CN109970859B

CN109970859B - Glypican-3特异性抗体及其特异性CAR-T细胞

Info

Publication number: CN109970859B
Application number: CN201711449721.0A
Authority: CN
Inventors: 曹卫
Original assignee: Boli Biotechnology Shanghai Co ltd; Genxi Biotechnology Shanghai Co ltd
Current assignee: Boli Biotechnology Shanghai Co ltd; Genxi Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2037-12-27
Also published as: CN109970859A

Abstract

本发明涉及Glypican‑3特异性抗体及其特异性CAR‑T细胞。具体地，本发明涉及一种抗人GPC‑3单克隆抗体，其包含具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的VH的和具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的VL。本发明还涉及一种嵌合抗原受体融合蛋白和包含该融合蛋白的CAR‑T细胞，从N末端至C末端包括：(i)本发明的单链抗体(scFv)，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一种共刺激结构域，和(iv)激活域。

Description

Glypican-3特异性抗体及其特异性CAR-T细胞

技术领域

本发明涉及基因治疗领域，更具体地涉及一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3，GPC 3)特异性抗体及其特异性CAR-T细胞，其可用于肿瘤的过继免疫基因治疗。

背景技术

免疫治疗是一种非常有前途的治疗癌症的方法。T细胞或T淋巴细胞是免疫***有效的武器，它们能够持续性地帮我们区分正常细胞和外来抗原或非正常细胞，如癌症或被感染的细胞。基因修饰的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)是设计肿瘤特异性T细胞的常见方案。将靶向肿瘤相关抗原(TAA)的CAR-T细胞输入患者(称为过继细胞转移或ACT)，这代表了一种有效的免疫治疗方法。与化疗或抗体技术相比，CAR-T技术的优点在于重编程的T细胞可以增殖并在患者体内持续存在(“活的药物”)。

CAR(嵌合抗原受体)通常是由一个单克隆抗体衍生的单链抗体(scFv)通过铰链和跨膜结构域连接到可变数目的胞内信号结构域：单个细胞活化的CD3-ζ结构域；以及和CD3-ζ结构域相连的CD28，CD137(4-1BB)或其他共刺激域(也可用CD27信号结构域代替CD28或CD137结构域)(图1)。CAR的发展从第一代(没有共刺激域)到第二代(具有一个共刺激域)到第三代CAR(具有多个共刺激域)。生成的具有多个共刺激域的CAR(即所谓的第三代CAR)会产生增加的细胞溶解活性，并显着改善CAR-T细胞的持续性，表现出增强的抗肿瘤活性。

然而，目前嵌合抗原受体的研究还有很多不足，还存在复发率高、安全性低等问题。因此，本领域迫切需要开发特异性好、疗效稳定、副作用小的嵌合抗原受体。

发明内容

本发明的目的在于提供Glypican-3特异性抗体及其特异性CAR-T细胞。

在本发明的第一方面，提供了一种抗人GPC-3单克隆抗体，所述抗体具有：

(i)氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的重链可变区；和

(ii)氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的轻链可变区。

在另一优选例中，所述抗体与人GPC-3蛋白的N末端的前55-200个氨基酸区域结合。

在另一优选例中，所述的抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。

在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。

在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。

在本发明的第二方面，提供了一种单链抗体，所述的单链抗体具有：

(i)氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的重链可变区；和

(ii)氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的轻链可变区。

在另一优选例中，所述的单链抗体还包含VH和VL之间的接头。

在另一优选例中，所述接头的氨基酸序列如SEQ ID NO.:7所示。

在另一优选例中，所述接头的氨基酸序列为3-5个重复的SEQ ID NO.:7所示的序列。

在另一优选例中，所述的单链抗体具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的单链抗体与人GPC-3蛋白的N末端的前55-200个氨基酸区域结合。

在本发明的第三方面，提供了一种嵌合抗原受体CAR，其特征在于，所述的CAR包含本发明第二方面所述的单链抗体。

在另一优选例中，所述的CAR从N末端至C末端包括：

(i)权利要求3所述的单链抗体，

(ii)跨膜结构域，

(iii)至少一种共刺激结构域，和

(iv)激活域。

在另一优选例中，所述的CAR具有下式I结构：

L-scFv-H-TM-C-CD3ζ (I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为任选的信号肽序列；

scFv为权利要求3所述的单链抗体；

H为任选的铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

在另一优选例中，所述的L为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的L为CD8来源的信号肽。

在另一优选例中，所述的H为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的H为CD8来源的铰链区。

在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。

在另一优选例中，TM包括CD8来源的跨膜区，和/或CD28来源的跨膜区。

在另一优选例中，所述的C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、或其组合。

在另一优选例中，C包括4-1BB来源的共刺激信号分子，和/或CD28来源的共刺激信号分子。

在本发明的第四方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

(i)如本发明第一方面所述的抗体、或本发明第二方面所述的单链抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。

在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。

在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。

本发明的第五方面，提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物含有：

(a)如本发明第一方面所述的抗体、或本发明第二方面所述的单链抗体；以及

(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。

在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。

在本发明的第六方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面的单链抗体、本发明第三方面所述的嵌合抗原受体(CAR)、本发明第四方面所述的重组蛋白、或本发明第五方面所述的抗体药物偶联物。

在本发明的第七方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第六方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

在本发明的第八方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第七方面所述的载体、染色体中整合有外源的本发明第六方面所述的核酸分子、或表达本发明第一方面所述的抗体、表达本发明第二方面的单链抗体、或表达本发明第三方面所述的CAR。

在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。

在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述细胞为T细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为工程化的免疫细胞。

在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞包括T细胞或NK细胞，较佳地为(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；或(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)。

在本发明的第九方面，提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，所述的工程化免疫细胞表达本发明第三方面所述的CAR，包括以下步骤：将本发明第六方面所述的核酸分子或本发明第七方面所述的载体转导入T细胞或NK细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

在本发明的第十方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面的单链抗体、本发明第三方面所述的嵌合抗原受体、本发明第四方面所述的重组蛋白、或本发明第五方面所述的抗体药物偶联物、或本发明第八方面所述的细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述制剂为药物组合物。

在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。

在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在本发明的第十一方面，提供了一种本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面的单链抗体、本发明第三方面所述的嵌合抗原受体、本发明第四方面所述的重组蛋白、或本发明第五方面所述的抗体药物偶联物、或本发明第八方面所述的细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、***癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、***、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、***、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、睾丸癌、结直肠癌、尿路肿瘤、甲状腺癌、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：卵巢癌、间皮瘤、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、子宫内膜癌、或其组合。

在本发明的第十二方面，提供了一种用于制备本发明第八方面所述细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的本发明第六方面所述的核酸分子、或本发明第七方面所述的载体。

在本发明的第十三方面，提供了一种本发明第八方面所述细胞、或本发明第六方面所述的制剂的用途，用于预防和/或治疗癌症或肿瘤。

在本发明的第十四方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第八方面所述的细胞、或本发明第六方面所述的制剂。

在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了CAR的结构。左边是第一代CAR(没有共刺激域)，中间是第二代CAR(一个共刺激结构域CD28或者4-BB)，右边是第三代CAR(两个或多个共刺激结构域)。

图2显示了GPC-3蛋白的结构。图示蛋白的HS、硫酸肝素、GPI、糖基磷脂酰肌醇被修饰。

图3显示了GPC-3CAR构建物的结构。此处使用第二代CAR作为代表进行说明。Pr，表示本发明的GPC-3抗体；Pu，表示已公开的GPC-3抗体。

图4显示GPC-3抗体染色证实GPC-3在GPC-3阳性HCC细胞系中的表达。第一抗体为GPC-3，阴性对照，同种型IgG2，第二抗体为Alexa647。图4A显示了Hep-3B和Huh-7HCC(GPC-3阳性)、SMMC7721(GPC-3-阴性)细胞系。图4B显示利用GPC-3抗体流式细胞仪检测GPC-3在Hep-G2，GPC-3阳性细胞中的表达。

图5显示了GPC-3CAR-T细胞的体外扩增。已公开的GPC-3作为阳性对照。Promab的GPC-3CAR-T和已公开的CAR-T细胞均在12天时表现出高效的体外扩增(>80倍)。包括：已公开的GPC3-28-Z CAR-T细胞，Promab GPC-3-28-Z CAR-T细胞；非GPC-3-28-Z CAR-T细胞；非转导性T细胞。z＝CD3ζ。

图6显示了Fab抗体染色检测GPC-3CAR-T细胞的转导。图6显示的是3次独立实验的代表性实验。

图7显示了GPC-3-CAR-T细胞对GPC-3阳性细胞(Hep-G2和Huh-7细胞)具有高细胞毒性，对GPC-3阴性细胞(SMMC7721细胞)无细胞毒性。图7A显示了Hep-G2GPC-3阳性细胞的实验结果，GPC-3CAR-T细胞的细胞毒性高于对照T细胞。图7B显示了GPC-3阳性Huh-7细胞的实验结果，GPC-3-CAR-T细胞的细胞毒性高于对照T细胞。图7C显示了GPC-3阴性SMMC7721细胞的实验结果，GPC-3细胞毒性与对照T细胞相同。Pu-GPC-3已公开GPC3，P3-GPC-3-PromabGPC-3序列。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种Glypican-3特异性抗体及其特异性CAR-T细胞。具体地，本发明涉及一种抗人GPC-3单克隆抗体，其包含具有SEQ IDNO：5所示氨基酸序列的VH的和具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的VL。本发明的抗体特异性靶向GPC-3阳性肝癌细胞中的GPC-3，而不靶向正常肝组织的小鼠抗人单克隆抗体。本发明还涉及一种靶向过表达GPC-3肿瘤抗原的癌细胞的GPC-3-CAR-T细胞。本发明的CAR-T细胞对几种肝癌细胞(HCC)具有高细胞毒性，对GPC-3阴性的肝细胞无活性。在此基础上完成本发明。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送***中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。

如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域，与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”也称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。所述的“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域的任何寡肽或多肽。

如本文所用，“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特异结构的区域。

如本文所用，“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。

GPC-3

GPC-3为磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白，是一种膜相关硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。GPC-3在胚胎组织如发育中的肠和中胚层组织中高度表达，其在大多数成人组织中表达下调，但在肝细胞癌(HCC)和肺癌中过表达。GPC-3在细胞生长、增殖和转移中起关键作用，特别是在肝细胞癌(HCC)中。GPC-3的过表达显示与肝细胞癌和肺癌患者预后不良有关。GPC-3是代表性的有价值的HCC分子靶标。用shRNA、或靶向GPC-3的CAR-T、或人源化的细胞毒性抗体、或疫苗来沉默GPC-3，会导致HCC的增殖减弱。最近，有研究人员在临床试验中，利用识别肝癌患者GPC-3蛋白C末端表位的GC33人源化GPC-3抗体，对GPC-3靶点进行了测试，在每周施用2.5-20mg/kg的情况下，没有表现出剂量限制性毒性。最近，有研究人员在临床前的异种移植小鼠模型中，测试了识别蛋白N末端(HN3抗体)和C-末端表位(YP7)的免疫毒素缀合的GPC-3抗体。N末端抗体阻断WNT信号传导，而C末端抗体没有，并且与假单胞菌外毒素A(PE38)片段融合的两个抗体均表现出抗肿瘤活性。

GPC-3结构

人GPC-3蛋白由580个氨基酸组成，分子量为65.6kDa。GPC-3基因位于染色体Xq26.2上。GPC-3通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚点附着于细胞膜。GPC-3蛋白的结构如图2所示。

Furin在R358和S359氨基酸之间切割GPC-3蛋白，形成两个亚基：40kDa的N-末端和30kDa的C末端。成熟的GPC-3异二聚体作为糖基磷脂酰肌醇(GPI)在细胞表面上表达。GPI锚点蛋白具有两个连接至C-末端区域(靠近细胞膜)的HS链(图2)。

GPC-3信号

细胞表面磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)通过其硫酸肝素(HS)侧链与WNT和肝素(结合了生长因子如成纤维细胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF))形成复合物，并在肝癌(HCC)细胞中刺激受体介导的信号传导。

本发明的抗体

本发明涉及一种抗人GPC-3单克隆抗体，其包括序列如SEQ ID NO：5所示的VH和氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的VL。抗人GPC-3单克隆抗体与人GPC-3蛋白N末端的前55-200个氨基酸结合。

在另一优选例中，抗人GPC-3单克隆抗体是单链抗体(scFv)。

如本文所用，术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的不同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。IgG代表免疫球蛋白中最重要的一类，由于化学结构和生物功能差异，它又可以分为4个子类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ或λ链。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

如本文所用，“单链抗体(scFv)”是指源自抗体的单链多肽，其保留了结合抗原的能力。scFv的实例包括通过重组DNA技术形成的抗体多肽，其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区经由间隔序列连接。制备scFv的各种方法是本领域技术人员所熟知的。

抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的FR区(FR)。4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR区，即轻链高变区(LCDR),指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链的3个CDR区，即重链高变区(HCDR),指HCDR1、HCDR2和HCDR3。发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。天然重链和轻链可变区中的四个FR区大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

如本文所用，术语“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。

如本文所用，术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。

如本文所用，术语“单克隆抗体”指得自单个细胞来源的克隆分泌的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原表位。所述的细胞可能是真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。

如本文所用，术语“嵌合抗体”是由鼠源性抗体的V区基因与人抗体的C区基因拼接为嵌合基因，然后***载体，转染宿主细胞表达的抗体分子。既保留了亲本鼠抗体的高特异性和亲和力，又使其人源Fc段能有效介导生物学效应功能。

如本文所用，术语“人源化抗体”，是本发明鼠抗的一种可变区改造形式，具有源自(或基本上源自)非人类抗体(优选小鼠单克隆抗体)的CDR区，和基本源自人源抗体序列的FR区和恒定区；即将鼠抗的CDR区序列嫁接到不同类型的人种系抗体构架序列上。因为CDR序列负责大部分的抗体-抗原相互作用，所以可以通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体性质的重组抗体。

在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。

抗体的制备

任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本发明的抗GPC-3抗体。例如，可以用连接或天然存在的GPC-3同源二聚体或其片段免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。

任何合适形式的GPC-3都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对GPC-3特异的非人抗体，筛选所述抗体的生物学活性。激发免疫原可以是全长的成熟人GPC-3，包括天然的同源二聚体，或含单个/多个表位的肽。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。免疫原可以由天然来源纯化，或者在遗传修饰的细胞中产生。编码免疫原的DNA在来源上可以是基因组或非基因组的(例如cDNA)。可以使用合适的遗传载体表达编码免疫原的DNA，所述载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体、质料和非病毒载体。

全人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在本发明中，抗体是IgG抗体，使用IgG4亚型。通过用下文实施例中描述的生物学测定筛选抗体易于实现必需恒定结构域序列的最优化，以产生所需生物学活性。

同样，任一类轻链都可以在本文的化合物和方法中使用。具体地说，κ、λ链或其变体在本发明的化合物和方法中是可以用的。

本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。具体地，宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、CHO-K1、HEK-293细胞。

优选的宿主细胞包括E.coli TG1或BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者CHO-K1细胞(表达全长IgG抗体)

本发明中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域熟知的技术进行。获得的转化子可用常规方法培养，转化子表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，用常规培养基在合适的条件下培养。

通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。

所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。

嵌合抗原受体(CAR)

本发明还涉及一种嵌合抗原受体融合蛋白，其从N末端至C末端包括：(i)抗GPC-3的单链抗体(scFv)(本发明)，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一种共刺激结构域，和(iv)激活域。

本发明人制备了针对血液恶性肿瘤(白血病，淋巴瘤和骨髓瘤)的GPC-3-ScFv-CD28-CD3-CAR-T(GPC-3-CAR-T)细胞，其对过表达GPC-3的癌细胞表现出高杀伤活性。本发明人提供了证明GPC-3-CAR-T细胞在体外培养中有效扩增的数据。

与未转导的T细胞相比，GPC-3-CAR-T细胞对GPC-3阳性的HCC细胞具有更高的细胞毒性。GPC-3-CAR-T细胞对GPC-3阴性HCC细胞无细胞毒性。

与已公开的GPC-3抗体相比，本发明的GPC-3单克隆抗体或GPC-3单链抗体的优点在于：本发明抗体对GPC-3阳性癌细胞具有高度特异性，因此临床上的细胞毒性较小。因此，GPC-3抗体在许多临床应用中作为治疗剂是非常有效的。

本发明的小鼠抗人GPC-3单克隆抗体与GPC-3阳性癌细胞中的GPC-3结合，而不与GPC-3阴性细胞中的GPC-3结合

具体地，本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。

在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向GPC-3的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1BB信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)₂片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别肿瘤高表达抗原的抗体，较佳地为单链抗体。

对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

本发明的CAR中的胞内结构域包括4-1BB的信号传导结构域和CD3ζ的信号传导结构域。

CAR-T细胞

如本文所用，术语“本发明的CAR-T细胞”、“Promab的GPC-3CAR-T”、“Promab的CAR-T细胞”、“Pr GPC-3CAR-T细胞”可互换使用，是指包含本发明的GPC-3单链抗体的CAR-T细胞。

优选的，本发明CAR-T细胞具有CD8-GPC-3ScFv MT28-CD28-CD3δ结构，包括人CD8信号肽，GPC-3scFv(VH-接头3x(G4S)-VL)，CD8铰链区，CD28跨膜区，激活域CD3ζ(图3，Pr)。具体地，CD8引导序列的编码序列如SEQ ID NO.:8所示。GPC-3scFv(V_H-接头-V_L)-CD28-CD3-zeta的编码序列如SEQ ID NO.:9所示，GPC-3scFv的编码序列如SEQ ID NO.:9的1-744位所示，接头(3x(G4S)的编码序列如SEQ ID NO.:9的364-408位所示，CD28-CD3-zeta的编码序列如SEQ ID NO.:9的745-1452位所示。本发明的GPC-3-CAR(CD8-GPC-3ScFv MT28-CD28-CD3δ)的氨基酸序列如SEQ ID NO.:10所示。

载体

编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了其中***本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的***，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递***的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因***载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒***在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达***是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因***哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散***，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的***，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体***为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递***的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。

制剂

本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面的单链抗体、本发明第三方面所述的嵌合抗原受体、本发明第四方面所述的重组蛋白、或本发明第五方面所述的抗体药物偶联物、或本发明第八方面所述的细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，更优地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明的GPC-3抗体可用于选自下组的免疫治疗应用：毒素/药物偶联Ab、治疗性单克隆抗体、人源化GPC-3抗体、CAR-T免疫治疗、或其组合。

包含本发明GPC-3抗体的GPC-3-CAR-T可有效靶向HCC、肝癌、肺癌等GPC-3阳性细胞系中的GPC-3。

本发明的GPC-3-CAR-T可以与不同类型的化疗(免疫检查点抑制剂)、靶向治疗、小分子抑制剂、抗体等联合应用。

本发明的GPC-3抗体可以通过定点诱变进行修饰，用于调控亲和力；也可用于人源化和完全人源化抗体的产生。

本发明的GPC-3-CAR-T细胞可以在临床上用于GPC-3阳性细胞的治疗。

本发明的GPC-3抗体靶向GPC-3的N-末端氨基酸(抗原表位位于GPC-3片段的N端区域：第55-200个氨基酸)，由于其靶向的蛋白片段更靠近肿瘤细胞，其与CAR-T和其他环境中的C-末端结构相比更具有优势。共激活域的修饰：可以利用CD28，4-1BB等提高其效果。可利用标签共轭GPC-3scFV产生CAR。

第三代CAR-T或其他共激活信号域可用于CAR内相同的GPC-3-scFv。

GPC-3与其他靶向其他肿瘤抗原或肿瘤微环境(VEGFR-1-3)的CAR或双scFv-CAR组合可以联合应用，以增强单独应用GPC-3-CAR的活性。

本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物GPC-3，协同激活T细胞，引起T细胞免疫应答，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。

因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗GPC-3的CAR-T细胞引起抗表达GPC-3的细胞的特异性免疫应答。

尽管本文公开的数据具体公开了包括抗-GPC-3scFv、铰链和跨膜区、和4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。

本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

本发明提供了***的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。

本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，***或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明经修饰的T细胞(如，CAR-T20细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明的抗体靶向GPC-3阳性肝癌细胞中的GPC-3，而不靶向正常肝组织。

(b)本发明抗体对GPC-3阳性癌细胞具有高度特异性，临床使用上的细胞毒性较小。

(c)本发明的CAR-T细胞对几种肝癌细胞(HCC)具有高细胞毒性，对GPC-3阴性的肝细胞无活性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

发明人将GPC-3CAR构建体克隆至慢病毒载体的Xba I和EcoR I位点，从而在慢病毒载体内产生CD19CAR构建体。pCD510-FMC63-28z慢病毒CAR构建体的XbaI和EcoRI克隆位点之间包含GPC-3ScFv-CD28-CD3zeta***片段。

慢病毒在293T细胞中产生，通过RT-PCR确定滴度。随后将等量的慢病毒用于T细胞转导，如方法部分所述。

实施例1CAR慢病毒的生产

慢病毒通过以下步骤制备：

第1天：

1.将5x 10⁶HEK293FT细胞接种到100毫米直径的培养皿；

第2天：

2.检查以确保70％-90％的细胞汇合；

3.为每个100毫米直径的培养皿准备转染复合物，流程如下：

a.在1.5ml管A中：将2.5μg CAR(嵌合抗原受体)DNA质粒(plasmid)和20μL慢病毒包装组合(ALSTEM,cat#VP100；see Appendix B3)稀释到0.5ml DMEM或Opti-MEM无血清培养基中，轻轻混合；

b.在1.5ml管B中：将30μL Nanofect转染试剂(ALSTEM,cat.no.NF100)稀释到0.5ml DMEM或Opti-MEM无血清培养基中，轻轻混合；

c.将管B中的NanoFect/DMEM加入到DNA/DMEM溶液(管A)中，涡旋5-10秒，将DMEM-plasmid-NanoFect混合物在室温下培养15分钟；

4.将步骤3获得的转染复合物全部滴到细胞板上，来回旋转使得转染复合物均匀地分散在板上；

5.37℃加湿5％CO₂培养箱中过夜培养该细胞；

第3天：

6.用10mL新鲜培养基替换上述转染复合物的上清液，并补充20μL ViralBoost(500X,ALSTEM,cat.no.VB100)；

7.37℃培育24小时；

第4天：

8.将含有慢病毒的培养液上清收集到50mL无菌有盖锥形离心管中，并放置于冰上；

9.上清液在4℃3000转条件下离心15分钟，以沉淀细胞碎片；

10.利用0.45μm的低蛋白结合无菌过滤器过滤澄清后的上清液；

11.通过定量RT-PCR测定慢病毒的浓度/滴度，利用Lenti-X qRT-PCR滴定试剂盒(Clontech；catalog number 631235)，测定上清液中HEK293的病毒浓度(通过DNaseI预处理去除任何可能残留的质粒DNA)；

12.上述病毒可以用于感染、纯化，或作为病毒原液存储于‐80℃备用，优选为小份单独存储，以减少反复冻融带来的病毒滴度损失。

实施例2慢病毒包装***

产品说明

产品名称：SuperLenti^TM Lentivirus Packaging System

说明书：

对于慢病毒颗粒的生产，通常需要三种成分：1)含有目标外源基因的慢病毒载体，2)包含所有必需的病毒结构蛋白的包装载体，3)表达水泡性口炎病毒(VSV)糖蛋白(G)。第三代慢病毒包装***提供了最大的生物安全性，因为慢病毒Rev基因是作为相对其他结构基因的独立载体提供，进一步消除了将载体逆向重组到有复制能力的病毒颗粒中的可能性。第三代慢病毒包装混合物仅支持嵌合5'LTR的慢病毒表达载体，其中HIV启动子被CMV或RSV替代，因此使其与TAT无关。

SuperLenti慢病毒包装混合物是一种基于HIV的即用型第三代慢病毒包装***，其中质粒表达慢病毒生产所需的元件，其允许创建基于HIV-1的复制无效的慢病毒，在***或非***哺乳动物细胞中递送并表达目标外源基因。

产品目录号：VP 100；

规格：200μL；

运输：室温；

储存和安全性：该产品可以在-20℃稳定储存6个月，尽量避免反复循环，应该分装成一次使用的剂量。

使用方法：

对于100mm培养皿的慢病毒包装，用20μl慢病毒包装混合物混合2.5μg慢病毒表达载体。

对于150mm培养皿的慢病毒包装，用40μL慢病毒包装混合物混合5μg慢病毒表达载体。

质量控制：每批次的慢病毒包装是在转染实验下通过使用人类胚胎肾293细胞下进行的测试。

仅供研究使用。不用于诊断或治疗程序。

实施例3全血中外周血单核细胞(PBMC)的分离

全血(斯坦福大学医院血液中心，斯坦福，加州)采集自单个个体或多个个体(取决于用血需求)，并置于10mL的Heparin vacutainers(Becton Dickinson公司)中。

注：应该在采血后的两小时内处理血液，以确保细胞产量最大。血液可以在室温下(室内)储存过夜，用于第二天的处理；然而，细胞产量会有一些损失。血液不应在4℃下储存在空管中。

在50ml锥形离心管中，将约10ml抗凝血液与无菌磷酸盐缓冲液(PBS)混合，总体积为20ml(PBS，pH7/4，不含Ca²⁺/Mg²⁺)。

在另一无菌50mL锥形离心管中，吸取15mL Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare，17-1440-03)。非常轻柔地将20ml的血液/PBS层压到Ficoll的表面，并在室温下以400xg离心样品30-40min，无需制动。

小心吸取稀释血浆和Ficoll分界处的包含外周血单核细胞(PBMC)的细胞层，避免吸入Ficoll。为了确保完全去除Ficoll，血小板和血浆蛋白，用PBS洗涤PBMC两次，总体积为40ml，并在室温下以200xg离心10分钟。然后用血细胞计数器计数细胞。如果洗涤的PBMC立即使用，则用CAR-T培养基(AIM V-AlbuMAX(BSA)(Life Technologies)，含有5％AB血清和1.25μg/mL两性霉素B(Gemini Bioproducts，Woodland，CA)，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)洗涤一次。如果要将PBMC冷冻，则在转移绝缘小瓶中重悬洗涤细胞，-80℃，保持24小时，然后储存在液氮中。

实施例4外周血单核细胞T细胞活化

如果使用新鲜分离的PBMC，分离的细胞(用1xPBS(pH7.4)洗涤，无Ca²⁺/Mg²⁺)用CAR-T培养基(AIM V-AlbuMAX(BSA)(Life Technologies)，含有5％AB血清和1.25μg/mL两性霉素B(Gemini Bioproducts，Woodland，CA)，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)洗涤一次，不使用人白细胞介素-2(huIL-2)(Invitrogen)，浓度为5×10⁵个细胞/mL。在不含huIL-2的CAR-T培养基中洗涤一次，最后用含30U/mL huIL2(1000×stock；Invitrogen)的CAR-T培养基重悬浮至终浓度为5×10⁵个细胞/mL。

如果使用冷冻的PBMC，在9mL预热(37℃)的DMEM培养基(Life Technologies，含有10％FBS，100u/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中，解冻并重悬细胞(1×10⁷细胞/mL)，浓度为5×10⁵个细胞/mL。300xg离心细胞5分钟，然后用不含huIL-2的CAR-T培养基中洗涤一次，最后用含30U/mL huIL2的CAR-T培养基重悬浮至终浓度为5×10⁵个细胞/mL。

在活化之前，将缀合抗人CD28和CD3抗体的磁珠(Invitrogen)用1mL无菌1xPBS(pH7.4)(使用磁性架从溶液中分离珠子)洗涤三次，然后重悬于CAR-T培养基中(30U.mLhuIL-2)，终浓度为2×10⁷珠/mL。

然后将25uL的磁珠添加到1mL的PBMC中，以1:1的磁珠细胞比混合PBMC和磁珠。

将所需数量的等分试样加到12孔低附着或未处理细胞培养板的各个孔中，并在37℃下CO₂存在下培养24小时，然后进行病毒转导。

实施例5T细胞转导和扩增

PBMC活化后，将细胞在37℃，5％CO₂下培养24小时。

冰上解冻慢病毒。每孔1x10⁶个细胞并添加5x10⁶个慢病毒和2μL/mL Transplus培养基(Alstem，Richmond，CA)(最终稀释1:500)。细胞培养24小时后重复添加病毒。

然后将细胞在含有30U/ml IL-2的新鲜培养基中培养12-14天(总培养时间取决于所需CAR-T细胞的最终数量)。

每隔2-3天分析细胞浓度，添加培养基稀释细胞悬浮液至1×10⁶细胞/mL。

实施例6转导验证-细胞染色

洗涤细胞，在FACS缓冲液(磷酸盐缓冲液(PBS)，缓冲液中加0.1％叠氮钠和0.4％牛血清白蛋白)中悬浮，然后细胞按1x10⁶等分分存到各试管。

与正常山羊IgG Fc(lifetechnologies)受体阻断，添加100μL 1:1000稀释的正常山羊IgG到各管，冰上孵育10分钟。

每管中加入1.0ml FACS缓冲液，充分混合并以300g离心5分钟。

加入生物素标记的多克隆山羊anti-mouse-F(ab)2抗体(Life Technologies)检测CD19scFv；加入生物素标记的正常多克隆山羊IgG抗体(Life Technologies)作为同种型对照。(1:200稀释，反应体积为100μl)。

将细胞在4℃孵育25分钟，并用FACS缓冲液洗涤一次。

在FACS缓冲液中悬浮细胞并通过向每个管中加入100μl 1:1000稀释的正常小鼠IgG来阻断细胞。在冰中孵育10分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞并重悬于100μl FAC缓冲液中。

随后用藻红蛋白(PE)标记的链霉亲和素(BD Pharmingen，San Diego，CA)和别藻蓝蛋白(APC)标记的CD3(eBiocience，San Diego，CA)对细胞进行染色。将1.0μl PE和APC分别加入管2和3。

利用流式细胞仪BD FacsCalibur(BD Biosciences)进行细胞采集，并用FlowJo软件(Treestar，Inc.Amland，OR)进行分析。

实施例7细胞毒性试验(实时ACEA)

利用ACEA仪器进行毒性试验，依据生产厂家的实时ACEA试验指导程序进行操作。

实时检测细胞的细胞毒性，采用5:1稀释效应细胞与靶细胞。结果显示，本发明的GPC-3-CAR-T细胞对GPC-3阳性的HCC细胞具有高细胞毒性作用。本发明的GPC-3-CAR-T细胞对GPC-3阴性HCC细胞无细胞毒性。

实施例8 GPC-3、GPC-3变量链和CAR构建体的杂交瘤细胞可变区测序

利用杂交瘤细胞产生小鼠抗人GPC-3单克隆抗体。产生针对GPC-3蛋白N-末端的150个氨基酸(55至200个氨基酸)的杂交瘤。采用的杂交瘤技术是标准的，并是其他地方描述。该抗体检测胞外结构域N-末端的55-200个氨基酸，为IgG2型。我们对此抗体进行了测序。VH、VL和scFv的序列如实施例9所示。

利用本领域的常规方法进行杂交瘤阳性克隆的测序。根据测序结果，可以分析确定重链和轻链的可变区序列。随后可以合成ScFv克隆。

实施例9 GPC-3 VH、VL和scFv的序列

通过对GPC-3阳性的杂交瘤克隆进行测序获得GPC-3 scFv的序列。GPC-3scFv的结构是VH-接头-VL。

粗体表示VH的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)；下划线表示VL的核苷酸序列(SEQ IDNO：2)；之间的序列(斜体)是编码G4S接头(GGGGS)的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。

GATGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGTCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCACTTTCACTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTAATTATAGCTGGCACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATACACTACAGTGGTAGCACTAAGTTCAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAAGGGAGGGGATTTATGGTTACGACGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTACCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGC AGGGCCAGTGAAAGTGTCAGTACATCTATCTATAATTATATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAA ACTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACT TTTCCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATTCTGCAACATATTTCTGTCAGCACAGTTGGGAGATTCCGCTC ACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG

GPC-3 scFv蛋白：238aa/26.3kD(SEQ ID NO:4)

DVQLQESGPVLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSNYSWHWIRQFPGNKLEWMGYIHYSGSTKFNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCAKGGDLWLRRYFDVWGAGTTVTVSS

DIVLTQSPASLPVSLGQRATISCRASESVSTSIYNYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGS GSGTDFSLNIHPVEEEDSATYFCQHSWEIPLTFGAGTKLELKR

在蛋白序列中，粗体表示VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)；下划线表示VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)；之间的序列(斜体)是G4S接头(GGGGS)的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)

实施例10 GPC-3-CAR序列

GPC-3-CAR构建体的示意图如图3所示。慢病毒载体LentiCMV-MCS-EF1a-puro用于克隆所有的scFv CAR序列。

本发明的GPC-3 ScFv MT28-CD28-CD3δ的结构包括人CD8信号肽，GPC-3scFv(VH-接头3x(G4S)-VL)，CD8铰链区，CD28跨膜区，激活域，CD3ζ(图3，Pr)。具体地，CD8引导序列的编码序列如SEQ ID NO.:8所示。GPC-3scFv(V_H-接头-V_L)-CD28-CD3-zeta的编码序列如SEQID NO.:9所示，GPC-3 scFv的编码序列如SEQ ID NO.:9的1-744位所示，接头(3x(G4S)的编码序列如SEQ ID NO.:9的364-408位所示，CD28-CD3-zeta的编码序列如SEQ ID NO.:9的745-1452位所示。本发明的GPC-3-CAR(CD8-GPC-3 ScFv MT28-CD28-CD3δ)的氨基酸序列如SEQ ID NO.:10所示。

在本发明的实施例中采用公开发表的GPC-3 CAR作为对照，公开的GPC-3CAR的结构包括人CD8信号肽，GPC-3scFv(VL接头3x(G4S)VH)，CD8铰链区，CD28跨膜区，激活域，CD3ζ(图3，Pu)。

实施例11利用流式细胞术和Western印迹进行GPC-3抗体对GPC-3阳性细胞系中GPC-3的检测

利用杂交瘤细胞生产小鼠抗人GPC-3单克隆抗体。该抗体结合胞外结构域N-末端的55-200个氨基酸。对该抗体进行测序。VH、VL和scFv的序列如实施例10所示。

在流式细胞术中，GPC-3在GPC-3阳性肝细胞癌(HCC)中高表达，并在GPC-3阴性HCC中不表达。

具体地，利用GPC-3单克隆抗体，进行SMMC-7721-GPC-3阴性细胞系和Hep-3B、Hep-G2和Huh-7肝细胞癌细胞系的染色。结果显示，SMMC-7721细胞系，以及>25％的GPC-3阳性细胞系无染色(图4A)。在HepG2细胞系中观察到相同的高GPC-3染色(图4B)。

实施例12 GPC-3-CAR-T细胞在培养中有效扩增

获得的GPC-3抗体和GPC-3单链抗体scFv的序列如实施例10所示。GPC-3scFv序列(实施例10)***至CAR结构的CD28和CD3ζ结构域，再利用慢病毒将CAR转导入T细胞。GPC-3-CAR细胞在体外有效扩增(图5)。

实施例13利用GPC3-CAR慢病毒构建体转染T细胞，证明GPC-3上的表达

为了检测转导，利用抗FAB抗体染色CAR-T细胞。相比非转导对照细胞，该染色细胞株显示出更高的转导效率(图6)

实施例14 GPC-3-CAR对GPC-3阳性HCC细胞的细胞毒性高于非转导T细胞，对GPC-3阴性HCC细胞无细胞毒性。

实时细胞毒性测定显示，GPC-3-CAR细胞对GPC-3阳性Hep-G2和Huh-7细胞具有高细胞毒性(图7)。其对GPC-3阴性细胞系SMMC7721中无细胞毒性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 曹卫

<120> Glypican-3特异性抗体及其特异性CAR-T细胞

<130> P2017-1504

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatgtgcagc ttcaggagtc aggacctgtc ctggtgaaac cttctcagtc actttcactc 60

acctgcactg tcactggcta ctccatcacc agtaattata gctggcactg gatccggcag 120

tttccaggaa acaaactgga atggatgggc tacatacact acagtggtag cactaagttc 180

aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240

ctgcagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aaagggaggg 300

gatttatggt tacgacggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 2

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttacctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcatgca gggccagtga aagtgtcagt acatctatct ataattatat gcactggtac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttttccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggattc tgcaacatat ttctgtcagc acagttggga gattccgctc 300

acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgg 336

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtggcggtg gttct 15

<210> 4

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Phe Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Gly Asp Leu Trp Leu Arg Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile

115 120 125

Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Gln Arg

130 135 140

Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Thr Ser Ile Tyr

145 150 155 160

Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu

165 170 175

Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe

180 185 190

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Val

195 200 205

Glu Glu Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Ser Trp Glu Ile

210 215 220

Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

225 230 235

<210> 5

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Phe Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Gly Asp Leu Trp Leu Arg Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Ile Tyr Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Glu Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105 110

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 8

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctagagccg ccaccatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg 60

ctccacgccg ccaggccggc tagc 84

<210> 9

<211> 1452

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatgtgcagc ttcaggagtc aggacctgtc ctggtgaaac cttctcagtc actttcactc 60

acctgcactg tcactggcta ctccatcacc agtaattata gctggcactg gatccggcag 120

tttccaggaa acaaactgga atggatgggc tacatacact acagtggtag cactaagttc 180

aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240

ctgcagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aaagggaggg 300

gatttatggt tacgacggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc 360

tcaggtggcg gtggttctgg tggcggtggt tctggtggcg gtggttctga cattgtgctg 420

acacagtctc ctgcttcctt acctgtatct ctggggcaga gggccaccat ctcatgcagg 480

gccagtgaaa gtgtcagtac atctatctat aattatatgc actggtacca acagaaacca 540

ggacagccac ccaaactcct catcaagtat gcatccaacc tagaatctgg ggtccctgcc 600

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttttccctca acatccatcc tgtggaggag 660

gaggattctg caacatattt ctgtcagcac agttgggaga ttccgctcac gttcggtgct 720

gggaccaagc tggagctgaa acggctcgag aagcccacca cgacgccagc gccgcgacca 780

ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgagccgg 840

ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgccagtga taagcccttt 900

tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 960

tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 1020

atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 1080

gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 1140

cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 1200

gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgca gagaaggaag 1260

aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 1320

gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1380

ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1440

taataggaat tc 1452

<210> 10

<211> 508

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ser Arg Ala Ala Thr Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro

1 5 10 15

Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Ala Ser Asp Val Gln Leu

20 25 30

Gln Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu

35 40 45

Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asn Tyr Ser Trp His

50 55 60

Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile

65 70 75 80

His Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Phe Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile

85 90 95

Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn

100 105 110

Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Gly

115 120 125

Asp Leu Trp Leu Arg Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

130 135 140

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

145 150 155 160

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Pro

165 170 175

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser

180 185 190

Val Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

195 200 205

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser

210 215 220

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser

225 230 235 240

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys

245 250 255

Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu

260 265 270

Glu Leu Lys Arg Leu Glu Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

275 280 285

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

290 295 300

Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

305 310 315 320

Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

325 330 335

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

340 345 350

Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn

355 360 365

Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr

370 375 380

Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser

385 390 395 400

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

405 410 415

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

420 425 430

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys

435 440 445

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

450 455 460

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

465 470 475 480

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

485 490 495

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

500 505

Claims

1.一种抗人GPC-3单克隆抗体，其特征在于，所述抗体具有：

(i)氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的重链可变区；和

(ii)氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的轻链可变区；

并且所述抗体与人GPC-3蛋白的N末端的前55-200个氨基酸区域结合。

2.一种单链抗体，其特征在于，所述的单链抗体具有：

(i)氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的重链可变区；和

(ii)氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的轻链可变区；

3.如权利要求2所述的单链抗体，其特征在于，所述的单链抗体还包含VH和VL之间的接头。

4.如权利要求2所述的单链抗体，其特征在于，所述的单链抗体具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

5.一种嵌合抗原受体CAR，其特征在于，所述的CAR包含权利要求2所述的单链抗体。

6.如权利要求5所述的CAR，其特征在于，所述的CAR从N末端至C末端包括：

(i)权利要求2所述的单链抗体，

(ii)跨膜结构域，

(iii)至少一种共刺激结构域，和

(iv)激活域。

7.如权利要求5所述的CAR，其特征在于，所述的CAR具有下式I结构：

L-scFv-H-TM-C-CD3ζ (I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为任选的信号肽序列；

scFv为权利要求2所述的单链抗体；

H为任选的铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

8.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：

(i)如权利要求1所述的抗体、或权利要求2所述的单链抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

9.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物含有：

(a)如权利要求1所述的抗体、或权利要求2所述的单链抗体；以及

10.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的抗体、权利要求2的单链抗体、权利要求5的嵌合抗原受体(CAR)。

11.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求10所述的核酸分子。

12.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求11所述的载体、染色体中整合有外源的权利要求10所述的核酸分子、或表达权利要求1所述的抗体、表达权利要求2所述的单链抗体、或表达权利要求5所述的CAR。

13.如权利要求12所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为工程化的免疫细胞。

14.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1所述的抗体、权利要求2的单链抗体、权利要求5的嵌合抗原受体(CAR)、权利要求9所述的抗体药物偶联物、或权利要求12所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

15.一种权利要求1所述的抗体、权利要求3的单链抗体、权利要求5的嵌合抗原受体(CAR)、权利要求9所述的抗体药物偶联物、或权利要求12所述的宿主细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。