KR20230114327A - 태아 세포의 단리, 검출 및 분석을 위한 조성물 및방법 - Google Patents

태아 세포의 단리, 검출 및 분석을 위한 조성물 및방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20230114327A
KR20230114327A KR1020237025070A KR20237025070A KR20230114327A KR 20230114327 A KR20230114327 A KR 20230114327A KR 1020237025070 A KR1020237025070 A KR 1020237025070A KR 20237025070 A KR20237025070 A KR 20237025070A KR 20230114327 A KR20230114327 A KR 20230114327A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
cells
magnetic particles
fetal
sample
Prior art date
Application number
KR1020237025070A
Other languages
English (en)
Inventor
파올라 카스타그놀리
안나 도피니
웬-샨 차오
Original Assignee
메나리니 바이오마커스 싱가포르 피티이 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 메나리니 바이오마커스 싱가포르 피티이 리미티드 filed Critical 메나리니 바이오마커스 싱가포르 피티이 리미티드
Publication of KR20230114327A publication Critical patent/KR20230114327A/ko

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0641—Erythrocytes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/005—Pretreatment specially adapted for magnetic separation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/32—Magnetic separation acting on the medium containing the substance being separated, e.g. magneto-gravimetric-, magnetohydrostatic-, or magnetohydrodynamic separation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2881—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD71
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0605—Cells from extra-embryonic tissues, e.g. placenta, amnion, yolk sac, Wharton's jelly
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/38—Pediatrics
    • G01N2800/385—Congenital anomalies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

태아 세포의 단리, 검출 및 분석을 위한 조성물, 키트 및 방법을 제공한다. 태아 세포 샘플의 제조 및 태아 유전자 검사의 수행을 위한 방법을 또한 본원에 제공한다. 상기 조성물, 키트 및 방법은 항-TREML2 항체를 포함하거나 사용할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 상기 조성물, 키트 및 방법은 콜로이드성 자성 입자 및/또는 외인성 응집 증대 인자에 접합된 항체를 포함하거나 사용한다.

Description

태아 세포의 단리, 검출 및 분석을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR ISOLATING, DETECTING, AND ANALYZING FETAL CELLS}
관련 출원에 대한 상호참조
본원은 2019년 7월 15일자로 출원된 미국 가 출원 제 62/874,306 호에 대한 우선권을 주장하고, 이의 개시내용은 전체가 참고로 인용된다.
지난 40년 동안 연구자들은 산전 진단 도구를 개발하기 위해 임산부의 태아 세포를 분리하려고 시도하였다. 1970년대 초에 양수천자가 처음 개발되었고 1980년대에 융모막 융모 샘플링(CVS)이 개발되었다. 양수천자 및 융모막 융모 샘플링(CVS)은 일반적인 태아 이수성(염색체의 잉여 사본), 예를 들어 13, 18 및 21번 염색체의 삼염색체(다운 증후군 유발)와 같은 염색체 이상의 진단을 위한 일상적인 임상 실행에서 사용되는 두 가지 침습적 방법이다.
임신 중에 모체 혈액으로부터 태아 세포 및 태아 DNA를 분리하는 능력은 개선된 비침습적 산전 검사에 흥미로운 기회를 열어주었다. 최근에 비침습적 산전 검사(NIPT)로 공지된 무세포 DNA-기반 검사(cfDNA)가 산전 선별에 도입되었고 이는 21번 삼염색체에 대한 예측도가 높은 것으로 인식되었다. 그럼에도 불구하고 선별 성능은 침습적 진단 도구보다 낮아, 확인 검사가 여전히 필요하다. 또한 NIPT는, 전문 학회(Practice Bulletin n163 Obstet Gynecol. 2016; 127(5) 979-981)에 따르면 복제수 변이(CNV) 또는 미세결실/중복을 예측하지 않는다. 따라서 현재의 무세포 NIPT는 높은 특이성, 민감도 및 양성 예측값으로 아염색체 결실 및 중복을 검출하기에는 아직 적합하지 않다.
산모 혈액 중에 태아 세포가 부족하기 때문에 산모 순환계에서 태아 세포를 직접 분석하는 것은 지금까지 어려운 일이었다. 필터, 밀도 구배, 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 미세 유체 및 면역-자성(magnetic) 비드를 포함한 다수의 상이한 농축 방법이 시험되었다. 이러한 방법은 순환하는 태아 세포를 회수할 수 있지만 일관성과 재현성이 부족하다. 이는 순환하는 태아 세포(약 1 내지 5백만 개의 세포를 함유하는 산모 혈액 1 ㎖ 중에 0.1 내지 10개의 세포)의 수가 극히 적기 때문이고, 이것은 지금까지 재현 가능한 프로토콜의 수립을 방해하여 왔다. 문제는 임신 첫 3개월 동안 순환하는 태아 세포를 거의 잃지 않으면서 모든 오염성 유핵 혈액 세포를 제거하는 것이다.
이러한 한계와, 양수천자 및 융모막 융모 샘플링(CVS)이 임신 손실의 위험과 관련된 시술이라는 사실을 고려하여, 선천적 결함 및 유전 질환을 선별하기 위해 임산부의 모체 혈액에서 태아 세포를 선택하는 새로운 세포-기반 NIPD(비침습적 산전 진단) 시술을 개발할 필요가 있다.
태아 유핵적혈구(Fetal nucleated red blood cell, nRBC) 및 세포영양막 세포(trophoblastic cell)는 모체 순환계에 존재하는 것으로 공지되어 있지만, 신뢰할 수 있는 세포유전학적 세포-기반 형태의 NIPT를 개발하는 것은 어려운 일이었다. 최근에 양수천자와 CVS에서 획득할 수 있는 것과 유사한 정확도로 이상을 검출하는 능력을 가진 세포-기반 형태의 NIPT에 대한 개발 가능성이 제안되었다(Amy M. Breman, et al., Prenatal Diagnosis, 2016, 36(11):1009-1019).
본원은 태아 세포 마커 및 이에 결합하는 작용제를 개시한다. 본원은 태아 세포 마커에 기반하여 태아 세포를 단리, 검출 및 분석하기 위한 조성물, 키트 및 방법을 추가로 개시한다.
본원은 임신한 피실험자의 샘플에서 태아 세포를 검출하는 방법을 개시하고, 상기 방법은 (a) 상기 샘플을 제1 항체와 접촉시키는 단계로서, 상기 샘플이 다수의 세포를 포함하는, 단계; (b) 상기 제1 항체에 결합된 세포를 단리하여 농축된 샘플을 생성시키는 단계; (c) 상기 농축된 샘플을 제2 항체와 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 제2 항체에 결합된 세포를 태아 세포로서 식별하는 단계를 포함하고, 상기 제1 항체 또는 제2 항체는 (i) 골수세포상에서 발현된 촉발 수용체 유사 2(TREML2) 단백질에 결합하는 항체이거나; 또는 (ii) TREML2 단백질에 결합하는 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시태양에서, 태아 세포는 태아 유핵 적혈구(fnRBC)이다. 일부 실시태양에서, 상기 태아 세포는 세포영양막이다.
일부 실시태양에서, 제1 항체를 하나 이상의 자성 입자에 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 자성 입자는 콜로이드성 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 자성유체(ferrofluid) 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 자성 입자를 제1 외인성 응집 증대 인자(EAEF)에 커플링시키고, 상기 제1 EAEF는 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc, 아비딘-비오틴, 비오틴 유사체-아비딘, 데스티오비오틴-스트렙타비딘, 데스티오비오틴-아비딘, 이미노비오틴-스트렙타비딘 및 이미노비오틴-아비딘을 포함하는 군으로부터 선택된 특정 결합 쌍의 한 구성원을 포함한다.
일부 실시태양에서, 단계 (a)는 제2 EAEF를 가하여 자성 입자의 응집을 유도함을 포함하고, 상기 제2 EAEF는 특정 결합 쌍의 다른 구성원을 포함한다.
일부 실시태양에서, 단계 (b)는 샘플에 자기장을 가함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 단계 (b)는 농축된 샘플에서 자성 입자의 응집을 역전시키기 위해 상기 농축된 샘플에 특정 결합 쌍의 구성원을 가함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 방법은 단계 (a) 전에, 샘플에, 환원제, 면역-복합체, 킬레이트제 및 다이아미노 부탄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 응집 억제제를 가함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 응집 억제제는 킬레이트제이다. 일부 실시태양에서, 상기 킬레이트제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이다.
일부 실시태양에서, 제2 항체는 TREML2 단백질에 결합하는 항체이거나, TREML2 단백질에 결합하는 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 TREML2 단백질은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 이루어지거나, 또는 상기 서열로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, TREML2 단백질은 서열번호 2 내지 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 이루어지거나, 또는 상기 서열로 필수적으로 이루어진다.
일부 실시태양에서, 방법은 단계 (d) 전에, 단일 태아 세포를 단리함을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 단일 태아 세포의 단리를, 제2 항체에 결합된 단일 태아 세포를 단리함으로써 수행된다.
일부 실시태양에서, 제2 항체를 표지에 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 형광 표지이다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 피코에리쓰린(PE), 알로피코시아닌(APC), 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 및 비오틴으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 단일 태아 세포의 단리는 면역형광 기술에 기반한다. 일부 실시태양에서, 단일 태아 세포의 단리를 형광 활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 수행한다. 일부 실시태양에서, 단일 세포의 단리를 DEPArray로 수행한다.
일부 실시태양에서, 단계 (d)는 서열분석을 수행함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 서열분석은 짧은 탠덤 반복(STR) 분석을 포함한다.
일부 실시태양에서, 방법은 태아 세포의 분석을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 태아 세포의 분석은 게놈 또는 유전자 분석을 수행함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 유전자 분석의 수행은 태아 세포 중 하나 이상의 유전적 이상의 존재 또는 부재를 검출함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 제1 항체는 TREML2 단백질에 결합하는 항체이거나, TREML2 단백질에 결합하는 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 TREML2 단백질은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 이루어지거나, 또는 상기 서열로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, TREML2 단백질은 서열번호 2 내지 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 이루어지거나, 또는 상기 서열로 필수적으로 이루어진다.
일부 실시태양에서, TREML2 단백질에 결합하는 항체 또는 TREML2 단백질에 결합하는 항원 결합 단편은 (i) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 상보성 결정 영역(CDR)1; (ii) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR2; (iii) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR3; (iv) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) CDR1; (v) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR2; 및 (vi) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR3 으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함한다. 일부 실시태양에서, 서열번호 6 내지 11 중 어느 하나는 독립적으로 하나 이상의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, TREML2 단백질에 결합하는 항체 또는 TREML2 단백질에 결합하는 항원 결합 단편은 (i) 내지 (vi)으로부터 선택된 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
일부 실시태양에서, TREML2 단백질에 결합하는 항체는 항-TREML2 항체이다. 일부 실시태양에서, 상기 항-TREML2 항체는 sc-109096, ARP49877_P050, OACA04996, AF3259, MA5-30973, PA5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul 및 BD563661로부터 선택된다.
본원은 임신한 피실험자의 샘플에서 태아 세포를 검출하는 방법을 개시하고, 상기 방법은 (a) 상기 샘플을 자성 시약과 접촉시키는 단계로서, 상기 샘플이 다수의 세포를 포함하고, 상기 자성 시약은 제1 항체에 접합된 자성 입자를 포함하고, 상기 제1 항체는 EpCAM, CD105 및 CD71로부터 선택된 단백질에 결합하는, 단계; (b) 상기 샘플을 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 항-TREML2 항체에 결합하는 세포를 태아 세포로서 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시태양에서, 방법은 단계 (c) 전에, 제1 항체에 결합된 세포를 단리함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 세포의 단리는, 샘플에 제1 항체에 결합된 세포를 농축시키기 위해 상기 샘플에 자기장을 가함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 자성 입자는 콜로이드성 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 자성유체 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 200 ㎚ 미만이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 약 80 내지 200 ㎚이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 약 90 내지 150 ㎚이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 50% 이상의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 60% 이상의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 70% 내지 90%의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는, 코팅 분자에 의해 둘러싸인 초상자성 물질의 결정성 코어를 포함한다.
일부 실시태양에서, 자성 입자를 제1 외인성 응집 증대 인자(EAEF)에 추가로 커플링시키고, 상기 제1 EAEF는 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc, 아비딘-비오틴, 비오틴 유사체-아비딘, 데스티오비오틴-스트렙타비딘, 데스티오비오틴-아비딘, 이미노비오틴-스트렙타비딘 및 이미노비오틴-아비딘을 포함하는 군으로부터 선택된 특정 결합 쌍의 한 구성원을 포함한다.
일부 실시태양에서, 방법은 단계 (a) 동안, 제2 EAEF를 가하여 입자의 응집을 증가시킴을 포함하고, 상기 제2 EAEF는 특정 결합 쌍의 다른 구성원을 포함한다.
일부 실시태양에서, 방법은 농축된 샘플에서 자성 입자의 응집을 역전시키기 위해 상기 농축된 샘플에 특정 결합 쌍(제3 EAEF)의 구성원을 가하고, 이에 의해 세포의 식별을 촉진함을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 방법은 단계 (a) 전에, 샘플에, 환원제, 면역-복합체, 킬레이트제 및 다이아미노 부탄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 응집 억제제를 가함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 응집 억제제는 킬레이트제이다. 일부 실시태양에서, 상기 킬레이트제는 EDTA이다.
일부 실시태양에서, 방법은 단계 (c) 전에, 항-TREML2 항체 또는 제2 항체를 사용하여 세포를 단리함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 제2 항체는 항-사이토케라틴 항체 및 항-HLAG 항체로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 제2 항체를 표지에 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 형광 표지이다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 피코에리쓰린(PE), 알로피코시아닌(APC), 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 및 비오틴으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 세포의 단리는 면역형광 기술에 기반한다. 일부 실시태양에서, 세포의 단리를 형광 활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 수행한다. 일부 실시태양에서, 세포의 단리를 DEPArray로 수행한다.
일부 실시태양에서, 세포의 식별은 서열분석을 수행함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 서열분석은 짧은 탠덤 반복(STR) 분석을 포함한다.
일부 실시태양에서, 방법은 태아 세포의 분석을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 태아 세포의 분석은 게놈 또는 유전자 분석을 수행함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 유전자 분석의 수행은 태아 세포 중 하나 이상의 유전적 이상의 존재 또는 부재를 검출함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 태아 세포는 태아 적혈구아세포 또는 태아 세포영양막이다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 상보성 결정 영역(CDR)1; (ii) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR2; (iii) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR3; (iv) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) CDR1; (v) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR2; 및 (vi) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR3 으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함한다. 일부 실시태양에서, 서열번호 6 내지 11 중 어느 하나는 독립적으로 하나 이상의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체는 sc-109096, ARP49877_P050, OACA04996, AF3259, MA5-30973, PA5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul 및 BD563661로부터 선택된다.
본원은 임신한 피실험자의 샘플에서 태아 세포를 검출하는 방법을 추가로 개시하고, 상기 방법은 (a) 상기 샘플을 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키키는 단계로서, 상기 샘플이 다수의 세포를 포함하고, 상기 제1 항체(항-TREML2 항체)는 골수세포상에서 발현된 촉발 수용체 유사 2(TREML2) 단백질에 결합하는, 단계; (b) 상기 제1 항체에 결합된 세포를 태아 세포로서 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시태양에서, 태아 세포는 태아 유핵 적혈구(fnRBC)이다.
일부 실시태양에서, 제1 항체를 하나 이상의 자성 입자에 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 자성 입자는 콜로이드성 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 자성유체 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 200 ㎚ 미만이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 약 80 내지 200 ㎚이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 약 90 내지 150 ㎚이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 50% 이상의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 60% 이상의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 70% 내지 90%의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 코팅 분자에 의해 둘러싸인 초상자성 물질의 결정성 코어를 포함한다.
일부 실시태양에서, 방법은 샘플에 자기장을 가함을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 자성 입자를 제1 외인성 응집 증대 인자(EAEF)에 커플링시키고, 상기 제1 EAEF는 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc, 아비딘-비오틴, 비오틴 유사체-아비딘, 데스티오비오틴-스트렙타비딘, 데스티오비오틴-아비딘, 이미노비오틴-스트렙타비딘 및 이미노비오틴-아비딘을 포함하는 군으로부터 선택된 특정 결합 쌍의 한 구성원을 포함한다.
일부 실시태양에서, 방법은 단계 (b) 전에, 제2 EAEF를 가하여 자성 입자의 응집을 증가시킴을 추가로 포함하고, 상기 제2 EAEF는 특정 결합 쌍의 다른 구성원을 포함한다.
일부 실시태양에서, 방법은 제1 항체에 결합된 세포를 단리하여 농축된 샘플을 생성시킴을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 방법은 농축된 샘플에서 자성 입자의 응집을 역전시키기 위해 상기 농축된 샘플에 제3 EAEF를 가함을 추가로 포함하고, 상기 제3 EAEF는 제1 EAEF 또는 제2 EAEF에 결합할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 제3 EAEF는 특정 결합 쌍의 한 구성원이다.
일부 실시태양에서, 방법은 단계 (a) 전에, 샘플에, 환원제, 면역-복합체, 킬레이트제 및 다이아미노 부탄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 응집 억제제를 가함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 응집 억제제는 킬레이트제이다. 일부 실시태양에서, 상기 킬레이트제는 EDTA이다.
일부 실시태양에서, 제1 항체를 표지에 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 형광 표지이다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 피코에리쓰린(PE), 알로피코시아닌(APC), 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 및 비오틴으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 방법은 단계 (b) 전에, 제1 항체에 결합된 세포를 단리함을 추가로 포함하고, 여기서 세포의 단리는 면역형광 기술에 기반한다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 항체에 결합된 세포의 단리를 형광 활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 수행한다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 항체에 결합된 세포의 단리를 DEPArray로 수행한다.
일부 실시태양에서, 단계 (b)는 서열분석을 수행함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 서열분석은 짧은 탠덤 반복(STR) 분석을 포함한다. 일부 실시태양에서, 방법은 태아 세포의 분석을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 태아 세포의 분석은 게놈 또는 유전자 분석을 수행함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 유전자 분석의 수행은 태아 세포 중 하나 이상의 유전적 이상의 존재 또는 부재를 검출함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR1; (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR2; (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR3; (d) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR1; (e) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR2; 및 (f) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR3 으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 서열번호 6 내지 11 중 어느 하나는 독립적으로 하나 이상의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 내지 (f)로부터 선택된 CDR 중 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다.
일부 실시태양에서, 제1 항체는 sc-109096, ARP49877_P050, OACA04996, AF3259, MA5-30973, PA5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul 및 BD563661로부터 선택된다.
본원은 세포-기반 태아 유전자 검사 방법을 추가로 개시하고, 상기 방법은 (a) 임신한 피실험자로부터 수득한 샘플을 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계로서, 상기 샘플이 다수의 세포를 포함하는, 단계; (b) 상기 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포를 단리하는 단계; (c) 상기 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포로부터의 하나 이상의 핵산 분자를 분석하는 단계; 및 (d) 상기 하나 이상의 핵산 분자의 분석에 기반한 보고서를 생성하는 단계를 포함하고, 상기 보고서는 태아가 하나 이상의 유전적 이상을 가질 가능성을 제공한다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포는 태아 세포이다.
일부 실시태양에서, 태아 세포는 태아 적혈구아세포이다. 일부 실시태양에서, 태아 세포는 태아 세포영양막이다.
일부 실시태양에서, 하나 이상의 핵산 분자의 분석은 핵형 분석을 수행함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 하나 이상의 핵산 분자의 분석은 서열분석을 수행함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 서열분석은 짧은 탠덤 반복(STR) 분석을 포함한다.
일부 실시태양에서, 하나 이상의 유전적 이상은 삼염색체, 성 염색체 이상 및 구조 이상으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 상기 삼염색체는 삼염색체 3, 삼염색체 4, 삼염색체 6, 삼염색체 7, 삼염색체 8, 삼염색체 9, 삼염색체 10, 삼염색체 11, 삼염색체 12, 삼염색체 13, 삼염색체 16, 삼염색체 17, 삼염색체 18, 삼염색체 20, 삼염색체 21 및 삼염색체 22로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 상기 성 염색체 이상은 일염색체 X, 삼중 X 및 클라인펠터(Klinefelter) 증후군으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 상기 구조 이상은 복제수 변이(CNV)이다. 일부 실시태양에서, 상기 구조 이상은 CNV의 결실 또는 CNV의 중복이다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체를 자성 입자에 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 자성 입자는 콜로이드성 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 자성유체 자성 입자이다.
일부 실시태양에서, 단계 (b)는 샘플에 자기장을 가함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 방법은 단계 (a) 전에, 샘플을 제1 항체와 접촉시킴을 추가로 포함하고, 상기 제1 항체는 EpCAM, CD105 및 CD71로부터 선택된 단백질에 결합한다.
일부 실시태양에서, 단계 (a) 전에, 제1 항체에 결합된 세포를 단리함을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 제1 항체를 자성 입자에 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 자성 입자는 콜로이드성 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 자성유체 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 200 ㎚ 미만이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 약 80 내지 200 ㎚이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 약 90 내지 150 ㎚이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 50% 이상의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 60% 이상의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 70% 내지 90%의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는, 코팅 분자에 의해 둘러싸인 초상자성 물질의 결정성 코어를 포함한다.
일부 실시태양에서, 제1 항체에 결합된 세포의 단리는 샘플에 자기장을 가함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 표지에 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 형광 표지이다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포의 단리는 면역형광 기술에 기반한다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포의 단리를 형광 활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 수행한다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포의 단리를 DEPArray로 수행한다.
일부 실시태양에서, 방법은 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포를 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시킴을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 제2 항체는 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 일부 실시태양에서, 제2 항체를 표지에 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 형광 표지이다.
일부 실시태양에서, 방법은 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포를 단리함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포의 단리는 면역형광 기술에 기반한다. 일부 실시태양에서, 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포의 단리를 형광 활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 수행한다. 일부 실시태양에서, 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포의 단리를 DEPArray로 수행한다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체는 sc-109096, ARP49877_P050, OACA04996, AF3259, MA5-30973, PA5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul 및 BD563661로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR1; (ii) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR2; (iii) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR3; (iv) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR1; (v) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR2; 및 (vi) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR3 으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 서열번호 6 내지 11 중 어느 하나는 독립적으로 하나 이상의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 내지 (vi)으로부터 선택된 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
본원은 임신한 피실험자로부터 수득된 모체 샘플로부터 태아 세포 샘플을 제조하는 방법을 추가로 개시하고, 상기 방법은 (a) 태아 세포 및 모체 세포를 포함하는 모체 샘플을 제1 항체 접합체와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 항체 접합체는 (i) 제1 항체; 및 (ii) 콜로이드성 자성 입자를 포함하고, 상기 제1 항체는 상기 콜로이드성 자성 입자에 접합되는, 단계; (b) 상기 모체 샘플에 자기장을 가함으로써 상기 제1 항체 접합체에 결합된 세포를 단리하고, 이에 의해 태아 세포 샘플을 제조하는 단계를 포함한다.
일부 실시태양에서, 자성 입자는 콜로이드성 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 자성유체 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 200 ㎚ 미만이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 약 80 내지 200 ㎚이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 약 90 내지 150 ㎚이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 50% 이상의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 60% 이상의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 70% 내지 90%의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는, 코팅 분자에 의해 둘러싸인 초상자성 물질의 결정성 코어를 포함한다.
일부 실시태양에서, 자성 입자를 제1 외인성 응집 증대 인자(EAEF)에 커플링시키고, 상기 제1 EAEF는 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc, 아비딘-비오틴, 비오틴 유사체-아비딘, 데스티오비오틴-스트렙타비딘, 데스티오비오틴-아비딘, 이미노비오틴-스트렙타비딘 및 이미노비오틴-아비딘을 포함하는 군으로부터 선택된 특정 결합 쌍의 한 구성원을 포함한다.
일부 실시태양에서, 방법은 모체 샘플에 제2 EAEF를 가함을 추가로 포함하고, 상기 제2 EAEF는 특정 결합 쌍의 다른 구성원을 포함한다.
일부 실시태양에서, 제1 항체는 항-TREML2 항체이다.
일부 실시태양에서, 제1 항체는 항-CD71 항체이다.
일부 실시태양에서, 제1 항체는 EpCAM 및 CD105로부터 선택된 단백질에 결합한다.
일부 실시태양에서, 태아 세포 샘플의 제조는 모체 샘플로부터 단리된 세포를 제2 항체와 접촉시킴을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 제2 항체를 표지에 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 형광 표지이다.
일부 실시태양에서, 태아 세포 샘플의 제조는 제2 항체에 결합된 세포를 단리함을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 제2 항체에 결합된 세포의 단리는 면역형광 기술에 기반한다. 일부 실시태양에서, 제2 항체에 결합된 세포의 단리를 형광 활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 수행한다. 일부 실시태양에서, 제2 항체에 결합된 세포의 단리를 DEPArray로 수행한다.
본원은 임신한 피실험자의 샘플에서 태아 세포를 검출하는 방법을 추가로 개시하고, 상기 방법은 (a) 상기 샘플을 제1 항체 접합체와 접촉시키는 단계로서, 상기 샘플이 다수의 세포를 포함하고, 상기 제1 항체는 콜로이드성 자성 입자에 접합된 제1 항체를 포함하는, 단계; (b) 상기 샘플에 자기장을 가함으로써 상기 제1 항체에 결합된 세포를 단리하고, 이에 의해 농축된 샘플을 생성시키는 단계; (c) 상기 농축된 샘플을 제2 항체와 접촉시키는 단계로서, 상기 제2 항체는 태아 세포의 표면상의 마커에 결합하는, 단계; 및(d) 상기 제2 항체에 결합된 세포를 태아 세포로서 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시태양에서, 태아 세포는 태아 유핵 적혈구(fnRBC)이다. 일부 실시태양에서, 상기 태아 세포는 태아 세포영양막이다.
일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 자성유체 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 200 ㎚ 미만이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 약 80 내지 200 ㎚이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 약 90 내지 150 ㎚이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 50% 이상의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 60% 이상의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 70% 내지 90%의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는, 코팅 분자에 의해 둘러싸인 초상자성 물질의 결정성 코어를 포함한다.
일부 실시태양에서, 자성 입자를 제1 외인성 응집 증대 인자(EAEF)에 커플링시키고, 상기 제1 EAEF는 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc, 아비딘-비오틴, 비오틴 유사체-아비딘, 데스티오비오틴-스트렙타비딘, 데스티오비오틴-아비딘, 이미노비오틴-스트렙타비딘 및 이미노비오틴-아비딘을 포함하는 군으로부터 선택된 특정 결합 쌍의 한 구성원을 포함한다.
일부 실시태양에서, 단계 (a)는 제2 EAEF를 가하여 자성 입자의 응집을 증가시킴을 포함하고, 상기 제2 EAEF는 특정한 결합 쌍의 다른 구성원을 포함한다.
일부 실시태양에서, 단계 (b)는 농축된 샘플에서 자성 입자의 응집을 역전시키기 위해 상기 농축된 샘플에 특정 결합 쌍의 구성원을 가함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 방법은 단계 (a) 전에, 샘플에, 환원제, 면역-복합체, 킬레이트제 및 다이아미노 부탄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 응집 억제제를 가함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 응집 억제제는 킬레이트제이다. 일부 실시태양에서, 상기 킬레이트제는 EDTA이다.
일부 실시태양에서, 제2 항체는 TREML2 단백질에 결합하는 항체이거나, TREML2 단백질에 결합하는 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시태양에서, 방법은 단계 (d) 전에, 단일 태아 세포를 단리함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 단일 태아 세포의 단리를, 제2 항체에 결합된 단일 태아 세포를 단리함으로써 수행한다.
일부 실시태양에서, 제2 항체를 표지에 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 형광 표지이다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 피코에리쓰린(PE), 알로피코시아닌(APC), 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 및 비오틴으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 단일 태아 세포의 단리는 면역형광 기술에 기반한다. 일부 실시태양에서, 단일 태아 세포의 단리를 형광 활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 수행한다. 일부 실시태양에서, 단일 태아 세포의 단리를 DEPArray로 수행한다.
일부 실시태양에서, 단계 (d)는 서열분석을 수행함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 서열분석은 짧은 탠덤 반복(STR) 분석을 포함한다.
일부 실시태양에서, 방법은 태아 세포의 분석을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 태아 세포의 분석은 게놈 또는 유전자 분석을 수행함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 유전자 분석의 수행은 태아 세포 중 하나 이상의 유전적 이상의 존재 또는 부재를 검출함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 제1 항체는 TREML2 단백질에 결합하는 항체이거나, TREML2 단백질에 결합하는 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시태양에서, TREML2 단백질에 결합하는 항체 또는 TREML2 단백질에 결합하는 항원 결합 단편은 (i) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 상보성 결정 영역(CDR)1; (ii) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR2; (iii) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR3; (iv) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) CDR1; (v) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR2; 및 (vi) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR3 으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, TREML2 단백질에 결합하는 항체 또는 TREML2 단백질에 결합하는 항원 결합 단편은 (i) 내지 (vi)으로부터 선택된 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시태양에서, 서열번호 6 내지 11 중 어느 하나는 독립적으로 하나 이상의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다.
일부 실시태양에서, TREML2 단백질에 결합하는 항체는 sc-109096, ARP49877_P050, OACA04996, AF3259, MA5-30973, PA5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul 및 BD563661로부터 선택된다.
본원은 추가로 항-TREML2 항체를 개시한다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR1; (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR2; (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR3; (d) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR1; (e) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR2; 및 (f) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR3 으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 서열번호 6 내지 11 중 어느 하나는 독립적으로 하나 이상의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 내지 (f)로부터 선택된 2개 이상의 CDR을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 내지 (f)로부터 선택된 3개 이상의 CDR을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 내지 (f)로부터 선택된 4개 이상의 CDR을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 내지 (f)로부터 선택된 5개 이상의 CDR을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 내지 (f)의 모든 CDR을 포함한다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 표지에 접합된다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 형광 표지이다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 피코에리쓰린(PE), 알로피코시아닌(APC), 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 및 비오틴으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 자성 입자에 접합된다. 일부 실시태양에서, 상기 자성 입자는 콜로이드성 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 자성유체 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 200 ㎚ 미만이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 약 80 내지 200 ㎚이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 약 90 내지 150 ㎚이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 50% 이상의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 60% 이상의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 70% 내지 90%의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는, 코팅 분자에 의해 둘러싸인 초상자성 물질의 결정성 코어를 포함한다.
일부 실시태양에서, 자성 입자는 제1 외인성 응집 증대 인자(EAEF)에 커플링되고, 상기 제1 EAEF는 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc, 아비딘-비오틴, 비오틴 유사체-아비딘, 데스티오비오틴-스트렙타비딘, 데스티오비오틴-아비딘, 이미노비오틴-스트렙타비딘 및 이미노비오틴-아비딘을 포함하는 군으로부터 선택된 특정 결합 쌍의 한 구성원을 포함한다.
본원은 (a) 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 (b) 자성 입자를 포함하는 항-TREML2 항체 접합체를 개시하고, 여기서 상기 자성 입자는 항-TREML2 항체에 접합된다.
일부 실시태양에서, 상기 자성 입자는 콜로이드성 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 자성유체 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 200 ㎚ 미만이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 약 80 내지 200 ㎚이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 약 90 내지 150 ㎚이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 50% 이상의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 60% 이상의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 70% 내지 90%의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는, 코팅 분자에 의해 둘러싸인 초상자성 물질의 결정성 코어를 포함한다.
일부 실시태양에서, 자성 입자는 제1 외인성 응집 증대 인자(EAEF)에 커플링되고, 상기 제1 EAEF는 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc, 아비딘-비오틴, 비오틴 유사체-아비딘, 데스티오비오틴-스트렙타비딘, 데스티오비오틴-아비딘, 이미노비오틴-스트렙타비딘 및 이미노비오틴-아비딘을 포함하는 군으로부터 선택된 특정 결합 쌍의 한 구성원을 포함한다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은
(a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR1; (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR2; (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR3; (d) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR1; (e) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR2; 및 (f) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR3 으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 서열번호 6 내지 11 중 어느 하나는 독립적으로 하나 이상의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 내지 (f)로부터 선택된 2개 이상의 CDR을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 내지 (f)로부터 선택된 3개 이상의 CDR을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 내지 (f)로부터 선택된 4개 이상의 CDR을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 내지 (f)로부터 선택된 5개 이상의 CDR을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 내지 (f)의 모든 CDR을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체는 sc-109096, ARP49877_P050, OACA04996, AF3259, MA5-30973, PA5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul 및 BD563661로부터 선택된다.
본원은 추가로 태아 세포를 단리, 검출 및/또는 분석하기 위한 키트를 개시한다. 일부 실시태양에서, 상기 키트는 (a) 골수세포상에서 발현된 촉발 수용체 유사 2(TREML2) 단백질에 결합하는 항체(항-TREML2 항체) 또는 그의 항원 결합 단편; 및 (b) 콜로이드성 자성 입자를 포함하는 자성 시약을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체는 sc-109096, ARP49877_P050, OACA04996, AF3259, MA5-30973, PA5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul 및 BD563661로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 상보성 결정 영역(CDR)1; (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR2; (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR3; (d) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) CDR1; (e) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR2; 및 (f) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR3 으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 서열번호 6 내지 11 중 어느 하나는 독립적으로 하나 이상의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 표지에 접합되어 접합된 항체를 생성시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 피코에리쓰린(PE), 알로피코시아닌(APC), 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 및 비오틴으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 콜로이드성 자성 입자는 크기가 200 ㎚ 미만이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 자성유체 입자이다.
일부 실시태양에서, 콜로이드성 자성 입자는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 접합된다.
일부 실시태양에서, 항체는 항-TREML2 항체이다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR1; (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR2; (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR3; (d) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR1; (e) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR2; 및 (f) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR3 으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 서열번호 6 내지 11 중 어느 하나는 독립적으로 하나 이상의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 내지 (vi)으로부터 선택된 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체는 sc-109096, ARP49877_P050, OACA04996, AF3259, MA5-30973, PA5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul 및 BD563661로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 키트는 환원제, 면역-복합체, 킬레이트제 및 다이아미노 부탄으로 이루어진 군으로부터 선택된 억제제를 추가로 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 상기 키트는 킬레이트제를 추가로 포함하거나, 상기로 이루어지거나 또는 상기로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 상기 킬레이트제는 EDTA이다.
일부 실시태양에서, 키트는 제1 외인성 응집 증대 인자(EAEF)를 추가로 포함하거나, 상기로 이루어지거나 또는 상기로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 상기 EAEF는 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc, 아비딘-비오틴, 비오틴 유사체-아비딘, 데스티오비오틴-스트렙타비딘, 데스티오비오틴-아비딘, 이미노비오틴-스트렙타비딘 및 이미노비오틴-아비딘을 포함하는 군으로부터 선택된 특정 결합 쌍의 한 구성원을 포함하거나, 상기로 이루어지거나 또는 상기로 필수적으로 이루어진다.
본원은 (a) 태아 세포의 표면상에서 발현된 단백질에 결합할 수 있는 제1 항체(여기서 상기 제1 항체는 콜로이드성 자성 입자에 결합한다); 및 (b) 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키트를 추가로 개시한다.
일부 실시태양에서, 제1 항체는 EpCAM, CD105 및 CD71로부터 선택된 단백질에 결합한다.
일부 실시태양에서, 콜로이드성 자성 입자는 자성유체 입자이다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR1; (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR2; (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR3; (d) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR1; (e) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR2; 및 (f) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR3 으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 서열번호 6 내지 11 중 어느 하나는 독립적으로 하나 이상의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체는 sc-109096, ARP49877_P050, OACA04996, AF3259, MA5-30973, PA5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul 및 BD563661로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 키트는 환원제, 면역-복합체, 킬레이트제 및 다이아미노 부탄으로 이루어진 군으로부터 선택된 억제제를 추가로 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 상기 킬레이트제는 EDTA이다.
일부 실시태양에서, 키트는 외인성 응집 증대 인자(EAEF)를 추가로 포함하거나, 상기로 이루어지거나 또는 상기로 필수적으로 이루어지고, 여기서 상기 EAEF는 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc, 아비딘-비오틴, 비오틴 유사체-아비딘, 데스티오비오틴-스트렙타비딘, 데스티오비오틴-아비딘, 이미노비오틴-스트렙타비딘 및 이미노비오틴-아비딘을 포함하는 군으로부터 선택된 특정 결합 쌍의 한 구성원을 포함하거나, 상기로 이루어지거나 또는 상기로 필수적으로 이루어진다.
도 1은 희귀 세포의 단리, 검출 및 분석을 위한 예시적인 방법을 도시한다.
도 2는 예시적인 자성유체 구조를 도시한다.
도 3은 희귀 세포의 검출을 위한 예시적인 방법을 도시한다.
도 4는 희귀 세포의 단리 및 검출을 위한 예시적인 방법을 도시한다.
도 5A-E는 FACS 장비를 사용하는 세포의 게이팅(gating)을 도시한다.
도 6은 희귀 세포의 단리, 검출 및 분석을 위한 예시적인 방법을 도시한다.
도 7은 조절된 응집을 통한 자성유체 응집의 개략도를 도시한다.
도 8: 태아 세포 농축에 대한 도식적 작업흐름도: 임산부의 전혈로부터 태아 세포를 농축시키고 염색한다. 순수한 단일 세포를, 전체 게놈 증폭 및 게놈 분석을 위해 DEPArray(상표)를 사용하여 단리한다.
도 9: 태아 혈액 샘플로부터 단리된 적혈구아세포의 게이팅 전략: (1) 주요 세포 집단을 게이팅하기 위한 FSC-A/SSC-A (2) 사이톡스 그린(Sytox Green) 음성 생세포 게이팅 (3) 더블릿(doublet) 세포를 제외하기 위한 FSC-H/W (4) 이중 양성 GPA/훽스트(Hoechst) 게이팅 (5) CD71pos/CD45neg 게이팅 (6) TLS1/TREML2 게이팅 및 아이소타입 대조군과 오버레이하여 TREML2 양성 세포의 %를 측정한다.
도 10: 골수 샘플로부터 단리된 적혈구아세포의 게이팅 전략: (1) 주요 세포 집단을 게이팅하기 위한 FSC-A/SSC-A (2) 사이톡스 그린 음성 생세포 게이팅 (3) 더블릿 세포를 제외하기 위한 FSC-H/W (4) 이중 양성 GPA/훽스트 게이팅 (5) CD71pos/CD45neg 게이팅 (6) TLS1/TREML2 게이팅 및 아이소타입 대조군과 오버레이하여 TREML2 양성 세포의 %를 측정한다.
도 11A 내지 11J는 다양한 클론의 다양한 태아 혈액(FB) 샘플로부터 단리된 태아 적혈구아세포상에서의 TLS1/TREML2 발현을 도시한다.
도 12A 내지 12L은 다양한 클론의 다양한 골수(BM) 샘플로부터 단리된 성체 적혈구아세포상에서의 TLS1/TREML2 발현을 도시한다.
도 13은 CD105-FF 및 EpCAM-FF로 스파이킹 및 농축 후에 DEPArray(상표)에 의해 식별된 TLS1/TREML-2 양성 세포영양막 세포의 산포도 분석을 도시한다.
도 14는 셀브라우저(CellBrowser)(등록상표) 이미지 갤러리를 도시한다: 세포영양막 세포는 TREML-2-PE 항체, CK-APC 및 핵 염색(nuclear stain)에서 양성 염색을 나타내었다.
도 15A는 건강한 공여자 혈액에 스파이킹되고 CD71-FF가 농축된 Draq5/훽스트 양성 적혈구아세포의 산포도 분석을 도시한다. 도 15B는 셀브라우저(등록상표) 이미지 갤러리를 도시한다: 적혈구아세포는 CD71-PE 항체, Draq5 및 훽스트 핵 염색에서 양성 염색을 나타내고, CD45-FITC 항체의 경우 음성 염색을 나타내었다.
도 16A는 건강한 공여자 혈액에 스파이킹되고 TLS1/TREML-2-FF가 농축된 Draq5/훽스트 양성 적혈구아세포의 산포도 분석을 도시한다. 도 16B는 셀브라우저(등록상표) 이미지 갤러리를 도시한다: 적혈구아세포는 CD71-PE 항체, Draq5 및 훽스트 핵 염색에서 양성 염색을 나타내고, CD45-FITC 항체의 경우 음성 염색을 나타내었다.
도 17은 모체 혈액에서 단리된 단일 태아 세포의 STR 분석을 도시한다.
도 18은 단일 태아 세포의 CNV 분석의 결과를 도시한다.
도 19는 건강한 공여자 단일 세포에 대한 CNV 분석의 결과를 도시한다.
도 20은 희귀 세포의 단리 및 검출을 위한 예시적인 방법을 도시한다.
본원은 샘플 중 희귀 세포의 단리, 검출 및/또는 분석을 위한 조성물, 키트 및 방법을 개시한다. 일반적으로, 본원에 개시된 조성물, 키트 및 방법은 골수세포상에서 발현된 촉발 수용체 유사 2(TREML2) 단백질(이 단백질은 또한 출원 전체를 통해 TLS1으로서 지칭된다)에 결합하는 작용제를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 본원에 개시된 조성물, 키트 및 방법은 항체 접합체를 포함한다. 상기 항체 접합체는 콜로이드성 자성 입자에 접합된 항체를 포함한다. 상기 희귀 세포는 태아 세포일 수 있다. 상기 샘플은 임신한 피실험자의 샘플일 수 있다.
희귀 세포의 단리, 검출 및/또는 특성화를 위한 방법
본원은 희귀 세포의 단리, 검출 및/또는 특성화를 위한 방법을 개시한다. 일부 실시태양에서, 상기 희귀 세포는 태아 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 희귀 세포는 태아 유핵 적혈구(fnRBC)이다. 일부 실시태양에서, 상기 태아 세포는 세포영양막이다. 일반적으로, 상기 방법은 태아 세포로서 세포를 식별하기 위해 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용함을 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 상기 방법은 태아 세포를 단리하기 위해 콜로이드 자성 입자에 접합된 항체를 사용함을 포함한다.
본원은 임신한 피실험자의 샘플에서 태아 세포를 검출하는 방법을 개시하고, 상기 방법은 (a) 상기 샘플을 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계로서, 상기 샘플이 다수의 세포를 포함하는, 단계; (b) 상기 항-TREML2 항체에 결합된 세포를 태아 세포로서 식별하는 단계를 포함한다.
본원은 임신한 피실험자의 샘플에서 태아 세포를 검출하는 방법을 추가로 개시하고, 상기 방법은 (a) 상기 샘플을 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계로서, 상기 샘플이 다수의 세포를 포함하는, 단계; (b) 상기 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포를 단리하여 농축된 샘플을 생성시키는 단계; (c) 상기 농축된 샘플을 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 제2 항체에 결합된 세포를 태아 세포로서 식별하는 단계를 포함하고, 상기 제1 항체 또는 제2 항체는 골수세포상에서 발현된 촉발 수용체 유사 2(TREML2) 단백질에 결합하는 항체이다.
본원은 임신한 피실험자의 샘플에서 태아 세포를 검출하는 방법을 추가로 개시하고, 상기 방법은 (a) 상기 샘플을 자성 시약과 접촉시키는 단계로서, 상기 샘플이 다수의 세포를 포함하고, 상기 자성 시약은 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 접합된 자성 입자를 포함하고, 상기 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 EpCAM, CD105 및 CD71로부터 선택된 단백질에 결합하는, 단계; (b) 상기 샘플을 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 항-TREML2 항체에 결합된 세포를 태아 세포로서 식별하는 단계를 포함한다.
본원은 임신한 피실험자의 샘플에서 태아 세포를 검출하는 방법을 추가로 개시하고, 상기 방법은 (a) 상기 샘플을 자성 시약과 접촉시키는 단계로서, 상기 샘플이 다수의 세포를 포함하고, 상기 자성 시약은 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 접합된 콜로이드성 자성 입자를 포함하고, 상기 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 EpCAM, CD105 및 CD71로부터 선택된 단백질에 결합하는, 단계; (b) 상기 샘플을 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 제2 항체에 결합된 세포를 태아 세포로서 식별하는 단계를 포함한다.
본원은 임신한 피실험자의 샘플에서 태아 세포를 검출하는 방법을 추가로 개시하고, 상기 방법은 (a) 상기 샘플을 자성 시약 및 제2 외인성 응집 증대 인자(EAEF)와 접촉시키는 단계로서, 상기 샘플이 다수의 세포를 포함하고, 상기 자성 시약은 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 접합된 콜로이드성 자성 입자를 포함하고, 상기 콜로이드성 자성 입자는 제1 EAEF에 접합되고, 여기서 상기 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 EpCAM, CD105 및 CD71로부터 선택된 단백질에 결합하는, 단계; (b) 상기 샘플을 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 제2 항체에 결합된 세포를 태아 세포로서 식별하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 EAEF는 특정 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하고, 상기 제2 EAEF는 상기 특정 결합 쌍의 제2 구성원을 포함하고, 상기 특정 결합 쌍은 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc, 아비딘-비오틴, 비오틴 유사체-아비딘, 데스티오비오틴-스트렙타비딘, 데스티오비오틴-아비딘, 이미노비오틴-스트렙타비딘 및 이미노비오틴-아비딘을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본원은 임신한 피실험자의 샘플에서 태아 세포를 검출하는 방법을 추가로 개시하고, 상기 방법은 (a) 상기 샘플을 제1 항체 접합체와 접촉시키는 단계로서, 상기 샘플이 다수의 세포를 포함하고, 상기 제1 항체 접합체는 콜로이드성 자성 입자에 접합된 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 단계; (b) 상기 샘플에 자기장을 가함으로써 상기 제1 항체에 결합된 세포를 단리하고, 이에 의해 농축된 샘플을 생성시키는 단계; (c) 상기 농축된 샘플을 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계로서, 상기 제2 항체가 태아 세포의 표면상의 마커에 결합하는, 단계; 및(d) 상기 제2 항체에 결합된 세포를 태아 세포로서 식별하는 단계를 포함한다.
본원은 임신한 피실험자로부터 수득된 모체 샘플에서 태아 세포 샘플을 제조하는 방법을 개시하고, 상기 방법은 (a) 태아 세포 및 모체 세포를 포함하는 모체 샘플을 제1 항체 접합체와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 항체 접합체는 (i) 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 (ii) 콜로이드성 자성 입자를 포함하고, 상기 제1 항체는 상기 콜로이드성 자성 입자에 접합되는, 단계; (b) 상기 모체 샘플에 자기장을 가함으로써 상기 제1 항체 접합체에 결합된 세포를 단리하고, 이에 의해 태아 세포 샘플을 제조하는 단계를 포함한다.
본원은 임신한 피실험자로부터 수득된 모체 샘플에서 태아 세포 샘플을 제조하는 방법을 개시하고, 상기 방법은 (a) 태아 세포 및 모체 세포를 포함하는 모체 샘플을 제1 항체 접합체 및 제2 외인성 응집 증대 인자(EAEF)와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 항체 접합체는 (i) 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (ii) 콜로이드성 자성 입자; 및 (iii) 제1 EAEF를 포함하고, 상기 제1 항체는 상기 콜로이드성 자성 입자에 접합되고, 여기서 상기 제1 EAEF는 상기 콜로이드성 자성 입자에 접합되는, 단계; (b) 상기 모체 샘플에 자기장을 가함으로써 상기 제1 항체 접합체에 결합된 세포를 단리하고, 이에 의해 태아 세포 샘플을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 EAEF는 특정 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하고, 상기 제2 EAEF는 상기 특정 결합 쌍의 제2 구성원을 포함하고, 상기 특정 결합 쌍은 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc, 아비딘-비오틴, 비오틴 유사체-아비딘, 데스티오비오틴-스트렙타비딘, 데스티오비오틴-아비딘, 이미노비오틴-스트렙타비딘 및 이미노비오틴-아비딘을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본원은 임신한 피실험자로부터 수득된 모체 샘플에서 태아 세포 샘플을 제조하는 방법을 추가로 개시하고, 상기 방법은 (a) 태아 세포 및 모체 세포를 포함하는 모체 샘플을 제1 항체 접합체와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 항체 접합체는 (i) 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 (ii) 콜로이드성 자성 입자를 포함하고, 상기 제1 항체는 상기 콜로이드성 자성 입자에 접합되고, 여기서 상기 제1 항체는 항-TREML2 항체되고; (b) 상기 모체 샘플에 자기장을 가함으로써 상기 제1 항체 접합체에 결합된 세포를 단리하고, 이에 의해 태아 세포 샘플을 제조하는 단계를 포함한다.
본원은 임신한 피실험자로부터 수득된 모체 샘플에서 태아 세포 샘플을 제조하는 방법을 추가로 개시하고, 상기 방법은 (a) 태아 세포 및 모체 세포를 포함하는 모체 샘플을 제1 항체 접합체 및 제2 외인성 응집 증대 인자(EAEF)와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 항체 접합체는 (i) 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 (ii) 콜로이드성 자성 입자를 포함하고, 상기 제1 항체는 상기 콜로이드성 자성 입자에 접합되고, 여기서 상기 콜로이드성 자성 입자는 제1 EAEF에 접합되는, 단계; (b) 상기 모체 샘플에 자기장을 가함으로써 상기 제1 항체 접합체에 결합된 세포를 단리하고, 이에 의해 태아 세포 샘플을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 EAEF는 특정 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하고, 상기 제2 EAEF는 상기 특정 결합 쌍의 제2 구성원을 포함하고, 상기 특정 결합 쌍은 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc, 아비딘-비오틴, 비오틴 유사체-아비딘, 데스티오비오틴-스트렙타비딘, 데스티오비오틴-아비딘, 이미노비오틴-스트렙타비딘 및 이미노비오틴-아비딘을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 태아 세포는 태아 유핵 적혈구(fnRBC)이다. 일부 실시태양에서, 상기 태아 세포는 적혈구아세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 태아 세포는 세포영약막이다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 항-TREML2 항체 또는 제1 항체에 결합된 세포를 단리함을 추가로 포함하고, 상기 세포의 단리가 세포의 식별 전에 발생한다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 제1 항체의 사용을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 항체를 하나 이상의 자성 입자에 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 자성 입자는 콜로이드성 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 자성 입자는 자성유체 자성 입자이다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포를 단리함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세포의 단리는 샘플에 자기장을 가함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 자성 입자를 제1 외인성 응집 증대 인자(EAEF)에 커플링시키고, 상기 제1 EAEF는 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc, 아비딘-비오틴, 비오틴 유사체-아비딘, 데스티오비오틴-스트렙타비딘, 데스티오비오틴-아비딘, 이미노비오틴-스트렙타비딘 및 이미노비오틴-아비딘을 포함하는 군으로부터 선택된 특정 결합 쌍의 한 구성원을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 제2 EAEF를 가하여 자성 입자의 응집을 유도함을 포함하고, 상기 제2 EAEF는 상기 특정 결합 쌍의 다른 구성원이다.
일부 실시태양에서, 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포의 단리는, 농축된 샘플에서 자성 입자의 응집을 역전시키기 위해 상기 농축된 샘플에 특정 결합 쌍의 구성원을 가함을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 필수적으로 이루어진다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 샘플에, 환원제, 면역-복합체, 킬레이트제 및 다이아미노 부탄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 응집 억제제를 가함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 응집 억제제는 킬레이트제이다. 일부 실시태양에서, 상기 킬레이트제는 EDTA이다. 상기 환원제는 머캅토에탄 설폰산일 수 있다. 상기 응집 억제제는 소 혈청 알부민(BSA)일 수 있다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 2차 항체를 사용한다. 일부 실시태양에서, 상기 2차 항체는 TREML2 단백질에 결합하는 항체이거나, TREML2 단백질에 결합하는 항원 결합 단편을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 단일 태아 세포를 단리함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 단일 태아 세포의 단리는 2차 항체에 결합된 단일 태아 세포를 단리함으로써 수행된다.
일부 실시태양에서, 제2 항체를 표지에 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 형광 표지이다. 일부 실시태양에서, 단일 태아 세포의 단리는 형광 기술에 기반한다. 일부 실시태양에서, 단일 태아 세포의 단리를 형광 활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 수행한다. 일부 실시태양에서, 단일 태아 세포의 단리를 DEPArray로 수행한다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 태아 세포로부터 단리된 하나 이상의 핵산 분자상에서 서열 분석을 수행함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 서열분석은 짧은 탠덤 반복(STR) 분석을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 태아 세포의 분석을 포함한다. 일부 실시태양에서, 태아 세포의 분석은 게놈 또는 유전자 분석을 수행함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 유전자 분석의 수행은 태아 세포 중 하나 이상의 유전적 이상의 존재 또는 부재를 검출함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 제1 항체는 TREML2 단백질에 결합하는 항체이거나, TREML2 단백질에 결합하는 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시태양에서, TREML2 단백질에 결합하는 항체 또는 TREML2 단백질에 결합하는 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 중쇄 가변 영역(HCVR) 상보성 결정 영역(CDR)1; (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 HCVR CDR2; (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어는 HCVR CDR3; (d) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 경쇄 가변 영역(LCVR) CDR1; (e) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 LCVR CDR2; 및 (f) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 LCVR CDR3으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시태양에서, 서열번호 6 내지 11 중 어느 하나는 독립적으로 하나 이상의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체를 하나 이상의 자성 입자에 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 자성 입자는 콜로이드성 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 자성유체 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 세포의 단리는 샘플을 자성 분리기에 놓음을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세포의 단리는 샘플에 자기장을 가함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체를 표지에 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 형광 표지이다. 일부 실시태양에서, 세포의 단리는 유식 세포측정을 포함한다. 일부 실시태양에서, 유식 세포측정은 형광 활성화된 세포 분류(FACS)이다.
일부 실시태양에서, 세포의 단리는 DEPArray를 수행함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 세포의 식별은 서열분석 반응을 수행함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 샘플은, 상기 샘플을 항-TREML2 항체와 접촉시키기 전에, 태아 세포가 농축된 샘플이다. 일부 실시태양에서, 상기 샘플을 자성유체 시약과 접촉시킴으로써 상기 샘플에 태아 세포를 농축시키고, 여기서 상기 자성유체은 자성유체에 커플링된 항체를 포함한다.
일부 실시태양에서, 항체는 EpCAM, CD105 및 CD71로부터 선택된 단백질에 결합한다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 자성유체에 커플링된 항체에 의해 결합된 세포를 단리하고, 이에 의해 태아 세포가 농축된 샘플을 생성시킴을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 서열분석을 수행함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 서열분석은 짧은 탠덤 반복(STR) 분석을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 태아 세포를 분석함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 태아 세포의 분석은 하나 이상의 태아 이상의 존재 또는 부재를 검출함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 태아 세포의 분석은 게놈 분석을 수행함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 태아 세포의 분석은 유전자 분석을 수행함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 유전자 분석의 수행은 태아 세포 중 하나 이상의 유전자 이상의 존재 또는 부재를 검출함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 유전자 분석의 수행은 태아 세포 중 염색체 이상의 존재 또는 부재를 검출함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 염색체 이상은 삼염색체 21, 삼염색체 18, 또는 삼염색체 13이다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 태아 세포상에서 유전자 검사를 수행함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 태아 세포상에서의 유전자 검사의 수행은 하나 이상의 태아 이상의 존재 또는 부재를 검출함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 태아 세포상에서의 유전자 검사의 수행은 게놈 분석을 수행함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 태아 세포상에서의 유전자 검사의 수행은 유전자 분석을 수행함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 유전자 분석의 수행은 태아 세포 중 염색체 이상의 존재 또는 부재를 검출함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 염색체 이상은 삼염색체 21, 삼염색체 18, 또는 삼염색체 13이다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 태아 세포 분석 결과에 기반하여 치료 권고를 제공함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 태아 세포상에서의 유전자 검사의 결과에 기반하여 치료 권고를 제공함을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 태아 세포 분석 결과에 기반하여 피실험자에게 치료법을 실행함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 태아 세포상에서의 유전자 검사의 결과에 기반하여 피실험자에게 치료법을 실행함을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 태아 세포 분석 결과에 기반하여 피실험자 또는 태아의 추가적인 모니터링을 권고함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 태아 세포상에서의 유전자 검사의 결과에 기반하여 피실험자 또는 태아의 추가적인 모니터링을 권고함을 추가로 포함한다.
도 1은 희귀 세포의 단리, 검출 및/또는 분석을 위한 예시적인 방법을 도시한다. 본원에 개시된 방법은 도 1에 도시된 하나 이상의 단계를 포함하거나, 상기 단계로 이루어지거나 또는 필수적으로 이루어질 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 (a) 피실험자의 다수의 세포를 포함하는 샘플을 수득하는 단계(101); 및 (b) 희귀 세포를 단리하는 단계(110)를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 (a) 피실험자의 다수의 세포를 포함하는 샘플을 수득하는 단계(101); (b) 희귀 세포를 단리하는 단계(110); 및 (c) 희귀 세포를 분석하는 단계(120)를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 (a) 피실험자의 다수의 세포를 포함하는 샘플을 수득하는 단계(101); (b) 희귀 세포를 단리하는 단계(110); (c) 희귀 세포를 분석하는 단계(120); 및 (d) 희귀 세포의 분석에 기반하여 하나 이상의 보고서를 생성하는 단계(106)를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 필수적으로 이루어진다.
도 1에 도시된 바와 같이, 일부 실시태양에서, 방법은 (a) 피실험자의 다수의 세포를 포함하는 샘플을 수득하는 단계(101); (b) (i) 상기 샘플로부터 비-희귀 세포를 고갈시켜 농축된 희귀 세포 샘플을 생성하는 단계(102); 및 (ii) 상기 농축된 희귀 세포 샘플로부터 희귀 세포를 단리함(103)으로써 희귀 세포를 단리하는 단계(110); (c) (i) 상기 희귀 세포로부터 핵산 분자를 정제하는 단계(104); (ii) 하나 이상의 핵산 분자를 서열분석함(105)으로써 희귀 세포를 분석하는 단계(120); 및 (f) 하나 이상의 보고서를 생성하는 단계(106)를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 상기 희귀 세포는 태아 세포이다. 일부 실시태양에서, 희귀 세포의 농축(102)은 샘플을 자성유체과 접촉시킴을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 필수적으로 이루어지고, 여기서 상기 자성유체은 자성 입자에 커플링된 항체를 포함하고, 상기 항체는 희귀 세포상의 마커에 결합한다. 일부 실시태양에서, 상기 희귀 세포상의 마커는 본원에 개시된 마커 중 어느 하나이다. 일부 실시태양에서, 상기 희귀 세포상의 마커는 TREML2 단백질이다. 일부 실시태양에서, 상기 항체는 본원에 개시된 항체 중 어느 하나이다. 일부 실시태양에서, 상기 항체는 항-TREML2 항체이다. 일부 실시태양에서, 상기 항체는 본원에 개시된 항-TREML2 항체 중 어느 하나이다. 일부 실시태양에서, 상기 자성유체은 도 2에 묘사된 자성유체을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 희귀 세포의 농축(102)은 외부의 구배 자성 분리기를 샘플에 적용하여 상기 자성유체에 결합하지 않은 세포를 제거함을 추가로 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 희귀 세포를 하나 이상의 추가적인 항체와 접촉시킴을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 필수적으로 이루어지고, 여기서 상기 하나 이상의 추가적인 항체는 표지에 접합된다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 형광 표지이다. 일부 실시태양에서, 희귀 세포를, 상기 휘귀 세포의 단리(103) 전에 하나 이상의 추가적인 항체와 접촉시킨다. 일부 실시태양에서, 희귀 세포의 단리(103)는 희귀 세포상의 마커에 결합하는 항체에 의해 결합된 단일 세포를 선택함을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 상기 항체는 항-TREML2 항체이다. 일부 실시태양에서, 상기 항-TREML2 항체는 본원에 개시된 항-TREML2 항체 중 어느 하나이다. 일부 실시태양에서, 상기 항-TREML2 항체는 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 중쇄 가변 영역(HCVR) 상보성 결정 영역(CDR)1; (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 HCVR CDR2; (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어는 HCVR CDR3; (d) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 경쇄 가변 영역(LCVR) CDR1; (e) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 LCVR CDR2; 및 (f) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 LCVR CDR3을 포함한다. 일부 실시태양에서, 희귀 세포의 단리(103)는 농축된 세포 샘플로부터 희귀 세포를 분류함을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 희귀 세포의 단리(103)는 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 희귀 세포의 단리(103)는 DEPArray를 수행함을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 희귀 세포로부터 핵산 분자의 정제(104)는 핵산 증폭을 수행함을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 희귀 세포로부터 핵산 분자의 정제(104)는 핵산 라이브러리를 생성시킴을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다.
도 3은 희귀 세포(예를 들어 태아 세포)를 검출하기 위한 예시적인 방법을 도시한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 (a) 다수의 세포(302,303)를 포함하는 샘플(301)을 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(304)과 접촉시키고; (b) 상기 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(304)에 의해 결합된 세포(303)를 태아 세포로서 식별하는 단계를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 항체(304)는 TREML2 단백질에 결합하는 항체이다. 일부 실시태양에서, 상기 항원 결합 단편(304)은 TREML2 단백질에 결합한다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 본원에 개시된 항-TREML2 항체 중 어느 하나를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 중쇄 가변 영역(HCVR) 상보성 결정 영역(CDR)1; (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 HCVR CDR2; (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어는 HCVR CDR3; (d) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 경쇄 가변 영역(LCVR) CDR1; (e) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 LCVR CDR2; 및 (f) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 LCVR CDR3을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 상기 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 자성 입자에 커플링시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 항체 또는 항원 결합 단편은 자성유체의 형태일 수 있다. 대안적으로, 상기 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 표지에 접합시킬 수 있다. 상기 표지는 본원에 개시된 표지 중 어느 하나일 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 항체 또는 항원 결합 단편을 형광 표지에 접합시킬 수 있다. 세포를 본원에 개시된 식별 기법 중 어느 하나에 의해 식별할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포의 식별은, 상기 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포를 단리함을 포함한다. 상기 세포의 단리는 본원에 개시된 세포 단리 기법 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 세포의 단리는 자성 분리를 포함한다. 일부 실시태양에서, 세포의 식별은 현미경의 사용을 포함할 수 있다. 상기 세포의 식별은 형광 현미경검사를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 세포의 식별은 FACS를 포함하거나 이에 기반한다. 대안적으로, 또는 추가로, 상기 세포의 식별은 DEPArray에 기반한다.
도 4는 희귀 세포의 단리 및 검출을 위한 예시적인 방법을 도시한다. 일부 실시태양에서, 상기 희귀 세포의 검출 방법은 (a) 다수의 세포(402,403)를 포함하는 샘플(401)을 항체 접합체(406)와 접촉시키는 단계로서, 상기 항체 접합체(406)는 자성 입자(405)에 커플링된 제1 항체 또는 항원 결합 단편(404)을 포함하는, 단계; (b) 상기 샘플에 자기장(407)을 가하고 상기 항체 접합체에 결합되지 않은 세포(402)를 제거함으로써 희귀 세포(403)를 농축시키고, 이에 의해 농축된 희귀 세포 샘플(411)을 생성하는 단계; (c) 상기 농축된 희귀 세포 샘플(411)을 항체 접합체(410)와 접촉시키는 단계로서, 상기 항체 접합체(410)는 표지(409)에 접합된 제2 항체 또는 항원 결합 단편(408)을 포함하는, 단계; 및 (d) 상기 항체 접합체에 결합된 세포를 희귀 세포(403)로서 식별함을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 상기 희귀 세포는 태아 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 희귀 세포는 태아 유핵 적혈구(fnRBC)이다. 일부 실시태양에서, 상기 농축된 희귀 세포 샘플(411)은 항체 접합체(406)에 결합된 희귀 세포(403)를 포함하고, 상기 항체 접합체는 자성 입자(405)에 접합된 제1 항체(404) 또는 그의 항원 결합 단편(404)을 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 상기 농축된 희귀 세포 샘플(411)은 상기 항체 접합체(406)로부터 희귀 세포(403)가 탈착되도록 추가로 가공된다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 항체 또는 항원 결합 단편은 TREML2 단백질에 결합한다. 일부 실시태양에서, 상기 제2 항체 또는 항원 결합 단편은 TREML2 단백질에 결합한다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 항체 또는 항원 결합 단편 및 제2 항체 또는 항원 결합 단편 모두 TREML2 단백질에 결합한다. 일부 실시태양에서, (a) 제1 항체 또는 항원 결합 단편 또는 (b) 제2 항체 또는 항원 결합 단편은 TREML2 단백질에 결합한다. 일부 실시태양에서, (a) 제1 항체 또는 항원 결합 단편은 EpCAM, CD105 및 CD71로부터 선택된 단백질에 결합하고; (b) 제2 항체 또는 항원 결합 단편은 TREML2 단백질에 결합한다. 일부 실시태양에서, (a) 제1 항체 또는 항원 결합 단편은 EpCAM에 결합하고; (b) 제2 항체 또는 항원 결합 단편은 TREML2 단백질에 결합한다. 일부 실시태양에서, (a) 제1 항체 또는 항원 결합 단편은 CD105에 결합하고; (b) 제2 항체 또는 항원 결합 단편은 TREML2 단백질에 결합한다. 일부 실시태양에서, (a) 제1 항체 또는 항원 결합 단편은 CD71에 결합하고; (b) 제2 항체 또는 항원 결합 단편은 TREML2 단백질에 결합한다. 일부 실시태양에서, TREML2에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 본원에 개시된 항-TREML2 항체 또는 항원 결합 단편 중 어느 하나이다. 일부 실시태양에서, 상기 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 중쇄 가변 영역(HCVR) 상보성 결정 영역(CDR)1; (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 HCVR CDR2; (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어는 HCVR CDR3; (d) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 경쇄 가변 영역(LCVR) CDR1; (e) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 LCVR CDR2; 및 (f) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 LCVR CDR3으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 상기 제2 항체는 상기 제1 항체에 결합하는 항체이다. 예를 들어, 상기 제1 항체가 염소 IgG 항체인 경우, 상기 제2 항체는 마우스 항-염소 IgG 항체일 수 있다. 일부 실시태양에서, 표지는 본원에 개시된 표지 중 어느 하나일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 형광 표지이다. 일부 실시태양에서, 자성 입자는 콜로이드성 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 자성유체 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 자성 입자를 제1 외인성 응집 증대 인자(EAEF)에 추가로 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 단계 (A) 중에, 샘플(401)을 상기 제1 EAEF에 결합할 수 있는 제2 EAEF와 접촉시킴을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 제2 EAEF의 첨가는 항체 접합체(406)의 응집을 유도한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 제1 및 제2 외인성 응집 증대 인자에 결합할 수 있는 제3 EAEF를 가함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 제3 EAEF의 첨가는 상기 제1 EAEF의 응집을 역전시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 단계 (a) 전에, 샘플에 응집 억제제를 가함을 추가로 포함한다. 세포를 본원에 개시된 식별 기법 중 어느 하나에 의해 식별할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 세포의 식별은 현미경의 사용을 포함할 수 있다. 상기 세포의 식별은 형광 현미경검사를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 세포의 식별은 FACS를 포함하거나 또는 이에 기반한다. 대안적으로, 또는 추가로, 상기 세포의 식별은 EDPArray를 포함하거나 또는 이에 기반한다.
도 20은 희귀 세포를 단리 및 검출하기 위한 또 다른 예시적인 방법을 도시한다. 도 20에 도시된 바와 같이, 일부 실시태양에서, 희귀 세포의 검출 방법은 단계 (A1): 다수의 세포(2002,2003)를 포함하는 샘플(2001)을 제1 항체 접합체(2006) 및 제2 외인성 응집 증대 인자(EAEF)(2011)와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 항체 접합체(2006)는 자성 입자(2005)에 커플링된 제1 항체 또는 항원 결합 단편(2004)을 포함하고, 상기 자성 입자(2005)는 제1 EAEF(2012)에 추가로 접합되는, 단계; 및 단계 (B1): 샘플에 자기장(2007)을 가하고 항체 접합체(2006)-제2 EAEF(2011) 복합체에 결합되지 않은 세포(2002)를 제거함으로써 희귀 세포(2003)를 농축시키고, 이에 의해 농축된 희귀 세포 샘플(2011)을 생성하는 단계를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 단계 (A2)에 도시된 바와 같이, 제2 EAEF(2011)의 첨가는 제1 항체 접합체(2006)의 응집을 유도한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 제3 EAEF(2013)를 농축된 희귀 세포 샘플(2011)에 가하는 단계 (B2)를 추가로 포함한다. 단계 (B3)에 도시된 바와 같이, 제3 EAEF(2013)의 첨가는 제1 항체 접합체(2006)의 응집을 역전시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 농축된 희귀 세포 샘플(2011)을 제2 항체 접합체(2010)와 접촉시키는 단계 (C)를 추가로 포함하고, 상기 제2 항체 접합체(2010)는 표지(2009)에 접합된 제2 항체 또는 항원 결합 단편(2008)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 제1 항체 접합체(2006)에 결합된 세포를 희귀 세포(2003)로서 식별하는 단계 (D)를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 제2 항체 접합체(2010)에 결합된 세포를 희귀 세포(2003)로서 식별하는 단계 (D)를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 희귀 세포는 태아 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 태아 세포는 태아 유핵 적혈구(fnRBC)이다. 일부 실시태양에서, 상기 농축된 희귀 세포 샘플(2011)은 제1 항체 접합체(2006)에 결합된 희귀 세포(2003)를 포함하고, 상기 제1 항체 접합체는 자성 입자(2005)에 접합된 제1 항체(2004) 또는 그의 항원 결합 단편(2004)을 포함하고, 상기 자성 입자(2005)는 제1 EAEF(2012)에 추가로 접합된다. 대안적으로, 또는 추가로, 농축된 희귀 세포 샘플(2011)은 상기 항체 접합체(2006)로부터 희귀 세포(2003)를 탈착시키도록 추가로 가공된다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 항체 또는 항원 결합 단편은 TREML2 단백질에 결합한다. 일부 실시태양에서, 상기 제2 항체 또는 항원 결합 단편은 TREML2 단백질에 결합한다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 항체 또는 항원 결합 단편 및 제2 항체 또는 항원 결합 단편 모두 TREML2 단백질에 결합한다. 일부 실시태양에서, (a) 제1 항체 또는 항원 결합 단편 또는 (b) 제2 항체 또는 항원 결합 단편은 TREML2 단백질에 결합한다. 일부 실시태양에서, (a) 제1 항체 또는 항원 결합 단편은 EpCAM, CD105 및 CD71로부터 선택된 단백질에 결합하고; (b) 제2 항체 또는 항원 결합 단편은 TREML2 단백질에 결합한다. 일부 실시태양에서, (a) 제1 항체 또는 항원 결합 단편은 EpCAM에 결합하고; (b) 제2 항체 또는 항원 결합 단편은 TREML2 단백질에 결합한다. 일부 실시태양에서, (a) 제1 항체 또는 항원 결합 단편은 CD105에 결합하고; (b) 제2 항체 또는 항원 결합 단편은 TREML2 단백질에 결합한다. 일부 실시태양에서, (a) 제1 항체 또는 항원 결합 단편은 CD71에 결합하고; (b) 제2 항체 또는 항원 결합 단편은 TREML2 단백질에 결합한다. 일부 실시태양에서, TREML2에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 본원에 개시된 항-TREML2 항체 또는 항원 결합 단편 중 어느 하나이다. 일부 실시태양에서, 상기 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 중쇄 가변 영역(HCVR) 상보성 결정 영역(CDR)1; (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 HCVR CDR2; (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어는 HCVR CDR3; (d) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 경쇄 가변 영역(LCVR) CDR1; (e) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 LCVR CDR2; 및 (f) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 LCVR CDR3으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 상기 제2 항체는 상기 제1 항체에 결합하는 항체이다. 예를 들어, 상기 제1 항체가 염소 IgG 항체인 경우, 상기 제2 항체는 마우스 항-염소 IgG 항체일 수 있다. 일부 실시태양에서, 표지는 본원에 개시된 표지 중 어느 하나일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 형광 표지이다. 일부 실시태양에서, 자성 입자는 콜로이드성 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 콜로이드성 자성 입자는 자성유체 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 일부 실시태양에서, 상기 방법은 단계 (A1) 전에, 샘플에 응집 억제제를 가함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 제1 EAEF(2012)는 데스티오비오틴이다. 일부 실시태양에서, 제2 EAEF(2011)는 스트렙타비딘이다. 일부 실시태양에서, 제3 EAEF(2013)는 비오틴이다. 세포를 본원에 개시된 식별 기법 중 어느 하나에 의해 식별할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 세포의 식별은 현미경의 사용을 포함할 수 있다. 상기 세포의 식별은 형광 현미경검사를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 세포의 식별은 FACS를 포함하거나 또는 이에 기반한다. 대안적으로, 또는 추가로, 상기 세포의 식별은 EDPArray를 포함하거나 또는 이에 기반한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포의 식별은 면역-기반 분석을 포함하거나 또는 이에 기반한다.
본원에 개시된 방법이 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 항-TREML2 항체를 포함하는 항체 접합체의 사용을 인용할 수 있지만, 이들 방법 중 임의의 방법을 TREML2 단백질에 결합할 수 있는 임의의 작용제 또는 TREML2 단백질에 결합할 수 있는 작용제를 포함하는 접합체를 사용하여 수행할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 상기 항-TREML2 항체를 포함하는 항체 접합체의 사용으로 제한되지 않는다.
세포-기반 태아 유전자 검사 방법
신규의 태아 세포 마커, 예를 들어 TREML-2의 식별은 태아 세포의 단리 및/또는 검출 및 상기와 같은 세포의 후속적인 분석을 허용한다. 따라서, 본원은 세포-기반 태아 유전자 검사 방법을 개시한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 (a) 항-TREML2 항체를 사용하여 임신한 피실험자의 샘플로부터 태아 세포를 단리하는 단계; 및 (b) 상기 태아 세포로부터의 하나 이상의 핵산 분자를 분석하여 태아가 하나 이상의 유전적 이상을 가질 가능성을 결정하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 상기 방법은 본원에 개시된 태아 세포를 단리 또는 검출하기 위한 방법 중 어느 하나를 사용하여 태아 세포를 단리하고 상기 단리되거나 검출된 태아 세포로부터의 하나 이상의 핵산 분자를 분석하여 태아가 하나 이상의 유전적 이상을 가질 가능성을 결정함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 의해 단리되고/되거나 검출된 태아 세포를 분석함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 의해 제조된 태아 세포를 분석함을 포함한다.
본원은 세포-기반 태아 유전자 검사 방법을 개시하고, 상기 방법은 (a) 임신한 피실험자로부터 수득한 샘플을 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계로서, 상기 샘플이 다수의 세포를 포함하는, 단계; (b) 상기 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포를 단리하는 단계; (c) 상기 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포로부터의 하나 이상의 핵산 분자를 분석하는 단계; 및 (d) 상기 하나 이상의 핵산 분자의 분석에 기반한 보고서를 생성하는 단계를 포함하고, 상기 보고서는 태아가 하나 이상의 유전적 이상을 가질 가능성을 제공한다.
본원은 세포-기반 태아 유전자 검사 방법을 추가로 개시하고, 상기 방법은 (a) 임신한 피실험자로부터 수득한 샘플을 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계로서, 상기 샘플이 다수의 세포를 포함하고, 상기 제1 항체 또는 항원 결합 단편은 콜로이드성 자성 입자에 접합되고, 여기서 상기 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 태아 세포상의 마커에 결합하는, 단계; 및(b) 상기 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포를 단리하는 단계; (c) 상기 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포로부터의 하나 이상의 핵산 분자를 분석하는 단계; 및 (d) 상기 하나 이상의 핵산 분자의 분석에 기반한 보고서를 생성하는 단계를 포함하고, 상기 보고서는 태아가 하나 이상의 유전적 이상을 가질 가능성을 제공한다.
본원은 세포-기반 태아 유전자 검사 방법을 개시하고, 상기 방법은 (a) 임신한 피실험자로부터 수득한 샘플을 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 제2 외인성 응집 증대 인자(EAEF)와 접촉시키는 단계로서, 상기 샘플이 다수의 세포를 포함하고, 상기 제1 항체 또는 항원 결합 단편은 콜로이드성 자성 입자에 접합되고, 여기서 상기 콜로이드성 자성 입자는 제1 EAEF에 접합되고, 여기서 상기 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 태아 세포상의 마커에 결합하는, 단계; 및(b) 상기 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포를 단리하는 단계; (c) 상기 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포로부터의 하나 이상의 핵산 분자를 분석하는 단계; 및 (d) 상기 하나 이상의 핵산 분자의 분석에 기반한 보고서를 생성하는 단계를 포함하고, 상기 보고서는 태아가 하나 이상의 유전적 이상을 가질 가능성을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 EAEF는 특정 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하고, 상기 제2 EAEF는 상기 특정 결합 쌍의 제2 구성원을 포함하고, 상기 특정 결합 쌍은 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc, 아비딘-비오틴, 비오틴 유사체-아비딘, 데스티오비오틴-스트렙타비딘, 데스티오비오틴-아비딘, 이미노비오틴-스트렙타비딘 및 이미노비오틴-아비딘을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 제1 항체는 항-TREML2 항체이다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 항체는 항-CD71 항체이다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 항체는 항-EpCAM 항체이다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 항체는 항-CD105 항체이다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 항체가 항-ECAM 항체 또는 항-CD105 항체인 경우, 방법은 단리된 세포를 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시킴을 추가로 포함하고, 상기 제2 항체는 태아 세포상의 마커에 결합한다. 일부 실시태양에서, 상기 제2 항체는 항-TREML2 항체이다. 일부 실시태양에서, 상기 제2 항체는 항-CD71 항체이다. 일부 실시태양에서, 상기 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 표지에 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 표지는 형광 표지이다. 일부 실시태양에서, 방법은 상기 제2 항체에 결합된 세포를 단리함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포로부터의 핵산 분자를 분석함을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포는 태아 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 태아 세포는 태아 적혈구아세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 태아 세포는 태아 유핵 적혈구(fnRBC)이다. 일부 실시태양에서, 상기 태아 세포는 태아 세포영양막이다.
일부 실시태양에서, 하나 이상의 핵산 분자의 분석은 핵형 분석을 수행함을 포함한다. 핵형 분석을 당해 분야에 공지된 기법 중 어느 하나를 사용하여 수행할 수 있다.
일부 실시태양에서, 하나 이상의 핵산 분자의 분석은 서열분석을 수행함을 포함한다. 서열분석을 당해 분야에 공지된 기법 중 어느 하나를 사용하여 수행할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 서열 분석은 짧은 탠덤 반복(STR) 분석을 포함한다.
일부 실시태양에서, 하나 이상의 핵산 분자의 분석은 하나 이상의 증폭 반응을 수행함을 포함한다. 핵산 증폭을 당해 분야에 공지된 기법 중 어느 하나를 사용하여 수행할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 핵산 증폭을 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 수행한다.
일부 실시태양에서, 하나 이상의 유전적 이상은 삼염색체, 성 염색체 이상 및 구조 이상으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 상기 유전적 이상은 삼염색체이다. 일부 실시태양에서, 상기 삼염색체는 삼염색체 3, 삼염색체 4, 삼염색체 6, 삼염색체 7, 삼염색체 8, 삼염색체 9, 삼염색체 10, 삼염색체 11, 삼염색체 12, 삼염색체 13, 삼염색체 16, 삼염색체 17, 삼염색체 18, 삼염색체 20, 삼염색체 21 및 삼염색체 22로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 상기 유전적 이상은 성 염색체 이상이다. 일부 실시태양에서, 상기 성 염색체 이상은 일염색체 X, 삼중 X 및 클라인펠터 증후군으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 상기 유전적 이상은 구조 이상이다. 일부 실시태양에서, 상기 구조 이상은 복제수 변이(CNV)이다. 일부 실시태양에서, 상기 구조 이상은 CNV의 결실 또는 CNV의 중복이다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 자성 입자에 접합된다. 일부 실시태양에서, 자성 입자는 콜로이드성 자성 입자이다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포의 단리는 샘플에 자기장을 가함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법은, 샘플을 항-TREML2 항체와 접촉 전에, 제1 항체와 접촉시킴을 추가로 포함하고, 상기 제1 항체는 EpCAM, CD105 및 CD71로부터 선택된 단백질에 결합한다. 일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법은 샘플을 항-TREML2 항체와 접촉 전에, 제1 항체에 결합된 세포를 단리함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 항체를 자성 입자에 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 자성 입자는 콜로이드성 자성 입자이다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 항체에 결합된 세포의 단리는 샘플에 자기장을 가함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 표지에 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 형광 표지이다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포의 단리는 면역형광 기술에 기반한다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포의 단리를 형광 활성화된 분류(FACS)에 의해 수행한다. 일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포의 단리를 DEPArray로 수행한다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법은 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포를 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시킴을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 제2 항체는 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 일부 실시태양에서, 상기 제2 항체를 표지에 접합시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 형광 표지이다. 일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법은 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포의 단리를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포의 단리는 면역형광 기술에 기반한다. 일부 실시태양에서, 상기 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포의 단리를 형광 활성화된 분류(FACS)에 의해 수행한다. 일부 실시태양에서, 상기 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 세포의 단리를 DEPArray로 수행한다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체는 sc-109096, ARP49877_P050, OACA04996, AF3259, MA5-30973, PA5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul 및 BD563661로부터 선택된다. 대안적으로, 또는 추가로, 상기 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 중쇄 가변 영역(HCVR) 상보성 결정 영역(CDR)1; (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 HCVR CDR2; (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어는 HCVR CDR3; (d) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 경쇄 가변 영역(LCVR) CDR1; (e) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 LCVR CDR2; 및 (f) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 LCVR CDR3으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 서열번호 6 내지 11 중 어느 하나는 독립적으로 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 서열번호 6 내지 11 중 어느 하나는 독립적으로 2개 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 태아 세포상에서 유전자 검사 결과에 기반한 치료 권고를 제공함을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 태아 세포상에서 유전자 검사 결과에 기반하여 피실험자에게 치료법을 실행함을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나는 태아 세포상에서 유전자 검사 결과에 기반하여 피실험자 또는 태아의 추가적인 모니터링을 권고함을 추가로 포함한다.
본원에 개시된 방법이 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 항-TREML2 항체를 포함하는 항체 접합체의 사용을 인용할 수 있지만, 이들 방법 중 임의의 방법을 TREML2 단백질에 결합할 수 있는 임의의 작용제 또는 TREML2 단백질에 결합할 수 있는 작용제를 포함하는 접합체를 사용하여 수행할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 상기 항-TREML2 항체를 포함하는 항체 접합체의 사용으로 제한되지 않는다.
희귀 세포 마커에 결합하는 작용제
본원은 희귀 세포 마커에 결합하는 작용제를 개시한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "희귀 세포 마커"는 희귀 세포(예를 들어 태아 세포)상의 마커(예를 들어 세포 표면 단백질)이다. 상기 희귀 세포 마커는 샘플 중의 또 다른 유형의 세포보다는 희귀 세포상에서 더 높은 수준으로 발현되는 세포 표면 단백질일 수 있다. 상기 희귀 세포 마커는 골수세포상에서 발현된 촉발 수용체 유사 2(TREML2) 단백질일 수 있다. 상기 희귀 세포 마커는 인간 TREML2 단백질일 수 있다. 상기 인간 TREML2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, 상기 희귀 세포 마커는 CD71일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 희귀 세포 마커는 CD71이 아니다.
본원에 사용되는 바와 같이, "TREML2" 및 "TLS1"이란 용어는 동일한 단백질이고 호환가능하게 사용된다. TLS1 및 TREML2는 서열번호 1의 아미노산 서열에 상응하는 동일한 서열을 갖고 서열번호 2 내지 5의 아미노산 서열을 갖는 도메인과 단편을 포함하는 동일한 마커를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "희귀 세포"는 전체 세포 집단의 10% 미만의 농도로 피실험자의 샘플 중에 존재하는 세포를 지칭하고, 여기서 상기 샘플은 정제되지 않은 또는 농축되지 않은 샘플이다. 일부 실시태양에서, 상기 희귀 세포는 샘플 중에 전체 세포 집단의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 농도로 존재한다. 일부 실시태양에서, 상기 희귀 세포는 샘플 중에 전체 세포 집단의 1% 미만의 농도로 존재한다. 일부 실시태양에서, 상기 희귀 세포는 태아 세포이고 상기 샘플은 임신한 피실험자의 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "정제되지 않은 샘플" 또는 "농축되지 않은 샘플"이란 용어는 호환가능하게 사용될 수 있고, 샘플로부터 세포를 제거하거나 단리하는 방식으로 처리되지 않은 피실험자로부터 수득된 샘플을 지칭한다. 대안적으로 또는 추가로, 정제되지 않은 샘플 또는 농축되지 않은 샘플은 하나 이상의 세포가 고갈되지 않은 피실험자로부터 수득된 샘플을 지칭한다. 대안적으로 또는 추가로, 정제되지 않은 샘플 또는 농축되지 않은 샘플은 다수의 상이한 세포 유형을 함유하는 피실험자로부터 수득된 샘플을 지칭한다.
일부 실시태양에서, 희귀 세포 마커에 결합하는 작용제는 항체, 항체 단편, 수용체 및 리간드로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 항체 단편은 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항체 단편은 1가 항원 결합 단편(Fab 또는 Fab'), 2가 항원 결합 단편((Fab)2 또는 (Fab')2), 가변 단편(Fv), 단쇄 가변 단편(scFv), 2가 항체, 트라이아바디, 테트라바디, 미니바디, 및 이중특이성 scFv(비스-scFv)로부터 선택된다.
일반적으로, 1가 Fab 단편은 하나의 항원 결합 부위를 갖는 반면, 2가 (Fab)2 단편은 다이설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 항원 결합 영역을 갖는다. Fab 단편은 항체의 중쇄 가변(VH) 및 경쇄 가변(VL) 영역 및 중쇄 1 불변(CH 1) 및 경쇄 1(CL 1) 불변 영역으로 이루어진다. Fv 단편은 중쇄 가변(VH) 및 경쇄 가변(VL) 영역으로 이루어진 항원 결합 부위를 갖지만, Fab의 불변 영역(CH 1 및 CL 1)은 없다. 상기 VH 및 VL은 비-공유 상호작용에 의해 Fv 단편에서 함께 유지된다. 상기 Fab는 이량체(Fab2) 또는 삼량체(Fab3)일 수 있고, 이는 각각 2 또는 3개의 상이한 항원의 결합을 허용한다.
V-도메인의 배향 및 링커 길이를 변화시켜 상이한 형태의 Fv 분자를 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 상기 링커가 12개 이상의 잔기 길이인 경우, scFv 단편은 주로 단량체성이다. 3 내지 11개의 잔기 길이인 링커는 기능성 Fv 도메인으로 폴딩될 수 없는 scFv 분자를 생성시킨다. 이러한 분자는 제2 scFv 분자와 회합하여, 2가 다이아바디를 생성시킨다. 트라이아바디 또는 테트라바디는 링커 길이가 3 잔기 미만인 경우 형성될 수 있다. 미니바디는 2가 이량체로 조립되는 scFv-CH3 융합 단백질이다. 비스-scFv 단편은 2개의 상이한 가변 도메인과 scFv 단편으로 이루어지고 2개의 상이한 에피토프와 동시에 결합할 수 있다.
항체는 다클론 항체일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체는 단클론 항체일 수 있다. 항체는 면역글로불린 감마(IgG) 항체일 수 있다. IgG 항체는 IgG1 항체일 수 있다. IgG 항체는 IgG2 항체일 수 있다. IgG 항체는 IgG3 항체일 수 있다. IgG 항체는 IgG4 항체일 수 있다. 항체는 면역글로불린 뮤(IgM) 항체일 수 있다. 항체는 면역글로불린 입실론(IgE) 항체일 수 있다. 항체는 면역글로불린 델타(IgD) 항체일 수 있다. 항체는 면역글로불린 알파(IgA) 항체일 수 있다. IgGA 항체는 IgGA1 항체일 수 있다. 대안적으로, IgG 항체는 IgGA2 항체이다.
일부 실시태양에서, 작용제는 TREML2 단백질에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 일부 실시태양에서, 항체 또는 항체 단편은 TREML2 단백질의 세포외 도메인에 결합한다. 일부 실시태양에서, 세포외 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다. 대안적으로, 항체 또는 항체 단편은 TREML2의 세포외 도메인의 단편에 결합할 수 있다. 세포외 도메인의 단편은 서열번호 3-4의 아미노산 서열을 갖는다. 항체 또는 항체 단편은 TREML2 단백질의 N-말단 도메인에 결합할 수 있다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체는 다클론 항체이다. 상기 다클론 항체는 sc-109096(산타 크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)), ARP49877_P050(아비바 시스템스 바이올로지(Aviva Systems Biology)), OACA04996(아비바 시스템스 바이올로지), AF3259(R&D 시스템스), PA5-47471(써모 피셔(Thermo Fisher)), ABIN634968(안티바디스(Antibodies)-online.com), ABIN928294(안티바디스-online.com), 30-552(ProSci), ABIN2463297(안티바디스-online.com), ABIN749888(안티바디스-online.com), bs-2737r(바이오스(Bioss)), ABIN1999045(안티바디스-online.com), 11655-rp02(시노 바이올로지컬(Sino Biological)), ABIN293207(안티바디스-online.com), ABIN2387613(안티바디스-online.com), t8282-40(USBio), ABIN4249314(안티바디스-online.com), 및 nbp1-70737-20ul(노부스 바이올로지컬스(Novus Biologicals))로부터 선택된 항-TREML2 항체로부터 선택될 수 있다.
항-TREML2 항체는 단클론 항체일 수 있다. 상기 단클론 항체는 MA5-30973(써모 피셔), ABIN19999041(안티바디스-online.com), 11655-r001(시노 바이올로지컬), 및 BD563661(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))중에서 선택될 수 있다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 중쇄 가변 영역(HCVR) 상보성 결정 영역(CDR)1; (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 HCVR CDR2; (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어는 HCVR CDR3; (d) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 경쇄 가변 영역(LCVR) CDR1; (e) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 LCVR CDR2; 및 (f) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 LCVR CDR3으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 중쇄 가변 영역(HCVR) 상보성 결정 영역(CDR)1; (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 HCVR CDR2; 및 (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어는 HCVR CDR3으로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 경쇄 가변 영역(LCVR) CDR1; (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 LCVR CDR2; 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 LCVR CDR3으로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 중쇄 가변 영역(HCVR) 상보성 결정 영역(CDR)1; (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 HCVR CDR2; (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어는 HCVR CDR3; (d) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 경쇄 가변 영역(LCVR) CDR1; (e) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 LCVR CDR2; 및 (f) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 LCVR CDR3을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다.
일부 실시태양에서, 서열번호 6 내지 11 중 어느 하나는 독립적으로 1, 2 또는 3개 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 서열번호 6은 1, 2 또는 3개 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 서열번호 7은 1, 2 또는 3개 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 서열번호 8은 1, 2 또는 3개 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 서열번호 9는 1, 2 또는 3개 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 서열번호 10은 1, 2 또는 3개 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 서열번호 11은 1, 2 또는 3개 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.
일부 실시태양에서, 항-TREML2 항체를 표지에 접합시켜 접합된 항체를 생성시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 형광 표지, 방사성핵종, 효소 표지, 화학발광 표지, 및 합텐으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 검출성 표지는 합텐이다. 일부 실시태양에서, 상기 합텐은 DCC, 비오틴, 나이트로피라졸, 티아졸설폰아미드, 벤조푸라잔 및 2-하이드록시퀴녹살린으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 상기 검출성 표지는 비오틴이다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 형광 분자이다. 일부 실시태양에서, 상기 형광 분자는 형광단, 시아닌 염료 및 근적외선(NIR) 염료로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 상기 형광 분자는 플루오레세인이다. 일부 실시태양에서, 상기 형광 분자는 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC)이다. 일부 실시태양에서, 상기 표지는 피코에리쓰린(PE), 알로피코시아닌(APC), 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 및 비오틴으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 상기 접합된 항체는 ABIN6070559(안티바디스-online.com), abx307664(아벡사 폴리클로날(Abbexa polyclonal)), ABIN6070561(안티바디스-online.com), abx307665(아벡사, 폴리클로날), ABIN2662892(안티바디스-online.com), bld-351203(바이오레전드(BioLegend)), ABIN2662891(안티바디스-online.com), bld-351204(바이오레전드), ABIN2662890(안티바디스-online.com, 단클론), 및 bld-351104(바이오레전드)로부터 선택된다.
자성 입자
본원에 개시된 방법, 조성물 및 키트는 자성 입자를 포함하거나 사용할 수 있다. 예를 들어 본원에 개시된 항체(또는 보다 일반적으로 희귀 세포 마커에 결합하는 임의의 작용제) 중 하나를 자성 입자에 접합시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 희귀 세포 마커(예를 들어 TREML2)에 결합하는 작용제를 자성 입자에 접합시킨다. 상기 자성 입자는 콜로이드성 자성 입자일 수 있다. 상기 콜로이드성 자성 입자는 자성유체일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "자성 입자"란 용어는 자기장을 사용하여 조작할 수 있는 입자를 지칭한다. 자성 입자는 금속을 포함한다. 금속의 예는 비제한적으로 철, 니켈, 코발트 및 구리를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "콜로이드성 자성 입자"란 용어는 비-자성 물질로 코팅된 자성 입자를 지칭한다. 비-자성 입자의 일례는 소 혈청 알부민(BSA)이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "자성유체 자성 입자"란 용어는 철을 함유하는 콜로이드성 자성 입자를 지칭한다.
일부 실시태양에서, 자성 입자는 서브-마이크론 입자 크기를 특징으로 한다. 일부 실시태양에서, 상기 입자는 일반적으로 직경이 약 300 나노미터(㎚), 275 ㎚, 250 ㎚, 225 ㎚, 200 ㎚, 190 ㎚, 180 ㎚, 170 ㎚, 160 ㎚, 150 ㎚, 140 ㎚, 130 ㎚, 120 ㎚, 110 ㎚, 또는 100 ㎚ 미만이다. 일부 실시태양에서, 상기 입자는 일반적으로 직경이 적어도 10 ㎚, 20 ㎚, 30 ㎚, 40 ㎚, 50 ㎚, 60 ㎚, 70 ㎚, 80 ㎚, 90 ㎚, 100 ㎚, 110 ㎚, 또는 120 ㎚ 또는 그 이상이다. 일부 실시태양에서, 상기 입자는 직경이 약 40 ㎚ 내지 250 ㎚, 40 ㎚ 내지 200 ㎚, 50 ㎚ 내지 200 ㎚, 50 ㎚ 내지 190㎚ 50 ㎚ 내지 180 ㎚, 50 ㎚ 내지 170 ㎚, 60 ㎚ 내지 200 ㎚, 70 ㎚ 내지 200 ㎚, 80 ㎚ 내지 200 ㎚, 90 ㎚ 내지 200 ㎚, 90 ㎚ 내지 175 ㎚, 또는 90 ㎚ 내지 150 ㎚이다.
일부 실시태양에서, 입자는 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97% 또는 그 이상의 자성 질량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 입자는 약 40% 내지 95%, 45% 내지 95%, 50% 내지 90%, 55% 내지 90%, 60% 내지 90%, 또는 70% 내지 90%의 자성 질량을 갖는다.
일부 실시태양에서, 90-150 ㎚의 범위이내 및 70-90%의 자성 질량을 갖는 입자를 사용할 수 있다.
일부 실시태양에서, 입자는 용액으로부터의 중력 분리에 대한 저항을 특징으로 한다. 상기 입자는 연장된 기간 동안 중력 분리에 저항성일 수 있다. 상기 입자는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 90, 105, 또는 120분 또는 그 이상 동안 중력 분리에 저항성일 수 있다. 상기 입자는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 90, 105, 또는 120시간 또는 그 이상 동안 중력 분리에 저항성일 수 있다. 상기 입자는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 90, 105, 또는 120일 또는 그 이상 동안 중력 분리에 저항성일 수 있다.
일부 실시태양에서, 자성 입자는, 자성 코어에 결합되고, 예를 들어 물리적으로 흡착되거나 공유 부착되고 안정화 콜로이드 성질을 부여하는 코팅 분자에 의해 둘러싸인 초상자성 물질의 결정성 코어로 구성된다. 상기 코팅 물질을, 샘플 중에서 발견되는 생물학적 거대분자와 자성 코어간의 비-특이적인 상호작용을 방지하기에 유효한 양으로 적용할 수 있다. 상기와 같은 생물학적 거대분자는 비-표적 세포, 렉틴, 당단백질 및 다른 막 성분의 표면상의 시알산 잔기를 포함할 수 있다. 또한, 상기 코팅 물질은 가능한 한 높은 자성 질량/나노입자 비를 함유할 수 있다. 상기 코어를 구성하는 자성 결정의 크기는 완전한 자성 도메인을 함유하지 않을 정도로 충분히 작다. 상기 나노입자의 크기는 그의 브라운 에너지가 그의 자성 모멘트를 초과하는 크기이다. 결과적으로, 이러한 콜로이드성 자성 입자의 북극-남극 정렬 및 후속적인 상호 인력/척력은 중간 정도로 강한 자기장에서조차 발생하지 않는 것으로 보이고, 이는 그의 용액 안정성에 기여한다.
자성 입자는 높은 자성 구배의 외부장 분리기에서 분리가능할 수 있다. 이러한 특징은 샘플 취급을 용이하게 하고, 강자성 비드 또는 스틸 울(steel wool)이 로딩된 보다 복잡한 내부 구배 컬럼에 비해 경제적인 장점을 제공한다.
자성 입자를, EP0842042(내용 전체가 참고로 인용된다)에 기재된 바와 같은 베이스 물질의 변형에 의해 제조할 수 있다.
자성 입자를 실시예 1에서 식별된 상위 후보에 상응하는 차별적으로 발현된 단백질을 인식할 수 있는 Ab(또는 보다 일반적으로는 임의의 작용제)로 코팅할 수 있다. 일부 실시태양에서, 자성 입자를 희귀 세포 마커(예를 들어 TREML2)에 결합하는 작용제로 코팅할 수 있다. 자성 입자를 본원에 개시된 항체 또는 작용제 중 어느 하나로 코팅할 수 있다.
자성 입자의 코팅을 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들어, 자성 입자를 US6365362B1(내용 전체가 참고로 인용된다)에 기재된 바와 같은 항체로 코팅할 수 있다.
도 2는 예시적인 자성유체 자성 입자 구조를 도시한다. 본원에 개시된 자성유체 자성 입자는 도 2에 도시된 자성유체 자성 입자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어질 수 있다. 일부 실시태양에서, 본원에 개시된 자성유체 자성 입자는 도 2에 도시된 자성유체 자성 입자 구조를 갖는다. 도 2에 도시된 바와 같이, 예시적인 자성유체 자성 입자 구조는 소 혈청 알부민(BSA)에 의해 둘러싸인 철 원자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어진다. BSA는 스트렙타비딘(SA)에 부착되고, 이는 비오틴(BT)에 부착된다. BT를 또 다른 BSA에 부착시킬 수 있고, 이는 외인성 응집 증대 인자(예를 들어 데스티오비오틴(Dt-BT))에 부착된다. BT를 또한 희귀 세포상의 마커에 결합하는 항체(Y)에 부착시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 희귀 세포는 태아 세포이다. 일부 실시태양에서, 마커는 TREML2이다. 대안적으로, 마커는 EpCAM, CD105, 또는 CD71이다.
도 7은 조절된 응집을 통한 자성 입자 응집의 개략도를 도시한다. 도 7에 도시된 바와 같이, 자성 입자, 예를 들어 도 2의 자성유체 자성 입자는 외인성 응집 증대 인자(EAEF, 예를 들어 데스티오비오틴(Dt-BT))에 커플링된다. 제1 EAEF에 결합할 수 있는 제2 EAEF(예를 들어 스트렙타비딘(SA))의 첨가는 항체-자성 입자 접합체의 응집을 촉진한다. 일부 실시태양에서, 항체-자성 입자 접합체의 응집은 제3 EAEF의 첨가에 의해 역전되고, 여기서 제3 EAEF는 제1 EAEF 또는 제2 EAEF에 결합할 수 있다. 일부 실시태양에서, 제3 EAEF는 제1 EAEF와 동일하다. 대안적으로, 제3 EAEF는 제2 EAEF와 동일하다. 또 다른 실시태양에서, 제3 EAEF는 제1 EAEF 또는 제2 EAEF(예를 들어 비오틴)의 결합 상대이다.
조성물 및 키트
본원은 본원에 개시된 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 어느 하나를 포함하는 조성물 및 키트를 개시한다. 조성물 또는 키트는 자성 시약, 하나 이상의 추가적인 항체 또는 항체 접합체, 응집 억제제, 및 응집 인자로부터 선택된 하나 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 키트는 (a) 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 (b) 자성 시약을 포함한다.
일부 실시태양에서, 키트는 (a) 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 (b) 콜로이드성 자성 입자를 포함한다.
일부 실시태양에서, 키트는 (a) 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 (b) 하나 이상의 추가적인 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.
본원은 (a) 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 (b) 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키트를 추가로 개시하고, 제2 항체는 태아 유핵 적혈구(fnRBC)의 표면상에서 발현된 단백질에 결합한다.
본원은 (a) 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 (b) 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키트를 추가로 개시하고, 제2 항체는 표지에 접합된다.
본원은 (a) 제1 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(여기서 제1 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 자성 입자에 접합된다); 및 (b) 제2 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(여기서 제2 항-TREML2 항체는 표지에 접합된다)을 포함하는 키트를 추가로 개시한다.
일부 실시태양에서, 조성물 또는 키트는 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하고, 여기서 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) (i) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 상보성 결정 영역(CDR)1; (ii) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 CDR2; 및 (iii) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어는 CDR3을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 중쇄 가변 영역(HCVR); 및 (b) (i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 CDR1; (ii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 CDR2; 및 (iii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 CDR3을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 필수적으로 이루어지는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 서열번호 6 내지 11 중 어느 하나는 독립적으로 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.
일부 실시태양에서, 키트는 (a) 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 (b) 응집 억제제를 포함하는 완충제를 포함한다.
일부 실시태양에서, 키트는 (a) 항-TREML2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 (b) 외인성 응집 증대 인자를 포함한다.
본원에 개시된 조성물, 키트 또는 방법 중 어느 하나는 하나 이상의 자성 시약을 포함할 수 있다. 자성 시약은 하나 이상의 자성 입자를 포함할 수 있다. 자성 시약은 강자성 입자, 초상자성 입자를 포함할 수 있다. 자성 시약은 자성유체 시약을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "강자성 입자"란 용어는 영구적으로 자화될 수 있는 입자를 의미한다.
자성 시약은 초상자성 입자를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "초상자성 입자"란 용어는 자성 반응성 입자인 입자를 지칭할 수 있다. 초상자성 입자는 자기장에 노출될 때만 자기 거동을 나타내는 입자이다. 일부 실시예에서, 콜로이드성 자성 입자는 초상자성 입자이다.
일부 실시태양에서, 자성 시약은 자성 입자를 포함한다. 일부 실시태양에서, 자성 입자는 크기가 약 1.5 내지 약 50 마이크론, 0.7-1.5 마이크론, 또는 200 ㎚ 미만이다. 일부 실시태양에서, 자성 입자는 크기가 200 ㎚ 미만이다. 일부 실시태양에서, 자성 시약은 항체에 접합된 자성 입자를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기와 같은 자성 입자에 접합된 항체는 상피 세포 부착 분자(EpCAM) 및 엔도글린(CD105)으로부터 선택된 단백질에 결합하는 항체이다. 대안적으로, 상기와 같은 자성 입자에 접합된 항체는 CD147에 결합한다. 추가의 실시태양에서, 상기와 같은 자성 입자에 접합된 항체는 CD45에 결합한다. 또 다른 실시태양에서, 상기와 같은 자성 입자에 접합된 항체는 태아 세포의 표면상에서 발현된 단백질에 결합한다.
일부 실시태양에서, 자성 시약은 자성유체 시약을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "자성유체 시약"이란 용어는 자성 입자를 포함하는 액체 현탁액을 지칭한다. 일부 실시태양에서, 자성유체 시약은 항-TREML2 항체에 접합된 자성 입자를 포함하는 액체 현탁액을 포하한다. 대안적으로, 자성유체 시약은 본원에 개시된 하나 이상의 항체에 접합된 자성 입자를 포함하는 액체 현탁액을 포함한다. 일부 실시태양에서, 자성유체 시약은 항-EPCAM 항체에 접합된 자성 입자를 포함하는 액체 현탁액을 포함한다. 일부 실시태양에서, 자성유체 시약은 항-CD015 항체에 접합된 자성 입자를 포함하는 액체 현탁액을 포함한다. 일부 실시태양에서, 자성유체 시약은 태아 세포의 표면상에서 발현된 단백질에 결합하는 항체에 접합된 자성 입자를 포함하는 액체 현탁액을 포함한다. 일부 실시태양에서, 자성유체 시약은 항-CD147 항체에 접합된 자성 입자를 포함하는 액체 현탁액을 포함한다.
일부 실시태양에서, 키트는 하나 이상의 염색 시약을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 염색 시약은 하나 이상의 항체 접합체를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 하나 이상의 항체 접합체의 항체 접합체는 표지에 접합된 항체이다. 일부 실시태양에서, 항체는 CD71, 글리코포린 A(GPA), 및 CD45로부터 선택된 단백질에 결합한다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 항체(예를 들어 항-TREML2 항체 또는 하나 이상의 추가적인 항체) 중 어느 하나는 표지를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 표지는 항체에 접합된다. 일부 실시태양에서, 표지는 피코에리쓰린(PE), 알로피코시아닌(APC), 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 및 비오틴으로부터 선택된다.
본원에 개시된 키트 중 어느 하나는 하나 이상의 항체 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 하나 이상의 항체는 태아 세포의 표면상에서 발현된 단백질에 결합할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 하나 이상의 항체는 모체 세포의 표면상에서 발현된 단백질에 결합할 수 있다. 하나 이상의 항체는 EpCAM, CD105, CD147, CD15, CD71, GPA, 및 CD45로부터 선택된 단백질에 결합할 수 있다. 하나 이상의 항체는 CD15, CD71, GPA, 및 CD45로부터 선택된 단백질에 결합할 수 있다.
본원에 개시된 키트 중 어느 하나는 하나 이상의 항체 또는 그의 단편을 포함할 수 있고, 여기서 상기 하나 이상의 항체는 태아 유핵 적혈구(fnRBC) 또는 세포영양막의 표면상에서 발현된 단백질에 결합한다. 항체는 EpCAM, CD105, CD71 및 CD147로부터 선택된 단백질에 결합할 수 있다.
본원에 개시된 키트 중 어느 하나는 하나 이상의 응집 억제제를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 키트는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 또는 그 이상의 응집 억제제를 포함할 수 있다. 응집 억제제는 내인성 자성유체 응집 인자를 억제할 수 있다. 일부 실시태양에서, 응집 억제제는 환원제, 이민-복합체, 킬레이트제 및 다이아미노 부탄으로부터 선택된다. 환원제는 머캅토에탄 설폰산일 수 있다. 응집 억제제는 소 혈청 알부민(BSA)일 수 있다. 킬레이트제는 EDTA일 수 있다.
응집 억제제는 항체 또는 그의 단편을 포함할 수 있고, 여기서 항체는 항-TREML2 항체와 동일한 아이소타입이다. 항체는 비-특이성 항체일 수 있다. 일부 실시태양에서, 항체는 마우스 항체이다.
본원에 개시된 키트 중 어느 하나는 항-TREML2 항체를 포함할 수 있고, 여기서 항-TREML2 항체는 자성유체에 커플링될 수 있다. 본원에 개시된 키트 중 어느 하나는 항-TREML2 항체를 포함할 수 있고, 여기서 항-TREML2 항체는 자성 입자에 접합된다. 자성 입자는 콜로이드성 자성 입자일 수 있다. 자성 입자는 자성유체 자성 입자일 수 있다.
본원에 개시된 키트 중 어느 하나는 외인성 응집 증대 인자(EAEF)를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본원에 개시된 키트는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 또는 그 이상의 EAEF를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본원에 개시된 자성 입자는 하나 이상의 EAEF에 커플링된다. 일부 실시태양에서, EAEF는 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc, 아비딘-비오틴, 비오틴 유사체-아비딘, 데스티오비오틴-스트렙타비딘, 데스티오비오틴-아비딘, 이미노비오틴-스트렙타비딘 및 이미노비오틴-아비딘을 포함하는 군으로부터 선택된 특정 결합 쌍의 하나의 구성원을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 키트는 2개 이상의 EAEF를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 제1 EAEF는 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc, 아비딘-비오틴, 비오틴 유사체-아비딘, 데스티오비오틴-스트렙타비딘, 데스티오비오틴-아비딘, 이미노비오틴-스트렙타비딘 및 이미노비오틴-아비딘을 포함하는 군으로부터 선택된 특정 결합 쌍의 하나의 구성원을 포함하고, 제2 EAEF는 상기 특정 결합 쌍의 다른 구성원을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 키트는 제3 EAEF를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 제3 EAEF는 제1 EAEF와 일치한다. 대안적으로, 제3 EAEF는 제2 EAEF와 일치한다. 또 다른 실시태양에서, 제3 EAEF는 제1 EAEF와 상호작용할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 제3 EAEF는 제2 EAEF와 상호작용할 수 있다. 제1 또는 제2 EAEF와 일치하거나 또는 제1 또는 제2 EAEF와 상호작용할 수 있는 제3 EAEF를 가짐으로써, 제3 EAEF의 첨가는 자성 입자의 응집을 역전시킨다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 키트는 하나 이상의 응집 억제제를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 응집 억제제는 환원제, 이민-복합체, 킬레이트제 및 다이아미노 부탄으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 응집 억제제는 킬레이트제이다. 일부 실시태양에서, 킬레이트제는 EDTA이다. 환원제는 머캅토에탄 설폰산일 수 있다. 응집 억제제는 소 혈청 알부민(BSA)일 수 있다.
실시예
실시예 1: 태아 세포에 대한 신규 마커의 식별
본 실시예는 태아 세포에 대한 신규 마커의 식별을 기재한다.
유핵 적혈구(nRBC)의 제조
태아 전혈(n=5)을 수술적 임신 종료가 예정된 임산부(10+0 15+6 임신 주수)로부터 초음파 유도 시술에 의해 수득하였다.
분만 시(n=2) 또는 수술적 임신 종료 전(n=1) 임산부로부터 20 ㎖의 말초 혈액을 수집하였다.
수집 후에, 태아 및 모체 혈액을 같은 부피의 포스페이트 완충된 염수(PBS)로 희석하고 퍼콜(Percoll) 구배상에 서서히 층상화하였다. 샘플을 실온에서 10분간 1800 rpm에서 원심분리하였다. 태아 또는 성체 적혈구아세포를 함유하는 간기의 층을 수집하고 PBS로 2회 세척하였다.
모체 혈액의 경우, CD45/CD15 양성 세포의 고갈 단계를, LD 컬럼(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))을 사용하여 세포를 항-CD45 및 항-CD15 미세비드(밀테니 바이오텍)로 표지함으로써 수행하였다.
모체 혈액의 경우, 미세유동 장치를 또한 사용하여 RBC 오염 세포를 제거하고 성체 적혈구아세포를 농축시켰다.
농축 및 유식 세포측정에 의한 세포 분류
FACS 분류용 샘플의 제조를 위해, 태아 및 모체 혈액으로부터 농축된 세포를 항-CD71 항체(밀테니 바이오텍), 항-GPA 항체(BD 바이오사이언스), 항-CD45 항체(밀테니 바이오텍), 훽스트(핵 염색), 및 사이톡스 그린 염료(생/사 세포)로 실온에서 30분간 염색하였다.
FACS 분류
적혈구아세포 세포를 도 5A-5E에 도시된 바와 같이 게이팅하고 분류하였다. 도 5B: FSC-H/W 게이팅 및 더블릿 세포 제외. 도 5C: 사이톡스 그린 neg 생 세포 게이팅. 도 5D: dp GPA/훽스트 게이팅. 도 5E: CD71pos/CD45neg 세포 게이팅.
태아 혈액 샘플의 경우, 200,000개 미만의 표적 적혈구아세포가 분류되었다.
모체 혈액 샘플의 경우, 모체 적혈구아세포의 수는 결코 1,000개를 초과하지 않았다.
분류된 집단상에서 RNA 추출
처리되고, 분류된 세포를 전체 RNA 추출에 사용하였다.
전체 RNA를 피코퓨어(Picopure) RNA 단리 키트(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems))를 사용하여 분류된 세포로부터 추출하고 Quant-iT RiboGreen RNA 분석 키트(써모 피셔)에 의해 정량분석하고 에이질런트(Agilent) 2100 생물분석기상에서 RNA 6000 피코(Pico) 키트를 사용하여 품질 관리를 위해 분석하였다.
RNAseq 제조 및 라이브러리 제조
cDNA 라이브러리를 일루미나 시퀀싱(Illumina Sequencing)(부록 A; RNA-Seq 프로토콜)으로부터 준비하였다. 서열분석을 HiSeq 2000상에서 2000만개의 판독/샘플로 수행하였다.
서열분석
차세대(일루미나) 서열분석으로부터 생성된 판독을 먼저 FastQC 프로토콜을 사용하여 표준 과정에 의해 품질 검사하고, 이어서 참조 게놈에 대해 맵핑하고 후속적으로 STAR 소프트웨어 버전 2.5를 사용하여 정량분석하였다. 생성된 판독-카운트 행렬(즉, 각 샘플에서 암호화 또는 암호화 RNA에 대해 검출된 모든 특징에 대한 판독-카운트 표)은 데이터 축소 단계를 통해 차원이 축소되어, 단일 샘플 중에서 적어도 단일 카운트가 있는 유전자만을 유지하였다.
생물정보학 도구를 사용한 데이터 분석
생성된 데이터를 차등적 발현을 위해 DESeq2 R/바이오컨덕터(Biocondutor) 패키지로 추가 처리하여 2개의 비교된 샘플 유형 사이에서 발현이 상당히 높거나 낮은 유전자를 발견하였다.
하기의 단계로 이루어지는 디폴트 DESeq2 차등 발현 분석을 수행하였다: 각각의 샘플에 대해서 "중간 비율 방법"(Anders and Huber, 2010)을 사용하여 크기 인자 추정이, 각각의 유전자에 대해서 분산 추정이, 음의 이항 분포 데이터에 대한 분산을 최적화하는 적합화 절차를 통해 발견되고, 최종적으로 상기 획득된 크기 인자와 분산 추정치를 사용하여 적합된 분포 계수의 유의수준을 시험하였다.
DESeq2 분석으로부터의 결과 표를 최종적으로 추출하여, 샘플, log2 변화 배수, 표준 오차, 시험 통계, p-값 및 0이 아닌 총 판독 카운트를 갖는 20205 특징(유전자)에 대해 조정된 p-값에 걸친 기본 평균을 획득하였다. 차등적으로 발현된 유전자를 0.01의 조정된 p-값(Benjamini-Hockberg/FDR 방법) 컷오프 및 2배 변화 발현 컷오프에 따라 필터링하였다. 이러한 매개변수를 사용하여 3233개의 유전자가 차등적으로 발현되는 것으로서 선택되었고, 이들 중 대부분(2961개)은 태아 혈액에서 상향조절되었다(변화 배수 컷오프와 별도로).
생성된 유전자 표를 앙상블(Ensembl) 데이터베이스에서 추출된 주석 및 기능 설명으로 장식하였다. 유전자 온톨로지(Gene Ontology) 용어 GO:0005886에 따라 "원형질막" 주석과 관련된 유전자를 플래깅하고 유니프롯(Uniprot) 데이터베이스에서 데이터를 얻는 "막관통"으로서 추가로 태깅하였다. 그 중 366개의 원형질막 유전자가 차등적으로 발현되었고, 이들 중 대부분(336개)은 태아 세포에서 상향조절되었다(변화 배수 컷오프와 별도로).
차등적 발현 분석과 병행하여, 보다 엄격한 발현 기준에 대한 선택을 수행하기 위해 DESeq2를 사용하여 판독 카운트를 정규화하고 변환시켰다: 태아 샘플에서 독점적으로 발현된 유전자 목록, 즉, 하기의 기준에 따라 3개의 모체 샘플(12187개의 유전자, 목록 "모든 데이터")에서 판독이 0인 것으로부터 출발하여 1차 선택을 수행하였다: 1) 모든 태아 샘플에서 검출된(즉, 발현된) 유전자의 선택; 2) 1보다 높은 발현 평균/sd 비를 갖는 유전자의 선택; 3) 원형질막 GO 태그와 연관되고 유니프롯 데이터베이스에 의해 "막관통 예측된"으로 태깅된 유전자의 선택. 하기의 선택 체계를 참조하시오. 이어서 생성된 77개 유전자를 태아 평균 발현 감소에 따라 순위를 매겼다(목록 "순위화"). 공지된 생물학적 기능, 샘플 전반에 걸친 발현 수준의 안정성 및 절대 발현 수준의 대략적인 추정(유전자 길이와 비교하여 판독), 항체 입수성 및 기타 생물학적 고려 사항(16개 유전자, 목록 "선택된")을 고려하여 수동 큐레이션에 의한 최종 선택을 수행하였다.
선택 체계
하기는 태아 세포에 대한 잠재적인 신규 마커의 식별에 사용된 선택 체계이다:
1) 임의의 모체 샘플에서 발현되지 않은 유전자: 12187
2) 모든 태아 샘플에서 독점적으로 발현된 유전자: 2079
2.1) GO 원형질막 용어와 연관된 것으로서 주석이 달린 유전자: 213
2.2) 막관통으로서 유니프롯에 의해 예측된 유전자: 305
3) GO 원형질막과 연관되고 막관통으로서 예측된 유전자: 89
4) 평균/sd 비가 1:77보다 높은 유전자
유전자 목록으로부터 차등 발현된 유전자의 순위
전사물 길이, 판독 횟수 및 기타 생물학적 관련 기준을 고려하여 추가로 최종의 수동 선별된 선택 및 순위화 절차를 수행하였고, 결과로 나온 상위 후보는 하기와 같았다:
태아 세포에 대한 신규 마커의 상위 후보
TREML2 STIM1 TNFSF18 SCARF
PTPRN SELPLG LRP11 ESYT1
BMPR2 GPR160 ABCA1 SCARB1
TNFRSF19 KLRD1 GPR176 LTB4R
선택된 표적 분자에 특이적인 항체의 식별FACS 분석에 의한 적혈구아세포에 대한 Ab 후보 시험
RNA 수준의 차등 발현이 각각의 단백질 수준에 반영되는 지의 여부를 결정하기 위해, 유식 세포측정 및 DEPArray 분석을 위해 상업적으로 입수할 수 있는 항체(n=13)에 의한 면역염색을 수행하였다.
음성 대조군으로서, 아이소타입 합치된 Ab(상기 상업적인 항체와 동일한 형광색소와 접합되었다)를 동일한 농도로 사용하였다.
표 2에 나타낸 13개의 항체를 모두 먼저 동결된 태아 혈액상에서 시험하였다.
오직 태아 적혈구아세포상에서 양성으로 발현된 항체만을 동결된 모체 혈액 샘플상에서 시험하였다.
시험하기 위한 특이적 항체 또는 아이소타입 대조군 외에, 염색에 사용된 항체는 적혈구아세포 식별을 위해 CD71 Ab(밀테니 바이오텍), GPA Ab(BD 바이오사이언스), CD45 Ab(밀테니 바이오텍), 훽스트를 포함한다. 간단히, 세포(2.5 - 5 x 105)를 FcR 차단 시약(밀테니 바이오텍)의 존재하에서 Ab와 실온에서 30분간 배양하였다. 결합되지 않은 Ab의 세척 후에, 세포 펠릿을 사이톡스 그린 염료와 함께 AutoMACS 실행 완충제(밀테니)로 재현탁시켰다.
FACS 분석 결과

항체		 적혈구아세포
망상적혈구
RBC
CD45
pos
아이소타입
접합
태아 모체 태아 모체 태아 모체 태아 모체
1 TLT
(MIH61)		 저 없음 저 없음 없음 없음 없음 없음 마우스
IgG1		 PE
6 TNFRSF19 고 고 고 고 고 고 없음 없음 마우스
IgG1		 PE
11 STIM1 초기 초기 초기 초기 저 저 고 불가 토끼
다클론		 미접합
2 TNFSF18 없음 불가 없음 불가 없음 불가 없음 불가 마우스
IgG1		 PE
2 TNFSF18 없음 불가 없음 불가 없음 불가 없음 불가 인간
IgG1		 PE
3 PTPRN 없음 불가 없음 불가 없음 불가 없음 불가 토끼
다클론		 미접합
4 LRP-11 없음 불가 없음 불가 없음 불가 없음 불가 토끼
다클론		 FITC
4 LRP-11 없음 불가 없음 불가 없음 불가 없음 불가 양
다클론		 미접합
5 BMPR2 없음 불가 없음 불가 없음 불가 없음 불가 토끼
다클론		 미접합
5 BMPR2 없음 불가 없음 불가 없음 불가 없음 불가 마우스
IgG1		 미접합
7 GPR176 없음 불가 없음 불가 없음 불가 없음 불가 토끼
재조합		 미접합
8 SCARF1 없음 불가 없음 불가 없음 불가 없음 불가 마우스
IgG2		 AF
647
9 SELPLG
(KLP-1)		 없음 불가 없음 불가 없음 불가 고 불가 마우스
IgG1		 PE
9 SELPLG
(HECA452)		 없음 불가 없음 불가 없음 불가 초기 불가 래트
IgM		 PE
10 GPR160 없음 불가 없음 불가 없음 불가 초기 불가 토끼
다클론		 미접합
12 LTB4R1
(203/14F11)		 없음 불가 없음 불가 없음 불가 초기 불가 마우스
IgG1		 PE
12 LTB4R1
(202/7B1)		 없음 불가 없음 불가 없음 불가 없음 불가 마우스
IgG2		 PE
13 KLRD1
(DX22)		 없음 불가 없음 불가 없음 불가 고 불가 마우스
IgG1		 PE
13 KLRD1
(REA113)		 없음 불가 없음 불가 없음 불가 고 불가 마우스
IgG1		 PE
Ab1 TLT2를 TREML2에 대해서 사용하였다(후자는 본원에서 TLS-1으로서 또한 지칭된다)실시예 2: 세포 포획 및 선택을 위한 자성유체 기술
본 실시예에서, 태아 세포로부터 독점적으로 발현된, 선택된 항체가 자성유체 접합에 사용되었다. TREML2-FF(또한 TLS1-FF라 지칭된다)는 자성유체에 접합된 TLS1 유전자에 의해 발현된 단백질에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다.
FF-Ab의 크기를 나노브룩 제타 플러스(NanoBrook Zeta Plus) 입자 크기 분석기를 사용하여 조사하고, 농도를 분광광도계로 조사하였다.
조절된 농축
혈액 샘플을, 자성유체을 혈액에 첨가하기 전에, 하나 이상의 억제제를 함유하는 완충제와 사전배양하여 내인성 자성유체 응집 인자를 억제한다(EP1311820(내용 전체가 참고로 인용된다)에 기재된 바와 같이). 상기 억제제 중 하나는 100 mM의 환원제, 예를 들어 머캅토에탄 설폰산일 수 있고, 이는 세포 표지에 사용되는 리간드에 영향을 미치지 않으면서 IgM-유도된 응집을 방지할 수 있다. 상기 환원제를 상기 혈액에 단일 시약으로서 첨가할 수 있다. 제2 억제제는 소 혈청 알부민일 수 있고, 이는 완충제 중에 10 ㎎/㎖로 포함될 수 있고, 임의의 HABAA를 중화시킬 것이다. 제3 억제제는 비특이성 마우스 항체, 특히 자성유체상의 항체와 합치하는 적합한 아이소타입일 수 있다. 이를 완충제 중에 0.5 내지 5 ㎎/㎖의 농도로 포함시킬 수 있는데, 이는 가장 심한 HAMA 조차 중화시킬 수 있다. 제4 억제제는, 필요한 경우, 혈장 중에 존재하는 임의의 항-스트렙타비딘 항체를 중화시키기 위해 완충제에 포함되는 스트렙타비딘일 수 있다. 상기 완충제 및 환원제에 의한 혈액의 사전-처리는 모든 내인성 응집 인자의 중화를 위해 15 내지 30분일 수 있다. 모든 내인성 응집 인자의 중화 후에, 외인성 자성유체 응집 인자를 샘플에 가한 다음, 자성유체을 가한다. 자성유체은 표적에 특이적인 항체뿐만 아니라, 상기 외인성 응집 인자에 특이적인 또 다른 리간드에 커플링된다. 자성유체에 의한 표적 세포의 최적의 표적화 및 외인성 응집 인자에 의한 자성유체의 응집 유도 후에, 샘플에 자성 분리를 가하여 표적을 농축시킨다.
상기 샘플을 자성 분리기(임뮤니콘(Immunicon) 카탈로그 QS-012번)에 10분간 둔다. 상기 샘플을 자석에서 꺼내어 와동에 의해 혼합하고, 자성에 의해 표지된 세포의 수집을 위해 다시 상기 자성 분리기에 10분간 둔다. 수집되지 않은 샘플을 흡출하고 자성에 의해 수집된 세포를 0.75 ㎖의 세척-희석 완충제에 재현탁시키고 자성 분리기에서 10분간 재-분리시켰다. 수집되지 않은 샘플은 버리고 수집된 세포는 자성 분리기로부터 튜브를 제거한 후에 재현탁시켰다. 모든 비-표적의 제거 후에, 자성에 의해 표지된 표적 및 유리 자성유체을 완충제에 재현탁시킨다. 경우에 따라, 외인성 매개된-자성유체 응집을 역전시켜야 한다. 이는 최종 샘플을, 외인성 응집 인자에 결합하는 해응집 인자를 함유하는 완충제에 재현탁시킴으로써 성취될 수 있다. 이러한 해응집 인자는 모든 자성유체 응집체를 해응집시켜, 세포를 추가의 분석에 용이하게 한다.
실시예 3: 태아 세포의 검출 및 분석
본 실시예는 단일 태아 세포의 단리 및 분석을 기재한다. DEPArray를 EP2152859(내용 전체가 참고로 인용된다)에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다.
임산부 및 건강한 자원자
말초 혈액 샘플을 임신 12주에서 17+2주 내에 14명의 임산부로부터 10 ㎖ 셀세이브(CellSave) 보존 튜브(메나리니 실리콘 바이오시스템스(Menarini Silicon Biosystems), 미국 펜실배니아주 헌팅돈 밸리 소재)로 정맥 천자에 의해 채취하였다. 스파이킹 실험을 위해 건강한 공여자로부터 말초 혈액을 채취하였다. 모든 공여자에게 서면 동의서를 제공했고 연구 프로토콜은 몬자(Monza)(이탈리아 소재)의 산 제라르도(San Gerardo) 병원 의료 윤리 위원회의 승인을 받았다. 모든 샘플을 1-4일 후에 처리하였다.
자성유체에 커플링된 상피세포 부착 항원(EpCAM), 혈관 내피 마커(CD105) 및/또는 TREML2에 대한 항체를 사용하여 오염 세포로부터 태아 세포영양막을 농축시켰다. 상기 농축된 세포를 피코에리쓰린(PE)으로 표지된 항-TREML2 단클론 항체(mAb)로 표지하였다. 상기 농축된 세포를 또한 백혈구 인식을 위해 알로피코시아닌(APC)으로 표지된 항-사이토케라틴 mAb C11, APC로 표지된 항-HLA-G mAb, 및 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC)로 표지된 항-CD45 mAb로 형광 표지하였다.
상기 표적 세포(예를 들어 세포영양막 세포)의 이러한 농축 과정은, 모체 혈액 중 상기 세포의 빈도가 전체 혈액 1 ㎖(10억개 초과의 세포를 함유한다) 내에 단지 1-10개의 세포로 대단히 낮은 것으로 공지되어 있기 때문에, 필요하다.
스파이킹을 위한 CVS 및 제대혈.
건강한 자원자의 전혈에 융모막 융모 샘플링(CVS)에서 유래된 태아 세포영양막 세포 또는 제대혈에서 유래된 태아 적혈구아세포로 스파이킹하였다.
CD105/EpCAM 발현을 위해 CVS 배양물을 선택하였다. 세포를 10% 소 태아 혈청(깁코(Gibco)), 1% 페니실린-스트렙토마이신(깁코) 및 L-글루타민(깁코)이 보충된 RPMI 1640(깁코)에서 37℃ 및 5% CO2에서 생육시켰다. 스파이킹 전에, 세포를 플라스크에서 탈착시키고 10 ㎖의 PBS(깁코)에 재현탁시키고 셀세이브 보존 튜브에 1일 이상 동안 두었다.
산 제라르도 병원에 의해 수득된 제대혈 샘플을 셀세이브 보존 튜브에 수집하였다.
상기 스파이킹 실험을 수행하여, 자성유체 접합된-항체를 사용하여 태아 세포를 포획하는 경우의 선택 과정의 특이성을 입증하였다.
태아 혈액 및 골수 샘플
태아 전혈(n=3)을 수술적 임신 종료가 예정된 임산부(10+0 15+6 임신 주수)로부터 초음파 유도 시술에 의해 수득하였다.
모든 공여자에게 서면 동의서를 제공했고 연구 프로토콜은 싱가포르 소재의 KK 여성 아동 병원의 의료 윤리 위원회의 승인을 받았다.
수집 후에, 태아 혈액을 같은 부피의 PBS로 희석하고 퍼콜 구배상에 서서히 층상화하였다. 샘플을 실온에서 10분간 1800 rpm에서 원심분리하였다. 태아 적혈구아세포를 함유하는 간기의 층을 수집하고 PBS로 2회 세척하였다.
성체 적혈구아세포를 함유하는 저온보존된 골수 단핵 세포를 구입하였다(론자, Cat. 2M-125C). 세포를 제조사의 설명에 따라 해동하고 DNaseI 처리하고 세척하였다. 이어서 세포를 10% FBS, 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민이 공급된 RPMI 배지에 37℃에서 1시간 동안 두고 음성 대조군(3명의 상이한 공여자가 시험되었다)으로서 사용하였다.
상업적으로 입수할 수 있는 TREML2 항체의 4개의 클론이 샘플 중에서 유식 세포측정에 의해 시험되었다.
상업적인 TREML2 Ab와 동일한 형광색소와 접합된 아이소타입 합치된 Ab를 동일한 농도로 사용하였다. TREML2 Ab 또는 아이소타입 대조군 외에, 염색에 사용되는 Ab는 CD71 Ab(밀테니 바이오텍), GPA Ab(BD 바이오사이언스), CD45 Ab(밀테니 바이오텍), 훽스트를 포함한다. 간단히, 세포(2.5 - 5 x 105)를 FcR 차단 시약(밀테니 바이오텍)의 존재하에서 Ab와 실온에서 30분간 배양하였다. 결합되지 않은 Ab의 세척 후에, 세포 펠릿을 FACS 분석을 위해 살아있는 세포상에서 게이팅하기 위해 사이톡스 그린 염료와 함께 실행 완충제로 재현탁시켰다.
조절된 응집을 위한 데스티오비오틴 자성유체 항체의 제조
일부 실시태양에서, 본 발명을 수행하는데 사용하기 위한 자성유체은 콜로이드로서 행동하는 입자이다. 이와 같은 입자는, 일반적으로 200 나노미터(㎚) 미만인 서브-마이크론 입자 크기, 및 연장된 기간 동안 용액으로부터의 중력 분리에 대한 저항을 특징으로 한다. 90 내지 150 ㎚ 범위의 70 내지 90% 자성 질량을 갖는 입자가 사용된다. 적합한 자성 입자는, 자성 코어에 결합되고, 예를 들어 물리적으로 흡착되거나 공유적으로 부착되고 안정화 콜로이드 성질을 부여하는 코팅 분자에 의해 둘러싸인 초상자성 물질의 결정성 코어로 구성된다. 이러한 코팅 물질은 바람직하게는 샘플에서 발견되는 생물학적 거대분자와 자성 코어 간의 비-특이적 상호작용을 방지하게에 유효한 양으로 적용되어야 한다. 이와 같은 생물학적 거대분자는 비-표적 세포, 렉틴, 당단백질 및 다른 막 성분의 표면상의 시알산 잔기를 포함할 수 있다. 또한, 상기 코팅 물질은 가능한 한 높은 자성 질량/나노입자 비를 함유해야 한다. 상기 코어를 구성하는 자성 결정의 크기는 완전한 자성 도메인을 함유하지 않을 정도로 충분히 작다. 상기 나노입자의 크기는 그의 브라운 에너지가 그의 자성 모멘트를 초과하는 크기이다. 결과적으로, 이러한 콜로이드성 자성 입자의 북극-남극 정렬 및 후속적인 상호 인력/척력은 중간 정도로 강한 자기장에서조차 발생하지 않는 것으로 보이고, 이는 그의 용액 안정성에 기여한다. 최종적으로, 자성 입자는 높은 자성 구배의 외부 장 분리기에서 분리가능해야 한다. 이 특징은 샘플 취급을 용이하게 하고 강자성 비드 또는 스틸 울이 로딩된 보다 복잡한 내부 구배 컬럼에 비해 경제적인 장점을 제공한다. 상술한 성질을 갖는 자성 입자를, EP0842042(내용 전체가 참고로 인용된다)에 기재된 바와 같은 베이스 물질의 변형에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 항-CD105 항체로 코팅된 자성 입자는 US6365362B1(내용 전체가 참고로 인용된다)에 기재된 바와 같이 제조된다.
CD105 항원에 대한 재조합 인간 항체를 하이브리도마 166707번(R&D 시스템스)으로부터 수득하였고 이를 미국특허 출원 제 09/248,388 호에 기재된 바와 같은 표준 커플링 화학에 의해 베이스 물질에 접합시켰다. 이어서 CD105 Ab 자성유체을 N-하이드록시숙신이미드-DL-데스티오비오틴(NHS-데스티오비오틴)(시그마, Cat. #H-2134)을 사용하여 데스티오비오틴에의 접합을 위해 20 mM HEPES, pH 7.5에 재현탁시켰다. NHS 데스티오비오틴의 모액을 DMSO 중에서 1 ㎎/㎖로 제조하였다. NHS-데스티오비오틴(5 ㎎)을 1 ㎎의 CD105 Ab 자성유체에 가하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 반응되지 않은 NHS-데스티오비오틴을, 높은 구배의 자석을 사용하여 1 ㎎/㎖ BSA, 0.05% 프로클린 300을 함유하는 20 mM HEPES, pH 7.5로 3회 세척하여 제거하였다. 최종 세척 후에, 데스티오비오틴/CD105 Ab 자성유체을 수/BSA/프로클린 300에 재현탁시키고 0.2 um 주사기 필터를 통해 여과하였다. CD105 Ab 자성유체의 철 농도를 분광광도측정 분석을 사용하여 측정하고 0.22 ㎎/㎖로 조절하였다. 입자 크기 측정을 입자 크기 분석기 나노브룩(NanoBrook) 90플러스(브룩헤븐 인스트루먼츠 코포레이션(Brookhaven Instruments Corporation)을 사용하여 수행하였다.
항-CD71, 항-TREML2 및 항-EpCAM 항체를 동일한 방법을 사용하여 자성유체에 접합시켰다.
혈액 처리
7.5 ㎖의 혈액 분액을 6.5 ㎖의 희석 완충제(메나리니 실리콘 바이오시스템스(Menarini Silicon Biosystems)로 희석하였다.
혈액 샘플(7.5 ㎖의 분액)을, 자성유체을 혈액에 가하기 전에 내인성 자성유체 응집 인자를 억제하기 위해 하나 이상의 억제제를 함유하는 6.5 ㎖의 희석 완충제(메나리니 실리콘 바이오시스템스)와 예비배양한다(내용 전체가 참고로 인용된 EP1311820에 기재된 바와 같이). 억제제 중 하나는 100 mM의 환원제, 예를 들어 머캅토에탄 설폰산일 수 있고, 이는 세포 표지에 사용되는 리간드에 영향을 미치지 않으면서 IgM-유도된 응집을 방지할 수 있다. 상기 환원제를 상기 혈액에 단일 시약으로서 첨가할 수 있다. 제2 억제제는 소 혈청 알부민일 수 있고, 이는 완충제 중에 10 ㎎/㎖로 포함될 수 있고, 임의의 HABAA를 중화시킬 것이다. 제3 억제제는 비특이성 마우스 항체, 특히 자성유체상의 항체와 합치하는 적합한 아이소타입일 수 있다. 이를 완충제 중에 0.5 내지 5 ㎎/㎖의 농도로 포함시킬 수 있는데, 이는 가장 심한 HAMA 조차 중화시킬 수 있다. 제4 억제제는, 필요한 경우, 혈장 중에 존재하는 임의의 항-스트렙타비딘 항체를 중화시키기 위해 완충제에 포함되는 스트렙타비딘일 수 있다. 상기 완충제 및 환원제에 의한 혈액의 사전-처리는 모든 내인성 응집 인자의 중화를 위해 15 내지 30분일 수 있다. 이러한 배양 시간 동안, 희석된 액체를 혈장 제거를 위해 실온에서 브레이크 없이 800g에서 10분간 원심분리시켰다.
모든 내인성 응집 인자의 중화 후에, 외인성 자성유체 응집 인자(스트렙타비딘)를 샘플에 가한 다음, 자성유체을 가한다. 자성유체은 표적에 특이적인 항체뿐만 아니라, 상기 외인성 응집 인자, 예를 들어 데스티오비오틴(데스티오비오틴-스트렙타비딘 결합 쌍)에 특이적인 또 다른 리간드에 커플링된다.
항-CD105 자성유체, 항-EpCAM 자성유체 및/또는 항-TREML2 자성유체이 태아 세포영양막 농축에 사용되었다. 항-CD71 자성유체 및/또는 항-TREML2 자성유체이 태아 적혈구아세포 농축에 사용되었다. 자성유체에 의한 표적 세포의 최적의 표적화 및 외인성 응집 인자에 의한 자성유체의 응집 유도 후에, 샘플에 자성 분리를 가하여 표적을 농축시킨다.
상기 샘플을 자성 분리기(임뮤니콘 카탈로그 QS-012번)에 10분간 둔다. 상기 샘플을 자석에서 꺼내어 와동에 의해 혼합하고, 자성에 의해 표지된 세포의 수집을 위해 다시 상기 자성 분리기에 10분간 둔다. 상기 샘플을 자석에서 꺼내어 다시 한번 혼합하고, 다른 20분 동안 자성 분리기에 다시 두었다. 수집되지 않은 샘플을 흡출하고 자성에 의해 수집된 세포를 3 ㎖의 세척-희석 완충제에 재현탁시키고 자성 분리기에서 10분간 재-분리시켰다. 수집되지 않은 샘플은 버리고 수집된 세포는 자성 분리기로부터 튜브를 제거한 후에 재현탁시켰다. 모든 비-표적의 제거 후에, 자성에 의해 표지된 표적 및 유리 자성유체을 완충제에 재현탁시킨다. 경우에 따라, 외인성 매개된-자성유체 응집을 역전시킨다. 응집의 역전은 최종 샘플을, 외인성 응집 인자(데스티오비오틴-스트렙타비딘 결합 쌍의 경우에 응집을 복귀시키는 외인성 작용제는 비오틴일 수 있다)에 결합하는 해응집 인자를 함유하는 완충제에 재현탁시킴으로써 성취될 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 이러한 해응집 인자는 모든 자성유체 응집체를 해응집시켜, 세포를 추가의 분석에 용이하게 한다.
세포영양막의 경우에, 농축된 세포를 피코에리쓰린(PE)으로 표지된 항-TREML2 단클론 항체(mAb)로 형광 표지하였다. 세포영양막의 경우에, 상기 농축된 세포를 또한 DNA 염색을 위해 핵산 염료(훽스트 33342), 백혈구 인식을 위해 알로피코시아닌(APC)으로 표지된 항-사이토케라틴 mAb C11, APC로 표지된 항-HLA-G mAb, 및/또는 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC)로 표지된 항-CD45 mAb로 형광 표지하였다.
적혈구아세포의 경우에, 상기 농축된 세포를 피코에리쓰린(PE)으로 표지된 항-TREML2 단클론 항체(mAb)로 형광 표지하였다. 적혈구아세포의 경우에, 상기 농축된 세포를 또한 DNA 염색을 위해 핵산 염료(훽스트 33342), 피코에리쓰린(PE)으로 표지된 항-CD71 단클론 항체(mAb) 및/또는 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC)로 표지된 항-CD45 mAb로 형광 표지하였다.
DEPArray(상표) NxT 시스템(메나리니 실리콘 바이오시스템스), 또는 FACS 분석을 위해 염색된 세포를 실온에서 20분간 2% 파라포름알데하이드(PFA)로 고정시키고, 이어서 세척하고 적합한 완충제 및 부피로 재현탁시켰다.
DEPArray 분석
DEPArray(상표) NxT는 순수한 단일 세포의 정확한 단리를 위한 반도체 기반 기술이다. 이는 DEPArray(상표) 제어 유닛과, 첨단 미세유체 및 실리콘 바이오칩 기술을 결합한 일회용 카트리지로 구성되어 농축된 샘플의 각 단일 표적 세포를 부드럽게 조작한다.
세포가 칩 내부에서 조작될 수 있게 하는 현상을 "유전영동"이라고 하고 전기장의 작용을 통해 액체 현탁 매질 내부의 입자를 분극화하는 능력을 기반으로 한다. 분극은 포텐셜 웰의 행에 있는 각 개별 입자를 포집하는데 사용될 수 있는 힘의 장을 생성시켜 입자의 위치를 제어할 수 있게 한다. 각각의 포텐셜 웰은 하나 이상의 입자를 초기 위치에서 최종 목적지로 이동하여 복구하기 위해 칩 프로그래밍을 수정하여 제어될 수 있다.
DEPArray(상표)는 대단히 높은 분해능(단일 세포까지) 및 대단히 높은 순도로 희귀 세포를 선택하고 분리할 수 있다. 명시야 또는 형광 이미지를 처리하여 얻은 형광 신호 및 형태적 특성의 다중 매개변수 분석을 통해 세포를 선택한다.
이 기술은 이미 종양이 있는 환자의 혈액에서 단일의 순환하는 종양 세포를 단리 및 선택하는데 사용되었다(내용 전체가 참고로 인용된 EP1311820에 기재된 바와 같다).
건강한 자원자로부터의 전혈 샘플을, 삼염색체 21을 갖는 태아 세포양양막 세포를 함유하는 융모막 융모 배양물로 스파이킹하였다.
세포영양막 세포를 DEPArray(상표) NxT 시스템상에서 분석하였다. 세포영양막 세포는 TREML2에 대해 양성 염색을 나타내었다. 더욱 또한, 범용-사이토케라틴(CK)에 대한 양성 염색 및 검출가능하지 않은 CD45 표지화 및 양성 핵 염색을 나타내는 세포를 태아 세포영양막 세포로서 분류하고, 단일 세포로서 단리하였다.
건강한 자원자로부터의 전혈 샘플을, Draq5 핵 염료로 사전-표지된 태아 적혈구아세포 세포를 함유하는 제대혈로 스파이킹하였다. 샘플을 CD71-Ab 자성유체 및 TREML2-Ab 자성유체으로 농축시키고 이전에 기재한 바와 같이 염색하였다. 적혈구아세포 농축된 세포를 DEPArray(상표) NxT 시스템상에서 분석하였다. CD71에 대한 양성 염색, 검출가능하지 않은 CD45 표지화 및 훽스트/Draq5에 대한 양성 핵 염색을 나타내는 세포를 태아 적혈구아세포 세포로서 분류하였다.
짧은 탠덤 반복(STR) 분석에 의한 태아 세포 기원의 입증
단리된 세포를 제조사의 설명에 따라 DEPArray(상표) LysePrep 키트(MSB, 이탈리아 소재)를 사용하여 용해시켰다.
단일 세포로부터의 DNA를 파워플렉스 퓨전(PowerPlex Fusion) 6c 인간 DNA 증폭 키트(프로메가(Promega) TMD045)(인간 게놈에 걸쳐 27개의 유전자좌에 표적화된 다중 프라이머 세트로 이루어진다)를 사용하여 PCR 증폭시켰다.
게놈 DNA를 또한 QIAgen DSP 혈액 미니 키트(퀴아겐(QIAgen))를 사용하여 200 ㎕의 모체 전혈로부터 단리하여 대조군으로서 제공하였다. 입수가능한 경우, 직접적인 또는 배양된 CVS 조직 또는 양수로부터 수득된 태아 게놈 DNA를 또한 분석하였다.
STR을 제조사의 권고에 따라 수행하고, 단편 분석을 써모피셔 사이언티픽 3500 제네틱 분석기(ThermoFisher Scientific 3500 Genetic Analyzer)(POP-4 및 36 ㎝ 모세관 배열)를 사용하여 수행하였고; 후속적인 소프트웨어 분석을 GeneMapper(등록상표) ID-X v1.4를 사용하여 수행하였다. 이어서 단리된 단일 세포의 대립유전자 패턴을 태아 및 부모 게놈 DNA 패턴과 비교하여 대립유전자 탈락 및 예상되는 유전 패턴을 평가하였다.
POC: 임신 첫 3개월 동안 20명의 임산부에 대한 임상 연구
20 ㎖의 말초 혈액 샘플을, 12 내지 17+2 임신 주수 내에 14명의 임산부로부터 10 ㎖ 셀세이브 보존 튜브(메나리니 실리콘 바이오시스템스, 미국 펜실배니아 헌팅돈 밸리 소재)로 정맥 천자하여 채취하였다. 모든 샘플을 1-4일 후에 처리하였다. 태아 세포영양막은 임신한 14명에게서 성공적으로 분리되었다(표 X). 14명의 양성 임산부로부터 평균 1.4개의 태아 세포영양막이 분리되었다.
복제수 변이체 분석(CNV)
건강한 자원자로부터의 전혈 샘플에 태아 세포영양막 세포를 함유하는 융모막 융모 배양물을 스파이킹하였다. 이전에 기재한 바와 같이 샘플을 농축시키고 염색하였다.
전체 게놈 증폭(Ampli1 WGA, 메나리니 실리콘 바이오시스템스)을 DEPArray(상표) NxT로부터 회수된 단일 태아 세포영양막에서 수행하였다.
Ampli1(상표) WGA 제품 5 ㎕를 제조사의 설명에 따라 1.8X SPRIselect 비즈(벡크만 쿨터(Beckman Coulter))로 정제하고 Ampl1(상표)로우 패스(Low pass) 키트(메나리니 실리콘 바이오시스템스)를 사용하여 라이브러리 제조를 위해 TE 완충제 12.5 ㎕에서 용출시켰다.
13개의 Ampli1(상표) 로우패스 라이브러리의 FASTQ 파일을 BWA를 사용하여 hg19 참조 게놈상에 정렬하였다. 대조용 샘플 없이 GC 정규화로, 대조용-FREEC를 사용하여 복제수 프로파일을 계산하였다. 사용자 정의 파이썬 스크립트를 사용하여 복제-수 플롯을 획득하였다.
결과
도 8은 태아 세포 농축에 대한 작업흐름도의 개략도를 도시한다. 도 8에 도시된 바와 같이, 작업흐름도는 3개의 별도의 단계로 이루어진다: 1. 샘플 수집 및 표적 세포를 특이적으로 선택하는 자성유체 접합된 항체를 사용하는 표적 세포의 포획. 2. 표적 세포를 선택된 항체로 표지하고 선별 및 선택을 위해 DEPArray 카트리지에 로딩한다. 이어서 선택된 단일 세포를 DEPArray 장비를 사용하여 분류한다. 3. 분류된 단일 세포를 STR(짧은 탠덤 반복) 기술에 의해 분석하여 그의 태아 세포 기원을 입증한다.
본 실시예에서, 태아 세포를 농축시키고 임산부의 전혈로부터 염색하였다. 순수한 단일 세포를, 전체 게놈 증폭 및 게놈 분석을 위해 DEPArray(상표)의 사용에 의해 단리한다.
도 9-10은 태아 혈액(FB)(도 9) 및 골수 샘플(BM)(도 10)로부터 단리된 적혈구아세포상에서의 TREML2(즉 TLS) 발현의 유식 세포측정 분석에 의해 입증된 바와 같은, 신규의 TREML2 항체의 특이성을 입증한다. 도 9-10에 도시된 바와 같이, 태아 혈액 또는 골수 샘플로부터 단리된 적혈구아세포를 (1) 주요 세포 집단을 게이팅하는 FSC-A/SSC-A, (2) 사이톡스 그린 음성 생 세포 게이팅, (3) 더블릿 세포의 제외를 위한 FSC-H/W, (4) 이중 양성 GPA/훽스트 게이팅, (5) CD71pos/CD45neg의 게이팅, 및 (6) TLS 게이팅 및 아이소타입 대조군과 오버레이하여 TREML2 양성 세포의 %를 측정함에 의해 게이팅하였다.
도 11A 내지 11J는 다양한 클론으로부터의 다양한 태아 혈액(FB) 샘플로부터 단리된 적혈구아세포상에서 TLS 발현을 도시한다. 도 12A 내지 12L은 다양한 클론으로부터의 다양한 골수(BM) 샘플로부터 단리된 적혈구아세포상에서 TLS 발현을 도시한다. 도 11A 내지 11J에 도시된 바와 같이, 태아 혈액으로부터의 태아 적혈구아세포는 TREML2 항체에 대한 양성 염색을 나타낸 반면, 골수로부터 단리된 성체 적혈구아세포에 대해서는 발현을 검출할 수 없다(도 12A 내지 12L).
Ab 자성유체 크기 측정(CD105-FF에 대한 평균 직경(㎚)은 128.70 ㎚였음)

유형
시작일/시간
샘플
ID
유효
직경
(㎚)
다분산도
기준선
지수
계수율
(kcps)
잔존
데이터
(%)
확산
계수
(cm2/s)
DLS 2019년 6월 20일
13:10:38		 CD105 FF coniug
200619
in6039 solution
0.2 mg/mL - 1		 127.51 0.320 5.6 441.9 91.55 3.849E-08
DLS 2019년 6월 20일
13:12:39		 CD105 FF coniug
200619
in6039 solution
0.2 mg/mL - 2		 128.38
 0.313 3.6 431.3 96.48 3.823E-08
DLS 2019년 6월 20일
13:14:41		 CD105 FF coniug
200619
in6039 solution
0.2 mg/mL - 3		 130.20 0.332 0.0 435.0
 94.88 3.769E-08
평균 128.70 0.321 3.1 436.0 94.30 3.814E-08
표준 오차 0.79 0.006 1.6 3.1 1.45 2.334E-10
표준 편차 1.37 0.010 2.8 3.4 2.51 4.043E-10
Ab 자성유체 크기 측정(TREML-2-FF에 대한 평균 직경(㎚)은 189.57였음. 두 크기 모두 콜로이드성 입자 범위 이내임)
샘플 ID 유효 직경(㎚) 다분산도 기준선 지수
TLS-FF 188.41 0.206 7.9
TLS--FF 189.36 0.217 8.6
TLS-FF 188.17 0.203 8.4
TLS-FF 190.88 0.213 8.3
TLS-FF 191.03 0.216 7.8
평균 189.57 0.211 8.2
표준 오차 0.6 0.003 0.2
표준 편차 1.34 0.006 0.4
CVS 배양물로부터 유래한 세포영양막을 사용하여 CD105-FF 및 EpCAM-FF 포획 및 농축의 특이성을 입증하였다.도 13은 CD105-FF 및 EpCAM-FF에 의한 스파이킹 및 농축 후에 DEPArray(상표)에 의해 식별된 TREML-2 양성 세포영양막 세포의 산포도 분석을 도시한다. 도 14는 셀브라우저(CellBrowser)(등록상표) 이미지 갤러리를 도시한다: 세포영양막 세포는 TREML-2-PE 항체, CK-APC 및 핵 염색에서 양성 염색을 나타내었다.
제대혈로부터 유래한 적혈구아세포를 사용하여 CD71 또는 TREML-2 포획 및 농축의 특이성을 입증하였다.
도 15A는 건강한 공여자 혈액에 스파이킹되고 CD71-FF가 농축된 Draq5/훽스트 양성 적혈구아세포의 산포도 분석을 도시한다. 도 15B는 셀브라우저(등록상표) 이미지 갤러리를 도시한다: 적혈구아세포는 CD71-PE 항체, Draq5 및 훽스트 핵 염색에서 양성 염색을 나타내고, CD45-FITC 항체의 경우 음성 염색을 나타내었다.
도 16A는 건강한 공여자 혈액에 스파이킹되고 TREML-2-FF가 농축된 Draq5/훽스트 양성 적혈구아세포의 산포도 분석을 도시한다. 도 16B는 셀브라우저(등록상표) 이미지 갤러리를 도시한다: 적혈구아세포는 CD71-PE 항체, Draq5 및 훽스트 핵 염색에서 양성 염색을 나타내고, CD45-FITC 항체의 경우 음성 염색을 나타내었다.
분류된 단일 세포를 STR(짧은 탠덤 반복) 기술에 의해 분석하여 그의 태아 세포 기원을 입증하였다(양수천자 시술로부터 유래한 모체 DNA뿐만 아니라 태아 DNA 분석과 비교하여). 동일한 유전자좌 프로파일이 검출되었다. 도 17은 단일 태아 세포로부터의 STR 분석을 도시한다.
파일럿 임상 연구에서, 다양한 임신주수의 14명의 임산부가 등록하였고 이 임산부로부터의 혈액 샘플에서 얻은 태아 세포는 STR 분석에 의해 입증된 바와 같이, 양성으로 검출되었다.
STR 분석의 요약을 나타냄

환자 ID
임신 주수
STR에 의해 식별된 세포
1 17+2 4
2 12+2 1
3 13+3 1
4 14 1
5 13+4 1
6 13+3 1
7 13+4 1
8 12 1
9 17 1
10 13+4 1
11 13+1 1
12 12 3
13 12 1
14 12 2
융모막 융모 샘플링으로부터 태아 세포의 단일 세포 회수로부터 chr21 삼염색체성 샘플링(VK)을 검출할 수 있음을 입증하기 위해, 본 발명자들은 복제-수 변이체(CNV) 분석을 수행하였다.도 18은 태아 세포의 CNV 분석의 결과를 도시한다. 도 18에 도시된 바와 같이, DEPArray로부터의 단일 세포 회수(예를 들어 회수 1(R1), 회수 3(R3) 및 회수 6(R6)으로부터)는 융모막 융모 샘플링(VK)으로부터의 라이브러리상에 존재하는 chr21 삼염색체를 입증한다.
도 19는 건강한 공여자 단일 세포에 대한 CNV 분석의 결과를 도시한다. 도 19에 도시된 바와 같이, 건강한 공여자(HD)는 DEPArray로부터 단리된 PBMC 단일 세포에 의해 수득된 경우와 유사하게, 편평한 복제-수 프로파일을 보인다.
실시예 4: 모체 혈액으로부터 nRBC 선택을 위한 작업흐름도 과정
본 실시예는 임신한 피실험자의 혈액 샘플로부터 유핵 적혈구(nRBC)를 선택하기 위한 하나의 방법을 기재한다. 도 6에 도시된 바와 같이, 혈액 샘플을 임신한 피실험자로부터 수집한다(601). 혈액 샘플을 셀세이브 튜브에 수집한다(601). nRBC를 자성 분리에 의해 농축시킬 수 있다(602, 예를 들어 자성유체 농축). 대안적으로 또는 추가로, 샘플을 셀트랙스(CELLTRACKS)(등록상표) 오토프렙(AUTOPREP)(등록상표) 시스템을 사용하여 처리할 수 있다(603). 단일 세포를 DEPArray(상표) NxT 조절 유닛 이미지-기반 기술을 사용하여 시각화하고 단리할 수 있다(604). 일단 세포가 단리되면, 단리된 세포로부터 핵산을 정제한다(605). 게놈 및/또는 유전자 분석을 수행한다(606). 예를 들어, 핵산 분자를 서열분석하여 염색체 이상을 검출한다.
실시예 5: RNA-서열분석 프로토콜
RNA와 같은 핵산 분자를 희귀 세포(예를 들어 태아 세포)로부터 단리할 수 있다. 본 실시예는 태아 세포로부터의 RNA를 서열분석하기 위한 예시적인 방법을 제공한다.
SMART-Seq V2
RT-PCR을 위해, Smartseq 버전 2를 일부 수정하여 변형시켰다.
태아 적혈구아세포(EB)의 경우, 2 ng의 전체 RNA 투입을 역전사 반응에 사용하였다. 모체 EB의 경우, 분류할 수 있는 모체 EB의 제한된 수로 인해, 모든 RNA를 농축시키고 역전사 반응에 사용하였다.
(1) 역전사
샘플 튜브에 1 ㎕의 올리고 dT 30VN 프라이머(10 uM) 및 1 ㎕의 dNTP 믹스(각각 10 mM)를 가한다.
샘플을 72℃에서 3분간 배양하고 즉시 얼음상에 둔다.
하기와 같은 역전사 믹스를 얼음상에서 제조하고, 5.7 ㎕를 각 샘플에 가한다.
하기와 같은 열 주기로 반응물을 배양한다:
(2) PCR 예비-증폭
하기와 같은 PCR 믹스를 얼음상에서 제조하고, 15 ㎕를 각 샘플에 가한다.
샘플을 유전자증폭기에 넣고 하기의 프로그램을 실행한다.
PCR 주기의 수는 세포 유형에 따라 변하고 증가되거나(낮은 RNA 함량을 갖는 세포의 경우) 감소될 수 있다(보다 많은 RNA를 갖는 세포의 경우).
(3) PCR 정제
증폭된 cDNA 산물을 0.5X 반응 부피의 AMPure XP 비즈(벡크만 쿨터)를 사용하여 2회 정제한다. 정제된 cDNA를 에이질런트 2100 생물분석기(Agilent 2100 Bioanalyzer)상에서 고감도 DNA 키트를 사용하여 정량분석한다.
(4) 일루미나 넥스테라(Illumina Nextera) XT DNA 샘플 제조
일루미나 넥스테라 XT DNA 키트를 수정 사용하여 라이브러리를 제조한다(cDNA 샘플, 시약의 부피 및 반응 부피를 제조사 설명서 부피의 1/4로 최적화하였다).
cDNA를 상응하게 희석하여 300 pg을 얻는다.
1.25 ㎕의 cDNA(300 pg)를 0.2 PCR 튜브에 분액한다.
2.5 ㎕의 태그먼트(Tagment) DNA 완충제 및 1.25 ㎕의 앰플리콘 태그먼트 Miz를 가한다.
증폭기상에서 태그멘테이션(tagmentation) 반응을 55도에서 5분간 배양한다.
1.25 ㎕의 NT를 즉시 가하고 실온에서 5분간 배양한다.
1.25 ㎕의 Index1, 1.25 ㎕의 Index2, 및 3.75 ㎕의 넥스테라 PCR 마스터 믹스(NPM)를 태그멘테이션된 DNA에 가한다.
하기의 프로그램을 사용하여 증폭을 수행한다:
(5) 라이브러리 DNA 클린업(정제):
AMPure XP 비즈(0.6X 반응 부피)를 라이브러리 DNA에 가한다.
비즈를 버리고 상등액을 1차 클린업을 위해 유지한다.
2차 클린업에서, AMPure XP 비즈(0.7X 반응 부피)를 가한다.
비즈를 유지시키고 DNA 단편을 용출시킨다.
성공적인 라이브러리(평균 400bp)를 에이질런트 2100 생물분석기상에서 고감도 DNA 키트를 사용하여 정량분석한다.
라이브러리를 모으기 위해, 각각의 라이브러리 샘플을 10 nM로 조절하고 부피 기준으로 모은다.
(6) 라이브러리 DNA 서열분석:
라이브러리를 서열분석 시설에 제출하고 일루미나 HiSeq(상표) 하이 아웃풋(Illumina HiSeqTM High Output) v3 시스템으로 대응-단부(paired-end) 서열분석하였다(2x101bp).
실시예 6: 세포영양막 검출
본 실시예는 세포영양막의 검출 방법을 기재한다. 본 실시예에서, 자성유체(FerroFluid) 기술을 세포 포획 및 선택에 사용하고 DEPArray 기술을 세포 분류에 사용한다.
세포영양막을 자성유체 기술 및 조절된 응집으로 포획한다. 임신한 피실험자의 혈액 샘플을 항-EpCAM 항체(EpCAM-FF)에 접합된 콜로이드성 자성 입자 또는 항-CD105 항체(CD105-FF)에 접합된 콜로이드성 자성 입자를 포함하는 자성유체과 접촉시킨다. 혈액 샘플은 다수의 세포(태아 세포 및 모체 세포)를 함유한다. 제1 외인성 응집 증대 인자, 예를 들어 데스티오비오틴을 콜로이드성 자성 입자에 접합시킨다. 제2 외인성 응집 증대 인자, 예를 들어 스트렙타비딘을 샘플에 가한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 제2 외인성 응집 증대 인자의 첨가는 상기 콜로이드성 자성 입자의 응집을 유도하고, 이에 의해 태아 세포를 보다 용이하게 분리하고 비-태아 세포에 의한 오염을 감소시킨다. 샘플을 자성 분리기에 적용하고 EpCAM-FF 또는 CD105-FF 결합된 세포를 단리한다.
EpCAM-FF 또는 CD105-FF 결합된 세포의 추가적인 분석을 용이하게 하는데 일조하기 위해, 제3 외인성 응집 증대 인자, 예를 들어 비오틴을 단리된 세포에 가한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 제3 외인성 응집 증대 인자의 첨가는 콜로이드성 자성 입자의 응집을 역전시켜, 단일 세포의 분석을 보다 용이하게 한다.
세포 분류를 위한 DEPArray 기술: TLS1(즉 TREML2)을 세포영양막의 염색을 위한 후보로서 사용한다. 단리된 세포를 형광-표지된 항-TLS 항체(즉 항-TREML2 항체), 항-HLA-G 항체 및 사이토케라틴으로 염색한다. 단리되고 염색된 세포 샘플을 DEPArray 카트리지에 적용하고 DEPArray 장비를 사용하여 분석한다. 세포가 TLS, HLA-G 및 사이토케라틴 염색에 양성인 경우 상기 세포를 세포영양막으로서 식별한다.
실시예 7: 태아 이상 진단
본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 의해 단리되거나 식별된 태아 세포를 태아 이상 진단을 위해 추가로 분석한다. 핵형 검사를 태아 세포상에서 수행하여 염색체 이상을 검출한다. 염색체 이상이 검출되면, 태아를 상응하는 질환이 있는 것으로 진단한다. 예를 들어, 염색체 21의 3개 사본이 검출되는 경우, 태아는 다운 증후군으로 진단된다. 또 다른 예에서, 염색체 18의 3개 사본이 검출되는 경우, 태아는 에드워드 증후군으로 진단된다.
SEQUENCE LISTING <110> Menarini Biomarkers Singapore PTE LTD <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR ISOLATING, DETECTING, AND ANALYZING FETAL CELLS <130> 111346-0203 <140> PCT/IB2020/056632 <141> 2020-07-14 <150> US 62/874,306 <151> 2019-07-15 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 321 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Pro Ala Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp Pro Gln Gly Cys 1 5 10 15 Val Ser Gly Pro Ser Ala Asp Ser Val Tyr Thr Lys Val Arg Leu Leu 20 25 30 Glu Gly Glu Thr Leu Ser Val Gln Cys Ser Tyr Lys Gly Tyr Lys Asn 35 40 45 Arg Val Glu Gly Lys Val Trp Cys Lys Ile Arg Lys Lys Lys Cys Glu 50 55 60 Pro Gly Phe Ala Arg Val Trp Val Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Leu Gln 65 70 75 80 Asp Asp Ala Gln Ala Lys Val Val Asn Ile Thr Met Val Ala Leu Lys 85 90 95 Leu Gln Asp Ser Gly Arg Tyr Trp Cys Met Arg Asn Thr Ser Gly Ile 100 105 110 Leu Tyr Pro Leu Met Gly Phe Gln Leu Asp Val Ser Pro Ala Pro Gln 115 120 125 Thr Glu Arg Asn Ile Pro Phe Thr His Leu Asp Asn Ile Leu Lys Ser 130 135 140 Gly Thr Val Thr Thr Gly Gln Ala Pro Thr Ser Gly Pro Asp Ala Pro 145 150 155 160 Phe Thr Thr Gly Val Met Val Phe Thr Pro Gly Leu Ile Thr Leu Pro 165 170 175 Arg Leu Leu Ala Ser Thr Arg Pro Ala Ser Lys Thr Gly Tyr Ser Phe 180 185 190 Thr Ala Thr Ser Thr Thr Ser Gln Gly Pro Arg Arg Thr Met Gly Ser 195 200 205 Gln Thr Val Thr Ala Ser Pro Ser Asn Ala Arg Asp Ser Ser Ala Gly 210 215 220 Pro Glu Ser Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Leu Ser Thr Arg Ser Pro 225 230 235 240 Thr Thr Gly Leu Cys Leu Thr Ser Arg Ser Leu Leu Asn Arg Leu Pro 245 250 255 Ser Met Pro Ser Ile Arg His Gln Asp Val Tyr Ser Thr Val Leu Gly 260 265 270 Val Val Leu Thr Leu Leu Val Leu Met Leu Ile Met Val Tyr Gly Phe 275 280 285 Trp Lys Lys Arg His Met Ala Ser Tyr Ser Met Cys Ser Asp Pro Ser 290 295 300 Thr Arg Asp Pro Pro Gly Arg Pro Glu Pro Tyr Val Glu Val Tyr Leu 305 310 315 320 Ile <210> 2 <211> 250 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Pro Ser Ala Asp Ser Val Tyr Thr Lys Val Arg Leu Leu Glu Gly 1 5 10 15 Glu Thr Leu Ser Val Gln Cys Ser Tyr Lys Gly Tyr Lys Asn Arg Val 20 25 30 Glu Gly Lys Val Trp Cys Lys Ile Arg Lys Lys Lys Cys Glu Pro Gly 35 40 45 Phe Ala Arg Val Trp Val Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Leu Gln Asp Asp 50 55 60 Ala Gln Ala Lys Val Val Asn Ile Thr Met Val Ala Leu Lys Leu Gln 65 70 75 80 Asp Ser Gly Arg Tyr Trp Cys Met Arg Asn Thr Ser Gly Ile Leu Tyr 85 90 95 Pro Leu Met Gly Phe Gln Leu Asp Val Ser Pro Ala Pro Gln Thr Glu 100 105 110 Arg Asn Ile Pro Phe Thr His Leu Asp Asn Ile Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Val Thr Thr Gly Gln Ala Pro Thr Ser Gly Pro Asp Ala Pro Phe Thr 130 135 140 Thr Gly Val Met Val Phe Thr Pro Gly Leu Ile Thr Leu Pro Arg Leu 145 150 155 160 Leu Ala Ser Thr Arg Pro Ala Ser Lys Thr Gly Tyr Ser Phe Thr Ala 165 170 175 Thr Ser Thr Thr Ser Gln Gly Pro Arg Arg Thr Met Gly Ser Gln Thr 180 185 190 Val Thr Ala Ser Pro Ser Asn Ala Arg Asp Ser Ser Ala Gly Pro Glu 195 200 205 Ser Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Leu Ser Thr Arg Ser Pro Thr Thr 210 215 220 Gly Leu Cys Leu Thr Ser Arg Ser Leu Leu Asn Arg Leu Pro Ser Met 225 230 235 240 Pro Ser Ile Arg His Gln Asp Val Tyr Ser 245 250 <210> 3 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Ala Asp Ser Val Tyr Thr Lys Val Arg Leu Leu Glu Gly Glu Thr 1 5 10 15 Leu Ser Val Gln Cys Ser Tyr Lys Gly Tyr Lys Asn Arg Val Glu Gly 20 25 30 Lys Val Trp Cys Lys Ile Arg Lys Lys Lys Cys Glu Pro Gly Phe Ala 35 40 45 Arg Val Trp Val Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Leu Gln Asp Asp Ala 50 55 60 <210> 4 <211> 50 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Arg Tyr Trp Cys Met Arg Asn Thr Ser Gly Ile Leu Tyr Pro Leu 1 5 10 15 Met Gly Phe Gln Leu Asp Val Ser Pro Ala Pro Gln Thr Glu Arg Asn 20 25 30 Ile Pro Phe Thr His Leu Asp Asn Ile Leu Lys Ser Gly Thr Val Thr 35 40 45 Thr Gly 50 <210> 5 <211> 50 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Thr Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Thr Ser Thr Thr Ser Gln Gly Pro Arg 1 5 10 15 Arg Thr Met Gly Ser Gln Thr Val Thr Ala Ser Pro Ser Asn Ala Arg 20 25 30 Asp Ser Ser Ala Gly Pro Glu Ser Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Leu 35 40 45 Ser Thr 50 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Ile Trp Trp Tyr Asp Asp Lys 1 5 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Val Arg Ile Glu Ser Thr Met Ile Thr Gly Asp Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Tyr Ser Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Ala Ala Ser 1 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Gln Gln Ser Ile Glu Asp Pro Trp Thr 1 5

Claims (38)

  1. 임신한 피실험자의 샘플로부터 태아 세포를 단리하는 방법으로서,
    (a) 다수의 세포를 포함하는 샘플을 다수의 자성 입자와 접촉시키는 단계로서, 상기 자성 입자가, CD105 및 CD71로부터 선택된 내피 마커에 결합하는 제1 항체에 접합된 것인, 단계;
    (b) 상기 제1 항체에 결합된 세포를 단리하여 농축된 샘플을 생성시키는 단계;
    (c) 상기 농축된 샘플을, 골수세포상에서 발현된 촉발 수용체 유사 2(Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells Like 2, TREML2) 및 사이토케라틴(CK)으로부터 선택된 태아 세포 마커에 결합하는 제2 항체와 접촉시키는 단계; 및
    (d) 상기 제2 항체에 결합된 태아 세포를 단리하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    태아 세포가 태아 유핵 적혈구(fetal nucleated red blood cell, fnRBC)인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    태아 세포가 세포영양막 세포(trophoblast)인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    자성 입자가 콜로이드성 자성 입자인, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    콜로이드성 자성 입자가 자성유체(ferrofluid) 자성 입자인, 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    단계 (b)가 샘플에 자기장을 가함을 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    자성 입자가 제1 외인성 응집 증대 인자(EAEF)에 커플링되고, 상기 제1 EAEF가 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc, 아비딘-비오틴, 비오틴 유사체-아비딘, 데스티오비오틴-스트렙타비딘, 데스티오비오틴-아비딘, 이미노비오틴-스트렙타비딘 및 이미노비오틴-아비딘을 포함하는 군으로부터 선택된 특정 결합 쌍의 한 구성원을 포함하는 것인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    단계 (a)가 제2 EAEF를 가하여 자성 입자의 응집을 유도함을 포함하고, 상기 제2 EAEF가 특정 결합 쌍의 다른 구성원을 포함하는 것인, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    단계 (b)가 농축된 샘플에서 자성 입자의 응집을 역전시키기 위해 상기 농축된 샘플에 특정 결합 쌍의 구성원을 가함을 포함하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    다수의 자성 입자가, 상피 마커에 결합하는 항체에 접합된 자성 입자를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상피 마커가 상피 세포 부착 분자(EpCAM)인, 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    제2 항체가, TREML2에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편인, 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    제2 항체가, CK에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편인, 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    단일 태아 세포를 단리하는 단계가, 제2 항체에 결합된 단일 태아 세포를 단리함을 포함하는, 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    단계 (c)가, 농축된 샘플을 항-CD45 항체와 접촉시킴을 추가로 포함하는, 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    단계 (c)가, 농축된 샘플을 핵 염색 물질(nuclear stain)과 접촉시킴을 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    표지가 형광 표지인, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    태아 세포를 단리하는 단계가 면역형광 기술에 기반하는, 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    태아 세포를 단리하는 단계가 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 포함하는, 방법.
  20. 제17항에 있어서,
    태아 세포를 단리하는 단계가 DEPArray를 포함하는, 방법.
  21. 제1항에 있어서,
    태아 세포를 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제1항에 있어서,
    태아 세포의 게놈 분석 또는 유전자 분석을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 임신한 피실험자의 샘플로부터 태아 세포를 단리하는 방법으로서,
    (a) 다수의 세포를 포함하는 샘플을 다수의 자성 입자와 접촉시키는 단계로서, 상기 다수의 자성 입자의 각각의 자성 입자가, (i) CD105 및 CD71로부터 선택된 내피 마커에 결합하는 제1 항체, (ii) 상피 마커에 결합하는 제2 항체, 또는 (iii) 상피 CD105 및 CD71로부터 선택된 내피 마커에 결합하는 제1 항체, 및 상피 마커에 결합하는 제2 항체 둘 다에 접합된 것인, 단계;
    (b) 상기 샘플에 자기장을 가하는 단계;
    (c) 상기 자성 입자에 결합된 세포를 단리하여 농축된 샘플을 생성시키는 단계;
    (d) 상기 농축된 샘플을, (i) 골수세포상에서 발현된 촉발 수용체 유사 2(TREML2) 및 사이토케라틴(CK)으로부터 선택된 태아 세포 마커에 결합하고 형광 표지에 접합된 제3 항체, (ii) 형광 표지에 접합된 항-CD45 항체, 및 (iii) 핵 염색 물질과 접촉시키는 단계; 및
    (e) 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 또는 DEPArray를 사용하여 태아 세포를 단리하는 단계로서, 상기 태아 세포가 태아 세포 마커 및 핵 염색에 대해 양성이고 CD45에 대해 음성인 것인, 단계
    를 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    태아 세포가 태아 유핵 적혈구(fnRBC)인, 방법.
  25. 제23항에 있어서,
    태아 세포가 세포영양막 세포인, 방법.
  26. 제23항에 있어서,
    자성 입자가 콜로이드성 자성 입자인, 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    콜로이드성 자성 입자가 자성유체 자성 입자인, 방법.
  28. 제23항에 있어서,
    제1 항체가 CD105에 결합하고, 제3 항체가 CK에 결합하는 것인, 방법.
  29. 제23항에 있어서,
    태아 세포를 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  30. 제23항에 있어서,
    태아 세포의 게놈 분석 또는 유전자 분석을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  31. 임신한 피실험자의 샘플로부터 태아 세포를 단리하는 방법으로서,
    (a) 다수의 세포를 포함하는 샘플을, CD105에 결합하는 제1 항체에 접합된 자성 입자를 포함하는 다수의 자성 입자와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 샘플에 자기장을 가하는 단계;
    (c) 상기 자성 입자에 결합된 세포를 단리하여 농축된 샘플을 생성시키는 단계;
    (d) 상기 농축된 샘플을, (i) 형광 표지에 접합된 항-사이토케라틴(CK) 항체, (ii) 형광 표지에 접합된 항-CD45 항체, 및 (iii) 핵 염색 물질과 접촉시키는 단계; 및
    (e) 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 사용하여 태아 세포를 단리하는 단계로서, 상기 태아 세포가 태아 세포 마커 및 핵 염색에 대해 양성이고 CD45에 대해 음성인 것인, 단계
    를 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    다수의 자성 입자가, 상피 마커에 결합하는 항체에 접합된 자성 입자를 포함하는 것인, 방법.
  33. 제31항에 있어서,
    태아 세포가 태아 유핵 적혈구(fnRBC)인, 방법.
  34. 제31항에 있어서,
    태아 세포가 세포영양막 세포인, 방법.
  35. 제31항에 있어서,
    자성 입자가 콜로이드성 자성 입자인, 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    콜로이드성 자성 입자가 자성유체 자성 입자인, 방법.
  37. 제31항에 있어서,
    태아 세포를 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  38. 제31항에 있어서,
    태아 세포의 게놈 분석 또는 유전자 분석을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
KR1020237025070A 2019-07-15 2020-07-14 태아 세포의 단리, 검출 및 분석을 위한 조성물 및방법 KR20230114327A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962874306P 2019-07-15 2019-07-15
US62/874,306 2019-07-15
PCT/IB2020/056632 WO2021009682A1 (en) 2019-07-15 2020-07-14 Compositions and methods for isolating, detecting, and analyzing fetal cells
KR1020227004546A KR20220044517A (ko) 2019-07-15 2020-07-14 태아 세포의 단리, 검출 및 분석을 위한 조성물 및 방법

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227004546A Division KR20220044517A (ko) 2019-07-15 2020-07-14 태아 세포의 단리, 검출 및 분석을 위한 조성물 및 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230114327A true KR20230114327A (ko) 2023-08-01

Family

ID=71728846

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237025070A KR20230114327A (ko) 2019-07-15 2020-07-14 태아 세포의 단리, 검출 및 분석을 위한 조성물 및방법
KR1020227004546A KR20220044517A (ko) 2019-07-15 2020-07-14 태아 세포의 단리, 검출 및 분석을 위한 조성물 및 방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227004546A KR20220044517A (ko) 2019-07-15 2020-07-14 태아 세포의 단리, 검출 및 분석을 위한 조성물 및 방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20220235420A1 (ko)
EP (1) EP3999856A1 (ko)
JP (2) JP2022541031A (ko)
KR (2) KR20230114327A (ko)
CN (1) CN114430805A (ko)
AU (1) AU2020315211A1 (ko)
WO (1) WO2021009682A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112980779B (zh) * 2021-05-20 2021-08-24 广州凯普医药科技有限公司 一种从孕妇宫颈脱落细胞中分离胎盘滋养层细胞的方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5698271A (en) 1989-08-22 1997-12-16 Immunivest Corporation Methods for the manufacture of magnetically responsive particles
WO1991007660A1 (en) * 1989-11-13 1991-05-30 Children's Medical Center Corporation Non-invasive method for isolation and detection of fetal dna
AU7232700A (en) * 1989-11-13 2001-03-01 Children's Medical Center Corporation Non-invasive method for isolation and detection of fetal DNA
US5731156A (en) * 1996-10-21 1998-03-24 Applied Imaging, Inc. Use of anti-embryonic hemoglobin antibodies to identify fetal cells
WO1999041613A1 (en) 1998-02-12 1999-08-19 Immunivest Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells
BR0017261A (pt) 2000-07-14 2003-07-29 Immunivest Corp Métodos para isolamento de uma bioentidade alvo de uma amostra biológica e de células de tumor com densidade de antìgeno baixa e, kits para inibir a agregação endógena de partìculas magnéticas coloidais no processamento de material biológico e, para isolamento de células de tumor de densidade de antìgeno baixa de uma amostra biológica com agregação ontrolada de partìculas magnéticas coloidais
JP4589106B2 (ja) * 2002-05-31 2010-12-01 ジェネティック テクノロジーズ リミテッド 母体血由来の胎児細胞を同定し濃化するための胎児細胞マーカーとしての母体抗体
US20060105353A1 (en) * 2004-11-16 2006-05-18 Jalal Syed M Non-invasive prenatal fetal cell diagnostic method
ITTO20070307A1 (it) 2007-05-04 2008-11-05 Silicon Biosystems Spa Metodo e dispositivo per la diagnosi prenatale non-invasiva
JP2018050559A (ja) * 2016-09-29 2018-04-05 富士フイルム株式会社 妊娠母体から採取された末梢血から胎児細胞を単離する方法、抗体セット、及び出生前遺伝学的検査方法
US11470827B2 (en) * 2017-12-12 2022-10-18 Alector Llc Transgenic mice expressing human TREM proteins and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP3999856A1 (en) 2022-05-25
JP2023156347A (ja) 2023-10-24
US20220235420A1 (en) 2022-07-28
AU2020315211A1 (en) 2022-02-10
WO2021009682A1 (en) 2021-01-21
JP2022541031A (ja) 2022-09-21
CN114430805A (zh) 2022-05-03
KR20220044517A (ko) 2022-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6310540B2 (ja) 母体血液中の胎児細胞の濃縮及び同定及びこれに使用するリガンド
US20090081689A1 (en) Reagents and methods to enrich rare cells from body fluids
EP1891437B1 (en) Method for purification of a cell population
US8263404B2 (en) Method for enriching rare cell subpopulations from blood
US20150133332A1 (en) Detection, isolation and analysis of rare cells in biological fluids
US9588117B2 (en) Detecting cells secreting a protein of interest
AU2005255024A1 (en) Antibodies binding to CD34+/CD36+ fetal but not to adult cells
US20150132738A1 (en) Method For Identification Of Non-Hematogeneous Karocytes Enriched From Body Fluid Of Humans Or Animals
JP6563379B2 (ja) 白血球の枯渇による循環腫瘍細胞の濃縮
SG194959A1 (en) Foetal nucleated red blood cell detection
US20090181421A1 (en) Diagnosis of fetal abnormalities using nucleated red blood cells
JP2023156347A (ja) 胎児細胞を単離、検出及び解析する組成物及び方法
TWI784163B (zh) 用於純化分離及分析腫瘤表面標記陰性且血球表面標記陰性之有核細胞的方法及腫瘤表面標記陰性且血球表面標記陰性之有核細胞之應用
JPH10507632A (ja) 母体からの胎児血液の濃縮
Wada et al. Method of separation and concentration of fetal nucleated red blood cells in maternal blood and its application to fetal diagnosis
US20140315748A1 (en) Detection, isolation and analysis of rare cells in biological fluids
JP2018105645A (ja) 希少細胞の検出方法
WO2023104773A1 (en) Isolation and diagnostics of fetal cells
JPWO2021009682A5 (ko)
JP2018054340A (ja) ヒト血液に含まれるヘモグロビンサブユニットγを含有する細胞を検出する方法、ヒトのヘモグロビンサブユニットγに対する抗体、ヒトのヘモグロビンサブユニットγに対する抗体の製造方法、ヒトのヘモグロビンサブユニットγに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び出生前遺伝学的検査方法
WO2014067528A1 (en) Improved enrichment and detection of rare blood cells

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent