JP2023547507A - 標的細胞限定的で共刺激性の二重特異性かつ２価の抗ｃｄ２８抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、２価でありかつ２つのＣＤ２８結合部位と少なくとも１つの標的結合部位とを含む、新規二重特異性抗ＣＤ２８抗体フォーマットを提供する。本発明の二重特異性抗ＣＤ２８抗体は、その厳密に標的細胞に限定された共刺激活性のために驚くほど有利である。本発明の二重特異性ＣＤ２８抗体は、単独で、またはＣＤ３／Ｔ細胞受容体シグナルを誘導するさらなる二重特異性抗体と組み合わせて、疾患の処置への使用のために提供される。【選択図】図１１

Description

本発明は、２価でありかつ２つのＣＤ２８結合部位と少なくとも１つの標的結合部位とを含む、新規二重特異性抗ＣＤ２８抗体フォーマットを提供するものである。本発明の二重特異性抗ＣＤ２８抗体は、その厳密に標的細胞に限定された共刺激活性のために驚くほど有利である。本発明の二重特異性ＣＤ２８抗体は、単独で、またはＣＤ３／Ｔ細胞受容体シグナルを誘導するさらなる二重特異性抗体と組み合わせて、疾患の処置への使用のために提供される。

説明
Ｔ細胞の活性化は、抗原特異的な免疫応答の開始のための中心である。過去数十年のうちに、このプロセスを形成する数多くのＴ細胞表面受容体が同定されている。最も重要なのは、抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体である。該ＴＣＲによる、ＭＨＣ分子により提示される抗原ペプチドの結合時に、該複合体の該ＣＤ３部分を介したシグナル（「シグナル１」とも称される）がＴ細胞活性化を開始する［１］。重要なことに、有効かつ持続的な応答のためには、ＣＤ２８、４-１ＢＢまたはＯｘ４０などの受容体を介した追加の共刺激性シグナル（「第２シグナル」）が必要である［２、３］。事実、かかるシグナルの非存在下では、単独のＴＣＲ／ＣＤ３刺激は最終的にＴ細胞の非応答性または細胞死すら招く可能性があり、またそれ故に、共刺激性シグナルは効果的なＴ細胞応答のための主要な必要条件であるように思われる［４、５］。

Ｔ細胞活性化に関与する表面受容体の同定は、腫瘍細胞に対してＴ細胞を動員することを目的とする２つの機能的に非常に類似した戦略、すなわち、
・ＣＡＲ Ｔ細胞に、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する抗体部分と、ＣＤ３分子の細胞内シグナル伝達モチーフとを含むキメラ受容体をトランスフェクトする戦略［７］
・同様に、ＴＡＡならびにＣＤ３分子に結合する二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）（本明細書中ではｂｓＡｂＣＤ３と表記する）を構築する戦略［８］
の基礎である［６］。

いずれのタイプの試薬も、Ｔ細胞の抗原特異性に関わらず該Ｔ細胞を腫瘍細胞に再指向させる能力があり、また８０年代後半には既に提案されている［９～１３］。ＣＤ１９を指向する抗体部分を備えたそれらは、今日ではＢ細胞由来の白血病およびリンパ腫の処置としてしっかりと確立されている。しかし、両試薬タイプは、重大な副作用、すなわち、しばしば重度でありかつ用量制限を要するサイトカイン放出症候群をもたらす過度の全身性のＴ細胞活性化［１４］もまた共有している。とはいえ、「第１世代」のＣＡＲ Ｔ細胞はＣＤ３由来のシグナル伝達モチーフのみを含有しており治療有効性が限定的であった、という注目すべき相違点も存在する。「第２世代」のＣＡＲ構築物に共刺激性分子ＣＤ２８および／または４-１ＢＢ由来の追加モチーフを備え付けた場合のみ、それらは永続的な治療効果を発揮する能力があった［１５］。注目すべきことに、二重特異性抗体とＴＡＡ×ＣＤ３およびＴＡＡ×ＣＤ２８との組み合わせによる適用が８０年代後半に既に提案されている［１６］が、ドイツ規制当局の承認を得る段階まで発展しなかった。これはかかる手法を実現するために必要とされる相当な技術的努力のためだけではなく、２００６年のいわゆるＴｅｇｅｎｅｒｏ事件の悪影響も原因となっており、その際、６人の健常ボランティアがスーパーアゴニストＣＤ２８抗体の注入中に重篤なサイトカイン放出症候群を呈し、参加者全員に緊急の集中治療が必要となった［１７］。このことは、臨床応用時の許容できない副作用を回避するためには、Ｔ細胞刺激抗体のアゴニスト活性が標的細胞に限定されるべきであること、つまり、各標的抗原への結合に依存すべきであることを劇的に例示している。実際に、これは（ｉ）標的細胞によるものではなくむしろＦｃＲ発現細胞によるＴ細胞活性化を阻止するために適切なＦｃ除去（Ｆｃ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ）抗体フォーマットを選択すること、ならびに（ｉｉ）刺激抗体の親和性および／または結合価の慎重な設計により達成しうる。

組換え抗体技術は、二機能性および多機能性抗体ベースの分子の構築用の複数のフォーマットを提供する［１８］。基準ｂｓＡｂであるブリナツモマブは、グリシンセリンリンカーにより融合された２つの一本鎖抗体からなる、いわゆる二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）フォーマットのＣＤ１９×ＣＤ３特異性を示す抗体である。このフォーマットは、そのＦｃ部分の欠損およびその一価でかつやや低い親和性を有するＣＤ３結合部により、標的細胞への限定を維持している。しかし、ＢｉＴＥ分子は、約１時間という相応に短い血清半減期をもたらす低分子量を有する。これは煩雑な連続注入レジメンを必要とする。ＣＨ２ドメイン中の選択した変異によりＦｃを減弱化した全長ＩｇＧベースのフォーマットは、かなり長い半減期という利点を提供するが、特にそのＴ細胞刺激部分が２価でありかつＣＤ３よりむしろＣＤ２８を指向するのであれば、慎重な設計を必要とする。これは一般に、２価形態のＣＤ３抗体はＴ細胞を活性化しないからである［１９］。それらは、例えばＦｃＲ発現細胞への結合による固定化を必要とする。対照的に、ＣＤ２８抗体は可溶性２価抗体として効率的な共刺激を伝達しうる［２０］。従って、原則として、２価ＣＤ２８結合部を含有するＴＡＡ×ＣＤ２８抗体を用いて標的細胞に限定された活性を得ることは困難であるように思われる。

本出願において、本発明は、これらの試薬の臨床適用中の全身性Ｔ細胞活性化を回避するために完全に標的細胞に限定された２価ＣＤ２８結合部を有する二重特異性ＴＡＡ×ＣＤ２８抗体について説明するものである。

たとえ標的細胞への限定が達成されたとしても、選択される標的抗原が（ほぼ全ての場合に）正常で健常な組織上で発現される限り、特異性の課題が残る。これはＴ細胞の望ましくない「ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ ｏｎ ｔａｒｇｅｔ」活性化をもたらす。この課題は、正常なＢ細胞上および脳の壁細胞上に発現される抗原であるＣＤ１９を標的とするＢｓＡｂＣＤ３であるブリナツモマブの周知の副作用により例示されている［２１］。これは特に脳組織における全身性Ｔ細胞活性化と、それに伴う用量制限副作用をもたらす。本明細書中で例示したこの特異性の課題に取り組むために、本発明者らは、本出願に関して、腫瘍細胞上ならびに腫瘍血管系上に発現されるＴＡＡであるＢ７Ｈ３を指向するＴＡＡ×ＴＣＲ／ＣＤ３ｂｓＡｂと共に組み合わせた標的細胞限定ＢｉＣｏの使用もまた提案する。これらのｂｓＡｂＣＤ３は、単独では弱い、副次的細胞***促進性の（ｓｕｂｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）Ｔ細胞活性化を誘導するのみであり、従って該ＢｉＣｏの存在に大きく依存する。あるいは、副次的細胞***促進性のＣＤ３刺激は、適切な低用量の細胞***促進性ｂｓＡｂＣＤ３により達成されるかもしれない。いずれにせよ、前記２つの成分が２つの異なる標的抗原を指向するのであれば、かかるｂｓＡｂの組み合わせの特異性は、それらの活性が２つの異なる標的抗原の同時存在に依存することから、大きく増大するであろう。

まとめると、腫瘍血管系上に提示されるかかる腫瘍関連抗原を標的化することで達成されうる、腫瘍塊の効率的なターゲティングを可能にするさらなる治療選択肢が必要とされている。従って、本発明は、がん性疾患の処置に使用できる抗体を同定しようと努めるものである。

本発明の簡単な説明
全般的に、かつ簡単な説明として、本発明の主な態様は以下のように記載することができる。

第１態様では、本発明は、対象における疾患の処置への使用のための、少なくとも２つの第１抗原結合部位と少なくとも１つの第２抗原結合部位とを含む、少なくとも二重特異性である結合分子であって、ここで
・該少なくとも２つの第１抗原結合部位は、Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８のエピトープに特異的に結合する能力があり、かつ
・該少なくとも１つの第２抗原結合部位は、該対象において該疾患に関連する細胞上または細胞内で発現される抗原標的タンパク質のエピトープに結合する能力があり、
ここで該処置は該対象への該結合分子の投与を含む、
該結合分子に関するものである。

代替的な態様では、本発明はまた、少なくとも配列ＲＮＹＶＴＧＦＤＹ（配列番号１６）、またはこの配列と比較すると３、２以下、好ましくは１以下のアミノ酸変異を伴う配列を有する重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）３、および配列ＨＱＹＬＳＳＹＴ（配列番号２０）、またはこの配列と比較すると３、２以下、好ましくは１以下のアミノ酸変異を伴う配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、を含むエンドグリン結合分子にも関するものである。

第２態様では、本発明は、前記第１態様のいずれか１つの結合分子、または該結合分子の抗原結合フラグメントもしくはモノマー、例えば重鎖もしくは軽鎖をコードする配列を含む単離された核酸に関するものである。

第３態様では、本発明は、前記第２態様の核酸と、（宿主）細胞における前記コード化結合分子、または該結合分子の成分（例えば抗体の重鎖もしくは軽鎖）の発現を可能にする１以上の追加の配列特徴とを含む核酸構築物（ＮＡＣ）に関するものである。

第４態様では、本発明は、前記第２または第３態様による核酸またはＮＡＣを含む組換え宿主細胞に関するものである。

第５態様では、本発明は、（ｉ）前記第１態様の結合分子、または（ｉｉ）前記第２もしくは第３態様の核酸もしくはＮＡＣ、または（ｉｉｉ）前記第４態様による組換え宿主細胞、ならびに製薬上許容可能な担体、安定剤および／または賦形剤を含む医薬組成物に関するものである。

第６態様では、本発明は、パッケージまたは医薬組成物のキットであって、該キットが別々の容器に（ｉ）前述の態様のいずれか１つに列挙した単離された結合分子、該単離された結合分子をコードする単離された核酸、および／またはかかる核酸もしくは単離された結合分子を含む組換え宿主細胞、ならびに（ｉｉ）前述の態様のいずれか１つに列挙した単離されたさらなる結合分子、該単離されたさらなる結合分子をコードする単離された核酸、および／またはかかる核酸または単離されたさらなる結合分子を含む組換え宿主細胞、を含む該パッケージまたは医薬組成物のキットに関するものである。

第７態様では、本発明は、医薬への使用のための成分であって、ここで該成分が（ｉ）前記第１態様の結合分子、または（ｉｉ）前記第２もしくは第３態様の核酸もしくはＮＡＣ、または（ｉｉｉ）前記第４態様による組換え宿主細胞、および（ｉｖ）前記第５もしくは第６態様による医薬組成物もしくはキット、からなるリストより選択される、該医薬への使用のための成分に関するものである。

本発明の詳細な説明
以下に、本発明の要素を記載する。これらの要素を具体的な実施形態と共に列挙するが、それらはさらなる実施形態を創出するために任意の様式および任意の数で組み合わせうることを理解されたい。様々に記載された実施例および好適な実施形態は、本発明を明確に記載された実施形態のみに限定するものと解釈してはならない。本記載は、明確に記載された実施形態のうちの２つ以上を組み合わせるか、または明確に記載された実施形態のうちの１つ以上を任意の数の開示された要素および／もしくは好適な要素と組み合わせる実施形態を支持かつ包含するものと理解されたい。さらに、本出願におけるあらゆる記載された要素の任意の並べ替えおよび組み合わせは、文脈上他を意味しない限り、本願の記載により開示されているとみなすべきである。

第１態様では、本発明は、少なくとも２つの第１抗原結合部位と少なくとも１つの第２抗原結合部位とを含む、少なくとも二重特異性である結合分子であって、ここで
・該少なくとも２つの第１抗原結合部位は、Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８のエピトープに特異的に結合する能力があり、かつ
・該少なくとも１つの第２抗原結合部位は、疾患に関連する細胞上または細胞内で発現される抗原標的タンパク質のエピトープに結合する能力がある、
該結合分子に関するものである。

本発明の結合分子は、好ましくは対象における疾患の処置への使用のためのものであり、ここで該処置は、該対象への該結合分子の投与を含む。

幾つかの特定の実施形態では、前記少なくとも２つの第１抗原結合部位および／または前記少なくとも１つの第２抗原結合部位は抗体または抗体様分子に由来するものであり、かつここで、該少なくとも２つの第１抗原結合部位は各々がＦ（ａｂ’）_２またはＦａｂではない抗体の抗原結合フラグメントとして提供され、また好ましくは一本鎖構築物であり、最も好ましくは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。

本発明の幾つかの実施形態では、前記結合分子は、抗原標的タンパク質を発現する第２細胞の非存在下でＣＤ２８陽性免疫細胞（例えばＴ細胞）である第１細胞と接触させる場合、ＣＤ２８シグナル伝達を誘導せず、また好ましくは該免疫細胞（Ｔ細胞）を活性化しない。

本発明の幾つかの好適な実施形態では、前記抗原標的タンパク質は、増殖性疾患に関連する細胞上に発現されるタンパク質、寄生生物、ウイルスまたは細菌などの病原性生物に関連するタンパク質または他の分子から選択される。例えば、該抗原標的タンパク質をエンドグリン、ＣＤ１０５、ＰＳＭＡ、ＦＬＴ３、Ｂ７Ｈ３、またはＦＡＢから選択してもよい。

幾つかの実施形態では、前記少なくとも２つの第１抗原結合部位の各々が、直接、例えば共有結合的または非共有結合的に、前記少なくとも１つの第２抗原結合部位と連結されていてもよい。

前記結合分子の好適な実施形態は、少なくとも２つの第２抗原結合部位を含む。

本発明のある好適な実施形態では、本明細書中に開示した結合分子は、正確に２つ、および２つ以下の第１抗原結合部位と、正確に１つまたは２つ、および１つまたは２つ以下の第２抗原結合部位を含む。

本発明の他の好適な実施形態は前記第１態様の結合分子に関するものであり、ここで前記少なくとも２つの第１抗原結合部位はＣＤ２８上の同一エピトープに結合し、好ましくはここで前記少なくとも２つの抗原結合部位は同一である。

幾つかの実施形態では、前記少なくとも２つの第１抗原結合部位のうちの少なくとも１つと前記少なくとも１つの第２抗原結合部位とが、好ましくはＩｇＧの、１つ以上の抗体由来ヒト定常ドメインを含むタンパク質リンカーにより互いに結合していること、例えばそれらがヒトＩｇＧ由来のヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３を介して結合していることが好ましい場合がある。

本発明の好適な実施形態では、前記少なくとも２つの第１抗原結合部位は抗体重鎖配列および抗体軽鎖配列（好ましくは少なくともＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、各々が配列番号２、３、４、もしくは５に示す抗体配列中に含まれるＣ末端結合部位（ｓｃＦｖ）（または配列番号７／８および９に示す抗体配列中に含まれるＮ末端結合部位）に由来するものであり、かつ該Ｃ末端結合部位（または該Ｎ末端結合部位）と同一の抗原に競合的に結合する。

好適な実施形態では、本発明は、結合分子であって、ここで前記少なくとも１つの第２抗原結合部位が抗体重鎖配列および抗体軽鎖配列を含み、各々が配列番号１および２／３からなる抗体中に含まれるＮ末端結合部位（または配列番号７／８および９に示す抗体配列中に含まれるＣ末端結合部位）に由来するものであり、かつ該Ｎ末端結合部位（または該Ｃ末端結合部位）と同一の抗原（エピトープ）に競合的に結合する、該結合分子に関するものである。

本発明の好適な実施形態では、前記結合分子は免疫細胞および疾患に関連する細胞に特異的に結合し、好ましくはここで、該免疫細胞は細胞媒介性免疫応答、例えば細胞傷害性免疫応答またはヘルパー細胞媒介性免疫応答に関与する免疫細胞である。かかる免疫細胞は細胞傷害性細胞またはヘルパー細胞、例えばＣＤ２８およびＣＤ３（およびＴＣＲ）を発現する細胞であり、かつ好ましくはＴ細胞である。

本発明の二重特異性抗体に使用され、かつＣＤ２８への結合を媒介する抗体可変重および軽鎖配列は、好ましくは、幾つかの実施形態ではＣＤ２８抗体クローンｈｕ９．３．８．Ｖ１に由来するものである。特に好適なのは、図１２または配列番号２４に示す重および軽鎖配列中にアミノ酸の改変を有する、かかる抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖ構築物である。好ましくは、本発明に関して使用される抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖは、配列番号２４と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むべきであり、好ましくはここで、かかる抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖ、または配列バリアントは、少なくとも配列番号２４に示す位置３にアミノ酸Ｑを含み、かつ配列番号２４に示す位置１６にアミノ酸Ｑを含み、かつ配列番号２４に示す位置６４にアミノ酸Ｑを含み、かつ配列番号２４に示す位置６７にアミノ酸Ｆを含み、かつ配列番号２４に示す位置１６０にアミノ酸Ｔを含む。

本発明のある特定の代替的な態様において、同様に提供されるのは、その重および軽鎖配列（リンカーを除く）中に配列番号２４に示す配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは９５％の配列同一性、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖであり、場合によってはここで該リンカーの配列は可変長の４ＧＳリンカーであってもよく、好ましくはここで、かかる抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖは配列番号２４に示す配列を有する。

本発明による医学的利用のためには、対象は、好ましくはＣＤ３／ＴＣＲシグナル伝達が処置により、または抗原タンパク質などの疾患関連抗原に応答して内因的に活性化されることを特徴とする。この関連で、該処置は、疾患に関連する細胞に対する免疫細胞の刺激および／または活性化、例えばＴ細胞の活性化および／または刺激をさらに含むことが好ましい。

さらなる１実施形態では、本発明の結合分子であって、ここで該結合分子が同数の第１および第２抗原結合部位を含み、かつここで該少なくとも２つの第１抗原結合部位の一方が該少なくとも２つの第２抗原結合部位の一方の軽鎖（または代替的に重鎖）に末端で（ペプチド結合を介して）連結されており、かつここで該少なくとも２つの第１抗原結合部位の他方が該少なくとも２つの第２抗原結合部位の他方の軽鎖（または代替的に重鎖）に末端で（ペプチド結合を介して）連結されている、該結合分子が好適である。この実施形態において、末端で連結されているとは、本明細書中の他の箇所に記載したような直接的な、またはペプチドリンカー配列を介したアミノ酸鎖への連結を指すものとする。

本発明の結合分子は、さらなる好適な実施形態では、２つの抗体重鎖配列と、２つの抗体軽鎖配列とを含み、かつここで
・前記少なくとも２つの第１抗原結合部位の一方が該２つの抗体軽鎖配列の一方のＣ末端に共有結合的に連結されており、かつ該少なくとも２つの第１抗原結合部位の他方が該２つの抗体軽鎖配列の他方のＣ末端に共有結合的に連結されているか、または
・該少なくとも２つの第１抗原結合部位の一方が該２つの抗体重鎖配列の一方のＣ末端に共有結合的に連結されており、かつ該少なくとも２つの第１抗原結合部位の他方が該２つの抗体重鎖配列の他方のＣ末端に共有結合的に連結されている。

本発明は、ＩｇＧベースの抗原結合部位と、（よりフレキシブルな）ｓｃＦｖ抗ＣＤ２８結合部位とを含む、新規ＣＤ２８二重特異性抗体フォーマットを提供するものである。この関連で、好適な実施形態における本発明は、結合分子であって、ここでその複数の結合部位がペプチドリンカーなしで、または５個以下のアミノ酸を有する短いペプチドリンカーにより、または少なくとも６個、好ましくは最大５０個のアミノ酸を有する長いペプチドリンカーを介して連結されており、ここでさらに好ましくは該ペプチドリンカーが（ＧＧＧＧＳ）_ｎリンカーであり、かつｎが２以上、例えばｎ＝２～４０、２～３０、または２～２０である、該結合分子に関するものである。

本発明のさらなる１実施形態では、前記リンカーは、ｎ＝３～６、好ましくは４である上記式の配列と、該配列の末端に追加の－ＧＧＳ－とを有していてもよい。

従って、本発明の結合分子であって、ここで前記少なくとも１つの第２抗原結合部位がＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、または最も好ましくはＩｇＧを含む、該結合分子が好適である。

本発明の別の特定の実施形態では、ＣＤ２８を指向する前記結合分子の使用は、非活性化Ｔ細胞においてＣＤ３／ＴＣＲシグナル伝達軸の活性化を媒介するさらなる結合分子と組み合わせて使用される。従って、好適な処置は、（ｉ）二重特異性であり、かつＣＤ３および／もしくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）への結合を介するなどしてＴ細胞に特異的に結合（およびＴ細胞を活性化）する能力があるさらなる結合分子、またはＴ細胞活性化のためのシグナルを提供もしくは増強する能力がある任意の他の試薬、例えば（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの抗原受容体（該受容体は抗原標的タンパク質に特異的に結合する能力がある）を発現する遺伝子改変免疫細胞（異種もしくは自己Ｔ細胞）、または（ｉｉｉ）感染因子もしくはがん細胞由来の抗原構造（ＴＡＡもしくはＴＳＡ）を提供するワクチンまたは（ｉｖ）チェックポイント分子、例えばＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４などを介して抑制性「第２シグナル」を遮断する試薬、の連続または同時投与を含む。かかる試薬はチェックポイント阻害剤と称される。

かかるさらなる結合分子は、少なくとも二重特異性であり、かつ少なくとも１つの第３抗原結合部位と少なくとも１つの第４抗原結合部位とを含み、ここで
・該少なくとも１つの第３抗原結合部位は、ＣＤ３および／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）（ＣＤ３／ＴＣＲ）に特異的に結合する能力があり、かつ
・該少なくとも１つの第４抗原結合部位は、対象において疾患に関連する細胞上または細胞内で発現されるさらなる抗原標的タンパク質のエピトープに特異的に結合する能力がある。

前記結合分子と前記さらなる結合分子とを組み合わせた使用を目的とする本発明との関連において、前記抗原標的タンパク質および前記さらなる抗原標的タンパク質は、（ｉ）同一であるか、または（ｉｉ）異なりはするが互いに空間的に密に近接している、例えば疾患に関連する同一細胞上に発現されるかもしくは同一疾患組織に位置する、例えば同一腫瘍環境で発現される。この実施形態では、両結合分子に対する２つの異なる抗原タンパク質の選択によって、処置の際のより厳密な標的細胞への限定とＴ細胞活性化のより厳格な調節が可能になるため、選択肢（ｉｉ）が好適である。

本発明の化合物／組成物および方法により処置する疾患は、好ましくは増殖性疾患、好ましくはがんなどのがん疾患、例えば肺がん、乳がん、大腸がん、胃がん、肝細胞がん、膵臓がん、卵巣がん、黒色腫、骨髄腫、腎臓がん、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、膀胱がんまたは前立腺がんから選択される増殖性疾患、特に黒色腫、肺がん（例えば非小細胞肺がん）、膀胱がん（例えば尿路上皮がん）、腎臓がん（例えば腎細胞がん）、頭頸部がん（例えば該頭頸部の扁平上皮がん）およびホジキンリンパ腫からなるリストより選択される増殖性疾患である。好ましくは、該増殖性疾患は黒色腫、または肺がん（例えば非小細胞肺がん）、好ましくは標的抗原タンパク質の発現に関して陽性のがんである。

ＣＤ２８を標的とする抗原結合タンパク質を含む結合分子
本明細書中で使用する「抗原結合タンパク質」（「ＡＢＰ」）は、本発明の結合分子の１以上の結合部位が、標的抗原により提示されるかまたは標的抗原上に存在する１以上のエピトープなどの標的抗原に特異的に結合するタンパク質によって提供されることを意味する。本発明のＡＢＰの１つの中心抗原（central antigen）は、ＣＤ２８またはそのオルソログ（もしくはパラログ）もしくは他のバリアントであり、また該ＡＢＰは、場合によっては該ＣＤ２８またはバリアントの１以上のドメインに結合できる（例えば、エピトープは、該ＣＤ２８またはバリアントの１以上の細胞外ドメインにより提示されうるか、または該細胞外ドメイン上に存在しうる）。典型的には、抗原結合タンパク質は抗体（またはそのフラグメント）であるが、抗原結合タンパク質の他の形態もまた本発明により想定される。例えば、該ＡＢＰは、例えばコンビナトリアルタンパク質設計の方法（ＧｅｂａｕｅｒおよびＳｋｅｒｒａ，２００９；Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，１３：２４５）を利用することで、結合機能を備えたものなどの、小さく強固な非免疫グロブリン「足場（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）」に由来する別の（非抗体）受容体タンパク質としてもよい。かかる非抗体ＡＢＰの特定の例としては、プロテインＡのＺドメインに基づくアフィボディ分子（Ｎｙｇｒｅｎ，２００８；ＦＥＢＳ Ｊ ２７５：２６６８）、γ－Ｂクリスタリンおよび／またはユビキチンに基づくアフィリン（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈら、２００７；Ｊ Ｍｏ Ｂｉｏｌ，３７２：１７２）、シスタチンに基づくアフィマー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、２０１２；Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８４：６５５３）、スルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｃａｌｄａｒｉｕｓ）由来のＳａｃ７ｄに基づくアフィチン（Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋら、２００８；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８３：１０５８）、三重らせんコイルドコイルに基づくアルファボディ（Ｄｅｓｍｅｔら、２０１４；Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｓ ５：５２３７）、リポカリンに基づくアンチカリン（Ｓｋｅｒｒａ，２００８；ＦＥＢＳ Ｊ ２７５：２６７７）、様々な膜受容体のＡドメインに基づくアビマー（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００５；Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３：１５５６）、アンキリンリピートモチーフに基づくＤＡＲＰｉｎ（Ｓｔｒｕｍｐｐら、２００８；Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，１３：６９５）、ＦｙｎのＳＨ３ドメインに基づくフィノマー（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉら、２００７；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：３１９６）、様々なプロテアーゼインヒビターのクニッツドメインに基づくクニッツドメインペプチド（Ｎｉｘｏｎら、Ｃｕｒｒ ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ，９：２６１）ならびにフィブロネクチンの１０番目のＩＩＩ型ドメインに基づくセンチリンおよびモノボディ（Ｄｉｅｍら、２０１４；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２７：４１９ ｄｏｉ：１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｕ０１６；ＫｏｉｄｅおよびＫｏｉｄｅ，２００７；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３５２：９５）、が挙げられる。

用語「エピトープ」には、抗体などの抗原結合タンパク質により結合される能力がある任意の決定基が含まれる。エピトープとは、抗原を標的とする抗原結合タンパク質により結合されるその抗原の領域であり、また該抗原がタンパク質である場合には、該抗原結合タンパク質に（例えば、該タンパク質の抗原結合ドメインを介して）結合する特定のアミノ酸を含む。エピトープ決定基はアミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面基（ｓｕｒｆａｃｅ ｇｒｏｕｐｉｎｇｓ）を含む可能性があり、また固有の三次元構造特性、および／または固有の電荷特性を有する可能性がある。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗原結合タンパク質は、タンパク質および／または高分子の複合混合物中の該標的抗原上のエピトープを選択的に認識する。

抗原結合タンパク質は、該抗原結合タンパク質がある抗原（例えばＣＤ２８、ＣＤ３、エンドグリンなど、例えばヒトＣＤ２８）に、該抗原結合タンパク質が２つ目の抗原に結合するよりも選択的に（例えば、より強くまたはより広範囲に）結合する場合、「特異的」である。ＡＢＰとの関連において本明細書中で使用する用語「特異的に結合する（specifically binds）」（または「特異的に結合する（binds specifically）」など）は、該ＡＢＰが所望の抗原に、他のタンパク質（または他の分子）に結合するよりも選択的に結合すること、例えば、他の免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー遺伝子の１以上と比較して選択的に結合することを意味する。従って、好ましくは、ある抗原（例えばＣＤ２８）への該ＡＢＰの結合親和性は、他の標的（例えば、マウスもしくはヒトＦｃドメイン、またはストレプトアビジンなどの非関連タンパク質）へのその親和性と比較して、少なくとも２倍、５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも２０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも１００００倍、少なくとも１０^５倍またはさらに少なくとも１０^６倍、最も好ましくは少なくとも２倍である。

用語「同一性」は、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の、該配列をアラインメントして比較することにより決定した関係を指す。「同一性パーセント」は、比較する分子中のアミノ酸間またはヌクレオチド間の同一残基の割合を意味しており、また比較している分子の最小限のサイズに基づいて算出される。これらの計算のために、アラインメント中のギャップ（存在するならば）を特定の数理モデルまたはコンピュータープログラム（すなわち、「アルゴリズム」）で処理することが好ましい。アラインメントした核酸またはポリペプチドの同一性を算出するために使用できる方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，編），１９８８，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，編），１９９３，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，編），１９９４，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，編），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；ならびにＣａｒｉｌｌｏら、１９８８，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されたものが挙げられる。

同一性パーセントを算出する際は、比較する配列は典型的には、該配列間に最大の一致が得られる形でアラインメントする。同一性パーセントを決定するために使用できるコンピュータープログラムの１例はＧＣＧプログラムパッケージであり、これにはＧＡＰが含まれる（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。該コンピューターアルゴリズムＧＡＰを使用することにより、配列同一性パーセントを決定する２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドをアラインメントする。該配列を、それらの各アミノ酸またはヌクレオチドの最適な一致のためにアラインメントする（該アルゴリズムによって決定される「一致スパン（ｍａｔｃｈｅｄ ｓｐａｎ）」）。ギャップ開始ペナルティ（平均対角線の３倍として算出され、該「平均対角線」は使用する比較行列の対角線の平均値であり、該「対角線」は特定の比較行列により各々の完全なアミノ酸一致に割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップ伸長ペナルティ（通常は該ギャップ開始ペナルティの１／１０倍である）、ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２などの比較行列を、該アルゴリズムと併せて使用する。

標準的な比較行列（ＰＡＭ２５０比較行列についてはＤａｙｈｏｆｆら、１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：３４５－３５２、ＢＬＯＳＵＭ６２比較行列についてはＨｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５－１０９１９を参照のこと）が前記アルゴリズムに使用されていてもよい。

前記ＧＡＰプログラムを使用してポリペプチドまたはヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定する際に用いることができるパラメータの例は、（ｉ）アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３、（ｉｉ）比較行列：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２，上掲のＢＬＯＳＵＭ６２、（ｉｉｉ）ギャップペナルティ：１２（ただし終了ギャップに対するペナルティはない）、（ｉｖ）ギャップ長ペナルティ：４、（ｖ）類似性の閾値：０である。

タンパク質または核酸と、ヒトＣＤ２８もしくは本発明の結合分子との間（またはヒトＣＤ２８と本発明の結合分子との間）の類似性を決定する好適な方法は、上掲のＵｎｉｐｒｏｔで支援されるＢｌａｓｔサーチ（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ）により提供されている方法、特にアミノ酸同一性に関しては、次のパラメータ、すなわちプログラム：ｂｌａｓｔｐ、行列：ｂｌｏｓｕｍ６２、閾値：１０、フィルタ処理：ｆａｌｓｅ、ギャップあり：ｔｒｕｅ、報告される最大ヒット数：２５０を使用する方法である。

２つのアミノ酸配列をアラインメントするための、ある特定のアラインメントスキームは、それら２つの配列の短い領域のみの一致を生じる場合があり、またこの小さなアラインメントされた領域は、その２つの全長配列間には有意な関係がないにもかかわらず、非常に高い配列同一性を有する場合がある。従って、選択したアラインメント方法（ＧＡＰプログラム）は、必要があれば、標的ポリペプチドまたはその領域の少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０または他の数の連続したアミノ酸に及ぶアラインメントが生じるように調整することができる。

特定の実施形態では、本発明のＡＢＰは少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば抗体由来（特にヒト抗体由来）のものを好ましく含みうるし、また特定の実施形態では、該ＡＢＰは、本明細書中の表１に記載したＣＤＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性（好ましくは、少なくとも９０％の配列同一性）を示すアミノ酸配列を有するＣＤＲか、または配列番号１～１１に示される抗体の配列に含まれるＣＤＲ配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するＣＤＲを含みうる。

用語「相補性決定領域」（または「ＣＤＲ」または「超可変領域」）は、本明細書中で使用する場合、概して抗体の軽または重鎖の可変領域中に見出される超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１以上を指す。例えば、「ＩＭＧＴ」，Ｌｅｆｒａｎｃら、２００３，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５、ＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００１，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０９：６５７、ＡｂｈｉｎａｎｄａｎおよびＭａｒｔｉｎ，２００８，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５：３８３２、Ｋａｂａｔ，ら（１９８７）：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄを参照のこと。これらの表現には、Ｋａｂａｔら（１９８３）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓにより定義された超可変領域、または抗体の３次元構造中の超可変ループ（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，１９８７；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１）が含まれる。各鎖中の該ＣＤＲはフレームワーク領域によって近接して保持されており、また他方の鎖由来のＣＤＲと共に、抗原結合部位の形成に寄与している。該ＣＤＲ内には、抗体－抗原相互作用において該ＣＤＲにより使用される重要な接触残基である、選択性決定領域（ＳＤＲ）と記載されている選択アミノ酸が存在する（Ｋａｓｈｍｉｒｉ，２００５；Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５）。

本発明のＡＢＰは、代替的に、またはＣＤＲ３配列だけでなく、少なくとも１つのＣＤＲ１、および／または少なくとも１つのＣＤＲ２（例えば、抗体由来、特にヒト抗体由来のもの）を含んでいてもよい。好ましくは、本発明のＡＢＰは少なくとも１つのかかるＣＤＲ３、ならびに少なくとも１つのかかるＣＤＲ１および少なくとも１つのかかるＣＤＲ２を含み、より好ましくはかかるＣＤＲの各々が、表１に示す対応する（重および軽鎖）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列から選択される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するか、または配列番号１～１２で示される配列のいずれかに含まれる（重および軽鎖）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列から選択される配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有する。

特定の実施形態では、本発明のＡＢＰは、抗体またはその抗原結合フラグメントでありうる。

本明細書中で使用する場合、用語「抗体」は、そのエピトープへの結合を可能にする任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）として最も広義に理解されうる。従って抗体はＡＢＰの一種である。全長「抗体」または「免疫グロブリン」は一般に、２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から構成される、約１５０ｋＤａのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有結合性ジスルフィド結合により重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は重鎖の様々な免疫グロブリンアイソタイプ間で異なる。各重および軽鎖は、規則的に間隔の空いた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、アミノ末端可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続く３つのカルボキシ末端定常ドメイン（ＣＨ）を有する。各軽鎖は、可変Ｎ末端ドメイン（ＶＬ）および単一のＣ末端定常ドメイン（ＣＬ）を有する。該ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に並ぶ、３つのＣＤＲと４つのＦＲからなる。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有している。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）を含む細胞または因子および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）への免疫グロブリンの結合を媒介しうる。他の形態の抗体としては重鎖抗体が挙げられ、これは２つの重鎖のみからなり、かつ抗体に通常見出される２つの軽鎖を欠損したものである。重鎖抗体としては、ラクダ科の動物、例えばヒトコブラクダ、ラクダ、ラマおよびアルパカのｈｃＩｇＧ（ＩｇＧ様）抗体、ならびに軟骨魚類（例えばサメ）のＩｇＮＡＲ抗体が挙げられる。またさらに他の形態の抗体としては、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、開発企業であるＡｂｌｙｎｘにはナノボディと呼ばれている）が挙げられる。単一ドメイン抗体は、典型的には重鎖抗体から作製されるが、従来の抗体から得てもよい。

抗体（またはそのフラグメントを単離できるもの）としては、例えば、キメラ、ヒト化、（完全）ヒト、または二重もしくは多重抗原もしくはエピトープ特異性を示すハイブリッド抗体、抗体フラグメントおよび抗体サブフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）および同類のもの（後述）、例えば任意の免疫グロブリンのハイブリッドフラグメントまたは複合体を形成するために特定の抗原に結合することにより抗体のように作用する任意の天然、合成もしくは遺伝子操作されたタンパク質を挙げることができる。

従って、ある特定の実施形態では、本発明のＡＢＰは抗体重鎖、もしくはその抗原結合フラグメント、および／または抗体軽鎖、もしくはその抗原結合フラグメントを含みうる。

さらなる実施形態では、本発明のＡＢＰは、抗体重鎖可変領域、もしくはその抗原結合フラグメント、および／または抗体軽鎖可変領域、もしくはその抗原結合フラグメントを含む可能性があり、またさらに別の実施形態では、本発明のＡＢＰは、抗体重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに／または抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む可能性がある。

本発明は、「二重特異性」または「二機能性」である結合分子に関し、好ましくは、２つの異なるエピトープ／抗原結合ドメイン（または「部位」）を有し、従って、２つの異なる標的エピトープに対する結合特異性を有するＡＢＰである結合分子に関する。これらの２つのエピトープは、同じ抗原のエピトープであってもよいし、本発明において好ましくは、異なる抗原、例えば異なる抗原であるエンドグリンおよびＣＤ３／ＴＣＲのエピトープであってもよい。

「二重特異性ＡＢＰ」は、重鎖と軽鎖、または主鎖とより短い／より小さい鎖との第１ペアにより定義される、２つ以上の結合アームのうちの１つで１つの抗原またはエピトープを結合し、かつ重鎖と軽鎖、または主鎖とより小さい鎖との第２ペアにより定義される第２アーム上に異なる抗原またはエピトープを結合するＡＢＰであってもよい。二重特異性ＡＢＰのかかる実施形態は、特異性とＣＤＲ配列の両方の点で２つの別個の抗原結合アームを有する。典型的には、二重特異性ＡＢＰはそれが結合する各抗原に対して１価である、すなわち、該各抗原またはエピトープに１つのアームだけで結合する。しかし、二重特異性抗体は二量体化または多量体化することも可能であり、このことは、本発明との関連においては好適である。例えば、本明細書中に記載した二量体ＩｇＧｓｃフォーマットでは、抗体は各抗原に対して２つの結合部位を有していてもよい（図３Ａ～Ｆ）。二重特異性抗体はハイブリッドＡＢＰであってもよく、これは第１軽鎖可変領域および第１重鎖可変領域により定義される第１結合領域と、第２軽鎖可変領域および第２重鎖可変領域により定義される第２結合領域とを有していてもよい。これらの結合領域のうちの一方が重鎖／軽鎖ペアにより定義されうることは、本発明により想定される。本発明との関連において、前記二重特異性ＡＢＰは、主鎖およびより小さな鎖の可変領域により定義される第１結合部位と、該ＡＢＰの主鎖に含まれるｓｃＦｖフラグメントの可変領域により定義される第２の異なる結合部位とを有していてもよい。本発明との関連において、二重特異性結合分子は、主鎖およびより小さい鎖の可変領域によって定義される第２の抗原結合部位と、結合分子の主鎖に含まれる、ｓｃＦｖフラグメントの可変領域によって定義される第１の異なる結合部位とを有し得る。

二重特異性ＡＢＰを作製する方法、例えば２つの異なるモノクローナル抗体の化学的コンジュゲーションまたは例えば、同様に２つの抗体フラグメントの（例えば、２つのＦａｂフラグメントの）化学的コンジュゲーションは、当分野で公知である。あるいは、二重特異性ＡＢＰを、親抗体を産生するハイブリドーマの融合によるものである、クアドローマ技術により作製する。ＨおよびＬ鎖のランダムな組み合わせにより、１０種の異なる抗体構造物の潜在的混合物が産生され、そのうちの１種のみが所望の結合特異性を有する。

本発明の二重特異性ＡＢＰは、各標的に関してモノクローナル抗体（ｍＡｂ）として機能しうる。幾つかの実施形態では、該抗体はキメラ、ヒト化または完全ヒト抗体である。二重特異性ＡＢＰは、例えば二重特異性タンデム一本鎖Ｆｖ、二重特異性Ｆａｂ２、または二重特異性ダイアボディであってもよい。

本発明のＡＢＰに含まれるドメインを基に、本発明の二重特異性ＡＢＰは、一般にヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよび一本鎖Ｆｖフラグメントを含みうる、Ｆａｂフラグメントを含んでいてもよい。かかる二重特異性ＡＢＰは「Ｆａｂｓｃ」ＡＢＰと称されており、国際特許出願ＷＯ２０１３／０９２００１に初めて記載された。より具体的には、本明細書中で使用する「Ｆａｂｓｃ」フォーマットのＡＢＰは、典型的には、Ｆａｂフラグメントを有する本発明の二重特異性ＡＢＰを指し、該Ｆａｂフラグメントは一般にヒンジ領域を含み、該ヒンジ領域はＣＨ２ドメインのＮ末端に結合している該ＦａｂフラグメントのＣ末端にあり、該ＣＨ２ドメインのＣ末端が今度はｓｃＦｖフラグメントのＮ末端に結合している。かかる「Ｆａｂｓｃ」はＣＨ３ドメインを含まないか、または本質的には含まない。これに関連して、「含まない」または「本質的には含まない」は、該ＡＢＰが完全長ＣＨ３ドメインを含まないことを意味する。それは好ましくは、該ＡＢＰが該ＣＨ３ドメインの１０以下、好ましくは５以下、好ましくは３またはさらに少ないアミノ酸を含むことを意味する。

ＣｏｌｏｍａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎの刊行物（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５：１５９－６３，１９９７）によれば、本発明の二重特異性ＡＢＰは、一般に、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、一般にＣＨ２ドメインのＣ末端側に配置されるＣＨ３ドメイン、および単鎖Ｆｖフラグメントを包含する、Ｆａｂフラグメントを有し得る。かかる分子は、本明細書中では「ＩｇＧｓｃ」フォーマットＡＢＰとも称され、これはＦａｂフラグメントを有する本発明の二重特異性ＡＢＰを意味しており、該Ｆａｂフラグメントは一般にヒンジ領域を含み、該ヒンジ領域は典型的にはＣＨ２ドメインのＮ末端に結合している該ＦａｂフラグメントのＣ末端にあり、該ＣＨ２ドメインのＣ末端は今度は典型的にはＣＨ３ドメインのＮ末端に結合しており、該ＣＨ３ドメインのＣ末端は今度は典型的にはｓｃＦｖフラグメントのＮ末端に結合している。ＩｇＧｓｃフォーマットＡＢＰの例示的例を図３に示す。かかる二重特異性ＡＢＰフォーマットは、本発明との関連において好適である。

さらに、または代替的に、本発明の「ＩｇＧｓｃ」ＡＢＰは、「Ｆｃ減弱化」ＣＨ２ドメイン（ヒンジ領域を含む）を同様に有していてもよい。この「Ｆｃ減弱化」は、Ｆｃ受容体への結合を媒介できる、該ＣＨ２ドメイン中の選択したアミノ酸残基のうちの少なくとも１つを欠失および／または置換（変異）させることにより達成される。例示的実施形態では、Ｆｃ受容体への結合を媒介可能でありかつ欠損しているかまたは変異している該ヒンジ領域または該ＣＨ２ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基は、配列位置２２８、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２６５、２９７、３２７、および３３０（ＥＵ－インデックスによる配列位置のナンバリング）からなる群より選択される。例示的具体例では、かかるＦｃ減弱化ＡＢＰは、アミノ酸２２８の欠失、アミノ酸２２９の欠失、アミノ酸２３０の欠失、アミノ酸２３１の欠失、アミノ酸２３２の欠失、アミノ酸２３３の欠失、置換Ｇｌｕ２３３→Ｐｒｏ、置換Ｌｅｕ２３４→Ｖａｌ、アミノ酸２３４の欠失、置換Ｌｅｕ２３５→Ａｌａ、アミノ酸２３５の欠失、アミノ酸２３６の欠失、アミノ酸２３７の欠失、アミノ酸２３８の欠失、置換Ａｓｐ２６５→Ｇｌｙ、置換Ａｓｎ２９７→Ｇｌｎ、置換Ａｌａ３２７→Ｇｌｎ、および置換Ａｌａ３３０→Ｓｅｒ（ＥＵ－インデックスによる配列位置のナンバリング、これに関しては、例えば、国際特許出願ＷＯ２０１３／０９２００１の図１Ｏおよび図１Ｐも参照のこと）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を含有していてもよい。Ｔ細胞を、例えば腫瘍細胞に対して活性化する二重特異性抗体の場合、Ｔ細胞の望ましくないオフターゲット活性化をもたらしうるＦｃ受容体担持細胞への該抗体の結合を阻止するには、Ｆｃ減弱化が望ましい場合がある。

本発明の好ましい一実施形態では、ＣＤ２８共刺激抗体は、いわゆるＬＡＬＡ Ｆｃ変異体とＹＴＥ変異体を組み合わせることによって、Ｆｃがサイレント化され、ハーフタイムが最適化される。いずれの修飾も当技術分野でよく知られており、例えば、Ｓａｕｎｄｅｒｓ ＫＯ， Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｈａｌｆ－Ｌｉｆｅ． Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１９；１０：１２９６．２０１９年６月７日発行、ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１９．０１２９６（その全体が本明細書に組み込まる）で詳細に説明されている。一般に、変異はヒトの CH ドメインで発見される。ＹＴＥは、Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ／Ｓｅｒ２５４Ｔｈｒ／Ｔｈｒ２５６Ｇｌｕの変異によって特徴付けられる(Ｄａｌｌ’ａｃｑｕａ ＷＦ， Ｗｏｏｄｓ ＲＭ， Ｗａｒｄ ＥＳ， Ｐａｌａｓｚｙｎｓｋｉ ＳＲ， Ｐａｔｅｌ ＮＫ， Ｂｒｅｗａｈ ＹＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ： ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００２） １６９：５１７１－８０． １０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１６９．９．５１７１も参照のこと)。ＬＡＬＡ修飾はＬｅｕ２３４Ａｌａ／Ｌｅｕ２３５Ａｌａである（Ｈｅｚａｒｅｈ Ｍ， Ｈｅｓｓｅｌｌ ＡＪ， Ｊｅｎｓｅｎ ＲＣ， ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ ＪＧ， Ｐａｒｒｅｎ ＰＷ． Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｐａｎｅｌ ｏｆ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ａ ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ２００１；７５（２４）：１２１６１－１２１６８． ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７５．２４．１２１６１－１２１６８．２００１も参照のこと）。

したがって、好ましい実施形態において、本発明のＡＢＰは、ＬＡＬＡおよびＹＴＥ修飾の両方の組み合わせを含み、したがって、配列番号１２および１３に示されるＣＨドメインの配列を含む。

本発明のＣＤ２８共刺激抗体のＩｇＧｓｃフォーマットは、一般に知られている小サイズのｓｃＦｖのみに基づくＢｉＴＥ抗体などの二重特異性抗体とは異なり、半減期が短いためＣＤ２８の使用にはあまり好ましくないことが示されており、一般的に多量体化能力が観察されているため、驚くほど効果的である。後者は制御が複雑であり、おそらく超アゴニスト作用を誘発するリスクを抱える。一方、ＣＤ２８のＩｇＧベースのフォーマットは、細胞の制限を不可能にする超アゴニスト活性を有する。本明細書では、ＣＤ２８結合部位がＩｇＧｓｃ内のｓｃＦｖとして提供される場合、ＣＤ２８二重特異性フォーマットとしてＩｇＧｓｃを使用することを提案する。ＩｇＧＳｃの使用は、標的細胞に限定された方法でＴ細胞を活性化するのに驚くほど効果的であったが、依然として共刺激のみであり、超アゴニスト作用は見られなかった。

前記抗体フォーマットＩｇＧｓｃは、Ｎ末端標的化部分がそれぞれ「生理的」Ｆａｂ領域またはＦａｂ２領域から構成されており、それによって分子のこの部分の一本鎖成分の使用を回避するという共通点を有する。これらのフォーマットを標的細胞に限定されたＴ細胞活性化のために使用する場合、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）媒介性活性化を阻止するために（希望する場合、または必要に応じて）Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合の減弱化を利用してもよい。これは例えば、上記、さらには国際特許出願ＷＯ２０１３／０９２００１およびＡｒｍｏｕｒら Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；２９：２６１３に記載の、分子のＣＨ２ドメインへの定義済みかつ周知の変異の導入により達成できる。従って、本発明のＩｇＧｓｃ ＡＢＰもまた、ＣＨ２ドメイン（ヒンジ領域を含む）を有していてもよく、ここでＦｃ受容体への結合を媒介できる該ヒンジ領域または該ＣＨ２ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基が欠損しているかまたは変異している。先に説明した通り、該ＣＨ２およびヒンジ領域中のこの残基は、それぞれ、配列位置２２８、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２６５、２９７、３２７、および３３０（ＥＵ－インデックスによる配列位置のナンバリング）からなる群より選択してもよい。しかし、該ＩｇＧｓｃ分子中のＣＨ３ドメインの存在により、２つの個々の分子が該ＣＨ３ドメインを介して（自然発生的に）ホモ二量体化し、４価分子を形成する（これに関しては、図１Ｂを再度参照のこと）。従って、前記ヒンジ領域の配列位置２２６および／または配列位置２２９のシステイン残基を欠失または変異させる必要がない。従って、本発明のかかる四量体ＩｇＧｓｃ ＡＢＰは、Ｋａｂａｔのナンバリング［ＥＵ－インデックス］による、各ヒンジドメインの１つの配列位置２２６および／または配列位置２２９にシステイン残基を有していてもよい。

好ましい実施形態では、本発明は、以下のＡＢＰである、単離された結合分子に関する：
・配列番号４もしくは５に示される２つの抗体重鎖配列、またはこれらの配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有する配列、及び配列番号６に示される２つの抗体軽鎖配列、またはこの配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有する配列を含み、各場合において、独立して、場合により、これらの配列と比較して、１０、９以下、好ましくは８、７、６、５、４、３または２以下、好ましくは１以下のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有する。 またはこれらの配列と比較した欠失を含むＡＢＰ、または
・配列番号１に示される２つの抗体重鎖配列、またはこれらの配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有する配列、及び配列番号２もしくは３に示される２つの抗体軽鎖配列、またはこの配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有する配列を含み、各場合において、独立して、場合により、これらの配列と比較して、１０、９以下、好ましくは８、７、６、５、４、３または２以下、好ましくは１以下のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有する。 またはこれらの配列と比較した欠失を含むＡＢＰ、または
・配列番号７もしくは８に示される２つの抗体重鎖配列、またはこれらの配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有する配列、及び配列番号９に示される２つの抗体軽鎖配列、またはこの配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有する配列を含み、各場合において、独立して、場合により、これらの配列と比較して、１０、９以下、好ましくは８、７、６、５、４、３または２以下、好ましくは１以下のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有する。 またはこれらの配列と比較した欠失を含むＡＢＰ。

代替的な態様では、本発明は、エンドグリンに特異的に結合するＡＢＰである単離された結合分子に関し、前記ＡＢＰは：
・配列番号１に示される２つの抗体重鎖配列、またはこれらの配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有する配列、及び配列番号６に示される２つの抗体軽鎖配列、またはこの配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有する配列を含み、各場合において、独立して、場合により、これらの配列と比較して、１０、９以下、好ましくは８、７、６、５、４、３または２以下、好ましくは１以下のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有する。 またはこれらの配列と比較した欠失を含む。

上記ＡＢＰベースの結合分子の好ましい実施形態において、ＣＤＲ領域は、参照する配列番号の対応するＣＤＲ配列と同一である。

二重特異性ＡＢＰの開示と同様に、本発明はさらに、標的細胞上の抗原に対しても同様に、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞上の別の受容体に特異的に結合する抗原結合部位を有する追加の（さらなる）結合分子の使用を提案する。免疫細胞上に存在するこの受容体は、免疫細胞を活性化することができる、または免疫細胞の免疫応答を刺激することができる受容体であり得る。誘発された免疫応答は、好ましくは細胞傷害性免疫応答であり得る。そのような適切な受容体は、例えば、CD3、抗原特異的T細胞受容体(TCR)、CD16、NKG2D、Ox40、4-1 BB、CD2、CD5、プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)およびCD95であり得る。特に好ましくは、第２の結合部がＣＤ３、ＴＣＲまたはＣＤ１６に結合するＡＢＰである。

タンパク質、例えばＡＢＰ（その１例は抗体でありうる）との関連において本明細書中で使用する用語「単離された」は、その治療的、診断的、予防的、研究的または他の用途の妨げになるであろうタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の混在物から精製されているタンパク質を指す。本発明による単離されたＡＢＰは、組換え、合成または改変（非天然）ＡＢＰであってもよい。核酸または細胞との関連において本明細書中で使用する用語「単離された」は、その治療的、診断的、予防的、研究的または他の用途の妨げになるであろうＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質もしくはポリペプチドまたは他の混在物（例えば他の細胞）から精製されている核酸または細胞を指すか、あるいは該用語は組換え、合成または改変（非天然）核酸を指す。好ましくは、単離されたＡＢＰまたは核酸または細胞は実質的に純粋である。この関連で、「組換え」タンパク質または核酸は、組換え技術を利用して作製されたものである。組換え核酸およびタンパク質の製造のための方法および技術は当分野で周知である。

結合分子、例えばＡＢＰ（その１例は抗体でありうる）との関連において本明細書中で使用する用語「単離された」は、その治療的、診断的、予防的、研究的または他の用途の妨げになるであろうタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の混在物から精製されているタンパク質を指す。本発明による単離されたＡＢＰは、組換え、合成または改変（非天然）ＡＢＰであってもよい。核酸または細胞との関連において本明細書中で使用する用語「単離された」は、その治療的、診断的、予防的、研究的または他の用途の妨げになるであろうＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質もしくはポリペプチドまたは他の混在物（例えば他の細胞）から精製されている核酸または細胞を指すか、あるいは該用語は組換え、合成または改変（非天然）核酸を指す。好ましくは、単離されたＡＢＰまたは核酸または細胞は実質的に純粋である。この関連で、「組換え」タンパク質または核酸は、組換え技術を利用して作製されたものである。組換え核酸およびタンパク質の製造のための方法および技術は当分野で周知である。

ある実施形態では、本発明のＡＢＰがポリクローナル抗体（混合物）であるか、または前記抗原結合フラグメントがポリクローナル抗体（混合物）のフラグメントである。

本発明の全ＡＢＰの代替的かつ好適な実施形態では、該ＡＢＰが抗体またはその抗原結合フラグメントであり、かつ該抗体がモノクローナル抗体であるか、またはここで該抗原結合フラグメントがモノクローナル抗体のフラグメントである。

本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、そのアミノ酸配列に基づいて実質的に同一の抗体の集団から取得される抗体を指す。モノクローナル抗体は典型的には高度に特異的である。さらに、典型的には抗原の種々の決定基（例えばエピトープ）に対する種々の抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、各ｍＡｂは典型的には抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、ｍＡｂは、それらが他の免疫グロブリンによる汚染のない細胞培養（ハイブリドーマ、組換え細胞など）により合成可能であるという点で有利である。ｍＡｂは、本明細書中では、例えばキメラの、ヒト化した、またはヒトの抗体または抗体フラグメントを含む。

本発明によるモノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により調製してもよい。例えば、マウス、ラットまたはウサギを、アジュバントと共に目的の抗原で免疫してもよい。ある特定の間隔で数回の免疫を行った動物から脾細胞をプールとして採取し、併せて試験用血液採取（ｔｅｓｔ ｂｌｅｅｄｓ）を血清抗体価について評価するために実施する。調製した脾細胞は、融合実験で直ちに使用するか、または今後の融合の際に使用するために液体窒素中で保存する。次に融合実験をＳｔｅｗａｒｔおよびＦｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８９，１２３：４５－５３の手順に従って実施する。ハイブリッドを増殖させているウェルから得た上清を、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりｍＡｂ分泌型に関してスクリーニングする。ＥＬＩＳＡ陽性培養物を限界希釈または蛍光活性化セルソーティングのいずれかによりクローン化することで、典型的には単一コロニーから樹立したハイブリドーマが得られる。抗体フラグメントまたはサブフラグメントを含む抗体の、特定抗原に結合する能力は、当分野で公知の結合アッセイにより、例えば、目的の抗原を結合パートナーとして使用して、判定することができる。

さらなる好適な実施形態では、本発明のＡＢＰは抗体またはその抗原結合フラグメントであり、ここで該抗体はヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラヒト抗体であるか、またはここで該抗原結合フラグメントはヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラヒト抗体のフラグメントである。

ヒト抗体もまたｉｎ ｖｉｔｒｏ法により誘導することができる。適切な例としてはファージディスプレイ法（ＣＡＴ、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｄｙａｘ、Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｘｏｍａ、Ｙｕｍａｂ、Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ、Ａｌｅｘｉｏｎ、Ａｆｆｉｍｅｄ）などが挙げられるが、これらに限定されない。ファージディスプレイ法では、単一ＦａｂまたはＦｖ抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを、ファージ粒子の表面上に発現させる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：５８１（１９９１）、米国特許第５，８８５，７９３号を参照のこと）。ファージは、標的に対する親和性を有するそれらの抗体フラグメントを同定するために「スクリーニング」される。従って、かかる過程の一部は、繊維状バクテリオファージの表面における抗体フラグメントレパートリーの提示と、その後の標的へのその結合によるファージの選択を通じて免疫選択を模倣している。一部のかかる手順では、高親和性の機能性中和抗体フラグメントが単離される。従って、ヒト抗体遺伝子の完全なレパートリーを、末梢血リンパ球から自然に再配列したヒトＶ遺伝子をクローン化することにより（例えば、Ｍｕｌｌｉｎａｘら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ），８７：８０９５－８０９９（１９９０）を参照のこと）、またはヒト抗体配列を用いて完全合成もしくは半合成ファージディスプレイライブラリを作製することにより（Ｋｎａｐｐｉｋら２０００；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７、ｄｅ Ｋｒｕｉｆら、１９９５；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８）：９７を参照のこと）、創出してもよい。

本明細書中に記載した抗体は、選択的に、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術の利用を通じて調製してもよい。かかるマウスはヒトの免疫グロブリン分子および抗体を産生する能力があり、かつマウスの免疫グロブリン分子および抗体の産生が欠損している。特に、マウスおよび抗体のトランスジェニック作製の好適な実施形態は、米国特許出願第０８／７５９，６２０号（１９９６年１２月３日出願）ならびに国際特許出願ＷＯ９８／２４８９３（１９９８年６月１１日公開）およびＷＯ００／７６３１０（２０００年１２月２１日公開）に開示されている。Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６－１５６（１９９７）も参照のこと。かかる技術の利用を通じて、様々な抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が作製されている。本質的には、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系のマウスを目的の抗原、例えばＣＤ２８、エンドグリン等で免疫し、リンパ細胞（例えば、Ｂ細胞）を過免疫マウスから回収してから、その回収したリンパ球を骨髄性の細胞系と融合することにより、不死ハイブリドーマ細胞系を調製する。これらのハイブリドーマ細胞系をスクリーニングし選別することにより、目的の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を同定する。他の「ヒト化」マウス、例えば、Ｍｅｄａｒｅｘ－ＨｕＭａｂマウス、Ｋｙｍａｂ－Ｋｙｍｏｕｓｅ、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ－Ｖｅｌｏｃｉｍｍｕｎｅマウス、Ｋｉｒｉｎ－ＴＣマウス、Ｔｒｉａｎｎｉ－Ｔｒｉａｎｎｉマウス、ＯｍｎｉＡｂ－ＯｍｎｉＭｏｕｓｅ、Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｈ２Ｌ２マウス、Ｍｅｒｕｓ－ＭｅＭｏマウスも市販されている。「ヒト化」した他の種、すなわちラット：ＯｍｎｉＡｂ－ＯｍｎｉＲａｔ、ＯＭＴ－ＵｎｉＲａｔ．Ｃｈｉｃｋｅｎ：ＯｍｎｉＡｂ－ＯｍｎｉＣｈｉｃｋｅｎも利用可能である。

本発明による用語「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列（ただし典型的には、まだ少なくとも一部）を含有する、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、もしくは抗体の他の抗原結合性部分配列）を指す。大抵の場合、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、該レシピエント抗体のＣＤＲ残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種免疫グロブリン（ドナー抗体）からのＣＤＲ残基で置き換えられている。そのため、該抗体またはそのフラグメントのフレームワーク配列の少なくとも一部は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列でありうる。一部の例では、特異性または親和性を増大させるために、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を対応する非ヒト残基で置き換える必要がある。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入したＣＤＲまたはフレームワーク配列中にも見出されない残基を含みうる。これらの改変は、抗体性能をさらに改善して最大化するために行われる。一般に、該ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および典型的には少なくとも２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、該可変ドメイン中の全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相当し、かつ全てまたは実質的に全てのフレームワーク領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である。該ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれも含み、該（例えばヒト）免疫グロブリン定常領域を（例えば突然変異または糖鎖工学により）改変することで、かかる領域の１以上の性質を最適化する、および／または（例えば治療用）抗体の機能を改善する、例えばＦｃエフェクター機能を向上もしくは低下させる、または血清中半減期を延長することができる。例示的なかかるＦｃ改変（例えば、Ｆｃ操作またはＦｃ増強）は本明細書中の他の箇所に記載する。

本発明による用語「キメラ抗体」は、その軽および／または重鎖遺伝子が、マウスおよびヒトなどの異なる種の対応配列と同一であるかまたは相同である免疫グロブリン可変および定常領域から、典型的には遺伝子操作により構築された抗体を指す。あるいは、可変領域遺伝子は特定の抗体クラスまたはサブクラスに由来するが、その鎖の残部は同じであるかまたは異なる種の別の抗体クラスまたはサブクラスに由来する。これはかかる抗体のフラグメントにも当てはまる。例えば、典型的な治療用キメラ抗体は、マウス抗体からの可変または抗原結合ドメインと、ヒト抗体からの定常またはエフェクタードメインとからなるハイブリッドタンパク質であるが、他の哺乳動物種を使用してもよい。

かかる実施形態の詳細においては、本発明のＡＢＰは抗体の抗原結合ドメインを含み、ここで該抗原結合ドメインはヒト抗体の抗原結合ドメインである。好ましくは、ＡＢＰは抗体またはその抗原結合フラグメントの抗原結合ドメインを含み、該抗原結合ドメインはヒト抗原結合ドメインであり、（ｉｉ）該抗体はモノクローナル抗体であり、すなわちここで該抗原結合フラグメントはモノクローナル抗体のフラグメントであり、また（ｉｉｉ）該抗体はヒト抗体またはヒト化抗体であり、すなわちここで該抗原結合フラグメントはヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラヒト抗体のフラグメントである。

ヒト抗体の軽鎖は一般にカッパおよびラムダ軽鎖として分類され、またこれらの各々が１つの可変領域と１つの定常ドメインを含有する。重鎖は典型的にはミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロン鎖として分類され、またこれらが抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ。ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義付けている。ヒトＩｇＧには、限定するものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む幾つかのサブタイプがある。ヒトＩｇＭのサブタイプとしては、ＩｇＭ、およびＩｇＭ２が挙げられる。ヒトＩｇＡのサブタイプとしてはＩｇＡ１およびＩｇＡ２が挙げられる。ヒトの場合、該ＩｇＡおよび該ＩｇＤのアイソタイプは４つの重鎖と４つの軽鎖を含有しており、該ＩｇＧおよび該ＩｇＥのアイソタイプは２つの重鎖と２つの軽鎖を含有しており、また該ＩｇＭのアイソタイプは１０または１２の重鎖と１０または１２の軽鎖を含有している。本発明による抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ免疫グロブリンでありうる。

幾つかの実施形態では、本発明のＡＢＰはＩｇＧ抗体またはそのフラグメントである。幾つかの実施形態では、本発明のＡＢＰはＩｇＥ抗体またはそのフラグメントである。幾つかの実施形態では、本発明のＡＢＰはＩｇＤ抗体またはそのフラグメントである。幾つかの実施形態では、本発明のＡＢＰはＩｇＡ抗体またはそのフラグメントである。幾つかの実施形態では、本発明のＡＢＰはＩｇＭ抗体またはそのフラグメントである。好ましくは、本発明のＡＢＰは、ＩｇＧ免疫グロブリンまたはそのフラグメント、例えば、ヒト、ヒト由来のＩｇＧ免疫グロブリン、またはウサギもしくはラット由来のＩｇＧ、および／またはＩｇＧ２免疫グロブリン、あるいはそのフラグメントであるか、それらを含むかまたはそれらに由来する。本発明のＡＢＰがラット由来のＩｇＧであるか、それを含むかまたはそれに由来するならば、その際は好ましくは、該ＡＢＰはラットＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ免疫グロブリンであるか、それを含むかまたはそれに由来する。本発明のＡＢＰがヒト由来のＩｇＧであるか、それを含むかまたはそれに由来するならば、その際はより好ましくは、本発明のＡＢＰはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であるか、それを含むかまたはそれに由来するものであり、最も好ましくは、本発明のＡＢＰはヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２であるか、それらを含むかまたはそれらに由来する。

従って、本発明の特定の実施形態では、ＡＢＰは抗体であり、ここで該抗体はＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ免疫グロブリンである。

本発明のＡＢＰは、免疫グロブリン定常領域（典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域）の少なくとも一部を含む場合、かかる領域の１以上の性質を最適化するため、および／または（例えば治療用）抗体の機能を改善するため、例えばＦｃエフェクター機能を向上もしくは低下させるかまたは血清中半減期を延長するために（例えば、例として糖鎖工学または突然変異により）改変された、かかる（例えばヒト）免疫グロブリン定常領域を有していてもよい。

本発明のＡＢＰ、特に本発明の方法において有用な該ＡＢＰには、エンドグリン発現細胞の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する抗体が含まれる。抗エンドグリン抗体のＡＤＣＣは、低レベルのフコースを有するかまたはフコースが欠損した抗体を使用することにより改善できる。フコースが欠損した抗体は、特に低用量の抗体で、増強されたＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性と関連付けられている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｈ，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０、Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｈ，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６）。

フコースを欠いた抗体またはフコースレベルが低下した抗体を調製する方法として、ラットのミエローマＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２）の増殖が挙げられる。ＹＢ２／０細胞は、ポリペプチドのフコシル化に必要な酵素（α１，６－フコシルトランフェラーゼ）をコードする、低レベルのＦＵＴ８ ｍＲＮＡを発現する。

あるいは、かかる抗体の発現の最中に、ツニカマイシン（Ｎ－グリコシド結合型糖鎖の前駆体であるコアオリゴ糖の形成の第１段階であるＧｌｃＮＡｃ－Ｐ－Ｐ－Ｄｏｌの形成を選択的に阻害する）、カスタノスペルミンおよびＷ－メチル－１－デオキシノジリマイシン（グリコシダーゼＩの阻害物質である）、キフネンシン（マンノシダーゼＩの阻害物質である）、ブロモコンズリトール（グリコシダーゼＩＩの阻害物質である）、１－デオキシノジリマイシンおよび１，４－ジオキシ－１，４－イミノ－Ｄ－マンニトール（マンノシダーゼＩの阻害物質である）、スワインソニン（マンノシダーゼＩＩの阻害物質である）、スワインソニン（マンノシダーゼＩＩの阻害物質である）などを含む、糖鎖の修飾に関する酵素に対する阻害物質を使用してもよい。グリコシルトランスフェラーゼに特異的な阻害物質の例としては、Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼＶ（ＧｎＴＶ）に対する基質のデオキシ誘導体などが挙げられる。同様に、１－デオキシノジリマイシンは複合型糖鎖の合成を阻害しかつ高マンノース型および混成型糖鎖の割当て量を増大させることが知られている（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ｓｅｒｉｅｓ ２－Ｄｅｓｔｉｎｙ ｏｆ Ｓｕｇａｒ Ｃｈａｉｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ，Ｋａｔｓｕｔａｋａ Ｎａｇａｉ，Ｓｅｎｉｃｈｉｒｏ ＨａｋｏｍｏｒｉおよびＡｋｉｒａ Ｋｏｂａｔａにより編集，１９９３）。

これらのデータを基に、様々な病状において利用しうるＦｃγＲに関連する具体的な特性を示す治療用モノクローナル抗体を選別する目的で、ＩｇＧのグリコシル化パターンを操作するため、幾つかの細胞系が遺伝子操作され、フコースを含有しないかまたは低レベルのフコースを含有する抗体が作製されている（Ｍｏｒｉら、２００４；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉら、２００４）。

ＵｍａｎａらおよびＤａｖｉｓらにより、増加した量の二分岐（bisected）複合オリゴ糖（二分岐（bisecting）Ａ／－アセチルグルコサミン、ＧｌｃＮＡＣ）を含有するよう操作されたＩｇＧ１抗体が、その親対応物と比較して強力なＡＤＣＣの誘発を可能にすることが示された（Ｕｍａｎａら、１９９９、Ｄａｖｉｅｓら、２００１）。第２に、ヒトＩｇＧ１ Ｎ－結合型オリゴ糖上のフコースの欠損がＦＣＧＲＩＩＩ結合およびＡＤＣＣを改善することが示された。

ＧＬＹＣＡＲＴ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＧ（Ｚｕｒｉｃｈ，ＣＨ）により、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系において前記Ｎ－結合型オリゴ糖への前記二分岐ＧｌｃＮａｃ残基の付加を触媒するＮ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）が明示されており、また作製したＩｇＧ１抗体のより強いＡＤＣＣが示されている（ＷＯ９９／５４３４２、ＷＯ０３／０１ １８７８、ＷＯ２００５／０４４８５９）。

ＷＯ２００７０１６６３０６は、（ｉ）抗ＣＤ１９抗体に対するｃＤＮＡおよび（ｉｉ）前記ＧｎＴＩＩＩ酵素に対するｃＤＮＡをトランスフェクトした哺乳動物ヒト２９３Ｔ胎児腎臓細胞において産生された６０％のＮ－アセチルグルコサミン二分岐オリゴ糖および１０％の非フコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン二分岐オリゴ糖を含有する抗体抗ＣＤ１９の改変に関連している。

ＹＢ２／０細胞（Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３、Ｓｉｂｅｒｉｌら、２００６）またはＣＨＯ－Ｌｅｃ１３（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２）で産生させた、野生型ＣＨＯ細胞で産生された同じＩｇＧ１と比較して低フコース含有量を示すかまたはフコースが欠損した組換えヒトＩｇＧ１は、細胞性細胞傷害を誘発する能力の増強を示した。対照的に、ガラクトースとＡＤＣＣとの間に相関関係は認められず、また二分岐ＧｌｃＮＡＣの含有量のみがＡＤＣＣにわずかに影響を及ぼした（Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３）。

前記抗体の前記Ｆｃ部分からフコースを除去するかまたは置き換えることにより、協和発酵工業（東京、日本）はＦｃ結合を増強してＡＤＣＣを改善し、結果としてＭＡｂの有効性を改善した（ＵＳ６，９４６，２９２）。この低フコシル化ＩｇＧの改善されたＦｃγＲＩＩＩＡ依存性エフェクター機能は、ＦｃγＲＩＩＩ対立遺伝子型とは無関係であることが示されている（Ｎｉｗａら、２００５）。さらに、ＩｇＧが高フコシル化ＩｇＧと比較して少ない含有量のフコースを有する場合、効率的なＡＤＣＣを誘導するために必要とされる抗原密度は低いことが最近になって示された（Ｎｉｗａら、２００５）。

Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｆｒａｎｇａｉｓ ｄｕ Ｆｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ ｅｔ ｄｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＬＦＢ）（フランス）により、高ＡＤＣＣを示す抗体を得るためにはＭＡｂオリゴ糖中のＦｕｃ／Ｇａｌ比は等しいかまたは０．６未満であるべきということが示された（ＦＲ２ ８６１ ０８０）。

Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉら（２０１９）は、α１，６－フコシルトランフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が欠損したＭｓ－７０４ＰＦ ＣＨＯ細胞において抗ＣＤ１９抗体を作製しており、この論文中では該抗体の非フコシル化は酵素欠損細胞系の操作を必要とする。この論文ではアミノ酸変異は考慮されていない。

Ｈｅｒｂｓｔらは、フコシルトランフェラーゼ－欠損プロデューサーＣＨＯ細胞系で発現させたヒト化ＩｇＧ１ ＭＡｂ ＭＥＤＩ－５５１を作製した。この論文ではアミノ酸変異は考慮されていない（Ｈｅｒｂｓｔら、２０１０）。Ｓ．Ｓｉｂｅｒｉｌらは、ラットのミエローマＹＢ２／０細胞系を使用することにより、フコース含有量が少ないＭＡｂ抗ＲｈＤを作製した。野生型ＣＨＯで産生されたＭＡｂが高いフコース含有量（８１％）を示す一方で、ＹＢ２／０細胞で産生された同じＭＡｂはより低いフコース含有量（３２％）を示した。この論文ではアミノ酸変異は考慮されていない（Ｓｉｂｅｒｉｌら、２００６）。

従って、本発明のＡＢＰは、上記のかかる糖鎖工学（例えば脱フコシル化）アプローチ／抗体の特徴の１以上を有するように調製してもよく、かつ／または有していてもよい。

本発明のＡＢＰに関するＡＤＤＣ活性を増大させるための代替法には、かかるＡＢＰのＦｃ部分の突然変異、特にＦｃγＲ受容体に対する抗体親和性を増大させる突然変異が含まれる。

従って、上記の本発明のＡＢＰのいずれかを、種々のアイソタイプまたは変異アイソタイプを用いて作製することにより、種々のＦｃγ受容体への結合の程度を制御することができる。Ｆｃ領域を欠く抗体（例えば、Ｆａｂフラグメント）は、種々のＦｃγ受容体への結合を欠く。アイソタイプの選択もまた、種々のＦｃγ受容体への結合に影響を及ぼす。３つの異なるＦｃγ受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩに対する様々なヒトＩｇＧアイソタイプの各親和性が決定されている（ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，４５７（１９９１）を参照のこと）。ＦｃγＲＩは、単量体型のＩｇＧに結合する高親和性受容体であり、後者２つは多量体型のＩｇＧにのみ結合する低親和性受容体である。一般に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は共に３つの受容体全てに対して有意な結合活性を有し、ＩｇＧ４はＦｃγＲＩに対して、またＩｇＧ２はＩＩａＬＲと呼ばれる１種類のＦｃγＲＩＩのみに対して有意な結合活性を有する（Ｐａｒｒｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，６９５（１９９２）を参照のこと）。従って、ヒトアイソタイプＩｇＧ１は、通常はＦｃγ受容体へのより強い結合が望ましい場合に選択され、またＩｇＧ２は通常はより弱い結合のために選択される。

増大したＦｃγＲ結合と変異型Ｆｃとの相関関係は、標的化細胞傷害細胞ベースアッセイ（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｈ，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１－６６０４、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｈ，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：４８７－４９０）を利用して実証されている。特定のＦｃ領域変異を通じてＡＤＣＣ活性を増大させるための方法には、２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０および３３２からなる群より選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＦｃバリアントが含まれ、ここで該Ｆｃ領域中の残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｈ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．１９８７））に記載されたＥＵインデックスのものである。

ある特定の具体的な実施形態では、前記Ｆｃバリアントは、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｆ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｔ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｔ、Ｖ２４０Ｍ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４１Ｙ、Ｆ２４１Ｅ、Ｆ２４１Ｒ、Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｙ、Ｆ２４３Ｒ、Ｆ２４３Ｑ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４５Ａ、Ｐ２４７Ｖ、Ｐ２４７Ｇ、Ｖ２６２Ｉ、Ｖ２６２Ａ、Ｖ２６２Ｔ、Ｖ２６２Ｅ、Ｖ２６３Ｉ、Ｖ２６３Ａ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｒ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６４Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｙ、Ｄ２６５Ｆ、Ｄ２６５Ｖ、Ｄ２６５Ｉ、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５Ｈ、Ｄ２６５Ｔ、Ｖ２６６Ｉ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｔ、Ｖ２６６Ｍ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｌ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｙ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｒ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｑ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｎ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｉ、Ｙ２９６Ｈ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｅ、Ａ２９８Ｈ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｅ、Ｗ３１３Ｆ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５Ｉ、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｔ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｈ、Ａ３２７Ｎ、Ａ３２７Ｌ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｎ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｆ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｔ、Ｌ３２８Ｈ、Ｌ３２８Ａ、Ｐ３２９Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｈ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２ＹおよびＩ３３２Ａからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含み、ここで該Ｆｃ領域中の残基のナンバリングはＫａｂａｔに記載されたＥＵインデックスのものである。

またＦｃバリアントは、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４１Ｌ／Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６２Ｉ／Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４１Ｗ／Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４１Ｗ／Ｆ２４３Ｗ／Ｖ２６２Ａ／Ｖ２６４Ａ、Ｆ２４１Ｌ／Ｖ２６２Ｉ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６２Ｉ／Ｖ２６４Ｗ、Ｆ２４１Ｙ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｔ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｅ、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２３８Ｍ／Ｉ３３２Ｅ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４５Ａ、Ｐ２４７Ｖ、Ｗ３１３Ｆ、Ｐ２４４Ｈ／Ｐ２４５Ａ／Ｐ２４７Ｖ、Ｐ２４７Ｇ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／２６４Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｇ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｑ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｑ、Ｔ２９９Ｉ、Ａ３２７Ｎ、Ｓ２６７Ｑ／Ａ３２７Ｓ、Ｓ２６７Ｌ／Ａ３２７Ｓ、Ａ３２７Ｌ、Ｐ３２９Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｄ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｓ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｄ２６５Ｆ／Ｎ２９７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２６３Ｉ、Ｖ２６６Ｉ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｑ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｎ、Ｆ２４１Ｙ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｆ、Ｓ２３９Ｔ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｔ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２６３Ａ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｔ、Ｖ２６６Ｍ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｙ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｒ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｉ、Ａ２９８Ｈ、Ｔ２９９Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｈ、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｔ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｈ、Ｌ３２８Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｖ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｈ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ａ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２Ｙ、Ｉ３３２Ａ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｖ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｉ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｌ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｆ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｈ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｎ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｑ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｈ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｖ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｆ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｈ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、およびＳ２３９Ｄ／２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅからなる群より選択することも可能であり、ここで該Ｆｃ領域中の残基のナンバリングはＫａｂａｔに記載されたＥＵインデックスのものである。本明細書中に参照により組み込まれるＷＯ２００４０２９２０７も参照のこと。

特定の実施形態では、ヒンジリンク領域中の部位上の、該部位に隣接する、または該部位に近接する変異（例えば、残基２３４、２３５、２３６および／または２３７を別の残基に置き換える変異）は、Ｆｃγ受容体、特にＦｃγＲＩ受容体に対する親和性を低減するために、前記アイソタイプの全てにおいて作製することができる（例えば、ＵＳ６６２４８２１を参照のこと）。場合によっては、２３４位、２３６位および／または２３７位をアラニンと置換し、かつ２３５位をグルタミン酸と置換する（例えばＵＳ５６２４８２１を参照のこと）。２３６位はヒトＩｇＧ２アイソタイプでは欠損している。ヒトＩｇＧ２の２３４位、２３５位および２３７位に対するアミノ酸の例示的セグメントは、Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ、Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ、Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ、Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ、およびＡｌａ Ｇｌｕ Ａｌａである。変異の好適な組み合わせは、ヒトアイソタイプＩｇＧ１の場合はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａであるか、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａである。本発明の特に好適なＡＢＰは、ヒトアイソタイプＩｇＧと、Ｆｃ領域のこれら３つの変異のうちの１つとを有する抗体である。Ｆｃγ受容体への結合を減少させる他の置換は、（特にマウスＩｇＧ１における）Ｅ２３３Ｐ変異および（特にマウスＩｇＧ２ａにおける）Ｄ２６５Ａである。Ｆｃおよび／またはＣ１ｑ結合を低減する変異および変異の組み合わせの他の例は、（特にマウスＩｇＧ１における）Ｅ３１８Ａ／Ｋ３２０Ａ／Ｒ３２２Ａ、（特にマウスＩｇＧ２ａにおける）Ｌ２３５Ａ／Ｅ３１８Ａ／Ｋ３２０Ａ／Ｋ３２２Ａである。同様に、ヒトＩｇＧ４中の残基２４１（Ｓｅｒ）を、例えばプロリンと置き換えることにより、Ｆｃ結合を破壊することができる。

エフェクター活性をモジュレートするために、定常領域にさらなる変異を作製することができる。例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａの定常領域にＡ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、または両方の変異を生じさせることができる。ＩｇＧ４の場合は、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４ＶおよびＬ２３５Ａの変異、ならびにＧ２３６欠失、またはこれらの任意の組み合わせを作製することができる。ＩｇＧ４には、Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅの一方または両方の変異を保有させることもできる。エフェクター機能をモジュレートするための破壊された定常領域配列の使用については、例えばＷＯ２００６１１８，９５９およびＷＯ２００６０３６２９１にさらに記載されている。

エフェクター活性をモジュレートするために、ヒトＩｇＧの定常領域にさらなる変異を作製することができる（例えば、ＷＯ２００６０３２９１を参照のこと）。これらの変異には、ヒトＩｇＧ１に対する次の置換、すなわち（ｉ）Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、（ｉｉ）Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６欠失、（ｉｉｉ）Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、（ｉｖ）Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６欠失、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、ならびに（ｖ）Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、または特に、（ｖｉ）（例えば、ヒトＩｇＧ１に対する）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓが含まれ、ここでＦｃ領域中の残基のナンバリングはＫａｂａｔに記載されたＥＵインデックスのものである。本明細書中に参照により組み込まれるＷＯ２００４０２９２０７も参照のこと。

前記ＦｃＲに対する抗体の親和性は、重鎖定常領域のある特定の残基を変異させることにより変更できる。例えば、ヒトＩｇＧ１のグリコシル化部位の破壊により、該抗体のＦｃＲ結合、ひいてはそのエフェクター機能を低減することができる（例えばＷＯ２００６０３６２９１を参照のこと）。トリペプチド配列ＮＸＳおよびＮＸＴ（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）は、該Ｎ残基のグリコシル化の際の酵素認識部位である。該トリペプチドアミノ酸のいずれかの破壊、特にＩｇＧのＣＨ２領域での破壊は、その部位でのグリコシル化を阻止する。例えば、ヒトＩｇＧ１のＮ２９７の変異は、グリコシル化を阻止し、かつこの抗体へのＦｃＲ結合を低減する。

Ｆｃ受容体結合の好適な増強は、本明細書中では通常「ＳＤＩＥ」（変異Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅを意味する）と称される、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン変異体を導入することにより達成できる。

ＡＤＣＣおよびＣＤＣの活性化は治療用抗体にとって望ましいことが多いが、エフェクター機能を活性化できない本発明のＡＢＰ（例えば、寛容なモジュレーター（ａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）である本発明のＡＢＰ）が好適な場合がある。これらの目的のためにＩｇＧ４が一般に使用されてきたが、これはＦａｂアーム交換を経るこのサブクラスの特有の性能（ｉｎ ｖｉｖｏではＩｇＧ４間で重鎖が入れ替わる可能性がある）のために近年は支持されていない。従って、Ｆｃ操作アプローチを同様に使用することにより、ＦｃドメインとＦｃγ受容体およびＣ１ｑとの重要な相互作用部位を決定し、その後例えば本発明のＡＢＰのＦｃにおいてこれらの位置を変異させて、結合を低減または消失させることができる。アラニンスキャニングを通じて、ＤｕｎｃａｎおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９８；Ｎａｔｕｒｅ ３３２：７３８）は、Ｆｃドメインのヒンジ部と上部ＣＨ２にわたる領域へのＣ１ｑの結合部位を初めて特定した。Ｇｅｎｍａｂ社の研究者らは、変異体Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを同定しており、これらは組み合わせると、ＦｃγＲおよびＣ１ｑ結合をほぼ完全に消失させるのに十分なものである（Ｈｅｚａｒｅｈら、２００１；Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５：１２１６１）。同様の方法で、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ社は後に、非常に類似した効果を有する一連の３つの変異、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（ＴＭと称される）を同定した（Ｏｇａｎｅｓｙａｎら、２００８；Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ ６４：７００）。代替アプローチは、最適なＦｃＲ相互作用に必要であることが知られている、Ｆｃドメインのアスパラギン２９７に対するグリコシル化の修飾である。ＦｃＲへの結合の喪失は、Ｎ２９７点突然変異（Ｔａｏら、１９８９；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４３：２５９５）、酵素的に脱グリコシル化したＦｃドメイン（Ｍｉｍｕｒａら、２００１；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：４５５３９）、グリコシル化阻害物質の存在下で組換えにより発現させた抗体（Ｗａｌｋｅｒら、１９８９；Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２５９：３４７）および細菌でのＦｃドメインの発現（Ｍａｚｏｒら２００７；Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５：５６３）において観察されている。従って、本発明は、かかる技術または変異を利用してエフェクター機能を低減させたＡＢＰの実施形態も含む。

ＩｇＧは本来、およそ２１日という典型的な半減期を与えるＦｃＲｎ媒介性リサイクリングにより（例えばヒト）血清中に長期間にわたり存続する。こうした事情にもかかわらず、該ＦｃＲｎとのＦｃドメインのｐＨ依存性相互作用を操作することにより、ｐＨ７．４では最小限の結合を保持しつつｐＨ６．０での親和性を増大させるための数多くの試みが為されている。ＰＤＬ ＢｉｏＰｈａｒｍａ社の研究者らは、アカゲザルにおいてＩｇＧの半減期のおよそ２倍の増大をもたらす変異Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌを同定し（Ｈｉｎｔｏら、２００４；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：６２１３）、カニクイザルにおいてＩｇＧの半減期のおよそ４倍の増大をもたらす変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥと称される）を同定した（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，ら２００６；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２３５１４）。本発明のＡＢＰはＰＥＧ化されていてもよい。ＰＥＧ化、すなわち合成ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との化学結合は、持続性作用を発揮する生物製剤の開発のための、一般に認められた技術として登場し、今日までに約１０種の臨床的に承認されたタンパク質薬およびペプチド薬が存在する（Ｊｅｖｓｅｖａｒら、２０１０；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ５：１１３）。本発明のＡＢＰは、薬剤的に活性なタンパク質の血漿中半減期を延長するためのＰＥＧ化の生物学的代替法である、ＰＡＳ化を施してもよい（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙら、２０１３；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２６：４８９；ＸＬ－ｐｒｏｔｅｉｎ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。従って、本発明は、かかる技術または変異を利用して（特にヒト血清における）血清中半減期を延長したＡＢＰの実施形態も含む。

「Ｆａｂフラグメント」は、軽鎖の隣接する定常領域と重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）により結び付けられた、重鎖および軽鎖の各々の１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインからなる。これらは従来の抗体から、例えばパパインによるプロテアーゼ消化により形成してもよいが、同様のＦａｂフラグメントを遺伝子操作により作製してもよい。Ｆａｂフラグメントには、Ｆａｂ’、Ｆａｂおよび「Ｆａｂ－ＳＨ」（少なくとも１つの遊離スルフヒドリル基を含有するＦａｂフラグメント）が含まれる。

Ｆａｂ’フラグメントは、それらが抗体ヒンジ領域からの１以上のシステインを含む重鎖の第１定常ドメインのカルボキシ末端に追加の残基を含有する点でＦａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’フラグメントには、「Ｆａｂ’－ＳＨ」（少なくとも１つの遊離スルフヒドリル基を含有するＦａｂ’フラグメント）が含まれる。

さらに、抗体フラグメントには、２つの軽鎖と、ＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間の定常領域の一部（「ヒンジ領域」）を含有する２つの重鎖とを含有し、鎖間ジスルフィド結合がこれら２つの重鎖間で形成されるような、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが含まれる。従って、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、それら２つの重鎖間のジスルフィド結合により結び付けられた２つのＦａｂ’フラグメントからなる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域より下で切断する酵素による（例えばペプシンによる）タンパク質切断により、または遺伝子操作により、従来の抗体から調製してもよい。

「Ｆｖ領域」は、重および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域が欠如している。「一本鎖抗体」または「ｓｃＦｖ」は、重および軽鎖可変領域がフレキシブルリンカーにより連結されて単一ポリペプチド鎖を形成し、該鎖が抗原結合領域を形成する、Ｆｖ分子である。

「Ｆｃ領域」は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖フラグメントを含む。かかる２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合、および該ＣＨ３ドメインの疎水性相互作用により結び付けられている。

好適な実施形態では、本発明のＡＢＰは、抗体またはそのフラグメントのフレームワーク配列の少なくとも一部がヒトコンセンサスフレームワーク配列である、例えば、ヒト生殖細胞系コード化フレームワーク配列を含む、該抗体である。

幾つかの実施形態では、本発明のＡＢＰは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増大させるために改変または操作されている。ここで当業者には理解されるように、本発明のかかるＡＢＰは、ＣＴＬのような免疫細胞に対する細胞抵抗性に関連する疾患または障害（例えば、ＣＤ２８陽性がん）の治療において特に有用である。これは、該ＡＤＣＣの機序（免疫系のエフェクター細胞が、その膜表面抗原に特異的抗体が結合した標的細胞を積極的に溶解することによる細胞媒介性免疫防御）がＣＴＬのような免疫細胞に対する抵抗性を有する細胞に関して増強され、該免疫系のエフェクター細胞による接着の増大、および／または該免疫系のエフェクター細胞によるかかる細胞の溶解の増大をもたらすことによる。

本明細書中で使用する場合、「治療」は疾患、障害、または状態を処置することと同義であり、これには該疾患、障害、もしくは状態の症状を低減すること、該疾患、障害、もしくは状態の進行を阻止すること、該疾患、障害、もしくは状態の軽減をもたらすこと、および／または該疾患、障害、もしくは状態を治癒させることが含まれる。

本発明のＡＢＰを改変または操作することによりＡＤＣＣを増大させるための様々な技術が公知であり（Ｓａｔｏｈら、２００６；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ６：１１６１；ＷＯ２００９／１３５１８１）、従ってかかる実施形態は、本発明のＡＢＰが脱フコシル化（ＧｌｙｃＡｒｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）されうる、例えば、抗体を内在性ＦＵＴ８遺伝子がノックアウトされているＣＨＯ細胞において産生させる実施形態、または該ＡＢＰが「糖操作抗体」（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）でありうる、例えばフコース類似体を抗体発現ＣＨＯ細胞に添加してフコシル化の有意な低下を生じさせる実施形態を含む。本発明のＡＢＰに適用しうる他の脱フコシル化アプローチは、本明細書中の他の箇所に記載されている。

本発明のＡＢＰを改変または操作することによりＡＤＣＣを増大させるための他の技術としては、（例えば、本明細書中の他の箇所により詳細に記載した）該ＡＢＰのＦｃ部分の突然変異、特にヒトＦｃの残基２３４、２３５、２３６および／もしくは２３７、ならびに／または残基３３０、３３１のうちの１以上をそのように変異させる突然変異が挙げられ、ここで該Ｆｃ領域中の該残基のかかるナンバリングはＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｈ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．１９８７）に記載されたＥＵインデックスのものである。

従って、ある特定の実施形態では、本発明のＡＢＰは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増大させるために改変または操作されており、好ましくはここで、該ＡＢＰを脱フコシル化する、ならびに／または該ＡＢＰのＦｃを変異させる（例えばその際、Ｆｃを次の残基変化、すなわちＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓおよび／もしくはＰ３３１Ｓのうちの１以上を利用して変異させる）。代替的実施形態では、本発明のＡＢＰは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低減するために改変または操作されている。

他のある特定の実施形態では、本発明のＡＢＰは、特にヒト血清における、血清中半減期を延長するために改変されている。例えば、本発明のＡＢＰはＰＥＧ化および／もしくはＰＡＳ化されていてもよく、またはＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８ＬもしくはＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ改変を持つＦｃ領域を有する。

本発明のＡＢＰは、単一特異性（すなわち、ただ１つの抗原に結合する抗原結合ドメインを持つ）であっても、または多重特異性（すなわち、異なる抗原に結合する２つ以上の異なる抗原結合ドメインを持つ）であってもよい。例えば、「二重特異性（ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「二特異性（ｄｕａｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」または「二機能性（ｂｉ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」ＡＢＰまたは抗体は、それぞれ、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッドのＡＢＰまたは抗体である。二重特異性抗原結合タンパク質および抗体は、多重特異性抗原結合タンパク質抗体の１種であり、限定するものではないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結（例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ，１９９０、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２を参照のこと）を含む様々な方法により作製することができる。二重特異性抗原結合タンパク質または抗体の前記２つの結合部位は、同一または異なるタンパク質標的上に存在しうる、２つの異なるエピトープに結合する。

従って、ある特定の実施形態では、本発明のＡＢＰは少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体であり、ここで各抗原結合ドメインは異なる抗原エピトープに特異的に結合する。

本発明のＡＢＰの好適なバリアントは、ＣＤ２８に対する抗体の抗原結合領域と、エンドグリン等の抗原性タンパク質に関連する疾患を標的とする第２抗原結合領域とを含む、二重特異性のものに関する。好ましくは、抗ＣＤ２８結合部位は、ｓｃＦｖ構築物である。本発明のある好適な構築物は、本明細書中では７Ｃ４と指定する抗体の２つの抗原結合ドメインと、２つの抗ＣＤ３結合ドメイン、例えば前述のＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ構築物とを含む。

好適な実施形態では、本発明のＡＢＰは少なくとも１つの抗体定常ドメインを含むことが可能であり、特にここで、少なくとも１つの抗体定常ドメインはＣＨ１、ＣＨ２、もしくはＣＨ３ドメイン、またはその組み合わせである。

さらなるかかる実施形態では、抗体定常ドメインを有する本発明のＡＢＰは、例えばＦｃ領域とＦｃ受容体（免疫エフェクター細胞上のＦｃ受容体（例えばＳａｘｅｎａおよびＷｕ，２０１６；Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：５８０）との相互作用を増大させるために、変異させた該Ｆｃ領域を含む。その例および実施形態は本明細書中の他の箇所に記載されている。

他の実施形態では、本発明のＡＢＰは、エフェクター基および／または標識基を含んでいてもよい。

用語「エフェクター基」は、任意の基、特に細胞傷害性物質として働く、抗原結合タンパク質などの別の分子に結合した基を意味する。適切なエフェクター基としての例は、放射性同位体または放射性核種である。他の適切なエフェクター基としては、毒素、治療基、または化学療法基が挙げられる。適切なエフェクター基の例としては、カリケアマイシン、アウリスタチン、ゲルダナマイシン、α－アマニチン、ピロロベンゾジアゼピンおよびマイタンシンが挙げられる。

用語「標識」または「標識基」は、任意の検出可能な標識を指す。一般に、標識はそれらを検出するアッセイに応じて、様々なクラス、すなわちａ）放射性同位体もしくは重同位体でありうる同位体標識、ｂ）磁気標識（例えば、磁性粒子）、ｃ）酸化還元活性部分、ｄ）光学色素；酵素基（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、ｅ）ビオチン化基、およびｆ）二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）に分類される。

代替的な態様では、本発明は、配列ＲＮＹＶＴＧＦＤＹ（配列番号１６）、またはこの配列と比較して、３、２以下、好ましくは１以下のアミノ酸変異を有する配列を有する重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）３と、配列ＨＱＹＬＳＳＹＴ（配列番号２０）、またはこの配列と比較して３、２以下、好ましくは１以下のアミノ酸変異を有する配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を少なくとも含む、エンドグリン結合分子にも関する。

さらなる一態様では、エンドグリン結合分子はＡＢＰであり、少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体重鎖配列、および、少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体軽鎖配列を含み、少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体重鎖配列は、配列ＳＹＷＭＨ（配列番号１４）を有するＨＣＤＲ１、配列ＮＩＹＰＧＳＴＦＹＤＥＫＦＫＧ（配列番号１５）を有するＨＣＤＲ２、および配列ＲＮＹＶＴＧＦＤＹ（配列番号１６）を有するＨＣＤＲ３を含む、 および／または、少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体軽鎖配列は、配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号１８）を有するＬＣＤＲ１、および配列ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号１９）を有するＬＣＤＲ２、および配列ＱＹＬＳＳＹＴ（配列番号２０）を有するＬＣＤＲ３を含む。場合により、各配列は、示された配列と比較して、アミノ酸の付加、欠失、挿入、または置換等の、３以下、好ましくは２以下、より好ましくは１以下のアミノ酸変異を有する。

本態様のさらなる実施形態では、エンドグリン抗体は、ＩｇＧ等の単一特異性ＡＢＰであってもよく、または、本明細書に開示される発明の他の態様との関連で、腫瘍関連抗原への結合を媒介する二重特異性分子の「第２の結合部位」として使用されてもよい。

好ましくは、エンドグリン結合分子はＡＢＰであり、重鎖配列は配列番号１７に示される抗体重鎖可変領域を含み、場合により、各配列は、示された配列と比較して、１０、９、８、７、６、５、４、３以下、好ましくは２以下、より好ましくは１以下のアミノ酸の付加、欠失、挿入、置換等のアミノ酸変異を有し、および／または、軽鎖配列は配列番号２１に示される抗体重鎖可変領域を含み、場合により、各配列は、示された配列と比較して、１０、９、８、７、６、５、４、３以下、好ましくは２以下、より好ましくは１以下のアミノ酸の付加、欠失、挿入、置換等のアミノ酸変異を有する。

さらに代替的な態様は、本発明の抗エンドグリンＡＢＰをコードする核酸配列、本発明の抗エンドグリンＡＢＰの重鎖および／または軽鎖配列の発現のためのベクターに関する。 このようなコードする核酸配列の例を、配列番号２２および２３に示す。

簡潔にするために、抗体に関する上記の一般的な説明は繰り返さないが、同様に適用されることを理解されたい。

第２態様では、本発明は、本発明の結合分子、または、重鎖もしくは軽鎖。結合分子、第１態様のいずれか1つ等の抗原結合フラグメントもしくはモノマー、または、本発明による二重特異性ＡＢＰをコードする配列を含む、単離された核酸に関する。

例えば、本発明の核酸によりコードされる成分は、本発明の抗体の１つの鎖の全部または一部であってもよいし、または該成分は前記結合分子のｓｃＦｖであってもよい。かかる核酸によりコードされる成分は、本発明の抗体の鎖の一方または他方の全部または一部であってもよく、例えば、かかる核酸によりコードされる該成分は本発明の結合分子であってもよい。本発明の核酸は同様に、本発明の結合分子のフラグメント、誘導体、変異体、またはバリアントをコードしていてもよく、かつ／または、ポリヌクレオチド、および前述のものの相補的配列の発現を阻害するための、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、アンチセンスもしくは抑制性核酸（例えば、ＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡもしくはｇＲＮＡ分子）を同定するか、解析するか、変異させるかもしくは増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーもしくはシークエンシングプライマーとしての使用に適切および／もしくは十分なポリヌクレオチドである成分であってもよい。

本発明の特定の実施形態では、本発明の核酸は、各場合に表１に示すような、重もしくは軽鎖ＣＤＲ、重および／もしくは軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組み合わせまたは重もしくは軽鎖可変ドメインをコードする配列を有する核酸、またはその機能的断片を含む。他の実施形態では、本発明の核酸は、本明細書中に開示したＣＤＲのいずれか、好ましくは表１の配列中のＣＤＲ３をコードする配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも７５％）の配列同一性を有する（または５０、４０、３０、２０、１５、１０もしくは５以下、好ましくは３、２もしくは１つ以下の塩基の置換、挿入もしくは欠失を有する）核酸配列を含む。

本発明による核酸は、場合によっては自然状態では結合していないポリヌクレオチドに結合している、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成起源、もしくはゲノム由来のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはその幾つかの組み合わせであってもよい。幾つかの実施形態では、かかる核酸は、１以上の（例えば、配列中の特定のヌクレオチドの２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくは２０個より多い、特に１～約５個、もしくは好ましくは全例の）非天然（例えば合成）ヌクレオチドを含んでいてもよく、かつ／またはかかる核酸は、標識基もしくはエフェクター基、例えば、本明細書中の他の箇所に記載した標識基もしくはエフェクター基などの別の化学的部分を含んでいてもよい（例えば該化学的部分に結合している）。

ある実施形態では、本発明の核酸は単離されていてもよいし、または実質的に純粋であってもよい。別の実施形態では、本発明の核酸は、組換え、合成および／または改変型であるか、または任意の他の形で非天然であってもよい。例えば、本発明の核酸は、ヒト核酸などの自然の産物と比較して少なくとも１つの核酸置換（または欠失）改変（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０より多くのかかる改変、特に１～約５のかかる改変、好ましくは２または３のかかる改変）を含有していてもよい。

前記核酸は、任意の適切な長さ、例えば約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００またはそれ以上のヌクレオチド長でありうる。例えば、ｓｉＲＮＡ核酸は、好ましくは、約１５～約２５塩基対の長さ（好ましくは約１９～約２１塩基対の長さ）であってもよく、ｓｈＲＮＡ核酸は、好ましくは、２０～３０塩基対のステム、少なくとも４ヌクレオチドのループ、および３’末端にジヌクレオチドオーバーハングを含んでいてもよく、マイクロＲＮＡは、好ましくは、約２２塩基対の長さであってもよく、本発明のＡＢＰまたはその成分（例えば、重もしくは軽鎖またはＩｇＧ抗体）をコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡ配列は、好ましくは、約５００～１，５００ヌクレオチドであってもよい。より好ましくは、哺乳動物の抗体の軽鎖をコードする核酸は約６３０～約６５０ヌクレオチドであってもよく、また哺乳動物の抗体の重鎖をコードする核酸は約１，３００～約１，６５０ヌクレオチドであってもよい。核酸は１以上の追加の配列、例えば、調節配列を含みうるか、および／またはより大きな核酸の一部でありうる。該核酸は一本鎖または二本鎖でありうるし、またＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチド、ならびにその人工バリアント（例えば、ペプチド核酸）を含みうる。

本発明の核酸の配列中に、突然変異により変化を導入することができる。かかる変化は、それらの性質およびコドン内の位置に応じて、それがコードするポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質）のアミノ酸配列に変化をもたらすことができる。突然変異は当分野で公知の任意の技術を利用して導入することができる。

ある実施形態では、１以上の特定のアミノ酸残基を、例えば、部位特異的突然変異誘発プロトコルを利用して変化させてもよい。別の実施形態では、１以上のランダムに選択した残基を、例えば、ランダム突然変異誘発プロトコルを利用して変化させてもよい。どんな方法で作製するにせよ、変異ポリペプチドを発現させて、所望の特性についてスクリーニングすることができる。変異は、核酸がコードするポリペプチドの生物学的活性を有意に変更することなく該核酸中に導入することができる。例えば、非必須アミノ酸残基でのアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を生じさせることができる。

本発明の核酸の配列に（例えば突然変異により）加えてもよい他の変化は、そのコード化ポリペプチドのアミノ酸配列を変更しなくてもよいが、該コード化ポリペプチドの発現のその安定性および／または有効性に変化をもたらしてもよい。例えば、コドン最適化により、所与のポリペプチド配列の発現を、そのヌクレオチドが発現される種に見出される、所与のアミノ酸に対してより多くみられるコドンを利用して改善してもよい。コドン最適化の方法、および代替法（例えば、ＣｐＧおよびＧ／Ｃ含量の最適化）は、例えば、Ｈａｓｓら、１９９６（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６：３１５）、ＷＯ１９９６／０９３７８、ＷＯ２００６／０１５７８９およびＷＯ２００２／９８４４３）に記載されている。

第３態様では、本発明は、前記第３態様の核酸と、細胞における前記コードされた結合分子（もしくはさらなる結合分子）、または該結合分子（もしくはさらなる結合分子）の成分（例えば抗体の重鎖もしくは軽鎖）の発現を可能にする１以上の追加の配列特徴とを含む核酸構築物（ＮＡＣ）に関する。

かかるＮＡＣは、細胞における（例えば宿主細胞における）前記コードされた結合分子または該結合分子の成分（例えば抗原結合部位）の発現を可能にする１以上の追加の特徴を含みうる。本発明のＮＡＣの例としては、限定するものではないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、ｍＲＮＡ、非エピソーマル哺乳動物ベクターおよび発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターが挙げられる。本発明の核酸構築物は、本発明の核酸を、宿主細胞などの細胞における該核酸の発現に適した形態で含みうる（下記参照）。本発明の核酸構築物は、典型的には、組換え核酸であり、かつ／または単離されていてもよく、かつ／または実質的に純粋であってもよい。組換え核酸は、特にそれらが異なる種および／または合成法、ｉｎ－ｖｉｔｒｏ法もしくは突然変異誘発法から得られる部分を含む場合、典型的には非天然である。

幾つかの実施形態では、本発明のＮＡＣは１以上の構築物を含み、該構築物のいずれかは、重または軽抗体鎖のいずれかをコードする核酸を含む。幾つかの実施形態では、本発明のＮＡＣは２つの構築物を含み、両構築物からの発現により完全な抗体分子が生成されうるように、その一方は重抗体鎖をコードする核酸を含み、他方は軽抗体鎖をコードする核酸を含む。幾つかの実施形態では、本発明のＮＡＣは、完全な抗体分子が１つの構築物から発現されうるように、重および軽抗体鎖の両方をコードする核酸を含む構築物を含む。他の実施形態では、本発明のＮＡＣは、（例えば、そのコードされた結合部位がｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ抗体）である場合）本発明のＡＢＰを形成するには十分である一本鎖をコードする単一構築物を含みうる。

幾つかの実施形態では、本発明のＮＡＣは定常領域の全てまたは一部をコードする配列を含み、重鎖および／または軽鎖の全体または一部を発現させることができる。

本発明によるＮＡＣは、本発明の結合分子をコードするオープンリーディングフレームを、例えば該結合分子の発現、ならびに好ましくはｍＲＮＡの安定性および／または該結合分子の発現の増強を可能にする上流ならびに下流要素（例えば、５’および／もしくは３’ＵＴＲならびに／またはポリＡストレッチ）と共に含むｍＲＮＡ分子を含んでいてもよい（または該ｍＲＮＡ分子から構成されていてもよい）。細胞内に導入してポリヌクレオチドを発現させるためのＮＡＣとしてのｍＲＮＡの使用については、例えば、Ｚａｎｇｉら Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ｖｏｌ．３１，８９８－９０７（２０１３）、Ｓａｈｉｎら（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １３：７５９およびＴｈｅｓｓらによるＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．ｖｏｌ．２３ ｎｏ．９，１４５６－１４６４（２０１５）に記載されている。本発明のｍＲＮＡ ＮＡＣに含まれていてもよい特定のＵＴＲとしては、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ（ＷＯ２０１３／１４３６９９）、および／またはヒストンステムループ（ＷＯ２０１３／１２０６２９）が挙げられる。本発明のｍＲＮＡ ＮＡＣは、５’キャップ、例えばｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ、（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＡもしくはＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇおよび／または天然に存在するヌクレオチドの類似体である少なくとも１つのヌクレオチド、例えばホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７－デアザ－グアノシン、５－メチルシトシンもしくはイノシンを含む１以上の化学修飾（ＥＰ１ ６８５ ８４４）をさらに含んでいてもよい。

本発明のＮＡＣ、例えばＤＮＡベース、レトロウイルスベースおよびｍＲＮＡベースのＮＡＣを、免疫系の疾患を処置または予防するための遺伝子治療的方法（後述の処置の方法を参照のこと）に使用してもよく、それによって本発明のＡＢＰをコードする発現可能な配列を含むＮＡＣを細胞または生物に（例えばトランスフェクションにより）投与する。特に、抗体の発現のためのｍＲＮＡ治療の利用は、ＷＯ２００８／０８３９４９より公知である。

好ましくは、第２および第３態様に関連して、核酸は、表１の配列番号１～１２のいずれか１つのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列を含み得る。

第４態様では、本発明は、前記第３または第４態様による核酸またはＮＡＣを含む組換え宿主細胞に関する。好ましくは、かかる細胞は、該ＮＡＣによりコードされる前記結合分子（またはその成分）を発現する能力がある。例えば、本発明の結合分子が２つの別々のポリペプチド鎖（例えばＩｇＧの重および軽鎖）を含むのであれば、その際本発明の細胞は、かかる結合分子の重鎖をコードする（かつ発現できる）第１のＮＡＣならびにかかる結合分子の軽鎖をコードする（かつ発現できる）第２のＮＡＣを含んでいてもよいし、あるいは、該細胞はかかる結合分子の両鎖をコードする単一のＮＡＣを含んでいてもよい。これらの方法で、かかる本発明の細胞は、本発明の機能性（例えば結合性および／または抑制性）結合分子を発現することができるであろう。本発明の（宿主）細胞は、本明細書中の他の箇所に記載した哺乳動物、原核生物または真核生物の宿主細胞のうちの１つであってもよく、特にその場合、該細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

かかる態様のある特定の実施形態では、前記（宿主）細胞はヒト細胞であり、特に該細胞は特定の個人から採取したヒト細胞（例えば自家ヒト細胞）であってもよい。かかる実施形態では、かかるヒト細胞を、本発明のＮＡＣを導入するためにｉｎ－ｖｉｔｒｏで増殖させる、および／または操作することができる。特定の個人から得た操作済みヒト細胞の有用性は、例えば治療に使用するために、かかる操作済みヒト細胞の集団をヒト対象に再導入することを含む、本発明の結合分子を産生することでありうる。かかる使用の一部においては、該操作済みヒト細胞を、該細胞を最初に採取した同一ヒト個体に（例えば、自家ヒト細胞として）導入してもよい。

かかる操作の対象となるヒト細胞は、体内の任意の生殖細胞または体細胞型でありうる。例えば、ドナー細胞は、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、上皮細胞、表皮細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、心臓細胞、食道細胞、筋細胞、メラニン細胞、造血細胞、マクロファージ、単球、および単核細胞からなる群より選択される生殖細胞または体細胞でありうる。該ドナー細胞は、体内の任意の臓器または組織から取得することが可能であり、例えば、該ドナー細胞は、肝臓、胃、腸、肺、膵臓、角膜、皮膚、胆のう、卵巣、精巣、腎臓、心臓、膀胱、および尿道からなる群より選択される臓器からの細胞でありうる。

第５態様では、本発明は、（ｉ）前記第１態様の結合分子、または（ｉｉ）前記第２もしくは第３態様の核酸もしくはＮＡＣ、または（ｉｉｉ）前記第４態様による組換え宿主細胞、ならびに製薬上許容可能な担体、安定剤および／または賦形剤、を含む医薬組成物に関する。

第６態様では、本発明は、パッケージまたは医薬組成物のキットであって、該キットが別々の容器に（ｉ）前述の態様のいずれか１つに列挙した単離された結合分子、該単離された結合分子をコードする単離された核酸、および／またはかかる核酸もしくは単離された結合分子を含む組換え宿主細胞、ならびに（ｉｉ）前述の態様のいずれか１つに列挙した単離されたさらなる結合分子、該単離されたさらなる結合分子をコードする単離された核酸、および／またはかかる核酸または単離されたさらなる結合分子を含む組換え宿主細胞、を含む該パッケージまたは医薬組成物のキットに関するものである。

治療に使用するために、本発明の結合分子、核酸またはＮＡＣ（または細胞、例えば宿主細胞）を、動物またはヒトへの投与を容易にするのに適した医薬組成物に製剤化してもよい。用語「医薬組成物」は、製薬用途のための治療活性物質（例えば本発明のＡＢＰ）を含む物質の混合物を意味する。

例として、本発明の医薬組成物は、０．１％～１００％（ｗ／ｗ）の活性成分、例えば約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、好ましくは約１％～約２０％、約１０％～５０％または約４０％～９０％の活性成分を含みうる。

本明細書中で使用する場合、「製薬上許容可能な」賦形剤、安定化剤または担体という言葉は、薬剤投与に適合する、任意かつ全ての溶媒、可溶化剤、充填剤、安定化剤、結合剤、吸収剤、基剤、緩衝剤、滑沢剤、徐放性ビヒクル、希釈剤、乳化剤、湿潤剤、分散媒、コーティング、抗菌剤または抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むものとする。薬剤的に活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当分野では周知である。いかなる従来の媒体または薬剤も該活性化合物と適合しない場合を除いては、組成物におけるその使用が想定される。補助的な薬剤もまた該組成物中に組み込むことができる。

本発明の（または本発明と共に使用するための）医薬組成物は、典型的には、その意図する投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、経口、非経口例えば、髄腔内、動脈内、静脈内、皮内、皮下、経口、経皮（局所）および経粘膜投与が挙げられる。

幾つかの実施形態では、結合分子またはＮＡＣを含む前記医薬組成物は、１０～１０００ｍｇの単位用量形態である。幾つかの実施形態では、結合分子またはＮＡＣを含む該医薬組成物は、１０～２００ｍｇの単位用量形態である。幾つかの実施形態では、結合分子を含む該医薬組成物は２００～４００ｍｇの単位用量形態である。幾つかの実施形態では、結合分子またはＮＡＣを含む該医薬組成物は４００～６００ｍｇの単位用量形態である。幾つかの実施形態では、結合分子またはＮＡＣを含む該医薬組成物は６００～８００ｍｇの単位用量形態である。幾つかの実施形態では、結合分子またはＮＡＣを含む該医薬組成物は８００～１００ｍｇの単位用量形態である。

結合分子またはＮＡＣを含む医薬組成物のための例示的な単位用量形態は、錠剤、カプセル剤（例えば粉剤、顆粒剤、マイクロタブレットもしくはマイクロペレットとして）、懸濁剤または使い捨ての充填済みシリンジである。ある特定の実施形態では、単一用量投与単位を作製するためのキットが提供される。該キットは、乾燥させた活性成分を有する第１容器と、水性製剤を有する第２容器の両方を含みうる。あるいは、該キットは、シングルチャンバー型およびマルチチャンバー型の充填済みシリンジを含有しうる。

かかる活性成分の毒性および治療効力（例えば有効性）は、例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ_５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。毒性作用と治療効果との用量比が治療指数であり、これはＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表すことができる。大きい治療指数を示す活性物質が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を使用してもよいが、非罹患（uninfected）細胞への潜在的損傷を最小限に抑え、またそれによって副作用を低減するために、罹患組織の部位にかかる化合物を標的化させる送達系を設計するよう注意を払うべきである。

本明細書中に提供する処置の医学的利用および方法の全ての態様および実施形態によれば、結合分子またはＮＡＣによる処置を必要とする対象に少なくとも１回投与する有効量は、典型的には、１回投与当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば１回投与当たり約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇである。幾つかの実施形態では、ＡＢＰまたはＮＡＣの該対象に少なくとも１回投与する該有効量は、１回投与当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ、１回投与当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、１回投与当たり約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、１回投与当たり約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、１回投与当たり約１０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、または１回投与当たり約５０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇである。

疾患の予防または処置のための、結合分子もしくはＮＡＣ（またはそれらからなる医薬組成物）の適当な投与量は、処置する疾患の種類、疾患の重症度および経過、結合分子もしくはＮＡＣおよび／または医薬組成物を予防目的で投与するのかまたは治療目的で投与するのか、以前の治療、患者の病歴、年齢、体格／体重ならびに結合分子もしくはＮＡＣおよび／または医薬組成物への応答、さらには主治医の判断によって決まる。該結合分子もしくはＮＡＣおよび／または医薬組成物は、１度に、または一連の処置にわたり適宜患者に投与される。かかる結合分子もしくはＮＡＣおよび／または医薬組成物を一連の処置にわたり投与する場合、所与の処置過程のための投与の総回数は、合計で約２、３、４、５、６、７、８、９、１０回または約１０回より多くの処置で構成されていてもよい。例えば、処置を１日１回（または１日に２、３もしくは４回）１週間、１ヶ月間、またはさらには数ヶ月間施してもよい。ある特定の実施形態では、該処置過程を無期限に続けてもよい。

第６態様では、本発明は医薬に使用するための成分に関するものであり、ここで該成分は、（ｉ）前記第１態様の結合分子もしくは二重特異性ＡＢＰ、または（ｉｉ）前記第２もしくは第３態様の核酸もしくはＮＡＣ、または（ｉｉｉ）前記第４態様による組換え宿主細胞および（ｉｖ）前記第５態様による医薬組成物、からなるリストより選択される。

関連のある態様では、本発明は、その必要がある哺乳動物対象において疾患、障害、または状態を処置または予防する方法であって、上記のモジュレーティング化合物の有効量を少なくとも１回該対象に投与すること、または、および特に先に記載した前記結合分子、前記ＮＡＣ、前記（宿主）細胞、または前記医薬組成物の有効量を少なくとも１回該対象に投与することを含む該方法にも関する。

別の関連のある態様では、本発明は、医薬品の製造のため、特に哺乳動物対象における疾患、障害、または状態の処置のための、特に該疾患、障害、または状態が本明細書中に記載したものである場合の、上記の本発明の生成物、または上記モジュレーティング化合物（特に本発明の結合分子）の使用にも関する。

本発明における用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患（または障害または状態）に対する治療、例えば治療的処置、ならびに予防的または抑制的手段を含むことを意味する。従って、例えば、疾患の発症前の本発明による化合物の投与の成功は、該疾患の処置につながる。「処置」は、疾患（またはその症状）を改善または根絶するための、該疾患の出現後の本発明の化合物の投与もまた包含する。発症後および臨床症状後の本発明のＣＤ２８結合分子の投与は、臨床症状の軽減の可能性および恐らくは疾患の改善と併せて、該疾患の処置も含む。「処置の必要がある」ものには、疾患、障害、または状態を既に有する対象（例えば、ヒト対象）、ならびに疾患、障害、または状態を有する傾向があるかまたは有する疑いがあるもの、例えば疾患、障害、または状態を予防すべきものが含まれる。

これらの態様の特定の実施形態では、前記モジュレーティング化合物は上記のもの、および／または本発明の結合分子、ＮＡＣ、（宿主）細胞、医薬組成物もしくはキット、特に本発明の結合分子である。

本明細書中の他の箇所に記載した他の態様では、哺乳動物対象において疾患、障害、もしくは状態を検出および／または診断するための方法が提供される。

ある特定の実施形態では、前記疾患、障害、または状態は病的免疫応答を特徴とする。

別の特定の実施形態では、前記疾患、障害、または状態は、特に前記生成物がモジュレーティング化合物（例えば、本発明の結合分子、核酸、ＮＡＣまたは組換え宿主細胞、特に本発明の結合分子）の場合、増殖性疾患（またはかかる障害もしくは疾患に関連する状態）である。

「増殖性疾患」は、細胞の異常増殖を特徴とする障害を指す。増殖性疾患は、細胞成長の速度に関する制限を意味するのではなく、単に成長および細胞***に影響を及ぼす正常な制御の喪失を示している。従って、幾つかの実施形態では、増殖性疾患の細胞は、正常細胞と同じ細胞***速度を有しうるが、かかる成長を制限するシグナルには応答しない。組織または細胞の異常な成長である新生物または腫瘍は、「増殖性疾患」の範囲内にある。がんは当分野で理解されており、周辺組織に浸潤する、および／または新たな定着部位に転移する能力を有する細胞の増殖を特徴とする様々な悪性新生物のいずれかを含む。増殖性疾患としては、がん、粥状硬化症、関節リウマチ、特発性肺線維症および肝臓の硬変症が挙げられる。非がん性増殖性疾患としては、皮膚における細胞の過剰増殖、例えば、乾癬およびその様々な臨床型、ライター症候群、毛孔性紅色粃糠疹、ならびに角化の障害の過剰増殖性変異型（例えば、光線性角化症、老人性角化症）、強皮症なども挙げられる。

より特定の実施形態では、前記増殖性疾患は、がんまたは腫瘍、特に固形腫瘍（またはかかるがんもしくは腫瘍に関連する状態）である。かかる増殖性疾患としては、限定するものではないが、頭頸部がん、扁平上皮がん、多発性骨髄腫、孤立性形質細胞腫、腎細胞がん、網膜芽細胞腫、胚細胞腫瘍、肝芽腫、肝細胞がん、黒色腫、腎横紋筋肉腫様腫瘍、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、任意の血液悪性腫瘍（例えば、慢性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、慢性骨髄芽球性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病、肥満細胞性白血病、肥満細胞性新生物、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、菌状息肉症、セザリー症候群（ｓｅａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、慢性骨髄増殖性疾患、骨髄線維症、骨髄化生、全身性肥満細胞症）、ならびに中枢神経系腫瘍（例えば、脳がん、膠芽腫、非膠芽腫脳がん、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原始神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星細胞腫、退形成性星細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫および脈絡叢乳頭腫）、骨髄増殖性疾患（例えば、真性赤血球増加症、血小板血症、特発性骨髄線維症）、軟部組織肉腫、甲状腺がん、子宮内膜がん、カルチノイドがん、または肝がんが挙げられる。

ある好適な実施形態では、本発明の様々な態様は、例えば、がん腫（例えば、乳がん、前立腺がん、胃がん、肺がん、大腸および／もしくは結腸がん、肝細胞がん、黒色腫）、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫および菌状息肉症）、白血病、肉腫、中皮腫、脳がん（例えば神経膠腫）、胚細胞腫（例えば、精巣がんおよび卵巣がん）、絨毛がん、腎がん、膵臓がん、甲状腺がん、頭頸部がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、または胃がんを含むがこれらに限定されないかかる増殖性疾患を検出／診断、予防および／または処置するために使用する本発明の結合分子に関する。

従って、好適な実施形態では、本発明による結合分子またはＮＡＣは、がん、例えば、副腎腫瘍、ＡＩＤＳ関連がん、胞巣状軟部肉腫、星細胞系腫瘍、膀胱がん、骨がん、脳および脊髄のがん、転移性脳腫瘍、乳がん、頸動脈球腫瘍、子宮頸がん、軟骨肉腫、脊索腫、色素嫌性腎細胞がん、明細胞がん、結腸がん、大腸がん、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、ユーイング腫瘍、骨外性粘液型軟骨肉腫、骨性線維形成不全症（ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ ｏｓｓｉｕｍ）、骨の線維性異形成症、胆のうまたは胆管がん、胃がん、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、頭頸部がん、肝細胞がん、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎がん、白血病、脂肪腫／良性脂肪腫性腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫性腫瘍、肝がん、リンパ腫、肺がん、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腺腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、甲状腺乳頭がん、副甲状腺腫瘍、小児がん、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺がん、後部ブドウ膜黒色腫、稀な血液障害、転移性腎がん、横紋筋肉腫様腫瘍、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｓａｒｃｏｍａ）、肉腫、皮膚がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺がん、胸腺腫、転移性甲状腺がん、ならびに子宮がんの細胞からなる群より選択されるがん細胞の存在を特徴とするがんの予防および／または処置に使用するためのものである。

他の方法では、前記モジュレーティング（例えば抑制）化合物（例えば、本発明のものなどの結合分子）を、異なる抗増殖治療、特に異なる抗がん治療と組み合わせて使用してもよく、特にここで、その異なる抗増殖治療は免疫療法、特に免疫チェックポイント分子に対するリガンドを用いる免疫療法である。従って、前記組成物は、その必要がある対象における増殖性疾患の処置に使用するためのものでありうるし、ここで該対象には免疫療法による共処置、特に免疫チェックポイント分子に対するリガンドとの共治療（例えば併用処置）を行う。

かかる実施形態では、前記リガンドは、免疫（抑制性）チェックポイント分子に結合するものである。例えば、かかるチェックポイント分子は、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ－１（もしくはそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２のうちの１つ）、ＴＩＭ－３（もしくはそのリガンドであるガレクチン－９）、ＴＩＧＩＴ、または例えばＦＬＴ３、ＰＳＭＡもしくは他の腫瘍関連標的をターゲティングする抗原結合分子からなる群より選択されるものであってもよい。特定のかかる実施形態では、該リガンドは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１から選択されるチェックポイント分子に結合する。他のより具体的な実施形態では、該リガンドは、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ＢＧＢ－Ａ３１７、アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブからなる群より選択される抗体、特に、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ）、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ）およびアテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ）からなる群より選択される抗体である。

本発明の治療における方法また使用（例えば、本発明のＡＢＰに関与するもの）を、かかる他の手法のいずれか（例えば、免疫（抑制性）チェックポイント分子に結合するリガンドなどの、別の作用物質またはがん免疫療法）と共に併用処置に利用する場合、併用処置レジメンであるかかる方法または使用は、かかる曝露／投与が同時である実施形態を含んでいてもよい。代替的実施形態、特に本発明のＡＢＰをかかる他の手法の前に投与するそれらの実施形態では、かかる投与は連続的であってもよい。例えば、本発明のかかる化合物を、他の手法の約１４日以内（例えば他の手法の前）、例えば他の手法の約１０日、７日、５日、２日または１日以内（例えば他の手法の前）に連続的に投与してもよく、さらに例えばここで、本発明の化合物を、他の手法の約４８時間、２４時間、１２時間、８時間、６時間、４時間、２時間、１時間、３０分、１５分または５分以内（例えば他の手法の前）に連続的に投与してもよい。

さらなる態様では、本発明は、対象における増殖性疾患の予防および／または処置のための方法であって、処置を必要とする対象への、本明細書に列挙した成分の治療上有効な量の投与を含み、かつここで該増殖性疾患が該増殖性疾患に関連する細胞における抗原性タンパク質の発現を特徴とする、該方法に関する。好ましい実施形態では、および本明細書の他の箇所で開示されるように、かかる処置は、さらなる結合分子の追加投与を含む。

上記の通り、ある態様では、上記ＡＢＰを発現する能力がある細胞、例えば（組換え）宿主細胞またはハイブリドーマが本明細書中に提供される。代替的な態様では、上記のＡＢＰまたはＡＢＰの成分をコードする少なくとも１つのＮＡＣを含む細胞が本明細書中に提供される。本発明の細胞は、本発明のＡＢＰおよび／またはＮＡＣを作製するために、本明細書中に提供する方法において使用することができる。

従って、別の態様では、本発明は、第１態様の結合分子を発現する能力がある組換え細胞系を作製する方法であって、
・適切な宿主細胞を用意するステップ、
・本発明の結合分子をコードするコード配列を含む少なくとも１つの遺伝子構築物を提供するステップ、
・かかる適切な宿主細胞に、該遺伝子構築物を導入するステップ、および
・場合によっては、該結合分子の発現を可能にする条件下でかかる適切な宿主細胞により該遺伝子構築物を発現させるステップ
を含む該方法に関する。

さらに別の態様では、例えば前記結合分子の発現を可能にする条件下で本発明の１以上の細胞を培養することを含む、上記のように該結合分子を作製する方法が本明細書中に提供される。

幾つかのさらなる態様および実施形態では、本発明は以下の項目に関するものであり、該項目は他の本明細書中に開示および記載した態様および実施形態、ならびに実施例を考慮して解釈されるものとする：
項目１．対象における疾患の処置への使用のための、少なくとも２つの第１抗原結合部位と少なくとも１つの第２抗原結合部位とを含む、少なくとも二重特異性である結合分子であって、ここで
（ｉ）該少なくとも２つの第１抗原結合部位は、Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８のエピトープに特異的に結合する能力があり、かつ
（ｉｉ）該少なくとも１つの第２抗原結合部位は、該対象において該疾患に関連する細胞上または細胞内で発現される抗原標的タンパク質のエピトープに結合する能力があり、
ここで該処置が該対象への該結合分子の投与を含む、該結合分子。
項目２．前記少なくとも２つの第１抗原結合部位および／または前記少なくとも１つの第２抗原結合部位が抗体または抗体様分子に由来するものであり、かつここで該少なくとも２つの第１抗原結合部位が各々、Ｆ（ａｂ’）_２またはＦａｂではなく、かつ好ましくは一本鎖構築物である抗体の抗原結合フラグメントとして、最も好ましくは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として提供される、項目１の使用のための結合分子。
項目３．前記結合分子が、前記抗原標的タンパク質を発現する第２細胞の非存在下でＣＤ２８陽性免疫細胞（例えばＴ細胞）である第１細胞と接触させた場合に、ＣＤ２８シグナル伝達を誘導せず、かつ好ましくは該免疫細胞（Ｔ細胞）を活性化しない、項目１または２の使用のための結合分子。
項目４．前記抗原標的タンパク質が、増殖性疾患に関連する細胞上に発現されるタンパク質、寄生生物、ウイルスまたは細菌などの病原性生物に関連するタンパク質または他の分子から選択される、項目１～３のいずれか１つの使用のための結合分子。
項目５．前記抗原標的タンパク質がエンドグリンである、項目１～４のいずれか１つの使用のための結合分子。
項目６．前記少なくとも２つの第１抗原結合部位の各々が、共有結合的または非共有結合的のように直接、前記少なくとも１つの第２抗原結合部位と連結されている、項目１～５のいずれか１つの使用のための結合分子。
項目７．少なくとも２つの第２抗原結合部位を含む、項目１～６のいずれか１つの使用のための結合分子。
項目８．前記少なくとも２つの第１抗原結合部位がＣＤ２８上の同一エピトープに結合し、好ましくはここで該少なくとも２つの抗原結合部位が同一である、項目１～７のいずれか１つの使用のための結合分子。
項目９．前記少なくとも２つの第１抗原結合部位のうちの少なくとも１つと前記少なくとも１つの第２抗原結合部位とが、好ましくはＩｇＧの、１つ以上の抗体由来ヒト定常ドメインを含むタンパク質リンカーにより互いに結合している、例えばそれらがヒトＩｇＧ由来のＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３を介して結合している、項目１～８のいずれか１つの使用のための結合分子。
項目１０．前記少なくとも２つの第１抗原結合部位が抗体重鎖配列および抗体軽鎖配列（好ましくは少なくともＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、各々が配列番号２、３、４、５、７、８または９に示す抗体配列中に含まれるＣ末端結合部位に由来するものであり、かつ該Ｃ末端結合部位と同一の抗原に競合的に結合する、項目１～９のいずれか１つの使用のための結合分子。
項目１１．前記少なくとも１つの第２抗原結合部位が抗体重鎖配列および抗体軽鎖配列を含み、各々が配列番号１および２からなる抗体中に含まれるＮ末端結合部位に由来するものであり、かつ該Ｎ末端結合部位と同一の抗原に競合的に結合する、項目１～１０のいずれか１つの使用のための結合分子。
項目１２．前記結合分子が免疫細胞および疾患に関連する細胞に特異的に結合し、好ましくはここで該免疫細胞が細胞傷害性免疫応答またはヘルパー細胞媒介性免疫応答などの細胞媒介性免疫応答に関与する免疫細胞である、項目１～１１のいずれか１つの使用のための結合分子。
項目１３．前記免疫細胞が好ましくは細胞傷害性細胞またはＣＤ２８およびＣＤ３（およびＴＣＲ）等のヘルパー細胞を発現する細胞であり、かつ好ましくはＴ細胞である、項目１～１２のいずれか１つの使用のための結合分子。
項目１４．前記対象が、ＣＤ３／ＴＣＲシグナル伝達が処置により、または抗原タンパク質などの疾患関連抗原に応答して内因的に活性化されることを特徴とする、項目１～１３のいずれか１つの使用のための結合分子。
項目１５．前記処置が疾患に関連する細胞に対する免疫細胞の刺激および／または活性化、例えばＴ細胞の活性化および／または刺激をさらに含む、項目１～１４のいずれか１つの使用のための結合分子。
項目１６．２つの抗体重鎖配列と、２つの抗体軽鎖配列とを含み、かつここで
（ｉ）前記少なくとも２つの第１抗原結合部位の一方が該２つの抗体軽鎖配列の一方のＣ末端に共有結合的に連結されており、かつ該少なくとも２つの第１抗原結合部位の他方が該２つの抗体軽鎖配列の他方のＣ末端に共有結合的に連結されているか、または
（ｉｉ）該少なくとも２つの第１抗原結合部位の一方が該２つの抗体重鎖配列の一方のＣ末端に共有結合的に連結されており、かつ該少なくとも２つの第１抗原結合部位の他方が該２つの抗体重鎖配列の他方のＣ末端に共有結合的に連結されている、
項目１～１５のいずれか１つの使用のための結合分子。
項目１７．前記結合部位がペプチドリンカーなしで、または以下のアミノ酸を有する短いペプチドリンカーにより、または少なくとも６個、好ましくは最大５０個のアミノ酸を有する長いペプチドリンカーを介して連結され、ここでさらに好ましくは該ペプチドリンカーが（ＧＧＧＧＳ）_ｎリンカーであり、かつｎが２以上である、項目１６の使用のための結合分子。
項目１８．前記少なくとも１つの第２抗原結合部位がＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、または最も好ましくはＩｇＧを含む、前述の項目のうちのいずれか１つの使用のための結合分子。
項目１９．前記処置が、（ｉ）二重特異性であり、かつＣＤ３および／もしくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）への結合を介するなどしてＴ細胞に特異的に結合（およびＴ細胞を活性化）する能力があるさらなる結合分子、またはＴ細胞活性化のためのシグナルを提供もしくは増強する能力がある任意の他の試薬、例えば（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの抗原受容体（該受容体は抗原標的タンパク質に特異的に結合する能力がある）を発現する遺伝子改変免疫細胞（異種もしくは自己Ｔ細胞）または（ｉｉｉ）感染因子もしくはがん細胞由来の抗原構造（ＴＡＡもしくはＴＳＡ）を提供するワクチンまたは（ｉｖ）ＰＤ１などのチェックポイント分子を介して抑制性「第２シグナル」を遮断する試薬、の連続または同時投与を含む、項目１～１８のいずれか１つの項目の使用のための結合分子。かかる試薬はチェックポイント遮断剤と称される。
項目２０．前記さらなる結合分子が少なくとも二重特異性であり、かつ少なくとも１つの第３抗原結合部位と少なくとも１つの第４抗原結合部位とを含み、ここで
（ｉ）該少なくとも１つの第３抗原結合部位は、ＣＤ３および／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）（ＣＤ３／ＴＣＲ）に特異的に結合する能力があり、かつ
（ｉｉ）該少なくとも１つの第４抗原結合部位は、前記対象において前記疾患に関連する細胞上または細胞内で発現されるさらなる抗原標的タンパク質のエピトープに特異的に結合する能力がある、
項目１９の使用のための結合分子。
項目２１．前記抗原標的タンパク質および前記さらなる抗原標的タンパク質が（ｉ）同一であるか、または（ｉｉ）異なりはするが互いに空間的に密に近接している、例えば疾患に関連する同一細胞上に発現されるかもしくは同一疾患組織に位置する、例えば同一腫瘍環境で発現される、項目１７の使用のための結合分子。
項目２２．前記疾患が、好ましくはがんなどのがん疾患、例えば肺がん、乳がん、大腸がん、胃がん、肝細胞がん、膵臓がん、卵巣がん、黒色腫、骨髄腫、腎臓がん、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、膀胱がんまたは前立腺がんから選択される増殖性疾患であって、特に黒色腫、肺がん（例えば非小細胞肺がん）、膀胱がん（例えば尿路上皮がん）、腎臓がん（例えば腎細胞がん）、頭頸部がん（例えば該頭頸部の扁平上皮がん）およびホジキンリンパ腫からなるリストより選択される増殖性疾患である、項目１～１８のいずれか１つに記載の使用のための結合分子。好ましくは、該増殖性疾患は黒色腫、または肺がん（例えば非小細胞肺がん）、好ましくは前記標的抗原タンパク質の発現に関して陽性のがんである。
項目２３．単離された結合分子であって、該単離された結合分子が前述の項目のうちのいずれか１つに列挙した結合分子である、該単離された結合分子。
項目２４．項目２３の単離された結合分子をコードする単離された核酸。
項目２５．項目２３の単離された結合分子または項目２４による単離された核酸を含む、組換え宿主細胞。
項目２６．項目２３の単離された結合分子、項目２４の単離された核酸、項目２５の組換え宿主細胞を、製薬上許容可能な担体および／または賦形剤と共に含む、医薬組成物。
項目２７．項目１９または２０に列挙した、単離されたさらなる結合分子をさらに含む、項目２６の医薬組成物。
項目２８．パッケージまたは医薬組成物のキットであって、該キットが別々の容器に（ｉ）前述の項目のうちのいずれか１つに列挙した単離された結合分子、該単離された結合分子をコードする単離された核酸、および／またはかかる核酸または単離された結合分子を含む組換え宿主細胞、ならびに（ｉｉ）前述の項目のうちのいずれか１つに列挙した単離されたさらなる結合分子、該単離されたさらなる結合分子をコードする単離された核酸、および／またはかかる核酸または単離されたさらなる結合分子を含む組換え宿主細胞、を含む、該キット。

本明細書中で使用する「［本］発明の」、「本発明による（ｉｎ ａｃｃｏｒｄａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」、「本発明による（ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」などの用語は、本明細書中に記載した、および／または項目別に示した本発明の全ての態様および実施形態を指すものとする。

本明細書中で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」の両方を包含するものと解釈され、それらの意味は共に、具体的に意図され、従って個別に開示された本発明による実施形態である。本明細書中で使用する場合、「および／または」は、２つの特定の特徴または成分の各々の、他方と併せた、または他方なしの具体的な開示とみなされる。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、まるで各々が本明細書中に個別に記載されているかのような、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の具体的な開示とみなされる。本発明との関連において、用語「約」および「およそ」は、当該特徴の技術的効果をさらに確実なものにすると当業者には理解される、精度の間隔（ｉｎｔｅｒｖａｌ ｏｆ ａｃｃｕｒａｃｙ）を意味する。該用語は典型的には、示された数値からの±２０％、±１５％、±１０％、および例えば±５％の偏差を示す。通常の技術を有する者には理解されるように、所与の技術的効果に関する数値の具体的なかかる偏差は、該技術的効果の性質によって決まる。例えば、天然の、または生物学的な技術的効果は、一般に、人工的または工学的な技術的効果に関するものより大きなかかる偏差を有する場合がある。通常の技術を有する者には理解されるように、所与の技術的効果に関する数値の具体的なかかる偏差は、該技術的効果の性質によって決まる。例えば、天然の、または生物学的な技術的効果は、一般に、人工的または工学的な技術的効果に関するものより大きなかかる偏差を有する場合がある。単数名詞に言及する際に不定冠詞または定冠詞、例えば「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」が使用されている場合、他のものが具体的に記載されていない限り、これはその名詞の複数形を含む。

特定の問題または環境への本発明の教示内容の適用、ならびに本発明のバリエーションまたはそれに対する追加の特徴（例えば、さらなる態様および実施形態）の包含は、本明細書中に含まれる教示内容を考慮すれば、当分野の通常の技術を有する者の能力の範囲内であることは理解されよう。

文脈上他を指示しない限り、上記の特徴の説明および定義は、本発明のいかなる特定の態様または実施形態にも限定されず、記載した全ての態様および実施形態に等しく適用される。

本明細書中で引用した全ての参考文献、特許、および刊行物は、その全内容が参照により本明細書中に組み込まれるものとする。

図面および配列の簡単な説明
図面は以下の内容を示すものである。

図１は、異なる細胞系におけるＢ７Ｈ３発現およびエンドグリン発現の定量化を示す図である。図示した細胞Ｕ９３７、ＨＴ－２９およびＨＥＫ２９３Ｔ（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をエンドグリン抗体ｍＫｒｏ－２２と共にインキュベートしてから、ＱＩＦＩＫＩＴアッセイ系を使用したフローサイトメトリーにより解析した（ＮＤ：不検出）。 図２は、新たに開発したエンドグリン抗体のパネルからの高親和性結合物質の選択を示す図である。種々の抗体の親和性は、フローサイトメトリー（Ａ）およびＢｉａｃｏｒｅ解析（Ｂ）により測定した。 図２－１の続きである。 図３は、本出願において使用した二重特異性抗体バリアントを示す図であり、（Ａ）はＴ細胞活性化のための減弱化された第１シグナルを与えるＢ７Ｈ３×ＴＣＲ／ＣＤ３特異性を有するＩｇＧｓｃフォーマットのｂｓＡｂ（ｂｓＡｂＣＤ３）を示す図であり（Ｂ～Ｅ）はＩｇＧｓｃフォーマットの二重特異性エンドグリン×ＣＤ２８抗体のバリアント（ＢｉＣｏ）を示す図である。一本鎖部分を、種々の長さのリンカーを使用して図に示す通りにＩｇＧ抗体の重鎖および軽鎖に融合させた。該ＢｉＣｏバリアントをＨｃ－Ｌ（Ｂ）、Ｈｃ＋Ｌ（Ｃ）、Ｌｃ－Ｌ（Ｄ）およびＬｃ＋Ｌ（Ｅ）と指定し、（Ｆ）はＣ末端側の一本鎖部分ではなくむしろＮ末端側のＦａｂ２部分としてそのＣＤ２８結合部を含有するＢｉＣｏバリアントを示す図である。さらなる情報については配列表を参照されたい。 図４は、ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現されたＣＤ２８への、前記の種々のＢｉＣｏバリアントの結合を示す図である。該バリアントの正常ヒトＴ細胞への結合は、各構築物とのＰＢＭＣのインキュベーションとそれに続くフローサイトメトリーによる解析後に測定した。 図５は、高および低エンドグリン発現を呈するＵ９３７およびＨＴ－２９標的細胞に対する前記ＢｉＣｏバリアントの共刺激活性をそれぞれ示す図である。単球除去（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｄｅｐｌｅｔｅｄ）ＰＢＭＣを、放射線を照射した標的細胞ならびに二重特異性Ｂ７Ｈ３×ＣＤ３構築物および４種のＢｉＣｏバリアントのうちの１種と共に（Ａ）および（Ｆ）の左上およびＸ軸にそれぞれ示した指示濃度でインキュベートした。３日間のインキュベーションの後、３Ｈチミジンの取込みを測定することでＴ細胞増殖を評価した。ＥおよびＪには、各標的細胞の非存在下での対照実験が示されている。これらの実験におけるｂｓＡｂＣＤ３およびＢｉＣｏの濃度は、それぞれ１μｇ／ｍＬおよび２μｇ／ｍＬとした。 図５－１の続きである。 図６は、高エンドグリン発現および検出不可能なエンドグリン発現を示すＵ９３７およびＨＥＫ２９３標的細胞に対する前記ＢｉＣｏバリアントの共刺激活性をそれぞれ示す図である。実験条件は、一定濃度の前記ｂｓＡｂＣＤ３および前記ＢｉＣｏ（それぞれ０，２μｇ／ｍＬおよび０，４μｇ／ｍＬ）を使用したことを除き、図５のものと同一とした。 図７は、前記ＢｉＣｏバリアントおよびその構築の際に使用した単一特異性の２価ＣＤ２８抗体の共刺激活性を示す図である。実験条件は図５のものと同一とした。抗体濃度は、前記ｂｓＡｂＣＤ３については０．２μｇ／ｍＬ、また全ての他の抗体については１．０μｇ／ｍＬとした。 図８は、免疫不全マウスモデルにおけるＢｉＣｏ１（Ｌｃ＋Ｌバリアント）によるｂｓＡｂＣＤ３の抗腫瘍活性の増強を示す図である。３×１０^６個のＨＴ－２９結腸がん細胞をＮＳＧマウスにｉ．ｖ．注射した。６時間後、ヒトＰＢＭＣ（２×１０^７個）を単独で、または２ｎＭのｂｓＡｂＣＤ３、５０ｎＭのＢｉＣｏ－１もしくは５０ｎＭのＢｉＣｏ－ｃｔｒ（単独で、または図に示す通りに組み合わせて）と共に静脈内に投与した。抗体による処置を４日目に繰り返した。８日目にマウスを犠牲にし、肺内のヒトＰＢＭＣおよび腫瘍細胞を酵素消化後にフローサイトメトリーにより定量化した。左パネルは肺内のがん細胞％を示し、右パネルはエフェクター細胞の増殖を示している。統計的分析はＭａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を利用して実施した（^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１）。ＢｉＣｏ－ｃｔｒはＬｃ＋Ｌフォーマットの非関連標的特異性（ＰＳＭＡ×ＣＤ２８）を有するＢｉＣｏである。 図９は、本発明のさらなる二重特異性抗体（「ＢｉＣｏ－２」）の結果を示す図であり、パネルＡは本発明の二重特異性抗体両方の構成を表しており、パネルＢは、ＰＳＭＡ×ＣＤ３特異性を有する二重特異性抗体であるＣＣ－１の様々な濃度（左側）と組み合わせた、Ｂ７Ｈ３×ＣＤ２８特異性を有するＢｉＣｏ（ＢｉＣｏ－２、Ｘ軸）の様々な濃度によるＴ細胞増殖を表している。該図面の右パネルは、ＢｉＣｏ－２を対照ＢｉＣｏ（ＰＳＭＡ結合部を非関連標的抗原（ＭＯＰＣ）を指向する抗体に置き換えたもの）に置き換えた同一の実験設定を利用したデータを提示したものである。異なる健常ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いた３回の実験のうちの代表的な１例を示す。 図９－１の続きである。 図１０は、本発明のさらなる二重特異性抗体（「ＢｉＣｏ－３」）の結果を示す図であり、パネルＡは本発明の二重特異性抗体両方の構成を図式的に表したものであり、該図面のパネルＢは、（ｉ）ヒトＦＡＰ（ｈＦＡＰトランスフェクト化Ｓｐ２／０細胞）もしくはＰＳＭＡ（ＬＮＣａＰ細胞）を発現する２つの異なる標的細胞、「Ｓｐ２／０ｈＦＡＰ」と指定した設定、または（ｉｉ）ＰＳＭＡ発現細胞およびコーティングした組換えＦＡＰタンパク質（「ｈＦＡＰ」）の存在下で、ＦＡＰ×ＣＤ２８特異性を有する一定濃度の２種のＢｉＣｏバリアント（ＢｉＣｏ－３、０．１μｇ／ｍＬ＝０．５ｎＭ）およびＰＳＭＡ×ＣＤ３特異性を有する低濃度の二重特異性抗体（ＣＣ－１、１ｎｇ／ｍＬ＝０．００５ｎＭ）により誘導されたＴ細胞増殖を表したものである。「ｍＦＡＰ」と表記されたバーは被覆マウスＦＡＰタンパク質の存在下での結果を表している。２つのＢｉＣｏバリアントを使用しており、１つはヒトＦＡＰとの排他的反応性を発揮する抗体（「Ｓｉｂｒｏ×９．３－８」）を含み、また1つはヒトおよびマウスＦＡＰに対する反応性を発揮する抗体（「ＭＦＰ５×９．３－８」）を含むことに留意されたい。該図面のパネルＣでは、汎（ｐａｎ）クローン性Ｔ細胞刺激因子ＰＨＡを用いるものを含めた、抗体の非存在下での様々な対照環境を検討している。 図１０－１の続きである。 図１１は、二重特異性共刺激性抗体フォーマットの比較を示す図である。パネルＡはこれらの実験に使用した構築物を表しており、パネルＢは、Ｂ７Ｈ３を発現する（ただしエンドグリンは発現しない）ＬＮＣａＰ細胞、Ｂ７Ｈ３×ＣＤ３特異性を有する二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）（ＣＣ－３）およびエンドグリン×ＣＤ２８特異性を有する様々なｂｓＡｂの存在下でのＴ細胞増殖を示している。Ｅｎｇ×ＣＤ２８ Ｌｃ＋Ｌは、例えば、図８に示した実験において使用し、かつＢｉＣｏ－１と指定したＢｉＣｏ分子を指す。これらの分子に共通するのは、ＣＤ２８抗体がＣ末端側の２価一本鎖部分として含有されているということである。ＣＤ２８×ＥｎｇＬｃ＋ＬおよびＣＤ２８×ＥｎｇＨｃ＋Ｌは、Ｎ末端側の２価ＣＤ２８抗体の軽鎖または重鎖に融合させたエンドグリン結合単一Ｃ末端２価一本鎖部分である、逆の配置を有する分子を指す（パネルＡ中の逆位ＢｉＣｏ－１（ＢｉＣｏ－１ ｉｎｖｅｒｔｅｄ））。パネルＣには、ポリクローナルＴ細胞マイトジェンＰＨＡを含むものを含めて評価した、抗体の非存在下での様々な対照環境が示されている。 図１１－１の続きである。 図１２は、本発明の改善されたｈｕ９．３．８．Ｖ１ ＣＤ２８抗体構築物の配列および表示された位置の変異を示す図である。 図１３は、本発明のＢｉＣｏ構築物の最適化を示す図である。ＣＤ２８ ｓｃＦｖの配列バリアントをタンパク質凝集について試験した。（ｉ）ＦｃＲ結合の減弱化および血清半減期の延長をもたらす新規Ｆｃ改変（ＬＡＬＡ－ＹＴＥ）ならびに（ｉｉ）凝集傾向および生成率を改善するための前記ＣＤ２８抗体のＶＨおよびＶＬドメイン中の５つの改変を含有する、オリジナルのＢｉＣｏ－１分子の改良版であるＢｉＣｏ－１ｏｐｔ（＝バリアント１）の特徴付けを示している。 図１４は、前記の旧型のＢｉＣｏ１分子と、前記の最適化バリアント１との共刺激活性の比較を示す図である。

配列を以下に示す：
表１：本発明の抗体の配列：

表２：エンドグリン抗体の配列：

本発明のある特定の態様および実施形態を、次に、例を挙げかつ本明細書中に記載した説明、図面および表を参照して例示する。本発明の方法、使用および他の態様のかかる具体例は単に代表的なものであって、本発明の範囲をかかる代表例のみに限定するとみなすべきではない。

実施例を以下に示す。
実施例１：ＣＤ２８およびエンドグリンへの結合特異性を有する二重特異性共刺激性（「ＢｉＣｏ」）抗体
本発明のために使用したＩｇＧベースの分子は、部分的に、一本鎖部分が正常なＩｇＧ抗体重鎖のＣ末端の後に融合されている、ＣｏｌｏｍａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎにより記載された構築物（ＩｇＧｓｃフォーマット）を基にしている［２２］。さらに、本発明者らは、２つの一本鎖を軽鎖のＣ末端に融合させた構築物を使用した。本発明者らはさらに、その融合部位に短いリンカーおよび長いリンカーを付加することで、ＣＤ２８結合部分の多様な親和性を可能にした（図３を参照されたい）。

１例として、図３に示す共刺激性構築物中のＴＡＡ抗体は、がん関連線維芽細胞上ならびに一部の白血病細胞上および、最も重要なことには、多くの固形腫瘍の血管系で発現される、エンドグリン（ＣＤ１０５）に対するものである［２３］。この試薬はその優れた親和性に基づいて新たに作製した抗体のパネルから選択した（図２）。使用したエンドグリンクローンを配列決定し、該配列を表２に示した。該クローンは、改善された結合親和性を特徴とする。

前記ＢｉＣｏを、Ｔ細胞活性化のための減弱化「第１シグナル」を与えるＴＣＲ／ＣＤ３複合体の特定のエピトープに対するＢ７Ｈ３×ＴＣＲ／ＣＤ３ ｂｓＡｂ（ｂｓＡｂＣＤ３）と組み合わせて評価した。これは大きくＣＤ２８に依存する活性化をもたらし、またその結果として、上記の組み合わせの特異性の増大をもたらした。

前記抗体を、ヒト単球除去ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）培養物と、エンドグリンの（ｉ）高い、または（ｉｉ）低い、または（ｉｉｉ）検出不可能な発現を呈した放射線照射腫瘍標的細胞との共培養物において試験した。単球除去ＰＢＭＣは、活性化された単球系統の細胞上に発現されるエンドグリンへの前記ＢｉＣｏバリアントの結合を阻止するために使用した。

１回目の実験において、全ＢｉＣｏバリアントが、標的細胞に限定した形でＰＢＭＣ培養物中のＴ細胞のｂｓＡｂＣＤ３誘導性の活性化を大幅に増強したことが示された。やや高い抗体濃度における標的細胞への限定が、（ｉ）標的細胞の非存在下、またはより一層具体的には（ｉｉ）該ＢｉＣｏの標的抗原であるエンドグリンを欠くが該ｂｓＡｂＣＤ３の標的抗原であるＢ７Ｈ３は発現する標的細胞の存在下、での活性の欠損により実証された。重要なことに、これらの実験において前記２つのｂｓＡｂの併用のみがＴ細胞活性化を効果的に誘導することが明確に実証され、従ってＴ細胞活性化は、この実証された標的細胞への限定によれば、２つの標的抗原の存在に依存している。前記ｂｓＡｂＣＤ３も前記ＢｉＣｏのいずれも、単独では活性を発揮しなかった。

２回目の実験においては、標的細胞の存在下で非発現標的抗原（フィブロネクチンのエクストラドメインＢ、ＥＤＢ）を指向するＢｉＣｏ分子は共刺激活性を呈示しないことも示されている。逆に、単一特異性の２価ＣＤ２８抗体（前記ＢｉＣｏ構築物中にＣ末端一本鎖部分として存在）は、該標的細胞上のいずれか特定の抗原の発現にかかわらず顕著な共刺激活性を発揮する。

従って、上記で実証された標的細胞への限定は予想外である。これは、ＣＤ２８結合部をＣ末端一本鎖部分ではなくむしろＮ末端Ｆａｂ２部分として含有する、特定のエンドグリンターゲティングＢｉＣｏバリアントであるＨｃ＋Ｌの非限定共刺激活性により最も顕著に例証される（図３Ｆおよび７を参照されたい）。

最後に、前記ＢｉＣｏバリアントＬｃ＋Ｌが、ヒトＰＢＭＣを養子移入した免疫不全マウスにおいてｂｓＡｂＣＤ３の抗腫瘍活性を大幅に増強することが実証された（図８）。

実施例２：ＣＤ２８およびＢ７Ｈ３への結合特異性を有する二重特異性共刺激性（「ＢｉＣｏ－２」）抗体
ＢｉＣｏ－２抗体の構成を図９Ａに示す。該ＢｉＣｏ－２構築物のＢ７Ｈ３への結合機能性は、ＷＯ２０２１／０９９３４７（その全内容が参照により本明細書中に組み込まれるものとする）に開示されている抗体クローン７Ｃ４に由来するものである。二重特異性ＣＣ－１構築物はＷＯ／２０１７／１２１９０５（その全内容が参照により本明細書中に組み込まれるものとする）に記載されている。

単球除去ＰＢＭＣ（２×１０^５個／ウェル）を、９６ウェル組織培養プレート中で標的抗原ＰＳＭＡおよびＢ７Ｈ３を発現する放射線照射ＬＮＣａＰ前立腺がん細胞（０,５×１０^５個／ウェル）ならびに指示抗体濃度と共にインキュベートした。２日後に３Ｈチミジン（０．５μＣｉ／ウェル）を添加し、さらに２０時間後に該プレートから採取し、細胞に取り込まれた放射能をＭｉｃｒｏ Ｂｅｔａシンチレーションカウンターを使用して測定した。

興味深いことに、前記ＢｉＣｏ－２構築物はＣＣ－１により誘導されるＴ細胞増殖をかなり増強するが、非関連標的抗原を指向する以外は同一の対照抗体は増強しない。該ＢｉＣｏ－２の効果は低いＣＣ－１濃度（１ｎｇ／ｍＬ）で最も顕著であり、その際、増殖はＢｉＣｏ－１にほぼ完全に依存している。より高いＣＣ－１濃度では、有意なＴ細胞増殖がＣＣ－１のみにより誘導される。

実施例３：ＣＤ２８および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＢ）への結合特異性を有するさらなる二重特異性共刺激性（「ＢｉＣｏ－３」）抗体
ＢｉＣｏ－３抗体の構成を図１０Ａに示す。該ＢｉＣｏ－３構築物のＦＡＢへの結合機能性は、ｈＦＡＢに対する抗体クローンＳｉｂｒｏ×９．３－８およびｍＦＡＢに対するＭＦＰ５×９．３－に由来するものである。二重特異性ＣＣ－１構築物は、ＷＯ／２０１７／１２１９０５（その全内容が参照により本明細書中に組み込まれるものとする）に記載されている。

ヒト単球除去ＰＢＭＣ（１０^５個／ウェル）を、０．１μg／ｍＬのＦＡＰ×ＣＤ２８バリアントおよび１ｎｇ／ｍＬのＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体と共に、ヒトＦＡＰをトランスフェクトした放射線照射Ｓｐ２／０細胞（０．５×１０^５個／ウェル）およびＰＳＭＡを発現する放射線照射ヒトＬＮＣａＰ細胞（０．５×１０^５個／ウェル）を合わせてインキュベートした。あるいは、放射線照射ＬＮＣａＰ細胞のみを、１μg／ｍＬの組換えヒトまたはマウスＦＡＰで予めコーティングしたウェルに使用した。２日後に３Ｈチミジン（０．５μＣｉ／ウェル）を添加し、さらに２０時間後にプレートから採取し、細胞に取り込まれた放射能をＭｉｃｒｏ Ｂｅｔａシンチレーションカウンターを使用して測定した。結果を図１０ＢおよびＣに示す。

結果は、ＦＡＰ×ＣＤ２８特異性を有するＢｉＣｏ分子の添加が、たとえ異なる標的抗原が別々の細胞上に、またはコーティングされたタンパク質として提示されるとしても、低濃度のＣＣ－１により誘導されるＴ細胞増殖を顕著かつ特異的に増強することを示している。

実施例４：標的細胞への限定は、１つの二重特異性共刺激性抗体構築物中にＦ（ａｂ）標的細胞特異的抗体と組み合わせたｓｃＦｖ抗ＣＤ２８を有する構築物によってのみ可能である
単球除去ＰＢＭＣ（１０^５個／ウェル）を、９６ウェル組織培養プレート中で放射線照射ＬＮＣａＰ細胞（０．５×１０^５個／ウェル）、ＣＣ－３（１０ｎｇ／ｍＬ）および指示濃度の二重特異性共刺激物質と共にインキュベートした。２日後に３Ｈチミジン（０．５μＣｉ／ウェル）を添加し、さらに２０時間後に該プレートから採取し、細胞に取り込まれた放射能をＭｉｃｒｏ Ｂｅｔａシンチレーションカウンターを使用して測定した。結果を図１１に示す。

天然のＮ末端ＣＤ２８結合部を有する逆位分子は、それらが結合しうるエンドグリンが存在しないにもかかわらず、ＣＣ－３と合わせると著明な共刺激を発揮する。ＢｉＣｏ－１の場合、このタイプの非特異的かつ望ましくない共刺激ははるかに目立たず、非常に高い抗体濃度でのみ検出される。この結果は、本明細書中に開示したこのＢｉＣｏ構成が他の既知二重特異性フォーマットより有利であることを示している。

実施例５：ＢｉＣｏ－１配列の最適化
図１２に列挙したＣＤ２８ ｓｃＦｖ（重軽鎖配列）に対する配列改変を導入し、ＣＨＯ細胞にその各構築物をトランスフェクトし、さらにタンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００カラムを使用してプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した（ＡおよびＢ）。Ｃではオリジナルのタンパク質および改変タンパク質の凝集塊％および生成速度を比較した。

図１３の結果は、最適化された分子がより低い凝集傾向と改善された生成率を示すことを示している。

前記の新規ＢｉＣｏバリアントを前記オリジナル分子と比較するために、単球除去ＰＢＭＣを、Ｂ７Ｈ３およびエンドグリンを発現する放射線照射Ｕ９３７細胞、二重特異性Ｂ７Ｈ３×ＣＤ３抗体ならびにエンドグリン×ＣＤ２８特異性を有するＢｉＣｏ－１抗体の旧型（ｏｌｄ）および最適化バリアント（ｖ１＝ＨＶ）と共にインキュベートした。２日後に３Ｈチミジン（０．５μＣｉ／ウェル）を添加し、さらに２０時間後にプレートから採取し、細胞に取り込まれた放射能をＭｉｃｒｏ Ｂｅｔａシンチレーションカウンターを使用して測定した。

図１４に示す結果は、前記の２つのＢｉＣｏ－１バリアントにより誘導されたＴ細胞増殖は識別不能であったことを示している。従って該配列バリアントは、同等の生物学的活性を有するが凝集しにくい。

参考文献
以下に参考文献を示す：

Claims (30)

1. 対象における疾患の処置への使用のための、少なくとも２つの第１抗原結合部位と少なくとも１つの第２抗原結合部位とを含む、少なくとも二重特異性である結合分子であって、ここで
   （ｉ）該少なくとも２つの第１抗原結合部位は、Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８のエピトープに特異的に結合する能力があり、かつ各々が抗体の抗原結合フラグメントとして提供されかつＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはＩｇＧではなく、および
   （ｉｉ）該少なくとも１つの第２抗原結合部位は、該対象において該疾患に関連する細胞上または細胞内で発現される抗原標的タンパク質のエピトープに結合する能力があり、かつここで該少なくとも１つの第２抗原結合部位が抗体または抗体様分子に由来するものであり、かつＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはＩｇＧを含み、
   ここで該処置が該対象への該結合分子の投与を含む、該結合分子。
2. 前記少なくとも２つの第１抗原結合部位が各々一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として提供される、請求項１記載の使用のための結合分子。
3. 前記結合分子が、前記抗原標的タンパク質を発現する第２細胞の非存在下でＣＤ２８陽性免疫細胞（例えばＴ細胞）である第１細胞と接触した場合に、ＣＤ２８シグナル伝達を誘導しない、請求項１または２記載の使用のための結合分子。
4. 前記抗原標的タンパク質が、増殖性疾患に関連する細胞上に発現されるタンパク質、病原性生物に関連するタンパク質または他の分子から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の使用のための結合分子。
5. 前記抗原標的タンパク質がエンドグリン、ＦＡＢまたはＢ７Ｈ２である、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のための結合分子。
6. 前記少なくとも２つの第１抗原結合部位の各々が、前記少なくとも１つの第２抗原結合部位と直接連結されている、請求項１～５のいずれか１項に記載の使用のための結合分子。
7. 前記結合分子が同数の第１および第２抗原結合部位を含み、かつここで少なくとも２つの第１抗原結合部位の一方が、少なくとも２つの第２抗原結合部位の一方の軽鎖（または代替的に重鎖）に末端で（ペプチド結合を介して）連結されており、かつここで、該少なくとも２つの第１抗原結合部位の他方が、該少なくとも２つの第２抗原結合部位の他方の軽鎖（または代替的に重鎖）に末端で（ペプチド結合を介して）連結されている、請求項６記載の使用のための結合分子。
8. 少なくとも２つの第２抗原結合部位を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用のための結合分子。
9. 前記結合分子が正確に２つ、および２つ以下の第１抗原結合部位と、正確に１つまたは２つ、および１つまたは２つ以下の第２抗原結合部位とを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用のための結合分子。
10. 前記少なくとも２つの第１抗原結合部位がＣＤ２８上の同一エピトープに結合する、請求項１～９のいずれか１項に記載の使用のための結合分子。
11. 前記少なくとも２つの第１抗原結合部位のうちの少なくとも１つと、前記少なくとも１つの第２抗原結合部位とが、１つ以上の抗体由来ヒト定常ドメインを含むタンパク質リンカーにより互いに結合している、請求項１～１０のいずれか１項に記載の使用のための結合分子。
12. 前記少なくとも２つの第１抗原結合部位が抗体重鎖配列および抗体軽鎖配列を含み、各々が配列番号２、３、４、５、７、８または９に示す抗体配列中に含まれるＣ末端結合部位に由来するものであり、かつ該Ｃ末端結合部位と同一の抗原に競合的に結合する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の使用のための結合分子。
13. 前記少なくとも１つの第２抗原結合部位が抗体重鎖配列および抗体軽鎖配列を含み、各々が配列番号１および２からなる抗体中に含まれるＮ末端結合部位に由来するものであり、かつ該Ｎ末端結合部位と同一の抗原に競合的に結合する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の使用のための結合分子。
14. 前記結合分子が免疫細胞および前記疾患に関連する細胞に特異的に結合し、ここで該免疫細胞が細胞媒介性免疫応答に関与する免疫細胞である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の使用のための結合分子。
15. 前記免疫細胞がＣＤ２８およびＣＤ３およびＴＣＲを発現する細胞である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の使用のための結合分子。
16. 前記対象が、ＣＤ３／ＴＣＲシグナル伝達が処置により、または疾患関連抗原に応答して内因的に活性化されることを特徴とする、請求項１～１５のいずれか１項に記載の使用のための結合分子。
17. 前記処置が、前記疾患に関連する細胞に対する免疫細胞の刺激および／または活性化をさらに含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の使用のための結合分子。
18. ２つの抗体重鎖配列と、２つの抗体軽鎖配列とを含み、かつここで
    （ｉ）前記少なくとも２つの第１抗原結合部位の一方が該２つの抗体軽鎖配列の一方のＣ末端に共有結合的に連結されており、かつ該少なくとも２つの第１抗原結合部位の他方が該２つの抗体軽鎖配列の他方のＣ末端に共有結合的に連結されているか、または
    （ｉｉ）該少なくとも２つの第１抗原結合部位の一方が該２つの抗体重鎖配列の一方のＣ末端に共有結合的に連結されており、かつ該少なくとも２つの第１抗原結合部位の他方が該２つの抗体重鎖配列の他方のＣ末端に共有結合的に連結されている、
    請求項１～１７のいずれか１項に記載の使用のための結合分子。
19. 前記結合部位がペプチドリンカーなしで、または５個以下のアミノ酸を有する短いペプチドリンカーにより、または少なくとも６個、好ましくは最大５０個のアミノ酸を有する長いペプチドリンカーを介して連結され、ここでさらに好ましくは該ペプチドリンカーが（ＧＧＧＧＳ）_ｎリンカーであり、かつｎが２以上である、請求項１８記載の使用のための結合分子。
20. 前記処置が、（ｉ）二重特異性であり、かつＣＤ３および／もしくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）への結合を介するなどしてＴ細胞に特異的に結合し該Ｔ細胞を活性化する能力があるさらなる結合分子、またはＴ細胞活性化のためのシグナルを提供もしくは増強する能力がある任意の他の試薬、例えば（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの抗原受容体（該受容体は前記抗原標的タンパク質に特異的に結合する能力がある）を発現する遺伝子改変免疫細胞（異種もしくは自己Ｔ細胞）、または（ｉｉｉ）感染因子もしくはがん細胞由来の抗原構造（ＴＡＡもしくはＴＳＡ）を提供するワクチン、または（ｉｖ）ＰＤ１などのチェックポイント分子を介して抑制性「第２シグナル」を遮断する試薬、の連続または同時投与を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の使用のための結合分子。
21. 前記さらなる結合分子が少なくとも二重特異性であり、かつ少なくとも１つの第３抗原結合部位と少なくとも１つの第４抗原結合部位とを含み、ここで
    （ｉ）該少なくとも１つの第３抗原結合部位は、ＣＤ３および／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）（ＣＤ３／ＴＣＲ）に特異的に結合する能力があり、かつ
    （ｉｉ）該少なくとも１つの第４抗原結合部位は、前記対象において前記疾患に関連する細胞上または細胞内で発現されるさらなる抗原標的タンパク質のエピトープに特異的に結合する能力がある、
    請求項２０記載の使用のための結合分子。
22. 前記抗原標的タンパク質および前記さらなる抗原標的タンパク質が（ｉ）同一であるか、または（ｉｉ）異なりはするが互いに空間的に密に近接している、例えば前記疾患に関連する同一細胞上に発現されるかもしくは同一疾患組織に位置する、例えば同一腫瘍環境で発現される、請求項２１記載の使用のための結合分子。
23. 前記疾患が、好ましくはがん（例えば肺がん、乳がん、大腸がん、胃がん、肝細胞がん、膵臓がん、卵巣がん、黒色腫、骨髄腫、腎臓がん、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、膀胱がんまたは前立腺がん）などのがん疾患から選択される増殖性疾患であって、特に黒色腫、肺がん（例えば非小細胞肺がん）、膀胱がん（例えば尿路上皮がん）、腎臓がん（例えば腎細胞がん）、頭頸部がん（例えば該頭頸部の扁平上皮がん）およびホジキンリンパ腫からなるリストより選択される増殖性疾患であり、好ましくは、該増殖性疾患は黒色腫、または肺がん（例えば非小細胞肺がん）、好ましくは前記標的抗原タンパク質の発現に関して陽性のがんである、請求項１～２２のいずれか１項に記載の使用のための結合分子。
24. 単離された結合分子であって、該単離された結合分子が、請求項１～２３のいずれか1項に記載の結合分子である、該単離された結合分子。
25. 請求項２４記載の単離された結合分子をコードする、単離された核酸。
26. 請求項２４記載の単離された結合分子または請求項２５記載の単離された核酸を含む、組換え宿主細胞。
27. 請求項２４記載の単離された結合分子、請求項２５記載の単離された核酸、請求項２６記載の組換え宿主細胞を、製薬上許容可能な担体および／または賦形剤と共に含む、医薬組成物。
28. 請求項２０または２１記載の単離されたさらなる結合分子をさらに含む、請求項２７記載の医薬組成物。
29. パッケージまたは医薬組成物のキットであって、該キットが別々の容器に（ｉ）請求項１～２８のいずれか1項に記載の単離された結合分子、該単離された結合分子をコードする単離された核酸、および／またはかかる核酸もしくは単離された結合分子を含む組換え宿主細胞、ならびに（ｉｉ）請求項１～２８のいずれか1項に記載の単離されたさらなる結合分子、該単離されたさらなる結合分子をコードする単離された核酸、および／またはかかる核酸もしくは単離されたさらなる結合分子を含む組換え宿主細胞、を含む、該キット。
30. 医薬への使用のための化合物または組成物であって、該化合物または組成物が、請求項１～２９のいずれか1項に記載の結合分子、請求項１～２９のいずれか1項に記載の単離された核酸、請求項１～２９のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞、請求項１～２９のいずれか1項に記載の医薬組成物、または請求項１～２９のいずれか1項に記載のキットを含む、該化合物または該組成物。

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