KR20220139958A - 토바모바이러스 저항성 토마토 식물, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 생산 방법, 토마토 식물에 있어서의 토바모바이러스 저항성 부여 방법, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 스크리닝 방법 및 토마토 식물에 있어서의 토바모바이러스 저항성 검출 방법 - Google Patents

토바모바이러스 저항성 토마토 식물, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 생산 방법, 토마토 식물에 있어서의 토바모바이러스 저항성 부여 방법, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 스크리닝 방법 및 토마토 식물에 있어서의 토바모바이러스 저항성 검출 방법 Download PDF

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가즈히로 이시바시
아키히토 가노
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코쿠리츠켄큐카이하츠호진 노교쇼쿠힌산교기주츠소고켄큐키코
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Abstract

ToBRFV에 대한 저항성을 갖는 토마토 식물을 제공한다. 본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물은 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d에 관해서 기능 상실되어 있다.

Description

토바모바이러스 저항성 토마토 식물, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 생산 방법, 토마토 식물에 있어서의 토바모바이러스 저항성 부여 방법, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 스크리닝 방법 및 토마토 식물에 있어서의 토바모바이러스 저항성 검출 방법
본 발명은, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 생산 방법, 토마토 식물에 있어서의 토바모바이러스 저항성 부여 방법, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 스크리닝 방법 및 토마토 식물에 있어서의 토바모바이러스 저항성 검출 방법에 관한 것이다.
토마토 재배에 있어서는 토바모바이러스속의 토마토 모자이크바이러스(ToMV)의 방제가 중요하여, 재배용 토마토 식물에는 토마토 모자이크바이러스 저항성 유전자가 도입되어 있다.
Tm-22(Tm-2a)는 타파되기 어려운 ToMV 저항성 유전자로서 알려져 있으며, 시판되는 거의 모든 재배 품종의 토마토 식물에 도입되어 있다. 그러나, 2015년에는 Tm-22가 효과를 보이지 않는 새로운 토바모바이러스인 Tomato brown rugose fruit virus(ToBRFV)가 중동에서 발견되고, 세계 각국으로 감염 지역이 확대되어 문제가 되고 있다(비특허문헌 1 및 2).
N. Salem et. al, "A new tobamovirus infecting tomato crops in Jordan", Arch. Virol., 2016, vol. 161, pages 503-506 Neta Luria et. al, "A New Israeli Tobamovirus Isolate Infects tomato Plants Harboring Tm-22 Resistance Genes", PLOS One, 2017, vol. 12, No. 1, e0170429
그래서, 본 발명은 ToBRFV에 대한 저항성을 갖는 토마토 식물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물(이하, 「저항성 식물」이라고도 한다)은 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d에 관해서 기능 상실되어 있다.
본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 생산 방법(이하, 「제1 생산 방법」이라고도 한다)은 하기 (a) 공정을 포함한다:
(a) 본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물과 다른 토마토 식물을 교잡(交雜)하는 공정.
본 발명의 토마토 식물에 있어서의 토바모바이러스 저항성 부여 방법(이하, 「부여 방법」이라고도 한다)은, 대상 토마토 식물의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자를 기능 상실시키는 기능 상실 공정을 포함한다.
본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 생산 방법(이하, 「제2 생산 방법」이라고도 한다)은, 대상 토마토 식물에 토바모바이러스 저항성을 부여하는 부여 공정을 포함하고,
상기 부여 공정은 상기 본 발명의 토마토 식물에 있어서의 토바모바이러스 저항성 부여 방법에 의해 실시된다.
본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 스크리닝 방법(이하, 「스크리닝 방법」이라고도 한다)은, 피검 토마토 식물로부터, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자를 기능 상실한 피검 토마토 식물을, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하는 선발 공정을 포함한다.
본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 생산 방법(이하, 「제3 생산 방법」이라고도 한다)은, 피검 토마토 식물로부터, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 관해서 기능 상실한 피검 토마토 식물을 스크리닝하는 스크리닝 공정을 포함하고,
상기 스크리닝 공정은 상기 본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 스크리닝 방법에 의해 실시된다.
본 발명의 토마토 식물의 토바모바이러스 저항성 검출 방법(이하, 「검출 방법」이라고도 한다)은, 피검 토마토 식물에 있어서, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자가 기능 상실되어 있는지를 검출하는 검출 공정을 포함한다.
본 발명의 토마토 식물의 가공 식품은 본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물을 이용한다.
본 발명의 토마토 식물은 ToBRFV에 대한 저항성을 갖는다.
도 1은 실시예 1에 있어서의 CBB 염색 후의 염색도를 도시하는 사진이다.
도 2는 실시예 1에 있어서의 CBB 염색 후의 염색도를 도시하는 사진이다.
도 3은 실시예 1에 있어서의 토바모바이러스 접종 후 20일째에 있어서의 각 식물을 도시하는 사진이다.
도 4는 실시예 1에 있어서의 야생형주(野生型株), 그리고 변이체의 생육 및 과실 형성을 도시하는 사진이다.
도 5는 실시예 2에 있어서의 토마토 식물의 발병 지수의 평가 기준을 도시하는 사진이다.
도 6은 실시예 2에 있어서의 CP를 코드하는 게노믹(genomic) RNA의 상대량을 도시하는 그래프이다.
<토바모바이러스 저항성 토마토 식물>
본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물은, 상술한 것과 같이, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d에 관해서 기능 상실되어 있다. 본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물은, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d에 관해서 기능 상실한 것이 특징이며, 그 밖의 구성 및 조건은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명자들은, 예의 연구한 결과, 토마토 식물에의 감염에 있어서, 토바모바이러스가 SlTOM1(Solanum lycopersicum TOM1) 유전자군을 이용하고 있다는 지견을 얻었다. 그리고, 본 발명자들은, SlTOM1 유전자군에 있어서, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자를 기능 결손시킴으로써, 특히 SlTOM1d 유전자의 기능 결손을 SlTOM1 유전자군의 다른 유전자의 기능 결손과 조합함으로써, 토마토 식물이 ToMV에 더하여 ToBRFV에 대한 저항성을 보인다는 것을 알아내어, 본 발명을 확립하기에 이르렀다. 이것은, 토바모바이러스가 RNA의 복제에 있어서 SlTOM1 유전자군을 이용하고 있는데, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자의 기능 상실에 의해 증식할 수 없게 되었기 때문이라고 추정된다. 한편, 본 발명은 상기 추정에 하등 제한되지 않는다. 이 때문에, 본 발명에 의하면, 토바모바이러스, 특히 ToBRFV에 대한 저항성을 보이는 토마토 식물을 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, 토바모바이러스는 토바모바이러스속(Genus Tobamovirus)에 속하는 바이러스를 의미한다. 상기 토바모바이러스속에 속하는 바이러스로서는, 예컨대 토마토 모자이크바이러스(tomato mosaic virus(ToMV)), tomato brown rugose fruit virus(ToBRFV), tomato mottle mosaic virus(ToMMV), 담배 모자이크바이러스(Tobacco mosaic virus), 수박 녹반(綠斑) 모자이크바이러스(Cucumber green mottle mosaic virus), 고추 미반(微斑) 바이러스(Pepper mild mottle virus), 담배 미반 모자이크바이러스(Tobacco mild green mosaic virus), 파프리카 미반 바이러스(Paprika mild mottle virus), 오이 녹반 모자이크바이러스(Kyuri green mottle mosaic virus), 히비스커스 잠재 포트 피어스 바이러스(Hibiscus latent Fort Pierce virus), 오돈토글로섬 윤점 바이러스(Odontoglossum ringspot virus), 지황 모자이크바이러스(Rehmannia mosaic virus), 샘몬스 오푼티아 바이러스(Sammon's Opuntia virus), 고추냉이 얼룩무늬 바이러스(Wasabi mottle virus), 평지 모자이크바이러스(Youcai mosaic virus), 선-헴프 모자이크바이러스(Sunn-hemp mosaic virus) 등을 들 수 있다. 상기 토바모바이러스는 토마토 식물에 감염 가능한 토바모바이러스가 바람직하다. 상기 토마토 식물에 감염 가능한 토바모바이러스는 예컨대 ToMV, ToBRFV, ToMMV 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「토바모바이러스 저항성」은 예컨대 「토바모바이러스병 내성」이라고도 한다. 상기 저항성은, 예컨대 토바모바이러스의 감염에 의한 병해의 발생 및 진행에 대한 저해능 또는 억제능을 의미하며, 구체적으로 예컨대 병해의 미발생, 발생한 병해의 진행 정지 및 발생한 병해의 진행 억제(「저해」라고도 한다.) 등의 어느 것이라도 좋다.
본 발명에 있어서, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물은, 어느 하나 이상의 토바모바이러스에 대하여 저항성을 보이면 되며, 바람직하게는 ToBRFV 또는 ToMV이고, 보다 바람직하게는 ToBRFV 및 ToMV이다.
본 발명에 있어서 「토바모바이러스 저항성」은, 예컨대 야생형의 SlTOM1 유전자군(정상 SlTOM1 유전자군)을 갖는 토마토 식물과 비교하여, 토바모바이러스에 대하여 유의(有意)한 저항성을 보인다는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서 「토바모바이러스 저항성」은, 예컨대 피검 토마토 식물의 자엽(子葉)(흡수 후 약 10일째)에 토바모바이러스를 접종하고, 접종 후의 소정 기간(약 7일)에 있어서의 토바모바이러스의 외피 단백질의 발현 유무 혹은 발현량의 측정, 또는 접종 후 소정 기간(약 20일) 후에 있어서의 토바모바이러스에 의한 발병의 유무 또는 발병의 정도에 기초하여 평가할 수 있다.
상기 외피 단백질의 발현에 기초하여 평가하는 경우, 외피 단백질의 발현은 후술하는 실시예 1의 설명을 참조할 수 있다. 그리고, 피검 토마토 식물에 있어서의 외피 단백질의 발현량이, SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자(「기능 상실체」라고도 한다, 이하 마찬가지), SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자 및 SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 갖는 토마토 식물에 있어서의 외피 단백질의 발현량과 동일한(유의차가 없는) 경우 및/또는 SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자, SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자 및 SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 갖는 토마토 식물에 있어서의 외피 단백질의 발현량보다 (유의하게) 낮은 경우, 상기 피검 토마토 식물은 예컨대 토바모바이러스 저항성이라고 평가할 수 있다. 피검 토마토 식물에 있어서의 외피 단백질의 발현량이, 야생형 SlTOM1a 유전자, 야생형 SlTOM1c 유전자 및 야생형 SlTOM1d 유전자를 호모 접합형으로 갖는 토마토 식물에 있어서의 외피 단백질의 발현량과 동일하거나(유의차가 없거나) 또는 (유의하게) 높은 경우 및/또는 SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자, SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자 및 SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 갖는 토마토 식물에 있어서의 외피 단백질의 발현량보다 (유의하게) 높은 경우, 상기 피검 토마토 식물은 예컨대 토바모바이러스 이병성(罹病性)이라고 평가할 수 있다.
상기 토바모바이러스의 발병에 기초하여 평가하는 경우, 토바모바이러스의 발병은, 예컨대 하기 참고정보 1에 기재된 병징(病徵)을 참조하여, 사상(絲狀) 잎 형성의 유무 및/또는 생육 지연의 유무에 의해 판단할 수 있다. 상기 사상 잎은, 예컨대 잎의 일부가 위축하여 사상 형태를 보이는 것을 의미하며, 구체예로서 하기 참고정보 1에 있어서의 Symptoms of ToBRFV (German DSMZ isolate) on Solanum lycopersicum cv. 'moneymaker' obtained by artificial inoculation under quarantine facilities (France, 2019)의 예를 참조할 수 있다. 피검 토마토 식물이 토바모바이러스에 감염된 경우, 상기 피검 토마토 식물에서는 예컨대 사상 잎의 형성 및/또는 생육 지연이 관찰된다. 이 때문에, 상기 피검 토마토 식물이 사상 잎을 형성하고 있는 경우 및/또는 생육 지연되고 있는 경우, 상기 피검 토마토 식물은 토바모바이러스에 걸렸다, 즉, 토바모바이러스 이병성이라고 평가할 수 있다. 다른 한편, 상기 피검 토마토 식물이 사상 잎을 형성하지 않은 경우 및/또는 생육 지연되지 않은 경우, 상기 피검 토마토 식물은 토바모바이러스에 걸리지 않았다, 즉, 토바모바이러스 저항성이라고 평가할 수 있다. 상기 생육 지연은, 토바모바이러스에 감염되지 않은 토마토 식물(예컨대 토바모바이러스 미접종의 개체)과 비교함으로써 평가하여도 좋고, 상기 피검 토마토 식물의 재배 일수를 감안하여, 일반적인 토마토 식물의 생육 상태와 비교함으로써 평가하여도 좋다.
참고정보 1: European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO), “EPPO Global Database”, [online], [2020년 2월 12일 검색], 인터넷 <https://gd.eppo.int/taxon/tobrfv/photos>
구체예로서, 상기 「토바모바이러스 저항성」은, 후술하는 실시예 2의 방법과 같은 식으로 준하여 토마토 식물의 발병 지수를 평가하고, 상기 발병 지수로부터 산출하는 발병도에 의해 나타낼 수 있다. 이 방법에 의한 상기 발병도의 산출은, 후술하는 실시예 2의 설명을 원용할 수 있으며, 예컨대 발병도 1 미만을 토바모바이러스 저항성(내병성), 발병도 1 이상을 토바모바이러스 이병성이라고 설정할 수 있다. 상기 발병도에 의해 상기 토바모바이러스 저항성을 판단하는 경우, 상기 발병도는, 예컨대 1주(株)의 토마토 식물의 발병도라도 좋고, 2주 이상의 토마토 식물의 평균의 발병도라도 좋지만, 후자가 바람직하다. 후자의 경우, 상기 토바모바이러스 저항성의 판단에 사용하는 토마토 식물의 수는 특별히 제한되지 않고, 예컨대 토바모바이러스 이병성 토마토 식물과의 통계학적인 검정이 가능한 수이며, 구체예로서 5∼20주, 5주이다.
본 발명에 있어서, 「토마토 식물」은, 가지속 Solanum의 Subgenus Solanum sensu strico에 있어서의 Section Lycopersion으로 분류되는 식물이다. 구체예로서, 상기 토마토 식물은 예컨대 S. lycopersicum, S. peruvianum, S. arcanum Peralta, S. chilense, S. corneliomulleri, S. huaylasense Peralta, S. cheesmaniae (L.Riley) Fosberg, S. chmielewskii, S. galapagense S.C.Darwin & Peralta, S. habrochaites, S. neorickii, S. pennelli, S. pimpinellifolium 등을 들 수 있고, 바람직하게는 교잡이 용이한 S. lycopersicum이다. 본 발명에 있어서, 상기 토마토 식물은 예컨대 재배용 토마토 식물이다. 상기 재배용 토마토 식물은 예컨대 토마토 식물의 재배 품종이라고 말할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 「식물체」는, 식물 전체를 나타내는 식물 개체 및 상기 식물 개체의 부분의 어느 쪽을 의미하여도 좋다. 상기 식물 개체의 부분은, 예컨대 기관, 조직, 세포 또는 영양 번식체 등을 들 수 있으며, 어느 것이라도 좋다. 상기 기관은 예컨대 꽃잎, 화관, 꽃, 잎, 종자, 과실, 줄기, 뿌리 등을 들 수 있다. 상기 조직은 예컨대 상기 기관의 부분이다. 상기 식물체의 부분은, 예컨대 1종류의 기관, 조직 및/또는 세포라도 좋고, 2종류 이상의 기관, 조직 및/또는 세포라도 좋다.
상술한 것과 같이, 토바모바이러스는, 토마토 식물에의 감염에 있어서, SlTOM1 유전자군을 이용하고 있다고 추정된다. 즉, SlTOM1 유전자군은 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 유전자군이라고 말할 수 있다. 본 발명에 있어서, 유전자가 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는다는 것은, 상기 유전자가 정상인 상태(예컨대 야생형 유전자)로 존재하면 토바모바이러스 저항성이라는 형질의 출현이 억제되는 것, 즉 토바모바이러스 저항성을 마이너스로 제어하는 것을 의미한다. 이 때문에, 상기 「토바모바이러스 저항성 제어 활성」은 예컨대 「토바모바이러스 저항성 억제 활성」이라고 말할 수 있다. 또한, SlTOM1 유전자군은, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 유전자군이므로, SlTOM1 유전자군을 구성하는 각 유전자는 예컨대 토바모바이러스 저항성 제어 유전자라고 말할 수도 있다. 상기 「토바모바이러스 저항성 제어 활성 유전자」는 예컨대 「토바모바이러스 저항성 억제 활성 유전자」라고 말할 수 있다. 또한, 각 유전자는, 상술한 것과 같이 토바모바이러스의 증식 또는 RNA의 복제를 제어함으로써, 토바모바이러스 저항성에 기여하고 있는다고 추정된다. 이 때문에, SlTOM1 유전자군을 구성하는 각 유전자는, 예컨대 토바모바이러스 증식 제어 유전자 또는 토바모바이러스 복제 제어 유전자라고 말할 수도 있다. 이하, 각 유전자는, 특별히 언급하지 않는 한, SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자, SlTOM1c 유전자 및/또는 SlTOM1d 유전자를 의미한다.
본 발명에 있어서, SlTOM1 유전자군 및 그것을 구성하는 후술하는 각 유전자는 RNA(예컨대 mRNA) 형태 또는 DNA 형태(예컨대 cDNA 또는 게놈 DNA)로 존재할 수 있다. DNA는 이중 가닥이라도 단일 가닥이라도 좋다. 본 발명에 있어서, 상기 유전자는 비번역 영역(UTR)의 서열 등의 부가적인 서열을 포함하는 것이라도 좋다.
토마토 식물에 있어서, 상기 SlTOM1 유전자군은, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 더하여, SlTOM1b 유전자를 갖는다. 이하, 각 유전자에 관해서 설명한다. 또한, 이하의 설명에 있어서, SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자는, 각각 정상인, 즉, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는, 야생형의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자를 의미한다.
SlTOM1a 유전자는 LeTH1이라고 말할 수도 있다. SlTOM1a 유전자는, 예컨대 Sol genomics network(Solyc:https://solgenomics.net/)에 있어서 액세션 번호(accession number): Solyc04g008540으로 등록되어 있는 염기 서열(서열 번호 1)을 포함하는 폴리뉴클레오티드, Genbank에 액세션 번호: AB193041로 등록되어 있는 염기 서열(서열 번호 2)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 등을 들 수 있다. 또한, 이하의 각 염기 서열에 있어서, 특별히 언급하지 않는 한, 밑줄로 나타내는 염기 서열이 단백질을 코드하는 염기 서열이다. 또한, SlTOM1a 유전자가 코드하는 단백질은, 예컨대 Solyc에 있어서, 액세션 번호: Solyc04g008540으로 등록되어 있는 아미노산 서열(서열 번호 3)을 포함하는 폴리펩티드, Genbank에 액세션 번호: AB193041로 등록되어 있는 염기 서열(서열 번호 3)을 포함하는 폴리펩티드 등을 들 수 있다.
SlTOM1a 유전자의 cDNA의 염기 서열(서열 번호 1, Solyc04g008540)
Figure pct00001
Figure pct00002
SlTOM1a 유전자의 cDNA의 염기 서열(서열 번호 2, AB193041)
Figure pct00003
SlTOM1a 유전자가 코드하는 단백질(서열 번호 3, Solyc04g008540, AB193041)
Figure pct00004
구체예로서, SlTOM1a 유전자는 예컨대 하기 (NA)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 토바모바이러스 저항성 제어 유전자를 들 수 있다.
(NA) 하기 (NA1)∼(NA7)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
(NA1) 서열 번호 1 및 2의 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
(NA2) 상기 (NA1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NA3) 상기 (NA1)의 염기 서열에 대하여, 80% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NA4) 상기 (NA1)의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트(stringent) 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NA5) 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NA6) 서열 번호 3의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NA7) 서열 번호 3의 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
상기 (NA2)∼(NA4) 및 (NA6)∼(NA7)의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 「토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는」은, 예컨대 상기 (NA1) 또는 (NA5)와 동등한(유의차가 없는) 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는다는 것을 의미한다.
상기 (NA1)에 있어서, 서열 번호 1의 염기 서열은 (NA5)의 코드 서열이다. 서열 번호 1의 염기 서열은 예컨대 S. lycopersicum의 Heinz 1706으로부터 얻을 수 있다. 또한, 상기 (NA1)에 있어서, 서열 번호 2의 염기 서열은 (NA5)의 코드 서열이다. 서열 번호 2의 염기 서열은 예컨대 S. lycopersicum의 cv. Craigella GCR26으로부터 얻을 수 있다.
상기 (NA2)에 있어서, 「하나 혹은 여러 개」는, 예컨대 상기 (NA2)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 범위이면 된다. 상기 (NA2)의 「하나 혹은 여러 개」는, 상기 (NA1)의 염기 서열에 있어서, 예컨대 1∼264개, 1∼198개, 1∼132개, 1∼66개, 1∼52개, 1∼39개, 1∼26개, 1∼13개, 1∼6개, 1∼3개, 1 또는 2개, 1개이다. 본 발명에 있어서, 염기수 또는 아미노산수 등의 개수의 수치 범위는, 예컨대 그 범위에 속하는 양의 정수를 전부 개시하는 것이다. 즉, 예컨대 「1∼5개」라는 기재는 「1, 2, 3, 4, 5개」의 모든 개시를 의미한다(이하 마찬가지).
상기 (NA3)에 있어서, 「동일성」은, 예컨대 상기 (NA3)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 범위이면 된다. 상기 (NA3)의 동일성은, 상기 (NA1)의 염기 서열에 대하여, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이다. 상기 「동일성」은, 2개의 염기 서열 또는 아미노산 서열을 얼라인먼트함으로써 구할 수 있다(이하 마찬가지). 상기 얼라인먼트는 예컨대 BLAST, FASTA 등을 이용하여 디폴트의 파라미터로 산출할 수 있다.
상기 (NA4)에 있어서, 「하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드」는, 예컨대 상기 (NA1)의 폴리뉴클레오티드에 대하여, 완전 또는 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드이다. 상기 하이브리다이즈는 예컨대 각종 하이브리다이제이션 어세이(hybridization assay)에 의해 검출할 수 있다. 상기 하이브리다이제이션 어세이는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대 잠브룩(Sambrook) 등 편 「몰레큘러 클로닝: 어 라보라토리 매뉴얼 제2판(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.)」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕 등에 기재되어 있는 방법을 채용할 수도 있다.
상기 (NA4)에 있어서, 「스트린젠트 조건」은, 예컨대 저(低) 스트린젠트 조건, 중(中) 스트린젠트 조건, 고(高) 스트린젠트 조건의 어느 것이라도 좋다. 「저스트린젠트 조건」은, 예컨대 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 32℃의 조건이다. 「중 스트린젠트 조건」은, 예컨대 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 42℃의 조건이다. 「고 스트린젠트 조건」은, 예컨대 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 50℃의 조건이다. 스트린젠시 정도는, 당업자라면, 예컨대 온도, 염 농도, 프로브의 농도 및 길이, 이온 강도, 시간 등의 조건을 적절하게 선택함으로써 설정할 수 있다. 「스트린젠트 조건」은, 예컨대 상술한 잠브룩(Sambrook) 등 편 「몰레큘러 클로닝: 어 라보라토리 매뉴얼 제2판(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.)」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕 등에 기재된 조건을 채용할 수도 있다.
상기 (NA5)의 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 상기 (NA5)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 염기 서열이면 된다. 상기 (NA5)의 폴리뉴클레오티드의 염기 서열은, 예컨대 상기 서열 번호 3의 아미노산 서열에 기초하여, 대응하는 코돈으로 치환함으로써 설계할 수 있다.
상기 (NA6)에 있어서, 아미노산 서열에 관한 「하나 혹은 여러 개」는, 예컨대 상기 (NA6)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 범위이면 된다. 상기 (NA6)의 「하나 혹은 여러 개」는, 예컨대 상기 서열 번호 3의 아미노산 서열에 있어서, 예컨대 1∼59개, 1∼58개, 1∼44개, 1∼43개, 1∼30개, 1∼29개, 1∼15개, 1∼14개, 1∼11개, 1∼8개, 1∼6개, 1∼5개, 1∼3개, 1 또는 2개, 1개이다.
상기 (NA7)에 있어서, 아미노산 서열에 관한 「동일성」은, 예컨대 상기 (NA7)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 범위이면 된다. 상기 (NA7)의 동일성은, 상기 서열 번호 3의 아미노산 서열에 대하여, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이다.
SlTOM1b 유전자는 LeTH2라고 말할 수도 있다. SlTOM1b 유전자는, 예컨대 Solyc에 있어서 액세션 번호: Solyc01g105270으로 등록되어 있는 염기 서열(서열 번호 4)을 포함하는 폴리뉴클레오티드, Genbank에 액세션 번호: AB193042로 등록되어 있는 염기 서열(서열 번호 5)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 등을 들 수 있다. 또한, SlTOM1b 유전자가 코드하는 단백질은, 예컨대 Solyc에 있어서, 액세션 번호: Solyc01g105270으로 등록되어 있는 아미노산 서열(서열 번호 6)을 포함하는 폴리펩티드, Genbank에 액세션 번호: AB193043으로 등록되어 있는 염기 서열(서열 번호 6)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 등을 들 수 있다.
SlTOM1b 유전자의 cDNA의 염기 서열(서열 번호 4, Solyc01g105270)
Figure pct00005
Figure pct00006
SlTOM1b 유전자의 cDNA의 염기 서열(서열 번호 5, AB193042)
Figure pct00007
Figure pct00008
SlTOM1b 유전자가 코드하는 단백질(서열 번호 6, Solyc01g105270, AB193042)
Figure pct00009
구체예로서, 상기 SlTOM1b 유전자는, 예컨대 하기 (NB)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 토바모바이러스 저항성 제어 유전자이다.
(NB) 하기 (NB1)∼(NB7)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
(NB1) 서열 번호 4 및 5의 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
(NB2) 상기 (NB1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NB3) 상기 (NB1)의 염기 서열에 대하여, 80% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NB4) 상기 (NB1)의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NB5) 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NB6) 서열 번호 6의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NB7) 서열 번호 6의 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
상기 (NB2)∼(NB4) 및 (NB6)∼(NB7)의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 「토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는」은, 예컨대 상기 (NB1) 또는 (NB5)와 동등한(유의차가 없는) 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는다는 것을 의미한다.
상기 (NB1)에 있어서, 서열 번호 4의 염기 서열은 (NB5)의 코드 서열이다. 서열 번호 4의 염기 서열은 예컨대 S. lycopersicum의 Heinz 1706으로부터 얻을 수 있다. 또한, 상기 (NB1)에 있어서, 서열 번호 5의 염기 서열은 (NB5)의 코드 서열이다. 서열 번호 5의 염기 서열은 예컨대 S. lycopersicum의 cv. Craigella GCR26으로부터 얻을 수 있다.
상기 (NB2)에 있어서, 「하나 혹은 여러 개」는, 예컨대 상기 (NB2)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 범위이면 된다. 상기 (NB2)의 「하나 혹은 여러 개」는, 상기 (NB1)의 염기 서열에 있어서, 예컨대 1∼264개, 1∼262개, 1∼260개, 1∼198개, 1∼195개, 1∼132개, 1∼131개, 1∼130개, 1∼66개, 1∼65개, 1∼52개, 1∼39개, 1∼26개, 1∼13개, 1∼6개, 1∼3개, 1 또는 2개, 1개이다.
상기 (NB3)에 있어서, 「동일성」은, 예컨대 상기 (NB3)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 범위이면 된다. 상기 (NB3)의 동일성은, 상기 (NB1)의 염기 서열에 대하여, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이다.
상기 (NB4)에 있어서, 「하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드」는, 예컨대 상기 (NB1)의 폴리뉴클레오티드에 대하여, 완전 또는 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드이다. 상기 하이브리다이즈는 예컨대 각종 하이브리다이제이션 어세이에 의해 검출할 수 있다. 상기 하이브리다이제이션 어세이는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대 잠브룩(Sambrook) 등 편 「몰레큘러 클로닝: 어 라보라토리 매뉴얼 제2판(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.)」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕 등에 기재되어 있는 방법을 채용할 수도 있다. 상기 (NB4)에 있어서, 「스트린젠트 조건」은 예컨대 상술한 설명을 원용할 수 있다.
상기 (NB5)의 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 상기 (NB5)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 염기 서열이면 된다. 상기 (NB5)의 폴리뉴클레오티드의 염기 서열은, 예컨대 상기 서열 번호 6의 아미노산 서열에 기초하여, 대응하는 코돈으로 치환함으로써 설계할 수 있다.
상기 (NB6)에 있어서, 아미노산 서열에 관한 「하나 혹은 여러 개」는, 예컨대 상기 (NB6)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 범위이면 된다. 상기 (NB6)의 「하나 혹은 여러 개」는, 예컨대 상기 서열 번호 6의 아미노산 서열에 있어서, 예컨대 1∼59개, 1∼58개, 1∼44개, 1∼43개, 1∼30개, 1∼29개, 1∼15개, 1∼14개, 1∼11개, 1∼8개, 1∼7개, 1∼6개, 1∼3개, 1 또는 2개, 1개이다.
상기 (NB7)에 있어서, 아미노산 서열에 관한 「동일성」은, 예컨대 상기 (NB7)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 범위이면 된다. 상기 (NB7)의 동일성은, 상기 서열 번호 6의 아미노산 서열에 대하여, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이다.
SlTOM1c 유전자는 LeTH3이라고 말할 수도 있다. SlTOM1c 유전자는, 예컨대 Solyc에 있어서 액세션 번호: Solyc02g080370으로 등록되어 있는 염기 서열(서열 번호 7)을 포함하는 폴리뉴클레오티드, Genbank에 액세션 번호: AB193043으로 등록되어 있는 염기 서열(서열 번호 8)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 등을 들 수 있다. 또한, SlTOM1c 유전자가 코드하는 단백질은, 예컨대 Solyc에 있어서, 액세션 번호: Solyc02g080370으로 등록되어 있는 아미노산 서열(서열 번호 9)을 포함하는 폴리펩티드, Genbank에 액세션 번호: AB193043으로 등록되어 있는 염기 서열(서열 번호 9)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 등을 들 수 있다.
SlTOM1c 유전자의 cDNA의 염기 서열(서열 번호 7, Solyc02g080370)
Figure pct00010
Figure pct00011
SlTOM1c 유전자의 cDNA의 염기 서열(서열 번호 8, AB193043)
Figure pct00012
Figure pct00013
SlTOM1c 유전자가 코드하는 단백질(서열 번호 9, Solyc02g080370, AB193043)
Figure pct00014
구체예로서, 상기 SlTOM1c 유전자는, 예컨대 하기 (NC)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 토바모바이러스 저항성 제어 유전자이다.
(NC) 하기 (NC1)∼(NC7)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
(NC1) 서열 번호 7 및 8의 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
(NC2) 상기 (NC1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NC3) 상기 (NC1)의 염기 서열에 대하여, 80% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NC4) 상기 (NC1)의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NC5) 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NC6) 서열 번호 9의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NC7) 서열 번호 9의 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
상기 (NC2)∼(NC4) 및 (NC6)∼(NC7)의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 「토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는」은, 예컨대 상기 (NC1) 또는 (NC5)와 동등한(유의차가 없는) 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는다는 것을 의미한다.
상기 (NC1)에 있어서, 서열 번호 7의 염기 서열은 (NC5)의 코드 서열이다. 서열 번호 7의 염기 서열은 예컨대 S. lycopersicum의 Heinz 1706으로부터 얻을 수 있다. 또한, 상기 (NC1)에 있어서, 서열 번호 8의 염기 서열은 (NC5)의 코드 서열이다. 서열 번호 8의 염기 서열은 예컨대 S. lycopersicum의 cv. Craigella GCR26으로부터 얻을 수 있다.
상기 (NC2)에 있어서, 「하나 혹은 여러 개」는, 예컨대 상기 (NC2)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 범위이면 된다. 상기 (NC2)의 「하나 혹은 여러 개」는, 상기 (NC1)의 염기 서열에 있어서, 예컨대 1∼268개, 1∼264개, 1∼254개, 1∼201개, 1∼198개, 1∼190개, 1∼134개, 1∼132개, 1∼127개, 1∼67개, 1∼66개, 1∼63개, 1∼53개, 1∼52개, 1∼50개, 1∼40개, 1∼39개, 1∼38개, 1∼26개, 1∼25개, 1∼13개, 1∼12개, 1∼6개, 1∼3개, 1 또는 2개, 1개이다.
상기 (NC3)에 있어서, 「동일성」은, 예컨대 상기 (NC3)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 범위이면 된다. 상기 (NC3)의 동일성은, 상기 (NC1)의 염기 서열에 대하여, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이다.
상기 (NC4)에 있어서, 「하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드」는, 예컨대 상기 (NC1)의 폴리뉴클레오티드에 대하여, 완전 또는 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드이다. 상기 하이브리다이즈는 예컨대 각종 하이브리다이제이션 어세이에 의해 검출할 수 있다. 상기 하이브리다이제이션 어세이는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대 잠브룩(Sambrook) 등 편 「몰레큘러 클로닝: 어 라보라토리 매뉴얼 제2판(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.)」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕 등에 기재되어 있는 방법을 채용할 수도 있다. 상기 (NC4)에 있어서, 「스트린젠트 조건」은 예컨대 상술한 설명을 원용할 수 있다.
상기 (NC5)의 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 상기 (NC5)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 염기 서열이면 된다. 상기 (NC5)의 폴리뉴클레오티드의 염기 서열은, 예컨대 상기 서열 번호 9의 아미노산 서열에 기초하여, 대응하는 코돈으로 치환함으로써 설계할 수 있다.
상기 (NC6)에 있어서, 아미노산 서열에 관한 「하나 혹은 여러 개」는, 예컨대 상기 (NC6)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 범위이면 된다. 상기 (NC6)의 「하나 혹은 여러 개」는, 예컨대 상기 서열 번호 9의 아미노산 서열에 있어서, 예컨대 1∼59개, 1∼56개, 1∼44개, 1∼42개, 1∼30개, 1∼28개, 1∼15개, 1∼14개, 1∼11개, 1∼8개, 1∼6개, 1∼5개, 1∼3개, 1 또는 2개, 1개이다.
상기 (NC7)에 있어서, 아미노산 서열에 관한 「동일성」은, 예컨대 상기 (NC7)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 범위이면 된다. 상기 (NC7)의 동일성은, 상기 서열 번호 9의 아미노산 서열에 대하여, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이다.
SlTOM1d 유전자는, 예컨대 Solyc에 있어서 액세션 번호: Solyc01g007900으로 등록되어 있는 염기 서열(서열 번호 10)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 등을 들 수 있다. 또한, SlTOM1d 유전자가 코드하는 단백질은, 예컨대 Solyc에 있어서, 액세션 번호: Solyc01g007900으로 등록되어 있는 아미노산 서열(서열 번호 11)을 포함하는 폴리펩티드 등을 들 수 있다.
SlTOM1d 유전자의 cDNA의 염기 서열(서열 번호 10, Solyc01g007900)
Figure pct00015
SlTOM1d 유전자가 코드하는 단백질(서열 번호 11, Solyc01g007900)
Figure pct00016
Figure pct00017
구체예로서, 상기 SlTOM1d 유전자는, 예컨대 하기 (ND)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 토바모바이러스 저항성 제어 유전자이다.
(ND) 하기 (ND1)∼(ND7)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
(ND1) 서열 번호 10의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
(ND2) 상기 (ND1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(ND3) 상기 (ND1)의 염기 서열에 대하여, 80% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(ND4) 상기 (ND1)의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(ND5) 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(ND6) 서열 번호 11의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(ND7) 서열 번호 11의 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
상기 (ND2)∼(ND4) 및 (ND6)∼(ND7)의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 「토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는」은, 예컨대 상기 (ND1) 또는 (ND5)와 동등한(유의차가 없는) 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는다는 것을 의미한다.
상기 (ND1)에 있어서, 서열 번호 10의 염기 서열은 (ND5)의 코드 서열이다. 서열 번호 10의 염기 서열은 예컨대 S. lycopersicum의 Heinz 1706으로부터 얻을 수 있다.
상기 (ND2)에 있어서, 「하나 혹은 여러 개」는, 예컨대 상기 (ND2)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 범위이면 된다. 상기 (ND2)의 「하나 혹은 여러 개」는, 상기 (ND1)의 염기 서열에 있어서, 예컨대 1∼264개, 1∼250개, 1∼198개, 1∼187개, 1∼132개, 1∼125개, 1∼66개, 1∼62개, 1∼52개, 1∼50개, 1∼39개, 1∼37,1∼26개, 1∼25개, 1∼13개, 1∼12개, 1∼6개, 1∼3개, 1 또는 2개, 1개이다.
상기 (ND3)에 있어서, 「동일성」은, 예컨대 상기 (ND3)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 범위이면 된다. 상기 (ND3)의 동일성은, 상기 (ND1)의 염기 서열에 대하여, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이다.
상기 (ND4)에 있어서, 「하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드」는, 예컨대 상기 (ND1)의 폴리뉴클레오티드에 대하여, 완전 또는 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드이다. 상기 하이브리다이즈는 예컨대 각종 하이브리다이제이션 어세이에 의해 검출할 수 있다. 상기 하이브리다이제이션 어세이는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대 잠브룩(Sambrook) 등 편 「몰레큘러 클로닝: 어 라보라토리 매뉴얼 제2판(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.)」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕 등에 기재되어 있는 방법을 채용할 수도 있다. 상기 (ND4)에 있어서, 「스트린젠트 조건」은 예컨대 상술한 설명을 원용할 수 있다.
상기 (ND5)의 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 상기 (ND5)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 염기 서열이면 된다. 상기 (ND5)의 폴리뉴클레오티드의 염기 서열은, 예컨대 상기 서열 번호 11의 아미노산 서열에 기초하여, 대응하는 코돈으로 치환함으로써 설계할 수 있다.
상기 (ND6)에 있어서, 아미노산 서열에 관한 「하나 혹은 여러 개」는, 예컨대 상기 (ND6)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 범위이면 된다. 상기 (ND6)의 「하나 혹은 여러 개」는, 예컨대 상기 서열 번호 11의 아미노산 서열에 있어서, 예컨대 1∼59개, 1∼58개, 1∼44개, 1∼43개, 1∼30개, 1∼29개, 1∼15개, 1∼14개, 1∼11개, 1∼8개, 1∼6개, 1∼5개, 1∼3개, 1 또는 2개, 1개이다.
상기 (ND7)에 있어서, 아미노산 서열에 관한 「동일성」은, 예컨대 상기 (ND7)의 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드되는 단백질이 상기 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 범위이면 된다. 상기 (ND7)의 동일성은, 상기 서열 번호 11의 아미노산 서열에 대하여, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이다.
본 발명에 있어서, 「기능 상실」은, 예컨대 상기 유전자가 원래 갖는 기능이 (유의하게) 저하하거나 또는 잃어버린 상태를 의미한다. 즉, 본 발명에 있어서, 「기능 상실 변이」(loss of function mutation)는, 상기 유전자가 본래 갖는 기능이 (유의하게) 감약하는 변이 및 완전한 기능 상실이 생기는 변이의 어느 의미로 이용하여도 좋다. 또한, 상기 「완전한 기능 상실이 생기는 변이」는, 예컨대 눌 변이(null mutation) 또는 아모르프(amorph)라고 말할 수도 있다.
상기 SlTOM1 유전자군에 있어서의 각 유전자의 기능 상실은, 예컨대 상기 기능 상실 유전자를 갖는 토마토 식물이, 정상의 SlTOM1a 유전자, 정상의 SlTOM1b 유전자, 정상의 SlTOM1c 유전자 및 정상의 SlTOM1d 유전자를 갖는 토마토 식물(이하, 「야생형 토마토 식물」이라고도 한다)과 비교하여, 토바모바이러스 저항성을 보일 정도로, 상기 상기 유전자의 기능이 (유의하게) 저하하거나 또는 잃어버린 상태를 의미한다. 상기 유전자의 기능 상실은, 구체적으로는 예컨대 상기 유전자의 mRNA 혹은 상기 유전자가 코드하는 단백질의 발현량이 (유의하게) 저하한 상태 또는 상기 유전자의 mRNA 혹은 상기 유전자가 코드하는 단백질이 완전히 발현하지 않은 상태를 의미하여도 좋고, 기능적인 상기 유전자의 mRNA 혹은 상기 유전자가 코드하는 단백질의 발현량이 저하한 상태 또는 기능적인 상기 유전자의 mRNA 혹은 상기 유전자가 코드하는 단백질이 완전히 발현하지 않은 상태를 의미하여도 좋다. 이 때문에, 본 발명에 있어서, 상기 SlTOM1 유전자군에 있어서의 각 유전자의 기능 상실은, 각 유전자에 기능 상실 변이를 도입함으로써 실시하여도 좋고, 각 유전자의 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 실시하여도 좋다. 상기 「유전자의 발현을 억제」는, 유전자 전사의 억제라도 좋고, 단백질로의 번역 억제라도 좋다.
본 발명에 있어서, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자를 기능 상실한 저항성 토마토 식물은, 예컨대 SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자, SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자 및 SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자를 갖는다. 상기 저항성 토마토 식물은, 토바모바이러스에 대한 저항성이 더욱 향상되므로, SlTOM1b 유전자의 기능 상실 유전자를 갖더라도 좋다. 또, 본 발명은 이것에 제한되지 않고, 본 발명의 저항성 토마토 식물은, 예컨대 SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자, SlTOM1b 유전자의 기능 상실 유전자, SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자 및 SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 기능 상실 유전자를 갖더라도 좋다. 즉, 본 발명의 저항성 토마토 식물은, 예컨대 SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자를 기능 상실하고 있으면 된다. 또한, 본 발명의 저항성 토마토 식물은, SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자와, SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자, SlTOM1b 유전자의 기능 상실 유전자 및 SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 기능 상실 유전자를 갖더라도 좋다.
상기 SlTOM1 유전자군에 있어서의 각 유전자의 기능 상실은, 예컨대 SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자, SlTOM1c 유전자 및/또는 SlTOM1d 유전자에 대하여, 돌연변이, 보다 구체적으로는 기능 상실 변이를 도입함으로써 야기할 수 있다. 상기 돌연변이의 종류는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대 점 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 난센스 돌연변이, 프레임시프트 돌연변이, 넓은 범위에 있어서의 염기의 결실(라지 딜리션) 등을 들 수 있다. 상기 돌연변이는 예컨대 각 유전자의 일부 또는 전부의 결실을 생기게 하여도 좋다. 상기 프레임시프트 돌연변이는, 염기의 결실 또는 삽입이 일어나, 3개 조합의 해독 구조(코돈)가 틀어졌을 때에 생기는 변이이다. 상기 프레임시프트 돌연변이는, 염기쌍 치환의 변이와 비교하여, 유전자 기능에 미치는 영향이 매우 크다. 이것은, 상기 프레임시프트 돌연변이가 생기면, 상기 유전자에 있어서, 상기 프레임시프트 돌연변이가 도입된 부위 이후의 유전 암호가 대폭 틀어져, 아미노산이 변할 뿐만 아니라, 종결 코돈 등도 틀어져 버리기 때문이다.
각 유전자의 기능 상실 유전자는, 예컨대 상기 SlTOM1 유전자군에 있어서의 각 유전자의 정상 유전자의 염기 서열에 대하여, 하나 혹은 여러 개의 염기(이하, 「1 염기 이상」이라고도 한다)의 삽입, 결실 및/또는 치환 등의 변이가 도입된 유전자이다. 구체예로서, 상기 SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자는, 예컨대 SlTOM1a 유전자의 정상 유전자의 염기 서열에 대하여, 1 염기 이상의 삽입, 결실 및/또는 치환 등의 변이가 도입된 유전자이다. 상기 SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자에 있어서, 1 염기 이상은, 예컨대 상기 (NA2)에 있어서의 염기수의 설명을 원용할 수 있다. 상기 SlTOM1b 유전자의 기능 상실 유전자는, 예컨대 SlTOM1b 유전자의 정상 유전자의 염기 서열에 대하여, 1 염기 이상의 삽입, 결실 및/또는 치환 등의 변이가 도입된 유전자이다. 상기 SlTOM1b 유전자의 기능 상실 유전자에 있어서, 1 염기 이상은, 예컨대 상기 (NB2)에 있어서의 염기수의 설명을 원용할 수 있다. 상기 SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자는, 예컨대 SlTOM1c 유전자의 정상 유전자의 염기 서열에 대하여, 1 염기 이상의 삽입, 결실 및/또는 치환 등의 변이가 도입된 유전자이다. 상기 SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자에 있어서, 1 염기 이상은 예컨대 상기 (NC2)에 있어서의 염기수의 설명을 원용할 수 있다. 상기 SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자는, 예컨대 SlTOM1d 유전자의 정상 유전자의 염기 서열에 대하여, 1 염기 이상의 삽입, 결실 및/또는 치환 등의 변이가 도입된 유전자이다. 상기 SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자에 있어서, 1 염기 이상은, 예컨대 상기 (ND2)에 있어서의 염기수의 설명을 원용할 수 있다. 상기 프레임시프트 돌연변이는, 예컨대 3m+1 염기 또는 3m+2 염기(m은 0 이상의 정수)의 삽입 또는 결실에 의해 생긴다.
본 발명에 있어서, 상기 SlTOM1 유전자군에 있어서의 각 유전자로의 돌연변이는, 예컨대 대상 토마토 식물의 게놈에 있어서의 대상 유전자에 대하여, 통상의 방법에 의해 변이를 도입함으로써 야기할 수 있다. 상기 변이의 도입 방법은, 예컨대 상동 재조합; ZFN, TALEN, CRISPR-CAS9, CRISPR-CPF1 등을 이용한 게놈 편집 기술: 등에 의해 실시할 수 있다. 상기 변이의 도입 방법은, 예컨대 부위 특이적 돌연변이 유발법 등의 변이 도입법에 의해 실시하여도 좋다. 또한, 상기 변이의 도입 방법은, 예컨대 랜덤 돌연변이 유발법에 의해 실시하여도 좋다. 상기 랜덤 돌연변이 유발법은, 예컨대 α선, β선, γ선, X선 등의 방사선 조사 처리; 메탄술폰산에틸(EMS), 에티닐니트로소우레아(ENU) 등의 변이 유발제에 의한 화학 물질 처리; 중(重)이온빔 처리; 등을 들 수 있다. 상기 게놈 편집 기술을 이용한 변이의 도입 방법은 예컨대 후술하는 실시예 1을 참조할 수 있다. 구체적으로는 상기 게놈 편집 기술을 이용한 변이의 도입은, 예컨대 게놈 편집 기술을 구성하는 단백질 및 핵산, 또는 이들을 코드하는 벡터를 도입함으로써 실시할 수 있다. 상기 단백질은, 예컨대 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 효소를 들 수 있고, 구체예로서 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 등을 들 수 있다. 상기 핵산은 예컨대 crRNA 및 tracrRNA, 또는 이들이 링커를 통해 연결된 단일 가닥 핵산을 들 수 있다. 이 경우, 상기 핵산은, 예컨대 crRNA에 있어서의 표적 서열과 어닐링하는 염기 서열을, 각 유전자를 코드하는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 설계한다. 상기 핵산은, 1종류를 단독으로 이용하여도 좋고, 2종류 이상을 병용하여도 좋다. 상기 변이의 도입 방법은, 예컨대 부위 특이적 돌연변이 유발법 등의 변이 도입법에 의해 실시하여도 좋다.
상기 SlTOM1 유전자군에 있어서의 각 유전자의 기능 상실 유전자에 있어서의 변이의 위치는, 특별히 제한되지 않고, 상기 각 유전자와 관련된 임의의 영역으로 할 수 있다. 구체예로서, 상기 SlTOM1 유전자군에 있어서의 각 유전자의 기능 상실 유전자에 있어서의 변이의 위치는, 예컨대 상기 각 유전자의 프로모터 영역 등의 발현 제어 영역, 상기 각 유전자가 코드하는 단백질의 막 관통 영역, 리간드 결합 영역 등의 각 유전자가 코드하는 단백질을 코드하는 코딩 영역을 포함하는 엑손 영역, 상기 각 유전자가 코드하는 단백질을 코드하지 않는 비코드 영역(예컨대 인트론 영역, 인핸서 영역 등) 등을 들 수 있고, 바람직하게는 엑손 영역이다.
구체예로서, 상기 SlTOM1 유전자군에 있어서의 유전자가 SlTOM1a 유전자인 경우, 상기 변이의 위치는, 서열 번호 1의 염기 서열에 있어서, 1∼514번째, 바람직하게는 167∼514번째의 염기 또는 서열 번호 2의 염기 서열에 있어서, 1∼507번째, 바람직하게는 160∼507번째의 염기를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 SlTOM1 유전자군에 있어서의 유전자가 SlTOM1b 유전자인 경우, 상기 변이의 위치는, 서열 번호 4의 염기 서열에 있어서, 1∼224번째, 바람직하게는 156∼224번째의 염기 또는 서열 번호 5의 염기 서열에 있어서, 1∼224번째, 바람직하게는 156∼224번째의 염기를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 SlTOM1 유전자군에 있어서의 유전자가 SlTOM1c 유전자인 경우, 상기 변이의 위치는, 서열 번호 7의 염기 서열에 있어서, 1∼149번째, 바람직하게는 107∼149의 염기 또는 서열 번호 8의 염기 서열에 있어서, 1∼73번째, 바람직하게는 31∼73번째의 염기를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 SlTOM1 유전자군에 있어서의, 유전자가 SlTOM1d 유전자인 경우, 상기 변이의 위치는, 서열 번호 10의 염기 서열에 있어서, 1∼437번째, 88∼437번째의 염기를 포함하는 것이 바람직하다. 이들 변이의 위치에 도입되는 변이는 바람직하게는 난센스 돌연변이 또는 프레임시프트 돌연변이이다.
또한, SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자는, 예컨대 하기 (MA)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 들 수 있다.
(MA) 하기 (MA1)∼(MA5)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
(MA1) 상기 (NA1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
(MA2) 상기 (NA1)의 염기 서열에 대하여, 80% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
(MA3) 상기 (NA1)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
(MA4) 서열 번호 3의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(MA5) 서열 번호 3의 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
상기 (MA1)∼(MA5)의 폴리뉴클레오티드는, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖지 않는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다.
상기 (MA1)∼(MA5)의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 「토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖지 않는」은, 예컨대 상기 (NA1) 또는 (NA5)의 폴리뉴클레오티드가 코드하는 단백질과 비교하여, 토바모바이러스 저항성 제어 활성이 유의하게 억제되고 있음을 의미하며, 바람직하게는 토바모바이러스 저항성 제어 활성이 완전히 상실되어 있음을 의미한다.
상기 (MA1)의 「하나 혹은 여러 개」는, 상기 (NA1)의 염기 서열에 있어서, 예컨대 1∼264개, 1∼198개, 1∼132개, 1∼66개, 1∼52개, 1∼39개, 1∼26개, 1∼13개, 1∼6개, 1∼3개, 1 또는 2개, 1개이다.
상기 (MA2)의 동일성은, 상기 (NA1)의 염기 서열에 대하여, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이다.
상기 (MA3)에 있어서, 「하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드」는, 예컨대 상기 (NA1)의 폴리뉴클레오티드에 대하여, 완전 또는 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드이다. 상기 하이브리다이즈는 예컨대 각종 하이브리다이제이션 어세이에 의해 검출할 수 있다. 상기 하이브리다이제이션 어세이는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대 잠브룩(Sambrook) 등 편 「몰레큘러 클로닝: 어 라보라토리 매뉴얼 제2판(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.)」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕 등에 기재되어 있는 방법을 채용할 수도 있다. 상기 (MA3)에 있어서, 「스트린젠트 조건」은 예컨대 상술한 설명을 원용할 수 있다.
상기 (MA4)의 「하나 혹은 여러 개」는, 예컨대 상기 서열 번호 3의 아미노산 서열에 있어서, 예컨대 1∼59개, 1∼44개, 1∼30개, 1∼15개, 1∼11개, 1∼8개, 1∼6개, 1∼3개, 1 또는 2개, 1개이다.
상기 (MA5)의 동일성은, 상기 서열 번호 3의 아미노산 서열에 대하여, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이다.
구체예로서, 상기 SlTOM1b 유전자의 기능 상실 유전자는 예컨대 하기 (MB)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자이다.
(MB) 하기 (MB1)∼(MB5)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
(MB1) 상기 (NB1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
(MB2) 상기 (NB1)의 염기 서열에 대하여, 80% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
(MB3) 상기 (NB1)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
(MB4) 서열 번호 6의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(MB5) 서열 번호 6의 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
상기 (MB1)∼(MB5)의 폴리뉴클레오티드는, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖지 않는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다.
상기 (MB1)∼(MB5)의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 「토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖지 않는」은, 예컨대 상기 (NB1) 또는 (NB5)의 폴리뉴클레오티드가 코드하는 단백질과 비교하여, 토바모바이러스 저항성 제어 활성이 유의하게 억제되고 있음을 의미하며, 바람직하게는 토바모바이러스 저항성 제어 활성이 완전히 상실되어 있음을 의미한다.
상기 (MB1)의 「하나 혹은 여러 개」는, 상기 (NB1)의 염기 서열에 있어서, 예컨대 1∼264개, 1∼198개, 1∼132개, 1∼66개, 1∼52개, 1∼39개, 1∼26개, 1∼13개, 1∼6개, 1∼3개, 1 또는 2개, 1개이다.
상기 (MB2)의 동일성은, 상기 (NB1)의 염기 서열에 대하여, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이다.
상기 (MB3)에 있어서, 「하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드」는, 예컨대 상기 (NB1)의 폴리뉴클레오티드에 대하여, 완전 또는 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드이다. 상기 하이브리다이즈는 예컨대 각종 하이브리다이제이션 어세이에 의해 검출할 수 있다. 상기 하이브리다이제이션 어세이는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대 잠브룩(Sambrook) 등 편 「몰레큘러 클로닝: 어 라보라토리 매뉴얼 제2판(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.)」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕 등에 기재되어 있는 방법을 채용할 수도 있다. 상기 (MB3)에 있어서, 「스트린젠트 조건」은 예컨대 상술한 설명을 원용할 수 있다.
상기 (MB4)의 「하나 혹은 여러 개」는, 예컨대 상기 서열 번호 6의 아미노산 서열에 있어서, 예컨대 1∼59개, 1∼44개, 1∼30개, 1∼15개, 1∼11개, 1∼8개, 1∼6개, 1∼3개, 1 또는 2개, 1개이다.
상기 (MB5)의 동일성은, 상기 서열 번호 6의 아미노산 서열에 대하여, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이다.
구체예로서, 상기 SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자는 예컨대 하기 (MC)의 폴리뉴클레오티드이다.
(MC) 하기 (MC1)∼(MC5)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
(MC1) 상기 (NC1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
(MC2) 상기 (NC1)의 염기 서열에 대하여, 80% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
(MC3) 상기 (NC1)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
(MC4) 서열 번호 9의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(MC5) 서열 번호 9의 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
상기 (MC1)∼(MC5)의 폴리뉴클레오티드는, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖지 않는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다.
상기 (MC1)∼(MC5)의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 「토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖지 않는」은, 예컨대 상기 (NC1) 또는 (NC5)의 폴리뉴클레오티드가 코드하는 단백질과 비교하여, 토바모바이러스 저항성 제어 활성이 유의하게 억제되고 있음을 의미하며, 바람직하게는 토바모바이러스 저항성 제어 활성이 완전히 상실되어 있음을 의미한다.
상기 (MC1)의 「하나 혹은 여러 개」는, 상기 (NC1)의 염기 서열에 있어서, 예컨대 1∼264개, 1∼198개, 1∼132개, 1∼66개, 1∼52개, 1∼39개, 1∼26개, 1∼13개, 1∼6개, 1∼3개, 1 또는 2개, 1개이다.
상기 (MC2)의 동일성은, 상기 (NC1)의 염기 서열에 대하여, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이다.
상기 (MC3)에 있어서, 「하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드」는, 예컨대 상기 (NC1)의 폴리뉴클레오티드에 대하여, 완전 또는 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드이다. 상기 하이브리다이즈는 예컨대 각종 하이브리다이제이션 어세이에 의해 검출할 수 있다. 상기 하이브리다이제이션 어세이는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대 잠브룩(Sambrook) 등 편 「몰레큘러 클로닝: 어 라보라토리 매뉴얼 제2판(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.)」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕 등에 기재되어 있는 방법을 채용할 수도 있다. 상기 (MC3)에 있어서, 「스트린젠트 조건」은 예컨대 상술한 설명을 원용할 수 있다.
상기 (MC4)의 「하나 혹은 여러 개」는, 예컨대 상기 서열 번호 9의 아미노산 서열에 있어서, 예컨대 1∼59개, 1∼44개, 1∼30개, 1∼15개, 1∼11개, 1∼8개, 1∼6개, 1∼3개, 1 또는 2개, 1개이다.
상기 (MC5)의 동일성은, 상기 서열 번호 9의 아미노산 서열에 대하여, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이다.
구체예로서, 상기 SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자는 예컨대 하기 (MD)의 폴리뉴클레오티드이다.
(MD) 하기 (MD1)∼(MD5)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
(MD1) 상기 (ND1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
(MD2) 상기 (ND1)의 염기 서열에 대하여, 80% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
(MD3) 상기 (ND1)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
(MD4) 서열 번호 11의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(MD5) 서열 번호 11의 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
상기 (MD1)∼(MD5)의 폴리뉴클레오티드는, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖지 않는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다.
상기 (MD1)∼(MD5)의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 「토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖지 않는」은, 예컨대 상기 (ND1) 또는 (ND5)의 폴리뉴클레오티드가 코드하는 단백질과 비교하여, 토바모바이러스 저항성 제어 활성이 유의하게 억제되고 있음을 의미하며, 바람직하게는 토바모바이러스 저항성 제어 활성이 완전히 상실되어 있음을 의미한다.
상기 (MD1)의 「하나 혹은 여러 개」는, 상기 (ND1)의 염기 서열에 있어서, 예컨대 1∼264개, 1∼198개, 1∼132개, 1∼66개, 1∼52개, 1∼39개, 1∼26개, 1∼13개, 1∼6개, 1∼3개, 1 또는 2개, 1개이다.
상기 (MD2)의 동일성은, 상기 (ND1)의 염기 서열에 대하여, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이다.
상기 (MD3)에 있어서, 「하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드」는, 예컨대 상기 (ND1)의 폴리뉴클레오티드에 대하여, 완전 또는 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드이다. 상기 하이브리다이즈는 예컨대 각종 하이브리다이제이션 어세이에 의해 검출할 수 있다. 상기 하이브리다이제이션 어세이는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대 잠브룩(Sambrook) 등 편 「몰레큘러 클로닝: 어 라보라토리 매뉴얼 제2판(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.)」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕 등에 기재되어 있는 방법을 채용할 수도 있다. 상기 (MD3)에 있어서, 「스트린젠트 조건」은 예컨대 상술한 설명을 원용할 수 있다.
상기 (MD4)의 「하나 혹은 여러 개」는, 예컨대 상기 서열 번호 11의 아미노산 서열에 있어서, 예컨대 1∼59개, 1∼44개, 1∼30개, 1∼15개, 1∼11개, 1∼8개, 1∼6개, 1∼3개, 1 또는 2개, 1개이다.
상기 (MD5)의 동일성은, 상기 서열 번호 11의 아미노산 서열에 대하여, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이다.
본 발명에 있어서, 각 유전자의 유전자형은, 예컨대 본 발명의 저항성 토마토 식물이 토바모바이러스 저항성을 보이는 범위에서 임의의 유전자형으로 할 수 있다. 각 유전자의 유전자형은, 예컨대 정상 유전자의 호모 접합형이라도 좋고, 정상 유전자와 기능 상실 유전자의 헤테로 접합형이라도 좋고, 기능 상실 유전자의 호모 접합형이라도 좋다. 즉, SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자는, 예컨대 본 발명의 저항성 토마토 식물이 토바모바이러스 저항성을 보이는 범위에서, 각각 정상 유전자의 호모 접합형이라도 좋고, 정상 유전자와 기능 상실 유전자의 헤테로 접합형이라도 좋고, 기능 상실 유전자의 호모 접합형이라도 좋다.
각 유전자의 유전자형의 조합은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대 하기의 조합을 예시할 수 있다.
SlTOM1a 유전자(정상 유전자): A, SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자: a
SlTOM1b 유전자(정상 유전자): B, SlTOM1b 유전자의 기능 상실 유전자: b
SlTOM1c 유전자(정상 유전자): C, SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자: c
SlTOM1d 유전자(정상 유전자): D, SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자: d
(유전자형의 조합)
aaBBccdd, aaBbccdd, aabbccdd, aabbccDd, aaBbccDd, aaBBccDd
(바람직한 조합)
aaBBccdd, aaBbccdd, aabbccdd, aabbccDd
본 발명에 있어서, 토바모바이러스 저항성 유전자의 발현을 억제함으로써 각 유전자의 기능을 상실시키는 경우, 각 유전자의 기능 상실은, 예컨대 각 유전자의 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드를 대상 토마토 식물에 도입함으로써 실시할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 도입 방법은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대 RNA 간섭, 안티센스 RNA, 게놈 편집 기술 등의 방법에 의해 실시할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 등의 발현 카세트는, 예컨대 폴리에틸렌글리콜법, 전기천공법(일렉트로포레이션법), 아그로박테리움을 매개로 한 방법, 파티클건법 등에 의해 대상 토마토 식물에 도입할 수 있다. 상기 대상 토마토 식물은, 예컨대 식물 세포, 캘러스, 식물 조직 및 식물 개체의 어느 것이라도 좋다.
상기 발현 억제의 대상이 되는 유전자는 예컨대 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자이다. 상기 발현 억제의 대상이 되는 유전자는 예컨대 SlTOM1b 유전자를 포함하여도 좋다. 단, 본 발명은 이것에 한정되지 않고, 상기 발현 억제의 대상이 되는 유전자는, 예컨대 SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나라도 좋다. 또한, 상기 발현 억제의 대상이 되는 유전자는, 예컨대 SlTOM1d 유전자와, SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자 및 SlTOM1c 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나라도 좋다.
본 발명의 저항성 토마토 식물에 있어서, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자가 기능 상실되고 있지만, 본 발명은 이것에 한정되지 않고, SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나가 기능 상실되어 있어도 좋다. 또한, 상기 기능 상실한 유전자는, 예컨대 SlTOM1d 유전자와, SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자 및 SlTOM1c 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나라도 좋다.
본 발명의 저항성 토마토 식물은, 상술한 것과 같이, 야생형 SlTOM1 유전자군에 기능 상실 변이가 생김으로써 얻을 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 저항성 토마토 식물은 예컨대 「토바모바이러스 저항성을 보이는 토마토 식물의 변이체」라고 말할 수도 있다. 또한, 본 발명의 저항성 토마토 식물은, 「토바모바이러스 저항성을 보이는 토마토 식물의 변이체」의 후대 계통이며, 상기 SlTOM1 유전자군에 기능 상실 변이를 갖는 토마토 식물이라도 좋다. 본 발명의 토마토 식물은, 예컨대 SlTOM1 유전자군의 염기 서열에, 상술한 변이의 도입 방법에 의해서 도입된 유전적변이를 갖는 토마토 식물의 변이체라고 말할 수도 있다. 본 발명의 저항성 토마토 식물은, 예컨대 본질적으로 생물학적인 프로세스(an essentially biological process)의 수단에 의해서만 얻어진 토마토 식물을 제외한, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물이라고 말할 수도 있다.
본 발명의 저항성 토마토 식물의 제조 방법에 관해서는, 후술하는 부여 방법, 제2 생산 방법, 스크리닝 방법 및 제3 생산 방법의 설명을 원용할 수 있다.
<제1 생산 방법>
본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 생산 방법은 상술한 것과 같이 하기 (a) 공정을 포함한다:
(a) 본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물과 다른 토마토 식물을 교잡하는 공정.
본 발명의 제1 생산 방법은, 상기 (a) 공정에 있어서, 상기 본 발명의 저항성 토마토 식물을 이용하는 것이 특징이며, 그 밖의 공정 및 조건은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 제1 생산 방법에 의하면, 토바모바이러스 저항성을 보이는 토마토 식물을 생산할 수 있다. 본 발명의 제1 생산 방법은 상기 본 발명의 토마토 식물의 설명을 원용할 수 있다.
상기 (a) 공정에 있어서, 제1 부모로서 사용하는 식물은 상기 본 발명의 저항성 토마토 식물이면 된다. 상술한 것과 같이, 상기 본 발명의 저항성 토마토 식물은, 예컨대 후술하는 상기 본 발명의 부여 방법, 제2 생산 방법, 스크리닝 방법 및 제3 생산 방법에 의해 얻을 수도 있다. 이 때문에, 상기 본 발명의 제1 생산 방법은, 예컨대 상기 (a) 공정에 앞서서, 상기 본 발명의 부여 방법, 제2 생산 방법, 스크리닝 방법 및 제3 생산 방법의 어느 하나 이상을 실시하여도 좋다. 이 경우, 각 방법의 설명은 후술하는 각 방법의 설명을 원용할 수 있다.
구체예로서, 본 발명의 제1 생산 방법은 하기 (x) 공정 또는 (y) 공정을 포함하여도 좋다.
(x) 피검 토마토 식물로부터 본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물을 선발하는 공정(선발 공정)
(y) 대상 토마토 식물로부터 본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물을 만들어내는 공정(창출 공정)
상기 (x) 공정에 있어서, 상기 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 선발은, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자를 기능 상실한 토마토 식물의 선발이라고 말할 수 있다. 이 때문에, 상기 (x) 공정은 예컨대 하기 (x1) 공정 및 (x2) 공정에 의해 행할 수 있다.
(x1) 상기 피검 토마토 식물의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자가 기능 상실되어 있는지를 검출하는 검출 공정
(x2) 상기 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자가 기능 상실한 경우, 상기 피검 토마토 식물을 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하는 선발 공정
상기 (x) 공정이 상기 (x1) 공정 및 (x2) 공정을 포함하는 경우, 상기 (x) 공정은, 예컨대 각 유전자의 염기 서열을 지표로 실시하여도 좋고, 각 유전자의 발현량을 지표로 실시하여도 좋다.
각 유전자의 염기 서열을 지표로 하는 경우, 상기 (x1) 공정에 있어서, 상기 각 유전자의 기능 상실의 검출은, 예컨대 상기 피검 토마토 식물의 각 유전자의 염기 서열을 해독하여, 대응하는 정상 유전자의 염기 서열과 비교함으로써 실시하여도 좋다. 상기 염기 서열의 해독은 예컨대 시퀀서를 이용하여 실시할 수 있다. 그리고, 상기 (x2) 공정에서는, 예컨대 상기 피검 토마토 식물의 각 유전자의 염기 서열이, 각각 대응하는 정상 유전자의 염기 서열에 대하여, 기능 상실 변이가 도입된 염기 서열인 경우, 상기 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발한다. 상기 선발의 조건에 관해서는 후술한다. 상기 정상 유전자의 염기 서열은 상술한 각 유전자의 염기 서열을 참조할 수 있다. 상기 염기 서열의 비교는, 예컨대 염기 서열의 해석 소프트웨어(예컨대 상술한 BLAST 등)에 의해 실시할 수 있다. 상기 (x2) 공정에 있어서, 염기 서열을 비교하는 영역은, 각 유전자의 인트론 영역이라도 좋고, 각 유전자의 엑손 영역이라도 좋지만, 바람직하게는 후자이다. 또한, 상기 각 유전자의 기능 상실이, 각각 대응하는 정상 유전자의 염기 서열에 대하여, 1 염기 이상의 삽입, 결실 및/또는 치환 등의 변이를 도입함으로써 야기되는 경우, 상기 (x1) 공정에서는, 예컨대 적어도 하나의 변이를 검출할 수 있는 프라이머 셋트, 프로브 또는 이들의 조합을 이용하여 실시하여도 좋다. 상기 프라이머 셋트 및 프로브는, 예컨대 상기 변이의 종류에 기초하여, 공지된 설계 방법을 이용하여 설계할 수 있다.
상기 (x2) 공정에서는, 예컨대 각 유전자의 정상 유전자에 대하여, 1 염기 이상의 삽입, 결실 및/또는 치환되어 있는 경우, 상기 유전자를 기능 상실 유전자라고 판단하여도 좋다. 또한, 상기 (x2) 공정에서는, 예컨대 각 유전자의 정상 유전자에 대하여, 프레임시프트 돌연변이가 도입되어 있는 경우, 상기 유전자를 기능 상실 유전자라고 판단하여도 좋다. 또한, 상기 (x2) 공정에서는, 예컨대 각 유전자의 정상 유전자가 부분 결실 또는 완전 결실되어 있는 경우, 상기 유전자를 기능 상실 유전자라고 판단하여도 좋다.
상기 (x2) 공정에서는, 또한 각 유전자의 유전자형에 기초하여 선발하여도 좋다. 구체예로서, 상기 (x2) 공정에서는, 상기 각 유전자의 유전자형이 상술한 유전자형의 조합에 해당하는 경우, 상기 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하여도 좋다. 구체예로서, 상기 (x2) 공정에서는, 예컨대 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 관해서, 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 갖는 경우, 상기 피검 토마토 식물을 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하여도 좋다. 또한, 상기 (x2) 공정에서는, 예컨대 SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 관해서, 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 갖는 경우, 상기 피검 토마토 식물을 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하여도 좋다.
각 유전자의 발현량을 지표로 하는 경우, 상기 (x1) 공정에 있어서, 상기 각 유전자의 기능 상실의 검출은, 예컨대 상기 피검 토마토 식물의 각 유전자의 mRNA 또는 각 유전자가 코드하는 단백질의 기능을 검출함으로써 실시하여도 좋다. 또한, 상기 (x1) 공정에 있어서, 상기 각 유전자의 기능 상실의 검출은, 예컨대 상기 피검 토마토 식물에 있어서의 각 유전자 혹은 각 유전자가 코드하는 단백질의 발현 유무, 또는 각 유전자 혹은 각 유전자가 코드하는 단백질의 발현량을 검출함으로써 실시하여도 좋다.
상기 (x) 공정에 있어서, 상기 각 유전자 혹은 각 유전자가 코드하는 단백질의 발현에 기초하여 판단하는 경우, 상기 (x1) 공정에서는, 예컨대 상기 피검 토마토 식물의 생체 시료에 있어서의 각 유전자 및 각 유전자가 코드하는 단백질의 적어도 한쪽의 발현량을 측정한다. 그리고, 상기 (x2) 공정에 있어서, 상기 피검 토마토 식물의 생체 시료에 있어서의 각 유전자 및 각 유전자가 코드하는 단백질의 적어도 한쪽의 발현량과 기준치에 기초하여, 상기 각 유전자에 관해서 기능 상실한 식물을 선발한다. 구체적으로 상기 (x2) 공정에서는, 상기 피검 토마토 식물에 있어서, 기능 상실한 식물의 선발은, 예컨대 상기 피검 토마토 식물의 생체 시료에 있어서의 각 유전자 및 각 유전자가 코드하는 단백질의 적어도 한쪽의 발현량과 상기 기준치를 비교함으로써 실시할 수 있다.
상기 피검 토마토 식물의 생체 시료는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대 상기 피검 토마토 식물의 식물 개체 및 상기 식물 개체의 부분 어느 것이라도 좋다. 상기 (x1) 공정에서 사용하는 생체 시료의 종류는, 예컨대 1종류라도 좋고, 2종류 이상이라도 좋다.
상기 (x1) 공정에 있어서, 각 유전자의 발현량은, 예컨대 반정량적 PCR, 정량적 PCR, 노던 블로팅, 디지털 PCR, RNA 시퀀스 해석(RNAseq) 등에 의해 측정할 수 있다. 또한, 상기 (x1) 공정에 있어서, 각 유전자가 코드하는 단백질의 발현량은, 예컨대 자외흡수법, 비신코닌산법 등의 분광광도계를 이용한 방법, ELISA, 웨스턴 블로팅 등의 단백질의 정량 방법에 의해 측정할 수 있다.
상기 기준치는, 예컨대 상기 야생형 토마토 식물에 있어서의 각 유전자 또는 각 유전자가 코드하는 단백질의 발현량, 대상으로 하는 각 유전자와 대응하는 유전자에 관해서, 기능 상실한 식물(예컨대 SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자, SlTOM1c 유전자 및/또는 SlTOM1d 유전자를 완전 결실한 토마토 식물)에 있어서의 각 유전자 또는 각 유전자가 코드하는 단백질의 발현량 등을 들 수 있다. 상기 기준치로서 상기 기능 상실한 식물에 있어서의 각 유전자의 발현량을 이용하는 경우, 상기 기능 상실한 식물은, 예컨대 한 쌍의 염색체 상의 각각에 자리잡는 2개의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자, SlTOM1c 유전자 및/또는 SlTOM1d 유전자 중, 어느 한쪽의 유전자에 관해서 기능 상실한 식물이라도 좋고, 양쪽의 유전자에 관해서 기능 상실한 식물이라도 좋다. 상기 기준치로 하는 각 유전자 또는 각 유전자가 코드하는 단백질의 발현량은, 예컨대 상기 피검 토마토 식물의 생체 시료와 동일한 조건으로 채취한 생체 시료에 있어서의 각 유전자 또는 각 유전자가 코드하는 단백질의 발현량을, 상기 피검 토마토 식물의 생체 시료와 같은 방법으로 측정함으로써 얻을 수 있다. 상기 기준치는, 예컨대 미리 측정하여도 좋고, 상기 피검 토마토 식물의 생체 시료와 동시에 측정하여도 좋다.
이 경우, 상기 (x2) 공정에 있어서, 상기 피검 토마토 식물에 있어서의 각 유전자에 관해서, 기능 상실되어 있는지의 평가 방법은, 특별히 제한되지 않고, 상기 기준치의 종류에 따라서 적절하게 결정할 수 있다. 구체예로서, 상기 피검 토마토 식물의 생체 시료에 있어서의 각 유전자의 발현량이, 대응하는 야생형 토마토 식물에 있어서의 대응하는 유전자의 발현량보다 낮은 경우, 상기 유전자에 관해서, 기능 상실한 식물에 있어서의 상기 유전자의 발현량과 동일한 경우(유의차가 없는 경우) 및/또는 기능 상실한 식물에 있어서의 유전자의 발현량보다 낮은 경우, 상기 피검 토마토 식물은, 예컨대 상기 유전자에 관해서 기능 상실했다고 평가할 수 있다. 또한, 상기 피검 토마토 식물의 생체 시료에 있어서의 각 유전자가 코드하는 단백질의 발현량이, 대응하는 야생형 토마토 식물에 있어서의 대응하는 유전자가 코드하는 단백질의 발현량보다 낮은 경우, 상기 피검 토마토 식물은, 예컨대 상기 유전자에 관해서, 기능 상실한 식물에 있어서의 상기 유전자가 코드하는 단백질의 발현량과 동일한 경우(유의차가 없는 경우) 및/또는 기능 상실한 식물에 있어서의 유전자가 코드하는 단백질의 발현량보다 낮은 경우, 상기 피검 토마토 식물은, 예컨대 상기 유전자에 관해서 기능 상실했다고 평가할 수 있다. 그리고, 상기 (x2) 공정에서는, 예컨대 상기 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 관해서 기능 상실되어 있다고 평가된 토마토 식물을, 상기 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발한다.
상기 (x2) 공정에서는, 예컨대 각 유전자의 발현량에 기초하여, 각 유전자의 유전자형을 평가하여도 좋고, 구체예로서 정상 유전자의 호모 접합형인지, 정상 유전자와 기능 상실 유전자의 헤테로 접합형인지, 기능 상실 유전자의 호모 접합형인지를 평가하여도 좋다. 이 경우, 상기 기준치로서, 각각 야생형 토마토 식물, 한 쌍의 염색체 상의 각각에 자리잡는 2개의 유전자 중, 한쪽이 정상 유전자이고, 다른 쪽이 기능 상실 유전자인 토마토 식물(헤테로 접합형의 토마토 식물), 한 쌍의 염색체 상의 각각에 자리잡는 2개의 유전자 양자가 모두 기능 상실 유전자인 토마토 식물(기능 상실의 호모 접합형 토마토 식물)을 이용함으로써 실시할 수 있다. 구체적으로는 상기 (x2) 공정에 있어서, 피검 토마토 식물에 있어서의 대상 유전자의 발현량이, 야생형 토마토 식물, 헤테로 접합형의 토마토 식물, 또는 기능 상실의 호모 접합형 토마토 식물에 있어서의 대상 유전자의 발현량과 동등한 경우, 상기 피검 토마토 식물은, 예컨대 동등한 발현량을 갖는 토마토 식물과 같은 유전자형인 것이라고 평가할 수 있다.
더욱이, 상기 (x2) 공정에서는, 얻어진 각 유전자의 유전자형의 평가에 입각하여 선발하여도 좋다. 구체예로서, 상기 (x2) 공정에서는, 상기 각 유전자의 유전자형이 상술한 유전자형의 조합에 해당하는 경우, 상기 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하여도 좋다. 구체예로서, 상기 (x2) 공정에서는, 예컨대 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 관해서, 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 갖는 경우, 상기 피검 토마토 식물을 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하여도 좋다. 또한, 상기 (x2) 공정에서는, 예컨대 SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자 및 SlTOM1c 유전자에 관해서, 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 갖고, SlTOM1d 유전자에 관해서, 기능 상실 유전자를 헤테로 접합형으로 갖는 경우, 상기 피검 토마토 식물을 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하여도 좋다. 또한, 상기 (x2) 공정에서는, 예컨대 SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 관해서, 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 갖는 경우, 상기 피검 토마토 식물을 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하여도 좋다.
상기 (x) 공정에 있어서의 선발에서는, SlTOM1b 유전자를 기능 상실한 토바모바이러스 저항성 토마토 식물을 선발하여도 좋다. 이 경우, 상기 (x1) 공정은, 상기 피검 토마토 식물의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자가 기능 상실되어 있는지를 검출하는 검출 공정이다. 또한, 상기 (x2) 공정은, 상기 SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자가 기능 상실한 경우, 상기 피검 토마토 식물을 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하는 공정이다. 또, 본 발명은 이것에 한정되지는 않으며, 상기 (x) 공정에서는, 피검 토마토 식물로부터 SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나를 기능 상실한 식물을 선발하여도 좋다. 또한, 상기 (x) 공정에서는, SlTOM1d 유전자와, SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자 및 SlTOM1c 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나를 기능 상실한 식물을 선발하여도 좋다.
상기 (y) 공정은, 예컨대 대상 토마토 식물의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자를 기능 상실시키는 공정(기능 상실 공정)이라고 말할 수도 있다. 상기 기능 상실 공정은, 후술하는 본 발명의 부여 방법에 있어서의 기능 상실 공정의 설명을 원용할 수 있다.
이어서, 상기 (a) 공정에 있어서, 다른 쪽의 부모로서 사용하는 토마토 식물은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대 기지의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물(예컨대 Tm-22를 갖는 토마토 식물)이라도 좋고, 다른 저항성을 갖는 토마토 식물이라도 좋고, 상기 본 발명의 저항성 토마토 식물이라도 좋다.
상기 (a) 공정에 있어서, 상기 토바모바이러스 저항성 토마토 식물과 상기 다른 토마토 식물을 교잡하는 방법은, 특별히 제한되지 않고, 공지된 방법을 채용할 수 있다.
상기 (b) 공정에 있어서, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물을 선발하는 대상은, 예컨대 상기 (a) 공정으로부터 얻어진 토마토 식물이라도 좋고, 또한 그 토마토 식물로부터 얻어진 후대 계통이라도 좋다. 구체적으로 상기 대상은, 예컨대 상기 (a) 공정의 교잡에 의해서 얻어진 F1의 토마토 식물이라도 좋고, 그 후대 계통이라도 좋다. 상기 후대 계통은, 예컨대 상기 (a) 공정의 교잡에 의해서 얻어진 F1의 토마토 식물의 자식(自殖) 교잡 후대 또는 여교잡 후대라도 좋고, 상기 F1의 토마토 식물 등의 후대 계통의 토마토 식물과 다른 토마토 식물을 교잡함으로써 얻어진 토마토 식물이라도 좋다.
상기 (b) 공정에 있어서, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 선발은, 예컨대 토바모바이러스 저항성을 직접적 또는 간접적으로 확인함으로써 선발할 수 있다.
상기 (b) 공정에 있어서, 상기 직접적인 확인은, 얻어진 상기 F1의 토마토 식물 또는 그 후대 계통에 관해서, 예컨대 상기 참고정보 1에 기재된 병징을 참조하여, 사상 잎 형성의 유무 및/또는 생육 지연의 유무에 의해 판단할 수 있다. 상기 사상 잎은, 예컨대 잎의 일부가 위축하여 사상 형태를 보이는 것을 의미하고, 구체예로서, 상기 참고정보 1에 있어서의 Symptoms of ToBRFV(German DSMZ isolate) on Solanum lycopersicum cv. 'moneymaker' obtained by artificial inoculation under quarantine facilities (France, 2019)의 예를 참조할 수 있다. 피검 토마토 식물이 토바모바이러스에 감염한 경우, 상기 피검 토마토 식물에서는, 예컨대 사상 잎의 형성 및/또는 생육 지연이 관찰된다. 이 때문에, 상기 피검 토마토 식물이 사상 잎을 형성하고 있는 경우 및/또는 생육 지연하고 있는 경우, 상기 피검 토마토 식물은, 토바모바이러스에 걸린, 즉, 이병성이라고 평가할 수 있다. 다른 한편, 상기 피검 토마토 식물이 사상 잎을 형성하지 않은 경우 및/또는 생육 지연하지 않은 경우, 상기 피검 토마토 식물은, 토바모바이러스에 걸리지 않은, 즉, 저항성이라고 평가할 수 있다. 상기 생육 지연은, 토바모바이러스에 감염되지 않은 토마토 식물(예컨대 토바모바이러스 미접종의 개체)와 비교함으로써 평가하여도 좋고, 상기 피검 토마토 식물의 재배 일수를 감안하여, 일반적인 토마토 식물의 생육 상태와 비교함으로써 평가하여도 좋다. 상기 (b) 공정에 있어서, 상기 직접적인 확인은, 예컨대 후술하는 실시예 2의 방법에 준하여, 토마토 식물의 발병 지수를 평가하여, 상기 발병 지수로부터 산출하는 발병도에 의해 평가하는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 「토바모바이러스 저항성」 및 「토바모바이러스 이병성」은 상술한 기준에 기초하여 평가할 수 있다.
또한, 상기 (b) 공정에 있어서, 상기 간접적인 확인에 의한 선발은 예컨대 하기 (b1) 및 (b2) 공정에 의해서 선발할 수 있다.
(b1) 상기 (a) 공정으로부터 피검 토마토 식물의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자가 기능 상실되어 있는지를 검출하는 검출 공정
(b2) 상기 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자가 기능 상실한 경우, 상기 피검 토마토 식물을 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하는 선발 공정
상기 (b) 공정에 있어서의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 선발은, 예컨대 상기 (x) 공정에서 설명한 방법과 같은 식이며, 상기 (b1) 공정은 상기 (x1) 공정과 같은 식으로, 상기 (b2) 공정은 상기 (x2) 공정과 같은 식으로 실시할 수 있다.
본 발명의 제조 방법은, 상기 (b) 공정에서 선발된 토바모바이러스 저항성 토마토 식물을 또한 육성하는 것이 바람직하다. 상기 토마토 식물의 육성 조건 및 육성 방법은, 예컨대 상기 토마토 식물의 성장 단계 및 상기 토마토 식물의 품종에 따라서 적절하게 결정할 수 있다. 상기 육성에서는 예컨대 상기 토마토 식물의 임의의 성장 단계까지 생육하여도 좋다.
이와 같이, 상기 (b) 공정에서는, 상기 토바모바이러스 저항성이 확인된 상기 토마토 식물 또는 그 후대 계통을, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발할 수 있다.
본 발명의 제조 방법은, 또한 교잡에 의해 얻어진 상기 후대 계통으로부터 종자를 채취하는 채종(採種) 공정을 포함하여도 좋다.
<부여 방법>
본 발명의 토마토 식물에 있어서의 토바모바이러스 저항성 부여 방법은, 상술한 것과 같이, 대상 토마토 식물의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자를 기능 상실시키는 기능 상실 공정을 포함한다. 본 발명의 부여 방법은, 대상 토마토 식물의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자를 기능 상실시키는 것이 특징이며, 그 밖의 공정 및 조건은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 부여 방법에 의하면, 토마토 식물에 토바모바이러스 저항성을 부여할 수 있다. 본 발명의 부여 방법은 상기 본 발명의 저항성 토마토 식물 및 제1 생산 방법의 설명을 원용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상술한 것과 같이, 상기 SlTOM1 유전자군에 있어서의 각 유전자의 기능 상실은, 각 유전자에 기능 상실 변이를 도입함으로써 실시하여도 좋고, 각 유전자의 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 실시하여도 좋고, 대상 토마토 식물과 본 발명의 토마토 식물을 교잡함으로써 실시하여도 좋다. 상기 교잡에 의해 실시하는 경우, 본 발명의 부여 방법은 예컨대 상기 본 발명의 제1 생산 방법과 같은 식으로 실시할 수 있다.
각 유전자에 기능 상실 변이를 도입하는 경우, 상기 기능 상실 공정에서는, 예컨대 대상 토마토 식물의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 기능 상실 변이를 도입한다. 상기 대상 토마토 식물은, 예컨대 한 쌍의 염색체 각각에, 상기 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자를 갖는다. 이 때문에, 상기 기능 상실 공정에서는, 예컨대 상기 대상 토마토 식물에 있어서의 한 쌍의 염색체의 상기 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자 중, 어느 한쪽의 염색체의 상기 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 관해서 기능 상실시키더라도 좋고, 양쪽 염색체의 상기 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 관해서 기능 상실시키더라도 좋지만, 후자가 바람직하다. 상기 기능 상실 공정에서는, 상기 각 유전자의 유전자형이 상술한 유전자형의 조합에 해당하도록 기능 상실 변이를 도입하는 것이 바람직하다. 구체예로서, 상기 기능 상실 공정에서는, 예컨대 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 관해서, 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 갖도록 기능 상실 변이를 도입한다. 또한, 상기 기능 상실 공정에서는, 한 쌍의 SlTOM1a 유전자, 한 쌍의 SlTOM1b 유전자 및 한 쌍의 SlTOM1c 유전자에 관해서 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 갖고, 한 쌍의 SlTOM1d 유전자에 관해서 기능 상실 유전자를 헤테로 접합형으로 갖도록 기능 상실 변이를 도입한다. 또한, 상기 기능 상실 공정에서는, 예컨대 SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 관해서 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 갖도록 기능 상실 변이를 도입한다.
각 유전자의 기능 상실은, 예컨대 상술한 것과 같이 돌연변이를 도입함으로써 실시할 수 있다. 상기 돌연변이는, 예컨대 상술한 설명을 원용할 수 있으며, 바람직하게는 난센스 돌연변이 또는 프레임시프트 돌연변이이다. 상기 기능 상실 변이는, 예컨대 각 유전자(각 유전자의 염기 서열)에 대하여, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가함으로써 도입하여도 좋고, 바람직하게는 각 유전자의 정상 유전자를 부분 결실 또는 완전 결실시킴으로써 도입한다.
상기 기능 상실 공정에 있어서, 각 유전자에 기능 상실 변이를 도입하는 영역은, 각 유전자의 인트론 영역이라도 좋고, 엑손 영역이라도 좋지만, 바람직하게는 후자이다.
상기 각 유전자의 기능 상실은, 예컨대 대상 토마토 식물의 대상 유전자에 대하여, 통상의 방법에 의해 변이를 도입함으로써 야기할 수 있다. 상기 변이의 도입 방법은, 예컨대 상동 재조합; ZFN, TALEN, CRISPR-CAS9, CRISPR-CPF1 등을 이용한 게놈 편집 기술: 등에 의해 실시할 수 있다. 상기 게놈 편집 기술을 이용한 변이의 도입 방법은 예컨대 후술하는 실시예 1을 참조할 수 있다. 또한, 상기 변이의 도입 방법은 예컨대 랜덤 돌연변이 유발법에 의해 실시하여도 좋다. 상기 랜덤 돌연변이 유발법은, 예컨대 α선, β선, γ선, X선 등의 방사선 조사 처리; 메탄술폰산에틸(EMS), 에티닐니트로소우레아(ENU) 등의 변이 유발제에 의한 화학 물질 처리; 중이온빔 처리; 등을 들 수 있다. 또, 상술한 각 변이의 도입 방법은 예컨대 시판 키트 등을 이용하여 실시하여도 좋다.
상기 대상 토마토 식물은 예컨대 식물 세포, 캘러스, 식물 조직 및 식물 개체의 어느 것이라도 좋다.
본 발명의 부여 방법에서는, 상기 기능 상실 공정 후에, 상기 각 유전자에 기능 상실 변이가 도입되어 있는 식물을 선발하는 것이 바람직하다. 상기 선발 대상 토마토 식물은, 예컨대 상기 기능 상실 공정에서 얻어진 토마토 식물이라도 좋고, 그 후대 계통이라도 좋다. 상기 선발은, 예컨대 상술한 (x) 공정과 같은 식으로 실시할 수 있으며, 그 설명을 원용할 수 있다.
이어서, 각 유전자의 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드의 도입 방법은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대 RNA 간섭, 안티센스 RNA, 게놈 편집 기술 등의 방법에 의해 실시할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 등의 발현 카세트는, 예컨대 폴리에틸렌글리콜법, 전기천공법(일렉트로포레이션법), 아그로박테리움을 매개로 한 방법, 파티클건법 등에 의해 대상 토마토 식물에 도입할 수 있다. 상기 대상 토마토 식물은 예컨대 식물 세포, 캘러스, 식물 조직 및 식물 개체의 어느 것이라도 좋다.
<제2 생산 방법>
본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 생산 방법은, 상술한 것과 같이, 대상 토마토 식물에 토바모바이러스 저항성을 부여하는 부여 공정을 포함하고, 상기 부여 공정은, 상기 본 발명의 토마토 식물에 있어서의 토바모바이러스 저항성 부여 방법에 의해 실시된다. 본 발명의 제2 생산 방법은, 상기 부여 공정을, 상기 본 발명의 토마토 식물에 있어서의 토바모바이러스 저항성 부여 방법에 의해 실시하는 것이 특징이며, 그 밖의 공정 및 조건은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 제2 생산 방법에 의하면, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물을 생산할 수 있다. 본 발명의 제2 생산 방법은, 상기 본 발명의 저항성 토마토 식물, 제1 생산 방법 및 부여 방법의 설명을 원용할 수 있다.
<스크리닝 방법>
본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 스크리닝 방법은, 상술한 것과 같이, 피검 토마토 식물로부터 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d를 기능 상실한 피검 토마토 식물을, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하는 선발 공정을 포함한다. 본 발명의 스크리닝 방법은, 상기 선발 공정에 있어서, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d의 기능 상실을 지표로 하는 것이 특징이며, 그 밖의 공정 및 조건은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의하면, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물을 스크리닝할 수 있다. 본 발명의 스크리닝 방법은, 상기 본 발명의 저항성 토마토 식물, 제1 생산 방법 및 부여 방법의 설명을 원용할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 선발 공정은, 상기 (x) 공정과 같은 식으로 실시할 수 있으며, 그 설명을 원용할 수 있다.
<제3 생산 방법>
본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 생산 방법은, 상술한 것과 같이, 피검 토마토 식물로부터 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 관해서, 기능 상실한, 피검 토마토 식물을 스크리닝하는 스크리닝 공정을 포함하고, 상기 스크리닝 공정은, 상기 본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 스크리닝 방법에 의해 실시된다. 본 발명의 제3 생산 방법은, 상기 스크리닝 공정을 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 실시하는 것이 특징이며, 그 밖의 공정 및 조건은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 제3 생산 방법은, 상기 본 발명의 저항성 토마토 식물, 제1 생산 방법, 부여 방법 및 스크리닝 방법의 설명을 원용할 수 있다.
<제2 토마토 식물>
본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물(이하, 「제2 토마토 식물」이라고도 한다)은, 상기 본 발명의 제1 생산 방법, 제2 생산 방법 또는 제3 생산 방법에 의해 얻을 수 있다. 본 발명의 제2 토마토 식물은, 상기 본 발명의 제1 생산 방법, 제2 생산 방법 또는 제3 생산 방법에 의해 얻어지는 것이 특징이며, 그 밖의 구성 및 조건은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 제2 토마토 식물은, 상기 본 발명의 저항성 토마토 식물, 제1 생산 방법, 부여 방법, 제2 생산 방법, 스크리닝 방법 및 제3 생산 방법의 설명을 원용할 수 있다.
<가공 식품>
본 발명의 식물의 가공 식품은, 상술한 것과 같이, 본 발명의 토바모바이러스 저항성 토마토 식물을 이용한다. 본 발명의 식물의 가공 식품은, 가공 대상 토마토 식물로서 상기 본 발명의 저항성 토마토 식물을 이용하는 것이 특징이며, 그 밖의 구성 및 조건은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 가공 식품은, 상기 본 발명의 저항성 토마토 식물, 제1 생산 방법, 부여 방법, 제2 생산 방법, 스크리닝 방법, 제3 생산 방법 및 제2 토마토 식물의 설명을 원용할 수 있다.
본 발명의 가공 식품에 있어서, 「가공」은 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 토마토 식물에 대한 임의의 처리를 의미한다. 구체예로서, 상기 가공은, 예컨대 절단, 슬라이스, 민싱(mincing), 체로 거르기, 건조, 통조림, 병조림, 세정, 포장, 냉동, 가열, 조미 등을 들 수 있다. 상기 가공 식품의 제조에 있어서 실시하는 가공은, 한 종류라도 좋고, 여러 종류라도 좋다. 또한, 상기 가공 식품의 제조에 있어서는, 동일한 처리를 한 번 실시하여도 좋고, 여러 번 실시하여도 좋다.
<검출 방법>
본 발명의 토마토 식물의 토바모바이러스 저항성 검출 방법은, 상술한 것과 같이, 피검 토마토 식물에 있어서, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 기능 상실되어 있는지를 검출하는 검출 공정을 포함한다. 본 발명의 검출 방법은, 상기 검출 공정에 있어서, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자가 기능 상실되어 있는지를 검출하는 것이 특징이며, 그 밖의 공정 및 조건은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 검출 방법에 의하면, 피검 토마토 식물이 토바모바이러스 저항성을 갖고 있는지 여부를 검출할 수 있다. 본 발명의 검출 방법은, 상기 본 발명의 저항성 토마토 식물, 제1 생산 방법, 부여 방법, 제2 생산 방법, 스크리닝 방법, 제3 생산 방법 및 제2 토마토 식물의 설명을 원용할 수 있다.
본 발명의 검출 방법은, 예컨대 피검 토마토 식물의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 관해서 기능 결실 변이를 검출하는 검출 공정을 포함한다. 상기 검출 공정은, 예컨대 상기 본 발명의 제1 생산 방법의 선발 공정에 있어서의 (x) 공정 또는 상기 간접적인 선발의 설명을 원용할 수 있다. 구체예로서, 상기 검출 공정에서는, 예컨대 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 관해서 유전자 발현 또는 그 염기 서열을 검출한다. 상기 검출 공정에서는, 예컨대 또한 SlTOM1b 유전자에 관해서 유전자 발현 또는 그 염기 서열을 검출한다.
본 발명의 검출 방법은, 또한 상기 유전자 발현 또는 염기 서열에 기초하여, 상기 피검 토마토 식물의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자가 정상 유전자인지 기능 상실 유전자인지를 판정하는 판정 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 판정 공정은, 예컨대 상기 피검 토마토 식물의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자를, 각각 대응하는 야생형 토마토 식물의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자와 비교함으로써 판정할 수 있다. 구체적으로 상기 판정 공정에서는, 상기 피검 토마토 식물의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자가, 야생형 토마토 식물의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자와 동일한 염기 서열을 갖고 있거나, 기능 상실 변이가 아닌 변이를 갖고 있는 경우, 상기 피검 토마토 식물의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자는 정상 유전자라고 판정할 수 있다. 다른 한편, 상기 판정 공정에서는, 상기 피검 토마토 식물의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자가 기능 상실 변이를 갖고 있는 경우, 상기 피검 토마토 식물의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자는 기능 상실 유전자라고 판정할 수 있다. 본 발명의 검출 방법이 상기 검출 공정에 있어서, SlTOM1b 유전자에 관해서 기능 결실 변이를 검출하는 경우, 본 발명의 검출 방법은, 또한 상기 유전자 발현 또는 염기 서열에 기초하여, 상기 피검 토마토 식물의 SlTOM1b 유전자가 정상 유전자인지 기능 상실 유전자인지를 판정하는 판정 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 판정 공정에서는, 상기 피검 토마토 식물의 SlTOM1b 유전자가, 야생형 토마토 식물의 SlTOM1b 유전자와 동일한 염기 서열을 갖고 있거나, 기능 상실 변이가 아닌 변이를 갖고 있는 경우, 상기 피검 토마토 식물의 SlTOM1b 유전자는 정상 유전자라고 판정할 수 있다. 다른 한편, 상기 판정 공정에서는, 상기 피검 토마토 식물의 SlTOM1b 유전자가 기능 상실 변이를 갖고 있는 경우, 상기 피검 토마토 식물의 SlTOM1b 유전자는 기능 상실 유전자라고 판정할 수 있다. 또, 상기 검출 공정에서는, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자를 지표로 했지만, 본 발명은 이것에 한정되지 않고, 예컨대 SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자를 지표로 하여도 좋다.
실시예
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 실시예에 기재된 양태에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
본 발명의 토마토 식물이 토바모바이러스 저항성을 보이는 것을 확인했다.
(1) 기능 상실 변이의 도입
SlTOM1a∼d 유전자에의 기능 상실 변이의 도입은 CRISPR-CAS9 시스템을 이용한 게놈 편집 기술에 의해 실시했다. 구체적으로 식물 세포에 도입하는 발현 벡터로서는, T-DNA 상에 Cas9 및 가이드 서열 삽입 부위를 갖는 바이너리 벡터인 pDe-Cas9_Kan(참고문헌 2)을 이용했다. 또한, 각 유전자에 대한 guide RNA 서열의 설계는 CRISPR-P 프로그램(참고문헌 3)을 이용하여 실시했다. 얻어진 후보 guide RNA에 있어서, 오프 타겟 부위(표적 이외의 부위)의 절단이 일어나기 어렵다고 예상된 guide RNA 서열을 선택했다. 그리고, 정제 Cas9 단백질과 선택한 후보 guide RNA와 표적 서열을 갖는 DNA를 이용하여, 시험관 내에서 표적 서열을 갖는 DNA의 절단 활성을 검토하여, 절단 활성을 갖는 guide RNA 서열을, 후술하는 토마토 식물에 도입하는 guide RNA로서 이용했다.
참고문헌 2: Friedrich Fauser et. al., “Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana”, The Plant Journal, 2014, vol. 79, pages 348-359
참고문헌 3: Yang Lei et. al, “CRISPR-P: A Web Tool for Synthetic Single-Guide RNA Design of CRISPR-System in Plants”, Molecular Plant, 2014, vol. 7, pages 1494-1496
각 유전자에 대한 guide RNA의 서열 및 프로토스페이서 인접 모티브(PAM)는 하기와 같다. 또, 하기 서열에 있어서, 밑줄로 나타내는 염기 서열이 PAM이다.
·SlTOM1a 유전자 및 SlTOM1d 유전자용 guide RNA의 표적 서열
5'-GTTGTGAAGAATGCAAGACTTGG-3'(서열 번호 12)
·SlTOM1b 유전자용 guide RNA의 표적 서열
5'-TCAAAGATGGGGCGAACTCGTGG-3'(서열 번호 13)
·SlTOM1c 유전자용 guide RNA의 표적 서열
5'-GCCGATTGACATCGCCGGTCCGG-3'(서열 번호 14)
이어서, 선발한 3종류의 guide RNA 서열을, 각각 U6 프로모터 하류에 삽입한 유전자 카세트를 제작했다. 얻어진 유전자 카세트를, pDe-Cas9_Kan 벡터의 클로닝 부위에 탠덤으로(3종류의 guide RNA 서열이 연속하여 배치되도록) 삽입하여, Cas9 및 guide RNA의 발현 벡터를 제작했다. 또한, 얻어진 발현 벡터를, 아그로박테리움을 이용하여 토마토 식물(GCR26 계통: ToMV 감수성)의 자엽편(子葉片)에 도입했다. 그리고, T-DNA 상의 선택 마커 nptII에 의한 카나마이신 내성을 지표로 한 선발을 행한 후, 캘러스 유도(callus induction), 슈트 유도(shoot induction) 및 발근(發根)을 거쳐 형질 전환체(T0 세대)를 취득했다. 토마토의 형질 전환에 관련한 일련의 조작은 참고문헌 4의 방법에 따라서 실시했다.
참고문헌 4: Hyeon-Jin Sun et. al, “A Highly Efficient Transformation Protocol”, Plant Cell Physiol., 2006, vol. 47, No. 3, pages 426-431
얻어진 T0 식물의 각 개체로부터 게놈 DNA를 통상의 방법에 의해 정제했다. 그리고, 상기 게놈 DNA에 있어서, SlTOM1c 유전자의 표적 부위 부근의 변이 유무에 관해서, Cleaved Amplified Polymorphic Sequence(CAPS)를 이용한 방법(참고문헌 5)에 의해 검출했다. 또한, 상기 게놈 DNA에 있어서, SlTOM1a 유전자, SlTOM1b 유전자 및 SlTOM1d 유전자의 표적 부위 부근의 변이 유무에 관해서, T7 엔도뉴클레아제 1을 이용한 방법(참고문헌 6)에 의해 검출했다. 이 결과, 11개의 독립된 캘러스로부터 얻은 18 줄기의 슈트에 있어서, 어느 하나 이상의 SlTOM1 유전자군에 변이가 생겼음이 시사되었다.
참고문헌 5: Andrzej Konieczny et. al., “A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers.”, The Plant Journal, 1993, vol. 4, No. 2, pages 403-410
참고문헌 6: Lena Vouillot et.al., “Comparison of T7E1 and Surveyor Mismatch Cleavage Assays to Detect Mutations Triggered by Engineered Nucleases”, 2015, vol. 5, No. 3, pages 407-415
이어서, 상기 18 줄기의 슈트에 유래하는 식물 개체(T0 세대)에 관해서, 자식(自殖)시켜, 4주(#4d, #47, #57, #106)로부터 T1 종자를 채종할 수 있었다. 여기서, 상기 4주는 각각 별도의 캘러스에 유래한다. 얻어진 T1 종자를 파종 및 생육 후, 얻어진 T1 식물의 각 개체로부터 게놈 DNA를 통상의 방법에 의해 정제했다. 그리고, 각 개체의 게놈 DNA의 표적 서열 부근의 염기 서열을 결정했다. 그 결과, 3주의 T0 식물(#47, #57, #106) 유래의 T1 식물에 변이가 발견되었다. 이들 3 계통 중 1 계통에 있어서, T1 식물에 Cas9 유전자와 nptII 유전자가 발견되었다. 다른 한편, 후의 2 계통(#57-1, #106-1)에는, 어느 유전자도 적어도 완전한 형태로는 존재하지 않았다(PCR로 검정). 또, Cas9 유전자 및 nptII 유전자의 검출은 PCR에 의해 실시했다. 상기 2 계통(#57-1, #106-1)의 결과를 하기 표 1에 나타낸다. 하기 표 1에 나타내는 것과 같이, T1 식물 #57-1-3에서는, SlTOM1b 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에, 각각 5, 1 및 2 염기의 결실에 의한 프레임시프트 돌연변이가 생겼다, 즉, 기능 상실 변이가 도입되어 있었다. 또한, T1 식물 #106-1-4에서는, SlTOM1a 유전자 및 SlTOM1c 유전자에, 1 염기의 삽입에 의한 프레임시프트 돌연변이가 생겼다, 즉, 기능 상실 변이가 도입되어 있었다. 또, 후술하는 해석으로부터 분명한 것과 같이, 모두 엑손 영역에 대하여 변이가 도입되어 있었다.
Figure pct00018
이어서, T1 식물 #57-1-3 및 #106-1-4와 상술한 피(被)형질 전환 식물(GCR26 계통)을 교잡하고, 얻어진 후대 계통으로부터 Sltom1a-1(#106-1-4 유래), Sltom1b-1(#57-1-3 유래), Sltom1c-1(#57-1-3 유래) 및 Sltom1d-1(#57-1-3 유래) 변이에 관해서, 다양한 조합으로 갖는 계통(시험 계통)을 확립했다. 후대 계통의 제노타이핑에는, 프래그먼트 해석(증폭 프래그먼트 장다형(長多型)의 DNA 시퀀서에 의한 해석), CAPS 해석, dCAPS(derived cleaved amplified polymorphic sequence, 참고문헌 7) 해석, DNA 시퀀싱 해석을 병용했다. 각 변이 얼릴(mutant allele)의 결과를 이하에 나타낸다.
참고문헌 7: Michael M. Neff et. al., “dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics”, The Plant Journal, 1998, vol. 14, No. 3, pages 387-392
(각 변이 얼릴)
·SlTOM1a의 변이 얼릴
SlTOM1ad 공통 가이드 서열(상보 가닥): CCAAGT-CTTGCATTCTTCACAAC(서열 번호 15)
Sltom1a-1(106-1-4 유래)(ins1): ATGCCAAGTACTTGCATTCTTCACAACTTT(서열 번호 16)
Sltom1a-1의 아미노산 서열: M P S(프레임시프트 돌연변이)
아미노산 잔기 번호(전체 길이 295 잔기): 105
·SlTOM1b의 변이 얼릴
SlTOM1b 가이드 서열(상보 가닥): CCACGAGTTCGCCCCATCTTTGA(서열 번호 17)
Sltom1b-1(57-1-3 유래)(del5): ACACCACGAG-----CCCATCTTTGATTG(서열 번호 18)
Sltom1b-1의 아미노산 서열: T P R(프레임시프트 돌연변이)
아미노산 잔기 번호(전체 길이 297 잔기): 21
·SlTOM1c의 변이 얼릴
SlTOM1c 가이드 서열: GCCGATTGACATCGCCGGTCCGG(서열 번호 19)
Sltom1c-1(57-1-3 유래)(del1): TCGCCGATTGACATCGCC-GTCCGGTGA(서열 번호 20)
Sltom1c-1의 아미노산 서열: S P I D I A(프레임시프트 돌연변이)
(서열 번호 21)
아미노산 잔기 번호(전체 길이 288 잔기): 14
·SlTOM1d의 변이 얼릴
SlTOM1ad 공통 가이드 서열(상보 가닥): CCAAGTCTTGCATTCTTCACAAC(서열 번호 22)
Sltom1d-1(57-1-3 유래)(del2): ATGCCAAGT--TGCATTCTTCACAACTTT(서열 번호 23)
Sltom1d-1의 아미노산 서열: M P S(프레임시프트 돌연변이)
아미노산 잔기 번호(전체 길이295 잔기): 105
·약어
del: 결실, ins: 삽입, -: 결실 염기
밑줄은 PAM을 나타낸다.
(2) 토바모바이러스 저항성의 검토
상기 시험 계통의 종자에 관해서, 흡수 후, 파종하여, 자엽을 전개시켰다. 그리고, 흡수 후 10일째의 시험 계통의 자엽에, 정제된 토마토 모자이크바이러스(ToMV-L, 참고문헌 8에서의 tobacco mosaic virus tomato strain (L))(0.1 g/l)를, 자엽 한 장 당 약 10 μl가 되도록 자엽 전면에 도포하여 접종한 후, 물로 씻어 냈다. 여기서, ToMV-L의 게놈 염기 서열은, Genbank 액세션 번호: X02144로 등록되어 있는 염기 서열을 포함한다. 상기 접종 후에 7일간 또 배양했다. 또한, 상기 배양은, 인공 기상측기를 이용하여, 25℃(Constant), 16시간 명기(明期), 8시간 암기(暗期)의 조건 하에서 실시했다. 상기 배양 후, 접종한 자엽(접종엽)으로 샘플을 조제하여, 접종엽에 있어서의 바이러스 외피 단백질(CP)의 축적을 검토했다. 구체적으로는, 상기 접종엽의 약 반(약 20 mg)을 지르코니아 볼(직경 3 mm) 2개가 들어간 1.5 ml 튜브로 회수했다. 그리고, 추출 버퍼 30 μl를 첨가하여, 파쇄 처리(Qiagen Tissue Lyser 「매초 28회, 30초」를 2회)를 실시했다. 상기 추출 버퍼의 조성은, 225 mmol/l Tris-HCl pH 7.5, 2.5 mmol/l EDTA-Na pH 8 및 1 mg/ml 아스코르브산으로 했다. 얻어진 파쇄물을 원심하고, 잔사를 튜브의 바닥에 모으고 나서, 물로 4배 희석한 겔 샘플 버퍼 120 μl를 첨가하여, 혼합했다. 상기 겔 샘플 버퍼의 조성은, 0.624 mol/l Tris-HCl pH 6.8, 0.2 g/ml SDS, 0.8 mg/ml 브로모페놀 블루, 10% (vol/vol) 글리세롤 및 1 mol/l DTT로 했다. 재차 원심 후(23℃, 14 krpm, 5 min), 상청을 SDS-PAGE용의 샘플로 했다. 얻어진 샘플에 관해서, SDS-PAGE를 행한 후, 쿠마시 브릴리언트 블루(CBB) 염색하여, CP의 축적을 확인했다. 또한, 시험 계통 대신에 야생형주로서 GCR26 계통을 이용한 것 이외에는, 같은 식으로 CP의 축적을 확인했다. 이들 결과를 도 1에 도시한다.
참고문헌 8: Takeshi OHNO et. al., “Nucleotide sequence of the tobacco mosaic virus (tomato strain) genome and comparison with the common strain genome.”, 1984, J. Biochem., vol. 96, No. 6 pages 1915-1923
도 1은 CBB 염색 후의 염색도를 도시하는 사진이다. 도 1에 있어서, (A)는 1중 변이체, 2중 변이체 및 야생형의 결과를 도시하고, (B)는 2중 변이체 및 야생형의 결과를 도시하고, (C)는 3중 변이체, 4중 변이체 및 야생형의 결과를 도시한다. 도 1의 (A)∼(C)에 있어서, 사진의 상부는 각 시험 계통의 유전자형 및 비접종(별표(*))을 나타내고, 사진의 하부는 샘플 유래 시험 계통의 주명(株命)을 나타낸다. 또, 도 1의 (A)∼(C)에 있어서, Sltom1a-1, Sltom1b-1, Sltom1c-1 및 Sltom1d-1의 변이 얼릴을 갖는 시험 계통에 관해서, 각각 a, b, c, d를 이용하여 도시하고 있다. 구체예로서, 시험 계통이 Δaa인 경우, 상기 시험 계통은 SlTOM1a의 양 얼릴이 변이 얼릴(Sltom1a-1)이다.
도 1의 (A)에 도시하는 것과 같이, SlTOM1a∼d 유전자 중 1종류의 유전자에 관해서 기능 상실한 경우, ToMV CP의 축적 정도는, 야생형의 개체와 같은 정도로, 현저한 영향을 주지 않았다. 또한, 도 1의 (A) 및 (B)에 도시하는 것과 같이, SlTOM1a∼d 유전자 중 2종류의 유전자에 관해서 기능 상실한 경우, ToMV CP의 축적 정도는 야생형주와 비교하여 약간 감소했다. 또한, 도 1의 (B) 및 (C)에 도시하는 것과 같이, 3중 변이체에서는, Δaaccdd < Δaabbcc < Δaabbdd < Δbbccdd의 순으로 ToMV CP의 축적이 높아졌다. 특히 Δaaccdd의 삼중 변이체에서는 CP의 축적이 거의 보이지 않았다. 또한, Δaabbccdd의 4중 변이체에서는 CP의 축적은 보이지 않았다. 이들 결과로부터, ToMV 증식에의 기여는, SlTOM1a 유전자 > SlTOM1c 유전자 > SlTOM1d 유전자 > SlTOM1b 유전자의 순으로 작아지는 것을 알 수 있었다. 또, Δaadd주에 있어서의 CP 축적은 Δaabbdd주에 있어서의 CP 축적보다 현저히 고레벨이었던 점 및 Δaacc주에 있어서의 CP 축적은 Δaabbcc주에 있어서의 CP 축적보다 현저히 고레벨이었던 점으로부터, 기여가 가장 작다고 생각되는 SlTOM1b도 ToMV의 증식에의 기여가 제로는 아니라는 것을 알 수 있다. 또한, 상기 고찰과 일치하도록, 2중 변이주 Δaabb주, Δaacc주 및 Δaadd주에서는, ToMV CP의 축적은 야생형주보다 약간 낮게 억제되었다.
이상의 점으로부터, Δaaccdd의 3중 변이체 또는 Δaabbccdd의 4중 변이체로 함으로써, 토바모바이러스에 대하여 강한 저항성을 보이는 것을 알 수 있었다.
이어서, ToBRFV를 이용하여 마찬가지로 저항성의 검토를 했다. 우선, T7 RNA 폴리메라아제 프로모터의 하류에, ToBRFV 게놈(비특허문헌 2, Genbank 액세션 번호: KX619418)의 완전 길이(full-length)의 cDNA를 갖는 유전자 카세트를 제작하고, 시험관내 전사에 의해 감염성 RNA를 합성했다. 또, 완전 길이의 cDNA는 화학 합성에 의해 제작했다. 이어서, 얻어진 감염성 RNA를 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에 접종했다. 접종 후 8일째에 바이러스의 증식을 확인후, 접종엽 및 상엽(上葉)을 베어내고, 생중량(生重量)의 2배 용량의 인산 완충액(0.1 mol/l, pH 7)과 함께 파쇄했다. 또한, 얻어진 파쇄물을, 생중량의 18배 용량의 물로 희석하여, 이것을 접종원(接種源)으로서 이용했다.
그리고, ToMV 대신에 ToBRFV를 접종한 것 이외에는 ToMV의 접종과 같은 식으로 하여 상기 시험 계통의 자엽에 접종했다. 그리고, 접종 후 7일째의 접종엽에 있어서의 외피 단백질의 축적을 마찬가지로 검토했다. 또한, 상기 시험 계통 대신에 야생형주로서 GCR26 계통을 이용하고, ToMV 저항성(Tm-22)주로서 GCR267 계통을 이용했다. 또한 바이러스로서, ToBRFV에 더하여 ToMV를 이용한 것 이외에는, 같은 식으로 CP의 축적을 확인했다. 이들 결과를 도 2에 도시한다.
도 2는 CBB 염색 후의 염색도를 도시하는 사진이다. 도 2에서, (A)는 1중 변이체, 2중 변이체, 야생형, Tm-22주 및 3중 변이체의 결과를 도시하고, (B)는 2중 변이체, 야생형, Tm-22주 및 3중 변이체의 결과를 도시하고, (C)는 3중 변이체, 4중 변이체, 야생형 및 Tm-22주의 결과를 도시한다. 도 2의 (A)∼(C)에 있어서, 사진의 상부는 각 시험 계통의 유전자형 및 비접종(별표(*))을 나타내고, 사진의 하부는 샘플 유래 시험 계통의 주명 및 접종한 바이러스의 종류를 나타낸다. 또, 도 2의 (A)∼(C)에 있어서, Sltom1a-1, Sltom1b-1, Sltom1c-1 및 Sltom1d-1의 변이 얼릴을 갖는 시험 계통에 관해서, 각각 a, b, c, d를 이용하여 나타내고 있다. 구체예로서, 시험 계통이 Δaa인 경우, 상기 시험 계통은 SlTOM1a의 양 얼릴이 변이 얼릴(Sltom1a-1)이다.
도 2의 (A)∼(C)에 도시하는 것과 같이, Tm-22주는, ToMV를 접종한 경우, CP의 축적이 보이지 않고, 저항성을 보였다. 다른 한편, Tm-22주에서는, ToBRFV를 접종한 경우, CP의 축적이 보여, ToBRFV는 Tm-22주의 토바모바이러스 저항성을 타파하는 것을 확인했다. 또한, 도 2의 (A)∼(C)에 도시하는 것과 같이, Δaabbccdd의 4중 변이체 및 Δaaccdd의 3중 변이체에서는, ToBRFV를 접종한 경우에 있어서도 CP의 축적은 볼 수 없었다. 다른 한편, Δaabbcc, Δaabbdd 또는 Δbbccdd의 3중 변이체에서는, ToBRFV를 접종한 경우에 있어서, CP의 축적이 보이고, 또한 Δaabbcc < Δaabbdd < Δbbccdd의 순으로 높은 CP의 축적을 볼 수 있었다. 더욱이, Δaaccdd의 3중 변이체 및 Δaabbcc의 3중 변이체에 있어서의 CP의 축적량을 웨스턴 블롯으로 비교한 바, Δaaccdd의 3중 변이체에 있어서의 CP의 축적은 검출 한계 이하이며, Δaabbcc의 3중 변이체에 있어서의 CP의 축적량을 기준으로 하여, 1/100∼1/10 이하인 것을 알 수 있었다. 또, 상기 웨스턴 블롯 해석에 있어서의 CP 축적의 검출 한계는, 도 2의 (C)에 도시하는, 87-7의 제4 주(Δaabbcc의 3중 변이체)에 있어서의 CP 축적의 1/100 정도였다.
또한, 데이터는 도시하지 않지만, 접종 후 21일째의 비접종 상엽을 조사하면, Δaabbccdd의 4중 변이체에서는, 접종한 6주의 어디에서도 CP의 축적은 볼 수 없었다. 또한, Δaaccdd의 3중 변이체에서는, 접종한 6주 중 3주에서 매우 낮은 레벨의 축적이 보이고, 다른 3주에서는 CP는 검출되지 않았다. 또한, Δaabbcc, Δaabbdd 또는 Δbbccdd의 3중 변이체에서는, CP는 현저히 축적되어 있었다. 더욱이, CP 축적이 보였던 Δaaccdd의 3중 변이체의 3주 및 Δaabbcc의 3중 변이체에 있어서의 CP의 축적량을 비교한 바, Δaaccdd의 3중 변이체에 있어서의 CP의 축적량은 Δaabbcc의 3중 변이체에 있어서의 CP의 축적량을 넘는 일은 없었다.
이상의 결과로부터, ToBRFV의 증식에의 기여는, ToMV의 경우와 마찬가지로 SlTOM1a 유전자 > SlTOM1c 유전자 > SlTOM1d 유전자 > SlTOM1b 유전자의 순으로 작게 되는 것을 알 수 있었다. 또한, Δaaccdd의 3중 변이체 또는 Δaabbccdd의 4중 변이체로 함으로써, ToBRFV에 대하여도 강한 저항성을 보이는 것을 알 수 있었다.
(3) 병징의 검토
야생형주와, Δaabbcc, Δaabbdd, Δaaccdd 및 Δbbccdd의 3중 변이체와, Δaabbccdd의 4중 변이체와, Tm-22주에 관해서, 상기 실시예 1(2)와 같은 식으로 흡수한 후, 파종했다. 그리고, 상기 실시예 1(2)와 같은 식으로 하여, 흡수 후 10일째에 ToBRFV를 접종했다. 그리고, 또 20일간 배양하여, 토바모바이러스의 병징이 나타났는지를 검토했다. 또한, Tm-22주에 ToMV를 접종한 것 이외에는 같은 식으로 하여 토바모바이러스의 병징을 검토했다. 이들 결과를 도 3에 도시한다.
도 3은 토바모바이러스 접종 후 20일째에 있어서의 각 식물을 도시하는 사진이다. 도 3에서 (A)는 ToMV 또는 ToBRFV를 접종한 Tm-22주를 도시하고, (B)는 ToBRFV를 접종한 야생형주 및 Δaabbccdd의 4중 변이주(Δabcd)의 결과를 도시하고, (C)는 ToBRFV를 접종한 Δaabbcc의 3중 변이체(Δabc) 및 Δaabbdd의 3중 변이체(Δabd)의 결과를 도시하고, (D)는 ToBRFV를 접종한 Δbbccdd의 3중 변이체(Δbcd) 및 Δaaccdd의 3중 변이체(Δacd)의 결과를 도시한다. 도 3의 (A) 및 (B)에 도시하는 것과 같이, ToBRFV를 접종한 야생형주 및 Tm-22주는 심한 병징을 보이고, 특징적인 사엽(絲葉) 증상을 보였다. 또한, Δaabbcc, Δaabbdd 및 Δbbccdd의 3중 변이체에 관해서도 접종 후 20일째에는 특징적인 사엽 증상을 보였다. 다른 한편, ToBRFV의 증식을 볼 수 없거나 또는 매우 낮은 레벨이었던 Δaaccdd의 3중 변이체 및 Δaabbccdd의 4중 변이체는, 접종 후 20일째에서도 병징을 보이지 않았다. 이들 결과로부터, Δaaccdd의 3중 변이체 또는 Δaabbccdd의 4중 변이체로 함으로써, ToBRFV의 병징도 억제 가능하다는 것을 알 수 있었다.
(4) 변이체 생육의 검토
Δaaccdd의 3중 변이체 및 Δaabbccdd의 4중 변이체는 토바모바이러스에 대하여 강한 저항성을 갖는 것을 알 수 있었다. 그래서, 이들 변이체가 통상의 재배 조건으로 정상으로 생육하여, 과실(果實)을 맺는지를 확인했다.
야생형주와 Δaaccdd의 3중 변이체와 Δaabbccdd의 4중 변이체에 관해서, 상기 실시예 1(2)와 같은 식으로 흡수 후, 파종했다. 상기 파종 후, 육묘 및 포트에의 정식(定植)을 행하여 재배했다. 그리고, 흡수 후 24, 39, 70 및 79일에 있어서의 식물체의 모습 및 79일째에서의 착과(着果)를 검토했다. 이들 결과를 도 4에 도시한다.
도 4는 야생형주 및 변이체의 생육 및 과실 형성을 도시하는 사진이다. 도 4에 있어서, (A)는 흡수 후 24일째의 상태를 도시하고, (B)는 흡수 후 39일째의 상태를 도시하고, (C)는 흡수 후 70일째의 상태를 도시하고, (D)는 흡수 후 79일째의 상태를 도시하고, (E)는 흡수 후 79일째에 있어서의 과실의 상태를 도시한다. 도 4의 (A)∼(D)에 도시하는 것과 같이, 어느 변이체의 생육은 대략 야생형주와 같았다. 또한, 도 4의 (D) 및 (E)에 도시하는 것과 같이, 어느 변이체의 과실의 형성도 대략 야생형주와 같았다.
이상의 점으로부터, 본 발명의 토마토 식물은 토바모바이러스 저항성을 보이는 것을 알 수 있었다.
[실시예 2]
본 발명의 토마토 식물이 토바모바이러스 저항성을 보이는 것을 확인했다.
(1) 발병 지수에 의한 저항성의 평가-1
야생형주와, Δaabbcc, Δaabbdd, Δaaccdd 및 Δbbccdd의 3중 변이체와, Δaabbccdd의 4중 변이체에 관해서, 상기 실시예 1(2)와 같은 식으로 흡수 후, 파종했다. 그리고, 상기 실시예 1(2)와 같은 식으로 하여, 흡수 후 10일째에 ToBRFV를 접종했다. 그리고, 상술한 조건으로 또 21∼22일간 배양하고, 생육한 토마토 식물에 관해서 이하와 같이 발병 조사를 실시했다.
발병 조사는 발병 지수를 이하의 기준에 따라서 평가함으로써 실시했다. 또한, 발병 지수의 평가 기준으로서 발병 지수 0∼3인 개체의 대표예를 도 5의 사진에 나타낸다(모두 토마토의 자엽에 ToBRFV를 접종하고, 21일 후에 비접종 상엽의 사진을 촬영한 것). 또, 도 5에서, 화살표 X로 나타내는 부분이 잎의 위축이 보이는 부위이고, 화살표 Y로 나타내는 둘러싼 영역이 사엽의 발생이 보이는 부위이다.
발병 지수 0: 무병징
발병 지수 1: 경미한 잎의 위축
발병 지수 2: 경미한 사엽의 발생과 잎의 위축
발병 지수 3: 명확한 사엽의 발생과 잎의 위축
그리고, 각 개체에 관해서, 각각 상기 기준에 따라서 발병 지수를 조사하여, 하기 식으로부터 각 계통의 발병도를 구했다.
발병도(N)=[(0×n0)+(1×n1)+(2×n2)+(3×n3)]/조사 개체수
상기 식에 있어서, 「0, 1, 2, 3」은 각각 발병 지수를 나타내고, 「n0, n1, n2, n3」은 각각 발병 지수 0, 발병 지수 1, 발병 지수 2, 발병 지수 3의 개체수를 나타낸다.
이들 결과를 하기 표 2에 나타낸다. 하기 표 2는 각 유전자형의 토마토 식물에 있어서의 각 발병 지수의 개체수 및 발병도를 나타낸다. 하기 표 2에 나타내는 것과 같이, Δaaccdd의 3중 변이체 또는 Δaabbccdd의 4중 변이체로 함으로써, 발병도가 1 미만으로 되어, ToBRFV에 대하여도 강한 저항성을 보이는 것을 알 수 있었다.
Figure pct00019
(2) 발병 지수에 의한 저항성의 평가-2
이어서, 야생형주와 Δaabbcc, Δaabbdd, Δaaccdd 및 Δbbccdd의 3중 변이체 대신에 ΔaaBBccDD(ww), ΔaaBbccDD(hw), ΔaabbccDD(mw), ΔaaBBccDd(wh), ΔaaBbccDd(hh), ΔaabbccDd(mh), ΔaaBBccdd(wm) 및 ΔaaBbccdd(hm)의 변이체를 이용한 것 이외에는, 상기 실시예 2(1)와 같은 식으로 하여 발병도를 평가했다. 여기서, A는 야생형의 SlTOM1a 유전자를 의미하고, B는 야생형의 SlTOM1b 유전자를 의미하고, C는 야생형의 SlTOM1c 유전자를 의미하고, D는 야생형의 SlTOM1d 유전자를 의미한다. 이 결과를 하기 표 3에 나타낸다.
Figure pct00020
상기 표 3은 각 유전자형 토마토 식물에 있어서의 각 발병 지수의 개체수 및 발병도를 나타낸다. 상기 표 3에 나타내는 것과 같이, ΔaabbccDd(mh), ΔaaBBccdd(wm), ΔaaBbccdd(hm) 및 Δaabbccdd(mm)의 변이체로 함으로써, 발병도가 1 미만으로 되어, ToBRFV에 대하여도 강한 저항성을 보이는 것을 알 수 있었다.
(3) ToBRFV 게노믹 RNA 축적량의 평가
상기 실시예 2(1)에 있어서의 ToBRFV 접종 후 14일째에, 야생형주의 각 개체로부터 비접종 상엽을 1장 회수했다. 또한, 상기 실시예 2(2)에 있어서의 ToBRFV 접종 후 14일째에, 각 변이체의 각 개체로부터 비접종 상엽을 1장 베어내어, 지르코니아 볼(직경 3 mm) 2개가 들어간 1.5 ml 원심 튜브에 회수했다. 상기 비접종 상엽을 튜브마다 액체 질소로 얼리고, 파쇄 장치(Qiagen Tissue Lyser, QIAGEN사 제조)로 매초 28회 15초 동안의 진탕을 2회 가하여 분쇄하고, RNA 추출 시약(RNAiso Plus, TaKaRa사 제조)을 이용하여 총 RNA를 추출, 정제 및 회수했다. 총 RNA는 물에 용해하여, 260 nm의 흡광도로부터 총 RNA의 농도를 산출했다.
이어서, 얻어진 총 RNA에 관해서, ToBRFV 게노믹 RNA를, 바이러스 외피 단백질(CP)을 코드하는 영역과 상보적인 하기 프로브를 이용하여 노던 블롯에 의해 정량했다. 여기서, 상기 프로브는 ToBRFV 게놈 RNA(GenBank: KX619418)의 5713∼6019번째의 뉴클레오티드의 상보 가닥에 상당하고, 상기 영역은 외피 단백질(CP)의 코드 영역의 일부이다. 또한, 상기 프로브는, 후술하는 것과 같이, 32P로 표지하고 있다. 상기 노던 블롯은 구체적으로는 하기의 수순으로 실시했다. 우선, 정제한 RNA를 글리옥살에 의해 변성하고, 1% 아가로스 겔 전기 영동에 의한 분획 후, 나일론막(Hybond N+, GE Healthcare사 제조)에 전사하여, 자외선 조사에 의해 고정했다(Sambrook 등 편, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕). 또한, 하이브리다이제이션 버퍼(PerfectHyb Plus, Sigma사 제조) 내에서 32P 표지한 RNA 프로브와 68℃, 16시간 하이브리다이즈시킨 후, 68℃의 1% SDS 함유 2×SSC 내에서 세정하고, 이미지 애널라이저(Typhoon, GE Healthcare사 제조)를 이용하여, 32P 시그널을 검출 및 정량했다. 상기 32P 표지 RNA 프로브는, ToBRFV 게놈 RNA(GenBank: KX619418)로부터 합성한 ToBRFV cDNA를 포함하는 플라스미드를 주형으로 하고, 하기 프로브용 프라이머 셋트를 이용하여 PCR에 의해 증폭한 후, 얻어진 DNA 단편을 주형으로 하고, 32P-CTP 존재 하에서 T7 RNA 폴리메라아제를 이용하여 합성했다. 여기서, 하기 T7_ToBRFV6019R에 있어서 밑줄로 나타내는 염기 서열이 T7 RNA 폴리메라아제의 프로모터이고, 밑줄부의 3’ 말단의 G가 독출 위치(ToBRFV 게놈 RNA의 6019번째의 뉴클레오티드)의 염기이다. 그리고, 노던 블롯에 제공한 총 RNA량으로, 각 변이체의 비접종 상엽 중의 32P 시그널을 보정했다. 그리고, 얻어진 보정치에 관해서, 각 유전자형의 각 개체의 평균치를 산출했다. 이 결과를 도 6에 도시한다.
(CP 검출용 프로브)
Figure pct00021
(프로브용 프라이머 셋트)
·포워드 프라이머: ToBRFV5713F
5'-TGTCTTACACAATCGCAACTCC-3'(서열 번호 25)
·리버스 프라이머: T7_ToBRFV6019R
5'-CGTACGTAATACGACTCACTATAGGGTTCGCCTGATTTTCGACTT3'(서열 번호 26)
도 6은 CP를 코드하는 게노믹 RNA의 상대량을 도시하는 그래프이다. 도 6에 있어서, 횡축은 변이체의 종류를 나타내고, 종축은 게노믹 RNA의 상대량을 나타낸다. 도 6에 도시하는 것과 같이, ΔaabbccDd(mh), ΔaaBBccdd(wm), ΔaaBbccdd(hm) 및 Δaabbccdd(mm)의 변이체로 함으로써, ToBRFV의 CP를 코드하는 게노믹 RNA가 보이지 않게 되었다. 이 결과는 상기 실시예 2의 (1) 및 (2)의 병징 발현과 잘 일치하는 것이었다.
이상의 점으로부터, 본 발명의 토마토 식물은 토바모바이러스 저항성을 보이는 것을 알 수 있었다.
이상, 실시형태 및 실시예를 참조하여 본 발명을 설명했지만, 본 발명은 상기 실시형태 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구성이나 상세에는, 본 발명의 범주 내에서 당업자가 이해할 수 있는 다양한 변경을 가할 수 있다.
이 출원은 2020년 2월 12일에 출원된 일본 출원 특원 2020-021960 및 2020년 5월 19일에 출원된 일본 출원 특원 2020-087665에 기초한 우선권을 주장하며, 그 개시 모두를 여기에 받아들인다.
<부기>
상기한 실시형태 및 실시예의 일부 또는 전부는 이하의 부기와 같이 기재될 수 있지만, 이하에 한정되지는 않는다.
(부기 1)
SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 관해서 기능 상실한 토바모바이러스 저항성 토마토 식물.
(부기 2)
상기 SlTOM1a 유전자는, 하기 (NA)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 토바모바이러스 저항성 제어 유전자인 부기 1에 기재한 토마토 식물:
(NA) 하기 (NA1)∼(NA7)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
(NA1) 서열 번호 1 및 2의 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
(NA2) 상기 (NA1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NA3) 상기 (NA1)의 염기 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NA4) 상기 (NA1)의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NA5) 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NA6) 서열 번호 3의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NA7) 서열 번호 3의 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
(부기 3)
상기 SlTOM1c 유전자는, 하기 (NC)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 토바모바이러스 저항성 제어 유전자인 부기 1 또는 2에 기재한 토마토 식물:
(NC) 하기 (NC1)∼(NC7)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
(NC1) 서열 번호 7 및 8의 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
(NC2) 상기 (NC1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NC3) 상기 (NC1)의 염기 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NC4) 상기 (NC1)의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NC5) 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NC6) 서열 번호 9의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NC7) 서열 번호 9의 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
(부기 4)
상기 SlTOM1d 유전자는, 하기 (ND)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 토바모바이러스 저항성 제어 유전자인 부기 1 내지 3의 어느 하나에 기재한 토마토 식물:
(ND) 하기 (ND1)∼(ND7)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
(ND1) 서열 번호 10의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
(ND2) 상기 (ND1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(ND3) 상기 (ND1)의 염기 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(ND4) 상기 (ND1)의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(ND5) 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(ND6) 서열 번호 11의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(ND7) 서열 번호 11의 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
(부기 5)
SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자, SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자 및 SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 포함하는 부기 1 내지 4의 어느 하나에 기재한 토마토 식물.
(부기 6)
SlTOM1b 유전자를 기능 상실한 부기 1 내지 5의 어느 하나에 기재한 토마토 식물.
(부기 7)
상기 SlTOM1b 유전자는, 하기 (NB)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 토바모바이러스 저항성 제어 유전자인 부기 6에 기재한 토마토 식물:
(NB) 하기 (NB1)∼(NB7)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
(NB1) 서열 번호 4 및 5의 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
(NB2) 상기 (NB1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NB3) 상기 (NB1)의 염기 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NB4) 상기 (NB1)의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NB5) 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NB6) 서열 번호 6의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NB7) 서열 번호 6의 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
(부기 8)
SlTOM1b 유전자의 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 포함하는 부기 6 또는 7에 기재한 토마토 식물.
(부기 9)
SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자, SlTOM1b 유전자의 기능 상실 유전자 및 SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 포함하고,
SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자를 헤테로 접합형으로 포함하는 부기 6 내지 8의 어느 하나에 기재한 토마토 식물.
(부기 10)
각 유전자의 기능 상실 유전자를 포함하고,
상기 기능 상실 유전자는, 각 유전자의 정상 유전자에 대하여, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가됨으로써 생긴 유전자인 부기 1 내지 9의 어느 하나에 기재한 토마토 식물.
(부기 11)
각 유전자의 기능 상실 유전자를 포함하고,
상기 기능 상실 유전자는, 각 유전자의 정상 유전자에 대하여, 프레임시프트 돌연변이가 도입됨으로써 생긴 유전자인 부기 1 내지 10의 어느 하나에 기재한 토마토 식물.
(부기 12)
각 유전자의 기능 상실 유전자를 포함하고,
상기 기능 상실 유전자는, 각 유전자의 정상 유전자가 부분 결실 또는 완전 결실하여 생긴 유전자인 부기 1 내지 11의 어느 하나에 기재한 토마토 식물.
(부기 13)
각 유전자의 기능 상실 유전자를 포함하고,
상기 기능 상실 유전자는, 각 유전자의 정상 유전자에 있어서, 엑손 영역에 변이가 도입됨으로써 생긴 유전자인 부기 1 내지 12의 어느 하나에 기재한 토마토 식물.
(부기 14)
상기 토바모바이러스 저항성 토마토 식물은 식물체 또는 그 부분인 부기 1 내지 13의 어느 하나에 기재한 토마토 식물.
(부기 15)
상기 토바모바이러스 저항성 토마토 식물은 종자인 부기 1 내지 14의 어느 하나에 기재한 토마토 식물.
(부기 16)
하기 (a) 공정을 포함하는 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 생산 방법:
(a) 부기 1 내지 15의 어느 하나에 기재한 토바모바이러스 저항성 토마토 식물과 다른 토마토 식물을 교잡하는 공정.
(부기 17)
하기 (b) 공정을 포함하는 부기 16에 기재한 생산 방법:
(b) 상기 (a) 공정에서 얻어진 토마토 식물 또는 그 후대 계통으로부터 토바모바이러스 저항성 토마토 식물을 선발하는 공정.
(부기 18)
상기 (b) 공정에 있어서의 선발은, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자를 기능 상실한 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 선발인 부기 17에 기재한 생산 방법.
(부기 19)
상기 (b) 공정에 있어서의 선발은, SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자, SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자 및 SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 포함하는 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 선발인 부기 17 또는 18에 기재한 생산 방법.
(부기 20)
상기 (b) 공정에 있어서의 선발은, SlTOM1b 유전자를 기능 상실한 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 선발인 부기 17 내지 19의 어느 하나에 기재한 생산 방법.
(부기 21)
상기 (b) 공정에 있어서의 선발은, SlTOM1b 유전자의 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 포함하는 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 선발인 부기 20에 기재한 생산 방법.
(부기 22)
상기 (b) 공정에서의 선발은,
SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자, SlTOM1b 유전자의 기능 상실 유전자 및 SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 포함하고,
SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자를 헤테로 접합형으로 포함하는, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 선발인 부기 20 또는 21에 기재한 생산 방법.
(부기 23)
상기 (a) 공정에 앞서서 하기 (x) 공정을 포함하는 부기 16 내지 22의 어느 하나에 기재한 생산 방법:
(x) 피검 토마토 식물로부터 부기 1 내지 15의 어느 하나에 기재한 토바모바이러스 저항성 토마토 식물을 선발하는 공정.
(부기 24)
상기 (x) 공정에 있어서의 선발은, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자를 기능 상실한 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 선발인 부기 23에 기재한 생산 방법.
(부기 25)
상기 (x) 공정에 있어서의 선발은, SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자, SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자 및 SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 포함하는 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 선발인 부기 23 또는 24에 기재한 생산 방법.
(부기 26)
상기 (x) 공정에 있어서의 선발은, SlTOM1b 유전자를 기능 상실한 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 선발인 부기 23 내지 25의 어느 하나에 기재한 생산 방법.
(부기 27)
상기 (x) 공정에 있어서의 선발은, SlTOM1b 유전자의 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 포함하는 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 선발인 부기 26에 기재한 생산 방법.
(부기 28)
상기 (x) 공정에 있어서의 선발은,
SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자, SlTOM1b 유전자의 기능 상실 유전자 및 SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 포함하고,
SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자를 헤테로 접합형으로 포함하는, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 선발인 부기 26 또는 27에 기재한 생산 방법.
(부기 29)
상기 SlTOM1a 유전자는, 하기 (NA)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 토바모바이러스 저항성 제어 유전자인 부기 18, 19, 22, 24 및 25의 어느 하나에 기재한 생산 방법:
(NA) 하기 (NA1)∼(NA7)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
(NA1) 서열 번호 1 및 2의 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
(NA2) 상기 (NA1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NA3) 상기 (NA1)의 염기 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NA4) 상기 (NA1)의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NA5) 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NA6) 서열 번호 3의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NA7) 서열 번호 3의 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
(부기 30)
상기 SlTOM1c 유전자는, 하기 (NC)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 토바모바이러스 저항성 제어 유전자인 부기 18, 19, 22, 24 및 25의 어느 하나에 기재한 생산 방법:
(NC) 하기 (NC1)∼(NC7)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
(NC1) 서열 번호 7 및 8의 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
(NC2) 상기 (NC1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NC3) 상기 (NC1)의 염기 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NC4) 상기 (NC1)의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NC5) 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NC6) 서열 번호 9의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NC7) 서열 번호 9의 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
(부기 31)
상기 SlTOM1d 유전자는, 하기 (ND)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 토바모바이러스 저항성 제어 유전자인 부기 18, 19, 22, 24 및 25의 어느 하나에 기재한 생산 방법:
(ND) 하기 (ND1)∼(ND7)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
(ND1) 서열 번호 10의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
(ND2) 상기 (ND1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(ND3) 상기 (ND1)의 염기 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(ND4) 상기 (ND1)의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(ND5) 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(ND6) 서열 번호 11의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(ND7) 서열 번호 11의 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
(부기 32)
상기 SlTOM1b 유전자는, 하기 (NB)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 토바모바이러스 저항성 제어 유전자인 부기 20 내지 22 및 26 내지 28의 어느 하나에 기재한 생산 방법:
(NB) 하기 (NB1)∼(NB7)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
(NB1) 서열 번호 4 및 5의 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
(NB2) 상기 (NB1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NB3) 상기 (NB1)의 염기 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NB4) 상기 (NB1)의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NB5) 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NB6) 서열 번호 6의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(NB7) 서열 번호 6의 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
(부기 33)
상기 토바모바이러스 저항성 토마토 식물은 각 유전자의 기능 상실 유전자를 포함하고,
상기 기능 상실 유전자는, 상기 각 유전자의 정상 유전자에 대하여, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가됨으로써 생긴 유전자인 부기 18 내지 22 및 24 내지 28의 어느 하나에 기재한 생산 방법.
(부기 34)
상기 토바모바이러스 저항성 토마토 식물은 각 유전자의 기능 상실 유전자를 포함하고,
상기 기능 상실 유전자는, 상기 각 유전자의 정상 유전자에 대하여, 프레임시프트 돌연변이가 도입됨으로써 생긴 유전자인 부기 18 내지 22, 24 내지 28 및 33의 어느 하나에 기재한 생산 방법.
(부기 35)
상기 토바모바이러스 저항성 토마토 식물은 각 유전자의 기능 상실 유전자를 포함하고,
상기 기능 상실 유전자는, 상기 각 유전자의 정상 유전자가 부분 결실 또는 완전 결실하여 생긴 유전자인 부기 18 내지 22, 24 내지 28, 33 및 34의 어느 하나에 기재한 생산 방법.
(부기 36)
상기 토바모바이러스 저항성 토마토 식물은 각 유전자의 기능 상실 유전자를 포함하고,
상기 기능 상실 유전자는, 상기 각 유전자의 정상 유전자에 있어서, 엑손 영역에 변이가 도입됨으로써 생긴 유전자인 부기 18 내지 22, 24 내지 28, 33 및 33 내지 35의 어느 하나에 기재한 생산 방법.
(부기 37)
대상 토마토 식물의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자를 기능 상실시키는 기능 상실 공정을 포함하는, 토마토 식물에 있어서의 토바모바이러스 저항성 부여 방법.
(부기 38)
상기 기능 상실 공정에서는, 한 쌍의 SlTOM1a 유전자, 한 쌍의 SlTOM1c 유전자 및 한 쌍의 SlTOM1d 유전자에 기능 상실 변이를 도입하는 부기 37에 기재한 부여 방법.
(부기 39)
상기 기능 상실 공정에서는, 대상 토마토 식물의 SlTOM1b 유전자에 대하여, 기능 상실 변이를 도입하는 부기 37 또는 38에 기재한 부여 방법.
(부기 40)
상기 기능 상실 공정에서는, 한 쌍의 SlTOM1b 유전자에 기능 상실 변이를 도입하는 부기 39에 기재한 부여 방법.
(부기 41)
상기 기능 상실 공정에서는, 한 쌍의 SlTOM1a 유전자, 한 쌍의 SlTOM1b 유전자 및 한 쌍의 SlTOM1c 유전자와, 한 쌍의 SlTOM1d 유전자 중 어느 한쪽에 기능 상실 변이를 도입하는 부기 39 또는 40에 기재한 부여 방법.
(부기 42)
상기 기능 상실 공정에서는, 상기 각 유전자의 염기 서열에 대하여, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가함으로써 기능 상실 변이를 도입하는 부기 37 내지 41의 어느 하나에 기재한 부여 방법.
(부기 43)
상기 기능 상실 공정에서는, 상기 각 유전자에 대하여, 프레임시프트 돌연변이를 도입함으로써 기능 상실 변이를 도입하는 부기 37 내지 42의 어느 하나에 기재한 부여 방법.
(부기 44)
상기 기능 상실 공정에서는, 상기 각 유전자의 정상 유전자를 부분 결실 또는 완전 결실시킴으로써 기능 상실 변이를 도입하는 부기 37 내지 43의 어느 하나에 기재한 부여 방법.
(부기 45)
상기 기능 상실 공정에서는, 상기 각 유전자의 정상 유전자에 있어서, 엑손 영역에 변이를 도입함으로써 기능 상실 변이를 도입하는 부기 37 내지 44의 어느 하나에 기재한 부여 방법.
(부기 46)
상기 기능 상실 공정에서는, 상기 각 유전자에 관해서, 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 갖도록 변이를 도입하는 부기 37 내지 45의 어느 하나에 기재한 부여 방법.
(부기 47)
상기 기능 상실 공정에 의해 얻어진 토마토 식물 또는 그 후대 계통으로부터 토바모바이러스 저항성 토마토 식물을 선발하는 공정을 포함하는 부기 37 내지 46의 어느 하나에 기재한 부여 방법.
(부기 48)
대상 토마토 식물에 토바모바이러스 저항성을 부여하는 부여 공정을 포함하고,
상기 부여 공정은, 부기 37 내지 47의 어느 하나에 기재한 토마토 식물에 있어서의 토바모바이러스 저항성 부여 방법에 의해 실시되는, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 생산 방법.
(부기 49)
피검 토마토 식물로부터, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자를 기능 상실한 피검 토마토 식물을, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하는 선발 공정을 포함하는, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 스크리닝 방법.
(부기 50)
상기 선발 공정에서는, SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자, SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자 및 SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 포함하는 피검 토마토 식물을, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하는 부기 49에 기재한 스크리닝 방법.
(부기 51)
상기 선발 공정에서는, SlTOM1b 유전자를 기능 상실한 피검 토마토 식물을, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하는 부기 49 또는 50에 기재한 스크리닝 방법.
(부기 52)
상기 선발 공정에서는, SlTOM1b 유전자의 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 포함하는 피검 토마토 식물을, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하는 부기 51에 기재한 스크리닝 방법.
(부기 53)
상기 선발 공정에서는,
SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자, SlTOM1b 유전자의 기능 상실 유전자 및 SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 포함하고,
SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자를 헤테로 접합형으로 포함하는, 피검 토마토 식물을, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하는 부기 51 또는 52에 기재한 스크리닝 방법.
(부기 54)
상기 선발 공정에서는, 상기 각 유전자의 정상 유전자에 대하여, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가됨으로써 생긴 유전자를 포함하는 피검 토마토 식물을, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하는 부기 49 내지 53의 어느 하나에 기재한 스크리닝 방법.
(부기 55)
상기 선발 공정에서는, 상기 각 유전자의 정상 유전자에 대하여, 프레임시프트 돌연변이가 도입됨으로써 생긴 유전자를 포함하는 피검 토마토 식물을, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하는 부기 49 내지 54의 어느 하나에 기재한 스크리닝 방법.
(부기 56)
상기 선발 공정에서는, 상기 각 유전자의 정상 유전자가 부분 결실 또는 완전 결실하여 생긴 유전자를 포함하는 피검 토마토 식물을, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하는 부기 49 내지 55의 어느 하나에 기재한 스크리닝 방법.
(부기 57)
상기 선발 공정에서는, 상기 각 유전자의 정상 유전자에 있어서, 엑손 영역에 변이가 도입됨으로써 생긴 유전자를 포함하는 피검 토마토 식물을, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하는 부기 49 내지 56의 어느 하나에 기재한 스크리닝 방법.
(부기 58)
피검 토마토 식물로부터, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 관해서, 기능 상실한 피검 토마토 식물을 스크리닝하는 스크리닝 공정을 포함하고,
상기 스크리닝 공정은, 부기 49 내지 57의 어느 하나에 기재한 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 스크리닝 방법에 의해 실시되는, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 생산 방법.
(부기 59)
부기 16 내지 36, 48 및 58의 어느 하나에 기재한 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 생산 방법에 의해 얻어지는, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물.
(부기 60)
피검 토마토 식물에 있어서, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자가 기능 상실되어 있는지를 검출하는 검출 공정을 포함하는, 토마토 식물의 토바모바이러스 저항성 검출 방법.
(부기 61)
상기 검출 공정에서는, 상기 피검 토마토 식물에 있어서, SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자, SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자 및 SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자가 호모 접합형으로 존재하고 있는지를 검출하는 검출 공정을 포함하는 부기 60에 기재한 검출 방법.
(부기 62)
상기 검출 공정에서는, 상기 피검 토마토 식물에 있어서, SlTOM1b 유전자가 기능 상실되어 있는지를 검출하는 부기 60 또는 61에 기재한 검출 방법.
(부기 63)
상기 검출 공정에서는, 상기 피검 토마토 식물에 있어서, SlTOM1b 유전자의 기능 상실 유전자가 호모 접합형으로 존재하고 있는지를 검출하는 검출 공정을 포함하는 부기 62에 기재한 검출 방법.
(부기 64)
상기 검출 공정에서는, 상기 피검 토마토 식물에 있어서,
SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자, SlTOM1b 유전자의 기능 상실 유전자 및 SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자가 호모 접합형으로 존재하고,
SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자가 헤테로 접합형으로 존재하고 있는지를 검출하는 검출 공정을 포함하는 부기 62 또는 63에 기재한 검출 방법.
(부기 65)
상기 검출 공정에서는, 상기 각 유전자의 정상 유전자에 대하여, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가됨으로써 생긴 유전자를 포함하는지를 검출하는 부기 60 내지 64의 어느 하나에 기재한 검출 방법.
(부기 66)
상기 검출 공정에서는, 상기 각 유전자의 정상 유전자에 대하여, 프레임시프트 돌연변이가 도입됨으로써 생긴 유전자를 포함하는지를 검출하는 부기 60 내지 65의 어느 하나에 기재한 검출 방법.
(부기 67)
상기 검출 공정에서는, 상기 각 유전자의 정상 유전자가 부분 결실 또는 완전 결실하여 생긴 유전자를 포함하는지를 검출하는 부기 60 내지 66의 어느 하나에 기재한 검출 방법.
(부기 68)
상기 검출 공정에서는, 상기 각 유전자의 정상 유전자에 있어서, 엑손 영역에 변이가 도입됨으로써 생긴 유전자를 포함하는지를 검출하는 부기 60 내지 67의 어느 하나에 기재한 검출 방법.
(부기 69)
부기 1 내지 15 및 59의 어느 한 항에 기재한 토바모바이러스 저항성 토마토 식물을 이용한 토마토 식물의 가공 식품.
이상과 같이, 본 발명의 토마토 식물은 ToBRFV에 대하여도 저항성을 보인다. 따라서, 본 발명은 예컨대 육종 분야, 농업 분야 등에 있어서 매우 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL RESEARCH AND DEVELOPMENT AGENCY NATIONAL AGRICULTURE AND FOOD RESEARCH ORGANIZATION Takii & Co.,Ltd. <120> A Tobamovirus resistant tomato plant, a method of producing a Tobamovirus resistant tomato plant, a method of giving a Tobamovirus resistance to a tomato plant, a method of screeing a Tobamovirus resistant tomato plant and a method of detecting a Tobamovirus resistance in a tomato plant <130> TF20001WO <150> JP2020-021960 <151> 2020-02-12 <150> JP2020-087665 <151> 2020-05-19 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1324 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 1 taatagtcaa aaagaataaa tcctagaacg ttcagggaac gccgctgtgt ttctctcctt 60 tctcgccggc cgttttaggc tcaataattt tctgatcaaa caaaaaattc tctaaaattt 120 catttatttc gtattttttg gtgtgtctaa tttcggatct ccggcgatgg gtcgggttga 180 aacagcggtg gacccgtcgt cgacggctgc ggtggcggcg taccgtttac atgaggcaat 240 aagctggtgg gatgaagtga atgaatctcc tatttggcaa gaccgtattt tctatgtcct 300 tgcgatctta tacggcgtcg tttctgctgt tgctcttgtg caattaatcc ggattcagat 360 gagagttccc gagtatggat ggaccactca gaaagtcttc catttcctca atttcttggt 420 gaatggggtt cgctctctgg tttttgtatt tcgtcgggat gttcagaagt tgaaccctga 480 gattatccaa cacatcttgc ttgatatgcc aagtcttgca ttcttcacaa cttttgcgct 540 tctagtattg ttctgggctg agatatacta tcaggcacgt gctgtatcta ctgatgctct 600 taggcctagt ttcttcacaa tcaatggagt tgtttatgct attcagatta ttttatggct 660 gataatatgg tggaagcctg ttccagtact cgtcatctta tcgaaggcat tctttgcagg 720 tgtatctcta tttgcagcct tggggtttct tctttatgga ggaaggcttt tccttatgtt 780 acggcgtttc cctgtagaat caagggggag acagaagaaa cttcaggaag ttggttatgt 840 gacaacaata tgtttttcat gcttcctgat tagatgcatt atgatgtgtt tcaatgcatt 900 tgataaagct gcggatcttg atgttttata tcatccaatg ttaaattttg tatactatct 960 gttggtagag attctacctt cttcacttgt ccttttcatt ttgaggaagt tgcctccaaa 1020 gcgagggatc acgcagtacc accctattcg ctgatacaac agcgtgcatc ggatgatgaa 1080 atcaagcgct gggatcaggt tatcagatga gttggctttt acgatactcg tcctacccat 1140 atagtgagat actgtacatg gagcatggtt catcaggact ctggaaaaat agtttgttct 1200 ctgcagatat tagttgtgtc tgtaatttgt ttgtagtctt gatacaagag ttgtggaaga 1260 agttgtgtta tttctagtgt aattatcttc atatttgtat gtttgagatt tcaattgatt 1320 attc 1324 <210> 2 <211> 1353 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 2 gaaaaagaat aaatcctaga acgttcaggg aacgccgctg tgtttctctc ctttctcgcc 60 ggccgtttta ggctcaataa ttttctgatc aaacaaaaaa ttctctaaaa tttcatttat 120 ttcgtatttt ttggtgtgtc taatttcgga tctccggcga tgggtcgggt tgaaacagcg 180 gtggacccgt cgtcgacggc tgcggtggcg gcgtaccgtt tacatgaggc aataagctgg 240 tgggatgaag tgaatgaatc tcctatttgg caagaccgta ttttctatgt ccttgcgatc 300 ttatacggcg tcgtttctgc tgttgctctt gtgcaattaa tccggattca gatgagagtt 360 cccgagtatg gatggaccac tcagaaagtc ttccatttcc tcaatttctt ggtgaatggg 420 gttcgctctc tggtttttgt atttcgtcgg gatgttcaga agttgaaccc tgagattatc 480 caacacatct tgcttgatat gccaagtctt gcattcttca caacttttgc gcttctagta 540 ttgttctggg ctgagatata ctatcaggca cgtgctgtat ctactgatgc tcttaggcct 600 agtttcttca caatcaatgg agttgtttat gctattcaga ttattttatg 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Cys Ile Met Met 225 230 235 240 Cys Phe Asn Ala Phe Asp Lys Ala Ala Asp Leu Asp Val Leu Tyr His 245 250 255 Pro Met Leu Asn Phe Val Tyr Tyr Leu Leu Val Glu Ile Leu Pro Ser 260 265 270 Ser Leu Val Leu Phe Ile Leu Arg Lys Leu Pro Pro Lys Arg Gly Ile 275 280 285 Thr Gln Tyr His Pro Ile Arg 290 295 <210> 4 <211> 1306 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 4 tacatttgtc ctccttcccc cttcatccac gtgtggttcc tccaaaccct ccaccccact 60 cttcactcta tttgatttga acgaacatcc ccatcacttc actctctaca tttttcttca 120 tctgtaaatc accatttttg ttagacgtag tagctatggt aaaatctata agctttcttc 180 ttgaattcgc aaaagattac gatgatggaa caccacgagt tcgccccatc tttgattggt 240 tcaatgcgat gatggaggtc tccgattatg agaaacaagc catcttttat tctctctctg 300 ccgcctatgc cttagtctca tttgttgcac tggtacaact catccgcatc caattgcgcc 360 tttcaggaat tggttggaca acacaaaagg tttttcactt gatgaatttt gttgtctgtg 420 gattgagagc aatattattt gggttctaca gcagcgtgtt caatcttaga tcaaaagcac 480 ttgagatgat gcttctggat ctccccggtc ttctattctt ctccacatac acactattag 540 ttctgttttg ggctgaaata ttccatcagg caagaaacct tccaatcgat aaacttcgac 600 ctgcatatta tgcagttaat gcagtcgtat attttataca gatatgcata tggatcttca 660 tcggtgttgg cccagcttcg gctgctgttg aaactgctaa actttttttc gcagttattt 720 catttactgc tgctctggga tttgttatgt atggtggaag gttgttcgct atgcttcggc 780 gcttccctat tgaatctaga ggccgtcaaa agaagcttca tgaggttggt ttcgtgactg 840 gtatttgctg catttgtttc atgatcagat gtgttatggt tgctgtttct gcttttaacg 900 ggaacgctga tgttgatgtc attgaccatc cagttctcat tctcttctat tacgtggtgg 960 tggagatctt gccttctgtt ttggtgcttt ttattctgcg caaattacct ccaaaacgtg 1020 tatcagagca atatcatcct atccaataac tcatagaaga gcatccctga ttttagtact 1080 tcaccgtttt tgttcaaaga agcccttgtc atgccagcca agtttttagt tcttataata 1140 tcatttttgc ttttattgtt ttggcgcttg tctcgagtga cgtggaggag ttatagtttg 1200 atttcagtac agctctgtag aagtcttgaa ttataaatta ttcaaagtgc atgtgacttg 1260 taatcatttg gatagaatta gatgttcgaa gtttaaaggc cttggg 1306 <210> 5 <211> 1316 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 5 gacatttgtc ctccttcccc cctcatccac gtgtggttcc 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900 ggaacgctga tgttgatgtc attgaccatc cagttctcat tctcttctat tacgtggtgg 960 tggagatctt gccttctgtt ttggtgcttt ttattctgcg caaattacct ccaaaacgtg 1020 tatcagagca atatcatcct atccaataac tcatagaaga gcatccctga ttttagtact 1080 tcaccgtttt tgttcaaaga agcccttgtc atgccagcca agtttttagt tcttataata 1140 tcatttttgc ttttattgtc ttgacgcttg tctcgagtga cgtggaggag ttatagtttg 1200 atttcagtac agctctgtag aagtcttgaa ttataaatta ttcaaagtgc atgtgacttg 1260 taatcatttg gatagaatta gatgttcgaa gtttaaaggc cttgggttat attgtg 1316 <210> 6 <211> 297 <212> PRT <213> Solanum lycopersicum <400> 6 Met Val Lys Ser Ile Ser Phe Leu Leu Glu Phe Ala Lys Asp Tyr Asp 1 5 10 15 Asp Gly Thr Pro Arg Val Arg Pro Ile Phe Asp Trp Phe Asn Ala Met 20 25 30 Met Glu Val Ser Asp Tyr Glu Lys Gln Ala Ile Phe Tyr Ser Leu Ser 35 40 45 Ala Ala Tyr Ala Leu Val Ser Phe Val Ala Leu Val Gln Leu Ile Arg 50 55 60 Ile Gln Leu Arg Leu Ser Gly Ile Gly Trp Thr Thr Gln Lys Val Phe 65 70 75 80 His Leu Met Asn Phe Val Val Cys Gly Leu Arg Ala Ile Leu Phe Gly 85 90 95 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Solanum lycopersicum <400> 7 tgctaatgaa cttgaatact tacagttatc ttaattgttt gtattaggaa gcatcagttt 60 tttgacttct ttcaatacaa caagataagc ggaggggaga gctgaaatgg ctaggttgcc 120 acttgggtcg tcgccgattg acatcgccgg tccggtgacc aactggtggg accacgtcaa 180 cgaatccgtt cagtggcaag atgggatttt ctactccctt tgtgcttcct atggtcttgt 240 ttcagcagtt gccctaattc aattaatacg aattgatttg agggtacccg agtatggctg 300 gacaacacaa aaggtgttcc atctgatgaa ctttgttgta aatggagttc gtgcaattgt 360 ctttggattt cacaaacatg tttttctgct ccattataag gtgctgactc tggcaatatt 420 ggacctacca gggctccttt tcttttcaac attcacactc cttgttctat tttgggctga 480 gatatatcac caggctagga gtttaccaac agataagctc aggatttctt atattgccat 540 taatgatgcc atatacttca ttcaggcctg tatctgggtt tacctctgga tcaatgacaa 600 tagcacagtg gaattcattg ggaagatatt tatggcagtt gtatcagtta ttgcagcctt 660 gggctttctg ctatatggtg gaaggttatt tctcatgctg cggcgcttcc ctattgaatc 720 taaagggagg agaaagaagc ttcatgaggt tggatcggtg actgccatat gtttcacctg 780 tttcctcatt agatgctttg tggttgtgtt atctgctttt gattctgacg catctcttga 840 cgtcttggat catcctgttt tgaatctgat atactacctg ctggtagaaa ttcttccttc 900 agctcttgtg ctgtacatcc tgcgaaaact gcctccaaaa agagtgtctg cacaatacca 960 cccaatcagt tagctgcagc agaattttat cgttagtgat acacgttccc atggtttctg 1020 ttgcagaagc taactggagt tgttcaggaa aagtgaaact gcaaaaggat attcggttgc 1080 aataattctg cggaaaggca aagattcaac gcttttttgg cagttgttaa aacagaggtt 1140 aagctgtttt gcttacatta tattgtttct gtggttttag tgtgaagcat gagacaaata 1200 agtgttcccc acgtctgtga aaaatcctag tcatgatgta atgacgcaga gggtaaatct 1260 cagtatcgcc attgtactgg catgttgtaa ctatgatgtt ctggatctcc tttactgcaa 1320 tgactgatgt cctttgtttg gtca 1344 <210> 8 <211> 1278 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 8 acaacaagat aagcggaggg gagagctgaa atggctaggt tgccacttgg gtcgtcgccg 60 attgacatcg ccggtccggt gaccaactgg tgggaccacg tcaacgaatc cgttcagtgg 120 caagatggga ttttctactc cctttgtgct tcctatggtc ttgtttcagc agttgcccta 180 attcaattaa tacgaattga tttgagggta cccgagtatg gctggacaac acaaaaggtg 240 ttccatctga tgaactttgt tgtaaatgga gttcgtgcaa ttgtctttgg atttcacaaa 300 catgtttttc tgctccatta taaggtgctg actctggcaa tattggacct accagggctc 360 cttttctttt caacattcac actccttgtt ctattttggg ctgagatata tcaccaggct 420 aggagtttac caacagataa gctcaggatt tcttatattg ccattaatga tgccatatac 480 ttcattcagg cctgtatctg ggtttacctc tggatcaatg acaatagcac agtggaattc 540 attgggaaga tatttatggc agttgtatca gttattgcag ccttgggctt tctgctatat 600 ggtggaaggt tatttctcat gctgcggcgc ttccctattg aatctaaagg gaggagaaag 660 aagcttcatg aggttggatc ggtgactgcc atatgtttca cctgtttcct cattagatgc 720 tttgtggttg tgttatctgc ttttgattct gacgcatctc ttgacgtctt ggatcatcct 780 gttttgaatc tgatatacta cctgctggta gaaattcttc cttcagctct tgtgctgtac 840 atcctgcgaa aactgcctcc aaaaagagtg tctgcacaat accacccaat cagttagctg 900 cagcagaatt ttatcgttag tgatacacgt tcccatggtt tctgttgcag aagctaactg 960 gagttgttca ggaaaagtga aactgcaaaa ggatattcgg ttgcaataat tctgcggaaa 1020 ggcaaagatt caacgctttt ttggcagttg ttaaaacaga ggttaagctg ttttgcttac 1080 attatattgt ttctgtggtt ttagtgtgaa gcatgagaca aataagtgtt ccccacgtct 1140 gtgaaaaatc ctagtcatga tgtaatgacg cagagggtaa atctcagtat cgccattgta 1200 ctggcatgtt gtaactatga tgttctggat ctcctttact gcaatgactg atgtcctttg 1260 tttggtcaaa aaaaaaaa 1278 <210> 9 <211> 288 <212> PRT <213> Solanum lycopersicum <400> 9 Met Ala Arg Leu Pro Leu Gly Ser Ser Pro Ile Asp Ile Ala Gly Pro 1 5 10 15 Val Thr Asn Trp Trp Asp His Val Asn Glu Ser Val Gln Trp Gln Asp 20 25 30 Gly Ile Phe Tyr Ser Leu Cys Ala Ser Tyr Gly Leu Val Ser Ala Val 35 40 45 Ala Leu Ile Gln Leu Ile Arg Ile Asp Leu Arg Val Pro Glu Tyr Gly 50 55 60 Trp Thr Thr Gln Lys Val Phe His Leu Met Asn Phe Val Val Asn Gly 65 70 75 80 Val Arg Ala Ile Val Phe Gly Phe His Lys His Val Phe Leu Leu His 85 90 95 Tyr Lys Val Leu Thr Leu Ala Ile Leu Asp Leu Pro Gly Leu Leu Phe 100 105 110 Phe Ser Thr Phe Thr Leu Leu Val Leu Phe Trp Ala Glu Ile Tyr His 115 120 125 Gln Ala Arg Ser Leu Pro Thr Asp Lys Leu Arg Ile Ser Tyr Ile Ala 130 135 140 Ile Asn Asp Ala Ile Tyr Phe Ile Gln Ala Cys Ile Trp Val Tyr Leu 145 150 155 160 Trp Ile Asn Asp Asn Ser Thr Val Glu Phe Ile Gly Lys Ile Phe Met 165 170 175 Ala Val Val Ser Val Ile Ala Ala Leu Gly Phe Leu Leu Tyr Gly Gly 180 185 190 Arg Leu Phe Leu Met Leu Arg Arg Phe Pro Ile Glu Ser Lys Gly Arg 195 200 205 Arg Lys Lys Leu His Glu Val Gly Ser Val Thr Ala Ile Cys Phe Thr 210 215 220 Cys Phe Leu Ile Arg Cys Phe Val Val Val Leu Ser Ala Phe Asp Ser 225 230 235 240 Asp Ala Ser Leu Asp Val Leu Asp His Pro Val Leu Asn Leu Ile Tyr 245 250 255 Tyr Leu Leu Val Glu Ile Leu Pro Ser Ala Leu Val Leu Tyr Ile Leu 260 265 270 Arg Lys Leu Pro Pro Lys Arg Val Ser Ala Gln Tyr His Pro Ile Ser 275 280 285 <210> 10 <211> 1251 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 10 ctgaaaaagg tagttgccga ttttggtgtt tgattttttt ttggggggat tttgaaattg 60 gtgagtttga ttttggaatc tccggtgatg ggacgggcgg agatggttgt aggcccgtcg 120 gagaaggtgg cggtggtggc atatcatctg aatgatgcaa tcaattggtg ggacgatgtg 180 aacagatctc ttgattggca aaaccgtata ttccatgtcc ttgctgttct ctacggcgtt 240 gtcgccgtcg ttgctcttgt acaattaatt cgcattcaaa tgagagttcc tgaatatggc 300 tggaccactc aaaaagtctt ccactttctc aatttctttg tgaatggagt tcgctcgcta 360 gtttttacat ttcgtcggga tgttcagaag ttgcacccgg agattgtgca acatattatg 420 cttgatatgc caagtcttgc attcttcaca acttatgctc tgctagtatt attctgggct 480 gagatatact accaggcacg tgctgtgtcc acggatgggc ttagacctag tttcttcaca 540 atcaacggag tggtttatgc tattcagatt atattatggc tgataatgtg gtggaaacct 600 attcgagtac tcttcatctt atccaagatg ttttttgcag gtgtatccct atttgcagca 660 ttgggatttc tcctctacgg tggaaggctt tttcttatgt tacagcggtt tccagtagaa 720 tcaagaggga gacgcaagaa gctgcaggag gttggttatg tcacgacaat atgtttttca 780 tgcttcctca ttagatgcgt tatgatgtgc ttcaatgcat ttgataaagc tgcagatctt 840 gatgttttgt atcatcctat tttgaatttg atatattacc tgttagtgga gatactgcct 900 tcttctcttg tcctttttat tttaaggaag ttgcctccaa agcgagggat cacacaatac 960 caccctattc actaatacat taagagggta gataatgatg aaaatcaggc tccgggatca 1020 ggtattaagt aagttggctt ttacctggat gtgatttgca agcaagaaat acgagaggag 1080 tgataatgta aattgaagta tggttcgtct atactgaaat atccgtctgt cctcacacta 1140 ggcagattgt agctctgttt tgtaccacta gttatagatg gaattgtgaa gtatcttacg 1200 acctttagtg tattatttcg cctttgtatg tgtcagattt caattgaatt c 1251 <210> 11 <211> 295 <212> PRT <213> Solanum lycopersicum <400> 11 Met Gly Arg Ala Glu Met Val Val Gly Pro Ser Glu Lys Val Ala Val 1 5 10 15 Val Ala Tyr His Leu Asn Asp Ala Ile Asn Trp Trp Asp Asp Val Asn 20 25 30 Arg Ser Leu Asp Trp Gln Asn Arg Ile Phe His Val Leu Ala Val Leu 35 40 45 Tyr Gly Val Val Ala Val Val Ala Leu Val Gln Leu Ile Arg Ile Gln 50 55 60 Met Arg Val Pro Glu Tyr Gly Trp Thr Thr Gln Lys Val Phe His Phe 65 70 75 80 Leu Asn Phe Phe Val Asn Gly Val Arg Ser Leu Val Phe Thr Phe Arg 85 90 95 Arg Asp Val Gln Lys Leu His Pro Glu Ile Val Gln His Ile Met Leu 100 105 110 Asp Met Pro Ser Leu Ala Phe Phe Thr Thr Tyr Ala Leu Leu Val Leu 115 120 125 Phe Trp Ala Glu Ile Tyr Tyr Gln Ala Arg Ala Val Ser Thr Asp Gly 130 135 140 Leu Arg Pro Ser Phe Phe Thr Ile Asn Gly Val Val Tyr Ala Ile Gln 145 150 155 160 Ile Ile Leu Trp Leu Ile Met Trp Trp Lys Pro Ile Arg Val Leu Phe 165 170 175 Ile Leu Ser Lys Met Phe Phe Ala Gly Val Ser Leu Phe Ala Ala Leu 180 185 190 Gly Phe Leu Leu Tyr Gly Gly Arg Leu Phe Leu Met Leu Gln Arg Phe 195 200 205 Pro Val Glu Ser Arg Gly Arg Arg Lys Lys Leu Gln Glu Val Gly Tyr 210 215 220 Val Thr Thr Ile Cys Phe Ser Cys Phe Leu Ile Arg Cys Val Met Met 225 230 235 240 Cys Phe Asn Ala Phe Asp Lys Ala Ala Asp Leu Asp Val Leu Tyr His 245 250 255 Pro Ile Leu Asn Leu Ile Tyr Tyr Leu Leu Val Glu Ile Leu Pro Ser 260 265 270 Ser Leu Val Leu Phe Ile Leu Arg Lys Leu Pro Pro Lys Arg Gly Ile 275 280 285 Thr Gln Tyr His Pro Ile His 290 295 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 12 gttgtgaaga atgcaagact tgg 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 13 tcaaagatgg ggcgaactcg tgg 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 14 gccgattgac atcgccggtc cgg 23 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 15 ccaagtcttg cattcttcac aac 23 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 16 atgccaagta cttgcattct tcacaacttt 30 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 17 ccacgagttc gccccatctt tga 23 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 18 acaccacgag cccatctttg attg 24 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 19 gccgattgac atcgccggtc cgg 23 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 20 tcgccgattg acatcgccgt ccggtga 27 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Solanum lycopersicum <400> 21 Ser Pro Ile Asp Ile Ala 1 5 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 22 ccaagtcttg cattcttcac aac 23 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 23 atgccaagtt gcattcttca caacttt 27 <210> 24 <211> 307 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> detection probe for CP gene sequence <400> 24 ggguucgccu gauuuucgac uucuauaauc cuauuucuag uaucgaaagc uccuaacaaa 60 gcaguaacua gaggaucuag uaccgcauug uaccuauaca ccuuaaaacc acugucagga 120 aaccuaacag ugacuugagg gacagguuuc cacacuucgc uaaauugccg uugaacgguu 180 guucuagcuu guuguguuug gaacugauua ccuagugaau uaguacauaa auuuauuaau 240 ucuauagggu cggcccaugc ugaugacaaa aacacaaauu gcgauggagu ugcgauugug 300 uaagaca 307 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CP gene sequence detection probe <400> 25 tgtcttacac aatcgcaact cc 22 <210> 26 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CP gene sequence detection probe <400> 26 cgtacgtaat acgactcact atagggttcg cctgattttc gactt 45

Claims (24)

  1. SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 관해서 기능 상실한 토바모바이러스 저항성 토마토 식물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 SlTOM1a 유전자는 하기 (NA)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 토바모바이러스 저항성 제어 유전자인 토마토 식물:
    (NA) 하기 (NA1)∼(NA7)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
    (NA1) 서열 번호 1 및 2의 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
    (NA2) 상기 (NA1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (NA3) 상기 (NA1)의 염기 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (NA4) 상기 (NA1)의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (NA5) 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (NA6) 서열 번호 3의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (NA7) 서열 번호 3의 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 SlTOM1c 유전자는 하기 (NC)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 토바모바이러스 저항성 제어 유전자인 토마토 식물:
    (NC) 하기 (NC1)∼(NC7)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
    (NC1) 서열 번호 7 및 8의 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
    (NC2) 상기 (NC1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (NC3) 상기 (NC1)의 염기 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (NC4) 상기 (NC1)의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (NC5) 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (NC6) 서열 번호 9의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (NC7) 서열 번호 9의 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SlTOM1d 유전자는 하기 (ND)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 토바모바이러스 저항성 제어 유전자인 토마토 식물:
    (ND) 하기 (ND1)∼(ND7)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
    (ND1) 서열 번호 10의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
    (ND2) 상기 (ND1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (ND3) 상기 (ND1)의 염기 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (ND4) 상기 (ND1)의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (ND5) 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (ND6) 서열 번호 11의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (ND7) 서열 번호 11의 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자, SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자 및 SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 포함하는 토마토 식물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, SlTOM1b 유전자를 기능 상실한 토마토 식물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 SlTOM1b 유전자는 하기 (NB)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 토바모바이러스 저항성 제어 유전자인 토마토 식물:
    (NB) 하기 (NB1)∼(NB7)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
    (NB1) 서열 번호 4 및 5의 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
    (NB2) 상기 (NB1)의 염기 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (NB3) 상기 (NB1)의 염기 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (NB4) 상기 (NB1)의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 대하여 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에, 상보적인 염기 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (NB5) 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (NB6) 서열 번호 6의 아미노산 서열에 있어서, 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
    (NB7) 서열 번호 6의 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 토바모바이러스 저항성 제어 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, SlTOM1b 유전자의 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 포함하는 토마토 식물.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, SlTOM1a 유전자의 기능 상실 유전자, SlTOM1b 유전자의 기능 상실 유전자 및 SlTOM1c 유전자의 기능 상실 유전자를 호모 접합형으로 포함하고,
    SlTOM1d 유전자의 기능 상실 유전자를 헤테로 접합형으로 포함하는 토마토 식물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 각 유전자의 기능 상실 유전자를 포함하고,
    상기 기능 상실 유전자는, 각 유전자의 정상 유전자에 대하여, 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가됨으로써 생긴 유전자인 토마토 식물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 각 유전자의 기능 상실 유전자를 포함하고,
    상기 기능 상실 유전자는, 각 유전자의 정상 유전자에 대하여, 프레임시프트 돌연변이가 도입됨으로써 생긴 유전자인 토마토 식물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 각 유전자의 기능 상실 유전자를 포함하고,
    상기 기능 상실 유전자는, 각 유전자의 정상 유전자가 부분 결실 또는 완전 결실하여 생긴 유전자인 토마토 식물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 각 유전자의 기능 상실 유전자를 포함하고,
    상기 기능 상실 유전자는, 각 유전자의 정상 유전자에 있어서, 엑손 영역에 변이가 도입됨으로써 생긴 유전자인 토마토 식물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 토바모바이러스 저항성 토마토 식물은 식물체 또는 그 부분인 토마토 식물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 토바모바이러스 저항성 토마토 식물은 종자인 토마토 식물.
  16. 하기 (a) 공정을 포함하는, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 생산 방법:
    (a) 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재한 토바모바이러스 저항성 토마토 식물과, 다른 토마토 식물을 교잡하는 공정.
  17. 제16항에 있어서, 하기 (b) 공정을 포함하는 생산 방법:
    (b) 상기 (a) 공정으로부터 얻어진 토마토 식물 또는 그 후대 계통으로부터 토바모바이러스 저항성 토마토 식물을 선발하는 공정.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 (a) 공정에 앞서서 하기 (x) 공정을 포함하는 생산 방법:
    (x) 피검 토마토 식물로부터 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재한 토바모바이러스 저항성 토마토 식물을 선발하는 공정.
  19. 대상 토마토 식물의 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자를 기능 상실시키는 기능 상실 공정을 포함하는, 토마토 식물에 있어서의 토바모바이러스 저항성 부여 방법.
  20. 대상 토마토 식물에 토바모바이러스 저항성을 부여하는 부여 공정을 포함하고,
    상기 부여 공정은, 제19항에 기재한 토마토 식물에 있어서의 토바모바이러스 저항성 부여 방법에 의해 실시되는, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 생산 방법.
  21. 피검 토마토 식물로부터, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자를 기능 상실한 피검 토마토 식물을, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물로서 선발하는 선발 공정을 포함하는, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 스크리닝 방법.
  22. 피검 토마토 식물로부터 SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자에 관해서 기능 상실한 피검 토마토 식물을 스크리닝하는 스크리닝 공정을 포함하고,
    상기 스크리닝 공정은, 제21항에 기재한 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 스크리닝 방법에 의해 실시되는, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 생산 방법.
  23. 피검 토마토 식물에 있어서, SlTOM1a 유전자, SlTOM1c 유전자 및 SlTOM1d 유전자가 기능 상실되어 있는지를 검출하는 검출 공정을 포함하는, 토마토 식물의 토바모바이러스 저항성 검출 방법.
  24. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재한 토바모바이러스 저항성 토마토 식물을 이용한 토마토 식물의 가공 식품.
KR1020227031234A 2020-02-12 2020-11-25 토바모바이러스 저항성 토마토 식물, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 생산 방법, 토마토 식물에 있어서의 토바모바이러스 저항성 부여 방법, 토바모바이러스 저항성 토마토 식물의 스크리닝 방법 및 토마토 식물에 있어서의 토바모바이러스 저항성 검출 방법 KR20220139958A (ko)

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