KR20230133837A - 조작된 키메라 융합 단백질 조성물 및 그의 사용 방법 - Google Patents

조작된 키메라 융합 단백질 조성물 및 그의 사용 방법 Download PDF

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KR20230133837A
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다니엘 게츠
유시아오 왕
브루스 주니어 맥크리디
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마이얼로이드 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

표적 세포, 예컨대, 이환된 세포 상의 표면 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인을 갖는 키메라 융합 단백질을 발현하는 조작된 세포, 예컨대, 조작된 골수 세포를 제조하고, 사용하기 위한 조성물 및 방법.

Description

조작된 키메라 융합 단백질 조성물 및 그의 사용 방법
상호 참조
본 출원은 2020년 11월 4일 출원된 미국 가출원 제63/109,445호; 2021년 10월 1일 출원된 미국 가출원 제63/251,400호; 2021년 6월 4일 출원된 미국 가출원 제63/196,994호; 및 2021년 3월 17일 출원된 미국 가출원 제63/162,205호의 이익을 주장하고; 이들은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열목록을 함유하며, 그의 전문이 본원에서 참조로 포함된다.　2021년 12월 8일 작성된 상기 ASCII 카피는 명칭은 56371-712_601_SL.txt이고, 크기는 84,863 바이트이다.
배경
세포 면역요법은 치료하기 어려운 질환, 예컨대, 암, 및 지속적인 감염, 및 다른 형태의 치료에 불응하는 특정 질환을 퇴치하기 위한 유망한 신기술이다. CAR-T 세포의 발견 및 면역요법에서의 그의 잠재적 사용으로 중대한 돌파구가 마련되었다. CAR-T 세포는 T 세포를 특정 이환된 세포, 예컨대, 암 세포로 표적화하는 것을 돕고, 사용된 세포내 도메인 및 공발현된 면역억제 사이토카인에 따라 표적 암 세포를 살해하기 위한 세포독성 반응, 또는 면역억제 및/또는 내성을 유도할 수 있는 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 림프구이다. 그러나, 그 과정에서 몇 가지 한계가 CAR-T 세포에 대한 진전을 늦추고, 임상 시험에서 그의 가능성을 약화시킨다.
CAR-T 세포의 한계를 이해하는 것은 기술을 사용하고, 더 우수한 면역요법 모델을 향한 혁신을 지속하는 열쇠이다. 구체적으로, T 세포 악성종양에서, CAR-T 세포는 중대한 문제점에 직면하는 것으로 보인다. CAR-T 세포 및 악성 T 세포는 대다수의 T 세포 림프종(TCL: T cell lymphoma)에서 표면 항원을 공유하므로, CAR-T 세포는 암 세포와 동일한 방식으로 세포독성에 노출된다. 일부 경우, CAR-T 생성물은 악성 T 세포에 의해 오염될 수 있다. 추가로, T 세포 무형성증은 CAR-T 세포의 지속이 연장됨에 따라 잠재적인 문제가 된다. 다른 한계는 CAR-T 세포가 고형 종양 내로 투과하는 능력 부족, 및 그의 항종양 잠재능을 하향조절하는 작용을 하는 강력한 종양 미세환경을 포함한다. CAR-T 세포 기능 또한 내인성 T 세포 불활성화 및 고갈을 유발하는 면역억제 종양 미세환경(TME: tumor microenvironment)에 의해 부정적인 영향을 받는다.
대식세포를 비롯한, 골수 세포는 골수 계통으로부터 유래하고, 선천 면역계에 속하는 세포이다. 이 세포들은 혈액 내로 빠져나가 조직 내로 이동할 수 있는 골수 줄기 세포로부터 유래한다. 이들의 주요 기능들 중 일부는 식세포작용, T 세포 반응 성화, 및 세포 잔해물 및 세포외 매트릭스의 제거를 포함한다. 이들은 또한 항상성 유지, 및 염증의 시작과 해소에 있어서 중요한 역할을 한다. 더욱이, 골수 세포는 그가 주변 미세환경으로부터 받는 자극 타입에 따라 염증유발성 반응부터 항염증성 반응까지 상이한 반응을 나타낼 수 있는, 대식세포를 비롯한, 다수의 하류 세포들로 분화할 수 있다. 추가로, 조직 대식세포는 CDT 이펙터 세포, NK 세포 및 T 조절 세포를 비롯한, 다른 면역 세포 유형에 대해 넓은 조절 및 활성화 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 대식세포는 악성 종양에서 주요 면역 침윤물인 것으로 나타났고, 이펙터 면역 침윤 및 기능에 대해 광범위한 면역억제 영향을 발휘하는 것으로 밝혀졌다.
골수 세포는 단핵구, 수지상 세포, 조직 대식세포 및 과립구를 포함하는 면역계의 주요 세포 구획이다. 골수 세포의 세포 개체발생, 활성화, 분화 및 조직 특이적 기능의 모델은 놀라운 결과를 제공하면서 지난 몇 년 동안 재검토되었다. 그러나, 항상성 및 질환 동안 그의 엄청난 가소성 및 이질성은 전혀 이해되지 않았다. 골수 세포가 식세포작용 및 T 세포를 활성화시키는 그의 능력, 가용성 인자 생산을 포함하는 많은 기능들을 갖지만, 치료적 용도를 위한 이 기능의 사용은 여전히 이해하기 어렵다. 따라서, 개선된 치료제의 개발을 위해 T 세포 악성종양을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다른 세포 유형을 사용하는 더 새로운 방법을 찾고 있다.
생체내 또는 생체외 조작된 골수 세포도 생체내에서 수명이 짧을 수 있고, 표현형상 다양할 수 있고, 감수성일 수 있고, 가소성을 가질 수 있고, 종종 시험관내에서 조작하기 어려운 것으로 발견된다. 예를 들어, 단핵구에서의 외인성 유전자 발현은 비조혈 세포에서의 외인성 유전자 발현에 비해 어렵다. 골수 세포(예컨대, 단핵구/대식세포)의 형질감염과 연관된 상당한 기술적 어려움이 있다. 전문적인 식세포로서 골수 세포, 예컨대, 단핵구/대식세포는 핵산 온전성을 파괴할 수 있고, 이 세포 내로의 유전자 전달을 비효율적인 프로세스로 만들 수 있는 많은 강력한 분해 효소들을 포함한다. 이는 면역 또는 염증 자극에 노출된 후, 그의 생리적 성질에 있어서 현저한 변화를 겪는 활성화된 대식세포의 경우에 특히 그러하다. 대식세포가 일반적으로 분열하지 않는 말기 세포이기 때문에, 이 세포의 바이러스 형질도입은 저해되는 바; 복제 게놈 내로의 통합에 의존하는 벡터들 중 일부는 제한된 성공을 거두었다. 추가로, 대식세포는 "위험 신호"에 잘 반응하므로, 유전자 전달에 사용된 원래의 바이러스 벡터 중 몇몇은 이 세포에서 강력한 항바이러스 반응을 유도함으로써, 이 벡터들을 유전자 전달에 부적합하게 만든다.
요약
골수 세포의 다양한 기능성은 이 세포를, 많은 치료 효과를 갖도록 조작될 수 있는 이상적인 세포 요법 후보물질로 만든다. 본 개시내용은 면역계의 골수 세포(예컨대, CD14+ 세포), 특히, 식세포성 세포를 사용한 면역요법에 관한 것이다. 골수 세포를 사용하여 다수의 치료적 적응증들을 예상할 수 있다. 예를 들어, 골수 세포 면역요법은 암, 자가면역, 섬유성 질환 및 감염에 있어서 매우 중요할 수 있다. 본 개시내용은 면역계의 식세포성 세포, 특히 대식세포를 포함하는 골수 세포를 사용하는 면역요법에 관한 것이다. 본원에 개시된 본 발명의 목적은 치료적 용도를 위해 골수 세포의 이 기능들 중 하나 이상의 기능을 사용하는 것이다. 예를 들어, 본원에 개시된 본 발명의 목적은 치료적 용도를 위해 조작된 골수 세포를 비롯한 골수 세포의 식세포 활성을 사용하는 것이다. 예를 들어, 본원에 개시된 본 발명의 목적은 T 세포 활성화를 촉진시키기 위해 조작된 골수 세포를 비롯한 골수 세포의 능력을 사용하는 것이다. 예를 들어, 본원에 개시된 본 발명의 목적은 살종양 분자의 분비를 촉진시키기 위해 조작된 골수 세포를 비롯한 골수 세포의 능력을 사용하는 것이다. 예를 들어, 본원에 개시된 본 발명의 목적은 면역 세포 및 분자의 모집 및 수송을 촉진시키기 위해 조작된 골수 세포를 비롯한 골수 세포의 능력을 사용하는 것이다. 본 개시내용은 추가로 세포의 분화 능력, 성숙화 잠재능 및/또는 그의 가소성을 손상시키지 않으면서, 골수 세포의 기능적 측면을 증강시킬 목적으로, 골수 세포를 성공적으로 형질감염, 또는 형질도입할 수 있거나, 또는 다르게는 골수 세포에서 유전자 변형을 유도할 수 있는 혁신적인 방법 및 조성물을 제공한다. 골수 세포는 생체내 체내에 상주하거나, 또는 생체외에서 조작될 수 있다.
본 개시내용은 생체내 또는 생체외에서 골수 세포를 프로그래밍하고, 이환된 세포, 예컨대, 암 세포 및 감염된 세포를 직접적 및/또는 간접적으로 공격하고, 살해할 수 있는(ATAK: attack and kill) 조작된 골수 세포(예컨대, CD14+ 세포), 예컨대, 대식세포 또는 다른 식세포성 세포를 제조하고, 사용하는 것을 포함한다. 조작된 골수 세포, 예컨대, 대식세포 및 다른 식세포성 세포는 예를 들어, 생체외에서 재조합 핵산 기술, 합성 핵산, 유전자 편집 기법(예컨대, CRISPR), 형질도입(예컨대, 바이러스 구성물의 사용), 전기천공 또는 뉴클레오펙션을 이용하여, 또는 생체내에서 LNP 기술을 포함하나, 이에 제한되지 않는, mRNA 전달 기술을 이용하여, 질환 연관 항원(예컨대, 암 항원)에 특이적인 세포외 결합 도메인을 가진 키메라 융합 단백질(CFP: chimeric fusion protein)을 코딩하는 핵산 서열(예컨대, mRNA, 플라스미드, 바이러스 구성물)을 세포 내로 도입함으로써 제조될 수 있다. 골수 세포는 넓고, 다양한 범위의 활성을 갖도록 조작될 수 있다는 것을 확인하였다. 예를 들어, 골수 세포는 항원 결합 도메인을 함유하는 키메라 융합 단백질(CFP)을 발현하여 넓고, 다양한 범위의 활성을 갖도록 조작될 수 있다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 골수 세포는 이 세포가 CFP와 표적 세포 상의 항원에 결합할 때 표적 세포의 증가된 식세포작용을 나타내도록 증강된 식세포 활성을 갖도록 조작될 수 있는 것을 발견하였다. 골수 세포는 이 세포가 CFP와 표적 세포 상의 항원에 결합할 때 T 세포, 예컨대, 종양 미세환경 내의 T 세포의 활성화를 촉진시키도록 T 세포 활성화를 촉진시키도록 조작될 수 있다는 것도 확인하였다. 골수 세포는 이 세포가 CFP와 표적 세포 상의 항원에 결합할 때 근처 세포로부터의 살종양 분자의 분비를 촉진시키도록 살종양 분자의 분비를 촉진시키도록 조작될 수 있다. 골수 세포는 이 세포가 CFP와 표적 세포 상의 항원에 결합할 때 면역 세포 및 분자를 표적 세포 또는 종양 미세환경으로 모집하고, 수송하는 것을 촉진시키도록 면역 세포 및 분자의 모집 및 수송을 촉진시키도록 조작될 수 있다.
본 개시내용은 조작된 골수 세포가 고형 종양으로 용이하게 모집된다는 점; 조작가능한 생존 기간을 가짐으로써, 무형성증 및 면역결핍을 초래하는 지속 연장의 위험을 저하시킨다는 점; 골수 세포가 T 세포에 의해 오염될 수 없다는 점; 적어도 골수 세포가 악성 T 세포와 동일한 항원을 발현하지 않기 때문에, 골수 세포가 동족살해를 피할 수 있다는 점; 및 골수 세포가 사용될 수 있는 수많은 항종양 기능들을 가진다는 점을 포함하는, 조작된 골수 세포가 CAR-T 세포의 한계들 중 적어도 일부를 극복한다는 중요한 발견에 기반한다. 일부 측면에서, 조작된 골수 유래 세포는 이환된 세포를 표적화하고, 파괴하는 더 안전한 면역요법 수단일 수 있다.
더욱이, 대식세포와 같은 골수 세포는 종양 환경(TME)에서 편재적으로 발견되고, 특히 일부 종양 타입에서 가장 풍부한 세포이다. 대식세포와 같은 골수 세포는 면역계에서의 그들의 역할의 일부로서 이환된 세포를 제거하는 데 천연적으로 인게이징한다. 본 발명은 또한 구체적으로 이환된 세포 뿐만 아니라, 전달 페이로드, 예컨대, 항원 및 사이토카인도 표적화하고, 살해하고, 직접적 및/또는 간접적으로 제거하기 위해 골수 세포 기능을 사용하는 것에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한 조작된 골수 세포가 내인성 T 세포 활성을 촉진시킬 수 있다는 중요한 발견을 기반으로 한다. 본 개시내용은 골수 세포의 프로그래밍을 추가로 포함한다. 조작된 골수 세포는 예를 들어, 생체외에서 재조합 핵산 기술, 합성 핵산, 유전자 편집 기법(예컨대, CRISPR), 형질도입(예컨대, 바이러스 구성물의 사용), 전기천공 또는 뉴클레오펙션을 이용하여, 또는 생체내에서 LNP 기술을 포함하나, 이에 제한되지 않는, mRNA 전달 기술을 이용하여, 질환 연관 항원(예컨대, 암 항원)에 특이적인 세포외 결합 도메인을 가진 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 핵산 서열(예컨대, mRNA, 플라스미드, 바이러스 구성물)을 세포 내로 도입하는 생체내 도입을 통해 달성될 수 있다.
조작된 골수 세포도 생체내에서 수명이 짧을 수 있고, 표현형상 다양할 수 있고, 감수성일 수 있고, 가소성을 가질 수 있고, 종종 시험관내에서 조작하기 어려운 것으로 발견된다. 예를 들어, 단핵구에서의 외인성 유전자 발현은 비조혈 세포에서의 외인성 유전자 발현에 비해 어렵다. 골수 세포(예컨대, 단핵구/대식세포)의 형질감염과 연관된 상당한 기술적 어려움이 있다. 전문적인 식세포로서 골수 세포, 예컨대, 단핵구/대식세포는 핵산 온전성을 파괴할 수 있고, 이 세포 내로의 유전자 전달을 비효율적인 프로세스로 만들 수 있는 많은 강력한 분해 효소들을 포함한다. 이는 면역 또는 염증 자극에 노출된 후, 그의 생리적 성질에 있어서 현저한 변화를 겪는 활성화된 대식세포의 경우에 특히 그러하다. 대식세포가 일반적으로 분열하지 않는 말기 세포이기 때문에, 이 세포의 바이러스 형질도입은 저해되는 바; 복제 게놈 내로의 통합에 의존하는 벡터들 중 일부는 제한된 성공을 거두었다. 추가로, 대식세포는 "위험 신호"에 잘 반응하므로, 유전자 전달에 사용된 원래의 바이러스 벡터 중 몇몇은 이 세포에서 강력한 항바이러스 반응을 유도함으로써, 이 벡터들을 유전자 전달에 부적합하게 만든다. 본 개시내용은 추가로 세포의 분화 능력, 성숙화 잠재능 및/또는 그의 가소성을 손상시키지 않으면서, 골수 세포의 기능적 측면을 증강시킬 목적으로, 골수 세포를 성공적으로 형질감염, 또는 형질도입할 수 있거나, 또는 다르게는 골수 세포에서 유전자 변형을 유도할 수 있는 혁신적인 방법 및 조성물을 제공한다.
본원에서는 이환된 세포, 예를 들어, 암 세포에서 발현되는 특정 항원에 결합하도록 지시된 치료제를 제공하고, 치료제(예컨대, 표적화된 "결합제)의, 이환된 이환된 세포 상의 표적 항원에의 결합이 표적 세포의 파괴 프로세스를 개시한다. 본원에 기술된 치료제는 적합한 세포, 예컨대, 포유동물 세포, 예컨대, 인간 세포에서 발현될 수 있는 재조합 핵산일 수 있으며, 여기서, 적합한 세포는 골수 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 치료제는 표적 세포 상의 표적 항원에 결합할 수 있는 재조합 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 치료제는 세포, 예를 들어, 골수 세포일 수 있고, 여기서, 골수 세포는 본원에 기술된 재조합 핵산을 포함하고/거나, 본원에 기술된 재조합 단백질을 발현하고, 이로써, 골수 세포는 세포의 표면 상에 표적 항원을 발현하는 이환된 세포로 표적화될 수 있고; 골수 세포는 이환된 세포를 용해시키거나, 포식한다.
일부 실시양태에서, 치료제는 본원에 기술된 것과 같은 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 골수 전구 세포이다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 미분화 및/또는 비분극화 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 식세포성 세포이다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 CD14+/CD16- 세포이다.
일부 실시양태에서, 치료제는 재조합 또는 조작된 핵산이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 RNA이다.
일부 실시양태에서, 조작된 핵산은 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 또는 조작된 핵산인 치료제는 키메라 융합 수용체 단백질(CFP)을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 예를 들어, 단백질의 한쪽 말단에 위치하는 표적 결합제 도메인으로 이환된 세포 상의 표적 항원과 결합하고; 이펙터 세포, 예컨대, 골수 세포의 구조 상의 분자에 결합하는 적어도 또 다른 도메인으로 이펙터 세포, 예컨대, 이펙터 골수 세포, 예컨대, 활성 식세포성 세포와 결합할 수 있는 "인게이저"로도 또한 공지된 세포외 또는 가용성 단백질을 코딩한다. 예시적인 인게이저는 본원에 기술된 바와 같은 이중특이적 인게이저(BiME), 또는 삼중특이적 인게이저(TRiME)이다.
한 측면에서, 본원에서는 (a) (i) 막횡단 도메인, 또는 (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR: phagocytic receptor) 서브유닛; 및 (b) 표적 세포 상의 CD137에 특이적으로 결합할 수 있는 CD137 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인이 작동가능하게 연결된 것인 조성물을 개시한다.
한 측면에서, 본원에서는 (a) 표적 세포 상의 CD137 항원에 특이적으로 결합하는 제1 CD137 항원 결합 도메인, 및 (b) 골수 세포 상의 표면 작용제에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 제1 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 CD137 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 표면 작용제에 결합하는 것인 조성물을 개시한다.
한 측면에서, 본원에서는 (a) (i) 막횡단 도메인, 또는 (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 (b) 표적 세포 상의 Claudin 18.2에 특이적으로 결합할 수 있는 Claudin 18.2 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인이 작동가능하게 연결된 것인 조성물을 개시한다.
한 측면에서, 본원에서는 (a) 표적 세포 상의 Claudin 18.2 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Claudin 18.2 항원 결합 도메인, 및 (b) 골수 세포 상의 표면 작용제에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 제1 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 Claudin 18.2 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 표면 작용제에 결합하는 것인 조성물을 개시한다.
한 측면에서, 본원에서는 (a) (i) 막횡단 도메인, 또는 (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 (b) 표적 세포 상의 Claudin 3에 특이적으로 결합할 수 있는 Claudin 3 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인이 작동가능하게 연결된 것인 조성물을 개시한다.
한 측면에서, 본원에서는 (a) 표적 세포 상의 Claudin 3 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Claudin 3 항원 결합 도메인, 및 (b) 골수 세포 상의 표면 작용제에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 제1 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 Claudin 18.2 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 표면 작용제에 결합하는 것인 조성물을 개시한다.
한 측면에서, 본원에서는 (a) (i) 막횡단 도메인, 또는 (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 (b) 표적 세포 상의 CD70에 특이적으로 결합할 수 있는 CD70 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인이 작동가능하게 연결된 것인 조성물을 개시한다.
한 측면에서, 본원에서는 (a) 표적 세포 상의 CD70 항원에 특이적으로 결합하는 제1 CD70 항원 결합 도메인, 및 (b) 골수 세포 상의 표면 작용제에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 제1 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 CD70 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 표면 작용제에 결합하는 것인 조성물을 개시한다.
한 측면에서, 본원에서는 (a) (i) 막횡단 도메인, 또는 (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 (b) 표적 세포 상의 TROP2에 특이적으로 결합할 수 있는 TROP2 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인이 작동가능하게 연결된 것인 조성물을 개시한다.
한 측면에서, 본원에서는 (a) 표적 세포 상의 TROP2 항원에 특이적으로 결합하는 제1 TROP2 항원 결합 도메인, 및 (b) 골수 세포 상의 표면 작용제에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 제1 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 TROP2 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 표면 작용제에 결합하는 것인 조성물을 개시한다.
한 측면에서, 본원에서는 (a) (i) 막횡단 도메인, 또는 (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 (b) 표적 세포 상의 TMPRSS에 특이적으로 결합할 수 있는 TMPRSS 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인이 작동가능하게 연결된 것인 조성물을 개시한다.
한 측면에서, 본원에서는 (a) 표적 세포 상의 TMPRSS 항원에 특이적으로 결합하는 제1 TMPRSS 항원 결합 도메인, 및 (b) 골수 세포 상의 표면 작용제에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 제1 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 TMPRSS 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 표면 작용제에 결합하는 것인 조성물을 개시한다.
한 측면에서, 본원에서는 (a) (i) 막횡단 도메인, 및 (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 (b) 표적 세포의 항원에 대한 강한 결합 친화성을 갖는, 상기 기술된 것 중 어느 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는, PR 융합 단백질(PFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 막횡단 도메인 및 세포외 도메인이 작동적으로 연결되고; 여기서, PFP가 표적 세포의 항원에 결합할 때 PFP를 발현하는 세포의 살해 또는 식세포작용 활성은 PFP를 발현하지 않는 세포와 비교하여 적어도 20% 초과만큼 증가되는 것인 조성물을 개시한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 PFP 중 어느 하나의 세포내 신호전달 도메인은 식세포 또는 테더링 수용체로부터 유래된 것이거나, 또는 여기서, 세포내 신호전달 도메인은 식세포작용 활성화 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 염증유발성 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 키나제 활성화 도메인 또는 키나제 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 PI3 키나제 모집 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 IL-1 신호전달 캐스케이드 활성화 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 TLR3, TLR4, TLR7, TLR 9, TRIF, RIG-1, MYD88, MAL, IRAK1, MDA-5, IFN-수용체, NLRP 패밀리 구성원, NLRP1-14, NOD1, NOD2, 피린, AIM2, NLRC4, FCGR3A, FCERIG, CD40, 카스파제 도메인 또는 프로카스파제 결합 도메인 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 PFP 중 어느 하나는 CD2, CD8, CD28, CD64 또는 CD68 단백질 TM 도메인으로부터 유래된 막횡단 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 PFP 중 어느 하나는 힌지 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, PFP가 표적 세포의 항원에 결합할 때 PFP를 발현하는 세포의 살해 활성은 PFP를 발현하지 않는 세포와 비교하여 적어도 20% 초과만큼 증가된다.
일부 실시양태에서, PFP가 표적 세포의 항원에 결합할 때 PFP를 발현하는 세포의 살해 활성은 PFP를 발현하지 않는 세포와 비교하여 적어도 1.1배만큼 증가된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 제1 치료제를 포함하고, 여기서, 치료제는, 표적 세포 상의 항원과 특이적으로 상호작용하는 제1 항체 또는 이들의 기능성 단편인 제1 결합 도메인, 및 골수 세포와 특이적으로 상호작용하는 제2 항체 또는 이들의 기능성 단편인 제2 결합 도메인을 포함하고; 여기서, (i) 제1 치료제는 제1 성분에 커플링되고, 여기서, 제1 성분은 추가 치료제 또는 제3 결합 도메인이거나, 또는 (ii) 일부 실시양태에서, 조성물은 추가 치료제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 치료제는 (a) 표적 세포의 항원과 특이적으로 상호작용하는 제1 결합 도메인, (b) 골수 세포와 특이적으로 상호작용하는 제2 결합 도메인, 및 (c) 골수 세포와 특이적으로 상호작용하는 제3 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 치료제의 결합 도메인 중 어느 하나는 항체, 항체의 기능성 단편, 이들의 가변 도메인, VH 도메인, VL 도메인, VNAR 도메인, VHH 도메인, 단일 쇄 가변 단편(scFv), Fab, 단일 도메인 항체(sdAb), 나노바디, 이중특이적 항체, 디아바디, 또는 기능성 단편 또는 이들의 조합의 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인이 결합하는 표적 세포 상의 항원은 세포 상의 암 항원 또는 병원성 항원 또는 자가면역 항원이다.
일부 실시양태에서, 제1 치료제는 길이가 1000개 미만의 아미노산 또는 1000 nm 미만인 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 치료제는 길이가 500개 미만의 아미노산 또는 500 nm 미만인 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 치료제는 길이가 200-1000개의 아미노산 또는 200-1000 nm인 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 치료제의 결합 도메인의 인게이지먼트(engagement)는 암 세포를 골수 세포에 접촉시킨다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 골수 세포와 특이적으로 상호작용하고, 골수 세포의 식세포작용 활성을 촉진시킨다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 골수 세포와 특이적으로 상호작용하고, 골수 세포의 염증성 신호전달을 촉진시킨다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 골수 세포 또는 부착 분자와 특이적으로 상호작용하고, 골수 세포의 표적 세포에의 부착을 촉진시킨다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 골수 세포와 특이적으로 상호작용하고, 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항식세포 활성을 억제시킨다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 골수 세포와 특이적으로 상호작용하고, 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항염증성 활성을 억제시킨다.
일부 실시양태에서, 제2 및/또는 제3 결합 도메인은 골수 세포의 식세포 활성을 촉진시킨다.
일부 실시양태에서, 제2 및/또는 제3 결합 도메인은 골수 세포의 염증성 신호전달을 촉진시킨다.
일부 실시양태에서, 제2 및/또는 제3 결합 도메인은 골수 세포 또는 부착 분자와 특이적으로 상호작용하고, 골수 세포의 표적 세포에의 부착을 촉진시킨다.
일부 실시양태에서, 제2 및/또는 제3 결합 도메인은 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항식세포 활성을 억제시킨다.
일부 실시양태에서, 제2 및/또는 제3 결합 도메인은 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항염증성 활성을 억제시킨다.
일부 실시양태에서, 제3 결합 도메인 또는 추가 치료제는 CD47 길항제, CD47 차단제, 항체, 키메라 CD47 수용체, 시알리다제, 사이토카인, 염증유발성 유전자, 프로카스파제, 또는 항암제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제3 결합 도메인 또는 추가 치료제는 SIRP-알파 길항제, SIRPA 차단제, 항체, 키메라 SIRPA 수용체, 사이토카인, 염증유발성 유전자, 프로카스파제, 또는 항암제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제3 결합 도메인 또는 추가 치료제는 PD1 길항제, PD1 차단제, 항체, 키메라 PD1 수용체, 사이토카인, 염증유발성 유전자, 프로카스파제, 또는 항암제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인 및 제3 결합 도메인은 별개의 비동일한 표적 항원에 결합한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인, 제2 결합 도메인 또는 제3 결합 도메인은 리간드 결합 도메인이다.
일부 실시양태에서, 제1, 제2 또는 제3 결합 도메인은 하나 이상의 링커에 의해 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 링커는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 링커는 기능성 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 링커는 수용체에 대한 리간드이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 단핵구 또는 대식세포 수용체에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, 링커는 수용체를 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 링커는 수용체를 억제시킨다.
일부 실시양태에서, 링커는 M2 대식세포 수용체에 대한 리간드이다. 일부 실시양태에서, 링커는 TLR 수용체, 예컨대, TLR4에 대한 리간드이다. 일부 실시양태에서, 링커는 TLR 수용체를 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 제1, 제2 및/또는 제3 결합 도메인은 결합 도메인에 결합하는 마스크와 회합된다.
일부 실시양태에서, 마스크는 마스크가 각각의 결합 도메인과 회합된 상태로 유지될 때, 결합 도메인의 그의 표적에의 상호작용을 억제시키는 억제제이다. 일부 실시양태에서, 마스크는 펩티드 링커를 통해 결합 도메인과 회합된다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 모이어티를 포함한다
일부 실시양태에서, 절단가능한 모이어티는 암 또는 종양 부위에 선택적으로 풍부한 단백질 또는 효소에 의해 절단된다.
일부 실시양태에서, 치료제는 핵산, 예컨대, 조작된 핵산이고, 여기서, 핵산은 RNA이다.
일부 실시양태에서, 핵산은 mRNA이다.
일부 실시양태에서, 핵산은 골수 세포를 표적화하도록 디자인된 자기 복제 RNA이다.
일부 실시양태에서, 핵산, 즉, 조작된 핵산은 골수 세포를 표적화하도록 디자인된 circRNA이다.
일부 실시양태에서, 조작된 재조합 핵산은 골수 세포를 표적화하도록 디자인된 RNA이다.
일부 실시양태에서, 조작된 핵산은 골수 세포를 표적화하도록 디자인된 mRNA이다.
일부 실시양태에서, 조작된 핵산은 골수 세포를 표적화하도록 디자인된 자기 복제 RNA이다.
일부 실시양태에서, 조작된 핵산은 골수 세포를 표적화하도록 디자인된 circRNA이다.
일부 실시양태에서, 조작된, 재조합 핵산은 하나 이상의 지질과 회합된다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 리포솜에 캡슐화된다.
일부 실시양태에서, 리포솜은 나노입자이다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 벡터에 포함된다.
본원에서는 상기 기술된 실시양태의 조성물의 재조합 핵산 중 어느 하나, 및 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본원에서는 상기 기술된 재조합 단백질 중 어느 하나를 코딩하는 재조합 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본원에서는 상기 기술된 재조합 단백질 중 어느 하나를 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 세포는 골수 세포이다.
일부 실시양태에서, 세포는 CD14+, CD16-이다.
본원에서는 상기 기술된 실시양태 중 어느 하나의 재조합 핵산을 포함하는 세포 집단을 포함하는 약학 조성물로서, 여기서, 적어도 50%의 세포는 CD14+CD16-인 것인, 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물 중 10% 미만의 세포는 수지상 세포이다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 적합한 부형제를 추가로 포함한다.
본원에서는 상기 기술된 실시양태 중 어느 하나의 조성물 중 어느 하나를 제조하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본원에서는 피험체에게 상기 기술된 실시양태 중 어느 하나의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본원에서는 피험체에게 상기 기술된 실시양태 중 어느 하나의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 암은 위암, 난소암, 신장암, 유방암, 전립선암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 교모세포종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 측면에서, 본원에서는 본원에 기술된 바와 같은 조성물 중 하나를 제조하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본원에서는 피험체에게 본원에 기술된 바와 같은 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본원에서는 피험체에게 본원에 기술된 바와 같은 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 암은 위암, 난소암, 신장암, 유방암, 전립선암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 교모세포종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 측면에서, 본원에서는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산을 포함하는 조성물로서, CFP는 (a) 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 및 (b) 세포외 도메인에 작동적으로 연결된 막횡단 도메인을 포함하고; 여기서, 막횡단 도메인은 골수 세포에서 내인성 FcR-감마 수용체와 이량체화하는 단백질로부터의 막횡단 도메인이고; 여기서, 재조합 폴리핵산은 나노입자 전달 비히클에 의해 캡슐화되고; 여기서, 인간 피험체에게로의 조성물 투여 후, CFP가 인간 피험체의 골수 세포의 표면 상에 발현되는 것인 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 Fab 단편, scFv 도메인 또는 sdAb 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD8, CD16a, CD64, CD68 또는 CD89로부터의 막횡단 도메인이다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 CD8로부터 유래된 힌지 도메인을 추가로 포함하고, 여기서, 힌지 도메인은 막횡단 도메인 및 항원 결합 도메인에 작동적으로 연결된다.
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 골수 세포, 단핵구 또는 대식세포에서 내인성 FcR-감마 수용체와 이량체화하는 단백질로부터의 막횡단 도메인이고; 여기서, 인간 피험체에게로의 약학 조성물 투여 후, CFP는 인간 피험체의 골수 세포, 단핵구 또는 대식세포에서 특이적으로 발현된다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD16a, CD64, CD68 또는 CD89로부터의 막횡단 도메인이다. 일부 실시양태에서, CFP는 세포내 도메인을 추가로 포함하고, 여기서, 세포내 도메인은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 FcγR, FcαR, FcεR, CD40 또는 CD3제타로부터의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 포스포이노시티드 3 키나제(PI3K) 모집 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, PI3K 모집 도메인은 서열 번호 26과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 CD16a, CD64, CD68 또는 CD89로부터의 세포내 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 CFP의 세포내 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM: immunoreceptor tyrosine-based activation motif) 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 CFP의 세포내 도메인은 1 초과의 ITAM 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, ITAM 도메인은 CD3 제타 TCR 서브유닛, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, TCR 제타 쇄, Fc 엡실론 수용체 1 쇄, Fc 엡실론 수용체 2 쇄, Fc 감마 수용체 1 쇄, Fc 감마 수용체 2a 쇄, Fc 감마 수용체 2b 1 쇄, Fc 감마 수용체 2b2 쇄, Fc 감마 수용체 3a 쇄, Fc 감마 수용체 3b 쇄, Fc 베타 수용체 1 쇄, TYROBP(DAP12), CD5, CD16a, CD16b, CD22, CD23, CD32, CD64, CD79a, CD79b, CD89, CD278, CD66d, 이들의 기능성 단편, 및 1개 이상 20개 이하의 변형을 가진 이들의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 또는 폴리펩티드의 세포내 도메인으로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 ITAM 도메인은 Src-패밀리 키나제 인산화 부위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 ITAM 도메인은 Syk 모집 도메인을 포함한다.
세포내 신호전달 서브유닛이 DAP12 모집 도메인을 추가로 포함하는 것인, 107-110항 중 어느 한 항의 조성물.
일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 ITAM 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 폴리핵산은 mRNA이다. 일부 실시양태에서, mRNA는 나노입자 전달 비히클을 통해 세포 내로 전달된다. 일부 실시양태에서, 나노입자 전달 비히클은 지질 나노입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 나노입자는 극성 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 나노입자는 비극성 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 나노입자 직경은 100 내지 300 nm이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 TROP2, GPC3, CD5, HER2, CD137, CD70, Claudin 3, Claudin 18.2, TMPRSS, CD19, CD22, CD7 및 GP75로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합한다.
본원에서는 상기 기술된 바와 같은 조성물, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 암을 앓는 인간 피험체에게 투여되었을 때, 암 성장을 억제시키는 것인, 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 조성물을 포함한다.
한 측면에서, 본원에서는 본원에 기술된 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 피험체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본원에서는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산의 존재하에서 골수 세포를 전기천공시키는 단계를 포함하고, CFP는 (a) 항TROP2 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 및 (b) 세포외 도메인에 작동적으로 연결된 막횡단 도메인을 포함하고; 여기서, 재조합 폴리핵산은 (i) 골수 세포 중에 존재하거나, 또는 (ii) 나노입자 전달 비히클에 의해 캡슐화되고; 재조합 폴리핵산은 인간 피험체의 골수 세포에서의 재조합 폴리핵산의 발현을 위해 구성되는 것인, 본원에 기술된 조성물을 골수 세포 내로 도입하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본원에서는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산을 포함하는 조성물로서, CFP는 (a) 서열 번호 34 및 서열 번호 35에 기재된 서열 중 적어도 하나, 또는 서열 번호 34 또는 서열 번호 35와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 항TROP2 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) FcγR1 분자(CD64), FcγRIIIA 분자(CD16), 또는 FcαR1 분자(CD89)의 막횡단 도메인으로부터의 서열을 포함하는, 세포외 도메인과 작동가능하게 연결된 막횡단 도메인; 및 (c) 임의로, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인에 작동가능하게 연결된 힌지 도메인으로서, 여기서, 힌지 도메인은 CD8α 힌지 도메인으로부터의 아미노산 서열을 포함하는 것인 힌지 도메인을 포함하는 것인 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 서열 번호 26, 27 또는 28에 기재된 서열로부터 선택되는 아미노산 서열; 또는 서열 번호 26, 27 또는 28에 기재된 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리핵산은 mRNA이다.
본원에서는 항TROP2 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산을 포함하는 세포로서, 여기서, 세포는 CD14+ 세포인 것인 세포를 제공한다.
본원에서는 질환 또는 장애 치료에서의, 본원에 기술된 조성물 또는 본원의 약학 조성물, 또는 본원에 기술된 바와 같은 세포 중 어느 하나의 용도를 제공한다.
본원에서는 피험체에서의 암 치료에서의 본원에 기술된 약학 조성물의 용도로서, 여기서, 암은 위암, 난소암, 신장암, 유방암, 전립선암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 교모세포종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도를 제공한다.
본원에서는 피험체에서의 암 치료용 의약 제조에서의 본원에 기술된 조성물, 또는 본원에 기술된 약학 조성물, 또는 본원에 기술된 세포 중 어느 하나의 용도로서, 여기서, 암은 위암, 난소암, 신장암, 유방암, 전립선암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 교모세포종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도를 제공한다.
본원에서는 또한 (A) 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열; (B) 키메라 항원 수용체 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 제2 핵산 서열로서, 여기서, CFP는 (a) 수용체에 의한 항원 결합시 인산화되는 하나 이상의 티로신 잔기를 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 서브유닛; (b) 막횡단 도메인, (c) 표적 세포의 표면 상의 성분에 대해 결합 특이성을 갖는 세포외 결합 도메인으로서, 여기서, 세포외 결합 도메인은 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결된 것인 세포외 결합 도메인; 및 (d) 프로테아제 절단 서열에 의해 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결된 전사 활성인자 도메인으로서, 여기서, 전사 활성인자 도메인은 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열의 전사를 촉진시키는 것인 전사 활성인자 도메인을 포함하는 것인 제2 핵산 서열; 및 (C) (i) 전사 활성인자 도메인을 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결하는 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제; (ii) CFP 활성화시 인산화되는 티로신 잔기에 결합하는 도메인을 코딩하는 제3 핵산 서열로서; 여기서, 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제, 및 티로신 잔기에 결합하는 도메인이 작동가능하게 연결된 것인 제3 핵산 서열을 포함하는, 하나 이상의 재조합 핵산 서열을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 제3 핵산 서열은 (iii) 자극 반응 요소를 추가로 코딩한다.
일부 실시양태에서, 자극 반응 요소(iii)는 인산화된 티로신 잔기에 결합하는 도메인에 융합된다.
일부 실시양태에서, 자극 반응 요소(iii)는 핵산 서열을 발현하는 세포의 미세환경에 반응성이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 재조합 핵산은 골수 세포에서 발현된다.
일부 실시양태에서, 전사 활성인자 도메인은 DNA 결합 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 Gal4, ZFHD1 또는 tet-R의 DNA 결합 도메인(DB)으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 전사 활성인자 도메인은 VP64 전사활성화 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 전사 활성인자 도메인을 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결하는 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제는 C형 간염 바이러스(HCV: hepatitis C virus) NS3 프로테아제이다.
일부 실시양태에서, CFP 활성화시 인산화되는 티로신 잔기에 결합하는 도메인은 포스포티로신 결합(PTB: phosphotyrosine binding) 도메인이다.
일부 실시양태에서, PTB는 Shc PTB이다.
일부 실시양태에서, (iii)은 (ii)와 작동가능하게 연결된 데그론이다.
일부 실시양태에서, 데그론은 HIF-1a 데그론이다.
본원에서는 단락 [0114] 내지 [00126]에 열거된 조성물 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본원에서는 단락 [0114] 내지 [00126]에 열거된 조성물을 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 CD14+이다. 본원에서는 피험체에게 단락 [0127]에 열거된 (i) 약학 조성물; 또는 (ii) 중 어느 하나를 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
참조에 의한 포함
본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 공개문헌, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적 및 개별적으로 명시된 것과 동일한 정도로 본원에서 참조로 포함된다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 기재되어 있다. 본 발명의 특징 및 장점은 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 실시양태가 기재되어 있는 하기 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 좌측의 세포외 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CFP, 및 우측의 세포외 결합 도메인, 막횡단 도메인, 제1 세포내 신호전달 도메인, 제2 세포내 신호전달 도메인, 제3 세포내 신호전달 도메인, 및 하나 이상의 추가 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CFP인, 두 예시적인 CFP를 보여주는 개략도를 도시한 것이다. 신호전달 도메인은 다른 수용체로부터 유래될 수 있고, 여러 세포 기능을 유도하도록 디자인될 수 있다. 예시적인 결합 도메인은 CD137 결합 도메인이다. 예시적인 결합 도메인은 TROP2 결합 도메인이다.
도 2a는 항CD137 세포외 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 PI3K 모집 도메인에 융합된 FcRγ로부터 유래된 세포내 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 예시적인 CFP 이량체를 보여주는 개략도를 도시한 것이다.
도 2b는 세포외 항CD137 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 식세포작용 도메인, PI3K 모집 도메인 및 염증유발 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 예시적인 CFP 이량체를 보여주는 개략도를 도시한 것이다.
도 3은 각 서브유닛이 단일 표적에 결합하는 scFv에 융합된 세포외 도메인을 포함하는 예시적인 CFP 동종이량체(좌측), 및 이종이량체의 제1 서브유닛은 제1 표적에 결합하는 scFv에 융합된 세포외 도메인을 포함하고, 이종이량체 서브유닛의 제2 서브유닛은 제2 표적에 결합하는 scFv에 융합된 세포외 도메인을 포함하는 예시적인 CFP 이종이량체(우측)을 도시한 개략도이다.
도 4a는 세포외 도메인(ECD: extracellular domain)에 융합된 항원 특이적 scFv에 융합된 신호 펩티드, 막횡단 도메인(TMD: transmembrane domain) 및 신호전달 도메인 1, 2, 및 3을 포함하는 스캐빈저 수용체의 세포내 도메인(ICD: intracellular domain)을 포함하는 CFP를 코딩하는 예시적인 재조합 핵산을 도시한 개략도이다. 추가로, 예시적인 재조합 핵산은 5'- 및 3'UTR을 포함하는 mRNA이다.
도 4b는 바이러스 유전자 전달(좌측 패널)의 경우, 일부 세포 유형은 치료 세포 기능 및 수명의 잠재적 효과에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 불량한 형질도입 및 세포 분화를 보이고; 플라스미드 매개 전달(우측 상단)은 분화 및 세포 사멸을 유도할 수 있는 반면; mRNA 전달은 안전하고, 전달 후 세포에서 거의 무시할 수 있는 정도의 면역 반응을 일으킨다는 것(우측 하단)을 데이터를 보여주는 것이다.
도 5는 상단의 그래픽 다이어그램에 도시된 바와 같이, 공 벡터(대조군) 또는 항원 코팅된 비드와 함께 공동 배양된 CFP를 코딩하는 벡터가 형질도입된 인간 1차 골수 세포에서 상대적인 식세포작용의 예상 결과를 도시한 예시적인 데이터이다. 식세포작용은 유세포 분석법을 사용하여 정량화된다.
도 6a는 상단의 그래픽 다이어그램에 도시된 바와 같이, 형광 염료로 표지된 항원 발현 표적 세포와 함께 공동 배양된 공 벡터(대조군) 또는 CFP를 코딩하는 벡터가 형질도입된 인간 1차 골수 세포에서 상대적인 식세포작용의 예상 결과를 도시한 예시적인 데이터이다. 식세포작용은 유세포 분석법을 사용하여 정량화된다. 다른 골수 세포 대 표적 비의 효과는 예상대로 도시된다.
도 6b는 CFP 결합 도메인(결합제)의 특이성을 입증하는 데이터를 보여주는 것으로, CD19 결합 CFP 구성물을 발현하는 세포(CD19-ATAK)는 표면 상에 CD19를 보유하지 않는 CD22+ 표적의 존재하가 아닌, 오직 CD19+ 표적의 존재하에서만 높은 식세포작용을 나타내고, 그 반대의 경우도 그러하다.
도 6c는 종양에서 형광 CFP 구성물을 발현하는 골수 세포의 성공적인 화학주성 및 국재화를 제시하는 데이터를 보여주는 것이고(이미징에 의해, 좌측 패널); 우측의 그래프는 다양한 농도의 CCL2의 존재하에서의 시험관내 화학주성을 나타낸다.
도 7a는 상이한 분극화 조건(상단 패널에 제시), 예컨대, MCSF 단독 존재하에(M0 조건); 또는 추가로 IL-10, IL-4 및 TGFβ 포함하에(M2 조건) 또는 IFN 및 LPS 존재하에 24시간 동안 인큐베이션된 후, 이어서, H9 T 세포 림프종 세포와 인큐베이션된 항CD5 CFP를 발현하는 1차 인간 단핵구 세포에서의 것을 도시한 유세포 분석법에 의한 분석으로부터의 예시적인 그래프를 도시한 것으로, 본 결과는 CFP의 발현이 상기 조건하에서 분극화될 수 있는 세포의 능력을 변경시키지 않았다는 것을 나타낸다. 추가로, 종양 세포와의 공동 인큐베이션은 분극화를 변경시키지 않았다. 추가로, 동일한 배양 조건을 이용하여 시험하였고, 항CD5 CFP를 발현하는 1차 인간 단핵구 세포가 M2 환경에서 강력한 종양 세포 식세포작용 및 살해 활성을 가졌다는 것을 입증하였다(본원에 제시되지 않음). 동일한 접근법을 사용하여 M1 또는 M2 촉진 환경에서 본원에 기술된 결합제 중 임의의 것의 시험관내 효능을 시험할 수 있다.
도 7b는 말초 T 세포 림프종 동물 모델 실험의 처리의 예시적인 실험 흐름도를 보여주는 개략도를 도시한 것이다. 1x10^6 CD5-HU9 시자리 증후군(Sezary Syndrome) 종양 세포주 세포를 마우스에 피하로 주사하였다. 명시된 양의, 항CD5 CFP를 발현하는 인간 1차 단핵구로 처리하는 것은 종양 세포주 세포 주사 후 11일째 개시하였다. 총 5회 주입으로 투여하였고, 매 3일마다 주입하였다. 동일한 접근법을 사용하여 생체내 적합한 실험 종양 모델에서 본원에 기술된 결합제 중 임의의 것의 시험관내 효능을 시험할 수 있다.
도 7c는 도 7b에 기술된 실험 요법에 따라 명시된 시점에서의 상대적 종양 크기(방사휘도)의 그래프를 도시한 것이다.
도 8은 단핵구 특이적 발현을 위한 CFP 구성물의 예시적인 모듈식 디자인을 보여주는 것이다(ECD = 세포외 도메인; H = 힌지; TMD = 막횡단 도메인; ICD = 세포내 도메인).
도 9는 항GPC3 또는 항TROP2 항체 도메인, FLAG 세포외 도메인, 인간 CD16 또는 인간 CD89 막횡단(TM) 도메인 및 인간 CD16 또는 인간 CD89 세포내(cyto) 도메인을 포함하는 항GPC3 CFP 구성물 및 항TROP2 CFP 구성물을 비롯한, 예시적인 CFP 구성물의 발현 및 기능성 분석에 대한 대표적인 작업 흐름을 보여주는 것이다. 도시된 바와 같이, 200 ug/mL의, 구성물을 코딩하는 RNA를 PBMC로 전기천공(EP)할 수 있고, 발현, 표적 종양 세포 살해 및 사이토카인/케모카인 생산을 분석할 수 있다.
도 10a는 다양한 세포 유형에서의 명시된 항TROP2 CFP 구성물의 발현을 분석하는 유세포 분석법 데이터를 도시한 것이다. 하단 패널에 제시된 바와 같이, 명시된 항TROP2 CFP 구성물의 발현은 CD14+ 골수 세포에서는 관찰되었지만, CD19+B 세포, CD3+ T 세포 또는 CD56+ NK 세포에서는 관찰되지 않았다.
도 10b는 다양한 세포 유형에서의 명시된 항GPC3 CFP 구성물의 발현을 분석하는 유세포 분석법 데이터를 도시한 것이다. 하단 패널에 제시된 바와 같이, 명시된 항GPC3 CFP 구성물의 발현은 CD14+ 골수 세포에서는 관찰되었지만, CD19+B 세포, CD3+ T 세포 또는 CD56+ NK 세포에서는 관찰되지 않았다.
도 11a는 명시된 항TROP2 CFP 구성물로 형질감염된 PBMC에 의한 SKOV3 세포의 살해를 측정하는 루시페라제 활성으로부터의 데이터를 도시한 것이다. 명시된 항TROP2 CFP 구성물로 형질감염된 PBMC를 5:1의 이펙터 세포:표적 세포 비로 SKOV3-Luc와 함께 3일 동안 공동배양하였다. 명시된 항TROP2 CFP 구성물로 형질감염된 PBMC는 대조군과 비교하여 특이적인 SKOV3 세포 살해를 보였다.
도 11b는 명시된 항TROP2 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP와 접촉된 골수 세포를 이용하여 발현, 종양 특이적 식세포작용 및 항종양 사이토카인 생산을 분석한 데이터를 도시한 것이다. 좌측 패널은 명시된 항TROP2 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP와 접촉된 다양한 세포 유형에서의 명시된 항TROP2 CFP 구성물의 발현을 분석하는 유세포 분석법 데이터를 도시한 것이다. 명시된 항TROP2 CFP 구성물의 발현은 CD14+ 골수 세포에서는 관찰되었지만, CD19+B 세포, CD3+ T 세포 또는 CD56+ NK 세포에서는 관찰되지 않았다. 중간 패널은 명시된 항TROP2 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP와 접촉된 PBMC에 의한 SKOV3 세포 살해를 측정하는 루시페라제 검정법으로부터의 데이터를 나타낸 그래프를 도시한 것이다. 명시된 항TROP2 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP와 접촉되고, SKOV3-Luc 세포와 함께 공동 배양된 PBMC는 대조군과 비교하여 특이적인 SKOV3 세포 살해를 나타내었다. 우측 패널은 중간 패널로부터의 샘플의 TNF-알파 생산의 그래프를 도시한 것이다.
도 12a는 명시된 항TROP2 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP와 접촉된 골수 세포를 이용한 사이토카인 생산의 데이터를 도시한 것이다. 명시된 항TROP2 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP와 접촉된 PBMC가 단독으로 배양되거나, 또는 SKOV3 세포와 함께 공동 배양된 샘플로부터의 IL-1베타 및 IL-18 생산의 그래프가 제시되어 있다.
도 12b는 명시된 항TROP2 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP와 접촉된 골수 세포를 이용한 사이토카인 생산의 데이터를 도시한 것이다. 명시된 항TROP2 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP와 접촉된 PBMC가 단독으로 배양되거나, 또는 SKOV3 세포와 함께 공동 배양된 샘플로부터의 CCL2 및 TNF-알파 생산의 그래프가 제시되어 있다.
도 12c는 골수 세포 특이적 생체내 프로그래밍을 구동시키는 CD89(FcR 알파 쇄)의 성공적인 이용을 나타낸 개략도를 보여주는 것이다. scFv가 CD89에 부착된 CFP를 코딩하는 mRNA를 LNP에 제제화하고, 마우스 내로 주사하였다. CFP를 발현하는 골수 세포 및 림프구의 비율(%)의 그래프가 제시되어 있다. 대조군과 비교하여 CFP 발현이 CD14+ 골수 세포에서는 관찰되었지만, 림프구에서는 관찰되지 않았다.
도 13a는 scFv를 포함하는 2개의 예시적인 항TROP2 CFP 구성물에 대한 상이한 VH 및 VL 도메인 구성의 예시적인 개략도를 도시한 것이다.
도 13b는 도 13a에 제시된 scFv를 포함하는 2개의 예시적인 항TROP2 CFP 구성물에 대한 상이한 VH 및 VL 도메인 구성이 명시된 CFP 구성물을 코딩하는 RNA이 전기천공된 THP-1 세포에서의 발현에 미치는 효과를 보여주는 예시적인 유세포 분석법 데이터를 도시한 것이다.
도 13c는 명시된 이펙터:표적 세포(E:T) 비에서, pHrhodo Red 신호 증가로 정량화된, X축에 명시된 명시된 구성물을 발현하는 THP-1 세포에 의한 SKOV3 세포의 식세포작용을 보여주는 예시적인 그래프를 도시한 것이다.
도 13d는 명시된 막횡단 및 세포내 도메인 조합을 포함하는 명시된 항TROP2 CFP 구성물의 발현을 나타낸 예시적인 유세포 분석법 데이터를 도시한 것이다. 모의 형질감염 및 항HER2 CFP 구성물 형질감염된 세트는 각각 음성 및 양성 대조군으로서의 역할을 한다.
도 13e는 명시된 막횡단 및 세포내 도메인 조합을 포함하는 명시된 항HER2(우측) 및 항TROP2(좌측) CFP 구성물의 발현을 나타낸 예시적인 데이터를 도시한 것이다.
도 14a는 예시적인 항GP75(αGP75) CFP 구성물의 개략도를 도시한 것이다. 예시적인 항GP75-FLAG-hCD8-Fcg-PI3K 구성물(제1 gen ATAK 수용체)이 맨 위에 제시되어 있다. 도시된 다른 항GP75 CFP 구성물은 각각 명시된 도메인을 코딩하는 서열을 포함하고, T2A 펩티드 코딩 서열에 의해 세포내 도메인 코딩 서열로부터 분리된 GFP 코딩 서열이 도시되어 있다. 좌측의 그래프는 항GP75 CFP 구성물의 CD16 막횡단 도메인 또는 CD89 막횡단 도메인과 내인성 Fc 수용체 단백질의 다량체화, 및 항GP75 CFP 구성물의 종양 세포 상의 GP75 항원에의 결합을 도시한 것이다.
도 14b는 명시된 CFP 구성물을 코딩하는 RNA를 함유하는 LNP를 마우스 내로 주사한 후, 생체내 다양한 타입의 마우스 폐 세포에서 명시된 CFP 구성물의 발현을 분석하는 데 사용된 예시적인 유세포 분석법 게이팅 전략법을 도시한 것이다.
도 14c는 CFP 구성물을 코딩하는 RNA를 함유하는 LNP를 마우스 내로 단일 또는 이중 주사하고, 도 14b에 도시된 게이팅 전략법에 따라 유세포 분석법에 의한 분석을 수행한 후, 생체내에서 명시된 타입의 마우스 폐 세포에서의 면역검정법에 의해 측정된 바와 같은, GFP 형광 또는 flag 발현에 대해 양성인 세포의 비율(%)로 측정된 CFP 구성물의 발현의 그래프를 도시한 것이다. 발현이 폐의 골수 세포에서는 관찰되었지만, 림프구 또는 CD45- 세포에서는 관찰되지 않았다.
도 14d는 명시된 CFP 구성물을 코딩하는 RNA를 함유하는 LNP를 마우스 내로 주사한 후, 생체내 다양한 타입의 마우스 간 세포에서 명시된 CFP 구성물의 발현을 분석하는 데 사용된 예시적인 유세포 분석법 게이팅 전략법을 도시한 것이다.
도 14e는 CFP 구성물을 코딩하는 RNA를 함유하는 LNP를 마우스 내로 단일 또는 이중 주사하고, 도 14d에 도시된 게이팅 전략법에 따라 유세포 분석법에 의한 분석을 수행한 후, 생체내에서 명시된 타입의 마우스 간 세포에서의 면역검정법에 의해 측정된 바와 같은, GFP 형광 또는 flag 발현에 대해 양성인 세포의 비율(%)로 측정된 CFP 구성물의 발현의 그래프를 도시한 것이다. 발현이 간의 골수 세포에서는 관찰되었다.
도 14f는 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP와 시험관내에서 접촉된 마우스 단핵구에서의 명시된 항GP75 CFP 구성물의 발현을 보여주는 예시적인 유세포 분석법 데이터를 도시한 것이다.
도 15a는 항GP75 CFP 구성물을 발현하는 골수 세포에 의한 pHrhodoRed 표지된 B16 세포의 식세포작용을 측정하는 예시적인 시험관내 검정법을 도시한 것이다. 골수 세포를 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP와 접촉시켰다(예컨대, 상기 LNP로 전기천공하였다). 도시된 유세포 분석법 데이터는 pHrhodoRed 표지된 B16 세포의 CD11b 양성 단핵구 식세포작용을 보여주는 것이다.
도 15b는 도 15a에 기술된 검정법을 이용한, CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP로의 전기천공 후, 명시된 항GP75 CFP 구성물을 발현하는 단핵구를 이용하여 예시적인 데이터를 도시한 것이다. 식세포작용 지수 및 유세포 분석법 데이터 그래프가 제시되어 있다. MYL157 구성물 = αGP75-FLAG-마우스 CD16 TMD-마우스 CD16 ICD-T2A-GFP(GP75-CD16a로도 또한 도시). MYL158 구성물 = αGP75-FLAG-마우스 CD89 TMD-마우스 CD89 ICD-T2A-GFP(GP75-CD89로도 또한 도시).
도 15c는 도 15a에 기술된 검정법을 이용한, CFP 구성물을 코딩하는 RNA를 함유하는 LNP로의 전기천공 후, 명시된 항GP75 CFP 구성물을 발현하는 단핵구를 이용하여 예시적인 데이터를 도시한 것이다. 구성물은 상단 패널에 그래프로 제시되어 있다. 유세포 분석법에 의한 분석에 기반한 식세포작용 지수를 도시한 데이터는 그래프로 제시되어 있다. CD8 힌지를 포함하는 구성물은 약간 더 우수한 발현을 보였다.
도 15d는 도 15a에 기술된 검정법을 이용한, 명시된 항GP75 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP로 전기천공된 골수 세포에 의한 사이토카인 생산의 데이터를 도시한 것이다. B16 세포 단독 또는 명시된 항GP75 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP와 접촉되고, B16 세포과 공동 배양된 단핵구로부터의 TNF-알파, CCL3, CCL4 및 CCL7 생산의 그래프가 제시되어 있다.
도 16은 생체내 전달을 위한 다양한 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP를 제조하기 위한 예시적인 개략도를 도시한 것이다.
도 17a는 B16 동계 마우스 모델에서의 종양 성장을 확립하고, 모니터링하기 위한 예시적인 LNP 투여 스케줄을 도시한 것이다. 종양 세포를 0일째 주사하고, 주사 후 10일 동안에 걸쳐 종양이 마우스에서 확립될 수 있도록 한다. 종양 확립 후, 마우스에 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP 제제를 다회에 걸쳐 주사하고, 종양 크기를 측정한다.
도 17b는 다양한 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 jet PEI 매개 형질감염 복합체를 제조하기 위한, 및 주사를 통해 생체내에서 복합체를 전달하기 위한 예시적인 개략도를 도시한 것이다.
도 18a는 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP의 꼬리 정맥 주사 후, 생체내에서 폐, 간, 및 비장의 골수 세포에서의 명시된 CFP 구성물의 양성 발현을 나타내는 명시된 CFP 구성물의 발현 데이터를 도시한 것이다. 폐, 간, 및 비장의 비골수 세포 유형에서는 발현이 관찰되지 않았다.
도 18b는 CFP 구성물을 코딩하는 RNA를 함유하는 LNP를 마우스 내로 단일 또는 이중 주사하고, 도 14b 또는 도 14d에 도시된 게이팅 전략법에 따라 유세포 분석법에 의한 분석을 수행한 후, 생체내에서 명시된 타입의 마우스 폐 및 간 세포에서의 면역검정법에 의해 측정된 바와 같은, GFP 형광 또는 FLAG 발현에 대해 양성인 세포의 비율(%)로 측정된 예시적인 CFP 구성물(맨 위에 그래프로 제시)의 발현의 그래프를 도시한 것이다.
도 18c는 단핵구 및 호중구에서 뚜렷한 GFP 발현을 나타내는 GFP 및 FLAG 오프셋 히스토그램을 도시한 것이다.
도 18d는 CFP 구성물을 코딩하는 RNA를 함유하는 LNP를 마우스 내로 주사하고, 도 14b 또는 도 14d에 도시된 게이팅 전략법에 따라 유세포 분석법에 의한 분석을 수행한 후, 생체내에서 명시된 타입의 마우스 폐 및 간 세포에서의 유세포 분석법에 의한 면역검정법에 의해 측정된 바와 같은, GFP 형광 또는 FLAG 발현에 대해 양성인 세포의 비율(%)로 측정된 CFP 구성물의 발현의 유세포 분석법 데이터를 도시한 것이다.
도 19는 항GP75 구성물을 코딩하는 RNA를 함유하는 LNP로 처리된 B16 마우스에서의 종양의 조직병리학적 분석을 도시한 것이다. 마우스 4마리 중 2마리는 완전한 항종양 반응을 보였고, 종양은 검출되지 않았다.
도 20a는 나이브 마우스, 또는 비히클 또는 항GP75-ATAK CFP 구성물을 발현하는 골수 세포로 처리된 마우스 종양 모델로부터의 세포의 사이토카인 생산의 데이터를 도시한 것이다. 마우스로부터의 CCL2 및 IL-1알파 생산의 그래프가 제시되어 있다. 종양 진행을 촉진시키는 CCL7은 처리된 마우스에서 감소된 반면, 종양 세포 사멸과 연관된 IL-1알파는 증가된다. ATAK, 항원 표적화 및 살해에 대한 약어.
도 20b는 나이브 마우스, 또는 비히클 또는 항GP75 CFP 구성물을 발현하는 골수 세포로 처리된 마우스 종양 모델로부터의 세포의 사이토카인 생산의 데이터를 도시한 것이다. 마우스로부터의 IL23, 에오탁신, CXCL1, IL17a, G-CSF, 및 CXCL5 생산의 그래프가 제시되어 있고, 이는 T 세포 증가 및 골수 세포 활성화를 나타낸다.
도 20c는 CAR 발현 단핵구는 자극시 T 세포를 모집한다는 것을 보여주는 것이다. 시험관내 검정법에서, CD5-ATAK 세포는 T 세포 화학주성을 유도한다.
도 21은 나이브 마우스, 또는 비히클 또는 항GP75 CFP 구성물을 발현하는 골수 세포로 처리된 마우스 종양 모델로부터의 세포의 사이토카인 생산의 데이터를 도시한 것이다. 각 마우스로부터 단리된 세포로부터의 IFN 감마, TNF-알파 및 IL-2 생산의 유세포 분석법 데이터가 제시되어 있다. IFN 감마, TNF-알파 및 IL-2를 생산하는 CD4+ T 세포의 비율(%) 그래프 또한 제시되어 있다.
도 22는 (X축 아래 화살표로 표시된) 명시된 시점에 명시된 항GP75 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP로 처리된 마우스에서의 시간 경과에 따른 종양 부피의 그래프를 도시한 것이다. 처리 후 9일째 각 군으로부터 마우스 5마리를 취하였다. 종양, 폐, 간, 및 비장의 플로우 분석을 위해 기관을 수확하였다. 나노스트링(NanoString) 유전자 발현 분석을 위해 종양 샘플로부터의 RNA 샘플을 저장하였다. Ova 펩티드를 이용한 T 세포 재자극 검정법 또한 수행하였다.
도 23은 LNP 처리가 면역 세포 종양 침윤을 변화시켰다는 것을 보여주는 것이다. 명시된 항GP75 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP로 처리된 마우스의 종양 미세환경에서 모든 CD45+ 면역 세포 중 명시된 세포 유형의 비율(%)의 그래프가 도시되어 있다. 처리한 결과, 종양에서 염증성 단핵구가 뚜렷이 증가한 것으로 나타났고, 대식세포 및 T 세포는 약간 증가하였다.
도 24는 LNP 처리가 CD8 세포독성 T 세포를 유의적으로 증가시켰고, Treg 세포를 감소시켰다는 것을 보여주는 것이다. 명시된 항GP75 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP로 처리된 마우스의 모든 CD45+ 면역 세포 중 명시된 세포 유형(%)의 비율의 그래프가 도시되어 있다. 처리한 결과, CD8+ 세포독성 T 세포의 존재는 증가한 반면, 면역억제성 Treg는 감소하였다.
도 25는 LNP 처리가 CD8 T 세포 면역 체크포인트 발현을 감소시켰다는 것을 보여주는 것이다. 명시된 항GP75 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP로 처리된 마우스의 종양 미세환경으로부터의 CD8+ T 세포에 의한 명시된 면역 체크포인트 분자의 발현 수준의 그래프가 도시되어 있다. 처리한 결과, PD1 발현 수준은 감소하였고, LAG3 발현은 약간 증가하였다.
도 26은 LNP 조성물 중 CFP를 코딩하는 핵산의 생체내 투여시 종양 미세환경의 염증성 표현형으로의 전환을 보여주는 것이다.
도 27은 LNP 처리가 CD8+ T 세포에서 Ki-67 및 퍼포린의 발현을 감소시켰다는 것을 보여주는 것이다. 명시된 항GP75 CFP 구성물을 코딩하는 mRNA를 함유하는 LNP로 처리된 마우스의 종양 미세환경으로부터의 CD8+ T 세포에 의한 명시된 분자의 발현 수준의 그래프가 도시되어 있다.
도 28은 CFP를 코딩하는 mRNA로 전기천공된 THP-1 세포에서의 CFP 구성물의 발현을 나타낸 유세포 분석법 데이터를 보여주는 것이다.
도 29는 마우스 항GP75(Trp-1) CFP ATAK 세포의 생성을 나타낸 개략도를 보여주는 것이다. 항GP75 CFP는 항GP75 CFP를 코딩하는 mRNA의 전기천공을 통해 마우스 단핵구에서 효율적으로 발현되고, 항GP75 CFP를 발현하는 세포는 식세포 활성을 갖고 있다.
도 30은 항GP75 ATAK 단핵구는 동계 B16 뮤린 모델에서 종양을 억제시킨다는 것을 입증하는 데이터를 보여주는 것이다. 본 데이터는 항GP75 CFP를 발현하는 마우스 단핵구로 처리한 후의 시간 경과에 따른 CAR-T 및 체크포인트 억제제에 대해 불응성인 마우스 종양 모델에서 종양 부피의 그래프를 보여준다. 마우스에 비히클 대비 2 x 10^6 세포를 8회 주입으로 투여하였다. 매일 x4 주입, 3일 휴약기, 매일 x4 +/- SD(만 휘트니 검정(Mann-Whitney test)).
도 31은 마우스 종양 모델로의 주입 후, 항GP75 CFP를 발현하는 마우스 단핵구가 종양으로 투과하고, CFP의 발현을 지속하고, 이펙터 세포, 예컨대, 염증성 세포, 수지상 세포 및 대식세포로 분화한다는 것을 입증하는 그래프를 보여주는 것이다. 좌측 그래프는 항GP75 CFP를 발현하는 마우스 단핵구 중 약 ~40%가 주입 후 5일 동안 CFP의 발현을 유지하였다는 것을 보여준다. 우측 상단 그래프는 ATAK 세포(CFP 발현 세포)가 종양과 비장을 투과하고, 수지상 세포가 된다는 것을 보여주는 것이다. 우측 하단 그래프는 ATAK 세포가 종양과 비장을 투과하고, 대식세포성 세포가 된다는 것을 보여주는 것이다.
도 32는 나이브 마우스, 또는 비히클 또는 항GP75 CFP 구성물을 발현하는 골수 세포로 처리된 마우스 종양 모델로부터의 세포의 사이토카인 생산의 데이터를 도시한 것이다. 명시된 사이토카인/케모카인의 생산의 그래프가 제시되어 있다. 처리 반응은 항종양 혈청 사이토카인 프로파일과 상관관계를 보였다. 분석은 연구 종료시 처리군의 반응자 동물을 포함한다.
도 33은 항GP75 CFP를 발현하는 마우스 단핵구에 의한 종양 항원의 교차 제시를 보여주는 데이터를 도시한 것이다. 항GP75 CFP를 발현하는 마우스 단핵구는 대용 종양 신생항원(이 경우 OVA 단백질로부터 유래)을 식세포작용을 통해 포식하고, 프로세싱하고, OVA로부터 유래된 클래스 I 제한 펩티드(SIINFEKL(서열 번호 87))에 대한 동족 TCR을 보유하는 T 세포에 제시할 수 있고, 및 T 세포 활성화는 IL2(좌측) 또는 인터페론(우측) 생성에 의해 측정되는 반면; ATAK 수용체를 발현하지 않는 동일한 마우스로부터의 단핵구는 상기와 같이 포식, 프로세싱 및 제시하지 못한다. 이는 항GP75 CFP를 발현하는 마우스 단핵구가 항원을 프로세싱하고, 적응 면역 세포, 예컨대, CD8 T 세포에 교차 제시할 수 있다는 것을 증명하는 것이다. ATAK-GP75(일명 TRP-1 ATAK) 구성물.
도 34는 CFP를 발현하는 인간 단핵구가 선천 면역을 이용하고, 적응 항종양 면역 반응을 자극한다는 것을 보여주는 데이터를 도시한 것이다. 본 데이터는 CFP를 발현하는 인간 단핵구가 종양을 투과하고, 종양에 축적되고, 종양을 인식한다는 것을 입증한다(좌측 상단). 본 데이터는 CFP를 발현하는 인간 단핵구가 골수 세포 활성화, 사이토카인 생산, 케모카인 생산 및 염증성 분극화를 초래한다는 것을 입증한다(우측 상단 그래프). 본 데이터는 CFP를 발현하는 인간 단핵구가 식세포작용(좌측 하단), 사이토카인 및 사멸 수용체(CD95L)를 통해 종양 세포를 직접적으로 살해한다는 것을 입증한다. 본 데이터는 CFP를 발현하는 인간 단핵구가 항원 제시, 에피토프 확산 및 T 세포 인게이지먼트(우측 하단 그래프)를 통해 종양의 장기 제어를 입증하여 면역 레퍼토리의 완전한 활성화를 보장한다는 것을 입증한다.
도 35는 항CD5 CFP를 발현하는 인간 단핵구가 시험관내에서 억제성 종양 미세환경(TME) 조건에서 강력한 활성을 나타낸다는 것을 보여주는 데이터를 도시한 것이다. 항CD5 CFP를 발현하는 인간 단핵구를 IL10, IL4 & TGFβ를 포함하는 배지에서 동족 항원의 부재 또는 존재하에 밤새도록 인큐베이션시켰다. 세포의 식세포 활성은 맨 좌측 상단의 그래프에서 입증된다. 명시된 바와 같은 사이토카인/케모카인을 배양 상청액에서 측정하였다.
도 36은 항CD5 CFP를 발현하는 인간 단핵구가 적응 면역계가 없음에도 불구하고, CD5+ CTCL 이종이식편 모델에서 성장을 억제하고, 생존을 연장시킨다는 것을 보여주는 데이터를 도시한 것이다.
도 37은 CD89(FcR알파) 쇄를 갖는 항GP75 CFP를 코딩하는 RNA를 함유하는 LNP를 마우스에 주사하면, 생체내에서 골수 세포를 선택적으로 프로그래밍하여 강력한 항종양 활성이 초래된다는 것을 보여주는 데이터를 도시한 것이다. 확립된 반응성이 낮은 종양(cold tumor) 모델에서 종양 매스(부피, 측정치 단위 ㎣)가 75% 감소된 것으로 관찰되었다.
도 38은 CD89(FcR알파) 쇄를 갖는 항GP75 CFP를 코딩하는 RNA를 함유하는 LNP를 마우스에 주사하면, TME 내의 염증성 단핵구에 의해 CFP가 발현된다는 것을 보여주는 데이터를 도시한 것이다. >15%의 종양 골수 세포가 항GP75 CFP를 발현하는 것으로 관찰되었다.
도 39는 CD89(FcR알파) 쇄를 갖는 항GP75 CFP를 코딩하는 RNA를 함유하는 LNP를 마우스에 주사하면, 염증성 세포의 축적을 특징으로 하는, TME의 변형이 이루어진다는 것을 보여주는 데이터를 도시한 것이다. 처리는 처리된 동물의 사후 측정에 따르면, 생체내에서 종양 염증성 단핵구(좌측), 및 수지상 세포(우측)를 유도한다. 처리는 선천 면역과 적응 면역을 연결하는 것과 연관된 면역 세포를 증가시켰다.
도 40은 CD89(FcR알파) 쇄를 갖는 항GP75 CFP를 코딩하는 RNA를 함유하는 LNP를 마우스에 주사하면, CTL 증가 및 Treg 감소를 특징으로 하는, TME의 변형이 이루어진다는 것을 보여주는 데이터를 도시한 것이다. 처리는 항종양 CD8 T 세포를 촉진시키고, 종양 연관 Treg를 감소시켰다.
도 41은 처리 전, 및 CD89(FcR알파) 쇄를 갖는 항GP75 CFP를 코딩하는 RNA를 함유하는 LNP의 마우스 내로의 2회 주사 후 24시간째 및 4회 주사 후 72시간째 명시된 염증유발성 혈청 사이토카인의 생산의 데이터를 도시한 것이다.
도 42는 처리 전, 및 CD89(FcR알파) 쇄를 갖는 항GP75 CFP를 코딩하는 RNA를 함유하는 LNP의 마우스 내로의 2회 주사 후 24시간째 및 4회 주사 후 72시간째 명시된 혈청 케모카인의 생산의 데이터를 도시한 것이다.
도 43은 실험 디자인 및 종양 성장을 도시한 것이다. 종양을 0일째 접종하고, 75 ㎣까지 성장시켰다. LNP-mRNA는 2 mg/kg으로 투여하였다.
도 44는 종양에서 T 세포 서브세트 및 표현형을 조사한 것을 도시한 것이다.
도 45는 mRNA-LNP 처리가 종양 내부의 T 세포 하위세트 빈도의 변화를 유도한다는 데이터를 도시한 것이다. 처리는 종양에서 % Treg를 감소시켰다.
도 46a는 GP75-CD89-LNP를 주사맞은 마우스에서 %CD8+ T 세포의 CD8 고갈 마커(PD1) 및 CD8 성숙화/이펙터 T 세포 마커(CD44)의 유세포 분석법에 의한 분석을 보여주는 그래프를 도시한 것이다.
도 46b는 T 세포에서의 PD1 및 CD44 발현의 유세포 분석법 데이터를 도시한 것이다.
도 47a는 GP75-CD89-LNP를 주사맞은 마우스에서 %CD8+ T 세포의 CD8 고갈 마커(TIM3 및 TOX)의 유세포 분석법에 의한 분석을 보여주는 그래프를 도시한 것이다.
도 47b는 T 세포에서의 TIM3 및 TOX 발현의 유세포 분석법 데이터를 도시한 것이다.
도 48a는 GP75-CD89-LNP를 주사맞은 마우스에서 세포 증식 마커 Ki67, 및 T 세포 활성화 마커 그랜자임 B의 유세포 분석법에 의한 분석을 보여주는 그래프를 도시한 것이다.
도 48b는 GP75-CD89-LNP를 주사맞은 마우스로부터의 CD8 T 세포에서 Ki67 및 그랜자임 B의 유세포 분석법 데이터를 도시한 것이다.
도 49는 세포 계통 조사로부터의 데이터를 보여주는 것이고; 마커 및 형광단 패널이 좌측에 명시되어 있다.
도 50은 mRNA/LNP 처리가 면역 세포 집단에서 유의적인 이동을 유도하지 않았다는 것을 나타내는 데이터를 도시한 것이다
도 51은 수용체 발현에 대한 데이터를 보여주는 것이다.
도 52는 수지상 세포에서의 FLAG(즉, 수용체) 발현을 나타내는 도트 플롯을 보여주는 것이다.
도 53은 Ly6Chi 염증성 단핵구에서의 FLAG 발현을 나타내는 도트 플롯을 보여주는 것이다.
도 54는 Ly6Clo 상주 골수 세포에서의 FLAG 발현을 나타내는 도트 플롯을 보여주는 것이다.
도 55는 마우스에서의 처리가 Ly6Chi 및 CCR2hi 염증성 단핵구에서 CD40 및 CD206 수준을 유의적으로 증가시켰다는 것을 나타내는 데이터를 도시한 것이다
도 56은 Ly6Clo 및 CCR2lo 상주 골수 세포에서의 PDL1, CD40, CD86, 및 CD206 수준을 도시한 것이다. 본 데이터는 마우스에서의 처리가 CD40 및 CD206 수준을 유의적으로 증가시켰다는 것을 나타낸다.
도 57은 PDL1, CD40, CD86, 및 CD206 수준을 보여주는 것이고; 결과는 처리가 종양 상주 대식세포에서 PDL1 수준을 약간 감소시켰다는 것을 나타낸다.
도 58은 처리가 비장 중 CD103+CD11b- 수지상 세포 표현형에서 MHCII, CD86 및 CD40을 비롯한 DC 활성화 마커를 유의적으로 증가시켰을 뿐만 아니라, PD-L1 수준도 증가시켰다는 것을 보여주는 것이다.
도 59는 처리가 비장 중 CD103-CD11b+ 수지상 세포 표현형에서 MHCII, CD86 및 CD40을 비롯한 DC 활성화 마커를 유의적으로 증가시켰을 뿐만 아니라, PD-L1 수준도 증가시켰다는 것을 보여주는 것이다.
도 60은 골수 세포에서, 골수 세포가 암 세포와 접촉할 때, 특이적으로 활성화되는 프로테아제 절단가능한, 유도가능한 유전자 전사 활성인자 단백질을 포함하는 키메라 수용체 단백질을 코딩하는 제1 벡터; 및 제1 벡터에 의해 코딩된 유전자 전사 활성인자에 의해 유도가능한 표적 유전자를 발현하는 제2 벡터를 발현하기 위한 예시적인 발현 벡터 디자인을 그래프로 나타낸 대표도를 보여주는 것이다.
도 61a는 도 60의 벡터의 발현에 의해 생성된 예시적인 키메라 단백질을 그래프로 나타낸 대표도를 보여주는 것이다. 도 61a는 또한 PTB가 키메라 수용체 세포내 도메인의 ITAM 모티프의 포스포티로신 잔기에 결합하지 않을 때, PTB에 융합된 데그론 복합체에 의해 개시되는 바와 같이, PTB-HIF-데그론에 융합된 프로테아제가 쉽게 분해된다는 것을 구체적으로 입증한다.
도 61b는 표적 유전자 발현을 유도하는 도 61a의 키메라 단백질의 예상 작용 모드를 도시한 것이다. HIF-데그론 프로테아제가 수용체의 인산화된 ITAM 모티프에 결합하면, 프로테아제는 활성화되어 전사 활성인자 GAL-VP64를 절단한다.
도 62a는 유도성 세포독성 단백질을 코딩하는 핵산 구성물을 그래프로 도시한 것을 보여주는 것이다. 구성물은 골수(예컨대, 대식세포) 세포에 의한 발현 및 분비를 위한 것으로 디자인된 것이다. 구성물은 인간 호산구 주요 염기성 단백질의 산성 도메인 및 세포독성 도메인을 포함한다. 두 도메인은 MMP 인식 펩티드를 코딩하는 서열에 산재되어 있고; MMP 인식 펩티드는 종양 미세환경에 풍부하게 존재하는 MMP에 의해 절단가능하다. MMP의 부재하에서, 분비된 세포독성 단백질은 MMP 인식 펩티드에 의해 결합된, 산성 도메인과의 회합에 의해 비활성 형태로 유지된다.
도 62b는 종양 미세환경에서 MMP에 의한 MMP 인식 서열의 절단시 세포독성 도메인 단백질에 의한 종양 세포의 용해를 유도하는 세포독성 도메인 단백질 활성화를 그래프로 나타낸 대표도를 보여주는 것이다.
모든 용어들은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 이해되는 것으로 의도된다. 달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 개시내용이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다.
본원에서 사용된 섹션 표제는 단지 조직화하기 위한 것이며, 기술된 대상을 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
본 개시내용의 다양한 특징들이 단일 실시양태의 맥락에서 기술될 수 있지만, 이 특징들은 별개로 또는 임의의 적합한 조합으로 제공될 수도 있다. 대조적으로, 본 개시내용이 명료함을 위해 별개의 실시양태의 맥락에서 본원에 기술될 수 있지만, 본 개시내용은 또한 단일 실시양태로 구현될 수도 있다.
본 명세서에서 "일부 실시양태," "한(an) 실시양태," "한(one) 실시양태" 또는 "다른 실시양태"의 언급은 실시양태와 관련하여 기술된 특징, 구조 또는 특성이 본 개시내용의 적어도 일부 실시양태에 포함되나, 반드시 모든 실시양태에 포함될 필요는 없음을 의미한다.
본 명세서 및 청구범위(들)에서 사용된 바와 같이, "포함하는(comprising)"(및 임의의 형태의 포함하는, 예컨대, "포함한다" 및 "포함하고"), "가진"(및 임의의 형태의 가진, 예컨대, "가진다" 및 "갖고"), "포함하는(including)"(및 임의의 형태의 포괄하는, 예컨대, "포함한다" 및 "포함하고") 또는 "함유하는"(및 임의의 형태의 함유하는, 예컨대, "함유한다" 및 "함유하고")이라는 단어는 포괄적이거나, 제한이 없고, 언급되지 않은 추가 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의의 실시양태가 본 개시내용의 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있고, 그 반대도 고려된다. 추가로, 본 개시내용의 조성물은 본 개시내용의 방법을 달성하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 측정가능한 값, 예컨대, 파라미터, 양, 일시적인 지속시간 등을 언급할 때, "약" 또는 "대략"이라는 용어는 특정된 값으로부터 +/-30% 이하, +/-20% 이하, +/-10% 이하, +/-5% 이하 또는 +/-1% 이하의 편차를 포함하기 위한 것이고, 단, 이러한 편차는 본 개시내용의 수행에 적절하여야 한다. "약" 또는 "대략"이라는 수식어가 지칭하는 값 그 자체도 구체적으로 개시된 것임을 이해하여야 한다.
"작용제"는 임의의 세포, 소분자 화학적 화합물, 항체 또는 이들의 단편, 핵산 분자, 또는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다.
"변경" 또는 "변화"는 증가 또는 감소를 지칭할 수 있다. 예를 들면, 변경은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%의, 또는 40%, 50%, 60%만큼의, 또는 심지어 70%, 75%, 80%, 90% 또는 100%만큼의 증가 또는 감소일 수 있다. 예를 들어, 변경은 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배의, 40배, 50배, 60배만큼의, 또는 심지어 70배, 75배, 80배, 90배 또는 100배만큼의 증가 또는 감소일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "항원 제시 세포" 또는 "APC(antigen presenting cell)"는 전문적인 항원 제시 세포(예컨대, B 림프구, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 랑게르한스 세포) 뿐만 아니라, 다른 항원 제시 세포(예컨대, 각질세포, 내피 세포, 성상세포, 섬유아세포, 희소돌기아교세포, 흉선 상피 세포, 갑상선 상피 세포, 아교 세포(뇌), 췌장 베타 세포, 및 혈관 내피 세포)도 포함한다. APC는 주조직적합성 복합체(MHC: Major Histocompatibility complex) 분자를 발현할 수 있고, 그의 표면 상에 MHC와 복합체를 형성하는 항원을 나타낼 수 있고, 이 항원은 T 세포에 의해 인식될 수 있고, T 세포 활성화 및 면역 반응을 유발할 수 있다. 전문적인 항원 제시 세포, 특히, 수지상 세포는 나이브 T 세포를 자극하는 데 있어서 중요한 역할을 한다. 비전문적인 항원 제시 세포, 예컨대, 섬유아세포도 이 프로세스에 기여할 수 있다. APC는 또한 외인성 항원을 프로세싱하고, 클래스 I MHC 분자 상의 프로세싱된 항원을 제시함으로써 펩티드 항원을 교차 제시할 수도 있다. 클래스 I MHC 분자와 함께 인식되는 단백질을 생성하는 항원은 일반적으로 세포 내부에서 생성된 단백질이고, 이 항원은 프로세싱되고, 클래스 I MHC 분자와 회합한다.
"생물학적 샘플"은 유기체로부터 유래된 임의의 조직, 세포, 유체 또는 다른 물질을 지칭할 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체 또는 그의 결합 단편, T 세포 수용체 및/또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정기, 예컨대, 서열 또는 구조 또는 아미노산 잔기를 지칭할 수 있다. 에피토프 결정기는 전형적으로 분자의 화학적 활성 표면 기, 예컨대, 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되고, 일반적으로, 특정 3차원 구조적 특징 뿐만 아니라, 특정 전하 특징도 가진다. "T 세포 에피토프"는 T 세포 수용체에 의해 인식되는 펩티드 또는 펩티드-MHC 복합체를 지칭할 수 있다.
조작된 세포, 예컨대, 조작된 골수 세포는 일시적으로 발현될지라도, 세포 내에 적어도 하나의 외인성 핵산 서열을 가진 세포를 지칭할 수 있다. 외인성 핵산의 발현은 다른 곳에 기술된 다양한 방법들에 의해 수행될 수 있고, 당업계에서 공지된 방법들을 포함한다. 본 개시내용은 조작된 세포, 예를 들면, 조작된 골수 세포, 예컨대, 조작된 식세포성 세포의 제조 및 사용에 관한 것이다. 본 개시내용은 특히, 예를 들어, 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 조작된 세포에 관한 것이다.
용어 "면역 반응"은 T 세포 매개 면역 반응, NK 세포 매개 면역 반응 및/또는 B 세포 매개 면역 반응을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이 반응들은 T 세포 공동자극 및 NK 세포 공동자극의 조절에 의해 영향을 받을 수 있다. 예시적인 면역 반응은 T 세포 반응, 예컨대, 사이토카인 생산 및 세포성 세포독성을 포함한다. 추가로, 면역 반응은 NK 세포 활성화, B 세포 활성화 및/또는 T 세포 활성화, 예컨대, 항체 생산(체액성 반응) 및 사이토카인 반응성 세포, 예컨대, 대식세포의 활성화에 의해 간접적으로 영향을 받는 면역 반응을 포함한다. 면역 반응은 적응 면역 반응을 포함한다. 적응 면역계는 외래 분자 구조물, 예컨대, 침입 유기체의 항원에 반응할 수 있다. 선천 면역계와 달리, 적응 면역계는 병원체에 고도로 특이적이다. 적응 면역은 오래 지속되는 보호도 제공할 수 있다. 적응 면역 반응은 체액성 면역 반응 및 세포 매개 면역 반응을 포함한다. 체액성 면역 반응에서, B 세포에 의해 체액 내로 분비된 항체는 병원체 유래 항원에 결합하여, 다양한 기전, 예컨대, 보체 매개 용해를 통해 병원체를 제거한다. 세포 매개 면역 반응에서, 다른 세포를 파괴할 수 있는 T 세포가 활성화된다. 예를 들어, 질환과 연관된 단백질이 세포에 존재하는 경우, 이 단백질은 세포 내에서 단백질용해에 의해 펩티드로 단편화될 수 있다. 이어서, 특정 세포 단백질은 그 자신을 이 방식으로 형성된 항원 또는 펩티드에 부착시킬 수 있고, 이들을 세포의 표면으로 수송할 수 있고, 여기서 분자 방어 기전, 예컨대, T 세포에 제시될 수 있다. 세포독성 T 세포는 이 항원을 인식할 수 있고, 이 항원을 가진 세포를 살해할 수 있다.
"리간드"는 수용체와 같은 또 다른 분자와 결합할 수 있거나, 복합체를 형성할 수 있는 분자를 지칭할 수 있다. 리간드는 단백질, 당단백질, 탄수화물, 지단백질, 호르몬, 지방산, 인지질, 또는 수용체에 결합하는 임의의 성분을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 수용체는 특정 리간드를 가진다. 일부 실시양태에서, 수용체는 리간드에의 복잡한 결합을 가질 수 있고, 이 경우, 수용체는 구조적 구성, 전하 분포 또는 임의의 다른 물리화학적 특징에서 적어도 유사성을 공유하는 여러 리간드들에 결합할 수 있다. 리간드는 생체분자일 수 있다. 리간드는 비생물적 물질일 수 있다. 예를 들어, 리간드는 스캐빈저 수용체 MARCO에 대한 리간드인 음으로 하전된 입자일 수 있다. 예를 들어, 리간드는 스캐빈저 수용체 SRA1에 대한 리간드인 TiO2일 수 있다.
용어 "주조직적합성 복합체(MHC)," "MHC 분자" 또는 "MHC 단백질"은 항원성 펩티드에 결합할 수 있고, 항원성 펩티드를 T 림프구에 제시할 수 있는 단백질을 지칭한다. 상기 항원성 펩티드는 T 세포 에피토프를 나타낼 수 있다. 인간 MHC는 HLA 복합체로서도 명명된다. 따라서, 용어 "인간 백혈구 항원(HLA: human leukocyte antigen)," "HLA 분자" 또는 "HLA 단백질"은 용어 "주조직적합성 복합체(MHC)," "MHC 분자" 및 "MHC 단백질"과 상호교환적으로 사용된다. HLA 단백질은 HLA 클래스 I 또는 HLA 클래스 II로서 분류될 수 있다. 상기 2종의 HLA 클래스의 단백질들의 구조는 매우 유사하나; 이들은 매우 상이한 기능을 가진다. 클래스 I HLA 단백질은 대다수의 종양 세포들을 포함하는 신체의 거의 모든 세포들의 표면 상에 존재한다. 클래스 I HLA 단백질은 통상적으로 내인성 단백질 또는 세포 내부에 존재하는 병원체로부터 유래된 항원으로 로딩된 후, 이어서, 나이브 또는 세포독성 T 림프구(CTL: cytotoxic T-lymphocyte)에 제시된다. HLA 클래스 II 단백질은 수지상 세포, B 세포 및 대식세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 항원 제시 세포(APC) 상에 존재한다. 이들은 주로 외부 항원 공급원, 예컨대, 세포의 외부로부터 프로세싱된 펩티드를 헬퍼 T 세포에 제시한다.
HLA 클래스 II 시스템에서, B 세포는 엔도솜 내로의 더 일반적인 세포내이입을 나타내지만, 대식세포 및 미성숙 수지상 세포와 같은 식세포는 식세포작용을 통해 엔티티를 파고솜 내로 흡수할 수 있고, 상기 파고솜은 리소솜과 융합되고, 리소솜의 산성 효소는 흡수된 단백질을 많은 상이한 펩티드로 절단한다. 자가포식은 HLA 클래스 II 펩티드의 또 다른 공급원이다. 가장 많이 연구된 서브클래스 II HLA 유전자는 HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA 및 HLA-DRB1이다.
HLA 클래스 II 분자에 의한 CD4+ 헬퍼 T 세포에의 펩티드의 제시는 외래 항원에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다. CD4+ T 세포는 일단 활성화되면, B 세포 분화 및 항체 생산 뿐만 아니라, CD8+ T 세포(CTL) 반응도 촉진할 수 있다. CD4+ T 세포는 다른 면역 세포의 분화를 활성화시키고, 유도하는 사이토카인 및 케모카인도 분비할 수 있다. HLA 클래스 II 분자는 전형적으로 클래스 I 펩티드 결합 홈보다 더 개방된 펩티드 결합 홈을 형성하기 위해 상호작용하는 α 쇄와 β 쇄의 이종이량체이다.
HLA 대립유전자는 전형적으로 공우성 방식으로 발현된다. 예를 들어, 각각의 사람은 3개의 클래스 I 유전자(HLA-A, HLA-B 및 HLA-C) 각각의 2개의 대립유전자를 보유하므로, 6개의 상이한 타입의 클래스 II HLA를 발현할 수 있다. 클래스 II HLA 유전자좌에서, 각각의 사람은 한 쌍의 HLA-DP 유전자(α 쇄 및 β 쇄를 코딩하는 DPA1 및 DPB1), HLA-DQ(α 쇄 및 β 쇄에 대한 DQA1 및 DQB1), 하나의 유전자 HLA-DRα(DRA1) 및 하나 이상의 유전자 HLA-DRβ(DRB1 및 DRB3, DRB4 또는 DRB5)를 유전한다. 예를 들어, HLA-DRB1은 거의 400개 초과의 공지된 대립유전자를 가진다. 이는 하나의 이형접합성 개체가 6개 또는 8개의 기능적 클래스 II HLA 대립유전자(각각의 부모로부터 3개 이상)을 유전할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, HLA 유전자는 고도의 다형성을 갖고; 많은 상이한 대립유전자들이 한 집단 내부의 상이한 개체에 존재한다. HLA 단백질을 코딩하는 유전자는 많은 가능한 변이를 가짐으로써, 각 사람의 면역계가 광범위한 외부 침입자에 반응할 수 있게 한다. 일부 HLA 유전자는 수백 개의 확인된 버전들(대립유전자들)을 갖고, 이는 각각 특정 번호를 제공받는다. 일부 실시양태에서, 클래스 I HLA 대립유전자는 HLA-A*02:01, HLA-B*14:02, HLA-A*23:01, HLA-E*01:01(비고전적)이다. 일부 실시양태에서, 클래스 II HLA 대립유전자는 HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02, HLA-DRB*11:01, HLA-DRB*15:01, 및 HLA-DRB*07:01이다.
"골수 세포"는 넓게는 조혈 세포 시스템의 골수 계통의 세포를 지칭할 수 있고, 예를 들어, 림프구 계통을 배제할 수 있다. 예를 들어, 골수 세포는 과립구 계통 및 단핵구 계통의 세포를 포함한다. 골수 세포는 골수 내의 조혈 줄기 세포로부터 유래된 공통된 조상세포로부터 분화된다. 골수 세포 계통에의 위탁은 상이한 전사 인자의 활성화에 의해 좌우될 수 있고, 따라서, 골수 세포는 세포외 자극 및 세포내 자극을 기반으로 말단 세포 유형으로 추가로 분화하는 능력으로서 기술될 수 있는 분화유연성 수준을 가진 세포로서 특징화될 수 있다. 골수 세포는 그의 표면 상의 다양한 케모카인 수용체를 통해 국소 조직 내로 신속히 모집될 수 있다. 골수 세포는 다양한 사이토카인 및 케모카인에 반응한다.
예를 들어, 골수 세포는 하나 이상의 사이토카인 및 케모카인, 예컨대, G-CSF, GM-CSF, Flt3L, CCL2, VEGF 및 S100A8/9의 영향하에서 골수에서 조혈 줄기 세포로부터 유래된 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 전구 세포이다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 공통된 골수 조상세포 또는 과립구 조상세포, 골수아세포 또는 단핵구-수지상 세포 조상세포, 또는 이들의 조합의 특징을 가진 세포일 수 있다. 골수는 과립구 또는 단핵구, 또는 그의 전구 세포를 포함할 수 있다. 골수는 미성숙 과립구, 미성숙 단핵구, 미성숙 대식세포, 미성숙 호중구 및 미성숙 수지상 세포를 포함할 수 있다. 골수는 단핵구 또는 전구단핵구 세포 또는 단핵구 전구체를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 본원에서 사용되는 바, 골수 세포는 M0 표현형, M1 표현형 또는 M2 표현형을 가진 단핵구를 지칭할 수 있다. 골수는 수지상 세포(DC: dendritic cell), 성숙한 DC, 단핵구 유래 DC, 형질세포양 DC, 전구수지상 세포, 또는 DC의 전구체를 포함할 수 있다. 골수는 성숙한 호중구, 호중구 전구체 또는 다형핵구(PMN)일 수 있는 호중구를 포함할 수 있다. 골수는 대식세포, 단핵구 유래 대식세포, 조직 대식세포, M0, M1 또는 M2 표현형의 대식세포를 포함할 수 있다. 골수는 종양 침윤 단핵구(TIM)를 포함할 수 있다. 골수는 종양 연관 단핵구(TAM: tumor associated monocyte)를 포함할 수 있다. 골수는 골수 유래 억제제 세포(MDSC: myeloid derived suppressor cell)를 포함할 수 있다. 골수는 조직 상주 대식세포를 포함할 수 있다. 골수는 종양 연관 DC(TADC: tumor associated DC)를 포함할 수 있다. 따라서, 골수 세포는 하나 이상의 세포 표면 마커, 예를 들어, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD38, CCR5, CD66, Lox-1, CD11c, CD64, CD68, CD163, CCR2, CCR5, HLA-DR, CD1c, CD83, CD141, CD209, CD205, P 셀렉틴, 인테그린, ICAMS, VCAMS, MHC-II, CD123, CD303, CD304, SIGLEC 패밀리 단백질 및 CLEC 패밀리 단백질을 발현할 수 있다. 일부 경우에서, 골수 세포는 하나 이상의 세포 표면 마커, 예를 들어, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD66, Lox-1, CD11c, CD64, CD68, CD163, CCR2, CCR5, HLA-DR, CD1c, CD83, CD141, CD209, MHC-II, CD123, CD303, CD304 또는 이들의 조합의 높거나 낮은 발현을 특징으로 할 수 있다.
"식세포작용"은 "포식"과 상호교환적으로 사용되고, 세포가 입자, 예컨대, 암 세포 또는 감염된 세포를 포식하는 프로세스를 지칭할 수 있다. 상기 프로세스는 입자를 함유하는 내부 구획(파고좀)을 생성할 수 있다. 상기 프로세스는 신체로부터 입자, 예컨대, 암 세포 또는 감염된 세포를 소화하고/거나, 제거하는 데 이용될 수 있다. 식세포 수용체는 식세포작용의 프로세스에 관여할 수 있다. 식세포작용의 프로세스는 면역 반응 및 항원 제시와 밀접하게 커플링될 수 있다. 외인성 항원의 프로세싱은 일부 타입의 세포내이입 이벤트에 의한 전문적인 항원 제시 세포 내로의 흡수 후에 일어난다. 식세포작용은 항원 제시도 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 암 항원을 포함하는, 식세포작용을 통해 포식된 세포 또는 병원체로부터의 항원은 프로세싱되고 APC의 세포 표면 상에 제시될 수 있다.
"폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 함께 연결된 아미노산을 함유하는 분자, 예컨대, 당단백질, 지단백질, 세포 단백질 또는 막 단백질을 지칭할 수 있다. 폴리펩티드는 단백질의 하나 이상의 서브유닛을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 재조합 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 단일 아미노산 쇄 내에 스페이서, 링커 또는 펩티드 절단 서열에 의해 분리될 수 있는 1개 초과의 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 융합된 폴리펩티드일 수 있다. 폴리펩티드는 하나 이상의 도메인, 모듈 또는 모이어티를 포함할 수 있다.
"수용체"는 신호를 전달하는 폴리펩티드, 예컨대, 세포외 신호를 세포에 전달하는 폴리펩티드로 구성된 화학적 구조물을 지칭할 수 있다. 수용체는 세포, 세포 형성 또는 유기체에서 정보를 전달하는 역할을 할 수 있다. 수용체는 적어도 하나의 수용체 유닛을 포함하고, 2개 이상의 수용체 유닛을 함유할 수 있고, 여기서, 각각의 수용체 유닛은 단백질 분자, 예를 들어, 당단백질 분자를 포함한다. 수용체는 리간드에 결합하고, 리간드와 복합체를 형성할 수 있는 구조물을 함유할 수 있다. 신호전달 정보는 세포 표면 상의 리간드와 결합한 후, 수용체의 입체구조적 변화에 의해 전달될 수 있다.
용어 "항체"는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgA(IgA1 및 IgA2를 포함), IgD, IgE, IgM 및 IgY를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 일반적으로 면역글로불린으로서 공지되어 있는 한 부류의 단백질을 지칭한다. 용어 "항체"는 전장 항체, 단일 쇄 항체, 단일 도메인 항체(sdAb) 및 그의 항원 결합 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항원 결합 항체 단편은 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd(VH 및 CH1로 구성), 단일 쇄 가변 단편(scFv), 단일 쇄 항체, 디술피드에 의해 연결된 가변 단편(dsFv), 및 VL 및/또는 VH 도메인을 포함하는 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항체는 임의의 동물 기원으로로부터 유래될 수 있다. 단일 쇄 항체를 비롯한 항원 결합 항체 단편은 단독으로, 또는 힌지 영역, CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인 중 하나 이상과 함께 가변 영역(들)을 포함할 수 있다. 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 임의의 조합도 포함된다. 항체는 예컨대, HLA와 회합된 폴리펩티드 또는 HLA-펩티드 복합체에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, 다중클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 및 인간 단일클론 및 다중클론 항체일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "결합제"는 표적에 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 나타내며, 여기서, 결합제에 대한 표적은 예컨대, 암 항원, 당단백질 등일 수 있다. 결합제는 종종 CFP, 예컨대, CAR을 나타내는 데 사용되며, 예컨대, CD5 항원에 대한 결합 도메인을 포함하는 CD5 결합제와 같이, 그의 결합 대상이 되는 표적에 의해 명명된다. 일부 경우에서, 이는 대안적으로, 또는 상호교환적으로, 항CD5 결합제, 또는 항TROP2 결합제로도 명명된다. 일반적으로 사용되는 바, 결합제라는 용어는 결합 도메인을 갖는 모든 분자를 지칭한다. 일부 경우에서, 문맥 내에서 기술될 때, 결합제는 BiME 또는 TRiME일 수 있다.
용어 "재조합 핵산"은 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 핵산을 지칭한다. 재조합 핵산은 자연적으로 발생되지 않는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 재조합 핵산은 실험실에서 합성될 수 있다. 재조합 핵산은 재조합 DNA 기술, 예를 들어, DNA의 효소 변형, 예컨대, 효소 제한 분해, 라이게이션 및 DNA 클로닝을 이용함으로써 제조될 수 있다. 재조합 핵산은 DNA, RNA, 그의 유사체, 또는 이들의 조합일 수 있다. 재조합 DNA는 예컨대, 메신저 RNA(mRNA)를 생성하기 위해 생체외에서 또는 시험관내에서 전사될 수 있다. 재조합 mRNA를 단리하고, 정제하고, 사용하여 세포를 형질감염시킬 수 있다. 재조합 핵산은 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
핵산을 세포 내로 도입하거나, 혼입하는 프로세스는 형질전환, 형질감염 또는 형질도입을 통한 프로세스일 수 있다. 형질전환은 박테리아 세포에 의한 외래 핵산의 흡수 프로세스이다. 이 프로세스는 플라스미드 DNA의 증식, 단백질 생성 및 다른 적용에 적합하다. 형질전환은 재조합 플라스미드 DNA를, 환경으로부터 세포외 DNA를 흡수하는 적격 박테리아 세포 내로 도입한다. 일부 박테리아 종은 특정 환경 조건하에서 자연적으로 적격하지만, 적격성은 실험실 환경에서 인공적으로 유도된다. 형질감염은 DNA, RNA 또는 항체와 같은 소분자를 진핵 세포 내로 도입하는 것이다. 형질감염은 박테리오파지를 박테리아 세포 내로 도입하는 것을 지칭할 수도 있다. '형질도입'은 주로 재조합 바이러스 벡터 입자를 표적 세포 내로 도입하는 것을 기술하는 데 사용되는 반면, '감염'은 야생형 바이러스에 의한 인간 또는 동물의 천연 감염을 지칭한다.
용어 "벡터"는 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있고, 핵산 분자를 클로닝할 수 있게 하는 핵산 분자를 지칭할 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 바이러스 벡터, 파지 벡터, 효모 벡터, 포유동물 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 외인성 유전자 형질전환을 위한 벡터는 플라스미드일 수 있다. 특정 실시양태에서, 벡터는 복제 기점, 및 숙주 세포에서의 핵산 서열의 복제 및/또는 유지에 필요한 다른 요소를 함유하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 벡터 또는 플라스미드는 발현 벡터이다. 발현 벡터는 이 벡터에 작동적으로 연결된 유전자 및/또는 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터 또는 플라스미드는 고리형 이중 가닥 DNA 분자의 형태로 존재한다. 벡터 또는 플라스미드는 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있거나, 통합되지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 플라스미드의 핵산 서열은 도입 후, 숙주 세포의 게놈 또는 염색체 내로 통합되지 않는다. 예를 들어, 플라스미드는 숙주 세포에서 핵산 서열, 예컨대, 플라스미드가 보유하는 유전자 또는 오픈 리딩 프레임의 일시적인 발현 또는 안정한 발현을 위한 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 일시적인 발현 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 숙주 세포에서 자율적으로 복제하는, 안정적으로 발현된 벡터이다. 일부 실시양태에서, 플라스미드의 핵산 서열은 숙주 세포 내로 도입될 때, 숙주 세포의 게놈 또는 염색체 내로 통합된다. 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있는 발현 벡터는 플라스미드, 에피솜, 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 박테리오파지 또는 바이러스 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 벡터는 (예컨대, 역전사를 통해) 숙주 세포 내로 도입될 때, 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있는 RNA 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다. 등가의 기능을 제공하는, 당업자에 의해 공지되어 있는 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들어, 자기 복제 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈 내로 통합될 수 있는 벡터도 사용될 수 있다. 예시적인 벡터는 그에 연결되어 있는 핵산을 자율적으로 복제할 수 있고/거나, 발현할 수 있는 벡터이다.
융합 단백질과 관련하여 사용된 용어 "스페이서" 또는 "링커"는 융합 단백질의 2개의 다른 펩티드 서열을 연결하는 펩티드 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커 또는 스페이서는 단백질 또는 RNA 서열 사이의 약간의 최소 거리 또는 다른 공간적 관계를 연결하거나, 보존하는 것 이외의 특정 생물학적 활성을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 스페이서의 성분 아미노산은 분자의 일부 특성, 예컨대, 분자의 폴딩, 가요성, 순전하 또는 소수성에 영향을 미치도록 선택될 수 있다. 본 개시내용의 실시양태에서 사용되기에 적합한 링커는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 직쇄 또는 분지쇄 탄소 링커, 헤테로사이클릭 탄소 링커 또는 펩티드 링커를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 링커는 각각의 항원성 펩티드가 적절히 폴딩되도록 보장하기에 충분한 거리에 의해 2개 이상의 폴리펩티드, 예컨대, 2개의 항원성 펩티드를 분리하는 데 사용된다. 예시적인 펩티드 링커 서열은 확장된 가요성 입체구조를 채택하고, 정돈된 2차 구조를 발생시키는 경향을 나타내지 않는다. 가용성 링커 단백질 영역의 아미노산은 Gly, Asn 및 Ser, 또는 Gly, Asn 및 Ser을 함유하는 아미노산 서열의 임의의 순열을 포함할 수 있다. 다른 거의 중성인 아미노산, 예컨대, Thr 및 Ala도 링커 서열에 사용될 수 있다.
"치료한다," "치료된," "치료하는," "치료"라는 용어 등은 장애 및/또는 이와 연관된 증상(예컨대, 신생물 또는 종양 또는 감염원 또는 자가면역 질환)을 감소시키거나, 예방하거나, 호전시키는 것을 지칭하기 위한 것이다. "치료하는"은 질환(예컨대, 암 또는 감염원에 의한 감염 또는 자가면역 질환)의 발병 또는 의심된 발병 후 요법을 피험체에게 투여하는 것을 지칭할 수 있다. "치료하는"은 질환과 관련된 임의의 증상 또는 다른 좋지 않은 효과 및/또는 요법과 연관된 부작용의 발생 또는 재발의 빈도, 또는 중증도를 경감시키는 것을 지칭할 수 있는 "호전"의 개념을 포함한다. "치료하는"이라는 용어는 환자의 질환 또는 장애의 중증도를 감소시키는 것, 예컨대, 질환을 앓는 환자의 수명을 연장시키거나, 생존가능성을 높이는 것, 또는 그의 재발을 지연시키는 것, 예컨대, 질환을 앓았던 환자의 관해 기간을 연장시키는 것을 지칭하는 "관리"의 개념도 포함한다. 배제되지는 않지만, 장애 또는 병태를 치료하는 것은 장애, 병태 또는 그와 연관된 증상이 완전히 제거될 것을 요구하지 않는다는 것이 인식된다. 본원에서 사용되는 바, "예방한다," "예방하는," "예방"이라는 용어 및 그의 문법적으로 동등한 용어는 작용제 또는 화합물의 투여가 시작될 때, 질환 또는 병태와 연관된 증상을 발생시키지 않은 피험체에서 이러한 증상의 발병을 피하거나, 지연시키는 것을 의미할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 피험체 또는 환자를 치료하는 것은 치료 조성물, 예컨대, 약물, 대사물질, 예방 성분, 또는 약물, 대사물질 또는 예방 성분을 코딩하거나, 다른 방식으로 형성하는 핵산, 펩티드 또는 단백질을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료하는 것은 세포 또는 세포 집단을, 치료를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료하는 것은 본원에 기술된 하나 이상의 조작된 세포, 예컨대, 하나 이상의 조작된 골수 세포, 예컨대, 식세포성 세포를 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료하는 것은 병리학적 질환, 병태 또는 증후군, 또는 잠복 질환, 병태 또는 증후군일 수 있는 질환, 병태 또는 증후군을 치료하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 본원에서 사용되는 바, 치료하는 것은 치료 백신을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 식세포성 세포는 환자 또는 피험체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 인간 피험체에게 투여된 세포는 면역원성을 감소시킨다. 예를 들어, 조작된 식세포성 세포는 이식편 대 숙주 질환(GVHD: graft versus host disease) 또는 동족 살해 효과를 유발하지 않을 수 있거나, 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 피험체에게 투여된 조작된 세포는 피험체에게 면역적합하다(즉, 피험체에서 천연적으로 발현된 매칭 HLA 서브타입을 가진다). 피험체 특이적 HLA 대립유전자 또는 피험체의 HLA 유전형은 당업계에서 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 확인될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 상기 방법은 시퀀싱 데이터 세트로부터 추출된 리드와, 다형성 유전자의 대립유전자 변이체를 포함하는 유전자 참조 세트의 정렬을 생성하는 단계, 상기 정렬에서 각각의 대립유전자 변이체에 대한 제1 사후 확률 또는 사후 확률 유도 점수를 결정하는 단계, 제1 대립유전자 변이체로서 최대 제1 사후 확률 또는 사후 확률 유도 점수를 가진 대립유전자 변이체를 확인하는 단계, 제1 대립유전자 변이체 및 하나 이상의 다른 대립유전자 변이체와 정렬된 하나 이상의 중첩 리드를 확인하는 단계, 가중 계수를 이용하여 하나 이상의 다른 대립유전자 변이체에 대한 제2 사후 확률 또는 사후 확률 유도 점수를 결정하는 단계, 최대 제2 사후 확률 또는 사후 확률 유도 점수를 가진 대립유전자 변이체를 선택함으로써 제2 대립유전자 변이체를 확인하는 단계(제1 대립유전자 변이체 및 제2 대립유전자 변이체는 다형성 유전자에 대한 유전자 타입을 정의한다), 및 제1 대립유전자 변이체 및 제2 대립유전자 변이체의 결과물을 제공하는 단계를 포함할 수 있는 다형성 유전자 타입을 확인하는 것을 포함한다.
"단편"은 단백질 또는 핵산의 일부를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단편은 참조 단백질 또는 핵산의 생물학적 활성의 적어도 50%, 75%, 또는 80%, 또는 90%, 95%, 또는 심지어 99%를 보유한다.
"단리된," "정제된," "생물학적으로 순수한"이라는 용어 및 그의 문법적으로 동등한 용어는 물질이 그의 천연 상태에서 발견되는 바와 같이, 그 물질이 보통 수반하는 성분을 다양한 정도로 함유하지 않는 물질을 지칭한다. "단리시키다"는 원래의 공급원 또는 주변으로부터의 분리 정도를 의미한다. "정제시키다"는 단리보다 더 높은 분리 정도를 의미한다. "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한" 단백질은 임의의 불순물이 단백질의 생물학적 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않거나, 다른 불리한 결과를 야기하지 않도록 다른 물질을 충분히 함유하지 않는다. 즉, 본 개시내용의 핵산 또는 펩티드는 재조합 DNA 기법에 의해 생성될 때, 세포 물질, 바이러스 물질 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성될 때, 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는다면, 정제된 것이다. 순도 및 균질도는 전형적으로 분석 화학 기법, 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 이용함으로써 측정된다. "정제된"이라는 용어는 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 본질적으로 1개의 밴드를 생성한다는 것을 의미할 수 있다. 변형, 예를 들어, 인산화 또는 글리코실화될 수 있는 단백질의 경우, 상이한 변형은 따로 정제될 수 있는 상이한 단리된 단백질을 생성할 수 있다.
용어 "신생물" 또는 "암"은 부적절하게 높은 수준의 세포 분열, 부적절하게 낮은 수준의 아폽토시스, 또는 그 둘 모두에 의해 유발되거나, 그를 초래하는 임의의 질환을 지칭한다. 교모세포종은 신생물 또는 암의 비제한적인 예이다. 용어 "암" 또는 "종양" 또는 "과다증식성 장애"는 암 유발 세포의 전형적인 특징, 예컨대, 제어되지 않는 증식, 불멸성, 전이성 잠재능, 빠른 성장 및 증식률, 및 특정 특징적인 형태학적 특징을 가진 세포의 존재를 지칭한다. 암 세포는 종종 종양 형태로 존재하나, 상기 세포는 동물 내에 단독으로 존재할 수 있거나, 비종양유발성 암 세포, 예컨대, 백혈병 세포일 수 있다.
용어 "백신"은 질환(예컨대, 신생물/종양/감염원/자가면역 질환)의 예방 및/또는 치료를 위한 면역을 생성하는 조성물을 의미하는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, 백신은 재조합 핵산, 또는 재조합 핵산을 포함하고, 발현하는 세포를 포함하는 의약이고, 백신접종으로 특정 방어 및 보호 물질을 생성하기 위해 인간 또는 동물에 사용되기 위한 것이다. "백신 조성물"은 약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 측면은 식세포성 세포 기반 백신을 제조하는 데 있어서 기술의 이용에 관한 것이다.
"약학적으로 허용되는"이라는 용어는 인간을 비롯한 동물에 사용되도록 연방정부 또는 주정부의 규제 관청에 의해 승인되었거나, 승인될 수 있거나, 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 열거되어 있다는 것을 지칭한다. "약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제"는 작용제와 함께 피험체에게 투여될 수 있고, 그의 약리학적 활성을 파괴하지 않고, 치료량의 작용제를 전달하기에 충분한 용량으로 투여될 때, 독성을 나타내지 않는 부형제, 담체 또는 희석제를 지칭한다.
본 개시내용의 방법에 유용한 핵산 분자는 활성을 갖거나, 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 핵산 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 내인성 서열과 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 이중 가닥 핵산 분자의 적어도 한 가닥과 하이브리드화할 수 있다. "하이브리드화한다"는 핵산 분자가 다양한 엄격도 조건하에서 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 사이에 쌍을 형성하여 이중 가닥 분자를 형성할 때를 지칭한다(예컨대, 문헌 [Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399]; [Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507] 참조). 예를 들어, 엄격한 염 농도는 통상적으로 약 750 mM 미만의 NaCl 및 75 mM의 시트르산삼나트륨, 약 500 mM 미만의 NaCl 및 50 mM의 시트르산삼나트륨, 또는 약 250 mM 미만의 NaCl 및 25 mM의 시트르산삼나트륨일 수 있다. 낮은 엄격도 하이브리드화는 유기 용매, 예컨대, 포름아미드의 부재하에서 수득될 수 있는 반면, 높은 엄격도 하이브리드화는 적어도 약 35% 포름아미드 또는 적어도 약 50% 포름아미드의 존재하에서 수득될 수 있다. 엄격한 온도 조건은 통상적으로 적어도 약 30℃, 적어도 약 37℃ 또는 적어도 약 42℃의 온도를 포함할 수 있다. 추가 파라미터, 예컨대, 하이브리드화 시간, 계면활성제, 예컨대, 도데실황산나트륨(SDS)의 농도 및 캐리어 DNA의 포함 또는 배제의 변경은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 다양한 수준의 엄격도는 필요에 따라 상기 다양한 조건들을 조합함으로써 달성될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 하이브리드화는 750 mM NaCl, 75 mM 시트르산삼나트륨 및 1% SDS에서 30℃에서 일어날 수 있다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 하이브리드화는 500 mM NaCl, 50 mM 시트르산삼나트륨, 1% SDS, 35% 포름아미드 및 100 ㎍/㎖ 변성된 연어 정자 DNA(ssDNA)에서 37℃에서 일어날 수 있다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 하이브리드화는 250 mM NaCl, 25 mM 시트르산삼나트륨, 1% SDS, 50% 포름아미드 및 200 ㎍/㎖ ssDNA에서 42℃에서 일어날 수 있다. 상기 조건의 유용한 변형은 당업자에게 용이하게 자명할 것이다. 대다수의 적용에 있어서, 하이브리드화 후 세척 단계도 엄격도가 달라질 수 있다. 세척 엄격도 조건은 염 농도 및 온도에 의해 정의될 수 있다. 상기와 같이, 세척 엄격도는 염 농도의 감소 또는 온도의 증가에 의해 증가될 수 있다. 예를 들어, 세척 단계를 위한 엄격한 염 농도는 약 30 mM 미만의 NaCl 및 3 mM 시트르산삼나트륨, 또는 약 15 mM 미만의 NaCl 및 15 mM 시트르산삼나트륨일 수 있다. 세척 단계를 위한 엄격한 온도 조건은 적어도 약 25℃, 적어도 약 42℃ 또는 적어도 약 68℃의 온도를 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 세척 단계는 30 mM NaCl, 3 mM 시트르산삼나트륨 및 0.1% SDS에서 25℃에서 일어날 수 있다. 다른 예시적인 실시양태에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산삼나트륨 및 0.1% SDS에서 42℃에서 일어날 수 있다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 세척 단계는 15 mM NaC1, 1.5 mM 시트르산삼나트륨 및 0.1% SDS에서 68℃에서 일어날 수 있다. 상기 조건의 추가 변형은 당업자에게 용이하게 자명할 것이다. 하이브리드화 기법은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Benton and Davis (Science 196:180, 1977)]; [Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975)]; [Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001)]; [Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York)]; 및 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]에 기술되어 있다.
"실질적으로 동일한"은 참조 아미노산 서열(예를 들어, 본원에 기술된 아미노산 서열 중 어느 하나) 또는 핵산 서열(예를 들어, 본원에 기술된 핵산 서열 중 어느 하나)와 적어도 50%의 동일성을 나타내는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 서열은 비교를 위해 사용된 서열과 아미노산 수준 또는 핵산에서 적어도 적어도 60%, 80% 또는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 심지어 99% 또는 그 초과로 동일할 수 있다. 서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어(예를 들어, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)(미국 위스콘신주 53705 매디슨 1710 유니버시티 애비뉴 위스콘신 대학교 생명공학 센터)의 서열 분석 소프트웨어 패키지, BLAST, BESTFIT, GAP 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 이용함으로써 측정된다. 상기 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및/또는 다른 변형에 상동성 정도를 배정함으로써 동일한 또는 유사한 서열을 매칭한다. 보존적 치환은 전형적으로 하기 군 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성 정도를 측정하는 예시적인 접근법에서, BLAST 프로그램은 밀접하게 관련된 서열을 표시하는, e-3과 e-m°사이의 확률 점수와 함께 사용될 수 있다. "참조"는 비교의 표준이다. 각각의 서열에서 특정 위치 또는 잔기의 넘버링은 사용된 특정 단백질 및 넘버링 체계에 의해 좌우됨을 이해할 것이다. 넘버링은 예컨대, 성숙한 단백질의 전구체 및 성숙 단백질 그 자체에서 상이할 것이고, 종 사이의 서열 차이는 넘버링에 영향을 미칠 수 있다. 당업자는 당업계에서 널리 공지되어 있는 방법, 예컨대, 참조 서열에의 서열 정렬 및 상동성 잔기의 확인으로 임의의 상동성 단백질 및 각각의 코딩 핵산에서 각각의 잔기를 확인할 수 있을 것이다.
용어 "피험체" 또는 "환자"는 치료, 관찰 또는 실험의 객체인 유기체, 예컨대, 동물(예컨대, 인간)을 지칭한다. 단지 예로써, 피험체는 인간 또는 비인간 포유동물, 예컨대, 비인간 영장류, 뮤린, 소, 말, 개, 양 또는 고양이를 포함하나, 이에 제한되지 않는 포유동물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "치료 효과"는 장애(예컨대, 신생물, 종양 또는 감염원에 의한 감염 또는 자가면역 질환) 또는 그의 연관된 병리의 증상 중 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시키는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "치료 유효량"은 세포 또는 피험체에게 1회 또는 다회 용량으로 투여될 때, 상기 치료의 부재하에서 예상된 것을 능가하는 수준으로 이러한 장애를 앓는 환자의 생존가능성을 높이거나, 장애의 하나 이상의 징후 또는 증상을 감소, 예방, 또는 지연시키는 등 그렇게 작용하는 데 효과적인 작용제의 양을 지칭한다. "치료 유효량"은 치료 효과를 달성하는 데 요구되는 양을 정량화하기 위한 것으로 의도된다. 당업계에서 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사는 요구되는 약학 조성물의 "치료 유효량"(예컨대, ED50)을 용이하게 결정하고, 처방할 수 있다.
본원에서는 표적 세포에 특이적으로 결합하도록 디자인된 조작된 골수 세포(호중구, 단핵구, 골수 수지상 세포(mDC: myeloid dendritic cell), 비만 세포 및 대식세포를 포함하나, 이에 제한되지 않음)를 제공한다. 조작된 골수 세포는 직접적으로(예컨대, 식세포작용을 통해) 및/또는 간접적으로(예컨대, T 세포를 활성화시킴으로써) 표적 세포를 공격하고, 살해할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 암 세포이다.
암은 본 개시내용에서 상세히 기술된 한 예시적인 실시양태이지만, 본원에 기술된 방법 및 기술은 체내의 감염된 세포 또는 다른 방식으로 이환된 세포를 표적화하는 데 유용할 것으로 예상된다. 유사하게, 조작된 세포를 사용하는 치료제 및 백신 조성물이 본원에 기술되어 있다.
본원에서는 암과 같은 질환 또는 병태를 치료하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에서 제공된 조성물 및 방법은 이환된 세포, 예컨대, 암 세포를 표적화하기 위해 호중구, 단핵구, 골수 수지상 세포(mDC), 비만 세포 및 대식세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는 인간 골수 세포를 사용한다. 본원에서 제공된 조성물 및 방법은 T 세포 활성화 및 모집, 이펙터 면역 세포 활성화(예컨대, CD8 T 세포 및 NK 세포 활성화), 항원 교차 제시, 증강된 염증 반응, 조절 T 세포의 감소 및 식세포작용을 포함하는 다양한 기전들로 이환된 세포, 예컨대, 암 세포 및/또는 이환된 조직을 제거하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 골수 세포는 암 세포에 대한 면역학적 반응을 지속시키는 데 사용될 수 있다.
본원에서는 키메라 융합 단백질(CFP), 예컨대, 식세포 수용체(PR) 융합 단백질(PFP: phagocytic fusion protein), 스캐빈저 수용체(SR: scavenger receptor) 융합 단백질(SFP: scavenger fusion protein), 인테그린 수용체(IR: integrin receptor) 융합 단백질(IFP: integrin fusion protein) 또는 카스파제 모집 수용체(카스파제-CAR) 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 재조합 핵산에 의해 코딩된 CFP는 표적 세포의 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인(ECD)을 포함할 수 있다. 세포외 도메인은 수용체, 예컨대, CD2, CD8, CD28, CD68, 식세포 수용체, 스캐빈저 수용체 또는 인테그린 수용체로부터 유래된 힌지 도메인 또는 세포외 도메인에 융합될 수 있다. 재조합 핵산에 의해 코딩된 CFP는 막횡단 도메인, 예컨대, CD2, CD8, CD28, CD68, 식세포 수용체, 스캐빈저 수용체 또는 인테그린 수용체로부터 유래된 막횡단 도메인도 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산에 의해 코딩된 CFP는 세포내 신호전달 도메인, 예컨대, 식세포 수용체, 스캐빈저 수용체 또는 인테그린 수용체로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 예를 들어, 세포내 도메인은 식세포 수용체, 스캐빈저 수용체 또는 인테그린 수용체로부터 유래된 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포내 도메인은 식세포 활성, 염증 반응, 산화질소 생성, 인테그린 활성화, (예컨대, 케모카인 수용체 발현을 통한) 증강된 이펙터 세포 이동, 항원 제시, 및/또는 증강된 교차 제시를 촉진시키는 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CFP는 식세포 수용체 융합 단백질(PFP)이다. 일부 실시양태에서, CFP는 식세포 스캐빈저 수용체 융합 단백질(PFP)이다. 일부 실시양태에서, CFP는 인테그린 수용체 융합 단백질(IFP)이다. 일부 실시양태에서, CFP는 염증성 수용체 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산에 의해 코딩된 CFP는 모집 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 예를 들어, 세포내 도메인은 하나 이상의 PI3K 모집 도메인, 카스파제 모집 도메인 또는 카스파제 활성화 및 모집 도메인(CARD)을 포함할 수 있다.
본원에서는 (i) 막횡단 도메인, 및 (ii) 식세포 수용체 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛(예컨대, 식세포 수용체 융합 단백질(PFP)); 및 항원, 예컨대, 표적 세포의 항원 또는 표적 세포 상에 제시된 항원에 특이적인 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 CFP를 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 막횡단 도메인 및 세포외 항원 결합 도메인은 융합된 수용체의 세포외 항원 결합 도메인에 의한 표적에의 항원 결합이 식세포 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 활성화시키도록 작동적으로 연결된 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, CFP의 세포외 도메인은 Ig 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, FcRγI, FcRγIIA, FcRγIIB, FcRγIIC, FcRγIIIA, FcRγIIIB, FcRn, TRIM21, FcRL5 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP의 세포외 도메인은 FcR 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP의 세포외 도메인은 FcRα, FcRβ, FcRε 또는 FcRγ 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 FcRα(FCAR) 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 FcRβ 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 FCER1A 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 FDGR1A, FCGR2A, FCGR2B, FCGR2C, FCGR3A, 또는 FCGR3B 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 인테그린 도메인 또는 인테그린 수용체 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 하나 이상의 인테그린 α1, α2, αIIb, α3, α4, α5, α6, α7, α8, α9, α10, α11, αD, αE, αL, αM, αV, αX, β1, β2, β3, β4, β5, β6, β7, 또는 β8 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 막횡단 도메인 및 세포외 항원 결합 도메인에 작동적으로 연결된 세포외 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 수용체, 힌지, 스페이서 및/또는 링커의 세포외 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 식세포 수용체의 세포외 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP의 세포외 부분은 세포내 신호전달 도메인이 유래된 수용체와 동일한 수용체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 스캐빈저 수용체의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 면역글로불린 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린 도메인은 면역글로불린 또는 면역글로불린 힌지 영역의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 식세포 포식 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 다량체 어셈블리가 가능한 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 다량체화를 위한 스캐폴드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 길이가 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 300, 400, 또는 500개의 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 길이가 최대 500, 400, 300, 200, 또는 100개의 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 표적 세포의 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 항체 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 수용체 도메인, 항체 도메인을 포함하고, 여기서, 항체 도메인은 기능성 항체 단편, 단일 쇄 가변 단편(scFv), Fab, 단일 도메인 항체(sdAb), 나노바디, VH 도메인, VL 도메인, VNAR 도메인, VHH 도메인, 이중특이적 항체, 디아바디, 또는 기능성 단편 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 리간드, 수용체의 세포외 도메인 또는 어댑터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 단일 항원에 특이적인 단일 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 적어도 2개의 세포외 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서, 적어도 2개의 세포외 항원 결합 도메인은 각각 상이한 항원에 특이적이다.
일부 실시양태에서, 항원은 암 연관 항원, 계통 연관 항원, 병원성 항원 또는 자가면역 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 T 림프구 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 세포외 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 세포내 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 티미딘 키나제(TK1: Thymidine Kinase), 히포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT: Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase), 수용체 티로신 키나제 유사 오펀 수용체 1(ROR1), 뮤신-1, 뮤신-16(MUC16), MUC1, 표피 성장 인자 수용체 vIII(EGFRvIII), 메소텔린, 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2: Human Epidermal Growth Factor Receptor 2), EBNA-1, LEMD1, 포스파티딜 세린, 암배아 항원(CEA: Carcinoembryonic Antigen), B 세포 성숙화 항원(BCMA: B-Cell Maturation Antigen), 글리피칸 3(GPC3), 여포 자극 호르몬 수용체, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP: Fibroblast Activation Protein), 에리트로포이에틴 생산 간세포암종 A2(EphA2: Erythropoietin-Producing Hepatocellular Carcinoma A2), EphB2, 자연 살해세포 군 2D(NKG2D: Natural Killer Group 2D) 리간드, 디시알로강글리오시드 2(GD2), CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD45, CD56CD79b, CD97, CD117, CD123, CD133, CD138, CD171, CD179a, CD213A2, CD248, CD276, PSCA, CS-1, CLECL1, GD3, PSMA, FLT3, TAG72, EPCAM, IL-1, 인테그린 수용체, PRSS21, VEGFR2, PDGFRβ, SSEA-4, EGFR, NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, GM3, TEM7R, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, Dsg1, Dsg3, IGLL1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항원은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CCR4, CD8, CD30, CD45, 및 CD56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 난소암 항원 또는 T 림프종 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 인테그린 수용체의 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 α1, α2, αIIb, α3, α4, α5, α6, α7, α8, α9, α10, α11, αD, αE, αL, αM, αV, αX, β1, β2, β3, β4, β5, β6, β7 및 β8로 이루어진 군으로부터 선택된 인테그린 수용체 또는 인테그린의 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 인테그린 수용체 리간드의 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐 또는 라미닌의 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 2개 이상의 상이한 항원들에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 자가항원 또는 이들의 단편, 예컨대, Dsg1 또는 Dsg3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 수용체 도메인 또는 항체 도메인을 포함하고, 여기서, 항체 도메인은 자가항원, 예컨대, Dsg1 또는 Dsg3에 결합한다.
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인 및 세포외 항원 결합 도메인은 링커를 통해 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인 및 세포외 항원 결합 도메인은 링커, 예컨대, CD8α, IgG1 또는 IgG4의 힌지 영역을 통해 작동적으로 연결된다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 다량체화 스캐폴드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD28 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD68 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD2 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 FcR 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 FcRγ 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 FcRα 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 FcRβ 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 FcRε 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 신탁신, 예컨대, 신탁신 3 또는 신탁신 4 또는 신탁신 5로부터의 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CFP가 세포에서 발현될 때, 내인성 수용체의 막횡단 도메인과 올리고머화한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CFP가 세포에서 발현될 때, 외인성 수용체의 막횡단 도메인과 올리고머화한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CFP가 세포에서 발현될 때, 내인성 수용체의 막횡단 도메인과 이량체화한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CFP가 세포에서 발현될 때, 외인성 수용체의 막횡단 도메인과 이량체화한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 세포내 신호전달 도메인이 유래된 단백질과 상이한 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 세포외 도메인이 유래된 단백질과 상이한 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 식세포 수용체의 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인 및 세포외 도메인은 동일한 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 세포내 신호전달 도메인과 동일한 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 DAP12 모집 도메인을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 DAP12와 올리고머화하는 막횡단 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 길이가 적어도 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32개의 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 길이가 최대 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32개의 아미노산 길이이다.
일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 식세포 수용체로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 Megf10, MerTk, FcRα 또는 Bai1로부터 선택된 식세포 수용체 이외의 식세포 수용체로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 TNFR1, MDA5, CD40, 렉틴, 덱틴 1, CD206, 스캐빈저 수용체 A1(SRA1), MARCO, CD36, CD163, MSR1, SCARA3, COLEC12, SCARA5, SCARB1, SCARB2, CD68, OLR1, SCARF1, SCARF2, CXCL16, STAB1, STAB2, SRCRB4D, SSC5D, CD205, CD207, CD209, RAGE, CD14, CD64, F4/80, CCR2, CX3CR1, CSF1R, Tie2, HuCRIg(L), CD64, CD32a, CD16a, CD89, Fc-알파 수용체 I, CR1, CD35, CD3ζ, CR3, CR4, Tim-1, Tim-4 및 CD169로 이루어진 군으로부터 선택되는 식세포 수용체로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 PI3K 모집 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 스캐빈저 수용체로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 CD47 억제 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 Rac 억제 도메인, Cdc42 억제 도메인 또는 GTPase 억제 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, Rac 억제 도메인, Cdc42 억제 도메인 또는 GTPase 억제 도메인은 PFP를 발현하는 세포의 식세포 컵(phagocytic cup)에서 Rac, Cdc42 또는 GTPase를 억제한다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 F-액틴 디셈블리 활성화 도메인, ARHGAP12 활성화 도메인, ARHGAP25 활성화 도메인 또는 SH3BP1 활성화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 포스파타제 억제 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 ARP2/3 억제 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 적어도 하나의 ITAM 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과의 ITAM 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD3 델타, Fc 엡실론 수용체 1 쇄, Fc 엡실론 수용체 2 쇄, Fc 감마 수용체 1 쇄, Fc 감마 수용체 2a 쇄, Fc 감마 수용체 2b 1 쇄, Fc 감마 수용체 2b2 쇄, Fc 감마 수용체 3a 쇄, Fc 감마 수용체 3b 쇄, Fc 베타 수용체 1 쇄, TYROBP(DAP12), CD5, CD16a, CD16b, CD22, CD23, CD32, CD64, CD79a, CD79b, CD89, CD278, CD66d, 이들의 기능성 단편, 및 1개 이상 20개 이하의 변형을 가진 이들의 아미노산 서열의 ITAM 도메인으로부터 선택되는 적어도 하나의 ITAM 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 ITAM 도메인은 Src-패밀리 키나제 인산화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 ITAM 도메인은 Syk 모집 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 F-액틴 해중합 활성화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인에는 효소 활성이 결여되어 있다.
일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 CD3 제타 세포내 도메인로부터 유래된 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 MerTK 세포내 도메인로부터 유래된 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 TLR4 세포내 도메인으로부터 유래된 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 CD47 억제 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 인테그린을 활성화시키는 도메인, 예컨대, PSGL-1의 세포내 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 Rap1 GTPase를 활성화시키는 도메인, 예컨대, EPAC 및 C3G로부터 유래된 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 팍실린으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 국소 부착 키나제를 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 단일 식세포 수용체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 단일 스캐빈저 수용체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 식세포작용 증강 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 염증유발성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 키나제 활성화 도메인 또는 키나제 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 IL-1 신호전달 캐스케이드 활성화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 TLR3, TLR4, TLR7, TLR 9, TRIF, RIG-1, MYD88, MAL, IRAK1, MDA-5, IFN-수용체, STING, NLRP 패밀리 구성원, NLRP1-14, NOD1, NOD2, 피린, AIM2, NLRC4, FCGR3A, FCERIG, CD40, Tank1 결합 키나제(TBK), 카스파제 도메인, 프로카스파제 결합 도메인 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 콘넥신(Cx) 단백질로부터 유래된 신호전달 도메인, 예컨대, 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 예를 들어, 세포내 도메인은 Cx43, Cx46, Cx37, Cx40, Cx33, Cx50, Cx59, Cx62, Cx32, Cx26, Cx31, Cx30.3, Cx31.1, Cx30, Cx25, Cx45, Cx47, Cx31.3, Cx36, Cx31.9, Cx39, Cx40.1 또는 Cx23으로부터 유래된 신호전달 도메인, 예컨대, 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포내 도메인은 Cx43으로부터 유래된 신호전달 도메인, 예컨대, 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다
일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 SIGLEC 단백질로부터 유래된 신호전달 도메인, 예컨대, 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 예를 들어, 세포내 도메인은 Siglec-1(시알로어드헤신(Sialoadhesin)), Siglec-2(CD22), Siglec-3(CD33), Siglec-4(MAG), Siglec-5, Siglec-6, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-9, Siglec-10, Siglec-11, Siglec-12, Siglec-13, Siglec-14, Siglec-15, Siglec-16 또는 Siglec-17로부터 유래된 신호전달 도메인, 예컨대, 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 C형 렉틴 단백질로부터 유래된 신호전달 도메인, 예컨대, 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 예를 들어, 세포내 도메인은 만노스 수용체 단백질로부터 유래된 신호전달 도메인, 예컨대, 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포내 도메인은 아시알로당단백질 수용체 단백질로부터 유래된 신호전달 도메인, 예컨대, 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포내 도메인은 대식세포 갈락토스 타입 렉틴(MGL: macrophage galactose-type lectin), DC-SIGN(CLEC4L), 란게린(Langerin)(CLEC4K), 골수 DAP12 연관 렉틴(MDL)-1(CLEC5A), DC 연관 C형 렉틴 1(덱틴 1) 서브패밀리 단백질, 덱틴 1/CLEC7A, DNGR1/CLEC9A, 골수 C형 렉틴 유사 수용체(MICL)(CLEC12A), CLEC2(CLEC1B), CLEC12B, DC 면역수용체(DCIR) 서브패밀리 단백질, DCIR/CLEC4A, 덱틴 2/CLEC6A, 혈액 DC 항원 2(BDCA2)(CLEC4C), 민클(Mincle)(대식세포 유도성 C형 렉틴)(CLEC4E), NOD 유사 수용체 단백질, NOD 유사 수용체 MHC 클래스 II 전사활성인자(CIITA), IPAF, BIRC1, RIG-I-유사 수용체(RLR) 단백질, RIG-I, MDA5, LGP2, NAIP5/Birc1e, NLRP 단백질, NLRP1, NLRP2, NLRP3, NLRP4, NLRP5, NLRP6, NLRP7, NLRP89, NLRP9, NLRP10, NLRP11, NLRP12, NLRP13, NLRP14, NLR 단백질, NOD1 또는 NOD2, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래된 신호전달 도메인, 예컨대, 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 세포 부착 분자로부터 유래된 신호전달 도메인, 예컨대, 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 예를 들어, 세포내 도메인은 IgCAM, 캐드헤린, 인테그린, C형의 렉틴 유사 도메인 단백질(CTLD) 및/또는 프로테오글리칸 분자로부터 유래된 신호전달 도메인, 예컨대, 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포내 도메인은 E-캐드헤린, P-캐드헤린, N-캐드헤린, R-캐드헤린, B-캐드헤린, T-캐드헤린 또는 M-캐드헤린으로부터 유래된 신호전달 도메인, 예컨대, 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포내 도메인은 셀렉틴, 예컨대, E-셀렉틴, L-셀렉틴 또는 P-셀렉틴으로부터 유래된 신호전달 도메인, 예컨대, 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, CFP는 전장의 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 길이가 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 300, 400, 또는 500개의 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 길이가 최대 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 300, 400, 또는 500개의 아미노산 길이이다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 FcRα 쇄 세포외 도메인, FcRα 쇄 막횡단 도메인 및/또는 FcRα 쇄 세포내 도메인을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 FcRβ 쇄 세포외 도메인, FcRβ 쇄 막횡단 도메인 및/또는 FcRβ 쇄 세포내 도메인을 코딩한다. 일부 실시양태에서, FcRα 쇄 또는 FcRβ 쇄는 세포에서 발현될 때, FcRγ와 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, FcRα 쇄 또는 FcRβ 쇄는 세포에서 발현될 때, 내인성 FcRγ와 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, FcRα 쇄 또는 FcRβ 쇄는 FcRγ를 발현하지 않는 세포의 세포막 내로 도입되지 않는다. 일부 실시양태에서, CFP는 FcRα 쇄 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, CFP는 FcRβ 쇄 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 TREM 세포외 도메인, TREM 막횡단 도메인 및/또는 TREM 세포내 도메인을 코딩한다. 일부 실시양태에서, TREM은 TREM1, TREM2 또는 TREM3이다.
본원에서는 암 세포와 같은 질환 세포를 표적화하고, 살해하도록 조작된 것과 같은 치료 골수 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 암 또는 종양 세포를 살해하기 위한 조성물 및 방법을 풍부하게 예시하지만, 당업자는 과도한 실험 없이 감염된 세포와 같은 또 다른 이환된 세포를 표적화하는 상기 대식세포를 디자인할 수 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 대식세포는 대식세포는 그를 필요로 하는 피험체로부터 단리되고, 단백질 또는 1개 초과의 관심 단백질을 발현하도록 조작된 후, 피험체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 피험체는 암 또는 종양을 앓는다. 피험체로부터 단리되고, 단백질 또는 1개 초과의 관심 단백질을 발현하도록 조작된 후, 피험체에게 투여되는 대식세포는 피험체의 암 세포 또는 종양 세포를 표적화하고, 살해할 수 있는 치료 대식세포이다.
한 측면에서, 본원에서는 (A) 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열; (B) 골수 세포 키메라 항원 수용체 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 제2 핵산 서열로서, 여기서, CFP는 (a) 수용체에 의한 항원 결합시 인산화되는 티로신 잔기를 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 서브유닛; (b) 막횡단 도메인, (c) 표적 세포의 표면 상의 성분에 대해 결합 특이성을 갖는 세포외 결합 도메인으로서, 여기서, 세포외 결합 도메인은 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결된 것인 세포외 결합 도메인; 및 (d) 프로테아제 절단 서열에 의해 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결된 전사 활성인자 도메인으로서, 여기서, 전사 활성인자 도메인은 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열의 전사를 촉진시키는 것인 전사 활성인자 도메인을 포함하는 것인 제2 핵산 서열; 및 (C) (a) 전사 활성인자 도메인을 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결하는 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제; (b) CFP 활성화시 인산화되는 티로신 잔기에 결합하는 도메인을 코딩하는 제3 핵산 서열로서; 여기서, 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제, 및 티로신 잔기에 결합하는 도메인이 작동가능하게 연결된 것인 제3 핵산 서열을 포함하는, 하나 이상의 재조합 핵산 서열을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 제3 핵산 서열은 (c) 자극 반응 요소를 추가로 코딩한다. 일부 실시양태에서, 자극 반응 요소(c)는 인산화된 티로신 잔기에 결합하는 도메인에 융합된다. 일부 실시양태에서, 자극 반응 요소(c)는 핵산 서열을 발현하는 세포의 미세환경에 반응성이다. 일부 실시양태에서, (c)는 (b)와 작동가능하게 연결된 데그론이다. 일부 실시양태에서, 데그론은 HIF-1a 데그론이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 재조합 핵산은 골수 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 대식세포성 세포이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 암 세포이다.
일부 실시양태에서, 제1 핵산은 식세포작용유발성 또는 염증유발성 폴리펩티드, 또는 그 둘 모두를 코딩한다. 일부 실시양태에서, CFP는 하나 이상의 식세포 수용체 도메인 또는 이들의 단편을 갖는 식세포 수용체 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 식세포 수용체 도메인 또는 이들의 단편은 렉틴, 덱틴 1, CD206, 스캐빈저 수용체 A1(SRA1), MARCO, CD36, CD163, MSR1, SCARA3, COLEC12, SCARA5, SCARB1, SCARB2, CD68, OLR1, SCARF1, SCARF2, CXCL16, STAB1, STAB2, SRCRB4D, SSC5D, CD205, CD207, CD209, RAGE, CD14, CD64, F4/80, CCR2, CX3CR1, CSF1R, Tie2, HuCRIg(L), CD64, CD32a, CD16a, CD89, Fc-알파 수용체 I, CR1, CD35, CR3, CR4, Tim-1, Tim-4 및 CD169로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, CFP의 세포내 도메인은 식세포 수용체로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 Megf10, MerTk, FcR-알파, 또는 Bai1로부터 선택된 식세포 수용체 이외의 수용체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 티로신 잔기를 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 서브유닛은 적어도 하나의 ITAM 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 서브유닛은 1개 초과의 ITAM 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 ITAM 도메인은 CD3 제타 TCR 서브유닛, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, TCR 제타 쇄, Fc 엡실론 수용체 1 쇄, Fc 엡실론 수용체 2 쇄, Fc 감마 수용체 1 쇄, Fc 감마 수용체 2a 쇄, Fc 감마 수용체 2b 1 쇄, Fc 감마 수용체 2b2 쇄, Fc 감마 수용체 3a 쇄, Fc 감마 수용체 3b 쇄, Fc 베타 수용체 1 쇄, TYROBP(DAP12), CD5, CD16a, CD16b, CD22, CD23, CD32, CD64, CD79a, CD79b, CD89, CD278, CD66d, 이들의 기능성 단편, 및 1개 이상 20개 이하의 변형을 가진 이들의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 ITAM 도메인은 Src-패밀리 키나제 인산화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 ITAM 도메인은 Syk 모집 도메인을 포함한다.
본원에 기술된 다양한 측면의 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 서브유닛은 DAP12 모집 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 ITAM 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 서브유닛은 IL-1 신호전달 캐스케이드 활성화 도메인을 포함하는 염증유발성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 TLR3, TLR4, TLR7, TLR 9, TRIF, RIG-1, MYD88, MAL, IRAK1, MDA-5, IFN-수용체, NLRP 패밀리 구성원, NLRP1-14, NOD1, NOD2, 피린, AIM2, NLRC4, FCGR3A, FCERIG, CD40, 카스파제 도메인 또는 프로카스파제 결합 도메인 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 인테그린을 활성화시키는 도메인, 예컨대, PSGL-1의 세포내 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 Rap1 GTPase를 활성화시키는 도메인, 예컨대, EPAC 및 C3G로부터 유래된 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 팍실린으로부터 유래된 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 국소 부착 키나제를 활성화시킨다.
일부 실시양태에서, 표적 세포의 표면 상의 성분에 대해 결합 특이성을 갖는 세포외 결합 도메인은 항체 또는 이들의 기능성 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적 세포의 표면 상의 성분은 티미딘 키나제(TK1), 히포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT), 수용체 티로신 키나제 유사 오펀 수용체 1(ROR1), 뮤신-1, 뮤신-16(MUC16), MUC1, 표피 성장 인자 수용체 vIII(EGFRvIII), 메소텔린, 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2), 메소텔린, EBNA-1, LEMD1, 포스파티딜 세린, 암배아 항원(CEA), B 세포 성숙화 항원(BCMA), 글리피칸 3(GPC3), 여포 자극 호르몬 수용체, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 에리트로포이에틴 생산 간세포 암종 A2(EphA2), EphB2, 자연 살해세포 군 2D(NKG2D) 리간드, 디시알로강글리오시드 2(GD2), CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD45, CD56CD79b, CD97, CD117, CD123, CD133, CD138, CD171, CD179a, CD213A2, CD248, CD276, PSCA, CS-1, CLECL1, GD3, PSMA, FLT3, TAG72, EPCAM, IL-1, 인테그린 수용체, PRSS21, VEGFR2, PDGFR-베타, SSEA-4, EGFR, NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, GM3, TEM7R, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, IGLL1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원이다.
일부 실시양태에서, 표적 세포의 표면 상의 성분은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CCR4, CD8, CD30, CD45, CD56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원이다.
일부 실시양태에서, 표적 세포의 표면 상의 성분은 난소암 항원 또는 T 림프종 항원이다.
일부 실시양태에서, 표적 세포의 표면 상의 성분은 인테그린 수용체이다.
일부 실시양태에서, 표적 세포의 표면 상의 성분은 α1, α2, αIIb, α3, α4, α5, α6, α7, α8, α9, α10, α11, αD, αE, αL, αM, αV, αX, β1, β2, β3, β4, β5, β6, β7, 또는 β8로 이루어진 군으로부터 선택되는 인테그린 수용체이다.
일부 실시양태에서, 표적 세포의 표면 상의 성분은 2개 이상의 상이한 항원을 포함한다.
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 길이가 적어도 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32개의 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 길이가 최대 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32개의 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 DAP12와 올리고머화하는 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인 및 세포외 항원 결합 도메인은 링커를 통해 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 CD8α, IgG1 또는 IgG4의 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 합성 링커이다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 FcR 막횡단 도메인을 포함한다.
전사 활성인자 도메인이 DNA 결합 도메인을 추가로 포함하는 것인, 상기 기술된 임의의 실시양태의 조성물. 일부 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 Gal4, ZFHD1 또는 tet-R의 DNA 결합 도메인(DB)으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 전사 활성인자 도메인은 VP64 전사활성화 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 전사 활성인자 도메인을 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결하는 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제는 C형 간염 바이러스(HCV) NS3 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, CFP 활성화시 인산화되는 티로신 잔기에 결합하는 도메인은 포스포티로신 결합(PTB) 도메인이다. 일부 실시양태에서, PTB는 Shc PTB이다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 DNA이다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 RNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 circRNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 레플리콘 RNA와 회합된다.
한 측면에서, 본원에서는 상기 기술된 실시양태 중 어느 하나의 하나 이상의 재조합 핵산을 코딩하는 벡터를 제공한다.
한 측면에서, 본원에서는 상기 기술된 실시양태의 벡터를 발현하는 골수 세포를 제공한다.
한 측면에서, 본원에서는 상기 기술된 실시양태의 골수 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본원에서는 (a) 세포독성 폴리펩티드; (b) 프로테아제 절단 서열; 및 (c) 세포독성 폴리펩티드를 억제시키는 억제성 폴리펩티드 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 세포로서, 여기서, 세포독성 폴리펩티드, 프로테아제 절단 서열 및 억제성 폴리펩티드 도메인은 작동가능하게 연결된 것인 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 세포는 골수 세포이다.
일부 실시양태에서, 세포독성 폴리펩티드는 인간 호산구 주요 염기성 단백질 세포독성 도메인이다. 일부 실시양태에서, 세포독성 폴리펩티드는 인간 호산구 주요 염기성 단백질 산성 도메인이다.
일부 실시양태에서, 프로테아제 절단 서열은 MMP 인식 서열이다.
일부 실시양태에서, 프로테아제 절단 서열은 MMP에 의해 절단된다.
한 측면에서, 본원에서는 본원에 기술된 실시양태의 세포 중 어느 하나를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본원에서는 본원에 기술된 실시양태의 세포 중 어느 하나의 재조합 핵산을 제공한다.
한 측면에서, 본원에서는 본원에 기술된 실시양태의 재조합 핵산을 코딩하는 벡터를 제공한다.
한 측면에서, 본원에서는 골수 세포에서 (A) 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열; (B) 골수 세포 키메라 항원 수용체(CFP)를 코딩하는 제2 핵산 서열로서, 여기서, CFP는 (a) CFP의 활성화시 인산화되는 티로신 잔기를 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 서브유닛; (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 표적 세포의 표면 상의 성분에 대해 결합 특이성을 갖는 세포외 결합 도메인으로서, 여기서, 세포외 결합 도메인은 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결된 것인 세포외 결합 도메인; 및 (d) 프로테아제 절단 서열에 의해 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결된 전사 활성인자 도메인으로서, 여기서, 전사 활성인자 도메인은 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열의 전사를 촉진시키는 것인 전사 활성인자 도메인을 포함하는 것인 제2 핵산 서열; 및 (C) (a) 전사 활성인자 도메인을 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결하는 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제; (b) CAR 활성화시 인산화되는 티로신 잔기에 결합하는 도메인을 코딩하는 제3 핵산 서열로서; 여기서, 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제, 및 티로신 잔기에 결합하는 도메인이 작동가능하게 연결된 것인 제3 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산을 발현하는 단계를 포함하는, 암에 대한 골수 세포 치료제를 제조하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본원에서는 골수 세포에서 (a) 인간 호산구 주요 염기성 단백질 산성 도메인; (b) MMP 인식 서열; 및 (c) 인간 호산구 주요 염기성 단백질 세포독성 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 발현하는 단계를 포함하는, 암에 대한 골수 세포 치료제를 제조하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본원에서는 암 치료를 필요로 하는 암을 앓는 피험체에게 본원에 기술된 실시양태 중 어느 하나의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 피험체를 치료하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본원에서는 종양 퇴행 유도를 필요로 하는 피험체에게 골수 세포를 포함하는 약학 조성물을 정맥내로 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 골수 세포는 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산을 발현하고, 여기서, 하나 이상의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 종양 미세환경에서 기능적으로 활성이고, 비종양 환경에서는 기능적으로 활성이 아닌 것인, 종양 퇴행 유도를 필요로 하는 피험체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법을 제공한다. 본원에 기술된 여러 측면의 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 기술된 실시양태의 약학 조성물이다. 본원에 기술된 여러 측면의 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 기술된 실시양태를 청구하는 약학 조성물이다.
본원에 기술된 여러 측면의 일부 실시양태에서, 표적 세포는 교모세포종 세포인 암 세포이다.
본원에서는 암 치료를 필요로 하는 암을 앓는 피험체에게 상기 기술된 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 피험체를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 염증유발성 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 재조합 핵산에서 염증유발성 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드, 예를 들어, ATP, ADP, UTP, UDP, 및/또는 UDP-글루코스를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 전사 활성인자 도메인은 VP64 전사활성화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전사 활성인자 도메인을 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결하는 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제는 C형 간염 바이러스(HCV) NS3 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, CFP 활성화시 인산화되는 티로신 잔기에 결합하는 도메인은 포스포티로신 결합(PTB) 도메인이다. 일부 실시양태에서, PTB는 Shc PTB이다. 일부 실시양태에서, 제3 핵산은 CFP에 작동가능하게 연결될 수 있는 데그론을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 데그론은 HIF-1a 데그론이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 DNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 RNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 circRNA이다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 레플리콘 RNA와 회합된다. 본원에서는 골수 세포에서 (A) 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열; (B) 골수 세포 키메라 항원 수용체(CFP)를 코딩하는 제2 핵산 서열로서, 여기서, CFP는 (a) CFP의 활성화시 인산화되는 티로신 잔기를 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 서브유닛; (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 표적 세포의 표면 상의 성분에 대해 결합 특이성을 갖는 세포외 결합 도메인으로서, 여기서, 세포외 결합 도메인은 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결된 것인 세포외 결합 도메인; 및 (d) 프로테아제 절단 서열에 의해 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결된 전사 활성인자 도메인으로서, 여기서, 전사 활성인자 도메인은 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열의 전사를 촉진시키는 것인 전사 활성인자 도메인을 포함하는 것인 제2 핵산 서열; 및 (C) (a) 전사 활성인자 도메인을 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결하는 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제; (b) CFP 활성화시 인산화되는 티로신 잔기에 결합하는 도메인을 코딩하는 제3 핵산 서열로서; 여기서, 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제, 및 티로신 잔기에 결합하는 도메인이 작동가능하게 연결된 것인 제3 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산을 발현하는 단계를 포함하는, 암에 대한 골수 세포 치료제를 제조하는 방법을 제공한다. 본원에서는 골수 세포에서 (a) 인간 호산구 주요 염기성 단백질 산성 도메인; (b) MMP 인식 서열; 및 (c) 인간 호산구 주요 염기성 단백질 세포독성 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 발현하는 단계를 포함하는, 암에 대한 골수 세포 치료제를 제조하는 방법을 제공한다.
본원에서는 암 치료를 필요로 하는 암을 앓는 피험체에게 상기 기술된 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 피험체를 치료하는 방법을 제공한다. 본원에서는 암 치료를 필요로 하는 암을 앓는 피험체에게 본원에 기술된 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 피험체를 치료하는 방법을 제공한다. 본원에서는 종양 퇴행 유도를 필요로 하는 피험체에게 골수 세포를 포함하는 약학 조성물을 정맥내로 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 골수 세포는 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산을 발현하고, 여기서, 하나 이상의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 종양 미세환경에서 기능적으로 활성이고, 비종양 환경에서는 기능적으로 활성이 아닌 것인, 종양 퇴행 유도를 필요로 하는 피험체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 염증유발성 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 폴리펩티드는 케모카인, 사이토카인이다. 일부 실시양태에서, 케모카인은 IL-1, IL3, IL5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-23, TNF, CCL2, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IL-18, IL-23, IL-27, CSF, MCSF, GMCSF, IL17, IP-10, RANTES, 및 인터페론으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 사이토카인은 IL-1, IL3, IL5, IL-6, IL-12, IL-13, IL-23, TNF, CCL2, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IL-18, IL-23, IL-27, CSF, MCSF, GMCSF, IL17, IP-10, RANTES, 및 인터페론으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 골수 세포는 전달을 위해 특이적으로 표적화된다. 골수 세포는 전문화된 생체분해성 중합체, 예컨대, PLGA(폴리(락트산-코-글리콜산)) 및/또는 폴리비닐 알콜(PVA)을 사용함으로써 표적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 화합물은 골수 세포 기능에 영향을 미치기 위해 상기 중합체 구조물 내로 선택적으로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 구조물은 예컨대, 하나 이상의 PLGA 및 하나 이상의 PVA 층의 다층화 구조물이다. 일부 실시양태에서, 표적화 구조물은 적층된 활성을 위해 순서대로 어셈블리된다. 일부 실시양태에서, 표적화된 중합체 구조물은 예컨대, 특정 분극화를 부여하는 미세환경에서 골수 세포를 유지하기 위해 골수 세포 표면에 부착될 수 있고, 하나 이상의 성분, 예컨대, 성장 인자 및 사이토카인을 전달할 수 있는 불안정한 구조물과 같은 특정 형상의 성분으로 조직화된다. 일부 실시양태에서, 중합체 구조물은 이 구조물이 골수 세포에 의한 식세포작용을 통해 포식되지 않지만, 표면 상에 부착된 상태로 남아있을 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 성장 인자는 M1 분극화 인자, 예컨대, 사이토카인일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 성장 인자는 M2 분극화 인자, 예컨대, 사이토카인일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 성장 인자는 대식세포 활성화 사이토카인, 예컨대, IFNγ일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체 구조물은 고형 종양과 같은 생체내 환경에서 하나 이상의 성장 인자를 지속적으로 방출할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 염증의 항상성 조절인자를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증의 항상성 조절인자는 mRNA의 비번역 영역(UTR: untranslated region) 내의 서열이다. 일부 실시양태에서, UTR 내의 서열은 RNA 결합 단백질에 결합하는 서열이다. 일부 실시양태에서, 번역은 RNA 결합 단백질이 비번역 영역(UTR) 내의 서열에 결합할 때, 억제되거나 방해된다. 일부 실시양태에서, UTR 내의 서열은 컨센서스 서열인 WWWU(AUUUA)UUUW(여기서, W는 A 또는 U이다)(서열 번호 85)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 바이시스트로닉 벡터에서 발현된다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 병원체에 의해 감염된 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 암 세포이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 림프구인 암 세포이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 난소암 세포인 암 세포이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 유방 세포인 암 세포이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 췌장 세포인 암 세포이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 교모세포종 세포인 암 세포이다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 DNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 RNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 비변형된 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 변형된 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 circRNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 tRNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 마이크로RNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 자기 복제 RNA이다.
본원에서는 또한 본원에 기술된 CFP를 코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열에 작동가능하게 연결 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 폴리시스트로닉이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 핵산 서열은 각각 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위(IRES: internal ribosome entry site)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 플랭킹하는 5' UTR 및/또는 3' UTR을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 하나 이상의 조절 영역을 추가로 포함한다.
본원에서는 또한 본원에 기술된 조성물의 재조합 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드도 제공한다.
본원에서는 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛을 포함하는 PR 서브유닛(예컨대, 식세포 수용체 융합 단백질(PFP)); 및 표적 세포의 항원에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CFP를 코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 조성물로서; 여기서, 막횡단 도메인 및 세포외 도메인이 작동적으로 연결되고; 여기서, CFP가 표적 세포의 항원에 결합할 때 CFP를 발현하는 호중구, 단핵구, 골수 수지상 세포(mDC), 비만 세포 또는 대식세포와 같은 골수 세포의 살해 또는 식세포작용 활성은 CFP를 발현하지 않는 세포와 비교하여 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 또는 1000% 초과만큼 증가되는 것인 조성물을 제공한다.
표 1은 본 개시내용에 대해 비제한적인 것으로 의도되는 키메라 융합 단백질 도메인 및/또는 이들의 단편의 예시적인 서열을 보여준다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
본원에서는 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛을 포함하는 PR 서브유닛(예컨대, 식세포 수용체 융합 단백질(PFP)); 및 표적 세포의 항원에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CFP를 코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 조성물로서; 여기서, 막횡단 도메인 및 세포외 도메인이 작동적으로 연결되고; 여기서, CFP가 표적 세포의 항원에 결합할 때 CFP를 발현하는 호중구, 단핵구, 골수 수지상 세포(mDC), 비만 세포 또는 대식세포와 같은 골수 세포의 살해 또는 식세포작용 활성은 CFP를 발현하지 않는 세포와 비교하여 적어도 1.1배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배,배, 17배, 18배, 19배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 75배, 또는 100배만큼 증가되는 것인 조성물을 제공한다.
CD137 결합제 단백질 및 도메인
한 측면에서, 본원에서는 표적 세포 상의 CD137에 결합할 수 있는 재조합 단백질을 제공한다. 본원에서 사용되는 바, 상기 표적 세포 상의 CD137에 결합할 수 있는 재조합 단백질은 CD137 결합제로 명명된다. 일부 실시양태에서, CD137 결합제는 키메라 융합 단백질(CFP)의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 본원에서 사용되는 바, CD137-CFP로 명명되는 키메라 CD137 결합제 수용체 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산 서열을 제공한다. 일부 실시양태에서, 예컨대, 키메라 수용체 융합 단백질, 예컨대, the CD137 결합제 수용체 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산은 적합한 세포, 예컨대, 골수 세포에서 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD137-CFP가 적합한 세포, 예컨대, 골수 세포 상에서 발현될 때, CD137 결합제는 CD137를 발현하는 표적 세포에 결합할 수 있고, 결합제를 발현하는 골수 세포는 활성화된다. 일부 실시양태에서, CD137-CFP가 CD137과 인게이징할 때 CD137-CFP를 코딩하는 재조합 핵산을 발현하는 골수 세포를 활성화시키는 CD137-CFP의 세포내 신호전달 도메인을 활성화시켰다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 식세포성 세포이다. 일부 실시양태에서, 식세포성 세포이고, CD137 결합제를 발현하는 골수 세포는 CD137 결합제가 또 다른 세포 (표적 세포) 상의 CD137에 결합할 때, 활성화될 수 있고, 표적 세포를 식세포작용을 통해 포식한다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 CD137을 발현하는 임의의 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 림프구성이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 T 림프구(T 세포)이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 악성 세포이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 악성 T 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, CD137 결합제 CFP-발현 골수 세포는 T 세포 림프종에 대한 치료 조성물을 생성하는 데 사용될 수 있다.
본원에서는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산으로서, 여기서, CFP 단백질은 T 림프구 상의 CD137에 결합할 수 있는 것인, 재조합 폴리핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 T 세포 상의 표적에 결합할 수 있는 CFP로서, 표적은 CD137인 것인 CFP를 제공한다. 일부 실시양태에서, 표적 T 세포는 활성화된 T 세포이다. 일부 실시양태에서, CFP는 T 세포 림프종에서 발현되는 활성화된 T 세포를 표적화한다. 본원에서는 CD137 표적화 CFP를 코딩하는 재조합 핵산으로서, 여기서, CFP는 (i) 항CD137 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 및 (ii) 세포외 도메인에 작동적으로 연결된 막횡단 도메인; 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하고; 여기서, 골수 세포는 CFP를 발현하고, CFP를 발현하지 않는 골수 세포와 비교하여 CD137을 발현하는 표적 세포의 식세포작용의 적어도 1.1배 증가를 보이는 것인 재조합 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, CD137 결합 도메인은 항체의 항원 결합 단편, Fab 단편, scFv 도메인 또는 sdAb 도메인을 포함하는 CD137 결합 단백질이다. 일부 실시양태에서, CD137 결합 도메인은 서열 번호 31의, 또는 서열 번호 31과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 CD137 리간드 서열을 포함한다.
본원에서는 CD137에 결합할 수 있는 키메라 융합 단백질인 재조합 단백질을 제공한다. CD137은 활성화된 T 세포 표면 마커이다. 따라서, CD137에 결합할 수 있는 키메라 융합 단백질은 활성화된 T 세포에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서, CFP는 (i) 항CD137 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 및 (ii) 세포외 도메인에 작동적으로 연결된 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD137 결합 도메인은 항체의 항원 결합 단편, Fab 단편, scFv 도메인 또는 sdAb 도메인을 포함하는 CD137 결합 단백질이다. 일부 실시양태에서, CD137 결합 도메인은 scFv를 포함한다. 본원에서는 T 세포 상에 발현된 CD137에 결합할 수 있는 키메라 융합 단백질인 재조합 단백질을 발현하는 골수 세포로서, 여기서, CFP는 (i) 항CD137 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 및 (ii) 세포외 도메인에 작동적으로 연결된 막횡단 도메인을 포함하고; 골수 세포는 CD137 발현 T 세포를 특이적으로 표적화할 수 있고, CD137 발현 T 세포를 식세포작용을 통해 포식하고, 용해시키고, 따라서, 용해시킨다. 일부 실시양태에서, CD137에 결합할 수 있는 키메라 융합 단백질인 재조합 단백질을 발현하는 골수 세포는 CD137+ve 암, 예컨대, T 세포 림프종에 대한 치료제이다.
일반적으로, CD137은 활성화된 면역 세포 상에서 발현된다. CD137은 면역 캐스케이드의 선천 및 적응 세포, 둘 모두에서 발현된다. 건강한 개체에서, T 세포는 림프절(예컨대, T 세포가 활성화된 상태로 발견되는 편도선)에 풍부할 수 있다. CD137+ve T 세포는 종양에서도 또한 풍부하다.
CD137+ve T 세포는 이식편 대 숙주 및 숙주 대 이식편 거부의 원인이 될 수 있다는 점에 주목한다. 동종이계 세포 요법의 경우, CD137은 숙주 대 이식 거부를 감소시키기 위해서 파괴를 위해 추가로 표적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 (i) 암 항원에 결합하고, 암 항원을 발현하는 암 세포를 용해시키는 키메라 수용체를 발현하는 동종이계 골수 세포를 사용하고; (ii) CD137에 결합하고, CD137+ve T 세포를 용해시킬 수 있는 키메라 항원을 발현하는 골수 세포를 투여하여 숙주의 CD137+ve T 림프구에 의한 동종이계 골수 세포의 살해를 감소시키는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본원에서는 CD137에 결합할 수 있고, 제2, 제3 또는 추가 세포외 모이어티에 결합하는 제2, 제3 또는 추가 결합 도메인 또한 포함하는 키메라 융합 단백질인 재조합 단백질로서, 여기서, 세포외 모이어티는 세포 표면 분자일 수 있는, 재조합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제2, 또는 제3 또는 추가 결합 도메인 중 어느 하나는 표적 세포 상의 추가 세포 표면 분자, 예컨대, CD137 이외의 다른 세포 표면 분자, 예컨대, 암 세포 또는 활성화된 T 세포 상의 세포 표면 분자에 대한 결합 도메인을 포함할 수 있다. 제2, 또는 제3 또는 추가 결합 도메인은 표적 세포 상의 임의의 추가 세포 표면 분자, 예컨대, CD5, 또는 본 명세서 어디에나 기술된 표적 세포 상의 임의의 다른 항원에 대한 결합 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2, 또는 제3 또는 추가 결합 도메인 중 어느 하나는 골수 세포 상의 세포 표면 분자에 대한 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 골수 세포에 대한 결합 도메인을 포함하는 제2, 또는 제3 또는 추가 결합 도메인 중 어느 하나는 결합시 골수 세포를 활성화시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, CD137 결합 단백질은 CD137에 결합할 수 있는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질이고, CD8로부터 유래된 힌지 도메인을 추가로 포함하고, 여기서, 힌지 도메인은 세포질 측에서 막횡단 도메인에, 및 세포외 측 상의 CD137 결합 도메인에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 15, 16, 17, 18 또는 19의 서열 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD8 알파(CD8a) 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 15에 기재된 서열, 또는 서열 번호 15와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 16에 기재된 서열, 또는 서열 번호 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD2 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 17에 기재된 서열, 또는 서열 번호 17과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD28 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 18에 기재된 서열, 또는 서열 번호 18과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD68 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 19에 기재된 서열, 또는 서열 번호 19와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP의 ECD는 서열 번호 15, 16, 17, 18 또는 19에 기재된 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 막횡단 도메인, 또는 서열 번호 15, 16, 17, 18 또는 19 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성이 있는 아미노산 서열을 갖는 막횡단 도메인에 융합된, 서열 번호 31에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 31과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성이 있는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포외 힌지 도메인 및 막횡단 도메인은 각각 서열 번호 20 또는 서열 번호 21의, 또는 서열 번호 20 또는 서열 번호 21과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 20의, 또는 서열 번호 20과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 막횡단 도메인에 융합된 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 21의, 또는 서열 번호 21과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 막횡단 도메인에 융합된 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 20 또는 21과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성이 있는 아미노산 서열을 갖는 힌지 및 막횡단 도메인에 융합된, 서열 번호 31과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 ECD 결합제 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 표 4에 기재된 바와 같은 (예컨대, 짧은 힌지 도메인을 포함하는) CD16 막횡단 도메인의 서열을 포함하는 TM 도메인에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 31에 기재된 서열, 또는 서열 번호 31과 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 CD64 막횡단 도메인 서열을 포함하는 TM 도메인에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 31에 기재된 서열, 또는 서열 번호 31과 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 표 4에 기재된 바와 같은 (예컨대, 짧은 힌지 도메인을 포함하는) CD89 막횡단 도메인의 서열을 포함하는 TM 도메인에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 31에 기재된 서열을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 31에 기재된 서열, 또는 서열 번호 31과 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 ECD; CD16 단백질의 TM 도메인 또는 CD64 단백질의 TMD 또는 CD89 단백질의 TMD로부터의 서열을 포함하는 TM 도메인, 및 임의로, 본원에 기술된 다른 별개의 ICD 이외에도, 각각, 예컨대, CD16 단백질, CD64 단백질, 또는 CD89 단백질로부터의 상응하는 세포내 도메인(ICD), 또는 그의 일부를 포함한다. 예시적인 CD16 및 CD89 ICD 서열은 표 4에 제공되어 있다.
일부 실시양태에서, CFP는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 식세포작용 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 Megf10, MerTk, FcRα, 및 Bai1 이외의 다른 수용체로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 Megf10, MerTk, FcR, 및 Bai1 이외의 다른 수용체로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ 이외의 다른 수용체로부터 유래된 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 FcRγ, FcRα 또는 FcRε로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 22, 23, 24 또는 25 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 22, 23, 24 또는 25 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 FcR감마 단백질(FcRγ 쇄)로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 염증유발성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 PI3 키나제(PI3K) 모집 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 서열 번호 26의, 또는 서열 번호 26과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 CD40의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 서열 번호 27의, 또는 서열 번호 27과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 28의, 또는 서열 번호 28과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 29의, 또는 서열 번호 29와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 30의, 또는 서열 번호 30과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 (a) (i) CD137에 특이적으로 결합하는 scFv, 및 (ii) CD8로부터 유래된 힌지 도메인; CD28로부터 유래된 힌지 도메인 또는 CD68로부터의 세포외 도메인의 적어도 일부를 포함하는 세포외 도메인; (b) CD8 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인, CD2 막횡단 도메인 또는 CD68 막횡단 도메인; 및 (c) 적어도 2개의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하고, 여기서, 적어도 2개의 세포내 신호전달 도메인은 (i) FcRα, FcRγ 또는 FcRε로부터 유래된 제1 세포내 신호전달 도메인, 및 (ii) (A) PI3K 모집 도메인을 포함하거나, 또는 (B) CD40으로부터 유래된 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 상기에 대한 대한 대안 (c)로서 적어도 2개의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하고, 여기서, 적어도 2개의 세포내 신호전달 도메인은 (i) 식세포 수용체 세포내 도메인으로부터 유래된 제1 세포내 신호전달 도메인, 및 (ii) (A) PI3K 모집 도메인을 포함하거나, 또는 (B) CD40으로부터 유래된 것을 포함하는 스캐빈저 수용체 식세포 수용체 세포내 도메인으로부터 유래된 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 선천 면역 수용체의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 융합 단백질은 1개 초과의 세포외 항원 결합 도메인을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 키메라 융합 단백질은 CD137 결합 도메인 및 제2 세포 표면 분자, 예컨대, 세포외 단백질 또는 당단백질, 암 세포 또는 표적 세포의 표면 상에 존재하는 막 단백질 또는 당단백질에 대한 제2 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 본원에 기술된 임의의 표적에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 제2 결합 도메인이 표적 세포 또는 이웃 세포의 세포외 매트릭스 상의 단백질에 결합하도록 디자인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 가용성 표적, 예컨대, 이웃 세포, 또는 표적 세포의 세포외 공간에 방출된 분자에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인을 포함할 수 있다.
한 측면에서, 본원에서는 표적 세포 상의 CD137(4-1BB로도 공지)에 결합할 수 있는 키메라 융합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, CD137에 결합할 수 있는 CFP를 코딩하는 재조합 핵산은 골수 세포가 CD137 결합 CFP를 발현하도록 골수 세포에 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 CD14+ 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 CD14+/CD16-일 수 있다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 CD14+/CD16low일 수 있다. CD137 결합 CFP 발현 골수 세포는 다양한 방식으로; 또는 치료 조성물에서 다른 CFP 발현 골수 세포와 함께 조합하여; 또는 별개로 조합 치료 요법과 함께 조합하여 사용될 수 있고; 단독으로 또는 다른 핵산-, 펩티드-, 단백질- 또는 소분자- 치료제를 포함하는 다른 치료제와 함께 조합하여 사용될 수 있다.
CD137은 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 9(TNFRSF9: tumor necrosis factor receptor superfamily member 9)의 구성원이며, 특정 면역 세포의 표면에서 발현된다. CD137은 활성화된 T 세포에서 발현되는 세포 표면 단백질이다. 활성화된 항원 제시 세포(APC: antigen-presenting cell) 상에서의 CD137과 그의 리간드(CD137L, TNFSF9 또는 4-1BBL로도 공지)의 상호작용은 암에 대한 면역을 촉진시키는 양방향 활성화로 이어질 수 있다. 예를 들어, CD137 수용체를 통한 신호는 T 세포 활성화 및 생존으로 이어질 수 있다는 것이 밝혀졌다. 반대로, 인게이징된 CD137L은 이를 발현하는 세포, 예컨대, 골수 세포, 수지상 세포에 영향을 주어 그의 활성화 및 성숙화를 유도할 수 있다. 예컨대, 우렐루맙 및 유토밀루맙과 같은 효능작용 CD137 항체의 사용은 다양한 유형의 종양을 치료하기 위한 유망한 면역치료적 접근법으로 간주된다. 일부 실시양태에서, CD137L을 포함하는 CFP는 골수 세포에서 발현될 수 있고, 항종양 요법에 사용될 수 있으며, CD137L의 단핵구로의 신호전달은 CD137L-DC로의 분화를 유도한다. CD137L-DC는 종양에 대한 타입 1 T 헬퍼(Th1) 세포 분극화 및 강력한 타입 1 CD8+ T 세포(Tc1) 반응을 우선적으로 유도한다.
CD137 효능작용 항체 또는 그의 CD137 결합 영역은 생체내에서 면역 반응을 활성화하도록 CFP를 디자인하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, CD137L 또는 이들의 단편은 생체내에서 면역 반응을 활성화하도록 CFP를 디자인하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포외 도메인으로서 CD137 효능작용 항체 또는 이들의 단편 또는 CD137L을 포함하는 CD137 결합 CFP는 면역 반응을 활성화시키기 위해 또는 항신생물제로서 사용될 수 있다. 본원에서는 CD137 효능작용 항체 또는 이들의 단편을 포함하는 CD137 결합 세포외 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질로서, 여기서, 항체는 scFv, 이중특이적 항체, Fab, Fab 단편, F(ab')2 단편, 1가 항체, scFv 단편, scRv-Fc 단편, IgNARs, hcIgGs, VHH 항체, 나노바디 및 알파바디일 수 있는 것인, 키메라 융합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, CD137 효능작용 항체는 인간 또는 인간화 항체 또는 이들의 단편이다. 일부 실시양태에서, CD137 효능작용 항체는 우렐루맙 또는 이들의 단편이다. 본원에서는 CD137 효능작용 항체 또는 이들의 단편을 포함하는 CD137 결합 세포외 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 핵산 구성물로서, 여기서, 항체는 항체는 scFv, 이중특이적 항체, Fab, Fab 단편, F(ab')2 단편, 1가 항체, scFv 단편, scRv-Fc 단편, IgNARs, hcIgGs, VHH 항체, 나노바디 및 알파바디일 수 있는 것인, 핵산 구성물을 제공한다. 본원에서는 CD137L 또는 이들의 단편을 포함하는 CD137 결합 세포외 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료 세포는 전체 길이 CD137L 단백질을 발현함으로써 생성될 수 있고, 골수 세포가 림프구에 결합하고, 이를 활성화하도록 골수 세포와 같은 세포에서 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 세포는 적어도 CD137L의 세포외 단편을 발현하는 CFP를 디자인하고, 발현함으로써 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD137 결합 도메인으로서 세포외 CD137L을 포함하는 CFP는 CD137L의 세포내 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 본 단락에 기술된 CFP는 CFP를 발현하는 치료 세포 또는 CFP를 코딩하는 핵산 구성물로서 피험체에 투여될 때 면역 반응을 자극시키하기 위한 임의의 치료 목적으로 사용될 수 있으며, 여기서, 핵산 구성물은 생체내에서 세포에 의해 흡수되고, 세포는 CFP를 발현하도록 투여된다. 일부 실시양태에서, 투여되는 핵산 구성물은 특정 세포 유형 또는 조직을 표적화하고, 그에 의해 흡수되는 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 구성물은 가용성 세포외 단백질과 같은 CD137 결합 도메인을 포함하는 세포외 단백질을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD137 결합 도메인을 포함하는 CFP는 가용성 세포외 단백질일 수 있고, 면역자극성 CD137 효능작용 단백질로서 작용하여, 투여되고, 피험체에서 생체내에서 발현되었을 때, 림프구를 활성화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 융합 단백질은 수용체 단백질이다. 따라서, CD137 결합 세포외 도메인을 포함하는 CFP 수용체는 막횡단 도메인을 포함하고, 임의로 세포내 도메인을 포함할 수 있다. CD137 효능제 결합 도메인 및/또는 막횡단 도메인을 갖는 융합 단백질을 발현하는 세포는 T 림프구를 활성화시킬 수 있고, 생체내에서 항종양 반응을 활성화시키는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, CD137 결합 융합 단백질은 항암 DC 백신과 같은 DC 백신을 생성하기 위해 디자인되고, DC 세포와 같은 골수 세포에서 발현될 수 있다. 본원에서는 예컨대, 인간 CD137L 또는 그의 결합 단편과 같은 CD137 결합 리간드를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CFP를 발현하는 골수 세포(예컨대, DC)를 제공한다.
그러나, CD137은 예컨대, T 세포 림프종과 같은 CD137+ve 암에서 표적화될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이 CD137 결합 키메라 융합 단백질을 발현하도록 디자인된 CD137 표적화된 골수 세포는 CD137+ 종양에서 강력하고, 안전하며, 효과적인 살종양제로서 작용할 수 있고, T 세포 림프종 뿐만 아니라, 다른 암, 예컨대, 폐암, 췌장암, 백혈구 암 및 다른 암에서의 입양 세포 요법에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 키메라 융합 단백질은 림프구 및 NK 세포 상의 CD137 수용체에 결합하도록 표적화된다. 적합한 골수 세포에서 발현될 때, 살해 골수 세포가 생성될 수 있으며, 추가로 제한된 기간 동안 적합한 배양 조건에서 세포에 영양을 공급하고, 치료제로서 세포를 생체외에서 발생시킨다. CD137 결합 CFP를 발현하는 본원에 기술된 살해 골수 세포는 CD137 세포 악성종양, 또는 CD137 세포 기능으로부터 발생하는 질환 또는 병태 가능성이 있는 피험체에서 요법을 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 키메라 융합 단백질은 적절한 세포가 생체내에서 핵산을 흡수할 때, 키메라 융합 단백질이 생체내에서 세포에 의해 발현되고, 세포는 생체내에서 CD137을 발현하는 세포에 결합할 수 있는, 치료 조성물 중 핵산 구성물 형태로 투여될 수 있는 치료제이다. CD137 결합 CFP 융합 단백질의 추가 도메인(예컨대, 세포내 신호전달 도메인)은 단백질이 발현되는 세포를 강력한 세포독성 세포, 예를 들어, 증강된 식세포 활성을 가진 세포로 만들 수 있으므로 단백질을 발현하는 세포를 "공격 세포" 또는 예컨대, 림프구 또는 NK 세포와 같은 CD137 발현 세포의 파괴를 위해 표적화된 살해 세포로 만들 수 있다.
일부 실시양태에서, CD137 결합 키메라 융합 단백질은 이종성 막횡단 도메인 및/또는 하나 이상의 이종성 세포내 도메인을 포함할 수 있고, 강력한 면역반응 세포를 생성하기 위해 적합한 세포, 예컨대, 골수 세포에서 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD137 결합제를 갖는 CFP의 결합은 키메라 융합 단백질(수용체) 세포내 도메인을 활성화시키고, 이는 CFP를 발현하는 세포에서 식세포 반응, 염증 반응 및/또는 세포독성 반응을 활성화시켜 CFP 발현 세포는 CD137을 발현하는 표적 세포를 파괴시킨다. CD137을 발현하는 표적 세포의 예로는 CD137+ ve 세포 암, 예를 들어, 폐암, 백혈병, 췌장암, 결장직장암 및 림프종에서와 같은 T 림프구 또는 NK 세포와 같은 림프구일 수 있다.
일부 실시양태에서, CD137 결합 CFP는 CD137 발현 세포가 활성화된 CD137+ 림프구에 결합하고, 살해함으로써 면역 반응의 조절인자로서 작용할 수 있도록 적합한 세포(예컨대, 골수 세포)에서 발현될 수 있다. 상기 실시양태에서, CD137 표적화된 CFP는 동종이계 면역 반응과 같은 활성화된 면역 반응을 감소시키기 위해 치료적으로 사용된다.
일부 실시양태에서, 항CD137 세포외 모이어티를 발현하도록 조작된 활성 식세포성 세포와 같은 살해 세포는 여러 비자가 세포 기반 면역요법에 대한 인접 요법으로 사용될 수 있다. 상기 조합 요법은 흑색종, 교모세포종, 육종, 신장 세포 암종, 난소암, 폐암, 췌장암 유방암 및 다수의 다른 암을 포함하나, 이에 제한되지 않는 매우 다양한 암에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, CFP의 발현을 위해 골수 세포에 도입될 수 있고, CD137 결합 CFP를 발현하는 골수 세포는 CAR-P (예컨대, CAR 또는 CFP를 발현하는 식세포성 세포) 요법 또는 CAR-T (CAR 발현 T 세포) 요법에서 헬퍼 세포로 사용될 수 있고, 여기서, CAR을 발현하는 세포는 CD137 이외의 암 항원, 예컨대, CD5, CD19, CD40 등을 표적화하고, 이로써, CD137 CFP 발현 세포가 CD137 발현 종양 억제인자 림프구를 감소시키거나 제거하여 암 표적화된 CAR 발현 세포 (CAR-P 또는 CAR-T)의 살종양 기능을 증강시킨다. 따라서, CD137 결합 CFP는 임의의 입양 세포 요법에서 공동 투여를 위해 헬퍼 세포를 발생시키기 위하여 사용될 수 있고, 여기서, 헬퍼 세포는 CD137 결합 CFP 코딩 핵산 구성물이 도입되고, 세포가 CD137 결합제 CFP 세포외 도메인을 발현하는 세포독성 세포이다. CD137 결합제 CFP 발현 세포는 골수 세포일 수 있다. CD137 결합제 CFP 발현 세포는 식세포 골수 세포일 수 있다. CD137 결합제 CFP 발현 세포는 림프구양 세포일 수 있다. CD137 결합제 CFP 발현 세포는 세포독성 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, CD137 결합 CFP는 적합한 세포(예컨대, 골수 세포)에서 발현될 수 있고, 이로써, CD137 발현 세포는 동종이계 세포 요법 반응, 숙주 대 이식편 질환 또는 자가면역 질환 또는 병태에서와 같이 면역 반응의 조절인자로서 작용할 수 있다. 예를 들어, CD137 결합 CFP는 CAR-P 또는 CAR-T가, 이환 세포, 예컨대, CD137 이외의 암 항원, 예컨대, CD5, CD19, CD40을 발현하는 암 세포를 표적화하는 동종이계 세포인 것인 CAR-P 또는 CAR-T 요법과 함께 조합하여 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD137 결합 CFP는 임의의 입양 세포 요법에서 공동 투여를 위해 헬퍼 세포를 발생시키는 데 사용될 수 있고, 여기서, 헬퍼 세포는 CD137 결합 CFP를 포함하고, CD137 결합제 CFP 세포외 도메인을 발현하는 세포독성 세포이다. CD137 결합제 CFP 발현 세포는 골수 세포일 수 있다. CD137 결합제 CFP 발현 세포는 식세포 골수 세포일 수 있다. CD137 결합제 CFP 발현 세포는 림프구양 세포일 수 있다. CD137 결합제 CFP 발현 세포는 세포독성 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, CD137 표적화된 CFP는 골수 세포에서 발현될 수 있고, CART 요법과 함께 사용될 수 있으며, 여기서, CART 세포는 동종이계 또는 자가일 수 있다. 일부 실시양태에서, CD137 표적화된 CFP는 골수 세포에서 발현될 수 있고, CD137+ 세포 이외의 암 세포를 표적화하는 CART 요법과 함께 사용될 수 있으며, 여기서, CART 세포는 동종이계 또는 자가일 수 있다. 일부 실시양태에서, CD137 표적화된 CFP는 골수 세포에서 발현될 수 있고, CART 요법과 함께 사용될 수 있으며, 여기서, CART 세포 및/또는 골수 세포는 동종이계 또는 자가일 수 있다. 일부 실시양태에서, CD137 표적화된 CFP 발현 세포는 요법으로서 세포가 투여되는 피험체 대비 동종이계 또는 자가일 수 있다.
일부 실시양태에서, CD137 표적화된 CFP는 CD137 효능제 항체 또는 이들의 단편으로 구성된 세포외 CD137 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD137 효능제 항체 또는 이들의 단편으로 구성된 세포외 CD137 결합 도메인은 scFv, VHH, 디아바디, 이중특이적 항체 또는 CD137 리간드 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD137 표적화된 CFP는 CD3ζ, CD2, CD8α, CD28, CD68, FcgR, FcG, FcR 감마, FcR 알파 막횡단 도메인 또는 임의의 다른 적합한 도메인으로부터 유래된 막횡단 도메인(TMD)을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 기술된 CD137 표적화된 CFP는 하나 이상의 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD137 표적화된 CFP는 PI3K 모집 도메인으로부터 유래된 세포내 도메인, 스캐빈저 수용체의 세포내 신호전달 도메인, CD40 세포내 도메인, FcR 유래된 신호전달 도메인, TLR 세포내 도메인, NLRP3 세포내 도메인, CD3 유래된 세포내 도메인 등을 포함할 수 있다. 표 1 및 4의 본 개시내용은 다양한 실시양태에서 본원에 기술된 다양한 개별 도메인에 대한 서열 정보를 나타내고, 그의 다양한 조합은 키메라 융합 단백질을 개발하기 위해 표 1 및 4의 서열 정보를 사용하고, 당업계에 공지된 분자 생물학 기술을 사용하여 단일 생체분자에 도입될 수 있다는 것이 본 개시내용의 범주 내에 포함되는 것으로 간주된다.
일부 실시양태에서, 키메라 융합 단백질(CFP)은 서열 번호 31의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 31과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있는 CD137에 결합하도록 표적화된 세포외 도메인(ECD)을 포함한다.
Figure pct00008
한 측면에서, 키메라 융합 단백질은 CD137에 결합하는 결합 도메인을 갖는 가용성 단백질을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 키메라 융합 단백질은 CD137에 결합하는 적어도 하나의 결합 도메인 및 하나 이상의 추가 결합 도메인을 갖는 가용성 단백질을 포함할 수 있으며, 이들 중 적어도 하나는 골수 세포 상의 세포 표면 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서, 키메라 융합 단백질은 CD137에 결합할 수 있는 결합 도메인, 및 골수 세포 상의 세포 표면 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 융합 단백질은 CD137에 결합할 수 있는 결합 도메인, 및 골수 세포 상의 세포 표면 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 또한 제3 또는 추가의 세포외 모이어티에 결합하는 제3의 또는 임의의 수의 추가 결합 도메인을 포함하며, 여기서, 세포외 모이어티는 세포 표면 분자 또는 세포외 환경에서의 가용성 성분일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 키메라 융합 단백질은 이중특이적 인게이저(예컨대, 이중특이적 골수 세포 인게이저, BiME)로 지칭될 수 있으며, 여기서, 이중특이적 인게이저는 2개의 "인게이저" 모이어티를 포함하고, 여기서, 인게이저 모이어티는 2개의 상이한 표적에 대한 결합 도메인이고, 여기서, 제1 결합 도메인은 예컨대, 활성화된 T 세포, 활성화된 NK 세포 또는 암 세포와 같은 임의의 CD137+ 세포 상의 CD137에 결합하고, 여기서, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 표면 분자에 결합한다. 일부 측면에서, 본원에 기술된 키메라 융합 단백질은 삼중특이적 인게이저(삼중특이적 골수 세포 인게이저, TRiME)로 명명되며, 여기서, 삼중특이적 인게이저는 3개의 상이한 표적에 대한 결합 도메인인 3개의 인게이저 모이어티를 포함하고, 여기서, 제1 결합 도메인은 예컨대, 활성화된 T 세포, 활성화된 NK 세포 또는 CD137 발현 암 세포와 같은 임의의 CD137+ 세포 상의 CD137에 결합하고, 여기서, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 세포 표면 분자에 결합하고, 제3 결합 도메인은 제3 요소에 결합하고, 여기서, 제3 요소는 CD137 이외의 다른 세포 표면 분자 또는 제2 결합 도메인이 결합하는 골수 세포 상의 세포 표면 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제3 결합 도메인은 CD137+ 세포 상의 CD137 이외의 세포 표면 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제3 결합 도메인은 골수 세포 상의 세포 표면 분자에 결합하고, 제2 결합 도메인이 결합하는 분자 이외의 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서, BiME 또는 TriME는 표적 세포를 골수 세포에 병치시켜, 골수 세포가 표적 세포를 공격하고, 식세포작용을 통해 포식하고, 용해시킬 수 있도록 한다. 일부 실시양태에서, 골수 세포에의 BiME 또는 TRiME 인게이지먼트는 골수 세포와 표적 세포를 근접하게 할 뿐만 아니라, 골수 세포를 활성화시켜 표적 세포를 효율적으로 인게이징하고, 살해한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 제2 및/또는 제3 결합 도메인은 결합시 골수 세포를 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, BiME 또는 TriME는 분비된 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 인게이저, 또는 본원에 기술된 임의의 결합 도메인은 항원 결합 단편(Fab), 단일 쇄 가변 단편(scFv), 나노바디, VH 도메인, VL 도메인, 단일 도메인 항체(sdAb), VNAR 도메인, 및 VHH 도메인, 이중특이적 항체, 디아바디, 또는 그 중 임의의 것의 기능성 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인게이저는 리간드, 예컨대, CD137 리간드 (서열 번호 31), 또는 CD137에 결합하는, 이들의 단편일 수 있다.
일부 실시양태에서, 종양 세포 상의 CD137에 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 CFP는 항종양 활성에 사용하기 위해 디자인된다. CD137에 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산은 골수 세포에서 발현되며, 여기서, 키메라 융합 단백질은 막횡단 단백질이고, 골수 세포는 식세포성 세포이고; 세포, 예컨대, 종양 세포 상에 발현된 표적 CD137에의 CFP의 인게이지먼트시 골수 세포는 활성화되고, 식세포작용을 통해 포식하고, 표적 세포, 예컨대, 종양 세포를 용해시켜, 종양 성장을 저속화시키거나, 또는 정지시키고, 종양 크기를 축소시키고/거나, 종양을 제거한다.
일부 실시양태에서, 활성화된 CD137 발현 세포 상의 CD137에 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 CFP는 숙주-대-이식편-질환(HVGD: host-versus-graph-disease) 또는 동종이계 반응과 관련된 병태, 또는 급성 또는 지속적인 중증 염증을 치료하기 위해 면역억제에 사용하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, CD137 발현 세포는 활성화된 T 세포, 또는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 골수 세포에서 발현된 CFP의 세포외 도메인 상의 CD137 리간드 또는 이들의 단편은 활성화된 T 세포 또는 NK 세포 상의 CD137에 결합시 골수 세포를 활성화시키고, 식세포작용을 활성화시키고, 활성화된 T 세포 또는 NK 세포를 용해시키고, 염증을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 예컨대, 약학 조성물이 (i) CD137에 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 CFP; (ii) CD137에 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 CFP를 코딩하는 재조합 핵산; 또는 (iii) CD137에 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 CFP를 발현하는 세포를 포함할 수 있는 것인 약학 조성물과 같은, 치료제를 기술한다.
일부 실시양태에서, 예컨대, CD137에 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 CFP; CD137에 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 CFP를 코딩하는 재조합 핵산; 또는 CD137에 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 CFP를 발현하는 세포를 포함하는 본원에 기술된 약학 조성물과 같은, 치료제는 각각 (i) 하나 이상의 추가 CFP; 또는 (ii) 하나 이상의 추가 CFP를 코딩하는 재조합 핵산; 또는 (iii) 하나 이상의 추가 CFP를 발현하는 세포, 또는 이들의 임의의 조합과 함께 조합하여 사용될 수 있다. 상기의 한 예로서, CD137에 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 CFP를 발현하는 골수 세포를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 기술될 수 있고, 이는 CD5에 결합할 수 있는 결합 도메인, 또는 본 명세서 어디에나 기술된 임의의 다른 결합 도메인을 포함하는 CFP를 발현하는 골수 세포와 함께 조합하여 사용될 수 있다. 유사하게, 본원에 기술된 조성물의 임의의 조합은 치료제로 조합되거나 혼합되는 것으로 고려되며, 이는 본 개시내용의 범위 내에 포함될 것이다.
CD70 결합제 단백질 및 도메인
CD70은 결장직장암(CRC: colorectal cancer), 폐암, T 세포 림프종, 신경아교종, 갑상선암, 두부경부암, 위암, 간암, 췌장암, 요로상피암, 난소암, 흑색종을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 특정 암에서 고도로 발현될 수 있다. 본원에서는 암 세포 상의 CD70에 결합할 수 있고, CD70의 과다발현을 수반하는 질환, 예컨대, 암에 대한 치료용으로 디자인된 키메라 융합 단백질을 제공한다.
한 측면에서, 본원에서는 CD70에 결합할 수 있는 세포외 결합 도메인을 갖는 키메라 융합 단백질(CD70 결합제 CFP)을 제공한다. 일부 실시양태에서, CD70 결합제 CFP는 서열 번호 32의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 32의 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 세포외 결합 도메인을 포함할 수 있다. CD70 결합 도메인은 항원 결합 단편(Fab), 단일 쇄 가변 단편(scFv), 나노바디, VH 도메인, VL 도메인, 단일 도메인 항체(sdAb), VNAR 도메인, 및 VHH 도메인, 이중특이적 항체, 디아바디, 또는 그 중 임의의 것의 기능성 단편을 포함할 수 있다
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 CD8로부터 유래된 힌지 도메인을 추가로 포함하고, 여기서, 힌지 도메인은 세포질 측에서 막횡단 도메인에, 및 세포외 측 상의 CD70 결합 도메인에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 15, 16, 17, 18 또는 19의 서열 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD8 알파(CD8a) 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 15에 기재된 서열, 또는 서열 번호 15와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 16에 기재된 서열, 또는 서열 번호 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD2 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 17에 기재된 서열, 또는 서열 번호 17과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD28 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 18에 기재된 서열, 또는 서열 번호 18과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD68 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 19에 기재된 서열, 또는 서열 번호 19와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP의 ECD는 서열 번호 15, 16, 17, 18 또는 19에 기재된 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 막횡단 도메인, 또는 서열 번호 15, 16, 17, 18 또는 19 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성이 있는 아미노산 서열을 갖는 막횡단 도메인에 융합된, 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 32와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성이 있는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포외 힌지 도메인 및 막횡단 도메인은 각각 서열 번호 20 또는 서열 번호 21의, 또는 서열 번호 20 또는 서열 번호 21과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 20의, 또는 서열 번호 20과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 막횡단 도메인에 융합된 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 21의, 또는 서열 번호 21과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 막횡단 도메인에 융합된 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 20 또는 21과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성이 있는 아미노산 서열을 갖는 힌지 및 막횡단 도메인에 융합된, 서열 번호 32와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 ECD 결합제 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 표 4에 기재된 바와 같은 (예컨대, 짧은 힌지 도메인을 포함하는) CD16 막횡단 도메인의 서열을 포함하는 TM 도메인에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 32에 기재된 서열, 또는 서열 번호 32와 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 CD64 막횡단 도메인 서열을 포함하는 TM 도메인에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 32에 기재된 서열, 또는 서열 번호 32와 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 표 4에 기재된 바와 같은 (예컨대, 짧은 힌지 도메인을 포함하는) CD89 막횡단 도메인의 서열을 포함하는 TM 도메인에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 32에 기재된 서열을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 32에 기재된 서열, 또는 서열 번호 32와 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 ECD; CD16 단백질의 TM 도메인 또는 CD64 단백질의 TMD 또는 CD89 단백질의 TMD로부터의 서열을 포함하는 TM 도메인, 및 임의로, 본원에 기술된 다른 별개의 ICD 이외에도, 각각, 예컨대, CD16 단백질, CD64 단백질, 또는 CD89 단백질로부터의 상응하는 세포내 도메인(ICD), 또는 그의 일부를 포함한다. 예시적인 CD16 및 CD89 ICD 서열은 표 4에 제공되어 있다.
일부 실시양태에서, CFP는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 식세포작용 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 Megf10, MerTk, FcRα, 및 Bai1 이외의 다른 수용체로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 Megf10, MerTk, FcR, 및 Bai1 이외의 다른 수용체로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ 이외의 다른 수용체로부터 유래된 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 FcRγ, FcRα 또는 FcRε로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 22, 23, 24 또는 25 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 22, 23, 24 또는 25 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 FcR감마 단백질(FcRγ 쇄)로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 염증유발성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 PI3 키나제(PI3K) 모집 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 서열 번호 26의, 또는 서열 번호 26과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 CD40의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 서열 번호 27의, 또는 서열 번호 27과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 28의, 또는 서열 번호 28과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 29의, 또는 서열 번호 29와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 30의, 또는 서열 번호 30과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
본원에서는 골수 세포와 같은 적합한 세포에서 발현될 수 있는 상기 기술된 바와 같은 CD70 결합 도메인(CD70 결합제)을 포함하는 CFP를 코딩하는 재조합 핵산을 제공한다. 골수 세포는 식세포성 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, CD70이 세포에 결합할 때, CD70 결합제는 CD70 결합 CFP를 발현하는 골수 세포를 활성화시킨다. 본원에서 사용되는 바, CD70-CFP로 명명된 키메라 CD70 결합제 수용체 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산 서열을 제공한다. 일부 실시양태에서, 예컨대, 키메라 수용체 융합 단백질, 예컨대, CD70 결합제 수용체 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산은 적합한 세포, 예컨대, 골수 세포에서 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD70-CFP는 적합한 세포, 예컨대, 골수 세포 상에서 발현될 때, CD70 결합제가 CD70을 발현하는 표적 세포에 결합할 수 있고, 결합제를 발현하는 골수 세포가 활성화된다. 일부 실시양태에서, CD70-CFP가 CD70과 인게이징할 때 CD70-CFP를 코딩하는 재조합 핵산을 발현하는 골수 세포를 활성화시키는 CD70-CFP의 세포내 신호전달 도메인을 활성화시켰다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 식세포성 세포이다. 일부 실시양태에서, 식세포성 세포이고, CD70 결합제를 발현하는 골수 세포는 CD70 결합제가 또 다른 세포(표적 세포)에서 발현된 CD70에 결합하고, 표적 세포를 식세포작용을 통해 포식할 때 활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 CD70을 발현하는 임의의 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 림프구이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 T 림프구(T 세포)이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 악성 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 악성 T 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, CD70 결합 CFP 발현 골수 세포는 T 세포 림프종에 대한 치료 조성물을 생성하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원에서는 CD70의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 가용성 단백질과 같은 세포외 단백질과 같은 재조합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 가용성 단백질과 같은 키메라 융합 단백질은 이중특이적 인게이저(예컨대, 이중특이적 골수 세포 인게이저, BiME)로 지칭될 수 있으며, 여기서, 이중특이적 인게이저는 2개의 "인게이저" 모이어티를 포함하고, 여기서, 인게이저 모이어티는 2개의 상이한 표적에 대한 결합 도메인이고, 여기서, 제1 결합 도메인은 예컨대, 활성화된 T 세포, 활성화된 NK 세포 또는 암 세포와 같은 임의의 CD70+ 세포 상의 CD70에 결합하고, 여기서, 제2 결합 도메인은 도메인은 골수 세포의 표면 분자에 결합한다. 일부 측면에서, 본원에 기술된 키메라 융합 단백질은 삼중특이적 인게이저(삼중특이적 골수 세포 인게이저, TRiME)로 명명되며, 여기서, 삼중특이적 인게이저는 3개의 상이한 표적에 대한 결합 도메인인 3개의 인게이저 모이어티를 포함하고, 여기서, 제1 결합 도메인은 CD70에 결합한다. 일부 실시양태에서, CD70에 결합할 수 있는 도메인을 갖는 재조합 세포외 단백질(BiME 또는 TRiME)은 예컨대, 식세포성 세포와 같은 골수 세포의 표면 단백질에 결합할 수 있는 제2 도메인을 추가로 포함한다. 골수 세포의 표면 단백질은 골수 세포의 막에 발현되는 단백질, 예를 들어, 식세포 수용체, 패턴 인식 분자 또는 스캐빈저 수용체일 수 있다. 본원에서는 본원에 기술된 바와 같은 CD70의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 가용성 단백질과 같은 세포외 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 제공한다.
본원에서는 피험체에서 질환을 치료하기 위한 치료제로서, 여기서, 질환은 CD70 단백질의 과다발현과 연관되고, 치료제는 적어도 CD70에 결합할 수 있는 세포외 결합 도메인을 갖는 재조합 단백질, 예컨대, 상기 기술된 CD70 결합제 단백질 중 임의의 것을 포함하는 것인 치료제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 CD70 결합 단백질을 발현하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 피험체에서 질환을 치료하기 위한 치료제로서, 여기서, 질환은 CD70의 과다발현과 연관되고, 치료제는 적어도 본원에 기술된 바와 같은 CD70 결합제를 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 것인 치료제를 제공한다. 본원에서는 피험체에서 질환을 치료하기 위한 치료제로서, 여기서, 질환은 CD70의 과다발현과 연관되고, 치료제는 본원에 기술된 바와 같은 CD70 결합제를 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 것인 치료제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 질환은 암, 예를 들어, T 세포 림프종 또는 결장직장암(CRC)이다.
예시적인 CD70 결합제 서열은 서열 번호 32이다:
Figure pct00009
일부 실시양태에서, 키메라 융합 단백질(CFP)은 서열 번호 32의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 32와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD70에 결합하도록 표적화된 세포외 도메인(ECD)을 포함한다.
Claudin 18.2 및 claudin 3 결합제 단백질 및 도메인
claudin 패밀리의 단백질은 밀착 세포 연접부의 성분이고, 이는 세포 사이의 분자 흐름을 제어하는 세포주위 장벽을 확립한다. claudin의 막횡단 도메인은 세포질에 N-말단 및 C-말단을 포함한다. Claudin 단백질은 조직 특이적 발현을 나타내며, 그의 변경된 기능은 종종 특정 조직의 암과 관련이 있다. Claudin-1 발현은 결장암에서 예후적 가치가 있는 것으로 나타났다. Claudin-1은 II기 대장암에서 강력한 예후 지표이며, claudin-18은 위암에서 강력한 예후 지표이다. claudin-18 유전자의 하향조절은 장 표현형을 갖는 위암에서 유전자 발현 데이터 분석의 연속 분석을 통해 입증되었으며, claudin-10의 하향 조절은 간세포 암종에서 입증되었다. 표면 단백질인 Claudin은 다양한 치료 전략법에 유용한 표적을 나타낸다.
Claudin 18 이소폼 2(claudin 18.2)는 매우 선택적인 세포 계통 마커이다. Claudin-18 스플라이스 변이체 2는 치료용 항체 개발에 적합한 범암 표적이며, 정상 조직에서 매우 제한된 발현 패턴을 나타내며, 위암, 난소암 및 췌장암을 포함한 다양한 인간 암에서 빈번한 이소성 활성화를 나타낸다.
Claudin-3은 밀착 연접부에서 발현되고, 유방, 난소, 자궁, 전립선 및 식도와 같은 다수의 기관 및 조직에서 종양 형성 동안 조절되는 것으로 보인다. Caudin 3 과다발현은 세포주위 저항으로 측정되는 상피 내성을 증가시키는 반면, 세포간 내성은 크게 변하지 않았다. Claudin-3 과다발현은 나트륨 및 염화물, 둘 모두에 대한 투과성을 감소시키고, Claudin 3 분자의 발현은 예컨대, 난소암, 전립선암, 유방암, 자궁암, 간암, 폐암, 췌장암, 위암, 방광암, 및 결장암 조직과 같은 많은 암 조직에서 증가한다. Claudin 3 및 Claudin 4의 발현은 화학요법 내성 자궁암에서 특히 증가하는 것으로 나타났다. Claudin 3은 4개의 막횡단 영역을 가진 단백질이고, 2개의 펩티드 루프를 세포 외부로 노출시키는 구조를 가지고 있다.
한 측면에서, 본원에서는 claudin 18.2에 결합할 수 있는 세포외 결합 도메인을 갖는 키메라 융합 단백질(Claudin 18.2 결합제 CFP)을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 claudin 3.0에 결합할 수 있는 세포외 결합 도메인을 갖는 키메라 융합 단백질을 제공한다.
한 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 인간 claudin 18.2에 특이적인 scFv 또는 이들의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 융합 수용체 단백질의 ECD는 표적 세포 상의 Claudin 18.2의 세포외 루프에 결합하는 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예시적인 Claudin 18.2 결합제 도메인은 서열 번호 33의 서열; 또는 서열 번호 33과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
Figure pct00010
일부 실시양태에서, 키메라 융합 단백질(CFP)은 서열 번호 33의 서열; 또는 서열 번호 33과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, Claudin 18.2에 결합하도록 표적화된 세포외 도메인(ECD)을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 표 4에 기재된 바와 같은 (예컨대, 짧은 힌지 도메인을 포함하는) CD16 막횡단 도메인의 서열을 포함하는 TM 도메인에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 33에 기재된 서열, 또는 서열 번호 33과 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 CD64 막횡단 도메인의 서열을 포함하는 TM 도메인에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 33에 기재된 서열, 또는 서열 번호 33과 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. CFP는 표 4에 기재된 바와 같은 (예컨대, 짧은 힌지 도메인을 포함하는) CD89 막횡단 도메인의 서열을 포함하는 TM 도메인에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 33에 기재된 서열, 또는 서열 번호 33과 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 33에 기재된 서열, 또는 서열 번호 33과 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 ECD; CD16 단백질의 TM 도메인 또는 CD64 단백질의 TMD 또는 CD89 단백질의 TMD로부터의 서열을 포함하는 TM 도메인, 및 임의로, 본원에 기술된 다른 별개의 ICD 이외에도, 각각, 예컨대, CD16 단백질, CD64 단백질, 또는 CD89 단백질로부터의 상응하는 세포내 도메인(ICD), 또는 그의 일부를 포함한다. 예시적인 CD16 및 CD89 ICD 서열은 표 4에 제공되어 있다.
한 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 인간 claudin 3.0에 특이적인 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 표 2에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 claudin 3 결합 도메인을 포함한다. 표 2는 본 개시내용에 대해 비제한적인 것으로 의도되는 인간 claudin 3.0 결합 도메인 및/또는 이들의 단편의 예시적인 서열을 보여준다.
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Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
claudin 3 결합 도메인은 표 2로부터의 서열 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, claudin 3 결합 도메인은 표 2의 서열을 포함하는 ScFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 표 2의 서열을 포함하는 항원 결합 단편(Fab), 단일 쇄 가변 단편(scFv), 나노바디, VH 도메인, VL 도메인, 단일 도메인 항체(sdAb), VNAR 도메인, 및 VHH 도메인, 이중특이적 항체, 디아바디, 또는 그 중 임의의 것의 기능성 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편(Fab), 단일 쇄 가변 단편(scFv), 나노바디, VH 도메인, VL 도메인, 단일 도메인 항체(sdAb), VNAR 도메인, 및 VHH 도메인, 이중특이적 항체, 디아바디, 또는 그 중 임의의 것의 기능성 단편은 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 키메라 융합 단백질은 항원 결합 도메인과 같은 세포외 결합 도메인을 포함하는 수용체이고; 여기서, 세포외 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 claudin 18.2 단백질에 결합할 수 있는 서열을 포함할 수 있거나; 또는 본원에 기술된 바와 같은 claudin 3 단백질에 결합할 수 있고; 세포외 항원 결합 도메인과 세포내 도메인 사이에 힌지 도메인을 포함하거나, 또는 그의 부재하에 막횡단 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 CD8로부터 유래된 힌지 도메인을 추가로 포함하고, 여기서, 힌지 도메인은 세포질 측에서 막횡단 도메인에, 및 세포외 측 상의 Claudin 18.2 결합 도메인에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 15, 16, 17, 18 또는 19의 서열 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD8 알파(CD8a) 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 15에 기재된 서열, 또는 서열 번호 15와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 16에 기재된 서열, 또는 서열 번호 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD2 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 17에 기재된 서열, 또는 서열 번호 17과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD28 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 18에 기재된 서열, 또는 서열 번호 18과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD68 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 19에 기재된 서열, 또는 서열 번호 19와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP의 ECD는 서열 번호 15, 16, 17, 18 또는 19에 기재된 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 막횡단 도메인, 또는 서열 번호 15, 16, 17, 18 또는 19 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성이 있는 아미노산 서열을 갖는 막횡단 도메인에 융합된, 표 2의 서열에 제시된 아미노산 서열, 또는 표 2의 서열 중의 임의의 것과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포외 힌지 도메인 및 막횡단 도메인은 각각 서열 번호 20 또는 서열 번호 21의, 또는 서열 번호 20 또는 서열 번호 21과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 20의, 또는 서열 번호 20과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 막횡단 도메인에 융합된 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 21의, 또는 서열 번호 21과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 막횡단 도메인에 융합된 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 20 또는 21과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성이 있는 아미노산 서열을 갖는 힌지 및 막횡단 도메인에 융합된, 표 2의 서열 중의 임의의 것과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 ECD 결합제 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 식세포작용 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 Megf10, MerTk, FcRα, 및 Bai1 이외의 다른 수용체로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 Megf10, MerTk, FcR, 및 Bai1 이외의 다른 수용체로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ 이외의 다른 수용체로부터 유래된 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 FcRγ, FcRα 또는 FcRε로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 22, 23, 24 또는 25 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 22, 23, 24 또는 25 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 FcR감마 단백질(FcRγ 쇄)로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 염증유발성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 PI3 키나제(PI3K) 모집 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 서열 번호 26의, 또는 서열 번호 26과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 CD40의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 서열 번호 27의, 또는 서열 번호 27과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 28의, 또는 서열 번호 28과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 29의, 또는 서열 번호 29와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 30의, 또는 서열 번호 30과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
본원에서는 골수 세포와 같은 적합한 세포에서 발현될 수 있는 상기 기술된 바와 같은 Claudin 18.2 결합 도메인(Claudin 18.2 결합제)을 포함하는 CFP를 코딩하는 재조합 핵산을 제공한다. 골수 세포는 식세포성 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, Claudin 18.2가 세포에 결합할 때, Claudin 18.2 결합제는 Claudin 18.2 결합 CFP를 발현하는 골수 세포를 활성화시킨다. 본원에서는 키메라 Claudin 18.2 결합제 수용체 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산 서열을 제공한다. 일부 실시양태에서, 예컨대, 키메라 수용체 융합 단백질, 예컨대, Claudin 18.2 결합제 수용체 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산은 적합한 세포, 예컨대, 골수 세포에서 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, Claudin 18.2-CFP는 적합한 세포, 예컨대, 골수 세포 상에서 발현될 때, Claudin 18.2 결합제가 Claudin 18.2를 발현하는 표적 세포에 결합할 수 있고, 결합제를 발현하는 골수 세포가 활성화된다. 일부 실시양태에서, Claudin 18.2-CFP는 Claudin 18.2와 인게이징할 때 Claudin 18.2-CFP를 코딩하는 재조합 핵산을 발현하는 골수 세포를 활성화시키는 Claudin 18.2-CFP의 세포내 신호전달 도메인을 활성화시켰다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 식세포성 세포이다. 일부 실시양태에서, 식세포성 세포이고, CD137 결합제를 발현하는 골수 세포는 Claudin 18.2 결합제가 또 다른 세포(표적 세포)에서 발현된 Claudin 18.2에 결합하고, 표적 세포를 식세포작용을 통해 포식할 때 활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 Claudin 18.2를 발현하는 임의의 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 림프구이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 T 림프구(T 세포)이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 악성 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 악성 T 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, Claudin 18.2 결합 CFP 발현 골수 세포는 T 세포 림프종에 대한 치료 조성물을 생성하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, claudin 18.2 결합제 키메라 융합 단백질은 claudin 18.2에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 단백질이다. 본원에서는 claudin 18.2에 결합할 수 있는 가용성 단백질과 같은 세포외 단백질과 같은 재조합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포외 단백질은 상기 기술된 바와 같이 claudin 18.2에 결합할 수 있는 항체 또는 이들의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 단백질 또는 가용성 단백질은 식세포성 세포와 같은 골수 세포의 표면 단백질에 결합할 수 있는 제2 도메인을 추가로 포함한다. 골수 세포의 표면 단백질은 골수 세포의 막에 발현되는 단백질, 예를 들어, 식세포 수용체, 패턴 인식 분자 또는 스캐빈저 수용체일 수 있다.
본원에서는 본원에 기술된 바와 같은 Claudin 18.2의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 가용성 단백질과 같은 세포외 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, claudin 3 결합제는 세포외 단백질이다. 본원에서는 claudin 3에 결합할 수 있는 가용성 단백질과 같은 세포외 단백질과 같은 재조합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포외 단백질은 예컨대, 표 2에 제시된 서열 중 임의의 하나 이상의 것과 같은, claudin 3에 결합할 수 있는 항체 또는 이들의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 claudin 3 결합제 단백질은 식세포성 세포와 같은 골수 세포의 표면 단백질에 결합할 수 있는 제2 도메인을 추가로 포함한다. 골수 세포의 표면 단백질은 골수 세포의 막에 발현되는 단백질, 예를 들어, 식세포 수용체, 패턴 인식 분자 또는 스캐빈저 수용체일 수 있다. 본원에서는 본원에 기술된 바와 같은 claudin 3의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 가용성 단백질과 같은 세포외 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 제공한다.
본원에서는 피험체에서 질환을 치료하기 위한 치료제로서, 여기서, 질환은 claudin 단백질, 예컨대, claudin 18.2 단백질 또는 claudin 3 단백질의 과다발현과 연관되고, 치료제는 적어도 각각 claudin 18.2 또는 claudin 3에 결합할 수 있는 세포외 결합 도메인을 갖는 재조합 단백질, 예컨대, 상기 기술된 claudin 18.2 또는 claudin 3 결합제 단백질 중 임의의 것을 포함하는 것인 치료제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 claudin 18.2 결합제 또는 claudin 3 결합을 발현하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 피험체에서 질환을 치료하기 위한 치료제로서, 여기서, 질환은 claudin 단백질, 예컨대, claudin 18.2 단백질 또는 claudin 3 단백질의 과다발현과 연관되고, 치료제는 적어도 본원에 기술된 바와 같은 claudin 18.2 결합제 또는 claudin 3 결합제를 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 것인 치료제를 제공한다. 본원에서는 피험체에서 질환을 치료하기 위한 치료제로서, 여기서, 질환은 claudin 단백질, 예컨대, claudin 18.2 단백질 또는 claudin 3 단백질의 과다발현과 연관되고, 치료제는 본원에 기술된 바와 같은 claudin 18.2 결합제 또는 claudin 3 결합제를 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 것인 치료제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 골수 세포이다.
TROP2 결합제 단백질 및 도메인
상피 당단백질-1, 위장 항원 733-1, 막 성분 표면 마커-1 및 종양 연관 칼슘 신호 전달인자-2로도 알려진 TROP2는 TACSTD2 유전자의 단백질 생성물이다. 다양한 세포 신호 전달 경로에서 작용하는 막횡단 당단백질이며, 세포내 칼슘 신호의 전달인자로 처음 밝혀졌다. TROP2 발현은 다양한 전사 인자에 의존하는 것으로 입증되었다. TROP2는 b-카테닌 신호전달을 통해 증식과 자가 재생을 조절하고, TROP2 신호전달은 암 세포의 줄기 세포 유사 특성을 증진시킨다. TROP2는 전통적으로 암 발달과 연관된 여러 분자 경로에 관여하는 경우 종양 진행에서 중요한 작용을 할 수 있다. 높은 TROP2 발현은 췌장암, 폐문 담관암종, 자궁경부암, 위암 등에서 불량한 예후와 상관관계가 있다(문헌 [Fong D et al., Br J Cancer. 2008;99(8):1290-1295]; [Ning S. et al., J Gastrointest Surg. 2013;17(2):360-368]; [Liu T, et al., PLoS One. 2013;8(9):e75864]; [Zhao W, et al., Oncotarget. 2016;7(5):6136-6145]). TROP2는 다양한 종양에서 과다발현되며, 정상 세포에 비해 발현이 상향조절되어 신규한 치료법 개발의 표적이 될 수 있다.
본원에서는 TROP2를 발현하는 암 세포에 결합할 수 있는 키메라 단백질을 제공한다. 본원에서는 TROP2의 세포외 도메인에 결합하는 키메라 단백질(TROP2)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 키메라 단백질은 TROP2에 결합할 수 있는 세포외 단백질의 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및/또는 세포질 도메인을 갖는 키메라 수용체 단백질이다. 일부 실시양태에서, 키메라 단백질은 TROP2의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 세포외 가용성 단백질인 단백질이다. 일부 실시양태에서, TROP2의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 세포외 가용성 키메라 단백질은 골수 세포, 예컨대, 식세포성 세포의 표면에서 발현되는 단백질의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 또 다른 도메인을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 본원에 기술된 키메라 단백질(TROP2 결합제)은 예컨대, 암과 같은 TROP2 단백질의 과다발현과 관련된 질환의 치료를 위한 TROP2 결합제를 포함하는 약학 조성물을 포함하는 치료제를 제조하는 데 사용될 수 있다. 상기 암으로는 췌장암, 폐문 담관암종, 자궁경부암 및 위암을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
한 측면에서, 본원에서는 세포외 TROP2 결합 도메인을 갖는 키메라 융합 수용체(CFP) 단백질(TROP2 결합제 CFP)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 TROP2에 결합할 수 있는 항체의 항원 결합 도메인, 또는 단편 단일 쇄 가변 단편(scFv), 나노바디, VH 도메인, VL 도메인, 단일 도메인 항체(sdAb), VNAR 도메인, 및 VHH 도메인, 이중특이적 항체, 디아바디, 또는 그 중 임의의 것의 기능성 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편(Fab), 단일 쇄 가변 단편(scFv), 나노바디, VH 도메인, VL 도메인, 단일 도메인 항체(sdAb), VNAR 도메인, 및 VHH 도메인, 이중특이적 항체, 디아바디, 또는 그 중 임의의 것의 기능성 단편은 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 TROP2 수용체에 대한 천연 리간드이다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 CD8로부터 유래된 힌지 도메인을 추가로 포함하고, 여기서, 힌지 도메인은 세포질 측에서 막횡단 도메인에, 및 세포외 측 상의 TROP2 결합 도메인에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 15, 16, 17, 18 또는 19의 서열 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD8 알파(CD8a) 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 15에 기재된 서열, 또는 서열 번호 15와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 16에 기재된 서열, 또는 서열 번호 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD2 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 17에 기재된 서열, 또는 서열 번호 17과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD28 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 18에 기재된 서열, 또는 서열 번호 18과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD68 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 19에 기재된 서열, 또는 서열 번호 19와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP의 ECD는 서열 번호 15, 16, 17, 18 또는 19에 기재된 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 막횡단 도메인, 또는 서열 번호 15, 16, 17, 18 또는 19 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성이 있는 아미노산 서열을 갖는 막횡단 도메인에 융합된, 표 2의 서열에 제시된 아미노산 서열, 또는 표 2의 서열 중의 임의의 것과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포외 힌지 도메인 및 막횡단 도메인은 각각 서열 번호 20 또는 서열 번호 21의, 또는 서열 번호 20 또는 서열 번호 21과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 20의, 또는 서열 번호 20과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 막횡단 도메인에 융합된 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 21의, 또는 서열 번호 21과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 막횡단 도메인에 융합된 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 20 또는 21과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성이 있는 아미노산 서열을 갖는 힌지 및 막횡단 도메인에 융합된, 표 2의 서열 중의 임의의 것과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 ECD 결합제 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 표 4에 기재된 바와 같은 (예컨대, 짧은 힌지 도메인을 포함하는) CD16 막횡단 도메인의 서열을 포함하는 TM 도메인에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 34 또는 서열 번호 35, 또는 그 둘 모두에 기재된 서열, 또는 서열 번호 34 또는 서열 번호 35와 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 CD64 막횡단 도메인 서열을 포함하는 TM 도메인에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 34 또는 서열 번호 35에 기재된 서열, 또는 서열 번호 34 또는 서열 번호 35와 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 표 4에 기재된 바와 같은 (예컨대, 짧은 힌지 도메인을 포함하는) CD89 막횡단 도메인의 서열을 포함하는 TM 도메인에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 34 또는 서열 번호 35에 기재된 서열을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 34 또는 서열 번호 35에 기재된 서열, 또는 서열 번호 34 또는 서열 번호 35와 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 ECD; CD16 단백질의 TM 도메인 또는 CD64 단백질의 TMD 또는 CD89 단백질의 TMD로부터의 서열을 포함하는 TM 도메인, 및 임의로, 본원에 기술된 다른 별개의 ICD 이외에도, 각각, 예컨대, CD16 단백질, CD64 단백질, 또는 CD89 단백질로부터의 상응하는 세포내 도메인(ICD), 또는 그의 일부를 포함한다. 예시적인 CD16 및 CD89 ICD 서열은 표 4에 제공되어 있다.
일부 실시양태에서, CFP는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 식세포작용 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 Megf10, MerTk, FcRα, 및 Bai1 이외의 다른 수용체로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 Megf10, MerTk, FcR, 및 Bai1 이외의 다른 수용체로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ 이외의 다른 수용체로부터 유래된 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 FcRγ, FcRα 또는 FcRε로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 22, 23, 24 또는 25 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 22, 23, 24 또는 25 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 FcR감마 단백질(FcRγ 쇄)로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 염증유발성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 PI3 키나제(PI3K) 모집 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 서열 번호 26의, 또는 서열 번호 26과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 CD40의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 서열 번호 27의, 또는 서열 번호 27과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 28의, 또는 서열 번호 28과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 29의, 또는 서열 번호 29와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 30의, 또는 서열 번호 30과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
본원에서는 골수 세포와 같은 적합한 세포에서 발현될 수 있는 상기 기술된 바와 같은 TROP2 결합 도메인(TROP2 결합제)을 포함하는 CFP를 코딩하는 재조합 핵산을 제공한다. 골수 세포는 식세포성 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 TROP2 결합 도메인, 서열 번호 21-30으로부터의 서열 중 하나 이상의 것을 포함하는 세포내 도메인; 및 서열 번호 15-21 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 갖는 서열을 포함하는 막횡단 도메인을 포함하는 CFP를 코딩하는 재조합 핵산.
또 다른 실시양태에서, 본원에서는 TROP2의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 가용성 단백질과 같은 세포외 단백질과 같은 재조합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, TROP2에 결합할 수 있는 도메인, 예컨대, TROP2의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 도메인을 갖는 재조합 세포외 단백질은 골수 세포, 예컨대, 식세포성 세포의 표면 단백질에 결합할 수 있는 제2 도메인을 추가로 포함한다. 골수 세포의 표면 단백질은 골수 세포의 막에 발현되는 단백질, 예를 들어, 식세포 수용체, 패턴 인식 분자 또는 스캐빈저 수용체일 수 있다. 본원에서는 본원에 기술된 바와 같은 TROP2의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 가용성 단백질과 같은 세포외 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 제공한다.
본원에서는 피험체에서 질환을 치료하기 위한 치료제로서, 여기서, 질환은 TROP2 단백질의 과다발현과 연관되고, 치료제는 적어도 TROP2에 결합할 수 있는 세포외 결합 도메인을 갖는 단백질, 예컨대, 상기 기술된 TROP2 결합제 단백질 중 임의의 것을 코딩하는 재조합 폴리핵산을 포함하는 것인 치료제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단백질을 코딩하는 재조합 폴리핵산은 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 단백질을 코딩하는 재조합 폴리핵산은 DNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리핵산은 세포외 TROP2 결합 도메인, 임의적인 막횡단 도메인 및 하나 이상의 세포내 도메인을 포함하는 키메라 융합 수용체 단백질(CFP)인 TROP2 결합제 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 세포내 도메인은 하나 이상의 세포 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 본 명세서에 기술된 바와 같이, PI3 키나제 모집 도메인, CD40 세포내 도메인, FcR 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리핵산은 세포에 포함된다. 일부 실시양태에서, TROP2 결합제 CFP를 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 mRNA는 골수 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 TROP2 결합제 단백질을 발현하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 피험체에서 질환을 치료하기 위한 치료제로서, 여기서, 질환은 TROP2 단백질의 과다발현과 연관되고, 치료제는 적어도 본원에 기술된 바와 같은 TROP2 결합제를 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 것인 치료제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 피험체에서 질환을 치료하기 위한 치료제로서, 여기서, 질환은 TROP2 단백질의 과다발현과 연관되고, 치료제는 본원에 기술된 바와 같은 TROP2 결합제를 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 것인 치료제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 질환은 췌장암, 폐문 담관암종, 자궁경부암, 위암, 폐암을 포함하나, 이에 제한되지 않는 암이다. 일부 실시양태에서, 질환은 비소세포 폐 암종이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 치료제는 적어도 골수 세포의 막 상에서 적절하게 발현되고, 국재화되도록 하기 위해 골수 세포에서 내인성 단백질에 결합할 수 있는, TROP2에 결합할 수 있는 세포외 결합 도메인, 임의로, CD8 힌지 도메인, 및 막횡단 도메인을 갖는 재조합 키메라 융합 단백질(CFP) 또는 재조합 CFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, TROP2 결합제는 골수 세포의 또 다른 막횡단 단백질과 이량체화 또는 올리고머화하는 막횡단 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, TROP2 결합제는 골수 세포 막 상의 Fc 감마 수용체와 이량체화하여 골수 세포에서만 발현할 수 있는 막횡단 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, TROP2 결합제는 단백질이 골수 세포에서만 발현되는 내인성 단백질과 이량체화(또는 올리고머화)되는 경우에만 기능적이도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, TROP2 결합제는 Fc알파 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, TROP2 결합제는 CD64(FcγR1) 단백질 막횡단 도메인, CD89(FcαR1) 단백질 막횡단 도메인, CD16a(FcγRIIIA) 막횡단 도메인으로부터 선택되는 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, TROP2 결합제는 Fc-엡실론 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 세포외 TROP2 결합 도메인, 임의로 짧은 힌지 영역, 예컨대, CD8 힌지 도메인을 포함하는 것, CD89 막횡단 도메인, 임의로, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인, 예컨대, CD40 세포내 도메인 및 PI3 키나제 모집 도메인에 융합된 CD89 세포내 영역을 포함하는 TROP2 결합 CFP(TROP2 결합제)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 세포외 TROP2 결합 도메인, 임의로 짧은 힌지 영역, 예컨대, CD8 힌지 도메인을 포함하는 것, CD64 막횡단 도메인, 임의로, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인, 예컨대, CD40 세포내 도메인 및 PI3 키나제 모집 도메인에 융합된 CD64 세포내 영역을 포함하는 TROP2 결합 CFP(TROP2 결합제)를 제공한다. TROP2 CFP는 하나 이상의 인간 또는 인간화 도메인을 포함할 수 있다. 본원에서는 CD89 막횡단 도메인에 작동가능하게 연결된 CD8 힌지 도메인에 융합된 항TROP2 ScFv(TROP2 항원 결합제), 및 세포내 도메인을 포함하는 TROP2 CFP 구성물을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, mRNA 또는 DNA를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 TROP2 CFP는 골수 세포 특이적 발현을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 TROP2 CFP는 Fc 감마 의존적 발현을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 TROP2 CFP는 폴리뉴클레오티드가 생체내 투여될 때, T 세포, B 세포, 상피 세포, 근육 세포, 신경 세포 또는 임의의 비골수 세포에서 검출불가능한 발현을 나타낸다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는, 본원에 기술된 바와 같은 CD16, CD89 또는 CD64 막횡단 도메인을 갖는 TROP2 결합제는 폴리뉴클레오티드가 생체내 투여될 때 CD14+ 세포에서 우세하게 발현된다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 CD16, CD89 또는 CD64 막횡단 도메인을 갖는 TROP2 결합제는 폴리뉴클레오티드가 생체내 투여될 때 오직 CD14+ 세포에서만 발현된다.
본원에서는 TROP2 결합 도메인을 갖는 CFP를 발현하는 CD14+ 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 적어도 50% 세포가 TROP2 결합제 CFP를 발현하는 CD14+ 세포인 세포 집단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 적어도 50%가 CD14+ 및 CD16-인 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 CD16-이고, TROP2-CFP(TROP2 결합 세포외 도메인을 갖는 CFP)를 발현하는 CD14+ 세포를 발현하는 세포를 적어도 50% 포함한다.
본원에서는 CD64, 또는 CD89 또는 CD16a 막횡단 도메인을 포함하는 막횡단 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드(폴리핵산)를 포함하는 약학 조성물로서, 여기서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 LNP 내에 캡슐화된 것인 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 폴리펩티드는 암 세포 상의 항원에의 결합에 특이적인 세포외 결합 도메인을 갖는 CFP이다. 일부 실시양태에서 CFP는 TROP2에의 결합에 특이적인 세포외 결합 도메인을 포함한다.
본원에서는 본원에 기술된 바와 같은 TROP2 결합제 CFP를 발현하는 세포, 예컨대, CD14+ 골수 세포를 포함하는, 인간 피험체에서 암을 치료하기 위한 약학 조성물로서, 여기서, 암은 폐암인 것인 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폐암은 NSCLC이다.
본원에서는 생체내 골수 세포에서 발현될 수 있는 TROP2 결합 세포외 도메인을 포함하는 CFP를 코딩하는 재조합 폴리핵산을 포함하는, 인간 피험체에서 암을 치료하기 위한 약학 조성물로서; 여기서, TROP2 결합 세포외 도메인을 포함하는 CFP는 본원에 기술된 바와 같은 CD64, CD16a 또는 CD89 막횡단 도메인을 포함하고, 여기서, 재조합 폴리핵산은 LNP에 캡슐화되고, 여기서, 암은 폐암인 것인, 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폐암은 NSCLC이다.
예시적인 TROP2 결합 도메인 서열은 서열 번호 34의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 34와 적어도 80%의 동일성을 공유하는 서열일 수 있다.
Figure pct00015
일부 실시양태에서, 키메라 융합 단백질(CFP)은 서열 번호 34의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 34와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, TROP2에 결합하도록 표적화된 세포외 도메인(ECD)을 포함한다.
예시적인 TROP2 결합 도메인은 서열 번호 35에 도시된 서열일 수 있다.
Figure pct00016
일부 실시양태에서, 키메라 융합 단백질(CFP)은 서열 번호 35의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 35와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, TROP2에 결합하도록 표적화된 세포외 도메인(ECD)을 포함한다.
TMPRSS3 결합제 단백질 및 도메인
전립선암의 대략 50%는 안드로겐 조절 유전자 막횡단 프로테아제, 세린 2(TMPRSS2)를 적혈구아세포증 바이러스 E26 형질전환 서열(ETS) 패밀리의 전사 인자, 전형적으로, 적혈구아세포 형질전환 특이적 관련 유전자(ERG)와 연결시키는 유전자 융합체를 보유한다. TMPRSS2:ERG 융합체는 전형적으로 종양 발생 초기에 발생하며, 종종 암 벌크 전체에 균일하게 분포된다는 것이 최근에 입증되었다. 최근 연구에서, 84개의 전립선암 중 30%의 림프절에서 불일치하는 ERG 소견이 관찰되었다. TMPRSS2:ERG 융합 단백질은 전립선암 세포에 대한 특이성이 높기 때문에, 신규한 요법을 위한 최적의 표적이 될 수 있다. 한 측면에서, 본원에서는 세포외 TMPRSS 결합 도메인을 갖는 키메라 융합 수용체(CFP) 단백질(TMPRSS 결합제 CFP)을 제공한다.
일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 TMPRSS에 결합할 수 있는 항체의 항원 결합 도메인, 또는 단편 단일 쇄 가변 단편(scFv), 나노바디, VH 도메인, VL 도메인, 단일 도메인 항체(sdAb), VNAR 도메인, 및 VHH 도메인, 이중특이적 항체, 디아바디, 또는 그 중 임의의 것의 기능성 단편이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편(Fab), 단일 쇄 가변 단편(scFv), 나노바디, VH 도메인, VL 도메인, 단일 도메인 항체(sdAb), VNAR 도메인, 및 VHH 도메인, 이중특이적 항체, 디아바디, 또는 그 중 임의의 것의 기능성 단편은 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 CD8로부터 유래된 힌지 도메인을 추가로 포함하고, 여기서, 힌지 도메인은 세포질 측에서 막횡단 도메인에, 및 세포외 측 상의 TMPRSS 결합 도메인에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 15, 16, 17, 18 또는 19의 서열 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD8 알파(CD8a) 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 15에 기재된 서열, 또는 서열 번호 15와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 16에 기재된 서열, 또는 서열 번호 16과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD2 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 17에 기재된 서열, 또는 서열 번호 17과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD28 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 18에 기재된 서열, 또는 서열 번호 18과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD68 막횡단 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 번호 19에 기재된 서열, 또는 서열 번호 19와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP의 ECD는 서열 번호 15, 16, 17, 18 또는 19에 기재된 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 막횡단 도메인, 또는 서열 번호 15, 16, 17, 18 또는 19 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성이 있는 아미노산 서열을 갖는 막횡단 도메인에 융합된, 표 2의 서열에 제시된 아미노산 서열, 또는 표 2의 서열 중의 임의의 것과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포외 힌지 도메인 및 막횡단 도메인은 각각 서열 번호 20 또는 서열 번호 21의, 또는 서열 번호 20 또는 서열 번호 21과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 20의, 또는 서열 번호 20과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 막횡단 도메인에 융합된 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 21의, 또는 서열 번호 21과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 막횡단 도메인에 융합된 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 20 또는 21과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성이 있는 아미노산 서열을 갖는 힌지 및 막횡단 도메인에 융합된, 표 2의 서열 중의 임의의 것과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 ECD 결합제 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, TMPRSS 단백질에 결합할 수 있는 ECD 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 CFP는 임의로, 본원에 기술된 하나 이상의 다른 ICD와 함께, TMD 및 힌지 도메인, 임의로, CD16, CD64 또는 CD89의 짧은 세포질 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 식세포작용 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 Megf10, MerTk, FcRα, 및 Bai1 이외의 다른 수용체로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 Megf10, MerTk, FcR, 및 Bai1 이외의 다른 수용체로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ 이외의 다른 수용체로부터 유래된 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식세포작용 신호전달 도메인은 FcRγ, FcRα 또는 FcRε로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 22, 23, 24 또는 25 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 22, 23, 24 또는 25 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 FcR감마 단백질 (FcRγ 쇄)로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 염증유발성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 PI3 키나제(PI3K) 모집 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 서열 번호 26의, 또는 서열 번호 26과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 CD40의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 신호전달 도메인은 서열 번호 27의, 또는 서열 번호 27과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 28의, 또는 서열 번호 28과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 29의, 또는 서열 번호 29와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CFP는 서열 번호 30의, 또는 서열 번호 30과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
본원에서는 골수 세포와 같은 적합한 세포에서 발현될 수 있는 상기 기술된 바와 같은 TMPRSS 결합 도메인(TMPRSS 결합제)을 포함하는 CFP를 코딩하는 재조합 핵산을 제공한다. 골수 세포는 식세포성 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 TMPRSS 결합 도메인, 서열 번호 21-30으로부터의 서열 중 하나 이상의 것을 포함하는 세포내 도메인; 및 서열 번호 15-21 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 갖는 서열을 포함하는 막횡단 도메인을 포함하는 CFP를 코딩하는 재조합 핵산.
또 다른 실시양태에서, 본원에서는 TMPRSS의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 가용성 단백질과 같은 세포외 단백질과 같은 재조합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, TMPRSS에 결합할 수 있는 도메인, 예컨대, TMPRSS의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 도메인을 갖는 재조합 세포외 단백질은 골수 세포, 예컨대, 식세포성 세포의 표면 단백질에 결합할 수 있는 제2 도메인을 추가로 포함한다. 골수 세포의 표면 단백질은 골수 세포의 막에 발현되는 단백질, 예를 들어, 식세포 수용체, 패턴 인식 분자 또는 스캐빈저 수용체일 수 있다. 본원에서는 본원에 기술된 바와 같은 TMPRSS의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 가용성 단백질과 같은 세포외 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 제공한다.
본원에서는 피험체에서 질환을 치료하기 위한 치료제로서, 여기서, 질환은 TMPRSS 단백질의 과다발현과 연관되고, 치료제는 적어도 TMPRSS에 결합할 수 있는 세포외 결합 도메인을 갖는 재조합 단백질, 예컨대, 상기 기술된 TMPRSS 결합제 단백질 중 임의의 것을 포함하는 것인 치료제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 TMPRSS 결합제 단백질을 발현하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 피험체에서 질환을 치료하기 위한 치료제로서, 여기서, 질환은 TMPRSS의 과다발현과 연관되고, 치료제는 적어도 본원에 기술된 바와 같은 TMPRSS 결합제를 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 것인 치료제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 피험체에서 질환을 치료하기 위한 치료제로서, 여기서, 질환은 TMPRSS의 과다발현과 연관되고, 치료제는 본원에 기술된 바와 같은 TMPRSS 결합제를 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 것인 치료제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 질환은 암, 예컨대, 전립선암이다.
BiME 및 TRiME 구조물
본원에서는 상기 기술된 치료제의 결합 도메인 중 어느 하나를 포함하는 이중특이적 인게이저(BiME) 또는 삼중특이적 인게이저(TRiME)로서, 여기서, 결합 도메인은 항체의 결합 도메인, 항체의 기능성 단편, 이들의 가변 도메인, VH 도메인, VL 도메인, VNAR 도메인, VHH 도메인, 단일 쇄 가변 단편(scFv), Fab, 단일 도메인 항체(sdAb), 나노바디, 이중특이적 항체, 디아바디, 또는 기능성 단편 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 BiME 또는 TRiME를 제공한다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인이 결합하는 표적 세포 상의 항원은 세포 상의 암 항원 또는 병원성 항원 또는 자가면역 항원이다. 일부 실시양태에서, 제1 치료제는 길이가 1000개 미만의 아미노산 또는 1000 nm 미만인 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 치료제는 길이가 500개 미만의 아미노산 또는 500 nm 미만인 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 치료제는 길이가 200-1000개의 아미노산 또는 200-1000 nm인 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 치료제의 결합 도메인의 인게이지먼트는 암 세포를 골수 세포에 접촉시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 골수 세포와 특이적으로 상호작용하고, 골수 세포의 식세포작용 활성을 촉진시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 골수 세포와 특이적으로 상호작용하고, 골수 세포의 염증성 신호전달을 촉진시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 골수 세포 또는 부착 분자와 특이적으로 상호작용하고, 골수 세포의 표적 세포에의 부착을 촉진시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 골수 세포와 특이적으로 상호작용하고, 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항식세포 활성을 억제시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 골수 세포와 특이적으로 상호작용하고, 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항염증성 활성을 억제시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 및/또는 제3 결합 도메인은 골수 세포의 식세포 활성을 촉진시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 및/또는 제3 결합 도메인은 골수 세포의 염증성 신호전달을 촉진시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 및/또는 제3 결합 도메인은 골수 세포 또는 부착 분자와 특이적으로 상호작용하고, 골수 세포의 표적 세포에의 부착을 촉진시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 및/또는 제3 결합 도메인은 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항식세포 활성을 억제시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 및/또는 제3 결합 도메인은 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항염증성 활성을 억제시킨다.
일부 실시양태에서, 제3 결합 도메인 또는 추가 치료제는 CD47 길항제, CD47 차단제, 항체, 키메라 CD47 수용체, 시알리다제, 사이토카인, 염증유발성 유전자, 프로카스파제, 또는 항암제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인, 제2 결합 도메인 및 제3 결합 도메인은 별개의 비동일한 표적 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인, 제2 결합 도메인 또는 제3 결합 도메인은 리간드 결합 도메인이다.
일부 실시양태에서, 제1, 제2 또는 제3 결합 도메인은 하나 이상의 링커에 의해 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 링커는 기능성 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 링커는 수용체에 대한 리간드이다. 일부 실시양태에서, 링커는 단핵구 또는 대식세포 수용체에 대한 리간드이다. 일부 실시양태에서, 링커는 수용체를 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 링커는 수용체를 억제시킨다. 일부 실시양태에서, 링커는 M2 대식세포 수용체에 대한 리간드이다. 일부 실시양태에서, 링커는 TLR 수용체, 예컨대, TLR4에 대한 리간드이다. 일부 실시양태에서, 링커는 TLR 수용체를 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 제1, 제2 및/또는 제3 결합 도메인은 결합 도메인에 결합하는 마스크와 회합된다. 일부 실시양태에서, 마스크는 마스크가 각각의 결합 도메인과 회합된 상태로 유지될 때, 결합 도메인의 그의 표적에의 상호작용을 억제시키는 억제제이다. 일부 실시양태에서, 마스크는 펩티드 링커를 통해 결합 도메인과 회합된다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 절단가능한 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단가능한 모이어티는 암 또는 종양 부위에 선택적으로 풍부한 단백질 또는 효소에 의해 절단된다.
치료 조성물
한 측면에서, 본원에서는 골수 세포, 예컨대, CD14+ 세포, CD14+/CD16- 세포, CD14+/CD16+ 세포, CD14-/CD16+ 세포, CD14-/CD16- 세포, 수지상 세포, M0 대식세포, M2 대식세포, M1 대식세포 또는 모자이크 골수 세포/대식세포/수지상 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 적어도 50% CD14+ 세포를 포함하는 치료 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료 조성물은 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 적어도 50% CD14+/CD16- 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만의 수지상 세포를 포함하는 치료 조성물을 제공한다. 본원에 기술된 바와 같은 치료 조성물에 대한 골수 세포는 본원에 기술된 바와 같은 CFP 수용체 단백질 또는 인게이저 단백질을 코딩하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 치료 조성물에 대한 골수 세포는 본원에 기술된 바와 같은 재조합 핵산에 의해 코딩되는 CFP를 발현하거나, 또는 본원에 기술된 바와 같은 재조합 핵산에 의해 코딩되는 인게이저 단백질을 발현한다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 키메라 융합 단백질, 예컨대, 키메라 융합 수용체 단백질(CFP)을 포함하는 치료 조성물로서, CFP는 (a) (i) 본원에 개시된 표적 중 어느 하나에 특이적으로 결합하는 scFv, 및 (ii) CD8로부터 유래된 힌지 도메인, CD28로부터 유래된 힌지 도메인 또는 CD68로부터의 세포외 도메인의 적어도 일부를 포함하는 세포외 도메인; (b) CD8 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인, CD2 막횡단 도메인 또는 CD68 막횡단 도메인; 및 (c) 적어도 2개의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인으로서, 여기서, 적어도 2개의 세포내 신호전달 도메인은 (i) FcRγ 또는 FcRε으로부터 유래된 제1 세포내 신호전달 도메인, 및 (ii) (A) PI3K 모집 도메인을 포함하거나, 또는 (B) CD40으로부터 유래된 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것인 세포내 도메인을 포함하는 것인 치료 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 본원에 개시된 바와 같은 이중특이적 또는 삼중특이적 인게이저를 포함하는 치료 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본원에서는 본원에 기술된 바와 같은 키메라 융합 단백질, 예컨대, 수용체, 또는 인게이저일 수 있는 하나 이상의 재조합 단백질을 코딩하는 하나 이상의 재조합 폴리핵산(들)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리핵산(들)은 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리핵산은 circRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리핵산은 바이러스 벡터에 포함된다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리핵산은 바이러스 벡터를 통해 전달된다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 키메라 융합 단백질, 예컨대, 키메라 융합 수용체 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 치료 조성물로서, CFP는 (a) (i) 본원에 개시된 표적 중 어느 하나에 특이적으로 결합하는 scFv, 및 (ii) CD8로부터 유래된 힌지 도메인, CD28로부터 유래된 힌지 도메인 또는 CD68로부터의 세포외 도메인의 적어도 일부를 포함하는 세포외 도메인; (b) CD8 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인, CD2 막횡단 도메인 또는 CD68 막횡단 도메인; 및 (c) 적어도 2개의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인으로서, 여기서, 적어도 2개의 세포내 신호전달 도메인은 (i) FcRγ 또는 FcRε으로부터 유래된 제1 세포내 신호전달 도메인, 및 (ii) (A) PI3K 모집 도메인을 포함하거나, 또는 (B) CD40으로부터 유래된 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것인 세포내 도메인을 포함하는 것인 치료 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 본원에 개시된 바와 같은 이중특이적 또는 삼중특이적 인게이저를 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 치료 조성물을 제공한다.
공동 투여를 위한 다른 치료 조성물
일부 실시양태에서, 치료 조성물은 CD47 효능제, Rac를 억제시키는 작용제, Cdc42를 억제시키는 작용제, GTPase를 억제시키는 작용제, F-액틴 디셈블리를 촉진시키는 작용제, PFP로의 PI3K 모집을 촉진시키는 작용제, PI3K 활성을 촉진시키는 작용제, 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리스포스페이트의 생산을 촉진시키는 작용제, ARHGAP12 활성을 촉진시키는 작용제, ARHGAP25 활성을 촉진시키는 작용제, SH3BP1 활성을 촉진시키는 작용제, 1차 및/또는 2차 림프구양 기관에서 림프구의 격리를 촉진시키는 작용제, 2차 림프구양 기관에서 나이브 T 세포 및 중추 기억 T 세포의 농도를 증가시키는 작용제 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가 치료제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 골수 세포는 (a) CFP와 이량체화하는 내인성 펩티드 또는 단백질; (b) CFP와 이량체화하는 비내인성 펩티드 또는 단백질; 및/또는 (c) CFP와 상호작용하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 제2 재조합 폴리핵산 서열을 추가로 포함하고; 여기서, 이량체화 또는 상호작용은 CFP를 발현하지 않는 골수 세포에 비해 CFP를 발현하는 골수 세포에 의한 식세포작용을 강화시킨다.
일부 실시양태에서, 골수 세포는 (i) 이펙터 활성, 교차 제시, 호흡 폭발, ROS 생산, iNOS 생산, 염증 매개인자, 세포외 소포체 생산, 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리스포스페이트 생산, 항원을 발현하는 표적 세포와의 트로고사이토시스(trogocytosis), 식세포작용의 CD47 매개 억제에 대한 내성, 식세포작용의 LILRB1 매개 억제에 대한 내성, 또는 이들의 임의의 조합의 증가; 및/또는 (ii) IL-1, IL3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-23, TNFα, 사이토카인의 TNF 패밀리, CCL2, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IL-18, IL-23, IL-27, CSF, MCSF, GMCSF, IL-17, IP-10, RANTES, 인터페론, MHC 클래스 I 단백질, MHC 클래스 II 단백질, CD40, CD48, CD58, CD80, CD86, CD112, CD155, TRAIL/TNF 패밀리 사멸 수용체, TGFβ, B7-DC, B7-H2, LIGHT, HVEM, TL1A, 41BBL, OX40L, GITRL, CD30L, TIM1, TIM4, SLAM, PDL1, MMP(예컨대, MMP2, MMP7 및 MMP9) 또는 이들의 임의의 조합의 발현 증가를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 식세포 또는 테더링 수용체로부터 유래되거나, 또는 세포내 신호전달 도메인은 식세포작용 활성화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 Megf10, MerTk, FcR-알파 또는 Bai1로부터 선택된 식세포 수용체 이외의 수용체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 예컨대, TNFR1, MDA5, CD40, 렉틴, 덱틴 1, CD206, 스캐빈저 수용체 A1(SRA1), MARCO, CD36, CD163, MSR1, SCARA3, COLEC12, SCARA5, SCARB1, SCARB2, CD68, OLR1, SCARF1, SCARF2, CXCL16, STAB1, STAB2, SRCRB4D, SSC5D, CD205, CD207, CD209, RAGE, CD14, CD64, F4/80, CCR2, CX3CR1, CSF1R, Tie2, HuCRIg(L), CD64, CD32a, CD16a, CD89, Fcα 수용체 I, CR1, CD35, CD3ζ, 보체 수용체, CR3, CR4, Tim-1, Tim-4 및 CD169로 이루어진 군으로부터 선택되는 수용체(예컨대, 식세포 수용체)와 같은 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 염증유발성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 PI3K 모집 도메인이 아닌 염증유발성 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 ITAM 도메인 함유 수용체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 재조합 세포내 신호전달 도메인은 식세포로부터 유래된 제1 부분 및 비식세포 수용체로부터 유래된 제2 부분을 포함하고, 여기서, 비식세포 수용체로부터 유래된 제2 부분은 인산화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인산화 부위는 자가인산화 부위에 적합한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인산화되는 아미노산 잔기는 티로신이다. 일부 실시양태에서, 인산화 부위는 Src 패밀리 키나제에 의한 인산화에 적합한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인산화 부위는 인산화시 키나제의 SH2 도메인에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용체 티로신 키나제 도메인은 제1 세포질 부분 이외에 키메라 수용체의 세포질 말단에서 융합된다.
일부 실시양태에서, 인산화 부위는 티로신 인산화 부위이다.
일부 실시양태에서, 제2 세포내 도메인은 면역 수용체 티로신 활성화 모티프 (ITAM)이다. 예시적인 ITAM 모티프는 포유동물 α 및 β 면역글로불린 단백질, TCRγ 수용체, FCRγ 수용체 서브유닛, CD3 쇄 수용체 및 NFAT 활성화 분자에 존재한다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 1개의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 1개 초과의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 2개 이상의 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 3개 이상의 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 4개 이상의 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 5개 이상의 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 6개 이상의 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 7개 이상의 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 8개 이상의 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 9개 이상의 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 10개 이상의 모티프를 포함한다.
본원에서는 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 표적 세포의 항원에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는, PR 융합 단백질(PFP)과 같은 CFP를 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 막횡단 도메인 및 세포외 도메인이 작동적으로 연결되고; 여기서, 세포내 신호전달 도메인은 Megf10, MerTk, FcRα, 또는 Bai1로부터 선택되는 식세포 수용체 이외의 다른 식세포 수용체로부터 유래된 것인 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, CFP가 표적 세포의 항원에 결합할 때 CFP를 발현하는 세포의 살해 활성은 CFP를 발현하지 않는 세포와 비교하여 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 또는 1000% 초과만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, CFP가 세포에서 발현될 때, CFP는 세포의 세포막 내로 기능적으로 도입된다. 일부 실시양태에서, CFP가 표적 세포의 항원에 결합할 때 CFP를 발현하는 세포의 살해 활성은 CFP를 발현하지 않는 세포와 비교하여 적어도 1.1배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 75배, 또는 100배만큼 증가된다.
일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 예컨대, TNFR1, MDA5, CD40, 렉틴, 덱틴 1, CD206, 스캐빈저 수용체 A1(SRA1), MARCO, CD36, CD163, MSR1, SCARA3, COLEC12, SCARA5, SCARB1, SCARB2, CD68, OLR1, SCARF1, SCARF2, CXCL16, STAB1, STAB2, SRCRB4D, SSC5D, CD205, CD207, CD209, RAGE, CD14, CD64, F4/80, CCR2, CX3CR1, CSF1R, Tie2, HuCRIg(L), CD64, CD32a, CD16a, CD89, Fcα 수용체 I, CR1, CD35, CD3ζ, CR3, CR4, Tim-1, Tim-4 및 CD169로 이루어진 군으로부터 선택되는 식세포 수용체와 같은 수용체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 염증유발성 신호전달 도메인을 포함한다.
본원에서는 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 표적 세포의 항원에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는, PR 융합 단백질(PFP)과 같은 CFP를 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 막횡단 도메인 및 세포외 도메인이 작동적으로 연결되고; 여기서, 세포내 신호전달 도메인은 예컨대, TNFR1, MDA5, CD40, 렉틴, 덱틴 1, CD206, 스캐빈저 수용체 A1(SRA1), MARCO, CD36, CD163, MSR1, SCARA3, COLEC12, SCARA5, SCARB1, SCARB2, CD68, OLR1, SCARF1, SCARF2, CXCL16, STAB1, STAB2, SRCRB4D, SSC5D, CD205, CD207, CD209, RAGE, CD14, CD64, F4/80, CCR2, CX3CR1, CSF1R, Tie2, HuCRIg(L), CD64, CD32a, CD16a, CD89, Fcα 수용체 I, CR1, CD35, CD3ζ, CR3, CR4, Tim-1, Tim-4 및 CD169로 이루어진 군으로부터 선택되는 식세포 수용체와 같은 수용체로부터 유래된 것인 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, CFP가 표적 세포의 항원에 결합할 때 CFP를 발현하는 세포의 살해 활성은 CFP를 발현하지 않는 세포와 비교하여 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 또는 1000% 초과만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 Megf10, MerTk, FcRα, 또는 Bai1로부터 선택되는 식세포 수용체 이외의 다른 식세포 수용체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 염증유발성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 PI3K 모집 도메인, 예컨대, CD19로부터 유래된 PI3K 모집 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 PI3K 모집 도메인이 아닌 염증유발성 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 항원을 발현하는 표적 세포의 식세포작용의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 항원을 발현하는 표적 세포의 식세포작용의 적어도 1.1배 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 항원을 발현하는 표적 세포의 식세포작용의 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배 또는 50배 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 사이토카인 생산의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 사이토카인은 IL-1, IL3, IL-6, IL-12, IL-13, IL-23, TNF, CCL2, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IL-18, IL-23, IL-27, CSF, MCSF, GMCSF, IL17, IP-10, RANTES, 인터페론 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 이펙터 활성의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 교차 제시의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 MHC 클래스 II 단백질의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 CD80의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 CD86의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 MHC 클래스 I 단백질의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 TRAIL/TNF 패밀리 사멸 수용체의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 B7-H2의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 LIGHT의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 HVEM의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 CD40의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 TL1A의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 41BBL의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 OX40L의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 GITRL 사멸 수용체의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 CD30L의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 TIM4의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 TIM1 리간드의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 SLAM의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 CD48의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 CD58의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 CD155의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 CD112의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 PDL1의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 B7-DC의 발현의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 호흡 폭발의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 ROS 생산의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 iNOS 생산의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 iNOS 생산의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 세포외 소포체 생산의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 항원을 발현하는 표적 세포와의 트로고사이토시스의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 식세포작용의 CD47 매개 억제에 대한 내성의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 CFP를 발현하지 않는 세포에 비해 식세포작용의 LILRB1 매개 억제에 대한 내성의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFP를 발현하는 세포는 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리스포스페이트 생산의 증가를 나타낸다.
또한 본원에서는 본원에 기술된 조성물, 예컨대, 본원에 기술된 재조합 핵산, 본원에 기술된 벡터, 본원에 기술된 폴리펩티드 또는 본원에 기술된 세포; 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 포함하는 제공한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 추가 치료제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 CD47 효능제, Rac를 억제시키는 작용제, Cdc42를 억제시키는 작용제, GTPase를 억제시키는 작용제, F-액틴 디셈블리를 촉진시키는 작용제, PFP로의 PI3K 모집을 촉진시키는 작용제, PI3K 활성을 촉진시키는 작용제, 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리스포스페이트의 생산을 촉진시키는 작용제, ARHGAP12 활성을 촉진시키는 작용제, ARHGAP25 활성을 촉진시키는 작용제, SH3BP1 활성을 촉진시키는 작용제 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 약학적으로 허용되는 부형제는 무혈청 배지, 지질, 또는 나노입자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 mRNA 또는 circRNA이다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 본 명세서 내의 어디에나 기술된 바와 같은 재조합 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 치료 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료 조성물은 본원 어디에나 기술된 바와 같은 키메라 단백질을 발현하는 재조합 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 CD14+ 세포, CD14+/CD16- 세포, CD14+/CD16+ 세포, CD14-/CD16+ 세포, CD14-/CD16- 세포, 수지상 세포, M0 대식세포, M2 대식세포, M1 대식세포 또는 모자이크 골수 세포/대식세포/수지상 세포이다.
신규한 키메라 수용체 융합 단백질(CFP) 구성물 생성 방법
한 측면에서, 본원에서는 예를 들어, 융합 수용체가 골수 세포에서 발현될 때, 본원에 기술된 명세서의 이펙터 골수 세포로서 작용하도록 골수 세포 기능을 증강시키는 데 유용할 수 있는 신규한 도메인의 확인을 포함하는, 신규한 키메라 수용체 단백질을 생성하는 방법을 제공한다. 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질의 생성은 널리 공지된 분자 클로닝 기법을 사용하여 수행될 수 있으며, 서열은 재조합 핵산의 생성 후에 검증될 수 있다.
CAR을 코딩하는 재조합 핵산 제조 : 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하고, 증폭 및/또는 진핵 세포에서의 발현 시험을 위해 플라스미드 벡터에 도입되는 재조합 핵산 구성물을 제조한다. 재조합 CAR은 당업계에 공지된 분자 클로닝 기법을 사용하여 구성된다. 재조합 CAR 단백질은 세포내 도메인, 막횡단 도메인 및 세포외 도메인을 포함한다. 각 도메인 또는 도메인의 서브섹션은 이종성 공급원 서열로부터 PCR에 의해 생성되고, 벡터에 개별적으로 클로닝함으로써 함께 연결되는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있거나, 또는 증폭을 위한 적절한 프로모터 및 3'-조절 요소와 함께 적합한 플라스미드 또는 벡터의 다중-클로닝 부위에 삽입되는 더 긴 핵산에 라이게이션될 수 있다. 간략하면, 예시적인 CAR은 하나 이상의 신호전달 도메인(예컨대, PI3 키나제 모집 도메인)을 코딩하는 핵산 서열, CD8 힌지 및 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열, 세포외 말단에서 표적 항원 결합 scFv를 코딩하는 서열을 갖는 세포외 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 도입함으로써 제조된다. 특정 구성물은 표적 항원에 결합하는 scFv에 방해가 되지 않도록 디자인된 세포외 말단에 FLAG 펩티드 서열을 포함한다. 상기 성분은 완전 기능성 막횡단 CAR을 코딩하는 서열로 함께 라이게이션된다. 재조합 단백질의 개별 도메인을 코딩하는 핵산 서브유닛은 두 도메인 사이에 개재하는 짧은 가요성 링커 서열을 포함하도록 디자인된다. 구성물은 프로모터와 3' 안정화 구조 단위를 갖는 플라스미드에 결찰된다. 한 변형에서, 구성물은 ORF2p를 코딩하고, CMV 프로모터인 각각의 5'- 및 3'-UTR 서열을 갖는 Alu 레트로트랜스포존 요소 내에 배치된다. 플라스미드는 E. 콜라이(E. coli)에서 증폭되고, 시퀀싱에 의해 검증되거나 (-) 80℃에서 보관된다.
mRNA 제조 : mRNA는 분해된 플라스미드를 주형으로 사용하여 시험관내 전사에 의해 제조되고, 오염물 DNA를 제거하기 위해 정제되고, 폴리아데닐화될 수 있다. RNA 생성물을 정제하고, RNase가 없는 물에 1 mg/ml로 재현탁시키고, 냉동 바이알에 보관한다.
신규한 CFP의 생성을 위한 유용한 CFP ECD, TM, ICD 및 항원 결합 도메인의 확인은 본원에 기술된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 간략하면, 다수의 잠재적인 후보 단백질이 증강된 식세포 특성 및 그 각각의 식세포작용 관련 세포내 신호전달에 대해 스크리닝될 수 있다. 이어서, 유용한 도메인을 새로운 CFP 생성에 사용할 수 있다. 스크린은 두 부분으로 나눌 수 있다: A. 식세포 수용체(PR) 도메인에 대 한 스크리닝; B. 세포외 항원 결합 도메인에 대한 스크리닝.
PR 도메인에 대한 스크리닝 :
한 실시양태에서, 본원에 기술된 일반 방법에 따라 약 5,800개의 원형질막 단백질들을 그의 식세포 잠재능에 대해 스크리닝하였다. J774 대식세포성 세포를 5,800개의 원형질막 단백질의 라이브러리로 일시적으로 형질감염시킬 수 있다. 원형질막의 다양한 잠재적 기능들을 평가하기 위해 고처리량 다중 검정법(6웰 플레이트 검정법 세트부터 최대 로봇 핸들링을 이용하는 384웰 플레이트 검정법까지)를 셋업할 수 있다. 예시적인 검정법은 식세포작용 검정법, 사이토카인 생산 검정법, 인플라마좀 활성화 검정법 및 iNOS 활성화 검정법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 단순화된 방법은 하기 단락들에 기술되어 있다. 각 방법의 변형도 이용될 수 있고, 숙련된 당업자에 의해 이해될 수 있다. 각 방법의 변형도 이용될 수 있고, 숙련된 당업자에 의해 이해될 수 있다. 시험된 예시적인 세포내 신호전달 도메인은 CD40-FcRγ; FcRγ-CD40; NLRP3; FcRγ-SH2-Pro카스파제; FcRγ-Myd88; FcRγ-IFN 수용체; FcR-TNFR1; FcRγ-TNFR2; FcR-AIM2; FcRγ-TRIFN; FcRγ-프로카스파제; TRIFC; RIG1; MDA5; TBK; CD64; CD16A; CD89; FcRε; SIRPβ를 포함하나, 이에 제한되지 않는다(2개의 연속 세포내 도메인은 하이픈으로 연결된 용어로서 표시되어 있고, 예를 들어, FcRγ-Myd88은 신호전달 도메인 1로서 FcRγ 세포내 신호전달 도메인; 및 신호전달 도메인 2로서 Myd88 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 지칭한다). 스크리닝된 세포외 링커 도메인은 CD64, CD16A, CD89, SIRPα, FcRε, CD8 힌지를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 시험된 막횡단 도메인은 CD8, CD64, CD16A, CD89, FcRε, SIRPα, TNFR1 및 CD40을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. MDA5 도메인 또한 스크리닝되었다.
식세포작용 검정법:
직경이 1 nm, 5 nm 또는 10 nm인 항원 연결된 실리카 또는 폴리스테렌 비드를 대식세포의 스크리닝에 사용하였다. 불활성 비드를 지지된 지질 이중층으로 코팅하고, 항원을 지질 이중층에 라이게이션시킬 수 있다. 클로닝된 재조합 원형질막 단백질을 각각 발현하는 J774 대식세포 세포주를 제조한다. 클로닝된 재조합 원형질막 단백질을 각각 발현하는 J774 대식세포성 세포주를 제조할 수 있다. 재조합 원형질막 단백질은 형광 태그도 발현할 수 있다. 세포주를 유지하고, 열 불활성화된 혈청 및 항생제(페니실린/스트렙토마이신)를 함유하는 완전 RPMI 배지에서 증식시킬 수 있다. 검정 당일, 세포를 웰당 1x10^6개 세포/ml의 밀도로 6웰 플레이트에 플레이팅하거나, 각각의 비율로 12웰 또는 24웰 플레이트에 플레이팅하고, 2-6시간 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 이어서, 세포를 포스페이트 완충제 염수 중에서 1회 세척하고, 비드를 혈청 고갈된 또는 보체 고갈된 영양분 배지에 첨가할 수 있다. 비드를 첨가한 지 30분 및 2시간 후 광학 현미경법으로 세포를 가시화할 수 있다. 태그부착된 항체를 사용하여 면역형광 반응을 수행할 수 있고, 형광 공초점 현미경법을 이용하여 포식시 세포 단백질들의 상호작용 및 공동 국재화를 검출한다. 던(Dunn)의 다중 비교 보정을 이용한 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정으로 신뢰 수준을 측정할 있다.
일부 예에서, 염료 로딩된 종양 세포를 대식세포 세포주에게 공급하고, 식세포작용을 현미경법으로 평가한다
사이토카인 생산:
대식세포성 세포주를 상기 기술된 바와 같이 배양할 수 있다. 한 검정법에서, 원형질막 단백질을 발현하는 각각의 J774 세포주를 다중 웰에 플레이팅하고, 항원 연결된 비드로 챌린징하고, 4시간 및 24시간에서 상청액을 수집함으로써 사이토카인 생산을 검정하였다. 또 다른 분획에서, 세포를 비드와 함께 인큐베이션시킨 후 4시간 및 24시간째 수집될 수 있고, 사이토카인을 검출하기 위해 유세포 분석법을 수행한다. 각 경우에서, 각각의 경우, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-12, IL-23, TNF-α, GMCSF, CXCL1, CXCL3, CXCL9, CXCL-10, MIP1-α 및 MIP-2로부터 선택될 수 있는 다수의 사이토카인들을 다중 포맷으로 검정할 수 있다. 대식세포 염증성 사이토카인 키트(R&D Systems)도 사용된다.
염증성 유전자 및 사이토카인 활성화를 위한 세포내 신호전달 경로를 MAP 키나제인 JNK의 인산화, Akt 신호전달 경로, STAT-1의 인산화 및 활성화를 포함하는 인터페론 활성화 경로에 대한 웨스턴 블롯 분석으로 확인할 수 있다.
기능 검정법
인플라마좀 활성화 검정법 :
증가된 IL-1 생산의 ELISA 검출, 및 더 짧은 카스파제를 생산하기 위한 프로카스파제의 절단을 검출하는, 웨스턴 블롯에 의한 카스파제-1 활성화 검출로 NLRP3 인플라마좀의 활성화를 검정한다. 마이크로웰 플레이트 다중 세팅에서, 카스파제-1 활성화를 더 빨리 판독하기 위해 카스파제-Glo((Promega Corporation)를 사용한다.
iNOS 활성화 검정법:
형광측정 검정법인 NOS 활성 검정법 키트(AbCAM)를 사용하여 iNOS 활성화 및 NO 생산으로 산화 폭발 잠재능의 활성화를 측정한다.
암 세포 살해 검정법:
Raji B 세포를 암 항원 제시 세포로서 사용할 수 있다. Raji 세포를 암 세포의 전체 세포 미정제 추출물과 함께 인큐베이션시키고, J774 대식세포성 세포주와 함께 공동 인큐베이션시킬 수 있다. 대식세포는 감염 1시간 후 세포를 파괴시킬 수 있고, 이는 현미경법에 의해 검출될 수 있거나, 또는 세포 사멸 검정법에 의해 검출될 수 있다.
고친화성 항원 결합 도메인에 대한 스크리닝 :
CFP를 위한 세포외 결합 도메인을 생성하기 위해 암 리간드를 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인에 대해 스크리닝할 수 있다. 인간 전장 항체 또는 scFv 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 라마에서 신규한 면역글로불린 결합 도메인을 개발하고, 단일 도메인 항체를 제조하기 위해 잠재적 리간드를 라마 면역화에도 사용할 수 있다.
이어서, 스크린으로부터 확인된 특정 유용한 도메인을 역전사하고, 렌티바이러스 발현 벡터 내로 클로닝하여 CFP 구성물을 생성할 수 있다. 스크린으로부터 생성된 고도의 식세포 수용체들의 세포외, TM 및 세포질 영역으로부터의 하나 이상의 도메인을 사용하여 CFP를 코딩하는 재조합 핵산을 생성할 수 있다. 간략하면, 염증유발성 사이토카인 생산 및 인플라마좀 활성화의 고도의 활성인자를 보이는 원형질막 수용체를 확인할 수 있다. 세포외 활성화 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어, 특정 키나제 활성화 부위, SH2 모집 부위를 비롯한 기능성 도메인을 확인하기 위해 생체정보학 연구를 수행할 수 있다. 이어서, 이 스크리닝된 기능성 도메인을 모듈식 구성으로 클로닝하여 신규한 CFP를 생성할 수 있다. 이들은 후보 CFP이고, 시험관내 및/또는 생체내에서 식세포 증강, 사이토카인 및 케모카인의 생산, 및/또는 종양 세포 살해에 대해 이 키메라 구성물을 각각 시험한다. 마이크로입자 기반 식세포작용 검정법을 이용하여 식세포작용의 변화를 조사하였다. 간략하면, 스트렙타비딘에 커플링된 형광 폴리스티렌 마이크로입자(직경 6 ㎛)를 비오티닐화된, 재조합적으로 발현되고, 정제된 암 리간드와 접합시킬 수 있다. 신규한 CFP를 발현하는 골수 세포를 1-4 h 동안 리간드 코팅된 마이크로입자와 함께 인큐베이션시키고, 유세포 분석법을 이용하여 식세포작용의 양을 분석하고 정량화하였다. 이어서, 디자이너 CFP의 플라스미드 또는 렌티바이러스 구성을 제조하고, 대식세포성 세포에서 암 세포 용해에 대해 시험할 수 있다.
세포 표적화된 CFP에 대한 구체적인 디자인
생체내 전달을 위한 키메라 항원 수용체를 코딩하는 재조합 핵산을 개발하는 한 측면은 단핵구 세포에서 CFP의 대식세포 특이적 흡수, 발현 및 기능을 제공하고, 식세포 능력이 없는 비골수 세포에서의 발현을 피하는 것이다. 따라서, 한 측면에서, CFP는 CFP의 발현이 골수 특이 단백질에 의존하도록 디자인된다. 예를 들어, CFP의 발현을 위해 골수 특이적 프로모터를 적용하는 개념이 본원에서 고려된다. 골수 특이적 프로모터는 CFP를 코딩하는 서열의 상류 위치에 작동가능하게 연결된 위치에서 벡터 또는 다르게는 재조합 핵산에 코딩될 수 있다. 특정 골수 세포 특이적 프로모터가 당업계에 개시되어 있다. 예를 들어, CD68S 프로모터는 골수 특이적 프로모터이다(문헌 [Scharenberg et al., Nat Commun 11, 3327 (2020)]).
한 측면에서, 재조합 핵산은 mRNA이다. 핵산이 mRNA로 전달되든, DNA로 전달되든 관계없이 이용될 수 있는 골수 특이적 발현을 위한 방법이 본원에서 고려된다. 따라서, 한 측면에서, CFP는 자체 발현 및 기능성을 위해 골수성 내인성 단백질의 존재를 활용하도록 디자인된다. 한 측면에서, CFP의 골수 특이적 발현은 CFP가 단핵구 특이적 단백질과 이량체화(또는 다량체화)될 때만 막에서 발현되는 디자인을 통해 달성된다. 일부 실시양태에서, CFP의 골수 특이적 기능성은 CFP가 단핵구 특이적 단백질과 이량체화(또는 다량체화)될 때만 막에서 발현되는 디자인을 통해 달성된다. FcR 알파 수용체는 골수 세포 및/또는 기능에 대한 막 발현을 위해 FcR 감마 수용체와 올리고머화된다. 여러 Fc 수용체(FcR)는 단핵구와 골수 세포에서 내인적으로 발현된다. FcR은 면역 복합체에 의해 가교된 후, 방출된 사이토카인에 의한 면역 반응 또는 식세포작용의 조정과 같은 다양한 역할을 한다. FcR 알파 수용체 FcR감마 수용체는 막횡단 도메인을 통해 올리고머화된다.
일부 실시양태에서, CFP는 내인성 FcR과 올리고머화되는 Fc 수용체로부터의 막횡단 도메인 및/또는 세포내 도메인을 포함한다
FcR 및 그의 세포 발현 패턴은 하기 표 3에 제시되어 있다
Figure pct00017
본원에 개시된 키메라 융합 단백질 수용체를 구성하는 데 사용되는 예시적인 FcR 도메인 서열이 표 4에 제공되어 있다.
Figure pct00018
일부 실시양태에서, CFP는 FcγR1(CD64)로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인으로부터 유래된 막횡단 도메인을 포함하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, CFP는 FcγRIIIA(CD16)로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인으로부터 유래된 막횡단 도메인을 포함하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, CFP는 FcγRIIA(CD32a)로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인으로부터 유래된 막횡단 도메인을 포함하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, CFP는 FcαR1(CD89)로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인으로부터 유도된 막횡단 도메인을 포함하도록 디자인된다. 본원에 기술된 CFP 내의 임의의 도메인은 임의의 다른 인접한 도메인의 기원에 따라 또는 그와 상관없이 적합한 포유동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 비인간 포유동물 막횡단 도메인은 본 개시내용의 범주 내에서 고려된다.
일부 실시양태에서, CFP는 세포외 도메인에 TMD가 유래된 단백질로부터의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18, 19 또는 20개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CFP는 세포내 도메인에 TMD가 유래된 단백질로부터의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18, 19 또는 20개 또는 그 초과의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, CFP는 TMD가 유래된 단백질 FcγR1(CD64), FcγRIIIA(CD16) 또는 FcγRIIA(CD32a)로부터의 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, TMD는 단백질 FcγR1(CD64), FcγRIIIA(CD16) 또는 FcγRIIA(CD32a)의 TMD의 서열과 동일한 서열을 갖는다.
골수 세포 특이적 CFP 구성물은 골수 세포에서 특이적으로 발현되는 내인성 Fc 감마 수용체와 이량체화하는 막횡단 도메인을 포함하도록 디자인되어 이량체화의 결과로서 기능적으로 활성 상태가 된다.
일부 실시양태에서, 골수 세포 특이적 CFP 구성물은 FcαR1(CD89) 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 골수 세포 특이적 CFP 구성물은 인간 FcαR1(CD89) 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 골수 세포 특이적 CFP 구성물은 마우스 FcαR1(CD89) 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 골수 세포 특이적 CFP 구성물은 설치류 FcαR1(CD89) 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 골수 세포 특이적 CFP 구성물은 말 FcαR1(CD89) 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 골수 세포 특이적 CFP 구성물은 돼지 FcαR1(CD89) 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 골수 세포 특이적 CFP 구성물은 양 FcαR1(CD89) 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD89 TMD는 인간 또는 마우스 CD89 TMD와 적어도 80% 상동성이다. 일부 실시양태에서, CD89 TMD는 인간 또는 마우스 CD89 TMD와 적어도 85% 상동성이다. 일부 실시양태에서, CD89 TMD는 인간 또는 마우스 CD89 TMD와 적어도 90% 상동성이다. 일부 실시양태에서, CD89 TMD는 인간 또는 마우스 CD89 TMD와 적어도 95% 상동성이다.
일부 실시양태에서, 골수 세포 특이적 CFP 구성물은 FcγRIII(CD16) 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 골수 세포 특이적 CFP 구성물은 인간 FcγRIII(CD16) 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 골수 세포 특이적 CFP 구성물은 마우스 FcγRIII(CD16) 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 골수 세포 특이적 CFP 구성물은 설치류 FcγRIII(CD16) 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 골수 세포 특이적 CFP 구성물은 말 FcγRIII(CD16) 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 골수 세포 특이적 CFP 구성물은 돼지 FcγRIII(CD16) 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 골수 세포 특이적 CFP 구성물은 양 FcγRIII(CD16) 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD16 TMD는 인간 또는 마우스 CD16 TMD와 적어도 80% 상동성이다. 일부 실시양태에서, CD16TMD는 인간 또는 마우스 CD16 TMD와 적어도 85% 상동성이다. 일부 실시양태에서, CD16 TMD는 인간 또는 마우스 CD16 TMD와 적어도 90% 상동성이다. 일부 실시양태에서, CD16 TMD는 인간 또는 마우스 CD16 TMD와 적어도 95% 상동성이다. 한 실시양태에서, FcγRIII는 FcγRIIIA(CD16a)이다.
임의의 골수 세포 특이적 CFP가 CD89 분자, CD16 분자, CD64 분자 또는 CD32a 분자로부터의 TMD를 사용하여 디자인 또는 생성될 수 있고, 원하는 항원 결합 도메인을 갖는 골수 세포 특이적 CFP는 본 개시내용에 기술된 조성물 및 방법에 기초하여 생성될 수 있다는 것이 본원에서 고려된다. 일부 실시양태에서, CFP는 골수 세포 특이적 발현을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 골수 세포 특이적 발현은 Fc 감마 의존적 발현이고, 즉 CFP 구성물을 포함하는 핵산을 포함하는 세포가 Fc 감마를 내인적으로 발현한다면, CFP는 세포에서 공동 발현할 것이다. 일부 실시양태에서, CFP는 비록 그것이 골수 세포 이외의 세포에서 발현지만, 일시적으로만 발현되며, 검출되지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 골수 세포만이 기능성 CFP를 Fc 감마 의존적 방식으로 발현하고, 즉, CFP는 Fc 감마를 내인적으로 발현하지 않는 세포에서 비기능성이다. 일부 실시양태에서, 골수 세포 특이적 CFP는 암 세포 특이적 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인, 및 1, 2, 3개 이상의 도메인, 예를 들어, 세포내 세포 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역, 예를 들어, PI3 키나제 모집 도메인을 포함한다. 예를 들어, 골수 세포 특이적 CFP는 CD5 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 각각의 CFP는 항CD5 항체 또는 그의 일부, 예를 들어, 항CD5 ScFv를 포함하는 세포외 도메인, 예를 들어, 힌지 도메인을 포함하여 디자인된다. 일부 실시양태에서, 골수 세포 특이적 CFP는 암 세포 특이적 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인, 및 1, 2, 3개 또는 그 초과의 도메인, 예컨대, 세포내 세포 신호전달 도메인, 예를 들어, PI3 키나제 모집 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함한다. 예를 들어, 본원에서는 CD5 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 각각의 CFP는 항CD5 항체 또는 그의 일부, 예컨대, 항CD5 ScFv, 힌지 도메인, 예컨대, CD8 힌지 도메인, 골수 세포에 의해 내인적으로 발현되는 Fc 감마 수용체와 이량체화할 수 있는 막횡단 도메인, 및 1, 2, 3개 또는 그 초과의 도메인, 예컨대, CD40 세포내 신호전달 도메인, 및/또는 PI3 키나제 모집 도메인을 비롯한 세포내 세포 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 골수 세포 특이적 CFP가 디자인된다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 세포외 TROP2 결합 도메인, 임의로, 예컨대, CD8 힌지 도메인을 포함하는 짧은 힌지 영역, CD89 막횡단 도메인, 임의로, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인, 예컨대, CD40 세포내 도메인 및 PI3 키나제 모집 도메인에 융합된 CD89 세포내 영역을 포함하는 TROP2 결합 CFP(TROP2 결합제)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 세포외 TROP2 결합 도메인, 임의로, 예컨대, CD8 힌지 도메인을 포함하는 짧은 힌지 영역, CD16 막횡단 도메인, 임의로, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인, 예컨대, CD40 세포내 도메인 및 PI3 키나제 모집 도메인에 융합된 CD16 세포내 영역을 포함하는 TROP2 결합 CFP(TROP2 결합제)를 제공한다. TROP2 CFP는 하나 이상의 인간 또는 인간화 도메인을 포함할 수 있다. 본원에서는 CD16 또는 CD89 막횡단 도메인에 작동가능하게 연결된, CD8 힌지 도메인에 융합된 항TROP2 ScFv(TROP2 항원 결합제), 및 세포내 도메인을 포함하는 TROP2 CFP 구성물을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, mRNA 또는 DNA를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 TROP2 CFP는 골수 세포 특이적 발현을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 TROP2 CFP는 Fc 감마 의존적 발현을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 TROP2 CFP는 폴리뉴클레오티드가 생체내 투여될 때, T 세포, B 세포, 상피 세포, 근육 세포, 신경 세포 또는 임의의 비골수 세포에서 검출불가능한 발현을 나타낸다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 본원에 기술된 바와 같은 CD16, CD89 또는 CD64 막횡단 도메인을 갖는 TROP2 결합제는 폴리뉴클레오티드가 생체내 투여될 때, CD14+ 세포에서 우세하게 발현된다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 CD16, CD89 또는 CD64 막횡단 도메인을 갖는 TROP2 결합제는 폴리뉴클레오티드가 생체내 투여될 때, 오직 CD14+ 세포에서만 발현된다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 세포외 GPC3 결합 도메인, 임의로, 예컨대, CD8 힌지 도메인을 포함하는 짧은 힌지 영역, CD89 막횡단 도메인, 임의로, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인, 예컨대, CD40 세포내 도메인 및 PI3 키나제 모집 도메인에 융합된 CD89 세포내 영역을 포함하는 GPC3 결합 CFP(GPC3 결합제)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 세포외 GPC3 결합 도메인, 임의로, 예컨대, CD8 힌지 도메인을 포함하는 짧은 힌지 영역, CD16 막횡단 도메인, 임의로, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인, 예컨대, CD40 세포내 도메인 및 PI3 키나제 모집 도메인에 융합된 CD16 세포내 영역을 포함하는 GPC3 결합 CFP(GPC3 결합제)를 제공한다. GPC3 CFP는 하나 이상의 인간 또는 인간화 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, GPC3-CFP는 인터페론 유도 세포내 도메인을 추가로 포함한다.
본원에서는 CD16 또는 CD89 막횡단 도메인에 작동가능하게 연결된, CD8 힌지 도메인에 융합된 항GPC3 ScFv(GPC3 항원 결합제), 및 세포내 도메인을 포함하는 GPC3 CFP 구성물을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, mRNA 또는 DNA를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 GPC3 CFP는 골수 세포 특이적 발현을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 GPC3 CFP는 Fc 감마 의존적 발현을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 GPC3 CFP는 폴리뉴클레오티드가 생체내 투여될 때, T 세포, B 세포, 상피 세포, 근육 세포, 신경 세포 또는 임의의 비골수 세포에서 검출불가능한 발현을 나타낸다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 본원에 기술된 바와 같은 CD16, CD89 또는 CD64 막횡단 도메인을 갖는 GPC3 결합제는 폴리뉴클레오티드가 생체내 투여될 때, CD14+ 세포에서 우세하게 발현된다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 CD16, CD89 또는 CD64 막횡단 도메인을 갖는 GPC3 결합제는 폴리뉴클레오티드가 생체내 투여될 때, 오직 CD14+ 세포에서만 발현된다. 일부 실시양태에서, GPC3-CFP는 인터페론 유도 세포내 도메인을 추가로 포함한다.
본원에서는 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인간 피험체에서 암을 치료하는 데 본원에 기술된 명세서의 GPC3 결합제가 사용된다. 일부 실시양태에서, GPC3 결합제는 간세포 암종(HCC)의 치료에 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 세포외 GP75 결합 도메인, 임의로, 예컨대, CD8 힌지 도메인을 포함하는 짧은 힌지 영역, CD89 막횡단 도메인, 임의로, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인, 예컨대, CD40 세포내 도메인 및 PI3 키나제 모집 도메인에 융합된 CD89 세포내 영역을 포함하는 GP75 결합 CFP(GP75 결합제)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 세포외 GP75 결합 도메인, 임의로, 예컨대, CD8 힌지 도메인을 포함하는 짧은 힌지 영역, CD16 막횡단 도메인, 임의로, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인, 예컨대, CD40 세포내 도메인 및 PI3 키나제 모집 도메인에 융합된 CD16 세포내 영역을 포함하는 GP75 결합 CFP(GP75 결합제)를 제공한다. GP75 CFP는 하나 이상의 인간 또는 인간화 도메인을 포함할 수 있다. 본원에서는 CD16 또는 CD89 막횡단 도메인에 작동가능하게 연결된, CD8 힌지 도메인에 융합된 항GP75 ScFv(GP75 항원 결합제), 및 세포내 도메인을 포함하는 GP75 CFP 구성물을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, mRNA 또는 DNA를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 GP75 CFP는 골수 세포 특이적 발현을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 GP75 CFP는 Fc 감마 의존적 발현을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 GP75 CFP는 폴리뉴클레오티드가 생체내 투여될 때, T 세포, B 세포, 상피 세포, 근육 세포, 신경 세포 또는 임의의 비골수 세포에서 검출불가능한 발현을 나타낸다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 본원에 기술된 바와 같은 CD16, CD89 또는 CD64 막횡단 도메인을 갖는 GP75 결합제는 폴리뉴클레오티드가 생체내 투여될 때, CD14+ 세포에서 우세하게 발현된다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 CD16, CD89 또는 CD64 막횡단 도메인을 갖는 GP75 결합제는 폴리뉴클레오티드가 생체내 투여될 때, 오직 CD14+ 세포에서만 발현된다.
일부 실시양태에서, 본 섹션에 기술된 CFP 구성물 중 어느 하나는 적어도 CD40 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 섹션에 기술된 CFP 구성물 중 어느 하나는 적어도 PI3 키나제 모집 및 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 섹션에 기술된 CFP 구성물 중 어느 하나는 적어도 CD40 세포내 신호전달 도메인 및 PI3 키나제 모집 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 섹션에 기술된 골수 세포 특이적 CFP 구성물은 예컨대, CD40 세포내 신호전달 도메인 및 PI3 키나제 모집 도메인 및 제3 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 적어도 3개의 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 섹션에 기술된 CFP 구성물 중 어느 하나는 수용체 활성화시 NF-카파 B 활성화를 유도하는 적어도 하나의 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 섹션에 기술된 CFP 구성물 중 어느 하나는 수용체 활성화시 인터페론 생산을 자극하는 적어도 하나의 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 섹션에 기술된 CFP 구성물 중 어느 하나는 NF-카파 B 활성화를 유도하는 적어도 하나의 세포내 도메인을 포함하고, 수용체 활성화시 인터페론 생산을 자극하는 적어도 하나의 세포내 도메인을 포함한다.
피험체로부터의 골수 세포 제조 방법
PBMC로부터의 골수 세포 단리:
히스토파크(Histopaque) 1077(Sigma)을 이용한 밀도 원심분리로 정상 공여자 버피 코트로부터 말초 혈액 단핵 세포를 분리할 수 있다. 세척 후, CliniMACS GMP 등급 CD14 마이크로비드 및 LS 분리 자기 칼럼(Miltenyi Biotec)을 이용하여 단핵 세포 분획으로부터 CD14+ 단핵구를 단리시킬 수 있다. 간략하면, 세포를 PEA 완충제(포스페이트 완충처리된 염수[PBS: phosphate-buffered saline] 플러스 25 mmol/L 에틸렌디아민테트라아세트산[EDTA] 및 인간 혈청 알부민[0.5% 최종 부피의 Alburex 20%, Octopharma])에 적절한 농도로 재현탁시키고, 제조사의 설명서에 따라 CliniMACS CD14 비드와 함께 인큐베이션시킨 후, 세척하고, 자기화된 LS 칼럼에 통과시킬 수 있다. 세척 후, 탈자기화된 칼럼으로부터 정제된 단핵구를 용출시키고, 세척하고, 배양을 위해 적절한 배지에 재현탁시킬 수 있다. 백혈구성분채집술로부터의 CD14+ 세포의 단리: 백혈구성분 채집술로 연구 참여에 대한 사전동의를 제공한 간경변 공여자로부터 PBMC를 수집할 수 있다. 멸균 수집으로 옵티아(Optia) 성분채집술 시스템을 이용하여 단핵 세포(MNC)를 위한 말초 혈액의 백혈구성분채집술을 수행한다. 2.5 혈액 부피를 프로세싱하는 MNC용 표준 수집 프로그램을 이용한다. GMP 준수 기능적으로 폐쇄된 시스템((CliniMACS Prodigy system, Miltenyi Biotec)을 이용하여 CD14 세포의 단리를 수행한다. 간략하면, 세포 계수를 위해 백혈구성분채집술 생성물을 샘플링하고, 분리 전 유세포 분석을 위해 분취물을 수득한다. 단핵구(CD14+)의 비율(%) 및 절대 세포수를 측정할 수 있고, 요구되는 경우, 선택을 위해 요구된 기준을 충족시키도록 부피를 조정한다(≤20 x 109 총 백혈구; < 400 x 106 백혈구/mL; ≤3.5 x 109 CD14 세포, 부피 50-300 mL). CliniMACS CD14 마이크로비드(의료 장치 클래스 III), TS510 튜빙 세트 및 LP-14 프로그램을 이용하는 CliniMACS 프로디지(Prodigy)를 이용하여 CD14 세포 단리 및 분리를 수행한다. 프로세스 종료시 선택된 CD14+ 양성 단핵구를 약학 등급 0.5% 인간 알부민(Alburex)을 함유하는 PBS/EDTA 완충제(CliniMACS 완충제, Miltenyi)로 세척한 후, 이어서, 배양을 위해 TexMACS(또는 비교대상) 배지에 재현탁시킨다.
세포 계수 및 순도:
Sysmex XP-300 자동화된 분석기(Sysmex)를 이용하여 총 MNC 및 단리된 단핵구 분획의 세포 계수를 수행할 수 있다다. Sysmex가 단핵구의 수를 일관되게 과소추정하였기 때문에, 절대 세포수를 측정하기 위해 TruCount 튜브(Becton Dickinson)를 이용한 유세포 분석법으로 대식세포 수의 평가를 수행한다. 인간 백혈구에 대한 항체의 패널(CD45-VioBlue, CD15-FITC, CD14-PE, CD16-APC)을 사용하는 유세포 분석법(FACSCanto II, BD Biosciences)을 이용하여 분리의 순도를 평가하고, 호중구 오염(CD45int, CD15pos)의 양을 측정하여 생성물 품질을 평가한다.
세포 배양 - 건강한 공여자 샘플을 사용한 배양의 개발
대식세포 분화를 위한 최적 배양 배지를 조사하고, 세포 생성물을 사용하여 3개의 후보물질을 시험할 수 있다. 추가로, 치료적으로 사용될 골수 세포 및 대식세포의 유도에 대한 단핵구 냉동보존의 효과를 조사한다. 본 개시내용의 임의의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 기능 검정법을 수행하여 골수 세포 및 대식세포의 식세포 능력 및 추가 분극화에 대한 그의 능력, 및 식세포 잠재능을 정량화할 수 있다.
피험체 샘플을 사용한 전체 규모 프로세스 검증
프로디지 단리로부터의 백혈구성분채집술로부터 배양된 단핵구를, GMP 등급 TexMACS(Miltenyi) 및 100 ng/mL M-CSF를 가진 배양 백(MACS GMP 분화 백, Miltenyi)에서 ㎠ 및 mL당 2 x 106개의 단핵구로 배양할 수 있다. 단핵구를 100 ng/mL GMP 준수 재조합 인간 M-CSF(R&D Systems)와 함께 배양할 수 있다. 세포를 7일 동안 37℃에서 5% CO2 하에 습한 대기에서 배양할 수 있다. 배양 배지의 50%를 제거한 후, (최종 농도 100 ng/mL를 회복하기 위해) 200 ng/mL M-CSF로 보충된 새로운 배지를 공급함으로써 배양 동안 50% 부피 배지 재보충을 2회(2 및 4일째) 수행한다.
세포 수거:
정상 공여자 유래 대식세포의 경우, 7일째 세포 해리 완충제(Gibco, Thermo Fisher) 및 파스테트(pastette)를 사용하여 웰로부터 세포를 제거할 수 있다. 세포를 PEA 완충제 중에 재현탁시키고, 계수한 후, 이어서, 유세포 분석법을 위해 시험당 대략 1x106개의 세포를 염색시킬 수 있다. 혈청으로부터의 약학 등급의 0.5% 인간 알부민(HAS; Alburex)을 함유하는 PBS/EDTA 완충제(CliniMACS 완충제, Miltenyi)를 사용하여 7일째 배양 백으로부터 백혈구성분채집술 유래 대식세포를 제거할 수 있다. 수거된 세포를 2종의 허가된 제품으로 구성된 부형제에 재현탁시킬 수 있다: 0.5% 인간 알부민(Alburex)을 함유하는 주입용 0.9% 염수(Baxter).
유세포 분석 특징규명:
FACSCanto II(BD Biosciences) 또는 MACSQuant 10(Miltenyi) 유세포 분석기를 이용하여 단핵구 및 대식세포 세포 표면 마커 발현을 분석할 수 있다. 각 샘플에 대해 대략 20,000개의 이벤트를 획득할 수 있다. 세포를 특이적 항체(최종 희석률 1:100)와 함께 인큐베이션시킴으로써, 새로 단리되고, 7일째 성숙된 세포에서 백혈구 마커의 세포 표면 발현을 수행한다. 세포를 FcR 블록(Miltenyi)과 함께 5 min 동안 인큐베이션시킨 후, 항체 칵테일과 함께 20 min 동안 4℃에서 인큐베이션시킨다. 세포를 PEA로 세척하고, 죽은 세포 배제 염료 DRAQ7(BioLegend)을 1:100으로 첨가한다. 세포를 하기와 같은 다양한 표면 마커들에 대해 염색할 수 있다: CD45-VioBlue, CD14-PE 또는 CD14-PerCPVio700, CD163-FITC, CD169-PE 및 CD16-APC(모두 Miltenyi), CCR2-BV421, CD206-FITC, CXCR4-PE 및 CD115-APC(모두 BioLegend), 및 25F9-APC 및 CD115-APC(eBioscience). 전방 및 측면 산란, 및 DRAQ7 사멸 세포 식별기(BioLegend)를 이용하여 단핵구 및 대식세포, 둘 모두를 게이팅함으로써 잔해물, 이중항 및 사멸된 세포를 제외시키고, FlowJo 소프트웨어(Tree Star)를 이용하여 분석할 수 있다. 초기 상세한 표현형 분석으로부터, 단핵구로부터의 기능성 대식세포의 발생을 정의하는 방출 기준(CD45-VB/CD206-FITC/CD14-PE/25F9 APC/DRAQ7)으로서 패널을 개발한다. 대식세포는 25F9 및 CD206 둘 모두에 대해 0일째 단핵구에 대한 수준보다 5배 더 높은 평균 형광 강도(MFI: mean fluorescence intensity)를 가진 것으로서 확인될 수 있다. CCR2-BV421/CD163-FITC/CD169-PE/CD14-PerCP-Vio700/CD16-APC/DRAQ7로 구성된, 확장된 패널의 부분으로서 다른 마커를 평가하는 제2 패널이 개발되어 있으나, 세포 생성물에 대한 방출 기준의 부분으로서 사용되지 않는다.
단핵구 및 대식세포를 단리된 말초 혈액 세포의 수크로스 구배 원심분리 샘플에서 형성된 버피 코트 층을 채취하는 것으로부터 단리시킬 수 있다. 산성 엔도솜 내로 흡수될 때에만 형광을 방출하는 pHRodo 비드를 사용하여 식세포 흡수에 대해 CD14 세포를 시험할 수 있다. 간략하면, 단핵구 또는 대식세포를 1 h 동안 1-2 uL의 pHRodo 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 생물입자(LifeTechnologies, Thermo Fisher)와 함께 배양할 수 있고, 이어서, 배지를 버리고, 세포를 세척하여 식세포작용을 통해 포식되지 않은 입자를 제거한다. EVOS 현미경(Thermo Fisher)을 이용하여 식세포작용을 평가하고, 영상을 포착하고 ImageJ 소프트웨어(NIH)를 이용하여 비드의 세포 흡수를 정량화한다. 48 h 동안 7일째 대식세포를 IFNγ(50 ng/mL) 또는 IL-4(20 ng/mL)로 처리하여 M1 또는 M2 표현형(또는 각각 M[IFNγ] 대 M[IL-4])으로의 분극화를 유도함으로써 규정된 분화된 대식세포를 향해 분극화하는 능력을 조사한다. 48 h 후, 세포를 EVOS 명시야 현미경법으로 시각화한 후, 이어서, 상기와 같이 수거하고, 표현형을 분석할 수 있다. 생성 후 염증 자극에 반응하는 대식세포의 사이토카인 및 성장 인자 분비 프로파일에 대한 추가 분석을 수행한다. 상기와 같이 건강한 공여자 버피 코트로부터 대식세포를 생성하고, 비처리 상태로 그대로 방치하거나, 또는 염증이 발생한 간에 존재하는 조건을 모방하기 위해 TNFα(50 ng/mL, Peprotech) 및 폴리이노신산:폴리시티딜산(폴리 I:C, TLR3에 결합하는 바이러스 상동체, 1 g/mL, Sigma)으로, 또는 최대 대식세포 활성화를 생성하기 위해 리포폴리사카라이드(LPS, 100 ng/mL, Sigma) 및 IFNγ(50 IU/mL, Peprotech)로 자극한다. 7일째 대식세포를 밤새도록 인큐베이션시키고, 상청액을 수집하고, 회전시켜 잔해물을 제거한 후, 이어서, 시험까지 -80℃에서 보관할 수 있다. Magpix 다중 효소 연결된 면역검정법 플레이트 판독기(BioRad) 상에서 실행된 27-플렉스 인간 사이토카인 키트 및 9-플렉스 매트릭스 메탈로프로테아제 키트를 사용하여 세크레톰(secretome) 분석을 수행한다.
생성물 안정성:
PBS/EDTA 완충제; 0.5% HAS(Alburex)를 포함하는 PBS/EDTA 완충제, 0.9% 염수 단독 또는 0.5% HAS를 포함하는 염수를 비롯한 다양한 부형제를 프로세스 개발 동안 시험할 수 있다. 0.5% HAS 부형제를 포함하는 0.9% 염수(Baxter)는 최적 세포 생존능 및 표현형을 유지하는 것으로 발견된다(데이터는 제시되지 않음). 수확 후, 간경변 공여자로부터의 대식세포의 안정성을 3회의 프로세스 최적화 실행에서 조사하고, 더 제한된 시점 범위를 프로세스 검증 실행에서 평가한다(n = 3). 수확 및 부형제(주입용 0.9% 염수, 0.5% 인간 혈청 알부민)에의 재현탁 후, 백을 주변 온도(21℃ 내지 22℃)에서 보관하고, 수확 후 0, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 30 및 48 h째에 샘플을 채취할 수 있다. 방출 기준 항체 패널을 각각의 샘플에 대해 실행하고, 생존능 및 0일째로부터의 평균 변화 배수를 25F9 및 CD206의 기하 MFI로부터 측정한다.
통계적 분석:
결과는 평균 ± SD로서 표현될 수 있다. 가능한 경우, GraphPad Prism 6을 이용하여 독립 양측 t-검정으로 차이의 통계적 유의성을 평가한다. 결과는 P 값이 < 0.05일 때, 통계적으로 유의적인 것으로 간주될 수 있다.
본원에서는 또한 본원에 기술된 조성물, 본원에 기술된 벡터 또는 본원에 기술된 폴리펩티드를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 식세포성 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 줄기 세포 유래 세포, 골수 세포, 대식세포, 수지상 세포, 림프구, 비만 세포, 단핵구, 호중구, 미세아교세포, 또는 성상세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 자가 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 동종이계 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 M1 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 M2 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 M1 대식세포성 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 M2 대식세포성 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 M1 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 M2 골수 세포이다.
본원에서는 또한 질환 치료를 필요로 하는 피험체에게 본원에 기술된 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 질환 치료를 필요로 하는 피험체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 질환은 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형암이다. 일부 실시양태에서, 고형암은 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 적합한 암은 난소암, 신장암, 유방암, 전립선암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 폐암을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 액체 암이다. 일부 실시양태에서, 액체 암은 백혈병 또는 림프종이다. 일부 실시양태에서, 액체 암은 T 세포 림프종이다. 일부 실시양태에서, 질환은 T 세포 악성종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 NSCLC이다. 일부 실시양태에서, 암은 HCC이다.
일부 실시양태에서, 방법은 피험체에게 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 CD47 효능제, Rac를 억제시키는 작용제, Cdc42를 억제시키는 작용제, GTPase를 억제시키는 작용제, F-액틴 디셈블리를 촉진시키는 작용제, PFP로의 PI3K 모집을 촉진시키는 작용제, PI3K 활성을 촉진시키는 작용제, 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리스포스페이트의 생산을 촉진시키는 작용제, ARHGAP12 활성을 촉진시키는 작용제, ARHGAP25 활성을 촉진시키는 작용제, SH3BP1 활성을 촉진시키는 작용제 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 투여는 주입 또는 주사를 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여는 고형암에 직접적으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여는 circRNA 기반 전달 절차, 비입자 캡슐화된 mRNA 기반 전달 절차, mRNA 기반 전달 절차, 바이러스 기반 전달 절차, 입자 기반 전달 절차, 리포솜 기반 전달 절차 또는 엑소솜 기반 전달 절차를 포함한다. 일부 실시양태에서, 피험체에서 CD4+ T 세포 반응 또는 CD8+ T 세포 반응이 유발된다.
본원에서는 또한 세포를 본원에 기술된 조성물, 본원에 기술된 벡터 또는 본원에 기술된 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포를 제조하는 방법도 제공한다. 일부 실시양태에서, 접촉은 형질도입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 접촉은 화학적 형질감염, 전기천공, 뉴클레오펙션, 또는 바이러스 감염 또는 형질도입을 포함한다.
본원에서는 상기 기술된 조성물 중 어느 하나를 포함하는 치료제를 투여하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 비경구 투여 경로를 통해 투여된다.
일부 실시양태에서, 치료제는 근육내 투여 경로를 통해 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 정맥내 투여 경로를 통해 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 피하 투여 경로를 통해 투여된다.
본원에서는 또한 본원에 기술된 수성 조성물 중 본원에 기술된 하나 이상의 재조합 핵산 및 지질을 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기술된 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질은 지질 나노입자를 형성하는 것을 포함한다.
재조합 핵산의 시험관내 및 생체내 전달
한 측면에서, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 재조합 핵산은 생체내 전달을 위한 치료 조성물에 적합한 지질 나노입자에 캡슐화된다. 재조합 핵산은 DNA, circRNA 또는 mRNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, 네이키드 DNA 또는 메신저 RNA(mRNA: messenger RNA)는 세포 내부에 핵산을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 융합 단백질을 코딩하는 DNA 또는 mRNA는 지질 나노입자(LNP: lipid nanoparticle) 캡슐화에 의해 식세포성 세포 내로 도입된다. mRNA는 코돈 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA는 5'-메틸시토신 또는 슈도우리딘과 같은 하나 이상의 변형된 또는 비천연 염기를 포함할 수 있다. mRNA는 50-10,000 염기 길이일 수 있다. 한 측면에서 트랜스진은 mRNA로서 전달된다. mRNA는 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000개 초과의 염기 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA는 10,000개 초과의 염기 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA는 약 11,000개의 염기 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA는 약 12,000개의 염기 길이일 수 있다.
일부 실시양태에서, 피험체에서 국소적으로 또는 전신적으로 전달되는 약학 조성물은 하나 이상의 지질 성분과 회합된, 본원에 기술된 키메라 융합 단백질을 코딩하는 메신저 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 지질 성분은 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 지질 성분은 비양이온성 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 지질 성분은 극성 지질 및/또는 비극성 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 지질 성분은 중성 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 지질 성분은 접합된 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 지질 성분은 mRNA 주위의 리포솜을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 지질 성분은 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 포함할 수 있다.
LNP 캡슐화된 DNA 또는 RNA는 단핵구 또는 대식세포와 같은 골수 세포를 형질감염시키기 위해 사용될 수 있거나, 피험체에게 투여될 수 있다. LNP는 피험체에게 국소적으로 또는 전신적으로 전달될 때 골수 세포에 의한 흡수를 위한 표적 전달을 위해 디자인될 수 있다. 일부 실시양태에서, LNP는 골수 세포의 표면 요소에 결합하고, 골수 세포에 의한 mRNA 캡슐화 LNP의 흡수를 촉진시키는 항체 또는 리간드, 또는 생체분자 또는 그의 일부와 같은 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, LNP는 LNP와 회합되거나, 그 내로 도입될 수 있는 하나 이상의 항체, 리간드, 결합제, 압타머에 의해 조직을 표적화할 수 있다
한 실시양태에서, LNP는 하나 이상의 중합체를 포함한다.
한 실시양태에서s, LNP는 합성 중합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, LNP는 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, LNP는 비양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, LNP는 중성 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, LNP는 하나 이상의 PEG화된 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, LNP는 직경이 약 100 nm 내지 약 200 nm이다. 일부 실시양태에서, LNP는 직경이 약 150 nm, 예컨대, 80-120 nm, 100-140 nm, 100-130 nm, 70-140 nm, 80-150 nm, 또는 90-180 nm이다. 일부 실시양태에서, LNP는 직경이 100 nm 미만, 예컨대, 90 nm 미만, 또는 80 nm 미만이다.
일부 실시양태에서, 전달 비히클은 상기 기술된 바와 같은 지질 비히클 중 어느 하나, 예컨대, 리포솜 또는 LNP를 캡슐화하는 재조합 핵산과 자유롭게 회합된 지질 성분이고, 여기서, mRNA는 본 명세서 내의 어디에나 기술된 바와 같이, 골수 세포에서 우선적으로 발현되도록 디자인된다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 전달 비히클을 갖는 mRNA는 단핵구 포함하는 세포 집단 중 골수 세포, 예컨대, 단핵구에서 CFP를 코딩하는 mRNA의 시험관내 전달을 위한 조성물을 제제화하는 데 사용되며, 여기서, CFP를 코딩하는 mRNA를 포함하는 골수 세포는 포유동물 피험체, 예컨대, 인간 피험체로의 전달을 위한 약학 조성물로 제제화된다. 일부 실시양태에서, mRNA는 본 명세서에 기술된 바와 같이 TROP2에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 CFP를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 명세서 어디에나 기술된 전달 비히클을 갖는 mRNA는 포유동물 피험체, 예컨대, 인간 피험체로의 전달을 위한 약학 조성물을 제제화하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, mRNA는 명세서에 기술된 바와 같이 TROP2에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 CFP를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TROP2 결합 CFP 및 전달 비히클을 코딩하는 서열을 포함하는 mRNA는 이종성 세포 집단에서 골수 세포에 의해 특이적으로 흡수된다. 일부 실시양태에서, TROP2 결합 CFP를 코딩하는 서열을 포함하는 mRNA는 이종성 세포 집단에서 골수 및 비골수 세포에 의해 특이적으로 흡수되지만, 이종성 세포 집단 내의 골수 세포에서만 발현되고/거나, 기능적이다.
일부 실시양태에서, 상기 기술된 mRNA는 세포 내로 전기천공된다. 일부 실시양태에서, mRNA를 포함하는 조성물은 시험관내에서 세포 내로 전기천공된다. 일부 실시양태에서, mRNA는 예를 들어, LNP에서 상기 기술된 바와 같은 하나 이상의 지질 성분과 회합된다. 일부 실시양태에서, (예를 들어, 하나 이상의 지질 성분을 포함하는) mRNA를 포함하는 조성물은 골수 세포로의 전달을 위해 디자인되고, 최적화된 시험관내에서 이종성 세포 집단 내 골수 세포로 전기천공된다.
기능적 증강을 위한 CFP 디자인 변형
한 측면에서, 본원에서는 (A) 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열; (B) 키메라 항원 수용체 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 제2 핵산 서열로서, 여기서, CFP는 (a) CFP의 활성화시 인산화되는 하나 이상의 티로신 잔기를 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 서브유닛; (b) 막횡단 도메인, (c) 표적 세포의 표면 상의 성분에 대해 결합 특이성을 갖는 세포외 결합 도메인으로서, 여기서, 세포외 결합 도메인은 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결된 것인 세포외 결합 도메인; 및 (d) 프로테아제 절단 서열에 의해 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결된 전사 활성인자 도메인으로서, 여기서, 전사 활성인자 도메인은 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열의 전사를 촉진시키는 것인 전사 활성인자 도메인을 포함하는 것인 제2 핵산 서열; 및 (C) (i) 전사 활성인자 도메인을 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결하는 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제; (ii) CFP 활성화시 인산화되는 티로신 잔기에 결합하는 도메인을 코딩하는 제3 핵산 서열로서; 여기서, 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제, 및 티로신 잔기에 결합하는 도메인이 작동가능하게 연결된 것인 제3 핵산 서열을 포함하는, 하나 이상의 재조합 핵산 서열을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제3 핵산 서열은 (iii) 자극 반응 요소를 추가로 코딩한다. 일부 실시양태에서, 자극 반응 요소(iii)는 인산화된 티로신 잔기에 결합하는 도메인에 융합된다. 일부 실시양태에서, 자극 반응 요소(iii)는 핵산 서열을 발현하는 세포의 미세환경에 반응성이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재조합 핵산은 골수 세포에서 발현된다.
일부 실시양태에서, 자극 반응 요소(iii)는 인산화된 티로신 잔기에 결합하는 도메인에 융합된다. 일부 실시양태에서, 자극 반응 요소는 핵산 서열을 발현하는 세포의 미세환경에 반응성이다. 일부 실시양태에서, (iii)은 (ii)와 작동가능하게 연결된 데그론이다. 일부 실시양태에서, 데그론은 HIF-1a 데그론이다.
일부 실시양태에서, 전사 활성인자 도메인은 VP64 전사활성화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전사 활성인자 도메인을 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결하는 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제는 C형 간염 바이러스(HCV) NS3 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, CFP 활성화시 인산화되는 티로신 잔기에 결합하는 도메인은 포스포티로신 결합(PTB) 도메인이다. 일부 실시양태에서, PTB는 Shc PTB이다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 DNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 RNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 circRNA이다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 레플리콘 RNA와 회합된다. 본원에서는 본원에서는 골수 세포에서 (A) 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열; (B) 골수 세포 키메라 항원 수용체(CFP)를 코딩하는 제2 핵산 서열로서, 여기서, CFP는 (a) CFP의 활성화시 인산화되는 티로신 잔기를 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 서브유닛; (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 표적 세포의 표면 상의 성분에 대해 결합 특이성을 갖는 세포외 결합 도메인으로서, 여기서, 세포외 결합 도메인은 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결된 것인 세포외 결합 도메인; 및 (d) 프로테아제 절단 서열에 의해 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결된 전사 활성인자 도메인으로서, 여기서, 전사 활성인자 도메인은 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열의 전사를 촉진시키는 것인 전사 활성인자 도메인을 포함하는 것인 제2 핵산 서열; 및 (C) (i) 전사 활성인자 도메인을 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결하는 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제; (ii) CFP 활성화시 인산화되는 티로신 잔기에 결합하는 도메인을 코딩하는 제3 핵산 서열로서; 여기서, 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제, 및 티로신 잔기에 결합하는 도메인이 작동가능하게 연결된 것인 제3 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산을 발현하는 단계를 포함하는, 암에 대한 골수 세포 치료제를 제조하는 방법을 제공한다.
본원에서는 골수 세포에서 (a) 인간 호산구 주요 염기성 단백질 산성 도메인; (b) MMP 인식 서열; 및 (c) 인간 호산구 주요 염기성 단백질 세포독성 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 발현하는 단계를 포함하는, 암에 대한 골수 세포 치료제를 제조하는 방법을 제공한다.
본원에서는 암 치료를 필요로 하는 암을 앓는 피험체에게 상기 기술된 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 피험체를 치료하는 방법을 제공한다. 본원에서는 암 치료를 필요로 하는 암을 앓는 피험체에게 본원에 기술된 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 피험체를 치료하는 방법을 제공한다. 본원에서는 종양 퇴행 유도를 필요로 하는 피험체에게 골수 세포를 포함하는 약학 조성물을 정맥내로 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 골수 세포는 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산을 발현하고, 여기서, 하나 이상의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 종양 미세환경에서 기능적으로 활성이고, 비종양 환경에서는 기능적으로 활성이 아닌 것인, 종양 퇴행 유도를 필요로 하는 피험체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법을 제공한다.
모듈식 감지 및 내부 프로그래밍 가능한 스위치가 있는 키메라 항원 수용체
면역치료제를 디자인함에 있어 중요한 목적은 (1) 치료제가 질환 부위에서 활성이고, 이환된 세포에 특이적으로 작용할 것이라는 것을 포함하는 질환 특이성; (2) 치료체가 원하는 시간 및 위치에서 그의 원하는 기능을 실행하도록 프로그램되거나, 또는 의도될 수 있는 것을 포함하는 프로그램 가능성을 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 질환 미세환경을 감지 및 이용하고, 이를 질환에 대항하는 결과적으로 나타나는 기능을 생성하도록 전환할 수 있는 키메라 항원 수용체의 개발을 포함한다. 한 실시양태에서, 이는 스위치 기능으로 지칭된다. 원칙적으로, 본원에 개시된 관심 재조합 단백질은 스위치를 수행하기 위해 종양 미세환경(TME)과 같은 질환 시스템 내에서 신호 전달을 이용한다. 예를 들어, TME는 키메라 단백질의 성분을 활성화시키고, 그 기능을 가능하게 하는 펩티드를 절단하는 트리거로 사용되는 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)가 풍부하다. 이를 통해 면역치료 세포의 기능이 특이적이고, 신체의 모든 세포에 적용되지 않으므로 면역요법과 연관된 독성 가능성이 확실히 감소된다.
골수 세포 치료제를 위한 표적 특이적, 프로그래밍 가능한 키메라 구성물 생성
본원에서는 종양 미세환경에서 유도될 수 있는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 외인성 재조합 핵산을 발현하는, 면역요법을 위한 골수 세포의 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 면역요법을 위한 골수 세포는 적어도 일부가 종양 미세환경(TME)에서 활성화되는 키메라 수용체를 발현하는 재조합 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역요법을 위한 골수 세포는 염증유발 단백질, 또는 프로아폽토시스 단백질 또는 용해 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하며, 그의 발현은 유도성 전사 활성인자의 제어하에 있다. 휴식 상태에서 전사 활성인자는 비핵 단백질에 융합된 상태로 남아 있다. 종양 환경에 도달하면, 융합 단백질로부터의 절단을 통해 염증유발성 단백질, 또는 프로아폽토시스 단백질 또는 용해성 단백질을 코딩하는 핵산 코딩의 핵 국재화 및 전사활성화를 위해 전사 활성인자가 방출된다. 이러한 기능적 결과는 재조합 단백질의 모듈식 디자인 및 골수 세포에서 발현함으로써 달성될 수 있다.
한 실시양태에서, 절단가능한 전사 활성인자는 비내인성 프로테아제에 의해 절단되는 절단가능한 서열을 삽입함으로써 디자인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전사 활성인자는 막횡단 단백질, 예를 들어, 키메라 수용체(CFP)에 융합된다. 일부 실시양태에서, CFP는 수용체 활성화시 활성화되는 하나 이상의 티로신 잔기를 포함하는 하나 이상의 ITAM 도메인을 갖는 ICD를 포함한다. 수용체 활성화는 세포외 결합 도메인을 통해 암 세포와 수용체가 인게이지먼트할 때 발생하는 것으로 이해된다. 일부 실시양태에서, 유도성 전사 활성인자의 예시적인 모듈 디자인은 다음과 같이 달성될 수 있다: 전사 활성인자 도메인은 비내인성 프로테아제 절단 서열에 의해 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결되고; 여기서, 비내인성 프로테아제는 동일한 세포에서 발현되는 재조합 핵산에 의해 코딩된다. 비내인성 프로테아제는 활성화를 위해 CFP의 활성화시 인산화되는 티로신 잔기에 결합하는 또 다른 단백질 도메인에 융합되고 작동 가능하게 연결되도록 디자인될 수 있다. 인산화된 티로신 잔기에 결합하는 도메인은 포스포티로신 결합 도메인(PTB)이다. CFP의 활성화시 ITAM이 인산화되고, PTB 도메인이 차례로 ITAM 도메인에 의해 활성화될 수 있고, 활성화된 PTB 도메인이 차례로 CFP의 세포질 말단으로부터 전사 활성인자 도메인을 절단할 수 있는 프로테아제를 활성화시켜 핵 국재화를 위한 전사 활성인자를 방출할 수 있다.
추가로, 프로테아제-PTB 융합 단백질은 불활성 상태에서 PTB 및 프로테아제의 분해를 개시하는 데그론에 융합될 수 있다. 한 실시양태에서, 데그론은 HIF 1-알파(HIF 1-a) 데그론 서열이며, 이는 정상산소 상태에서 자연적으로 분해된다. 따라서, PTB-프로테아제는 정상 산소 상태, 즉, 순환 중인 세포 또는 정상(비종양) 조직에서 분해될 것이다. 한편, 단백질을 발현하는 세포가 저산소 조직 환경에 있을 때, PTB-프로테아제는 더 이상 분해되지 않고, 활성화된 CFP 세포내 서열에 있는 인산화된 동족 잔기를 발견한다. 더욱이, 데그론-PTB 복합체가 CFP-ICD 중의 세포내 포스포티로신 잔기에 결합할 때, 데그론은 ICD의 일부와 접촉하여 불활성화된다(도 2b 참조). 따라서, 재조합 단백질은 하기와 같이 디자인될 수 있다: 재조합 단백질은 (i) 암 세포 또는 종양 세포의 표면 상의 성분에 결합하고, 결합이 수용체(CFP)를 활성화시키는 세포외 도메인을 포함하는 CFP로서, CFP는 막횡단 및 세포내 도메인(ICD)을 포함하고, ICD는 수용체 활성화시 활성화되고, 인산화되는 ITAM 도메인을 포함하는 것인 CFP; (ii) 재조합 핵산을 코딩하는 동일한 벡터에 의해 임의로 코딩될 수 있고, T2A 자동 절단가능한 서열이 측면에 있는 데그론-PTB-프로테아제를 갖는 프리-단백질을 생성할 수 있는 데그론-PTB-프로테아제 복합체; (iii) 프로테아제의 기질인 절단가능한 서열에 의해 CFP의 세포내 도메인에 작동가능하게 연결된 전사 활성인자를 포함한다. 추가로, 골수 세포는 절단가능한 서열에 의해 CFP의 세포내 도메인에 작동가능하게 연결된 전사 활성인자에 반응하는 프로모터 또는 전사 활성인자의 영향하에 핵산을 공동 발현한다. 암 세포와의 인게이지먼트를 통해 CFP가 활성화되면, ICD의 ITAM이 인산화되고, 활성화된 ITAM 도메인이 PTB의 결합과 활성화를 촉진시키는 동시에, 결합은 데그론을 불활성화하고, 그렇지 않으면 유리 (ITAM의 포스포티로신 잔기에 결합되지 않은, 불활성 상태인 것) 데그론-PTB-프로테아제를 분해한다. 활성화된 PTB는 프로테아제를 활성화하고, 안정화하여(데그론 활성 부재하에), 차례로 핵 국재화를 위해 전사 활성인자를 절단한다.
제1 융합 단백질에 사용될 수 있는 예시적인 프로테아제로는 C형 간염 바이러스 프로테아제(예컨대, NS3 및 NS2-3); 신호 펩티다아제; 서브틸리신/켁신 패밀리의 프로단백질 컨버타제(푸린, PC1, PC2, PC4, PACE4, PCS, PC); 소수성 잔기(예컨대, Leu, Phe, Val 또는 Met)에서 절단하는 프로단백질 컨버타제; Ala 또는 Thr와 같은 작은 아미노산 잔기에서 절단하는 프로단백질 컨버타제; 프로피오멜라노코르틴 전환 효소(PCE: proopiomelanocortin converting enzyme); 크로마핀 과립 아스파르트산 프로테아제(CGAP: chromaffin granule aspartic protease); 프로호르몬 티올 프로테아제; 카르복시펩티다제(예컨대, 카르복시펩티다제 E/H, 카르복시펩티다제 D 및 카르복시펩티다제 Z); 아미노펩티다제(예컨대, 아르기닌 아미노펩티다제, 리신 아미노펩티다제, 아미노펩티다제 B); 프롤릴 엔도펩티다제; 아미노펩티다제 N; 인슐린 분해효소; 칼페인; 고분자량 프로테아제; 및 카스파제 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9를 포함한다. 다른 프로테아제로는 아미노펩티다제 N; 퓨로마이신 감수성 아미노펩티다제; 안지오텐신 전환 효소; 피로글루타밀 펩티다제 II; 디펩티딜 펩티다제 IV; N-아르기닌 이염기 컨버타제; 엔도펩티다제 24.15; 엔도펩티다제 24.16; 아밀로이드 전구체 단백질 세크레타제 알파, 베타 및 감마; 안지오텐신 전환 효소 세크레타제; TGF 알파 세크레타제; TNF 알파 세크레타제; FAS 리간드 세크레타제; TNF 수용체-I 및 -II 세크레타제; CD30 세크레타제; KL1 및 KL2 세크레타제; IL6 수용체 세크레타제; CD43, CD44 세크레타제; CD16-I 및 CD16-II 세크레타제; L-셀렉틴 세크레타제; 폴레이트 수용체 세크레타제; MMP 1, 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15; 유로키나제 플라스미노겐 활성인자; 조직 플라스미노겐 활성인자; 플라스민; 트롬빈; BMP-1(프로콜라겐 C 펩티다제); ADAM 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 및 11; 및 그랜자임 A, B, C, D, E, F, G, 및 H를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 프로테아제는 C형 간염 바이러스(HCV) 비구조 단백질 3 프로테아제 NS3이다. 일부 실시양태에서, NS3 절단가능한 서열은 EDVVCC(서열 번호 36)이다. 일부 실시양태에서, NS3 절단가능한 서열은 DEMEEC(서열 번호 37)이다.
일부 실시양태에서, 전사 활성인자는 DNA 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 GAL4 도메인이다. 일부 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 ZFHD1 또는 tetR의 것이다. 일부 실시양태에서, 전사 활성인자는 VP64 전사활성화 도메인(단순 헤르페스 단백질 VP16의 최소 활성화 도메인(아미노산 437-447)의 사량체 반복부)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 데그론은 HIF-데그론이다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 (A) 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열; (B) 키메라 항원 수용체 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 제2 핵산 서열로서, 여기서, CFP는 (a) CFP의 활성화시 인산화되는 티로신 잔기를 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 서브유닛; (b) 막횡단 도메인, (c) 표적 세포의 표면 상의 성분에 대해 결합 특이성을 갖는 세포외 결합 도메인으로서, 여기서, 세포외 결합 도메인은 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결된 것인 세포외 결합 도메인; 및 (d) 프로테아제 절단 서열에 의해 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결된 전사 활성인자 도메인으로서, 여기서, 전사 활성인자 도메인은 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열의 전사를 촉진시키는 것인 전사 활성인자 도메인을 포함하는 것인 제2 핵산 서열; 및 (C) (i) 전사 활성인자 도메인을 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결하는 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제; (ii) CFP 활성화시 인산화되는 티로신 잔기에 결합하는 도메인을 코딩하는 제3 핵산 서열로서; 여기서, 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제, 및 티로신 잔기에 결합하는 도메인이 작동가능하게 연결된 것인 제3 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 면역요법에서 사용하기 위한, 골수 세포에서 발현될 수 있는 모듈식 폴리펩티드에 대한 재조합 핵산을 제공한다. 재조합 핵산은 (a) 세포독성 폴리펩티드; (b) 프로테아제 절단 서열; 및 (c) 억제성 폴리펩티드 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 코딩하고, 여기서, 억제성 폴리펩티드 도메인은 세포독성 폴리펩티드를 억제시키고; 여기서, 세포독성 폴리펩티드, 프로테아제 절단 서열 및 억제성 폴리펩티드 도메인은 작동가능하게 연결되어 있다. 일부 실시양태에서, 세포독성 폴리펩티드는 인간 호산구 주요 염기성 단백질 세포독성 도메인이다. 일부 실시양태에서, 세포독성 폴리펩티드는 인간 호산구 주요 염기성 단백질 산성 도메인이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 절단 서열은 MMP 인식 서열이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 절단 서열은 MMP에 의해 절단된다.
일부 실시양태에서, 제1 식세포 ICD 중의 하나 이상의 도메인은 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 ICD의 하나 이상의 도메인은 키나제 결합 도메인을 증강시키기 위한 돌연변이, 인산화 부위를 생성하기 위한 돌연변이, SH2 도킹 부위를 생성하기 위한 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함한다.
염증성 유전자의 공동 발현
한 측면에서, 재조합 핵산은 조작된 세포에서 키메라 수용체와 공동 발현되는 염증유발성 유전자에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발성 유전자는 사이토카인이다. 예로는 TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, CSF, GMCSF 또는 IL-12 또는 인터페론을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
염증유발성 유전자를 코딩하는 재조합 핵산은 모노시스트론일 수 있으며, 여기서, (a) CFP 및 (b) 염증유발성 유전자에 대한 2개의 코딩 서열은 독립적인 발현을 위해 전사 후 또는 번역 후 절단된다.
일부 실시양태에서, 2개의 코딩 서열은 예를 들어, P2A 서열을 코딩하는 자가 절단 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 2개의 코딩 영역은 IRES 부위에 의해 분리된다.
일부 실시양태에서, 2개의 코딩 서열은 바이시스트로닉 유전 요소에 의해 코딩된다. (a) CFP 및 (b) 염증유발성 유전자에 대한 코딩 영역은 단방향일 수 있으며, 여기서, 각각은 별개의 조절 제어하에 있다. 일부 실시양태에서, 둘 모두에 대한 코딩 영역은 양방향이고, 반대 방향으로 구동된다. 각 코딩 서열은 별개의 조절 제어하에 있다.
염증유발성 유전자의 공동 발현은 대식세포의 강력한 염증 자극을 부여하고, 염증을 위해 주변 조직을 활성화하도록 디자인된다.
세포내 신호전달 및 염증 활성화를 증강시키기 위한 키메라 항원 수용체
한 측면에서, 재조합 핵산은 세포외 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 일부 경우에, 수용체의 전체 세포내 도메인의 일부 또는 전체 이외에도 키메라 세포내 도메인을 코딩한다. 세포내 도메인은 예컨대, 대식세포가 감염 퇴치에 인게이징할 때와 같이, 강력한 염증유발성 면역 활성화 능력을 갖도록 디자인된다. 키메라 세포내 도메인(또는 경우에 따라 제2 ICD)은 ICD가 세포외 도메인에 작동가능하게 연결되고, 세포외 도메인의 활성화가 융합된 ICD를 활성화시킬 수 있도록 키메라 수용체의 세포질 말단에 융합된다. 상기 ICD는 염증유발성 신호를 유발하는 데 필요한 제2 신호를 제공한다. 한 실시양태에서, 염증유발성 신호는 인플라마좀의 활성화를 위한 신호이다. Nod 유사 수용체(NLR: Nod-like receptor)는 인플라마좀 경로의 성분을 형성하는 수용체의 서브세트이다. 이러한 수용체는 선천 면역 반응에서 활성화되고, 올리고머화되어 염증유발성 카스파제를 모집하고, 그의 절단 및 활성화를 유도하는 플랫폼 역할을 하는 다중 단백질 복합체를 형성한다. 이는 ROS의 직접적인 활성화로 이어지고, 종종 파이롭토시스로 알려진 강력한 세포 사멸을 초래한다. NLRP1m, NLRP3, IPAF 및 AIM2의 4가지 인플라마좀 복합체가 있다.
종양 미세환경(TME)은 면역억제 환경을 구성한다. IL-10, 글루코코르티코이드 호르몬, 아폽토시스 세포 및 면역 복합체의 영향은 선천 면역 세포 기능을 방해할 수 있다. 식세포성 세포를 포함한 면역 세포는 관용원성 표현형으로 정착한다. 대식세포에서, 일반적으로 M2 표현형으로 알려진 이 표현형은 대식세포가 강력하고 병원균을 살해할 수 있는 M1 표현형과 구별된다. 예를 들어, LPS 또는 IFN-감마에 노출된 대식세포는 M1 표현형 쪽으로 분극화할 수 있는 반면, IL-4 또는 IL-13에 노출된 대식세포는 M2 표현형 쪽으로 분극화할 것이다. LPS 또는 IFN-감마는 Trif 및 MyD88 경로를 유도하는 대식세포 표면의 Toll 유사 수용체 4(TLR4)와 상호작용하여 전사 인자 IRF3, AP-1 및 NFKB의 활성화를 유도하여 염증유발성 M1 대식세포 반응에 필요한 TNF 유전자, 인터페론 유전자, CXCL10, NOS2, IL-12 등을 활성화시킬 수 있다. 유사하게, IL-4 및 IL-13은 IL-4R에 결합하여 Jak/Stat6 경로를 활성화하며, 이는 항염증 반응(M2 반응)과 연관된 유전자인 CCL17, ARG1, IRF4, IL-10, SOCS3 등의 발현을 조절한다. CD14, CD80, D206의 발현 및 CD163의 낮은 발현은 M1 표현형에 대한 대식세포 분극화의 지표이다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 염증 반응을 위한 세포질 도메인을 포함하는 하나 이상의 추가적인 세포내 도메인을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 조작된 대식세포에서 염증 반응을 위한 세포질 도메인을 포함하는 키메라 수용체 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산의 발현은 M1 표현형과 유사한 강력한 염증유발성 반응을 부여한다.
일부 실시양태에서, 염증 반응을 위한 세포질 도메인은 TLR3, 4, 9, MYD88, TRIF, RIG-1, MDA5, CD40, IFN 수용체, NLRP-1-14, NOD1, NOD2, 피린, AIM2, NLRC4, CD40의 신호 전달 도메인 또는 영역일 수 있다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산의 발현은 IL-1 신호전달 캐스케이드의 활성화를 위한 염증유발성 세포질 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체의 세포질 부분은 toll 유사 수용체로부터의 세포질 도메인, 예컨대, toll 유사 수용체 3(TLR3), toll 유사 수용체 4(TLR4), toll 유사 수용체 7(TLR7), toll 유사 수용체 8(TLR8), toll 유사 수용체 9(TLR9)의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체의 세포질 부분은 인터류킨-1 수용체 연관 키나제 1(IRAK1)로부터의 적합한 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체의 세포질 부분은 분화 1차 반응 단백질(MYD88)로부터의 적합한 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체의 세포질 부분은 미엘린 및 림프구 단백질(MAL)로부터의 적합한 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체의 세포질 부분은 레티노산 유도성 유전자(RIG-1: retinoic acid inducible gene)로부터의 적합한 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체의 막횡단 도메인은 MYD88, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, TLR9, MAL, IRAK1 단백질 중 어느 하나의 막횡단 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 세포내 신호전달 도메인은 식세포 수용체로부터 유래된 제1 부분 및 비식세포 수용체로부터 유래된 제2 부분을 포함하고, 여기서, 비식세포 수용체로부터 유래된 제2 부분은 인산화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인산화 부위는 자가인산화 부위에 적합한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인산화되는 아미노산 잔기는 티로신이다. 일부 실시양태에서, 인산화 부위는 Src 패밀리 키나제에 의한 인산화에 적합한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인산화 부위는 인산화시 키나제의 SH2 도메인에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용체 티로신 키나제 도메인은 제1 세포질 부분 이외에 키메라 수용체의 세포질 말단에서 융합된다.
일부 실시양태에서, 인산화 부위는 티로신 인산화 부위이다.
일부 실시양태에서, 제2 세포내 도메인은 면역 수용체 티로신 활성화 모티프(ITAM)이다. 예시적인 ITAM 모티프는 포유동물 α 및 β 면역글로불린 단백질, TCRγ 수용체, FCRγ 수용체 서브유닛, CD3 쇄 수용체 및 NFAT 활성화 분자에 존재한다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 1개의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 1개 초과의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 2개 이상의 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 3개 이상의 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 4개 이상의 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 5개 이상의 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 6개 이상의 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 7개 이상의 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 8개 이상의 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 9개 이상의 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포내 도메인은 10개 이상의 모티프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 식세포 ICD 중의 하나 이상의 도메인은 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 ICD의 하나 이상의 도메인은 키나제 결합 도메인을 증강시키기 위한 돌연변이, 인산화 부위를 생성하기 위한 돌연변이, SH2 도킹 부위를 생성하기 위한 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함한다.
"기성품" 치료 조성물로서 골수 세포 특이적 키메라 항원 수용체 코딩 폴리핵산
본원에서는 임의의 시점에서 이를 필요로 하는 피험체에게 사용하기 위해 제조되고, 보관될 수 있는 치료적으로 효과적인 조성물을 최초로 제공한다. 치료적으로 효과적인 조성물은 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 서열을 갖는 핵산 조성물을 포함한다. CFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 (i) 세포외 항원 결합 도메인, 예컨대, ScFv를 코딩하는 서열, (ii) 세포에서 발현시 Fc 감마 수용체 막횡단 도메인과 이량체화할 수 있는 막횡단 도메인을 코딩하는 서열, 및 (iii) 세포내 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료적으로 효과적인 조성물은 상기의 것 이외에도 전달 비히클을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전달 비히클은 지질 나노입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산, 즉, 폴리뉴클레오티드는 mRNA이다.
본원에서는 CFP를 코딩하는 골수 세포 특이적 발현 구성물로서, 여기서, CFP는 (i) 표적 항원에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인을 코딩하는 서열로서, 여기서, 결합 도메인은 표적 특이적 항체 또는 이들의 단편, 예컨대, scFv, 예를 들어, 암 세포 상에서 발현되는 표적 항원에 결합하는 scFv를 포함하는 것인 서열, (ii) 세포에서 발현시 Fc 감마 수용체 막횡단 도메인과 이량체화할 수 있는 막횡단 도메인을 코딩하는 서열, 및 (iii) 구성물을 발현하는 세포에서 식세포작용 활성화, 염증성 사이토카인 분비 및/또는 면역 활성화를 위한 세포내 신호 전달을 활성화시킬 수 있는 신호전달 도메인을 포함하는 하나 이상의 세포내 도메인을 코딩하는 서열을 포함하고; 여기서, 발현 구성물은 전달을 위해 지질 나노입자에 캡슐화된 폴리뉴클레오티드인 것인, 골수 세포 특이적 발현 구성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 mRNA이다.
본원에서는 CFP를 코딩하는 골수 세포 특이적 발현 구성물로서, 여기서, CFP는 (i) 표적 항원, 예컨대, 암 세포 상에서 발현되는 표적 항원, 예를 들어, CD5, HER2, TROP2, GPC3, GP75, CD19, CD7, CD22 또는 임의의 다른 가능한 표적 항원에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인을 코딩하는 서열, (ii) 예를 들어, CD89 TMD, CD16 TMD, CD64 TMD 또는 CD32a TMD와 같이, 세포에서 발현시 Fc 감마 수용체 막횡단 도메인과 이량체화할 수 있는 막횡단 도메인을 코딩하는 서열, 및 (iii) 식세포작용 활성화, 염증성 사이토카인 분비 및/또는 구성물을 발현하는 세포에서 면역 활성화를 위한 세포내 신호 전달을 활성화시킬 수 있는 신호전달 도메인을 포함하는 하나 이상의 세포내 도메인을 코딩하는 서열을 포함하고; 여기서, 발현 구성물은 폴리뉴클레오티드이고, 여기서, 발현 구성물은 전달을 위해 지질 나노입자에 캡슐화된 것인, 골수 세포 특이적 발현 구성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 mRNA이다.
치료적으로 효과적인 조성물은 약학 조성물이다. 약학 조성물은 생체내 전달에 적합하고, 예를 들어, 그를 필요로 하는 인간에게 전달하기에 적합하다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 CFP를 코딩하는 골수 세포 특이적 발현 구성물을 포함하는 약학 조성물은 그 안에 있는 조성물의 보존을 위한 적절한 온도 및 조건에서 보관되어야 한다.
본원에 기술된 치료적으로 효과적인 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 안와내, 두개내, 척수강내, 비강내, 또는 임의의 적합한 투여 경로에 의해 전달될 수 있다
본원에서는 또한 이를 필요로 하는 피험체를 위한 "기성품" 제품으로 제제화될 수 있는 치료 조성물로서 CFP를 코딩하는 골수 세포 특이적 발현 구성물을 포함하는 골수 세포가 고려된다. 일부 실시양태에서 골수 세포는 CFP를 코딩하는 구성물로 전기천공되며, 여기서, CFP는 (i) 표적 항원, 예컨대, 암 세포 상에서 발현되는 표적 항원, 예를 들어, CD5, HER2, TROP2, GPC3, GP75, CD19, CD7, CD22 또는 임의의 다른 가능한 표적 항원에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인을 코딩하는 서열, (ii) 예를 들어, CD89 TMD, CD16 TMD, CD64 TMD 또는 CD32a TMD와 같이, 세포에서 발현시 Fc 감마 수용체 막횡단 도메인과 이량체화할 수 있는 막횡단 도메인을 코딩하는 서열, 및 (iii) 식세포작용 활성화, 염증성 사이토카인 분비 및/또는 구성물을 발현하는 세포에서 면역 활성화를 위한 세포내 신호 전달을 활성화시킬 수 있는 신호전달 도메인을 포함하는 하나 이상의 세포내 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 골수 세포는 생체내 전달을 위한 조성물로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 이를 필요로 하는 인간에게 생체내 전달에 적합하다.
열거된 실시양태
1. (a) (i) 막횡단 도메인, 또는
(ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및
(b) 표적 세포 상의 CD137에 특이적으로 결합할 수 있는 CD137 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인이 작동가능하게 연결된 것인 조성물.
2. (a) 표적 세포 상의 CD137 항원에 특이적으로 결합하는 제1 CD137 항원 결합 도메인, 및 (b) 골수 세포 상의 표면 작용제에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 제1 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 CD137 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 표면 작용제에 결합하는 것인 조성물.
3. (a) (i) 막횡단 도메인, 또는 (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 (b) 표적 세포 상의 Claudin 18.2에 특이적으로 결합할 수 있는 Claudin 18.2 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인이 작동가능하게 연결된 것인 조성물.
4. (a) 표적 세포 상의 Claudin 18.2 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Claudin 18.2 항원 결합 도메인, 및 (b) 골수 세포 상의 표면 작용제에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 제1 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 Claudin 18.2 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 표면 작용제에 결합하는 것인 조성물.
5. (a) (i) 막횡단 도메인, 또는 (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 (b) 표적 세포 상의 Claudin 3에 특이적으로 결합할 수 있는 Claudin 3 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인이 작동가능하게 연결된 것인 조성물.
6. (a) 표적 세포 상의 Claudin 3 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Claudin 3 항원 결합 도메인, 및 (b) 골수 세포 상의 표면 작용제에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 제1 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 Claudin 18.2 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 표면 작용제에 결합하는 것인 조성물.
7. (a) (i) 막횡단 도메인, 또는 (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 (b) 표적 세포 상의 CD70에 특이적으로 결합할 수 있는 CD70 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인이 작동가능하게 연결된 것인 조성물.
8. (a) 표적 세포 상의 CD70 항원에 특이적으로 결합하는 제1 CD70 항원 결합 도메인, 및 (b) 골수 세포 상의 표면 작용제에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 제1 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 CD70 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 표면 작용제에 결합하는 것인 조성물.
9. (a) (i) 막횡단 도메인, 또는 (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 (b) 표적 세포 상의 TROP2에 특이적으로 결합할 수 있는 TROP2 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인이 작동가능하게 연결된 것인 조성물.
10. (a) 표적 세포 상의 TROP2 항원에 특이적으로 결합하는 제1 TROP2 항원 결합 도메인, 및 (b) 골수 세포 상의 표면 작용제에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 제1 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 TROP2 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 표면 작용제에 결합하는 것인 조성물.
11. (a) (i) 막횡단 도메인, 또는 (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 (b) 표적 세포 상의 TMPRSS에 특이적으로 결합할 수 있는 TMPRSS 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인이 작동가능하게 연결된 것인 조성물.
12. (a) 표적 세포 상의 TMPRSS 항원에 특이적으로 결합하는 제1 TMPRSS 항원 결합 도메인, 및 (b) 골수 세포 상의 표면 작용제에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 제1 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 TMPRSS 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 표면 작용제에 결합하는 것인 조성물.
13. (a) (i) 막횡단 도메인, 및 (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 (b) 표적 세포의 항원에 대한 강한 결합 친화성을 갖는, 실시양태 1, 3, 5, 7, 9 또는 11 중 어느 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는, PR 융합 단백질(PFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 여기서, 막횡단 도메인 및 세포외 도메인이 작동적으로 연결되고; 여기서, PFP가 표적 세포의 항원에 결합할 때 PFP를 발현하는 세포의 살해 또는 식세포작용 활성은 PFP를 발현하지 않는 세포와 비교하여 적어도 20% 초과만큼 증가되는 것인 조성물.
14. 실시양태 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13 중 어느 하나에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 식세포 또는 테더링 수용체로부터 유래되거나, 또는 세포내 신호전달 도메인이 식세포작용 활성화 도메인을 포함하는 것인 조성물.
15. 실시양태 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 14 중 어느 하나에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 염증유발성 신호전달 도메인을 포함하는 것인 조성물.
16. 실시양태 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13-15 중 어느 하나에 있어서, 염증유발성 신호전달 도메인이 키나제 활성화 도메인 또는 키나제 결합 도메인을 포함하는 것인 조성물.
17. 실시양태 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13-16 중 어느 하나에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 PI3 키나제 모집 도메인을 포함하는 것인 조성물.
18. 실시양태 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13-17 중 어느 하나에 있어서, 염증유발성 신호전달 도메인이 IL-1 신호전달 캐스케이드 활성화 도메인을 포함하는 것인 조성물.
19. 실시양태 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13-18 중 어느 하나에 있어서, 염증유발성 신호전달 도메인이 TLR3, TLR4, TLR7, TLR 9, TRIF, RIG-1, MYD88, MAL, IRAK1, MDA-5, IFN-수용체, NLRP 패밀리 구성원, NLRP1-14, NOD1, NOD2, 피린, AIM2, NLRC4, FCGR3A, FCERIG, CD40, 카스파제 도메인 또는 프로카스파제 결합 도메인 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것인 조성물.
20. 실시양태 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 13-19 중 어느 하나에 있어서, CD2, CD8, CD28 또는 CD68 단백질 TM 도메인으로부터 유래된 막횡단 도메인을 추가로 포함하는 조성물.
21. 실시양태 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 13-20 중 어느 하나에 있어서, 힌지 도메인을 추가로 포함하는 조성물.
22. 실시양태 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13-22 중 어느 하나에 있어서, PFP가 표적 세포의 항원에 결합할 때 PFP를 발현하는 세포의 살해 활성이 PFP를 발현하지 않는 세포와 비교하여 적어도 20% 초과만큼 증가되는 것인 조성물.
23. 실시양태 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13-22 중 어느 하나에 있어서, PFP가 표적 세포의 항원에 결합할 때 PFP를 발현하는 세포의 살해 활성이 PFP를 발현하지 않는 세포와 비교하여 적어도 1.1배만큼 증가되는 것인 조성물.
24. 실시양태 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 중 어느 하나에 있어서,
제1 치료제를 포함하고, 여기서, 치료제는
a. 표적 세포 상의 항원과 특이적으로 상호작용하는 제1 항체 또는 이들의 기능성 단편인 제1 결합 도메인, 및
b. 골수 세포와 특이적으로 상호작용하는 제2 항체 또는 이들의 기능성 단편인 제2 결합 도메인을 포함하고; 여기서,
(i) 제1 치료제는 제1 성분에 커플링되고, 여기서, 제1 성분은 추가 치료제 또는 제3 결합 도메인이거나, 또는
(ii) 조성물은 추가 치료제를 포함하는 것인 조성물.
25. 실시양태 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 24 중 어느 하나에 있어서, 치료제가 (a) 표적 세포의 항원과 특이적으로 상호작용하는 제1 결합 도메인, (b) 골수 세포와 특이적으로 상호작용하는 제2 결합 도메인, 및 (c) 골수 세포와 특이적으로 상호작용하는 제3 결합 도메인을 포함하는 것인 조성물.
26. 실시양태 1-25 중 어느 하나에 있어서, 치료제의 결합 도메인 중 어느 하나가 항체의 결합 도메인, 항체의 기능성 단편, 이들의 가변 도메인, VH 도메인, VL 도메인, VNAR 도메인, VHH 도메인, 단일 쇄 가변 단편(scFv), Fab, 단일 도메인 항체(sdAb), 나노바디, 이중특이적 항체, 디아바디, 또는 기능성 단편 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 조성물.
27. 실시양태 1-26 중 어느 하나에 있어서, 제1 결합 도메인이 결합하는 표적 세포 상의 항원이 세포 상의 암 항원 또는 병원성 항원 또는 자가면역 항원인 것인 조성물.
28. 실시양태 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 24 중 어느 하나에 있어서, 제1 치료제는 길이가 1000개 미만의 아미노산 또는 1000 nm 미만인 폴리펩티드를 포함하는 것인 조성물.
29. 실시양태 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 또는 28 중 어느 하나에 있어서, 제1 치료제는 길이가 500개 미만의 아미노산 또는 500 nm 미만인 폴리펩티드를 포함하는 것인 조성물.
30. 실시양태 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 28, 또는 29 중 어느 하나에 있어서, 제1 치료제는 길이가 200-1000개의 아미노산 또는 200-1000 nm인 폴리펩티드를 포함하는 것인 조성물.
31. 실시양태 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 또는 28-30 중 어느 하나에 있어서, 제1 치료제의 결합 도메인의 인게이지먼트가 암 세포를 골수 세포에 접촉시키는 것인 조성물.
32. 실시양태 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 또는 28-31 중 어느 하나에 있어서, 제2 결합 도메인이 골수 세포와 특이적으로 상호작용하고, 골수 세포의 식세포작용 활성을 촉진시키는 것인 조성물.
33. 실시양태 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 또는 28-32 중 어느 하나에 있어서, 제2 결합 도메인이 골수 세포와 특이적으로 상호작용하고, 골수 세포의 염증성 신호전달을 촉진시키는 것인 조성물.
34. 실시양태 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 또는 28-33 중 어느 하나에 있어서, 제2 결합 도메인이 골수 세포 또는 부착 분자와 특이적으로 상호작용하고, 골수 세포의 표적 세포에의 부착을 촉진시키는 것인 조성물.
35. 실시양태 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 또는 28-34 중 어느 하나에 있어서, 제2 결합 도메인이 골수 세포와 특이적으로 상호작용하고, 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항식세포 활성을 억제시키는 것인 조성물.
36. 실시양태 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 또는 28-35 중 어느 하나에 있어서, 제2 결합 도메인이 골수 세포와 특이적으로 상호작용하고, 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항염증성 활성을 억제시키는 것인 조성물.
37. 실시양태 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 또는 28-36 중 어느 하나에 있어서, 제2 및/또는 제3 결합 도메인 은 골수 세포의 식세포 활성을 촉진시키는 것인 조성물.
38. 실시양태 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 또는 28-37 중 어느 하나에 있어서, 제2 및/또는 제3 결합 도메인 은 골수 세포의 염증성 신호전달을 촉진시키는 것인 조성물.
39. 실시양태 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 또는 28-38 중 어느 하나에 있어서, 제2 및/또는 제3 결합 도메인은 골수 세포 또는 부착 분자와 특이적으로 상호작용하고, 골수 세포의 표적 세포에의 부착을 촉진시키는 것인 조성물.
40. 실시양태 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 또는 28-39 중 어느 하나에 있어서, 제2 및/또는 제3 결합 도메인은 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항식세포 활성을 억제시키는 것인 조성물.
41. 실시양태 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 또는 28-40 중 어느 하나에 있어서, 제2 및/또는 제3 결합 도메인은 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항염증성 활성을 억제시키는 것인 조성물.
42. 실시양태 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 또는 28-41 중 어느 하나에 있어서, 제3 결합 도메인 또는 추가 치료제가 CD47 길항제, CD47 차단제, 항체, 키메라 CD47 수용체, 시알리다제, 사이토카인, 염증유발성 유전자, 프로카스파제, 또는 항암제를 포함하는 것인 조성물.
43. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 제1 결합 도메인, 제2 결합 도메인 및 제3 결합 도메인이 별개의 비동일한 표적 항원에 결합하는 것인 조성물.
44. 실시양태 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 또는 28-43 중 어느 하나에 있어서, 제1 결합 도메인, 제2 결합 도메인 또는 제3 결합 도메인이 리간드 결합 도메인인 것인 조성물.
45. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 제1, 제2 또는 제3 결합 도메인이 하나 이상의 링커에 의해 작동가능하게 연결된 것인 조성물.
46. 실시양태 45에 있어서, 링커가 폴리펩티드인 것인 조성물.
47. 실시양태 46에 있어서, 링커가 기능성 펩티드인 것인 조성물.
48. 실시양태 45-47 중 어느 하나에 있어서, 링커가 수용체에 대한 리간드인 것인 조성물.
49. 실시양태 45에 있어서, 링커가 단핵구 또는 대식세포 수용체에 대한 리간드인 것인 조성물.
50. 실시양태 45-49 중 어느 하나에 있어서, 링커가 수용체를 활성화시키는 것인 조성물.
51. 실시양태 45-50 중 어느 하나에 있어서, 링커가 수용체를 억제시키는 것인 조성물.
52. 실시양태 51에 있어서, 링커가 M2 대식세포 수용체에 대한 리간드인 것인 조성물.
53. 실시양태 48 또는 49에 있어서, 링커가 TLR 수용체, 예컨대, TLR4에 대한 리간드인 것인 조성물.
54. 실시양태 48, 49 또는 50 중 어느 하나에 있어서, 링커가 TLR 수용체를 활성화시키는 것인 조성물.
55. 실시양태 45-54 중 어느 하나에 있어서, 제1, 제2 및/또는 제3 결합 도메인이 결합 도메인에 결합하는 마스크와 회합되는 것인 조성물.
56. 실시양태 55에 있어서, 마스크가, 마스크가 각각의 결합 도메인과 회합된 상태로 유지될 때, 결합 도메인의 그의 표적에의 상호작용을 억제시키는 억제제인 것인 조성물.
57. 실시양태 56에 있어서, 마스크가 펩티드 링커를 통해 결합 도메인과 회합되는 것인 조성물.
58. 실시양태 57에 있어서, 펩티드 링커가 절단가능한 모이어티를 포함하는 것인 조성물.
59. 실시양태 57에 있어서, 절단가능한 모이어티가 암 또는 종양 부위에 선택적으로 풍부한 단백질 또는 효소에 의해 절단되는 것인 조성물.
60. 실시양태 1-59 중 어느 하나에 있어서, 재조합 핵산이 RNA인 것인 조성물.
61. 실시양태 1-60 중 어느 하나에 있어서, 재조합 핵산이 mRNA인 것인 조성물.
62. 실시양태 1-61 중 어느 하나에 있어서, 재조합 핵산이 하나 이상의 지질과 회합되는 것인 조성물.
63. 실시양태 1-61 중 어느 하나에 있어서, 재조합 핵산이 리포솜에 캡슐화되는 것인 조성물.
64. 실시양태 63에 있어서, 리포솜이 나노입자인 것인 조성물.
65. 실시양태 1-64 중 어느 하나에 있어서, 재조합 핵산이 벡터에 포함된 것인 조성물.
66. 실시양태 1-65의 조성물의 재조합 핵산 중 어느 하나, 및 부형제를 포함하는 약학 조성물.
67. 실시양태 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 또는 28 - 59 중 어느 하나의 재조합 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물.
68. 실시양태 1-67 중 어느 하나의 재조합 핵산을 포함하는 세포.
69. 실시양태 68에 있어서, 세포가 골수 세포인 것인 세포.
70. 실시양태 69에 있어서, 세포가 CD14+, CD16-인 것인 세포.
71. 실시양태 1-66 중 어느 하나의 재조합 핵산을 포함하는 세포 집단을 포함하는 약학 조성물로서, 여기서, 적어도 50%의 세포는 CD14+CD16-인 것인, 약학 조성물.
72. 실시양태 71에 있어서, 10% 미만의 세포가 수지상 세포인 것인, 약학 조성물.
73. 실시양태 71 또는 72에 있어서, 적합한 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
74. 실시양태 1-73의 조성물 중 어느 하나를 제조하는 방법.
75. 피험체에게 실시양태 71-73 중 어느 하나의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 암을 치료하는 방법.
76. 피험체에게 실시양태 66의 약학 조성물; 또는 실시양태 67의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 암을 치료하는 방법.
77. 실시양태 75 또는 76에 있어서, 암이 위암, 난소암, 신장암, 유방암, 전립선암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 교모세포종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
78. 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산을 포함하는 조성물로서, CFP는 (a) 항종양 연관 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 및 (b) 세포외 도메인에 작동적으로 연결된 막횡단 도메인을 포함하고; 여기서, 막횡단 도메인은 골수 세포에서 내인성 FcR-감마 수용체와 이량체화하는 단백질로부터의 막횡단 도메인이고; 여기서, 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산이 세포에서 발현되었을 때, 골수 세포에서는 기능성이고, 비골수 세포에서는 비기능성인 것인 조성물.
79. 실시양태 78에 있어서, CFP의 발현이 CFP를 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 핵산으로의 형질감염 후 24 h, 36 h, 48 h, 또는 72 h째에 골수 세포에서 검출가능하고, 상기 재조합 핵산으로의 형질감염 후 24 h, 36 h, 48 h, 또는 72 h째에 비골수 세포에서는 검출이 불가능한 것인 조성물.
80. 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산을 포함하는 조성물로서, CFP는
(a) 항종양 연관 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 및
(b) 세포외 도메인에 작동적으로 연결된 막횡단 도메인을 포함하고;
여기서, 재조합 폴리핵산은 나노입자 전달 비히클에 의해 캡슐화되고; 여기서, 인간 피험체에게로의 조성물 투여 후, CFP가 인간 피험체의 골수 세포의 표면 상에 발현되는 것인 조성물.
81. 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산을 포함하는 조성물로서, CFP는
(a) 항종양 연관 칼슘 신호 전달인자 2(항TROP2) 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 및
(b) 세포외 도메인에 작동적으로 연결된 막횡단 도메인을 포함하고;
여기서, 막횡단 도메인은 골수 세포에서 내인성 FcR-감마 수용체와 이량체화하는 단백질로부터의 막횡단 도메인이고; 여기서, 재조합 폴리핵산은 나노입자 전달 비히클에 의해 캡슐화되고; 여기서, 인간 피험체에게로의 조성물 투여 후, CFP가 인간 피험체의 골수 세포의 표면 상에 발현되는 것인 조성물.
82. 실시양태 1에 있어서, 항TROP2 결합 도메인이 Fab 단편, scFv 도메인 또는 sdAb 도메인을 포함하는 것인 조성물.
83. 실시양태 1에 있어서, 세포외 도메인 또는 막횡단 도메인이 CD8, CD16a, CD64, CD68 또는 CD89로부터의 세포외 도메인 또는 막횡단 도메인인 것인 조성물.
84. 실시양태 1에 있어서, 세포외 도메인이 CD8로부터 유래된 힌지 도메인을 추가로 포함하고, 여기서, 힌지 도메인이 막횡단 도메인 및 항TROP2 결합 도메인에 작동적으로 연결된 것인 조성물.
85. 실시양태 78에 있어서, 막횡단 도메인이 골수 세포, 단핵구 또는 대식세포에서 내인성 FcR-감마 수용체와 이량체화하는 단백질로부터의 막횡단 도메인이고; 여기서, 인간 피험체에게로의 약학 조성물 투여 후, CFP는 인간 피험체의 골수 세포, 단핵구 또는 대식세포에서 특이적으로 발현되는 것인 조성물.
86. 실시양태 85에 있어서, 막횡단 도메인이 CD16a, CD64, CD68 또는 CD89로부터의 막횡단 도메인인 것인 조성물.
87. 실시양태 78에 있어서, CFP가 세포내 도메인을 추가로 포함하는 것인 조성물.
88. 실시양태 87에 있어서, 세포내 도메인이 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인이 FcγR, FcαR, FcεR, CD40 또는 CD3제타로부터의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것인 조성물.
89. 실시양태 87에 있어서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인이 포스포이노시티드 3 키나제(PI3K) 모집 도메인을 추가로 포함하는 것인 조성물.
90. 실시양태 89에 있어서, PI3K 모집 도메인이 서열 번호 26과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조성물.
91. 실시양태 87에 있어서, 세포내 도메인이 CD16a, CD64, CD68 또는 CD89로부터의 세포내 도메인을 포함하는 것인 조성물.
92. 실시양태 1에 있어서, 재조합 폴리핵산이 mRNA인 것인 조성물.
93. 실시양태 78에 있어서, 나노입자 전달 비히클이 지질 나노입자를 포함하는 것인 조성물.
94. 실시양태 93에 있어서, 지질 나노입자가 극성 지질을 포함하는 것인 조성물.
95. 실시양태 93에 있어서, 지질 나노입자가 비극성 지질을 포함하는 것인 조성물.
96. 실시양태 93에 있어서, 지질 나노입자 직경이 100 내지 300 nm인 것인 조성물.
97. 실시양태 78의 조성물, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
98. 실시양태 97에 있어서, 약학 조성물이 암을 앓는 인간 피험체에게 투여되었을 때, 암 성장을 억제시키는 것인, 유효량의 실시양태 78의 조성물을 포함하는 것인 약학 조성물.
99. 암 치료를 필요로 하는 피험체에게 실시양태 97 또는 98의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 피험체에서 암을 치료하는 방법.
100. 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산의 존재하에서 골수 세포를 전기천공시키는 단계를 포함하고, CFP는
(a) 항TROP2 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 및
(b) 세포외 도메인에 작동적으로 연결된 막횡단 도메인을 포함하고;
여기서, 재조합 폴리핵산은
(i) 골수 세포 중에 존재하거나, 또는
(ii) 나노입자 전달 비히클에 의해 캡슐화되고;
여기서, 재조합 폴리핵산은 인간 피험체의 골수 세포에서의 재조합 폴리핵산의 발현을 위해 구성되는 것인, 실시양태 78의 조성물을 골수 세포 내로 도입하는 방법.
101. 실시양태 81-84에 있어서, 인터페론 유도 세포내 도메인을 추가로 포함하는 조성물.
실시예
실시예 1. CD137- FcR - PI3K CFP 구성물:
본 섹션에서, 항원, 예컨대, 암 항원, 예컨대, CD37에 결합하는 세포외 결합 도메인을 갖는 예시적인 키메라 융합 단백질(CFP) 수용체의 디자인 및 기능적 분석, 간략하면, CD137 결합제 CFP 수용체 단백질을 본원에 기술된 결합제에 대한 예시적인 경우로서 제공한다(도 1, 2a, 2b 및 도 3에 그래픽으로 제시). 절차 및 방법은 본원에 기술된 다른 구성물 중 어느 하나를 생성하기 위해 필요에 따라 일부 수정하여 사용될 수 있다. CD137 표적화된 CFP는 공지된 분자 생물학 기술을 사용하여 구성된다. 핵산 구성물은 인간 CD137L의 리간드 결합 단편으로부터 유래된 세포외 CD137 결합 도메인을 코딩하는 서열의 상류에 융합된 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 인간 CD137L의 리간드 결합 도메인을 인간 상보적 DNA 라이브러리로부터 PCR 증폭시키고, 짧은 링커를 통해 CD8α 쇄 힌지 및 CD8α 쇄 TM 도메인에 부착된 막횡단 영역을 포함하는 백본과 융합시켰다. TM 도메인은 세포질 말단에서 FcRγ 세포질 부분 및 PI3K 모집 도메인과 융합된다. 그래픽으로 표현된 대표도가 도 4a에 제공되어 있다. 구성물은 형광 마커 및 약물(암피실린) 내성을 갖는 벡터에서 제조되고, 박테리아 숙주를 형질감염시켜 증폭된다.
구성물은 mRNA로서 비분열 포유동물 세포로 전달되고, 전달 비히클, 예컨대, 지질, 리포솜, 지질 나노입자 또는 중합체 등과 같은 합성 화합물이 동반된다. 골수 세포와 같은 여러 세포 유형이 바이러스 형질 도입 또는 플라스미드 전달에 의해 영향을 받는다는 것이 그룹에 의해 발견되었고, 앞서 보고된 바 있다. 골수 세포는 외래 DNA를 제대로 발현하지 못하며, 종종 외래 DNA를 발현하는 것처럼 간단한 세포 조작시 성숙, 분화와 같은 세포 형질전환이 이루어진다(도 4b, 좌측). 일부 경우에서, 세포의 생존능이 영향을 받는다(우측 상단). 한편, 도 4b, 우측에 제시된 바와 같이, mRNA를 통한 전달은 세포가 세포 활성화의 지표인 TNF 및 IL6과 같은 사이토카인을 방출하지 않는다는 점에서 세포 진행, 노화 또는 형질전환을 유도하지 않는다.
실시예 2. CD137 표적화 키메라 항원 수용체 발현 단핵구의 효능
본 실시예에서, 본 개시내용에 기술된 예시적인 디자인의 세포외 CD137 항원 결합 도메인을 갖는 키메라 융합 단백질(CAR)을 잠재적인 항암제로서의 기능적 효능에 대해 분석한다. 1세대 렌티바이러스 벡터를 사용하여 골수 THP1 세포주를 형질도입하는 데 사용되는 렌티바이러스를 생성할 수 있다. PMA 처리된 THP1 세포에서의 형질도입 효율은 다른 결합 도메인을 가진 CD137 결합제와 유사한 CFP 구성물에 대해 67-90% 범위이다. 실험 셋업은 도 5 상단 패널의 개략도에 도시되어 있고, 도 5, 식세포작용에 대한 예상 결과가 도 5 하단 패널에 도시되어 있다. 표적 세포 사멸은 하기 공식으로 계산할 수 있다: [(# SKOV3 단독 - 이펙터하의 #SKOV3)/ # SKOV3 단독] x 100.
건강한 공여자로부터 단리된 CD14+ 세포는 FcRγ + PI3K 세포내 도메인을 코딩하는 렌티바이러스 CD137 표적화 CFP 구성물로 형질도입하고, CSFE 표지된 SCOV3 종양 세포의 식세포작용 및 살해에 대해 분석한다(도 6a).
ATAK 구성물은 구성물을 발현하는 세포에 표적 특이성을 제공한다(도 6b). 예를 들어, CD19 결합제를 발현하는 세포는 표면에 CD19가 아닌 CD22를 제시하는 표적을 포식하지 않았다. 도 6c는 구성물을 골수 세포에 도입하는 것이 세포의 종양 부위로의 이동에 영향을 미치지 않는다는 것을 도시한 것이다(예컨대, 좌측 이미지, CAR 구성물을 발현하는 세포는 종양에서 GFP+이고, 세포는 mRNA의 마우스로의 도입 후에 이동하였다). CAR 발현 세포는 데이터(우측)에 제시된 바와 같이 시험관내에서 케모카인에 대해 반응성을 띤다.
CD137 구성물을 발현하는 이들 세포가 종양 환경에서 M0, M1, M2 표현형으로 분화할 수 있는지 여부를 시험하기 위해, CAR 발현 골수 세포를 M0, M1 또는 M2 분극화 신호에 적용시키고, 종양 세포 또는 비종양 대조군 세포의 존재하에 18시간 동안 배양물 중에서 인큐베이션시켰다. M0(100 ng/ml MCSF); M1 (5 ng/ml LPS+100 ng/ml IFNγ); M2(100 ng/ml MCSF + 20 ng/ml IL-10 + 20 ng/ml TGFβ); DC(100 ng/ml GMCSF + 20 ng/ml IL-4); 및 대조군. 도 7a는 기술된 상이한 조건하에서 예상되는 CD80 및 CD206 발현 프로필을 보여주는 것으로, 이는 상기 세포의 차등적 잠재능을 나타낸다. 이들 실험 중 일부를 위해, FLAG 펩티드를 코딩하는 서열을 키메라 CD137 구성물의 세포외 영역에서 scFv와 막횡단 도메인 사이에 도입한다. 세포를 수확할 수 있고, 세포 생존능을 시험할 수 있으며, 80% 초과인 것으로 확인될 수 있다. 세포의 표현형은 24시간째에 유세포 분석법으로 검사할 수 있다. 24, 48 및 72시간째에 여러 세포 마커의 발현을 측정할 수 있다. CD16 발현은 CAR 발현만으로는 증가하지 않는다.
CD137 발현 종양에 대한 생체내 모델을 이용하여 CD137-CFP를 발현하는 세포의 종양 투과 및 활성화를 조사할 수 있다. 실험 디자인의 개략도가 도 7b에 도시되어 있다. CD137 표적화된 CFP 발현 세포의 이동 및 투과는 세포질 염료 CSFE로 표지된 CFP 발현 세포의 단일 주입 후 24시간째에 측정할 수 있다. 조직학을 위해 종양을 제거하고, 프로세싱할 수 있다. 도 7c의 예언적 데이터에 제시된 바와 같이, CD137-CFP 발현 골수 세포는 종양으로 이동하여 종양 세포 주위에 축적될 수 있다. MSTO 종양 보유 NSG 마우스에서 CFSE 표지된 CD137-표적화된 CFP 발현 세포 투여 후 24시간째, 비장을 제거하고, 조직학을 위해 프로세싱할 수 있다.
실시예 3. 골수 특이적 발현을 위한 키메라 항원 수용체
본 실시예는 골수 특이적 발현을 위한 키메라 항원 수용체 디자인을 보여준다. 디자인의 키메라 융합 단백질은 FcR TDM으로 구성된 막횡단 도메인을 가지며, 세포막에서의 그의 발현은 단핵구에서 내인적으로 발현되는 Fc 감마 수용체와 다량체화하는 것에 의존한다. 본 실시예에서, 단핵구 특이적 발현을 위한 CFP 구성물은 CD16 또는 CD89의 막횡단 도메인(TMD)으로 디자인된다. 특정 CFP는 도 8에 요약된 일반적인 개략도를 기반으로 디자인될 수 있다. 예시적인 디자인은 CD16(FcRIIIA) TMD 및 CD16 세포내 도메인과 작동가능하게 연결된 세포외 암 항원 결합 도메인을 갖는 것; 또는 CD89(FcRI 알파) TMD 및 CD89 세포내 도메인과 작동가능하게 연결된 세포외 암 항원 결합 도메인을 갖는 것. 특정 CFP는 도 8에 요약된 일반 개략도를 기반으로 디자인될 수 있다. 예시적인 디자인은 CD16(FcRIIIA) TMD 및 CD16 세포내 도메인과 작동가능하게 연결된 세포외 암 항원 결합 도메인을 갖는 것; 또는 CD89(FcRI 알파) TMD 및 CD89 세포내 도메인과 작동가능하게 연결된 세포외 암 항원 결합 도메인을 갖는 것을 포함한다. 세포외 항원 결합 도메인 사이에 힌지(H)가 존재할 수 있다. 특정 구성물에서, CD16 또는 CD89 TMD는 가요성을 위해 세포외 영역에서 약 10개의 아미노산으로 연장되고, 별도의 힌지 도메인이 포함될 수도 있거나, 그렇지 않을 수도 있다. ECD 암 항원 결합 도메인은 본원에서 고려되는 다양한 항원 중 어느 하나에 결합하는 scFv, 또는 항체 또는 이들의 단편일 수 있다.
실시예 4. TROP2 항원 특이적 CFP 구성물
본 실시예는 암 세포 상의 TROP2를 표적화하고, 골수 세포에서 발현되는 CFP의 디자인을 보여주는 것이다. 시험관내 시험 목적을 위한 세포외 FLAG-태그를 갖는 예시적인 버전이 도 9에 제시되어 있다. 간략하면, 한 구성물은 본 경우에서는 FLAG 태그에 융합된, 세포외 항TROP2 scFv, 이어서, FcRIIIA(CD16) 단백질의 막횡단 도메인, 및 동일한 단백질의 세포질 도메인으로 구성된다. 또 다른 구성물은 본 경우에서는 FLAG 태그에 융합된, 세포외 항TROP2 scFv, 이어서, Fc-알파 R(CD89) 단백질의 막횡단 도메인 및 CD89 세포질 도메인으로 구성된다.
또한 PBMC에서 각 구성물을 코딩하는 재조합 mRNA의 전기천공 및 식세포작용 및 사이토카인 생성의 시험관내 시험을 위한 간소화된 실험 계획이 도면에 제시되어 있다. 도 16은 생체내 전달을 위한 일반화된 LNP 제제를 그래프로 보여주는 것이다.
실시예 5. TROP2 -CD16 및 TROP2 -CD89 구성물은 골수 세포/단핵구에서 우선적으로 발현된다
CD16 및 CD89 TMD 및 TROP2 결합제를 갖는 구성물을 유세포 분석 검정법을 위한 FLAG 태그를 사용하여 상이한 세포 유형에서의 발현에 대해 시험하였다. TROP2 결합제는 또한 다른 곳에 개시된 바와 같이 항TROP2 scFV이다. B 세포, T 세포, NK 세포 및 단핵구의 공급원인 PBMC를 TROP2-FLAG-CD16 및 TROP2-FLAG-CD89 mRNA로 전기천공하고, 24시간째 유세포 분석법을 수행하였다. 데이터는, 구성물이 단핵구(맨 우측)에서 우선적으로 성공적으로 발현하고, CD19+(B 세포), CD3+(림프구) 또는 CD56+(NK 세포)에서는 발현이 검출되지 않았다는 것을 보여주는 도 10에 제시되어 있다. CD89 기반 구성물은 CD16 기반 구성물보다 더 높은 발현을 나타내며, 여기서, 60% 초과의 게이팅된 세포가 TROP2-FLAG-CD89 구성물을 나타낸다.
실시예 6. TROP2 -CD16 및 TROP2 -CD89 세포는 표적 세포 식세포작용을 보였다
TROP2 구성물로 전기천공된 PBMC를 시험관내에서 종양 세포의 식세포작용에 미치는 효과에 대해 시험하였다. 사용된 표적 종양 세포는 루시페라제를 발현하는 SKOV3 세포주였다. 루시페라제 활성의 감소에 의해 측정된 바, 모의 형질감염된 단핵구 및 비형질감염된 단핵구는 기저 수준의 식세포작용을 나타냈다. 두 TROP2 CFP를 발현하는 세포는 이들 대조군과 비교하여 루시페라제 활성의 통계상 유의적인 감소를 보였고, 이는 구성물의 발현이 세포의 식세포작용 능력을 증가시킨다는 것을 보여준다(도 11).
표적 SKOV3 세포의 존재 및 부재, 둘 모두에서 TROP2-FLAG-CD16 및 TROP2-FLAG-CD89-발현 세포에 나타난 결과에서 사이토카인 발현을 조사하였다. 도 12a 및 12b에 도시된 데이터는 TROP2-CD16 및 TROP2-CD89 구성물의 발현은 단핵구에서 강장성 신호를 나타내지 않는다는 것을 보여주는 것이다. 이는 사이토카인 또는 케모카인 발현(IL-1b, IL-18 또는 TNF-알파 또는 케모카인 CCL2)이 CFP의 ECD와 그의 표적의 인게이지먼트시에 표적 세포(SKOV3)의 존재하에 유도되었다는 사실에 의해 입증된다. 표적 세포 부재하에서, 사이토카인은 유도되지 않거나, 또는 무시해도 될 정도로 유도되었다는 것이 명백하게 나타났다. 본 결과는 암 세포 상의 TROP2에 결합할 수 있고, 표적화된 암 세포의 표적화된 파괴를 위해 골수 세포를 활성화시킬 수 있는 특정 골수 표적화된 CFP가 생성되었고, 치료 조성물을 향한 추가 개발이 이들 구성물을 이용함으로써 수행될 수 있다는 것을 시사한다.
이어서, TROP2에 결합하는 scFv의 VH 및 VL의 배향이 발현 수준에 차이를 만드는지 여부를 시험하였다. 도 13a는 VL-VH(좌측) 및 VH-VL(우측) 배향을 갖는 구성물을 도시한 것이다. 예시적인 VL-VH scFv는 서열 번호 34의 서열을 갖는다. 예시적인 VH-VL scFv는 서열 번호 35의 서열을 갖는다. VH-VL 구성물의 발현은 THP-1 세포(도 13b) 및 1차 단핵구(데이터는 제시되지 않음), 둘 모두에서 더 높은 발현을 나타낸다. 또한, VH-VL 구성물을 발현하는 THP-1 세포는 VL-VH 구성물보다 약간 더 높은 식세포 능력을 보였다(도 13c). 막횡단 및 세포내 도메인의 조합을 포함하는 TROP2 결합 CFP 구성물을 구성하였다. 막횡단 도메인(TMD)이 CD8 힌지와 TM 도메인을 포함하는 TM 도메인이고, 세포내 도메인은 Fc 수용체 γ 쇄 및 PI3 키나제 모집 도메인을 포함하도록 TROP2-CD8힌지-CD8TM-FcRγ-PI3K 구성물을 생성하였다. 유사하게, CD8 힌지 및 TM 도메인, 및 CD137(4-1BB) 세포내 도메인을 갖는 것으로서 TROP2-FcR-41BB 구성물을 생성하였고; TROP2-41BB-FcR 구성물은 CD8 힌지 및 TM 도메인, 및 CD137(4-1BB) 세포내 도메인인 FcRγ 세포내 도메인을 갖는 것으로 생성하였다. TROP2-CD40-FcR은 CD8 힌지 및 TM 도메인, CD40 세포내 도메인 및 FcR 세포내 도메인을 사용하여 구성하였다. TROP2-FcR-MDA5는 CD8 힌지와 TM 도메인, FcRγ 세포내 도메인은 MDA5 탠덤 CARD 도메인으로 구성하였다. TROP2-CD64 및 TROP2 CD89 구성물은 CD64 또는 CD89 TM 도메인과 세포내 도메인을 갖는 것으로 생성되었으며, 세포내 신호전달을 위해 내인성 FcR 구성물 쇄와의 이량체화 또는 다량체화를 필요로 한다. 시험관내에서 식세포작용 잠재능을 시험하기 위한 HER2-CD8힌지-CD8TM-FcRγ-PI3K 및 다른 구성물을 안정적으로 발현하는 THP-1-565 세포주.
도 13d는 구성물의 발현을 나타내는 유세포 분석법 데이터를 보여주는 것이다. 각 TROP2 결합제 구성물은 HER2 결합제 CFP 구성물과 비교하여 발현 수준이 더 낮다. 도 13e는 각 TROP2 결합제 및 HER2 결합제 구성물의 발현 수준의 유세포 분석법 검출에 의한 직접적인 비교를 보여주는 것이다.
실시예 7. GP75 표적화된 CAR-P 구성물 및 발현
GP75는 흑색종 및 정상 멜라닌 세포, 둘 모두에서 발현되는 멜라노좀 당단백질이다. GP75는 인간 및 마우스 흑색종에서 세포 표면 뿐만 아니라, 세포내에서도 발현될 수 있다. GP75 결합 도메인을 갖는 키메라 융합 단백질을 세포 및 동물 모델에서 시험하기 위해 구성하였다. 도 14a에 제시된 바와 같이, 키메라 수용체의 항GP75 결합 세포외 도메인을 방해하지 않는 세포외 FLAG 도메인을 갖는 실험 구성물을 발현 시험을 위해 디자인하였다. 한 구성물에서, CD8 힌지 및 막횡단 도메인은 세포외 항-GP75-ScFv-FLAG 서열에 융합된다. Fcγ 도메인은 ICD로서 포함된다. PI3 키나제 모집 도메인은 ICD에 도입된다. 도 14a에 제시된 바와 같이, CD16 또는 CD89 막횡단 영역을 갖는 항GP75 세포외 결합 도메인을 갖는 예시적인 CFP 구성물 세트를 생성하였다. 일부 구성물에서, CD16 및 CD89 도메인은 전체 세포질 부분을 가지고 있다. GFP 코딩 서열은 자가 절단가능한 펩티드 T2A를 코딩하는 서열에 의해 키메라 융합 단백질(CFP)의 세포질 도메인으로부터 분리된 세포질 말단에 태그부착된다. 마우스 특이적 발현 및 마우스 생체내 실험을 위해, 인간 서열 대신 마우스 CD16 또는 CD89 막횡단 도메인을 코딩하는 서열을 도입하였다. 상응하는 인간 CD89를 포함하는 구성물 또한 디자인하고, 제조하였다.
힌지 도메인이 발현 수준에 미치는 효과를 시험하기 위해, 도 14a의 하단 패널에 구체적으로 제시된 바와 같이, 실험을 위한 다양한 힌지/TM 및 ICD를 갖는 일부 예시적인 CD16 기반 항GP75-FLAG 구성물을 생성하였다. 구성물 범위는 힌지 도메인이 없는 것(MYL157)에서부터, CD8 힌지 도메인을 갖는 것(MYL184), CD28 힌지 도메인을 갖는 것(MYL185)까지였다. 본원에 제시되지 않은 다른 구성물로는 항GP75-FLAG-hCD89 TM-hCD89 ICD(MYL158)를 포함한다.
음성 선택에 의해 마우스 대퇴골로부터 단핵구를 단리시키고, mRNA 구성물로 전기천공하고, 밤새도록 배양하고, GP75 발현 B16 종양 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 뮤린 세포에서 구성물이 성공으로 발현된 것으로 관찰되었다(도 14b). CD8 힌지 도메인의 도입은 발현 수준에서 구성물의 약간의 이점을 나타내었다(제시되지 않음). 도 15a-15c에 제시된 바와 같이, 강력한 종양 세포 특이적 식세포작용이 관찰되었다. 구체적으로 도 15b에 제시된 바와 같이, 항GP75 ECD 및 CD89 TM 도메인을 갖는 구성물 MYL158은 증가된 식세포작용을 나타내었다. 유사하게, 도 15c에 제시된 바와 같이, GP75 세포외 항원 결합 도메인 및 CD89 TM 도메인을 갖는 MYL158 및 MYL 186 구성물, 둘 모두는 증가된 식세포작용을 나타내었다. 도면에서 양성 대조군은 FcR-PI3K 모집 ICD를 갖고, 높은 식세포 지수를 나타낸, 본 발명자들의 1세대 골수 세포 CFP 구성물이다. 도 15d는 명시된 구성물을 발현하는 단핵구 세포에 의한 사이토카인 방출 데이터를 보여주는 것이다.
실시예 8. 동계 마우스 종양 모델 및 CAR-P 요법
본 실시예에서, HER2 동계 마우스 모델을 사용하여 내인성 종양에 대한 CFP의 효과를 시험하였다. 유청 단백질 프로모터 구성물에 의해 구동되는 인간 Erb B2를 사용하여 동계 마우스 뇌와 유선에서 인간 HER2를 발현하여 거부 없이 hHER2 종양을 확립할 수 있었다. HER2+ 종양은 완전히 면역적격인 숙주에서 확립되었다. 이어서, hHER2를 발현하는 항HER2 CFP의 효과를 마우스 모델에서 조사하였다. CRISPR 편집된 HER2-CFP 발현 단핵구를 이용하여 상기 모델에서 HER2 종양을 치료하였다. 종양 성장, CAR 세포의 수송, CAR 세포의 지속성 및 종양으로의 침윤 및 면역 분석을 수행하였다.
실시예 9. CFP의 생체내 전달 및 골수 특이적 발현
도 16은 LNP에 캡슐화된, GFP 태그 및/또는 FLAG 태그를 갖는 조작된 CFP를 코딩하는 재조합 mRNA를 그래프로 나타낸 대표도를 보여주는 것으로, 이를 생체내 골수 세포 특이적 발현 및 항종양을 시험하기 위해 주사에 의해 마우스 흑색종 모델 내로 도입하였다(도 17a).
도 17b는 생체내에서 CFP를 코딩하는 mRNA의 생체내 전달을 위한 PEI 제제를 보여주는 것이다.
CFP는 CD89 막횡단 도메인을 갖는다. 기관을 도 18a에 제시된 바와 같이 주기적으로 적출하고, mRNA 코딩된 CFP의 기관 특이적 발현을 검정하였다. 비골수 세포(예컨대, 림프구)는 CFP를 발현하지 않았다. 폐, 간, 비장의 골수 세포에서 발현이 양성으로 확인되었다. 도 18b는 세포 유형 특이적 발현을 추가로 분석한 것이다. CFP의 1차 또는 2차 주사 후 단리된 세포는 두 기관 모두에서 Ly6C+/F4/80+ 대식세포 및 LY6C+Ly6G- 단핵구에서 태그의 발현이 통계적으로 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 호중구에서도 또한 구성물의 발현이 나타났다. T 세포와 같은 비골수 세포는 발현을 나타내지 않았다. 도 18c-18j는 도면에 명시된 바와 같은 특정 막횡단 도메인을 갖는 구성물의 세포 특이적 및 조직 특이적 발현으로, 시험관내 및 생체내 둘 모두에서의 골수 세포 특이적 발현을 허용하는 것을 추가로 예시한 것이다.
실시예 10. 마우스에서 CAR 발현 대식세포 처리의 면역학적 영향
종양 조직병리학 결과, 처리된 마우스 4마리 중 2마리에서 종양이 상당부 감소되고, 소멸된 것으로 보이고, 비처리 군에서는 어떤 감소도 없는 것으로 보인다. 대표적인 결과는 도 19에 제시되어 있다. 추가로, 도 20a 및 20b는 종양 살해에 필요한 높은 골수성 세포 활성을 나타내는 조직에서의 사이토카인 및 케모카인 시그니처를 보여주는 것이다. 도 20c는 조작된 단핵구가 시험관내 검정법에서 T 세포를 모집한다는 것을 입증하는 것이다. 도 21 및 도 41 및 42는 CFP 구성물을 투여받은, 종양을 앓는 마우스로부터 단리된 세포에 의한 염증성 사이토카인 분비 증가를 보여주는 것이다. 잠재적으로 상기 염증성 사이토카인은 반응성이 낮은 종양을 반응성이 높은(hot) TME로 전환시킨다.
도 22는 CFP를 포함하는 LNP 주사를 받은 마우스에서의 종양 감소를 확인하기 위한 데이터를 보여주는 것이다. GP75 결합 CFP를 발현하는 골수 세포로 동계 마우스 모델을 생성하였다. 마우스 항GP75(Trp-1) ATAK 세포의 생성은 도 29에 제시되어 있다. 좌측 하단 패널의 유세포 분석법 플롯에서 입증되는 바와 같이, ATAK-GP75 수용체는 mRNA의 전기천공을 통해 마우스 단핵구에서 효율적으로 발현된다. 이들 세포는 GP75 발현 종양 세포를 효율적으로 식세포작용을 통해 포식할 수 있었다(도 29 우측 하단 그래프). 유사한 데이터가 각 CFP를 발현하는 마우스에서의 종양 감소 및 생존 이익을 도시한 도 30, 및 도 36 및 37의 데이터에 의해 확증된다. 도 30은 CAR T & 체크포인트 억제제에 불응성인 종양 모델에서 종양 성장을 억제시킬 수 있는 ATAK 골수 세포의 효력에 관한 제1 생체내 예시를 나타낸 것이다. 비히클 대비 2x106 ATAK 세포 8회 주입. 매일 x4 주입, 3일 휴약기, 매일 x4 +/- SD(만 휘트니 검정). s.c. 인식된 GP75+ B16 흑색종 종양을 보유하는 면역적격 C57Bl/6 마우스(상기 마우스는 B16 동계 종양에 대해 내성을 띤다) 내로 GP-75 ATAK 단핵구를 i.v. 주사하였을 때, 이때 마우스는 종양 성장을 제어할 수 있고, 비히클 또는 대조군 단핵구를 투여받은 마우스와 비교하여 유의적으로 개선된 생존을 경험할 수 있었다. 추가로, 동물로부터 종양을 제거하고, 면역 세포 함량을 조사하였을 때, GP75-ATAK 단핵구로 처리된 동물은 염증성 단핵구/대식세포 및 호중구에 의한 종양 침윤 수준이 훨씬 더 높았고, MDSC 대비 수지상 세포의 증가도 나타났다. 이는 ATAK 단핵구가 종양 부위로 이동하고, 종양 성장을 억제하고, 다른 면역 세포 집단을 TME로 모집한다는 것을 입증하였다.
도 21은 구체적으로 CFP를 발현하는 골수 세포로 마우스를 처리하는 것이 CD4 에피토프 확산을 비롯한, 비장 재자극 배양물에서의 광범위한 T 세포 활성과 연관이 있다는 것을 보여주는 것이다. 본 실험에서, 비장 세포 회상 배양을 수행하였고, 여기서, 비장 세포를 OVA323 * 329SINFECKEL("SINFECKEL"은 서열 번호 86으로 개시) 또는 PMA/이오노마이신으로 6시간 동안 자극시켰다. 사이토카인을 유세포 분석법으로 검출하였다. GP75-ATAK 세포 처리는 교차 제시를 나타내는 것인, 비항원 특이 활성 증가와 연관이 있었다.
골수 세포 및 일부 CD3+ 세포에서 양성 CFP 발현이 확인되었다(도 23 및 도 24). 증가된 식세포작용 및 사이토카인 분비 또한 도 31, 32, 33 및 35에 제시된 데이터에서 분명히 나타난다. 도 31에 제시된 바와 같이, 단핵구는 추가로 종양 및 비장 내부에서 DC 및 성숙한 단핵구가 되었다. 도 32에 제시된 혈청 사이토카인 수준은 반응자의 광범위한 골수 활성을 나타낸다. 치료 반응은 항종양 혈청 사이토카인 프로파일과 상관관계가 있었다. 다른 중요한 관찰결과는 ATAK 단핵구에 의한 종양 항원의 교차 제시였다(도 33). ATAK 골수 세포는 신생항원을 식세포작용을 통해 포식하고, 유리시키고, T 세포에 제시하여 적응 T 세포 면역 반응을 일으킬 수 있다. ATAK-GP75(일명 TRP-1 ATAK) 단핵구는 대용 종양 신생항원(이 경우 OVA 단백질로부터 유래)을 식세포작용을 통해 포식하고, 프로세싱하고, OVA로부터 유래된 클래스 I 제한 펩티드(SIINFEKL(서열 번호 87))에 대한 동족 TCR을 보유하는 T 세포에 제시할 수 있지만, ATAK 수용체를 발현하지 않는 동일한 마우스로부터의 단핵구는 상기와 같이 포식, 프로세싱 및 제시하지 못한다. 이는 ATAK 단핵구가 항원을 프로세싱하고, 적응 면역 세포, 예컨대, CD8 T 세포에 교차 제시할 수 있다는 것을 증명하는 것이다. 이는 추가로 T 세포의 잠재적인 새로운 서브세트가 생체내에서 상기 골수 세포의 기능을 통해 자극을 받을 수 있다는 것을 나타내며, 따라서, T 세포와 같은 다른 면역 세포 유형에 의한 치료와 달리 더 넓은 면역학적 적용범위를 입증한다.
생체내 골수 세포에서의 구성물의 우선적 발현은 도 38에 도시된 데이터에서 확증되었다.LNP-FcRα 쇄 수용체 수용체는 TME 내의 염증성 단핵구에 의해 발현되었으며, 15% 초과의 종양 골수 세포가 GP-75-FcaR 구성물을 발현한다.
실시예 11. 생체내 CFP 발현 변형에 의한 미세환경 변형
본 실시예에서, 염증성 유전자 발현을, 염증유발성 사이토카인 및 케모카인의 발현, (TME의 히팅), 및 도 34(우측 상단)와 함께, CFP 구성물이 종양 미세환경을 활성 염증 부위로 전환시킨다는 것을 나타내는 생체내 종양 샘플로부터 프로파일링하였다. 도 27 및 도 34는 생체내 CFP 주사가 T 세포를 유도할 수 있다는 것을 나타내는 데이터를 보여주는 것이다. 도 34는 본원에 개시된 인간 ATAK 단핵구가 선천 면역을 이용하고, 적응 항종양 면역 반응을 자극시킬 수 있다는 것을 입증한다. 조작된 인간 세포 생성물이 주요 기능성 기전을 가지고 있다는 것이 확인되었음을 나타내는 주요 요약 사항은 하기에 열거되어 있다.
종양 투과 & 인식
· 투과
· 축적
· 종양 인식
신호전달 역학
· 골수 세포 활성화
· 사이토카인 생산
· 케모카인 생산
· 염증성 분극화
직접적인 종양 살해
· 식세포작용
· 사이토카인
· 사멸 수용체(CD95L)
장기 종양 제어
· 항원 제시
· 에피토프 확산
· T 세포 인게이지먼트.
제시된 데이터에 따르면, 도 39에 제시된 바와 같이, 골수 세포가 염증성 단핵구 및 DC 증가와 함께 종양 미세환경을 변경시키는 능력을 갖는다는 것으로 명백하다. 도 39의 데이터는 염증성 단핵구(좌측) 및 수지상 세포(우측)의 상향조절을 보여주는 것이다. 추가로, 상기 세포는 T 세포 기능에 영향을 미친다. 종합하면, 본 출원인이 아는 한, 치료 가능성 및 관련성의 이러한 극적인 효과는 이전에 달성되거나 입증된 적이 없었다.
실시예 12. 마우스에서 처리 후 생체내 T 세포의 특징규명.
도 40-도 60에 제시된 데이터는 전달을 위한 LNP 조성물의 사용을 포함한다. 도 40은 꼬리 정맥 주사를 통한 마우스에서의 CFP 처리에 의한 CD8+ T 세포의 상향조절을 보여주는 것이다. T 세포 서브세트 표현형 조사 결과는 도 41에 사이토카인 프로필과 함께 제시되어 있다. T 세포 서브세트 표현형의 조사 결과는 도 42에 케모카인 프로필과 함께 제시되어 있다. 본원에서 논의된 연구에서, GP75 종양을 보유하는 동계 마우스에 매 4일마다 1회 또는 격일로 1회 투여하였고, 종양 크기를 측정하여 종양 진행을 결정하였다. 도 43에 제시된 바와 같이, 두 처리군 모두 대조군에 비해 종양 진행의 효율적인 억제를 보였다. 도 44는 T 세포 서브타입을 연구하기 위한 게이팅 전략법을 보여주었다.
T 세포 서브타입 분석 결과, 종양에서 CD8+ 세포의 높은 유도 및 Treg의 감소가 나타났다(도 45). T 세포 고갈 마커(PD1)의 저하와 함께 T 세포 활성화 마커의 상승이 T 세포에서 관찰되었다(도 46a 및 46b, 도 47a 및 47b, 도 48a 및 48b).
실시예 13. 마우스에서 처리 후 생체내 골수 세포의 특징규명.
추가로, 도 49에 제시된 게이팅 전략법을 이용하여, 비처리된 GP75 마우스 대비 처리된 GP75 마우스로부터 단리시킨 후, 림프구, DC 등을 비롯한 모든 세포 유형을 프로파일링하였다. 전반적으로 면역세포 빈도는 현저한 변화를 보이지 않았다(도 50). 골수 및 수지상 세포는 수용체 구성물의 높은 발현을 나타낸다. 도 51-53에 제시된 바와 같이, 다양한 세포 유형에서 발현이 특징규명되고, 이는 골수 세포가 LNP 제제를 통해 전달된 구성물의 현저한 발현을 보인다는 것을 나타낸다. 도 54는 50% 초과의 상주 골수(Ly6Clo)세포에서의 수용체 발현을 보여주는 것이다. 도 55는 마우스에서의 처리가 Ly6Chi 및 CCR2hi 염증성 단핵구에서 CD40 및 CD206 수준을 유의적으로 증가시켰다는 것을 나타내는 데이터를 도시한 것이다.
도 56에 제시된 바와 같이, CD40 및 CD206 수준은 Ly6Clo 및 CCR2lo 상주 골수 세포에서 유의적으로 증가되고; PDL1 수준은 종양 상주 대식세포에서 약간 감소하였다(도 57). 도 58은 처리가 비장에서 MHCII, CD86 및 CD40을 비롯한 DC 활성화 마커를 유의적으로 증가시켰을 뿐만 아니라, CD103+CD11b- 수지상 세포 표현형에서 PD-L1 수준도 증가시켰다는 것을 보여주는 것이다. 도 59는 처리가 비장에서 MHCII, CD86 및 CD40을 비롯한 DC 활성화 마커를 유의적으로 증가시켰을 뿐만 아니라, CD103-CD11b+ 수지상 세포 표현형에서 PD-L1 수준도 증가시켰다는 것을 보여주는 것이다.
실시예 14. 프로테아제 모집 티로신 인산화 도메인 및 프로테아제 유도성 전사 활성인자를 갖는 키메라 융합 단백질 라이브러리의 생성
본 실시예에서, 대식세포 또는 골수 세포에서 발현될 때, 골수 세포의 표적 세포 특이적 활성화를 허용하고, 이어서, 골수 세포가 그의 예상되는 기능을 수행하여 표적 세포에 대한 면역원성 반응 및 표적 세포 파괴를 유도하는 표적 특이적, 프로그래밍 가능한 발현 벡터를 디자인한다. 벡터는 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 발현 벡터일 수 있다. 표적 세포는 암 세포이다. 본 실시예에서, 예시적인 골수 세포 발현 벡터를 제조하기 위한 조성물 및 방법이 설명되며, 여기서, 발현 벡터는 암 특이적 세포외 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 포스포티로신 결합 단백질(PTB)을 모집하는 티로신 인산화 및 활성화 모이어티(ITAM 도메인)를 갖는 세포내 도메인을 갖는 막 단백질을 코딩하는 반면, 세포내 도메인은 포스포티로신 결합 프로테아제 절단가능한 서열을 통해 전사 활성인자 도메인 및 HIF-데그론 서열에 융합된 프로테아제(예컨대, T2A 절단 프로테아제)(HIF-데그론-프로테아제)에 연결된다. 발현 벡터는 전사 활성인자에 의해 활성화될 수 있는 표적 유전자 서열을 코딩한다. 표적 유전자 또는 이들의 단편은 염증유발성 또는 식세포작용유발성 단백질 또는 단백질 단편이다. 벡터는 전사 활성화를 위해 선택된 임의의 표적 유전자를 사용하는 유연성을 유지하도록 디자인될 수 있다. 예시적인 대식세포 발현 벡터는 도 60에 명시된 바와 같이 디자인된다.
벡터는 5'에서 3'으로 하기 (a) 막횡단 국재화를 허용하는 N-말단 신호 서열을 갖는 세포외 암 세포 결합 도메인, (b) 막횡단 도메인, (c) 포스포티로신 활성화/모집 도메인(예컨대, ITAM)을 포함하는 세포내 도메인; (d) 포스포티로신 결합 단백질(PTB) 의존성 프로테아제의 기질인 절단가능한 서열에 의해 세포내 도메인 코딩 서열에 연결된, GAL4 DNA 결합 서열 및 VP64 전사 활성인자를 포함하는 DNA 결합 도메인 및 전사 활성화 인자, (e) 예시적인 구성물에서 PTB-HIF 데그론에 융합된 HCV 비구조 프로테아제(NS3)인 포스포티로신 PTB 의존성 프로테아제(PTB-HIF-NS3 서열은 T2A 절단가능하다)를 코딩하는 서열을 각각 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 포스포티로신 결합 단백질(PTB) 의존성 프로테아제의 기질인 절단가능한 서열은 EDVVCC(서열 번호 36) 또는 DEMEEC(서열 번호 37)이다. 제2 벡터 구성물을 사용하여 표적 표적를 코딩하는 서열을 공동 발현하고, 그의 전사는 상류에 코딩된 전사 활성화 인자에 의해 활성화된다. 표적 유전자는 상류 GAL4 결합 및 활성화 도메인과 함께 CMV 미니프로모터에 의해 구동된다. 세포외 암 세포 결합 모이어티를 코딩하는 핵산 서열은 예시적인 구성물에서, CD19 결합 scfv이지만, 암 세포, 또는 표적 세포 상에서 특이적으로 발현되는 또 다른 단백질에 대해 특이적인 scfv일 수 있는 scfv 항체를 코딩한다. 전사 결합 및 활성화 인자는 CMV 프로모터 상류의 GAL-4 DNA 결합 영역을 통해 결합할 수 있는 VP64 서열에 융합된 5X GAL4 서열을 포함하고, 이로써, 표적 유전자의 전사를 활성화시킨다. PTB-HIF 및 인접 프로테아제 서열은 T2A 절단가능한 서열 측면에 위치하고, T2A 프로테아제에 의해 자가 절단가능하며, 이로써, 번역 후에는 프로테아제를 방출한다.
본 실시예에 제시된 다양한 부분을 코딩하는 벡터 디자인은 달리 다양하게 디자인될 수 있다. 예를 들어, 폴리시스트론 디자인 또는 다중 벡터 디자인이 본원에서 동등하게 고려된다.
상기 기술된 성분이 공동 발현되는 모듈식 벡터 디자인은 대식세포 매개 식세포작용의 활성화 및 강화 및 표적 세포의 살해를 야기할 수 있는 CMV 프로모터 하류의 표적 유전자의 유연한 도입을 위한 길을 열어준다. 예시적인 표적 유전자는 염증성 유전자, 인플라마좀 활성화 유전자, 사이토카인, 케모카인, REDOX 유전자이다.
세포외 및 세포내 도메인 및 절단가능한 단위의 기본 구조 레이아웃은 도 61a에 제시되어 있다. 상기 기술된 구성물은 대식세포에서 발현된다. 발현 후, 성숙한 단백질의 번역 및 방출 후 예상되는 작용 모드가 도 61b에 제시되어 있다. PTB 및 ITAM 상호 작용을 통해 세포내 도메인 상의 포스포티로신 결합 요소에 결합하면, HIF-데그론은 비활성화되고, 프로테아제의 적절한 기능을 허용하여 전사 인자의 절단 및 방출을 허용한다. ITAM과의 회합이 없는 경우, 데그론은 도 2b에 제시된 바와 같이 HIF-프로테아제 요소의 분해를 담당한다. 따라서, ITAM은 예컨대, 암 세포 상의 그의 CD19 표적에 결합된 scfv와 같은 세포외 도메인으로부터 신호를 받을 때에만 활성화되고, PTB를 모집하기 때문에, 상기 기능은 전사 인자의 암 세포 특이적 활성화를 허용하고, 차례로 CMV 프로모터에 의해 구동되는 특정 표적 유전자 전사를 허용한다.
실시예 15. 종양 활성화 호산구 용해 단백질의 생성
본 실시예에서, 호산구 용해 단백질은 표적 세포, 예컨대, 암 세포를 용해시킬 수 있는 조작된 대식세포 또는 골수 세포를 제조하는 데 사용된다. 상기 실시예에 명시된 바와 같이, 예시적인 발현 벡터는 구성되고, 대식세포에서 발현되는 반면; 발현 벡터는 표적 특이성을 허용하고, 세포 용해서 기능 실행을 위해 프로그래밍 가능하다.
구성 디자인은 도 62a에 제시되어 있다. 본질적으로, 벡터는 인간 호산구 주요 결합 단백질 1의 산성 도메인(아미노산 잔기 17-105)을 코딩하는 서열; 인간 호산구 주요 결합 단백질 1의 세포독성 도메인(아미노산 잔기 106-222)을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 키메라 단백질을 코딩하고; 호산구 주요 결합 단백질의 두 도메인 사이의 프레임 내에 산재된 서열은 동족 MMP에 의해 절단가능한 매트릭스 메탈로프로테아제 단백질(MMP) 인식 서열을 코딩하는 서열이다. 키메라 단백질 코딩 서열은 대식세포성 세포 밖으로의 키메라 단백질의 분비를 허용하는 신호 펩티드를 코딩하는 서열 뒤에 위치한다. 대식세포로부터 분비되는 것과 같은 성숙한 키메라 단백질은 예시적인 도 62b에 제시되어 있다. 산성 도메인 및 세포독성 도메인은 MMP에 의해 결합된 조밀한 쌍 구성을 형성하는 반면, 산성 도메인 결합 형태는 세포독성 도메인을 비활성 상태로 유지시킨다.
종양 미세환경에는 MMP가 풍부하기 때문에, MMP 인식 절단가능한 도메인을 갖는 분비된 키메라 단백질은 쉽게 절단되어, 세포독성 도메인으로부터 산성 도메인을 방출하고, 따라서, 세포독성 도메인을 유리시켜 용해 활성을 수행한다. 종양 세포는 환경에 풍부하고, 방출된 호산구 주요 염기성 단백질 세포독성 도메인 단백질에 의해 공격, 용해 및 손상되는 반면, 근처의 대식세포는 용해 및/또는 손상된 세포를 더 쉽게 식세포작용을 통해 포식하고, 스케빈징한다. 한편, 대식세포는 추가 단백질, 키메라 수용체 및 또는 표적 세포 테더링 모이어티를 추가로 발현하여 암 세포에 대한 분비된 호산구 주요 염기성 단백질의 효과를 강화시킬 수 있다.
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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 34 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln 115 120 125 Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser 130 135 140 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val 145 150 155 160 Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr 165 170 175 Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala 180 185 190 Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser 195 200 205 Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Phe 210 215 220 Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 35 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 35 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro 130 135 140 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys 145 150 155 160 Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 180 185 190 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val 225 230 235 240 Glu Ile Lys Arg <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Hepacirivirus C <400> 36 Glu Asp Val Val Cys Cys 1 5 <210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> Hepacirivirus C <400> 37 Asp Glu Met Glu Glu Cys 1 5 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Gly Tyr Thr Met Asn 1 5 <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Gly Ser Tyr Gly Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 41 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 41 Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser 1 5 10 15 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Met Lys Gln Gly His 20 25 30 Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly 35 40 45 Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp 50 55 60 Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu 65 70 75 80 Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Tyr Gly Ser Ser Tyr 85 90 95 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5 <210> 43 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Arg Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Asn Ser Phe Val Tyr 1 5 10 <210> 45 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 45 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Leu Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 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Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Leu Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Asn Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Ser Gly Asn Tyr Val Met Asp Tyr 1 5 <210> 56 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 56 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala His 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 57 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Gly Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Gln Gln Tyr Tyr Asn Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 60 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 60 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Gly 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 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Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Arg 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 65 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 15 <210> 66 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 66 Phe Ala Ser Tyr Leu Glu Ser 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 67 Pro Val Glu Glu Glu Phe Pro Arg Thr 1 5 <210> 68 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 68 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Phe Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 69 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 69 Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 70 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 70 Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 71 Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 72 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 72 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 73 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 73 Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln 1 5 10 15 <210> 74 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 74 Gly Ala Ser Asn Val Glu Ser 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 75 Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 76 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 76 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr 20 25 30 Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 77 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 1 5 10 15 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 20 25 30 Leu Tyr Phe Ser Val 35 <210> 78 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 1 5 10 15 Val <210> 79 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu 1 5 10 15 Tyr Phe Ser Val 20 <210> 80 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp Lys Asp His Lys Phe 1 5 10 15 Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 20 25 <210> 81 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Ile His Gln Asp Tyr Thr Thr Gln Asn Leu Ile Arg Met Ala Val Ala 1 5 10 15 Gly Leu Val Leu Val Ala Leu Leu Ala Ile Leu Val 20 25 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Ile His Gln Asp Tyr Thr Thr Gln Asn 1 5 <210> 83 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Leu Ile Arg Met Ala Val Ala Gly Leu Val Leu Val Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ile Leu Val <210> 84 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Glu Asn Trp His Ser His Thr Ala Leu Asn Lys Glu Ala Ser Ala Asp 1 5 10 15 Val Ala Glu Pro Ser Trp Ser Gln Gln Met Cys Gln Pro Gly Leu Thr 20 25 30 Phe Ala Arg Thr Pro Ser Val Cys Lys 35 40 <210> 85 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 wwwuauuuau uuw 13 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 86 Ser Ile Asn Phe Glu Cys Lys Glu Leu 1 5 <210> 87 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 87 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5

Claims (129)

  1. (a) (i) 막횡단 도메인, 또는
    (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인
    을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및
    (b) 표적 세포 상의 CD137에 특이적으로 결합할 수 있는 CD137 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인
    을 포함하고, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인이 작동가능하게 연결된 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물.
  2. (a) 표적 세포 상의 CD137 항원에 특이적으로 결합하는 제1 CD137 항원 결합 도메인, 및 (b) 골수 세포 상의 표면 작용제에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 제1 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 CD137 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 표면 작용제에 결합하는 것인 조성물.
  3. (a) (i) 막횡단 도메인, 또는 (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 (b) 표적 세포 상의 Claudin 18.2에 특이적으로 결합할 수 있는 Claudin 18.2 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하고; 세포외 도메인 및 막횡단 도메인이 작동가능하게 연결된 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물.
  4. (a) 표적 세포 상의 Claudin 18.2 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Claudin 18.2 항원 결합 도메인, 및 (b) 골수 세포 상의 표면 작용제에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 제1 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 Claudin 18.2 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 표면 작용제에 결합하는 것인 조성물.
  5. (a) (i) 막횡단 도메인, 또는 (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 (b) 표적 세포 상의 Claudin 3에 특이적으로 결합할 수 있는 Claudin 3 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하고; 세포외 도메인 및 막횡단 도메인이 작동가능하게 연결된 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물.
  6. (a) 표적 세포 상의 Claudin 3 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Claudin 3 항원 결합 도메인, 및 (b) 골수 세포 상의 표면 작용제에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 제1 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 Claudin 18.2 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 표면 작용제에 결합하는 것인 조성물.
  7. (a) (i) 막횡단 도메인, 또는 (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 (b) 표적 세포 상의 CD70에 특이적으로 결합할 수 있는 CD70 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하고; 세포외 도메인 및 막횡단 도메인이 작동가능하게 연결된 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물.
  8. (a) 표적 세포 상의 CD70 항원에 특이적으로 결합하는 제1 CD70 항원 결합 도메인, 및 (b) 골수 세포 상의 표면 작용제에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 제1 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 CD70 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 표면 작용제에 결합하는 것인 조성물.
  9. (a) (i) 막횡단 도메인, 또는 (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 (b) 표적 세포 상의 TROP2에 특이적으로 결합할 수 있는 TROP2 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하고; 세포외 도메인 및 막횡단 도메인이 작동가능하게 연결된 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물.
  10. (a) 표적 세포 상의 TROP2 항원에 특이적으로 결합하는 제1 TROP2 항원 결합 도메인, 및 (b) 골수 세포 상의 표면 작용제에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 제1 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 TROP2 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 표면 작용제에 결합하는 것인 조성물.
  11. (a) (i) 막횡단 도메인, 또는 (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 (b) 표적 세포 상의 TMPRSS에 특이적으로 결합할 수 있는 TMPRSS 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하고; 세포외 도메인 및 막횡단 도메인이 작동가능하게 연결된 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물.
  12. (a) 표적 세포 상의 TMPRSS 항원에 특이적으로 결합하는 제1 TMPRSS 항원 결합 도메인, 및 (b) 골수 세포 상의 표면 작용제에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서; 제1 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 TMPRSS 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인은 골수 세포 상의 표면 작용제에 결합하는 것인 조성물.
  13. (a) (i) 막횡단 도메인, 및 (ii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체(PR) 서브유닛; 및 (b) 표적 세포의 항원에 대한 강한 결합 친화성을 갖는, 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 및 제11항 중 어느 한 항의 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하고, 막횡단 도메인 및 세포외 도메인이 작동적으로 연결된 PR 융합 단백질(PFP)을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 조성물로서, PFP가 표적 세포의 항원에 결합할 때, PFP를 발현하는 세포의 살해 또는 식세포작용 활성은 PFP를 발현하지 않는 세포와 비교하여 적어도 20% 초과만큼 증가되는 것인 조성물.
  14. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 식세포 또는 테더링 수용체로부터 유래되거나, 또는 세포내 신호전달 도메인이 식세포작용 활성화 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  15. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 염증유발성 신호전달 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  16. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 및 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 염증유발성 신호전달 도메인이 키나제 활성화 도메인 또는 키나제 결합 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  17. 제11항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 및 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 PI3 키나제 모집 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  18. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 및 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 염증유발성 신호전달 도메인이 IL-1 신호전달 캐스케이드 활성화 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  19. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 및 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 염증유발성 신호전달 도메인이 TLR3, TLR4, TLR7, TLR 9, TRIF, RIG-1, MYD88, MAL, IRAK1, MDA-5, IFN 수용체, NLRP 패밀리 구성원, NLRP1-14, NOD1, NOD2, 피린(Pyrin), AIM2, NLRC4, FCGR3A, FCERIG, CD40, 카스파제 도메인 또는 프로카스파제 결합 도메인 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  20. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 및 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, CD2, CD8, CD28 또는 CD68 단백질 TM 도메인으로부터 유래된 막횡단 도메인을 추가로 포함하는 조성물.
  21. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 및 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지 도메인을 추가로 포함하는 조성물.
  22. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 및 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, PFP가 표적 세포의 항원에 결합할 때, PFP를 발현하는 세포의 살해 활성이 PFP를 발현하지 않는 세포와 비교하여 적어도 20% 초과만큼 증가되는 것인 조성물.
  23. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 및 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, PFP가 표적 세포의 항원에 결합할 때, PFP를 발현하는 세포의 살해 활성이 PFP를 발현하지 않는 세포와 비교하여 적어도 1.1배만큼 증가되는 것인 조성물.
  24. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 치료제를 포함하는 조성물로서, 치료제는
    표적 세포 상의 항원과 특이적으로 상호작용하는 제1 항체 또는 이들의 기능성 단편인 제1 결합 도메인, 및
    골수 세포와 특이적으로 상호작용하는 제2 항체 또는 이들의 기능성 단편인 제2 결합 도메인
    을 포함하고;
    (i) 제1 치료제가 제1 성분에 커플링되고, 제1 성분이 추가 치료제 또는 제3 결합 도메인이거나, 또는
    (ii) 조성물이 추가 치료제를 포함하는 것인 조성물.
  25. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항 및 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 (a) 표적 세포의 항원과 특이적으로 상호작용하는 제1 결합 도메인, (b) 골수 세포와 특이적으로 상호작용하는 제2 결합 도메인, 및 (c) 골수 세포와 특이적으로 상호작용하는 제3 결합 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제의 결합 도메인 중 어느 하나가 항체의 결합 도메인, 항체의 기능성 단편, 이들의 가변 도메인, VH 도메인, VL 도메인, VNAR 도메인, VHH 도메인, 단일 쇄 가변 단편(scFv), Fab, 단일 도메인 항체(sdAb), 나노바디, 이중특이적 항체, 디아바디, 또는 기능성 단편 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 도메인이 결합하는 표적 세포 상의 항원이 표적 세포 상의 암 항원 또는 병원성 항원 또는 자가면역 항원인 조성물.
  28. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항 및 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 치료제는 길이가 1000개 미만의 아미노산 또는 1000 nm 미만인 폴리펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  29. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항, 제24항 및 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 치료제는 길이가 500개 미만의 아미노산 또는 500 nm 미만인 폴리펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  30. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항, 제24항, 제28항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 치료제는 길이가 200-1000개의 아미노산 또는 200-1000 nm인 폴리펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  31. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항, 제24항, 및 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 치료제의 결합 도메인의 인게이지먼트(engagement)가 암 세포를 골수 세포에 접촉시키는 것인 조성물.
  32. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항, 제24항, 및 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인이 골수 세포와 특이적으로 상호작용하고, 골수 세포의 식세포작용 활성을 촉진시키는 것인 조성물.
  33. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항, 제24항, 및 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인이 골수 세포와 특이적으로 상호작용하고, 골수 세포의 염증성 신호전달을 촉진시키는 것인 조성물.
  34. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항, 제24항, 및 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인이 골수 세포 또는 부착 분자와 특이적으로 상호작용하고, 골수 세포의 표적 세포에의 부착을 촉진시키는 것인 조성물.
  35. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항, 제24항, 및 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인이 골수 세포와 특이적으로 상호작용하고, 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항식세포 활성을 억제시키는 것인 조성물.
  36. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항, 제24항, 및 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인이 골수 세포와 특이적으로 상호작용하고, 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항염증성 활성을 억제시키는 것인 조성물.
  37. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항, 제24항, 및 제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인 및/또는 제3 결합 도메인이 골수 세포의 식세포 활성을 촉진시키는 것인 조성물.
  38. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항, 제24항, 및 제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인 및/또는 제3 결합 도메인이 골수 세포의 염증성 신호전달을 촉진시키는 것인 조성물.
  39. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항, 제24항, 및 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인 및/또는 제3 결합 도메인은 골수 세포 또는 부착 분자와 특이적으로 상호작용하고, 골수 세포의 표적 세포에의 부착을 촉진시키는 것인 조성물.
  40. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항, 제24항, 및 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인 및/또는 제3 결합 도메인이 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항식세포 활성을 억제시키는 것인 조성물.
  41. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항, 제24항, 및 제28항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인 및/또는 제3 결합 도메인이 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항염증성 활성을 억제시키는 것인 조성물.
  42. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항, 제24항, 및 제28항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 결합 도메인 또는 추가 치료제가 CD47 길항제, CD47 차단제, 항체, 키메라 CD47 수용체, 시알리다제, 사이토카인, 염증유발성 유전자, 프로카스파제, 또는 항암제를 포함하는 것인 조성물.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 도메인, 제2 결합 도메인 및 제3 결합 도메인이 별개의 비동일한 표적 항원에 결합하는 것인 조성물.
  44. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항, 제24항, 및 제28항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 도메인, 제2 결합 도메인 또는 제3 결합 도메인이 리간드 결합 도메인인 조성물.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 도메인, 제2 결합 도메인 또는 제3 결합 도메인이 하나 이상의 링커에 의해 작동가능하게 연결된 것인 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 링커가 폴리펩티드인 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 링커가 기능성 펩티드인 조성물.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 수용체에 대한 리간드인 조성물.
  49. 제45항에 있어서, 링커가 단핵구 또는 대식세포 수용체에 대한 리간드인 조성물.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 수용체를 활성화시키는 것인 조성물.
  51. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 수용체를 억제시키는 것인 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 링커가 M2 대식세포 수용체에 대한 리간드인 조성물.
  53. 제48항 또는 제49항에 있어서, 링커가 TLR 수용체, 예컨대, TLR4에 대한 리간드인 조성물.
  54. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 TLR 수용체를 활성화시키는 것인 조성물.
  55. 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 도메인, 제2 결합 도메인 및/또는 제3 결합 도메인이 결합 도메인에 결합하는 마스크와 회합되는 것인 조성물.
  56. 제55항에 있어서, 마스크가 각각의 결합 도메인과 회합된 상태로 유지될 때, 마스크가 결합 도메인의 그의 표적에의 상호작용을 억제시키는 억제제인 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 마스크가 펩티드 링커를 통해 결합 도메인과 회합되는 것인 조성물.
  58. 제57항에 있어서, 펩티드 링커가 절단가능한 모이어티를 포함하는 것인 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 절단가능한 모이어티가 암 또는 종양 부위에 선택적으로 풍부한 단백질 또는 효소에 의해 절단되는 것인 조성물.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 핵산이 RNA인 조성물.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 핵산이 mRNA인 조성물.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 핵산이 하나 이상의 지질과 회합되는 것인 조성물.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 핵산이 리포솜에 캡슐화되는 것인 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 리포솜이 나노입자인 조성물.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 핵산이 벡터에 포함되는 것인 조성물.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항의 조성물의 재조합 핵산 중 어느 하나, 및 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  67. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항의 재조합 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물.
  68. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항의 재조합 핵산을 포함하는 세포.
  69. 제68항에 있어서, 골수 세포인 세포.
  70. 제69항에 있어서, CD14+, CD16-인 세포.
  71. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항의 재조합 핵산을 포함하는 세포 집단을 포함하는 약학 조성물로서, 적어도 50%의 세포는 CD14+CD16-인 약학 조성물.
  72. 제71항에 있어서, 10% 미만의 세포가 수지상 세포인 약학 조성물.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 적합한 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항의 조성물을 제조하는 방법.
  75. 피험체에게 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 암을 치료하는 방법.
  76. 피험체에게 제66항, 제67항, 및 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 암을 치료하는 방법.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 암이 위암, 난소암, 신장암, 유방암, 전립선암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 교모세포종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  78. (a) 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 및
    (b) 세포외 도메인에 작동적으로 연결된 막횡단 도메인
    을 포함하는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산을 포함하는 조성물로서,
    막횡단 도메인은 골수 세포에서 내인성 FcR-감마 수용체와 이량체화하는 단백질로부터의 막횡단 도메인이고; 재조합 폴리핵산은 나노입자 전달 비히클에 의해 캡슐화되고; 인간 피험체에게로의 조성물 투여 후, CFP가 인간 피험체의 골수 세포의 표면 상에 발현되는 것인 조성물.
  79. 제78항에 있어서, 항원 결합 도메인이 Fab 단편, scFv 도메인 또는 sdAb 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  80. 제78항에 있어서, 막횡단 도메인이 CD8, CD16a, CD64, CD68 또는 CD89로부터의 막횡단 도메인인 조성물.
  81. 제78항에 있어서, 세포외 도메인이 CD8로부터 유래된 힌지 도메인을 추가로 포함하고, 힌지 도메인이 막횡단 도메인 및 항원 결합 도메인에 작동적으로 연결되는 것인 조성물.
  82. 제78항에 있어서, 막횡단 도메인이 골수 세포, 단핵구 또는 대식세포에서 내인성 FcR-감마 수용체와 이량체화하는 단백질로부터의 막횡단 도메인이고; 인간 피험체에게로의 약학 조성물 투여 후, CFP는 인간 피험체의 골수 세포, 단핵구 또는 대식세포에서 특이적으로 발현되는 것인 조성물.
  83. 제78항에 있어서, 막횡단 도메인이 CD16a, CD64, CD68 또는 CD89로부터의 막횡단 도메인인 조성물.
  84. 제78항에 있어서, CFP가 세포내 도메인을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  85. 제84항에 있어서, 세포내 도메인이 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인이 FcγR, FcαR, FcεR, CD40 또는 CD3제타로부터의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  86. 제84항에 있어서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인이 포스포이노시티드 3 키나제(PI3K) 모집 도메인을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  87. 제86항에 있어서, PI3K 모집 도메인이 서열 번호 26과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조성물.
  88. 제84항에 있어서, 세포내 도메인이 CD16a, CD64, CD68 또는 CD89로부터의 세포내 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  89. 제78항에 있어서, 재조합 폴리핵산이 mRNA인 조성물.
  90. 제78항에 있어서, 나노입자 전달 비히클이 지질 나노입자를 포함하는 것인 조성물.
  91. 제90항에 있어서, 지질 나노입자가 극성 지질을 포함하는 것인 조성물.
  92. 제90항에 있어서, 지질 나노입자가 비극성 지질을 포함하는 것인 조성물.
  93. 제90항에 있어서, 지질 나노입자의 직경이 100 내지 300 nm인 조성물.
  94. 제78항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인이 TROP2, GPC3, CD5, HER2, CD137, CD70, Claudin 3, Claudin 18.2, TMPRSS, CD19, CD22, CD7 및 GP75로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합하는 것인 조성물.
  95. 제78항 내지 제94항 중 어느 한 항의 조성물, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  96. 제95항에 있어서, 유효량의 제78항 내지 제94항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하고, 암을 앓는 인간 피험체에게 투여되었을 때 암 성장을 억제시키는 약학 조성물.
  97. 피험체에게 제95항 또는 제96항의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 피험체에서 암을 치료하는 방법.
  98. 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산의 존재하에서 골수 세포를 전기천공시키는 단계를 포함하는, 제78항 내지 제94항 중 어느 한 항의 조성물을 골수 세포 내로 도입하는 방법으로서, CFP는 (a) 항TROP2 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 및 (b) 세포외 도메인에 작동적으로 연결된 막횡단 도메인을 포함하고; 재조합 폴리핵산은 (i) 골수 세포에 존재하거나, 또는 (ii) 나노입자 전달 비히클에 의해 캡슐화되고; 재조합 폴리핵산은 인간 피험체의 골수 세포에서의 재조합 폴리핵산의 발현을 위해 구성되는 것인 방법.
  99. (a) 서열 번호 34 및 서열 번호 35에 기재된 서열 중 적어도 하나, 또는 서열 번호 34 또는 서열 번호 35와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 항TROP2 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인;
    (b) FcγR1 분자(CD64), FcγRIIIA 분자(CD16), 또는 FcαR1 분자(CD89)의 막횡단 도메인으로부터의 서열을 포함하는, 세포외 도메인과 작동가능하게 연결된 막횡단 도메인; 및
    (c) 임의로, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인에 작동가능하게 연결되고, CD16 단백질, CD64 단백질 또는 CD89 단백질로부터의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 도메인, 또는 CD8α 힌지 도메인
    을 포함하는 키메라 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산을 포함하는 조성물.
  100. 제99항에 있어서, 서열 번호 26, 27 또는 28에 기재된 서열로부터 선택되는 아미노산 서열; 또는 서열 번호 26, 27 또는 28에 기재된 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 세포내 도메인, 및 임의로, CD16 단백질, CD64 단백질 또는 CD89 단백질 또는 이들의 단편으로부터의 세포내 도메인을 추가로 포함하는 조성물.
  101. 제99항 또는 제100항에 있어서, 재조합 폴리핵산이 mRNA인 조성물.
  102. 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하고, CD14+ 세포인 세포.
  103. 질환 또는 장애 치료에서의, 제1항 내지 제65항, 제78항 내지 제94항 및 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제66항, 제67항, 제71항 내지 제73항, 제95항 및 제96항 중 어느 한 항의 약학 조성물, 또는 제68항 내지 제70항 및 제102항 중 어느 한 항의 세포의 용도.
  104. 피험체에서의 암 치료에서의, 제66항, 제67항, 제71항 내지 제73항, 제95항 및 제96항 중 어느 한 항의 약학 조성물, 또는 제68항 내지 제70항 및 제102항 중 어느 한 항의 세포의 용도.
  105. 제103항 또는 제104항에 있어서, 암이 위암, 난소암, 신장암, 유방암, 전립선암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 교모세포종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  106. 피험체에서의 암 치료용 의약 제조에서의, 제1항 내지 제65항, 제78항 내지 제94항 및 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제66항, 제67항, 제71항 내지 제73항, 제95항 및 제96항 중 어느 한 항의 약학 조성물, 또는 제68항 내지 제70항 및 제102항 중 어느 한 항의 세포의 용도로서, 암이 위암, 난소암, 신장암, 유방암, 전립선암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 교모세포종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  107. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 및 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 적어도 하나의 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM) 도메인을 포함하는 티로신 잔기를 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  108. 제107항에 있어서, 적어도 하나의 ITAM 도메인이 CD3 제타 TCR 서브유닛, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, TCR 제타 쇄, Fc 엡실론 수용체 1 쇄, Fc 엡실론 수용체 2 쇄, Fc 감마 수용체 1 쇄, Fc 감마 수용체 2a 쇄, Fc 감마 수용체 2b 1 쇄, Fc 감마 수용체 2b2 쇄, Fc 감마 수용체 3a 쇄, Fc 감마 수용체 3b 쇄, Fc 베타 수용체 1 쇄, TYROBP(DAP12), CD5, CD16a, CD16b, CD22, CD23, CD32, CD64, CD79a, CD79b, CD89, CD278, CD66d, 이들의 기능성 단편, 및 1개 이상 20개 이하의 변형을 가진 이들의 아미노산 서열의 군으로부터 선택되는 단백질 또는 폴리펩티드의 세포내 도메인으로부터의 것인 조성물.
  109. 제107항에 있어서, 적어도 하나의 ITAM 도메인이 Src-패밀리 키나제 인산화 부위를 포함하는 것인 조성물.
  110. 제107항에 있어서, 적어도 하나의 ITAM 도메인이 Syk 모집 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  111. 제107항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 서브유닛이 DAP12 모집 도메인을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  112. 제107항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 도메인이 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 ITAM 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  113. (A) 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열;
    (B) (a) 수용체에 의한 항원 결합시 인산화되는 하나 이상의 티로신 잔기를 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 서브유닛;
    (b) 막횡단 도메인,
    (c) 표적 세포의 표면 상의 성분에 대한 결합 특이성을 갖고, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결되는 세포외 결합 도메인; 및
    (d) 프로테아제 절단 서열에 의해 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결되고, 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열의 전사를 촉진시키는 전사 활성인자 도메인
    을 포함하는 키메라 항원 수용체 융합 단백질(CFP)을 코딩하는 제2 핵산 서열; 및
    (C) (i) 전사 활성인자 도메인을 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결하는 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제; (ii) CFP 활성화시 인산화되는 티로신 잔기에 결합하는 도메인을 코딩하는 제3 핵산 서열로서; 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제, 및 티로신 잔기에 결합하는 도메인이 작동가능하게 연결되는 것인 제3 핵산 서열
    을 포함하는, 하나 이상의 재조합 핵산 서열을 포함하는 조성물.
  114. 제113항에 있어서, 제3 핵산 서열이 (iii) 자극 반응 요소를 추가로 코딩하는 것인 조성물.
  115. 제114항에 있어서, 자극 반응 요소(iii)가 인산화된 티로신 잔기에 결합하는 도메인에 융합되는 것인 조성물.
  116. 제114항 또는 제115항에 있어서, 자극 반응 요소(iii)가 핵산 서열을 발현하는 세포의 미세환경에 반응성인 것인 조성물.
  117. 제116항에 있어서, 하나 이상의 재조합 핵산이 골수 세포에서 발현되는 것인 조성물.
  118. 제113항에 있어서, 전사 활성인자 도메인이 DNA 결합 도메인을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  119. 제118항에 있어서, DNA 결합 도메인이 Gal4, ZFHD1 또는 tet-R의 DNA 결합 도메인(DB)으로부터 선택되는 것인 조성물.
  120. 제113항에 있어서, 전사 활성인자 도메인이 VP64 전사활성화 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  121. 제113항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 활성인자 도메인을 세포내 신호전달 서브유닛에 작동가능하게 연결하는 프로테아제 절단 서열을 절단하는 프로테아제가 C형 간염 바이러스(HCV) NS3 프로테아제인 조성물.
  122. 제113항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, CFP 활성화시 인산화되는 티로신 잔기에 결합하는 도메인이 포스포티로신 결합(PTB) 도메인인 조성물.
  123. 제122항에 있어서, PTB가 Shc PTB인 조성물.
  124. 제113항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, (c)는 (b)와 작동가능하게 연결된 데그론인 조성물.
  125. 제124항에 있어서, 데그론이 HIF-1a 데그론인 조성물.
  126. 제113항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  127. 제113항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 세포.
  128. 제127항에 있어서, CD14+인 세포.
  129. 피험체에게
    (i) 제126항의 약학 조성물; 또는
    (ii) 제127항 또는 제128항의 세포
    중 어느 하나를 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 질환을 치료하는 방법.
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