CN107903324B

CN107903324B - 一种结合人cd19和cd3的双特异性抗体

Info

Publication number: CN107903324B
Application number: CN201711131955.0A
Authority: CN
Inventors: 孔健; 叶艺; 周朋; 黄颖; 孔茜; 杨帅; 许磊涛; 张琨; 张凯丽; 王斯斯
Original assignee: Beijing Luzhu Biotechnology Co ltd
Current assignee: BEIJING LUZHU BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.; Lvzhu biopharmaceutical (Zhuhai) Co., Ltd
Priority date: 2017-11-15
Filing date: 2017-11-15
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2037-11-15
Also published as: CN107903324A; US20190284279A1; WO2019095641A1

Abstract

本发明涉及一种结合人CD19和CD3的双特异性抗体，所述双特异性抗体是由特异性识别细胞膜抗原的Fab片段和识别CD3分子的单链抗体构成，其中识别CD3分子的单链抗体通过亲水性的连接肽‑linker和Fab片段的CH1区肽段的C末端相连；其中特异性识别细胞膜抗原的Fab片段为含有特异性识别人CD19抗原的Fab结构，所述双特异性抗体结构如下：

或

其中连接肽‑linker为8‑20亲水性氨基酸所组成。

Description

一种结合人CD19和CD3的双特异性抗体

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种抗体的制备，所述抗体为一种结合人CD19和CD3的双特异性抗体。

背景技术：

近20多年来，随着人类生活水平及卫生条件的不断改善，人类的期望寿命在持续的增加，恶性肿瘤患病人数也日益增长，恶性肿瘤事实上已成为当下严重威胁人类健康的主要疾病。近年来各种免疫治疗方法以及药物发展迅速，在抗体、免疫调节剂以及细胞治疗等各方面都取得重大进展。其中，以T淋巴细胞为主要效应细胞的肿瘤免疫疗法，如嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)和免疫检查点抑制剂(immunecheckpoint inhibitors)成为了肿瘤免疫治疗领域的重大突破。

目前世界范围内经政府批准上市的双特异性抗体产品只有两个，一个是TrionPharma公司开发的catumaxomab，能够靶向肿瘤表面抗原EpCAM和T细胞表面受体CD3，另一个是Micromet公司和Amgen公司开发的Blinatumomab(MT103)，可以同时结合CD19和CD3。两者都是通过激活并召集杀伤性T细胞，从而达到***的目的。Catumaxomab属于Triomab技术平台，由一个靶向肿瘤的小鼠IgG2a和一个靶向人CD3ε的大鼠IgG2b构成，同时还能通过Fcγ受体激活单核细胞、巨噬细胞、星状细胞以及NK细胞，从而实现“三功能”抗体活性。由于小鼠和大鼠的轻重链之间很少发生错配，通过杂交杂交瘤的方式，将分别表达小鼠和大鼠抗体的杂交瘤进行二次融合，从而得到同时分泌Triomab双特异性抗体以及小鼠和大鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株。然后再通过亲和纯化的方式，分别去除小鼠和大鼠单克隆抗体。尽管Catumaxomab是第1个批准上市的双特异性抗体，但它具有非常明显的局限性，主要体现在Triomab抗体技术相对基因工程抗体而言，生产工艺复杂且难于控制，另外还有这种异源抗体容易产生免疫原性的问题。Blinatumomab是一种基于BiTE技术的双特异性抗体，由2个只含有可变区的ScFv通过多肽连接而成。与Triomab抗体不同，BiTE抗体可以通过重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行大规模培养生产，并且BiTE抗体只含有两个结合域，一个高亲和力地靶向癌细胞表面抗原(例如CD19)，另一个以较低亲和力靶向CD3，临床试验已经证明Blinatumomab即便在很低的使用剂量下，仍然可以有效的激活T细胞并清除肿瘤细胞。2017年7月美国FDA批准了依据鼠源性单链抗体分子结构构建的Blinatumomab用于B细胞淋巴瘤的治疗，至此，基因工程双特异抗体用于恶性肿瘤的免疫治疗实现了零的突破。

B细胞淋巴瘤是血液***的B细胞发生的实体肿瘤，它包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)，其分型众多，经典霍奇金淋巴瘤和结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤，现在被认为是起源于B细胞的肿瘤。弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤(MCL)等这5种B细胞非霍奇金淋巴瘤最为常见，约占非霍奇金淋巴瘤的3/4。非霍奇金淋巴瘤是一组起源于淋巴组织并弥漫全身的恶性肿瘤，其发病率和死亡率已居恶性肿瘤第5位，大部分NHL来源于B淋巴细胞(B-NHL)。

B淋巴细胞表面的标记已被普遍地认为是B细胞淋巴瘤、B细胞紊乱性疾病等自身免疫性疾病的靶标。B淋巴细胞表面存在的标志有CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD81～CD86等，目前已针对B淋巴细胞表面高表达数量的分子如CD20、CD19等研究出了单克隆抗体药物，用于B细胞淋巴瘤、类风湿关节炎、全身性红斑狼疮等自身免疫性疾病的治疗，特别是抗人CD20单抗(利妥昔单抗等)已成为治疗非何杰金氏淋巴瘤的首选药物，并在全世界范围内得到了最为广泛的使用。

众所周知的一个事实是急性淋巴母细胞性白血病(ALL)和许多其它的B淋巴细胞恶性肿瘤并不表达CD20，或低水平的表达CD20，大约仅有一半的非何杰金氏淋巴瘤患者对CD20控制的免疫疗法有反应。CD19是一种与B淋巴细胞分化、活化、增殖及抗体产生有关的重要膜抗原，是诊断B淋巴细胞系肿瘤(白血病、淋巴瘤)和鉴定B淋巴细胞的最好标志。CD19是B淋巴细胞表面特异标志，属于免疫球蛋白超家族成员，与B细胞活化和信号的转导有关，在前B淋巴细胞、未成熟B淋巴细胞、成熟B淋巴细胞、激活的B淋巴细胞中表达，在淋巴多能干细胞以及其他组织中均无表达；大多数NHL起源于B淋巴细胞，95％以上的B细胞NHL表达CD19抗原，且CD19抗原比较暴露，人体血清中也无游离的CD19存在，因此CD19可作为治疗B细胞淋巴瘤的靶点。

CD19分子是一个比CD20存在更为广泛的B细胞表面的标志，是表达在B细胞表面的受体，它属于免疫球蛋白超家族，其配体及相关分子有:CR2(CD21)、TAPA-1(CD81)、Leu-13、PI-3K、Vav、lyn及fyn。CD19是一种重要的信号传导分子，调节B淋巴细胞的生长、激活和分化。CD19能调节信号反应，在调节B淋巴细胞抗原受体或其他表面受体的信号阔值中起重要作用。CD19是一种在前B细胞发育的早期阶段到终末分化表达的泛B细胞膜糖蛋白，能调节B淋巴细胞的发育和功能。在大多数淋巴来源的肿瘤、大多数非霍奇金淋巴瘤(NHL)和包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(WM)在内的白血病上鉴定到CD19的表达。

CD19的表达贯穿于B淋巴细胞的整个生命周期，从原始B细胞、前B细胞、早期发育的B细胞、成熟的B细胞、从成熟的B细胞发育而来的浆细胞、以及恶性B淋巴瘤细胞。绝大多数B淋巴细胞来源的瘤细胞如前B急性淋巴母细胞性白血病、慢性B淋巴细胞性白血病、前淋巴细胞性白血病、非何杰金氏淋巴瘤、毛细胞白血病、普通急性淋巴细胞型白血病和一些非急性淋巴母细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤等都表达CD19分子。

CD3是存在于所有T淋巴细胞表面的一种标志。CD3别名T3或Leu-4。有3个亚型，分别为CD 3δ、CD 3ε和CD 3γ,CD 3δ和CD 3ε的分子量均为20kD，CD3γ的分子量为26kD，它表达于T淋巴细胞、胸腺细胞及NK细胞膜的表面。在正常外周血淋巴细胞上有61％～85％表达，在胸腺细胞上有60％～85％表达。它属于免疫球蛋白超家族。CD3是T淋巴细胞受体(TCR)复合体的组成部分，与α/β和γ/δ的T淋巴细胞受体(TCR)形成复合体，是传导与肽/MHC结合的TCR信号的主要膜抗原。TCR在细胞表面的表达、抗原识别及信号传导中是必不可少的。

CD3是T淋巴细胞表面特异分子，通过它可以募集具有杀伤作用的T淋巴细胞。CD3的单克隆抗体可以诱导或阻止T淋巴细胞活化。在抗CD28抗体或IL-2存在下，抗CD3抗体可诱导T淋巴细胞的凋亡。CD3是外周血中成熟T淋巴细胞的最好标志物(marker)之一，测定CD3+T淋巴细胞对评价免疫缺陷症(T淋巴细胞缺乏症)、白血病、淋巴瘤(T淋巴细胞型)的分型诊断具有重要意义。抗CD3单克隆抗体可用于器官移植或骨髓移植时的免疫抑制治疗，还可用于重症自身免疫性疾病的免疫调节治疗，以去除T淋巴细胞。美国专利4,361,549记载了一种鼠源性杂交细胞系，用于生产针对发现于正常人T细胞和皮肤T淋巴瘤细胞的抗原的单克隆抗体OKT3，另外在美国专利5,885,573中，记载了将鼠源性的OKT3转移到人类抗体框架中构建的人源化单抗，以期降低其在人体应用时的免疫原性，减少人抗鼠抗体(HAMA)反应的发生几率。OKT3是美国FDA在1986年批准的第一个用于治疗器官移植急性期排斥的鼠源性单克隆药物，也是全世界第一个经政府药品管理当局批准使用的单克隆抗体药物。鼠源性OKT3单抗治疗的主要缺陷是由于T细胞和FcγR承载细胞之间的交叉连接导致的细胞因子释放所引起的T细胞活化以及HAMA反应，OKT3在市场上使用了10多年之后终被人源化的抗体以及新的小分子免疫抑制剂所取代。另一方面，OKT3或其它抗CD3抗体可用作刺激T细胞活化与增殖的免疫增强剂，在体外细胞培养中抗CD3单抗、与抗CD28抗体或白细胞介素-2联合应用以诱导T细胞增殖。OKT3还进一步单独或作为双特异性抗体的组分用于将细胞毒T细胞靶向于肿瘤细胞和病毒感染细胞。到目前为止，用抗体作为招募T细胞试剂的方法被若干发现所阻碍。首先，具有T细胞高亲和力的天然或改造的抗体常常不会激活它们所结合的T细胞；其次，T细胞低亲和力的天然或改选的抗体在引发T细胞介导的细胞裂解能力方面通常是效果欠佳或是无效的，因此选择一种具有合适亲和力的抗CD3单抗是十分重要的。

目前国内外含有特异于人CD19和CD3的双特异抗体分子在动物模型体内和/或一些有限的临床试验研究中显示出有明显的效果。根据所使用的表达***平台技术的差别，其作用效果表现出了极大地差别；已发表的科学文献、专利文献中使用原核表达***表达小分子双特异抗体的较多，这种表达***操作快速简单，但得到的双特异性抗体分子表现出的效果总是不能令人满意，另一方便其稳定性也较差，容易形成聚合体而失去活性，需要超低温冰箱冻存或制成冻干粉才能解决稳定性不佳的问题。双功能抗体可通过杂交杂交瘤技术、化学反应共价偶联连接单克隆抗体或基因工程技术的方法进行生产，其中一些双功能抗体的低生物活性或因采用非定向偶联技术致使必须使用较高剂量的药物才能发挥一定的效用，在很多情况下，在动物实验模型阶段即可发现这些经化学反应共价偶联获得的双功能抗体通常不能展示出有明显的治疗效果。

现有的研究已经显示出了包含特异于人CD3和人CD19抗原的双特异性单链抗体分子[Loffler，Blood 95(2000)，2098-103；WO99/54440；Dreier，Int.J.Cancer.100(2002)，690-7、WO99/54440专利列举了VL(CD19)-VH(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)]具有较为确切的临床疗效，同时也强调该构建体可变区的顺序不是决定性的。但对于药用用途的双特异性抗体，研究人员必须能提供可靠的高水平表达和可行的纯化技术路线才可能大量生产药物分子，所设计和表达的蛋白质药物分子中最好不含非必需的肽段特别是一些可在人体产生抗体的肽段。WO 99/54440专利、中国专利200480014513.2所列示的CD19xCD3重组肽链的C末端携带了6个组氨酸形成的尾巴(His-Tag)，主要是为了利用金属离子螯合色谱进行纯化，且此6个组氨酸尾巴并没有从最终形成的药品中除掉。含此种分子结构的双特异抗体Blinatumomab已于2014年被美国FDA批准治疗费城染色体阴性前体B细胞急性淋巴性白血病的治疗。

单抗隆抗体药物已成功的应用于多种恶性肿瘤及人类自身免疫性疾病的治疗。各种单克隆抗体药物具有优异的靶向性，副作用明显小于大多数的化学合成药，尽管其价格昂贵，但这丝毫不能阻挡其迅猛的增长趋势，在世界各国民众生活水平日益提高的当下，为数众多的基因工程抗体药物也将备受患者及医务人员的青睐。目前临床上使用的各种治疗恶性肿瘤的单抗多是人IgG1型的，其作用的发挥主要依赖ADCC、以及CDC作用，但这种结构的单抗分子量大，很难穿透肿瘤血管发挥应有的杀伤作用，一般需要特别高的剂量才能在肿瘤内达到应有的浓度，发挥有效的治疗作用，因此单抗药物的治疗费用一直居高不下。相对于完整分子的单抗而言，微型双功能抗体具有分子量小的优点，具有较好的肿瘤穿透性，逐渐成为了目前研究的热点，这种微型双功能抗体药物分子一般不含有人类IgG抗体分子结构的CH1、CH2、CH3结构区域，也不含N糖基化位点，可以使用非哺乳类细胞表达体系进行表达。另外尚有多种具有人完整IgG分子结构的双功能抗体，如具有完整的CH1、CH2、CH3结构的双特异性抗体，其两个Fab片段分别识别一种特异的抗原位点，这种分子结构的双特异抗抗体在结果设计上一般需要采用CH1区和轻链的CH进行互换，以增加双功能抗体形成的比例；或如在识别一种抗原的完整分子的重链的C末端连接识别另外一种抗原的单链抗体，这样形成的双功能抗体Fab段保持了原始抗体的亲合力，而其重链C末端的的ScFv的亲和力一般会低于亲本抗体的亲和力。

T细胞表面抗原CD3和恶性肿瘤细胞膜表面相对上调表达抗原的双特异性微型抗体介导的抗肿瘤治疗，以及体外致敏的树突状细胞诱导的相对特异的细胞毒性淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)对肿瘤的杀伤等，被认为是传统的手术治疗、放化疗方法之外最有希望清除残余肿瘤细胞和微小转移病灶从而根治肿瘤的辅助治疗措施，许多动物实验和临床试验已经证实了生物治疗措施的疗效。双功能抗体具有两条抗原结合臂，能分别与靶细胞和效应细胞结合，引导效应细胞靶向杀灭肿瘤，实现肿瘤的靶向治疗。

发明内容：

本发明提供一种以人类白细胞分化抗原CD3和CD19为主要靶点的非对称结构的双特异抗体，通过它可以达到利用人体自身的T细胞来杀伤B细胞，以达到治疗各种B淋巴细胞来源的恶性肿瘤的目的。与Blinatumomab不同的是本发明的双特异性抗体结合肿瘤抗原的部分采用了结构稳定的Fab，而不是容易产生聚合的ScFv结构，且在肽链的C末端也没有6×His尾巴。

本发明的双特异性抗体具有两个特异性抗原结合位点，它可以同时与CTL细胞表面的CD3分子复合物以及靶细胞表面的特异性抗原相结合，无需主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ类分子的参与，这种结合产生的效应因B淋巴细胞表面存在的B7和T细胞表面存在的CD28共刺激分子参与而明显放大，从而激活T细胞高效精准地杀伤肿瘤细胞。

与已经上市的Blintumomab相比，本发明的抗人CD19、CD3双功能抗体具有明显的优势，其抗人CD19分子(或其他的肿瘤分子)部分为完整的人源化Fab抗体，与人CD19的亲和力明显优于鼠源性的ScFv抗体，而与人CD3分子相结合的部分采用了结合力较弱的ScFv分子形式，C末端不含非必须的组氨酸尾巴。本发明的双功能抗体为创造性的采用Fab-ScFv这种非对称结构形式的全新一代基因工程双功能抗体。此种新的分子形式最大程度的保持了与肿瘤靶标抗原结合的能力，而又适当的弱化了与T细胞上CD3的结合力，选择CD3相对较弱的结合力的目的是保证只有同时结合靶细胞时才能激活细胞信号通路,在无靶细胞的情况下,由于缺乏必需的共刺激分子的作用，本发明的双功能抗体在该浓度下并不具备激活T细胞的作用。

为此，本发明提供一种结合人CD19和CD3的双特异性抗体，所述双特异性抗体是由特异性识别细胞膜抗原的Fab片段和识别CD3分子的单链抗体构成，其中识别CD3分子的单链抗体通过亲水性的连接肽-linker和Fab片段的CH1区肽段的C末端相连；

其中特异性识别细胞膜抗原的Fab片段为含有特异性识别人CD19抗原的Fab结构，所述双特异性抗体结构如下：

其中连接肽-linker为8-20亲水性氨基酸所组成。

优选的，本发明所述的双特异性抗体，结构如下：

其中连接肽-linker为GGGGS形式的2-3倍多肽作为连接肽。

以下结构中，

VH(CD19)-CH1-linker-VH(CD3)-linker-VL(CD3)的氨基酸序列见序列表3

VL(CD19)-CL的氨基酸序列见序列表9

VH(CD19)-CH1-linker-VL(CD3)-linker-VH(CD3)的氨基酸序列见序列表6

VL(CD19)-CL的氨基酸序列见序列表9

其中含编码引导肽基因序列的重链所含的核苷酸序列见序列1，相对于结构式的第14-70个核苷酸的位置；CD19重链可变区序列、人IgG CH1序列相对于第71-754个核苷酸的位置；连接肽相对于第755-799、1175-1219个核苷酸的位置；VH(CD3)相对于第800-1174个核苷酸的位置；VL(CD3)相对于第1220-1546的位置；

含引导肽序列的重链所含的氨基酸序列如序列2所示；引导肽序列相对于第1-19个氨基酸。第20～247个氨基酸为VH(CD19)+IgG CH1，第248～262个氨基酸、第388～402个氨基酸为连接肽(G4S)₃，第263～387个氨基酸为VH(CD3)，第403～511个氨基酸为VL(CD3)。

其中含编码引导肽基因序列的重链所含的核苷酸序列见序列4，相对于结构式的第14-70个核苷酸的位置；CD19重链可变区序列、人IgG CH1序列相对于第71-754个核苷酸的位置；连接肽相对于第755-799，1127-1171个核苷酸的位置；VL(CD3)相对于第800-1126个核苷酸的位置；VH(CD3)相对于第1172-1546的位置。

含引导肽的重链所含的氨基酸序列如序列5所示；第1～19个氨基酸为信号肽序列，第20～247个氨基酸为VH(CD19)+IgG CH1，第248～262个氨基酸、372～386个氨基酸为连接肽，第263～371个氨基酸为VL(CD3)，第387～511个氨基酸：VH(CD3)。

含编码引导肽基因序列的轻链所含的核苷酸序列见序列表7所示，相对于第14-73核苷酸的位置。

含引导肽序列的轻链氨基酸序列如序列8所示所示，相对于结构式的第1-20氨基酸的位置。

不含引导肽重链所含氨基酸的序列如序列3、6所示

不含引导肽轻链所含的氨基酸序列如序列9所示

其中所述的识别CD3分子的单链抗体结构采用ScFv的形式，是针对人CD3ε的，可以来源目前公知的各种单克隆抗体的可变区基因序列，包括但不限于OKT3、X35-3、WT31、WT32、SPv-T3b、TR-66、11D8、12F6、M-T301、SMC2和F101.01的CD3特异性抗体。

其中所述的特异性识别人CD19抗原的Fab结构片段可以来源于公知的各种鼠源性抗人CD19单克隆抗体的轻链、重链可变区的序列，如4G7、B43、CLB-CD19、SJ25-C1、Leu-12、HD37或其它已知的抗人CD19单抗的可变区序列，或使用本公司自行构建的抗CD19单抗重链、轻链可变区的序列。

本发明进一步提供本发明双特异性抗体的制备方法，所述双特异性抗体采用基因重组技术制备，可以使用各种形式的哺乳类动物细胞表达载体，优选使用GS表达***，在CHO细胞中进行表达，CHO细胞的培养采用化学成分限定培养基，培养过程中不添加激素及各种毒物来源的蛋白质或其水解物。

本发明所述的制备方法，包括将含双特异性抗体基因的单一质粒载体采用单一内切酶酶切进行线性化，转染CHO细胞后获得阳性克隆株，生物反应器中培养，产物分泌到培养液上清中，利用离子交换色谱介质、或亲和色谱联合离子交换色谱进行纯化，得到可特异性结合人CD19和CD3的双特异性抗体。

本发明进一步提供本发明的双特异性抗体在制备治疗人类B细胞来源各种恶性肿瘤或免疫紊乱性疾病，如各种B细胞白血病(淋巴瘤)、非何杰金氏淋巴瘤、严重的自身免疫性疾病如类风湿关节炎、强直性脊柱炎的药物中的应用。

本发明进一步提供含有本发明双特异性抗体的药物组合物。所述的药物组合物，可以制成液体制剂，也可以制成冻干制剂，可以使用持续性输液泵持续给药，也可采用脉冲形式的输液泵定时给药，推荐使用静脉内给药，也可以采用皮下注射给药。

采用本发明的技术构建的双功能抗体在CHO细胞中成功的实现了高水平的稳定表达、及液相色谱纯化，通过本发明的技术与方法可以得到具有极高纯度的双功能抗体并针对该抗体开发出了多种液体制剂；采用本发明给出的液体制剂配方，本发明的双特异性抗体在0.1-10mg/ml浓度范围内在2-8℃避光存放的条件下质量稳定。

本发明提供了可产生高亲和力的肿瘤靶向分子抗体和具有相对弱结合能力的CD3抗体，二者通过适宜长度的亲水性肽链相连接，为抗体特异性结合部分提供了充分的自由伸展的空间，该分子结构具有良好的热稳定性，较少产生聚合体，最大限度的保证了抗体分子的稳定性及优良的结合能力，优良的液体制剂配方及稳定的分子结构为方便临床安全给药提供了保障。

本发明所述的药物所述的药物主要用于治疗和/或减轻B细胞相关或B细胞介导的紊乱。

在本发明双特异抗体实施方案中，所述CD3特异性结构域的VH和VL区可来源于目前已知的多种抗人CD3的单抗隆抗体：如OKT3、X35-3、WT31、WT32、SPv-T3b、TR-66、11D8、12F6、M-T301、SMC2和F101.01的CD3特异性抗体。这些CD3单抗的特异性在免疫学研究领域中均是已知的，在多种形式的出版物中均有描述。在更优选的实施方案中，该CD3特异性结构域的所述VH和VL区来源于OKT-3或TR-66、或来源于其针对CD3ε的抗体衍生物。

在本发明的实施方案中，人源化CD19单抗的序列可来源于本领域的科研人员公知的鼠源性抗人CD19单克隆抗体的轻链、重链可变区的序列，如4G7、B43、CLB-CD19、SJ25-C1、Leu-12、HD37或其它已知的抗人CD19单抗的可变区序列，或使用本公司自行构建的抗CD19单抗K19的重链、轻链可变区的序列。

本发明的抗人CD19和CD3双特异性抗体分子是一种能同时和人B细胞表面的CD19分子以及人CD3分子相结合的的基因工程抗体分子，它是将抗人CD19分子重链可变区基因、人IgG CH1区基因、亲水性连接肽基因和抗人CD3单链抗体的基因***到表达载体中，之后再将含抗人CD19单抗轻链(含kappa链CL区)的基因***到表达载体之中，所构建的质粒载体含有完整的表达抗人CD19单抗Fab以及抗人CD3ε单链抗体的基因，将此质粒用内切酶酶切，进行线性化之后，再用电转仪转染CHO细胞，筛选出表达抗人CD19和CD3ε的阳性克隆，进一步加压筛选出高表达的阳性克隆，建立细胞种子库，保存于液氮容器中。用流式细胞计测定所表达的双特异性抗体和人T淋巴瘤细胞、人B淋巴瘤细胞的结合活性。将获得的高表达克隆株用化学成分限定培养基培养一定的时间后，离心收获上清，经过多次离子交换色谱纯化工艺纯化，获得了单体纯度在98％以上的双特异性抗体，在B细胞和T细胞存在的条件下，该双特异性抗体可持续高效的激活T淋巴细胞杀伤B淋巴细胞。本发明双特异性抗体的含引导肽基因VH(CD19)-CH1-linker-VH(CD3)-linker-VL(CD3)的重链的核苷酸序列见SEQID No.1，含引导肽的重链氨基酸序列见SEQ ID No.2，不含引导肽的重链氨基酸序列见SEQID No.3；本发明双特异性抗体的含引导肽基因VH(CD19)-CH1-linker-VL(CD3)-linker-VH(CD3)的重链的核苷酸序列见SEQ ID No.4，含引导肽的重链氨基酸序列见SEQ ID No.5，不含引导肽的重链氨基酸序列见SEQ ID No.6；含引导肽基因的CD19单抗轻链的核苷酸序列见SEQ ID No.7；含引导肽轻链的氨基酸序列见SEQ ID No.8,不含引导肽的CD19抗体轻链VL(CD19)-CL氨基酸序列见SEQ ID No.9。

本发明的双特异抗体的重链中的含有一段将抗人CD19单抗Fab重链CH1区与抗人CD3单链抗体相连接的亲水性多肽，为了给CD3特异性的单链抗体提供更大的自由度，连接肽的长度应不短于8个氨基酸，不长于20个氨基酸；氨基酸肽链的长度优选业界常用的GGGGS的形式的整倍数、或其非整倍数亦可，优选GGGGS形式的2～3倍作为连接肽，即连接肽的长度在10～15个氨基酸之间为优选长度。

在本发明的实施方案中，提供了生产本发明药物的具体方法，该方法包含此处所定义的非对称型双特异性抗体载体的构建、质粒转染、克隆细胞株、生物反应器培养试验、双功能抗体的纯化、稳定的液体制剂配方及其稳定性试验、T淋巴细胞增殖试验、B淋巴细胞杀伤试验、荷瘤鼠模型试验等，相应的方法在实施例中进行了阐明。

本发明的双特异性抗体可用于B细胞来源的各种恶性肿瘤的治疗，也可用于自身免疫性疾病、B细胞来源的免疫紊乱性疾病的治疗。

以下我们将通过实施例介绍本发明的双特异性抗体及其用途。

附图说明：

图1、193HVkP重组质粒酶切电泳照片

泳道1-4：193HVkP质粒酶切产物

泳道5：DL2000(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)

泳道6：DL10000(10000bp、7000bp、4000bp、2000bp、1000bp、500bp、250bp)

图2、CD19-CD3双特异抗体非还原SDS-PAGE分析结果

图3、CD19-CD3双特异抗体还原型SDS-PAGE分析结果

图4、CD19-CD3双特异抗体HPLC-SEC色谱图

图5、K193抗体还原型/非还原型CE-SDS电泳图谱

图6A、CD19-CD3双特异抗体LC-MS质谱图

图6B、CD19-CD3双特异抗体LC-MS质谱图

图7、CD19-CD3双特异性抗体(上)、OKT3(下)与Jurkat细胞的结合反应

图8、CD19-CD3双特异性抗体与CD19阳性细胞反应(流式细胞仪)

图9、CD19-CD双特异抗体与CD19阳性B细胞的结合反应

图10A、CD19-CD3双特异性抗体、CD单抗K19与Raji细胞的反应(流式细胞仪)

图10B、CD19-CD3双特异性抗体、CD单抗K19与Raji细胞的反应(流式细胞仪)

图10C、CD19-CD3双特异性抗体、CD单抗K19与Raji细胞的反应(流式细胞仪)

图11、CD19-CD3双特异性抗体、CD19单抗与Raji细胞的反应(流式细胞仪)

图12、K193抗体激发T细胞杀伤B细胞的剂量反应曲线

图13、K193抗体与重组人CD3E的特异性结合反应曲线

图14、K193抗体与重组人CD19的特异性结合反应曲线

图15 B细胞存在与否对K193抗体作用的影响

图16、B7:CD28共刺激分子单抗对K193激活淋巴细胞表达CD69的影响

图17、B7:CD28共刺激分子单抗对K193激活淋巴细胞表达CD25的影响

图18、双特异性抗体CD19-CD3介导的PBMC对CD19阳性细胞的杀伤作用

图18A、K193，BLI193抗体对Raji细胞杀伤百分比

图18B、K193，BLI193抗体对Namalwa细胞杀伤百分比

图18C、K193，BLI193抗体对Daudi细胞杀伤百分比

图18D、K193，BLI193抗体对K562细胞杀伤百分比

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明。

实施例1、质粒表达载体的构建：

质粒LZ19HT的构建(pMD19-T Vector+CD19VH+hIgG1 CH1)和LZ19VkT(pMD19-TVector+CD19Vk+hIgG1 Ck)的构建

使用引物H-F1，LZ19H-F2和LZ19H-R1从含有人源化抗CD19单抗重链质粒PTY5-KJ2-h中扩增出片段CD19VH+hIgG1 CH1并引入KOZAK序列和重链信号肽序列、Linker((G4S)3)和酶切位点，然后加A尾并同pMD19-T Vector进行连接，获得质粒LZ19HT；

使用引物P71-F1，LZ19Vk-F2和LZ19Vk-R1从含有人源化抗CD19单抗轻链质粒PTY5-KJ2-l中扩增出CD19Vk+hCk基因片段并引入KOZAK序列和轻链信号肽序列和酶切位点，然后加A尾并pMD19-T Vector进行连接，获得质粒LZ19VkT；将LZ19HT和LZ19VkT的不同克隆送测序公司(北京英骏生物技术有限公司)进行测序并挑选出完全正确的克隆进行下一步试验，克隆编号为LZ19HT36和LZ19VkT20；

引物编号	引物序列(5’→3’)
		H-F1	CCCAAGCTTAATTGCCGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTGTTCCTGTTCTTTCTGTCC
LZ19H-F2	TTCCTGTTCTTTCTGTCCGTGACCACAGGCGTGCATTCTCAGGTGCAGCTGCAGCAG
		LZ19H-R1	CGCCACCGCCGGATCCACCTCCGCC
P71-F1	CCCAAGCTTAATTGCCGCCACCATGTCTGTGCCTACCCAGGTGCTGGGACTGCTGCTG
		LZ19Vk-F2	CTGGGACTGCTGCTGCTGTGGCTGACAGACGCCCGCTGTGACATCCAGCTGACACAGT
19Vk-R1	CCG GAATTC TCATTA GCTACACTCTCCCCTG

质粒19H3HVkP(pXC184+CD19VH+HIgG1 CH1+Anti-Human-CD3-ScFv)和19VkP的构建(pXC174+CD19Vk+hIgG1 Ck)的构建

将LZ19HT36、pXC-184以及LZI2CHL(Anti-Human-CD3-ScFv序列)通过相应的限制性内切酶处理后，获得LZ19HT-HindIII/BamHI，LZI2CHL-BamHI/EcoRI以及pXC18.4-HindIII/EcoRI，将三个酶切产物进行连接，转化和筛选获得阳性克隆19H3HVkP(pXC184+CD19VH+HIgG1 CH1+Anti-Human-CD3-ScFv)。

将LZ19VkT20、pXC-17.4通过相应的限制性内切酶处理后，获得LZ19VkT-HindIII/EcoRI，pXC174-HindIII/EcoRI，将2个酶切产物进行连接，转化和筛选获得阳性克隆19VkP(pXC174+CD19Vk+hIgG1 Ck)。

193HVkP的构建

使用限制性内切酶NotI和PvuI处理19H3HVkP和19VkP，获得酶切产物19H3HVkP-N/P和19VkP-N/P，通过连接酶将两个酶切产物进行连接，转化和筛选获得阳性克隆193HVkP，大量提取质粒193HVkP并使用限制性内切酶PvuI进行线性化处理和苯酚抽提纯化，获得线性化质粒193HVkP-直；质粒琼脂糖电泳照片见图1。

实施例2、稳定克隆株的建立、筛选

在无菌层流工作台内，将基因脉冲发生器Xcell(Bio-Rad)的穿孔电压设定为300V、900μF、指数脉冲，取出间隙为4mm一次性电击杯，加入40μg直线化的质粒DNA(100μl)及0.7ml CHO K1细胞(GS KO)悬液，将电穿孔仪的电阻设为无穷大，通过电转染的方法将线性化后的质粒193HVkP-直转染至CHO K1细胞中，将电击杯内的细胞转移至三角培养瓶内，加入CD CHO培养液，于36～37℃、5％CO₂摇床上培养，135转/分钟，培养24小时之后，低速离心收集细胞，更换为含50μM MSX的CD CHO培养液(不含谷氨酰胺)，通过有限稀释法获得单克隆细胞株，之后通过ELISA的方法(鼠抗人κ链单克隆抗体+表达产物K193+羊抗人IgG-HRP)筛选出表达量较高的克隆株并进行传代培养，最终获得6个克隆株，克隆编号分别为45B10、45D10、41C11、41B6、45C7和45F6，使用流式细胞仪检测每个克隆株表达产物同Jurkat细胞和Raji细胞的结合活性，依据培养上清中抗体表达量，结合活性试验的结果选择41C11克隆株(K193)进行放大试验。

实施例3、针对CD19-CD3双特异抗体表达产物的纯化

将获得的41C11克隆株(K193)接种到含500ml CD CHO培养液的2L三角瓶内，旋紧透气瓶盖，于36～37℃、5％CO₂摇床上培养，135转/分钟，培养7天之后，活细胞密度降至60％至70％之间时，12000r/min高速离心去除细胞及细胞碎片，收集细胞培养物上清，然后用纯水或pH5.0-6.0的20mM柠檬酸磷酸盐缓冲液进行有限的稀释，稀释至溶液的电导率不超过4mSimens/cm，之后流经强阳离子交换凝胶Eshmuno S充填的色谱柱(XK26*20cm，GEHealthCare)，在此条件下Eshmuno S凝胶可吸附CD19-CD3双特异性抗体，上样结束之后，再用柠檬酸磷酸盐缓冲液流洗至基线，梯度增加氯化钠浓度，依次洗脱结合到凝胶上的蛋白质，最早出峰的即为抗CD19-CD3抗体。超滤置换缓冲液之后，再经POROS XQ强阴离子交换色谱柱纯化，收获CD19-CD3双特异性抗体，然后用12.5％SDS-PAGE(Mini-PROTEAN TetraSystem，Bio-Rad)对纯化后的CD19-CD3双特异性抗体进行电泳，当溴酚蓝指示剂电泳到距凝胶玻璃板下端时，停止电泳，取出凝胶，用考马斯亮蓝染色液染色2小时，脱色至背景透亮后拍照。电泳结果见图2、图3。

纯化后的CD19-CD3双特异性抗体用40mM PBS(含0.5M Na₂SO₄,pH 6.5)作为流动相，在岛津LC-20AT HPLC TSK 3000SWxl(7.8x300mm)分析柱上进行单体、聚合体含量分析，检测的结果表明，HPLC纯度不低于95％，聚合物含量小于5％，未发现可见的杂质峰出现，结果见图4。

在Agilent CE 7100高效毛细管电泳仪上，我们对纯化后的CD19-CD3双特异性抗体进行了还原性、非还原性CE-SDS分析。使用未涂层熔融毛细管柱(内径50μm，总长33cm，有效长度24.5cm)，在还原和非还原条件下，依据分子量大小，定量测定CD19-CD3双特异性抗体(K193抗体)的纯度。取超滤脱盐后的K193抗体(蛋白质含量1mg/ml)86μl，加入9μl样品缓冲液(含1％SDS的100mM Tris-HCl，pH8.3)，加入5μlβ-巯基乙醇/5μl 250mM碘乙酰胺，混匀后置于70℃水浴加热10分钟，分别得到还原型/非还原型电泳样品。CE-SDS参数：电动进样，-5KV进样80秒；分离电压为-16.5KV，升压时间为1分钟；DAD检测波长：220nm，4nm带宽(Reference off)；采样频率设置为2.5Hz；运行过程中进出口缓冲瓶压力为2bar。图5为K193抗体还原型/非还原型电泳谱图：结果表明CD19-CD3双特异性抗体的纯度超过了95％以上。

采用waters ACQUITY UPLC-Xevo G2-XS QTof液质联用***(bioQuaternarySolvent Manager型超高效液相色谱四元泵、TUV Detector型紫外检测器、bioSamplesManager-FTN型自动进样器、Waters Xevo G2-XS Q Tof串联四级杆飞行质谱***)，对CD19-CD3双特异性抗体(K193抗体)的完整蛋白分子质量进行测定。使用MassLynxTM4.1软件进行数据采集，并采用UNIFI Portal软件对数据进行处理。UPLC参数：流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；色谱柱：XBridge Protein BEH C4,2.1mmX100mm,3.5μm；流速：0.300ml/min；检测波长：280nm；样品浓度：0.5mg/ml；进样体积：1μl；柱温：80℃；样品盘温度：10℃；运行时间：10min；程序：0-1min 5％B，6-7min 95％B，7.5-8min 5-95％B，8.5-9min 5-95％B，9.5-10min 5％B。质谱参数：ESI模式：正离子MS(+)，灵敏度模式；毛细管电压：3kV，锥孔电压：180V，offset：150V；脱溶剂气(N2)流速：800L/h，脱溶剂气温度：450℃，源温度：120℃；质量扫描范围：600～4500。使用UNIFI Portal软件处理数据，去卷积参数为：m/z范围1500-2500；输出分子量范围70000-80000；选择手动峰宽模式，起始峰宽0.1，结束峰宽0.2；迭代的最大次数18。选择N末端焦谷氨酸化为可变修饰。图6为K193抗体分子量检测所得质谱图以及去卷积图谱。UPLC-ESI QTOF检测CD19-CD3双特异抗体的完整分子量为75311。

实施例4、流式细胞计测定CD19-CD3抗体与CD3阳性细胞的结合活性

为了测试CD19-CD3双特异性抗体与CD3结合的能力，我们对获得的双特异性抗体进行流式细胞术分析(FACS)。用0.02mol/L PBS(pH 7.4，含1％BSA)稀释K193抗体至起始蛋白质浓度162μg/ml(对照OKT3单抗起始浓度为54μg/ml)。取一96孔U型板，向A行10～12孔加入0.02mol/L PBS(pH 7.4，含1％BSA)50μl，作为空白对照孔。向B行2～10孔加入0.02mol/LPBS(pH 7.4，含1％BSA)50μl，随后向B1孔中加入抗体含量稀释至162μg/ml的K193抗体75μl，移液器吸取B1孔中抗体溶液25μl至B2孔，混合均匀后按3倍梯度依次稀释至B10孔，混匀后吸出25μl，废弃，保持每孔体积50μl。稀释范围162μg/ml～0.0082μg/ml，共10个稀释度。制备细胞密度为5.0×10⁶cells/ml的Jurkat细胞悬液，向上述样品孔中依次加入100μl细胞悬液，混匀置于室温反应60分钟后，离心小心吸出上清弃去。除空白对照A10、A12孔加入0.02mol/L PBS(pH 7.4，含1％BSA)50μl外，其余各孔均加入稀释至2μg/ml的鼠抗人IgGκ链单抗50μl，混匀置于室温反应60分钟后，离心小心吸出上清弃去。向空白对照A10、A11孔加入0.02mol/L PBS(pH 7.4，含1％BSA)50μl，向样品孔加入稀释好的FITC标记的羊抗鼠IgG(1:1000)50μl，混匀置于室温避光反应30分钟后，离心小心吸出上清弃去。向各孔分别加入150μl 0.02mol/L PBS(pH 7.4)，将孔内细胞重悬。设定流式细胞仪门内上样量50000events，流速Fast，枪尖小心吹悬混匀细胞后，将细胞悬液转移至0.5ml离心管中，依次测定细胞荧光值，同时用GraphPad Prism5.0软件计算K193抗体的EC50值为4.01×10^- ⁸mole/L，对照OKT3的EC50值为6.09×10^-9mole/L，K193抗体与CD3的结合活性仅约为OKT3的1/10，K193与T细胞表面CD3ε分子的结合能力明显弱于OKT3，结果见图7。

实施例5、CD19-CD3双特异性抗体与CD19阳性细胞的结合活性试验Raji细胞、Daudi细胞、IM-9细胞均为B淋巴瘤细胞，其细胞表面有CD19抗原，可以特异性的与细胞表面的CD19抗原相结合。采用流式细胞仪检测双特异抗体样品K193与Raji细胞、Daudi细胞、IM-9细胞CD19位点特异性结合情况。本实验选用CD19阴性的K562细胞作为阴性对照。

1、CD19-CD3双特异性抗体与多种B细胞淋巴瘤细胞的结核反应采用流式细胞仪(Accuri^TM C6 Flow Cytometer，Becton Dickinson公司)检测K193抗体与Raji、Daudi、IM-9、K562细胞CD19位点特异性结合活性。用0.02mol/L PBS(pH 7.4，含1％BSA)稀释K193抗体至起始蛋白质浓度18μg/ml，取1块96孔U型板，向A行10～11孔加入0.02mol/L PBS(pH 7.4，含1％BSA)50μl，作为空白对照孔。向B、C、D、E行2～9孔加入0.02mol/L PBS(pH 7.4，含1％BSA)50μl，随后向B1、C1、D1、E1孔中加入抗体含量稀释至18μg/ml的K193抗体75μl，移液器吸取列1孔中抗体溶液25μl至列2孔，混合均匀后按3倍梯度依次稀释至列9孔，混匀后吸出25μl，废弃，保持每孔体积50μl。稀释范围18μg/ml～0.0027μg/ml，共9个稀释度。制备细胞密度为5.0×10⁶cells/ml的细胞悬液，分别向B、C、D、E行上述样品孔加入Raji、Daudi、IM-9、K562细胞悬液100μl，混匀置于室温反应60分钟后，离心小心吸出上清弃去。

除空白对照A10孔加入0.02mol/L PBS(pH 7.4，含1％BSA)50μl外，其余各孔均加入稀释好的鼠抗人κ链单抗-FITC(1：1000)50μl，混匀置于室温避光反应30分钟后，离心小心吸出上清弃去。向各孔分别加入150μl 0.02mol/L PBS(pH 7.4)，将孔内细胞重悬。设定流式细胞仪门内上样量50000events，流速Fast，加样尖小心吹悬混匀细胞后，将细胞悬液转移至0.5ml离心管中，依次测定细胞荧光值，流式细胞仪测定结果见图8，反应曲线见图9，用GraphPad Prism5.0软件计算K193抗体与Raji、Daudi、IM-9细胞结合的EC₅₀值分别为231.6、359.9、324.5ng/ml，或3.08×10^-9mole/L、4.78×10^-9mole/L、4.31×10^-9mole/L，K193抗体与K562细胞无结合活性。

2、K193与人源化单克隆抗体CD19单抗K19结合活性比较

采用流式细胞仪(Accuri^TM C6 Flow Cytometer，Becton Dickinson公司)检测K193抗体、人源化CD19单抗K19与Raji特异性结合活性，试验以OKT3单抗作为对照。用0.02mol/L PBS(pH 7.4，含1％BSA)稀释K193-Biotin、K19-Biotin单抗、OKT3-Biotin单抗至起始蛋白质浓度15μg/ml，3倍系列稀释至0.185μg/ml，制备细胞密度为5.0×10⁶cells/ml的Raji细胞悬液，每孔加入细胞悬液100μl，混匀后反应60分钟，将流式细胞计设定为FAST，测定50000events，依次测定各孔内细胞的平均荧光值，流式细胞仪测定结果见图10及下表，剂量反应曲线见图11。采用GraphPad Prism5软件计算出的K19单抗、K193抗体与Raji细胞结合的EC50值分别为1206ng/ml、697.2ng/ml，或8.06×10^-9mole/L、9.25×10^- ⁹mole/L，从计算的结果可以看出，K193抗体、K19单抗与CD19膜抗原的结合活性高度一致。

实施例6：CD19-CD3双特异性抗体的生物学活性测定

本实验通过基于荧光染料释放的细胞毒性测定法来测定CD19-CD3双特异性抗体的细胞毒活性。

将生长良好的Raji细胞吹打均匀后取样计数，根据计数结果和实验需要取出一定体积的Raji细胞至离心管中，放入离心机800rpm离心10分钟，弃上清，用HBSS溶液洗涤细胞3次。然后向离心管中加入4ml HBSS溶液吹悬Raji细胞，加入20μl Fluo 3–AM储存液(1mmol/L,每1ml细胞悬液加5μl Fluo 3–AM储存液)，再加入10μl 20％Pluronic F-127(每1ml细胞悬液加2.5μl 20％Pluronic F-127)，混匀后放入37℃恒温箱静置60分钟。之后放入离心机800rpm离心10分钟，弃上清，用HBSS溶液洗涤细胞3次，充分去除残留的Fluo3–AM工作液，然后用HBSS溶液将Raji细胞调整至4×10⁶cells/ml。

将生长良好的Jurkat细胞(CD4+)吹打均匀后取样计数，根据计数结果和实验需要取出一定体积的Jurkat细胞至离心管中，放入离心机800rpm离心10分钟，弃上清，用HBSS溶液洗涤细胞3次。然后用HBSS溶液调整Jurkat细胞密度至4×10⁷cell/ml。将调整后的Raji细胞和Jurkat细胞等体积混合均匀后，用微量移液器加入到96孔全黑荧光板2-10列各孔中，100μl/孔。

取出1块已辐照的深孔稀释板，将4批K193抗体溶液(批号：20170317P、20170317T、20170317M、20170317H)按照标示的蛋白质含量在深孔稀释板稀释200ng/ml～0.02pg/ml，10倍稀释，共8个稀释度。然后用多通道移液器依次将稀释好的4批K193抗体转移至上述96孔全黑荧光板3-10列各孔中(每批K193抗体作2个平行孔)，100μl/孔。向96孔全黑荧光板第2列的A2-D2孔加入HBSS溶液，100μl/孔，作为空白对照。向96孔全黑荧光板第2列的E2-H2孔加入HBSS溶液，95μl/孔，再加入2％皂苷溶液，5μl/孔，作为阳性对照。将该96孔全黑荧光板放入37℃、8％CO₂培养箱内孵育4小时。

打开TECAN多功能酶标仪开关，选择荧光强度测定选项：设定激发波长488nm，发射波长526nm，增益值选择优化选项，开始测量。按如下公式计算细胞杀伤率：

细胞杀伤率＝(样品孔测量值-空白)/(阳性对照孔测量值-空白)×100％

K193抗体细胞毒性剂量反应曲线见图12，试验的结果表明，4批次的CD19-CD3双特异性抗体均能在pg/ml的水平上将B细胞来源的肿瘤细胞杀死50％以上。20170317P、20170317T、20170317M、20170317H批次的K193抗体杀伤B淋巴瘤细胞的ED50依次为133.30、83.60、131.20、97.84pg/ml，相对应的摩尔浓度依次为：1.77×10^-12mole/L、1.11×10^- ¹²mole/L、1.74×10^-12mole/L、1.30×10^-12mole/L，从这些结果可以看出K193抗体发挥作用的浓度很低。

各浓度的K193抗体激发T细胞杀伤B细胞对应的荧光值

荧光值求平均后计算杀伤百分比

采用GraphPad Prism 5软件计算出ED50值见下表

实施例7、CD19-CD3双特异性抗体与基因工程重组人CD3ε胞外区的结合活性

将重组人CD3ε(神州细胞，批号：LC11MA1103)用0.5ml注射用水溶解，再用碳酸盐包被液稀释到0.4μg/ml，包被96孔酶标板(深圳金灿华)，每孔100μl，37℃放置2小时，2～8℃冰箱放置过夜。用洗液(20mmol/L PBS-T，pH7.4)洗涤3遍，拍干。酶标板各孔加入封闭液(含2％BSA的20mmol/L PBS-T)220μl，37℃放置60分钟。用洗液洗涤3遍，拍干。用20mmol/LPBS(pH7.4)将K193抗体-Biotin按照蛋白质含量预稀释至10μg/ml，封闭后的酶标板B2-C2孔加入稀释好的K193抗体-Biotin，以10μg/ml为起点，3倍系列稀释，共稀释11个稀释度，每孔100μl(每个稀释度2孔)；加样后的酶标板在37℃孵育反应60分钟后，用洗液洗涤4遍，拍干。向酶标板各孔加入稀释好的辣根过氧化物标记的链霉亲和素(1:20000)，每孔100μl，在37℃孵育反应60分钟；之后用洗液洗涤5遍，拍干。酶标板各孔加入TMB显色液，每孔100μl，37℃避光反应15分钟。每孔加入50μl终止液(1mol/L硫酸)终止反应。用Multiskan FC酶标仪读取A450值，将K193抗体各浓度的对数对应的A450值作图，见图13，采用GraphPad Prism5软件，选择五参数曲线方程计算K193抗体反应的EC₅₀＝73.11ng/ml，或9.71×10^-10mole/L。

实施例8、CD19-CD3双特异性抗体与基因工程重组人CD19胞外区的结合活性

将重组人CD19(神州细胞，批号：LC10AU1901)用0.5ml蒸馏水溶解，之后用碳酸盐包被液稀释到0.4μg/ml，包被96孔酶标板，每孔100μl，37℃放置2小时，2～8℃冰箱放置过夜。用洗液洗涤3遍，拍干。酶标板各孔加入封闭液(含2％BSA的20mmol/L PBS-T)，每孔220μl，37℃放置60分钟。用洗液洗涤3遍，拍干。用20mmol/L PBS(pH7.4)将K193抗体-Biotin按照蛋白质含量预稀释至10μg/ml，封闭后的酶标板B2-C2孔加入稀释好的K193抗体-Biotin，以10μg/ml为起点，3倍系列稀释，共稀释11个稀释度，每孔100μl(每个稀释度2孔)；加样后的酶标板在37℃孵育反应60分钟后，用洗液洗涤4遍，拍干。向酶标板各孔加入稀释好的辣根过氧化物标记的亲和素(1:8000)，每孔100μl，在37℃孵育反应60分钟。之后用洗液洗涤5遍，拍干。酶标板各孔加入TMB显色液，每孔100μl，37℃避光反应10～15分钟。每孔加入50μl终止液(1mol/L硫酸)终止反应。用Multiskan FC酶标仪读取A450值，K193抗体各浓度对应A450值的剂量反应曲线见图14，采用GraphPad Prism 5软件选择五参数曲线方程计算K193抗体反应的EC₅₀＝70.65ng/ml，或9.38×10^-10mole/L。

实施例9、重组CD3ε和CD19双抗原夹心法测定CD19-CD3双特异性抗体结合活性

将重组人CD3E(神州细胞，批号：LC11MA1103)用0.5ml注射用水溶解，用碳酸盐包被液将0.4μg/ml的包被96孔酶标板，每孔100μl，37℃放置2小时，2～8℃冰箱放置过夜。用洗液洗涤3遍，拍干。酶标板各孔加入封闭液(含2％BSA的20mmol/L PBS-T)，每孔220μl，37℃放置60分钟。用洗液洗涤3遍，拍干。用20mmol/L PBS(pH7.4)将3批K193抗体溶液(批号：20171001、20171002、20171003)按照蛋白质含量预稀释至10μg/ml，封闭后的酶标板第1列依次加入稀释好的3批K193抗体溶液，以10μg/ml为起点，3倍系列稀释，共稀释11个稀释度，每孔100μl(每个稀释度2孔)；加样后的酶标板在37℃孵育反应60分钟后，用洗液洗涤4遍，拍干。

将生物素标记的重组人CD19稀释至100ng/ml，加入酶标板各孔，每孔100μl，在37℃孵育反应60分钟后，用洗液洗涤4遍，拍干。向酶标板各孔加入稀释好的辣根过氧化物标记的链霉亲和素(1:20000)，每孔100μl，在37℃孵育反应60分钟。之后用洗液洗涤5遍，拍干。酶标板各孔加入TMB显色液，每孔100μl，37℃避光反应10分钟。每孔加入50μl终止液(1mol/L硫酸)终止反应。用Multiskan FC酶标仪读取A450值，采用GraphPad Prism 5软件五参数曲线方程计算K193抗体溶液在双抗原夹心酶联免疫法反应的EC₅₀值，各批次K193抗体的EC₅₀值分别为82.45、87.32、76.66ng/ml，或1.09×10^-9、1.16×10^-9、1.02×10^-9mole/L，显示出各批次间是高度一致的。

实施例10、CD19-CD3抗体T淋巴细胞增殖试验

CD69分子是T细胞活化的早期标志物，正常条件下培养的Jurkat E6-1细胞很少表达CD69分子，将Jurkat E6-1细胞、Raji细胞以适当的比例共培养且存在CD3分子激活剂如OKT3、K193抗体的条件下，Jurkat E6-1细胞表面可表达CD69，且表达量的高低与刺激物的浓度呈正相关；OKT3分子(CD3单抗)需要和第二刺激因子共同作用才能更好的刺激T细胞产生CD69分子，单一的OKT3分子在较高的浓度时也可激活CD69分子的低丰度表达。

1、K193抗体、OKT3单抗在B细胞存在的情况下刺激T细胞的增殖试验

离心收集用10％FCS 1640培养液培养的Jurkat E6-1细胞，调整细胞浓度后与Raji细胞混合，混合后的细胞悬液中含Jurkat E6-1细胞2×10⁶/ml，Raji细胞2×10⁵/ml，将上述细胞悬液接入到24孔细胞培养板中，加入系列稀释的K193抗体、OKT3抗体，然后在10％CO2、37℃培养箱内培养18小时，离心去上清液后与Anti-Human CD4 FITC+Anti-HumanCD69 PE(clone：FN50，LOT：E13987-103，eBioscience Anti-Human CD4 FITC，clone：OKT4，LOT：E10526-1634，eBioscience)混合样品5μl(1:1)避光反应30min后，使用流式细胞仪测定细胞表达CD69、CD4的高低，将所测细胞荧光值作对比，观察细胞经各浓度K193或OKT3(阳性对照)刺激后CD69表达的量反应关系。对两抗体对应Mean FL2-A值(CD69)进行软件分析处理，下表中的参数计算采用GraphPad Prism 5.0软件计算，所使用抗体的计量单位为ng，取其对数值进行计算K193抗体对应ED50值为0.08663ng/ml，OKT3抗体对应ED₅₀值为1278ng/ml，约为1.47×10⁴倍的比例关系，即在B细胞存在的条件下OKT3刺激表达的CD69的量明显低于K193抗体的。

2、K193抗体活化T细胞需要B细胞的协同刺激

离心收集用10％FCS 1640培养液培养的Jurkat E6-1细胞，调整细胞浓度至3×10⁶/ml，备用；①与Raji细胞混合混合后的细胞悬液中含Jurkat E6-1细胞2×10⁶/ml，Raji细胞2×105/ml；②将细胞浓度为3×10⁶/ml的Jurkat E6-1细胞，加入1/3体积的细胞培养液；③Raji细胞2×10⁵/ml；将上述细胞悬液分别接入到24孔细胞培养板中，加入系列稀释的K193抗体，然后在10％CO2、37℃培养箱内培养18小时，离心去上清液后与Anti-HumanCD69 PE(clone：FN50，LOT：E13987-103，eBioscience)混合样品5μl(1:1)避光反应30min后，使用流式细胞仪测定细胞表达CD69的平均荧光强度，结果见下表，将所测各浓度K193作为横坐标，细胞平均荧光强度做纵坐标作图，见图15，观察细胞经各浓度K193(阳性对照)刺激后CD69表达的量反应关系。

由上述数据计算得知，(T+B)Cell+K193抗体组对应ED₅₀值为60.95pg/ml，T Cell+K193抗体组对应ED₅₀值为642ng/ml，约为1.05×10⁴倍比例关系，在缺乏B细胞存在的条件下，CD69的MFI较低，即便是在K193达到20μg/ml的情况下，MFI也仅仅能达到5900的水平，约为基础本底值的3倍，因此单独的K193不能很好的刺激T细胞进行活化。

由本试验结果可知经K193活化后的Jurkat E6-1细胞表面会大量表达CD69分子，这是K193抗体在Raji细胞存在共同刺激下产生的共刺激作用，这两种条件缺一不可，单一条件下无法实现T细胞的高效活化。在B细胞存在的前提下，在一定的浓度范围内，T细胞产生CD69分子的量与K193的量呈对数正相关关系。

实施例11、K193抗体刺激T细胞作用机理的研究

由实施例10可以清楚地感知K193抗体在B细胞存在的情况下，可以以极低的浓度下引发T细胞的激活，这与OKT3激活T细胞有着极其明显的不一致。可能是由于B7:CD28共刺激信号参与了激活的过程。CD80(B7.1)及CD86(B7.2)为B淋巴细胞膜表面分子，CD28为T淋巴细胞膜表面分子，它们均属共刺激分子免疫球蛋白超家族成员。表达在B细胞或抗原呈递细胞上的B7与表达在T细胞上的CD28相结合，其介导的共刺激信号为T细胞活化、增殖和产生效应所必需。CD86与CD28相互作用，是诱导T淋巴细胞增殖及产生IL-2的主要协同因子。

OKT3为小鼠抗人CD3单克隆抗体，高浓度的OKT3单抗与T细胞表面的CD3ε结合可引起T细胞TCR-CD3复合体的交联，直接产生T细胞活化信号，它不需要第二信号的辅助；K19单抗可以特异性的与B细胞表面的CD19位点结合。K193单抗是一种能和人T细胞表面的CD3ε、B细胞表面的CD19分子发生特异性结合的双特异性抗体，已进行的研究已表明在B细胞存在的条件下，K193单抗可以在低于ng/ml的浓度下引发T细胞的活化，本实施例旨在为验证这种超高效的活化效应是否由B7:CD28共刺激分子所加强，设计了在反应体系中加入CD3ε、CD19单抗以竞争性部分阻断K193与CD19、CD3ε的结合，同时加入B7.1(CD80)、B7.2(CD86)单抗阻断B细胞表面的B7与T细胞表面的CD28分子结合，以期达到通过实验证明这些环节的竞争性阻断能下调CD69、CD25分子的表达。

正常条件下培养的T淋巴细胞基本不表达CD69、CD25分子，前期的实验表明以Jurkat E6-1细胞、Raji细胞混合培养物(T:B＝10:1)做试验研究时，当K193单抗含量在20pg/ml～2000pg/ml范围内时，该比例的T+B细胞在36.5℃、8％CO2培养箱培养，JurkatE6-1受到K193单抗和B细胞的共同刺激，培养18小时后其细胞表面可大量表达CD69分子，培养40小时后可产生大量的CD25分子。本实施例选用的K193抗体的浓度为200pg/ml、其它单抗的浓度均选为1μg/ml。本研究所用抗体为针对以下位点的CD80、CD86、CD28、CD3、CD19，其中CD80、CD86为兔单抗，购自神州细胞工程有限公司；CD19单抗本公司制备的人源化单克隆抗体，CD28、CD3单抗(OKT3)为鼠源性单抗，购自北京弘业新创抗体技术股份有限公司。所使用的细胞为Raji和Jurkat E6-1(美国ATCC)，RPMI1640培养基购自美国Life TechnologiesInc.,胎牛血清购自EXcell.Biology.Inc，细胞培养板购自Nest Biotechnology Co,.Ltd.

自-20℃冰箱取出CD80、CD86、CD28、K19、OKT3单抗试剂，室温放置融化后，轻轻晃动瓶内液体使其完全混匀。依次稀释CD80、CD86、OKT3、K19单抗溶液至抗体含量为8μg/ml，稀释CD28单抗样品抗体含量至4μg/ml。K193抗体稀释至800pg/ml(最后加入到24孔板内的浓度为200pg/ml，其它单抗的终浓度为1μg/ml)，各抗体之间的组合模式见图16。

流式细胞计计数Jurkat E6-1细胞、Raji细胞，800r/min离心沉淀细胞，取适宜体积的细胞培养液重悬Jurkat E6-1细胞(J)、Raji细胞(B)浓度为3×10⁶cells/ml、3×10⁵cells/ml，等体积混合均匀后加入到24板相应的孔内，600μl/孔。自J管取出适宜体积的细胞悬液，与等体积的10％FCS的RPMI 1640细胞培养液混匀，细胞密度为1.5×10⁶cells/ml，用吸管将细胞吹散，加入到24孔板对应T细胞空白对照孔600μl。将细胞培养板放入36.5℃、8％CO2孵箱共培养16-18小时，取出培养板内各孔中1/2体积的细胞培养物(剩余的放回培养箱继续培养至40小时)，离心后加入抗PE标记的CD69单抗，反应60分钟后用BD C6流式细胞检测仪检测各孔细胞的平均荧光强度，逐一测定结果；各对应单抗组合物激发T细胞表达CD的平均强度见图16，从图16可以看出，在T细胞、B细胞共同存在的条件下，OKT3、K193单独存在时均能刺激T细胞产生高水平的CD69，当在T+B体系中加入其他单抗之后，T细胞表达CD69的量随之减少，体系中二者同时存在时你表达CD69的少于单独存在时，大剂量的CD19、CD28单抗可非常显著的降低CD69的表达，导致CD69的表达量与空白对照组的相当或更低，CD80、CD86单抗与K193二者共同存在也会导致CD69表达量的降低，当***中同时存在CD80单抗、CD86单抗、和K193抗体时，CD69的表达量较高，以上结果表明，尽管K193在B细胞存在时能高效激活T细胞，但这种激活可以通过向***中增加超高浓度(体系中各种单抗的实际浓度为K193浓度的5000倍)的CD19、CD28单抗所终止，但不能通过向***中加入超高浓度的CD80和CD86单抗所阻断，T细胞的活化需要B细胞的共刺激，这其中CD28共刺激分子的作用是最为直接的，但这远远是不够的，因为高浓度的CD3、CD28单抗在缺乏B细胞的体系中没有表现出比单纯的CD3单抗更大的优越性，低浓度的K193抗体对T细胞的激活仅有轻微的作用。

将24孔板各孔中剩余的细胞培养至40小时，取出后离心，加入含PE标记的抗人CD25单抗，2-8℃反应2小时，之后用BD C6流式细胞检测仪检测各孔细胞的平均荧光强度，逐一测定结果；各对应单抗组合物激发T细胞表达CD的平均强度见图17。从图中可以看出，在T细胞、B细胞共同存在的条件下，OKT3、K193单独存在时均能刺激T细胞产生高水平的CD25，当K193的T+B体系中加入CD19单抗之后，T细胞表达CD25的量低于空白对照组，体系中K193、OKT3二者同时存在时表达CD25的明显高于单独存在时，CD28单抗可非常显著的降低CD25的表达，CD80、CD86单抗与K193二者共同存在对CD25的表无明显作用，以上结果表明，尽管K193在B细胞存在时能高效激活T细胞，但这种激活可以通过向***中增加超高浓度(体系中各种单抗的实际浓度为K193浓度的5000倍)的CD19单抗所终止；T细胞的活化需要B细胞的共刺激，这其中CD28共刺激分子的作用是存在的，但这远远是不够的，高浓度的CD3单抗、CD28单抗在缺乏B细胞的体系中没有表现出比单纯的CD3单抗更大的优越性。

实施例12、双特异性抗体K193激活人PBMC杀伤B淋巴瘤细胞

将生长良好的K562、Daudi、Namalwa、Raji细胞吹打均匀后取样计数，根据计数结果和实验需要取出一定体积的细胞至离心管中，放入离心机800rpm室温下离心10分钟，弃上清，用HBSS(Hank's平衡盐溶液)溶液洗涤细胞3次。然后向离心管中加入4ml HBSS溶液吹悬细胞，加入20μl Fluo 3–AM储存液(1mmol/L，每1ml细胞悬液加5μl Fluo 3–AM储存液)，再加入10μl 20％Pluronic F-127(原则上是每1ml细胞悬液加2.5μl 20％Pluronic F-127)，混匀后放入37℃孵箱静置60分钟。之后放入离心机800rpm离心10分钟，弃上清，用HBSS溶液洗涤细胞3次，充分去除残留的Fluo3–AM工作液，然后用HBSS溶液将细胞调整至4×10⁶cell/ml。

将从健康人外周血中新鲜分离的的淋巴细胞(PBMC)取样计数，根据计数结果取适当体积的人PBMC细胞至15ml离心管中，放入离心机800rpm离心10分钟，弃上清，用HBSS溶液洗涤细胞2次。然后用HBSS溶液调整PBMC细胞密度至4×10⁷cell/ml。将调整后的K562、Daudi、Namalwa细胞分别和人PBMC细胞等体积混合均匀后，用微量移液器加入到96孔全黑荧光板2-11列各孔中，100μl/孔。

取出1块已辐照的深孔稀释板，将K193抗体溶液(2～8℃保存)以及BLI-193(串联单链抗体结构，Blintumomab，-70℃)按照标示的蛋白质含量在深孔稀释板稀释100ng/ml～0.1pg/ml，10倍稀释，共7个稀释度，每个稀释度6孔。然后用多通道微量移液器依次将稀释好的K193抗体转移至上述96孔全黑荧光板对应孔中，100μl/孔。设HBSS溶液空白对照6孔，100μl/孔。向96孔板阳性对照孔加入HBSS溶液95μl/孔，再加入2％皂苷溶液，5μl/孔，将该96孔全黑荧光板放入37℃、8％CO2培养箱内孵育4小时。

打开Bio-Tek多功能酶标仪开关，设定激发波长488nm，发射波长526nm，增益值选择优化选项，开始测量。采用下述公式计算细胞杀伤％

图18显示了人外周血PBMC对CD19阳性、CD19阴性的细胞的杀伤作用，K562是一种不表达CD19膜抗原的细胞，从结果可以看出K193、BLI193对它几乎没有任何杀伤作用，尽管各浓度显示出轻微的杀伤，但杀伤率均很低，且与双功能抗体的浓度无关。K193、BLI193对CD19阳性细胞的杀伤作用较强，尤其是K193的杀伤作用明显好于BLI193，采用GraphPadPrism 5.0软件计算K193抗体对Daudi、Namalwa、Raji细胞杀伤的ED₅₀分别为410.3pg/ml、31.25pg/ml、15.47pg/ml；BLI193对Daudi、Namalwa、Raji细胞杀伤的ED₅₀分别为2574.0pg/ml、107.4pg/ml、86.80pg/ml。

序列表

<110>北京绿竹生物技术股份有限公司

<120>一种结合人CD19和CD3的双特异性抗体

<160> 15

<210> 1

<211> 1546

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400>1

aattgccgcc accatggaat ggagctgggt gttcctgttc tttctgtccg tgaccacagg 60

cgtgcattct caggtgcagc tgcagcagtc cggagctgaa ctggtgagac ccggctccag 120

cgtcaaaatt tcctgtaagg ctagcggata tgcattttct agttactgga tgaattgggt 180

gaagcagcga cctggacagg gtctggagtg gatcggccag atttggccag gcgatggaga 240

caccaactac aatgggaagt tcaaaggcaa ggccaccctg acagctgacg aatcatccag 300

cacagcatat atgcagctgt ctagtctggc aagcgaggat tctgccgtgt acttttgtgc 360

taggcgggaa accacaactg tcggcagata ctattacgct atggactact gggggcaggg 420

aacaactgtg accgtgagca gcgcgtcgac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc 480

ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt 540

ccccgaacct gtgacggtct cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt 600

cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc 660

cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa 720

ggtggacaag agagttgagc ccaaatcttg tagcggtgga ggcggttcag gcggaggtgg 780

atccggcggt ggcggcagcg aggtgcagct ggtcgagtct ggaggaggat tggtgcagcc 840

tggagggtca ttgaaactct catgtgcagc ctctggattc accttcaata agtacgccat 900

gaactgggtc cgccaggctc caggaaaggg tttggaatgg gttgctcgca taagaagtaa 960

atataataat tatgcaacat attatgccga ttcagtgaaa gacaggttca ccatctccag 1020

agatgattca aaaaacactg cctatctaca aatgaacaac ttgaaaactg aggacactgc 1080

cgtgtactac tgtgtgagac atgggaactt cggtaatagc tacatatcct actgggctta 1140

ctggggccaa gggactctgg tcaccgtctc ctcaggtggt ggtggttctg gcggcggcgg 1200

ctccggtggt ggtggttctc agactgttgt gactcaggaa ccttcactca ccgtatcacc 1260

tggtggaaca gtcacactca cttgtggctc ctcgactggg gctgttacat ctggcaacta 1320

cccaaactgg gtccaacaaa aaccaggtca ggcaccccgt ggtctaatag gtgggactaa 1380

gttcctcgcc cccggtactc ctgccagatt ctcaggctcc ctgcttggag gcaaggctgc 1440

cctcaccctc tcaggggtac agccagagga tgaggcagaa tattactgtg ttctatggta 1500

cagcaaccgc tgggtgttcg gtggaggaac caaactgact gtccta 1546

<210> 2

<211> 511

<212> 氨基酸序列

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400>2

MET Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr

5 10 15

Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp MET Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro

50 55 60

Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly

65 70 75

Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr

80 85 90

Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr MET Gln Leu Ser Ser Leu

95 100 105

Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Glu Thr

110 115 120

Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala MET Asp Tyr Trp Gly Gln

125 130 135

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

140 145 150

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

155 160 165

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

170 175 180

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

185 190 195

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

200 205 210

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

215 220 225

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg

230 235 240

Val Glu Pro Lys Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

260 265 270

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala

275 280 285

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala MET Asn Trp Val Arg

290 295 300

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser

305 310 315

Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp

320 325 330

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

335 340 345

Gln MET Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

350 355 360

Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala

365 370 375

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

380 385 390

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val

395 400 405

Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val

410 415 420

Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn

425 430 435

Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

440 445 450

Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg

455 460 465

Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser

470 475 480

Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp

485 490 495

Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

500 505 510

Leu

<210> 3

<211> 492

<212> 氨基酸序列

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400>3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly

5 10 15

Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Trp MET Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr

50 55 60

Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser

65 70 75

Ser Ser Thr Ala Tyr MET Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp

80 85 90

Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly

95 100 105

Arg Tyr Tyr Tyr Ala MET Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

110 115 120

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

125 130 135

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

140 145 150

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

155 160 165

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

170 175 180

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

185 190 195

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

200 205 210

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys

215 220 225

Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

230 235 240

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

245 250 255

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

260 265 270

Thr Phe Asn Lys Tyr Ala MET Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

275 280 285

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn

290 295 300

Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile

305 310 315

Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln MET Asn Asn

320 325 330

Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly

335 340 345

Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln

350 355 360

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

365 370 375

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu

380 385 390

Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys

395 400 405

Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp

410 415 420

Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly

425 430 435

Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

440 445 450

Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro

455 460 465

Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg

470 475 480

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

485 490

<210> 4

<211> 1546

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400>4

aattgccgcc accatggaat ggagctgggt gttcctgttc tttctgtccg tgaccacagg 60

cgtgcattct caggtgcagc tgcagcagtc cggagctgaa ctggtgagac ccggctccag 120

cgtcaaaatt tcctgtaagg ctagcggata tgcattttct agttactgga tgaattgggt 180

gaagcagcga cctggacagg gtctggagtg gatcggccag atttggccag gcgatggaga 240

caccaactac aatgggaagt tcaaaggcaa ggccaccctg acagctgacg aatcatccag 300

cacagcatat atgcagctgt ctagtctggc aagcgaggat tctgccgtgt acttttgtgc 360

taggcgggaa accacaactg tcggcagata ctattacgct atggactact gggggcaggg 420

aacaactgtg accgtgagca gcgcgtcgac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc 480

ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt 540

ccccgaacct gtgacggtct cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt 600

cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc 660

cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa 720

ggtggacaag agagttgagc ccaaatcttg tagcggtgga ggcggttcag gcggaggtgg 780

atccggcggt ggcggcagcc agactgttgt gactcaggaa ccttcactca ccgtatcacc 840

tggtggaaca gtcacactca cttgtggctc ctcgactggg gctgttacat ctggcaacta 900

cccaaactgg gtccaacaaa aaccaggtca ggcaccccgt ggtctaatag gtgggactaa 960

gttcctcgcc cccggtactc ctgccagatt ctcaggctcc ctgcttggag gcaaggctgc 1020

cctcaccctc tcaggggtac agccagagga tgaggcagaa tattactgtg ttctatggta 1080

cagcaaccgc tgggtgttcg gtggaggaac caaactgact gtcctaggtg gtggtggttc 1140

tggcggcggc ggctccggtg gtggtggttc tgaggtgcag ctggtcgagt ctggaggagg 1200

attggtgcag cctggagggt cattgaaact ctcatgtgca gcctctggat tcaccttcaa 1260

taagtacgcc atgaactggg tccgccaggc tccaggaaag ggtttggaat gggttgctcg 1320

cataagaagt aaatataata attatgcaac atattatgcc gattcagtga aagacaggtt 1380

caccatctcc agagatgatt caaaaaacac tgcctatcta caaatgaaca acttgaaaac 1440

tgaggacact gccgtgtact actgtgtgag acatgggaac ttcggtaata gctacatatc 1500

ctactgggct tactggggcc aagggactct ggtcaccgtc tcctca 1546

<210> 5

<211> 511

<212> 氨基酸序列

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400>5

MET Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr

5 10 15

Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp MET Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro

50 55 60

Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly

65 70 75

Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr

80 85 90

Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr MET Gln Leu Ser Ser Leu

95 100 105

Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Glu Thr

110 115 120

Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala MET Asp Tyr Trp Gly Gln

125 130 135

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

140 145 150

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

155 160 165

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

170 175 180

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

185 190 195

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

200 205 210

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

215 220 225

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg

230 235 240

Val Glu Pro Lys Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro

260 265 270

Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly

275 280 285

Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val

290 295 300

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr

305 310 315

Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu

320 325 330

Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu

335 340 345

Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp

350 355 360

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly

365 370 375

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu

380 385 390

Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys

395 400 405

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala MET

410 415 420

Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

425 430 435

Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

440 445 450

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn

455 460 465

Thr Ala Tyr Leu Gln MET Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala

470 475 480

Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile

485 490 495

Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

500 505 510

Ser

<210> 6

<211> 492

<212> 氨基酸序列

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400>6

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly

5 10 15

Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Trp MET Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr

50 55 60

Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser

65 70 75

Ser Ser Thr Ala Tyr MET Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp

80 85 90

Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly

95 100 105

Arg Tyr Tyr Tyr Ala MET Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

110 115 120

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

125 130 135

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

140 145 150

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

155 160 165

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

170 175 180

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

185 190 195

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

200 205 210

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys

215 220 225

Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

230 235 240

Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val

245 250 255

Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly

260 265 270

Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro

275 280 285

Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala

290 295 300

Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys

305 310 315

Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu

320 325 330

Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly

335 340 345

Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

350 355 360

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

365 370 375

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala

380 385 390

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala MET Asn Trp Val Arg

395 400 405

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser

410 415 420

Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp

425 430 435

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

440 445 450

Gln MET Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

455 460 465

Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala

470 475 480

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

485 490

<210> 7

<211> 730

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400>7

aattgccgcc accatgtctg tgcctaccca ggtgctggga ctgctgctgc tgtggctgac 60

agacgcccgc tgtgacatcc agctgacaca gtcaccagca tccctggccg tgagcctggg 120

acagcgagca actatctctt gcaaagcctc acagtccgtc gactatgatg gggacagcta 180

tctgaactgg taccagcaga tcccaggaca gccccctaag ctgctgatct acgacgctag 240

taatctggtg tcaggaatcc cacccaggtt cagcggttct ggcagtggaa ctgattttac 300

cctgaacatt caccccgtgg agaaagtcga cgccgctacc tatcattgcc agcagtccac 360

agaggacccc tggactttcg gcggagggac caaactggaa atcaagcgta cggtggctgc 420

accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt 480

tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa 540

cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac 600

ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta 660

cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg 720

agagtgtagc 730

<210> 8

<211> 239

<212> 氨基酸序列

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400>8

MET Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu

5 10 15

Thr Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser

20 25 30

Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala

35 40 45

Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr

50 55 60

Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala

65 70 75

Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly

80 85 90

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Lys Val

95 100 105

Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp

110 115 120

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

125 130 135

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

140 145 150

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

155 160 165

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

170 175 180

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

185 190 195

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

200 205 210

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

215 220 225

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser

230 235

<210> 9

<211> 219

<212> 氨基酸序列

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400>9

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu

5 10 15

Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp

20 25 30

Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly

35 40 45

Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser

50 55 60

Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

65 70 75

Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr

80 85 90

His Cys Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly

95 100 105

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe

110 115 120

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

125 130 135

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val

140 145 150

Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

155 160 165

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

170 175 180

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

185 190 195

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

200 205 210

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser

215

<210> 10

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400>10

Cccaagctta attgccgcca ccatggaatg gagctgggtg ttcctgttct ttctgtcc 58

<210> 11

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400>11

Ttcctgttct ttctgtccgt gaccacaggc gtgcattctc aggtgcagct gcagcag 57

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400>12

Cgccaccgcc ggatccacct ccgcc 25

<210> 13

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400>13

Cccaagctta attgccgcca ccatgtctgt gcctacccag gtgctgggac tgctgctg 58

<210> 14

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400>14

Ctgggactgc tgctgctgtg gctgacagac gcccgctgtg acatccagct gacacagt 58

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400>15

Ccggaattct cattagctac actctcccct g 31

Claims

1.一种结合人CD19和CD3的双特异性抗体，所述双特异性抗体是由特异性识别细胞膜抗原的Fab片段和识别CD3分子的单链抗体构成，其中识别CD3分子的单链抗体通过亲水性的连接肽-linker和Fab片段的CH1区肽段的C末端相连；其中特异性识别细胞膜抗原的Fab片段为含有特异性识别人CD19抗原的Fab结构，所述双特异性抗体结构如下：

其中连接肽-linker为GGGGS形式的2-3倍多肽作为连接肽，

其中，含引导肽的基因VH(CD19)-CH1-linker-VH(CD3)-linker-VL(CD3)的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，不含引导肽VH(CD19)-CH1-linker-VH(CD3)-linker-VL(CD3)的氨基酸序列为SEQ ID No.3所示；

其中，含引导肽基因VH(CD19)-CH1-linker-VL(CD3)-linker-VH(CD3)的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示，其氨基酸序列为SEQ ID No.5所示，不含引导肽VH(CD19)-CH1-linker-VL(CD3)-linker-VH(CD3)的氨基酸序列为SEQ ID No.6所示；含引导肽基因的CD19单抗VL(CD19)-CL的核苷酸序列为SEQ ID No.7所示，其氨基酸序列为SEQ ID No.8所示,不含引导肽的CD19抗体VL(CD19)-CL的氨基酸序列为SEQ ID No.9所示。

2.权利要求1所述的双特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述双特异性抗体采用基因重组技术制备，使用哺乳类动物细胞表达载体，在CHO细胞中进行表达，CHO细胞的培养采用化学成分限定培养基，培养过程中不添加激素及各种动物来源的蛋白质或其水解物。

3.权利要求2所述的双特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述双特异性抗体采用基因重组技术制备，使用GS表达***，在CHO细胞中进行表达，CHO细胞的培养采用化学成分限定培养基，培养过程中不添加激素及各种动物来源的蛋白质或其水解物。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将含双特异性抗体基因的单一质粒载体采用单一内切酶酶切进行线性化，转染CHO细胞后获得阳性克隆株，生物反应器中培养，产物分泌到培养液上清中，利用离子交换色谱介质、或亲和色谱联合离子交换色谱进行纯化，得到特异性结合人CD19和CD3的双特异性抗体。

5.权利要求1所述的双特异性抗体在制备治疗人类B细胞来源的恶性肿瘤或免疫紊乱性疾病，选自：各种B细胞白血病、非何杰金氏淋巴瘤、类风湿关节炎、强直性脊柱炎的药物中的应用。

6.含有权利要求1所述的双特异性抗体的药物组合物。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，制成液体制剂，或者制成冻干制剂，或者使用持续性输液泵持续给药，或者采用脉冲形式的输液泵定时给药，或者使用静脉内给药，或者采用皮下注射给药。