 그룹(예컨대, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)에 직접 결합될 수 있거나, 또는 링커 모이어티, 예를 들어, 하나 이상의 탄소 원자가 산소, 질소 또는 황과 같은 헤테로원자에 의해 대체될 수 있는 2가 C1-C12 그룹을 통해 결합될 수 있다. 적합한 링커 모이어티는, 예를 들어, 테트라에틸렌 글리콜, ―(CH2)3―, ―NH―(CH2)6―NH―, ―(CH2)2―NH― 및 ―CH2―O―CH2―CH2―O―CH2―CH2―O―CH―NH―를 포함한다. 링커 모이어티를 포함하는 변형제는, 예를 들어, 모노-Boc-알킬디아민(예컨대, 모노-Boc-에틸렌디아민, 모노-Boc-디아미노헥산)을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)의 존재 하에 지방산과 반응시켜 유리 아민 및 지방산 카르복실레이트 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 생산될 수 있다. Boc 보호 그룹은 트리플루오로아세트산(TFA)으로 처리하여 기재된 바와 같이 또 다른 카르복실레이트에 결합될 수 있는 1차 아민을 노출시킴으로써 생성물로부터 제거될 수 있거나, 또는 말레익 무수물과 반응하여 생성된 생성물을 고리화하여 지방산의 활성화된 말레이미도 유도체를 생산할 수 있다(예를 들어, 이의 전체 교시가 본원에 참고로 포함된 Thompson, et al., WO 제92/16221호 참고)

본 개시내용의 변형된 단백질 스캐폴드는 단백질 스캐폴드 또는 단편을 변형제와 반응시킴으로써 생산될 수 있다. 예를 들어, 유기 모이어티는 아민 반응성 변형제, 예를 들어, PEG의 NHS 에스테르를 사용함으로써 비부위 특이적 방식으로 단백질 스캐폴드에 결합될 수 있다. 본 개시내용의 단백질 스캐폴드의 특정 부위에 결합된 유기 모이어티를 포함하는 변형된 단백질 스캐폴드 및 단편은 적합한 방법, 예컨대 역 단백질분해(Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153(1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417(1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241(1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68(1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463(1997)), 및 문헌[Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif.(1996)]에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

정의

본 개시내용 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a," "and," 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 복수의 이러한 방법을 포함하고 "용량"에 대한 언급은 하나 이상의 용량 및 당업자에게 알려진 이의 등가물 등에 대한 언급을 포함한다.

용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 값이 측정 또는 결정되는 방법, 예컨대, 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존한다. 예를 들어, "약"은 1 이상의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 또는 최대 10%, 또는 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 용어는 값의 10배 이내, 바람직하게는 5배 이내, 및 더욱 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구범위에 기재된 경우, 달리 언급되지 않는 한 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내를 의미하는 용어 "약"이 추정되어야 한다.

본 개시내용은 단리된 또는 실질적으로 정제된 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 조성물을 제공한다. "단리된" 또는 "정제된" 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 부분은 그의 자연발생 환경에서 발견되는 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질을 정상적으로 동반하거나 이와 상호작용하는 구성요소가 실질적으로 또는 본질적으로 없다. 따라서, 단리된 또는 정제된 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질은 재조합 기술에 의해 생산될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다. 최적으로, "단리된" 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드가 유래된 유기체의 게놈 DNA에서 폴리뉴클레오타이드에 자연적으로 측접하는 서열(최적으로는 단백질 코딩 서열)(즉, 폴리뉴클레오타이드의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열)이 없다. 예를 들어, 다양한 양태에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드가 유래된 세포의 게놈 DNA에서 폴리뉴클레오타이드에 자연적으로 측접하는 뉴클레오타이드 서열의 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 또는 0.1 kb 미만을 함유할 수 있다. 세포 물질이 실질적으로 없는 단백질은 약 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 1%(건조 중량) 미만의 오염 단백질을 갖는 단백질 제제를 포함한다. 본 개시내용의 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분이 재조합적으로 생산되는 경우, 최적으로 배양 배지는 화학적 전구체 또는 비단백질 관심 화학물질의 약 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 1%(건조 중량) 미만을 나타낸다.

본 개시내용은 개시된 DNA 서열 및 이들 DNA 서열에 의해 코딩된 단백질의 단편 및 변이체를 제공한다. 본 개시내용 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 용어 "단편"은 DNA 서열의 일부 또는 아미노산 서열의 일부 및 그에 따라 코딩되는 단백질을 지칭한다. 코딩 서열을 포함하는 DNA 서열의 단편은 천연 단백질의 생물학적 활성 및 이에 따라 본원에 기재된 바와 같은 표적 DNA 서열에 대한 DNA 인식 또는 결합 활성을 보유하는 단백질 단편을 코딩할 수 있다. 대안적으로, 혼성화 프로브로서 유용한 DNA 서열의 단편은 일반적으로 생물학적 활성을 유지하거나 프로모터 활성을 유지하지 않는 단백질을 코딩하지 않는다. 따라서, DNA 서열의 단편은 적어도 약 20개의 뉴클레오타이드, 약 50개의 뉴클레오타이드, 약 100개의 뉴클레오타이드, 및 본 개시내용의 최대 전장 폴리뉴클레오타이드 범위일 수 있다.

본 개시내용의 핵산 또는 단백질은 후속적으로 최종 목적지 벡터로 조립될 수 있는 표적 벡터에서 단량체 단위 및/또는 반복 단위를 사전 조립하는 것을 포함하는 모듈식 접근법에 의해 제작될 수 있다. 본 개시내용의 폴리펩타이드는 본 개시내용의 반복 단량체를 포함할 수 있고, 후속적으로 최종 목적지 벡터로 조립될 수 있는 표적 벡터에서 반복 단위를 사전 조립함으로써 모듈식 접근법에 의해 제작될 수 있다. 본 개시내용은 이 방법에 의해 생산된 폴리펩타이드뿐만 아니라 이들 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 본 개시내용은 이러한 모듈식 접근법에 의해 생산된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 숙주 유기체 및 세포를 제공한다.

용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 단일 단클론 항체(작용제 및 길항제 항체 포함) 및 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물을 포함한다. 또한 본원에 정의된 바와 같은 본원의 항체의 천연 또는 합성 유사체, 돌연변이체, 변이체, 대립유전자, 상동체 및 오르소로그(ortholog)(본원에서 집합적으로 "유사체"로 지칭됨)를 사용하는 것은 본원의 범위에 속한다. 따라서, 이의 양태에 따르면, 용어 "본원의 항체"는 가장 넓은 의미에서 또한 이러한 유사체를 포함한다. 일반적으로, 이러한 유사체에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 본원의 항체와 비교하여 대체, 결실 및/또는 부가될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 "항체 단편", 및 모든 문법적 변형은 온전한 항체의 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부로서 정의되며, 상기 일부는 온전한 항체의 Fc 영역의 불변 중쇄 도메인(즉, 항체 아이소타입에 따라 CH2, CH3, 및 CH4)이 없다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', Fab'- SH, F(ab')_2, 및 Fv 단편; 디아바디; 비제한적으로 (l) 단일-사슬 Fv(scFv) 분자, (2) 결합된 중쇄 모이어티 없이, 오직 하나의 경쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인의 3개의 CDR을 함유하는 이의 단편을 함유하는 단일 사슬 폴리펩타이드 및 (3) 결합된 경쇄 모이어티 없이, 오직 하나의 중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역의 3개의 CDR을 함유하는 이의 단편을 함유하는 단일 사슬 폴리펩타이드를 포함하는, 연속적인 아미노산 잔기의 하나의 중단되지 않은 서열로 구성되는 1차 구조를 갖는 폴리펩타이드인 임의의 항체 단편(본원에서 "단일-사슬 항체 단편" 또는 "단일 사슬 폴리펩타이드"로 지칭됨); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 또는 다가 구조를 포함한다. 하나 이상의 중쇄를 포함하는 항체 단편에서, 중쇄(들)는 온전한 항체의 비Fc 영역에서 발견되는 임의의 불변 도메인 서열(예컨대, IgG 아이소타입에서 CHI)을 함유할 수 있고/거나, 온전한 항체에서 발견되는 임의의 힌지 영역 서열을 함유할 수 있고/거나, 힌지 영역 서열 또는 중쇄(들)의 불변 도메인 서열에 융합되거나 위치하는 류신 지퍼 서열을 함유할 수 있다. 용어는 일반적으로 단일 단량체성 가변 항체 도메인(예를 들어, 낙타과로부터 유래)을 갖는 항체 단편을 지칭하는 단일 도메인 항체("sdAB")를 추가로 포함한다. 이러한 항체 단편 유형은 당업자에 의해 쉽게 이해될 것이다.

"결합"은 거대분자 사이의(예컨대, 단백질 및 핵산 사이의) 서열 특이적 비공유 상호작용을 지칭한다. 상호작용이 그 전체로서 서열 특이적인 한, 결합 상호작용의 모든 구성요소가 서열 특이적(예컨대, DNA 백본에서 포스페이트 잔기와의 접촉)일 필요는 없다.

용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만, 다른 요소를 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하는데 사용될 때 "본질적으로 구성되는"은 의도된 목적을 위해 사용될 때 조합에 임의의 본질적인 중요한 다른 요소를 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같이 요소로 본질적으로 구성되는 조성물은 미량의 오염물질 또는 불활성 담체를 배제하지 않을 것이다. "구성되는"은 다른 성분 및 실질적인 방법 단계의 미량을 초과하는 원소를 배제하는 것을 의미한다. 이러한 각각의 전환 용어에 의해 정의되는 양태는 본 개시내용의 범위 내에 속한다.

용어 "에피토프"는 폴리펩타이드의 항원 결정기를 지칭한다. 에피토프는 공간적 형태에 3개의 아미노산을 포함할 수 있고, 이는 에피토프에 고유하다. 일반적으로, 에피토프는 적어도 4, 5, 6, 또는 7개의 이러한 아미노산으로 구성되고, 보다 일반적으로, 적어도 8, 9, 또는 10개의 이러한 아미노산으로 구성된다. 아미노산의 공간적 형태를 결정하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속적으로 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA로부터 유래된 경우, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.

"유전자 발현"은 유전자에 함유된 정보를 유전자 생성물로 전환시키는 것을 지칭한다. 유전자 생성물은 유전자의 직접적인 전사 생성물(예컨대, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, shRNA, 마이크로 RNA, 구조적 RNA 또는 임의의 다른 유형의 RNA) 또는 mRNA의 번역에 의해 생산된 단백질일 수 있다. 유전자 생성물은 또한 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화, 및 편집과 같은 과정에 의해 변형된 RNA, 및, 예를 들어, 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화, 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.

유전자 발현의 "조절(Modulation 또는 regulation)"은 유전자의 활성의 변화를 지칭한다. 발현의 조절은, 비제한적으로, 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있다.

용어 "작동가능하게 연결된(operatively linked)" 또는 그의 균등물(예컨대, "작동가능하게 연결된(linked operatively)"은 2개 이상의 분자가 하나 또는 두 분자 또는 이의 조합에 기인하는 기능에 영향을 미치기 위해 상호작용할 수 있도록 서로에 대해 위치하는 것을 의미한다.

비공유 연결된 구성요소 및 비공유 연결된 구성요소의 제조 및 사용 방법이 개시되어 있다. 다양한 구성요소는 본원에 기재된 바와 같이 다양한 상이한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 비공유 연결된(즉, 작동가능하게 연결된) 단백질은 당업계의 하나 이상의 문제를 피하는 일시적인 상호작용을 허용하는 데 사용될 수 있다. 단백질과 같은 비공유 연결된 구성요소가 결합하고 해리하는 능력은 원하는 활성을 위해 이러한 결합이 필요한 상황에서만 또는 주로 이러한 상황에서 기능적 결합을 가능하게 한다. 연결은 원하는 효과를 허용하기에 충분한 기간일 수 있다.

단백질을 유기체의 게놈 내의 특정 유전자좌로 향하게 하는 방법이 개시된다. 방법은 DNA 국소화 구성요소를 제공하고 효과기 분자를 제공하는 단계를 포함할 수 있고, DNA 국소화 구성요소 및 효과기 분자는 비공유 연결을 통해 작동가능하게 연결될 수 있다.

용어 "scFv"는 단일 사슬 가변 단편을 지칭한다. scFv는 링커 펩타이드로 연결된 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 링커 펩타이드는 약 5 내지 40개의 아미노산 또는 약 10 내지 30개의 아미노산 또는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40개의 아미노산 길이일 수 있다. 단일 사슬 가변 단편은 완전한 항체 분자에서 발견되는 불변 Fc 영역이 없으므로, 항체를 정제하는 데 사용되는 공통 결합 부위(예컨대, 단백질 G)가 없다. 용어는 세포의 세포질에서 안정하고 세포내 단백질에 결합할 수 있는 항체인 인트라바디인 scFv를 추가로 포함한다.

용어 "단일 도메인 항체"는 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 단일 단량체성 가변 항체 도메인을 갖는 항체 단편을 의미한다. 단일 도메인 항체는 일반적으로 중쇄 항체, 또는 공통 IgG의 하나의 가변 도메인(VH)을 포함하는 약 110개의 아미노산 길이의 펩타이드 사슬이며, 이는 일반적으로 전체 항체와 유사한 항원에 대한 친화성을 갖지만, 더 내열성이고 세제 및 고농도의 요소에 대해 안정하다. 예는 낙타과 또는 생선 항체로부터 유래된 것이다. 대안적으로, 단일 도메인 항체는 4개의 사슬을 갖는 공통 쥣과 또는 인간 IgG로부터 제조될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "특이적으로 결합하는" 및 "특이적 결합"은 항체, 항체 단편 또는 나노바디가 상이한 항원의 균질한 혼합물에 존재하는 특정 항원에 우선적으로 결합하는 능력을 지칭한다. 일부 양태에서, 특이적 결합 상호작용은 샘플에서 바람직한 항원 및 바람직하지 않은 항원을 구별할 것이다. 일부 양태에서, 약 10 내지 100배 초과(예컨대, 약 1000배 또는 10,000배 초과). "특이성"은 나노바디와 같은 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편이 상이한 항원 표적에 비해 하나의 항원 표적에 우선적으로 결합하는 능력을 지칭하며, 반드시 높은 친화성을 의미하지 않는다.

"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합을 위한 충분한 조건이 존재한다면 결합 분자가 결합할 핵산의 부분을 정의하는 핵산 서열이다.

용어 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 함께 공유 결합된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 지칭한다. 단일 가닥의 묘사는 또한 상보적 가닥의 서열을 정의한다. 따라서, 핵산은 또한 묘사된 단일 가닥의 상보적 가닥을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 핵산은 또한 동일한 구조를 보유하거나 동일한 단백질을 코딩하는 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 상보체를 포함한다.

본 개시내용의 프로브는 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 서열에 혼성화할 수 있는 단일 가닥의 핵산을 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 핵산은 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화하는 프로브를 지칭할 수 있다.

본 개시내용의 핵산은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 본 개시내용의 핵산은 분자의 대부분이 단일 가닥인 경우에도 이중 가닥의 서열을 함유할 수 있다. 본 개시내용의 핵산은 분자의 대부분이 이중 가닥인 경우에도 단일 가닥의 서열을 함유할 수 있다. 본 개시내용의 핵산은 게놈 DNA, cDNA, RNA, 또는 이의 하이브리드를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오타이드의 조합을 함유할 수 있다. 본 개시내용의 핵산은 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 포함하는 염기의 조합을 함유할 수 있다. 본 개시내용의 핵산은 비천연 아미노산 변형을 포함하도록 합성될 수 있다. 본 개시내용의 핵산은 화학적 합성 방법에 의해 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.

본 개시내용의 핵산, 이들의 전체 서열, 또는 이의 임의의 부분은 비자연발생일 수 있다. 본 개시내용의 핵산은 자연적으로 발생하지 않아 전체 핵산 서열을 비자연발생으로 만드는 하나 이상의 돌연변이, 치환, 결실, 또는 삽입을 함유할 수 있다. 본 개시내용의 핵산은 하나 이상의 복제, 역전 또는 반복 서열을 함유할 수 있고, 생성된 서열은 자연적으로 발생하지 않아 전체 핵산 서열을 비자연발생으로 만든다. 본 개시내용의 핵산은 자연적으로 발생하지 않아 전체 핵산 서열을 비자연발생으로 만드는 변형된, 인공, 또는 합성 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다.

유전적 코드의 중복성을 감안할 때, 복수의 뉴클레오타이드 서열은 임의의 특정 단백질을 코딩할 수 있다. 이러한 모든 뉴클레오타이드 서열이 본원에서 고려된다.

본 개시내용 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 공간적으로 연결된 프로모터의 제어 하에 있는 유전자의 발현을 지칭한다. 프로모터는 제어 하에 있는 유전자의 5'(상류) 또는 3'(하류)에 위치할 수 있다. 프로모터 및 유전자 사이의 거리는 프로모터 및 프로모터가 유래된 유전자에서 그것이 제어하는 유전자 사이의 거리와 거의 동일할 수 있다. 프로모터 및 유전자 사이의 거리 변화는 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.

본 개시내용 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 세포에서 핵산의 발현을 부여, 활성화 또는 향상시킬 수 있는 합성 또는 천연 유래된 분자를 지칭한다. 프로모터는 발현을 추가로 향상시키고/거나 이의 공간적 발현 및/또는 일시적 발현을 변경하기 위해 하나 이상의 특이적 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 전사의 시작 부위로부터 수천 염기쌍만큼 위치할 수 있는 원위 인핸서 또는 억제자 요소를 포함할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충, 및 동물을 포함하는 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 장기에 대해 또는, 발현이 일어나는 발달 단계에 대해, 또는 생리적 스트레스, 병원체, 금속 이온, 또는 유도제와 같은 외부 자극에 대한 반응으로 항시적으로 또는 차등적으로 유전자 구성요소의 발현을 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예는 박테리오파아지 T7 프로모터, 박테리오파아지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 오퍼레이터-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, EF-1 알파 프로모터, CAG 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터를 포함한다.

본 개시내용 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 상보적인"은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540개 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 영역에 걸쳐 제2 서열의 상보체와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제1 서열을 지칭하거나, 또는 두 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화한다는 것을 지칭한다.

본 개시내용 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일한"은 제1 및 제2 서열이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540개 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 영역에 걸쳐, 또는 제1 서열이 제2 서열의 상보체와 실질적으로 동일한 경우 핵산에 대해, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 것을 지칭한다.

본 개시내용 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 핵산을 설명하기 위해 사용될 때 용어 "변이체"는 (i) 참조된 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 단편; (ii) 참조된 뉴클레오타이드 서열의 상보체 또는 이의 부분; (iii) 참조된 핵산 또는 이의 상보체와 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 엄격한 조건 하에 참조된 핵산, 이의 상보체, 또는 이와 실질적으로 동일한 서열에 혼성화하는 핵산을 지칭한다.

본 개시내용 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 복제 원점을 함유하는 핵산 서열을 지칭한다. 벡터는 바이러스 벡터, 박테리오파아지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가 복제하는 염색체외 벡터일 수 있고, 바람직하게는, DNA 플라스미드이다. 벡터는 아미노산과 DNA 서열, RNA 서열, 또는 DNA 및 RNA 서열 모두와의 조합을 포함할 수 있다.

본 개시내용 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 설명하기 위해 사용될 때 용어 "변이체"는 아미노산의 삽입, 결실, 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 아미노산 서열을 갖는 참조된 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다.

아미노산의 보존적 치환, 즉, 아미노산을 유사한 특성(예컨대, 하전된 영역의 친수성, 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 대체하는 것은 전형적으로 사소한 변화를 수반하는 것으로 당업계에서 인식된다. 이러한 사소한 변화는 부분적으로 당업계에서 이해되는 바와 같이 아미노산의 소수성 지수(hydropathic index)를 고려함으로써 확인될 수 있다(Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132(1982)). 아미노산의 소수성 지수는 그의 소수성과 전하의 고려에 기초한다. 유사한 소수성 지수의 아미노산은 치환될 수 있고, 여전히 단백질 기능을 유지한다. 일 양태에서, ±2의 소수성 지수를 갖는 아미노산은 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 단백질이 생물학적 기능을 유지하게 할 치환을 밝히는 데 사용될 수 있다. 펩타이드의 문맥에서 아미노산의 친수성을 고려하면 항원성 및 면역원성과 상관관계가 있는 것으로 보고된 유용한 척도인 펩타이드의 가장 큰 국소 평균 친수성을 계산할 수 있다(그 전체가 참조로 본원에 포함된 미국 특허 제4,554,101호).

유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은 생물학적 활성, 예를 들어 면역원성을 유지하는 펩타이드를 생성할 수 있다. 치환은 서로 ±2 이내의 친수성 값을 갖는 아미노산을 이용하여 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값은 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 이러한 관찰과 일치하게도, 생물학적 기능과 양립할 수 있는 아미노산 치환은 소수성, 친수성, 전하, 크기, 및 다른 특성에 의해 밝혀진 바와 같이 아미노산의 상대적 유사성, 및 특히 상기 아미노산의 측쇄에 의존하는 것으로 이해된다.

본원에 사용된 바와 같이, "보존적" 아미노산 치환은 하기 표 A, B, 또는 C에 기재된 바와 같이 정의될 수 있다. 일부 양태에서, 융합 폴리펩타이드 및/또는 이러한 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 본 개시내용의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 변형에 의해 도입된 보존적 치환을 포함한다. 아미노산은 물리적 특성 및 2차 및 3차 단백질 구조에 대한 기여에 따라 분류될 수 있다. 보존적 치환은 하나의 아미노산을 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 예시적인 보존적 치환이 표 A에 제시되어 있다.

표 A -- 보존적 치환 I

대안적으로, 보존적 아미노산은 표 B에 제시된 바와 같이 문헌[Lehninger, (Biochemistry, 제2 Edition; Worth Publishers, Inc. NY, N.Y.(1975), pp. 71-77)]에 기재된 바와 같이 분류될 수 있다.

표 B -- 보존적 치환 II

대안적으로, 예시적인 보존적 치환이 표 C에 제시되어 있다.

표 C -- 보존적 치환 III

본 개시내용의 폴리펩타이드는 아미노산 잔기의 하나 이상의 삽입, 결실, 또는 치환, 또는 이의 임의의 조합뿐만 아니라 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 또는 치환 이외의 변형을 갖는 폴리펩타이드를 포함하고자 하는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시내용의 폴리펩타이드 또는 핵산은 하나 이상의 보존적 치환을 포함할 수 있다.

본 개시내용 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 용어 전술한 아미노산 치환 중 "하나 초과"는 언급된 아미노산 치환 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이상을 지칭한다. 용어 "하나 초과"는 언급된 아미노산 치환 중 2, 3, 4, 또는 5개를 지칭할 수 있다.

본 개시내용의 폴리펩타이드 및 단백질, 이들의 전체 서열, 또는 이의 임의의 부분은 비자연발생일 수 있다. 본 개시내용의 폴리펩타이드 및 단백질은 자연적으로 발생하지 않아 전체 아미노산 서열을 비자연발생으로 만드는 하나 이상의 돌연변이, 치환, 결실, 또는 삽입을 함유할 수 있다. 본 개시내용의 폴리펩타이드 및 단백질은 하나 이상의 복제, 역전 또는 반복 서열을 함유할 수 있고, 생성된 서열은 자연적으로 발생하지 않아 전체 아미노산 서열 서열을 비자연발생으로 만든다. 본 개시내용의 폴리펩타이드 및 단백질은 자연적으로 발생하지 않아 전체 아미노산 서열 서열을 비자연발생으로 만드는 변형된, 인공, 또는 합성 아미노산을 함유할 수 있다.

본 개시내용 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, "서열 동일성"은 기본 매개변수를 사용하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information) ftp 사이트로부터 검색될 수 있는 2개의 서열을 블라스팅하기 위한 독립 실행형 BLAST 엔진 프로그램(bl2seq)을 사용하여 결정될 수 있다(Tatusova and Madden, FEMS Microbiol Lett., 1999, 174, 247-250; 그 전체가 참조로 본원에 포함됨). 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 문맥에서 사용될 때 용어 "동일한" 또는 "동일성"은 각각의 서열의 특정 영역에 걸쳐 동일한 잔기의 특정 백분율을 지칭한다. 백분율은 2개의 서열을 최적으로 정렬하고, 특정 영역에 걸쳐 2개의 서열을 비교하고, 두 서열에서 동일한 잔기가 발생하는 위치의 수를 계산하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 특정 영역에서의 위치의 총 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다. 2개의 서열이 길이가 상이하거나 정렬이 하나 이상의 엇갈린 말단을 생성하고 특정 비교 영역이 단일 서열만을 포함하는 경우, 단일 서열의 잔기는 계산의 분자가 아닌 분모에 포함된다. DNA 및 RNA를 비교할 때, 티민(T) 및 우라실(U)은 동등한 것으로 간주될 수 있다. 동일성은 수동으로 또는 BLAST 또는 BLAST 2.0과 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다.

본 개시내용 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 용어 "내인성"은 표적 유전자 또는 그것이 도입되는 숙주 세포와 자연적으로 회합되는 핵산 또는 단백질 서열을 지칭한다.

본 개시내용 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 용어 "외인성"은 표적 유전자 또는 그것이 도입되는 숙주 세포와 자연적으로 회합되지 않는 핵산 또는 단백질 서열을 지칭하며, 이는 자연발생 핵산, 예컨대, DNA 서열의 비자연발생 다중 사본, 또는 비자연발생 게놈 위치에 위치한 자연발생 핵산 서열을 포함한다.

본 개시내용은 DNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 구조체를 숙주 세포 내로 도입하는 방법을 제공한다. "도입"은 구조체가 숙주 세포의 내부에 접근하는 방식으로 폴리뉴클레오타이드 구조체를 세포에 제시하는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 방법은 폴리뉴클레오타이드 구조체가 숙주의 하나의 세포의 내부에 접근하는 것을 제외하면 폴리뉴클레오타이드 구조체를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 특정 방법에 좌우되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드 구조체를 박테리아, 식물, 진균 및 동물에 도입하기 위한 방법은 당업계에 알려져 있으며, 이는 비제한적으로, 안정한 형질전환 방법, 일시적 형질전환 방법, 및 바이러스 매개 방법을 포함한다.

실시예 1: PiggyBac 나노트랜스포존을 이용한 개선된 전위

인간 범(pan) T 세포의 게놈 내로의 전위 효율에 대한 piggyBac 트랜스포존 플라스미드 백본을 단축하여 ITR 사이의 거리를 감소시키는 효과를 평가하였다. 각각 GFP를 코딩하는 트랜스포존을 포함하는, 전체 크기의 piggyBac 플라스미드(FP)(도 1), piggyBac 나노트랜스포존(NT)(도 1) 및 piggyBac 짧은 나노트랜스포존(NTS)(도 3)을 제작하였다. FP 백본은 박테리아 pUC 복제 원점 뿐만 아니라 Kan/Neo 내성 유전자를 코딩하였다. NT 백본은 RNA-OUT 요소 뿐만 아니라 R6K 미니 복제 원점을 포함하는 항생제가 없는 수크로스 선택가능한 나노플라스미드 백본을 코딩하였다. NTS는 백본 RNA-OUT 요소 및 R6K 미니 복제 원점이 트랜스포존 요소 내부에 배치되어 ITR 사이의 거리를 추가로 감소시킨다는 점에서 NT와 상이하였다. 도 1은 전체 플라스미드 및 NT 나노트랜스포존 사이의 차이를 예시한다. 트랜스포존의 크기는 일정하게 유지되었지만(3,606 bp), NT 백본은 더 짧아서, ITR 측접 거리를 표 1에 상세히 설명된 바와 같이 2,034 bp에서 493 bp로 4배 넘게 효과적으로 감소시켰다. 도 3은 piggyBac NT 및 piggyBac NTS 사이의 차이를 예시한다. 트랜스포존의 크기가 3,614 bp에서 4,069로 증가하였지만(RNA-OUT 및 R6K 서열을 혼입하기 위해), NTS 백본은 더 짧아서, ITR 측접 거리를 표 2에 상세히 설명된 바와 같이 485 bp에서 48 bp로 10배 넘게 효과적으로 감소시켰다.

표 1

표 2

piggyBac FP 또는 piggyBac NT를 Super piggyBac 트랜스포사제 효소(SPB)를 코딩하는 mRNA와 함께 또는 없이 전기천공(EP)을 통해 인간 범 T 세포에 전달하였다(도 2). 추가로, FP 및 NT를 등몰 또는 등질량으로 세포에 전달하였다. EP 후, 세포를 표준 TCR 활성화 시약을 사용하여 자극시키고, GFP 발현을 15일 후 FACS에 의해 평가하였다. 이러한 데이터는 ITR 측접 거리를 4배 넘게(2,034 bp에서 493 bp로) 감소시키는 것이 FP GFP 트랜스포존 플라스미드와 비교하여 등몰 및 등질량에서 더 큰 수준의 GFP 전위를 초래하였음을 보여준다. 또한, GFP 발현은 트랜스포존의 안정적인 통합의 결과였는데, GFP 발현이 SPB의 부재 하에 전기천공된 T 세포에서 검출되지 않았기 때문이었다.

도 1 및 도 2는 piggyBac 트랜스포존 플라스미드 백본을 단축시키는 것이 인간 범 T 세포 내로의 트랜스포존의 전위 효율을 증가시켰음을 입증한다. 그러나, 총 플라스미드 크기가 FP 및 NT 사이에서 동일하지 않았기 때문에, NT에 의한 향상된 전위 효율이 더 작은 플라스미드(등몰; 더 적은 DNA가 세포에 전달됨), 전달되는 더 많은 총 플라스미드(등몰), 또는 piggyBac ITR에 측접하는 더 짧은 거리의 결과였는지 여부가 불분명하다. 인간 범 T 세포에 전달된 DNA는 면역조절 효과를 유발할 수 있고 독성일 수 있기 때문에, NT에 의한 향상된 전위 효율은 더 적은 총 DNA(등몰)의 전달 또는 더 많은 플라스미드(등질량)의 전달의 결과일 수 있다. 이를 시험하기 위해, 나노플라스미드 백본이 인슐레이터 및 ITR 사이에 위치한 트랜스포존 내에 재위치한 NTS를 제작하였다(도 3). NT 및 NTS의 크기는 일정하게 유지되었지만(4,099 및 4,117 bp), NTS에서의 ITR 측접 거리는 10배 더 짧았다(485 bp에서 48 bp로)(표 2). 등몰/등질량의 NT 또는 NTS를 SPB를 코딩하는 mRNA와 함께 전기천공(EP)을 통해 인간 범 T 세포에 전달하였다. EP 후, 세포를 표준 TCR 활성화 시약을 사용하여 자극시키고, GFP 발현을 15일 후에 FACS에 의해 평가하였다. 이러한 데이터는 총 플라스미드 크기를 일정하게 유지하면서 ITR 측접 거리를 10배 넘게(485 bp에서 48 bp로) 감소시키는 것이 NT GFP 나노트랜스포존과 비교하여 NTS에 의한 더 큰 수준의 GFP 전위를 초래하였음을 보여준다(도 4).

실시예 2: BCMA CAR 및 PSMA CAR 나노트랜스포존의 전위

전체 크기의 piggyBac 플라스미드(FP) 또는 piggyBac 나노트랜스포존(NT)을 코딩하는 항-BCMA CAR 및 항-PSMA CAR을 Super piggyBac 트랜스포사제 효소를 코딩하는 mRNA와 함께 전기천공(EP)을 통해 인간 범 T 세포에 등질량으로 전달하였다(도 5). EP 후, 세포를 선택 시약의 부재 하에 표준 TCR 활성화 시약을 사용하여 자극시키고, CAR 발현을 5일 후에 FACS에 의해 평가하였다. 이러한 데이터는 두 NT가 FP 트랜스포존 플라스미드와 비교하여 등질량에서 더 큰 수준의 전위를 초래하였음을 보여준다. 이것은 CAR-T 세포가 2명의 상이한 정상 공여체의 인간 범 T 세포로부터 생산되었을 때 사실이었다. 전체 크기의 piggyBac 플라스미드(FP) 또는 piggyBac 나노트랜스포존(NT)을 사용하여 생산된 항-BCMA CAR 및 항-PSMA CAR T 세포를 본원에 기재된 바와 같이 생산하였다. 표시된 효과기 대 표적 비율에서 CAR-T 세포에 의한 BCMA(K562.BCMA) 또는 PSMA(K562.PSMA)를 발현하도록 조작된 K562 세포의 사멸(도 6). 이들 데이터는 모든 CAR-T 세포가 FP 또는 NT를 사용하여 생산되었는지 여부에 관계없이 항원 의존적 방식으로 표적 종양 세포를 사멸시킬 수 있었음을 보여준다. 이것은 2명의 상이한 정상 공여체의 인간 범 T 세포로부터 생산된 CAR-T 세포에 대해 사실이었다. 도 7은 항-BCMA CAR 또는 항-PSMA CAR 나노트랜스포존(NT)을 사용하여 생산된 인간 CAR-T 세포가 표현형 조성에서 대등하였음을 보여주는 일련의 그래프이다. 전체 크기의 piggyBac 플라스미드(FP) 또는 piggyBac 나노트랜스포존(NT)을 사용하여 생산된 항-BCMA CAR 및 항-PSMA CAR T 세포를 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 기억 T 세포 마커 및 활성화/소진 마커의 표현형 분석(데이터는 나타내지 않음)을 수행하였다. 이들 데이터는 모든 CAR-T 세포가 FP 또는 NT를 사용하여 생산되었는지 여부에 관계없이 CD45RA+CD62L+(Tscm), CD45RA-CD62L+(Tcm), CD45RA-CD62L-(Tem), 및 CD45RA+CD62L-(Teff) 세포의 유사한 표현형 조성을 나타내었음을 보여준다. 또한, CCR7(CD197), CD127, CD27, LAG3, TIM3, CXCR3, PD-1, 및 CD25의 대등한 수준의 발현이 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). 이것은 2명의 상이한 정상 공여체의 인간 범 T 세포로부터 생산된 CAR-T 세포에 대해 사실이었다. 통합된 트랜스포존의 평균 카피 수를 정량적 PCR에 의해 측정하였다. 이들 데이터는 2명의 상이한 공여체에서, 모든 CAR-T 세포가 FP 또는 NT를 사용하여 생산되었는지 여부에 관계없이 트랜스포존의 유사한 통합된 카피 수를 나타내었음을 보여준다(도 8).

고도의 다량체성 로트(7% 단량체성)를 고도의 단량체성 로트(87% 단량체성)와 상이한 비율로 혼합함으로써 상이한 단량체성 순도의 항-BCMA CAR piggyBac 나노트랜스포존을 생산하였다. 2개의 로트는 유전자 시퀀싱에 의해 단량체성 또는 다량체성 구조에서 1차 수준에서 동일하고 3차 수준에서만 상이한 것으로 확인되었다. 혼합된 항-BCMA CAR NT의 각각의 새로운 로트를 제한 절단의 부재 하에 아가로스 겔에서 실행하여 생성된 단량체성 대 다량체성 나노트랜스포존의 비율을 밝혀내었고; 많은 다양한 단량체성 순도를 생성하였다(7%, 32%, 45%, 59%, 65%, 72%, 및 87%). 겔 상에서, 다량체성 NT는 단량체성 NT보다 느리게 이동하였다(도 9). 도 9에 도시된 겔의 밴드는 다량체성(위) 및 단량체성(아래) 나노트랜스포존을 예시하기 위해 직사각형에 의해 박스표시되어 있으며; 넘버링은 위에서 아래로, 왼쪽에서 오른쪽으로 진행된다: 1(다량체성) 및 2(단량체성)[7% 단량체성 순도], 3 및 4[32% 단량체성 순도], 5 및 6[45% 단량체성 순도], 7 및 8[59% 단량체성 순도], 9 및 10[65% 단량체성 순도], 11 및 12[72% 단량체성 순도], 13 및 14[블랭크], 15 및 16[87% 단량체성 순도].

상이한 단량체성 순도의 항-BCMA CAR piggyBac NT를 Super piggyBac 트랜스포사제 효소를 코딩하는 mRNA와 함께 전기천공(EP)을 통해 인간 범 T 세포에 전달하였다(도 10). 대조군으로서, 94% 단량체성 순도의 전체 크기의 항-BCMA CAR 플라스미드(FP)를 또한 등몰량으로 전달하였다. EP 후, 세포를 선택 시약의 부재 하에 표준 TCR 활성화 시약을 사용하여 자극시키고 CAR 발현을 5일 후에 FACS에 의해 평가하였다. 이들 데이터는 2명의 개별 공여체(공여체 #3 및 공여체 #2)에서 단량체성 순도가 전위 효율에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 보여준다. 또한, 이들 데이터는 NT가 FP 트랜스포존 플라스미드 등몰량과 비교하여 더 큰 수준의 전위를 초래하였음을 보여준다.

실시예 3: P- PSMA -101 나노트랜스포존의 전임상 평가

쥣과 이종이식편 모델을 사용하여 '스트레스' 용량에서 전장 플라스미드(FLP) 대 나노트랜스포존(NT)에 의해 전달될 때 P-PSMA-101 트랜스포존의 효능을 전임상 환경에서 평가하였다. NSG 마우스에 피하(SC) 주사된 루시퍼라제 발현 LNCaP 세포주(LNCaP.luc)를 사용한 쥣과 이종이식편 모델을 이용하여 2명의 상이한 정상 공여체로부터의 총 CAR-T 세포의 2개의 상이한 '스트레스' 용량(2.5x10^6 또는 4x10^6)에서 전장 플라스미드(FLP) 또는 나노트랜스포존(NT)에 의해 전달된 바와 같은 P-PSMA-101 트랜스포존의 생체내 항종양 효능을 평가하였다(도 11). 모든 CAR-T 세포를 FLP 또는 NT 전달을 사용하여 P-PSMA-101 트랜스포존의 piggyBac(PB) 전달을 사용하여 생산하였다. 마우스에게 LNCaP를 겨드랑이로 주사하고, 종양이 확립되었을 때(캘리퍼 측정에 의해 100-200 mm³) 치료하였다. FLP 및 NT에 의한 트랜스포존 전달 사이의 가능한 효능의 기능적 차이를 감지하는 데 있어서 더 큰 해상도를 위해 마우스에게 IV 주사에 의해 P-PSMA-101 CAR-T의 2개의 상이한 '스트레스' 용량(2.5x10⁶ 또는 4x10⁶)을 처리하였다. 오차 막대와 함께 그룹 평균(위) 및 개별 마우스(아래)로서 나타낸 바와 같은 대조군 마우스(검정색), 공여체 #1 FLP 마우스(빨간색), 공여체 #1 NT 마우스(파란색), 공여체 #2 FLP 마우스(주황색), 및 공여체 #2 NT 마우스(녹색)에 대한 캘리퍼 측정에 의한 종양 부피 평가(도 12). y-축은 캘리퍼 측정에 의해 평가된 종양 부피(mm³)를 보여준다. x-축은 T 세포 치료 후 일수를 보여준다. NT에 의해 전달될 때, '스트레스' 용량에서 P-PSMA-101 트랜스포존은 확립된 SC LNCaP.luc 고형 종양에 대해 FLP 및 대조군 마우스와 비교하여 캘리퍼에 의해 측정된 바와 같이 향상된 항종양 효능을 입증하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Poseida Therapeutics, Inc. <120> NANOTRANSPOSON COMPOSITIONS AND METHODS OF USE <130> POTH-047/001WO (325002-2401) <150> 62/783,133 <151> 2018-12-20 <150> 62/815,335 <151> 2019-03-07 <150> 62/815,845 <151> 2019-03-08 <160> 98 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6198 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P-BCMA-101 nanotransposon expressing a BCMA CARTyrin <400> 1 tgtacataga ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg 60 cgtaaaattg acgcatgtgt tttatcggtc tgtatatcga ggtttattta ttaatttgaa 120 tagatattaa gttttattat atttacactt acatactaat aataaattca acaaacaatt 180 tatttatgtt tatttattta ttaaaaaaaa acaaaaactc aaaatttctt ctataaagta 240 acaaaacttt tatcgaatac ctgcagcccg ggggatgcag agggacagcc cccccccaaa 300 gcccccaggg atgtaattac gtccctcccc cgctaggggg cagcagcgag ccgcccgggg 360 ctccgctccg gtccggcgct ccccccgcat ccccgagccg gcagcgtgcg gggacagccc 420 gggcacgggg aaggtggcac gggatcgctt tcctctgaac gcttctcgct gctctttgag 480 cctgcagaca cctgggggga tacggggaaa agttgactgt gcctttcgat cgaaccatgg 540 acagttagct ttgcaaagat ggataaagtt ttaaacagag aggaatcttt gcagctaatg 600 gaccttctag gtcttgaaag gagtgggaat tggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg 660 cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta 720 gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc 780 cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa 840 cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt 900 tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacc tggctgcagt acgtgattct 960 tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc 1020 cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat 1080 ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt 1140 ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga 1200 tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca 1260 gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta 1320 gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc 1380 ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc 1440 cggccctgct gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga 1500 gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac 1560 ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc 1620 tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt gggtggagac 1680 tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta attctccttg gaatttgccc tttttgagtt 1740 tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca 1800 ggtgtcgtga gaattctaat acgactcact atagggtgtg ctgtctcatc attttggcaa 1860 agattggcca ccaagcttgc caccatgggg gtccaggtcg agactatttc accaggggat 1920 gggcgaacat ttccaaaaag gggccagact tgcgtcgtgc attacaccgg gatgctggag 1980 gacgggaaga aagtggacag ctccagggat cgcaacaagc ccttcaagtt catgctggga 2040 aagcaggaag tgatccgagg atgggaggaa ggcgtggcac agatgtcagt cggccagcgg 2100 gccaaactga ccattagccc tgactacgct tatggagcaa caggccaccc agggatcatt 2160 ccccctcatg ccaccctggt cttcgatgtg gaactgctga agctggaggg aggaggagga 2220 tccggatttg gggacgtggg ggccctggag tctctgcgag gaaatgccga tctggcttac 2280 atcctgagca tggaaccctg cggccactgt ctgatcatta acaatgtgaa cttctgcaga 2340 gaaagcggac tgcgaacacg gactggctcc aatattgact gtgagaagct gcggagaagg 2400 ttctctagtc tgcactttat ggtcgaagtg aaaggggatc tgaccgccaa gaaaatggtg 2460 ctggccctgc tggagctggc tcagcaggac catggagctc tggattgctg cgtggtcgtg 2520 atcctgtccc acgggtgcca ggcttctcat ctgcagttcc ccggagcagt gtacggaaca 2580 gacggctgtc ctgtcagcgt ggagaagatc gtcaacatct tcaacggcac ttcttgccct 2640 agtctggggg gaaagccaaa actgttcttt atccaggcct gtggcgggga acagaaagat 2700 cacggcttcg aggtggccag caccagccct gaggacgaat caccagggag caaccctgaa 2760 ccagatgcaa ctccattcca ggagggactg aggacctttg accagctgga tgctatctca 2820 agcctgccca ctcctagtga cattttcgtg tcttacagta ccttcccagg ctttgtctca 2880 tggcgcgatc ccaagtcagg gagctggtac gtggagacac tggacgacat ctttgaacag 2940 tgggcccatt cagaggacct gcagagcctg ctgctgcgag tggcaaacgc tgtctctgtg 3000 aagggcatct acaaacagat gcccgggtgc ttcaattttc tgagaaagaa actgttcttt 3060 aagacttccg gatctggaga gggaagggga agcctgctga cctgtggaga cgtggaggaa 3120 aacccaggac caatggcact gccagtcacc gccctgctgc tgcctctggc tctgctgctg 3180 cacgcagcta gaccaatgct gcctgcacca aagaacctgg tggtgagccg gatcacagag 3240 gactccgcca gactgtcttg gaccgcccct gacgccgcct tcgattcctt tccaatccgg 3300 tacatcgaga cactgatctg gggcgaggcc atctggctgg acgtgcccgg ctctgagagg 3360 agctacgatc tgacaggcct gaagcctggc accgagtatg cagtggtcat cacaggagtg 3420 aagggcggca ggttcagctc ccctctggtg gcctctttta ccacaaccac aacccctgcc 3480 cccagacctc ccacacccgc ccctaccatc gcgagtcagc ccctgagtct gagacctgag 3540 gcctgcaggc cagctgcagg aggagctgtg cacaccaggg gcctggactt cgcctgcgac 3600 atctacattt gggcaccact ggccgggacc tgtggagtgc tgctgctgag cctggtcatc 3660 acactgtact gcaagagagg caggaagaaa ctgctgtata ttttcaaaca gcccttcatg 3720 cgccccgtgc agactaccca ggaggaagac gggtgctcct gtcgattccc tgaggaagag 3780 gaaggcgggt gtgagctgcg cgtgaagttt agtcgatcag cagatgcccc agcttacaaa 3840 cagggacaga accagctgta taacgagctg aatctgggcc gccgagagga atatgacgtg 3900 ctggataagc ggagaggacg cgaccccgaa atgggaggca agcccaggcg caaaaaccct 3960 caggaaggcc tgtataacga gctgcagaag gacaaaatgg cagaagccta ttctgagatc 4020 ggcatgaagg gggagcgacg gagaggcaaa gggcacgatg ggctgtacca gggactgagc 4080 accgccacaa aggacaccta tgatgctctg catatgcagg cactgcctcc aaggggaagt 4140 ggagaaggac gaggatcact gctgacatgc ggcgacgtgg aggaaaaccc tggcccaatg 4200 gtcgggtctc tgaattgtat cgtcgccgtg agtcagaaca tgggcattgg gaagaatggc 4260 gatttcccat ggccacctct gcgcaacgag tcccgatact ttcagcggat gacaactacc 4320 tcctctgtgg aagggaaaca gaatctggtc atcatgggaa agaaaacttg gttcagcatt 4380 ccagagaaga accggcccct gaaaggcaga atcaatctgg tgctgtcccg agaactgaag 4440 gagccaccac agggagctca ctttctgagc cggtccctgg acgatgcact gaagctgaca 4500 gaacagcctg agctggccaa caaagtcgat atggtgtgga tcgtcggggg aagttcagtg 4560 tataaggagg ccatgaatca ccccggccat ctgaaactgt tcgtcacacg gatcatgcag 4620 gactttgaga gcgatacttt ctttcctgaa attgacctgg agaagtacaa actgctgccc 4680 gaatatcctg gcgtgctgtc cgatgtccag gaagagaaag gcatcaaata caagttcgag 4740 gtctatgaga agaatgacta ataaggtacc gatcacatat gcctttaatt aaacactagt 4800 tctatagtgt cacctaaatt ccctttagtg agggttaatg gccgtaggcc gccagaattg 4860 ggtccagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga 4920 aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc 4980 tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag 5040 gtgtgggagg ttttttcgga ctctaggacc tgcgcatgcg cttggcgtaa tcatggtcat 5100 agctgtttcc tgttttcccc gtatcccccc aggtgtctgc aggctcaaag agcagcgaga 5160 agcgttcaga ggaaagcgat cccgtgccac cttccccgtg cccgggctgt ccccgcacgc 5220 tgccggctcg gggatgcggg gggagcgccg gaccggagcg gagccccggg cggctcgctg 5280 ctgcccccta gcgggggagg gacgtaatta catccctggg ggctttgggg gggggctgtc 5340 cctctcaccg cggtggagct ccagcttttg ttcgaattgg ggccccccct cgagggtatc 5400 gatgatatct ataacaagaa aatatatata taataagtta tcacgtaagt agaacatgaa 5460 ataacaatat aattatcgta tgagttaaat cttaaaagtc acgtaaaaga taatcatgcg 5520 tcattttgac tcacgcggtc gttatagttc aaaatcagtg acacttaccg cattgacaag 5580 cacgcctcac gggagctcca agcggcgact gagatgtcct aaatgcacag cgacggattc 5640 gcgctattta gaaagagaga gcaatatttc aagaatgcat gcgtcaattt tacgcagact 5700 atctttctag ggttaatcta gctagcctta agggcgcagc ccgcctaatg agcgggcttt 5760 tttttggctt gttgtccaca accgttaaac cttaaaagct ttaaaagcct tatatattct 5820 tttttttctt ataaaactta aaaccttaga ggctatttaa gttgctgatt tatattaatt 5880 ttattgttca aacatgagag cttagtacgt gaaacatgag agcttagtac gttagccatg 5940 agagcttagt acgttagcca tgagggttta gttcgttaaa catgagagct tagtacgtta 6000 aacatgagag cttagtacgt actatcaaca ggttgaactg ctgatccacg ttgtggtaga 6060 attggtaaag agagtcgtgt aaaatatcga gttcgcacat cttgttgtct gattattgat 6120 ttttggcgaa accatttgat catatgacaa gatgtgtatc taccttaact taatgatttt 6180 gataaaaatc attaggta 6198 <210> 2 <211> 238 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITR <400> 2 ccctagaaag ataatcatat tgtgacgtac gttaaagata atcatgcgta aaattgacgc 60 atgtgtttta tcggtctgta tatcgaggtt tatttattaa tttgaataga tattaagttt 120 tattatattt acacttacat actaataata aattcaacaa acaatttatt tatgtttatt 180 tatttattaa aaaaaaacaa aaactcaaaa tttcttctat aaagtaacaa aactttta 238 <210> 3 <211> 232 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulator <400> 3 gagggacagc ccccccccaa agcccccagg gatgtaatta cgtccctccc ccgctagggg 60 gcagcagcga gccgcccggg gctccgctcc ggtccggcgc tccccccgca tccccgagcc 120 ggcagcgtgc ggggacagcc cgggcacggg gaaggtggca cgggatcgct ttcctctgaa 180 cgcttctcgc tgctctttga gcctgcagac acctgggggg atacggggaa aa 232 <210> 4 <211> 1264 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1alpha promoter <400> 4 agctttgcaa agatggataa agttttaaac agagaggaat ctttgcagct aatggacctt 60 ctaggtcttg aaaggagtgg gaattggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc 120 gcccacagtc cccgagaagt tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag 180 gtggcgcggg gtaaactggg aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg 240 tgggggagaa ccgtatataa gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt 300 tgccgccaga acacaggtaa gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg 360 ttatggccct tgcgtgcctt gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc 420 cgagcttcgg gttggaagtg ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc 480 gcctcgtgct tgagttgagg cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg 540 gcaccttcgc gcctgtctcg ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg 600 acctgctgcg acgctttttt tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca 660 cactggtatt tcggtttttg gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac 720 atgttcggcg aggcggggcc tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca 780 agctggccgg cctgctctgg tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc 840 ggcaaggctg gcccggtcgg caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc 900 tgctgcaggg agctcaaaat ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc 960 cacacaaagg aaaagggcct ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta 1020 ccgggcgccg tccaggcacc tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg 1080 ttggggggag gggttttatg cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt 1140 taggccagct tggcacttga tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc 1200 ttggttcatt ctcaagcctc agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc 1260 gtga 1264 <210> 5 <211> 1185 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inducible proapoptotic polypeptides <400> 5 atgggggtcc aggtcgagac tatttcacca ggggatgggc gaacatttcc aaaaaggggc 60 cagacttgcg tcgtgcatta caccgggatg ctggaggacg ggaagaaagt ggacagctcc 120 agggatcgca acaagccctt caagttcatg ctgggaaagc aggaagtgat ccgaggatgg 180 gaggaaggcg tggcacagat gtcagtcggc cagcgggcca aactgaccat tagccctgac 240 tacgcttatg gagcaacagg ccacccaggg atcattcccc ctcatgccac cctggtcttc 300 gatgtggaac tgctgaagct ggagggagga ggaggatccg gatttgggga cgtgggggcc 360 ctggagtctc tgcgaggaaa tgccgatctg gcttacatcc tgagcatgga accctgcggc 420 cactgtctga tcattaacaa tgtgaacttc tgcagagaaa gcggactgcg aacacggact 480 ggctccaata ttgactgtga gaagctgcgg agaaggttct ctagtctgca ctttatggtc 540 gaagtgaaag gggatctgac cgccaagaaa atggtgctgg ccctgctgga gctggctcag 600 caggaccatg gagctctgga ttgctgcgtg gtcgtgatcc tgtcccacgg gtgccaggct 660 tctcatctgc agttccccgg agcagtgtac ggaacagacg gctgtcctgt cagcgtggag 720 aagatcgtca acatcttcaa cggcacttct tgccctagtc tggggggaaa gccaaaactg 780 ttctttatcc aggcctgtgg cggggaacag aaagatcacg gcttcgaggt ggccagcacc 840 agccctgagg acgaatcacc agggagcaac cctgaaccag atgcaactcc attccaggag 900 ggactgagga cctttgacca gctggatgct atctcaagcc tgcccactcc tagtgacatt 960 ttcgtgtctt acagtacctt cccaggcttt gtctcatggc gcgatcccaa gtcagggagc 1020 tggtacgtgg agacactgga cgacatcttt gaacagtggg cccattcaga ggacctgcag 1080 agcctgctgc tgcgagtggc aaacgctgtc tctgtgaagg gcatctacaa acagatgccc 1140 gggtgcttca attttctgag aaagaaactg ttctttaaga cttcc 1185 <210> 6 <211> 1185 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inducible proapoptotic polypeptides <400> 6 atgggggtcc aggtcgagac tatttcacca ggggatgggc gaacatttcc aaaaaggggc 60 cagacttgcg tcgtgcatta caccgggatg ctggaggacg ggaagaaagt ggacagctcc 120 agggatcgca acaagccctt caagttcatg ctgggaaagc aggaagtgat ccgaggatgg 180 gaggaaggcg tggcacagat gtcagtcggc cagcgggcca aactgaccat tagccctgac 240 tacgcttatg gagcaacagg ccacccaggg atcattcccc ctcatgccac cctggtcttc 300 gatgtggaac tgctgaagct ggagggagga ggaggatccg gatttgggga cgtgggggcc 360 ctggagtctc tgcgaggaaa tgccgatctg gcttacatcc tgagcatgga accctgcggc 420 cactgtctga tcattaacaa tgtgaacttc tgcagagaaa gcggactgcg aacacggact 480 ggctccaata ttgactgtga gaagctgcgg agaaggttct ctagtctgca ctttatggtc 540 gaagtgaaag gggatctgac cgccaagaaa atggtgctgg ccctgctgga gctggctcag 600 caggaccatg gagctctgga ttgctgcgtg gtcgtgatcc tgtcccacgg gtgccaggct 660 tctcatctgc agttccccgg agcagtgtac ggaacagacg gctgtcctgt cagcgtggag 720 aagatcgtca acatcttcaa cggcacttct tgccctagtc tggggggaaa gccaaaactg 780 ttctttatcc aggcctgtgg cggggaacag aaagatcacg gcttcgaggt ggccagcacc 840 agccctgagg acgaatcacc agggagcaac cctgaaccag atgcaactcc attccaggag 900 ggactgagga cctttgacca gctggatgct atctcaagcc tgcccactcc tagtgacatt 960 ttcgtgtctt acagtacctt cccaggcttt gtctcatggc gcgatcccaa gtcagggagc 1020 tggtacgtgg agacactgga cgacatcttt gaacagtggg cccattcaga ggacctgcag 1080 agcctgctgc tgcgagtggc aaacgctgtc tctgtgaagg gcatctacaa acagatgccc 1140 gggtgcttca attttctgag aaagaaactg ttctttaaga cttcc 1185 <210> 7 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A Sequence <400> 7 ggatctggag agggaagggg aagcctgctg acctgtggag acgtggagga aaacccagga 60 cca 63 <210> 8 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A Sequence <400> 8 ggatctggag agggaagggg aagcctgctg acctgtggag acgtggagga aaacccagga 60 cca 63 <210> 9 <211> 1002 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA CARTyrin <400> 9 atggcactgc cagtcaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgcagctaga 60 ccaatgctgc ctgcaccaaa gaacctggtg gtgagccgga tcacagagga ctccgccaga 120 ctgtcttgga ccgcccctga cgccgccttc gattcctttc caatccggta catcgagaca 180 ctgatctggg gcgaggccat ctggctggac gtgcccggct ctgagaggag ctacgatctg 240 acaggcctga agcctggcac cgagtatgca gtggtcatca caggagtgaa gggcggcagg 300 ttcagctccc ctctggtggc ctcttttacc acaaccacaa cccctgcccc cagacctccc 360 acacccgccc ctaccatcgc gagtcagccc ctgagtctga gacctgaggc ctgcaggcca 420 gctgcaggag gagctgtgca caccaggggc ctggacttcg cctgcgacat ctacatttgg 480 gcaccactgg ccgggacctg tggagtgctg ctgctgagcc tggtcatcac actgtactgc 540 aagagaggca ggaagaaact gctgtatatt ttcaaacagc ccttcatgcg ccccgtgcag 600 actacccagg aggaagacgg gtgctcctgt cgattccctg aggaagagga aggcgggtgt 660 gagctgcgcg tgaagtttag tcgatcagca gatgccccag cttacaaaca gggacagaac 720 cagctgtata acgagctgaa tctgggccgc cgagaggaat atgacgtgct ggataagcgg 780 agaggacgcg accccgaaat gggaggcaag cccaggcgca aaaaccctca ggaaggcctg 840 tataacgagc tgcagaagga caaaatggca gaagcctatt ctgagatcgg catgaagggg 900 gagcgacgga gaggcaaagg gcacgatggg ctgtaccagg gactgagcac cgccacaaag 960 gacacctatg atgctctgca tatgcaggca ctgcctccaa gg 1002 <210> 10 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A Sequence <400> 10 ggaagtggag aaggacgagg atcactgctg acatgcggcg acgtggagga aaaccctggc 60 cca 63 <210> 11 <211> 561 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DHFR selection <400> 11 atggtcgggt ctctgaattg tatcgtcgcc gtgagtcaga acatgggcat tgggaagaat 60 ggcgatttcc catggccacc tctgcgcaac gagtcccgat actttcagcg gatgacaact 120 acctcctctg tggaagggaa acagaatctg gtcatcatgg gaaagaaaac ttggttcagc 180 attccagaga agaaccggcc cctgaaaggc agaatcaatc tggtgctgtc ccgagaactg 240 aaggagccac cacagggagc tcactttctg agccggtccc tggacgatgc actgaagctg 300 acagaacagc ctgagctggc caacaaagtc gatatggtgt ggatcgtcgg gggaagttca 360 gtgtataagg aggccatgaa tcaccccggc catctgaaac tgttcgtcac acggatcatg 420 caggactttg agagcgatac tttctttcct gaaattgacc tggagaagta caaactgctg 480 cccgaatatc ctggcgtgct gtccgatgtc caggaagaga aaggcatcaa atacaagttc 540 gaggtctatg agaagaatga c 561 <210> 12 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PolyA sv40 <400> 12 cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 60 aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 120 ataaaca 127 <210> 13 <211> 231 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulator <400> 13 ttttccccgt atccccccag gtgtctgcag gctcaaagag cagcgagaag cgttcagagg 60 aaagcgatcc cgtgccacct tccccgtgcc cgggctgtcc ccgcacgctg ccggctcggg 120 gatgcggggg gagcgccgga ccggagcgga gccccgggcg gctcgctgct gccccctagc 180 gggggaggga cgtaattaca tccctggggg ctttgggggg gggctgtccc t 231 <210> 14 <211> 309 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITR <400> 14 gatatctata acaagaaaat atatatataa taagttatca cgtaagtaga acatgaaata 60 acaatataat tatcgtatga gttaaatctt aaaagtcacg taaaagataa tcatgcgtca 120 ttttgactca cgcggtcgtt atagttcaaa atcagtgaca cttaccgcat tgacaagcac 180 gcctcacggg agctccaagc ggcgactgag atgtcctaaa tgcacagcga cggattcgcg 240 ctatttagaa agagagagca atatttcaag aatgcatgcg tcaattttac gcagactatc 300 tttctaggg 309 <210> 15 <211> 281 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R6K Origin of Replication <400> 15 ggcttgttgt ccacaaccgt taaaccttaa aagctttaaa agccttatat attctttttt 60 ttcttataaa acttaaaacc ttagaggcta tttaagttgc tgatttatat taattttatt 120 gttcaaacat gagagcttag tacgtgaaac atgagagctt agtacgttag ccatgagagc 180 ttagtacgtt agccatgagg gtttagttcg ttaaacatga gagcttagta cgttaaacat 240 gagagcttag tacgtactat caacaggttg aactgctgat c 281 <210> 16 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA-OUT <400> 16 gtagaattgg taaagagagt cgtgtaaaat atcgagttcg cacatcttgt tgtctgatta 60 ttgatttttg gcgaaaccat ttgatcatat gacaagatgt gtatctacct taacttaatg 120 attttgataa aaatcatta 139 <210> 17 <211> 958 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P-BCMA-101 amino acid sequence <400> 17 Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe 1 5 10 15 Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu 20 25 30 Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys 35 40 45 Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val 50 55 60 Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp 65 70 75 80 Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala 85 90 95 Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Phe Gly Asp Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala 115 120 125 Asp Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile 130 135 140 Ile Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr 145 150 155 160 Gly Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu 165 170 175 His Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val 180 185 190 Leu Ala Leu Leu Glu Leu Ala Gln Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys 195 200 205 Cys Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln 210 215 220 Phe Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu 225 230 235 240 Lys Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly 245 250 255 Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp 260 265 270 His Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly 275 280 285 Ser Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr 290 295 300 Phe Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile 305 310 315 320 Phe Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro 325 330 335 Lys Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln 340 345 350 Trp Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn 355 360 365 Ala Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn 370 375 380 Phe Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser Gly Ser Gly Glu Gly 385 390 395 400 Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro 405 410 415 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 420 425 430 His Ala Ala Arg Pro Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser 435 440 445 Arg Ile Thr Glu Asp Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala 450 455 460 Ala Phe Asp Ser Phe Pro Ile Arg Tyr Ile Glu Thr Leu Ile Trp Gly 465 470 475 480 Glu Ala Ile Trp Leu Asp Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu 485 490 495 Thr Gly Leu Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Ala Val Val Ile Thr Gly Val 500 505 510 Lys Gly Gly Arg Phe Ser Ser Pro Leu Val Ala Ser Phe Thr Thr Thr 515 520 525 Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser 530 535 540 Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly 545 550 555 560 Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp 565 570 575 Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile 580 585 590 Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys 595 600 605 Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys 610 615 620 Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val 625 630 635 640 Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn 645 650 655 Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 660 665 670 Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 675 680 685 Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 690 695 700 Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 705 710 715 720 Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 725 730 735 Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser 740 745 750 Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn 755 760 765 Pro Gly Pro Met Val Gly Ser Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln 770 775 780 Asn Met Gly Ile Gly Lys Asn Gly Asp Phe Pro Trp Pro Pro Leu Arg 785 790 795 800 Asn Glu Ser Arg Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu 805 810 815 Gly Lys Gln Asn Leu Val Ile Met Gly Lys Lys Thr Trp Phe Ser Ile 820 825 830 Pro Glu Lys Asn Arg Pro Leu Lys Gly Arg Ile Asn Leu Val Leu Ser 835 840 845 Arg Glu Leu Lys Glu Pro Pro Gln Gly Ala His Phe Leu Ser Arg Ser 850 855 860 Leu Asp Asp Ala Leu Lys Leu Thr Glu Gln Pro Glu Leu Ala Asn Lys 865 870 875 880 Val Asp Met Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Lys Glu Ala 885 890 895 Met Asn His Pro Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln 900 905 910 Asp Phe Glu Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Glu Lys Tyr 915 920 925 Lys Leu Leu Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gln Glu Glu 930 935 940 Lys Gly Ile Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp 945 950 955 <210> 18 <211> 6204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P-PSMA-101 nanotransposon expressing a PSMA CARTyrin <400> 18 tgtacataga ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg 60 cgtaaaattg acgcatgtgt tttatcggtc tgtatatcga ggtttattta ttaatttgaa 120 tagatattaa gttttattat atttacactt acatactaat aataaattca acaaacaatt 180 tatttatgtt tatttattta ttaaaaaaaa acaaaaactc aaaatttctt ctataaagta 240 acaaaacttt tatcgaatac ctgcagcccg ggggatgcag agggacagcc cccccccaaa 300 gcccccaggg atgtaattac gtccctcccc cgctaggggg cagcagcgag ccgcccgggg 360 ctccgctccg gtccggcgct ccccccgcat ccccgagccg gcagcgtgcg gggacagccc 420 gggcacgggg aaggtggcac gggatcgctt tcctctgaac gcttctcgct gctctttgag 480 cctgcagaca cctgggggga tacggggaaa agttgactgt gcctttcgat cgaaccatgg 540 acagttagct ttgcaaagat ggataaagtt ttaaacagag aggaatcttt gcagctaatg 600 gaccttctag gtcttgaaag gagtgggaat tggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg 660 cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta 720 gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc 780 cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa 840 cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt 900 tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacc tggctgcagt acgtgattct 960 tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc 1020 cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat 1080 ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt 1140 ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga 1200 tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca 1260 gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta 1320 gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc 1380 ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc 1440 cggccctgct gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga 1500 gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac 1560 ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc 1620 tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt gggtggagac 1680 tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta attctccttg gaatttgccc tttttgagtt 1740 tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca 1800 ggtgtcgtga gaattctaat acgactcact atagggtgtg ctgtctcatc attttggcaa 1860 agattggcca ccaagcttgc caccatgggg gtccaggtcg agactatttc accaggggat 1920 gggcgaacat ttccaaaaag gggccagact tgcgtcgtgc attacaccgg gatgctggag 1980 gacgggaaga aagtggacag ctccagggat cgcaacaagc ccttcaagtt catgctggga 2040 aagcaggaag tgatccgagg atgggaggaa ggcgtggcac agatgtcagt cggccagcgg 2100 gccaaactga ccattagccc tgactacgct tatggagcaa caggccaccc agggatcatt 2160 ccccctcatg ccaccctggt cttcgatgtg gaactgctga agctggaggg aggaggagga 2220 tccggatttg gggacgtggg ggccctggag tctctgcgag gaaatgccga tctggcttac 2280 atcctgagca tggaaccctg cggccactgt ctgatcatta acaatgtgaa cttctgcaga 2340 gaaagcggac tgcgaacacg gactggctcc aatattgact gtgagaagct gcggagaagg 2400 ttctctagtc tgcactttat ggtcgaagtg aaaggggatc tgaccgccaa gaaaatggtg 2460 ctggccctgc tggagctggc tcagcaggac catggagctc tggattgctg cgtggtcgtg 2520 atcctgtccc acgggtgcca ggcttctcat ctgcagttcc ccggagcagt gtacggaaca 2580 gacggctgtc ctgtcagcgt ggagaagatc gtcaacatct tcaacggcac ttcttgccct 2640 agtctggggg gaaagccaaa actgttcttt atccaggcct gtggcgggga acagaaagat 2700 cacggcttcg aggtggccag caccagccct gaggacgaat caccagggag caaccctgaa 2760 ccagatgcaa ctccattcca ggagggactg aggacctttg accagctgga tgctatctca 2820 agcctgccca ctcctagtga cattttcgtg tcttacagta ccttcccagg ctttgtctca 2880 tggcgcgatc ccaagtcagg gagctggtac gtggagacac tggacgacat ctttgaacag 2940 tgggcccatt cagaggacct gcagagcctg ctgctgcgag tggcaaacgc tgtctctgtg 3000 aagggcatct acaaacagat gcccgggtgc ttcaattttc tgagaaagaa actgttcttt 3060 aagacttccg gatctggaga gggaagggga agcctgctga cctgtggaga cgtggaggaa 3120 aacccaggac caatggcact gccagtcacc gccctgctgc tgcctctggc tctgctgctg 3180 cacgcagcta gaccaatgct gcctgcacca aagaacctgg tggtgtctcg ggtgaccgag 3240 gactctgcca gactgagctg ggccatcgac gagcagaggg attggttcga gagctttctg 3300 atccagtatc aggagtccga gaaagtgggc gaggccatcg tgctgacagt gcctggcagc 3360 gagcggtcct atgatctgac cggcctgaag ccaggcacag agtacaccgt gtccatctac 3420 ggcgtgtatc acgtgtacag gtccaatcct ctgtctgcca tcttcaccac aaccacaacc 3480 cctgccccca gacctcccac acccgcccct accatcgcga gtcagcccct gagtctgaga 3540 cctgaggcct gcaggccagc tgcaggagga gctgtgcaca ccaggggcct ggacttcgcc 3600 tgcgacatct acatttgggc accactggcc gggacctgtg gagtgctgct gctgagcctg 3660 gtcatcacac tgtactgcaa gagaggcagg aagaaactgc tgtatatttt caaacagccc 3720 ttcatgcgcc ccgtgcagac tacccaggag gaagacgggt gctcctgtcg attccctgag 3780 gaagaggaag gcgggtgtga gctgcgcgtg aagtttagtc gatcagcaga tgccccagct 3840 tacaaacagg gacagaacca gctgtataac gagctgaatc tgggccgccg agaggaatat 3900 gacgtgctgg ataagcggag aggacgcgac cccgaaatgg gaggcaagcc caggcgcaaa 3960 aaccctcagg aaggcctgta taacgagctg cagaaggaca aaatggcaga agcctattct 4020 gagatcggca tgaaggggga gcgacggaga ggcaaagggc acgatgggct gtaccaggga 4080 ctgagcaccg ccacaaagga cacctatgat gctctgcata tgcaggcact gcctccaagg 4140 ggaagtggag aaggacgagg atcactgctg acatgcggcg acgtggagga aaaccctggc 4200 ccaatggtcg ggtctctgaa ttgtatcgtc gccgtgagtc agaacatggg cattgggaag 4260 aatggcgatt tcccatggcc acctctgcgc aacgagtccc gatactttca gcggatgaca 4320 actacctcct ctgtggaagg gaaacagaat ctggtcatca tgggaaagaa aacttggttc 4380 agcattccag agaagaaccg gcccctgaaa ggcagaatca atctggtgct gtcccgagaa 4440 ctgaaggagc caccacaggg agctcacttt ctgagccggt ccctggacga tgcactgaag 4500 ctgacagaac agcctgagct ggccaacaaa gtcgatatgg tgtggatcgt cgggggaagt 4560 tcagtgtata aggaggccat gaatcacccc ggccatctga aactgttcgt cacacggatc 4620 atgcaggact ttgagagcga tactttcttt cctgaaattg acctggagaa gtacaaactg 4680 ctgcccgaat atcctggcgt gctgtccgat gtccaggaag agaaaggcat caaatacaag 4740 ttcgaggtct atgagaagaa tgactaataa ggtaccgatc acatatgcct ttaattaaac 4800 actagttcta tagtgtcacc taaattccct ttagtgaggg ttaatggccg taggccgcca 4860 gaattgggtc cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg 4920 cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt 4980 ataagctgca ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag 5040 ggggaggtgt gggaggtttt ttcggactct aggacctgcg catgcgcttg gcgtaatcat 5100 ggtcatagct gtttcctgtt ttccccgtat ccccccaggt gtctgcaggc tcaaagagca 5160 gcgagaagcg ttcagaggaa agcgatcccg tgccaccttc cccgtgcccg ggctgtcccc 5220 gcacgctgcc ggctcgggga tgcgggggga gcgccggacc ggagcggagc cccgggcggc 5280 tcgctgctgc cccctagcgg gggagggacg taattacatc cctgggggct ttgggggggg 5340 gctgtccctc tcaccgcggt ggagctccag cttttgttcg aattggggcc ccccctcgag 5400 ggtatcgatg atatctataa caagaaaata tatatataat aagttatcac gtaagtagaa 5460 catgaaataa caatataatt atcgtatgag ttaaatctta aaagtcacgt aaaagataat 5520 catgcgtcat tttgactcac gcggtcgtta tagttcaaaa tcagtgacac ttaccgcatt 5580 gacaagcacg cctcacggga gctccaagcg gcgactgaga tgtcctaaat gcacagcgac 5640 ggattcgcgc tatttagaaa gagagagcaa tatttcaaga atgcatgcgt caattttacg 5700 cagactatct ttctagggtt aatctagcta gccttaaggg cgcagcccgc ctaatgagcg 5760 ggcttttttt tggcttgttg tccacaaccg ttaaacctta aaagctttaa aagccttata 5820 tattcttttt tttcttataa aacttaaaac cttagaggct atttaagttg ctgatttata 5880 ttaattttat tgttcaaaca tgagagctta gtacgtgaaa catgagagct tagtacgtta 5940 gccatgagag cttagtacgt tagccatgag ggtttagttc gttaaacatg agagcttagt 6000 acgttaaaca tgagagctta gtacgtacta tcaacaggtt gaactgctga tccacgttgt 6060 ggtagaattg gtaaagagag tcgtgtaaaa tatcgagttc gcacatcttg ttgtctgatt 6120 attgattttt ggcgaaacca tttgatcata tgacaagatg tgtatctacc ttaacttaat 6180 gattttgata aaaatcatta ggta 6204 <210> 19 <211> 1008 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSMA CARTyrin <400> 19 atggcactgc cagtcaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgcagctaga 60 ccaatgctgc ctgcaccaaa gaacctggtg gtgtctcggg tgaccgagga ctctgccaga 120 ctgagctggg ccatcgacga gcagagggat tggttcgaga gctttctgat ccagtatcag 180 gagtccgaga aagtgggcga ggccatcgtg ctgacagtgc ctggcagcga gcggtcctat 240 gatctgaccg gcctgaagcc aggcacagag tacaccgtgt ccatctacgg cgtgtatcac 300 gtgtacaggt ccaatcctct gtctgccatc ttcaccacaa ccacaacccc tgcccccaga 360 cctcccacac ccgcccctac catcgcgagt cagcccctga gtctgagacc tgaggcctgc 420 aggccagctg caggaggagc tgtgcacacc aggggcctgg acttcgcctg cgacatctac 480 atttgggcac cactggccgg gacctgtgga gtgctgctgc tgagcctggt catcacactg 540 tactgcaaga gaggcaggaa gaaactgctg tatattttca aacagccctt catgcgcccc 600 gtgcagacta cccaggagga agacgggtgc tcctgtcgat tccctgagga agaggaaggc 660 gggtgtgagc tgcgcgtgaa gtttagtcga tcagcagatg ccccagctta caaacaggga 720 cagaaccagc tgtataacga gctgaatctg ggccgccgag aggaatatga cgtgctggat 780 aagcggagag gacgcgaccc cgaaatggga ggcaagccca ggcgcaaaaa ccctcaggaa 840 ggcctgtata acgagctgca gaaggacaaa atggcagaag cctattctga gatcggcatg 900 aagggggagc gacggagagg caaagggcac gatgggctgt accagggact gagcaccgcc 960 acaaaggaca cctatgatgc tctgcatatg caggcactgc ctccaagg 1008 <210> 20 <211> 960 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P-PSMA-101 amino acid sequence <400> 20 Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe 1 5 10 15 Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu 20 25 30 Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys 35 40 45 Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val 50 55 60 Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp 65 70 75 80 Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala 85 90 95 Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Phe Gly Asp Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala 115 120 125 Asp Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile 130 135 140 Ile Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr 145 150 155 160 Gly Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu 165 170 175 His Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val 180 185 190 Leu Ala Leu Leu Glu Leu Ala Gln Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys 195 200 205 Cys Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln 210 215 220 Phe Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu 225 230 235 240 Lys Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly 245 250 255 Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp 260 265 270 His Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly 275 280 285 Ser Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr 290 295 300 Phe Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile 305 310 315 320 Phe Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro 325 330 335 Lys Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln 340 345 350 Trp Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn 355 360 365 Ala Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn 370 375 380 Phe Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser Gly Ser Gly Glu Gly 385 390 395 400 Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro 405 410 415 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 420 425 430 His Ala Ala Arg Pro Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser 435 440 445 Arg Val Thr Glu Asp Ser Ala Arg Leu Ser Trp Ala Ile Asp Glu Gln 450 455 460 Arg Asp Trp Phe Glu Ser Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys 465 470 475 480 Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr 485 490 495 Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr 500 505 510 Gly Val Tyr His Val Tyr Arg Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr 515 520 525 Thr Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 530 535 540 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 545 550 555 560 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr 565 570 575 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 580 585 590 Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 595 600 605 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 610 615 620 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 625 630 635 640 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 645 650 655 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 660 665 670 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 675 680 685 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 690 695 700 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 705 710 715 720 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 725 730 735 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 740 745 750 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 755 760 765 Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Gly Ser Leu Asn Cys Ile Val Ala Val 770 775 780 Ser Gln Asn Met Gly Ile Gly Lys Asn Gly Asp Phe Pro Trp Pro Pro 785 790 795 800 Leu Arg Asn Glu Ser Arg Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser 805 810 815 Val Glu Gly Lys Gln Asn Leu Val Ile Met Gly Lys Lys Thr Trp Phe 820 825 830 Ser Ile Pro Glu Lys Asn Arg Pro Leu Lys Gly Arg Ile Asn Leu Val 835 840 845 Leu Ser Arg Glu Leu Lys Glu Pro Pro Gln Gly Ala His Phe Leu Ser 850 855 860 Arg Ser Leu Asp Asp Ala Leu Lys Leu Thr Glu Gln Pro Glu Leu Ala 865 870 875 880 Asn Lys Val Asp Met Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Lys 885 890 895 Glu Ala Met Asn His Pro Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg Ile 900 905 910 Met Gln Asp Phe Glu Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Glu 915 920 925 Lys Tyr Lys Leu Leu Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gln 930 935 940 Glu Glu Lys Gly Ile Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp 945 950 955 960 <210> 21 <211> 6248 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P-BCMA-ALLO1 nanotransposon expressing a BCMA VCAR <400> 21 tgtacataga ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg 60 cgtaaaattg acgcatgtgt tttatcggtc tgtatatcga ggtttattta ttaatttgaa 120 tagatattaa gttttattat atttacactt acatactaat aataaattca acaaacaatt 180 tatttatgtt tatttattta ttaaaaaaaa acaaaaactc aaaatttctt ctataaagta 240 acaaaacttt tatcgaatac ctgcagcccg ggggatgcag agggacagcc cccccccaaa 300 gcccccaggg atgtaattac gtccctcccc cgctaggggg cagcagcgag ccgcccgggg 360 ctccgctccg gtccggcgct ccccccgcat ccccgagccg gcagcgtgcg gggacagccc 420 gggcacgggg aaggtggcac gggatcgctt tcctctgaac gcttctcgct gctctttgag 480 cctgcagaca cctgggggga tacggggaaa agttgactgt gcctttcgat cgaaccatgg 540 acagttagct ttgcaaagat ggataaagtt ttaaacagag aggaatcttt gcagctaatg 600 gaccttctag gtcttgaaag gagtgggaat tggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg 660 cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta 720 gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc 780 cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa 840 cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt 900 tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacc tggctgcagt acgtgattct 960 tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc 1020 cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat 1080 ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt 1140 ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga 1200 tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca 1260 gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta 1320 gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc 1380 ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc 1440 cggccctgct gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga 1500 gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac 1560 ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc 1620 tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt gggtggagac 1680 tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta attctccttg gaatttgccc tttttgagtt 1740 tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca 1800 ggtgtcgtga gaattctaat acgactcact atagggtgaa gcttgccacc atgggggtcc 1860 aggtggaaac aatctctccg ggggatgggc ggacattccc taaaaggggc cagacctgcg 1920 tggtgcatta caccggcatg ctggaagatg gcaagaaggt ggacagcagc cgggacagaa 1980 acaagccctt caagttcatg ctgggcaagc aagaagtgat cagaggctgg gaagagggcg 2040 tcgcccagat gtctgttgga cagagagcca agctgacaat cagccccgat tacgcctatg 2100 gcgccacagg acaccctggc atcattcctc cacatgccac actggtgttc gacgtggaac 2160 tgctgaagct ggaaggcggc ggaggatctg gctttggaga tgtgggagcc ctggaaagcc 2220 tgagaggcaa tgccgatctg gcctacatcc tgagcatgga accttgcggc cactgcctga 2280 ttatcaacaa cgtgaacttc tgtagagaga gcggcctgcg gaccagaacc ggcagcaata 2340 tcgattgcga gaagctgcgg cggagattca gcagcctgca cttcatggtg gaagtgaagg 2400 gcgacctgac cgccaagaaa atggtgctgg ctctgctgga actggcccag caagatcatg 2460 gcgccctgga ttgctgtgtg gtcgtgatcc tgtctcacgg ctgtcaggcc agccaccttc 2520 aattccctgg cgccgtgtat ggcacagatg gctgtcctgt gtccgtggaa aagatcgtga 2580 acatcttcaa cggcaccagc tgtcctagcc tcggcggaaa gcccaagctg ttcttcatcc 2640 aagcctgtgg cggcgagcag aaggatcacg gatttgaggt ggccagcaca agccccgagg 2700 atgagtctcc tggaagcaac cctgagcctg acgccacacc tttccaagag ggcctgagaa 2760 ccttcgacca gctggacgct atcagctccc tgcctacacc tagcgacatc ttcgtgtcct 2820 acagcacatt ccccggcttt gtgtcttggc gggaccctaa gtctggctct tggtacgtgg 2880 aaaccctgga cgacatcttt gagcagtggg ctcacagcga ggacctccag tctctgctgc 2940 tgagagtggc caatgccgtg tccgtgaagg gcatctacaa gcagatgcct ggctgcttca 3000 acttcctgcg gaagaagctg tttttcaaga ccagcggcag cggcgaaggc agaggatccc 3060 ttttgacatg cggcgatgtg gaagagaacc ccggacctat ggctctgcct gtgacagctc 3120 tgcttctgcc tctggcactg cttcttcatg cggcgcgccc tgaagttcag ctgcttgaat 3180 ctggcggagg cctggttcaa cctggcggat ctctgagact gagctgtgcc gccagcggct 3240 tcaccttcag caattacgcc atgacctgga tcagacaggc ccctggcaaa ggcctggaat 3300 gggtgtccgg aattacaggc gacggcggca gcacctttta cgccgattct gtgaagggca 3360 gattcaccat cagccgggac aacagcaaga acaccctgta cctgcagatg aacagcctga 3420 gagccgagga caccgccgtg tactactgcg tgaaggactg gaacaccacc atgatcaccg 3480 agagaggcca gggcacactg gtcaccgtgt cctctacaac aacaccggcg cctagacctc 3540 caacaccagc tcctacaatc gcgagtcagc ccctgtctct cagacccgaa gcctgcaggc 3600 cagctgcagg aggagctgtg cacaccaggg gcctggactt cgcctgcgac atctacattt 3660 gggcaccact ggccgggacc tgtggagtgc tgctgctgag cctggtcatc acactgtact 3720 gcaagagagg caggaagaaa ctgctgtata ttttcaaaca gcccttcatg cgccccgtgc 3780 agactaccca ggaggaagac gggtgctcct gtcgattccc tgaggaagag gaaggcgggt 3840 gtgagctgcg cgtgaagttt agtcgatcag cagatgcccc agcttacaaa cagggacaga 3900 accagctgta taacgagctg aatctgggcc gccgagagga atatgacgtg ctggataagc 3960 ggagaggacg cgaccccgaa atgggaggca agcccaggcg caaaaaccct caggaaggcc 4020 tgtataacga gctgcagaag gacaaaatgg cagaagccta ttctgagatc ggcatgaagg 4080 gggagcgacg gagaggcaaa gggcacgatg ggctgtacca gggactgagc accgccacaa 4140 aggacaccta tgatgctctg catatgcagg cactgcctcc aaggggaagt ggagaaggac 4200 gaggatcact gctgacatgc ggcgacgtgg aggaaaaccc tggcccaatg gtcgggtctc 4260 tgaattgtat cgtcgccgtg agtcagaaca tgggcattgg gaagaatggc gatttcccat 4320 ggccacctct gcgcaacgag tcccgatact ttcagcggat gacaactacc tcctctgtgg 4380 aagggaaaca gaatctggtc atcatgggaa agaaaacttg gttcagcatt ccagagaaga 4440 accggcccct gaaaggcaga atcaatctgg tgctgtcccg agaactgaag gagccaccac 4500 agggagctca ctttctgagc cggtccctgg acgatgcact gaagctgaca gaacagcctg 4560 agctggccaa caaagtcgat atggtgtgga tcgtcggggg aagttcagtg tataaggagg 4620 ccatgaatca ccccggccat ctgaaactgt tcgtcacacg gatcatgcag gactttgaga 4680 gcgatacttt ctttcctgaa attgacctgg agaagtacaa actgctgccc gaatatcctg 4740 gcgtgctgtc cgatgtccag gaagagaaag gcatcaaata caagttcgag gtctatgaga 4800 agaatgacta ataaggtacc gatcacatat gcctttaatt aaacactagt tctatagtgt 4860 cacctaaatt ccctttagtg agggttaatg gccgtaggcc gccagaattg ggtccagaca 4920 tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct 4980 ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac 5040 aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag gtgtgggagg 5100 ttttttcgga ctctaggacc tgcgcatgcg cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 5160 tgttttcccc gtatcccccc aggtgtctgc aggctcaaag agcagcgaga agcgttcaga 5220 ggaaagcgat cccgtgccac cttccccgtg cccgggctgt ccccgcacgc tgccggctcg 5280 gggatgcggg gggagcgccg gaccggagcg gagccccggg cggctcgctg ctgcccccta 5340 gcgggggagg gacgtaatta catccctggg ggctttgggg gggggctgtc cctctcaccg 5400 cggtggagct ccagcttttg ttcgaattgg ggccccccct cgagggtatc gatgatatct 5460 ataacaagaa aatatatata taataagtta tcacgtaagt agaacatgaa ataacaatat 5520 aattatcgta tgagttaaat cttaaaagtc acgtaaaaga taatcatgcg tcattttgac 5580 tcacgcggtc gttatagttc aaaatcagtg acacttaccg cattgacaag cacgcctcac 5640 gggagctcca agcggcgact gagatgtcct aaatgcacag cgacggattc gcgctattta 5700 gaaagagaga gcaatatttc aagaatgcat gcgtcaattt tacgcagact atctttctag 5760 ggttaatcta gctagcctta agggcgcagc ccgcctaatg agcgggcttt tttttggctt 5820 gttgtccaca accgttaaac cttaaaagct ttaaaagcct tatatattct tttttttctt 5880 ataaaactta aaaccttaga ggctatttaa gttgctgatt tatattaatt ttattgttca 5940 aacatgagag cttagtacgt gaaacatgag agcttagtac gttagccatg agagcttagt 6000 acgttagcca tgagggttta gttcgttaaa catgagagct tagtacgtta aacatgagag 6060 cttagtacgt actatcaaca ggttgaactg ctgatccacg ttgtggtaga attggtaaag 6120 agagtcgtgt aaaatatcga gttcgcacat cttgttgtct gattattgat ttttggcgaa 6180 accatttgat catatgacaa gatgtgtatc taccttaact taatgatttt gataaaaatc 6240 attaggta 6248 <210> 22 <211> 1086 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA VCAR <400> 22 atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60 cctgaagttc agctgcttga atctggcgga ggcctggttc aacctggcgg atctctgaga 120 ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc agcaattacg ccatgacctg gatcagacag 180 gcccctggca aaggcctgga atgggtgtcc ggaattacag gcgacggcgg cagcaccttt 240 tacgccgatt ctgtgaaggg cagattcacc atcagccggg acaacagcaa gaacaccctg 300 tacctgcaga tgaacagcct gagagccgag gacaccgccg tgtactactg cgtgaaggac 360 tggaacacca ccatgatcac cgagagaggc cagggcacac tggtcaccgt gtcctctaca 420 acaacaccgg cgcctagacc tccaacacca gctcctacaa tcgcgagtca gcccctgtct 480 ctcagacccg aagcctgcag gccagctgca ggaggagctg tgcacaccag gggcctggac 540 ttcgcctgcg acatctacat ttgggcacca ctggccggga cctgtggagt gctgctgctg 600 agcctggtca tcacactgta ctgcaagaga ggcaggaaga aactgctgta tattttcaaa 660 cagcccttca tgcgccccgt gcagactacc caggaggaag acgggtgctc ctgtcgattc 720 cctgaggaag aggaaggcgg gtgtgagctg cgcgtgaagt ttagtcgatc agcagatgcc 780 ccagcttaca aacagggaca gaaccagctg tataacgagc tgaatctggg ccgccgagag 840 gaatatgacg tgctggataa gcggagagga cgcgaccccg aaatgggagg caagcccagg 900 cgcaaaaacc ctcaggaagg cctgtataac gagctgcaga aggacaaaat ggcagaagcc 960 tattctgaga tcggcatgaa gggggagcga cggagaggca aagggcacga tgggctgtac 1020 cagggactga gcaccgccac aaaggacacc tatgatgctc tgcatatgca ggcactgcct 1080 ccaagg 1086 <210> 23 <211> 570 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P-BCMA-ALLO1 amino acid sequence <400> 23 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Thr Gly Asp Gly Gly Ser Thr Phe 65 70 75 80 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Val Lys Asp Trp Asn Thr Thr Met Ile Thr Glu 115 120 125 Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala 130 135 140 Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr 165 170 175 Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala 180 185 190 Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 195 200 205 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 210 215 220 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 225 230 235 240 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 245 250 255 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 260 265 270 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 275 280 285 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 290 295 300 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 305 310 315 320 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 325 330 335 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 340 345 350 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg 355 360 365 Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met 370 375 380 Val Gly Ser Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly Ile 385 390 395 400 Gly Lys Asn Gly Asp Phe Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Ser Arg 405 410 415 Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln Asn 420 425 430 Leu Val Ile Met Gly Lys Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys Asn 435 440 445 Arg Pro Leu Lys Gly Arg Ile Asn Leu Val Leu Ser Arg Glu Leu Lys 450 455 460 Glu Pro Pro Gln Gly Ala His Phe Leu Ser Arg Ser Leu Asp Asp Ala 465 470 475 480 Leu Lys Leu Thr Glu Gln Pro Glu Leu Ala Asn Lys Val Asp Met Val 485 490 495 Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Lys Glu Ala Met Asn His Pro 500 505 510 Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Asp Phe Glu Ser 515 520 525 Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Glu Lys Tyr Lys Leu Leu Pro 530 535 540 Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile Lys 545 550 555 560 Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp 565 570 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITR <400> 24 ccctagaaag atagtctgcg taaaattgac gcatg 35 <210> 25 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITR <400> 25 ccctagaaag ataatcatat tgtgacgtac gttaaagata atcatgcgta aaattgacgc 60 atg 63 <210> 26 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITR <400> 26 ccctagaaag ataatcatat tgtgacgtac gttaaagata atcatgcgta aaattgacgc 60 atg 63 <210> 27 <211> 241 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITR <400> 27 ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg tgtaaaattg 60 acgcatgtgt tttatcggtc tgtatatcga ggtttattta ttaatttgaa tagatattaa 120 gttttattat atttacactt acatactaat aataaattca acaaacaatt tatttatgtt 180 tatttattta ttaaaaaaaa caaaaactca aaatttcttc tataaagtaa caaaactttt 240 a 241 <210> 28 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA centyrin <400> 28 Ala Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala 1 5 10 15 Ala Gly Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gly 20 25 30 Cys Cys Gly Gly Ala Thr Cys Ala Cys Ala Gly Ala Gly Gly Ala Cys 35 40 45 Thr Cys Cys Gly Cys Cys Ala Gly Ala Cys Thr Gly Thr Cys Thr Thr 50 55 60 Gly Gly Ala Cys Cys Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Gly Cys 65 70 75 80 Cys Gly Cys Cys Thr Thr Cys Gly Ala Thr Thr Cys Cys Thr Thr Thr 85 90 95 Cys Cys Ala Ala Thr Cys Cys Gly Gly Thr Ala Cys Ala Thr Cys Gly 100 105 110 Ala Gly Ala Cys Ala Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly 130 135 140 Gly Ala Cys Gly Thr Gly Cys Cys Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Gly 145 150 155 160 Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Cys Thr Ala Cys Gly Ala Thr Cys Thr 165 170 175 Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr 180 185 190 Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly Thr Ala Thr Gly Cys Ala Gly 195 200 205 Thr Gly Gly Thr Cys Ala Thr Cys Ala Cys Ala Gly Gly Ala Gly Thr 210 215 220 Gly Ala Ala Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys 225 230 235 240 Ala Gly Cys Thr Cys Cys Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly 245 250 255 Cys Cys Thr Cys Thr Thr Thr Thr Ala Cys Cys Ala Cys Ala 260 265 270 <210> 29 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA centyrin <400> 29 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Ile Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Pro Ile Arg Tyr Ile Glu Thr Leu Ile Trp Gly Glu Ala Ile Trp Leu 35 40 45 Asp Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Ala Val Val Ile Thr Gly Val Lys Gly Gly Arg Phe 65 70 75 80 Ser Ser Pro Leu Val Ala Ser Phe Thr Thr 85 90 <210> 30 <211> 334 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA CARTyrin <400> 30 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser 20 25 30 Arg Ile Thr Glu Asp Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala 35 40 45 Ala Phe Asp Ser Phe Pro Ile Arg Tyr Ile Glu Thr Leu Ile Trp Gly 50 55 60 Glu Ala Ile Trp Leu Asp Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu 65 70 75 80 Thr Gly Leu Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Ala Val Val Ile Thr Gly Val 85 90 95 Lys Gly Gly Arg Phe Ser Ser Pro Leu Val Ala Ser Phe Thr Thr Thr 100 105 110 Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser 115 120 125 Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly 130 135 140 Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp 145 150 155 160 Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile 165 170 175 Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys 180 185 190 Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys 195 200 205 Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val 210 215 220 Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn 225 230 235 240 Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 245 250 255 Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 260 265 270 Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 275 280 285 Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 290 295 300 Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 305 310 315 320 Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 325 330 <210> 31 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 signal peptide <400> 31 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 32 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 Signal Peptide <400> 32 atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60 cct 63 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 33 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 34 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 34 ggcggaggcg gtagcggtgg cggaggtagc ggaggtggtg gatct 45 <210> 35 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8a Hinge <400> 35 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 36 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8a Hinge <400> 36 accacaacac cggcgcctag acctccaaca ccagctccta caatcgcgag tcagcccctg 60 tctctcagac ccgaagcctg caggccagct gcaggaggag ctgtgcacac caggggcctg 120 gacttcgcct gcgac 135 <210> 37 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8a TM <400> 37 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 20 <210> 38 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8a TM <400> 38 atctacattt gggcaccact ggccgggacc tgtggagtgc tgctgctgag cctggtcatc 60 acactgtact gc 72 <210> 39 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 41BB ICS <400> 39 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 40 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 41BB ICS <400> 40 aagagaggca ggaagaaact gctgtatatt ttcaaacagc ccttcatgcg ccccgtgcag 60 actacccagg aggaagacgg gtgctcctgt cgattccctg aggaagagga aggcgggtgt 120 gagctg 126 <210> 41 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3z ICS <400> 41 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 42 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 41BB ICS <400> 42 cgcgtgaagt ttagtcgatc agcagatgcc ccagcttaca aacagggaca gaaccagctg 60 tataacgagc tgaatctggg ccgccgagag gaatatgacg tgctggataa gcggagagga 120 cgcgaccccg aaatgggagg caagcccagg cgcaaaaacc ctcaggaagg cctgtataac 180 gagctgcaga aggacaaaat ggcagaagcc tattctgaga tcggcatgaa gggggagcga 240 cggagaggca aagggcacga tgggctgtac cagggactga gcaccgccac aaaggacacc 300 tatgatgctc tgcatatgca ggcactgcct ccaagg 336 <210> 43 <211> 1053 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SCas9 - 40-18163 <400> 43 Met Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val 1 5 10 15 Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly 20 25 30 Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg 35 40 45 Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile 50 55 60 Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His 65 70 75 80 Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu 85 90 95 Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu 100 105 110 Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr 115 120 125 Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala 130 135 140 Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys 145 150 155 160 Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr 165 170 175 Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln 180 185 190 Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg 195 200 205 Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys 210 215 220 Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe 225 230 235 240 Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr 245 250 255 Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn 260 265 270 Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe 275 280 285 Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu 290 295 300 Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys 305 310 315 320 Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr 325 330 335 Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala 340 345 350 Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu 355 360 365 Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser 370 375 380 Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile 385 390 395 400 Asn Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile Ala 405 410 415 Ile Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln 420 425 430 Gln Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro 435 440 445 Val Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile 450 455 460 Ile Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg 465 470 475 480 Glu Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys 485 490 495 Arg Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr 500 505 510 Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp 515 520 525 Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu 530 535 540 Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro 545 550 555 560 Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys 565 570 575 Gln Glu Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu 580 585 590 Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile 595 600 605 Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu 610 615 620 Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp 625 630 635 640 Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Gly Leu 645 650 655 Met Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys 660 665 670 Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp 675 680 685 Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp 690 695 700 Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys 705 710 715 720 Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys 725 730 735 Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu 740 745 750 Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp 755 760 765 Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Glu Leu Ile 770 775 780 Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu 785 790 795 800 Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu 805 810 815 Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His 820 825 830 Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly 835 840 845 Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr 850 855 860 Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile 865 870 875 880 Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp 885 890 895 Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr 900 905 910 Arg Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val 915 920 925 Lys Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser 930 935 940 Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala 945 950 955 960 Glu Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Asn Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly 965 970 975 Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile 980 985 990 Glu Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Asn Met 995 1000 1005 Asn Asp Lys Arg Pro Pro Arg Ile Ile Lys Thr Ile Ala Ser Lys 1010 1015 1020 Thr Gln Ser Ile Lys Lys Tyr Ser Thr Asp Ile Leu Gly Asn Leu 1025 1030 1035 Tyr Glu Val Lys Ser Lys Lys His Pro Gln Ile Ile Lys Lys Gly 1040 1045 1050 <210> 44 <211> 1053 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dSaCas9 - 40-18164 <400> 44 Met Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Ala Ile Gly Ile Thr Ser Val 1 5 10 15 Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly 20 25 30 Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg 35 40 45 Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile 50 55 60 Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His 65 70 75 80 Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu 85 90 95 Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu 100 105 110 Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr 115 120 125 Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala 130 135 140 Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys 145 150 155 160 Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr 165 170 175 Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln 180 185 190 Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg 195 200 205 Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys 210 215 220 Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe 225 230 235 240 Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr 245 250 255 Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn 260 265 270 Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe 275 280 285 Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu 290 295 300 Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys 305 310 315 320 Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr 325 330 335 Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala 340 345 350 Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu 355 360 365 Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser 370 375 380 Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile 385 390 395 400 Asn Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile Ala 405 410 415 Ile Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln 420 425 430 Gln Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro 435 440 445 Val Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile 450 455 460 Ile Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg 465 470 475 480 Glu Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys 485 490 495 Arg Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr 500 505 510 Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp 515 520 525 Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu 530 535 540 Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro 545 550 555 560 Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys 565 570 575 Gln Glu Glu Ala Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu 580 585 590 Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile 595 600 605 Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu 610 615 620 Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp 625 630 635 640 Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Gly Leu 645 650 655 Met Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys 660 665 670 Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp 675 680 685 Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp 690 695 700 Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys 705 710 715 720 Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys 725 730 735 Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu 740 745 750 Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp 755 760 765 Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Glu Leu Ile 770 775 780 Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu 785 790 795 800 Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu 805 810 815 Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His 820 825 830 Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly 835 840 845 Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr 850 855 860 Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile 865 870 875 880 Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp 885 890 895 Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr 900 905 910 Arg Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val 915 920 925 Lys Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser 930 935 940 Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala 945 950 955 960 Glu Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Asn Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly 965 970 975 Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile 980 985 990 Glu Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Asn Met 995 1000 1005 Asn Asp Lys Arg Pro Pro Arg Ile Ile Lys Thr Ile Ala Ser Lys 1010 1015 1020 Thr Gln Ser Ile Lys Lys Tyr Ser Thr Asp Ile Leu Gly Asn Leu 1025 1030 1035 Tyr Glu Val Lys Ser Lys Lys His Pro Gln Ile Ile Lys Lys Gly 1040 1045 1050 <210> 45 <211> 1368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dCas9 - 40-18165 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 45 Xaa Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala 1010 1015 1020 Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe 1025 1030 1035 Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala 1040 1045 1050 Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu 1055 1060 1065 Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val 1070 1075 1080 Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr 1085 1090 1095 Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys 1100 1105 1110 Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro 1115 1120 1125 Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val 1130 1135 1140 Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys 1145 1150 1155 Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser 1160 1165 1170 Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys 1175 1180 1185 Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu 1190 1195 1200 Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly 1205 1210 1215 Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val 1220 1225 1230 Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys 1250 1255 1260 His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys 1265 1270 1275 Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala 1280 1285 1290 Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn 1295 1300 1305 Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala 1310 1315 1320 Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser 1325 1330 1335 Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr 1340 1345 1350 Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1355 1360 1365 <210> 46 <211> 1368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dCas9 - 40-18166 <400> 46 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala 1010 1015 1020 Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe 1025 1030 1035 Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala 1040 1045 1050 Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu 1055 1060 1065 Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val 1070 1075 1080 Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr 1085 1090 1095 Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys 1100 1105 1110 Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro 1115 1120 1125 Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val 1130 1135 1140 Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys 1145 1150 1155 Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser 1160 1165 1170 Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys 1175 1180 1185 Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu 1190 1195 1200 Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly 1205 1210 1215 Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val 1220 1225 1230 Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys 1250 1255 1260 His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys 1265 1270 1275 Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala 1280 1285 1290 Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn 1295 1300 1305 Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala 1310 1315 1320 Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser 1325 1330 1335 Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr 1340 1345 1350 Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1355 1360 1365 <210> 47 <211> 199 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clo051 - 40-18030 <400> 47 Glu Gly Ile Lys Ser Asn Ile Ser Leu Leu Lys Asp Glu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Gln Ile Ser His Ile Ser His Glu Tyr Leu Ser Leu Ile Asp Leu Ala 20 25 30 Phe Asp Ser Lys Gln Asn Arg Leu Phe Glu Met Lys Val Leu Glu Leu 35 40 45 Leu Val Asn Glu Tyr Gly Phe Lys Gly Arg His Leu Gly Gly Ser Arg 50 55 60 Lys Pro Asp Gly Ile Val Tyr Ser Thr Thr Leu Glu Asp Asn Phe Gly 65 70 75 80 Ile Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Glu Gly Tyr Ser Leu Pro Ile 85 90 95 Ser Gln Ala Asp Glu Met Glu Arg Tyr Val Arg Glu Asn Ser Asn Arg 100 105 110 Asp Glu Glu Val Asn Pro Asn Lys Trp Trp Glu Asn Phe Ser Glu Glu 115 120 125 Val Lys Lys Tyr Tyr Phe Val Phe Ile Ser Gly Ser Phe Lys Gly Lys 130 135 140 Phe Glu Glu Gln Leu Arg Arg Leu Ser Met Thr Thr Gly Val Asn Gly 145 150 155 160 Ser Ala Val Asn Val Val Asn Leu Leu Leu Gly Ala Glu Lys Ile Arg 165 170 175 Ser Gly Glu Met Thr Ile Glu Glu Leu Glu Arg Ala Met Phe Asn Asn 180 185 190 Ser Glu Phe Ile Leu Lys Tyr 195 <210> 48 <211> 1591 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dCas9-Clo051 - 40-18168 <400> 48 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Gly Ile Lys Ser Asn Ile 1 5 10 15 Ser Leu Leu Lys Asp Glu Leu Arg Gly Gln Ile Ser His Ile Ser His 20 25 30 Glu Tyr Leu Ser Leu Ile Asp Leu Ala Phe Asp Ser Lys Gln Asn Arg 35 40 45 Leu Phe Glu Met Lys Val Leu Glu Leu Leu Val Asn Glu Tyr Gly Phe 50 55 60 Lys Gly Arg His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ile Val Tyr 65 70 75 80 Ser Thr Thr Leu Glu Asp Asn Phe Gly Ile Ile Val Asp Thr Lys Ala 85 90 95 Tyr Ser Glu Gly Tyr Ser Leu Pro Ile Ser Gln Ala Asp Glu Met Glu 100 105 110 Arg Tyr Val Arg Glu Asn Ser Asn Arg Asp Glu Glu Val Asn Pro Asn 115 120 125 Lys Trp Trp Glu Asn Phe Ser Glu Glu Val Lys Lys Tyr Tyr Phe Val 130 135 140 Phe Ile Ser Gly Ser Phe Lys Gly Lys Phe Glu Glu Gln Leu Arg Arg 145 150 155 160 Leu Ser Met Thr Thr Gly Val Asn Gly Ser Ala Val Asn Val Val Asn 165 170 175 Leu Leu Leu Gly Ala Glu Lys Ile Arg Ser Gly Glu Met Thr Ile Glu 180 185 190 Glu Leu Glu Arg Ala Met Phe Asn Asn Ser Glu Phe Ile Leu Lys Tyr 195 200 205 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly 210 215 220 Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro 225 230 235 240 Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys 245 250 255 Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu 260 265 270 Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys 275 280 285 Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys 290 295 300 Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu 305 310 315 320 Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp 325 330 335 Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys 340 345 350 Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu 355 360 365 Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly 370 375 380 Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu 385 390 395 400 Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser 405 410 415 Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg 420 425 430 Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly 435 440 445 Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe 450 455 460 Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys 465 470 475 480 Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp 485 490 495 Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile 500 505 510 Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro 515 520 525 Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu 530 535 540 Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys 545 550 555 560 Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp 565 570 575 Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu 580 585 590 Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu 595 600 605 Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His 610 615 620 Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp 625 630 635 640 Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu 645 650 655 Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser 660 665 670 Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp 675 680 685 Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile 690 695 700 Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu 705 710 715 720 Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu 725 730 735 Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu 740 745 750 Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn 755 760 765 Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile 770 775 780 Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn 785 790 795 800 Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys 805 810 815 Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val 820 825 830 Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu 835 840 845 Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys 850 855 860 Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn 865 870 875 880 Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys 885 890 895 Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp 900 905 910 Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln 915 920 925 Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala 930 935 940 Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val 945 950 955 960 Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala 965 970 975 Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg 980 985 990 Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu 995 1000 1005 Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu 1010 1015 1020 Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln 1025 1030 1035 Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile 1040 1045 1050 Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val 1055 1060 1065 Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro 1070 1075 1080 Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu 1085 1090 1095 Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr 1100 1105 1110 Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe 1115 1120 1125 Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val 1130 1135 1140 Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn 1145 1150 1155 Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys 1160 1165 1170 Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 1175 1180 1185 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala 1190 1195 1200 Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser 1205 1210 1215 Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met 1220 1225 1230 Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr 1235 1240 1245 Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr 1250 1255 1260 Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn 1265 1270 1275 Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala 1280 1285 1290 Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys 1295 1300 1305 Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu 1310 1315 1320 Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp 1325 1330 1335 Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr 1340 1345 1350 Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys 1355 1360 1365 Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg 1370 1375 1380 Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly 1385 1390 1395 Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr 1400 1405 1410 Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser 1415 1420 1425 Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys 1430 1435 1440 Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys 1445 1450 1455 Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln 1460 1465 1470 His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe 1475 1480 1485 Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu 1490 1495 1500 Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala 1505 1510 1515 Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro 1520 1525 1530 Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr 1535 1540 1545 Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser 1550 1555 1560 Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly 1565 1570 1575 Gly Asp Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ser Ser 1580 1585 1590 <210> 49 <211> 4776 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dCas9-Clo051 - 40-18169 <400> 49 atggcaccaa agaagaaaag aaaagtggag ggcatcaagt caaacatcag cctgctgaaa 60 gacgaactgc ggggacagat tagtcacatc agtcacgagt acctgtcact gattgatctg 120 gccttcgaca gcaagcagaa tagactgttt gagatgaaag tgctggaact gctggtcaac 180 gagtatggct tcaagggcag acatctgggc gggtctagga aacctgacgg catcgtgtac 240 agtaccacac tggaagacaa cttcggaatc attgtcgata ccaaggctta ttccgagggc 300 tactctctgc caattagtca ggcagatgag atggaaaggt acgtgcgcga aaactcaaat 360 agggacgagg aagtcaaccc caataagtgg tgggagaatt tcagcgagga agtgaagaaa 420 tactacttcg tctttatctc aggcagcttc aaagggaagt ttgaggaaca gctgcggaga 480 ctgtccatga ctaccggggt gaacggatct gctgtcaacg tggtcaatct gctgctgggc 540 gcagaaaaga tcaggtccgg ggagatgaca attgaggaac tggaacgcgc catgttcaac 600 aattctgagt ttatcctgaa gtatggaggc gggggaagcg ataagaaata ctccatcgga 660 ctggccattg gcaccaattc cgtgggctgg gctgtcatca cagacgagta caaggtgcca 720 agcaagaagt tcaaggtcct ggggaacacc gatcgccaca gtatcaagaa aaatctgatt 780 ggagccctgc tgttcgactc aggcgagact gctgaagcaa cccgactgaa gcggactgct 840 aggcgccgat atacccggag aaaaaatcgg atctgctacc tgcaggaaat tttcagcaac 900 gagatggcca aggtggacga tagtttcttt caccgcctgg aggaatcatt cctggtggag 960 gaagataaga aacacgagcg gcatcccatc tttggcaaca ttgtggacga agtcgcttat 1020 cacgagaagt accctactat ctatcatctg aggaagaaac tggtggactc caccgataag 1080 gcagacctgc gcctgatcta tctggccctg gctcacatga tcaagttccg ggggcatttt 1140 ctgatcgagg gagatctgaa ccctgacaat tctgatgtgg acaagctgtt catccagctg 1200 gtccagacat acaatcagct gtttgaggaa aacccaatta atgcctcagg cgtggacgca 1260 aaggccatcc tgagcgccag actgtccaaa tctaggcgcc tggaaaacct gatcgctcag 1320 ctgccaggag agaagaaaaa cggcctgttt gggaatctga ttgcactgtc cctgggcctg 1380 acacccaact tcaagtctaa ttttgatctg gccgaggacg ctaagctgca gctgtccaaa 1440 gacacttatg acgatgacct ggataacctg ctggctcaga tcggcgatca gtacgcagac 1500 ctgttcctgg ccgctaagaa tctgagtgac gccatcctgc tgtcagatat tctgcgcgtg 1560 aacacagaga ttactaaggc cccactgagt gcttcaatga tcaaaagata tgacgagcac 1620 catcaggatc tgaccctgct gaaggctctg gtgaggcagc agctgcccga gaaatacaag 1680 gaaatcttct ttgatcagag caagaatgga tacgccggct atattgacgg cggggcttcc 1740 caggaggagt tctacaagtt catcaagccc attctggaaa agatggacgg caccgaggaa 1800 ctgctggtga agctgaatcg ggaggacctg ctgagaaaac agaggacatt tgataacgga 1860 agcatccctc accagattca tctgggcgaa ctgcacgcca tcctgcgacg gcaggaggac 1920 ttctacccat ttctgaagga taaccgcgag aaaatcgaaa agatcctgac cttcagaatc 1980 ccctactatg tggggcctct ggcacgggga aatagtagat ttgcctggat gacaagaaag 2040 tcagaggaaa ctatcacccc ctggaacttc gaggaagtgg tcgataaagg cgctagcgca 2100 cagtccttca ttgaaaggat gacaaatttt gacaagaacc tgccaaatga gaaggtgctg 2160 cccaaacaca gcctgctgta cgaatatttc acagtgtata acgagctgac taaagtgaag 2220 tacgtcaccg aagggatgcg caagcccgca ttcctgtccg gagagcagaa gaaagccatc 2280 gtggacctgc tgtttaagac aaatcggaaa gtgactgtca aacagctgaa ggaagactat 2340 ttcaagaaaa ttgagtgttt cgattcagtg gaaatcagcg gcgtcgagga caggtttaac 2400 gcctccctgg ggacctacca cgatctgctg aagatcatca aggataagga cttcctggac 2460 aacgaggaaa atgaggacat cctggaggac attgtgctga cactgactct gtttgaggat 2520 cgcgaaatga tcgaggaacg actgaagact tatgcccatc tgttcgatga caaagtgatg 2580 aagcagctga aaagaaggcg ctacaccgga tggggacgcc tgagccgaaa actgatcaat 2640 gggattagag acaagcagag cggaaaaact atcctggact ttctgaagtc cgatggcttc 2700 gccaacagga acttcatgca gctgattcac gatgactctc tgaccttcaa ggaggacatc 2760 cagaaagcac aggtgtctgg ccagggggac agtctgcacg agcatatcgc aaacctggcc 2820 ggcagccccg ccatcaagaa agggattctg cagaccgtga aggtggtgga cgaactggtc 2880 aaggtcatgg gacgacacaa acctgagaac atcgtgattg agatggcccg cgaaaatcag 2940 acaactcaga agggccagaa aaacagtcga gaacggatga agagaatcga ggaaggcatc 3000 aaggagctgg ggtcacagat cctgaaggag catcctgtgg aaaacactca gctgcagaat 3060 gagaaactgt atctgtacta tctgcagaat ggacgggata tgtacgtgga ccaggagctg 3120 gatattaaca gactgagtga ttatgacgtg gatgccatcg tccctcagag cttcctgaag 3180 gatgactcca ttgacaacaa ggtgctgacc aggtccgaca agaaccgcgg caaatcagat 3240 aatgtgccaa gcgaggaagt ggtcaagaaa atgaagaact actggaggca gctgctgaat 3300 gccaagctga tcacacagcg gaaatttgat aacctgacta aggcagaaag aggaggcctg 3360 tctgagctgg acaaggccgg cttcatcaag cggcagctgg tggagacaag acagatcact 3420 aagcacgtcg ctcagattct ggatagcaga atgaacacaa agtacgatga aaacgacaag 3480 ctgatcaggg aggtgaaagt cattactctg aaatccaagc tggtgtctga ctttagaaag 3540 gatttccagt tttataaagt cagggagatc aacaactacc accatgctca tgacgcatac 3600 ctgaacgcag tggtcgggac cgccctgatt aagaaatacc ccaagctgga gtccgagttc 3660 gtgtacggag actataaagt gtacgatgtc cggaagatga tcgccaaatc tgagcaggaa 3720 attggcaagg ccaccgctaa gtatttcttt tacagtaaca tcatgaattt ctttaagacc 3780 gaaatcacac tggcaaatgg ggagatcaga aaaaggcctc tgattgagac caacggggag 3840 acaggagaaa tcgtgtggga caagggaagg gattttgcta ccgtgcgcaa agtcctgtcc 3900 atgccccaag tgaatattgt caagaaaact gaagtgcaga ccgggggatt ctctaaggag 3960 agtattctgc ctaagcgaaa ctctgataaa ctgatcgccc ggaagaaaga ctgggacccc 4020 aagaagtatg gcgggttcga ctctccaaca gtggcttaca gtgtcctggt ggtcgcaaag 4080 gtggaaaagg ggaagtccaa gaaactgaag tctgtcaaag agctgctggg aatcactatt 4140 atggaacgca gctccttcga gaagaatcct atcgattttc tggaagccaa gggctataaa 4200 gaggtgaaga aagacctgat cattaagctg ccaaaatact cactgtttga gctggaaaac 4260 ggacgaaagc gaatgctggc aagcgccgga gaactgcaga agggcaatga gctggccctg 4320 ccctccaaat acgtgaactt cctgtatctg gctagccact acgagaaact gaaggggtcc 4380 cctgaggata acgaacagaa gcagctgttt gtggagcagc acaaacatta tctggacgag 4440 atcattgaac agatttcaga gttcagcaag agagtgatcc tggctgacgc aaatctggat 4500 aaagtcctga gcgcatacaa caagcaccga gacaaaccaa tccgggagca ggccgaaaat 4560 atcattcatc tgttcaccct gacaaacctg ggcgcccctg cagccttcaa gtattttgac 4620 accacaatcg atcggaagag atacacttct accaaagagg tgctggatgc taccctgatc 4680 caccagagta ttaccggcct gtatgagaca cgcatcgacc tgtcacagct gggaggcgat 4740 gggagcccca agaaaaagcg gaaggtgtct agttaa 4776 <210> 50 <211> 1588 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dCas9-Clo051 - 40-18170 <400> 50 Met Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Gly Ile Lys Ser Asn Ile Ser 1 5 10 15 Leu Leu Lys Asp Glu Leu Arg Gly Gln Ile Ser His Ile Ser His Glu 20 25 30 Tyr Leu Ser Leu Ile Asp Leu Ala Phe Asp Ser Lys Gln Asn Arg Leu 35 40 45 Phe Glu Met Lys Val Leu Glu Leu Leu Val Asn Glu Tyr Gly Phe Lys 50 55 60 Gly Arg His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ile Val Tyr Ser 65 70 75 80 Thr Thr Leu Glu Asp Asn Phe Gly Ile Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Tyr Ser Leu Pro Ile Ser Gln Ala Asp Glu Met Glu Arg 100 105 110 Tyr Val Arg Glu Asn Ser Asn Arg Asp Glu Glu Val Asn Pro Asn Lys 115 120 125 Trp Trp Glu Asn Phe Ser Glu Glu Val Lys Lys Tyr Tyr Phe Val Phe 130 135 140 Ile Ser Gly Ser Phe Lys Gly Lys Phe Glu Glu Gln Leu Arg Arg Leu 145 150 155 160 Ser Met Thr Thr Gly Val Asn Gly Ser Ala Val Asn Val Val Asn Leu 165 170 175 Leu Leu Gly Ala Glu Lys Ile Arg Ser Gly Glu Met Thr Ile Glu Glu 180 185 190 Leu Glu Arg Ala Met Phe Asn Asn Ser Glu Phe Ile Leu Lys Tyr Gly 195 200 205 Gly Gly Gly Ser Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr 210 215 220 Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser 225 230 235 240 Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys 245 250 255 Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala 260 265 270 Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn 275 280 285 Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val 290 295 300 Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu 305 310 315 320 Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu 325 330 335 Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys 340 345 350 Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala 355 360 365 Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp 370 375 380 Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val 385 390 395 400 Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly 405 410 415 Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg 420 425 430 Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu 435 440 445 Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys 450 455 460 Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp 465 470 475 480 Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln 485 490 495 Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu 500 505 510 Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu 515 520 525 Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr 530 535 540 Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu 545 550 555 560 Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly 565 570 575 Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu 580 585 590 Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp 595 600 605 Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln 610 615 620 Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe 625 630 635 640 Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr 645 650 655 Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg 660 665 670 Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn 675 680 685 Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu 690 695 700 Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro 705 710 715 720 Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr 725 730 735 Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser 740 745 750 Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg 755 760 765 Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu 770 775 780 Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala 785 790 795 800 Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp 805 810 815 Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu 820 825 830 Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys 835 840 845 Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg 850 855 860 Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly 865 870 875 880 Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser 885 890 895 Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser 900 905 910 Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly 915 920 925 Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile 930 935 940 Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys 945 950 955 960 Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg 965 970 975 Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met 980 985 990 Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys 995 1000 1005 Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr 1010 1015 1020 Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu 1025 1030 1035 Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val 1040 1045 1050 Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu 1055 1060 1065 Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser 1070 1075 1080 Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu 1085 1090 1095 Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys 1100 1105 1110 Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile 1115 1120 1125 Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala 1130 1135 1140 Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp 1145 1150 1155 Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu 1160 1165 1170 Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu 1175 1180 1185 Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 1190 1195 1200 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu 1205 1210 1215 Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile 1220 1225 1230 Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe 1235 1240 1245 Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu 1250 1255 1260 Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly 1265 1270 1275 Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr 1280 1285 1290 Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys 1295 1300 1305 Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro 1310 1315 1320 Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp 1325 1330 1335 Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser 1340 1345 1350 Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu 1355 1360 1365 Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser 1370 1375 1380 Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr 1385 1390 1395 Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser 1400 1405 1410 Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala 1415 1420 1425 Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr 1430 1435 1440 Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly 1445 1450 1455 Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His 1460 1465 1470 Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser 1475 1480 1485 Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser 1490 1495 1500 Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu 1505 1510 1515 Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala 1520 1525 1530 Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr 1535 1540 1545 Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile 1550 1555 1560 Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly 1565 1570 1575 Asp Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1580 1585 <210> 51 <211> 4767 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dCas9-Clo051 - 40-18171 <400> 51 atgcctaaga agaagcggaa ggtggaaggc atcaaaagca acatctccct cctgaaagac 60 gaactccggg ggcagattag ccacattagt cacgaatacc tctccctcat cgacctggct 120 ttcgatagca agcagaacag gctctttgag atgaaagtgc tggaactgct cgtcaatgag 180 tacgggttca agggtcgaca cctcggcgga tctaggaaac cagacggcat cgtgtatagt 240 accacactgg aagacaactt tgggatcatt gtggatacca aggcatactc tgagggttat 300 agtctgccca tttcacaggc cgacgagatg gaacggtacg tgcgcgagaa ctcaaataga 360 gatgaggaag tcaaccctaa caagtggtgg gagaacttct ctgaggaagt gaagaaatac 420 tacttcgtct ttatcagcgg gtccttcaag ggtaaatttg aggaacagct caggagactg 480 agcatgacta ccggcgtgaa tggcagcgcc gtcaacgtgg tcaatctgct cctgggcgct 540 gaaaagattc ggagcggaga gatgaccatc gaagagctgg agagggcaat gtttaataat 600 agcgagttta tcctgaaata cggtggcggt ggatccgata aaaagtattc tattggttta 660 gccatcggca ctaattccgt tggatgggct gtcataaccg atgaatacaa agtaccttca 720 aagaaattta aggtgttggg gaacacagac cgtcattcga ttaaaaagaa tcttatcggt 780 gccctcctat tcgatagtgg cgaaacggca gaggcgactc gcctgaaacg aaccgctcgg 840 agaaggtata cacgtcgcaa gaaccgaata tgttacttac aagaaatttt tagcaatgag 900 atggccaaag ttgacgattc tttctttcac cgtttggaag agtccttcct tgtcgaagag 960 gacaagaaac atgaacggca ccccatcttt ggaaacatag tagatgaggt ggcatatcat 1020 gaaaagtacc caacgattta tcacctcaga aaaaagctag ttgactcaac tgataaagcg 1080 gacctgaggt taatctactt ggctcttgcc catatgataa agttccgtgg gcactttctc 1140 attgagggtg atctaaatcc ggacaactcg gatgtcgaca aactgttcat ccagttagta 1200 caaacctata atcagttgtt tgaagagaac cctataaatg caagtggcgt ggatgcgaag 1260 gctattctta gcgcccgcct ctctaaatcc cgacggctag aaaacctgat cgcacaatta 1320 cccggagaga agaaaaatgg gttgttcggt aaccttatag cgctctcact aggcctgaca 1380 ccaaatttta agtcgaactt cgacttagct gaagatgcca aattgcagct tagtaaggac 1440 acgtacgatg acgatctcga caatctactg gcacaaattg gagatcagta tgcggactta 1500 tttttggctg ccaaaaacct tagcgatgca atcctcctat ctgacatact gagagttaat 1560 actgagatta ccaaggcgcc gttatccgct tcaatgatca aaaggtacga tgaacatcac 1620 caagacttga cacttctcaa ggccctagtc cgtcagcaac tgcctgagaa atataaggaa 1680 atattctttg atcagtcgaa aaacgggtac gcaggttata ttgacggcgg agcgagtcaa 1740 gaggaattct acaagtttat caaacccata ttagagaaga tggatgggac ggaagagttg 1800 cttgtaaaac tcaatcgcga agatctactg cgaaagcagc ggactttcga caacggtagc 1860 attccacatc aaatccactt aggcgaattg catgctatac ttagaaggca ggaggatttt 1920 tatccgttcc tcaaagacaa tcgtgaaaag attgagaaaa tcctaacctt tcgcatacct 1980 tactatgtgg gacccctggc ccgagggaac tctcggttcg catggatgac aagaaagtcc 2040 gaagaaacga ttactccatg gaattttgag gaagttgtcg ataaaggtgc gtcagctcaa 2100 tcgttcatcg agaggatgac caactttgac aagaatttac cgaacgaaaa agtattgcct 2160 aagcacagtt tactttacga gtatttcaca gtgtacaatg aactcacgaa agttaagtat 2220 gtcactgagg gcatgcgtaa acccgccttt ctaagcggag aacagaagaa agcaatagta 2280 gatctgttat tcaagaccaa ccgcaaagtg acagttaagc aattgaaaga ggactacttt 2340 aagaaaattg aatgcttcga ttctgtcgag atctccgggg tagaagatcg atttaatgcg 2400 tcacttggta cgtatcatga cctcctaaag ataattaaag ataaggactt cctggataac 2460 gaagagaatg aagatatctt agaagatata gtgttgactc ttaccctctt tgaagatcgg 2520 gaaatgattg aggaaagact aaaaacatac gctcacctgt tcgacgataa ggttatgaaa 2580 cagttaaaga ggcgtcgcta tacgggctgg ggacgattgt cgcggaaact tatcaacggg 2640 ataagagaca agcaaagtgg taaaactatt ctcgattttc taaagagcga cggcttcgcc 2700 aataggaact ttatgcagct gatccatgat gactctttaa ccttcaaaga ggatatacaa 2760 aaggcacagg tttccggaca aggggactca ttgcacgaac atattgcgaa tcttgctggt 2820 tcgccagcca tcaaaaaggg catactccag acagtcaaag tagtggatga gctagttaag 2880 gtcatgggac gtcacaaacc ggaaaacatt gtaatcgaga tggcacgcga aaatcaaacg 2940 actcagaagg ggcaaaaaaa cagtcgagag cggatgaaga gaatagaaga gggtattaaa 3000 gaactgggca gccagatctt aaaggagcat cctgtggaaa atacccaatt gcagaacgag 3060 aaactttacc tctattacct acaaaatgga agggacatgt atgttgatca ggaactggac 3120 ataaaccgtt tatctgatta cgacgtcgat gccattgtac cccaatcctt tttgaaggac 3180 gattcaatcg acaataaagt gcttacacgc tcggataaga accgagggaa aagtgacaat 3240 gttccaagcg aggaagtcgt aaagaaaatg aagaactatt ggcggcagct cctaaatgcg 3300 aaactgataa cgcaaagaaa gttcgataac ttaactaaag ctgagagggg tggcttgtct 3360 gaacttgaca aggccggatt tattaaacgt cagctcgtgg aaacccgcca aatcacaaag 3420 catgttgcac agatactaga ttcccgaatg aatacgaaat acgacgagaa cgataagctg 3480 attcgggaag tcaaagtaat cactttaaag tcaaaattgg tgtcggactt cagaaaggat 3540 tttcaattct ataaagttag ggagataaat aactaccacc atgcgcacga cgcttatctt 3600 aatgccgtcg tagggaccgc actcattaag aaatacccga agctagaaag tgagtttgtg 3660 tatggtgatt acaaagttta tgacgtccgt aagatgatcg cgaaaagcga acaggagata 3720 ggcaaggcta cagccaaata cttcttttat tctaacatta tgaatttctt taagacggaa 3780 atcactctgg caaacggaga gatacgcaaa cgacctttaa ttgaaaccaa tggggagaca 3840 ggtgaaatcg tatgggataa gggccgggac ttcgcgacgg tgagaaaagt tttgtccatg 3900 ccccaagtca acatagtaaa gaaaactgag gtgcagaccg gagggttttc aaaggaatcg 3960 attcttccaa aaaggaatag tgataagctc atcgctcgta aaaaggactg ggacccgaaa 4020 aagtacggtg gcttcgatag ccctacagtt gcctattctg tcctagtagt ggcaaaagtt 4080 gagaagggaa aatccaagaa actgaagtca gtcaaagaat tattggggat aacgattatg 4140 gagcgctcgt cttttgaaaa gaaccccatc gacttccttg aggcgaaagg ttacaaggaa 4200 gtaaaaaagg atctcataat taaactacca aagtatagtc tgtttgagtt agaaaatggc 4260 cgaaaacgga tgttggctag cgccggagag cttcaaaagg ggaacgaact cgcactaccg 4320 tctaaatacg tgaatttcct gtatttagcg tcccattacg agaagttgaa aggttcacct 4380 gaagataacg aacagaagca actttttgtt gagcagcaca aacattatct cgacgaaatc 4440 atagagcaaa tttcggaatt cagtaagaga gtcatcctag ctgatgccaa tctggacaaa 4500 gtattaagcg catacaacaa gcacagggat aaacccatac gtgagcaggc ggaaaatatt 4560 atccatttgt ttactcttac caacctcggc gctccagccg cattcaagta ttttgacaca 4620 acgatagatc gcaaacgata cacttctacc aaggaggtgc tagacgcgac actgattcac 4680 caatccatca cgggattata tgaaactcgg atagatttgt cacagcttgg gggtgacgga 4740 tcccccaaga agaagaggaa agtctga 4767 <210> 52 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DHFR mutein - 40-17012 <400> 52 Met Val Gly Ser Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly 1 5 10 15 Ile Gly Lys Asn Gly Asp Phe Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Ser 20 25 30 Arg Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln 35 40 45 Asn Leu Val Ile Met Gly Lys Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys 50 55 60 Asn Arg Pro Leu Lys Gly Arg Ile Asn Leu Val Leu Ser Arg Glu Leu 65 70 75 80 Lys Glu Pro Pro Gln Gly Ala His Phe Leu Ser Arg Ser Leu Asp Asp 85 90 95 Ala Leu Lys Leu Thr Glu Gln Pro Glu Leu Ala Asn Lys Val Asp Met 100 105 110 Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Lys Glu Ala Met Asn His 115 120 125 Pro Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Asp Phe Glu 130 135 140 Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Glu Lys Tyr Lys Leu Leu 145 150 155 160 Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile 165 170 175 Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp 180 185 <210> 53 <211> 561 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DHFR mutein - 40-17095 <400> 53 atggtcgggt ctctgaattg tatcgtcgcc gtgagtcaga acatgggcat tgggaagaat 60 ggcgatttcc catggccacc tctgcgcaac gagtcccgat actttcagcg gatgacaact 120 acctcctctg tggaagggaa acagaatctg gtcatcatgg gaaagaaaac ttggttcagc 180 attccagaga agaaccggcc cctgaaaggc agaatcaatc tggtgctgtc ccgagaactg 240 aaggagccac cacagggagc tcactttctg agccggtccc tggacgatgc actgaagctg 300 acagaacagc ctgagctggc caacaaagtc gatatggtgt ggatcgtcgg gggaagttca 360 gtgtataagg aggccatgaa tcaccccggc catctgaaac tgttcgtcac acggatcatg 420 caggactttg agagcgatac tttctttcct gaaattgacc tggagaagta caaactgctg 480 cccgaatatc ctggcgtgct gtccgatgtc caggaagaga aaggcatcaa atacaagttc 540 gaggtctatg agaagaatga c 561 <210> 54 <211> 18 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 54 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 55 <211> 21 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 55 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 56 <211> 63 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 56 ggatctggag agggaagggg aagcctgctg acctgtggag acgtggagga aaacccagga 60 cca 63 <210> 57 <211> 20 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 57 Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 58 <211> 23 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 58 Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp 1 5 10 15 Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 59 <211> 22 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 59 Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 60 <211> 25 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 60 Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 61 <211> 19 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 61 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 62 <211> 22 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 62 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 63 <211> 594 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A - 40-18099 <400> 63 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Ile Ser Asp 20 25 30 His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile 35 40 45 Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu 50 55 60 Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn 65 70 75 80 Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His 85 90 95 Cys Trp Ser Thr Ser Lys Ser Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu 100 105 110 Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile 115 120 125 Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile 130 135 140 Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg 145 150 155 160 Glu Ser Met Thr Gly Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile 165 170 175 Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn 180 185 190 His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr 195 200 205 Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu 210 215 220 Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val 225 230 235 240 Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile 245 250 255 Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu 260 265 270 Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Met Tyr Ile Pro Asn Lys Pro 275 280 285 Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Tyr Lys 290 295 300 Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn 305 310 315 320 Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val 325 330 335 His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile 340 345 350 Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val 355 360 365 Gly Thr Val Arg Ser Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn 370 375 380 Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro 385 390 395 400 Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu 405 410 415 Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys 420 425 430 Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr 435 440 445 Leu Asp Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg 450 455 460 Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn 465 470 475 480 Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val 485 490 495 Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Ser Leu Thr Ser 500 505 510 Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu 515 520 525 Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Asn Glu Val Pro Gly Thr Ser 530 535 540 Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr 545 550 555 560 Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Asn Ala Ser Cys Lys Lys 565 570 575 Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser 580 585 590 Cys Phe <210> 64 <211> 594 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SPB transposase -40-14484 <400> 64 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Val Ser Asp 20 25 30 His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile 35 40 45 Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu 50 55 60 Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn 65 70 75 80 Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His 85 90 95 Cys Trp Ser Thr Ser Lys Ser Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu 100 105 110 Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile 115 120 125 Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile 130 135 140 Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg 145 150 155 160 Glu Ser Met Thr Ser Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile 165 170 175 Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn 180 185 190 His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr 195 200 205 Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu 210 215 220 Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val 225 230 235 240 Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile 245 250 255 Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu 260 265 270 Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Val Tyr Ile Pro Asn Lys Pro 275 280 285 Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys 290 295 300 Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn 305 310 315 320 Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val 325 330 335 His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile 340 345 350 Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val 355 360 365 Gly Thr Val Arg Ser Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn 370 375 380 Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro 385 390 395 400 Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu 405 410 415 Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys 420 425 430 Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr 435 440 445 Leu Asp Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg 450 455 460 Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn 465 470 475 480 Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val 485 490 495 Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Ser Leu Thr Ser 500 505 510 Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu 515 520 525 Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Lys Glu Val Pro Gly Thr Ser 530 535 540 Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr 545 550 555 560 Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Asn Ala Ser Cys Lys Lys 565 570 575 Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser 580 585 590 Cys Phe <210> 65 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SB100X transposase - 40-14485 <400> 65 Met Gly Lys Ser Lys Glu Ile Ser Gln Asp Leu Arg Lys Lys Ile Val 1 5 10 15 Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu 20 25 30 Lys Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys Tyr Lys His 35 40 45 His Gly Thr Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Ser Gly Arg Arg Arg Val Leu 50 55 60 Ser Pro Arg Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Lys Val Gln Ile Asn Pro 65 70 75 80 Arg Thr Thr Ala Lys Asp Leu Val Lys Met Leu Glu Glu Thr Gly Thr 85 90 95 Lys Val Ser Ile Ser Thr Val Lys Arg Val Leu Tyr Arg His Asn Leu 100 105 110 Lys Gly Arg Ser Ala Arg Lys Lys Pro Leu Leu Gln Asn Arg His Lys 115 120 125 Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala Thr Ala His Gly Asp Lys Asp Arg Thr 130 135 140 Phe Trp Arg Asn Val Leu Trp Ser Asp Glu Thr Lys Ile Glu Leu Phe 145 150 155 160 Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys 165 170 175 Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly Gly Ser Ile 180 185 190 Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys 195 200 205 Ile Asp Gly Ile Met Arg Lys Glu Asn Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln 210 215 220 His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg Lys Trp Val 225 230 235 240 Phe Gln Met Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys Val Val Ala Lys 245 250 255 Trp Leu Lys Asp Asn Lys Val Lys Val Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser 260 265 270 Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu Lys Lys Arg 275 280 285 Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His Gln Leu Cys 290 295 300 Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Thr Tyr Cys Gly Lys Leu Val 305 310 315 320 Glu Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Thr Gln Val Lys Gln Phe Lys Gly Asn 325 330 335 Ala Thr Lys Tyr 340 <210> 66 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hyperSB100X transposase -40-14486 <400> 66 Met Gly Lys Ser Lys Glu Ile Ser Gln Asp Leu Arg Lys Arg Ile Val 1 5 10 15 Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu 20 25 30 Ala Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys Tyr Lys His 35 40 45 His Gly Thr Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Ser Gly Arg Arg Arg Val Leu 50 55 60 Ser Pro Arg Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Lys Val Gln Ile Asn Pro 65 70 75 80 Arg Thr Thr Ala Lys Asp Leu Val Lys Met Leu Glu Glu Thr Gly Thr 85 90 95 Lys Val Ser Ile Ser Thr Val Lys Arg Val Leu Tyr Arg His Asn Leu 100 105 110 Lys Gly His Ser Ala Arg Lys Lys Pro Leu Leu Gln Asn Arg His Lys 115 120 125 Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala Thr Ala His Gly Asp Lys Asp Arg Thr 130 135 140 Phe Trp Arg Asn Val Leu Trp Ser Asp Glu Thr Lys Ile Glu Leu Phe 145 150 155 160 Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys 165 170 175 Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly Gly Ser Ile 180 185 190 Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys 195 200 205 Ile Asp Gly Ile Met Asp Ala Val Gln Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln 210 215 220 His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg Lys Trp Val 225 230 235 240 Phe Gln His Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys Val Val Ala Lys 245 250 255 Trp Leu Lys Asp Asn Lys Val Lys Val Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser 260 265 270 Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu Lys Lys Arg 275 280 285 Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His Gln Leu Cys 290 295 300 Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Asn Tyr Cys Gly Lys Leu Val 305 310 315 320 Glu Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Thr Gln Val Lys Gln Phe Lys Gly Asn 325 330 335 Ala Thr Lys Tyr 340 <210> 67 <211> 5296 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helraiser transposon - 40-18174 <400> 67 tcctatataa taaaagagaa acatgcaaat tgaccatccc tccgctacgc tcaagccacg 60 cccaccagcc aatcagaagt gactatgcaa attaacccaa caaagatggc agttaaattt 120 gcatacgcag gtgtcaagcg ccccaggagg caacggcggc cgcgggctcc caggaccttc 180 gctggccccg ggaggcgagg ccggccgcgc ctagccacac ccgcgggctc ccgggacctt 240 cgccagcaga gagcagagcg ggagagcggg cggagagcgg gaggtttgga ggacttggca 300 gagcaggagg ccgctggaca tagagcagag cgagagagag ggtggcttgg agggcgtggc 360 tccctctgtc accccagctt cctcatcaca gctgtggaaa ctgacagcag ggaggaggaa 420 gtcccacccc cacagaatca gccagaatca gccgttggtc agacagctct cagcggcctg 480 acagccagga ctctcattca cctgcatctc agaccgtgac agtagagagg tgggactatg 540 tctaaagaac aactgttgat acaacgtagc tctgcagccg aaagatgccg gcgttatcga 600 cagaaaatgt ctgcagagca acgtgcgtct gatcttgaaa gaaggcggcg cctgcaacag 660 aatgtatctg aagagcagct actggaaaaa cgtcgctctg aagccgaaaa acagcggcgt 720 catcgacaga aaatgtctaa agaccaacgt gcctttgaag ttgaaagaag gcggtggcga 780 cgacagaata tgtctagaga acagtcatca acaagtacta ccaataccgg taggaactgc 840 cttctcagca aaaatggagt acatgaggat gcaattctcg aacatagttg tggtggaatg 900 actgttcgat gtgaattttg cctatcacta aatttctctg atgaaaaacc atccgatggg 960 aaatttactc gatgttgtag caaagggaaa gtctgtccaa atgatataca ttttccagat 1020 tacccggcat atttaaaaag attaatgaca aacgaagatt ctgacagtaa aaatttcatg 1080 gaaaatattc gttccataaa tagttctttt gcttttgctt ccatgggtgc aaatattgca 1140 tcgccatcag gatatgggcc atactgtttt agaatacacg gacaagttta tcaccgtact 1200 ggaactttac atccttcgga tggtgtttct cggaagtttg ctcaactcta tattttggat 1260 acagccgaag ctacaagtaa aagattagca atgccagaaa accagggctg ctcagaaaga 1320 ctcatgatca acatcaacaa cctcatgcat gaaataaatg aattaacaaa atcgtacaag 1380 atgctacatg aggtagaaaa ggaagcccaa tctgaagcag cagcaaaagg tattgctccc 1440 acagaagtaa caatggcgat taaatacgat cgtaacagtg acccaggtag atataattct 1500 ccccgtgtaa ccgaggttgc tgtcatattc agaaacgaag atggagaacc tccttttgaa 1560 agggacttgc tcattcattg taaaccagat cccaataatc caaatgccac taaaatgaaa 1620 caaatcagta tcctgtttcc tacattagat gcaatgacat atcctattct ttttccacat 1680 ggtgaaaaag gctggggaac agatattgca ttaagactca gagacaacag tgtaatcgac 1740 aataatacta gacaaaatgt aaggacacga gtcacacaaa tgcagtatta tggatttcat 1800 ctctctgtgc gggacacgtt caatcctatt ttaaatgcag gaaaattaac tcaacagttt 1860 attgtggatt catattcaaa aatggaggcc aatcggataa atttcatcaa agcaaaccaa 1920 tctaagttga gagttgaaaa atatagtggt ttgatggatt atctcaaatc tagatctgaa 1980 aatgacaatg tgccgattgg taaaatgata atacttccat catcttttga gggtagtccc 2040 agaaatatgc agcagcgata tcaggatgct atggcaattg taacgaagta tggcaagccc 2100 gatttattca taaccatgac atgcaacccc aaatgggcag atattacaaa caatttacaa 2160 cgctggcaaa aagttgaaaa cagacctgac ttggtagcca gagtttttaa tattaagctg 2220 aatgctcttt taaatgatat atgtaaattc catttatttg gcaaagtaat agctaaaatt 2280 catgtcattg aatttcagaa acgcggactg cctcacgctc acatattatt gatattagat 2340 agtgagtcca aattacgttc agaagatgac attgaccgta tagttaaggc agaaattcca 2400 gatgaagacc agtgtcctcg actttttcaa attgtaaaat caaatatggt acatggacca 2460 tgtggaatac aaaatccaaa tagtccatgt atggaaaatg gaaaatgttc aaagggatat 2520 ccaaaagaat ttcaaaatgc gaccattgga aatattgatg gatatcccaa atacaaacga 2580 agatctggta gcaccatgtc tattggaaat aaagttgtcg ataacacttg gattgtccct 2640 tataacccgt atttgtgcct taaatataac tgtcatataa atgttgaagt ctgtgcatca 2700 attaaaagtg tcaaatattt atttaaatac atctataaag ggcacgattg tgcaaatatt 2760 caaatttctg aaaaaaatat tatcaatcat gacgaagtac aggacttcat tgactccagg 2820 tatgtgagcg ctcctgaggc tgtttggaga ctttttgcaa tgcgaatgca tgaccaatct 2880 catgcaatca caagattagc tattcatttg ccaaatgatc agaatttgta ttttcatacc 2940 gatgattttg ctgaagtttt agatagggct aaaaggcata actcgacttt gatggcttgg 3000 ttcttattga atagagaaga ttctgatgca cgtaattatt attattggga gattccacag 3060 cattatgtgt ttaataattc tttgtggaca aaacgccgaa agggtgggaa taaagtatta 3120 ggtagactgt tcactgtgag ctttagagaa ccagaacgat attaccttag acttttgctt 3180 ctgcatgtaa aaggtgcgat aagttttgag gatctgcgaa ctgtaggagg tgtaacttat 3240 gatacatttc atgaagctgc taaacaccga ggattattac ttgatgacac tatctggaaa 3300 gatacgattg acgatgcaat catccttaat atgcccaaac aactacggca actttttgca 3360 tatatatgtg tgtttggatg tccttctgct gcagacaaat tatgggatga gaataaatct 3420 cattttattg aagatttctg ttggaaatta caccgaagag aaggtgcctg tgtgaactgt 3480 gaaatgcatg cccttaacga aattcaggag gtattcacat tgcatggaat gaaatgttca 3540 catttcaaac ttccggacta tcctttatta atgaatgcaa atacatgtga tcaattgtac 3600 gagcaacaac aggcagaggt tttgataaat tctctgaatg atgaacagtt ggcagccttt 3660 cagactataa cttcagccat cgaagatcaa actgtacacc ccaaatgctt tttcttggat 3720 ggtccaggtg gtagtggaaa aacatatctg tataaagttt taacacatta tattagaggt 3780 cgtggtggta ctgttttacc cacagcatct acaggaattg ctgcaaattt acttcttggt 3840 ggaagaacct ttcattccca atataaatta ccaattccat taaatgaaac ttcaatttct 3900 agactcgata taaagagtga agttgctaaa accattaaaa aggcccaact tctcattatt 3960 gatgaatgca ccatggcatc cagtcatgct ataaacgcca tagatagatt actaagagaa 4020 attatgaatt tgaatgttgc atttggtggg aaagttctcc ttctcggagg ggattttcga 4080 caatgtctca gtattgtacc acatgctatg cgatcggcca tagtacaaac gagtttaaag 4140 tactgtaatg tttggggatg tttcagaaag ttgtctctta aaacaaatat gagatcagag 4200 gattctgctt atagtgaatg gttagtaaaa cttggagatg gcaaacttga tagcagtttt 4260 catttaggaa tggatattat tgaaatcccc catgaaatga tttgtaacgg atctattatt 4320 gaagctacct ttggaaatag tatatctata gataatatta aaaatatatc taaacgtgca 4380 attctttgtc caaaaaatga gcatgttcaa aaattaaatg aagaaatttt ggatatactt 4440 gatggagatt ttcacacata tttgagtgat gattccattg attcaacaga tgatgctgaa 4500 aaggaaaatt ttcccatcga atttcttaat agtattactc cttcgggaat gccgtgtcat 4560 aaattaaaat tgaaagtggg tgcaatcatc atgctattga gaaatcttaa tagtaaatgg 4620 ggtctttgta atggtactag atttattatc aaaagattac gacctaacat tatcgaagct 4680 gaagtattaa caggatctgc agagggagag gttgttctga ttccaagaat tgatttgtcc 4740 ccatctgaca ctggcctccc atttaaatta attcgaagac agtttcccgt gatgccagca 4800 tttgcgatga ctattaataa atcacaagga caaactctag acagagtagg aatattccta 4860 cctgaacccg ttttcgcaca tggtcagtta tatgttgctt tctctcgagt tcgaagagca 4920 tgtgacgtta aagttaaagt tgtaaatact tcatcacaag ggaaattagt caagcactct 4980 gaaagtgttt ttactcttaa tgtggtatac agggagatat tagaataagt ttaatcactt 5040 tatcagtcat tgtttgcatc aatgttgttt ttatatcatg tttttgttgt ttttatatca 5100 tgtctttgtt gttgttatat catgttgtta ttgtttattt attaataaat ttatgtatta 5160 ttttcatata cattttactc atttcctttc atctctcaca cttctattat agagaaaggg 5220 caaatagcaa tattaaaata tttcctctaa ttaattccct ttcaatgtgc acgaatttcg 5280 tgcaccgggc cactag 5296 <210> 68 <211> 1496 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Helitron transposase - 40-14488 <400> 68 Met Ser Lys Glu Gln Leu Leu Ile Gln Arg Ser Ser Ala Ala Glu Arg 1 5 10 15 Cys Arg Arg Tyr Arg Gln Lys Met Ser Ala Glu Gln Arg Ala Ser Asp 20 25 30 Leu Glu Arg Arg Arg Arg Leu Gln Gln Asn Val Ser Glu Glu Gln Leu 35 40 45 Leu Glu Lys Arg Arg Ser Glu Ala Glu Lys Gln Arg Arg His Arg Gln 50 55 60 Lys Met Ser Lys Asp Gln Arg Ala Phe Glu Val Glu Arg Arg Arg Trp 65 70 75 80 Arg Arg Gln Asn Met Ser Arg Glu Gln Ser Ser Thr Ser Thr Thr Asn 85 90 95 Thr Gly Arg Asn Cys Leu Leu Ser Lys Asn Gly Val His Glu Asp Ala 100 105 110 Ile Leu Glu His Ser Cys Gly Gly Met Thr Val Arg Cys Glu Phe Cys 115 120 125 Leu Ser Leu Asn Phe Ser Asp Glu Lys Pro Ser Asp Gly Lys Phe Thr 130 135 140 Arg Cys Cys Ser Lys Gly Lys Val Cys Pro Asn Asp Ile His Phe Pro 145 150 155 160 Asp Tyr Pro Ala Tyr Leu Lys Arg Leu Met Thr Asn Glu Asp Ser Asp 165 170 175 Ser Lys Asn Phe Met Glu Asn Ile Arg Ser Ile Asn Ser Ser Phe Ala 180 185 190 Phe Ala Ser Met Gly Ala Asn Ile Ala Ser Pro Ser Gly Tyr Gly Pro 195 200 205 Tyr Cys Phe Arg Ile His Gly Gln Val Tyr His Arg Thr Gly Thr Leu 210 215 220 His Pro Ser Asp Gly Val Ser Arg Lys Phe Ala Gln Leu Tyr Ile Leu 225 230 235 240 Asp Thr Ala Glu Ala Thr Ser Lys Arg Leu Ala Met Pro Glu Asn Gln 245 250 255 Gly Cys Ser Glu Arg Leu Met Ile Asn Ile Asn Asn Leu Met His Glu 260 265 270 Ile Asn Glu Leu Thr Lys Ser Tyr Lys Met Leu His Glu Val Glu Lys 275 280 285 Glu Ala Gln Ser Glu Ala Ala Ala Lys Gly Ile Ala Pro Thr Glu Val 290 295 300 Thr Met Ala Ile Lys Tyr Asp Arg Asn Ser Asp Pro Gly Arg Tyr Asn 305 310 315 320 Ser Pro Arg Val Thr Glu Val Ala Val Ile Phe Arg Asn Glu Asp Gly 325 330 335 Glu Pro Pro Phe Glu Arg Asp Leu Leu Ile His Cys Lys Pro Asp Pro 340 345 350 Asn Asn Pro Asn Ala Thr Lys Met Lys Gln Ile Ser Ile Leu Phe Pro 355 360 365 Thr Leu Asp Ala Met Thr Tyr Pro Ile Leu Phe Pro His Gly Glu Lys 370 375 380 Gly Trp Gly Thr Asp Ile Ala Leu Arg Leu Arg Asp Asn Ser Val Ile 385 390 395 400 Asp Asn Asn Thr Arg Gln Asn Val Arg Thr Arg Val Thr Gln Met Gln 405 410 415 Tyr Tyr Gly Phe His Leu Ser Val Arg Asp Thr Phe Asn Pro Ile Leu 420 425 430 Asn Ala Gly Lys Leu Thr Gln Gln Phe Ile Val Asp Ser Tyr Ser Lys 435 440 445 Met Glu Ala Asn Arg Ile Asn Phe Ile Lys Ala Asn Gln Ser Lys Leu 450 455 460 Arg Val Glu Lys Tyr Ser Gly Leu Met Asp Tyr Leu Lys Ser Arg Ser 465 470 475 480 Glu Asn Asp Asn Val Pro Ile Gly Lys Met Ile Ile Leu Pro Ser Ser 485 490 495 Phe Glu Gly Ser Pro Arg Asn Met Gln Gln Arg Tyr Gln Asp Ala Met 500 505 510 Ala Ile Val Thr Lys Tyr Gly Lys Pro Asp Leu Phe Ile Thr Met Thr 515 520 525 Cys Asn Pro Lys Trp Ala Asp Ile Thr Asn Asn Leu Gln Arg Trp Gln 530 535 540 Lys Val Glu Asn Arg Pro Asp Leu Val Ala Arg Val Phe Asn Ile Lys 545 550 555 560 Leu Asn Ala Leu Leu Asn Asp Ile Cys Lys Phe His Leu Phe Gly Lys 565 570 575 Val Ile Ala Lys Ile His Val Ile Glu Phe Gln Lys Arg Gly Leu Pro 580 585 590 His Ala His Ile Leu Leu Ile Leu Asp Ser Glu Ser Lys Leu Arg Ser 595 600 605 Glu Asp Asp Ile Asp Arg Ile Val Lys Ala Glu Ile Pro Asp Glu Asp 610 615 620 Gln Cys Pro Arg Leu Phe Gln Ile Val Lys Ser Asn Met Val His Gly 625 630 635 640 Pro Cys Gly Ile Gln Asn Pro Asn Ser Pro Cys Met Glu Asn Gly Lys 645 650 655 Cys Ser Lys Gly Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Asn Ala Thr Ile Gly Asn 660 665 670 Ile Asp Gly Tyr Pro Lys Tyr Lys Arg Arg Ser Gly Ser Thr Met Ser 675 680 685 Ile Gly Asn Lys Val Val Asp Asn Thr Trp Ile Val Pro Tyr Asn Pro 690 695 700 Tyr Leu Cys Leu Lys Tyr Asn Cys His Ile Asn Val Glu Val Cys Ala 705 710 715 720 Ser Ile Lys Ser Val Lys Tyr Leu Phe Lys Tyr Ile Tyr Lys Gly His 725 730 735 Asp Cys Ala Asn Ile Gln Ile Ser Glu Lys Asn Ile Ile Asn His Asp 740 745 750 Glu Val Gln Asp Phe Ile Asp Ser Arg Tyr Val Ser Ala Pro Glu Ala 755 760 765 Val Trp Arg Leu Phe Ala Met Arg Met His Asp Gln Ser His Ala Ile 770 775 780 Thr Arg Leu Ala Ile His Leu Pro Asn Asp Gln Asn Leu Tyr Phe His 785 790 795 800 Thr Asp Asp Phe Ala Glu Val Leu Asp Arg Ala Lys Arg His Asn Ser 805 810 815 Thr Leu Met Ala Trp Phe Leu Leu Asn Arg Glu Asp Ser Asp Ala Arg 820 825 830 Asn Tyr Tyr Tyr Trp Glu Ile Pro Gln His Tyr Val Phe Asn Asn Ser 835 840 845 Leu Trp Thr Lys Arg Arg Lys Gly Gly Asn Lys Val Leu Gly Arg Leu 850 855 860 Phe Thr Val Ser Phe Arg Glu Pro Glu Arg Tyr Tyr Leu Arg Leu Leu 865 870 875 880 Leu Leu His Val Lys Gly Ala Ile Ser Phe Glu Asp Leu Arg Thr Val 885 890 895 Gly Gly Val Thr Tyr Asp Thr Phe His Glu Ala Ala Lys His Arg Gly 900 905 910 Leu Leu Leu Asp Asp Thr Ile Trp Lys Asp Thr Ile Asp Asp Ala Ile 915 920 925 Ile Leu Asn Met Pro Lys Gln Leu Arg Gln Leu Phe Ala Tyr Ile Cys 930 935 940 Val Phe Gly Cys Pro Ser Ala Ala Asp Lys Leu Trp Asp Glu Asn Lys 945 950 955 960 Ser His Phe Ile Glu Asp Phe Cys Trp Lys Leu His Arg Arg Glu Gly 965 970 975 Ala Cys Val Asn Cys Glu Met His Ala Leu Asn Glu Ile Gln Glu Val 980 985 990 Phe Thr Leu His Gly Met Lys Cys Ser His Phe Lys Leu Pro Asp Tyr 995 1000 1005 Pro Leu Leu Met Asn Ala Asn Thr Cys Asp Gln Leu Tyr Glu Gln 1010 1015 1020 Gln Gln Ala Glu Val Leu Ile Asn Ser Leu Asn Asp Glu Gln Leu 1025 1030 1035 Ala Ala Phe Gln Thr Ile Thr Ser Ala Ile Glu Asp Gln Thr Val 1040 1045 1050 His Pro Lys Cys Phe Phe Leu Asp Gly Pro Gly Gly Ser Gly Lys 1055 1060 1065 Thr Tyr Leu Tyr Lys Val Leu Thr His Tyr Ile Arg Gly Arg Gly 1070 1075 1080 Gly Thr Val Leu Pro Thr Ala Ser Thr Gly Ile Ala Ala Asn Leu 1085 1090 1095 Leu Leu Gly Gly Arg Thr Phe His Ser Gln Tyr Lys Leu Pro Ile 1100 1105 1110 Pro Leu Asn Glu Thr Ser Ile Ser Arg Leu Asp Ile Lys Ser Glu 1115 1120 1125 Val Ala Lys Thr Ile Lys Lys Ala Gln Leu Leu Ile Ile Asp Glu 1130 1135 1140 Cys Thr Met Ala Ser Ser His Ala Ile Asn Ala Ile Asp Arg Leu 1145 1150 1155 Leu Arg Glu Ile Met Asn Leu Asn Val Ala Phe Gly Gly Lys Val 1160 1165 1170 Leu Leu Leu Gly Gly Asp Phe Arg Gln Cys Leu Ser Ile Val Pro 1175 1180 1185 His Ala Met Arg Ser Ala Ile Val Gln Thr Ser Leu Lys Tyr Cys 1190 1195 1200 Asn Val Trp Gly Cys Phe Arg Lys Leu Ser Leu Lys Thr Asn Met 1205 1210 1215 Arg Ser Glu Asp Ser Ala Tyr Ser Glu Trp Leu Val Lys Leu Gly 1220 1225 1230 Asp Gly Lys Leu Asp Ser Ser Phe His Leu Gly Met Asp Ile Ile 1235 1240 1245 Glu Ile Pro His Glu Met Ile Cys Asn Gly Ser Ile Ile Glu Ala 1250 1255 1260 Thr Phe Gly Asn Ser Ile Ser Ile Asp Asn Ile Lys Asn Ile Ser 1265 1270 1275 Lys Arg Ala Ile Leu Cys Pro Lys Asn Glu His Val Gln Lys Leu 1280 1285 1290 Asn Glu Glu Ile Leu Asp Ile Leu Asp Gly Asp Phe His Thr Tyr 1295 1300 1305 Leu Ser Asp Asp Ser Ile Asp Ser Thr Asp Asp Ala Glu Lys Glu 1310 1315 1320 Asn Phe Pro Ile Glu Phe Leu Asn Ser Ile Thr Pro Ser Gly Met 1325 1330 1335 Pro Cys His Lys Leu Lys Leu Lys Val Gly Ala Ile Ile Met Leu 1340 1345 1350 Leu Arg Asn Leu Asn Ser Lys Trp Gly Leu Cys Asn Gly Thr Arg 1355 1360 1365 Phe Ile Ile Lys Arg Leu Arg Pro Asn Ile Ile Glu Ala Glu Val 1370 1375 1380 Leu Thr Gly Ser Ala Glu Gly Glu Val Val Leu Ile Pro Arg Ile 1385 1390 1395 Asp Leu Ser Pro Ser Asp Thr Gly Leu Pro Phe Lys Leu Ile Arg 1400 1405 1410 Arg Gln Phe Pro Val Met Pro Ala Phe Ala Met Thr Ile Asn Lys 1415 1420 1425 Ser Gln Gly Gln Thr Leu Asp Arg Val Gly Ile Phe Leu Pro Glu 1430 1435 1440 Pro Val Phe Ala His Gly Gln Leu Tyr Val Ala Phe Ser Arg Val 1445 1450 1455 Arg Arg Ala Cys Asp Val Lys Val Lys Val Val Asn Thr Ser Ser 1460 1465 1470 Gln Gly Lys Leu Val Lys His Ser Glu Ser Val Phe Thr Leu Asn 1475 1480 1485 Val Val Tyr Arg Glu Ile Leu Glu 1490 1495 <210> 69 <211> 4682 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tol2 transposon - 40-14491 <400> 69 Cys Ala Gly Ala Gly Gly Thr Gly Thr Ala Ala Ala Gly Thr Ala Cys 1 5 10 15 Thr Thr Gly Ala Gly Thr Ala Ala Thr Thr Thr Thr Ala Cys Thr Thr 20 25 30 Gly Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr Ala Cys Thr Thr Ala Ala Gly 35 40 45 Thr Ala Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr 50 55 60 Thr Thr Thr Thr Ala Cys Thr Thr Thr Ala Cys Thr Thr Gly Ala Gly 65 70 75 80 Thr Ala Cys Ala Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala 85 90 95 Thr Ala Cys Thr Thr Thr Thr Ala Cys Thr Thr Thr Thr Ala Cys Thr 100 105 110 Thr Ala Ala Thr Thr Ala Cys Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala 115 120 125 Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr Ala Cys Thr Thr Thr 130 135 140 Thr Thr Ala Cys Thr Cys Cys Thr Thr Ala Cys Ala Ala Thr Thr Thr 145 150 155 160 Thr Ala Thr Thr Thr Ala Cys Ala Gly Thr Cys Ala Ala Ala Ala Ala 165 170 175 Gly Thr Ala Cys Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Gly Gly Ala 180 185 190 Gly Ala Thr Cys Ala Cys Thr Thr Cys Ala Thr Thr Cys Thr Ala Thr 195 200 205 Thr Thr Thr Cys Cys Cys Thr Thr Gly Cys Thr Ala Thr Thr Ala Cys 210 215 220 Cys Ala Ala Ala Cys Cys Ala Ala Thr Thr Gly Ala Ala Thr Thr Gly 225 230 235 240 Cys Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Cys Cys Cys Ala Gly Thr Thr Thr 245 250 255 Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr Ala Thr Thr Thr 260 265 270 Ala Thr Thr Cys Thr Gly Cys Cys Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala 275 280 285 Thr Cys Gly Thr Thr Thr Thr Cys Ala Cys Ala Thr Thr Ala Thr Ala 290 295 300 Thr Gly Ala Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Cys Ala Gly Ala Cys Ala 305 310 315 320 Thr Gly Thr Thr Cys Ala Thr Thr Gly Gly Thr Cys Cys Thr Thr Thr 325 330 335 Gly Gly Ala Ala Gly Thr Gly Ala Cys Gly Thr Cys Ala Thr Gly Thr 340 345 350 Cys Ala Cys Ala Thr Cys Thr Ala Thr Thr Ala Cys Cys Ala Cys Ala 355 360 365 Ala Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Thr Thr Gly Ala 370 375 380 Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Gly Gly Gly Ala Ala 385 390 395 400 Ala Thr Thr Ala Thr Ala Ala Cys Ala Gly Thr Cys Ala Ala Thr Cys 405 410 415 Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Gly Ala 420 425 430 Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ala Thr Gly Thr Gly Ala Thr Thr Cys Ala 435 440 445 Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Gly Ala Gly Cys Ala 450 455 460 Gly Cys Ala Cys Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ala Ala Ala Thr Cys Ala 465 470 475 480 Gly Cys Cys Ala Cys Ala Gly Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly Ala Gly 485 490 495 Cys Ala Cys Cys Cys Gly Thr Gly Gly Cys Cys Gly Thr Ala Thr Cys 500 505 510 Thr Thr Cys Gly Cys Gly Ala Ala Thr Thr Cys Thr Thr Thr Thr Cys 515 520 525 Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Gly Gly Thr Gly Thr Ala Ala Ala Thr 530 535 540 Ala Ala Ala Gly Ala Thr Thr Cys Ala Thr Thr Cys Ala Ala Gly Ala 545 550 555 560 Thr Gly Ala Ala Ala Thr Gly Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Thr Gly 565 570 575 Thr Cys Thr Cys Cys Cys Gly Cys Thr Thr Ala Ala Thr Ala Ala Ala 580 585 590 Gly Ala Ala Ala Thr Ala Thr Cys Gly Gly Cys Cys Thr Thr Cys Ala 595 600 605 Ala Ala Ala Gly Thr Thr Cys Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Ala 610 615 620 Cys Cys Thr Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Cys Ala Thr Ala Thr Thr 625 630 635 640 Gly Ala Gly Gly Thr Ala Ala Gly Thr Ala Cys Ala Thr Thr Ala Ala 645 650 655 Gly Thr Ala Thr Thr Thr Thr Gly Thr Thr Thr Thr Ala Cys Thr Gly 660 665 670 Ala Thr Ala Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr 675 680 685 Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr 690 695 700 Thr Gly Gly Gly Thr Gly Thr Gly Cys Ala Thr Gly Thr Thr Thr Thr 705 710 715 720 Gly Ala Cys Gly Thr Thr Gly Ala Thr Gly Gly Cys Gly Cys Gly Cys 725 730 735 Cys Thr Thr Thr Thr Ala Thr Ala Thr Gly Thr Gly Thr Ala Gly Thr 740 745 750 Ala Gly Gly Cys Cys Thr Ala Thr Thr Thr Thr Cys Ala Cys Thr Ala 755 760 765 Ala Thr Gly Cys Ala Thr Gly Cys Gly Ala Thr Thr Gly Ala Cys Ala 770 775 780 Ala Thr Ala Thr Ala Ala Gly Gly Cys Thr Cys Ala Cys Gly Thr Ala 785 790 795 800 Ala Thr Ala Ala Ala Ala Thr Gly Cys Thr Ala Ala Ala Ala Thr Gly 805 810 815 Cys Ala Thr Thr Thr Gly Thr Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Ala Ala 820 825 830 Cys Gly Thr Thr Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Cys Gly Gly Gly Ala 835 840 845 Ala Ala Thr Thr Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys Thr Ala Thr Thr Gly 850 855 860 Cys Ala Gly Cys Thr Thr Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Ala 865 870 875 880 Thr Thr Ala Thr Cys Ala Thr Thr Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Cys 885 890 895 Thr Cys Ala Thr Thr Gly Thr Gly Thr Thr Thr Gly Ala Ala Thr Thr 900 905 910 Cys Ala Thr Gly Cys Ala Ala Ala Ala Cys Ala Cys Ala Ala Gly Ala 915 920 925 Ala Ala Ala Cys Cys Ala Ala Gly Cys Gly Ala Gly Ala Ala Ala Thr 930 935 940 Thr Thr Thr Thr Thr Thr Cys Cys Ala Ala Ala Cys Ala Thr Gly Thr 945 950 955 960 Thr Gly Thr Ala Thr Thr Gly Thr Cys Ala Ala Ala Ala Cys Gly Gly 965 970 975 Thr Ala Ala Cys Ala Cys Thr Thr Thr Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala 980 985 990 Gly Gly Thr Thr Gly Ala Thr Thr Ala Gly Thr Thr Cys Ala Thr Gly 995 1000 1005 Thr Ala Thr Thr Ala Ala Cys Thr Ala Ala Cys Ala Thr Thr Ala 1010 1015 1020 Ala Ala Thr Ala Ala Cys Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys Ala Ala 1025 1030 1035 Thr Ala Cys Ala Thr Thr Thr Gly Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr 1040 1045 1050 Ala Thr Cys Thr Gly Thr Thr Ala Ala Thr Cys Thr Thr Thr Gly 1055 1060 1065 Thr Thr Ala Ala Cys Gly Thr Thr Ala Gly Thr Thr Ala Ala Thr 1070 1075 1080 Ala Gly Ala Ala Ala Thr Ala Cys Ala Gly Ala Thr Gly Thr Thr 1085 1090 1095 Cys Ala Thr Thr Gly Thr Thr Thr Gly Thr Thr Cys Ala Thr Gly 1100 1105 1110 Thr Thr Ala Gly Thr Thr Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala 1115 1120 1125 Thr Thr Ala Ala Cys Thr Ala Ala Thr Gly Thr Thr Ala Ala Cys 1130 1135 1140 Ala Ala Gly Ala Thr Ala Thr Ala Ala Ala Gly Thr Ala Thr Thr 1145 1150 1155 Ala Gly Thr Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr Gly Ala Ala Ala Thr 1160 1165 1170 Thr Ala Ala Cys Ala Thr Gly Thr Ala Thr Ala Cys Gly Thr Gly 1175 1180 1185 Cys Ala Gly Thr Thr Cys Ala Thr Thr Ala Thr Thr Ala Gly Thr 1190 1195 1200 Thr Cys Ala Thr Gly Thr Thr Ala Ala Cys Thr Ala Ala Thr Gly 1205 1210 1215 Thr Ala Gly Thr Thr Ala Ala Cys Thr Ala Ala Cys Gly Ala Ala 1220 1225 1230 Cys Cys Thr Thr Ala Thr Thr Gly Thr Ala Ala Ala Ala Gly Thr 1235 1240 1245 Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Ala Ala Cys Thr 1250 1255 1260 Ala Ala Thr Gly Thr Ala Ala Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala 1265 1270 1275 Ala Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Ala Thr Gly 1280 1285 1290 Thr Cys Ala Gly Cys Cys Thr Thr Ala Cys Ala Gly Thr Cys Cys 1295 1300 1305 Thr Gly Thr Gly Thr Thr Thr Thr Thr Gly Thr Cys Ala Ala Thr 1310 1315 1320 Ala Thr Ala Ala Thr Cys Ala Gly Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala 1325 1330 1335 Ala Thr Thr Ala Ala Thr Gly Thr Thr Thr Gly Ala Thr Thr Gly 1340 1345 1350 Thr Cys Ala Cys Thr Ala Ala Ala Thr Gly Cys Thr Ala Cys Thr 1355 1360 1365 Gly Thr Ala Thr Thr Thr Cys Thr Ala Ala Ala Ala Thr Cys Ala 1370 1375 1380 Ala Cys Ala Ala Gly Thr Ala Thr Thr Thr Ala Ala Cys Ala Thr 1385 1390 1395 Thr Ala Thr Ala Ala Ala Gly Thr Gly Thr Gly Cys Ala Ala Thr 1400 1405 1410 Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Thr Cys Ala 1415 1420 1425 Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ala Ala Gly Gly Gly Thr 1430 1435 1440 Thr Ala Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala 1445 1450 1455 Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Thr Gly Thr Cys Ala Thr 1460 1465 1470 Thr Ala Ala Thr Gly Ala Cys Thr Cys Gly Cys Cys Cys Thr Cys 1475 1480 1485 Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Thr Cys Cys Ala Ala Gly Cys Cys 1490 1495 1500 Cys Gly Thr Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Cys Cys Gly Thr Thr 1505 1510 1515 Cys Ala Thr Cys Thr Thr Cys Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Ala 1520 1525 1530 Gly Thr Thr Thr Ala Ala Gly Ala Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala 1535 1540 1545 Gly Ala Thr Thr Thr Ala Gly Thr Cys Cys Gly Ala Gly Ala Gly 1550 1555 1560 Cys Thr Thr Thr Cys Thr Gly Thr Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala 1565 1570 1575 Thr Thr Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly Thr Ala Thr Gly Thr Ala 1580 1585 1590 Cys Gly Gly Thr Ala Thr Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys Ala Thr 1595 1600 1605 Gly Thr Cys Cys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Thr Ala Ala Thr 1610 1615 1620 Ala Ala Ala Ala Ala Cys Ala Thr Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala 1625 1630 1635 Gly Thr Cys Cys Ala Thr Gly Thr Gly Ala Cys Ala Thr Cys Ala 1640 1645 1650 Gly Thr Gly Gly Gly Thr Thr Ala Gly Thr Thr Ala Gly Ala Ala 1655 1660 1665 Thr Thr Thr Thr Thr Thr Gly Ala Ala Gly Cys Ala Thr Cys Gly 1670 1675 1680 Ala Ala Thr Ala Cys Ala Thr Thr Thr Thr Gly Gly Thr Cys Cys 1685 1690 1695 Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Cys Ala Ala Ala Ala Cys Cys 1700 1705 1710 Thr Ala Cys Gly Ala Cys Thr Thr Thr Ala Thr Thr Cys Gly Gly 1715 1720 1725 Cys Ala Thr Thr Gly Thr Ala Thr Thr Cys Thr Cys Thr Thr Cys 1730 1735 1740 Cys Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Thr Thr Gly Thr Cys Ala Ala 1745 1750 1755 Thr Cys Cys Gly Cys Gly Thr Thr Cys Ala Cys Gly Ala Cys Thr 1760 1765 1770 Thr Cys Gly Cys Ala Gly Thr Gly Ala Cys Gly Cys Thr Ala Cys 1775 1780 1785 Ala Ala Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Thr 1790 1795 1800 Cys Gly Thr Ala Gly Gly Thr Thr Thr Thr Gly Thr Thr Ala Thr 1805 1810 1815 Thr Thr Thr Thr Gly Gly Ala Cys Cys Ala Ala Ala Ala Thr Gly 1820 1825 1830 Thr Ala Thr Thr Thr Thr Cys Gly Ala Thr Gly Cys Thr Thr Cys 1835 1840 1845 Ala Ala Ala Thr Ala Ala Thr Thr Cys Thr Ala Cys Cys Thr Ala 1850 1855 1860 Ala Cys Cys Cys Ala Cys Thr Gly Ala Thr Gly Thr Cys Ala Cys 1865 1870 1875 Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Thr Thr Gly Ala Thr 1880 1885 1890 Gly Thr Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Ala Cys Cys Thr Thr Thr 1895 1900 1905 Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Thr 1910 1915 1920 Ala Thr Ala Cys Cys Gly Thr Ala Cys Ala Thr Ala Cys Ala Thr 1925 1930 1935 Thr Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Cys 1940 1945 1950 Ala Gly Ala Ala Ala Gly Cys Thr Cys Thr Cys Gly Gly Ala Cys 1955 1960 1965 Thr Ala Ala Ala Thr Cys Thr Ala Ala Ala Ala Thr Ala Thr Cys 1970 1975 1980 Thr Thr Ala Ala Ala Cys Thr Gly Thr Gly Thr Thr Cys Cys Gly 1985 1990 1995 Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Gly Gly Ala Gly Gly Thr 2000 2005 2010 Gly Thr Thr Ala Cys Gly Gly Gly Cys Thr Thr Gly Gly Ala Ala 2015 2020 2025 Cys Gly Ala Cys Ala Thr Gly Ala Gly Gly Gly Thr Gly Ala Gly 2030 2035 2040 Thr Cys Ala Thr Thr Ala Ala Thr Gly Ala Cys Ala Thr Cys Thr 2045 2050 2055 Thr Thr Thr Cys Ala Thr Thr Thr Thr Thr Gly Gly Gly Thr Gly 2060 2065 2070 Ala Ala Cys Thr Ala Ala Cys Cys Cys Thr Thr Thr Ala Ala Thr 2075 2080 2085 Gly Cys Thr Gly Thr Ala Ala Thr Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly 2090 2095 2100 Thr Gly Thr Ala Thr Gly Thr Gly Thr Ala Ala Thr Thr Gly Thr 2105 2110 2115 Thr Ala Cys Ala Thr Thr Thr Ala Thr Thr Gly Cys Ala Thr Ala 2120 2125 2130 Cys Ala Ala Thr Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Thr Thr Ala 2135 2140 2145 Thr Thr Thr Gly Thr Thr Gly Thr Thr Thr Thr Thr Ala Cys Ala 2150 2155 2160 Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly Cys Ala Cys Cys Cys Ala Ala Ala 2165 2170 2175 Thr Thr Ala Cys Cys Thr Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys Thr Ala 2180 2185 2190 Cys Thr Cys Thr Ala Ala Ala Thr Thr Gly Ala Cys Ala Gly Cys 2195 2200 2205 Ala Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Thr 2210 2215 2220 Cys Gly Gly Gly Ala Cys Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Cys Ala 2225 2230 2235 Thr Gly Cys Thr Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Ala 2240 2245 2250 Gly Cys Ala Ala Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Ala 2255 2260 2265 Cys Thr Cys Ala Gly Thr Thr Thr Thr Cys Cys Cys Ala Gly Thr 2270 2275 2280 Cys Ala Ala Ala Cys Ala Thr Gly Thr Gly Thr Cys Thr Cys Cys 2285 2290 2295 Ala Gly Thr Cys Ala Cys Thr Gly Thr Gly Ala Ala Cys Ala Ala 2300 2305 2310 Ala Gly Cys Thr Ala Thr Ala Thr Thr Ala Ala Gly Gly Thr Ala 2315 2320 2325 Cys Ala Thr Cys Ala Thr Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Thr 2330 2335 2340 Thr Cys Ala Thr Cys Cys Thr Thr Thr Cys Ala Gly Cys Ala Cys 2345 2350 2355 Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly Cys Cys Ala Thr Cys 2360 2365 2370 Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Gly Ala Thr 2375 2380 2385 Thr Ala Gly Thr Ala Cys Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys 2390 2395 2400 Thr Gly Gly Cys Ala Thr Thr Thr Cys Thr Gly Thr Cys Ala Thr 2405 2410 2415 Thr Ala Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Thr Ala Cys Thr Thr Thr 2420 2425 2430 Ala Cys Gly Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly Ala Thr Ala Gly Cys 2435 2440 2445 Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly Ala Thr 2450 2455 2460 Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr 2465 2470 2475 Gly Ala Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys Ala Thr Gly Ala Gly 2480 2485 2490 Thr Gly Ala Ala Gly Thr Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Ala Thr 2495 2500 2505 Thr Gly Cys Ala Ala Cys Cys Ala Cys Ala Ala Cys Gly Gly Ala 2510 2515 2520 Thr Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ala Cys Thr Gly Cys Ala Cys Gly 2525 2530 2535 Thr Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr Cys Ala Thr Thr Cys Ala Thr 2540 2545 2550 Thr Gly Gly Thr Gly Thr Ala Ala Cys Thr Gly Cys Thr Cys Ala 2555 2560 2565 Cys Thr Gly Gly Ala Thr Cys Ala Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly 2570 2575 2580 Ala Ala Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Ala 2585 2590 2595 Thr Thr Cys Cys Gly Cys Thr Gly Cys Ala Cys Thr Thr Gly Cys 2600 2605 2610 Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ala Thr 2615 2620 2625 Gly Gly Gly Cys Thr Cys Thr Cys Ala Thr Ala Cys Thr Thr Thr 2630 2635 2640 Thr Gly Ala Gly Gly Thr Ala Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Gly 2645 2650 2655 Thr Gly Cys Cys Ala Thr Gly Ala Ala Thr Gly Ala Thr Ala Thr 2660 2665 2670 Cys Cys Ala Cys Thr Cys Ala Gly Ala Gly Thr Ala Thr Gly Ala 2675 2680 2685 Ala Ala Thr Ala Cys Gly Thr Gly Ala Cys Ala Ala Gly Gly Thr 2690 2695 2700 Thr Gly Thr Thr Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala Cys 2705 2710 2715 Ala Gly Ala Cys Ala Gly Thr Gly Gly Thr Thr Cys Cys Ala Ala 2720 2725 2730 Cys Thr Thr Thr Ala Thr Gly Ala Ala Gly Gly Cys Thr Thr Thr 2735 2740 2745 Cys Ala Gly Ala Gly Thr Thr Thr Thr Thr Gly Gly Thr Gly Thr 2750 2755 2760 Gly Gly Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala Thr Ala Thr 2765 2770 2775 Cys Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Ala Gly Gly Cys Ala Ala Gly 2780 2785 2790 Ala Ala Gly Gly Thr Gly Thr Gly Ala Ala Ala Gly Thr Gly Ala 2795 2800 2805 Thr Gly Ala Cys Ala Cys Thr Gly Ala Thr Thr Cys Thr Gly Ala 2810 2815 2820 Ala Gly Gly Cys Thr Gly Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gly Gly Gly 2825 2830 2835 Ala Ala Gly Thr Gly Ala Thr Gly Gly Thr Gly Thr Gly Gly Ala 2840 2845 2850 Ala Thr Thr Cys Cys Ala Ala Gly Ala Thr Gly Cys Cys Thr Cys 2855 2860 2865 Ala Cys Gly Ala Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys Ala 2870 2875 2880 Ala Gly Ala Cys Gly Ala Thr Gly Gly Cys Thr Thr Cys Gly Ala 2885 2890 2895 Ala Thr Thr Cys Cys Ala Gly Cys Thr Ala Cys Cys Ala Ala Ala 2900 2905 2910 Ala Cys Ala Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gly Thr Gly Cys 2915 2920 2925 Cys Thr Gly Thr Cys Ala Cys Thr Thr Ala Cys Thr Thr Ala Ala 2930 2935 2940 Cys Cys Thr Ala Gly Thr Cys Thr Cys Ala Ala Gly Cys Gly Thr 2945 2950 2955 Thr Gly Ala Thr Gly Cys Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Gly Cys 2960 2965 2970 Thr Cys Thr Cys Thr Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala 2975 2980 2985 Cys Thr Ala Cys Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys Thr Cys Thr Ala 2990 2995 3000 Cys Ala Gly Ala Thr Cys Thr Gly Thr Cys Thr Thr Thr Gly Gly 3005 3010 3015 Cys Ala Ala Ala Thr Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Thr Thr 3020 3025 3030 Ala Thr Gly Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly 3035 3040 3045 Cys Cys Gly Ala Thr Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Ala Gly Cys 3050 3055 3060 Ala Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Thr Thr Gly Ala 3065 3070 3075 Ala Thr Cys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Cys Cys Gly Gly Cys Thr 3080 3085 3090 Thr Cys Ala Gly Cys Thr Thr Thr Thr Ala Ala Gly Gly Cys Cys 3095 3100 3105 Ala Ala Ala Cys Cys Ala Ala Ala Cys Gly Cys Gly Gly Thr Gly 3110 3115 3120 Gly Ala Ala Thr Thr Cys Ala Ala Cys Thr Thr Thr Thr Ala Thr 3125 3130 3135 Gly Gly Cys Thr Gly Thr Thr Gly Ala Cys Ala Gly Ala Ala Thr 3140 3145 3150 Thr Cys Thr Thr Cys Ala Ala Ala Thr Thr Thr Gly Cys Ala Ala 3155 3160 3165 Ala Gly Ala Ala Gly Cys Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly 3170 3175 3180 Cys Gly Cys Ala Cys Thr Thr Cys Gly Gly Ala Ala Thr Ala Thr 3185 3190 3195 Ala Thr Gly Cys Ala Cys Cys Thr Cys Thr Cys Thr Thr Gly Ala 3200 3205 3210 Gly Gly Thr Thr Cys Cys Ala Ala Thr Gly Thr Ala Ala Gly Thr 3215 3220 3225 Gly Thr Thr Thr Thr Thr Cys Cys Cys Cys Thr Cys Thr Ala Thr 3230 3235 3240 Cys Gly Ala Thr Gly Thr Ala Ala Ala Cys Ala Ala Ala Thr Gly 3245 3250 3255 Thr Gly Gly Gly Thr Thr Gly Thr Thr Thr Thr Thr Gly Thr Thr 3260 3265 3270 Thr Ala Ala Thr Ala Cys Thr Cys Thr Thr Thr Gly Ala Thr Thr 3275 3280 3285 Ala Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Thr Thr Cys Thr Cys Cys Thr 3290 3295 3300 Gly Thr Ala Gly Gly Thr Thr Thr Ala Ala Thr Cys Cys Ala Gly 3305 3310 3315 Cys Ala Gly Ala Ala Ala Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Cys Thr 3320 3325 3330 Thr Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Cys Cys Ala 3335 3340 3345 Ala Cys Ala Cys Ala Ala Thr Gly Cys Gly Thr Cys Cys Ala Gly 3350 3355 3360 Thr Thr Gly Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Ala Cys Thr Cys Gly 3365 3370 3375 Ala Cys Ala Thr Cys Thr Thr Gly Cys Ala Ala Gly Cys Gly Gly 3380 3385 3390 Ala Ala Ala Cys Gly Ala Ala Thr Ala Cys Ala Cys Ala Gly Cys 3395 3400 3405 Thr Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys 3410 3415 3420 Cys Thr Ala Gly Thr Gly Thr Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Thr 3425 3430 3435 Thr Ala Ala Gly Cys Thr Thr Gly Ala Ala Ala Cys Thr Thr Cys 3440 3445 3450 Ala Gly Cys Gly Ala Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Thr 3455 3460 3465 Cys Thr Cys Thr Cys Ala Gly Gly Thr Ala Cys Thr Gly Thr Gly 3470 3475 3480 Ala Cys Cys Cys Ala Cys Thr Thr Gly Thr Gly Gly Ala Thr Gly 3485 3490 3495 Cys Cys Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala 3500 3505 3510 Thr Cys Cys Ala Ala Ala Cys Ala Cys Gly Ala Thr Thr Cys Ala 3515 3520 3525 Ala Gly Cys Ala Thr Ala Thr Gly Thr Thr Thr Gly Ala Ala Gly 3530 3535 3540 Ala Thr Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Thr Ala Gly 3545 3550 3555 Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Cys Ala Thr Cys Cys Thr Thr Cys 3560 3565 3570 Thr Cys Cys Cys Thr Ala Ala Ala Thr Thr Thr Cys Gly Gly Ala 3575 3580 3585 Cys Cys Thr Cys Thr Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Ala Thr Gly 3590 3595 3600 Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Thr Ala Ala 3605 3610 3615 Ala Ala Cys Gly Ala Gly Gly Thr Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala 3620 3625 3630 Thr Gly Cys Ala Ala Gly Cys Ala Ala Cys Ala Thr Ala Cys Ala 3635 3640 3645 Cys Thr Thr Gly Ala Cys Gly Ala Ala Thr Thr Cys Thr Ala Ala 3650 3655 3660 Thr Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala Ala Cys Cys Thr Thr Thr Gly 3665 3670 3675 Ala Gly Cys Cys Ala Thr Ala Cys Cys Ala Ala Ala Ala Thr Thr 3680 3685 3690 Ala Thr Thr Cys Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr Thr 3695 3700 3705 Thr Ala Thr Thr Thr Thr Thr Gly Cys Ala Cys Thr Thr Thr Thr 3710 3715 3720 Thr Ala Gly Gly Ala Ala Thr Gly Thr Thr Ala Thr Ala Thr Cys 3725 3730 3735 Cys Cys Ala Thr Cys Thr Thr Thr Gly Gly Cys Thr Gly Thr Gly 3740 3745 3750 Ala Thr Cys Thr Cys Ala Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ala 3755 3760 3765 Thr Thr Gly Ala Thr Gly Thr Ala Ala Ala Gly Thr Ala Thr Thr 3770 3775 3780 Cys Thr Thr Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly Thr Thr Gly Thr 3785 3790 3795 Ala Gly Thr Thr Ala Thr Cys Cys Cys Thr Cys Ala Gly Thr Gly 3800 3805 3810 Thr Thr Thr Cys Thr Thr Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Ala Ala 3815 3820 3825 Cys Thr Cys Ala Thr Ala Thr Gly Thr Ala Thr Cys Ala Thr Ala 3830 3835 3840 Thr Gly Thr Gly Gly Thr Thr Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Gly 3845 3850 3855 Cys Ala Gly Thr Thr Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Gly 3860 3865 3870 Cys Thr Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Gly Gly Gly Ala Thr Thr 3875 3880 3885 Thr Gly Cys Ala Thr Gly Ala Thr Thr Thr Thr Ala Gly Ala Thr 3890 3895 3900 Gly Thr Ala Gly Ala Thr Gly Ala Cys Thr Gly Cys Ala Cys Gly 3905 3910 3915 Thr Ala Ala Ala Thr Gly Thr Ala Gly Thr Thr Ala Ala Thr Gly 3920 3925 3930 Ala Cys Ala Ala Ala Ala Thr Cys Cys Ala Thr Ala Ala Ala Ala 3935 3940 3945 Thr Thr Thr Gly Thr Thr Cys Cys Cys Ala Gly Thr Cys Ala Gly 3950 3955 3960 Ala Ala Gly Cys Cys Cys Cys Thr Cys Ala Ala Cys Cys Ala Ala 3965 3970 3975 Ala Cys Thr Thr Thr Thr Cys Thr Thr Thr Gly Thr Gly Thr Cys 3980 3985 3990 Thr Gly Cys Thr Cys Ala Cys Thr Gly Thr Gly Cys Thr Thr Gly 3995 4000 4005 Thr Ala Gly Gly Cys Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Ala 4010 4015 4020 Thr Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Cys Ala Thr Cys Thr Gly Gly 4025 4030 4035 Ala Gly Cys Cys Thr Thr Thr Gly Gly Ala Cys Cys Ala Cys Ala 4040 4045 4050 Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Ala Thr Thr Gly Gly Cys Cys Ala 4055 4060 4065 Ala Cys Ala Gly Thr Thr Cys Ala Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly 4070 4075 4080 Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Cys Gly 4085 4090 4095 Cys Thr Thr Cys Thr Thr Thr Gly Ala Ala Ala Cys Cys Gly Ala 4100 4105 4110 Cys Ala Ala Cys Ala Cys Ala Thr Gly Ala Ala Gly Cys Cys Ala 4115 4120 4125 Gly Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Thr Thr Gly Gly Ala Thr Gly 4130 4135 4140 Gly Ala Thr Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Cys Thr Gly Thr Gly 4145 4150 4155 Thr Thr Thr Cys Ala Gly Ala Cys Ala Cys Cys Ala Gly Gly Gly 4160 4165 4170 Ala Gly Thr Cys Thr Cys Thr Gly Cys Thr Cys Ala Cys Gly Thr 4175 4180 4185 Thr Thr Cys Cys Thr Gly Cys Thr Ala Thr Thr Thr Gly Cys Ala 4190 4195 4200 Gly Cys Cys Thr Cys Thr Cys Thr Ala Thr Cys Ala Ala Gly Ala 4205 4210 4215 Cys Thr Ala Ala Thr Ala Cys Ala Cys Cys Thr Cys Thr Thr Cys 4220 4225 4230 Cys Cys Gly Cys Ala Thr Cys Gly Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr 4235 4240 4245 Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Ala 4250 4255 4260 Gly Cys Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Ala Thr Thr Gly Cys 4265 4270 4275 Thr Thr Thr Thr Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Ala Ala Ala 4280 4285 4290 Gly Ala Gly Cys Thr Ala Gly Gly Cys Thr Thr Gly Ala Cys Ala 4295 4300 4305 Cys Thr Ala Ala Cys Ala Ala Thr Thr Thr Thr Gly Ala Gly Ala 4310 4315 4320 Ala Thr Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Thr Gly Ala 4325 4330 4335 Ala Gly Thr Thr Ala Ala Ala Thr Cys Thr Gly Ala Gly Gly Thr 4340 4345 4350 Thr Thr Thr Ala Cys Ala Ala Cys Thr Thr Thr Gly Ala Gly Thr 4355 4360 4365 Ala Gly Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Gly Gly Cys Ala Thr 4370 4375 4380 Thr Ala Gly Ala Thr Thr Gly Thr Cys Thr Gly Thr Cys Thr Thr 4385 4390 4395 Ala Thr Ala Gly Thr Thr Thr Gly Ala Thr Ala Ala Thr Thr Ala 4400 4405 4410 Ala Ala Thr Ala Cys Ala Ala Ala Cys Ala Gly Thr Thr Cys Thr 4415 4420 4425 Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ala Cys 4430 4435 4440 Cys Thr Thr Gly Thr Ala Thr Gly Cys Ala Thr Thr Thr Cys Ala 4445 4450 4455 Thr Thr Thr Ala Ala Thr Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Gly Ala 4460 4465 4470 Gly Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Ala Ala 4475 4480 4485 Cys Ala Ala Gly Ala Ala Thr Cys Thr Cys Thr Ala Gly Thr Thr 4490 4495 4500 Thr Thr Cys Thr Thr Thr Cys Thr Thr Gly Cys Thr Thr Thr Thr 4505 4510 4515 Ala Cys Thr Thr Thr Thr Ala Cys Thr Thr Cys Cys Thr Thr Ala 4520 4525 4530 Ala Thr Ala Cys Thr Cys Ala Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Thr 4535 4540 4545 Thr Thr Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ala Gly Thr Ala Cys Thr Thr 4550 4555 4560 Thr Thr Thr Thr Ala Cys Thr Thr Thr Thr Ala Cys Thr Cys Ala 4565 4570 4575 Ala Gly Thr Ala Ala Gly Ala Thr Thr Cys Thr Ala Gly Cys Cys 4580 4585 4590 Ala Gly Ala Thr Ala Cys Thr Thr Thr Thr Ala Cys Thr Thr Thr 4595 4600 4605 Thr Ala Ala Thr Thr Gly Ala Gly Thr Ala Ala Ala Ala Thr Thr 4610 4615 4620 Thr Thr Cys Cys Cys Thr Ala Ala Gly Thr Ala Cys Thr Thr Gly 4625 4630 4635 Thr Ala Cys Thr Thr Thr Cys Ala Cys Thr Thr Gly Ala Gly Thr 4640 4645 4650 Ala Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Gly Ala Gly Thr Ala Cys 4655 4660 4665 Thr Thr Thr Thr Thr Ala Cys Ala Cys Cys Thr Cys Thr Gly 4670 4675 4680 <210> 70 <211> 649 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tol2 transposase - 40-14490 <400> 70 Met Glu Glu Val Cys Asp Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Thr Val Gln 1 5 10 15 Asn Gln Pro Gln Asp Gln Glu His Pro Trp Pro Tyr Leu Arg Glu Phe 20 25 30 Phe Ser Leu Ser Gly Val Asn Lys Asp Ser Phe Lys Met Lys Cys Val 35 40 45 Leu Cys Leu Pro Leu Asn Lys Glu Ile Ser Ala Phe Lys Ser Ser Pro 50 55 60 Ser Asn Leu Arg Lys His Ile Glu Arg Met His Pro Asn Tyr Leu Lys 65 70 75 80 Asn Tyr Ser Lys Leu Thr Ala Gln Lys Arg Lys Ile Gly Thr Ser Thr 85 90 95 His Ala Ser Ser Ser Lys Gln Leu Lys Val Asp Ser Val Phe Pro Val 100 105 110 Lys His Val Ser Pro Val Thr Val Asn Lys Ala Ile Leu Arg Tyr Ile 115 120 125 Ile Gln Gly Leu His Pro Phe Ser Thr Val Asp Leu Pro Ser Phe Lys 130 135 140 Glu Leu Ile Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Ser Val Ile Thr Arg Pro 145 150 155 160 Thr Leu Arg Ser Lys Ile Ala Glu Ala Ala Leu Ile Met Lys Gln Lys 165 170 175 Val Thr Ala Ala Met Ser Glu Val Glu Trp Ile Ala Thr Thr Thr Asp 180 185 190 Cys Trp Thr Ala Arg Arg Lys Ser Phe Ile Gly Val Thr Ala His Trp 195 200 205 Ile Asn Pro Gly Ser Leu Glu Arg His Ser Ala Ala Leu Ala Cys Lys 210 215 220 Arg Leu Met Gly Ser His Thr Phe Glu Val Leu Ala Ser Ala Met Asn 225 230 235 240 Asp Ile His Ser Glu Tyr Glu Ile Arg Asp Lys Val Val Cys Thr Thr 245 250 255 Thr Asp Ser Gly Ser Asn Phe Met Lys Ala Phe Arg Val Phe Gly Val 260 265 270 Glu Asn Asn Asp Ile Glu Thr Glu Ala Arg Arg Cys Glu Ser Asp Asp 275 280 285 Thr Asp Ser Glu Gly Cys Gly Glu Gly Ser Asp Gly Val Glu Phe Gln 290 295 300 Asp Ala Ser Arg Val Leu Asp Gln Asp Asp Gly Phe Glu Phe Gln Leu 305 310 315 320 Pro Lys His Gln Lys Cys Ala Cys His Leu Leu Asn Leu Val Ser Ser 325 330 335 Val Asp Ala Gln Lys Ala Leu Ser Asn Glu His Tyr Lys Lys Leu Tyr 340 345 350 Arg Ser Val Phe Gly Lys Cys Gln Ala Leu Trp Asn Lys Ser Ser Arg 355 360 365 Ser Ala Leu Ala Ala Glu Ala Val Glu Ser Glu Ser Arg Leu Gln Leu 370 375 380 Leu Arg Pro Asn Gln Thr Arg Trp Asn Ser Thr Phe Met Ala Val Asp 385 390 395 400 Arg Ile Leu Gln Ile Cys Lys Glu Ala Gly Glu Gly Ala Leu Arg Asn 405 410 415 Ile Cys Thr Ser Leu Glu Val Pro Met Phe Asn Pro Ala Glu Met Leu 420 425 430 Phe Leu Thr Glu Trp Ala Asn Thr Met Arg Pro Val Ala Lys Val Leu 435 440 445 Asp Ile Leu Gln Ala Glu Thr Asn Thr Gln Leu Gly Trp Leu Leu Pro 450 455 460 Ser Val His Gln Leu Ser Leu Lys Leu Gln Arg Leu His His Ser Leu 465 470 475 480 Arg Tyr Cys Asp Pro Leu Val Asp Ala Leu Gln Gln Gly Ile Gln Thr 485 490 495 Arg Phe Lys His Met Phe Glu Asp Pro Glu Ile Ile Ala Ala Ala Ile 500 505 510 Leu Leu Pro Lys Phe Arg Thr Ser Trp Thr Asn Asp Glu Thr Ile Ile 515 520 525 Lys Arg Gly Met Asp Tyr Ile Arg Val His Leu Glu Pro Leu Asp His 530 535 540 Lys Lys Glu Leu Ala Asn Ser Ser Ser Asp Asp Glu Asp Phe Phe Ala 545 550 555 560 Ser Leu Lys Pro Thr Thr His Glu Ala Ser Lys Glu Leu Asp Gly Tyr 565 570 575 Leu Ala Cys Val Ser Asp Thr Arg Glu Ser Leu Leu Thr Phe Pro Ala 580 585 590 Ile Cys Ser Leu Ser Ile Lys Thr Asn Thr Pro Leu Pro Ala Ser Ala 595 600 605 Ala Cys Glu Arg Leu Phe Ser Thr Ala Gly Leu Leu Phe Ser Pro Lys 610 615 620 Arg Ala Arg Leu Asp Thr Asn Asn Phe Glu Asn Gln Leu Leu Leu Lys 625 630 635 640 Leu Asn Leu Arg Phe Tyr Asn Phe Glu 645 <210> 71 <211> 636 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TcBuster transposase - 40-18214 <400> 71 Met Met Leu Asn Trp Leu Lys Ser Gly Lys Leu Glu Ser Gln Ser Gln 1 5 10 15 Glu Gln Ser Ser Cys Tyr Leu Glu Asn Ser Asn Cys Leu Pro Pro Thr 20 25 30 Leu Asp Ser Thr Asp Ile Ile Gly Glu Glu Asn Lys Ala Gly Thr Thr 35 40 45 Ser Arg Lys Lys Arg Lys Tyr Asp Glu Asp Tyr Leu Asn Phe Gly Phe 50 55 60 Thr Trp Thr Gly Asp Lys Asp Glu Pro Asn Gly Leu Cys Val Ile Cys 65 70 75 80 Glu Gln Val Val Asn Asn Ser Ser Leu Asn Pro Ala Lys Leu Lys Arg 85 90 95 His Leu Asp Thr Lys His Pro Thr Leu Lys Gly Lys Ser Glu Tyr Phe 100 105 110 Lys Arg Lys Cys Asn Glu Leu Asn Gln Lys Lys His Thr Phe Glu Arg 115 120 125 Tyr Val Arg Asp Asp Asn Lys Asn Leu Leu Lys Ala Ser Tyr Leu Val 130 135 140 Ser Leu Arg Ile Ala Lys Gln Gly Glu Ala Tyr Thr Ile Ala Glu Lys 145 150 155 160 Leu Ile Lys Pro Cys Thr Lys Asp Leu Thr Thr Cys Val Phe Gly Glu 165 170 175 Lys Phe Ala Ser Lys Val Asp Leu Val Pro Leu Ser Asp Thr Thr Ile 180 185 190 Ser Arg Arg Ile Glu Asp Met Ser Tyr Phe Cys Glu Ala Val Leu Val 195 200 205 Asn Arg Leu Glu Asn Ala Lys Cys Gly Phe Thr Leu Gln Met Asp Glu 210 215 220 Ser Thr Asp Val Ala Gly Leu Ala Ile Leu Leu Val Phe Val Arg Tyr 225 230 235 240 Ile His Glu Ser Ser Phe Glu Glu Asp Met Leu Phe Cys Lys Ala Leu 245 250 255 Pro Thr Gln Thr Thr Gly Glu Glu Ile Phe Asn Leu Leu Asn Ala Tyr 260 265 270 Phe Glu Lys His Ser Ile Pro Trp Asn Leu Cys Tyr His Ile Cys Thr 275 280 285 Asp Gly Ala Lys Ala Met Val Gly Val Ile Lys Gly Val Ile Ala Arg 290 295 300 Ile Lys Lys Leu Val Pro Asp Ile Lys Ala Ser His Cys Cys Leu His 305 310 315 320 Arg His Ala Leu Ala Val Lys Arg Ile Pro Asn Ala Leu His Glu Val 325 330 335 Leu Asn Asp Ala Val Lys Met Ile Asn Phe Ile Lys Ser Arg Pro Leu 340 345 350 Asn Ala Arg Val Phe Ala Leu Leu Cys Asp Asp Leu Gly Ser Leu His 355 360 365 Lys Asn Leu Leu Leu His Thr Glu Val Arg Trp Leu Ser Arg Gly Lys 370 375 380 Val Leu Thr Arg Phe Trp Glu Leu Arg Asp Glu Ile Arg Ile Phe Phe 385 390 395 400 Asn Glu Arg Glu Phe Ala Gly Lys Leu Asn Asp Thr Ser Trp Leu Gln 405 410 415 Asn Leu Ala Tyr Ile Ala Asp Ile Phe Ser Tyr Leu Asn Glu Val Asn 420 425 430 Leu Ser Leu Gln Gly Pro Asn Ser Thr Ile Phe Lys Val Asn Ser Arg 435 440 445 Ile Asn Ser Ile Lys Ser Lys Leu Lys Leu Trp Glu Glu Cys Ile Thr 450 455 460 Lys Asn Asn Thr Glu Cys Phe Ala Asn Leu Asn Asp Phe Leu Glu Thr 465 470 475 480 Ser Asn Thr Ala Leu Asp Pro Asn Leu Lys Ser Asn Ile Leu Glu His 485 490 495 Leu Asn Gly Leu Lys Asn Thr Phe Leu Glu Tyr Phe Pro Pro Thr Cys 500 505 510 Asn Asn Ile Ser Trp Val Glu Asn Pro Phe Asn Glu Cys Gly Asn Val 515 520 525 Asp Thr Leu Pro Ile Lys Glu Arg Glu Gln Leu Ile Asp Ile Arg Thr 530 535 540 Asp Thr Thr Leu Lys Ser Ser Phe Val Pro Asp Gly Ile Gly Pro Phe 545 550 555 560 Trp Ile Lys Leu Met Asp Glu Phe Pro Glu Ile Ser Lys Arg Ala Val 565 570 575 Lys Glu Leu Met Pro Phe Val Thr Thr Tyr Leu Cys Glu Lys Ser Phe 580 585 590 Ser Val Tyr Val Ala Thr Lys Thr Lys Tyr Arg Asn Arg Leu Asp Ala 595 600 605 Glu Asp Asp Met Arg Leu Gln Leu Thr Thr Ile His Pro Asp Ile Asp 610 615 620 Asn Leu Cys Asn Asn Lys Gln Ala Gln Lys Ser His 625 630 635 <210> 72 <211> 1911 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TcBuster transposase - 40-18215 <400> 72 Ala Thr Gly Ala Thr Gly Thr Thr Gly Ala Ala Thr Thr Gly Gly Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Cys Thr 20 25 30 Thr Gly Ala Ala Ala Gly Thr Cys Ala Ala Thr Cys Ala Cys Ala Gly 35 40 45 Gly Ala Ala Cys Ala Gly Ala Gly Thr Thr Cys Cys Thr Gly Cys Thr 50 55 60 Ala Cys Cys Thr Thr Gly Ala Gly Ala Ala Cys Thr Cys Thr Ala Ala 65 70 75 80 Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Cys Gly 85 90 95 Cys Thr Cys Gly Ala Thr Thr Cys Thr Ala Cys Ala Gly Ala Thr Ala 100 105 110 Thr Thr Ala Thr Cys Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala 115 120 125 Cys Ala Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Cys Cys 130 135 140 Thr Cys Thr Cys Gly Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly Cys Gly Gly Ala 145 150 155 160 Ala Ala Thr Ala Thr Gly Ala Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Thr Ala 165 170 175 Thr Cys Thr Gly Ala Ala Cys Thr Thr Cys Gly Gly Thr Thr Thr Thr 180 185 190 Ala Cys Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Cys Gly Ala Cys Ala 195 200 205 Ala Gly Gly Ala Thr Gly Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Cys Gly Gly 210 215 220 Ala Cys Thr Thr Thr Gly Thr Gly Thr Gly Ala Thr Thr Thr Gly Cys 225 230 235 240 Gly Ala Gly Cys Ala Gly Gly Thr Ala Gly Thr Cys Ala Ala Cys Ala 245 250 255 Ala Thr Thr Cys Cys Thr Cys Ala Cys Thr Thr Ala Ala Cys Cys Cys 260 265 270 Gly Gly Cys Cys Ala Ala Ala Cys Thr Gly Ala Ala Ala Cys Gly Cys 275 280 285 Cys Ala Thr Thr Thr Gly Gly Ala Cys Ala Cys Ala Ala Ala Gly Cys 290 295 300 Ala Thr Cys Cys Gly Ala Cys Gly Cys Thr Thr Ala Ala Ala Gly Gly 305 310 315 320 Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Gly Ala Ala Thr Ala Cys Thr Thr Cys 325 330 335 Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Thr Ala Ala Cys Gly 340 345 350 Ala Gly Cys Thr Cys Ala Ala Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala 355 360 365 Gly Cys Ala Thr Ala Cys Thr Thr Thr Thr Gly Ala Gly Cys Gly Ala 370 375 380 Thr Ala Cys Gly Thr Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys Gly Ala Thr Ala 385 390 395 400 Ala Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys Thr Cys Cys Thr Gly Ala Ala 405 410 415 Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Thr Ala Thr Cys Thr Cys Gly Thr Cys 420 425 430 Ala Gly Thr Thr Thr Gly Ala Gly Ala Ala Thr Ala Gly Cys Thr Ala 435 440 445 Ala Ala Cys Ala Gly Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly Cys Ala Thr Ala 450 455 460 Thr Ala Cys Cys Ala Thr Ala Gly Cys Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly 465 470 475 480 Thr Thr Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly Cys Cys Thr Thr Gly Cys Ala 485 490 495 Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Thr Cys Thr Gly Ala Cys Ala Ala Cys 500 505 510 Thr Thr Gly Cys Gly Thr Ala Thr Thr Thr Gly Gly Ala Gly Ala Ala 515 520 525 Ala Ala Ala Thr Thr Cys Gly Cys Gly Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly 530 535 540 Thr Thr Gly Ala Thr Cys Thr Cys Gly Thr Cys Cys Cys Cys Cys Thr 545 550 555 560 Gly Thr Cys Cys Gly Ala Cys Ala Cys Gly Ala Cys Thr Ala Thr Thr 565 570 575 Thr Cys Ala Ala Gly Gly Cys Gly Ala Ala Thr Cys Gly Ala Ala Gly 580 585 590 Ala Cys Ala Thr Gly Ala Gly Thr Thr Ala Cys Thr Thr Cys Thr Gly 595 600 605 Thr Gly Ala Ala Gly Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly 610 615 620 Ala Ala Cys Ala Gly Gly Thr Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly 625 630 635 640 Cys Thr Ala Ala Ala Thr Gly Thr Gly Gly Gly Thr Thr Thr Ala Cys 645 650 655 Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Gly Gly Ala Cys Gly Ala Gly 660 665 670 Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Ala Thr Gly Thr Thr Gly Cys Cys Gly 675 680 685 Gly Thr Cys Thr Thr Gly Cys Ala Ala Thr Cys Cys Thr Gly Cys Thr 690 695 700 Thr Gly Thr Gly Thr Thr Thr Gly Thr Thr Ala Gly Gly Thr Ala Cys 705 710 715 720 Ala Thr Ala Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Gly Cys Thr Cys Thr Thr 725 730 735 Thr Thr Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Thr Ala Thr Gly Thr Thr 740 745 750 Gly Thr Thr Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Gly Cys Ala Cys Thr Thr 755 760 765 Cys Cys Cys Ala Cys Thr Cys Ala Gly Ala Cys Gly Ala Cys Ala Gly 770 775 780 Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys Ala Ala 785 790 795 800 Thr Cys Thr Thr Cys Thr Cys Ala Ala Thr Gly Cys Cys Thr Ala Thr 805 810 815 Thr Thr Cys Gly Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Cys Thr Cys Cys Ala 820 825 830 Thr Cys Cys Cys Ala Thr Gly Gly Ala Ala Thr Cys Thr Gly Thr Gly 835 840 845 Thr Thr Ala Cys Cys Ala Cys Ala Thr Thr Thr Gly Cys Ala Cys Ala 850 855 860 Gly Ala Cys Gly Gly Thr Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Cys Ala Ala 865 870 875 880 Thr Gly Gly Thr Ala Gly Gly Ala Gly Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ala 885 890 895 Ala Gly Gly Ala Gly Thr Cys Ala Thr Ala Gly Cys Gly Ala Gly Ala 900 905 910 Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Thr Cys Gly Thr Cys Cys 915 920 925 Cys Thr Gly Ala Thr Ala Thr Ala Ala Ala Ala Gly Cys Thr Ala Gly 930 935 940 Cys Cys Ala Cys Thr Gly Thr Thr Gly Cys Cys Thr Gly Cys Ala Thr 945 950 955 960 Cys Gly Cys Cys Ala Cys Gly Cys Thr Thr Thr Gly Gly Cys Thr Gly 965 970 975 Thr Ala Ala Ala Gly Cys Gly Ala Ala Thr Ala Cys Cys Gly Ala Ala 980 985 990 Thr Gly Cys Ala Thr Thr Gly Cys Ala Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly 995 1000 1005 Cys Thr Cys Ala Ala Thr Gly Ala Cys Gly Cys Thr Gly Thr Thr 1010 1015 1020 Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Thr Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys 1025 1030 1035 Ala Thr Cys Ala Ala Gly Thr Cys Thr Cys Gly Gly Cys Cys Gly 1040 1045 1050 Thr Thr Gly Ala Ala Thr Gly Cys Gly Cys Gly Cys Gly Thr Cys 1055 1060 1065 Thr Thr Cys Gly Cys Thr Thr Thr Gly Cys Thr Gly Thr Gly Thr 1070 1075 1080 Gly Ala Cys Gly Ala Thr Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ala Gly Cys 1085 1090 1095 Cys Thr Gly Cys Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Thr Cys Thr Thr 1100 1105 1110 Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Ala Thr Ala Cys Cys Gly Ala Ala 1115 1120 1125 Gly Thr Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gly Thr Cys Thr 1130 1135 1140 Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly 1145 1150 1155 Ala Cys Cys Cys Gly Ala Thr Thr Thr Thr Gly Gly Gly Ala Ala 1160 1165 1170 Cys Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Ala Thr Thr 1175 1180 1185 Ala Gly Ala Ala Thr Thr Thr Thr Cys Thr Thr Cys Ala Ala Cys 1190 1195 1200 Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Ala Ala Thr Thr Thr Gly Cys Cys 1205 1210 1215 Gly Gly Gly Ala Ala Ala Thr Thr Gly Ala Ala Cys Gly Ala Cys 1220 1225 1230 Ala Cys Cys Ala Gly Thr Thr Gly Gly Thr Thr Gly Cys Ala Ala 1235 1240 1245 Ala Ala Thr Thr Thr Gly Gly Cys Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala 1250 1255 1260 Gly Cys Thr Gly Ala Cys Ala Thr Ala Thr Thr Cys Ala Gly Thr 1265 1270 1275 Thr Ala Thr Cys Thr Gly Ala Ala Thr Gly Ala Ala Gly Thr Thr 1280 1285 1290 Ala Ala Thr Cys Thr Thr Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala 1295 1300 1305 Gly Gly Gly Cys Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Cys Ala Cys Ala 1310 1315 1320 Ala Thr Cys Thr Thr Cys Ala Ala Gly Gly Thr Ala Ala Ala Thr 1325 1330 1335 Ala Gly Cys Cys Gly Cys Ala Thr Thr Ala Ala Cys Ala Gly Thr 1340 1345 1350 Ala Thr Thr Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly 1355 1360 1365 Ala Ala Gly Thr Thr Gly Thr Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly 1370 1375 1380 Thr Gly Thr Ala Thr Ala Ala Cys Gly Ala Ala Ala Ala Ala Thr 1385 1390 1395 Ala Ala Cys Ala Cys Thr Gly Ala Gly Thr Gly Thr Thr Thr Thr 1400 1405 1410 Gly Cys Gly Ala Ala Cys Cys Thr Cys Ala Ala Cys Gly Ala Thr 1415 1420 1425 Thr Thr Thr Thr Thr Gly Gly Ala Ala Ala Cys Thr Thr Cys Ala 1430 1435 1440 Ala Ala Cys Ala Cys Thr Gly Cys Gly Thr Thr Gly Gly Ala Thr 1445 1450 1455 Cys Cys Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Thr Cys Thr 1460 1465 1470 Ala Ala Thr Ala Thr Thr Thr Thr Gly Gly Ala Ala Cys Ala Thr 1475 1480 1485 Cys Thr Cys Ala Ala Cys Gly Gly Thr Cys Thr Thr Ala Ala Gly 1490 1495 1500 Ala Ala Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly 1505 1510 1515 Thr Ala Thr Thr Thr Thr Cys Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys Gly 1520 1525 1530 Thr Gly Thr Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala Thr Cys Thr Cys Cys 1535 1540 1545 Thr Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Ala Ala Thr Cys Cys Thr 1550 1555 1560 Thr Thr Cys Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Gly Cys Gly Gly Thr 1565 1570 1575 Ala Ala Cys Gly Thr Cys Gly Ala Thr Ala Cys Ala Cys Thr Cys 1580 1585 1590 Cys Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly 1595 1600 1605 Gly Ala Ala Cys Ala Ala Thr Thr Gly Ala Thr Thr Gly Ala Cys 1610 1615 1620 Ala Thr Ala Cys Gly Gly Ala Cys Thr Gly Ala Thr Ala Cys Gly 1625 1630 1635 Ala Cys Ala Thr Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys Thr Thr Cys Ala 1640 1645 1650 Thr Thr Cys Gly Thr Gly Cys Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Thr 1655 1660 1665 Ala Thr Ala Gly Gly Ala Cys Cys Ala Thr Thr Cys Thr Gly Gly 1670 1675 1680 Ala Thr Cys Ala Ala Ala Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Ala Cys 1685 1690 1695 Gly Ala Ala Thr Thr Thr Cys Cys Ala Gly Ala Ala Ala Thr Thr 1700 1705 1710 Ala Gly Cys Ala Ala Ala Cys Gly Ala Gly Cys Thr Gly Thr Cys 1715 1720 1725 Ala Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Cys Ala Thr Gly Cys Cys Ala 1730 1735 1740 Thr Thr Thr Gly Thr Ala Ala Cys Cys Ala Cys Thr Thr Ala Cys 1745 1750 1755 Cys Thr Cys Thr Gly Thr Gly Ala Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala 1760 1765 1770 Thr Thr Thr Thr Cys Cys Gly Thr Cys Thr Ala Thr Gly Thr Ala 1775 1780 1785 Gly Cys Cys Ala Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala Ala Ala 1790 1795 1800 Thr Ala Thr Cys Gly Ala Ala Ala Thr Ala Gly Ala Cys Thr Thr 1805 1810 1815 Gly Ala Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Cys Gly Ala Thr 1820 1825 1830 Ala Thr Gly Cys Gly Ala Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Thr 1835 1840 1845 Ala Cys Thr Ala Cys Thr Ala Thr Cys Cys Ala Thr Cys Cys Ala 1850 1855 1860 Gly Ala Cys Ala Thr Thr Gly Ala Cys Ala Ala Cys Cys Thr Thr 1865 1870 1875 Thr Gly Thr Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala Gly Cys Ala Gly 1880 1885 1890 Gly Cys Thr Cys Ala Gly Ala Ala Ala Thr Cys Cys Cys Ala Cys 1895 1900 1905 Thr Gly Ala 1910 <210> 73 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FKBP12 -40-18091 <400> 73 Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro 1 5 10 15 Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp 20 25 30 Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe 35 40 45 Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala 50 55 60 Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr 65 70 75 80 Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr 85 90 95 Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu 100 105 <210> 74 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FKBP12 -40-18092 <400> 74 ggggtccagg tcgagactat ttcaccaggg gatgggcgaa catttccaaa aaggggccag 60 acttgcgtcg tgcattacac cgggatgctg gaggacggga agaaagtgga cagctccagg 120 gatcgcaaca agcccttcaa gttcatgctg ggaaagcagg aagtgatccg aggatgggag 180 gaaggcgtgg cacagatgtc agtcggccag cgggccaaac tgaccattag ccctgactac 240 gcttatggag caacaggcca cccagggatc attccccctc atgccaccct ggtcttcgat 300 gtggaactgc tgaagctgga g 321 <210> 75 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker-40-18093 <400> 75 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker-40-18094 <400> 76 Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Thr Cys Cys 1 5 10 15 <210> 77 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> truncatedCas9-40-18095 <400> 77 Gly Phe Gly Asp Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala Asp 1 5 10 15 Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile Ile 20 25 30 Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr Gly 35 40 45 Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu His 50 55 60 Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val Leu 65 70 75 80 Ala Leu Leu Glu Leu Ala Gln Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys Cys 85 90 95 Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln Phe 100 105 110 Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu Lys 115 120 125 Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly Lys 130 135 140 Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp His 145 150 155 160 Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly Ser 165 170 175 Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe 180 185 190 Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile Phe 195 200 205 Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro Lys 210 215 220 Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp 225 230 235 240 Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala 245 250 255 Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe 260 265 270 Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser 275 280 <210> 78 <211> 843 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> truncatedCas9-40-18096 <400> 78 tttggggacg tgggggccct ggagtctctg cgaggaaatg ccgatctggc ttacatcctg 60 agcatggaac cctgcggcca ctgtctgatc attaacaatg tgaacttctg cagagaaagc 120 ggactgcgaa cacggactgg ctccaatatt gactgtgaga agctgcggag aaggttctct 180 agtctgcact ttatggtcga agtgaaaggg gatctgaccg ccaagaaaat ggtgctggcc 240 ctgctggagc tggctcagca ggaccatgga gctctggatt gctgcgtggt cgtgatcctg 300 tcccacgggt gccaggcttc tcatctgcag ttccccggag cagtgtacgg aacagacggc 360 tgtcctgtca gcgtggagaa gatcgtcaac atcttcaacg gcacttcttg ccctagtctg 420 gggggaaagc caaaactgtt ctttatccag gcctgtggcg gggaacagaa agatcacggc 480 ttcgaggtgg ccagcaccag ccctgaggac gaatcaccag ggagcaaccc tgaaccagat 540 gcaactccat tccaggaggg actgaggacc tttgaccagc tggatgctat ctcaagcctg 600 cccactccta gtgacatttt cgtgtcttac agtaccttcc caggctttgt ctcatggcgc 660 gatcccaagt cagggagctg gtacgtggag acactggacg acatctttga acagtgggcc 720 cattcagagg acctgcagag cctgctgctg cgagtggcaa acgctgtctc tgtgaagggc 780 atctacaaac agatgcccgg gtgcttcaat tttctgagaa agaaactgtt ctttaagact 840 tcc 843 <210> 79 <211> 394 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Inducible proapoptotic polypeptides <400> 79 Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro 1 5 10 15 Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp 20 25 30 Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe 35 40 45 Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala 50 55 60 Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr 65 70 75 80 Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr 85 90 95 Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Phe Gly Asp Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala Asp 115 120 125 Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile Ile 130 135 140 Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr Gly 145 150 155 160 Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu His 165 170 175 Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val Leu 180 185 190 Ala Leu Leu Glu Leu Ala Gln Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys Cys 195 200 205 Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln Phe 210 215 220 Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu Lys 225 230 235 240 Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly Lys 245 250 255 Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp His 260 265 270 Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly Ser 275 280 285 Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe 290 295 300 Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile Phe 305 310 315 320 Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro Lys 325 330 335 Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp 340 345 350 Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala 355 360 365 Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe 370 375 380 Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser 385 390 <210> 80 <211> 1182 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inducible proapoptotic polypeptides <400> 80 ggggtccagg tcgagactat ttcaccaggg gatgggcgaa catttccaaa aaggggccag 60 acttgcgtcg tgcattacac cgggatgctg gaggacggga agaaagtgga cagctccagg 120 gatcgcaaca agcccttcaa gttcatgctg ggaaagcagg aagtgatccg aggatgggag 180 gaaggcgtgg cacagatgtc agtcggccag cgggccaaac tgaccattag ccctgactac 240 gcttatggag caacaggcca cccagggatc attccccctc atgccaccct ggtcttcgat 300 gtggaactgc tgaagctgga gggaggagga ggatccggat ttggggacgt gggggccctg 360 gagtctctgc gaggaaatgc cgatctggct tacatcctga gcatggaacc ctgcggccac 420 tgtctgatca ttaacaatgt gaacttctgc agagaaagcg gactgcgaac acggactggc 480 tccaatattg actgtgagaa gctgcggaga aggttctcta gtctgcactt tatggtcgaa 540 gtgaaagggg atctgaccgc caagaaaatg gtgctggccc tgctggagct ggctcagcag 600 gaccatggag ctctggattg ctgcgtggtc gtgatcctgt cccacgggtg ccaggcttct 660 catctgcagt tccccggagc agtgtacgga acagacggct gtcctgtcag cgtggagaag 720 atcgtcaaca tcttcaacgg cacttcttgc cctagtctgg ggggaaagcc aaaactgttc 780 tttatccagg cctgtggcgg ggaacagaaa gatcacggct tcgaggtggc cagcaccagc 840 cctgaggacg aatcaccagg gagcaaccct gaaccagatg caactccatt ccaggaggga 900 ctgaggacct ttgaccagct ggatgctatc tcaagcctgc ccactcctag tgacattttc 960 gtgtcttaca gtaccttccc aggctttgtc tcatggcgcg atcccaagtc agggagctgg 1020 tacgtggaga cactggacga catctttgaa cagtgggccc attcagagga cctgcagagc 1080 ctgctgctgc gagtggcaaa cgctgtctct gtgaagggca tctacaaaca gatgcccggg 1140 tgcttcaatt ttctgagaaa gaaactgttc tttaagactt cc 1182 <210> 81 <211> 463 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CSR-CD2z-46-17062 <400> 81 Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn 1 5 10 15 Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu 20 25 30 Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe 35 40 45 Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp 50 55 60 Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu 65 70 75 80 Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His 85 90 95 Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr 100 105 110 Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu 115 120 125 Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu 130 135 140 Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln 145 150 155 160 Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp 165 170 175 Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val 180 185 190 Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu 195 200 205 Asp Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met 210 215 220 Val Phe Val Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile Thr Lys Arg Lys Lys Gln 225 230 235 240 Arg Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu Leu Glu Thr Arg Ala His Arg Val 245 250 255 Ala Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys Pro His Gln Ile Pro Ala Ser Thr 260 265 270 Pro Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln His Pro Pro Pro Pro Pro Gly His 275 280 285 Arg Ser Gln Ala Pro Ser His Arg Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Val 290 295 300 Gln His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala Pro Ser Gly Thr Gln Val 305 310 315 320 His Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg Pro Arg Val Gln Pro Lys 325 330 335 Pro Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu Ser Pro Ser Ser Asn Arg 340 345 350 Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln 355 360 365 Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp 370 375 380 Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro 385 390 395 400 Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp 405 410 415 Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg 420 425 430 Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr 435 440 445 Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 450 455 460 <210> 82 <211> 184 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD2 ECD with D11H-46-17119 <400> 82 Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp 1 5 10 15 Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp 20 25 30 Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg 35 40 45 Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys 50 55 60 Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile 65 70 75 80 Tyr Lys Val Ser Ile Tyr His Thr Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys 85 90 95 Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser 100 105 110 Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr 115 120 125 Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser 130 135 140 Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe 145 150 155 160 Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro 165 170 175 Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu 180 <210> 83 <211> 463 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CSR CD2z-D111H-46-17118 <400> 83 Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn 1 5 10 15 Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu 20 25 30 Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe 35 40 45 Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp 50 55 60 Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu 65 70 75 80 Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His 85 90 95 Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr His Thr 100 105 110 Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu 115 120 125 Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu 130 135 140 Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln 145 150 155 160 Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp 165 170 175 Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val 180 185 190 Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu 195 200 205 Asp Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met 210 215 220 Val Phe Val Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile Thr Lys Arg Lys Lys Gln 225 230 235 240 Arg Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu Leu Glu Thr Arg Ala His Arg Val 245 250 255 Ala Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys Pro His Gln Ile Pro Ala Ser Thr 260 265 270 Pro Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln His Pro Pro Pro Pro Pro Gly His 275 280 285 Arg Ser Gln Ala Pro Ser His Arg Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Val 290 295 300 Gln His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala Pro Ser Gly Thr Gln Val 305 310 315 320 His Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg Pro Arg Val Gln Pro Lys 325 330 335 Pro Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu Ser Pro Ser Ser Asn Arg 340 345 350 Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln 355 360 365 Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp 370 375 380 Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro 385 390 395 400 Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp 405 410 415 Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg 420 425 430 Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr 435 440 445 Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 450 455 460 <210> 84 <211> 89 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 84 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 <210> 85 <211> 90 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 85 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg 65 70 75 80 Ser Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 90 <210> 86 <211> 270 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 86 atgctgcctg caccaaagaa cctggtggtg tctcatgtga cagaggatag tgccagactg 60 tcatggactg ctcccgacgc agccttcgat agttttatca tcgtgtaccg ggagaacatc 120 gaaaccggcg aggccattgt cctgacagtg ccagggtccg aacgctctta tgacctgaca 180 gatctgaagc ccggaactga gtactatgtg cagatcgccg gcgtcaaagg aggcaatatc 240 agcttccctc tgtccgcaat cttcaccaca 270 <210> 87 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A-B Loop <400> 87 Thr Glu Asp Ser 1 <210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A-B Loop <400> 88 Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe 1 5 <210> 89 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A-B Loop <400> 89 Ser Glu Lys Val Gly Glu 1 5 <210> 90 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D-E Loop <400> 90 Gly Ser Glu Arg 1 <210> 91 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E-F Loop <400> 91 Gly Leu Lys Pro Gly 1 5 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F-G Loop <400> 92 Lys Gly Gly His Arg Ser Asn 1 5 <210> 93 <211> 411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSMA centyrin <400> 93 atgctgcctg caccaaagaa cctggtggtg tctcgggtga ccgaggactc tgccagactg 60 agctgggcca tcgacgagca gagggattgg ttcgagagct ttctgatcca gtatcaggag 120 tccgagaaag tgggcgaggc catcgtgctg acagtgcctg gcagcgagcg gtcctatgat 180 ctgaccggcc tgaagccagg cacagagtac accgtgtcca tctacggcgt gtatcacgtg 240 tacaggtcca atcctctgtc tgccatcttc accacaacca caacccctgc ccccagacct 300 cccacacccg cccctaccat cgcgagtcag cccctgagtc tgagacctga ggcctgcagg 360 ccagctgcag gaggagctgt gcacaccagg ggcctggact tcgcctgcga c 411 <210> 94 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PSMA centyrin <400> 94 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Ala Ile Asp Glu Gln Arg Asp Trp Phe Glu 20 25 30 Ser Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile 35 40 45 Val Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Tyr His Val 65 70 75 80 Tyr Arg Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 95 <211> 336 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PSMA CARTyrin <400> 95 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser 20 25 30 Arg Val Thr Glu Asp Ser Ala Arg Leu Ser Trp Ala Ile Asp Glu Gln 35 40 45 Arg Asp Trp Phe Glu Ser Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys 50 55 60 Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr 65 70 75 80 Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr 85 90 95 Gly Val Tyr His Val Tyr Arg Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr 100 105 110 Thr Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 115 120 125 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 130 135 140 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr 145 150 155 160 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 165 170 175 Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 180 185 190 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 195 200 205 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 210 215 220 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 225 230 235 240 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 245 250 255 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 260 265 270 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 275 280 285 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 290 295 300 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 305 310 315 320 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 325 330 335 <210> 96 <211> 489 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA VH <400> 96 gaagttcagc tgcttgaatc tggcggaggc ctggttcaac ctggcggatc tctgagactg 60 agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc aattacgcca tgacctggat cagacaggcc 120 cctggcaaag gcctggaatg ggtgtccgga attacaggcg acggcggcag caccttttac 180 gccgattctg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgt gaaggactgg 300 aacaccacca tgatcaccga gagaggccag ggcacactgg tcaccgtgtc ctctacaaca 360 acaccggcgc ctagacctcc aacaccagct cctacaatcg cgagtcagcc cctgtctctc 420 agacccgaag cctgcaggcc agctgcagga ggagctgtgc acaccagggg cctggacttc 480 gcctgcgac 489 <210> 97 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA VH <400> 97 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Thr Gly Asp Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Lys Asp Trp Asn Thr Thr Met Ile Thr Glu Arg Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 98 <211> 362 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA VCAR <400> 98 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Thr Gly Asp Gly Gly Ser Thr Phe 65 70 75 80 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Val Lys Asp Trp Asn Thr Thr Met Ile Thr Glu 115 120 125 Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala 130 135 140 Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr 165 170 175 Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala 180 185 190 Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 195 200 205 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 210 215 220 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 225 230 235 240 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 245 250 255 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 260 265 270 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 275 280 285 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 290 295 300 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 305 310 315 320 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 325 330 335 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 340 345 350 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 355 360

Claims (54)

1. (a) 제1 역위 말단 반복(inverted terminal repeat, ITR), (b) 제2 ITR 및 (c) 인트라-ITR(intra-ITR) 서열을 포함하는 제1 핵산 서열로서, 인트라-ITR 서열은 트랜스포존(transposon) 서열을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
   인터-ITR(inter-ITR) 서열을 포함하는 제2 핵산 서열로서, 인터-ITR 서열의 길이는 종점을 포함하여 1 내지 600개의 뉴클레오타이드인 것인 제2 핵산 서열
   을 포함하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 인터-ITR 서열의 길이는 종점을 포함하여 1 내지 100개의 뉴클레오타이드인 것인 조성물.
3. 제1항에 있어서, 제1 핵산 서열은 복제 원점 서열을 추가로 포함하는 것인 조성물.
4. 제1항에 있어서, 제2 핵산 서열은 복제 원점 서열을 추가로 포함하는 것인 조성물.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 복제 원점 서열의 길이는 1 내지 450개의 뉴클레오타이드인 것인 조성물.
6. 제5항에 있어서, 복제 원점 서열은 R6K 복제 원점을 포함하는 것인 조성물.
7. 제1항에 있어서, 제1 핵산은 제1 선택 마커를 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 것인 조성물.
8. 제1항에 있어서, 제2 핵산 서열은 제1 선택 마커를 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 것인 조성물.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 제1 선택 마커의 길이는 1 내지 200개의 뉴클레오타이드인 것인 조성물.
10. 제7항 또는 제8항에 있어서, 제1 선택 마커는 수크로스 선택 마커인 것인 조성물.
11. 제7항 또는 제8항에 있어서, 수크로스 선택 마커는 RNA-OUT 선택 마커인 것인 조성물.
12. 제1항에 있어서, 제1 핵산 서열은 재조합 부위, 절제 부위, 결찰 부위, 또는 이의 조합을 포함하지 않는 것인 조성물.
13. 제1항에 있어서, 제2 핵산 서열은 재조합 부위, 절제 부위, 결찰 부위, 또는 이의 조합을 포함하지 않는 것인 조성물.
14. 제1항에 있어서, 제1 핵산 서열은 외래 DNA를 코딩하는 서열을 포함하지 않는 것인 조성물.
15. 제1항에 있어서, 제2 핵산 서열은 외래 DNA를 코딩하는 서열을 포함하지 않는 것인 조성물.
16. 제1항에 있어서, 제1 핵산 서열은 적어도 하나의 외인성 서열 및 포유동물 세포에서 외인성 서열을 발현할 수 있는 프로모터를 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 것인 조성물.
17. 제16항에 있어서, 제1 핵산 서열은 인슐레이터(insulator)를 코딩하는 적어도 하나의 서열을 추가로 포함하는 것인 조성물.
18. 제16항에 있어서, 제1 핵산 서열은 폴리아데노신(polyA) 서열을 추가로 포함하는 것인 조성물.
19. 제16항에 있어서, 포유동물 세포에서 외인성 서열을 발현할 수 있는 프로모터를 코딩하는 서열은 인간 세포에서 외인성 서열을 발현할 수 있는 것인 조성물.
20. 제19항에 있어서, 프로모터는 항시성 프로모터인 것인 조성물.
21. 제19항에 있어서, 프로모터는 유도성 프로모터인 것인 조성물.
22. 제16항에 있어서, 적어도 하나의 외인성 서열은 비자연발생 항원 수용체를 코딩하는 서열, 치료적 폴리펩타이드를 코딩하는 서열, 또는 이의 조합을 포함하는 것인 조성물.
23. 제22항에 있어서, 비자연발생 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 것인 조성물.
24. 제23항에 있어서, CAR은
    (a) 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인(ectodomain),
    (b) 막관통 도메인, 및
    (c) 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 엔도도메인(endodomain)
    을 포함하는 것인 조성물.
25. 제24항에 있어서, 항원 인식 영역은 적어도 하나의 단일 사슬 가변 단편(scFv), 단일 도메인 항체, 센티린(Centyrin), 또는 이의 조합을 포함하는 것인 조성물.
26. 제25항에 있어서, 단일 도메인 항체는 VHH 또는 VH인 것인 조성물.
27. 제24항에 있어서, 항원 인식 영역은 적어도 하나의 항-BCMA 센티린을 포함하는 것인 조성물.
28. 제27항에 있어서, 항-BCMA 센티린은 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
29. 제24항에 있어서, 항원 인식 영역은 적어도 하나의 항-BCMA VH를 포함하는 것인 조성물.
30. 제29항에 있어서, 항-BCMA VH는 서열번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
31. 제24항에 있어서, 항원 인식 영역은 적어도 하나의 항-PSMA 센티린을 포함하는 것인 조성물.
32. 제31항에 있어서, 항-PSMA 센티린은 서열번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
33. 제24항에 있어서, 엑토도메인은 신호 펩타이드를 추가로 포함하는 것인 조성물.
34. 제24항에 있어서, CAR은 항원 인식 영역과 막관통 도메인 사이에 힌지 영역을 추가로 포함하는 것인 조성물.
35. 제24항에 있어서, 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 조성물.
36. 제24항에 있어서, 적어도 하나의 공자극 도메인은 CD3ζ 공자극 도메인, 4-1BB 공자극 도메인, 또는 이의 조합을 포함하는 것인 조성물.
37. 제24항에 있어서, 적어도 하나의 공자극 도메인은 CD3ζ 공자극 도메인 및 4-1BB 공자극 도메인을 포함하고, 4-1BB 공자극 도메인은 막관통 도메인과 CD3ζ 공자극 도메인 사이에 위치하는 것인 조성물.
38. 제XX항에 있어서, 적어도 하나의 외인성 서열은 유도성 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드를 코딩하는 서열, 제2 선택 마커를 코딩하는 서열, 키메라 자극 수용체(CSR)를 코딩하는 서열, 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열, 자가 절단 펩타이드를 코딩하는 서열, 또는 이의 조합을 포함하는 것인 조성물.
39. 제38항에 있어서, 제2 선택 마커는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 뮤테인 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 조성물.
40. 제1항에 있어서, 조성물은 트랜스포존인 것인 조성물.
41. 제40항에 있어서, 트랜스포존은 piggyBac 트랜스포존인 것인 조성물.
42. 제1항의 조성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
43. 제1항의 조성물을 포함하는 세포.
44. 복수의 세포 집단이 제24항의 CAR을 발현하도록 변형된 것인 세포 집단.
45. 제44항에 있어서, 복수의 변형된 세포는 복수의 변형된 면역 세포인 것인 세포 집단.
46. 제44항에 있어서, 복수의 변형된 세포는 복수의 변형된 T-세포인 것인 세포 집단.
47. 제44항에 있어서, 복수의 변형된 T-세포의 적어도 50%는 CD45RA 및 CD62L을 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하고 CD45RO를 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하지 않는 것인 세포 집단.
48. 제43항의 세포를 포함하는 조성물.
49. 제44항의 세포 집단을 포함하는 조성물.
50. 제1항, 제48항 또는 제49항 중 어느 한 항의 조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
51. 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암 치료에 사용하기 위한, 제1항, 제48항 또는 제49항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제50항의 약학 조성물.
52. 제51항에 있어서, 암은 BCMA 양성 암 또는 PSMA 양성 암인 것인 용도.
53. 제51항에 있어서, 암은 원발성 종양, 전이성 암, 다중 내성 암, 진행성 종양 또는 재발성 암인 것인 용도.
54. 제51항에 있어서, 암은 폐암, 뇌암, 두경부암, 유방암, 피부암, 간암, 췌장암, 위암, 결장암, 직장암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 피부암, 식도암, 림프종, 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 급성 림프성 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML), 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myelocytic leukemia, CML), 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 털세포 백혈병(hairy cell leukemia), 골수이형성 증후군(myelodyplastic syndrome, MDS), 호지킨병, 비호지킨 림프종, 또는 다발성 골수종인 것인 용도.

Images