KR20230117589A - 항체 약물 접합체, 이의 중간체, 제조 방법 및 용도 - Google Patents

항체 약물 접합체, 이의 중간체, 제조 방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항체 약물 접합체, 이의 중간체, 제조 방법 및 용도를 개시한다. 본 발명은 우수한 표적화성을 가지고, HER3을 양성으로 발현하는 종양 세포에 대해 우수한 억제 효과를 가지며, 또한 우수한 약용성, 높은 안전성을 가지는 식(I)으로 표시되는 항체 약물 접합체를 제공한다. 상기 항체 약물 접합체는 HER3에 대한 억제 효과가 있고, SK-BR-3 및 SW620 세포에 대한 억제 효과도 있으며, 또한 22Rv1, LNCaP, NCI-H820, OVCAR-8 및 HCC827 세포 중 적어도 하나에 대해 우수한 억제 효과가 있다.

Description

항체 약물 접합체, 이의 중간체, 제조 방법 및 용도
본 발명은 생물의약 분야에 관한 것으로, 특히 항체 약물 접합체, 이의 중간체, 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
HER 패밀리는 구조적으로 유사하고 기능적으로 관련된 4개의 RTKs로 구성되어 있으며, 각각 HER1(EGFR), HER2, HER3 및 HER4이고, 수용체 간의 이합체화는 HER 패밀리가 이의 기능 및 신호 전달 활성을 발휘하기 위한 기본 조건이다. 수용체의 이합체화 후, 세포 내의 고도로 보존된 키나아제 잔기의 가교 및 인산화를 유도하여 하류 단백질을 모집하고 활성화시켜 신호 캐스케이드 반응을 일으켜, 세포의 증식, 생존, 이동, 발생, 전이 등 과정을 조절한다. HER3은 비록 뉴레귤린(Neuregulin, NRG)과 결합할 수 있으나. 내재적 티로신 키나아제 활성이 부족하기 때문에 다른 수용체와 이종이합체를 형성해야만 기능을 발휘할 수 있다. 반대로 HER2는 티로신 키나아제 활성을 가지고 있지만 이에 결합하는 상응하는 리간드가 없다. HER2의 세포외 영역의 구조는 자연적으로 개방된 구조로서, HER2가 리간드의 활성화 없이 다른 수용체와 이합체화할 수 있도록 하므로 HER2는 HER3의 바람직한 이합체화 파트너이다.
HER2와 HER3이 이종이합체를 형성하여, PI3K/AKT 경로를 직접적으로 활성화시킬 수 있으며, PI3K/AKT 경로는 종양 세포 증식을 촉진하는 가장 중요한 신호 전달 경로로서, 유전자 발현 조절, 세포 대사, 세포 골격 재배열 등 과정에 참여하므로 HER2-HER3 이종이합체는 HER 패밀리에서 신호 전달 능력이 가장 강한 이합체로 간주된다. 연구에 따르면 PI3K/AKT 경로를 직접적 또는 간접적으로 억제하는 약물은 HER3 전사를 증가시킬 수 있고, PI3K/AKT 음성 피드백 조절을 통해 HER3 발현을 상향 조절 및 활성화하며, 약물 내성을 생성하기 위해 하류 경로를 재활성화시키고, 항HER2 및 항EGFR 표적 치료의 내성과 관련된다. 또한 HER3의 주요 리간드인 NRG1은 주변 분비 및 자가 분비 경로를 통해 HER3의 신호 전달 등에 참여하여 HER3 경로의 활성화를 유도할 수 있으며, HER 패밀리 표적 치료의 내성에도 참여할 수 있다. 또한, HER3은 EGFR과 같은 다른 HER 패밀리 구성원, 및 MET, IGF-1R과 같은 비 HER 패밀리 구성원과 이량체를 형성하여 종양의 발생, 발달에 참여할 수 있다. HER3은 다른 표적과 이종이합체를 형성하여 가장 강한 PI3K/AKT를 전달할 수 있고 티로신 키나아제 활성이 결핍하기 때문에 HER3의 치료제는 주로 HER의 3세포외 영역을 표적으로 하여 항체계 약물을 개발한다. 현재 여러 개의 단일 클론 항체 약물 또는 이중특이성 항체 약물이 임상연구 단계에 있지만, 기존 데이터는 모두 이의 임상적 유효성 데이터가 충분히 유의미하지 않음을 나타내며, 향후 추가 개발 가능성이 비교적 적다.
항체-소분자 약물 접합체(Antibody-drug conjugate, ADC)는 차세대 항체 표적 치료제로서 주로 암 종양의 치료에 사용된다. ADC 약물은 소분자 세포독성 약물(Drug), 항체(Antibody) 및 항체와 세포 독성 약물을 연결하는 링커(Linker)의 세 부분으로 구성되며, 소분자 세포 독성 약물은 화학적으로 커플링하는 방법에 의해 항체 단백질에 결합된다. ADC 약물은 항체를 사용하여 소분자 약물이 암 특이성 항원을 발현하는 암세포 표적으로 특이적으로 인식하고 안내하며, 세포내이입 효과를 통해 암세포에 진입한다. 링커 부분은 세포 내 낮은 pH 값 환경 또는 리소좀 프로테아제의 작용으로 파괴되어 소분자 세포 독성 약물을 방출하여 정상적인 조직 세포를 손상시키지 않고 암세포를 특이적으로 사멸시키는 역할을 한다. 따라서 ADC 약물은 항체의 표적 특이성과 암세포에 대한 소분자 독소의 높은 독성의 특징을 결합하여 약물의 유효 치료량 창(Therapeutic window)을 크게 확장시킨다. 임상 연구에 따르면 ADC 약물은 약효가 높고 혈액에서 상대적으로 안정적이며 순환 시스템 및 건강한 조직에 대한 소분자 세포 독성 약물(화학 약물) 자체의 독성을 효과적으로 줄일 수 있어, 현재 국제적으로 항암 약물의 연구 개발의 핫스팟이다.
항체 약물의 Fc 말단에는 주로 Fcγ 수용체 즉 FcγR, Fc 신생아 수용체 즉 FcRn 및 C형 렉틴 수용체 등을 포함하는 다양한 수용체가 포함되어 있다. FcγR 수용체에는 여러 가지의 아형이 있고, 상이한 FcγR은 ADCC, ADCP 및 CDC 등을 포함하는 다양한 이펙터 기능을 매개하며, 세포 면역과 체액 면역을 연결하는 핵심 요소이다. 단일 클론 항체 약물에서는 FcγR이 매개하는 이펙터 기능이 일부 치료용 항체의 유효성에 중요한 역할을 하지만, ADC 약물에서는 FcγR이 ADC 약물의 Fc와 결합하여 관련 세포에서 ADC 약물의 내재화, 수송 및 활성 분자 방출을 매개하여 심각한 독성 사건을 일으킬 수 있다. 예를 들어, FcγRIIa(즉 CD32a)는 DM1계 ADC 약물이 혈소판 감소와 같은 독성 사건의 발생을 매개할 수 있으므로 ADC 약물과 FcγRIIa의 결합을 감소시키면 FcγRIIa 세포에 대한 ADC 약물의 사멸을 감소시킬 수 있어 FcγRIIa에 의해 매개되는 독성 사건의 발생을 감소시킬 수 있다.
HER3 표적을 기반으로 하는 단일 클론 항체 약물의 개발은 임상적으로 유효성이 미흡하여, 해당 표적을 기반으로 한 보다 효과적인 항체 약물 접합체 또는 FcγRIIa에 대한 결합을 감소시킬 수 있는 항체 약물 접합체를 연구 개발하는 것은 매우 좋은 임상적 가치를 가진다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 기존의 항체 약물 접합체의 종류가 단일한 단점을 극복하기 위해 항체 약물 접합체, 이의 중간체, 제조 방법 및 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 우수한 표적화성를 가지고, HER3을 양성으로 발현하는 종양 세포에 대해 우수한 억제 효과를 가지며, 또한 우수한 약용성, 높은 안전성을 가지는 항체 약물 접합체를 개발하였다. 상기 항체 약물 접합체는 HER3에 대한 억제 효과가 있고, SK-BR-3 및 SW620 세포에 대한 억제 효과도 있으며, 또한 22Rv1, LNCaP, NCI-H820, OVCAR-8 및 HCC827 세포 중 적어도 하나에 대해 우수한 억제 효과가 있다.
본 발명은 아래의 기술적 해결 수단을 통해 상기 기술적 과제를 해결한다.
본 발명은 항체 약물 접합체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물을 제공하며; 상기 항체 약물 접합체의 구조는 식(I)으로 표시된 바와 같고;
I
상기 식에서, Ab는 HER3 항체 또는 HER3 항체의 변이체이고;
m은 2 내지 8이고;
D는 세포 독성 약물 토포이소머라아제 억제제이고;
R1은 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬, 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬, C1-C6알킬, C3-C10사이클로알킬, C6-C14아릴 또는 5 내지 14원 헤테로아릴이고; 상기 5 내지 14원 헤테로아릴에서 헤테로원자는 N, O 및 S에서 선택되는 하나 또는 복수이고, 헤테로원자의 개수는 1, 2, 3 또는 4이고; 상기 R1-1, R1-2 및 R1-3은 각각 독립적으로 C1-C6알킬이며;
L1은 독립적으로 페닐알라닌 잔기, 알라닌 잔기, 글리신 잔기, 글루탐산 잔기, 아스파라긴산 잔기, 시스테인 잔기, 글루탐산 잔기, 히스티딘 잔기, 이소류신 잔기, 류신 잔기, 라이신 잔기, 메티오닌 잔기, 프롤린 잔기, 세린 잔기, 트레오닌 잔기, 트립토판 잔기, 티로신 잔기 및 발린 잔기 중 하나 또는 복수이고; p는 2 내지 4이며;
L2는 , , , , 또는 이고, 여기서 n은 독립적으로 1 내지 12이며, c 말단은 카르보닐기를 통해 L1에 연결되고, f 말단은 상기 L3의 d 말단에 연결되며;
L3은 이고, 여기서 b 말단은 상기 Ab에 연결되고. d 말단은 상기 L2의 f 말단에 연결된다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 항체 약물 접합체에서, 특정 기는 하기와 같은 정의를 가지며, 언급되지 않은 기의 정의는 상기 임의의 형태에 서술된 바와 같다(본 단락의 내용은 이하 “본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서”라고 함).
상기 HER3 항체는 HER3 항체 A이고, 상기 HER3 항체 A에서 경쇄의 아미노산 서열은 서열표의 서열번호: 1로 표시되고, 중쇄의 아미노산 서열은 서열표의 서열번호: 2로 표시된다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 HER3 항체의 변이체는 HER3 항체 A의 변이체이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 HER3 항체의 변이체는 HER3 항체와 비교하여, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 가진다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 HER3 항체 A의 변이체에서, 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시된다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 중쇄의 아미노산 서열은 E233P, L234V, L234F, L235A, L235E 또는 P331S 중 하나 또는 복수의 부위 돌연변이를 갖는 서열표의 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열이다. 예를 들어 E233P, L234V 및 L235A의 부위 돌연변이(즉 서열표의 서열번호: 3)를 가지거나, L234F, L235E 및 P331S의 부위 돌연변이(즉 서열표의 서열번호: 4)를 가지며, 상기 복수는 바람직하게는 2개 또는 3개이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 L3의 b 말단은 바람직하게는 티오에테르의 형태로 상기 항체의 메르캅토에 연결된다. 를 예로 들어, 는 상기 항체의 시스테인 잔기와 연결되는 형태는 이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, D가 세포 독성 약물 토포이소머라아제 억제제인 경우, 상기 세포 독성 약물 토포이소머라아제 억제제는 또는 이며; R2 및 R5는 각각 독립적으로 H, C1-C6알킬 또는 할로겐이고; R3 및 R6은 각각 독립적으로 H, C1-C6알킬 또는 할로겐이며; R4 및 R7은 각각 독립적으로 C1-C6알킬이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 R2 및 R5가 각각 독립적으로 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 바람직하게는 C1-C4알킬이고, 보다 바람직하게는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이며, 가장 바람직하게는 메틸이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 R2 및 R5가 각각 독립적으로 할로겐인 경우, 상기 할로겐은 바람직하게는 불소, 염소, 브롬 또는 요오드이고, 보다 바람직하게는 불소이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 R3 및 R6이 각각 독립적으로 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 바람직하게는 C1-C4알킬이고, 보다 바람직하게는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이며, 가장 바람직하게는 메틸이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 R3 및 R6이 각각 독립적으로 할로겐인 경우, 상기 할로겐은 바람직하게는 불소, 염소, 브롬 또는 요오드이고, 보다 바람직하게는 불소이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 R4 및 R7이 각각 독립적으로 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 바람직하게는 C1-C4알킬이고, 보다 바람직하게는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이며, 가장 바람직하게는 에틸이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, R2 및 R5는 각각 독립적으로 C1-C6알킬이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, R3 및 R6은 각각 독립적으로 할로겐이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, R4 및 R7은 에틸이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, D는 또는 이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 D가 또는 인 경우, 상기 항체 약물 접합체는 또는 일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 R1이 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 보다 바람직하게는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이고, 가장 바람직하게는 에틸이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 R1이 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬인 경우, 상기 복수는 2개 또는 3개이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 R1-1 및 R1-2가 각각 독립적으로 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 바람직하게는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이고, 가장 바람직하게는 메틸이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 R1이 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬인 경우, 상기 -NR1-1R1-2는 바람직하게는 -N(CH3)2이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 R1이 하나의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬인 경우, 상기 하나의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬은 이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 R1이 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 바람직하게는 C1-C4알킬이고, 보다 바람직하게는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이며, 가장 바람직하게는 에틸이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 R1이 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬인 경우, 상기 복수는 2개 또는 3개이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 R1-3이 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 바람직하게는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이고, 가장 바람직하게는 메틸이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 R1이 하나의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬인 경우, 상기 하나의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬은 이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 R1이 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 바람직하게는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이고, 가장 바람직하게는 메틸이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 m은 정수(예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8) 또는 비정수이며, 바람직하게는 4 내지 8이고, 더 바람직하게는 6 내지 8이고, 보다 바람직하게는 7 내지 8이고, 보다 더 바람직하게는 7.4 내지 7.85이며, 예를 들어 7.49, 7.56, 7.59, 7.60, 7.63, 7.65, 7.67, 7.72, 7.78, 7.81, 7.82 또는 7.83이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 L1은 바람직하게는 페닐알라닌 잔기, 알라닌 잔기, 글리신 잔기, 이소류신 잔기, 류신 잔기, 프롤린 잔기 및 발린 잔기 중 하나 또는 복수이고, 더 바람직하게는 페닐알라닌 잔기, 알라닌 잔기, 글리신 잔기 및 발린 잔기 중 하나 또는 복수이고, 보다 바람직하게는 발린 잔기 및/또는 알라닌 잔기이며, 상기 복수는 바람직하게는 2개 또는 3개이고, 상기 p는 바람직하게는 2이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 (L1)p는 보다 바람직하게는 이고, 여기서 g 말단은 카르보닐기를 통해 상기 L2의 c말단에 연결된다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 n은 바람직하게는 8 내지 12이고, 예를 들어 8, 9, 10, 11 및 12이며, 더 예를 들어 8 또는 12이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 R1-1, R1-2 및 R1-3이 독립적으로 바람직하게는 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 바람직하게는 C1-C4알킬이고, 보다 바람직하게는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이며, 가장 바람직하게는 메틸이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 R1은 바람직하게는 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬, 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬, C1-C6알킬 또는 C3-C10사이클로알킬이고, R1은 더 바람직하게는 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬, 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬, 또는 C1-C6알킬이고, 보다 바람직하게는 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬 또는 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬이며, 가장 바람직하게는 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 식(I)으로 표시되는 화합물은 하기 방안 중 어느 하나이며:
방안 1:
상기 Ab는 HER3 항체 A 또는 HER3 항체 A의 변이체이고, 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되고; 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 중쇄의 아미노산 서열은 E233P, L234V, L234F, L235A, L235E 또는 P331S 중 하나 또는 복수의 부위 돌연변이를 갖는 서열표의 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열이며, 예를 들어 E233P, L234V 및 L235A의 부위 돌연변이(즉 서열표의 서열번호: 3)를 가지거나, L234F, L235E 및 P331S의 부위 돌연변이(즉 서열표의 서열번호: 4)를 가지며;
D는 또는 이고; R2 및 R5는 각각 독립적으로 H, C1-C6알킬 또는 할로겐이고; R3 및 R6은 각각 독립적으로 H, C1-C6알킬 또는 할로겐이고; R4 및 R7은 각각 독립적으로 C1-C6알킬이고; D는 바람직하게는 또는 이며;
R1은 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬, 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬, C1-C6알킬 또는 C3-C10사이클로알킬이고; 상기 R1-1, R1-2 및 R1-3은 각각 독립적으로 C1-C6알킬이며;
L1은 독립적으로 페닐알라닌 잔기, 알라닌 잔기, 글리신 잔기, 이소류신 잔기, 류신 잔기, 프롤린 잔기 및 발린 잔기 중 하나 또는 복수이며;
방안 2:
상기 Ab는 HER3 항체 A 또는 HER3 항체 A의 변이체이고, 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되고; 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 중쇄의 아미노산 서열은 E233P, L234V, L234F, L235A, L235E 또는 P331S 중 하나 또는 복수의 부위 돌연변이를 갖는 서열표의 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열이며, 예를 들어 E233P, L234V 및 L235A의 부위 돌연변이(즉 서열표의 서열번호: 3)를 가지거나, L234F, L235E 및 P331S의 부위 돌연변이(즉 서열표의 서열번호: 4)를 가지며;
D는 또는 이고; 상기 R2 및 R5는 각각 독립적으로 C1-C6알킬이고; 상기 R3 및 R6은 각각 독립적으로 할로겐이고; D는 바람직하게는 또는 이고;
상기 R1은 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬, 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬, 또는 C1-C6알킬이며;
방안 3:
상기 Ab는 HER3 항체 A 또는 HER3 항체 A의 변이체이고, 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되고; 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 중쇄의 아미노산 서열은 E233P, L234V, L234F, L235A, L235E 또는 P331S 중 하나 또는 복수의 부위 돌연변이를 갖는 서열표의 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열이며, 예를 들어 E233P, L234V 및 L235A의 부위 돌연변이(즉 서열표의 서열번호: 3)를 가지거나, L234F, L235E 및 P331S의 부위 돌연변이(즉 서열표의 서열번호: 4)를 가지며;
D는 또는 이고; 상기 R2 및 R5는 각각 독립적으로 C1-C6알킬이고; 상기 R3 및 R6은 각각 독립적으로 할로겐이고; D는 바람직하게는 또는 이고;
상기 m은 7 내지 8이고,
상기 R1은 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬, 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬, 또는 C1-C6알킬이며;
상기 L1은 독립적으로 발린 잔기 및/또는 알라닌 잔기이고;
방안 4:
상기 Ab는 HER3 항체 A 또는 HER3 항체 A의 변이체이고, 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되고; 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 중쇄의 아미노산 서열은 E233P, L234V, L234F, L235A, L235E 또는 P331S 중 하나 또는 복수의 부위 돌연변이를 갖는 서열표의 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열이며, 예를 들어 E233P, L234V 및 L235A의 부위 돌연변이(즉 서열표의 서열번호: 3)를 가지거나, L234F, L235E 및 P331S의 부위 돌연변이(즉 서열표의 서열번호: 4)를 가지며;
상기 D는 또는 이고,
상기 R1은 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬, 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬, 또는 C1-C6알킬이며;
방안 5:
상기 Ab는 HER3 항체 A 또는 HER3 항체 A의 변이체이고, 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되고; 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 중쇄의 아미노산 서열은 E233P, L234V, L234F, L235A, L235E 또는 P331S 중 하나 또는 복수의 부위 돌연변이를 갖는 서열표의 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열이며, 예를 들어 E233P, L234V 및 L235A의 부위 돌연변이(즉 서열표의 서열번호: 3)를 가지거나, L234F, L235E 및 P331S의 부위 돌연변이(즉 서열표의 서열번호: 4)를 가지며;
상기 D는 또는 이고,
상기 m은 7 내지 8이고,
상기 R1은 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬, 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬, 또는 C1-C6알킬이며;
상기 L1은 독립적으로 발린 잔기 및/또는 알라닌 잔기이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 항체 약물 접합체는 바람직하게는 , 또는 이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 L2는 바람직하게는 이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 항체 약물 접합체의 항체는 바람직하게는 HER3 항체 A 또는 HER3 항체 A의 변이체이고, 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄의 아미노산 서열은 서열표의 서열번호: 1로 표시되고, 중쇄는 서열표의 서열번호: 3 또는 서열번호: 4로 표시되는 아미노산 서열에서 선택되며; D는 또는 이고; L1은 발린 잔기 및/또는 알라닌 잔기이고, p는 2이고, (L1)p는 바람직하게는 이며; R1은 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬, 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬, 또는 C1-C6알킬이고, 바람직하게는 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬 또는 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬이고, 보다 바람직하게는 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬이며; 상기 R1-1, R1-2 및 R1-3은 독립적으로 C1-C4알킬이고, 바람직하게는 메틸이며; 상기 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬은 바람직하게는 이고; 상기 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬은 바람직하게는 이고; L2는 이며; L3은 이다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 항체 약물 접합체는 바람직하게는 하기 식으로 표시되는 화합물 중 어느 하나이며:
,
,
,
,
,
,
,
,
,
또는
;
상기 식에서, Ab는 HER3 항체 A 또는 HER3 항체 A의 변이체이고, m은 7.49, 7.56, 7.59, 7.60, 7.63, 7.65, 7.67, 7.72, 7.78, 7.81 또는 7.83이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 3 또는 서열번호: 4로 표시되는 아미노산 서열에서 선택된다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 항체 약물 접합체는 바람직하게는 하기 식으로 표시되는 화합물 중 어느 하나이며:
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
또는
;
상기 식에서, Ab는 HER3 항체 A 또는 HER3 항체 A의 변이체이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 3 또는 서열번호: 4로 표시되는 아미노산 서열에서 선택된다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 항체 약물 접합체는 바람직하게는 하기 식으로 표시되는 화합물 중 어느 하나이며:
,
또는
,
상기 식에서, Ab는 HER3 항체 A 또는 HER3 항체 A의 변이체이고; m은 7.56, 7.59, 7.63, 7.67, 7.72, 7.81 또는 7.83이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 3 또는 서열번호: 4로 표시되는 아미노산 서열에서 선택된다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 항체 약물 접합체는 바람직하게는 하기 식으로 표시되는 화합물 중 어느 하나이며:
,
,
,
,
,
,
,
또는
;
상기 식에서, Ab는 HER3 항체 A 또는 HER3 항체 A의 변이체이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 3 또는 서열번호: 4로 표시되는 아미노산 서열에서 선택된다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 항체 약물 접합체는 바람직하게는 하기 식으로 표시되는 화합물 중 어느 하나이며:
, Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.56이며;
, Ab는 HER3 항체 A의 변이체이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체의 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 3으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄이고, m은 바람직하게는 7.67이며;
, Ab는 HER3 항체 A의 변이체이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체의 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 4로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄이고, m은 바람직하게는 7.72이며;
, Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.63이며;
, Ab는 HER3 항체 A의 변이체이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체의 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 3으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄이고, m은 바람직하게는 7.59이며;
, Ab는 HER3 항체 A의 변이체이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체의 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 4로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄이고, m은 바람직하게는 7.67이고;
, Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.81이며;
, Ab는 HER3 항체 A의 변이체이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체의 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 3으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄이고, m은 바람직하게는 7.63이며;
, Ab는 HER3 항체 A의 변이체이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체의 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 4으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄이고, m은 바람직하게는 7.82이며;
, Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.56이며;
, Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.83이며;
, Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.49이며;
, Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.60이며;
, Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.78이며;
, Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.65이며;
, Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.83이며; 또는
, Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.82이다.
본 발명은 항체에서 경쇄의 아미노산 서열이 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되고; 항체에서 중쇄의 아미노산 서열이 서열표의 서열번호: 3 또는 서열번호: 4로 표시되는 항체를 더 제공한다.
본 발명은 식(II)으로 표시되는 화합물과 Ab-수소를 하기에 나타낸 바와 같은 커플링 반응을 수행시키는 단계를 포함하는 항체 약물 접합체의 제조 방법을 더 제공하며:
상기 식에서, 상기 L1, L2, L3, R1, p 및 Ab는 상기에 정의된 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 커플링 반응의 조건 및 작업은 당업계의 해당 커플링 반응의 통상적인 조건 및 작업일 수 있다.
본 발명은 물질 X 및 약용 보조재를 포함하는 약학 조성물을 더 제공하며; 상기 물질 X는 상기에 서술된 바와 같은 항체 약물 접합체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물이다.
상기 약학 조성물에서, 상기에 서술된 물질 X의 투여량은 치료적 유효량일 수 있다.
본 발명은 HER3 단백질 억제제의 제조에 있어서의 상기 물질 X 또는 상기 약학 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 약물의 제조에 있어서의 상기 물질 X 또는 상기 약학 조성물의 용도를 더 제공하며, 상기 종양은 바람직하게는 HER3 양성 종양이다.
상기 용도에 있어서, 상기 HER3 양성 종양은 바람직하게는 HER3 양성 폐암, 난소암, 결장직장암, 유선암, 전립선암 및 위암 중 하나 또는 복수이다.
본 발명의 일부 실시예에 있어서, 상기 전립선암에서, 전립선암 세포는 22Rv1 세포이다.
본 발명의 일부 실시예에 있어서, 상기 전립선암에서, 전립선암 세포는 LNCaP 세포이다.
본 발명의 일부 실시예에 있어서, 상기 결장직장암에서, 결장직장암 세포는 SW620 세포이다.
본 발명의 일부 실시예에 있어서, 상기 폐암에서, 폐암 세포는 NCI-H820 세포이다.
본 발명의 일부 실시예에 있어서, 상기 난소암에서, 난소암 세포는 OVCAR-8 세포이다.
본 발명의 일부 실시예에 있어서, 상기 폐암에서, 폐암 세포는 HCC827 세포이다.
본 발명의 일부 실시예에 있어서, 상기 유선암에서, 유선암 세포는 SK-BR-3 세포이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 명세서 및 청구범위에 나타나는 하기 용어는 다음과 같은 의미를 가진다:
상기 약용 보조재는 약물 생산 분야에서 널리 사용되는 보조재일 수 있다. 보조재는 주로 안전하고 안정적이며 기능적인 약학 조성물을 제공하기 위해 사용되며, 또한 피험자가 투여를 받은 후 활성 성분을 원하는 속도로 용해하거나, 피험자가 조성물의 투여를 받은 후 활성 성분이 효과적으로 흡수되도록 촉진하는 방법을 더 제공할 수 있다. 상기 약용 보조재는 불활성 충전제이거나, 해당 조성물의 전체 pH 값을 안정화시키거나 조성물의 활성 성분의 분해를 방지하는 것과 같은 특정 기능을 제공할 수 있다. 상기 약용 보조재는 완충제, 킬레이트제, 방부제, 가용화제, 안정화제, 부형제, 계면활성제, 착색제, 향미제 및 감미제 중 하나 또는 복수의 보조재를 포함할 수 있다.
용어 “약학적으로 허용 가능한”은 염, 용매, 보조재 등 일반적으로 독성이 없고, 안전하며, 환자가 사용하기에 적합한 것을 지칭한다. 상기 “환자”는 바람직하게는 포유동물이고, 더 바람직하게는 인간이다.
용어 “약학적으로 허용 가능한 염”은 본 발명의 화합물이 상대적으로 독성이 없고 약학적으로 허용 가능한 산 또는 염기와 제조하여 수득된 염을 지칭한다. 본 발명의 화합물에 상대적으로 산성인 관능기가 함유될 경우, 순수한 용액 또는 적합한 불활성 용매에서 충족한 양의 약학적으로 허용 가능한 염기와 이러한 화합물의 중성 형식으로 접촉시키는 방식으로 염기 부가염을 수득할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염기 부가염은 리튬염, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 알루미늄염, 마그네슘염, 아연염, 비스무트염, 암모늄염, 디에탄올아민염을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 화합물에 상대적으로 염기성인 관능기가 함유될 경우, 순수한 용액 또는 적합한 불활성 용매에서 충족한 약학적으로 허용 가능한 양의 산과 이러한 화합물의 중성 형식으로 접촉시키는 방식으로 산 부가염을 수득할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 산은 무기산을 포함하며, 상기 무기산은 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 질산, 탄산, 인산, 아인산, 황산 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용 가능한 산은 유기산을 포함하며, 상기 유기산은 아세트산, 프로피온산, 옥살산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 락트산, 만델산, 프탈산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 구연산, 살리실산, 타르타르산, 메탄술폰산, 이소니코틴산, 산성 구연산, 올레산, 탄닌산, 판토텐산, 타르타르산수소, 아스코르브산, 젠티식산, 푸마르산, 글루콘산, 당산, 포름산, 에탄술폰산, 파모산(즉 4,4’-메틸렌-비스(3-하이드록시-2-나프토산)), 아미노산(예를 들어, 글루탐산, 아르기닌) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 화합물이 상대적으로 산성 및 상대적으로 염기성인 관능기를 함유하는 경우, 염기 부가염 또는 산 부가염으로 전환될 수 있다. 자세한 내용은 Berge et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science 66: 1 내지 19 (1977), 또는, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use(P. Heinrich Stahl and Camille G. Wermuth, ed., Wiley-VCH, 2002)를 참조할 수 있다.
용어 “용매화물”은 본 발명의 화합물이 화학량론적 또는 비화학량론적 용매와 결합하여 형성되는 물질을 지칭한다. 용매화물의 용매 분자는 정렬되거나 정렬되지 않은 형태로 존재할 수 있다. 상기 용매는 물, 메탄올, 에탄올 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
천연 또는 천연 서열의 HER3은 자연으로부터 분리될 수 있고, 재조합 DNA 기술, 화학적 합성 방법을 사용할 수도 있으며, 또는 상기 기술 및 유사한 기술의 조합에 의해 제조될 수 있다.
여기서 항체는 가장 넓은 의미로 해석되며 해당 면역 글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 하나의 항원 인식 영역을 통해 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지방, 폴리펩티드 등과 같은 표적과 특이적으로 결합할 수 있다. 필요한 생물학적 활성을 갖는 한, 구체적으로 온전한 단일 클론 항체, 다클론 항체, 이중특이성 항체 및 항체 단편을 포함한다. 본 발명의 항체의 변이체는 아미노산 서열 돌연변이체, 및 천연 폴리펩티드의 공유 결합 유도체를 지칭하며, 조건은 천연 폴리펩티드에 필적하는 생물학적 활성을 유지하고 있는 것이다. 아미노산 서열 돌연변이체와 천연 아미노산 서열의 차이는 일반적으로 천연 아미노산 서열 중 하나 또는 복수의 아미노산이 치환되거나 폴리펩티드 서열에서 하나 또는 복수의 아미노산이 결실 및/또는 삽입되는 것이다. 결실 돌연변이체는 천연 폴리펩티드의 단편 및 N 말단 및/또는 C 말단 절단 돌연변이체를 포함한다. 통상적으로 아미노산 서열 돌연변이체는 천연 서열과 비교하여 적어도 70%(예를 들어 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 99％)의 상동성을 가진다.
단일 클론 항체 또는 단일 항체는 해당 항체가 기본적으로 균일한 항체군으로부터 유래되며, 즉 존재할 수 있는 소량의 천연 돌연변이 또는 항체의 발현 및 제조 과정에서 생성된 이성질체를 제외하고는 상기 군을 구성하는 각 항체는 완전히 동일한 것을 지칭한다. 단일 클론 항체는 단일 항원에 대해 높은 특이성을 가진다. 다클론 항체는 상이한 결정 인자를 표적으로 하는 상이한 항체를 포함하며, 각각의 단일 클론 항체는 항원의 하나의 결정 인자만 표적으로 한다.
본 발명에 있어서, 단일 클론 항체는 특히 키메라 항체 및 이의 단편을 더 포함하며, 즉 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종류, 유형 또는 특정 하위 유형에서 유래하고 나머지 부분은 다른 종류, 유형 또는 하위 유형에서 유래한다
본 발명의 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술 또는 이러한 기술들의 조합, 또는 당업계에 공지된 다른 기술과 같은 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
용어 “약물 항체 커플링 비율”(drug-antibody ratio, 즉 DAR)에 대한 설명: L-D는 항체에서의 접합점과 반응하는 기이고, L은 링커이고, D는 L에 연결된 항체에 추가로 접합된 세포 독성제이며, 본 발명에서 D는 Dxd이고, 각 항체가 최종적으로 D에 접합되는 DAR의 수를 m로 표시하고 또는 m은 단일 항체가 D에 접합되는 수를 나타낼 수도 있다. 일부 실시 형태에 있어서, m은 실제로 2 내지 8, 4 내지 8 또는 6 내지 8 사이의 평균값이고, 또는 m은 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8의 정수 중 어느 하나이고; 일부 실시 형태에 있어서, m은 2, 4, 6 또는 8의 평균값이며; 다른 실시 형태에 있어서, m은 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8의 평균값이다.
링커는 항체와 약물 사이의 직접적 또는 간접적 연결을 지칭한다. 링커는 표면 라이신, 산화된 탄수화물에 대한 환원적 커플링, 및 사슬간 이황화 결합을 환원시켜 방출된 시스테인 잔기를 통한 것과 같은 다양한 방식으로 mAb에 연결될 수 있다. 하이드라존, 이황화물 및 펩티드를 기반으로 하는 연결을 포함하는 다양한 ADC 연결 시스템은 당업계에 공지되어 있다.
용어 “치료” 또는 이의 동등한 표현이 예를 들어 암에 적용되는 경우, 환자 체내의 암 세포의 수가 감소 또는 제거되거나 암 증상을 완화하기 위해 사용되는 절차 또는 과정을 지칭한다. 암 또는 다른 증식성 장애의 "치료"는 반드시 암세포 또는 다른 장애가 실제로 제거된다는 것을 의미하지는 않지만 세포 또는 장애의 수가 실제로 감소되거나 암 또는 다른 장애의 증상이 실제로 완화됨을 지칭한다. 통상적으로, 암을 치료하는 방법은 성공 확률이 낮더라도 수행하게 되지만 환자의 병력과 예상 생존 기대치를 고려하여 여전히 전반적으로 유익한 행동 과정을 유도하는 것으로 간주된다.
용어 “예방”은 질환 또는 장애를 얻거나 발병할 위험의 감소를 지칭한다.
용어 “사이클로알킬”은 3개 내지 20개의 탄소원자를 포함하는 포화된 사이클로 탄화수소 원자단(예를 들어 C3-C6사이클로알킬)을 지칭하며, 단일 고리 사이클로알킬 및 다중 고리 사이클로알킬을 포함한다. 사이클로알킬은 3개 내지 20개의 탄소원자를 포함하고, 바람직하게는 3개 내지 10개의 탄소원자를 포함하며, 더 바람직하게는 3개 내지 6개의 탄소원자를 포함한다. 사이클로알킬의 예로는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 사이클로노닐 및 사이클로데실을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
용어 “알킬”은 지정된 탄소원자의 수를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬을 지칭한다. 알킬의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, tert-부틸, 이소부틸, sec-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 및 이의 유사한 알킬을 포함한다.
용어 “할로겐”은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 지칭한다.
용어 “헤테로아릴”은 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 N, O 및 S에서 선택되는 헤테로원자를 포함하는 아릴(또는 아릴 고리)을 지칭하고, 이는 단일 고리, 이중 고리 또는 삼중 고리의 방향족계일 수 있으며, 예를 들어 푸릴, 피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 티오페닐, 이속사졸릴, 옥사졸릴, 디아졸릴, 이미다졸릴, 피롤릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 티아디아졸릴, 벤즈이미다졸릴, 인돌릴, 인다졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조이소티아졸릴, 벤즈옥사졸릴, 벤조이소옥사졸릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐 등이다.
용어 “아릴”은 모든 고리가 방향족 고리인 임의의 안정적인 단일 고리 또는 이중 고리의 탄소 고리를 지칭한다. 상기 아릴 단위의 예로는 페닐 또는 나프틸을 포함한다.
상기 각 바람직한 조건은 당업계의 통상적인 지식을 위반하지 않는 기초에서 본 발명의 각각의 바람직한 실시예를 수득하기 위하여 임의로 조합할 수 있다.
특별한 설명이 없는 한, 본 발명에서의 실온은 20 내지 30℃를 지칭한다.
본 발명에서 사용된 시약 및 원료는 모두 시판으로 수득할 수 있다.
본 발명의 긍정적인 진보 효과는:
1. 본 발명에서 제공되는 HER3 항체를 포함하는 항체 약물 접합체는 우수한 표적화성을 가지며, HER3 등을 발현하는 다양한 종양 세포에 대해 우수한 억제 효과를 가진다.
2. 체내 연구에 따르면, 본 발명의 항체 약물 접합체가 보다 우수한 체외 세포 독성, 체내 항종양 활성을 가진다.
3. 본 발명의 항체 약물 접합체는 용해도가 양호하고 우수한 약용성을 가지며, 커플링 제조 과정에서 침전 등의 이상 현상이 없어 항체 약물 접합체의 제조에 매우 유리하다.
도 1은 항체의 경쇄, 중쇄에 대한 발현 벡터의 구축을 나타내며, 여기서 Ab-L은 항체의 경쇄이고, Ab-H는 항체의 중쇄이다.
하기 실시예를 통해 본 발명을 추가로 설명하지만, 본 발명이 해당 실시예의 범위로 한정되는 것이 아니다. 하기 실시예에서 구체적인 조건을 명시하지 않은 실험 방법은 통상적인 방법 및 조건에 따르거나 제품 설명서에 따라 선택된다.
약어의 설명:
PCR 중합 효소 연쇄 반응
CHO 중국 햄스터 난소 세포
HTRF 균질 시간 분해 형광
PB 인산염 완충액
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
TECP 트리스(2-카르복시에틸)포스핀
DMSO 디메틸술폭시드
DMF N,N-디메틸포름아미드
HATU 2-(7-옥소벤조트리아졸)-N,N,N’,N’-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트
v/v V/V, 체적 비율
UV 자외선 가시광선
ELISA 효소 결합 면역 흡착 분석
BSA 소 혈청 알부민
rpm 분당 회전수
FBS 소 태아 혈청
실시예 1: HER3 항체의 제조
본 발명에서는 친화력이 높고 특이적으로 HER3을 표적으로 하는 단일 클론 항체 FDA026을 선별하였으며, 이의 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호: 1로 표시되고, 이의 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호: 2로 표시된다. FDA026의 경쇄 및 중쇄 뉴클레오티드 서열은 전체 유전자 합성(Suzhou Genewiz) 방법을 통해 수득하였다. EcoR I 및 Hind III(TAKARA에서 구입) 이중 효소 절단을 통해 pV81 벡터에 각각 별도로 구축(도 1)하고, 연결을 통해 Trans 1-T1 컴피턴트 세포(Beijing TransGen Biotech에서 구입, 제품 번호: CD501-03)로 형질전환하고, 여기서 클론을 선택하여 PCR 검정 및 검사를 위해 제출하여 시퀀싱을 확인하였으며, 양성 클론을 배양 "G 증폭하고 플라스미드에서 추출하여 항체 경쇄 진핵 발현 플라스미드 FDA026-L/pV81 및 항체 중쇄 진핵 발현 플라스미드 FDA026-H/pV81을 수득하고, XbaⅠ(Takara에서 구입, 제품 번호: 1093S)를 사용하여 상기 두개의 플라스미드에 대해 효소 절단 선형화를 수행하고, 경쇄, 중쇄의 진핵 발현 플라스미드의 비율은 1.5/1이며, 전기 충격으로 현탁액 성장에 적응된 CHO세포(ATCC에서 구입)에 형질전환하고, 전기 충격 후 세포를 2000 내지 5000세포/웰로 96웰 플레이트에 접종하고, 3주 동안 배양한 후 HTRF 방법(균질 시간 분해 형광)으로 발현량을 측정하여, 발현량이 가장 높은 상위 10개의 세포 풀을 선택하여 증폭한 후 동결 보관하였다. 하나의 세포를 125ml의 진탕 플라스크(배양 체적 30mL)에서 소생시키고, 37℃, 5.0% CO2, 130rpm에서 진탕 배양하고, 3일 후 1000ml의 진탕 플라스크(배양 체적 300mL)로 확장하여, 37℃, 5.0% CO2, 130rpm에서 진탕 배양하고, 4일째부터 시작하여 격일로 초기 배양 체적의 5 내지 8%의 보충 배지를 가하고, 10 내지 12일까지 배양한 후 배양을 종료하며, 수확액을 9500rpm에서 15분 동안 원심분리하여, 세포 침전을 제거하고, 상청액을 수집하여 0.22μm의 여과막으로 여과 처리하고, 처리된 시료를 MabSelect 친화성 크로마토그래피 컬럼(GE회사에서 구입)으로 정제하여 항체 FDA026을 수득하였다.
Fc 돌연변이(즉 E233P, L234V, L235A)를 갖는 HER3 항체 FDA028을 상기와 동일한 제조 방법으로 제조하였으며, 이의 경쇄 아미노산은 서열번호: 1로 표시되고, 이의 중쇄 서열은 서열번호: 3으로 표시되며; 및 Fc 돌연변이(즉 L234F, L235E, P331S)를 갖는 HER3 항체 FDA029의 경쇄 아미노산은 서열번호: 1로 표시되고, 이의 중쇄 서열은 서열번호: 4로 표시된다.
FDA026, FDA028 및 FDA029의 경쇄 서열은 하기에 표시된 바와 같다:
서열번호: 1:
DIEMTQSPDS LAVSLGERAT INCRSSQSVL YSSSNRNYLA WYQQNPGQPP 50
KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQQYYST 100
PRTFGQGTKV EIKRTVAAPS VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA 150
KVQWKVDNAL QSGNSQESVT EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC 200
EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC 220
FDA026의 중쇄 서열은 하기에 표시된 바와 같다:
서열번호: 2:
QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS GYYWSWIRQP PGKGLEWIGE 50
INHSGSTNYN PSLKSRVTIS VETSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCARDKW 100
TWYFDLWGRG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF 150
PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC 200
NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT 250
LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY 300
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT 350
LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 400
DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK 447
FDA028의 중쇄 서열은 하기에 표시된 바와 같다:
서열번호: 3 FDA028 중쇄
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVETSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDKWTWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
FDA029의 중쇄 서열은 하기에 표시된 바와 같다:
서열번호: 4 FDA029 중쇄
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVETSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDKWTWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
실시예 2: 링커-약물 접합체의 합성
실시예 2-1: LE12의 합성
중간체 2의 합성:
(S)-2-아지도프로피온산(10g, 86.9mmol)과 4-아미노벤질알코올(21.40g, 173.8mmol)을 300mL의 디클로로메탄 및 메탄올의 혼합 용매(체적 비율 2:1)에 용해시키고, 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디하이드로퀴놀린(21.49g, 86.9mmol)을 가하고, 실온에서 5시간 동안 반응시킨 후, 갑압 하에 용매를 증발 건조시킨 다음, 수득된 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피[디클로로메탄:에틸 아세테이트=1:1(v/v)]로 정제하여 중간체 2(16.3g, 수율85％)를 수득하였다. ESI-MS m/z：221(M+H).
중간체 3의 합성:
중간체 2(15g, 68.2mmol)를 비스(p-니트로페닐)카보네이트(22.82g, 75.02mmol)와 혼합하여 200mL의 무수 N,N-디메틸포름아미드에 용해시키고, 25mL의 트리에틸아민을 가하여, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 액체 크로마토그래피 질량분석기로 원료의 반응이 완료됨을 모니터링한 후 메틸아민염산염(6.91g, 102.3mmol)을 가하고, 실온에서 1시간 동안 계속하여 반응시켰다. 반응이 완료된 후 감압 증류하여 대부분의 용매를 제거하고, 200mL의 물, 200mL의 에틸 아세테이트를 가하고, 용액을 분리한 후 유기상을 수집하고, 유기상을 건조시킨 후 농축하여, 수득된 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피[디클로로메탄:에틸 아세테이트=10:1(v/v)]로 정제하여 중간체 3(18.9g, 수율100％)을 수득하였다. ESI-MS m/z：278(M+H).
중간체 5의 합성:
중간체 3(10g, 36.1mmol)을 폴리포름알데히드(1.63g, 54.2mmol)와 혼합하여 150mL의 무수 디클로로메탄에 용해시키고, 트리메틸클로로실란(6.28g, 57.76mmol)을 천천히 가하고, 실온에서 2시간 동안 반응시켜 중간체 4의 조질의 생성물 용액을 수득하였고, 시료를 취하여 메탄올을 가하여 퀀칭시킨 후 액체 크로마토그래피 질량분석기로 반응을 모니터링하고, 반응이 완료된 후 반응 용액을 여과한 다음 여액에 tert-부틸 하이드록시아세테이트(9.54g, 72.2mmol) 및 트리에틸아민(10mL, 72.2mmol)을 가하고, 실온에서 2시간 동안 계속하여 반응시켰다. 반응이 완료된 후 감압 증류하여 대부분의 용매를 제거하고, 수득된 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피[석유 에테르:에틸 아세테이트=3:1(v/v)]로 정제하여 중간체 5(11.2g, 수율74％)를 수득하였다. ESI-MS m/z：422(M+H).
중간체 6의 합성:
중간체 5(10g, 23.8mmol)를 80mL의 무수 테트라하이드로푸란에 용해시키고, 80mL의 물을 가한 다음 트리스(2-카르복시에틸포스핀)염산염(13.6g, 47.6mmol)을 가하고, 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 감압 증류하여 테트라하이드로푸란을 제거한 다음, 에틸 아세테이트를 가하여 추출하고, 수득된 유기상을 건조시킨 후 감압 증류하여 용매를 제거하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피[디클로로메탄:메탄올=10:1(v/v)]로 정제하여 중간체 6(8.1g, 수율86％)을 수득하였다. ESI-MS m/z：396(M+H).
중간체 8의 합성:
중간체 6(5g, 12.7mmol)을 60mL의 디클로로메탄 및 메탄올의 혼합 용매(v/v=2:1)에 용해시키고, 3mL의 트리플루오로아세트산을 천천히 가하고, 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 동일한 체적의 물 및 에틸 아세테이트를 가하고, 유기상을 건조시킨 후 농축하여, 수득된 조질의 생성물을 다음 단계에 직접 사용하였다.
상기 단계에서 수득된 조질의 생성물을 50mL의 무수 N,N-디메틸포름아미드에 용해시키고, Fmoc-발린 하이드록시숙신이미드 에스테르(8.3g, 19.1mmol), 트리에틸아민(5mL)을 가하고, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 감압 증류하여 대부분의 용매를 제거하고, 수득된 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피[디클로로메탄:메탄올=10:1(v/v)]로 정제하여 중간체 8(5.4g, 수율64％)을 수득하였다. ESI-MS m/z：661(M+H).
중간체 9의 합성:
중간체 8(1g, 1.5mmol)과 엑사테칸(Exatecan) 메탄설포네이트(0.568g, 1mmol)를 30mL의 무수 N,N-디메틸포름아미드에 혼합하고, 2-(7-옥소벤조트리아졸)-N,N,N’,N’-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(1.14g, 3.0mmol), 2mL의 트리에틸아민을 가하고, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 감압 증류하여 용매를 제거하고, 수득된 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피[클로로포름:메탄올=10:1(v/v)]로 정제하여 중간체 9(0.94g, 수율87％)를 수득하였다. ESI-MS m/z：1078(M+H).
화합물 LE12의 합성:
중간체 9(1g, 0.929mmol)를 20mL의 무수 DMF에 용해시키고, 0.5mL의 1,8-디아자비사이클로운덱-7-엔을 가하고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 원료의 반응이 완료된 후, N-숙신이미딜 6-말레이미도헥사노에이트(428.5mg, 1.39mmol)를 직접 가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 감압 증류하여 용매를 제거하고, 수득된 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피[클로로포름:메탄올=8:1(v/v)]로 정제하여 표제 화합물(0.7g, 수율73％)을 수득하였다. ESI-MS m/z：1035(M+H).
실시예 2-2: 화합물 LE13의 합성
중간체 14의 합성
시판되는 중간체 12(267mg, 0.8mmol)와 폴리포름알데히드(50mg, 1.6mmol)를 혼합하여 20mL의 무수 디클로로메탄에 용해시키고, 트리메틸클로로실란(0.3mL, 3.4mmol)을 천천히 가하고, 첨가가 완료된 후 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 다음 시료를 취하여 메탄올을 가하여 퀀칭시킨 후 액체 크로마토그래피 질량분석기로 반응을 모니터링하고, 반응이 완료된 후 반응 용액을 여과한 다음 여액에 tert-부틸 하이드록시아세테이트(211mg, 1.6mmol) 및 0.5mL의 펨피딘(pempidine)을 가하고, 실온에서 약 2시간 동안 계속하여 반응시키고, 반응이 완료된 후 감압 증류하여 대부분의 용매를 제거하고, 수득된 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피[디클로로메탄:메탄올=20:1(v/v)]로 정제하여 중간체 14(260mg, 수율68％)를 수득하였다. ESI-MS m/z：479(M+H).
중간체 15의 합성
중간체 14(238 mg, 0.50mmol)를 6mL의 디클로로메탄 및 메탄올의 혼합 용매(v/v=2:1)에 용해시키고, 0.3mL의 트리플루오로아세트산을 천천히 가하고, 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 동일한 체적의 물 및 에틸 아세테이트를 가하고, 유기상을 건조시킨 후 농축하여, 수득된 조질의 생성물을 다음 단계에 직접 사용하였다.
중간체 16의 합성
상기 단계에서 수득된 조질의 생성물과 엑사테칸 메탄설포네이트(170mg, 0.30mmol)를 5mL의 무수 N,N-디메틸포름아미드에 혼합하고, 2-(7-옥소벤조트리아졸)-N,N,N’,N’-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(341mg, 0.90mmol), 0.60mL의 트리에틸아민을 가하여, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 감압 증류하여 용매를 제거하고, 수득된 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피[클로로포름:메탄올=10:1(v/v)]로 정제하여 중간체 16(210mg, 83%)을 수득하였다. ESI-MS m/z：840(M+H).
중간체 17의 합성
중간체 16(100mg, 0.12mmol)을 15mL의 무수 테트라하이드로푸란에 용해시키고, 3mL의 물을 가한 다음, 1mol/L의 0.3mL의 트리에틸포스핀 수용액을 가하고, 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료됨을 모니터링한 후 반응 용액을 감압 증류하여 테트라하이드로푸란을 제거하고, 나머지 수용액에 탄산수소나트륨을 가하여 pH를 중성으로 조절한 다음 디클로로메탄을 가하여 추출하고, 수득된 유기상을 건조시킨 후 감압 증류하여 용매를 제거하고, 수득된 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피[디클로로메탄:메탄올=10:1(v/v)]로 정제하여 중간체 17(69mg, 수율71％)을 수득하였다. ESI-MS m/z：814(M+H).
화합물 LE13의 합성
상기 단계의 합성 방법에 따라 수득된 중간체 17(120mg, 0.15mmol)과 시판되는 원료 MC-V(102mg, 0.33mmol)를 40mL의 디클로로메탄에서 혼합하고, 축합제 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디하이드로퀴놀린(82mg, 0.33mmol)을 가하고, 실온에서 밤새 반응시키며, 반응이 완료된 후 감압 하에 용매를 증발 건조시키고, 수득된 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피[디클로로메탄:메탄올=10:1(v/v)]로 정제하여 화합물 LE13(116mg, 수율70％)을 수득하였다. ESI-MS m/z：1106.5(M+H).
실시예 2-3: 화합물 LE14의 합성
중간체 19의 합성
시판되는 중간체 18(300mg, 0.8mmol)를 폴리포름알데히드(50mg, 1.6mmol)와 혼합하여 20mL의 무수 디클로로메탄에 용해시키고, 트리메틸클로로실란(0.3mL, 3.4mmol)을 천천히 가하여, 실온에서 2시간 동안 반응시키며, 시료를 취하여 메탄올을 가하여 퀀칭시킨 후 액체 크로마토그래피 질량분석기로 반응을 모니터링하였다. 반응이 완료된 후 반응 용액을 여과한 다음 여액에 tert-부틸 하이드록시아세테이트(211mg, 1.6mmol) 및 트리에틸아민(0.22m, 1.6mmol)을 가하고, 실온에서 약 2시간 동안 계속하여 반응시키고, 반응이 완료된 후 감압 증류하여 대부분의 용매를 제거하고, 수득된 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피[디클로로메탄:메탄올=20:1(v/v)]로 정제하여 중간체 19(349mg, 수율85％)를 수득하였다. ESI-MS m/z：514(M+H), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.13 (s, 1H), 7.56 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.35 (s, 2H), 5.14 (s, 2H), 4.91 (s, 2H), 4.25 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 3.99 (d, J = 42.5 Hz, 2H), 3.85 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.40 (dd, J = 18.5, 7.6 Hz, 2H), 2.89 (d, J = 48.6 Hz, 3H), 1.65 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.46 (s, 9H).
중간체 20의 합성
중간체 19(257mg, 0.50mmol)를 6mL의 디클로로메탄 및 메탄올의 혼합 용매(v/v=2:1)에 용해시키고, 0.3mL의 트리플루오로아세트산을 천천히 가하고, 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 동일한 체적의 물 및 에틸 아세테이트를 가하고, 유기상을 건조시킨 후 농축하여, 수득된 조질의 생성물을 다음 단계에 직접 사용하였다.
수득된 조질의 생성물과 엑사테칸 메탄설포네이트(170mg, 0.30mmol)를 5mL의 무수 N,N-디메틸포름아미드에 혼합하고, 2-(7-옥소벤조트리아졸)-N,N,N’,N’-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(341mg, 0.90mmol), 0.60mL의 트리에틸아민을 가하고, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 감압 증류하여 용매를 제거하고, 수득된 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피[디클로로메탄:메탄올=20:1(v/v)]로 정제하여 중간체 20(212mg, 수율81％)을 수득하였다. ESI-MS m/z：875(M+H). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.27 (d, J = 34.7 Hz, 1H), 7.63 - 7.35 (m, 5H), 7.21 - 7.10 (m, 1H), 5.71 - 5.48 (m, 2H), 5.24 - 4.95 (m, 3H), 4.95 - 4.72 (m, 4H), 4.45 (s, 1H), 4.33 - 3.97 (m, 3H), 3.75 (s, 2H), 3.39 - 2.99 (m, 4H), 2.76 (d, J = 15.3 Hz, 3H), 2.43 - 2.15 (m, 5H), 2.04 (s, 1H), 1.94 - 1.75 (m, 2H), 1.62 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 1.11 - 0.89 (m, 3H).
중간체 21의 합성
중간체 20(77mg, 0.09mmol)을 12mL의 무수 테트라하이드로푸란에 용해시키고, 3mL의 물을 가한 다음, 1mol/L의 0.3mL의 트리에틸포스핀 수용액을 가하여, 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 감압 증류하여 테트라하이드로푸란을 제거하고, 남은 수용액에 탄산수소나트륨을 가하여 pH를 중성으로 조절하고, 디클로로메탄을 가하여 추출하고, 수득된 유기상을 건조시킨 후 감압 증류하여 용매를 제거하고, 수득된 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피[디클로로메탄:메탄올=10:1(v/v)]로 정제하여 중간체 21(53mg, 수율69％)을 수득하였다. ESI-MS m/z：849(M+H). 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.52 (s, 1H), 7.79 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 7.67 - 7.55 (m, 2H), 7.47 - 7.21 (m, 3H), 6.51 (s, 1H), 5.60 (s, 1H), 5.52 - 5.32 (m, 2H), 5.30 - 5.11 (m, 2H), 5.11 - 4.94 (m, 2H), 4.94 - 4.74 (m, 2H), 4.02 (s, 2H), 3.81 - 3.66 (m, 2H), 3.60 - 3.35 (m, 4H), 3.24 - 3.08 (m, 2H), 2.94 (d, J = 30.8 Hz, 3H), 2.39 (s, 3H), 2.28 - 2.04 (m,2H), 2.00 - 1.73 (m, 2H), 1.22 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.96 - 0.70 (m, 3H).
화합물 LE14의 합성
중간체 21(134mg, 0.16mmol)과 시판되는 원료 MC-V(102mg, 0.33mmol)를 40mL의 디클로로메탄에 혼합하고, 축합제 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디하이드로퀴놀린(82mg, 0.33mmol)을 가하고, 실온에서 밤새 반응시키며, 반응이 완료된 후 감압 하에 용매를 증발 건조시키고, 수득된 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피[디클로로메탄:메탄올=10:1(v/v)]로 정제하여 화합물 LE14(137mg, 수율75％)를 수득하였다. ESI-MS m/z：1141.4(M+H). 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.97 (s, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.27 - 8.09 (m, 1H), 7.88 - 7.70 (m, 2H), 7.63 - 7.51 (m, 2H), 7.28 (s, 3H), 6.99 (s, 2H), 6.51 (s, 1H), 5.59 (s, 1H), 5.50 - 5.32 (m, 2H), 5.17 (s, 2H), 4.98 (s, 2H), 4.85 (d, J = 17.3 Hz, 2H), 4.43 - 4.33 (m, 1H), 4.21 - 4.12 (m, 1H), 4.03 (s, 2H), 3.74 - 3.64 (m, 2H), 3.20 - 3.03 (m, 3H), 3.02 - 2.84 (m, 4H), 2.36 (s, 3H), 2.23 - 2.09 (m, 4H), 2.01 - 1.90 (m, 1H), 1.90 - 1.78 (m, 2H), 1.55 - 1.39 (m, 4H), 1.30 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 1.23 - 1.11 (m, 2H), 0.93 - 0.77 (m, 9H).
실시예 2-4: 화합물 LE15 내지 LE20의 합성
중간체 VI는 Fmoc-L-발린-L-알라닌을 출발원료로 사용할 수 있고, 실시예 2-1에서 중간체 3의 합성 방법의 단계 a 및 b를 참조하며, 단계 b에서의 메틸아민염산염을 시판에서 수득할 수 있는 상응하는 아미노 화합물로 대체하여 제조하였다. 후속 단계는 중간체 VI부터 출발하여, 실시예 2-1에서의 단계 c, d, f 및 h와 동일한 방법에 따라 중간체 9와 유사한 중간체 IX를 수득한 다음, 실시예 6에서의 단계 i 및 j와 동일한 단계에 따라 처리하고, 아미노 보호기를 제거한 다음 시판에서 수득할 수 있는 다른 말레이미드와 축합하여 최종 산물을 수득하였다. 사용된 아미노 화합물 및 말레이미드의 구조는 표 1에 나타낸 바와 같다. 화합물 LE15: 회백색 고체, ESI-MS m/z: 1121.2(M+H); 화합물 LE16: 담황색 고체, ESI-MS m/z: 1167.1(M+H); 화합물 LE17: 황색 고체, ESI-MS m/z: 1132.3(M+H); 화합물 LE18: 담황색 고체, ESI-MS m/z: 1305.4(M+H); 화합물 LE19: 담황색 고체, ESI-MS m/z: 1307.4(M+H); 화합물 LE20: 담황색 고체, ESI-MS m/z: 1337.6(M+H).
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실시예 2-5: 화합물 LE21 및 LE22의 합성
화합물 DXD-1의 합성
시판되는 엑사테칸 메탄설포네이트(0.568g, 1mmol)를 시판되는 2-(tert-부틸디메틸실록시)아세트산(CAS:105459-05-0, 0.38g, 2mmol)을 혼합하여 20mL의 무수 디클로로메탄에 용해시키고, 축합제 HATU(0.76g, 2mmol) 및 1mL의 피리딘을 가하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후 감압 하에 용매를 증발 건조시키고, 수득된 조질의 생성물을 컬럼 크로마토그래피[디클로로메탄:메탄올=50:1(v/v)]로 정제하여 표제 화합물 DXD-1(0.55g, 수율90％)을 수득하였다. ESI-MS m/z：608.1(M+H). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.73 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.05 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.80 - 5.62 (m, 2H), 5.41 - 5.14 (m, 4H), 4.29 - 4.15 (m, 2H), 4.08-4.03 (m, 1H), 3.27 - 3.07 (m, 2H), 2.45 (s, 3H), 2.38 - 2.28 (m, 2H), 1.96 - 1.81 (m, 2H), 1.04 (t, J = 7.4 Hz, 3H), 0.80 (s, 9H), 0.11 (s, 3H), 0.03 (s, 3H).
중간체 V의 제조
중간체 V는 실시예 2-1에서 화합물 4의 제조 방법을 참조하여 단계 b에서의 메틸아민염산염을 시판에서 수득할 수 있는 상응하는 아미노 화합물로 대체하여 제조할 수 있다.
LE21 내지 LE22의 합성
중간체 V를 DXD-1와 반응시킨 후, 10%의 트리플루오로아세트산/디클로로메탄 용액으로 처리를 거쳐 중간체 X를 수득된 후, 중간체 X는 실시예 2-1에서 화합물 5의 후속 단계 e, g, i 및 j를 참조하여 반응시키며: 중간체 X를 환원시켜 아미노 화합물을 수득하고, 수득된 아미노 화합물과 Fmoc-발린 하이드록시숙신이미드를 축합한 다음 수득된 산물 중의 아미노의 Fmoc 보호기를 제거하고, 수득된 아미노 산물을 N-숙신이미딜 6-말레이미도헥사노에이트와 반응시켜 최종 산물을 수득하였다. 화합물 LE21: 황색 고체, ESI-MS m/z：1141.2(M+H); 화합물 LE22: 황색 고체, ESI-MS m/z：1106.6(M+H).
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실시예 2-6: 화합물 LS13의 합성
실시예 2-4의 LE15의 합성 방법을 참조하여, SN-38(7-에틸-10-하이드록시캄프토테신)을 중간체 VII(R1은 메틸술폰에틸)와 반응시킨 후 탈보호, 축합 등의 단계를 거쳐 화합물 LS13을 수득하였다: 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.92 (d, J = 22.4 Hz, 1H), 8.14 (s, 1H), 8.08 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.81 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.70 - 7.50 (m, 3H), 7.47 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.27 (s, 1H), 7.20 (s, 1H), 6.98 (s, 2H), 6.51 (s, 1H), 5.61 (s, 2H), 5.48 - 5.35 (m, 2H), 5.27 (s, 2H), 5.10 (d, J = 20.6 Hz, 2H), 4.36 (s, 1H), 4.21 - 4.07 (m, 1H), 3.84 (s, 2H), 3.48 (s, 2H), 3.21 - 2.92 (m, 6H), 2.25 - 2.04 (m, 2H), 2.04 - 1.78 (m, 3H), 1.55 - 1.36 (m, 4H), 1.36 - 1.10 (m, 9H), 0.95 - 0.71 (m, 10H).
실시예 2-7: 화합물 GGFG-Dxd의 합성
화합물 GGFG-Dxd는 WO2015146132A1에 보도된 공지된 합성 방법을 참조하여 제조하였다. ESI-MS m/z：1034.5(M+H), 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.61 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 8.50 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 8.28 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.05 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.99 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.25 - 7.16 (m, 5H), 6.98 (s, 2H), 6.51 (s, 1H), 5.59 (dt, J = 7.4, 4.1 Hz, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.20 (s, 2H), 4.64 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 4.53 - 4.40 (m, 1H), 4.02 (s, 2H), 3.74 - 3.37 (m, 8H), 3.18 - 3.00 (m, 2H), 3.04 - 2.97 (m, 1H), 2.77 (dd, J = 13.5, 9.4 Hz, 1H), 2.38 (s, 3H), 2.19 (dd, J = 14.9, 8.5 Hz, 2H), 2.11 - 2.05 (m, 2H), 1.86 (dd, J = 14.0, 6.7 Hz, 2H), 1.45 (s, 4H), 1.20 - 1.14 (m, 2H), 0.87 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
실시예 3: 항체 약물 접합체의 제조
실시예 1의 방법에 따라 제조하여 수득된 HER3의 항체 FDA026 및 FDA028 및 FDA029는 G25 탈염 컬럼을 사용하여 각각 50mM의 PB/1.0mM의 EDTA 완충액(pH 7.0)으로 치환하고, 12당량의 TECP를 가하고, 37℃에서 2시간 동안 교반하여 항체 사슬 간의 이황화 결합을 완전히 열리도록 한 후 인산을 사용하여 환원된 항체 용액의 pH를 6.0으로 조절하고, 수조의 온도를 25℃로 낮추어, 커플링 반응을 위해 준비하였다. 상기 실시예 2의 방법에 따라 제조하여 수득된 링커-약물 접합체 LE12-LE22, LS13 및 GGFG-Dxd를 DMSO로 각각 용해시키고, 12당량의 링커-약물 접합체를 흡입하여 환원된 항체 용액에 천천히 적가하고, 이의 최종 농도 10%(v/v)가 되도록 DMSO를 추가로 가하여, 25℃에서 0.5시간 동안 교반하고 반응시키고, 반응이 완료된 후, 0.22um의 막으로 시료를 여과하였다. 접선 흐름 여과 시스템으로 정제하여 커플링되지 않은 소분자를 제거하고, 완충액은 50mM의 PB/1.0mM의 EDTA 용액(pH 6.0)이고, 정제한 후 최종 농도가 6%인 수크로스를 가하고 -20℃의 냉장고에 방치하여 보관하였다. UV법으로 각각 280nm 및 370nm에서 흡광도 값을 측정하여 DAR 값을 계산하였고, 결과는 표 2에 나타낸 바와 같다.
본 실시예의 상기 동일한 작업 단계에 따라 커플링 반응을 수행하고, 시료는 모두 가장 높은 DAR에 따라 제조(즉 과도 커플링)하며, 각 커플링 반응이 일어날 때 침전의 발생을 관찰하고, 각 커플링 반응이 완료된 후 중합체 비율 및 회수율을 계산하였으며, 수득한 결과는 마찬가지로 표 2에 나타낸 바와 같다.
“/”는 회수율을 계산하지 않음을 나타낸다.
실제 연구에서는 링커-약물 접합체 GGFG-Dxd가 다른 항체와 커플링하는 경우 침전이 생성되며, 중합체의 비율이 높아 보편성을 가지지 않음을 나타내었다. 그러나 본 기술 수단에서의 링커-약물 접합체가 상이한 항체와 커플링을 시도하는 경우, 침전이 생성되지 않고, 또한 중합체 비율이 정상 범위 내에 있어, 본 발명에서 제공되는 링커-약물 접합체는 보다 우수한 물리화학적 특성을 가짐을 나타내었다.
효과예 1: 항체 약물 접합체와 항원의 결합 능력 평가
경쟁적 ELISA 방법을 사용하여 FDA026 항체와 링커-약물 접합체 LE12-LE22의 커플링 전후 Her3 항원에 대한 결합 능력의 변화 여부를 평가하였으며 구체적인 방법은 다음과 같다: 100ng/ml의 HER3 항원(Sino Biological에서 구입, 제품 번호: 10201-H8H)을 100μl/웰로 친수성 ELISA 플레이트 스트립에 코팅하고 3% BSA로 실온에서 2시간 동안 방치하여 차단하였다. 33ng/ml의 비오틴 표지된 FDA026 항체(DAR-2.82)를 일련의 최종 농도(100000, 10000, 1000, 400, 160, 64, 3.2 및 0.16ng/ml)의 FDA026 항체 및 실시예 3에서 제조된 항체 약물 접합체와 1:1로 사전 혼합한 다음 Her3 항원이 코팅된 ELISA 플레이트에 가하고, 실온 조건에서 200rpm 수평으로 1시간 동안 진탕하고, 100μl/웰의 Pierce™ High Sensitivity Streptavidin-HRP, 사전 희석된 효소 결합 항체(Thermo, 제품 번호: 21134)(희석 비율은 1:500임)를 가하고, Sigma의 TMB 발색 용액(Sigma, 제품 번호: T0440)으로 25분 동안 발색시킨 후 1mol/L의 H2SO4로 정지시켰다. 마이크로플레이트 판독기의 기준 파장은 650nm이고, 450nm에서 흡광도 판독 값을 측정한 결과(표 3에 나타낸 바와 같음): FDA026 항체와 링커-약물 접합체의 커플링 전후 HER3 항원에 대한 결합 활성에 차이가 없는 것으로 나타났다. 동일한 방법으로 항체 FDA028 및 FDA029가 링커-약물 접합체와의 커플링 전후 Her3 항원에 대한 결합 능력의 변화 여부를 각각 평가한 결과(표 3에 나타낸 바와 같음): 항체 FDA028 및 FDA029가 링커-약물 접합체와 커플링 전후 HER3 항원에 대한 결합 활성에 차이가 없는 것으로 나타났다.
효과 실시예 2: 항체 약물 접합체의 체외 사멸 활성 평가
SK-BR-3(ATCC) 세포를 실험용 체외 활성 검출용 세포주로 선택하여, 웰당 2000개의 세포를 96웰 세포 배양 플레이트에 접종하고, 20 내지 24시간 동안 배양하였다. 실시예 3의 방법에 따라 제조된 항체 약물 접합체를 10%FBS가 포함된 L15 세포 배양 배지를 사용하여 1000, 166.7, 55.6, 18.6, 6.17, 2.06, 0.69, 0.23, 0.08, 0.008 및 0nM의 총 11개 농도로 구배된 시험 용액으로 제조하고, 100μl/웰의 희석된 시험 용액을 취하여 세포가 접종된 배양 플레이트에 가하고, 37℃, 5%CO2의 인큐베이터에서 144시간 동안 배양한 후 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존능 검정 시약(Luminescent Cell Viability Assay Reagent)(50μl/웰)을 가하고, 실온에서 500rpm으로 10분 동안 진탕하여 균일하게 혼합하고, SpectraMaxL 마이크로플레이트 판독기로 데이터(OD570nm, 2s 간격으로 판독)를 판독한 후 IC50을 계산하였으며, 결과는 표 4에 나타낸 바와 같다.
상기와 동일한 방법으로 ATCC에서 구입한 22Rv1, LNCaP, SW620, NCI-H820, OVCAR-8 및 HCC827 여러 개의 종양 세포에 대한 각 항체 약물 접합체의 세포 독성 사멸 활성을 시험하였고, 결과는 표 4에 나타낸 바와 같다. 표 4의 결과로부터 본 발명에서 제공되는 항체 약물 접합체가 SK-BR-3, 22Rv1, LNCaP, SW620, NCI-H820, OVCAR-8 및 HCC827 등 세포에 대해 매우 우수한 체외 사멸 활성을 가짐을 알 수 있다.
효과 실시예 3: 항체 약물 접합체에서 항체 Fc 말단 돌연변이가 CD32a 수용체를 발현하는 세포에 대한 결합 활성 및 세포 독성에 미치는 영향
효과 실시예 3-1: 항체 약물 접합체에서 항체 Fc 말단 돌연변이가 CD32a 수용체를 발현하는 세포에 대한 결합 활성에 미치는 영향
HTRF법을 사용하여 제조된 ADC와 CD32a를 발현하는 세포의 결합 능력을 분석하고, HEK293 세포(ATCC)를 취하여 37℃의 수조에서 빠르게 흔들어 세포를 소생시키고, 원심분리한 후 상청을 제거하고, 1.1mL의 1× Tag-lite buffer으로 재현탁하고, 웰당 10μL의 세포를 384웰 플레이트에 접종한 다음, 세포가 첨가된 웰에 사전 제조된 FDA026-LE14, FDA028-LE14 및 FDA029-LE14 등 항체 약물 접합체 시료를 일련의 희석 농도(100000, 3333.33, 1111.11, 370.37, 123.46, 41.15, 13.72, 4.57 및 1.52nM)에 따라 5μL/웰로 384웰 플레이트에 가하고, 마지막으로 상기 웰 플레이트에 5μL의 d2 표지 면역글로불린 IgG-d2 접합체를 각각 가하고, 상기 IgG-d2 접합체는 CD32a와 결합할 수 있으며, 실온에서 빛을 차단하고 3시간 동안 배양하면, FRET 신호가 생성된다. 상기 ADC 시료를 웰 플레이트에 가한 후, ADC 시료가 표지된 IgG와 경쟁적으로 CD32a에 결합하여, FRET 신호를 감소시킬 수 있었다. SpectraMax Paradigm 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 데이터를 판독하고, 340nm을 여기파장, 616nm을 기준파장, 665nm을 특징적 발광파장으로 하여, 흡광도를 측정하고, 이의 IC50값을 계산하였으며, 결과는 표 5에 나타낸 바와 같다. 각 항체 약물 접합체와 CD32의 결합 능력은 표 5에 나타낸 바와 같으며; Fc 말단 아미노산에 의해 변형된 FDA028-LE14 및 FDA029-LE14가 CD32와의 결합 능력은 변형되지 않은 FDA026-LE14의 결합 능력과 비교하여 비교적 약하고(~10%); Fc 말단 아미노산에 의해 변형된 항체 약물 접합체와 CD32a의 결합이 비교적 약함을 나타내었다.
효과 실시예 3-2: 항체 약물 접합체에서 항체 Fc 말단 돌연변이가 CD32a 수용체를 발현하는 세포에 대한 세포 독성에 미치는 영향
FcγRIIa를 양성으로 발현하는 K562(ATCC) 세포(참고: 해당 세포는 Her3 항원을 발현하지 않음)를 실험용 체외 활성 검출용 세포주로 선택하여, 웰당 5000개의 세포를 96웰 세포 배양 플레이트에 접종하고 16 내지 20시간 동안 배양하였다. 상기에 따라 제조된 항체 약물 접합체 FDA026-LE14, FDA028-LE14 및 FDA029-LE14를 10%FBS가 포함된 L15 세포 배양 배지를 사용하여 1000, 166.7, 55.6, 18.6, 6.17, 2.06, 0.69, 0.23, 0.08, 0.008 및 0nM의 총 11개 농도로 구배된 시험 용액으로 제조하고, 100μl/웰의 희석된 시험 용액을 취하여 세포를 접종한 배양 플레이트에 가하고, 37℃, 5%CO2의 인큐베이터에서 144시간 동안 배양한 후 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존능 검정 시약(Luminescent Cell Viability Assay Reagent)(50μl/웰)을 가하고, 실온에서 500rpm으로 10분 동안 진탕하여 균일하게 혼합하고, SpectraMaxL 마이크로플레이트 판독기로 데이터(OD570nm, 2s 간격으로 판독)를 판독한 후 IC50을 계산하였고 결과는 표 5에 나타낸 바와 같으며, 결과는 Fc에 의해 변형되지 않은 FDA026-LE14 접합 약물이 K562 세포에 대해 모두 소정의 사멸 작용이 있는 반면, Fc에 의해 변형된 ADC 약물 FDA028-LE14 및 FDA029-LE14가 K562 세포에 대한 사멸 활성이 유의하게 감소된 것으로 나타났다.
상기 K562 세포주와 동일한 실험 방법을 사용하여, 4일 동안 분화된 HSC 세포(stem cell회사에서 구입, 제품 번호: 70008.1)를 선택하여 6일 동안 투여 처리하여 세포 독성 활성을 검출하고, 항체 약물 접합체를 6일 동안 처리한 후 유동 분석에 의해 HSC 세포의 표면 항원 풍부도(즉 binding ratio, CD32a 7.4;Her3 항원 0.8; CD34 69.0)가 CD32를 높게 발현하고, Her3 항원을 거의 발현하지 않음을 나타내었으며, 이의 시험 활성 결과는 표 6에 나타낸 바와 같고, Fc에 의해 변형되지 않은 FDA026-LE14 접합 약물이 HSC세포에 대해 모두 소정의 사멸 작용이 있는 반면, Fc에 의해 변형된 ADC 약물 FDA028-LE14 및 FDA029-LE14가 HSC 세포에 대한 사멸 활성이 유의하게 감소된 것으로 나타났다.
효과 실시예 4: 체외 혈장 안정성 시험
본 실시예는 인간 혈장에서의 실시예 3의 방법에 따라 제조된 항체 약물 접합체의 안전성을 평가하였다. 구체적으로, 본 실시예에서는 실시예 3의 항체 약물 접합체를 인간 혈장에 가하여, 37℃의 수조에 1, 3, 7, 14, 21, 28일 동안 방치하고 내부 표준 물질(Exatecan을 내부 표준 물질로 함)을 가하고 추출한 다음 고성능 액체 크로마토그래피로 유리 약물의 방출량을 검출하였으며, 결과는 표 7에 나타낸 바와 같다.
혈장 안전성 결과는 새로운 기술 수단을 사용하여 수득된 ADC의 안전성이 FDA026-1402보다 열등하지 않고, 일부는 보다 우수하며, 동시에 상기 활성 시험 결과도 새로 수득된 일부 ADC의 활성이 FDA026-1402보다 우수함을 입증하였다.
효과 실시예 5: 링커-약물 접합체의 체외 효소 절단 실험
링커-약물 접합체(LE14 및 GGFG-Dxd)와 카텝신 B를 3가지 상이한 pH(5.0, 6.0, 7.0) 완충액에서 공동 배양하고, 상이한 시점에서 시료를 취하여 고성능 액체 크로마토그래피-질량분석기에 넣어 외부 표준 방법(DXD를 외부 표준으로 함)으로 약물의 방출 백분율을 결정하였다. 실험 결과(표 8에 나타낸 바와 같음)는 GGFG-Dxd가 사용되는 pH 범위에서 효소 절단 속도가 비교적 느린 반면, 본 발명의 LE14는 pH 5.0 내지 pH 7.0의 범위에서 모두 빠르게 효소 절단할 수 있음을 나타내었다.
효과 실시예 6: FDA026-LS13의 체외 효소 절단 실험
SK-BR-3 세포주를 실험 세포주로 선택하고, 시료를 카텝신 B 체계(100mM의 아세트산나트륨-아세트산 완충액, 4mM의 디티오트레이톨, pH 5.0)에서 37℃에서 4시간 동안 배양한 후, 수득된 시료를 배양 배지를 사용하여 상이한 농도로 희석하고, SN-38 농도 70nM 내지 0.003nM에 따라 8개의 농도(1.5 내지 10배로 희석)로 설정하며, 144시간 동안 세포주에 대한 사멸(억제) 능력 변화를 관찰하고, CellTiter-Glo® 발광 세포 생존능 검정 시약(Luminescent Cell Viability Assay)으로 화학적 발광 염색 후 형광 데이터를 판독하여 IC50 값을 계산하였다.
상기 카텝신 B 체계에서 37℃에서 4시간 동안 배양하여 수득된 효소 절단 시료를 적당량의 에탄올로 침전시켜 단백질을 제거하고, 고성능 액체 크로마토그래피로 방출된 소분자 화합물을 측정하며 동일한 량의 SN-38을 기준으로 4시간 동안의 방출률을 측정한 결과 방출률이 99%에 달하였다.
실험 결과(표 9에 나타낸 바와 같음)는 효소 절단 처리된 후 FDA026-LS13의 세포 독성 활성이 동일한 량의 SN-38과 거의 동일하며, FDA026-LS13이 카텝신 B의 작용 하에 SN-38을 거의 완전히 방출하고 작용을 발휘하는 반면, FDA026-LS13이 리소좀으로 세포내이입되면 예측할 수 없는 변화가 발생하여 SN-38이 효과적으로 기능할 수 없게 될 수 있음을 나타내었다.
효과 실시예 7: SW620 인간 결장직장암 모델에서 FDA026-LE14의 항종양 활성 시험
6 내지 8주령의 암컷 Balb/c 누드 마우스를 선택하여 오른쪽 목덜미 부분에 100ul의 PBS 용액에 용해시킨 5×106의 인간 유래 결장직장암 세포(SW620)를 피하 접종하고, 종양의 평균 체적이 150 내지 200mm3로 성장한 다음, 종양의 크기 및 마우스의 체중에 따라 무작위로 6마리씩 8개의 군으로 나누고, 각각 블랭크 대조군, 100mg/kg의 이리노테칸 염산 군, 및 항체 약물 접합체 FDA026-1402, FDA028-LE14 및 FDA026-LE14의 각각 5.0mg/kg과 10.0mg/kg의 2개 투여량 군이며, 매주 1회 복강 내 투여하였다. 실험 동물의 체중 및 종양 체적을 매주 2회 측정하고 실험 과정에서 동물의 생존 상태를 관찰하였다. 결과는 표 9에 나타낸 바와 같이, 이리노테칸 염산(100mg/kg) 치료군의 투여가 끝난 후 14일째(즉 관찰 46일째, 이하 동일)의 평균 종양 체적은 1120.09mm3이고, 투여가 끝난 후 블랭크 대조군의 마우스의 평균 종양 체적은 2074.5mm3이었다. 5.0mg/kg의 시험약을 투여한 FDA026-1402 치료군의 투여가 끝난 후 14일째의 평균 종양 체적은 260.87mm3이고, 10mg/kg의 FDA026-1402 치료군의 투여가 끝난 후 14일째의 평균 종양 체적은 0.00mm3이었다. 시험약 5.0mg/kg의 FDA026-LE14 치료군의 투여가 끝난 후 14일째의 평균 종양 체적은 13.79mm3이고, 10mg/kg의 FDA026-LE14 치료군의 투여가 끝난 후 14일째의 평균 종양 체적은 0.00mm3이었다. 시험약 5.0mg/kg의 FDA028-LE14 치료군의 투여가 끝난 후 14일째의 평균 종양 체적은 9.86mm3이고, 10mg/kg의 FDA028-LE14 치료군의 투여가 끝난 후 14일째의 평균 종양 체적은 0.00mm3이었다. 실험 결과는 FDA026-LE14 및 FDA028-LE14가 모두 비교적 좋은 체내 항종양 활성을 가지며, 동시에 모든 실험 마우스에서 사망, 체중 감소가 없어, FDA026-LE14가 우수한 안전성을 가짐을 나타내었다.
참고: 01군은 블랭크 대조군이고; 02군은 5mg/kg의 FDA026-LE14 군이고; 03군은 10mg/kg의 FDA026-LE14 군이고; 04군은 5mg/kg의 FDA026-1402 군이고; 05군은 10mg/kg의 FDA026-1402 군이고; 06군은 5mg/kg의 FDA028-LE14 군이고; 07군은 10mg/kg의 FDA028-LE14 군이며; 08군은 100mg/kg의 이리노테칸 염산 군이다.
SEQUENCE LISTING <110> SHANGHAI FUDAN-ZHANGJIANG BIO-PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> ANTIBODY-DRUG CONJUGATE, AND INTERMEDIATE THEREOF, PREPARATION METHOD THEREFOR, AND APPLICATION THEREOF <130> P23412167KR <140> PCT/CN2020/133872 <141> 2020-12-04 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Ser Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Asn Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 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240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

Claims (14)

  1. 구조가 식(I)으로 표시되는 항체 약물 접합체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물:

    I
    상기 식에서, Ab는 HER3 항체 또는 HER3 항체의 변이체이고;
    m은 2 내지 8이고;
    D는 세포 독성 약물 토포이소머라아제 억제제이고;
    R1은 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬, 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬, C1-C6알킬, C3-C10사이클로알킬, C6-C14아릴 또는 5 내지 14원 헤테로아릴이며; 상기 5 내지 14원 헤테로아릴에서 헤테로원자는 N, O 및 S에서 선택되는 하나 또는 복수이고, 헤테로원자의 개수는 1, 2, 3 또는 4이고; 상기 R1-1, R1-2 및 R1-3은 각각 독립적으로 C1-C6알킬이며;
    L1은 독립적으로 페닐알라닌 잔기, 알라닌 잔기, 글리신 잔기, 글루탐산 잔기, 아스파라긴산 잔기, 시스테인 잔기, 글루탐산 잔기, 히스티딘 잔기, 이소류신 잔기, 류신 잔기, 라이신 잔기, 메티오닌 잔기, 프롤린 잔기, 세린 잔기, 트레오닌 잔기, 트립토판 잔기, 티로신 잔기 및 발린 잔기 중 하나 또는 복수이고; p는 2 내지 4이며;
    L2는 , , , , 또는 이고, 여기서 n은 독립적으로 1 내지 12이며, c 말단은 카르보닐기를 통해 L1에 연결되고, f 말단은 상기 L3의 d 말단에 연결되며;
    L3은 이고, 여기서 b 말단은 상기 Ab에 연결되고. d 말단은 상기 L2의 f 말단에 연결된다.
  2. 제1항에 있어서,
    Ab가 HER3 항체인 경우, 상기 HER3 항체는 HER3 항체 A이고, 상기 HER3 항체 A에서 경쇄의 아미노산 서열은 서열표의 서열번호: 1로 표시되고, 중쇄의 아미노산 서열은 서열표의 서열번호: 2로 표시되며; 및/또는
    Ab가 HER3 항체의 변이체인 경우, 상기 HER3 항체의 변이체는 HER3 항체 A의 변이체이고, HER3 항체 A와 비교하여, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 가지며; 상기 HER3 항체 A에서 경쇄의 아미노산 서열은 서열표의 서열번호: 1로 표시되고, 중쇄의 아미노산 서열은 서열표의 서열번호: 2로 표시되며; 및/또는
    D가 세포 독성 약물 토포이소머라아제 억제제인 경우, 상기 세포 독성 약물 토포이소머라아제 억제제는 또는 이고; R2 및 R5는 각각 독립적으로 H, C1-C6알킬 또는 할로겐이고; R3 및 R6은 각각 독립적으로 H, C1-C6알킬 또는 할로겐이며; R4 및 R7은 각각 독립적으로 C1-C6알킬인
    것을 특징으로 하는 항체 약물 접합체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되고; 및/또는
    상기 HER3 항체 A의 변이체에서 중쇄의 아미노산 서열은 E233P, L234V, L234F, L235A, L235E 또는 P331S 중 하나 또는 복수의 부위 돌연변이를 갖는 서열표의 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열이며; 및/또는
    상기 L3의 b 말단은 티오에테르 결합의 형태로 상기 항체의 메르캅토에 연결되고; 및/또는
    상기 R2 및 R5가 각각 독립적으로 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 C1-C4알킬이고; 및/또는
    상기 R2 및 R5가 각각 독립적으로 할로겐인 경우, 상기 할로겐은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드이고; 및/또는
    상기 R3 및 R6이 각각 독립적으로 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 C1-C4알킬이고; 및/또는
    상기 R3 및 R6이 각각 독립적으로 할로겐인 경우, 상기 할로겐은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드이고; 및/또는
    상기 R4 및 R7이 각각 독립적으로 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 C1-C4알킬이고; 및/또는
    상기 R1이 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이고, 바람직하게는 에틸이며; 및/또는
    상기 R1이 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬인 경우, 상기 복수는 2개 또는 3개이고; 및/또는
    상기 R1-1 및 R1-2가 각각 독립적으로 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이고, 바람직하게는 메틸이며; 및/또는
    상기 R1이 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 C1-C4알킬이고, 바람직하게는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이고, 가장 바람직하게는 에틸이며; 및/또는
    상기 R1이 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬인 경우, 상기 복수는 2개 또는 3개이고; 및/또는
    상기 R1-3이 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이고, 바람직하게는 메틸이며; 및/또는
    상기 R1이 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이고, 바람직하게는 메틸이며; 및/또는
    상기 m은 정수 또는 비정수이고, 바람직하게는 4 내지 8이고, 보다 바람직하게는 7 내지 8이며; 및/또는
    상기 p는 2이고; 및/또는
    상기 n은 8 내지 12이며; 및/또는
    상기 R1-1, R1-2 및 R1-3이 독립적으로 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 C1-C4알킬인
    것을 특징으로 하는 항체 약물 접합체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 HER3 항체 A의 변이체에서 중쇄의 아미노산 서열은 E233P, L234V 및 L235A의 부위 돌연변이 또는 L234F, L235E 및 P331S의 부위 돌연변이를 갖는 서열표의 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열이며; 및/또는
    상기 R2 및 R5가 각각 독립적으로 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이고, 바람직하게는 메틸이며; 및/또는
    상기 R2 및 R5가 각각 독립적으로 할로겐인 경우, 상기 할로겐은 불소이고; 및/또는
    상기 R3 및 R6이 각각 독립적으로 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이고, 바람직하게는 메틸이며; 및/또는
    상기 R3 및 R6이 각각 독립적으로 할로겐인 경우, 상기 할로겐은 불소이고; 및/또는
    상기 R4 및 R7이 각각 독립적으로 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이고, 바람직하게는 에틸이며; 및/또는
    상기 R1이 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬인 경우, 상기 -NR1-1R1-2는 -N(CH3)2이고; 및/또는
    상기 R1이 하나의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬인 경우, 상기 하나의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬은 이고; 및/또는
    상기 R1이 하나의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬인 경우, 상기 하나의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬은 이며; 및/또는
    m은 7.49, 7.56, 7.59, 7.60, 7.63, 7.65, 7.67, 7.72, 7.78, 7.81, 7.82 또는 7.83이고; 및/또는
    상기 (L1)p는 이고, 여기서 g 말단은 카르보닐기를 통해 상기 L2의 c 말단에 연결되며; 및/또는
    상기 n은 8, 9, 10, 11 및 12이고; 및/또는
    상기 R1-1, R1-2 및 R1-3이 독립적으로 바람직하게는 C1-C6알킬인 경우, 상기 C1-C6알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이고, 바람직하게는 메틸인
    것을 특징으로 하는 항체 약물 접합체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물.
  5. 제2항에 있어서,
    R2 및 R5는 각각 독립적으로 C1-C6알킬이고; 및/또는
    R3 및 R6은 각각 독립적으로 할로겐이고; 및/또는
    R4 및 R7은 에틸이며; 및/또는
    상기 R1은 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬, 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬, C1-C6알킬 또는 C3-C10사이클로알킬이고, 바람직하게는 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬, 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬, 또는, C1-C6알킬이고, 더 바람직하게는 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬, 또는 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬이며; 및/또는
    상기 L1은 페닐알라닌 잔기, 알라닌 잔기, 글리신 잔기, 이소류신 잔기, 류신 잔기, 프롤린 잔기 및 발린 잔기 중 하나 또는 복수이고, 바람직하게는 페닐알라닌 잔기, 알라닌 잔기, 글리신 잔기 및 발린 잔기 중 하나 또는 복수이고, 더 바람직하게는 발린 잔기 및/또는 알라닌 잔기이며; 및/또는
    상기 D는 바람직하게는 또는 인
    것을 특징으로 하는 항체 약물 접합체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 약물 접합체는 하기 방안 중 어느 하나이고:
    방안 1:
    상기 Ab는 HER3 항체 A 또는 HER3 항체 A의 변이체이고, 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되고; 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 중쇄의 아미노산 서열은 E233P, L234V, L234F, L235A, L235E 또는 P331S 중 하나 또는 복수의 부위 돌연변이를 갖는 서열표의 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열이고, 예를 들어 E233P, L234V 및 L235A의 부위 돌연변이를 가지거나, L234F, L235E 및 P331S의 부위 돌연변이를 가지며;
    D는 또는 이고; R2 및 R5는 각각 독립적으로 H, C1-C6알킬 또는 할로겐이고; R3 및 R6은 각각 독립적으로 H, C1-C6알킬 또는 할로겐이고; R4 및 R7은 각각 독립적으로 C1-C6알킬이고; D는 바람직하게는 또는 이며;
    R1은 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬, 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬, C1-C6알킬 또는 C3-C10사이클로알킬이고; 상기 R1-1, R1-2 및 R1-3은 각각 독립적으로 C1-C6알킬이고;
    L1은 독립적으로 페닐알라닌 잔기, 알라닌 잔기, 글리신 잔기, 이소류신 잔기, 류신 잔기, 프롤린 잔기 및 발린 잔기 중 하나 또는 복수이며;
    방안 2:
    상기 Ab는 HER3 항체 A 또는 HER3 항체 A의 변이체이고, 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되고; 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 중쇄의 아미노산 서열은 E233P, L234V, L234F, L235A, L235E 또는 P331S 중 하나 또는 복수의 부위 돌연변이를 갖는 서열표의 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열이고, 예를 들어 E233P, L234V 및 L235A의 부위 돌연변이를 가지거나, L234F, L235E 및 P331S의 부위 돌연변이를 가지며;
    D는 또는 이고; 상기 R2 및 R5는 각각 독립적으로 C1-C6알킬이고; 상기 R3 및 R6은 각각 독립적으로 할로겐이고; D는 바람직하게는 또는 이고;
    상기 R1은 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬, 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬, 또는 C1-C6알킬이며;
    방안 3:
    상기 Ab는 HER3 항체 A 또는 HER3 항체 A의 변이체이고, 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되고; 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 중쇄의 아미노산 서열은 E233P, L234V, L234F, L235A, L235E 또는 P331S 중 하나 또는 복수의 부위 돌연변이를 갖는 서열표의 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열이고, 예를 들어 E233P, L234V 및 L235A의 부위 돌연변이를 가지거나, L234F, L235E 및 P331S의 부위 돌연변이를 가지며;
    D는 또는 이고; 상기 R2 및 R5는 각각 독립적으로 C1-C6알킬이고; 상기 R3 및 R6은 각각 독립적으로 할로겐이고; D는 바람직하게는 또는 이고;
    상기 m은 7 내지 8이고,
    상기 R1은 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬, 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬, 또는 C1-C6알킬이고;
    상기 L1은 독립적으로 발린 잔기 및/또는 알라닌 잔기이며;
    방안 4:
    상기 Ab는 HER3 항체 A 또는 HER3 항체 A의 변이체이고, 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되고; 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 중쇄의 아미노산 서열은 E233P, L234V, L234F, L235A, L235E 또는 P331S 중 하나 또는 복수의 부위 돌연변이를 갖는 서열표의 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열이고, 예를 들어 E233P, L234V 및 L235A의 부위 돌연변이를 가지거나, L234F, L235E 및 P331S의 부위 돌연변이를 가지며;
    상기 D는 또는 이고,
    상기 R1은 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬, 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬, 또는 C1-C6알킬이며;
    방안 5:
    상기 Ab는 HER3 항체 A 또는 HER3 항체 A의 변이체이고, 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되고; 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 중쇄의 아미노산 서열은 E233P, L234V, L234F, L235A, L235E 또는 P331S 중 하나 또는 복수의 부위 돌연변이를 갖는 서열표의 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열이고, 예를 들어 E233P, L234V 및 L235A의 부위 돌연변이를 가지거나, L234F, L235E 및 P331S의 부위 돌연변이를 가지며;
    상기 D는 또는 이고,
    상기 m은 7 내지 8이고,
    상기 R1은 하나 또는 복수의 -NR1-1R1-2에 의해 치환된 C1-C6알킬, 하나 또는 복수의 R1-3S(O)2-에 의해 치환된 C1-C6알킬, 또는 C1-C6알킬이고;
    상기 L1은 독립적으로 발린 잔기 및/또는 알라닌 잔기인
    것을 특징으로 하는 항체 약물 접합체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 항체 약물 접합체는 하기 식으로 표시되는 화합물 중 어느 하나이며:
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    또는
    ;
    상기 식에서, Ab는 HER3 항체 A 또는 HER3 항체 A의 변이체이고, m은 7.49, 7.56, 7.59, 7.60, 7.63, 7.65, 7.67, 7.72, 7.78, 7.81 또는 7.83이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 3 또는 서열번호: 4로 표시되는 아미노산 서열에서 선택되는
    것을 특징으로 하는 항체 약물 접합체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 항체 약물 접합체는 하기 방안 중 어느 하나이며:
    방안 A:
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    또는
    ;
    상기 식에서, Ab는 HER3 항체 A 또는 HER3 항체 A의 변이체이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 3 또는 서열번호: 4로 표시되는 아미노산 서열에서 선택되며;
    방안 B:
    , 또는 ,
    상기 식에서, Ab는 HER3 항체 A 또는 HER3 항체 A의 변이체이고; m은 7.56, 7.59, 7.63, 7.67, 7.72, 7.81 또는 7.83이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 3 또는 서열번호: 4로 표시되는 아미노산 서열에서 선택되며;
    방안 C:
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    또는
    ;
    상기 식에서, Ab는 HER3 항체 A 또는 HER3 항체 A의 변이체이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체에서 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 3 또는 서열번호: 4로 표시되는 아미노산 서열에서 선택되는
    것을 특징으로 하는 항체 약물 접합체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 항체 약물 접합체는 하기 화합물 중 어느 하나이며:
    , Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.56이며;
    , Ab는 HER3 항체 A의 변이체이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체의 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 3으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄이고, m은 바람직하게는 7.67이며;
    , Ab는 HER3 항체 A의 변이체이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체의 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 4로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄이고, m은 바람직하게는 7.72이고;
    , Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.63이며;
    , Ab는 HER3 항체 A의 변이체이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체의 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 3으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄이고, m은 바람직하게는 7.59이며;
    , Ab는 HER3 항체 A의 변이체이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체의 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 4로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄이고, m은 바람직하게는 7.67이며;
    , Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.81이며;
    , Ab는 HER3 항체 A의 변이체이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체의 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 3으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄이고, m은 바람직하게는 7.63이며;
    , Ab는 HER3 항체 A의 변이체이고; 상기 HER3 항체 A의 변이체의 경쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄이고, 중쇄는 바람직하게는 서열표의 서열번호: 4으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄이고, m은 바람직하게는 7.82이며;
    , Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.56이며;
    , Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.83이며;
    , Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.49이며;
    , Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.60이며;
    , Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.78이며;
    , Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.65이며;
    , Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.83이며; 또는
    , Ab는 HER3 항체 A이고, m은 바람직하게는 7.82인
    것을 특징으로 하는 항체 약물 접합체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물.
  10. 항체로서,
    상기 항체에서 경쇄의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열표의 서열번호: 1로 표시되고; 상기 항체에서 중쇄의 아미노산 서열은 서열표의 서열번호: 3 또는 서열번호: 4로 표시되는 것인, 항체.
  11. 식(II)으로 표시되는 화합물과 Ab-수소를 하기에 나타낸 바와 같은 커플링 반응을 수행시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 약물 접합체의 제조 방법.
  12. 물질 X 및 약용 보조재를 포함하는 약학 조성물로서,
    상기 물질 X는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 약물 접합체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물인, 약학 조성물.
  13. HER3 단백질 억제제의 제조에 있어서의 물질 X 또는 제12항에 따른 약학 조성물의 용도로서,
    상기 물질 X가 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 약물 접합체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물인, 용도.
  14. 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 약물의 제조에 있어서의 물질 X 또는 제12항에 따른 약학 조성물의 용도로서,
    상기 물질 X는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 약물 접합체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물이고,
    상기 종양은 바람직하게는 HER3 양성 종양이고; 상기 HER3 양성 종양은 바람직하게는 폐암, 난소암, 결장직장암, 유선암, 전립선암 및 위암 중 하나 또는 복수이며; 전립선암 세포는 바람직하게는 22Rv1 세포 및/또는 LNCaP 세포이고; 결장직장암 세포는 바람직하게는 SW620 세포이고; 폐암 세포는 바람직하게는 NCI-H820 세포 및/또는 HCC827 세포이고; 난소암 세포는 바람직하게는 OVCAR-8 세포이며; 유선암 세포는 바람직하게는 SK-BR-3 세포인, 용도.
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