KR20240049688A - Cd5를 표적하는 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 면역세포 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포내 신호전달 도메인으로 OX40 리간드를 포함하는 키메라 항원 수용체와 IL-15를 공발현하는 면역세포 및 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 면역세포는 상기 키메라 항원 수용체와 IL-15의 공발현을 통해 상승적인 종양세포 사멸 활성을 나타낼 뿐 아니라 생존률과 체외 증식률 또한 현저히 개선되어, 효율적인 항암 세포치료제로 유용하게 이용될 수 있다. 특히 본 발명의 면역세포는 CD5를 타겟팅하는 키메라 항원 수용체를 발현할 경우 림프구성 백혈병을 비롯한 다양한 CD5 양성 종양의 효과적인 치료 조성물로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 CD5를 특이적으로 인식하는 키메라 항원 수용체와 IL-15를 발현하는 면역세포; 및 이를 이용한 CD5 양성 종양의 치료 방법에 관한 것이다.
자연살해(Natural Killer, NK) 세포는 혈구세포의 약 10% 정도를 차지하고, 면역반응에 중요한 역할을 하는 림프구계 세포이다. NK 세포는 선천면역방어(innate immune defense)에서의 중요한 구성원으로서 암세포나 외인성 병원균에 감염된 세포를 사멸시키는 면역세포 치료(adoptive cellular immunotherapy)에 적합하다. 또 다른 면역세포인 T 세포를 이용한 세포치료 분야에서 특정 종양 항원을 발현하는 암세포에 대한 특이적인 사멸 효과가 증대되도록 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor, CAR)를 T 세포에 도입하는 기술이 활발하게 연구되고 있다. CAR는 면역세포에 항원 특이성을 전달하도록 설계된 인공 수용체로서 T 세포 등의 면역세포를 활성화시켜 특이적 면역성을 제공하도록 선택된 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 세포외 항원 결합 도메인은 확인된 종양 항원을 표적으로 하는 단일 사슬 가변 단편(single-chain variable fragment; scFv)을 포함함으로서 종양 항원을 발현하는 암 세포 특이적-면역세포 활성화를 유발할 수 있다.
한편, OX40 리간드(CD252)는 TNFR superfamily에 속하는 단백질로서, 항원 전달 세포(antigen-presenting cell, APC), 일부 자연살해세포 및 B세포에서 발현되며, 이들 세포의 활성화 후 수 시간에서 수일 내에 발현되는 것으로 알려져 있다. OX40 리간드의 수용체인 OX40(CD134)는 T 세포에서 발현되며, CD28에 의해 활성화된 T 세포에서 발현되는 것으로 알려져 있다. OX40의 발현은 CD28 활성화에 의한 T 세포 반응을 더욱 강화하여 T 세포의 증식, 사이토카인 분비 및 생존을 증대시킨다.
CD5는 타입Ⅰ 당단백질로서 스캐빈저(scavenger)-수용체 패밀리의 일원이다. CD5는 가슴샘세포, 성숙 T 세포, 및 성숙 B 세포에 의해 발현되고, 림프구 활성화의 조절 및 분화 과정과 관련된 것으로 알려졌다. CD5는 BCR의 활성화 신호를 완화하여 B-1 세포가 정상 조직 단백질이 아닌 매우 강한 자극(박테리아 단백질 등)에 의해서만 활성화될 수 있도록 한다. CD5는 급성 T 림프구성 백혈병과 말초 T-세포 림프종을 비롯한 다양한 혈액암과 유방암, 흉선암 등의 고형암에서 고발현되고 정상 세포에서는 발현이 억제되어, 이들 종양에 대한 치료 타겟으로 활발하게 연구되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 림프구성 백혈병을 비롯한 다양한 CD5 양성 종양에 대한 효율적인 면역세포 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, OX40L를 세포내 신호전달 도메인으로 포함하는 키메라 항원 수용체와 IL-15가 결합된 융합단백질을 면역세포에서 발현시킬 경우 면역세포의 생존률, 체외 증식률 및 항종양 활성이 모두 현저히 증진되어 치료적 유효량의 세포가 용이하게 확보될 뿐 아니라 적은 투여량으로도 CD5 양성 종양에 대한 우수한 항암 효과를 발휘하는 효율적인 세포치료제로 이용될 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 OX40 리간드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인과 CD5에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체; 및 IL-15를 포함하는 융합단백질을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합단백질을 발현하는 면역세포 및 이를 유효성분으로 포함하는 CD5 양성 종양의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 융합단백질을 제공한다:
(a) OX40 리간드(OX40L)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain); 및 CD5에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인(extracellular antigen binding domain)을 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor; CAR); 및
(b) IL(Interleukin)-15.
본 발명자들은 림프구성 백혈병을 비롯한 다양한 CD5 양성 종양에 대한 효율적인 면역세포 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, OX40L를 세포내 신호전달 도메인으로 포함하는 키메라 항원 수용체와 IL-15가 결합된 융합단백질을 면역세포에서 발현시킬 경우 면역세포의 생존률, 체외 증식률 및 항종양 활성이 모두 현저히 증진되어 치료적 유효량의 세포가 용이하게 확보될 뿐 아니라 적은 투여량으로도 CD5 양성 종양에 대한 우수한 항암 효과를 발휘하는 효율적인 세포치료제로 이용될 수 있음을 발견하였다.
본 명세서에서 용어“융합단백질(fusion protein)”은 특정 단백질 또는 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열이 상이한 단백질 또는 도메인으로부터 유래된 또 다른 아미노산 서열과 융합된 재조합 단백질 분자를 의미한다. 상이한 유래를 가지는 각 아미노산 서열은 융합단백질 내에서 직접 연결될 수도 있고 링커서열, 태그(tag)서열, 자가절단서열(self-cleaving sequence) 또는 이들의 조합을 통해 연결될 수도 있다. 본 발명의 융합단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)의 아미노산 서열과 IL-15 단백질의 아미노산 서열이 직접 결합하거나 링커, 태그, 자가절단서열 또는 이들의 조합에 의해 간접적으로 연결될 수 있으며, 당업계에 공지된 재조합 기술에 의해 제작되거나 목적 세포에서 발현될 수 있다.
본 명세서에서 용어“세포외 항원 결합 도메인(extracellular antigen binding domain)”은 키메라 항원 수용체가 대상 세포(예를 들어 면역세포)에서 발현될 경우 세포 외 부분에 위치하여 목적 항원을 특이적으로 인식함으로써 면역세포의 세포사멸 활성을 타겟 세포(예를 들어 암세포) 특이적으로 활성화시키기 위한 도메인이며, 예컨대 Fc 수용체(Fc receptor), 단일사슬항체절편(single-chain variable fragment, ScFv)과 같은 항체의 항원결합 단편일 수 있다. 따라서, 본 발명의 용어“세포외 항원 결합 도메인”은 "세포외 도메인(extracellular domain)”, “항원 인식 단편”또는“항원 결합 단편”과 동일한 의미로 사용된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 항-CD5 항체의 항원 결합 단편이다.
본 명세서에서 용어“항체(antibody)”는 CD5 단백질에 대한 항체로서, 이의 특정 에피토프를 특이적으로 인식하여 이에 결합하며, 완전한 전장 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편(항체 단편)을 포함하는 의미이다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
본 명세서에서 용어“항체의 항원 결합 단편”은 전체 항체 분자 내에서 항원-항체 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 구체적으로는 Fab 단편, F(ab')단편, F(ab')2 단편 및 Fv 단편을 포함한다.
항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각이며 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, ScFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
보다 구체적으로는 본 발명에서 이용되는 항체의 항원 결합 단편은 항-CD5 항체의 ScFv이다.
본 명세서에서 용어“중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 본 명세서에서, 용어“CDR(complementarity determining region)”은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 경쇄(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)에는 각각 3개의 CDR이 포함되어 있으며, 이들 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편의 범위에는 CDR 영역에 보존적 아미노산 치환을 갖는 변이체가 포함된다. 또한, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은, 인산화된 PLCγ2를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체의 항원인식단편 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인 하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 일 특정예에 따르면 85%의 상동성, 다른 특정예에 따르면 90%의 상동성, 또 다른 특정예에 따르면 95%의 상동성, 또 다른 특정예에 따르면 99%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Huang et al. Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 및 Pearson et al. Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31).
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열목록 제26서열의 아미노산 서열을 가지는 HCDR1, 서열목록 제28서열의 아미노산 서열을 가지는 HCDR2 및 서열목록 제30서열의 아미노산 서열을 가지는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함한다.
보다 구체적으로는, 상기 중쇄 가변영역은 서열목록 제32서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열목록 제34서열의 아미노산 서열을 가지는 LCDR1, 서열목록 제36서열의 아미노산 서열을 가지는 LCDR2 및 서열목록 제38서열의 아미노산 서열을 가지는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 추가적으로 포함한다.
보다 구체적으로는, 상기 경쇄 가변영역은 서열목록 제40서열의 아미노산 서열을 포함한다.
가장 구체적으로는, 본 발명에서 이용되는 세포외 항원 결합 도메인은 서열목록 제9서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD28, CD3-zeta, OX40 및 4-1BB로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인을 추가적으로 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD28 및 CD3-zeta를 추가적으로 포함한다.
가장 구체적으로는, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD28, OX40L 및 CD3-zeta가 세포막으로부터 세포내 방향으로 순서대로 포함된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 융합단백질은 상기 키메라 항원 수용체와 상기 IL-15 사이에 위치하는 자가절단 펩타이드(self-cleaving peptide)를 추가적으로 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 자가절단 펩타이드는 서열목록 제21서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 따르면, 서열목록 제21서열의 아미노산 서열은 T2A 자가절단 펩타이드의 아미노산 서열이다. T2A 자가절단 펩타이드는 세포 내 단백질 번역과정에서 리보솜 스키핑(ribosomal skipping)을 유도함으로서 전장 단백질을 짧은 펩타이드 절편으로 절단하는 2A-자가절단 펩타이드의 일종으로, 서열목록 제21서열의 18개 아미노산(EGRGSLLTCGDVEENPGP)을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 서열목록 제21서열의 아미노산 서열에 의한 자가 절단 활성을 증진시키기 위해 N-말단에 GSG(Gly-Ser-Gly) 서열이 추가될 수 있다. 본 발명의 T2A 자가절단 펩타이드에 의해 본 발명의 키메라 항원 수용체와 IL-15는 절단되어 발현될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 융합단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어“핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 본 발명의 핵산 분자는 전술한 본 발명의 융합단백질을 대상 세포, 예를 들어 면역세포에서 발현시키기 위해 유전자 전달체에 삽입되어 목적세포로 도입될 수 있다.
본 명세서에서 용어“발현시키다”는 대상 세포가 외래(exogenous) 유전자를 발현하게 하거나 또는 내인성(endogenous) 유전자의 자연적 발현량을 증가시키기 위해 유전자 전달체를 이용하여 인위적으로 이를 도입함으로써 유전자가 대상 세포 내에서 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 따라서, 용어“발현”은“형질전환(transformation)”, "형질주입(transfection)" 또는 "형질도입(transduction)"과 동일한 의미이다.
본 명세서에서, 용어“유전자 전달체”또는“유전자 전달 시스템(gene delivery system)”은 유전자를 세포 내로 운반하는 모든 수단을 의미하며, 유전자 전달은 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 세포 또는 조직 수준에서, 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.
본 발명의 유전자 전달체를 제조하기 위해, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에서 적합한 발현조절서열에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명의 목적 유전자에 결합된 프로모터는, 구체적으로는 동물세포, 보다 구체적으로는 포유동물 세포, 가장 구체적으로는 면역세포에서 작동하여 목적 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대 CMV(포유동물 사이토 메갈로 바이러스) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
표적 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 유전자 도입에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 예를 들어 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Act . Sci USA 92:1411-1415(1995)), 백시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀(Methods in Molecular Biology, 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 유전자 전달체는 바이러스 벡터이다. 보다 구체적으로는, 상기 바이러스는 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 백시니아 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되며, 가장 구체적으로는 렌티바이러스이다.
본 발명의 융합단백질 전체 또는 이를 구성하는 각 도메인을 인코딩하는 핵산 분자의 염기서열 목록은 하기 표 2에 정리되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 핵산 분자를 발현하는 면역세포를 제공한다.
본 명세서에서 용어“면역세포”는 면역반응의 개시 또는 촉진 과정에 관여하는 모든 세포를 의미하며, 보다 구체적으로는 면역 작동세포(immune effector cell)를 의미한다. 면역세포는 예를 들어 T 세포, B 세포, 자연살해(NK)세포, 자연살해 T(NKT) 세포 및 비만 세포(mast cell)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 상기 면역세포는 자연살해세포이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 발현하는 면역세포를 제공한다:
(a) OX40 리간드(OX40L)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain); 및 CD5에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인(extracellular antigen binding domain)을 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor; CAR); 및
(b) IL(Interleukin)-15.
본 발명에서 이용되는 면역세포는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 면역세포는 전술한 본 발명의 일 양태에서 설명한 바와 같이 키메라 항원 수용체 및 IL-15를 이들이 서로 결합된 단일 융합단백질의 형태로 발현할 수도 있고, 본 양태에서와 같이 키메라 항원 수용체와 IL-15가 결합되지 않은 개별적인 각각의 단백질 분자로서 발현할 수도 있다. 이 경우, 키메라 항원 수용체와 IL-15는 각각 이들을 인코딩하는 핵산분자가 개별적인 유전자 전달체에 삽입되어 면역세포에 공-형질전환될 수도 있고, 하나의 유전자 전달체에 함께 삽입되어 형질전환될 수도 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 면역세포는 자연살해세포이며, 보다 구체적으로는 상기 자연살해세포는 23일 내지 35일, 보다 더 구체적으로는 25일 내지 33일, 가장 구체적으로는 28일 내지 30일간 배양 후 동결 및 해동된 자연살해세포이다.
본 명세서에서 용어“배양”이란 세포가 배양배지 등의 인 비트로 환경에서 생물학적 활성을 유지한 채로 생장 및 증식하도록 유도하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어“배양배지”는 당, 아미노산, 무기질 기타 영양물질과 같이 세포의 생장 및 증식에 필수적인 요소를 포함하는, 인 비트로 내에서 세포의 성장 및 증식을 효율적으로 유도 및 촉진하기 위한 혼합물을 포괄하는 의미이다. 세포 배양배지는 특정 세포의 종류와 그 표현형 및 배양 특성에 따라 최적화될 수 있으며, 예를 들어 세포 생장의 지지를 위해 조제된 기본 배양배지, 세포로부터 단백질의 재조합적 생산을 촉진하도록 조제된 배양배지, 영양소들을 고농도로 농축시켜 만든 농축 배지가 있다.
본 명세서에서 용어“동결(freezing)”또는“동결보존(cryopreservation)”은 저온 상태, 구체적으로는 -80℃ 내지 -200℃의 초저온 상태에서 단기간 혹은 장기간에 걸쳐 세포를 안정하게 유지시키는 것을 의미한다. 세포는 일반적으로 배양과정에서 일만 개 중에 한 개 정도의 비율로 돌연변이가 일어나며, 장기간에 걸쳐 세포의 계대를 계속하면 본래의 세포집단과는 다른 세포집단으로 변성되거나, 세포 고유의 생물학적 활성 및 기능이 소실될 수 있고, 기간에 비례하여 마이코플라스마 등에 의한 감염 위험성도 증가하므로 세포의 고유한 특성을 보존하고자 세포를 동결시키는 방법이 널리 사용된다. 본 발명자들은 면역세포, 특히 렌티바이러스 벡터를 이용한 유전자 도입 효율이 저조한 자연살해세포에서 적절한 시간 동안 배양 후 동결 과정이 선행될 경우 유전자 전달율 및 세포 사멸율이 크게 개선된다는 점을 규명하였다. 따라서, 본 발명에서 수행되는 동결 단계는 세포의 장기간 보전 목적 하에 수행되는 동결보존(cryopreservation)과 달리 단기간 동안만 수행될 수도 있다.
세포의 동결은 동결과 해동과정에서 필연적으로 동반되는 얼음 결정의 형성과 이온 및 삼투압의 불균형에 따른 세포의 손상을 최소화할 수 있는 동결억제제를 처리함으로써 수행될 수 있다. 동결 배지에는 세포가 동결되는 동안의 안전성 및 안정성을 향상시키기 위해 예를 들어 덱스트란, 알부민 및/또는 DMSO가 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어“해동(thawing)”은 동결 또는 동결보존된 세포가 생명활동을 다시 재개하도록 하기 위해 연질(soft) 상태의 살아있는 세포가 될 때까지 온도를 상승시키는 과정을 의미한다. 해동은 통상적으로 액체질소탱크 등에서 초저온 동결된 세포를 꺼내어 37℃ 항온 수조에 넣어 빠르게 진행할 수 있다.
본 발명의 동결 및 해동 과정은 세포의 장기간 보관이 아닌 세포의 유전자 도입효율 개선 및 병원성 세포의 사멸활성 증진에 그 목적이 있으므로, 동결 및 해동은 시간적 간격 없이 동결이 완료된 후 바로 해동 과정이 개시될 수도 있고, 필요에 따라 동결 과정과 해동 과정 간에 적절한 시간차를 둘 수도 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 면역세포를 유효성분으로 포함하는 CD5 양성 종양의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적 유전자(CD5를 특이적으로 인식하는 키메라 항원 수용체-코딩 핵산분자)가 도입된 면역세포가 대상체에 투여되면 CD5 양성 암세포의 사멸을 유도함으로써 림프구성 백혈병을 비롯한 다양한 CD5 양성 종양으로 인한 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 질환의 세포 치료제 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 용어“투여”또는“투여하다”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 주입함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
본 발명에서 용어“치료적 유효량”은 본 발명의 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에“예방적 유효량”을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 용어“대상체”는 제한 없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 명세서에서 용어“CD5 양성 종양”은 정상 세포 또는 CD5 음성 종양에 비하여 CD가 측정 가능한 정도로 고발현되는 고형암 또는 혈액암을 의미한다. CD5는 85%의 급성 T 림프구성 백혈병(T-lineage Acute Lymphoblastic Leukemia, T-ALL)와 75%의 말초 T-세포 림프종에서 발현되며, 맨틀세포 림프종(mantle cell lymphoma), B-CLL(Chronic lymphocytic leukemia) 및 털세포 백혈병(hairy cell leukemia)에서 고발현되는 막관통 수용체 단백질로서, 정상 세포에서는 발현이 억제되어 유효한 종양의 치료 및 진단 타겟으로 이용되고 있다.
본 발명의 조성물로 예방 또는 치료될 수 있는 CD5 양성 종양은 백혈병, 림프종, 다발성골수종 등의 혈액암과, 유방암 및 흉선암 등의 고형암을 포함하나, 이에 제한되지 않고 종양 세포 표면에서 CD5를 측정 가능한 수준으로 발현함으로서 본 발명의 면역세포가 특이적으로 인식할 수 있는 악성 종양을 모두 포함한다.
보다 구체적으로는, 상기 CD5 양성 종양은 T 림프구성 백혈병이며, 보다 구체적으로는 급성 T 림프구성 백혈병이다.
본 발명의 면역세포, 구체적으로는 자연살해세포는 이를 유효성분으로 포함하는 CD5 양성 종양의 예방 또는 치료용 조성물의 총 중량에 대하여 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 약리성분인 자연살해세포 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 항암 약리성분을 1종 이상 추가로 포함되어 제제화할 수 있다.
상기 조성물의 투여량은 CD5 양성 종양의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 포함된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 자연살해세포의 투여량은 예를 들어 0.01 x 107 cells/kg 내지 1.0 x 109 cells/kg일 수 있고, 0.5 x 107 cells/kg 내지 1.0 x 108 cells/kg일 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 세포치료제 주입 방법에 의해 개체에 투여될 수 있다. 상기 투여 경로는 투여 방법, 체액의 부피, 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 조성물은 비경구로 투여되며, 구체적으로는 정맥, 피하 또는 복강투여될 수 있으며, 가장 구체적으로는 정맥투여될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 세포내 신호전달 도메인으로 OX40 리간드를 포함하는 키메라 항원 수용체와 IL-15를 공발현하는 면역세포 및 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 면역세포는 상기 키메라 항원 수용체와 IL-15의 공발현을 통해 상승적인 종양세포 사멸 활성을 나타낼 뿐 아니라 생존률과 체외 증식률 또한 현저히 개선되어, 효율적인 항암 세포치료제로 유용하게 이용될 수 있다.
(c) 특히 본 발명의 면역세포는 CD5를 타겟팅하는 키메라 항원 수용체를 발현할 경우 림프구성 백혈병을 비롯한 다양한 CD5 양성 종양의 효과적인 치료 조성물로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 사용된 키메라 항원 수용체(CAR)의 구성을 보여주는 그림으로, GFP만 포함된 대조군, CD28, OX40L 및 CD3ζ를 신호전달 도메인으로 포함하는 3세대 CAR 구조물, 신호전달 도메인이 결핍되어 있고 IL-15 도메인만이 포함된 구조물 및 상기 3세대 CAR 구조물에 IL-15 도메인이 추가적으로 결합된 4세대 CAR 구조물에 대한 모식도를 각각 보여준다.
도 2는 IL-2 사이토카인 부재 시 3세대 CAR-NK 세포와 4세대 CAR-NK 세포의 생존율 및 증식(fold expansion)을 측정한 결과를 나타내는 그림이다.
도 3은 HER2양성 종양 세포주인 HCC1954와 SKOV에 대해 3세대 CAR-NK 세포 및 4세대 CAR-NK 세포의 종양세포 살해능을 측정한 결과를 보여주는 그림이다.
도 4는 HER2양성 종양 세포주인 HCC1954와 SKOV에 접촉한 3세대 CAR-NK 세포 및 4세대 CAR-NK 세포의 IFN-γ 분비량 변화를 관찰한 결과를 보여주는 그림이다.
도 5는 본 발명에서의 NK 세포 배양과정을 요약한 모식도이다.
도 6은 상기 도 5의 상단 과정을 통해 배양 28 내지 30일차까지 배양 후 동결한 자연살해세포(MCB)와, 도 1의 하단 과정을 통해 배양 42 내지 44일차까지 배양 후 동결한 자연살해세포(DP)에서의 CD5 CAR 발현 양상을 측정한 결과이다.
도 7은 MCB와 DP의 각 표면마커 발현 양상에 기반하여 세포 표현형을 분석한 결과이다.
도 8은 K562, NALM6, CCRF-CEM, RPMI-8402_Luc, NALM6-NucLight, CCRF-CEM-NucLight 및 RPMI-8402-NucLight의 각 종양 세포주에서 CD5 단백질 발현을 측정한 FACS 분석 결과이다.
도 9는 다양한 종양 세포주와 공배양한 CBNK 또는 CD5 CAR-NK에서 CD107a, IFN-γ 및 TNFα(n=3) 발현량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은 CD5 CAR 형질도입 세포의 종양세포 살해능 확인을 위한 배양 모식도를 보여주는 그림이다.
도 11은 CD5 양성 및 CD 음성 종양세포에 대한 NK 세포의 살해능을 확인한 결과이다.
도 12는 공여자 3명의 IFN-γ 평균 분비량(pg/mL)을 측정한 결과이다.
도 13은 각 표적 세포와 공배양한 NK 세포의 IL-15 평균 분비량(pg/mL)을 측정한 결과이다.
도 14는 CD5 양성 및 CD5 음성 종양세포를 CD5 CAR-NK 세포와 96시간 동안 공배양한 후 장시간 종양세포 살해능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 15는 각 실험군에서 종양 이식 후 각 투여물질에 따라 140일까지의 생존율(%)을 측정한 결과는 보여준다.
도 16은 종양 이식 후 본 발명의 NK 세포 주입에 따른 112일까지의 동물 생체 이미징 결과를 나타낸다.
도 17은 종양 이식 후 35일째 까지 영상 신호 수치(photon/s)를 시간의 경과에 따라 측정한 결과를 나타낸다.
도 18은 실험동물에 종양 이식 후 본 발명의 NK 세포 주입에 따른 133일까지의 생존율(%)을 측정한 결과이다.
도 19는 실험동물에 종양 이식 후 본 발명의 NK 세포 주입에 따른 126일까지의 생체 이미징 결과이다.
도 2는 IL-2 사이토카인 부재 시 3세대 CAR-NK 세포와 4세대 CAR-NK 세포의 생존율 및 증식(fold expansion)을 측정한 결과를 나타내는 그림이다.
도 3은 HER2양성 종양 세포주인 HCC1954와 SKOV에 대해 3세대 CAR-NK 세포 및 4세대 CAR-NK 세포의 종양세포 살해능을 측정한 결과를 보여주는 그림이다.
도 4는 HER2양성 종양 세포주인 HCC1954와 SKOV에 접촉한 3세대 CAR-NK 세포 및 4세대 CAR-NK 세포의 IFN-γ 분비량 변화를 관찰한 결과를 보여주는 그림이다.
도 5는 본 발명에서의 NK 세포 배양과정을 요약한 모식도이다.
도 6은 상기 도 5의 상단 과정을 통해 배양 28 내지 30일차까지 배양 후 동결한 자연살해세포(MCB)와, 도 1의 하단 과정을 통해 배양 42 내지 44일차까지 배양 후 동결한 자연살해세포(DP)에서의 CD5 CAR 발현 양상을 측정한 결과이다.
도 7은 MCB와 DP의 각 표면마커 발현 양상에 기반하여 세포 표현형을 분석한 결과이다.
도 8은 K562, NALM6, CCRF-CEM, RPMI-8402_Luc, NALM6-NucLight, CCRF-CEM-NucLight 및 RPMI-8402-NucLight의 각 종양 세포주에서 CD5 단백질 발현을 측정한 FACS 분석 결과이다.
도 9는 다양한 종양 세포주와 공배양한 CBNK 또는 CD5 CAR-NK에서 CD107a, IFN-γ 및 TNFα(n=3) 발현량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은 CD5 CAR 형질도입 세포의 종양세포 살해능 확인을 위한 배양 모식도를 보여주는 그림이다.
도 11은 CD5 양성 및 CD 음성 종양세포에 대한 NK 세포의 살해능을 확인한 결과이다.
도 12는 공여자 3명의 IFN-γ 평균 분비량(pg/mL)을 측정한 결과이다.
도 13은 각 표적 세포와 공배양한 NK 세포의 IL-15 평균 분비량(pg/mL)을 측정한 결과이다.
도 14는 CD5 양성 및 CD5 음성 종양세포를 CD5 CAR-NK 세포와 96시간 동안 공배양한 후 장시간 종양세포 살해능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 15는 각 실험군에서 종양 이식 후 각 투여물질에 따라 140일까지의 생존율(%)을 측정한 결과는 보여준다.
도 16은 종양 이식 후 본 발명의 NK 세포 주입에 따른 112일까지의 동물 생체 이미징 결과를 나타낸다.
도 17은 종양 이식 후 35일째 까지 영상 신호 수치(photon/s)를 시간의 경과에 따라 측정한 결과를 나타낸다.
도 18은 실험동물에 종양 이식 후 본 발명의 NK 세포 주입에 따른 133일까지의 생존율(%)을 측정한 결과이다.
도 19는 실험동물에 종양 이식 후 본 발명의 NK 세포 주입에 따른 126일까지의 생체 이미징 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한`되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 3세대 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 CAR-NK와 3세대 키메라 항원 수용체 및 IL-15 도메인을 동시에 발현하는 4세대 CAR-NK 세포의 제작
본 발명에서 이용되는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)의 구조를 하기 표 1에 요약하였다
| CAR 종류 |
약칭 | 신호 서열 |
ECD | 힌지 | TM | 신호-1 | 신호-2 | 신호-3 | 2A펩타이드 | |
| 3세대 | HER2 CAR | CD8α | 항-HER2 scFv | CD8α | CD28 | CD28 | OX40L | CD3z | - | - |
| Truncated | HER2 CAR(t)-IL-15 | CD8α | 항-HER2 scFv | CD8α | CD28 | - | - | - | T2A | IL- 15 |
| 4세대 | HER2 CAR-IL-15 | CD8α | 항-HER2 scFv | CD8α | CD28 | CD28 | OX40L | CD3z | T2A | IL- 15 |
| 4세대 | CD5 CAR | CD8α | 항-CD5 scFv | CD8α | CD28 | CD28 | OX40L | CD3z | T2A | IL- 15 |
본 발명의 OX40L 포함 CAR와 IL-15의 공발현에 의한 상승효과를 확인하기 위해 제작된 HER2 CAR (3세대)는 CD8a의 신호서열 도메인(890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); 항-HER2 scFv 서열(VH-(GGGGS)3-VL 도메인); 인간 CD8α 유래의 힌지 도메인(1292-1435 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); CD28 유래의 막관통 및 세포내 신호전달 도메인(679-882 뉴클레오타이드, GenBank NM 006139.3); CD252 유래의 세포내 신호전달 도메인(141-206 뉴클레오타이드, GenBank NM 003326.4); 및 CD3z 유래의 세포내 신호전달 도메인(299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3)과 종결 코돈인 TGA가 순차적으로 연결된 구조를 가진다.
HER2 CAR(t)-IL-15는 CD8α의 신호서열 도메인(890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); 항-HER2 scFv 서열(VH-(GGGGS)3-VL 도메인); 인간 CD8α 유래의 힌지 도메인 (1292-1435 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); CD28 유래의 막관통 도메인(679-759 뉴클레오타이드, GenBank NM 006139.3); 글라이신(G)-세린(S)-글라이신(G)와 연결된 T2A 자가 절단 펩티드 서열; 인간 IL-15 서열(375-860 뉴클레오타이드, GenBank NM000585.4)과 종결코돈인 TGA가 순차적으로 연결된 구조를 가진다.
HER2 CAR-IL-15(4세대)는 CD8α의 신호서열 도메인(890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); 항-HER2 scFv 서열(VH-(GGGGS)3-VL 도메인); 인간 CD8α 유래의 힌지도메인(1292-1435 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); CD28 유래의 막관통 및 세포내 신호전달 도메인(679-882 뉴클레오타이드, GenBank NM 006139.3); CD252 유래의 세포내 신호전달 도메인(141-206 뉴클레오타이드, GenBank NM 003326.4); 및 CD3z 유래의 세포내 신호전달 도메인(299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3); G-S-G와 연결된 T2A 자가절단 펩타이드 서열; 인간 IL-15 서열(375-860 뉴클레오타이드, GenBank NM000585.4)과 종결코돈인 TGA가 순차적으로 연결된 구조를 가진다.
CD5 CAR (4세대)는 CD8α의 신호서열(890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); 항-CD5 scFv 도메인(VH-(GGGGS)3 linker-VL); CD8α 유래의 힌지 도메인 (1292-1435 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); CD28 유래의 막관통 및 세포내 신호전달 도메인(679-882 뉴클레오타이드, GenBank NM 006139.3); CD252 유래의 세포내 신호전달 도메인(141-206 뉴클레오타이드, GenBank NM 003326.4); CD3z 유래의 세포내 신호전달 도메인(299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3); G-S-G와 연결된 T2A 자가절단 펩타이드 서열; 인간 IL-15 서열(375-860 뉴클레오타이드, GenBank NM000585.4)과 종결코돈인 TGA가 순차적으로 연결된 구조를 가진다.
본 발명에서 제작된 키메라 항원 수용체에 포함된 각 도메인들의 염기서열 및 아미노산 서열을 아래 표 2에 정리하였다.
| 서열번호 | 서열이름 | 서열에 대한 설명 |
| 1 | CD8a 뉴클레오타이드 | CD8a의 신호서열 (890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6) |
| 2 | CD8a 뉴클레오타이드 코돈 최적화 | 서열번호 1의 코돈 최적화된 서열 |
| 3 | CD8a 아미노산 | 서열번호1및 2에 대응하는 아미노산 서열 |
| 4 | 항-HER2 scFv 뉴클레오타이드 | 항- HER2 scFv 서열 VH-(GGGGS)3 링커-VL 도메인 |
| 5 | 항-HER2 scFv 아미노산 | 서열번호 4에 대응하는 아미노산 서열 |
| 6 | 항-CD5 scFv (VH-GS3-VL) 뉴클레오타이드 | 항-CD5 scFv 서열 VH-(GGGGS)3 링커-VL 도메인 |
| 7 | 항-CD5 scFv (VH-GS3-VL) 아미노산 | 서열번호 6에 대응하는 아미노산 서열 |
| 8 | CD8a 뉴클레오타이드 | 인간 CD8a 유래의 힌지 도메인 (1292-1435 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6) |
| 9 | CD8a 뉴클레오타이드 코돈 최적화 | 서열번호 8의 코돈 최적화된 서열 |
| 10 | CD8a 아미노산 | 서열번호 8 및 9의 아미노산 서열 |
| 11 | CD28 뉴클레오타이드 | CD28 유래의 막관통 및 세포내 신호전달 도메인 (679-882 뉴클레오타이드, GenBank NM 006139.3) |
| 12 | CD28 뉴클레오타이드 코돈 최적화 | 서열번호 11의 코돈 최적화된 서열 |
| 13 | CD28 아미노산 | 서열번호 11 및 12의 아미노산 서열 |
| 14 | CD252 뉴클레오타이드 | CD252 유래의 세포내 신호전달 도메인 (141-206 뉴클레오타이드, GenBank NM 003326.4) |
| 15 | CD252 뉴클레오타이드 코돈 최적화 | 서열번호 14의 코돈 최적화된 서열 |
| 16 | CD252 아미노산 | 서열번호 14및 15의 아미노산 서열 |
| 17 | CD3z 뉴클레오타이드 | CD3z 유래의 세포내 신호전달 도메인 (299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3) |
| 18 | CD3z 뉴클레오타이드 코돈 최적화 | 서열번호 17의 코돈 최적화된 서열 |
| 19 | CD3z 아미노산 | 서열번호 17 및 18의 아미노산 서열 |
| 20 | T2A 뉴클레오타이드 | T2A 자가 절단 펩티드 서열 |
| 21 | T2A 아미노산 | 서열번호 20의 아미노산 서열 |
| 22 | IL-15 뉴클레오타이드 | 인간 IL-15 서열 (375-860 뉴클레오타이드, GenBank NM000585.4) |
| 23 | IL-15 뉴클레오타이드 코돈 최적화 | 서열번호 22의 코돈 최적화된 서열 |
| 24 | IL-15 아미노산 | 서열번호 22 및 23의 아미노산 서열 |
| 25 | 항-CD5 scFv HCDR1 뉴클레오타이드 | 항-CD5 scFv의 HCDR1 코딩 뉴클레오타이드 |
| 26 | 항-CD5 scFv HCDR1 아미노산 | 서열번호 25의 아미노산 서열 |
| 27 | 항-CD5 scFv HCDR2 뉴클레오타이드 | 항-CD5 scFv의 HCDR2 코딩 뉴클레오타이드 |
| 28 | 항-CD5 scFv HCDR2 아미노산 | 서열번호 27의 아미노산 서열 |
| 29 | 항-CD5 scFv HCDR3 뉴클레오타이드 | 항-CD5 scFv의 HCDR3 코딩 뉴클레오타이드 |
| 30 | 항-CD5 scFv HCDR3 아미노산 | 서열번호 29의 아미노산 서열 |
| 31 | 항-CD5 scFv 중쇄 가변영역 뉴클레오타이드 | 항-CD5 scFv의 전체 중쇄가변영역 코딩 뉴클레오타이드 |
| 32 | 항-CD5 scFv 중쇄 가변영역 아미노산 | 서열번호 31의 아미노산 서열 |
| 33 | 항-CD5 scFv LCDR1 뉴클레오타이드 | 항-CD5 scFv의 LCDR1 코딩 뉴클레오타이드 |
| 34 | 항-CD5 scFv LCDR1 아미노산 | 서열번호 33의 아미노산 서열 |
| 35 | 항-CD5 scFv LCDR2 뉴클레오타이드 | 항-CD5 scFv의 LCDR2 코딩 뉴클레오타이드 |
| 36 | 항-CD5 scFv LCDR2 아미노산 | 서열번호 35의 아미노산 서열 |
| 37 | 항-CD5 scFv LCDR3 뉴클레오타이드 | 항-CD5 scFv의 LCDR3 코딩 뉴클레오타이드 |
| 38 | 항-CD5 scFv LCDR3 아미노산 | 서열번호 37의 아미노산 서열 |
| 39 | 항-CD5 scFv 경쇄 가변영역 뉴클레오타이드 | 항-CD5 scFv의 전체 경쇄가변영역 코딩 뉴클레오타이드 |
| 40 | 항-CD5 scFv 경쇄 가변영역 아미노산 | 서열번호 39의 아미노산 서열 |
IL-15는 NK 세포를 활성화시키고 이의 생존 및 증식에 기여하는 사이토카인으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 키메라 항원 수용체를 발현하는 NK 세포에서 IL-15를 공발현시킬 경우 생존 및 체내 지속성이 개선되는지 여부를 확인하기 위해 HER2를 특이적으로 인식하는 scFv 절편 및 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체에 수용성(soluble) 형태의 IL-15 단백질을 도입하여 그 효능을 평가하였다(도 1). 항-HER2 scFv 절편 및 신호전달 도메인과 수용성 IL-15 도메인을 T2A 시스템으로 연결하여 바이시스트로닉(bicistronic) 형태의 키메라 항원 수용체를 발현하는 NK 세포를 제작하고 이를“4세대 CAR-NK 세포”로 명명하였다(도 1의“d”). 대조군으로 항-HER2 scFv 절편 및 신호전달 도메인은 발현하지만 IL-15 도메인을 포함하지 않는 키메라 항원 수용체를 발현하는 3세대 CAR-NK 세포(도 1의 “b”), 항-HER2 scFv 절편은 발현하지만 세포내 신호전달 도메인은 없고 IL-15 도메인을 발현하는 NK 세포(도 1의“c”, CAR(t)-IL-15-NK 세포로 명명)도 함께 제작하였다. GFP를 발현하는 유전자는 대조군(도 1의“a”)으로 사용하였다.
실시예 2: 3세대와 4세대 CAN-NK 세포의 생존율 및 성장성 결과
제대혈 유래의 NK 세포를 배양하고 7일 째에 각 유전자를 도입하였으며 배양 22일차부터 IL-2를 배양 배지에 첨가하지 않고 배양하며 세포 생존율 및 성장을 관찰하였다. 4세대 CAR-NK 세포와 CAR(t)-NK 세포를 제외한 세포군은 IL-2를 첨가하지 않은 시점부터 생존율이 현저히 감소하고 더 이상 성장이 되지 않았으며 배양 41일째 대부분의 세포가 사멸하였다(도 2). IL-15 도메인이 포함된 구조의 CAR-NK 세포만 생존 및 성장성을 유지하였으며 분비된 IL-15이 NK 세포의 생존 및 증식에 기여하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 3세대와 4세대 CAR-NK 세포의 효능 비교 및 IL-15 도메인에 의한 시너지 효과
3-1) 종양세포 살해능 평가
4세대 CAR-NK 세포의 효능을 확인하기 위해 HER2를 발현하는 종양 세포주와 공배양하여 NK 세포의 세포 독성을 확인하고자 하였다. HER2를 발현하는 2종의 종양 세포주(HCC1954, SKOV3)를 타겟으로 사용하였으며 RFP를 발현시켜 세포 사멸시 형광 신호가 소멸되도록 하였다. 배양 22일부터 IL-2를 첨가하지 않고 배양한 다양한 종류의 NK 세포군과 종양 세포주를 E: T = 0.3:1 비율로 6일 동안 공배양한 후 종양세포의 증식 여부를 관찰하였다. HCC1954와 SKOV3, 2종의 종양 세포주 모두에서 IL-15를 분비하는 4세대 HER2 CAR-NK 세포가 종양 세포주의 증식을 억제하여 뛰어난 세포 독성을 보인 반면 3세대 HER2 CAR-NK 세포 및 HER2 CAR(t)-NK 세포는 상대적으로 낮은 세포 독성을 나타냈다(도 3). 3세대 HER2 CAR-NK는 IL-2와 같은 추가적인 사이토카인의 부재로 인해 종양 세포의 형성을 효과적으로 억제하지 못했을 것으로 생각되고 HER2 CAR(t)-NK 세포는 신호전달도메인이 없기 때문에 세포 독성 효과가 낮게 관찰된 것으로 추정할 수 있었다.
3-2) IFN-γ 분비능 평가
NK 세포가 타겟 종양세포와 접촉하였을 때 분비하는 기능성 사이토카인 중 하나인 IFN-γ 분비량을 측정한 결과, 3세대 HER2 CAR-NK 세포와 HER2 CAR(t)-NK 세포는 IFN-γ를 거의 분비하지 않는 반면 4세대 CAR-NK 세포는 IFN-γ를 매우 높은 수준으로 분비함을 관찰하였다(도 4). 이를 통해 생존 및 증식이 원활하지 않은 3세대 CAR-NK 세포와 달리 4세대 CAR-NK 세포는 OX40L를 신호 도메인으로 포함하는 본 발명의 키메라 항원 수용체와 IL-15의 공발현으로 인해 상승적인 항종양 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 4: NK 세포의 배양 및 배양 시점 별 세포 동결
4-1) 세포 해동
동결된 세포를 미리 예열한 37℃ 항온 수조에서 빠르게 해동하였다. 90% 이상 해동된 상태에서 생물안전작업대 상에서 50 mL 튜브에 세포를 옮기고 10 배 (v/v)의 ACD 완충액을 천천히 첨가하였다. 이후 1200 rpm, 4℃로 10 분간 원심분리하여 상층액을 모두 제거 후 CellGro 배지에 현탁하고 세포수를 측정하였다.
4-2) NK 세포 배양 및 렌티바이러스 벡터를 이용한 형질도입
배양 0일차 1.0 x 106/mL의 NK 세포와 2.5 x 106/mL의 지지세포, CellGro 배지를 각각 1:1:1 비율로 섞어 주고, 37℃ CO2 배양기에서 정치배양하였다. 이때 전체 부피에 해당되는 만큼의 IL-2(1,000 IU/mL), 인간혈장(2%) 및 OKT3(10μg/mL)가 첨가된 Cellgro 배지를 사용하였다. 배양 4일차에 IL-2(1,000 IU/mL) 및 인간혈장(1%)을 포함하는 CellGro 혼합배지를 전체부피의 동량만큼 추가하였다. 배양 7일차 전체 세포를 회수한 후, 별도의 희석 없이 세포수를 측정하여 0.66 x 106/mL이상이면 세포를 동결하였다. 배양 7일차에 동결한 세포를 해동한 원료세포를 CellGro 배지에 현탁 후 세포수를 측정하여 1.0 x 106/mL 농도로 희석된 세포를 배양하였다. 배양 10일차에 1.0 x 106/mL의 세포에 20 MOI의 렌티바이러스 벡터를 처리하기 위해 6.6 x 108 TU/mL의 렌티바이러스 벡터 30μL를 혼합액과 함께 처리 하였으며, 렌티바이러스 벡터 형질도입을 위한 혼합액 조성은 아래 표 3과 같다.
| 혼합액 | 용액 | 보관용량 | 최종 농도 |
| 1 | 렌티바이러스 벡터 | 해당 없음 | 20 MOI/1ⅹ106 cells |
| Protransduzin RUO | DMSO에 10 mg/mL | 10μg/mL | |
| 2 | IL-21 | PBS에 100μg/mL | 20 ng/mL |
| 인간혈장 | 해당없음 | 1% | |
| IL-2 | 2,500,000 IU/mL | 1,000 IU/mL | |
| Glutamine | 200 mM | 2% | |
| CellGro 배지 | 해당 없음 | 해당없음 |
혼합액 1과 2를 각각 제조한 후 배양용기에 천천히 넣어주었다. 렌티바이러스 벡터 형질도입을 하지 않는 CBNK에는 1 mL의 CellGro 배지에 인간혈장(1%)과 IL-2(1,000 IU)를 섞은 혼합배지(이하 CellGro 혼합배지)를 넣어준 후 37℃ CO2배양기에서 정치배양하였다. 배양 11일차에는 6-웰 기준 배양 10일차 부피의 동량에 해당하는 CellGro 혼합배지와 IL-21를 20 ng/mL의 농도로 추가하였다. 배양 13일차에는 세포를 회수하여 별도의 희석없이 CellGro 혼합배지를 추가하여 1 x 106/mL로 맞춰주었다. 배양 16일차에는 CD5 CAR를 발현하는 NK 세포를 얻기 위해 CD5 양성세포를 분리하였다. 이를 위해 NK 세포를 모두 회수하여 1200 rpm, 4℃로 5분간 원심분리 후 상층액을 제거 한 뒤 MACS 완충액에 현탁 후 세포수를 측정하여 1.0 x 107/mL이 되게 MACS 완충액을 추가하였다. 이후 바이오틴이 태그된 재조합 인간 CD5 단백질(His & AVI tag)(250μg/mL)를 1μL/106 cells로 넣고 잘 섞은 뒤 4℃에서 30분간 반응시켰다. 1차 반응시킨 부피의 10배의 MACS 완충액을 넣어 340g, 4℃에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 1.0 x 108/mL이 되도록 MACS 완충액으로 현탁 후 항-바이오틴 비드(Miltenyi Biotec, 130-092-357)를 37.5μL/40 x 106 cells로 넣고 4℃에서 15 분간 반응시켰다. 10배 부피의 MACS 완충액을 넣어 340g, 4℃에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 1.0 x 108 cells/500μL로 MACS 완충액을 넣은 후 여러 번 파이페팅하여 세포를 잘 풀어주었다. QuadroMACSTM Separator(Miltenyi Biotec)에 LS 컬럼(Miltenyi Biotec)을 장착하고 3 mL의 MACS 완충액을 흘려주어 컬럼을 활성화시켰다. 비드와 반응한 세포를 파이페팅으로 잘 풀어준 뒤 컬럼당 500μL씩 담아 세포 현탁액이 모두 내려가길 기다렸다. 컬럼 세척을 위해 위해 3 mL의 MACS 완충액을 흘려 보내주며 총 3회 세척하였다. 컬럼을 QuadroMACSTM Separator에서 분리한 후 MACS 완충액 5 mL을 넣고 플런저(plunger)로 내려 CD5 CAR 양성세포를 회수하였다. 분리된 세포는 원심분리 후 1 x 106/mL이 되게 CellGro 혼합배지를 추가하고, 배양 0일차와 동일한 방법으로 지지세포를 이용한 재자극을 진행 한 후 37℃ CO2 배양기에서 정치배양하였다. 배양 19 일차에는 배양 16일차 배양부피와 동량의 CellGro 혼합배지를 추가하였다. 배양 21 일차 세포를 회수하여 별도의 희석없이 세포 수를 측정하고 CellGro 혼합배지를 추가하여 1 x 106/mL로 맞춰 주며, 이후 배양 28일~ 30일차까지 CellGro 혼합배지를 추가하여 1 x 106/mL 농도를 유지하도록 배양하였다. 배양 28일 ~ 30일차 NK 세포를 모두 회수한 후 세포를 동결하였다. 이하 배양 28일~30일차까지 배양 후 동결한 세포를“MCB”라고 명명한다. 나머지 세포는 1.0 x 106/mL이 되도록 CellGro 배지를 추가한 후 배양 16일차와 같이 지지세포를 이용한 재자극을 진행 하고 37℃ CO2 배양기에서 정치배양하였다. 이후 14일간 CellGro 혼합배지를 추가하여 1 x 106/mL농도를 유지하도록 배양하였다. 배양 42일 ~ 44일차 NK 세포를 모두 회수한 후 세포를 동결하였으며 이와 같이 동결한 세포를“DP”라고 명명한다.
4-3) 세포 동결
원심 분리 후 PBS에 세포를 현탁 하여 동결배지 혼합액을 1:1로 섞어 동결용기 당 100 x 106/mL로 분주하고 자동세포동결기(CRF)로 세포를 동결하였다.
실시예 5: CD5 CAR 형질도입된 NK 세포의 특성
5-1) CD5 CAR 발현의 확인
1 - 5 x 105개의 세포를 수거하여 원심 후 상층액을 제거한 후 2 mL의 2% FBS가 첨가된 FACS 완충액에 부유켰다. 이후 원심분리하여 상층액을 제거하고 다시 100μL의 FACS 완충액과 바이오틴이 태그된 재조합 인간 CD5 단백질(His & AVI tag)(250μg/mL) 1 μL을 넣어서 4℃, 30분간 차광하여 반응시켰다. 이후 2mL의 FACS 완충액을 넣어 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 2차 염색을 위해 세척된 NK 세포에 100 μL 세포 완충액을 넣어준 뒤 분석에 사용될 항체를 첨가하고 4℃, 30분간 차광하여 반응시켰다.
| 항체 | 용량 |
| 스트랩타비딘-PE | 0.5 μL |
| 항-인간 CD56 APC | 5 μL |
| 항-인간 CD3-PE-Cy7 | 1 μL |
| 7-AAD | 5 μL |
| FACS 완충액 | 최대 100 μL |
| 전체 용량 | 100 μL |
이후 2mL의 FACS 완충액을 넣어 원심분리한 후 상층액을 제거하고 200 μL의 BD cytofix 용액을 넣고 잘 섞어준 뒤 LSRfortessa 장비를 이용하여 염색된 세포를 분석하였다. 미가공 데이터를 Flowjo 프로그램을 이용하여 분석하였으며, 게이팅(Gating)은“singlet → 림프구 → 살아있는 세포(7-AAD-) → NK 세포(CD56+, CD3-) → CD5 CAR 발현“의 순서로 진행하였다. 해동 후 MCB의 CD5 CAR 발현율은 96.46±2.00(평균값±표준편차), DP의 CD5 CAR 발현율은 93.68±2.23(평균값±표준편차)로, MCB와 DP 모두 90% 이상의 세포가 CD5 CAR를 발현했으며(도 6) 해당 값은 양측 t-검정을 통해 통계적 유의성을 확인하였다(표 5, *p<0.05, **p<0.01, ***<0.001, ns: 유의성 없음). 위의 결과를 통해서 배양기간이 늘어나도 CD5 CAR의 발현은 잘 유지되고 있었으며, 동결된 세포를 해동한 경우에도 CD5 CAR의 발현이 급격히 감소하지 않음을 확인하였다).
| CAR 발현 | % | MFI | |
| CBNK (MCB) | 평균 | 0.19 | 233.65 |
| STD | 0.08 | 101.10 | |
| CD5 CAR-NK (MCB) | 평균 | 96.46 | 13437.68 |
| STD | 2.00 | 482.37 | |
| CBNK(MCB)vs CD5CAR-NK(MCB)의 p-값 | 0.0001 | 0.0004 | |
| CBNK (DP) | 평균 | 0.26 | 245.49 |
| STD | 0.14 | 136.91 | |
| CD5 CAR-NK (DP) | 평균 | 93.68 | 10443.52 |
| STD | 2.23 | 2875.77 | |
| CBNK(DP)vs CD5CAR-NK(DP)의 p-값 | 0.0002 | 0.0232 | |
| CD5CAR-NK(MCB)vs CD5CAR-NK(DP)의 p-값 | 0.0093 | ns | |
5-2) CD5 CAR 형질도입된 NK 세포의 표현형 확인
NK 세포를 1.0-2.5 x 106/mL 농도로 FACS 완충액에 현탁한 후, 항체 혼합액이 분주된 플레이트에 100μL씩 분주하였다. 세포와 항체가 잘 섞이도록 수회 파이페팅하였다. 항체 혼합액 조성은 하기 표 6과 같으며 각 표현형에 해당하는 PE 항체를 첨가하였다.
| PE_Cy7 | PE | APC | PerCP_Cy5.5 | 총 염색 용적 (μL) |
|||||
| PE_Cy7 | 용적 (μL) | PE | 용적(μL) | APC | 용적 (μL) | PerCP_Cy5.5 | 용적(μL) | ||
| 1 | CD3 | 1 | CD16 | 5 | CD56 | 5 | 7-AAD | 5 | 16 |
| 2 | NKG2A | 1 | 12 | ||||||
| 3 | NKG2C | 1 | 12 | ||||||
| 4 | NKG2D | 5 | 16 | ||||||
| 5 | NKp30 | 1 | 12 | ||||||
| 6 | NKp44 | 5 | 16 | ||||||
| 7 | NKp46 | 5 | 16 | ||||||
| 8 | CXCR3 | 5 | 16 | ||||||
| 9 | DNAM-1 | 5 | 16 | ||||||
| 10 | CD25 | 5 | 16 | ||||||
| 11 | CD57 | 1 | 12 | ||||||
| 12 | CD62L | 1 | 12 | ||||||
| 13 | CD69 | 5 | 16 | ||||||
| 14 | PD-1 | 1 | 12 | ||||||
| 15 | TIGIT | 1 | 12 | ||||||
| 16 | LAG3 | 1 | 12 | ||||||
| 17 | TIM3 | 1 | 12 | ||||||
| 18 | KLRG-1 | 1 | 12 | ||||||
| 19 (FMO1) |
mIgG1 | 5 | 16 | ||||||
| 20 (FMO2) |
mIgG2a | 5 | 16 | ||||||
| 아형 | mIgG1 | 1 | mIgG1 | 5 | mIgG1 | 5 | 16 | ||
4℃에서 30분간 반응시키고 FACS 완충액을 100μL씩 넣어 파이페팅으로 섞은 뒤 원심분리(2000 rpm, 3 분, 4℃)한 후 BD cytofix 용액을 각 웰에 200μL씩 분주하였다. LSRfortessa 장비를 이용하여 유세포분석 진행 후 결과를 분석한다. NK 세포는 singlets → 림프구 → 살아있는 세포(7-AAD-) → NK 세포(CD56+, CD3-) 의 순으로 게이팅하고, 각 마커의 발현은 아형 항체 기준으로 값을 계산하였다. NK 세포의 특성 분석을 위해서 18종의 표면 마커 발현을 유세포 분석기로 분석하였고, CD5 CAR-NK의 MCB, DP를 CBNK의 MCB, DP와 비교했다. 그 결과, CD5 CAR-NK에서 각 표면마커의 발현은 CBNK와 비교했을 때 큰 차이가 없었고, MCB와 DP간에도 유의미한 차이는 없었다(도 7, 표 7).
실시예 6: CD5 CAR 형질도입 세포의
in vitro
효능 평가
6-1) 종양세포주의 제작 및 배양
동결된 K562, NALM6, CCRF-CEM, RPMI-8402_Luc, NALM6-NucLight, CCRF-CEM-NucLight 및 RPMI-8402-NucLight 세포를 37℃ 항온수조에서 빠르게 해동시킨 뒤 배양배지 10 mL에 희석하고 원심분리를 통해 상층액을 제거한 다음 배지 1 mL 넣어 세포수를 측정하였다. 1-2 x 106개의 세포를 T75 플라스크에 넣고 CO2 배양기에서 2-3일간 배양하였다. NucLight가 표지된 종양 세포주를 제작하기 위해 8μg/mL 폴리브렌(Santa cruz, CA, USA)을 사용하여 세포주에 Incucyte® NuclightRed 렌티바이러스(Sartorius, Gttingen, Germany)를 형질도입하고, 4일 후 퓨로마이신(Gibco, USA)을 0.5, 1, 1.5 및 2μg/mL로 처리하였다. 퓨로마이신 처리 7일 후 종양세포를 100% 사멸시킨 농도 중 가장 낮은 농도를 선택하여 적색 형광 단백질을 발현하고 있는 세포만 선별한 후 배양하였다.
6-2) 종양세포에서의 CD5 발현
종양세포를 회수하여 1 - 5 x 105개의 세포를 FACS 튜브에 옮겼다. 원심분리 후 FACS 완충액 100 μL에 항-인간 CD5 PE 1μL를 넣고 섞어주고 4℃, 30분간 차광하여 반응시켰다. 1mL의 FACS 완충액을 넣고 원심분리 한 후 상층액을 버리고 BD cytofix 용액 200 μL를 넣고 섞어준 후 FACS 분석을 진행하였다. 분석결과, 회색의 음영은 아형 대조군을, 파란색의 실선은 항-인간 CD5 항체를 염색한 결과를 보여주며, 숫자는 아형 대조군 대비 발현율(%)을 나타낸다. K562, NALM6, NALM6-Nuclight에서는 CD5를 거의 발현 하지 않는 반면에 CCRF-CEM, CCRF-CEM-Nuclight, RPMI-8402_Luc, RPMI-8402-Nuclight 및 Jurkat- Nuclight에서는 CD5를 높게 발현함을 확인하였다(도 8).
6-3) CD5 CAR 형질도입 세포의 CD107a 및 사이토카인 발현 확인
NK 세포와 타겟 종양 세포주를 각각 RPMI-1640 + 10% FBS(이하 어세이 배지)에 2.5 x 106/mL로 현탁하였다. CD5에 특이적인 세포 활성을 보이는지 확인하기 위하여 CD5 양성 종양 세포주로 CCRF-CEM과 RPMI-8402_Luc를 사용하였으며 CD5 음성 종양 세포주로 NALM-6를 사용하였다. NK 세포 내 생성된 사이토카인이 밖으로 분비되지 않도록 Golgistop(1.3μ/mL)과 Golgiplug(2μ/mL)를 넣고 섞어주었다. 96-웰 둥근바닥 플레이트에 (-)웰과 타겟 웰에 APC 항-인간 CD107a 항체 (1μL)을 분주하였다. 항체가 분주된 플레이트에 (-) 웰에는 NK 세포 자체의 사이토카인 발현을 확인 하고자 어세이 배지 100μL와 NK 세포 100μL를 넣어주고, 타겟 웰에는 NK 세포와 타겟 종양 세포주를 각 100μL씩 함께 넣어주었다. 96 웰 플레이트를 호일로 싸서 빛을 차단한 후 37℃ CO2배양기에서 4시간 동안 공배양하였다. 원심분리(2000rpm, 3분, 4℃) 후 상층액을 제거하고 200μL FACS 완충액을 넣은 후 섞어주고 원심분리 한 후 상층액을 제거하였다. 웰당 FACS 완충액 100μL에 세포표면 염색을 위해 항-인간 CD3 PerCP-Cy5.5(1uL), 항-인간 CD56-APC-e780(1 uL) 그리고 7-AAD(4μL)를 넣고 4℃, 30분간 배양하였다. 100μL FACS 완충액을 첨가한 후 원심분리를 2회 진행한 후 상층액을 제거하고 200μL 고정/투과화 용액을 첨가한 뒤 4℃에서 30분 배양하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 200μL 1 x Perm 세척 완충액을 첨가한 후 원심분리하였다. 웰당 1 x Perm 세척 완충액 100 μL를 넣은 후 항-인간 IFN-η FITC(1μL), 항-인간 TNF-α PE-Cy7(1μL)를 넣고 4℃에서 30 분간 배양하였다. 100μL 1 x Perm 세척 완충액을 첨가한 후 원심분리 한 뒤 상층액을 제거하고 200μL 1 x Perm 세척 완충액을 첨가하여 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 200μL의 BD cytofix를 첨가하여 LSRFortessa FACS 장비를 통해 측정 후 FlowJo 분석 프로그램을 이용하여 결과를 분석하였다. 그 결과, NK 세포의 활성을 평가할 때 사용되는 K562 세포주에 대한 CD107a의 발현과 사이토카인(IFN-γη, TNF-α)의 발현은 CBNK, CD5 CAR-NK에서 큰 차이 없이 높은 발현을 보였으며, 양성 세포주인 CCRF-CEM 및 RPMI-8402_Luc 세포주와 공배양한 경우에는 CBNK 대비 CD5 CAR-NK 그룹에서 2배 이상 높은 발현을 보인 반면 음성 세포주인 NALM-6에 대해서는 낮은 수준의 비슷한 발현을 보여 CD5 특이적으로 사이토카인을 발현하는 것을 확인하였다(도 9). 공여자 3명의 CD107a 발현량 사이토카인 2종 측정 결과는 양측 t-검정를 이용하여 통계적 유의성을 확인하였으며 표 8에 평균값±표준편차로 나타내었다(도 9, *p<0.05, **p<0.01, ns: 유의성 없음). CBNK 대비 CD5 CAR-NK에서 CD5 특이적으로 높은 CD107a의 발현과 사이토카인 발현 증가를 보였으며 MCB와 DP 사이의 통계적 유의성은 없었다.
| CD107α | w/o 타겟 | K562 | NALM6 | CCRF-CEM | RPMI-8402_ Luc | |
| CBNK (MCB) | 평균 | 5.59 | 55.57 | 10.26 | 18.19 | 7.87 |
| STD | 8.48 | 14.85 | 11.58 | 8.79 | 7.99 | |
| CD5 CAR-NK (MCB) | 평균 | 7.97 | 48.55 | 9.15 | 45.37 | 30.6 |
| STD | 7.68 | 3.14 | 7.05 | 7.17 | 13.82 | |
| CBNK(MCB) vs CD5CAR-NK(MCB)의 p-값 |
ns | ns | ns | 0.0149 | 0.0643 | |
| CBNK (DP) | 평균 | 4.14 | 46.69 | 7.96 | 19.82 | 5.72 |
| STD | 5.44 | 5.19 | 3.23 | 3.02 | 4.07 | |
| CD5 CAR-NK (DP) | 평균 | 7.56 | 47.51 | 9.87 | 43.15 | 24.4 |
| STD | 9.53 | 6.79 | 4.41 | 7.19 | 8.56 | |
| CBNK(DP) vs CD5CAR-NK(DP)의 p-값 |
ns | ns | ns | 0.0429 | 0.0251 | |
| CD5CAR-NK(MCB)vs CD5CAR-NK(DP)의 p-값 |
ns | ns | ns | 0.0573 | 0.4914 | |
| IFN-γ | w/o 타겟 | K562 | NALM6 | CCRF-CEM | RPMI-8402_ Luc | |
| CBNK (MCB) | 평균 | 3.3 | 56.51 | 4.66 | 9.89 | 3.76 |
| STD | 2.83 | 6.62 | 2.37 | 0.2 | 0.98 | |
| CD5 CAR-NK (MCB) | 평균 | 7.65 | 50.99 | 7.8 | 54.7 | 45.47 |
| STD | 6.36 | 15.79 | 5.47 | 14.86 | 15.82 | |
| CBNK(MCB) vs CD5CAR-NK(MCB)의 p-값 |
ns | ns | ns | 0.0344 | 0.05 | |
| CBNK (DP) | 평균 | 5.17 | 49.83 | 5.96 | 13.65 | 4.23 |
| STD | 4.91 | 7.1 | 2.6 | 5.25 | 1.67 | |
| CD5 CAR-NK (DP) | 평균 | 3.17 | 49.54 | 5.36 | 49.88 | 36.07 |
| STD | 1.07 | 8.15 | 1.71 | 5.35 | 3.91 | |
| CBNK(DP) vs CD5CAR-NK(DP)의 p-값 |
ns | ns | ns | 0.0064 | 0.0072 | |
| CD5CAR-NK(MCB) vs CD5CAR-NK(DP)의 p-값 |
ns | ns | ns | 0.4959 | 0.3298 | |
| TNF-α | w/o 타겟 | K562 | NALM6 | CCRF-CEM | RPMI-8402_ Luc | |
| CBNK (MCB) | 평균 | 3.49 | 44.49 | 7.54 | 10.27 | 5.45 |
| STD | 4.78 | 18.61 | 8.03 | 6.53 | 5.91 | |
| CD5 CAR-NK (MCB) | 평균 | 4.38 | 35.72 | 5.94 | 41.33 | 37.24 |
| STD | 3.9 | 3.09 | 4.5 | 3.76 | 5.18 | |
| CBNK(MCB) vs CD5CAR-NK(MCB)의 p-값 |
ns | ns | ns | 0.0042 | 0.0024 | |
| CBNK (DP) | 평균 | 3.82 | 41.66 | 6.83 | 12.94 | 5.14 |
| STD | 5.15 | 4 | 3.54 | 2.22 | 4.09 | |
| CD5 CAR-NK (DP) | 평균 | 3.83 | 42.28 | 7.59 | 45.47 | 35.34 |
| STD | 4.47 | 5.3 | 3.61 | 0.46 | 2.81 | |
| CBNK(DP) vs CD5CAR-NK(DP)의 p-값 |
ns | ns | ns | 0.0022 | 0.0018 | |
| CD5CAR-NK(MCB) vs CD5CAR-NK(DP)의 p-값 |
ns | ns | ns | 0.2001 | 0.4893 | |
6-4) CD5 CAR 형질도입 세포의 종양세포 살해능 평가
NK 세포(CBNK, CD5 CAR-NK)를 회수하여 상온, 1200 rpm 으로 5분간 원심분리하였다. 상층액은 제거하고 1 mL 어세이 배지로 현탁 후 세포 수를 측정하였다. 5 mL FACS 튜브에 형질도입 세포를 E (NK 세포):T (타겟 세포) 비율에 맞게 어세이 배지에 현탁하여 첨가하였다. NK 세포는 다음과 같이 10:1 비율은 1 x 105 cells/100μL, 3:1 비율은 3 x 104 cells/100μL, 1:1 비율은 1 x 104 cells/100μL, 0.3:1 비율은 3 x 103 cells/100μL이 되게 준비하였다.
96-웰 둥근바닥 플레이트에 타겟 세포주를 1 x 104 cells/well(1 x 105 cells/mL, 100μL)로 고정하고 NK 세포를 E:T 비율에 맞게 100μL씩 넣어주었다. Calcein-AM으로 염색된 타겟 세포에서 스스로 방출되는 Calcein-AM에 대한 형광값을 보정해주기 위해 타겟 세포 100 μL와 어세이 배지 100 μL를 넣어주고 이때 측정된 값을 최소방출량 값으로 하였다. 타겟 세포에서 최대로 방출되는 Calcein-AM 형광 값을 측정하기 위해, 타겟 세포 100 μL와 2% 트리톤 X-100을 100μL을 넣어 세포를 전부 용해시키고 이 때 측정된 형광값을 최대방출량 값으로 하였다. 트리톤 X-100에 의해 형광값이 낮아지는 것을 보정하기 위해, MM 웰에는 어세이 배지 200 μL를 넣고 MT 웰에는 어세이 배지 100μL와 2% Triton X-100 100μL를 넣어주었다. 차광 하에 37℃ 배양기에서 4시간 동안 배양 후 4℃, 2000 rpm으로 3 분간 원심분리하였다. 상층액 100 μL를 검정 96-웰 납작바닥 플레이트에 옮겨 넣고 458 nm/535nm, 0.1s 조건에서 형광측정기를 이용하여 형광값을 측정하고 세포 살해능은 표 9의 계산식에 따라 계산하였다.
| NK 세포 살해능 계산 방법 |
| MM 웰 평균 형광 값 - MT 웰 평균 형광 값 = 특이적 용해 비율 A% = [(시료 웰 평균 형광 값 - 최소방출량 웰 평균 형광 값) /(최대방출량 웰 평균 형광 값 + A) - 최소방출량 웰 평균 형광 값] x 100 |
3명의 공여자(2024P, 2044P, 605463P)에서 4 종의 타겟 세포에 대한 CBNK (MCB), CD5 CAR-NK(MCB), CBNK(DP), CD5 CAR-NK(DP)의 각 세포 살해능을 도 7에 나타내었으며, 각 세포 살해능 수치(%)는 하기 표 10에 요약하였다. 도 11 및 표 10에서 보는 바와 같이, CD5 양성세포주인 CCRF-CEM과 RPMI-8402-Luciferase 세포에 대한 CD5 CAR-NK 세포의 종양살해능이 CBNK 대비 높았으며 CD5 CAR-NK(MCB)와 CD5 CAR-NK(DP) 간의 차이는 크지 않았다(양측 t-검정 *p<0.05, **p<0.01, ***<0.001, ns: 유의성 없음).
| K562 | 10:1 | 3:1 | 1:1 | 0.3:1 | |
| CBNK (MCB) | 평균 | 82.65 | 74.02 | 45.16 | 18.80 |
| STD | 2.96 | 4.81 | 6.25 | 6.08 | |
| CD5 CAR-NK (MCB) |
평균 | 82.53 | 71.45 | 39.17 | 14.13 |
| STD | 7.87 | 4.24 | 4.08 | 5.14 | |
| CBNK(MCB) vs CD5 CAR-NK(MCB)의 p-값 | ns | ns | ns | ns | |
| CBNK (DP) | 평균 | 82.13 | 57.72 | 25.43 | 8.28 |
| STD | 6.74 | 3.83 | 4.27 | 2.65 | |
| CD5 CAR-NK (DP) |
평균 | 92.76 | 65.25 | 30.27 | 8.26 |
| STD | 6.61 | 7.40 | 8.32 | 5.59 | |
| CBNK(DP) vs CD5 CAR-NK(DP)의 p-값 | ns | ns | ns | ns | |
| CD5 CAR-NK(MCB) vs CD5 CAR-NK(DP)의 p-값 | ns | ns | ns | 0.0264 | |
| NALM6 | 10:1 | 3:1 | 1:1 | 0.3:1 | |
| CBNK (MCB) | 평균 | 15.60 | 9.48 | 5.31 | 3.54 |
| STD | 4.27 | 4.44 | 4.25 | 2.93 | |
| CD5 CAR-NK (MCB) |
평균 | 6.75 | 2.91 | 0.43 | -0.75 |
| STD | 3.14 | 3.04 | 3.89 | 2.95 | |
| CBNK(MCB) vs CD5CAR-NK(MCB)의 p-값 | 0.0286 | 0.0226 | 0.0242 | 0.0291 | |
| CBNK (DP) | 평균 | 6.96 | 3.11 | 3.80 | 6.78 |
| STD | 7.68 | 3.66 | 2.79 | 2.59 | |
| CD5 CAR-NK (DP) |
평균 | 13.51 | 3.45 | 1.75 | 3.95 |
| STD | 14.69 | 5.43 | 2.19 | 2.60 | |
| CBNK(DP) vs CD5CAR-NK(DP)의 p-값 | ns | ns | 0.045 | 0.0017 | |
| CD5 CAR-NK(MCB) vs CD5 CAR-NK(DP)의 p-값 | ns | ns | ns | ns | |
| CCRF-CEM | 10:1 | 3:1 | 1:1 | 0.3:1 | |
| CBNK (MCB) | 평균 | 29.68 | 18.56 | 10.86 | 4.83 |
| STD | 7.08 | 4.96 | 3.05 | 1.64 | |
| CD5 CAR-NK (MCB) |
평균 | 59.04 | 48.76 | 29.66 | 11.09 |
| STD | 2.83 | 2.59 | 3.54 | 2.43 | |
| CBNK(MCB) vs CD5CAR-NK(MCB)의 p-값 | 0.0345 | 0.0182 | 0.0378 | ns | |
| CBNK (DP) | 평균 | 24.91 | 11.53 | 5.16 | 2.98 |
| STD | 7.86 | 4.65 | 0.74 | 0.74 | |
| CD5 CAR-NK (DP) |
평균 | 74.20 | 50.30 | 20.90 | 6.86 |
| STD | 7.06 | 7.02 | 4.33 | 3.68 | |
| CBNK(DP) vs CD5CAR-NK(DP)의 p-값 | 0.0002 | 0.0063 | 0.0237 | ns | |
| CD5 CAR-NK(MCB) vs CD5 CAR-NK(DP)의 p-값 | ns | ns | 0.0437 | ns | |
| RPMI-8402 루시퍼라제 | 10:1 | 3:1 | 1:1 | 0.3:1 | |
| CBNK (MCB) | 평균 | 15.27 | 8.13 | 5.17 | 3.52 |
| STD | 5.29 | 3.71 | 2.66 | 4.91 | |
| CD5 CAR-NK (MCB) |
평균 | 61.76 | 36.60 | 13.97 | 3.29 |
| STD | 2.37 | 3.78 | 2.73 | 4.45 | |
| CBNK(MCB) vs CD5 CAR-NK(MCB)의 p-값 | 0.0082 | 0.0044 | 0.0051 | ns | |
| CBNK (DP) | 평균 | 6.44 | 2.26 | 2.09 | 4.90 |
| STD | 0.77 | 2.60 | 3.48 | 3.61 | |
| CD5 CAR-NK (DP) |
평균 | 60.12 | 27.42 | 9.28 | 4.86 |
| STD | 11.07 | 3.84 | 2.82 | 3.38 | |
| CBNK(DP) vs CD5 CAR-NK(DP)의 p-값 | 0.0129 | 0.0144 | 0.0028 | ns | |
| CD5 CAR-NK(MCB) vs CD5 CAR-NK(DP) | ns | 0.0025 | ns | ns | |
6-5) CD5 CAR 형질도입 세포의 IFN-γ 분비능 확인
타겟세포를 어세이 배지에 희석하여 1 x 105/mL로 준비하고 NK 세포를 어세이 배지에 희석하여 3 x 105/mL 농도로 준비한 뒤 각각 100μL씩 96 웰 둥근바닥 플레이트에 분주하여 E:T = 3:1 비율로 공배양하였다. 이후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양 후 상층액을 취하여 -20℃에서 보관하였다.
IFN-γ 정량을 위해 ELISA를 수행하였다. 실험 하루전‘1x 코팅 완충액 A’에‘200 x 포집 항체’를 희석한 뒤 96-웰 플레이트에 100μL를 넣어 2-8℃에서 16-18시간 배양하였다. 실험 당일 세척 완충액을 이용하여 플레이트를 4회 세척하고‘1 x 어세이 희석액 A’를 200μL씩 각 웰에 넣어 비특이적 결합을 억제하였다. 플레이트를 밀봉한 뒤 플레이트 셰이커에서 1 시간 방치하였다. ‘1x 어세이 희석액 A’에‘인터페론 감마 스탠다드 저장용액’을 단계적으로 희석(500, 250, 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.8, 0 pg/mL)하여 스탠다드를 제작하였다. 이후 -20℃에 보관해 두었던 상층액을 녹여 1/10로‘1 x 어세이 희석액 A’에 희석하여 샘플을 제작하였다. 스탠다드와 희석한 샘플을 웰에 100μL씩 분주하고 플레이트를 밀봉 한 뒤 플레이트 셰이커에서 상온에서 2 시간 반응시켰다. 세척 완충액을 이용하여 플레이트를 4회 세척하였다. ‘1 x 검출 항체’를 100μL씩 각 웰에 넣고 플레이트를 밀봉한 뒤 플레이트 셰이커에서 상온에서 1시간 반응하였다. 세척 완충액을 이용하여 플레이트를 4회 세척하였다. ‘1 x Avidin-HRP’를 100μL씩 각 웰에 넣고 플레이트를 밀봉한 뒤 플레이트 셰이커에서 상온에서 30분간 반응시켰다. 세척 완충액을 이용하여 플레이트를 5회 세척한 뒤‘TMB Substrate’를 100μL씩 웰에 넣고 상온에서 20분간 차광 하에 반응시켰다. ‘Stop 용액’을 100μL씩 넣어 반응을 종료하고, 분광광도계를 이용하여 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, CD5 음성 세포주인 K562와 NALM6에서는 공여자 3명(2024P, 2044P, 605463P)의 CBNK(MCB, DP)와 CD5 CAR-NK(MCB, DP)간의 IFN-γ 분비의 차이는 있지만 모든 공여자의 결과를 종합해서 분석했을 때 유의미한 차이는 없었다. CD5 양성 세포주인 CCRF-CEM과 RPMI-8402-Luciferase에서는 공여자 2024P에서 CBNK(MCB, DP)는 40-60 pg/mL, CD5 CAR-NK(MCB, DP)는 350-550 pg/mL의 IFN-γ를 분비하였고, CBNK 대비 CD5 CAR-NK의 IFN-γ의 분비량이 약 8~9배 높았다. 공여자 2044P에서는 CBNK(MCB, DP)는 45-55 pg/mL, CD5 CAR-NK(MCB, DP)에서는 250-350 pg/mL의 IFN-γ를 분비하여 CBNK 대비 CD5 CAR-NK가 약 5~6배 많이 IFN-γ를 분비했다. 공여자 605463P에서는 CBNK(MCB, DP)는 70-120 pg/mL, CD5 CAR-NK (MCB, DP)는 600-1300 pg/mL의 IFN-γ를 분비하여 CD5 CAR-NK가 CBNK에 비해서 8~10배 많은 IFN-γ를 분비했다. 종합적으로 공여자 3명 모두 CD5 CAR-NK에서 CD5 양성세포주 특이적으로 향상된 IFN-γ 분비능을 나타냈고, 통계적으로 의미 있는 결과를 보였다(도 12, *p<0.05, **p<0.01, ***<0.001, ****<0.0001, ns: 유의성 없음). CD5 CAR-NK(MCB)와 CD5 CAR-NK(DP) 사이의 통계적 유의성은 없었다.
| IFN-g | K562 | NALM6 | CCRF-CEM | RPMI-8402_Luc | |
| CBNK (MCB) | 평균 | 357.54 | 31.32 | 45.56 | 37.56 |
| STD | 365.59 | 21.42 | 37.40 | 27.52 | |
| CD5 CAR-NK (MCB) |
평균 | 386.74 | 76.47 | 646.38 | 556.69 |
| STD | 146.29 | 30.05 | 285.06 | 156.63 | |
| CBNK(MCB) vs CD5 CAR-NK(MCB)의 p-값 | ns | 0.0021 | <0.0001 | <0.0001 | |
| CBNK (DP) | 평균 | 304.12 | 37.84 | 54.67 | 45.59 |
| STD | 228.44 | 25.69 | 46.72 | 37.87 | |
| CD5 CAR-NK (DP) |
평균 | 303.88 | 59.91 | 707.42 | 581.36 |
| STD | 142.75 | 9.07 | 443.92 | 194.58 | |
| CBNK(DP) vs CD5 CAR-NK(DP)의 p-값 | ns | 0.0272 | 0.0005 | <0.0001 | |
| CD5 CAR-NK(MCB) vs CD5 CAR-NK(DP)의 p-값 | ns | ns | ns | ns | |
6-6) CD5 CAR 형질도입 세포의 IL-15 분비능 확인
타겟 세포와 NK 세포를 어세이 배지에 희석하여 타겟 세포는 2 x 106/mL, NK세포는 6 x 106/mL 농도로 준비하였다. 각각 100μL씩 96 웰 둥근바닥 플레이트에 분주하여 E:T = 1:3의 비율로 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 공배양한 후 상층액을 얻어 -20℃로 보관하였다.
IL-15 ELISA kit를 이용하여 ELISA 분석을 수행하였다. 마이크로 플레이트 스트립을 플레이트 틀에 끼우고 어세이 희석액 RD1-19를 각 웰에 100μL씩 분주하였다. IL-15 스탠다드와 보관해 두었던 상층액을 플레이트에 50μL씩 분주하고, 상온에서 3시간, 셰이커에서 반응시켰다. 세척 완충액을 이용하여 플레이트를 4회 세척하였다. ‘IL-15 컨쥬게이트를 각 웰에 200μL씩 넣고, 상온에서 45분간 셰이커에서 반응시켰다. 세척완충액을 이용하여 플레이트를 4회 세척한 뒤‘Substrate 용액’을 200μL씩 넣고, 상온에서 30분간 차광 반응하였다. ‘Stop 용액’50μL씩 넣어 반응을 종료하고, 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 도 13 및 하기 표 12에서 보는 바와 같이 타겟 세포 없이 NK 세포만 배양한 조건 (effector only)에서는 3명의 공여자에서 CBNK(MCB, DP) 4-6 pg/mL, CD5 CAR-NK (MCB, DP) 5-17 pg/mL 수준의 IL-15을 분비하였다. CD5 음성 세포주인 K562와 NALM6에서는 3명의 공여자의 CBNK(MCB, DP)와 CD5 CAR-NK(MCB, DP)에서 NK 세포만 배양한 그룹(effector only)과 비슷한 수준의 IL-15을 분비하였다. CD5 양성 세포주인 CCRF-CEM과 RPMI-8402-Luciferase에 대해 CBNK(MCB, DP)는 CD5 음성 세포주와 비슷한 수준의 IL-15을 분비하였으며, CD5 CAR-NK(MCB, DP)에서는 공여자 2024P는 25-60pg/mL, 공여자 2044P에서는 8~13 pg/mL, 공여자 605463P 20-50pg/mL로 IL-15의 분비가 증가하여 CBNK 대비 CD5 CAR-NK에서 MCB, DP 모두 통계적으로 의미있는 결과를 보였다. CD5 CAR-NK(MCB)가 CD5 CAR-NK(DP) 사이의 통계적 유의성은 없었다(도 13, *p<0.05, **p<0.01, ns:유의성 없음).
| IL-15 | Effector only | K562 | NALM6 | CCRF-CEM | RPMI-8402_Luc | |
| CBNK (MCB) | 평균 | 4.97 | 5.88 | 4.98 | 5.06 | 5.81 |
| STD | 0.24 | 0.59 | 0.24 | 0.28 | 0.29 | |
| CD5 CAR-NK (MCB) | 평균 | 12.21 | 11.80 | 8.41 | 39.97 | 20.95 |
| STD | 5.00 | 3.78 | 2.23 | 21.81 | 8.32 | |
| CBNK(MCB) vs CD5 CAR-NK(MCB)의 p-값 | 0.0053 | 0.0036 | 0.0038 | 0.0029 | 0.0012 | |
| CBNK (DP) | 평균 | 4.97 | 4.99 | 4.95 | 4.86 | 5.58 |
| STD | 0.41 | 0.16 | 0.12 | 0.25 | 0.20 | |
| CD5 CAR-NK (DP) | 평균 | 7.65 | 8.55 | 6.59 | 19.85 | 13.27 |
| STD | 1.86 | 2.89 | 1.58 | 11.39 | 5.98 | |
| CBNK(DP) vs CD5CAR-NK(DP)의 p-값 | 0.0063 | 0.0131 | 0.0302 | 0.0092 | 0.0103 | |
| CD5CAR-NK(MCB) vs CD5CAR-NK(DP)의 p-값 |
ns | ns | ns | ns | ns | |
6-7) CD5 CAR 유전자 도입한 NK 세포의 장시간 종양 세포주 살해능 분석시험
CD5 CAR 유전자를 도입한 NK 세포의 장시간 종양 세포주 살해능을 평가하기 위해 적색 형광단백질을 발현하는 종양 세포주를 3명 공여자의 CD5 CAR 세포와 96시간동안 공배양하여 종양 세포주 살해능을 확인하고자하였다. CD5 음성 B 세포 유래 암세포인 NALM6와 CD5 양성 급성 T 림프구성 백혈병 세포주인 CCRF-CEM 및 RPMI-8402를 실험에 사용하였다. 어세이 배지(10% FBS가 포함된 RPMI 1640 (Gibco, 11875093))를 사용하여 종양세포를 1 x 105 cells/mL의 농도로 부유시켰다. 종양 세포주를 스페로이드 형태로 만들기 위해 96-웰 ULA(ultra-low attachment) 플레이트(Corning)에 웰 당 100 μL씩 넣어 준 후 125g, 4℃, 10분간 원심분리 하였다. NALM6, RPMI-8402와 공배양하는 NK 세포는 1 x 105cells/mL의 농도(E:T 비율=1:1)로 준비하였고 CCRF-CEM과 공배양하는 NK 세포는 0.3 x 105 cells/mL의 농도(E:T 비율= 0.3:1)로 어세이 배지를 사용하여 부유시킨 후 종양 세포를 넣어준 웰에 100 μL씩 첨가하였다. 종양 세포 단독 대조군은 NK 세포 대신 어세이 배지 100 μL를 종양 세포 100 μL와 넣어 주었다. Incucyte S3 기기 (Sartorius)에 플레이트를 넣고 96시간 동안 공배양하여 얻어진 종양 세포의 스페로이드 내 적색 형광강도(All Brightfield Object Total Red Integrated Intensity, RCU x μm2/Image)를 Oncocyte 스페로이드 분석 소프트웨어(v2019B)를 사용하여 분석하였다. 그래프는 각 시간대 공배양한 웰의 적색 형광강도를 종양세포만 넣은 웰의 적색 형광강도로 정규화(normalization)하여 수치를 나타내었다. 도 10에서 보는 바와 같이, 3명의 공여자에서 분리하여 제작한 NK 세포의 CD5 음성 NALM6 세포에 대한 종양 살해능은 CBNK 세포 대비 유사하였다. CD5 양성 종양세포인 CCRF-CEM에 대해 CBNK 세포(MCB, DP) 대비 CD5 CAR-NK 세포(MCB, DP)는 지속적으로 종양세포의 성장을 억제하였고 공여자 1의 MCB와 DP의 CD5 CAR-NK 세포는 종양세포 증식 저해능이 유사하였다. 반면에, 공여자 2와 3에서는 CCRF-CEM과 공배양시 CD5 CAR-NK 세포(DP)보다 CD5 CAR-NK 세포(MCB)의 종양세포 살해능이 더 높았다. CD5 양성 종양세포인 RPMI-8402에 대해 두 공여자(공여자 1 및 3)의 경우 CBNK 세포(MCB, DP) 대비 CD5 CAR-NK 세포(MCB)의 종양세포 살해능이 CD5 CAR-NK 세포(DP)보다 더 높았으나, 공여자 2의 CD5 CAR-NK 세포(DP)는 종양살해능을 보이지 않았으며(도 14), 양측 t-검정을 통해 유의성을 확인하였다(*p<0.05, **p<0.01, ***<0.001, ns: 유의성 없음). 결론적으로, CD5 양성 종양세포에 대한 CD5 CAR NK 세포의 장시간 종양세포 살해능을 확인하였으며 CD5 CAR-NK(DP) 세포보다 CD5 CAR-NK(MCB) 세포가 높은 살해능을 보였다(표 13).
| NALM-6 (0.3:1) | CCRF-CEM (0.3:1) | RPMI-8402 (1:1) | ||
| 타겟 only | 평균 | 100 | 100 | 100 |
| STD | 0 | 0 | 0 | |
| CBNK (MCB) | 평균 | 102.00 | 85.88 | 108.41 |
| STD | 7.71 | 5.47 | 5.44 | |
| CBNK(MCB)의 p-값 | ns | ns | ns | |
| CAR-NK (MCB) | 평균 | 109.92 | 12.82 | 54.08 |
| STD | 12.05 | 6.51 | 23.27 | |
| CAR-NK(MCB)의 p-값 | ns | <0.0001 | 0.0063 | |
| CBNK (DP) | 평균 | 108.50 | 88.07 | 106.36 |
| STD | 5.33 | 5.52 | 2.23 | |
| CBNK(DP)의 p-값 | ns | ns | ns | |
| CAR-NK (DP) | 평균 | 114.07 | 30.45 | 79.49 |
| STD | 14.77 | 22.56 | 11.52 | |
| CAR-NK(DP)의 p-값 | 0.0157 | <0.0001 | ns | |
실시예 7: CD5 CAR 형질도입 세포의
인 비보
효능 평가
7-1) 종양세포 배양 및 동결
인체 유래 T세포성급성림프성백혈병 암세포주인 RPMI-8402에 CML-Luc 렌티바이러스 벡터를 삽입하여 제작한 RPMI-8402-Luc 세포주를 배양하였다. 암세포주 배양 배지는 10%(v/v)의 우태아혈청(FBS)(Gibco), 2.0 μg/mL의 퓨로마이신(Gibco)을 포함하는 IMDM 배지(ATCC)를 사용하며, 암세포주 배양시 세포 농도를 1 x 105 cells/mL로 조절하여 적절한 용량의 배양 용기에 배양하였다. 암세포주의 동결은 20% DMSO(Avantor)를 포함하는 암세포주 배양 배지를 사용하며 Mr. Frosty(동결용기)(Thermo Fisher)를 이용하여 초저온 냉동고에서 일주일 이내로 보관 후 초저온 액체질소탱크로 옮겨 보관하였다.
7-2) 종양세포주 이종이식 및 NK 세포 투여
실험동물의 경우 특정병원체 부재(SPF)NOD.Cg-Prkdc scid IL2γg tm1Sug /JicKoat(이하 NOG) 마우스(새론바이오 공급(제작: ㈜코아텍))로 6주령 암컷을 사용하였다. 마우스 종양이식에 사용할 암세포는 동결된 세포주를 해동한 후 3~4일에 한번씩 계대배양하여 준비했고, 마우스에 종양을 이식하는 당일 모든 암세포를 수거하여 원심분리하고 PBS를 이용해 재현탁하였다. 종양세포 및 NK 세포의 투여조건은 ①투여 횟수 및 투여량에 따른 비교(MCB), ② 배양 조건에 따른 비교(MCB, DP)로 나누어 실험을 진행하였다.
① 투여 횟수 및 투여량에 따른 비교의 경우 종양 세포주를 5 x 106 cells/mL의 농도로 세포 현탁액을 준비하였다. 준비한 세포 현탁액을 각 실험군별로 마우스 한 마리당 0.2 mL씩 꼬리 정맥에 주사하여 1 x 106 cells/head로 암세포를 이식하였다. 이식 3일 후부터 CBNK(MCB) 및 CD5 CAR-NK(MCB) 세포를 (A) 단회 투여; (B) 주 2회 간격으로 3회 투여; 및 (C) 주 1회 간격으로 3회 투여하는 총 3개의 시험군으로 구성하였다(표 14). 동결된 NK 세포를 해동한 후 동결배지를 이용하여 세포 현탁액의 농도를 실험조건에 맞게 재현탁한 뒤 0.2 mL씩 단회 혹은 총 3회 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 총 3회 투여는 주 2회 기준 3, 7, 10 일차에 NK 세포를 투여하였으며, 주 1회 기준 3, 10, 17 일차에 NK 세포를 투여하였다. 주 1회 총 3회 투여하는 시험군의 경우 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107 cells/head로 CD5 CAR-NK (MCB)의 투여 용량을 나누어 투여하였다. 대조군으로 PBS만을 투여하는 실험군과 암세포주 1 x 106 cells/head만을 투여하는 Tumor only 실험군을 추가했고, 각 실험군에는 3 또는 5 개체를 포함시켰다.
② 배양 기간에 따른 비교(MCB, DP)의 경우 종양 세포주를 1.5 x 107 cells/mL의 농도로 세포 현탁액을 준비하였다. 준비한 세포 현탁액을 각 실험군별로 마우스 한 마리당 0.2 mL씩 꼬리 정맥에 주사하여 3 x 106 cells/head로 암세포를 이식하였다. 이식 3일 후부터 CBNK (MCB) 및 CD5 CAR-NK (MCB, DP) 세포를 단회로 1 x 107 cells/head씩 투여하였다(표 15). 대조군으로 PBS만을 투여하는 실험군과 암세포주 3 x 106 cells/head만을 투여하는 Tumor only 실험군을 추가했고, 각 실험군에는 3 또는 5 개체를 포함시켰다.
| 그룹 | 투여물질 | 투여량(세포/head) | 투여 간격 | 투여 횟수 | 개체수 |
| 대조군 | PBS | N/A | N/A | N/A | 3 |
| Tumor only | N/A | N/A | N/A | 5 | |
| (A) | CBNK (MCB) | 1 x 107 | 1회 | 1회 | 5 |
| CD5 CAR-NK (MCB) | 1 x 107 | 1회 | 1회 | 5 | |
| (B) | CBNK (MCB) | 1 x 107 | 주 2회 | 3회 | 5 |
| CD5 CAR-NK (MCB) | 1 x 107 | 주 2회 | 3회 | 5 | |
| (C) | CBNK (MCB) | 1 x 107 | 주 1회 | 3회 | 5 |
| CD5 CAR-NK (MCB) | 1 x 107 | 주 1회 | 3회 | 5 | |
| CD5 CAR-NK (MCB) | 5 x 106 | 주 1회 | 3회 | 5 | |
| CD5 CAR-NK (MCB) | 2 x 106 | 주 1 회 | 3회 | 5 |
| 그룹 | 투여물질 | 투여량(세포/head) | 투여 간격 | 투여 횟수 | 개체수 |
| 대조군 | PBS | N/A | N/A | N/A | 3 |
| Tumor only | N/A | N/A | N/A | 5 | |
| 실험군 | CBNK (MCB) | 1 x 107 | 주 1회 | 3회 | 4 |
| CD5 CAR-NK (MCB) | 1 x 107 | 주 1회 | 3회 | 7 | |
| CD5 CAR-NK (DP) | 1 x 107 | 주 1회 | 3회 | 7 |
7-3) 마우스에서 투여횟수 및 투여량에 따른 CD5 CAR-NK 세포의 효능 평가
모든 동물에 대하여 시험기간 중 하루 2회(주말 및 공휴일 1회) 일반증상 및 일주일에 3회 체중 변화를 측정하였고 암세포 이식 60일째부터는 일주일에 1회 체중 변화를 측정하였다. 사망 여부 또한 관찰한 뒤 GraphPad Prism을 이용하여 모든 군의 중앙 생존 기간(Median survival time)을 계산함으로써 생존율을 평가하였다. 15 mg/ml 농도의 D-루시페린(GOLDBIO)을 마우스의 복부 양쪽에 각각 50μL씩 복강투여한 후 2% 이소플루란으로 7분간 흡입마취하여 소동물 생체 이미징(Perkin Elmer, IVIS Spectrum Series)을 실시하였다. 암세포 이식일부터 주 1회씩 총 13회(이식일로부터 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 70, 84, 102, 112일) 영상을 촬영하였다. 그 결과, CBNK(MCB) 투여군에서 투여 횟수에 관계없이 모든 개체에서 40일 전후로 뒷다리 마비 증상을 확인하였고 증상 발현 후 2주 이내에 모든 개체가 사망하였으며 Tumor only 군에 비해 더 이른 시점에 사망하여 중앙생존기간이 48 - 50일로 측정되었다(표 16). CD5 CAR-NK(MCB) 투여군의 경우 단회 투여군에서는 뒷다리 마비 증상이 관찰되지 않았고 주 2회 간격으로 총 3회 투여군과 주 1회 간격으로 총 3회 투여군 중 일부의 개체에서만 뒷다리 마비 증상이 관찰되었다. 용량별 비교 결과, 저용량 투여시 더 많은 개체가 뒷다리 마비 증상을 보였다. 최종 관찰시점인 137일에 CD5 CAR-NK(MCB) 투여군의 중앙생존기간은 각각 단회 투여군 129일, 주 2회 간격으로 총 3회 투여 >137일, 주 1회 간격으로 총 3회 투여군의 경우 5 x 106, 1x107 cells/head 실험군 모두 >137일, 2 x 106 cells/head 실험군 100일로 tumor only 및 CBNK(MCB) 투여군의 중앙생존기간이 50일 전후인 데 반해 2배 이상의 생존기간 연장 효과를 보였다(표 16). 주 1회 총 3회 투여군을 통해 투여 용량과 횟수가 많을수록 생존 기간이 늘어나는 경향을 확인하였다(도 15)(*p<0.05, **p<0.01, ***<0.001, ns: 유의성 없음).
체중변화의 경우 Tumor only 군과 CBNK(MCB) 투여군은 37일 전후로 체중 감소가 시작되었고 각각 56일과 53일째 모든 개체가 사망하였으며 질병의 진행에 따라 체중이 감소하다가 사망하는 경향을 보였다. CD5 CAR-NK(MCB) 투여군의 경우 뚜렷한 체중 감소가 관찰되지 않은 채 사망하는 경우도 있었다.
영상 측정 결과, 단회 및 3회 투여한 CBNK(MCB) 투여군의 경우 21일차부터 영상 신호가 측정되는 반면 모든 CD5 CAR-NK (MCB) 투여군은 영상 신호가 측정되지 않아 두드러진 종양 형성 억제능을 확인할 수 있었다(도 16). 56일째 CBNK(MCB) 투여군이 모두 사망한 시점에도 CD5 CAR-NK(MCB) 투여군은 2 x 106 cells/head 실험군 중 일부 개체를 제외하고 종양이 형성이 억제된 것을 확인할 수 있었다. 영상신호수치(photon/s)를 측정 결과 21일차부터 CBNK(MCB) 투여군의 영상신호수치가 증가하는 반면 CD5 CAR-NK (MCB) 투여군은 단회 및 3회 투여군 모두에서 35일차까지 종양 투여일과 비슷한 수준을 유지하였다(도 16). 최종 영상관찰 시점인 112일에도 CD5 CAR-NK(MCB) 투여군의 생존 개체에서 종양형성 억제능이 유지되고 있음을 확인할 수 있었으며 일원 분산분석(ANOVA)을 통해 통계적 유의성을 확인하였다(*p<0.05, **p<0.01, ***<0.001, ****<0.0001, ns: 유의성 없음).
| 시험군 | 투여물질 | 투여량(마우스당 세포수) | 중앙생존 기간 |
P-값 |
| 대조군 | PBS | N/A | >137일 | ns |
| Tumor only | N/A | 51일 | ns | |
| (A) | CBNK (MCB) | 1 x 107 | 50일 | 0.0021 (CBNK 대비) |
| CD5 CAR-NK (MCB) | 1 x 107 | 129일 | ||
| (B) | CBNK (MCB) | 1 x 107 | 48일 | 0.0018 (CBNK 대비) |
| CD5 CAR-NK (MCB) | 1 x 107 | >137일 | ||
| (C) | CBNK (MCB) | 1 x 107 | 48일 | ns |
| CD5 CAR-NK (MCB) | 1 x 107 | >137일 | 0.0036 (CBNK 대비) | |
| CD5 CAR-NK (MCB) | 5 x 106 | >137일 | 0.0036 (CBNK 대비) | |
| CD5 CAR-NK (MCB) | 2 x 106 | 100일 | 0.0026 (CBNK 대비) |
| A (광자/s) | D0 | D7 | D14 | D21 | D28 | D35 | |
| CBNK (단일주사) |
평균 | 242000 | 460000 | 2220000 | 4530000 | 38400000 | 49600000 |
| SD | 19500 | 132000 | 940000 | 1850000 | 10800000 | 20100000 | |
| CAR-NK (단일주사) |
평균 | 243000 | 459000 | 2020000 | 559000 | 1860000 | 475000 |
| SD | 22300 | 150000 | 874000 | 81500 | 848000 | 88400 | |
| p 값 | ns | ns | ns | 0.0047 | <0.0001 | 0.0005 | |
| CBNK (3회, 주 2회) |
평균 | 243000 | 436000 | 2210000 | 5270000 | 31800000 | 60800000 |
| SD | 19000 | 108000 | 826000 | 2070000 | 7340000 | 30700000 | |
| p 값 | ns | ns | ns | ns | ns | ns | |
| CAR-NK (3회, 주 2회) |
평균 | 243000 | 421000 | 2080000 | 489000 | 2330000 | 559000 |
| SD | 38900 | 114000 | 902000 | 25500 | 1060000 | 56900 | |
| p 값 | ns | ns | ns | 0.004 | <0.0001 | 0.0005 | |
| CBNK (3회, 매주) |
평균 | 243000 | 433000 | 1860000 | 6230000 | 32400000 | 66300000 |
| SD | 26900 | 102000 | 503000 | 3050000 | 4060000 | 18900000 | |
| p 값 | ns | ns | ns | ns | ns | ns | |
| CAR-NK (3회, 매주) |
평균 | 242000 | 340000 | 1850000 | 689000 | 2760000 | 509000 |
| SD | 23200 | 110000 | 835000 | 75400 | 1420000 | 23900 | |
| p 값 | ns | ns | ns | 0.0063 | <0.0001 | 0.0005 | |
| B (광자/s) | D0 | D7 | D14 | D21 | D28 | D35 | |
| CBNK (10M/head) |
평균 | 243000 | 433000 | 1860000 | 6230000 | 32400000 | 66300000 |
| SD | 26900 | 102000 | 503000 | 3050000 | 4060000 | 18900000 | |
| CAR-NK (2M/head) |
평균 | 243000 | 349000 | 2040000 | 732000 | 2580000 | 673000 |
| SD | 29600 | 110000 | 869000 | 115000 | 1330000 | 148000 | |
| p 값 | ns | ns | ns | 0.0001 | <0.0001 | <0.0001 | |
| CAR-NK (5M/head) |
평균 | 243000 | 422000 | 2670000 | 542000 | 2230000 | 669000 |
| SD | 25900 | 117000 | 1230000 | 58900 | 893000 | 128000 | |
| p 값 | ns | ns | ns | <0.0001 | <0.0001 | <0.0001 | |
| CAR-NK (10M/head) |
평균 | 242000 | 340000 | 1850000 | 689000 | 2760000 | 509000 |
| SD | 23200 | 110000 | 835000 | 75400 | 1420000 | 23900 | |
| p 값 | ns | ns | ns | <0.0001 | <0.0001 | <0.0001 | |
7-4) 마우스에서 배양 기간에 따른 CD5 CAR-NK 세포의 효능 평가
실시예 7-3과 동일한 과정을 통해 모든 동물에 대하여 시험기간 중 주 2회 일반증상 및 체중 변화를 측정하고 중앙생존기간을 계산하여 배양 기간에 따른(MCB, DP) 생존율을 비교하였다. 암세포 이식 일부터 주 1회씩 총 17회(이식일로부터 0, 7, 14, 27, 35, 42, 49, 56, 65, 72, 78, 86, 94 100, 107, 118, 126일) 영상을 촬영하였다. 그 결과, CBNK(MCB) 투여군에서 투여 횟수에 관계없이 모든 개체에서 40일 전후로 뒷다리 마비 증상을 확인할 수 있었고 증상 발현 이후 2주 이내에 모든 개체가 사망하였으며 중앙 생존기간이 49일로 Tumor only군과 동일하게 측정되었다(표 19). CD5 CAR-NK(MCB) 투여군의 경우 69일차에 처음으로 뒷다리 마비가 나타났고 72일차에 처음으로 마우스 1 마리가 사망하였다. CD5 CAR-NK(DP) 투여군의 경우 83일차에 처음으로 마우스 1 마리가 사망하였으며 사망 직전 뒷다리 마비 증상은 없었다. 이후 CBNK(MCB)와는 달리 CD5 CAR-NK(MCB)와 CD5 CAR-NK(DP)의 일부 개체에서만 사망 전 뒷다리 마비 증상이 관찰되었다. 중앙생존기간의 경우 CD5 CAR-NK(DP)는 90일로 측정되었으나 CD5 CAR-NK(MCB)는 133일차까지 절반 이상의 마우스가 사망하지 않아 중앙생존기간을 계산할 수 없었다(도 18). 이에 CD5 CAR-NK(MCB)의 중앙생존기간이 CD5 CAR-NK(DP)보다 길었으나 통계적으로 유의한 값은 아니었다. 하지만 CD5 CAR-NK(MCB)와 CD5 CAR-NK(DP) 모두 CBNK(MCB)에 비해 통계적으로 유의한 생존율 향상 효과를 보였으며 log-rank(mantel-cox) 검정을 통해 통계적 유의성을 확인하였다(*p<0.05, **p<0.01, ***<0.001, ns: 유의성 없음).
영상 측정의 경우 Tumor only와 CBNK(MCB) 투여군의 경우 14일차부터 마우스의 뒷마리 부근에 영상신호가 측정된 반면 모든 CD5 CAR-NK(MCB) 투여군은 영상 신호가 측정되지 않아 두드러진 종양형성 억제능을 확인할 수 있었다(도 19). CD5 CAR-NK(DP) 투여군의 경우 종양세포 투여 후 35일차에 영상신호가 관측되기 시작했으며, CD5 CAR-NK(MCB)의 경우 일주일 뒤인 42일차에 영상신호가 관찰되기 시작했다. CBNK(MCB)가 모두 사망한 49일차에도 CD5 CAR-NK(MCB)와 CD5 CAR-NK(DP) 투여군은 일부 개체에서만 영상 신호가 관찰되어 통해 CBNK(MCB)에 비해 CD5 CAR-NK (MCB, DP) 투여군의 종양형성이 억제되었음을 알 수 있었다. 최종 영상관찰 시점인 126일에도 생존 개체에서는 종양 형성 억제능이 유지되고 있음을 확인하였으며 일원분산분석을 통해 통계적 유의성을 확인하였다(*p<0.05, **p<0.01, ***<0.001, ****<0.0001, ns: 유의성 없음).
| 시험군 | 투여물질 | 투여량 | 중앙생존 기간 | P-값 |
| (마우스당 NK 세포수) | ||||
| 대조군 | PBS | N/A | >133일 | ns |
| Tumor only | N/A | 49일 | ns | |
| 실험군 | CBNK (MCB) | 1 x 107 | 49일 | ns |
| CD5 CAR-NK (MCB) | 1 x 107 | >133일 | 0.0016(CBNK 대비) | |
| CD5 CAR-NK (DP) | 1 x 107 | 90일 | 0.0016(CBNK 대비) |
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (20)
- 다음을 포함하는 융합단백질:
(a) OX40 리간드(OX40L)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain); 및 CD5에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인(extracellular antigen binding domain)을 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor; CAR); 및
(b) IL(Interleukin)-15.
- 제 1 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 항-CD5 항체의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 2 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 2 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열목록 제26서열의 아미노산 서열을 가지는 HCDR1, 서열목록 제28서열의 아미노산 서열을 가지는 HCDR2 및 서열목록 제30서열의 아미노산 서열을 가지는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 4 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열목록 제32서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 2 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열목록 제34서열의 아미노산 서열을 가지는 LCDR1, 서열목록 제36서열의 아미노산 서열을 가지는 LCDR2 및 서열목록 제38서열의 아미노산 서열을 가지는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 6 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 2 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열목록 제7서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD28, CD3-zeta, OX40 및 4-1BB로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 9 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD28 및 CD3-zeta를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 10 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD28, OX40L 및 CD3-zeta가 세포막으로부터 세포내 방향으로 순서대로 포함되는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 융합단백질은 상기 키메라 항원 수용체와 상기 IL-15 사이에 위치하는 자가절단 펩타이드(self-cleaving peptide)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 12 항에 있어서, 상기 자가절단 펩타이드는 서열목록 제21서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 융합단백질을 인코딩하는 핵산 분자.
- 제 14 항의 핵산 분자를 발현하는 면역세포.
- 다음을 발현하는 면역세포:
(a) OX40 리간드(OX40L)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain); 및 CD5에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인(extracellular antigen binding domain)을 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor; CAR); 및
(b) IL(Interleukin)-15.
- 제 16 항에 있어서, 상기 면역세포는 자연살해세포인 것을 특징으로 하는 면역세포.
- 제 17 항에 있어서, 상기 자연살해세포는 23일 내지 35일간 배양 후 동결 및 해동된 자연살해세포인 것을 특징으로 하는 면역세포.
- 제 15 항 또는 제 16 항의 면역세포를 유효성분으로 포함하는 CD5 양성 종양의 예방 또는 치료용 조성물.
- 제 19 항에 있어서, 상기 CD5 양성 종양은 림프구성 백혈병인 것을 특징으로 하는 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2023/015186 WO2024076121A1 (ko) | 2022-10-05 | 2023-10-04 | Cd5를 표적하는 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 면역세포 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240049688A true KR20240049688A (ko) | 2024-04-17 |
Family
ID=
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