KR20220126788A

KR20220126788A - Ｂ형 간염 감염 및 관련 질병의 치료를 위한 항체

Info

Publication number: KR20220126788A
Application number: KR1020227030102A
Authority: KR
Inventors: 웬신 루오; 시밍 강; 이웬 왕; 쿠안 유안; 티안잉 장; 닝샤오 시아
Original assignee: 시아먼 유니버시티; 양셍탕 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2017-04-07
Filing date: 2018-04-08
Publication date: 2022-09-16
Also published as: KR20200010217A; CN113480641A; RU2765878C2; CN108690134B; RU2019135404A3; KR102561555B1; CN113480641B; RU2019135404A; CN108690134A; WO2018184593A1

Abstract

B형 간염 표면 항원에 대한 항체, 그의 암호화 핵산 및 제조 방법, 및 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 항체 및 약학 조성물의 용도를 또한 제공한다. 항체 및 약학 조성물을 사용하여 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)을 예방 및/또는 치료하고, 피실험자(예를 들어 인간)의 신체에서 HBV의 독성을 중화시키고, HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시킬 수 있다.

Description

Ｂ형 간염 감염 및 관련 질병의 치료를 위한 항체{Antibodies for treatment of hepatitis B infection and related diseases}

본 발명은 분자 바이러스학 및 면역학의 분야, 특히 B형 간염 바이러스(HBV) 감염의 치료 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 B형 간염 표면 항원(HBsAg)에 대한 항체, 이를 암호화하는 핵산 분자, 이의 제조 방법, 및 이를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 약학 조성물은 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)의 예방 및/또는 치료, 피실험자(예를 들어 인간)에서 HBV의 독성의 중화, 또는 피실험자에서 HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준의 감소에 사용될 수 있다. 상응하게, 본 발명은 또한 약학 조성물의 제조에서 항체(특히 그의 인간화된 항체) 및 그의 변체의 용도에 관한 것이며, 여기에서 약학 조성물은 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)의 예방 및/또는 치료, 피실험자(예를 들어 인간)에서 HBV의 독성의 중화, 또는 피실험자에서 HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준의 감소에 사용된다.

B형 간염 바이러스 감염, 특히 만성 HBV 감염은 세계에서 가장 중요한 공중 보건 문제 중 하나이다(Dienstag JL. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 2008 Oct 2; 359(14): 1486-1500). 만성 HBV 감염은 일련의 간 질환, 예를 들어 만성 B형 간염(CHB), 간경변증(LC) 및 간세포 암종(HCC)에 이를 수 있다(Liaw YF, Chu CM. Hepatitis B virus infection. Lancet 2009 Feb 14;373(9663): 582-592). 보고서에 따르면, 전세계적으로 약 20억명의 사람이 HBV에 감염되었으며, 약 3억5천만명의 사람이 만성 B형 간염 바이러스에 감염되어 있고, 이들 감염된 사람은 결국 HBV 감염-관련된 간 질환으로 인해 15% 내지 25%의 위험률로 사망할 수 있으며, 전세계적으로 매년 100만명이 넘는 사람이 상기 질환으로 인해 사망할 수 있다(Dienstag JL., ibid; 및 Liaw YF et al., ibid.).

현재, 만성 HBV 감염에 대한 치료 약물은 주로 인터페론(INF)과 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드(NA)로 분류될 수 있다(Dienstag JL., ibid; Kwon H, Lok AS. Hepatitis B therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2011 May; 8(5): 275-284; 및 Liaw YF et al., ibid). 전자는 통상적인 인터페론(IFN) 및 peg-인터페론(Peg-IFN, 또한 오래-작용하는 인터페론으로서 공지됨)을 포함하며, 환자에서 주로 전체적인 면역성의 증대를 통해 HBV 억제 및 CHB 치료 효과를 성취하는 반면; 후자는, 주로 HBV의 폴리머라제 활성을 직접적으로 억제시킴으로써 HBV 복제를 억제하는 라미뷰딘(LMV), 아데포비어 디피복실(ADV), 엔테카비어(ETV), 텔비뷰딘(LdT), 테노포비어(테노포비어) 등을 주로 포함한다. HBV-감염된 환자(예를 들어 CHB 환자)의 경우, 상기 약물을 단독으로 사용하거나 또는 병용하는 치료법은 생체내에서 바이러스 복제를 유효하게 억제시킬 수 있으며 HBV DNA 수준을 현저하게 감소시킬 수 있고; 특히 치료법을 52주간 또는 연장된 기간 동안 수행한 후에, 환자에서 HBV DNA 수준이 검출 하한 미만인 바이러스학적 반응의 반응률은 40 내지 80%에 달할 수 있다(Kwon H et al., ibid.). 그러나, 상기 언급한 약물을 단독으로 사용하거나 또는 병용하는 치료법은 감염된 환자에서 HBV 바이러스를 완전히 제거할 수는 없으며, 이는 대개 5% 미만인 HBsAg 음성 전환 또는 HBsAg 혈청전환(감염된 환자에서 HBV 바이러스의 완전한 제거의 표시)의 반응률을 도출한다(Kwon H et al., ibid.). 따라서, HBV 바이러스, 특히 HBsAg를 보다 유효하게 제거할 수 있는 HBV-감염된 환자에 대한 혁신적인 치료 방법 및 약물의 개발이 시급히 필요하다.

면역학적 방법에 기반한 만성 HBV 감염의 치료를 위한 신규 약물의 개발이 본 분야에서 중요한 연구 방향 중 하나이다. 만성 HBV 감염에 대한 면역요법은 대개 2가지 방법인 능동 면역요법(백신 등과 같은 약물 형태에 상응한다)과 수동 면역요법(항체 등과 같은 약물 형태에 상응한다)에 의해 수행된다. 능동 면역요법은 HBV의 억제 또는 제거의 목적을 성취하기 위해서 치료학적 백신(단백질 백신, 폴리펩티드 백신 및 핵산 백신 등을 포함한다)을 투여함으로써 만성 HBV 감염된 개인을 자극하여 HBV에 대한 세포 면역 반응(CTL 효과 등) 및/또는 체액 면역 반응(항체 등)을 능동적으로 생성시키는 방법을 지칭한다. 현재, 만성 HBV 감염의 치료에 현저하게 유효한 능동 면역요법을 위한 약물이나 백신은 없다. 수동 면역요법(일례로서 항체에 의한)은 HBV-감염된 개인에게 치료학적 항체를 투여하고, 따라서 미경험 간세포가 항체-매개된 바이러스 중화에 의해 HBV 감염되는 것을 방지하거나, 또는 항체-매개된 면역 제거에 의해 신체로부터 바이러스 및 감염된 간세포를 제거하고, 이에 의해 치료학적 효과를 성취하는 방법을 지칭한다. 현재, 예방학적 B형 간염 백신에 대한 면역 응답자 또는 HBV 감염 생존자의 혈청/혈장으로부터 정제에 의해 획득한 항-HBs 다클론 항체, 즉 고-역가 B형 간염 면역글로불린(HBIG)이 모체에서 유아로의 HBV 수직 감염을 차단하고, 만성 HBV 감염 환자에서 간이식후 HBV 재감염을 예방하며, 우연히 HBV에 노출된 사람에서 감염을 예방하기 위해 널리 사용되어 오고 있다. 그러나, HBIG의 HBV-감염된 환자(예를 들어 CHB 환자)에의 직접적인 투여의 치료법은 그다지 효과가 없으며, 고역가 혈장의 적은 공급원, 고가, 불안정한 성질, 및 잠재적인 안전성 문제와 같은 다수의 한계를 갖는다.

따라서, HBV 감염의 치료에 보다 유효한 HBV 감염에 대한 혁신적인 치료학적 방법 및 약물의 개발이 시급히 필요하다.

하나의 태양에서, 본 발명은

(a) (i) 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 18, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 상기 서열과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH CDR1;

(ii) 서열번호 7, 서열번호 13, 서열번호 19, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 상기 서열과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH CDR2; 및

(iii) 서열번호 8, 서열번호 14, 서열번호 20, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 상기 서열과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH CDR3

로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상(예를 들어 1, 2 또는 3개)의 중쇄 가변 영역(VH) 상보성 결정 영역(CDR); 및/또는

(b) (vi) 서열번호 9, 서열번호 15, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 상기 서열과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VL CDR1;

(v) 서열번호 10, 서열번호 16, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 상기 서열과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VL CDR2; 및

(vi) 서열번호 11, 서열번호 17, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 상기 서열과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VL CDR3

로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상(예를 들어 1, 2 또는 3개)의 경쇄 가변 영역(VL) CDR

을 포함하는, HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기에 정의된 바와 같은 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다. 몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기에 정의된 바와 같은 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함한다. 몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기에 정의된 바와 같은 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은

(a) (i) 서열번호 7, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 서열번호 7과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH CDR2;

(ii) 서열번호 8, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 서열번호 8과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH CDR3; 및

(iii) 임의의 면역글로불린의 중쇄 가변 영역 중에 함유된 VH CDR1의 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH CDR1

을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는

(b) (iv) 서열번호 9, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 서열번호 9와 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VL CDR1;

(v) 서열번호 11, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 서열번호 11과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VL CDR3; 및

(vi) 임의의 면역글로불린의 경쇄 가변 영역(예를 들어 κ 경쇄 가변 영역) 중에 함유된 VL CDR2의 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VL CDR2

를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)

을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, VH CDR1은 인간 면역글로불린의 중쇄 가변 영역 중에 포함된 VH CDR1의 서열이다.

몇몇 바람직한 구현예에서, VH CDR1은 (a) 서열번호 6, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 서열번호 6과 상이한 서열; 또는 (b) 인간 중쇄 생식계열 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 함유된 VH CDR1의 서열 중에서 선택된 서열로 이루어진다. 몇몇 예시적인 구현예에서, 인간 중쇄 생식계열 유전자는 IGHV4-4^*08 및 IGHV4-61^*01로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

몇몇 예시적인 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VH CDR3, 및 서열번호 6, 서열번호 137 또는 서열번호 138의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, VL CDR2는 인간 면역글로불린의 경쇄 가변 영역(예를 들어 κ 경쇄 가변 영역) 중에 함유된 VL CDR2의 서열이다.

몇몇 바람직한 구현예에서, VL CDR2는 (a) 서열번호 10, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 서열번호 10과 상이한 서열; 또는 (b) 인간 경쇄 생식계열 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 함유된 VL CDR2의 서열 중에서 선택된 서열로 이루어진다. 몇몇 예시적인 구현예에서, 인간 경쇄 생식계열 유전자는 IGKV1-39^*01 및 IGKV1-5^*03으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

몇몇 예시적인 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VL CDR3, 및 서열번호 10, 서열번호 139 또는 서열번호 140의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2를 포함한다.

몇몇 예시적인 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VH CDR3, 및 서열번호 6, 137 또는 138의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1을 포함하고, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VL CDR3, 및 서열번호 10, 139 또는 140의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2를 포함한다.

(a) (i) 서열번호 12, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 서열번호 12와 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH CDR1;

(ii) 서열번호 14, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 서열번호 14와 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH CDR3; 및

(iii) 임의의 면역글로불린의 중쇄 가변 영역 중에 함유된 VH CDR2의 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH CDR2

를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는

(b) (iv) 서열번호 15, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 서열번호 15와 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VL CDR1;

(v) 서열번호 17, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 서열번호 17과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VL CDR3; 및

를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)

을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, VH CDR2는 인간 면역글로불린의 중쇄 가변 영역 중에 함유된 VH CDR2의 서열이다.

몇몇 바람직한 구현예에서, VH CDR2는 (a) 서열번호 13, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 서열번호 13과 상이한 서열; 또는 (b) 인간 중쇄 생식계열 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 함유된 VH CDR2의 서열 중에서 선택된 서열로 이루어진다. 몇몇 예시적인 구현예에서, 인간 중쇄 생식계열 유전자는 IGHV4-30-4^*07 및 IGHV4-4^*01로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

몇몇 예시적인 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 (a) 서열번호 12에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 14에 제시된 바와 같은 VH CDR3, 및 서열번호 13, 서열번호 141 및 서열번호 142로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, VL CDR2는 (a) 서열번호 16, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 서열번호 16과 상이한 서열; 또는 (b) 인간 경쇄 생식계열 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 함유된 VL CDR2의 서열 중에서 선택된 서열로 이루어진다. 몇몇 예시적인 구현예에서, 인간 경쇄 생식계열 유전자는 IGKV2-28^*01 및 IGKV3-15^*01로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

몇몇 예시적인 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 17에 제시된 바와 같은 VL CDR3, 및 서열번호 16, 서열번호 143 및 서열번호 144로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2를 포함한다.

몇몇 예시적인 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 14에 제시된 바와 같은 VH CDR3, 및 서열번호 13, 서열번호 141 및 서열번호 142로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2를 포함하고, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 17에 제시된 바와 같은 VL CDR3, 및 서열번호 16, 서열번호 143 및 서열번호 144로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2를 포함한다.

(a) (i) 서열번호 18, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 서열번호 18과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH CDR1;

(ii) 서열번호 19, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 서열번호 19와 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH CDR2; 및

(iii) 서열번호 20, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 서열번호 20과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH CDR3

를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는

(v) 서열번호 16, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 서열번호 16과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VL CDR2, 및

(vi) 서열번호 17, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 서열번호 17과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VL CDR3

를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)

을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 18에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 19에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 및 서열번호 20에 제시된 바와 같은 VH CDR3을 포함하고, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 16에 제시된 바와 같은 VL CDR2, 및 서열번호 17에 제시된 바와 같은 VL CDR3를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간화된다. 몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 또는 적어도 98%의 인간화 정도를 갖는다. 몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 비-CDR 영역은 19 이하, 15 이하, 14 이하, 13 이하, 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 또는 3 이하의 비-인간 공급원(예를 들어 시노몰구스 원숭이 공급원)의 아미노산 잔기를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 프레임워크 영역(FR)을 추가로 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은

(a) (i) 서열번호 21, 서열번호 29, 서열번호 37, 서열번호 44, 서열번호 50, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 상기 서열과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH FR1;

(ii) 서열번호 22, 서열번호 30, 서열번호 38, 서열번호 51, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 상기 서열과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH FR2;

*(iii) 서열번호 23, 서열번호 31, 서열번호 39, 서열번호 45, 서열번호 52, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 상기 서열과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH FR3; 및

(iv) 서열번호 24, 서열번호 32, 서열번호 46, 서열번호 53, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 상기 서열과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH FR4

중에서 선택된 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3 또는 4개)의 중쇄 가변 영역(VH) 프레임워크 영역(FR); 및/또는

(b) (v) 서열번호 25, 서열번호 33, 서열번호 47, 서열번호 54, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 상기 서열과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VL FR1;

(vi) 서열번호 26, 서열번호 34, 서열번호 48, 서열번호 55, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 상기 서열과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VL FR2;

(vii) 서열번호 27, 서열번호 35, 서열번호 49, 서열번호 56, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 상기 서열과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VL FR3; 및

(viii) 서열번호 28, 서열번호 36, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 상기 서열과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VL FR4

중에서 선택된 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3 또는 4개)의 경쇄 가변 영역(VL) 프레임워크 영역(FR)

을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기에 정의된 바와 같은 VH FR1, VH FR2, VH FR3 및 VH FR4를 포함한다. 몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기에 정의된 바와 같은 VL FR1, VL FR2, VL FR3 및 VL FR4를 포함한다. 몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기에 정의된 바와 같은 VH FR1, VH FR2, VH FR3, VH FR4, VL FR1, VL FR2, VL FR3 및 VL FR4를 포함한다.

(a) 서열번호 1, 3, 5, 57, 59, 157, 158, 163 및 164에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 중에서 선택된 중쇄 가변 영역 중에 함유된 중쇄 프레임워크 영역에 비해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 상동성을 갖는 중쇄 프레임워크 영역; 및/또는

(b) 서열번호 2, 4, 58, 60, 159, 160, 165 및 166에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 중에서 선택된 경쇄 가변 영역 중에 함유된 경쇄 프레임워크 영역에 비해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 상동성을 갖는 경쇄 프레임워크 영역

을 포함한다.

(a) 서열번호 1, 3, 5, 57, 59, 157, 158, 163 및 164 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 중에서 선택된 중쇄 가변 영역 중에 함유된 4개의 FR; 및/또는

(b) 서열번호 2, 4, 58, 60, 159, 160, 165 및 166 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 중에서 선택된 경쇄 가변 영역 중에 함유된 4개의 FR

을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는

(a) 서열번호 21에 제시된 바와 같은 VH FR1, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 VH FR2, 서열번호 23에 제시된 바와 같은 VH FR3, 및 서열번호 24에 제시된 바와 같은 VH FR4;

(b) 서열번호 29에 제시된 바와 같은 VH FR1, 서열번호 30에 제시된 바와 같은 VH FR2, 서열번호 31에 제시된 바와 같은 VH FR3, 및 서열번호 32에 제시된 바와 같은 VH FR4;

(c) 서열번호 37에 제시된 바와 같은 VH FR1, 서열번호 38에 제시된 바와 같은 VH FR2, 서열번호 39에 제시된 바와 같은 VH FR3, 및 서열번호 32에 제시된 바와 같은 VH FR4;

(d) 서열번호 44에 제시된 바와 같은 VH FR1, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 VH FR2, 서열번호 45에 제시된 바와 같은 VH FR3, 및 서열번호 46에 제시된 바와 같은 VH FR4; 또는

(e) 서열번호 50에 제시된 바와 같은 VH FR1, 서열번호 51에 제시된 바와 같은 VH FR2, 서열번호 52에 제시된 바와 같은 VH FR3, 및 서열번호 53에 제시된 바와 같은 VH FR4

를 포함하고/하거나, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은

(a) 서열번호 25에 제시된 바와 같은 VL FR1, 서열번호 26에 제시된 바와 같은 VL FR2, 서열번호 27에 제시된 바와 같은 VL FR3, 및 서열번호 28에 제시된 바와 같은 VL FR4;

(b) 서열번호 33에 제시된 바와 같은 VL FR1, 서열번호 34에 제시된 바와 같은 VL FR2, 서열번호 35에 제시된 바와 같은 VL FR3, 및 서열번호 36에 제시된 바와 같은 VL FR4;

(c) 서열번호 47에 제시된 바와 같은 VL FR1, 서열번호 48에 제시된 바와 같은 VL FR2, 서열번호 49에 제시된 바와 같은 VL FR3, 및 서열번호 28에 제시된 바와 같은 VL FR4; 또는

(d) 서열번호 54에 제시된 바와 같은 VL FR1, 서열번호 55에 제시된 바와 같은 VL FR2, 서열번호 56에 제시된 바와 같은 VL FR3, 및 서열번호 36에 제시된 바와 같은 VL FR4

를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(예를 들어 인간 생식계열 항체 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 함유된 프레임워크 영역)을 포함하고, 프레임워크 영역은 인간 잔기에서 시노몰구스 원숭이 잔기로의 하나 이상의 역 돌연변이를 임의로 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 중쇄 생식계열 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 함유된 중쇄 프레임워크 영역, 및/또는 인간 경쇄 생식계열 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 함유된 경쇄 프레임워크 영역을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IGHV 4-4^*08에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 함유된 중쇄 프레임워크 영역, 및 IGKV 1-39^*01에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 함유된 경쇄 프레임워크 영역을 포함하며, 여기에서 중쇄 프레임워크 영역 및/또는 경쇄 프레임워크 영역은 인간 잔기에서 시노몰구스 원숭이 잔기로의 하나 이상의 역 돌연변이를 임의로 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IGHV 4-4^*02에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 함유된 중쇄 프레임워크 영역, 및 IGKV 4-1^*01에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 함유된 경쇄 프레임워크 영역을 포함하며, 여기에서 중쇄 프레임워크 영역 및/또는 경쇄 프레임워크 영역은 인간 잔기에서 시노몰구스 원숭이 잔기로의 하나 이상의 역 돌연변이를 임의로 포함한다.

(a) 서열번호 21에 제시된 바와 같은 VH FR1, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 VH FR2, 서열번호 23에 제시된 바와 같은 VH FR3, 및 서열번호 24에 제시된 바와 같은 VH FR4; 및 서열번호 25에 제시된 바와 같은 VL FR1, 서열번호 26에 제시된 바와 같은 VL FR2, 서열번호 27에 제시된 바와 같은 VL FR3, 및 서열번호 28에 제시된 바와 같은 VL FR4;

(b) 서열번호 29에 제시된 바와 같은 VH FR1, 서열번호 30에 제시된 바와 같은 VH FR2, 서열번호 31에 제시된 바와 같은 VH FR3, 및 서열번호 32에 제시된 바와 같은 VH FR4; 및 서열번호 33에 제시된 바와 같은 VL FR1, 서열번호 34에 제시된 바와 같은 VL FR2, 서열번호 35에 제시된 바와 같은 VL FR3, 및 서열번호 36에 제시된 바와 같은 VL FR4;

(c) 서열번호 37에 제시된 바와 같은 VH FR1, 서열번호 38에 제시된 바와 같은 VH FR2, 서열번호 39에 제시된 바와 같은 VH FR3, 및 서열번호 32에 제시된 바와 같은 VH FR4; 및 서열번호 33에 제시된 바와 같은 VL FR1, 서열번호 34에 제시된 바와 같은 VL FR2, 서열번호 35에 제시된 바와 같은 VL FR3, 및 서열번호 36에 제시된 바와 같은 VL FR4;

(d) 서열번호 44에 제시된 바와 같은 VH FR1, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 VH FR2, 서열번호 45에 제시된 바와 같은 VH FR3, 및 서열번호 46에 제시된 바와 같은 VH FR4; 및 서열번호 47에 제시된 바와 같은 VL FR1, 서열번호 48에 제시된 바와 같은 VL FR2, 서열번호 49에 제시된 바와 같은 VL FR3, 및 서열번호 28에 제시된 바와 같은 VL FR4; 또는

(e) 서열번호 50에 제시된 바와 같은 VH FR1, 서열번호 51에 제시된 바와 같은 VH FR2, 서열번호 52에 제시된 바와 같은 VH FR3, 및 서열번호 53에 제시된 바와 같은 VH FR4; 및 서열번호 54에 제시된 바와 같은 VL FR1, 서열번호 55에 제시된 바와 같은 VL FR2, 서열번호 56에 제시된 바와 같은 VL FR3, 및 서열번호 36에 제시된 바와 같은 VL FR4

를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 1, 3, 5, 57, 59, 157, 158, 163 및 164에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 비해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 상동성을 갖는다. 몇몇 바람직한 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1, 3, 5, 57, 59, 157, 158, 163 및 164 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역이다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 2, 4, 58, 60, 159, 160, 165 및 166 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 비해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 상동성을 갖는다. 몇몇 바람직한 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역은 서열번호 2, 4, 58, 60, 159, 160, 165 및 166 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역이다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기에 정의된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 상기에 정의된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1, 57, 157 및 158 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역이고; 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역은 서열번호 2, 58, 159 및 160 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역이거나; 또는

본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역은 서열번호 3, 59, 163 및 164 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역이고; 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역은 서열번호 4, 60, 165 및 166 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역이다.

(1) 서열번호 1에 제시된 바와 같은 VH 및 서열번호 2에 제시된 바와 같은 VL;

(2) 서열번호 3에 제시된 바와 같은 VH 및 서열번호 4에 제시된 바와 같은 VL;

(3) 서열번호 5에 제시된 바와 같은 VH 및 서열번호 4에 제시된 바와 같은 VL;

(4) 서열번호 57에 제시된 바와 같은 VH 및 서열번호 58에 제시된 바와 같은 VL;

(5) 서열번호 59에 제시된 바와 같은 VH 및 서열번호 60에 제시된 바와 같은 VL;

(6) 서열번호 157에 제시된 바와 같은 VH 및 서열번호 58에 제시된 바와 같은 VL;

(7) 서열번호 158에 제시된 바와 같은 VH 및 서열번호 58에 제시된 바와 같은 VL;

(8) 서열번호 57에 제시된 바와 같은 VH 및 서열번호 159에 제시된 바와 같은 VL;

(9) 서열번호 57에 제시된 바와 같은 VH 및 서열번호 160에 제시된 바와 같은 VL;

(10) 서열번호 163에 제시된 바와 같은 VH 및 서열번호 60에 제시된 바와 같은 VL;

(11) 서열번호 164에 제시된 바와 같은 VH 및 서열번호 60에 제시된 바와 같은 VL;

(12) 서열번호 59에 제시된 바와 같은 VH 및 서열번호 165에 제시된 바와 같은 VL; 또는

(13) 서열번호 59에 제시된 바와 같은 VH 및 서열번호 166에 제시된 바와 같은 VL

을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 scFv, Fab, Fab', (Fab')₂, Fv 단편, 디아바디, 이중특이성 항체, 다중특이성 항체, 키메릭 항체, 및 인간화된 항체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 몇몇 바람직한 구현에에서, 항체는 키메릭 항체 또는 인간화된 항체이다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IgG 부류(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 부류)의 것이다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 피실험자에서 HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있고, HBV의 독성을 중화시킬 수 있고, 및/또는 HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시킬 수 있다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 표지한다. 몇몇 바람직한 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 검출 가능한 표지, 예를 들어 방사성동위원소, 형광 물질, 발광 물질, 발색성 물질 또는 효소(예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제)로 표지한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 그의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터(예를 들어 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)를 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자 또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명에 따른 숙주 세포를 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하고, 배양된 숙주 세포의 배양물로부터 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수함을 포함하는, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법을 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 검출 가능한 표지를 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서, 키트는 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 특이적으로 인식하는 2차 항체를 추가로 포함한다. 바람직하게, 2차 항체는 검출 가능한 표지를 추가로 포함한다. 당해 분야의 숙련가에게 주지된 상기와 같은 검출 가능한 표지는 비제한적으로 방사성동위원소, 형광 물질, 발광 물질, 발색성 물질 및 효소(예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제) 등을 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용함을 포함하는, 샘플 중 HBsAg 단백질의 존재 또는 수준을 검출하는 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 검출 가능한 표지를 추가로 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 방법은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 검출하기 위한 검출 가능한 표지를 갖는 2차 항체를 사용함을 추가로 포함한다. 방법을 진단용으로 또는 비-진단용(예를 들어, 상기 샘플은 환자로부터의 샘플이 아닌 세포 샘플이다)으로 사용할 수 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용하여 피실험자로부터의 샘플에서 HBsAg 단백질의 존재를 검출함을 포함하는, 피실험자가 HBV에 감염된 여부를 진단하는 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 검출 가능한 표지를 추가로 포함한다. 또 다른 바람직한 구현에에서, 방법은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 검출하기 위해 검출 가능한 표지를 운반하는 2차 항체를 사용함을 추가로 포함한다.

또 다른 태양에서, 샘플 중 HBsAg의 존재 또는 수준을 검출하거나 또는 피실험자가 HBV에 감염된 여부를 진단하기 위한 키트의 제조에서 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 피실험자(예를 들어 인간)에서 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)을 예방하거나 치료하고, 시험관내에서 또는 피실험자(예를 들어 인간)에서 HBV 독성을 중화시키고, 피실험자(예를 들어 인간)에서 HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시키기 위해 사용할 수 있다.

따라서, 또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 추가적인 약학적으로 활성인 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 추가적인 약학적으로 활성인 작용제는 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)의 예방 또는 치료를 위한 작용제, 예를 들어 인터페론-유형 작용제, 예를 들어 인터페론 또는 페길화된 인터페론이다.

또 다른 태양에서, 피실험자(예를 들어 인간)에서 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)을 예방하거나 치료하고, 시험관내에서 또는 피실험자(예를 들어 인간)에서 HBV 독성을 중화시키고, 및/또는 피실험자(예를 들어 인간)에서 HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시키기 위한 약제의 제조에서 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 본 발명에 따른 약학 조성물의 용도를 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 피실험자(예를 들어 인간)에서 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)을 예방하거나 치료하고, 피실험자(예를 들어 인간)에서 HBV 독성을 중화시키고, 및/또는 피실험자(예를 들어 인간)에서 HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 피실험자에게 유효량의 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 투여함을 포함한다.

본 발명에서 제공된 약제 및 약학 조성물을 단독으로 또는 함께 사용하거나, 또는 추가적인 약학적으로 활성인 작용제(예를 들어 다른 항바이러스제, 예를 들어 인터페론-유형 작용제, 예를 들어 인터페론 또는 페길화된 인터페론)와 함께 사용할 수 있다.

본 발명의 구현예를 첨부된 도면 및 실시예를 참조하여 하기에 상세히 기재할 것이나, 당해 분야의 숙련가는 하기의 도면 및 실시예가 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아님을 알 것이다. 본 발명의 다양한 목적 및 유리한 태양은 하기의 바람직한 구현예 및 첨부된 도면의 상세한 설명으로부터 당해 분야의 숙련가에게 자명해질 것이다.

도 1은 실시예 2에서 항원 HBsAg에 대한 3개의 시노몰구스 원숭이-인간 키메릭 단클론 항체 M1-23, M3-23 및 M3-13의 결합 활성을 측정하기 위한 ELISA 분석의 결과를 도시하며, 여기에서 가로 좌표는 항체 농도(Log₁₀ ng/㎖)를 나타내고 세로 좌표는 OD 값을 나타낸다. 결과는 3개의 시노몰구스 원숭이-인간 키메릭 단클론 항체가 모두 양호한 항원-결합 활성을 가짐을 보였다.
도 2는 실시예 2에서 6D11 마우스 항체에 의한 항원 HBsAg에 대한 3개의 시노몰구스 원숭이-인간 키메릭 단클론 항체 M1-23, M3-23 및 M3-13의 결합의 교차-차단에 대한 경쟁적 ELISA 분석의 결과를 도시한다. 결과는 HBsAg에 대한 M1-23, M3-23 및 M3-13의 결합이 6D11에 의해 현저하게 억제될 수 있음을 보였다.
도 3a 및 도 3b는 실시예 2에서 HBV 트랜스제닉 마우스에서 시노몰구스 원숭이-인간 키메릭 단클론 항체 M1-23, M3-23의 생체내 치료 효과의 평가 결과를 도시한다. 도 3a는 마우스의 혈청 중 HBsAg 수준의 변화를 도시하며, 여기에서 가로 좌표는 키메릭 항체의 주사후 일수를 나타내고, 세로 좌표는 마우스의 혈청 중 HBsAg의 상대적인 감소 수준(Log₁₀ IU/㎖)을 나타내며; 도 3b는 마우스의 혈청 중 HBV DNA 수준의 변화를 도시하며, 여기에서 가로 좌표는 키메릭 항체의 주사후 일수를 나타내고, 세로 좌표는 마우스의 혈청 중 HBV DNA의 상대적인 감소 수준(Log₁₀ IU/㎖)을 나타낸다. 결과는 M1-23 및 M3-23이 동물에서 HBsAg 및 HBV DNA를 명백하게 제거할 수 있음을 보였다.
도 4는 실시예 4에서 항원 HBsAg에 대한 인간화된 항체 M1D, M3D의 결합 활성의 ELISA 분석의 결과를 도시하며, 여기에서 가로 좌표는 항체 농도(Log₁₀ ng/㎖)를 나타내고 세로 좌표는 OD 값을 나타낸다. 결과는 2개의 인간화된 항체가 모두 양호한 항원 결합 활성을 가지며, HBsAg에 대한 그들의 친화성이 참조 항체 162의 친화성보다 우수함을 보였다.
도 5는 실시예 4에서 6D11 마우스 항체에 의한 항원 HBsAg에 대한 인간화된 항체 M1D, M3D의 결합의 교차-차단에 대한 경쟁적 ELISA 분석의 결과를 도시한다. 결과는 항원 HBsAg에 대한 인간화된 항체 M1D, M3D의 결합이 6D11에 의해 현저하게 억제될 수 있음을 보였다.
도 6a 및 도 6b는 실시예 4에서 HBV 바이러스에 대한 인간화된 항체 M1D의 중화 활성의 측정 결과를 도시하며, 여기에서 도 6a는 표준으로서 HBIG를 사용하여 획득한 표준 곡선을 도시하고, 도 6b는 샘플에서 중화 활성의 측정 결과를 도시하며, 여기에서 세로 좌표는 항체의 ㎎당 중화 활성과 동등한 중화 활성을 갖는 HBIG의 표준 단위(mIU)의 수를 나타낸다. 결과는 HBV에 대한 M1D의 중화 활성이 참조 항체 162의 경우에 필적함을 보였다.
도 7은 실시예 5에서 HBV 트랜스제닉 마우스에서 인간화된 항체 M1D 및 M3D 및 키메릭 항체 M3-13의 생체내 치료학적 효과의 평가 결과를 도시한다. 도 7a는 마우스의 혈청 중 HBsAg 수준의 변화를 도시하며, 여기에서 가로 좌표는 인간화된 항체의 주사후 일수를 나타내고, 세로 좌표는 마우스의 혈청 중 HBsAg의 상대적인 감소 수준(Log₁₀ IU/㎖)을 나타내며; 도 7b는 마우스의 혈청 중 HBV DNA 수준의 변화를 도시하며, 여기에서 가로 좌표는 키메릭 항체의 주사후 일수를 나타내고, 세로 좌표는 마우스의 혈청 중 HBV DNA의 상대적인 감소 수준(Log₁₀ IU/㎖)을 나타낸다. 결과는 3개의 항체가 모두 동물에서 HBsAg 및 HBV DNA를 명백하게 제거할 수 있고 이들의 효과가 참조 항체 162의 경우보다 우수함을 보였다.
도 8a 내지 도 8e는 실시예 6에서 항원 HBsAg에 대한, 인간화된 항체 M1D와 비교시 CDR 영역의 치환을 함유하는 항체의 결합 활성의 ELISA 분석의 결과를 도시하며, 여기에서 가로 좌표는 항체 농도(Log₁₀ ng/㎖)를 나타내고 세로 좌표는 OD 값을 나타낸다. 결과는 항체 M1D의 HCDR1 및 LCDR2의 치환이 항원 HBsAg에 대한 결합 활성에 영향을 미치지 않음을 보였으며, 이는 항체 M1D의 HCDR1 및 LCDR2 영역이 항원 HBsAg에의 결합에 중요한 CDR 영역이 아님을 가리킨다.
도 9a 내지 도 9e는 실시예 6에서 항원 HBsAg에 대한, 인간화된 항체 M3D와 비교시 CDR 영역의 치환을 함유하는 항체의 결합 활성의 ELISA 분석의 결과를 도시하며, 여기에서 가로 좌표는 항체 농도(Log₁₀ ng/㎖)를 나타내고 세로 좌표는 OD 값을 나타낸다. 결과는 중쇄 CDR2(HCDR2) 및 경쇄 CDR2(LCDR2)의 치환이 항원 HBsAg에 대한 결합 활성에 영향을 미치지 않음을 보였으며, 이는 항체 M3D의 HCDR2 및 LCDR2 영역이 항원 HBsAg에의 결합에 중요한 CDR 영역이 아님을 암시한다.
도 10은 실시예 8에서 HBsAg aa 113-135의 다양한 단일-부위 돌연변이된 폴리펩티드 단편에 대한 항체 M1D, M3D, 162의 결합에 대한 웨스턴 블럿 분석의 결과를 도시한다. 결과는 aa 120, aa 122 및 aa 123 중의 부위가 알라닌으로 돌연변이되고 그의 코어 에피토프가 CKTC(aa 121-124)인 경우 항체 162가 HBsAg에 대한 결합 활성을 상실하고; aa 118-124 중의 부위가 알라닌으로 돌연변이되고 그의 코어 에피토프가 참조 항체 162의 경우보다 더 긴 TGPCKTCT(aa 118-124)이고 참조 항체 162의 경우에 비해 순방향 위치에 있는 경우 M1D가 HBsAg에 대한 결합 활성을 상실하며; aa 121-125 중의 부위가 알라닌으로 돌연변이되고 그의 코어 에피토프가 162의 경우에 비해 역방향 위치에 있는 CKTCT(aa 121-125)인 경우 M3D가 HBsAg에 대한 결합 활성을 상실함을 보였다.
도 11a 및 도 11b는 실시예 9에서 상이한 하위유형의 HBsAg-aa 113-135에 대한 인간화된 항체 M1D, M3D의 결합 활성의 ELISA 분석의 결과를 도시하며, 여기에서 가로 좌표는 항체 농도(Log₁₀ ng/㎖)를 나타내고 세로 좌표는 OD 값을 나타낸다. 결과는 M1D 및 M3D가 대부분의 HBV 하위유형에 결합할 수 있음을 보였다.
도 12a 및 도 12b는 실시예 11에서 20 ㎎/㎏의 인간화된 항체 M1D, M3D의 단일 정맥내 주사후 시간의 함수로서 각각의 시노몰구스 원숭이(그룹 1)의 혈청 중 인간화된 항체 M1D의 혈액 농도에 대한 곡선 그래프를 도시하며, 여기에서 가로 좌표는 시간(h)을 나타내고 세로 좌표는 혈액 농도(ng/㎖)를 나타낸다.
도 13a 및 도 13b는 실시예 12에서 3개의 상이한 완충제 중의 인간화된 항체 M1D, M3D의 Tm 값을 도시한다. 가로 좌표는 온도(℃)를 나타내고 세로 좌표는 CP(cal/℃)를 나타낸다. 결과는 인간화된 항체 M1D의 Tm 개시가 61.7℃ 초과이고, M3D의 Tm 개시 값이 모두 61.6℃ 초과임을 보였으며, 이는 M1D 및 M3D가 양호한 열 안정성을 가졌음을 가리킨다.

서열 정보

본 발명에 관련된 일부 서열의 정보를 하기 표 1에 제공한다.

서열의 기재

서열번호	서열정보
1	QVQLQESGPGLVKPSEILSVTCSVSGGSITSNFWSWIRQPPGKGLEWIGYISGSGTYTDYNPSLRSRVTLSVDTSKNQLSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGLRVTVSS
2	EIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISSSLNWYQQKPGKAPQLLIYYANRLESGVPSRFRGSGSGTEFTLTISSLQPEDFTTYYCQQYHSLPLTFGGGTKVEIK
3	QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGVSISSPYDWTWIRQPPGKGLEWIGRIHGNGGSTSYNPSLKNRVTISKDTSKNQFSLILSSVTAADTAVYYCVRDETWGQGVLVTVSS
4	DIQMSQSPDSLAVSLGERVTINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQAPKLLFYWASTRESGVPNRFSGSGSGTDFTLTIRGLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK
5	QVQLQESGPRLVKSSETLPLTCAVSGASNSSNYWSWIRQPPGKGLEWIGRIYGNSGSTDYNPSLKSRVSISTDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYFCARGSVYTYSWGQGVLVTVSS
6	GGSITSNF
7	ISGSGTYT
8	ARSHDYGSNDYAFDF
9	QDISSS
10	YAN
11	QQYHSLPLT
12	GVSISSPYDW
13	IHGNGGST
14	VRDET
15	QSLLYSSNNKNY
16	WAS
17	QQHYTTPLT
18	GASNSSNY
19	IYGNSGST
20	ARGSVYTYS
21	QVQLQESGPGLVKPSEILSVTCSVS
22	WSWIRQPPGKGLEWIGY
23	DYNPSLRSRVTLSVDTSKNQLSLKLSSVTAADTAVYYC
24	WGQGLRVTVSS
25	EIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAT
26	LNWYQQKPGKAPQLLIY
27	RLESGVPSRFRGSGSGTEFTLTISSLQPEDFTTYYC
28	FGGGTKVEIK
29	QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVS
30	TWIRQPPGKGLEWIGR
31	SYNPSLKNRVTISKDTSKNQFSLILSSVTAADTAVYYC
32	WGQGVLVTVSS
33	DIQMSQSPDSLAVSLGERVTINCKSS
34	LAWYQQKPGQAPKLLFY
35	TRESGVPNRFSGSGSGTDFTLTIRGLQAEDVAVYYC
36	FGQGTKVEIK
37	QVQLQESGPRLVKSSETLPLTCAVS
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39	DYNPSLKSRVSISTDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYFC
40	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYTSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR
41	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP
42	QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR
43	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP
44	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS
45	DYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC
46	WGQGTTVTVSS
47	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAT
48	LNWYQQKPGKAPKLLIY
49	RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
50	QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVS
51	TWVRQPPGKGLEWIGR
52	SYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC
53	GQGTLVTVSS
54	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSS
55	LAWYQQKPGQPPKLLFY
56	TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC
57	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITSNFWSWIRQPPGKGLEWIGYISGSGTYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGTTVTVSS
58	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISSSLNWYQQKPGKAPKLLIYYANRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHSLPLTFGGGTKVEIK
59	QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGVSISSPYDWTWVRQPPGKGLEWIGRIHGNGGSTSYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVRDETWGQGTLVTVSS
60	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLFYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK
61	GGACAGCCKGGAAGGTGTGC
62	GAGGCAGTTCCAGATTTCAA
63	CCGCGTACTTGTTGTTGCTCTGT
64	5'- AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTcaggtgcagctgcaggagtcaggcccag
65	5'- caggagtcaggcccaggactggtgaagccttcggagaCCCTGTCCCTCACCTGCAC
66	5'- aagccttcggagaCCCTGTCCCTCACCTGCACtgtctctggtggctccatc
67	5'- GTTCTTGGACGTGTCTACGGATATGGTGACTCGACTCTTGAGGGAGGGGTTGTAGT
68	5'- TCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTtctccctgaaactgagctc
69	5'- GATGGGCCCTTGGTCGACGCtgaagagacggtgacGGTGGTcccttggccccagaaatc
70	5'- AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATACAGATGACGCAGTCTCCATCC
71	5'- CAGCAAAAACCGGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGC
72	5'- GAACCTTGATGGGACCCCACTTTGCAAACGATTTGCATAATAGATCAGGAGC
73	5'- CTGTCCCAGATCCACTGCCACTGAACCTTGATGGGACCCC
74	5'- GCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAACCTGAGG
75	5'- GCAGCCTGCAACCTGAGGATTTTGCAACTTATTACTGTCAAC
76	5'- GACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCAT
77	5'-AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCC
78	5'- ATTCCCGGGTagatgcccaGTAAAAGAGCAGCTTAGGAGGCTGTCCTGGTTTCTGCTG
79	5'- ggtgtctccatcagcagtccttatgacTGGACCTGGGTCCGCCAGCCCCCAGGGAAG
80	5'- AACTGGTTCTTGGACTTGTCTACTGAAATGGTGACTCGACTCTTGAGGGAGGGGTTG
81	5'- AGACAAGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGC
82	5'- gaaaccTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATC
83	5'- AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCC
84	5'- CCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGAGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAG
85	5'- CAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCTTTTACtgggcatctACCCGGGAAT
86	5'- GTGAAATCTGTCCCAGATCCACTGCCACTGAATCGGTCAGGGACCCCGGATTCCCGGGTagatgcc
87	5'- GGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATG
88	5'- ATGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCC
89	5'-AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCAGGC
90	5'- GATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAAGAGACGGTGAC
91	5'- AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATACAGATGACGCAGTC
92	5'- ATGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC
93	5'- GTAGTAACTACTGATGGAGCCACCAGAGACAGTGCAGGTGAG
94	5'- GgtggctccatcagtagttactacTGGAGCTGGATCCGCCAG
95	5'- ATAGTAACTACCACTGCTGACGGAGCCACCAGAGACAGTGCAGGTGAG
96	5'- GgtggctccgtcagcagtggtagttactATTGGAGCTGGATCCGCCAG
97	5'- GGTGCTCCCACTGGTATAGATATACCCAATCCACTCCAG
98	5'- AtctataccagtgggagcaccGACTACAACCCCTCCCTC
99	5'- TGTGTAACTACTACTACTACTAATATACCCAATCCACTCCAG
100	5'- AttagtagtagtagtagttacacaGACTACAACCCCTCCCTC
101	5'- GTAGCTGCTGCTAACACTCTGAGTTGCCCGGCAAGTGATGG
102	5'- CagagtgttagcagcagctacTTAAATTGGTATCAGC
103	5'- AGTATTACTTCCGATGTTGGAGCTAGTTGCCCGGCAAGTGATGG
104	5'- AgctccaacatcggaagtaatactTTAAATTGGTATCAGC
105	5'- GACCCCACTTTGCAAACGGGATGCAGCATAGATCAGGAGCTTAGG
106	5'- CCTAAGCTCCTGATCTATGctgcatccCGTTTGCAAAGTGGGGTC
107	5'- GACCCCACTTTGCAAACGAGACGCCTTATAGATCAGGAGCTTAGG
108	5'- CCTAAGCTCCTGATCTATAaggcgtctCGTTTGCAAAGTGGGGTC
109	5'- AGTGAGAGGGTAATTGTAATCTTGTAGACAGTAATAAGTTGCAAAATC
110	5'- CtacaagattacaattaccctCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAG
111	5'- AGTGAGAGGTAAACTACTACTCTGATGACAGTAATAAGTTGCAAAATC
112	5'- catcagagtagtagtttacctCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAG
113	5'-AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCG
114	5'- GATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCAG
115	5'- AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATCGTGATGACCCAGTCTC
116	5'- ATGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTC
117	5'- GGAGTAACCACCACTGCTGATGGAGCCACCAGAGACAGCGCAGGTGAGGGACAG
118	5'- ggtggctccatcagcagtggtggttactccACCTGGGTCCGCCAGCCC
119	5'- CCAGTTACTACTGCTGATGGAGCCACCAGAGACAGCGCAGGTGAGGGACAG
120	5'- GgtggctccatcagcagtagtaactggACCTGGGTCCGCCAGCCC
121	5'- GGTGCTCCCACTATGATAGATTCGTCCAATCCACTCCAG
122	5'- AtctatcatagtgggagcaccAGCTACAACCCCTCCCTCAAG
123	5'- TGTGCTACCACCACTACCACTAATTCGTCCAATCCACTCCAG
124	5'- attagtggtagtggtggtagcacaAGCTACAACCCCTCCCTCAAG
125	5'- ATAGGTCTTTCCATCACTATGCAGGAGGCTCTGGCTGGACTTGCAGTTGATGGTGGC
126	5'- cagagcctcctgcatagtgatggaaagacctatTTAGCCTGGTACCAGCAGAAAC
127	5'- GTAGCTGCTGCTAACACTCTGGCTGGACTTGCAGTTGATGGTGGC
128	5'- CagagtgttagcagcagctacTTAGCCTGGTACCAGCAGAAAC
129	5'- GGGACCCCGGATTCCCGGGTAGAACCCAAGTAAAAGAGCAGCTTAGGAGG
130	5'- CCTCCTAAGCTGCTCTTTTACTtgggttctACCCGGGAATCCGGGGTCCC
131	5'- GGGACCCCGGATTCCCGGGTGGATGCACCGTAAAAGAGCAGCTTAGGAGG
132	5'- CCTCCTAAGCTGCTCTTTTACGgtgcatccACCCGGGAATCCGGGGTCCC
133	5'- CGTCCAAGGAGTACTATAATATTGCTGACAGTAATACACTGCCACATC
134	5'- CagcaatattatagtactccttggacgTTCGGCCAAGGGACCAAG
135	5'- CGTCCAAGGAGTTTGTAGAGCTTGCATACAGTAATACACTGCCACATC
136	5'- AtgcaagctctacaaactccttggacgTTCGGCCAAGGGACCAAG
137	GGSISSYY
138	GGSVSSGSYY
139	AAS
140	KAS
141	IYHSGST
142	ISGSGGST
143	LGS
144	GAS
145	IYTSGST
146	ISSSSSYT
147	QSVSSSY
148	SSNIGSNT
149	LQDYNYPLT
150	HQSSSLPLT
151	GGSISSGGYS
152	GGSISSSNW
153	QSLLHSDGKTY
154	QSVSSSY
155	QQYYSTPWT
156	MQALQTPWT
157	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYISGSGTYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGTTVTVSS
158	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYISGSGTYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGTTVTVSS
159	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISSSLNWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHSLPLTFGGGTKVEIK
160	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISSSLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHSLPLTFGGGTKVEIK
161	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITSNFWSWIRQPPGKGLEWIGYISSSSSYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGTTVTVSS
162	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATSSNIGSNTLNWYQQKPGKAPKLLIYYANRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHSLPLTFGGGTKVEIK
163	QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGVSISSPYDWTWVRQPPGKGLEWIGRIYTSGSTSYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVRDETWGQGTLVTVSS
164	QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGVSISSPYDWTWVRQPPGKGLEWIGRISGSGGSTSYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVRDETWGQGTLVTVSS
165	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLFYLGSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK
166	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLFYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK
167	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLHSDGKTYLAWYQQKPGQPPKLLFYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK
168	SSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFP
169	SSTTATGPCKTCTTPAQGTSMFP
170	SSTTSAGPCKTCTTPAQGTSMFP
171	SSTTSTAPCKTCTTPAQGTSMFP
172	SSTTSTGACKTCTTPAQGTSMFP
173	SSTTSTGPSKTCTTPAQGTSMFP
174	SSTTSTGPCATCTTPAQGTSMFP
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177	SSTTSTGPCKTCATPAQGTSMFP
178	SSTTSTGPCKTCTAPAQGTSMFP
179	SSTTSTGPCKTCTTAAQGTSMFP
180	SSTTSTGPCKTCTTPAAGTSMFP
181	SSTTSTGPCKTCTTPAQGASMFP
182	SSTTSTGPCKTCTTPAQGTAMFP
183	ATCAACTACCGCCACGGGACCATGCAAGACCTGCAC
184	GGTCCCGTGGCGGTAGTTGATGTTCCTGGAAGTAGA
185	AACTACCAGCGCGGGACCATGCAAGACCTGCACGAT
186	CATGGTCCCGCGCTGGTAGTTGATGTTCCTGGAAGT
187	ACCAGCACGGCACCATGCAAGACCTGCACGATTCCT
188	CTTGCATGGTGCCGTGCTGGTAGTTGATGTTCCTGG
189	CAGCACGGGAGCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGC
190	GTCTTGCATGCTCCCGTGCTGGTAGTTGATGTTCCT
191	ACGGGACCATCCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAA
192	GCAGGTCTTGGATGGTCCCGTGCTGGTAGTTGATGT
193	GGGACCATGCCGGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGG
194	GTGCAGGTCCGGCATGGTCCCGTGCTGGTAGTTGAT
195	GGGACCATGCGCGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGG
196	GTGCAGGTCGCGCATGGTCCCGTGCTGGTAGTTGAT
197	ACCATGCAAGGCCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAAC
198	ATCGTGCAGGCCTTGCATGGTCCCGTGCTGGTAGTT
199	TGCAAGACCTCCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCT
200	AGGAATCGTGGAGGTCTTGCATGGTCCCGTGCTGGT
201	CAAGACCTGCGCGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTAT
202	GCAGGAATCGCGCAGGTCTTGCATGGTCCCGTGCTG
203	GACCTGCACGGCTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTT
204	TGAGCAGGAGCCGTGCAGGTCTTGCATGGTCCCGTG
205	CTGCACGATTGCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCC
206	CCTTGAGCAGCAATCGTGCAGGTCTTGCATGGTCCC
207	GATTCCTGCTGCAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTG
208	GAGGTTCCTGCAGCAGGAATCGTGCAGGTCTTGCAT
209	TGCTCAAGGAGCCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTG
210	AACATAGAGGCTCCTTGAGCAGGAATCGTGCAGGTC
211	TCAAGGAACCGCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTAC
212	GGAAACATAGCGGTTCCTTGAGCAGGAATCGTGCAG
213	STTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFP
214	TSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFP
215	SSTTSTGPCRTCTTPAQGTSMYP
216	SSTTSTGPCRTCTTLAQGTSMFP
217	STTTSTGPCKTCTTLAQGTSMFP
218	STTTSTGPCKTCTALAQGTSMFP
219	STTTSTGPCRTCTTLAQGTSMLP
220	SSTTSTGPCKTCTTPAQGNSMYP

용어의 정의

본 발명에서, 본 명세서에 사용되는 과학기술 용어는 달리 서술되지 않는 한 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 더욱이, 본 명세서에 사용되는 세포 배양, 생화학, 핵산 화학, 면역학 실험 등의 실행 단계는 상응하는 분야에서 널리 사용되는 통상적인 단계이다. 또한, 본 발명의 보다 양호한 이해를 위해서, 관련된 정의 및 설명을 하기에 제공한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "항체"란 용어는 전형적으로 두 쌍의 폴리펩티드 쇄(각각의 쌍은 "경"(L)쇄 및 "중"(H)쇄를 갖는다)로 구성된 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체 경쇄는 κ 및 λ 경쇄로서 분류될 수 있다. 중쇄는 μ, δ, γ, α 또는 ε으로서 분류될 수 있고 항체의 아이소타입은 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 정의된다. 경쇄 및 중쇄내에서, 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 가변 영역과 불변 영역이 결합되며, 중쇄는 약 3개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 추가로 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(V_H) 및 중쇄 불변 영역(C_H)으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인(C_H1, C_H2 및 C_H3)으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(V_L) 및 경쇄 불변 영역(C_L)으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 C_L로 이루어진다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어 효과기 세포) 및 고전적인 보체계의 제1 성분(C1q)을 포함하여 숙주 조직 또는 인자에의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. V_H 및 V_L 영역은 또한 프레임워크 영역(FR)이라 칭하는 비교적 보존적인 영역과 이격된 고가변 영역(상보성 결정 영역(CDR)이라 칭한다)으로 세분될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: 아미노 말단에서부터 카복시 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 각각의 중/경쇄 쌍의 가변 영역(V_H 및 V_L)은 각각 항체 결합 부위를 형성한다. 다양한 영역 또는 도메인 중의 아미노산의 분포는 문헌[Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))], 또는 문헌[Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883]의 정의에 따른다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이란 용어는 항원 결합을 담당하는 항체의 가변 영역 중의 아미노산 잔기를 지칭하며, 일반적으로 경쇄 가변 영역 중의 잔기 24-34{LCDR1}, 50-56{LCDR2}, 89-97{LCDR3}, 및 중쇄 가변 영역 중의 잔기 31-35{HCDR1}, 50-65{HCDR2}, 95-102{HCDR3}(예를 들어 문헌[Kabat et al, Sequences of Proteins of lmmunological lnterest, 5^th edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1991)] 참조), 또는 경쇄 가변 영역 중의 잔기 26-32{Ll}, 50-52{L2}, 91-96{L3}, 및 중쇄 가변 영역 중의 잔기 26-32{H1}, 53-55{H2}, 96-101{H3}(문헌[Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)] 참조)를 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "프레임워크 영역" 또는 "FR"이란 용어는 항체의 가변 영역 중의 상기에 정의된 바와 같은 CDR 잔기 이외의 아미노산 잔기를 지칭한다.

"항체"란 용어는 항체를 생성시키는 임의의 특정한 방법에 의해 제한되지 않는다. 예를 들어, 항체는 재조합 항체, 단클론 항체 및 다클론 항체를 포함한다. 항체는 상이한 아이소타입의 항체, 예를 들어 IgG(예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위유형), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 항체의 "항원-결합 단편"이란 용어는, 완전길이 항체가 결합하는 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하고/하거나 항원에 특이적으로 결합하는 완전길이 항체와 경쟁하고, 또한 "항원-결합 부분"이라 지칭되는 완전길이 항체의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일반적으로 문헌[Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed., Raven Press, NY (1989)](모든 목적을 위해 내용 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 인용됨)을 참조하시오. 항체의 항원-결합 단편을 재조합 DNA 기법에 의해서 또는 완전 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해서 생성시킬 수 있다. 일부의 경우에, 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')₂, Fd, Fv, dAb 및 상보성 결정 영역(CDR)의 단편, 단쇄 항체(예를 들어 scFv), 키메릭 항체, 디아바디, 및 폴리펩티드에 특이적인 항원 결합 능력을 부여하기에 충분한 항체의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Fd 단편"이란 용어는 V_H 및 C_H1 도메인으로 이루어지는 항체 단편을 지칭하며; "dAb 단편"이란 용어는 V_H 도메인으로 이루어지는 항체 단편을 지칭하고(Ward et al, Nature 341:544 546 (1989)); "Fab 단편"이란 용어는 V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인으로 이루어지는 항체 단편을 지칭하며; "F(ab')₂ 단편"이란 용어는 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 항체 단편을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Fv 단편"이란 용어는 항체의 단일 가지의 V_L 및 V_H 도메인으로 이루어지는 항체 단편을 지칭한다. Fv 단편은 일반적으로 완전한 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 최소의 항체 단편인 것으로 간주된다. 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 것으로 여겨진다. 그러나, 심지어 하나의 가변 영역(예를 들어 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 함유하는 Fd 단편) 조차, 전체 결합 부위의 친화성보다 적은 친화성이기는 하지만, 항원을 인식하고 결합할 수 있다.

일부의 경우에, 항체의 항원-결합 단편은 단쇄 항체(예를 들어 scFv)이며, 여기에서 V_L 및 V_H 도메인은 짝을 이루어, 이들이 단일 폴리펩티드 쇄를 생성시킬 수 있게 하는 링커를 통해 1가 분자를 형성한다(예를 들어 문헌[Bird et al., Science 242: 423-426 (1988)]; 문헌[Huston et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)]; 및 문헌[Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, edited by Roseburg and Moore, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)] 참조). 상기와 같은 scFv 분자는 일반적인 구조: NH₂-V_L-링커-V_H-COOH 또는 NH₂-V_H-링커-V_L-COOH를 가질 수 있다. 종래 기술에서 적합한 링커는 GGGGS의 반복되는 아미노산 서열 또는 그의 변체로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 (GGGGS)₄를 갖는 링커를 사용할 수 있으며, 그의 변체를 또한 사용할 수 있다(Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). 본 발명에 유용한 다른 링커는 하기의 문헌에 기재되어 있다: Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293: 41-56 및 Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단쇄 항체-Fc" 또는 "scFv-Fc"란 용어는 scFv를 항체의 Fc 단편에 연결시킴으로써 형성된 조작된 항체를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Fc 단편"이란 용어는 항체의 제1 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역을 디설파이드 결합을 통해 제2 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역에 연결시킴으로써 형성된 항체 단편을 지칭한다. 항체의 Fc 단편은 다양한 상이한 기능을 갖지만, 항원 결합에는 관련되지 않는다.

일부의 경우에, 항체의 항원-결합 단편은 디아바디, 즉 V_L 및 V_H 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄상에서 발현되지만 사용되는 링커가 동일한 쇄의 2개 도메인간에 짝을 이루기에는 너무 짧아, 하나의 도메인을 강제로 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 짝을 이루게 하여 2개의 항원-결합 부위를 생성시키는 2가 항체이다(예를 들어 문헌[Holliger P.et al., Proc. Natl. Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)], 및 문헌[Poljak R.J.et al., Structure 2: 1121-1123 (1994)] 참조).

항체의 항원-결합 단편(예를 들어 상술한 상체 단편)을 당해 분야의 숙련가에게 공지된 통상적인 기법(예를 들어 재조합 DNA 기법 또는 효소적 또는 화학적 절단 방법)을 사용하여 주어진 항체(예를 들어 본 명세서에 제공된 단클론 항체)로부터 수득할 수 있으며, 완전 항체를 선별하는 방식과 동일한 방식으로 특이성에 대해 선별할 수 있다.

여기에서, 명확히 명시되지 않는 한, "항체"란 용어를 언급할 때, 항체는 완전 항체뿐만 아니라 항체의 항원 결합 단편을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "mAb" 및 "단클론 항체"란 용어는 고도로 상동성인 항체 분자의 집단, 즉 자발적으로 발생할 수도 있는 자연 돌연변이를 제외하고 완전히 동일한 항체 분자의 집단으로부터의 항체 또는 항체의 단편을 지칭한다. 단클론 항체는 항원의 단일 에피토프에 대해 높은 특이성을 갖는다. 단클론 항체와 비교하여, 다클론 항체는 일반적으로 항원상의 상이한 에피토프를 일반적으로 인식하는 적어도 2개 이상의 상이한 항체를 포함한다. 단클론 항체는 일반적으로 코흘러(Kohler) 등(Nature, 256:495, 1975)에 의해 최초로 보고된 하이브리도마 기법에 의해 수득되며, 또한 재조합 DNA 기법에 의해 수득될 수 있다(예를 들어 미국특허 제 4,816,567 호 참조).

예를 들어, 단클론 항체를 하기와 같이 제조할 수 있다. 먼저, 비-인간 영장류(예를 들어 시노몰구스 원숭이) 또는 다른 적합한 숙주 동물을 면역원의 주사(필요한 경우, 항원보강제를 가한다)에 의해 면역시킨다. 면역원 또는 항원보강제의 주사 수단은 일반적으로 피하 다중-점 주사(multi-point injection) 또는 복강내 주사이다. 일부 공지된 단백질(예를 들어 혈청 알부민 또는 대두 트립신 억제제)에의 면역원의 예비-접합은 숙주에서 항원의 면역원성을 촉진할 수 있다. 항원보강제는 프로인트 항원보강제 또는 MPL-TDM 등일 수 있다. 동물의 면역화 후에, 면역원에 특이적으로 결합하는 항체를 분비하는 림프구가 동물에서 생성된다. 또한, 림프구를 시험관내 면역화에 의해 수득할 수 있다. 관심 림프구를 수집하고 적합한 융합제(예를 들어 PEG)를 사용하여 골수종 세포에 융합시켜 하이브리도마 세포를 얻는다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103, Academic Press, 1996). 상기에서 제조된 하이브리도마 세포를 적합한 배양 배지에 시딩하고 배지에서 증식시키며, 배양 배지는 바람직하게는 융합되지 않은, 모 골수종 세포의 증식을 억제할 수 있는 하나 이상의 물질을 포함한다. 예를 들어, 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 모 골수종 세포의 경우에, 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배양 배지)과 같은 물질을 배양 배지에 첨가하여 HGPRT-결핍 세포의 증식을 억제시킨다. 바람직한 골수종 세포는 높은 융합률, 안정한 항체 분비 능력을 가져야 하며, HAT 배양 배지에 민감해야 하는 등이다. 하이브리도마 세포의 증식을 위한 배양 배지를 사용하여 특정 항원에 대한 단클론 항체의 생성을 검출한다. 하기의 방법, 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사성면역분석(RIA) 및 효소 결합된 면역흡수 분석(ELISA)을 사용하여 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단클론 항체의 결합 특이성을 측정할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Munson et al., Anal. Biochem. 107: 220 (1980)]에 기재된 스캐차드 분석을 사용하여 단클론 항체의 친화성을 측정할 수 있다. 하이브리도마에 의해 생성된 항체의 특이성, 친화성 및 반응성 측정 후에, 관심 세포주를 문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1996]에 기재된 표준 제한 희석 방법에 의해 서브클로닝할 수 있다. 적합한 배양 배지는 DMEM 또는 RPMI-1640 등일 수 있다. 또한, 하이브리도마 세포를 동물체에서 복수 종양의 형태로 증식시킬 수 있다. 면역글로불린의 정제를 위한 전통적인 방법, 예를 들어 단백질 A 아가로스 젤, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용함으로써, 서브클론 세포에 의해 분비된 단클론 항체를 세포 배양물, 복수 또는 혈청으로부터 단리할 수 있다.

단클론 항체를 또한 유전자 조작 재조합 기법에 의해 수득할 수 있다. MAb 중쇄 및 경쇄의 유전자에 특이적으로 결합하는 핵산 프라이머를 PCR 증폭시켜, 하이브리도마 세포로부터 MAb 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA 분자를 수득한다. 수득된 DNA 분자를 발현 벡터에 삽입하고, 숙주 세포(예를 들어 E.coli 세포, COS 세포, CHO 세포, 또는 면역글로불린을 생성시키지 않는 다른 골수종 세포)를 벡터로 형질감염시키고, 재조합 발현에 의해 관심 항체를 수득하기에 적합한 조건하에서 배양한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "항원성 에피토프" 및 "에피토프"란 용어는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원상의 일부를 지칭한다. "에피토프"는 또한 "항원 결정인자"로서 공지되어 있다. 에피토프 또는 항원 결정인자는 일반적으로 아미노산, 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹으로 이루어지며, 일반적으로 특정한 3차원 구조 및 특정한 전하 특징을 갖는다. 예를 들어, 에피토프는 일반적으로 독특한 입체 형태("선형"이거나 "입체형태성"일 수 있다)로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 연속적인 또는 비-연속적인 아미노산을 포함한다. 예를 들어 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)]을 참조하시오. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호작용 분자(예를 들어 항체) 사이의 모든 상호작용 부위는 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 존재한다. 입체형태성 에피토프에서, 상호작용 부위는 단백질 중에서 상호작용 부위를 서로로부터 분리시키는 아미노산 잔기에 걸쳐 있다. 항체를 당해 분야의 숙련가에 의해 공지된 통상적인 기법에 의해 동일한 에피토프에의 결합 경쟁력에 따라 선별할 수 있다. 예를 들어, 경쟁 또는 교차-경쟁에 대한 연구를 수행하여 항원에의 결합에 대해 서로 경쟁하거나 교차-경쟁하는 항체를 수득할 수 있다. 교차-경쟁에 기반한, 동일한 에피토프에의 항체 결합을 획득하기 위한 대량처리 방법이 국제특허출원 WO 03/48731에 기재되어 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "생식계열 항체 유전자" 또는 "생식계열 항체 유전자 단편(segment)"이란 용어는 특정한 면역글로불린의 발현을 위해 유전자 재배열 및 돌연변이를 유도할 수 있는 성숙화 과정을 겪지 않은, 면역글로불린을 암호화하는 유전자의 게놈 중에 존재하는 서열을 지칭한다. 본 발명에서, "중쇄 생식계열 유전자"란 표현은 V 유전자(가변), D 유전자(다양성), J 유전자(결합) 및 C 유전자(불변)를 포함하는 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 생식계열 항체 유전자 또는 유전자 단편을 지칭하며; 유사하게, "경쇄 생식계열 유전자"란 표현은 V 유전자(가변), J 유전자(결합) 및 C 유전자(불변)를 포함하는 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 생식계열 항체 유전자 또는 유전자 단편을 지칭한다. 본 발명에서, 생식계열 항체 유전자 또는 생식계열 항체 유전자 단편에 의해 암호화된 아미노산 서열을 또한 "생식계열 서열"이라 칭한다. 생식계열 항체 유전자 또는 생식계열 항체 유전자 단편 및 그의 상응하는 생식계열 서열은 당해 분야의 숙련가에게 주지되어 있으며 전문적인 데이터베이스(예를 들어 IMGT, unswag, NCBI 또는 VBASE2)로부터 획득되거나 조회될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "특이적으로 결합하다" 및 "특이적으로 결합하는"이란 용어는 비-무작위 방식의 2개 분자의 결합, 예를 들어 항체와 상기에 대한 항원간의 반응을 지칭한다. 일부 실시태양에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체(또는 항원에 특이적인 항체)는 약 10^-5 M 미만, 예를 들어 약 10^-6 M, 10^-7 M, 10^-8 M, 10^-9 M 또는 10^-10 M 미만 또는 그 이하의 친화성(K_D)으로 항원에 결합하는 항체를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "K_D"란 용어는 항원에 대한 항체의 결합 친화성을 기재하는데 사용되는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭한다. 해리 상수가 작을수록 항체에 더 단단히 결합하며, 항체와 항원간의 친화성이 높아진다. 일반적으로, 항체(예를 들어 본 발명에 따른 항체)는, 예를 들어 BIACORE 장치에서 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정된 약 10^-5 M 미만, 예를 들어 약 10^-6 M, 10^-7 M, 10^-8 M, 10^-9 M 또는 10^-10 M 미만 또는 그 이하의 K_D로 항원(예를 들어 HBsAg)에 결합한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "면역원성"이란 용어는 유기체에서 특정한 항체 또는 감작 림프구의 형성을 자극하는 능력을 지칭한다. 상기는 면역학적 효과기 물질, 예를 들어 항체 및 감작 림프구를 최종적으로 생성시키기 위해 특정한 면역세포를 활성화하고, 증식하고 분화하도록 자극하는 항원의 성질을 지칭할뿐만 아니라, 항원의 자극 후에 항체 또는 감작 T 림프구가 유기체의 면역계에서 형성될 수 있는 특정한 면역 반응을 지칭한다. 이종 항체를 피실험자에게 적용하는 경우, 피실험자에서 이종 항체의 면역원성은 불필요하다. 상기와 같은 면역원성은 피실험자의 면역계/면역 세포에 의해 이종 항체의 거부에 이를 수 있고, 이에 의해 피실험자에서 이종 항체의 감소된 효능이 생성되거나 또는 피실험자에서 불필요한 부작용이 생성될 수 있다. 따라서, 인간 피실험자에게 투여 전에, 이종 항체(예를 들어 시노몰구스 원숭이-유래된 항체)는 일반적으로 가능한 한 많이 그의 면역원성을 감소시키도록 조작할 필요가 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "키메릭 항체"란 용어는 항체가 여전히 관심 항원에 결합하는 활성을 유지하는 한, 그의 경쇄 및/또는 중쇄의 일부가 항체(특정한 종으로부터 기원하거나 또는 특정한 항체 유형 또는 하위유형에 속할 수 있다)로부터 유래하고 그의 경쇄 및/또는 중쇄의 다른 부분은 또 다른 항체(동일하거나 상이한 종으로부터 기원하거나 또는 동일하거나 상이한 항체 유형 또는 하위유형에 속할 수 있다)로부터 유래하는 상기와 같은 항체를 지칭한다(미국특허 제 4,816,567 호(Cabilly et al.); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). 예를 들어, "키메릭 항체"란 용어는 상기와 같은 항체(예를 들어 인간-원숭이 키메릭 항체)를 포함할 수 있으며, 여기에서 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 1차 항체(예를 들어 시노몰구스 원숭이-유래된 항체)로부터 유래하는 반면, 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 영역은 2차 항체(예를 들어 인간 항체)로부터 유래한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "인간화된 항체"란 용어는 아미노산 서열이 인간 항체의 서열에 대한 그의 상동성이 증가하도록 변형된 유전자 조작된 비-인간 항체를 지칭한다. 일반적으로, 인간화된 항체의 CDR 영역의 일부 또는 전부가 비-인간 항체(공여자 항체)로부터 유래되고, 비-CDR 영역(예를 들어 가변 영역 FR 및/또는 불변 영역)의 일부 또는 전부는 인간 면역글로불린(수용자 항체)으로부터 유래된다. 인간화된 항체는 전형적으로 공여자 항체의 예상되는 성질, 예를 들어 비제한적으로 항원 특이성, 친화성, 반응성, 바이러스를 중화 및/또는 제거하는 능력 등을 유지한다. 공여자 항체는 예상되는 성질(예를 들어 항원 특이성, 친화성, 반응성, 바이러스 중화 능력, 및/또는 바이러스 제거 능력)을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류(예를 들어 시노몰구스 원숭이)의 항체일 수 있다.

인간화된 항체는 비-인간 공여자 항체(예를 들어 시노몰구스 원숭이-유래된 항체)의 예상되는 성질을 유지할 수 있고 인간 피실험자에서 비-인간 공여자 항체(예를 들어 시노몰구스 원숭이-유래된 항체)의 면역원성 감소에 유효하기 때문에 특히 유리하다. 그러나, 공여자 항체의 CDR과 수용자 항체의 FR간의 합치 문제로 인해, 인간화된 항체의 예상되는 성질(예를 들어 항원 특이성, 친화성, 반응성, 바이러스 중화 능력, 및/또는 바이러스 제거 능력)은 비-인간 공여자 항체(예를 들어 시노몰구스 원숭이-유래된 항체)의 경우보다 일반적으로 더 낮다.

따라서, 당해 분야의 연구자는 항체의 인간화에 대한 예의 연구를 수행하였고 일부 진보를 이루었지만(예를 들어 문헌[Jones et al., Nature, 321:522 525 (1986)]; 문헌[Reichmann et al., Nature, 332:323 329 (1988)]; 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593 596 (1992)]; 및 문헌[Clark, Immunol. Today 21: 397 402 (2000)] 참조), 생성되는 인간화된 항체가 가능한 한 많이 공여자 항체의 예상되는 성질을 유지하면서 인간화 정도를 가능한 한 높게 가질 수 있게 하기에 충분히 몇몇 공여자 항체를 인간화하는 방법에 관하여, 종래 기술에서는 상세한 안내가 제공되지 않고 있다. 당해 분야의 숙련가는 특정한 공여자 항체를 조사하고, 탐구하고 조작해야 하며, 높은 인간화 정도(예를 들어 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 인간화 정도)를 가질뿐만 아니라 공여자 항체의 예상되는 성질을 유지하는 인간화된 항체를 수득하기 위해 많은 창의적인 연구를 수행해야 한다.

본 발명에서, 공여자 항체의 성질(예를 들어 특이성, 친화성, 반응성, 바이러스 중화 능력 및/또는 바이러스 제거 능력 포함)을 가능한 한 많이 유지하는 인간화된 항체를 제조하기 위해서, 본 발명의 인간화된 항체의 프레임워크 영역(FR)은 인간 기원의 수용체 항체의 아미노산 잔기 및 비-인간 기원의 상응하는 공여자 항체의 아미노산 잔기를 모두 포함할 수 있다.

또한, 비-인간 아미노산 잔기에 의해 야기된 면역원성을 가능한 한 많이 감소시키기 위해 인간화 정도를 더욱 증가시키기 위해서, 본 발명의 인간화된 항체에서 공여자 항체의 CDR 영역으로부터 유래된 아미노산 잔기의 일부를 예를 들어 인간 면역글로불린의 CDR 영역의 상응하는 아미노산 잔기 또는 다른 아미노산 잔기로 치환시킬 수 있다.

또한, 인간화된 항체의 성능을 더욱 개선시키거나 최적화하기 위해서, 본 발명의 인간화된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 중의 아미노산 잔기의 일부를, 예를 들어 수용자 항체로부터 유래되지도 않고 공여자 항체로부터 유래되지도 않은 아미노산 잔기로 추가로 치환시킬 수 있다.

구체적으로, 본 출원에서, 발명자는 먼저 각각 M1-23, M3-23 및 M3-13이라 명명된, 탁월한 성질을 갖는 3개의 시노몰구스 원숭이-인간 키메릭 단클론 항체(이들의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 서열번호 1-5에 제시되어 있다)를 개발하였다: 3개의 항체는 HBsAg를 특이적으로 인식/결합하고 HBV 독성을 중화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 피실험자에서 HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시킬 수 있으며, 신체에서 HBV 및 HBV에 의해 감염된 세포를 유효하게 제거할 수 있다. 따라서, M1-23, M3-23 및 M3-13 항체는 HBV 감염 및 HBV 감염과 관련된 질병, 예를 들어 B형 간염의 예방 및 치료에 사용 가능성을 갖는다.

이를 토대로, 발명자는 2개의 키메릭 항체 M1-23 및 M3-23을 예의 연구하고 변형시키고자 광범위한 창의적인 노력을 수행하였으며, 따라서 M1-23 및 M3-23의 인간화된 항체를 개발하였다: 본 발명의 인간화된 항체는 매우 높은 인간화 정도(인간화 정도는 98% 만큼 높을 수 있다)를 가질 뿐만 아니라 모 항체와 실질적으로 동일한(또는 심지어 우수한) 예상되는 성질(비제한적으로 HBsAg 결합 활성, HBV 중화 활성, 생체내 HBV DNA 또는 HBsAg의 제거 활성, 또는 생체내 HBV 및 HBV로 감염된 세포의 제거 활성 등)을 갖는다.

따라서, 본 발명의 항체(특히 인간화된 항체)는 모 항체의 기능 및 성질을 유지할 수 있기 때문에 매우 유리하며, 따라서 HBV 감염 및 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)의 예방 및 치료 가능성을 갖고; 더욱이, 항체는 매우 높은 인간화 정도(98% 까지의 인간화 정도)를 가질 수 있으며, 따라서 인간 피실험자에게, 면역원 반응을 상승시키지 않으면서 안전하게 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 항체(특히 인간화된 항체)는 상당한 임상적 가치를 가질 수 있다.

본 출원에서, 본 발명의 항체의 예상되는 성질은 HBsAg에 특이적으로 결합하는 활성, HBV 중화 활성, 생체내 HBV DNA 또는 HBsAg의 제거 활성, 및/또는 생체내 HBV 및 HBV로 감염된 세포의 제거 활성을 포함한다. 본 발명에 따른 인간화된 항체는 그의 모 항체(시노몰구스 원숭이-인간 키메릭 항체)의 상술한 예상되는 성질 중 하나 이상을 유지하며, 바람직하게는 그의 모 항체(시노몰구스 원숭이-인간 키메릭 항체)의 상술한 예상되는 성질을 모두 유지한다.

본 출원에서, 본 발명의 인간화된 항체를, 본 발명의 모 항체(시노몰구스 원숭이-인간 키메릭 항체)를 변형시킴으로써 수득한다. 예를 들어, 항체의 FR 중의 일부 아미노산 잔기를 치환시킨다(예를 들어 보존적 치환). 상기와 같은 치환은 예를 들어 (1) 단백질분해에 대한 항체의 감도를 감소시키거나; (2) 산화에 대한 항체의 민감성을 감소시키거나; (3) 항체의 항원 결합 친화성을 변화시키거나(예를 들어 증대시키거나); (4) 항체의 HBV-중화 활성을 변화시키거나(예를 들어 증대시키거나); (5) 항체의 HBV-제거 활성을 변화시키거나(예를 들어 증대시키거나); (6) 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 항체의 인간화 정도를 더욱 증대시키거나; 또는 (7) 항체의 다른 생화학적 특성 또는 기능적 성질을 변화시킬 수 있지만; 항체의 예상되는 성질은 여전히 유지할 수 있다. 상기와 같은 치환은 CDR 및/또는 FR 중에 존재할 수 있으며, 단일 아미노산 치환 또는 다중 아미노산 치환일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "인간화 정도"란 용어는 인간화된 항체 중의 비-인간 아미노산 잔기의 수를 가리키는 지수이다. 인간화된 항체의 인간화 정도를 예를 들어 하기 식에 의해 계산할 수 있다: 인간화 정도 = (FR 중의 아미노산의 수 - FR 중의 비-인간 아미노산의 수)/FR 중의 아미노산의 수 x 100%.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "중화 항체"란 용어는 표적 바이러스의 독성(예를 들어 세포를 감염시키는 능력)을 현저하게 감소시키거나 또는 완전히 억제할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. 일반적으로, 중화 항체는 표적 바이러스를 인식하고 결합할 수 있으며, 피실험자에서 표적 바이러스가 세포에 진입하고/세포를 감염시키는 것을 방지할 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 중화 항체이다.

그러나, 본 출원에서, 항체의 바이러스-중화 능력이 항체의 바이러스-제거 능력과 직접적으로 균등하지 않음은 물론이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "바이러스 중화"는 표적 바이러스가 피실험자의 세포에 진입하고/세포를 감염시키는 것을 억제함으로써 표적 바이러스의 독성을 중화시킴(즉 표적 바이러스의 독성이 현저하게 감소되거나 완전하게 억제된다)을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "바이러스 제거"는 표적 바이러스(세포를 감염시키든 감염시키지 않든 상관 없이)를 유기체로부터 제거하고, 따라서 유기체가 바이러스에 의한 감염전의 상태로 되돌아 감을 의미한다(예를 들어 바이러스의 혈청학적 시험 결과가 음성으로 변한다). 따라서, 일반적으로, 중화 항체는 반드시 바이러스-제거 능력을 가질 필요는 없다. 그러나, 본 출원에서, 발명자는 놀랍게도 본 발명에 따른 항체가 HBV를 중화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 바이러스를 제거할 수 있으며(즉 생체내에서 HBV DNA 및/또는 HBsAg를 제거할 수 있고, 생체내에서 HBV 및 HBV-감염된 세포를 제거할 수 있으며), 따라서 중요한 임상적 가치를 가짐을 발견하였다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단리된"이란 용어는 인공 수단에 의해 자연 상태로부터 획득되는 상태를 지칭한다. 몇몇 "단리된" 물질 또는 성분이 자연 중에 존재하는 경우, 이는 그의 자연 환경이 변화하거나 또는 물질이 자연 환경으로부터 단리되거나, 또는 이 둘 모두 때문에 가능하다. 예를 들어, 몇몇 단리되지 않은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 몇몇 살아있는 동물체 중에 자연적으로 존재하며, 상기와 같은 자연 상태로부터 고 순도로 단리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드라 칭한다. "단리된"이란 용어는 혼합된 인공 또는 합성 물질도, 단리된 물질의 활성에 영향을 미치지 않는 다른 불순한 물질도 제외시키지 않는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "벡터"란 용어는 폴리뉴클레오티드가 삽입될 수 있는 핵산 비히클을 지칭한다. 벡터가 상기 중에 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 단백질의 발현을 허용할 때, 벡터를 발현 벡터라 칭한다. 벡터는 숙주 세포내로의 형질전환, 형질도입 또는 형질감염에 의해 숙주 세포에서 발현되는 운반된 유전 물질을 가질 수 있다. 벡터, 예를 들어 비제한적으로 플라스미드, 파지, 코스미드, 인공 염색체, 예를 들어 효모 인공 염색체(YAC), 세균 인공 염색체(BAC) 또는 P1-유래된 인공 염색체(PAC); 파지, 예를 들어 λ 파지 또는 M13 파지 및 동물 바이러스가 당해 분야의 숙련가에게 주지되어 있다. 벡터로서 사용될 수 있는 동물 바이러스는 비제한적으로 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스(예를 들어 헤르페스 단순 바이러스), 수두 바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스, 파포바 바이러스(예를 들어 SV40)를 포함한다. 벡터는 발현을 조절하기 위한 다수의 요소, 예를 들어 비제한적으로 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인헨서 서열, 선택 요소 및 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 기원을 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "숙주 세포"란 용어는 벡터가 도입될 수 있는 세포, 예를 들어 비제한적으로 원핵생물 세포, 예를 들어 E.coli 또는 바실러스 서브틸리스, 및 진균 세포, 예를 들어 효모 세포 또는 아스퍼질러스, 곤충 세포, 예를 들어 S2 드로소필라 세포 또는 Sf9, 또는 동물 세포, 예를 들어 섬유아세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK 293 세포 또는 인간 세포를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "상동성"이란 용어는 2개의 폴리펩티드 사이 또는 2개의 핵산 사이의 합치 정도를 지칭한다. 비교를 위한 2개의 서열이 어떤 부위에서 염기 또는 아미노산의 동일한 단량체 서브유닛을 갖는 경우(예를 들어 2개의 각각의 DNA 분자가 어떤 부위에서 아데닌을 갖거나, 또는 2개의 각각의 폴리펩티드가 어떤 부위에서 리신을 갖는 경우), 2개의 분자는 상기 부위에서 동일하다. 2개 서열간의 상동성 퍼센트는 비교를 위한 부위의 총수에 걸쳐 2개 서열에 의해 공유된 동일한 부위의 수 x 100의 함수이다. 예를 들어, 2개 서열의 10개 부위 중 6개가 합치하는 경우, 이들 2개 서열은 60%의 상동성을 갖는다. 예를 들어, DNA 서열: CTGACT 및 CAGGTT는 50%의 상동성을 공유한다(6개의 부위 중 3개가 합치된다). 일반적으로, 2개 서열의 비교를 최대의 상동성을 생성시키는 방식으로 수행한다. 상기와 같은 정렬을 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 Align 프로그램(DNAstar, Inc.)(문헌[Needleman, et al., J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970]의 방법을 기본으로 한다)을 사용하여 수행할 수 있다. 2개 아미노산 서열간의 상동성 퍼센트를 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 끊김 길이 벌점 및 4의 끊김 벌점을 사용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 이 마이어스(E. Meyers)와 더블유 밀러(W. Miller)(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))의 알고리즘을 사용하여 측정할 수 있다. 또한, 2개 아미노산 서열간의 상동성 퍼센트를 Blossum 62 행렬 또는 PAM250 행렬 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 끊김 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램(http://www.gcg.com에서 입수할 수 있다)에 통합된 니들맨(Needleman)과 분취(Wunsch)(J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))의 알고리즘에 의해 측정할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "보존적 치환" 및 "보존적 아미노산 치환"이란 용어는 아미노산 서열을 포함하는 단백질/폴리펩티드의 예상되는 성질에 불리한 영향을 미치지 않거나 또는 상기 성질을 변화시키지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 예를 들어, 보존적 치환을 당해 분야에 공지된 표준 기법, 예를 들어 부위-지향된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발에 의해 도입시킬 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 상응하는 아미노산 잔기에 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기, 예를 들어 물리적으로 또는 기능적으로 유사한(예를 들어 유사한 크기, 모양, 전하, 공유 결합 또는 수소 결합을 형성하는 능력을 포함한 화학적 성질 등을 갖는) 잔기로 치환되는 치환을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당해 분야에서 정의되었다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 리신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 아스파트산 및 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 쓰레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 상응하는 아미노산 잔기를 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 치환시킨다. 아미노산 보존적 치환의 식별 방법은 당해 분야에 주지되어 있다(예를 들어 문헌[Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993)]; 문헌[Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999)]; 및 문헌[Burks et al., Proc. Natl Acad. Set USA 94: 412-417 (1997)](본 명세서에 참고문헌으로 인용됨) 참조).

본 명세서에 관련된 20개의 통상적인 아미노산을 통상적인 방법에 따라 나타낸다. 예를 들어 본 명세서에 참고로 인용된 문헌[Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)]을 참조하시오. 본 발명에서, "폴리펩티드" 및 "단백질"이란 용어는 동일한 의미를 가지며, 호환 가능하게 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명에서, 아미노산을 일반적으로 1-문자 코드 및 3-문자 코드로서 나타낸다. 예를 들어, 알라닌을 A 또는 Ala로서 나타낼 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 바와 같이, "단클론 항체" 및 "mAb"란 용어는 동일한 의미를 가지며, 호환 가능하게 사용될 수 있고; "다클론 항체" 및 "pAb"란 용어는 동일한 의미를 가지며, 호환 가능하게 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제"란 용어는 피실험자 및 활성제와 약물학적으로 및/또는 생리학적으로 상용성인 담체 및/또는 부형제를 지칭하며, 이들은 당해 분야에 주지되어 있고(예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995] 참조), 비제한적으로 pH 조절제, 계면활성제, 항원보강제, 이온 강도 증대제, 희석제, 삼투압-조절제, 흡수 지연제, 및 보존제를 포함한다. 예를 들어, pH 조절제는 비제한적으로 포스페이트 완충제를 포함한다. 계면활성제는 비제한적으로 양이온성, 음이온성, 또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈-80을 포함한다. 이온 강도 증대제는 비제한적으로 염화 나트륨을 포함한다. 보존제는 비제한적으로 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 및 소르브산을 포함한다. 삼투압 조절제는 비제한적으로 당, NaCl 및 그의 유사체를 포함한다. 흡수 지연제는 비제한적으로 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "항원보강제(adjuvant)"는 항원과 함께 유기체에 전달되거나 또는 유기체에 미리 전달될 때 유기체에서 항원에 대한 면역 반응을 증대시키거나 면역 반응의 유형을 변화시킬 수 있는 비-특이적인 면역강화제를 지칭한다. 다양한 항원보강제, 예를 들어 비제한적으로 알루미늄 항원보강제(예를 들어 수산화 알루미늄), 프로인트 항원보강제(예를 들어 프로인트 완전 항원보강제 및 프로인트 불완전 항원보강제), 코리네 박테리움 파르븀, 리포폴리사카라이드, 사이토카인 등이 존재한다. 프로인트 항원보강제가 현재 동물 실험에 가장 통상적으로 사용되는 항원보강제이다. 수산화 알루미늄 항원보강제는 임상 시험에서 보다 통상적으로 사용된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "예방/예방하는"이란 용어는 피실험자에서 질병, 질환 또는 증상(예를 들어 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병)의 발생을 억제하거나 지연시키기 위해 수행되는 방법을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "치료/치료하는"이란 용어는 이롭거나 목적하는 임상 결과를 획득하기 위해 수행되는 방법을 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 목적하는 임상 결과는, 검출될 수 있거나 또는 검출될 수 없는 것과 상관없이, 비제한적으로 증상의 경감, 질병 범위 줄이기, 질병 상태의 안정화(즉 악화시키지 않음), 질병 진행의 지연 또는 늦춤, 및 증상의 완화(부분적인 또는 완전한)를 포함한다. 또한, "치료"는 예상되는 생존 기간(치료를 수용하지 않은 경우)에 비해 연장된 생존 기간을 지칭한다. 본 출원에서, 본 발명에 따른 항체는 HBV를 중화시키는 능력을 가지며, 따라서 병들지 않은 피실험자 또는 그의 세포를 HBV에 의한 감염으로부터 예방/보호하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 HBV를 제거하는 능력을 가지며(즉 생체내에서 HBV DNA 및/또는 HBsAg를 제거할 수 있고, 생체내에서 HBV 및 HBV에 의해 감염된 세포를 제거할 수 있으며), 따라서 감염된 피실험자에서 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병을 치료하는데 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "피실험자"란 용어는 포유동물, 예를 들어 영장류 포유동물, 예를 들어 인간을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유효량"이란 용어는 예상되는 효과를 성취하거나 또는 적어도 부분적으로 성취하기에 충분한 양을 지칭한다. 예를 들어, 질병(예를 들어 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병)의 예방에 유효한 양은 질병(예를 들어 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병)의 예방, 억제 또는 질병 발생의 지연에 유효한 양을 지칭한다. 질병의 치료에 유효한 양은 질병이 있는 환자에서 질병 및 그의 합병증의 치유 또는 적어도 부분적인 차단에 유효한 양을 지칭한다. 상기와 같은 유효량의 측정은 당해 분야의 숙련가의 능력내에 있다. 예를 들어, 치료학적 용도에 유효한 양은 치료하고자 하는 질병의 중증도, 환자에서 면역계의 일반적인 상태, 환자의 일반적인 조건, 예를 들어 연령, 체중 및 성별, 약물의 투여 수단, 동시에 사용되는 추가적인 치료법 등에 따라 변한다.

발명의 항체

본 출원에서, 발명자는 먼저 각각 M1-23, M3-23 및 M3-13이라 명명된, 탁월한 성질을 갖는 3개의 시노몰구스 원숭이-인간 키메릭 단클론 항체(이들의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 서열번호 1-5에 제시되어 있다)를 개발하였다: 3개의 항체는 HBsAg를 특이적으로 인식/결합하고 HBV의 독성을 중화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 피실험자에서 HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시킬 수 있으며, 신체에서 HBV 및 HBV에 의해 감염된 세포를 유효하게 제거할 수 있다. 따라서, M1-23, M3-23 및 M3-13 항체는 HBV 감염 및 HBV 감염과 관련된 질병, 예를 들어 B형 간염의 예방 및 치료에 사용 가능성을 갖는다.

이를 토대로, 발명자는 2개의 키메릭 항체 M1-23 및 M3-23에 대한 예의 연구와 변형을 수행하였으며, M1-23 및 M3-23 항체의 인간화된 항체를 개발하였다: 본 발명의 인간화된 항체는 매우 높은 인간화 정도(인간화 정도는 98% 만큼 높을 수 있다)를 가질 뿐만 아니라 모 항체와 실질적으로 동일한(또는 심지어 우수한) 예상되는 성질(비제한적으로 HBsAg 결합 활성, HBV 중화 활성, 생체내 HBV DNA 또는 HBsAg의 제거 활성, 또는 생체내 HBV 및 HBV로 감염된 세포의 제거 활성 등)을 갖는다.

따라서, 본 발명의 항체(특히 인간화된 항체)는 모 항체의 기능 및 성질을 유지할 수 있고, 따라서 HBV 감염 및 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)의 예방 및 치료에 사용 가능성을 가질 뿐만 아니라; 매우 높은 인간화 정도(98% 까지)를 가질 수 있으며, 따라서 인간 피실험자에게, 면역원 반응을 유도하지 않으면서 안전하게 투여될 수 있다는 점에서 매우 유리하다. 본 발명의 항체(특히 인간화된 항체)는 상당한 임상적 가치를 갖는다.

따라서, 하나의 태양에서, 본 발명은 HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은

을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기에 정의된 바와 같은 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기에 정의된 바와 같은 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기에 정의된 바와 같은 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함한다.

을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는

를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)

을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR2; 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VH CDR3; 및 임의의 면역글로불린의 중쇄 가변 영역 중에 함유된 VH CDR1의 서열(예를 들어 서열번호 6, 137 또는 138) 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH CDR1을 포함하고;

항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VL CDR3, 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR2; 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VH CDR3; 및 서열번호 6에 제시된 바와 같은 VH CDR1을 포함하고;

항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VL CDR3, 및 임의의 면역글로불린의 경쇄 가변 영역(예를 들어 κ 경쇄 가변 영역) 중에 함유된 VL CDR2의 서열(예를 들어 서열번호 10, 139 또는 140) 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VL CDR2를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VH CDR3, 및 서열번호 6, 137 또는 138의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1을 포함하고; 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VL CDR3, 및 서열번호 10, 139 또는 140의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VH CDR3을 포함하고; 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 10에 제시된 바와 같은 VL CDR2, 및 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VL CDR3을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 137에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VH CDR3을 포함하고; 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 10에 제시된 바와 같은 VL CDR2, 및 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VL CDR3을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 138에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VH CDR3을 포함하고; 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 10에 제시된 바와 같은 VL CDR2, 및 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VL CDR3을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VH CDR3을 포함하고; 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 139에 제시된 바와 같은 VL CDR2, 및 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VL CDR3을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VH CDR3을 포함하고; 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 140에 제시된 바와 같은 VL CDR2, 및 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VL CDR3을 포함한다.

를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는

를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)

을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 14에 제시된 바와 같은 VH CDR3, 및 임의의 면역글로불린의 중쇄 가변 영역 중에 포함된 VH CDR2의 서열(예를 들어 서열번호 13, 서열번호 141 또는 서열번호 142) 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH CDR2를 포함하고;

항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 17에 제시된 바와 같은 VL CDR3, 및 서열번호 16에 제시된 바와 같은 VL CDR2를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 VH CDR1; 서열번호 14에 제시된 바와 같은 VH CDR3; 및 서열번호 13에 제시된 바와 같은 VH CDR2를 포함하고;

항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 17에 제시된 바와 같은 VL CDR3, 및 임의의 면역글로불린의 경쇄 가변 영역(예를 들어 카파 경쇄 가변 영역) 중에 함유된 VL CDR2의 서열(예를 들어 서열번호 16, 서열번호 143 또는 서열번호 144) 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VL CDR2를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 14에 제시된 바와 같은 VH CDR3, 및 서열번호 13, 141 또는 142로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 갖는 VH CDR2를 포함하고; 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 17에 제시된 바와 같은 VL CDR3, 및 서열번호 16, 143 또는 144로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 갖는 VL CDR2를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 13에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 및 서열번호 14에 제시된 바와 같은 VH CDR3을 포함하고; 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 16에 제시된 바와 같은 VL CDR2, 및 서열번호 17에 제시된 바와 같은 VL CDR3을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 141에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 및 서열번호 14에 제시된 바와 같은 VH CDR3을 포함하고; 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 16에 제시된 바와 같은 VL CDR2, 및 서열번호 17에 제시된 바와 같은 VL CDR3을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 142에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 및 서열번호 14에 제시된 바와 같은 VH CDR3을 포함하고; 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 16에 제시된 바와 같은 VL CDR2, 및 서열번호 17에 제시된 바와 같은 VL CDR3을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 13에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 및 서열번호 14에 제시된 바와 같은 VH CDR3을 포함하고; 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 143에 제시된 바와 같은 VL CDR2, 및 서열번호 17에 제시된 바와 같은 VL CDR3을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 13에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 및 서열번호 14에 제시된 바와 같은 VH CDR3을 포함하고; 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 144에 제시된 바와 같은 VL CDR2, 및 서열번호 17에 제시된 바와 같은 VL CDR3을 포함한다.

를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는

를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)

을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 프레임워크 영역을 추가로 포함한다.

(iii) 서열번호 23, 서열번호 31, 서열번호 39, 서열번호 45, 서열번호 52, 또는 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가)에 의해 상기 서열과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH FR3;

을 포함한다.

(b) 서열번호 29에 제시된 바와 같은 VH FR1, 서열번호 30에 제시된 바와 같은 VH FR2, 서열번호 31에 제시된 바와 같은 VH FR3, 및 서열번호 32에 제시된 바와 같은 VH FR4; 또는

(c) 서열번호 37에 제시된 바와 같은 VH FR1, 서열번호 38에 제시된 바와 같은 VH FR2, 서열번호 39에 제시된 바와 같은 VH FR3, 및 서열번호 32에 제시된 바와 같은 VH FR4

를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은

(a) 서열번호 25에 제시된 바와 같은 VL FR1, 서열번호 26에 제시된 바와 같은 VL FR2, 서열번호 27에 제시된 바와 같은 VL FR3, 및 서열번호 28에 제시된 바와 같은 VL FR4; 또는

(b) 서열번호 33에 제시된 바와 같은 VL FR1, 서열번호 34에 제시된 바와 같은 VL FR2, 서열번호 35에 제시된 바와 같은 VL FR3, 및 서열번호 36에 제시된 바와 같은 VL FR4

를 포함한다.

(b) 서열번호 29에 제시된 바와 같은 VH FR1, 서열번호 30에 제시된 바와 같은 VH FR2, 서열번호 31에 제시된 바와 같은 VH FR3, 및 서열번호 32에 제시된 바와 같은 VH FR4; 및 서열번호 33에 제시된 바와 같은 VL FR1, 서열번호 34에 제시된 바와 같은 VL FR2, 서열번호 35에 제시된 바와 같은 VL FR3, 및 서열번호 36에 제시된 바와 같은 VL FR4; 또는

(c) 서열번호 37에 제시된 바와 같은 VH FR1, 서열번호 38에 제시된 바와 같은 VH FR2, 서열번호 39에 제시된 바와 같은 VH FR3, 및 서열번호 32에 제시된 바와 같은 VH FR4; 및 서열번호 33에 제시된 바와 같은 VL FR1, 서열번호 34에 제시된 바와 같은 VL FR2, 서열번호 35에 제시된 바와 같은 VL FR3, 및 서열번호 36에 제시된 바와 같은 VL FR4

를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 인간화시킨다. 몇몇 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 적어도 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 인간화 정도를 갖는다. 몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 비-CDR 영역은 비-인간(예를 들어 시노몰구스 원숭이) 공급원의 19개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산 잔기를 포함하거나, 또는 비-CDR 영역은 비-인간(예를 들어 시노몰구스 원숭이) 공급원의 아미노산 잔기를 포함하지 않는다. 몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 FR 영역은 비-인간(예를 들어 시노몰구스 원숭이) 기원의 19개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산 잔기를 포함하거나, 또는 FR 영역은 비-인간(예를 들어 시노몰구스 원숭이) 기원의 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역, 예를 들어 인간 생식계열 항체 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 함유된 프레임워크 영역을 포함한다. 몇몇 바람직한 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 중쇄 생식계열 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 함유된 중쇄 프레임워크 영역, 및/또는 인간 경쇄 생식계열 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 함유된 경쇄 프레임워크 영역을 포함한다.

상기와 같은 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 프레임워크 영역 및/또는 경쇄 프레임워크 영역은 비-인간(예를 들어 시노몰구스 원숭이) 기원의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 몇몇 바람직한 구현예에서, 중쇄 프레임워크 영역 및/또는 경쇄 프레임워크 영역은 시노몰구스 원숭이의 상응하는 잔기에 역 돌연변이된 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 상응하는 잔기의 보존적 치환을 포함한다(상기와 같은 돌연변이를 역 돌연변이라 칭한다).

몇몇 바람직한 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 인간 중쇄 생식계열 유전자 IGHV 4-4^*08에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 포함된 중쇄 프레임워크 영역을 포함하고, 중쇄 프레임워크 영역은 인간-유래된 잔기로부터 시노몰구스 원숭이-유래된 잔기로의 하나 이상의 역 돌연변이를 임의로 포함한다. 몇몇 바람직한 구현예에서, IGHV 4-4^*08은 서열번호 40에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 암호화한다.

(i) 서열번호 21이거나, 또는

(01) H17에서 T;

(02) H20에서 L; 및

(03) H23에서 T

로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 또는 다수의 아미노산 치환(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환)에 의해 서열번호 21과 상이한 VH FR1;

(ii) 서열번호 22인 VH FR2;

(iii) 서열번호 23이거나, 또는

(01) H64에서 K;

(02) H69에서 I; 및

(03) H78에서 F

로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 또는 다수의 아미노산 치환(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환)에 의해 서열번호 23과 상이한 VH FR3;

(iv) 서열번호 24이거나, 또는

(01) H107에서 T; 및

(02) H108에서 T

로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 또는 다수의 아미노산 치환(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환)에 의해 서열번호 24와 상이한 VH FR4

를 포함하고, 여기에서 상기에 언급한 모든 아미노산 위치는 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.

몇몇 예시적인 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 44에 제시된 바와 같은 VH FR1, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 VH FR2, 서열번호 45에 제시된 바와 같은 VH FR3, 및 서열번호 46에 제시된 바와 같은 VH FR4를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 인간 중쇄 생식계열 유전자 IGHV 4-4^*02에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 포함된 중쇄 프레임워크 영역을 포함하고, 중쇄 프레임워크 영역은 인간-유래된 잔기로부터 시노몰구스 원숭이-유래된 잔기로의 하나 이상의 역 돌연변이를 임의로 포함한다. 몇몇 바람직한 구현예에서, IGHV 4-4^*02에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열번호 42에 제시되어 있다.

(i) 서열번호 29이거나, 또는

(01) H2에서 V; 및

(02) H16에서 G

로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 또는 다수의 아미노산 치환(예를 들어 1 또는 2개)에 의해 서열번호 29와 상이한 VH FR1;

(ii) 서열번호 30이거나, 또는 하기의 아미노산 치환: H37에서 V에 의해 서열번호 30과 상이한 VH FR2;

(iii) 서열번호 31이거나, 또는

(01) H65에서 S;

(02) H71에서 V;

(03) H73에서 K; 및

(04) H81에서 K

로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 또는 다수의 아미노산 치환(예를 들어 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환)에 의해 서열번호 31과 상이한 VH FR3;

(iv) 서열번호 32이거나, 또는 하기의 아미노산 치환: H107에서 T에 의해 서열번호 32와 상이한 VH FR4

몇몇 예시적인 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는 서열번호 50에 제시된 바와 같은 VH FR1, 서열번호 51에 제시된 바와 같은 VH FR2, 서열번호 52에 제시된 바와 같은 VH FR3, 및 서열번호 53에 제시된 바와 같은 VH FR4를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 인간 경쇄 생식계열 유전자 IGKV1-39^*01에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 함유된 경쇄 프레임워크 영역을 포함하고, 여기에서 경쇄 프레임워크 영역은 인간-유래된 잔기로부터 시노몰구스 원숭이-유래된 잔기로의 하나 이상의 역 돌연변이를 임의로 포함한다. 몇몇 바람직한 구현예에서, IGKV1-39^*01에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열번호 41에 제시되어 있다.

(i) 서열번호 25이거나, 또는

(01) L1에서 D; 및

(02) L3에서 Q

로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 또는 다수의 아미노산 치환(예를 들어 하나 또는 2개의 아미노산 치환)에 의해 서열번호 25와 상이한 VL FR1;

(ii) 서열번호 26이거나, 또는 하기의 아미노산 치환: L45에서 K에 의해 서열번호 26과 상이한 VL FR2;

(iii) 서열번호 27이거나, 또는

(01) L55에서 Q;

(02) L63에서 S;

(03) L70에서 D; 및

(04) L84에서 A

로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 또는 다수의 아미노산 치환(예를 들어 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환)에 의해 서열번호 27과 상이한 VL FR3

(iv) 서열번호 28인 VL FR4

몇몇 예시적인 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 47에 제시된 바와 같은 VL FR1, 서열번호 48에 제시된 바와 같은 VL FR2, 서열번호 49에 제시된 바와 같은 VL FR3, 및 서열번호 28에 제시된 바와 같은 VL FR4를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 인간 경쇄 생식계열 유전자 IGKV4-1^*01에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 함유된 경쇄 프레임워크 영역을 포함하고, 여기에서 경쇄 프레임워크 영역은 인간-유래된 잔기로부터 시노몰구스 원숭이-유래된 잔기로의 하나 이상의 역 돌연변이를 임의로 포함한다. 몇몇 바람직한 구현예에서, IGKV4-1^*01에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열번호 43에 제시되어 있다.

(i) 서열번호 33이거나, 또는

(01) L3에서 V;

(02) L5에서 T; 및

(03) L19에서 A

로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환)에 의해 서열번호 33과 상이한 VL FR1;

(ii) 서열번호 34이거나, 또는 하기의 아미노산 치환: L43에서 V에 의해 서열번호 34와 상이한 VL FR2;

(iii) 서열번호 35이거나, 또는

(01) L60에서 D;

(02) L76에서 S; 및

(03) L77에서 S

로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환)에 의해 서열번호 35와 상이한 VL FR3

(iv) 서열번호 36인 VL FR4

를 포함하고, 여기에서 상기에 언급한 아미노산 위치는 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.

몇몇 예시적인 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은 서열번호 54에 제시된 바와 같은 VL FR1, 서열번호 55에 제시된 바와 같은 VL FR2, 서열번호 56에 제시된 바와 같은 VL FR3, 및 서열번호 36에 제시된 바와 같은 VL FR4를 포함한다.

(a) IGHV4-4^*08에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 포함된 중쇄 프레임워크 영역, 및 IGKV1-39^*01에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 포함된 경쇄 프레임워크 영역; 또는

(b) IGHV4-4^*02에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 포함된 중쇄 프레임워크 영역, 및 IGKV4-1^*01에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 포함된 경쇄 프레임워크 영역

을 포함한다.

(a) 서열번호 44에 제시된 바와 같은 VH FR1, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 VH FR2, 서열번호 45에 제시된 바와 같은 VH FR3, 및 서열번호 46에 제시된 바와 같은 VH FR4; 및 서열번호 47에 제시된 바와 같은 VL FR1, 서열번호 48에 제시된 바와 같은 VL FR2, 서열번호 49에 제시된 바와 같은 VL FR3, 및 서열번호 28에 제시된 바와 같은 VL FR4; 또는

(b) 서열번호 50에 제시된 바와 같은 VH FR1, 서열번호 51에 제시된 바와 같은 VH FR2, 서열번호 52에 제시된 바와 같은 VH FR3, 및 서열번호 53에 제시된 바와 같은 VH FR4; 및 서열번호 54에 제시된 바와 같은 VL FR1, 서열번호 55에 제시된 바와 같은 VL FR2, 서열번호 56에 제시된 바와 같은 VL FR3, 및 서열번호 36에 제시된 바와 같은 VL FR4

를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH는

를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL은

를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역은 상기에 정의된 바와 같은 VH FR1, VH CDR1, VH FR2, VH CDR2, VH FR3, VH CDR3 및 VH FR4를 포함한다. 몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역은 상기에 정의된 바와 같은 VL FR1, VL CDR1, VL FR2, VL CDR2, VL FR3, VL CDR3 및 VL FR4를 포함한다. 몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역은 상기에 정의된 바와 같은 VH FR1, VH CDR1, VH FR2, VH CDR2, VH FR3, VH CDR3 및 VH FR4를 포함하고; 경쇄 가변 영역은 상기에 정의된 바와 같은 VL FR1, VL CDR1, VL FR2, VL CDR2, VL FR3, VL CDR3 및 VL FR4를 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 1, 3, 5, 57, 59, 157, 158, 163 및 164에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 상동성을 갖는다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1, 3, 5, 57, 59, 157, 158, 163 및 164에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역이다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 2, 4, 58, 60, 159, 160, 165 및 166에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 상동성을 갖는다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역은 서열번호 2, 4, 58, 60, 159, 160, 165 및 166에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역이다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 상기에 정의된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 상기에 정의된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함한다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1, 57, 157 및 158 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역이고; 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역은 서열번호 2, 58, 159 및 160 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역이다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역은 서열번호 3, 59, 163 및 164 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역이고; 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역은 서열번호 4, 60, 165 및 166 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역이다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는

을 포함한다.

본 발명의 항체를 유전자 조작 재조합 기법에 의해 수득할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자의 DNA 분자를 화학 합성 또는 PCR에 의해 수득할 수 있다. 생성되는 DNA 분자를 발현 벡터에 삽입하고 이어서 숙주 세포, 예를 들어 E.coli 세포, 유인원 COS, CHO 세포, 또는 면역글로불린을 생성시키지 않는 다른 골수종 세포에 형질감염시킨다. 이어서, 형질감염된 숙주 세포를 특정한 조건하에서 배양하고 본 발명의 항체를 발현시킨다.

본 발명의 항체는 HBsAg 단백질에 대해 높은 특이성 및 높은 친화성을 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 1 x 10^-5 M 미만의 KD로 HBsAg와 결합할 수 있으며; 바람직하게 KD 값은 1 x 10^-6 M 미만이고; 보다 바람직하게 KD 값은 1 x 10^-7 M 미만이고; 가장 바람직하게 KD 값은 1 x 10^-8 M 미만이다.

본 발명의 항체는, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고 통상적인 "Y" 유형 구조를 갖는 항체일 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는, HBsAg 단백질에 대한 친화성을 유지하며 통상적인 "Y" 유형 구조를 갖는 항체보다 더 높거나 더 낮은 친화성으로 HBsAg 단백질과 결합할 수 있는 Fab 단편, Fab', F(ab)₂, Fv, 또는 통상적인 "Y" 유형 구조를 갖는 항체의 단편의 다른 유형일 수 있다.

본 발명의 항원-결합 단편을 완전 항체 분자의 가수분해에 의해 수득할 수 있다(문헌[Morimoto et al., J. biochem. Biophys. Methods 24: 107-117 (1992)] 및 문헌[Brennan et al., Science 229: 81 (1985)] 참조). 한편으로, 이들 항원-결합 단편을 재조합 숙주 세포로부터 직접 생성시킬 수 있다(문헌[Hudson, curr. Opin. Immunol. 11: 548-557 (1999)]; 문헌[Little et al., Immunol. Today, 21: 364-370 (2000)]에 리뷰되어 있다). 예를 들어, Fab' 단편을 E.coli 세포로부터 직접 수득할 수 있으며; Fab' 단편을 화학적으로 결합시켜 F(ab')₂ 단편을 형성시킬 수 있다(Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)). 더욱 또한, Fv, Fab 또는 F(ab')₂ 단편을 또한 재조합 숙주 세포의 배양물로부터 직접 단리할 수 있다. 이들 항원-결합 단편의 다른 제조 기법은 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 주지되어 있다.

따라서, 몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 scFv, Fab, Fab', (Fab')₂, Fv 단편, 디아바디, 이중특이성 항체, 다중특이성 항체, 키메릭 항체, 또는 인간화된 항체로 이루어지는 그룹 중에서 선택한다. 특히 바람직하게, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 키메릭 항체 또는 인간화된 항체이다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있고, HBV의 독성을 중화시킬 수 있고, 및/또는 피실험자에서 HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시킬 수 있다.

몇몇 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IgG 부류의 것이다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IgG1 또는 IgG2 또는 IgG3 또는 IgG4 부류의 것일 수 있다.

융합 항체

또 다른 태양에서, 융합 항체 또는 면역부착소를 제조할 수 있다, 예를 들어 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 또 다른 폴리펩티드에 연결시킬 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 융합 항체는 본 발명에 따른 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 융합 항체는 본 발명에 따른 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하며; 여기에서 VH 도메인은 제1 폴리펩티드에 연결되고; VL 도메인은 제2 폴리펩티드에 연결된다.

유도체화된 항체

본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유도체화할 수 있다, 예를 들어 또 다른 분자(예를 들어 또 다른 폴리펩티드 또는 단백질)에 연결할 수 있다. 일반적으로, 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 유도체화(예를 들어 표지화)는 HBsAg에 대한 그의 결합에 불리한 영향을 미치지 않을 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 상기와 같은 유도체화된 형태를 포함하고자 한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 하나 이상의 다른 분자 그룹, 예를 들어 또 다른 항체(예를 들어 이중특이성 항체를 형성하는), 검출제, 약물, 및/또는 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 또 다른 분자(예를 들어 아비딘 또는 폴리히스티딘-태그)와의 회합을 매개할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드에 기능적으로 (화학적 커플링, 유전자 융합, 비-공유 결합 또는 다른 수단에 의해) 연결시킬 수 있다.

유도체화된 항체의 한 가지 유형(예를 들어 이중특이성 항체)을, (동일한 유형에 속하거나 속하지 않는) 2개 이상의 항체를 가교결합시킴으로써 생성시킨다. 적합한 가교결합제는 예를 들어, 적합한 이격자에 의해 분리된 2개의 상이한 반응기를 포함하는 이종이작용성 가교결합제(예를 들어 m-말레이미도벤조일-N-하이드록실숙신이미드 에스테르); 및 동종이작용성 가교결합제(디숙신이미딜 수베레이트)를 포함한다. 상기와 같은 가교결합제를 Pierce Chemical Company(Rockford, II)로부터 구입할 수 있다.

또 다른 유형의 유도체화된 항체는 표지된 항체이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유용한 검출제에 연결시킬 수 있다. 상기와 같은 검출제는 예를 들어 형광 화합물, 예를 들어 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 단실 클로라이드, 피코에리쓰린, 란타나이드 인광체 등을 포함한다. 또한, 항체를 효소, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제, 글루코스 옥시다제 등에 의해 또한 표지할 수 있다. 항체를 효소에 의해 표지하는 경우, 효소에 의해 사용되어 식별가능한 신호 또는 반응 생성물을 생성시킬 수 있는 시약을 가하여 표지된 항체를 검출할 수 있다. 예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제를 사용하여 항체를 표지하는 경우, 표지된 항체의 존재 또는 양을 측정하기 위해서 과산화 수소 및 디아미노벤지딘을 가하여 검출 가능한 발색성 반응 생성물을 생성시킬 수 있다. 또한, 항체를 비오틴에 의해 표지할 수 있다. 이 경우, 표지된 항체의 존재 또는 양을, 아비딘의 결합을 간접적으로 측정함으로써 측정할 수 있다. 또한, 항체를, 제2 리포터 분자(예를 들어 류신 지퍼쌍 서열, 금속-결합 도메인, 에피토프 태그 등)에 의해 인식될 수 있는 태그에 의해 표지할 수 있다. 일부 특정한 구현예에서, 표지를 상이한 길이의 이격자 가지를 통해 항체에 연결시켜 잠재적인 입체 장애를 감소시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 또한 화학기, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메틸 또는 에틸, 또는 사카라이드기로 또한 유도체화할 수 있다. 이들 기를 사용하여 항체의 생물학적 성질을 개선시킬 수 있다, 예를 들어 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다.

핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 그의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자는 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 그의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 암호화한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터(예를 들어 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)를 제공한다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지 등이다. 일부 바람직한 구현예에서, 벡터는 피실험자(예를 들어 포유동물, 예를 들어 인간)에서 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 발현할 수 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자 또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기와 같은 숙주 세포는 비제한적으로 원핵생물 세포, 예를 들어 E.coli 세포, 및 진핵생물 세포, 예를 들어 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포(예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 마우스 세포 및 인간 세포)를 포함한다. 본 발명에 따른 세포는 세포주, 예를 들어 293T 세포일 수 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명에 따른 숙주 세포를 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하고, 배양된 숙주 세포의 배양물로부터 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수함을 포함하는, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법을 제공한다.

진단 방법 및 키트

본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있으며, 따라서 샘플 중 HBsAg 단백질의 존재 또는 수준을 검출하는데 사용될 수 있고, 피실험자의 HBV에 의한 감염 여부를 진단하는데 사용될 수 있다.

따라서, 또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 검출 가능한 표지를 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서, 키트는 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 특이적으로 인식하는 2차 항체를 추가로 포함한다. 바람직하게, 2차 항체는 검출 가능한 표지를 추가로 포함한다.

상술한 방법에 따라, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 2차 항체를 표지할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 검출 가능한 표지로 표지할 수 있다. 당해 분야의 숙련가에 의해 주지된 상기와 같은 검출 가능한 표지는 비제한적으로 방사성동위원소, 형광 물질, 발광 물질, 발색성 물질 및 효소(예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제) 등을 포함한다. 또한, 상기와 같은 검출 가능한 표지는 예를 들어 방사성동위원소, 예를 들어 ¹²⁵I; 형광 물질, 예를 들어 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아미노-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리쓰린, 및 란타나이드 인광체; 식별 가능한 신호 또는 반응 생성물을 생성시킬 수 있는 효소, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제, 및 글루코스 옥시다제; 제2 리포터 분자에 의해 인식될 수 있는 태그, 예를 들어 비오틴, 아비딘, 류신 지퍼쌍 서열, 금속-결합 도메인, 및 에피토프 태그를 추가로 포함한다. 일부 특정한 실시태양에서, 검출제(예를 들어 태그)를 상이한 길이의 링커를 통해 항체에 연결시켜 잠재적인 입체 장애를 감소시킬 수 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용함을 포함하는, 샘플 중 HBsAg 단백질의 존재 또는 수준의 검출 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 검출 가능한 표지를 추가로 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 방법은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 검출하기 위해 검출 가능한 표지를 운반하는 2차 항체를 사용함을 추가로 포함한다. 방법을 진단 목적으로 또는 비-진단 목적으로 사용할 수 있다(예를 들어 상기 샘플은 환자로부터의 샘플이 아닌 세포 샘플이다).

또 다른 태양에서, 본 발명은 피실험자로부터의 샘플 중 HBsAg 단백질의 존재를 검출하기 위해 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용함을 포함하는, 피실험자의 HBV에 의한 감염 여부를 진단하기 위한 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 검출 가능한 표지를 추가로 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 방법은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 검출하기 위해 검출 가능한 표지를 운반하는 2차 항체를 사용함을 추가로 포함한다.

또 다른 태양에서, 샘플 중 HBsAg의 존재 또는 수준을 검출하기 위한 또는 피실험자의 HBV에 의한 감염 여부를 진단하기 위한 키트의 제조에서 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.

치료 방법 및 약학 조성물

따라서, 또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 추가적인 약학적으로 활성인 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 추가적인 약학적으로 활성인 작용제는 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)의 예방 또는 치료를 위한 작용제, 예를 들어 다른 항바이러스제, 예를 들어 인터페론-유형 작용제, 예를 들어 인터페론 또는 페길화된 인터페론이다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 피실험자에서 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)을 예방하거나 치료하고, 피실험자(예를 들어 인간)에서 HBV 독성을 중화시키고, 및/또는 피실험자(예를 들어 인간)에서 HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 피실험자에게 유효량의 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 투여함을 포함한다.

본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 전통적인 경로, 예를 들어 비제한적으로 경구, 구강, 설하, 안내, 국소, 비경구, 직장, 질내, 수조내, 서혜부내, 방광내, 국소(예를 들어 분말, 연고 또는 점적제), 또는 코 경로에 의해 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 당해 분야에 공지된 다중 경로에 의해 투여할 수 있다. 그러나, 다수의 치료학적 용도를 위해서, 바람직한 투여 경로/방식은 비경구 투여(예를 들어 정맥내 주사, 피하 주사, 복강내 주사, 및 근육내 주사)이다. 당해 분야의 숙련가는 투여 경로/방식을, 기대하는 목적에 따라 변화시킬 수 있음을 이해한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여한다.

본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 수회 투여형, 예를 들어 액체, 반고체, 및 고체 형태, 예를 들어 용액(예를 들어 주사), 분산액 또는 현탁액, 정제, 분말, 과립, 유화액, 환제, 시럽, 분말, 리포솜, 캡슐 및 좌약으로 제조할 수 있다. 바람직한 투여형은 예상되는 투여 경로 및 치료학적 용도에 따라 변한다.

예를 들어, 하나의 바람직한 투여형은 주사이다. 상기와 같은 주사는 멸균 주사성 용액일 수 있다. 예를 들어, 멸균 주사성 용액을 하기의 방법에 의해 제조할 수 있다: 필요한 용량의 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 적합한 용매에 혼입시키고, 임의로 다른 예상되는 성분(비제한적으로 pH 조절제, 계면활성제, 항원보강제, 이온 강도 증대제, 등장화제, 보존제, 희석제 또는 이들의 임의의 조합 포함)을 동시에 혼입시키며, 이어서 여과 멸균을 수행한다. 또한, 멸균 주사성 용액을 보관 및 사용의 편의를 위해서 멸균 분말로 제조할 수 있다(예를 들어 진공 건조 또는 동결 건조에 의해). 상기와 같은 멸균 분말을 사용전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균의 발열원이 없는 수 중에 분산시킬 수 있다.

또 다른 바람직한 투여형은 분산액이다. 분산액을 하기의 방법에 의해 제조할 수 있다: 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 염기성 분산 매질 및 임의로 다른 예상되는 성분(비제한적으로 pH 조절제, 계면활성제, 항원보강제, 이온 강도 증대제, 등장화제, 보존제, 희석제 또는 이들의 임의의 조합 포함)을 포함하는 멸균 비히클 중에 혼입시킨다. 또한, 흡수 지연제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을, 예상되는 약동학적 성질을 획득하기 위해 분산액에 또한 혼입시킬 수 있다.

또 다른 바람직한 투여형은 캡슐, 정제, 분말, 과립 등을 포함한 경구 고체 투여형이다. 상기와 같은 고체 투여형은 일반적으로 (a) 불활성 약물 부형제(또는 비히클), 예를 들어 나트륨 시트레이트 및 칼슘 포스페이트; (b) 충전제, 예를 들어 전분, 락토스, 슈크로스, 만노스 및 규산; (c) 결합제, 예를 들어 카복시메틸 셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 슈크로스 및 아라비아 검; (d) 습윤제, 예를 들어 글리세롤; (e) 붕해제, 예를 들어 아가, 칼슘 카보네이트, 감자 또는 타피오카 전분; (f) 지연제, 예를 들어 올레핀; (g) 흡수 증대제, 예를 들어 4급 암모늄 화합물; (h) 보습제, 예를 들어 세틸 알콜 및 글리세릴 모노스테아레이트; (i) 흡착제, 예를 들어 카올린 및 벤토나이트; (j) 윤활제, 예를 들어 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 도데실 설페이트, 또는 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나를 포함한다. 정제 및 캡슐 투여형의 경우에, 완충제를 또한 포함할 수 있다.

또한, 방출률 변경제(즉 약물 방출률을 변화시킬 수 있는 작용제)를, 변형된 방출 또는 펄스화된 방출 투여형을 획득하기 위해 경구 고체 투여형에 또한 가할 수 있다. 상기와 같은 방출률 변경제는 비제한적으로 카복시프로필 메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 카복시메틸 셀룰로스 나트륨, 에틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 폴리에틸렌 옥사이드, 잔탄검, 이소아크릴 아미노 공중합체, 수소화된 풍미 오일, 카나우바 왁스, 파라핀, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 카복시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 메트아크릴산 공중합체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 변형된 방출 또는 펄스화된 방출 투여형은 방출률 변경제 중 하나 또는 그룹을 포함할 수 있다.

또 다른 바람직한 투여형은 유화액, 용액, 현탁액, 시럽 등을 포함한 경구 액체 투여형이다. 활성 성분 외에, 상기와 같은 경구 액체 투여형은 당해 분야에 통상적으로 사용되는 불활성 용매, 예를 들어 수 또는 다른 용매, 예를 들어 에틸 알콜, 이소프로판올, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일(예를 들어 면실유, 땅콩 오일, 옥수수 오일, 올리브 오일, 풍미 오일 및 참깨 오일), 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 및 솔비탄 지방산 에스테르, 및 이들의 임의의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 이들 불활성 용매 외에, 상기와 같은 경구 액체 투여형은 보습제, 유화제, 현탁제, 감미제, 풍미제, 향기제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 투여의 편의성을 위해서 약학 조성물 중에서 단위 투여형으로 존재할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 제조 및 보관 조건하에서 멸균성이고 안정성이어야 한다.

본 발명에 제공된 약제 및 약학 조성물을 단독으로 사용하거나 병용하거나, 또는 추가적인 약학적으로 활성인 작용제(예를 들어 다른 항바이러스제, 예를 들어 인터페론-유형 작용제, 예를 들어 인터페론 또는 페길화된 인터페론)와 함께 사용할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을, HBV 감염과 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하기 위해서, 다른 항바이러스제(들)와 함께 사용한다. 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 상기와 같은 항바이러스제(들)를 동시에, 별도로 또는 연속적으로 투여할 수 있다. 상기와 같은 항바이러스제(들)는 비제한적으로 인터페론-유형 작용제, 리바비린, 아다만탄, 하이드록시우레아, IL-2, L-12 및 펜타카복시 시토솔산 등을 포함한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"의 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. "예방학적 유효량"은 질병(예를 들어 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병)의 발생을 예방하거나, 억제하거나 또는 지연시키기에 충분한 양을 지칭한다. "치료학적 유효량"은 질병이 있는 환자에서 질병 및 그의 합병증을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 억제하기에 충분한 양을 지칭한다. 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 치료학적 유효량은 하기의 인자에 따라 변할 수 있다: 치료하고자 하는 질병의 중증도, 환자에서 면역계의 일반적인 상태, 환자의 일반적인 조건, 예를 들어 연령, 체중 및 성별, 약물의 투여 방식, 동시에 사용되는 추가적인 치료법 등.

최적의 목적하는 효과(예를 들어 치료학적 또는 예방학적 효과)를 제공하기 위해서 투여량 섭생을 조절할 수 있다. 예를 들어, 단일 용량을 투여하거나, 또는 수회 용량을 일정 기간내에 투여하거나, 또는 용량을 치료 상황의 긴급성이 가리키는 대로 비례적으로 감소시키거나 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 경우, 치료학적 또는 예방학적 유효량에 대한 예시적인 비제한적인 범위는 0.025 내지 50 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 0.1 내지 50 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 0.1 내지 25 ㎎/㎏, 0.1 내지 10 ㎎/㎏이다. 용량은 치료하고자 하는 질병의 유형 및 중증도에 따라 변할 수 있음을 알아야 한다. 또한, 당해 분야의 숙련가는 임의의 특정한 환자에 대해서, 특정한 투여량 섭생을 환자의 요구 및 의사에 의해 수행된 전문적인 평가에 따라 시간에 걸쳐 조절해야 하며; 여기에서 제공되는 용량 범위는 본 발명에 따른 약학 조성물의 용도 또는 범위를 한정한다기 보다는 단지 예시를 목적으로 제공될 뿐임을 이해한다.

발명의 이로운 효과

종래 기술과 비교하여, 본 발명의 기술적 해법은 하기의 이로운 효과를 갖는다:

(1) 본 발명의 항체는 HBsAg를 특이적으로 인식하고/결합하고 HBV의 독성을 중화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 피실험자에서 HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시킬 수 있으며, 생체내에서 HBV 및 HBV에 의해 감염된 세포를 유효하게 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 HBV 감염 및 HBV 감염과 관련된 질병, 예를 들어 B형 간염의 예방 및 치료에 사용가능하다.

(2) 본 발명의 항체(특히 인간화된 항체)는 모 원숭이 항체의 기능 및 성질을 유지하고, 따라서 HBV 감염 및 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)의 예방 및 치료에 사용가능할 뿐만 아니라; 면역원성 반응의 유발 없이 인간 피실험자에게 안전하게 투여될 수 있는 매우 높은 인간화 정도(98% 까지)를 갖는다. 따라서, 본 발명의 항체(특히 인간화된 항체)는 현저한 임상적 가치를 갖는다.

발명을 수행하기 위한 구체적인 모델

이제 본 발명을 하기의 실시예를 참조하여 기재할 것이며, 이들 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것이지, 제한하고자 하는 것은 아니다.

달리 명시되지 않는 한, 본 발명에 사용된 분자 생물학 실험 방법 및 면역분석은 기본적으로 문헌[J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 및 문헌[FM Ausubel et al., Guide to Editing Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995]을 참조하며; 제한 엔도뉴클레아제를 제조사의 권장 조건에 따라 사용한다. 당해 분야의 숙련가는 실시예가 본 발명을 예로서 예시하며 청구된 바와 같은 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아님을 알 것이다.

실시예 1: HBsAg에 특이적으로 결합하는 인간-시노몰구스 원숭이 키메릭 단클론 항체의 제조

1.1 시노몰구스 원숭이의 면역화

이전에 실험실에서 개발한 재조합 HBV 백신(재조합 백신은 중국특허출원 201710085194.3에 상세히 기재되어 있음)을 사용하여, 6개월이 넘은 4±1 ㎏ 체중의 시노몰구스 원숭이를 근육내 주사에 의해 면역화시켰으며, 주사 용량은 20 ㎍/원숭이/시간이었다. 면역화 시점은 각각 0, 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26주째였다. 시노몰구스 원숭이의 혈청 역가가 4번째 면역화 주사(10주)시에 안정기에 도달한 후에, 본 발명자들은 각각 13, 17, 25 및 29주째에(즉 각각의 면역화 후 3번째 주 및 다수의 기억 B 세포가 생성된 시간에) 시노몰구스 원숭이의 말초 혈액 10 ㎖/원숭이/시간을 샘플링하였다.

1.2 시노몰구스 원숭이 말초 혈액 단핵세포의 분리

시노몰구스 원숭이 말초 혈액 단핵세포의 분리를 SepMate^TM의 설명을 참조하여 수행하였다. SepMate^TM 튜브를 사용하여 인간 말초 전혈 및 제대혈 샘플로부터 밀도 구배 원심분리에 의해 단핵세포(MNC)를 분리하였다. 분리에 앞서 샘플, 2% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 PBS 완충제(PBS + 2% FBS), 밀도 구배 배지, 및 원심분리기를 실온(15℃ 내지 25℃)에서 보관하였다. 구체적인 단계는 하기와 같았다:

1) 밀도 구배 배지를 피펫을 사용하여 SepMate^TM 삽입물의 중심 구멍을 통해 SepMate^TM 튜브에 조심스럽게 가하였다. 밀도 구배 배지의 상단은 삽입물 위에 있어야 한다. 주: 밀도 구배 배지는 피펫 사용 후에 작은 기포를 생성시킬 수도 있으며, 이는 수행성능에 영향을 미치지 않을 것이다.

2) 샘플을 동 부피의 PBS + 2% FBS로 희석하고, 서서히 철저하게 혼합하였다.

3) SepMate^TM 튜브를 수직으로 유지시키고, 희석된 샘플을 피펫을 사용하여 튜브의 측면 아래로 가하였다. 샘플이 삽입물 위에서 밀도 구배 배지와 혼합될 것이다. 주: 샘플을 튜브의 측면 아래로 직접 부을 수 있었다. 주: 희석된 샘플을 중심 구멍을 통해 직접 부어서는 안 된다.

4) 원심분리기 브레이크를 멈출 필요 없이 실온에서 10분간 1200 × g에서 원심분리를 수행하였다. 주: 24시간을 초과하여 보관된 샘플의 경우, 20분의 원심분리 시간이 권장되었다.

5) 농축된 MNC를 함유한 상부 층을 새로운 튜브에 부었다. SepMate^TM 튜브를 2초 넘게 뒤집어진 위치로 놓아서는 안 된다. 주: 원심분리 후에, 일부 적혈구 세포(RBC)가 SepMate^TM 삽입물의 표면상에 나타날 수도 있으나, 이는 수행성능에 영향을 미치지 않았다.

6) MNC를 PBS + 2% FBS로 세척하였다. 세척을 1회 반복하였다. 주: 원심분리기 브레이크를 멈출 필요 없이 실온에서 8분간 1200 × g에서 원심분리하에 세포의 세척을 수행해야 한다.

1.3 기억 B 세포의 분리

시중에 시노몰구스 원숭이의 기억 B 세포를 분류하기 위한 특정한 시약이 없기 때문에, 그의 분리를 EasySep^TM 인간 범-B 세포 농축 키트를 사용하여 수행하였다.

1) 상기 1.2에 기재된 방법에 의해 분리된 PBMC 세포를 300 g에서 10분간 원심분리시키고 이어서 10 ㎖의 무혈청 1640 배양 배지로 1회 세척하였다.

2) 세척을 10 ㎖의 여과된 MACS 완충제로 1회 반복하였다.

3) 세포를 1 ㎖의 MACS 완충제에 재현탁시키고 이어서 5 ㎖ 폴리스티렌 환저 튜브로 옮겼다.

4) 50 ㎕/㎖의 EasySep^TM 인간 범-B 세포 농축 칵테일(EasySep^TM Human Pan-B Cell Enrichment Cocktail)을 세포에 가하였다.

5) 10분간 실온에서 인큐베이션한 후에, 75 ㎕/㎖의 EasySep^TM D 자기 입자(EasySep^TM D Magnetic Particles)를 세포에 가하였다.

6) MACS 완충제를 2.5 ㎖에 도달하도록 가하고 서서히 위아래로 혼합하였다.

7) 튜브를 5분간 자기 분리기상에 놓고, 이어서 목적하는 양성 세포를 새로운 튜브로 옮겼으며, 이러는 동안 원치않는 음성 세포는 원래의 튜브에 남아있었다.

1.4 시험관내 자극 및 배양

1.4.1 HEK293-CD154 조사

조사 용량은 40 Gy이었으며, 구체적인 실행 단계는 RS 2000 생물학적 X-선 조사기의 설명서에 기재되었다.

1.4.2 세포 도말

RPMI 1640 배지에 5 세포/웰로 재현탁된 세포를 50 ng/㎖의 IL21 및 10⁴ 세포/웰의 조사된 HEK293-CD154와 혼합한 후, 배양하여 96-웰 플레이트에서 250 ㎕/웰로 도말하였다. 세포를 CO₂ 배양기에서 37℃에서 인큐베이션하고 자극을 위해 14일 동안 배양하였다.

1.4.3 세포 배양 양성 웰 분석

HBsAg용의 상업적인 반응 플레이트(Beijing Wantai로부터 구입함)를 사용하였으며, 시험하고자 하는 상등액 100 ㎕를 각 웰에 가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, ELISA 플레이트를 PBST로 5회 세척한 후, 1:5000으로 희석한 GAH-HRP 100 ㎕를 가하여 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 이후, ELISA 플레이트를 PBST로 5회 세척하고, 기질 TMB 용액을 가하였다. 15분의 색상 발색 후에, 색상 발색 반응을 H₂SO₄로 정지시키고 OD450/620에서 판독을 측정하였다. RPMI 1640 배양 배지를 음성 대조용으로서 사용하였다.

1.5 B 세포의 항체 가변 영역 유전자의 획득

1.5.1 세포 처리

양성 B 세포용 배양 웰을 갖는 플레이트를 300 × g에서 5분간 원심분리하고, 세포 상등액을 흡출하였다. 150 ㎕의 용해 완충제(Beijing GenMagBio로부터 구입함)를 가하고, 수회 위 아래로 피펫팅하고, RNase가 없는 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 샘플을 냉장고에서 -80℃에서 1년 동안 보관할 수 있다.

1.5.2 RNA 추출

RNA 추출 방법은 바이러스 DNA/RNA 공-추출 키트(viral DNA/RNA co-extraction kit; GenMagBio)의 설명서에 기재되어 있다.

1) 10 ㎕의 프로테아제 K, 4 ㎕의 아크릴 담체, 300 ㎕의 용해 완충제 및 20 ㎕의 자기 비드(자기 비드를 사용 전에 위-아래로 뒤집거나 위 아래로 피펫팅함으로써 균일하게 혼합함)를 1.5 ㎖ 뉴클레아제가 없는(nuclease-free) 에펜도르프 튜브에 가하고; 200 ㎕의 샘플을 추가로 가하였으며, 균일하게 혼합하고 자기 비드와 핵산 사이에 충분한 결합이 가능하도록 각각의 원심분리 튜브를 실온에서 10분간 위 아래로 쉐이킹하였다.

2) 튜브를 자기 선반위에 1분간 놓아 원심분리기 튜브 중의 자기 비드를 흡수시켰으며, 튜브 중의 액체를 피펫에 의해 제거하고, 원심분리기 튜브를 꺼내었다.

3) 자기 비드를 500 ㎕의 세척 완충제 I을 가하여 재현탁시키고 자기 선반에 의해 흡착시켰으며, 튜브 중의 액체를 1분 후에 제거하고, 원심분리기 튜브를 꺼내었다.

4) 자기 비드를 500 ㎕의 세척 완충제 II를 가하여 재현탁시키고 자기 선반에 의해 흡착시켰으며, 튜브 중의 액체를 1분 후에 제거하고, 원심분리기 튜브를 동시에 자기 선반상에서 유지하여, 자기 비드를 연속적으로 흡착시켰다.

5) 가능한 한 많은 자기 비드가 세척되는 것을 피하는 방식으로 550 ㎕의 세척 완충제 III를 가하였으며; 튜브 중의 액체를 1분 후에 제거하고, 원심분리 튜브를 꺼내었다.

6) 50 ㎕의 용출 완충제를 가하여 자기 비드를 재현탁시키고; 55℃의 워터 베스(water bath)에서 5분간 수행하고, 워터 베스에서 핵산을 완전히 용출시키는 동안 가벼운 쉐이킹을 2회 수행하였다.

7) 원심분리기 튜브를 1분간 자기 선반상에 놓아 자기 비드가 흡착되게 하고, 액체를 새로운 1.5 ㎖ 뉴클레아제가 없는 원심분리기 튜브로 옮겼다.

1.5.3 B 세포의 항체 가변 영역에 대한 RT-PCR

역전사에 사용되는 프라이머(문헌[Meng W, Li L, Xiong W, et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single rhesus macaque antibody securing cells [C]// mAbs. Taylor & Francis, 2015, 7 (4): 707-718] 참조)를 표 2에 나타낸다.

시노몰구스 원숭이 항체 가변 영역 유전자에 대한 역전사 프라이머

프라이머 명칭	서열번호	프라이머 서열
Rh 감마-PCR1	61	5'GGACAGCCKGGAAGGTGTGC
Rh 카파-PCR1	62	5'GAGGCAGTTCCAGATTTCAA
Rh 람다-PCR1	63	5'CCGCGTACTTGTTGTTGCTCTGT

구체적인 단계는 하기와 같다:(1) 먼저 용액 I을 하기 제조법에 따라 제조하였다:

(2) 워터베스에서 75℃에서 5분간 유지시켰다.

(3) 신속히 아이스 베스에 넣어 5분간 유지시켰다.

(4) 이후 용액 II를 하기 제조법에 따라 제조하였다.

(5) 균일하게 혼합하고, 각각의 튜브에 5.2 ㎕를 가하였다.

(6) 균일하게 혼합하고, 역전사를 42℃ 워터베스에서 40분간 수행하였다.

(7) 패킹하고 보관하였으며, 단기간 사용되는 경우 -20℃에 두거나, 단기간 사용되지 않는 경우 -80℃에 두었다.

1.5.4 항체 가변 영역 유전자에 대한 증폭

B 세포 항체 H 쇄, κ 경쇄 및 λ 경쇄 가변 영역 유전자를 네스티드(nested) PCR에 의해 증폭시켰으며, 증폭 프라이머는 참고문헌에 기재되었고(Meng W, Li L, Xiong W, et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single rhesus macaque Antibody secreting cells [C]//mAbs. Taylor & Francis, 2015, 7(4): 707-718), 여기에서 벡터에 상동성인 네스티드 PCR의 두 번째 라운드를 위한 프라이머 중에 함유된 서열을 상동성 서열로서 본 발명자 실험실의 진핵생물 발현 벡터(실시예 1.5.5.1 참조)의 단편으로 교체하였다. PCR 반응 시스템을 표 3에 따라 제조하였으며, 각각의 시스템은 25 ㎕이었다. 역전사된 cDNA를 네스티드 반응의 첫 번째 라운드에서 주형으로서 사용하였으며, 반응 조건은 95℃, 5분; 95℃, 30초; 55℃, 60초; 72℃, 90초; 72℃, 7분이었고; 증폭 주기수(cycle)는 35였으며; 첫 번째 라운드의 증폭 생성물을 네스티드 반응의 두 번째 라운드에서 주형으로서 사용하였고, 반응 조건은 95℃, 5분; 95℃, 30초; 58℃, 60초; 72℃, 90초; 72℃, 7분이었으며; 증폭 주기수는 35였다. 이어서 증폭 생성물을 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석하고, 증폭 생성물을 DNA 정제 회수 키트(DNA purification recovery kit; TianGen, DP214-03)를 사용하여 회수하였다.

네스티드 PCR(Nested PCR) 반응 시스템

완충제	첫 번째 라운드 PCR의 부피(㎕)	두 번째 라운드 PCR의 부피(㎕)
DEPC 수	12.5 ㎕	15.5 ㎕
10ХPCR 완충제	2.5 ㎕	2.5 ㎕
2.5 mmol/L dNTP	2.5 ㎕	2.5 ㎕
HS Taq DNA 폴리머라제	0.5 ㎕	0.5 ㎕
F_mix	1 ㎕	1 ㎕
R_mix	1 ㎕	1 ㎕
주형	5 ㎕	2 ㎕

1.5.5 항체 유전자의 발현 및 정제1.5.5.1 진핵생물 발현을 위한 재조합 벡터의 구성

본 발명에서, 다량의 항체 재조합이 요구되며, 따라서 항체를 효율적으로 재조합할 수 있는 경쇄 및 중쇄 벡터의 세트를 구성하는 것이 필요하였다. 본 발명에서, 본 발명자 실험실의 기존의 진핵생물 발현 벡터 pTT5를, 이중 플라스미드의 동시-형질감염을 위한 경쇄 및 중쇄 재조합 벡터 세트를 구성하도록 특별히 변형시켰다. 경쇄 및 중쇄에 대한 신호 펩티드는 MGWSCIILFLVATATGVHS이다. 신호 펩티드의 하류를 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄 불변 영역을 암호화하는 서열과 연결시켜 항체 재조합을 촉진하기 위한 pTT5-CH, pTT5-Cκ 및 pTT5-Cλ 진핵생물 발현 벡터 세트를 구성하였다. 구성된 진핵생물 발현 벡터를 실험실-제조된(laboratory-made) 깁슨 조립 용액(Gibson assembly solution)을 사용함으로써 1.5.4에서 회수된 항체 가변 영역 유전자의 PCR 생성물(벡터와 상동성인 서열을 갖는 프라이머)과 결찰(ligation)시켜 재조합 벡터 VH+pTT5-CH, VH+pTT5-Cκ 및 VH+pTT5-Cλ를 수득하였다. 재조합 벡터를 E.coli DH5α 균주내로 형질전환시키고, LB 플레이트상에 도말하고, 배양기에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 단클론 콜로니를 플레이트로부터 채취하여 서열분석하고, 서열분석 결과를 Igblast를 사용하여 정렬시켜 유전자의 타당성을 확인하고 위유전자(pseudogene)는 제외시켰다.

1.5.5.2 항체 유전자의 소량 및 대량 발현

구성된 재조합 벡터 VH+pTT5-CH 및 VH+pTT5-Cκ 및 VH+pTT5-Cλ를 HEK293-세포내에 동시-형질감염시키고, 소량 발현용 이중 플라스미드를 24-웰 플레이트에 웰당 500 ㎕로 동시-형질감염시키고; 소량 발현 세포 상등액이 항원 활성을 갖는 경우, 형질감염 시스템을 100 ㎖ 까지(항체의 양에 따라)의 CHO-S 현탁액 세포(세포 밀도: 약 2 × 10⁶ 세포/㎖)로 규모 확대시켰다. 형질감염된 세포를 5% CO₂ 배양기에서 32℃에서 진탕 플라스크에서 배양하고, 상등액을 7일의 발현 후에 수집하였다.

1.5.5.3 항체 정제

세포 발현 상등액을 수집하고 제조사의 지시에 따라 단백질 A 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 정제하였다. 그의 구체적인 단계는 하기와 같았다: 수집된 세포 배양 상등액을 8000 rpm에서 10분간 원심분리하여 생성된 상등액을 유지시키고, 이의 pH를 건조 분말 형태의 Na₂HPO₄로 8.4로 조절한 후, 0.22 ㎛의 기공 크기를 갖는 필터 멤브레인을 통해 여과하였다. 단백질 A와 접합된 세파로스 4B 배지 10 ㎖을 컬럼에 충전하고, 컬럼을 AKTA Explorer 100 시스템에 연결하였다. 펌프 A를 0.2 M 이나트륨 수소 포스페이트(disodium hydrogen phosphate) 용액에 연결하고, 펌프 B를 0.2 M 시트르산 용액에 연결하였다. 검출 파장은 UV 280 ㎚이고, 유량은 5 ㎖/분이었으며, 펌프 A/B의 샘플 주사 비율을 조절하였다. 컬럼을 먼저 100% B(pH 2.3)로 세척하여 단백질 불순물을 제거하고, pH를 10% B(pH 8.0)로 균형을 맞추었으며, 검출 파장에서 신호는 안정화 후에 0으로 복귀하였고, 이어서 샘플을 로딩하였다. 통과 피크가 지나간 후에, 검출 파장의 신호가 0으로 감소되고 안정화될 때까지 10% B를 균형을 위해 사용하였으며, 70% B(pH 4.0)를 사용하여 용출을 수행하고, 용출 피크를 수집하였다. 용출 피크 샘플을 PBS 완충제 내로 투석하고 농도 분석 및 SDS-PAGE 분석을 수행하여 IgG 항체의 순도를 측정하였다.

실시예 2: HBsAg에 특이적으로 결합하는 시노몰구스 원숭이-인간 키메릭 단클론 항체의 성질 분석

HBsAg에 특이적으로 결합하는 3개의 시노몰구스 원숭이-인간 키메릭 단클론 항체(M1-23, M3-23 및 M3-13으로 명명됨)를 실시예 1의 방법에 따라 제조하였다. 3개 균주의 VH 및 VL 아미노산 서열을 하기 표에 나타낸다(서열번호 1 내지 5). 또한, 3개 항체 균주의 CDR 서열을 IMGT를 사용하여 측정하고, 이들 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 CDR의 아미노산 서열을 표 5에 나타낸다(서열번호 6 내지 20).

M1-23/M3-23/M3-13의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열

서열 명칭	서열번호	아미노산 서열
M1-23 VH	1	QVQLQESGPGLVKPSEILSVTCSVSGGSITSNFWSWIRQPPGKGLEWIGYISGSGTYTDYNPSLRSRVTLSVDTSKNQLSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGLRVTVSS
M1-23 VK	2	EIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISSSLNWYQQKPGKAPQLLIYYANRLESGVPSRFRGSGSGTEFTLTISSLQPEDFTTYYCQQYHSLPLTFGGGTKVEIK
M3-23 VH	3	QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGVSISSPYDWTWIRQPPGKGLEWIGRIHGNGGSTSYNPSLKNRVTISKDTSKNQFSLILSSVTAADTAVYYCVRDETWGQGVLVTVSS
M3-23 VK	4	DIQMSQSPDSLAVSLGERVTINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQAPKLLFYWASTRESGVPNRFSGSGSGTDFTLTIRGLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK
M3-13 VH	5	QVQLQESGPRLVKSSETLPLTCAVSGASNSSNYWSWIRQPPGKGLEWIGRIYGNSGSTDYNPSLKSRVSISTDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYFCARGSVYTYSWGQGVLVTVSS
M3-13 VK	4	DIQMSQSPDSLAVSLGERVTINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQAPKLLFYWASTRESGVPNRFSGSGSGTDFTLTIRGLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK

M1-23/M3-23/M3-13의 경쇄 및 중쇄의 CDR의 서열

M1-23
VH CDR1	GGSITSNF	서열번호 6
VH CDR2	YISGSGTYT	서열번호 7
VH CDR3	ARSHDYGSNDYAFDF	서열번호 8
VL CDR1	QDISSS	서열번호 9
VL CDR2	YAN	서열번호 10
VL CDR3	QQYHSLPLT	서열번호 11
M3-23
VH CDR1	GVSISSPYDW	서열번호 12
VH CDR2	IHGNGGST	서열번호 13
VH CDR3	VRDET	서열번호 14
VL CDR1	QSLLYSSNNKNY	서열번호 15
VL CDR2	WAS	서열번호 16
VL CDR3	QQHYTTPLT	서열번호 17
M3-13
VH CDR1	GASNSSNY	서열번호 18
VH CDR2	IYGNSGST	서열번호 19
VH CDR3	ARGSVYTYS	서열번호 20
VL CDR1	QSLLYSSNNKNY	서열번호 15
VL CDR2	WAS	서열번호 16
VL CDR3	QQHYTTPLT	서열번호 17

본 발명자들은 정제된 3개의 단클론 항체상에서 일련의 성질 분석을 수행하였다. 먼저, HBsAg에 대한 M1-23, M3-23 및 M3-13의 결합 능력을 ELISA에 의해 검출하였다. 10 ㎍/㎖로부터 출발하여 3배 농도 구배 희석을 수행하여 12개의 농도 구배를 획득하였다. 이후, 희석된 항체를 HBsAg용의 상업적인 반응 플레이트(Beijing Wantai로부터 구입함)에 가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음 PBST로 5회 세척하고 건조시켰다. 이후, GAH-HRP 효소-표지된 2차 항체를 가하고, 30분간 인큐베이션한 다음 PBST로 5회 세척하고 건조시켰다. 기질 TMB 용액을 가하였다. 15분의 색상 발색 후에, 색상 반응을 H₂SO₄로 정지시키고, 판독을 OD450/630에서 측정하였다. 결과를 도 1에 나타내며, 여기에서 M1-23, M3-23 및 M3-13 모두 양호한 항원-결합 활성을 갖는다.HBsAg SA 유형 에피토프(HBsAg aa113-135)를 인식하는 마우스 단클론 항체 6D11(중국특허출원 제 201610879693.5 호에 기재됨)에 의한 HBsAg에 대한 M1-23, M3-23 및 M3-13의 결합의 차단을 경쟁적 ELISA 방법에 의해 연구하였다. 경쟁적 ELISA 방법의 구체적인 단계에 대해서 실시예 4.2를 참조하시오. 도 2에 도시된 바와 같이, 결과는 마우스 mAb 6D11이 HBsAg에 대한 M1-23, M3-23 및 M3-13의 결합을 현저하게 차단하였음을 보였으며, 이는 M1-23, M3-23 및 M3-13 및 마우스 단클론 항체 6D11이 동일한 HBsAg SA 선형 에피토프를 인식함을 나타낸다.

동물에서 시노몰구스-인간 키메릭 항체의 바이러스 제거 능력을 HBV 트랜스제닉 마우스에서 평가하였다. 시노몰구스 원숭이-인간 키메릭 항체를 HBV 트랜스제닉 마우스(그룹당 6 HBV 트랜스제닉 마우스)에게 꼬리 정맥 주사에 의해 10 ㎎/㎏의 용량으로 단일 용량으로서 투여하였다. 이후, 마우스의 혈액을 후안와 정맥총으로부터 수집하고, 마우스의 혈청 중 HBsAg 수준 및 HBV DNA 수준의 변화를 측정하였다. 마우스 혈청 중 HBsAg 수준 및 HBV DNA 수준의 측정 방법은 실시예 5.1 및 5.2에서 알 수 있다. 결과는 M1-23, M3-23 및 M3-13(M1-23, M3-23의 결과를 도 3a 및 도 3b에 도시하였고; HBsAg에 대한 M3-13의 제거 결과를 도 7a 및 도 7b에 도시하였다)이 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병, 예를 들어 B형 간염의 치료에 가능성을 가짐을 나타내었다.

실시예 3: 항체 M1-23 및 M3-23의 인간화

인간 피실험자에게 투여된 이종 항체에 의해 야기된 면역원성을 감소시키기 위해서, 본 발명자들은 2개의 항체, M1-23 및 M3-23을 인간화시켰다. 시노몰구스 원숭이 및 인간의 면역글로불린간의 아미노산 서열의 높은 상동성으로 인해, 2개 항체 M1-23 및 M3-23의 경우, 2개의 항체를 인간 치료에 적합하게 만들기 위해서 단지 몇 개의 가변 영역 FR 아미노산을 인간 가변 영역 FR 서열 중의 상응하는 아미노산으로 교체시킬 것이 필요하다. 그러나, 항체는 주로 CDR을 통해 항원과 접촉하여 항원을 인식하지만, 항체의 FR 영역의 잔기 중 일부는 항원-항체 상호작용에도 관련될 수 있으며, 이에 의해 CDR의 입체 배열에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 마우스 항체의 FR 영역을 인간 항체의 FR 영역으로 교체 후에, 마우스 항체의 CDR의 입체 배열이 종종 변할 수 있으며, 이는 항원을 인식/결합하는 인간화된 항체의 친화성을 현저하게 감소시키고, 심지어 항원과 결합하는 인간화된 항체의 능력을 상실시킬 수 있다(Ge Yan, Development Strategy Analysis and Application Research of Humanized Antibodies [J]. Foreign Medical Sciences, Immunology, 2004, 27(5): 271). 따라서, M1-23 및 M3-23의 인간화 과정에서, 가변 영역 FR 서열 중 점 돌연변이의 위치 및 원래의 것과 교체될 수 있는 아미노산의 선택이 매우 중요하다.

실험적 경험과 함께 IMGT 정보 시스템(http://www.imgt.org)의 용도를 통해서, 그리고 다수의 분석 및 실험을 토대로, 본 발명자들은 뜻밖에도 인간 생식계열 유전자 서열 IGHV4-4*08(서열번호 40) 및 IGKV1-39*01(서열번호 41)이 M1-23의 인간화를 위한 주형으로서 특히 유리하고, IGHV4-4*02(서열번호 42) 및 IGKV4-1*01(서열번호 43)이 M3-23의 인간화를 위한 주형으로서 특히 유리함을 밝혀냈으며, 관련된 생식계열 유전자 서열을 하기 표 6에 나열하였다.

인간 생식계열 유전자의 아미노산 서열

생식계열 유전자	상응하는 서열의 명칭	서열번호	아미노산 서열
IGHV4-4*08	M1-23 VH	40	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYTSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR
IGKV1-39*01	M1-23 VK	41	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP
IGHV4-4*02	M3-23 VH	42	QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR
IGKV4-1*01	M3-23 VK	43	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP

생식계열 유전자 서열에 상응하게, 및 CDR에 가까운 FR 영역 중의 아미노산의 변화가 항원을 인식/결합하는 인간화된 항체의 친화성에 영향을 미칠 수도 있음을 고려하여, 본 발명자들은 2개 항체의 FR 영역을 변형시키고자, CDR 영역 부근의 아미노산은 유지시키면서 하기의 단일 점 돌연변이를 설계하였다. 인간화된 M1-23 및 M3-23을 각각 M1D 및 M3D라 명명하였다.

항체 M1-23의 FR 영역 중 아미노산 잔기의 단일 점 돌연변이

No.^※		원래 아미노산	인간화 후 아미노산	No.^※	원래 아미노산	인간화 후 아미노산
HFR1		LFR1
H17		I	T	L1	E	D
H20		V	L	L3	V	Q
H23	S		T	LFR2
HFR3		L45	Q	K
H64	R		K	LFR3
H69		L	I	L55	E	Q
H78		L	F	L63	R	S
HFR4		L70	E	D
H107		L	T	L84	T	A
H108		R	T

※: 상기 표에서 언급된 아미노산 위치를 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링한다.

항체 M3-23의 FR 영역 중 아미노산 잔기의 단일 점 돌연변이

No.^※	원래 아미노산	인간화 후 아미노산	No.^※	원래 아미노산	인간화 후 아미노산
HFR1			LFR1
H2	L	V	L3	Q	V
H16	E	G	L5	S	T
HFR2			L19	V	A
H37	I	V	LFR2
HFR3			L43	A	P
H65	N	S	LFR3
H71	K	V	L60	N	D
H73	T	K	L76	R	S
H81	I	K	L77	G	S
HFR4
H107	V	T

M1-23, M3-23의 FR 영역의 인간화를 위한 프라이머

프라이머 명칭	서열 번호	프라이머 서열
PTT5-1-23H-F	64	5'-AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTcaggtgcagctgcaggagtcaggcccag
1-23H-F1	65	5'-caggagtcaggcccaggactggtgaagccttcggagaCCCTGTCCCTCACCTGCAC
1-23H-F2	66	5'- aagccttcggagaCCCTGTCCCTCACCTGCACtgtctctggtggctccatc
1-23H-R1	67	5'-GTTCTTGGACGTGTCTACGGATATGGTGACTCGACTCTTGAGGGAGGGGTTGTAGT
1-23H-F3	68	5'- TCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTtctccctgaaactgagctc
PTT5-1-23H-R	69	5'-GATGGGCCCTTGGTCGACGCtgaagagacggtgacGGTGGTcccttggccccagaaatc
PTT5-1-23K2-F	70	5'- AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATACAGATGACGCAGTCTCCATCC
1-23K-R2	71	5'- CAGCAAAAACCGGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGC
1-23K2-R1	72	5'- GAACCTTGATGGGACCCCACTTTGCAAACGATTTGCATAATAGATCAGGAGC
1-23K2-R2	73	5'- CTGTCCCAGATCCACTGCCACTGAACCTTGATGGGACCCC
1-23K-F2	74	5'- GCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAACCTGAGG
1-23K-F3	75	5'- GCAGCCTGCAACCTGAGGATTTTGCAACTTATTACTGTCAAC
PTT5-1-23K-R	76	5'- GACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCAT
PTT5-3-23HV2-F	77	5'-AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCC
3-23HV2-R1	78	5'-ATTCCCGGGTagatgcccaGTAAAAGAGCAGCTTAGGAGGCTGTCCTGGTTTCTGCTG
3-23HV2-F1	79	5'-ggtgtctccatcagcagtccttatgacTGGACCTGGGTCCGCCAGCCCCCAGGGAAG
3-23HV2-R2	80	5'-AACTGGTTCTTGGACTTGTCTACTGAAATGGTGACTCGACTCTTGAGGGAGGGGTTG
3-23HV2-F2	81	5'- AGACAAGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGC
PTT5-3-23HV1-R	82	5'-gaaaccTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATC
PTT5-3-23KV1-F	83	5'- AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCC
3-23KV1-F1	84	5'-CCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGAGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAG
3-23KV2-R1	85	5'- CAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCTTTTACtgggcatctACCCGGGAAT
3-23KV1-R2	86	5'-GTGAAATCTGTCCCAGATCCACTGCCACTGAATCGGTCAGGGACCCCGGATTCCCGGGTagatgcc
3-23KV1-F2	87	5'- GGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATG
PTT5-3-23KV1-R	88	5'- ATGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCC

표 7 및 표 8에 나열된 단일 점 돌연변이에 따라, 관련된 프라이머를 설계하였다(표 9 참조). 상응하는 위치에서 모든 원래의 아미노산의 돌연변이를 PCR에 의해 수행하였으며, 여기에서 M1-23-H, M1-23-L, M3-23-H 및 M3-23-L을 주형으로서 별도로 사용하였다. 일례로서 M1-23 중쇄 가변 영역(M1-23-H)의 인간화를 고려하여, 올리고뉴클레오티드 프라이머 PTT5-1-23H-F, 1-23H-F1, 1-23H-F2, 1-23H-R1, 1-23H-F3 및 PTT5-1-23H-R(이들의 서열은 상기 표에 나타냄)을 설계하였다. PCR의 특정한 프로토콜은 하기와 같았다: M1-23-H를 암호화하는 유전자를 주형으로서 사용하였고, 프라이머 쌍 1-23H-F1/1-23H-R1 및 1-23H-F3/PTT5-1-23H-R을 증폭에 사용하여 각각 단편 1 및 단편 2를 수득하였으며; 단편 1을 주형으로서 사용하여, 프라이머 쌍 1-23H-F2/1-23H-R1을 증폭에 사용하여 단편 3을 수득하였고; 단편 3을 주형으로서 사용하여, 프라이머 쌍 PTT5-1-23H-F/1-23H-R1을 증폭에 사용하여 단편 4를 수득하였으며; 단편 4 및 단편 2를 중복 연장 PCR에 의해 함께 결찰시키고 이어서 PTT5-1-23H-F/PTT5-1-23H-R을 증폭에 상류 및 하류 프라이머로서 사용하여 인간화된 유전자 단편 M1D-H를 수득하였다.상기 방법에 따라, M1-23-L의 인간화된 유전자 단편 M1D-L, M3-23-H의 인간화된 유전자 단편 M3D-H, 및 M3-23-L의 인간화된 유전자 단편 M3D-L을 수득하였다.

수득된 바와 같은 인간화된 유전자 단편 M1D-H 및 M3D-H를 각각 실험실-제조된 깁슨 조립 액체를 사용하여, 진핵생물 발현 벡터 pTT5-CH와 결찰시키고, M1D-L 및 M3D-L을 각각 진핵생물 발현 벡터 pTT5-Cκ와 결찰시켜 재조합 벡터를 수득하였다. 재조합 벡터를 Escherichia coli DH5α 균주내로 형질전환시키고, LB 플레이트상에 도말하고, 37℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. 단클론 콜로니를 플레이트로부터 채취한 후, 서열분석하였다. 정확한 서열을 갖는 플라스미드를 선택하고, 항체의 발현 및 정제를 실시예 1의 방법에 따라 수행하였다.

인간화된 항체 M1D 및 M3D의 아미노산 서열을 표 11에 나타내었다. 또한, M1D 및 M3D의 인간화 정도를 하기 제조법에 따라 계산하였다. 하기 표 10에 나타낸 바와 같이, 2개 항체의 인간화 후에, 인간화 정도는 약 90%에서 약 98%까지 증가하였다.

인간화된 항체의 서열 분석

인간화 전		인간화 후
항체 명칭	인간화 정도	항체 명칭	인간화 정도
M1-23	90%	M1D	98.33%
M3-23	91.67%	M3D	97.78%

인간화 정도 = (FR 영역 중 아미노산의 수 - FR 영역 중에 유지된 원숭이-유래된 아미노산의 수)/FR 영역 중 아미노산 수 × 100%

항체 M1D, M3D의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열

상응하는 서열의 명칭	서열번호	아미노산 서열
M1D VH	57	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITSNFWSWIRQPPGKGLEWIGYISGSGTYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGTTVTVSS
M1D VK	58	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISSSLNWYQQKPGKAPKLLIYYANRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHSLPLTFGGGTKVEIK
M3D VH	59	QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGVSISSPYDWTWVRQPPGKGLEWIGRIHGNGGSTSYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVRDETWGQGTLVTVSS
M3D VK	60	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLFYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK

실시예 4: 인간화된 항체 M1D, M3D의 시험관내 결합 활성의 평가

4.1 항체의 항원 결합 활성의 측정

항원 HBsAg에 대한 인간화된 항체 M1D, M3D의 결합 활성을 ELISA 방법(효소-결합 면역흡착 분석)에 의해 조사하였다. 10 ㎍/㎖로부터 출발하여 3배 농도 구배 희석을 수행하여 12개의 농도 구배를 획득하였다. 인간화된 항체 162(중국특허출원 CN201610879693.5에 상세히 기재되어 있음)를 참조 항체로서 사용하였다. 후속적으로, 희석된 항체를 HBsAg용의 상업적인 반응 플레이트(Beijing Wantai로부터 구입함)에 가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음 PBST로 5회 세척하고 건조시켰다. 이후, GAH-HRP 효소-표지된 2차 항체를 가하고, 30분간 배양한 다음 PBST로 5회 세척하고 건조시켰다. 이후 기질 TMB 용액을 가하였다. 15분의 색상 발색 후에, 색상 반응을 H₂SO₄로 정지시키고, 판독을 OD450/630에서 측정하였다. 결과를 도 4에 나타내며, 여기에서 인간화된 항체 M1D 및 M3D 모두 탁월한 항원-결합 활성을 가졌고, 항원 HBsAg에 대한 이들의 친화성은 참조 항체 162의 경우보다 우수하였다. 상기 결과는 2개의 인간화된 항체가 매우 높은 인간화 정도(97% 초과)를 가졌을 뿐만 아니라, 그들의 모 항체의 항원-결합 활성을 실질적으로 유지하였고, 심지어 그들의 모 항체보다 양호한 항원 결합 활성을 나타냄을 가리켰다.

4.2 항체의 예비 에피토프 식별

본 발명자들은 항체에 대한 에피토프의 예비 식별을 수행하여, 선택된 인간-원숭이 키메릭 항체 및 인간화된 항체가 HBsAg 상의 SA 에피토프를 인식하는지의 여부도 측정하였다. 고농도의 SA 유형 에피토프를 인식하는 6D11을 사용하여, 시험하고자 하는 항체의 HBsAg에의 결합을 교차-차단하였으며, 여기에서 상당한 차단(경쟁) 효과가 존재한 경우, 시험하고자 하는 항체는 6D11과 동일한 에피토프를 인식하였다. 구체적인 단계는 하기와 같았다:

(1) 항체 농도의 측정 후에, 항체를 HBsAg용의 상업적인 ELISA 플레이트에 10 ㎍/웰로 가하고, 이어서 부피를 20% NBS로 50 ㎕까지 만들고, 배양을 37℃에서 30분간 수행하였다.

(2) ED-11로 1:20000 희석한 6D11-HRP를 ELISA 플레이트에 50 ㎕/웰로 가하고, 37℃에서 30분간 배양하였다.

(3) 플레이트를 PBST로 5회 세척하고, 건조시켰다.

(4) 기질 TMB 용액을 가하고, 15분의 색상 발색 후에, 색상 반응을 H₂SO₄로 종결시켰다.

(5) 판독을 OD450/630에서 측정하였다.

결과를 도 5에 나타내었으며, 여기에서 162를 상기 실험에서 양성 대조용으로서 사용하였다. HBsAg에 대한 M1D, M3D의 결합은 마우스 항체 6D11에 의해 경쟁될 수 있었으며, 경쟁 효과는 양성 대조용 162 및 모 항체 M1-23, M3-23의 효과에 필적하였다. 상기 결과는 인간화된 항체 M1D, M3D가 또한 SA 에피토프를 인식함을 나타내었다.

4.3 항체의 중화 활성의 측정

본 발명자들은 HBV 감염(100 MOI의 HBV 감염 역가를 갖는)을 중화시키는 항체의 능력을 평가하기 위해서 실험실-제조된 세포 모델 HepaG2-NTCP를 사용하였다. 일정량의 HBV 및 구배-희석된 항체를 HepaG2 세포에서 공-배양하였으며, HBV는 분화된 HepaG2 세포를 칩입하여 세포에서 복제할 수 있었다. 상이한 항체의 첨가 및 첨가된 항체량의 변화와 함께, HBV의 침입 및 복제가 상이한 정도로 약화되거나 억제되었으며, 따라서 상이한 수준의 HBV 항원(HBeAg)이 세포 상등액 중에 존재하였을 것이다. 따라서, HBV 항원(HBeAg)의 수준을 측정함으로써, HBV를 중화시키는 상이한 인간화된 항체의 능력을 측정할 수 있었다.

인간화된 항체를 2배 구배로 희석하고 162 항체를 양성 대조용으로서 사용하였다. 10 ㎍/㎖로부터, 총 18개의 희석 구배를 만들었다. 바이러스 감염 시스템을 항체와 별도로 혼합하고 1시간 동안 예비-배양하였다. 이어서, 상기를 HepaG2로 예비-도말한 세포 플레이트에 가하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 배지를 2일마다 신선한 것으로 교체하였다. 감염후 7일째에, 세포 배양 상등액을 채취하여 HBeAg의 수준을 측정하였다. 측정 방법은 하기 단계를 포함하였다:

(1) 반응 플레이트의 제조: 항-HBeAg 단클론 항체를 20 mM PB 완충제(Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ 완충제, pH 7.4)로 2 ㎍/㎖로 희석하였다. 희석된 항-HBeAg 단클론 항체(100 ㎕/웰)를 96-웰 화학발광 플레이트에 가하고 37℃에서 2시간 동안 및 이어서 4℃에서 밤새 배양하였다. 사용된 원료 물질을 Beijing Wantai Biological Pharmaceutical Co., Ltd로부터 구입하였다. 96-웰 화학발광 플레이트를 PBST로 1회 세척하고 건조시켰다. 차단 용액(blocking solution)을 200 ㎕/웰로 96-웰 화학발광 플레이트에 가하고, 37℃에서 2시간 동안 차단하였다. 이후, 차단 용액을 버리고, 플레이트를 건조한 방에 두고 건조시키고, 사용시까지 2 내지 8℃에서 보관하였다.

(2) 배양: 100 ㎕/웰의 시험하고자 하는 샘플을 상기 제조된 반응 플레이트에 가하고, 37℃에서 60분 동안 배양하였다.

(3) 세척: 96-웰 화학발광 플레이트를 PBST로 5회 세척하고 건조시켰다.

(4) 배양: 양고추냉이 퍼옥시다제-표지된 항-HBeAg 항체(100 ㎕/웰)를 가하고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 원료 물질을 Beijing Wantai Biological Pharmaceutical Co., Ltd로부터 구입하였다.

(5) 세척: 96-웰 화학발광 플레이트를 PBST로 5회 세척하고 건조시켰다.

(6) 색상 발색: 루미놀 화학발광 시약(100 ㎕/웰)을 가하였다.

(7) 판독 플레이트: 값을 화학발광 미세플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.

실험 결과를 도 6a 및 도 6b에 나타내었으며, 이는 HBV에 대한 M1D의 중화 활성이 참조 항체 162의 활성에 필적함을 가리켰다.

실시예 5: 인간화된 항체 M1D, M3D의 치료학적 효과의 측정

상기 5개 항체를 HBV 트랜스제닉 마우스에게 10 ㎎/㎏의 단일 용량으로 별도로 투여하였으며, 각각의 그룹은 6개의 HBV 트랜스제닉 마우스를 함유하였다. 이후, 혈액을 마우스의 후-안와 정맥총으로부터 수집하고, 마우스의 혈청 중 HBsAg 수준 및 HBV DNA 수준의 변화를 측정하였다.

5.1 HBsAg의 정량적인 측정

(1) 반응 플레이트의 제조: 마우스 단클론 항체 HBs-45E9를 20 mM PB 완충제(Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ 완충제, pH 7.4)로 2 ㎍/㎖로 희석하고, 코팅 완충제를 100 ㎕/웰로 화학발광 플레이트에 가하였다. 플레이트를 6℃ 내지 8℃에서 16-24시간 동안 그리고 이어서 37℃에서 2시간 동안 코팅한 다음, PBST 세척액으로 1회 세척하고 건조시켰다. 세척 후에, 200 ㎕의 차단 용액을 각 웰에 가하고 차단을 37℃에서 2시간 동안 수행하였다. 이어서, 차단 용액을 버리고, 플레이트를 건조한 방에 두고 건조시키고, 사용시까지 2℃ 내지 8℃에서 보관하였다.

(2) 샘플 희석: 수집된 마우스 혈액을 후속의 정량적인 검출을 위해 20% NBS(갓난 소 혈청)를 함유하는 PBS 용액으로 1:30 및 1:150의 2개의 구배로 희석하였다.

(3) 샘플의 변성 처리: 상기 희석된 혈청 샘플 15 ㎕를 7.5 ㎕의 변성 완충제(15% SDS, 20 mM PB7.4에 용해됨)과 철저히 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어서 90 ㎕의 중화 완충제(4% CHAPS, 20 mM PB7.4에 용해됨)를 가하고 충분히 혼합하였다.

(4) 샘플 반응: 100 ㎕의 상기 변성된 혈청 샘플을 반응 플레이트에 가하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어서 반응 플레이트를 PBST로 5회 세척하고 건조시켰다.

(5) 효소 표지 반응: HBs-A6A7-HRP 반응 용액(100 ㎕/웰)을 화학발광 플레이트에 가하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어서 플레이트를 PBST로 5회 세척하고 건조시켰다.

(6) 발광 반응 및 측정: 발광 액체(100 ㎕/웰)를 화학발광 플레이트에 가하고, 광 강도 측정을 수행하였다.

(7) 마우스 혈청 샘플 중 HBsAg 농도의 계산: 표준 샘플에 대해 병행 실험을 수행하였으며, 표준 곡선을 표준 샘플의 측정 결과를 근거로 작성하였다. 이어서, 마우스 혈청 샘플의 광 강도 값을 표준 곡선에 삽입하여, 시험하고자 하는 혈청 샘플 중의 HBsAg 농도를 계산하였다.

5.2 HBV DNA의 정량적인 측정

HBV DNA의 정량적인 측정을 HBV DNA 실시간 형광 정량측정 키트(키트를 Shanghai Kehua Bioengineering Co., Ltd.로부터 구입함)의 지시에 따라 수행하였다.

본 실시예에서, 동물 중의 인간화된 항체 M1D, M3D, 시노몰구스-원숭이 키메릭 항체 M3-13, 및 참조 항체 162의 바이러스 제거 능력을 측정하였다. 결과를 도 7a 및 도 7b에 도시하였다. 결과는 인간화된 항체 M1D, M3D 및 시노몰구스 원숭이-인간 키메릭 항체 M3-13이 양호한 바이러스 제거 능력을 가지며, 동물에서 HBsAg 및 HBV DNA를 제거하는 그들의 능력이 참조 항체 162의 능력보다 양호함을 보였다.

상기 결과는 본 발명의 인간화된 항체가 매우 높은 인간화 정도(98%까지)를 가져서, 면역학적 거부의 가능성을 감소시켰을 뿐만 아니라, 원숭이-인간 키메릭 항체의 경우와 동등하고 참조 항체 162의 경우보다 우수한 바이러스 제거 능력을 나타냄을 입증하였다. 상기와 같은 기술적 효과는 현저하였으며 예측되지 않은 것이었다.

실시예 6: 인간화된 항체 M1D, M3D의 중요하지 않은 CDR 영역의 측정

항체 가변 영역 도메인에서, 항원에 직접 결합하는 부위는 주로 CDR 영역 중에 있으나, 다수의 연구는 항체의 6개 CDR이 모두 항원-항체 결합에 중요한 영역은 아니며, 중요하지 않은 CDR 영역을 CDR 교체 방법에 의해 측정할 수 있음을 보였다. 본 발명에서, 원래 CDR에 대한 교체 서열을 최적 합치 원리에 따라 선택하였다. 인간화된 항체 M1D 및 M3D의 VH 및 VL 아미노산 서열을 IMGT 정보 시스템의 검색 박스에 입력하고, 이어서 생식계열 유전자 중의 항체 경쇄 및 중쇄의 상응하는 아미노산 서열을 시스템에 의해 검색하였다. FR 영역이 최고의 상동성을 가졌으며 CDR 영역 서열이 최대의 차이를 가졌다는 원리에 따라, 2개의 교체 서열을 중쇄 CDR3를 제외하고, 인간화된 항체 중의 각각의 CDR 영역에 대해 선택하였다. 교체 서열을 하기 표에 나타낸다:

인간화된 항체 M1D, M3D에대한 CDR 교체 서열

번호	원래 CDR	교체 CDR-A	교체 CDR-A 생식계열 유전자	교체 CDR-B	교체 CDR-B 생식계열 유전자
M1D-H-CDR1	GGSITSNF	GGSISSYY	IGHV4-4*08	GGSVSSGSYY	IGHV4-61*01
M1D-H-CDR2	ISGSGTYT	IYTSGST	IGHV4-4*08	ISSSSSYT	IGHV3-11*03
M1D-L-CDR1	QDISSS	QSVSSSY	IGKV3D-7*01	SSNIGSNT	IGLV1-44*01
M1D-L-CDR2	YAN	AAS	IGKV1-39*01	KAS	IGKV1-5*03
M1D-L-CDR3	QQYHSLPLT	LQDYNYPLT	IGKV1-6*01	HQSSSLPLT	IGKV6-21*02
M3D-H-CDR1	GVSISSPYDW	GGSISSGGYS	IGHV4-30-4*07	GGSISSSNW	IGHV4-4*01
M3D-H-CDR2	IHGNGGST	IYHSGST	IGHV4-4*02	ISGSGGST	IGHV3-23*02
M3D-L-CDR1	QSLLYSSNNKNY	QSLLHSDGKTY	IGKV2-29*02	QSVSSSY	IGKV3D-7*01
M3D-L-CDR2	WAS	LGS	IGKV2-28*01	GAS	IGKV3-15*01
M3D-L-CDR3	QQHYTTPLT	QQYYSTPWT	IGKV4-1*01	MQALQTPWT	IGKV2-28*01

관련된 프라이머를 상기 표에 기재된 CDR 교체 서열에 따라 설계하였으며, M1D 및 M3D 항체 중 상응하는 CDR 영역을 PCR 방법에 의해 교체하였다. 설계된 바와 같은 프라이머를 하기 표에 나타내었다. 일례로서 M1D 중쇄 가변 영역 CDR1(M1D-HCDR1)의 첫 번째 치환(M1D-H-CDR1-A)을 고려하여, 올리고뉴클레오티드 프라이머 M1D-H-CDR1-A R 및 M1D-H-CDR1 F를 설계하고(서열을 하기 표에 나타내었다), CDR의 상기 교체 후의 항체를 M1D HCDR1-1이라 명명하였다. 다른 교체 항체의 명명을 같은 방식으로 수행할 수 있었다. PCR의 구체적인 프로토콜은 하기와 같았다: M1D-H의 암호화 유전자를 주형으로서 사용하였으며, 프라이머 쌍 pTT5-M1D-HF/M1D-H-CDR1-A R 및 M1D-H-CDR1-A F/pTT5-M1D-HR을 증폭에 사용하여 각각 상류 및 하류 단편을 수득하였고; 단편을 중복 연장 PCR에 의해 함께 결찰하고, 이어서 상류 및 하류 프라이머로서 pTT5-M1D-HF/pTT5-M1D-HR로 증폭시켜 M1D의 HCDR1이 교체된 유전자 단편을 수득하였다.

CDR 교체를 위한 프라이머 서열

프라이머 명칭	서열번호	프라이머 서열
pTT5-M1D-H-F	89	5'- AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCAGGC
pTT5-M1D-H-R	90	5'- GATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAAGAGACGGTGAC
pTT5-M1D-L-F	91	5'- AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATACAGATGACGCAGTC
pTT5-M1D-L-R	92	5'- ATGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC
M1D- H-CDR1-1 R	93	5'- GTAGTAACTACTGATGGAGCCACCAGAGACAGTGCAGGTGAG
M1D- H-CDR1-1 F	94	5'- GgtggctccatcagtagttactacTGGAGCTGGATCCGCCAG
M1D- H-CDR1-2 R	95	5'- ATAGTAACTACCACTGCTGACGGAGCCACCAGAGACAGTGCAGGTGAG
M1D- H-CDR1-2 F	96	5'- GgtggctccgtcagcagtggtagttactATTGGAGCTGGATCCGCCAG
M1D- H-CDR2-1 R	97	5'- GGTGCTCCCACTGGTATAGATATACCCAATCCACTCCAG
M1D- H-CDR2-1 F	98	5'- AtctataccagtgggagcaccGACTACAACCCCTCCCTC
M1D- H-CDR2-2 R	99	5'- TGTGTAACTACTACTACTACTAATATACCCAATCCACTCCAG
M1D- L-CDR2-2 F	100	5'- AttagtagtagtagtagttacacaGACTACAACCCCTCCCTC
M1D- L-CDR1-1 R	101	5'- GTAGCTGCTGCTAACACTCTGAGTTGCCCGGCAAGTGATGG
M1D- L-CDR1-1 F	102	5'- CagagtgttagcagcagctacTTAAATTGGTATCAGC
M1D- L-CDR1-2 R	103	5'- AGTATTACTTCCGATGTTGGAGCTAGTTGCCCGGCAAGTGATGG
M1D- L-CDR1-2 F	104	5'- AgctccaacatcggaagtaatactTTAAATTGGTATCAGC
M1D- L-CDR2-1 R	105	5'- GACCCCACTTTGCAAACGGGATGCAGCATAGATCAGGAGCTTAGG
M1D- L-CDR2-1 F	106	5'- CCTAAGCTCCTGATCTATGctgcatccCGTTTGCAAAGTGGGGTC
M1D- L-CDR2-2 R	107	5'- GACCCCACTTTGCAAACGAGACGCCTTATAGATCAGGAGCTTAGG
M1D- L-CDR2-2 F	108	5'- CCTAAGCTCCTGATCTATAaggcgtctCGTTTGCAAAGTGGGGTC
M1D- L-CDR3-1 R	109	5'- AGTGAGAGGGTAATTGTAATCTTGTAGACAGTAATAAGTTGCAAAATC
M1D- L-CDR3-1 F	110	5'- CtacaagattacaattaccctCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAG
M1D- L-CDR3-2 R	111	5'- AGTGAGAGGTAAACTACTACTCTGATGACAGTAATAAGTTGCAAAATC
M1D- L-CDR3-2 F	112	5'- catcagagtagtagtttacctCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAG
pTT5-M3D-H-F	113	5'-AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCG
pTT5-M3D-H-R	114	5'- GATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCAG
pTT5-M3D-L-F	115	5'- AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATCGTGATGACCCAGTCTC
pTT5-M3D-L-R	116	5'- ATGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTC
M3D- H-CDR1-1 R	117	5'-GGAGTAACCACCACTGCTGATGGAGCCACCAGAGACAGCGCAGGTGAGGGACAG
M3D- H-CDR1-1 F	118	5'- ggtggctccatcagcagtggtggttactccACCTGGGTCCGCCAGCCC
M3D- H-CDR1-2 R	119	5'- CCAGTTACTACTGCTGATGGAGCCACCAGAGACAGCGCAGGTGAGGGACAG
M3D- H-CDR1-2 F	120	5'- GgtggctccatcagcagtagtaactggACCTGGGTCCGCCAGCCC
M3D- H-CDR2-1 R	121	5'- GGTGCTCCCACTATGATAGATTCGTCCAATCCACTCCAG
M3D- H-CDR2-1 F	122	5'- AtctatcatagtgggagcaccAGCTACAACCCCTCCCTCAAG
M3D- H-CDR2-2 R	123	5'- TGTGCTACCACCACTACCACTAATTCGTCCAATCCACTCCAG
M3D- L-CDR2-2 F	124	5'- attagtggtagtggtggtagcacaAGCTACAACCCCTCCCTCAAG
M3D- L-CDR1-1 R	125	5'-ATAGGTCTTTCCATCACTATGCAGGAGGCTCTGGCTGGACTTGCAGTTGATGGTGGC
M3D- L-CDR1-1 F	126	5'-cagagcctcctgcatagtgatggaaagacctatTTAGCCTGGTACCAGCAGAAAC
M3D- L-CDR1-2 R	127	5'- GTAGCTGCTGCTAACACTCTGGCTGGACTTGCAGTTGATGGTGGC
M3D- L-CDR1-2 F	128	5'- CagagtgttagcagcagctacTTAGCCTGGTACCAGCAGAAAC
M3D- L-CDR2-1 R	129	5'- GGGACCCCGGATTCCCGGGTAGAACCCAAGTAAAAGAGCAGCTTAGGAGG
M3D- L-CDR2-1 F	130	5'- CCTCCTAAGCTGCTCTTTTACTtgggttctACCCGGGAATCCGGGGTCCC
M3D- L-CDR2-2 R	131	5'- GGGACCCCGGATTCCCGGGTGGATGCACCGTAAAAGAGCAGCTTAGGAGG
M3D- L-CDR2-2 F	132	5'- CCTCCTAAGCTGCTCTTTTACGgtgcatccACCCGGGAATCCGGGGTCCC
M3D- L-CDR3-1 R	133	5'- CGTCCAAGGAGTACTATAATATTGCTGACAGTAATACACTGCCACATC
M3D- L-CDR3-1 F	134	5'- CagcaatattatagtactccttggacgTTCGGCCAAGGGACCAAG
M3D- L-CDR3-2 R	135	5'- CGTCCAAGGAGTTTGTAGAGCTTGCATACAGTAATACACTGCCACATC
M3D- L-CDR3-2 F	136	5'- AtgcaagctctacaaactccttggacgTTCGGCCAAGGGACCAAG

상기 방법에 따라, 수득된 CDR 교체를 갖는 중쇄의 유전자 단편을 진핵생물 발현 벡터 pTT5-CH에 별도로 결찰시키고, 이어서 CDR 교체가 없는 상응하는 경쇄의 발현 벡터와 HEK293-세포내로 소량으로 동시-형질감염시키고, 소량 발현의 세포 상등액의 항원 활성을 측정하였다. 유사하게, 수득된 CDR 교체를 갖는 경쇄의 유전자 단편을 진핵생물 발현 벡터 pTT5-Cκ에 별도로 결찰시키고, 이어서 CDR 교체가 없는 상응하는 중쇄의 발현 벡터와 동시-형질감염시키고, 형질감염 상등액의 항원-결합 활성을 측정하였다.인간화된 항체의 몇몇 CDR 영역을 교체한 후에, 상응하는 세포 형질감염 상등액이 항원-결합 활성을 보이지 않거나 또는 항원-결합 활성의 현저한 감소를 보인 경우, 교체된 CDR 영역이 항체-항원 결합에 중요한 CDR 영역이라는 결론을 내릴 수 있었으며; 상응하는 세포 형질감염 상등액이 교체 후에 실질적으로 변하지 않은 항원-결합 활성을 보인 경우, 교체된 CDR 영역은 항체-항원 결합에 중요한 영역이 아니었다.

M1D에 대한 교체 결과를 도 8a 내지 도 8e에 도시하였다. M1D의 중쇄 CDR1(M1D-H-CDR1) 및 경쇄 CDR2(M1D-L-CDR2)의 교체 후에, HBsAg에 대한 항원-결합 활성은 실질적으로 변하지 않았으며; 중쇄 CDR2 및 경쇄 CDR1의 교체 후에, 항원-결합 활성이 현저하게 감소하였고; 경쇄 CDR3의 교체 후에, 항원-결합 활성은 완전히 상실되었다. 상기 결과는 항체 M1D의 HCDR1 및 LCDR2가 항원 HBsAg에의 결합에 중요한 CDR 영역이 아니며, 그의 교체는 항체의 항원에 대한 결합 활성에 영향을 미치지 않음을 나타내었다.

M3D에 대한 교체 결과를 도 9a 내지 도 9e에 도시하였다. M3D의 중쇄 CDR2(HCDR2) 및 경쇄 CDR2(LCDR2)의 교체 후에, 항원-결합 활성은 실질적으로 변하지 않았으며; 경쇄 CDR1의 교체 후에, 하나의 교체(M3D-LCDR1-1)가 항원-결합 활성의 현저한 감소를 보인 반면, 다른 교체(M3D-LCDR1-2)는 항원-결합 활성을 실질적으로 보이지 않았으며; 중쇄 CDR1(HCDR1) 및 경쇄 CDR3(LCDR3)의 교체 후에, 항원-결합 활성은 실질적으로 존재하지 않았다. 상기 결과는 항체 M3D의 HCDR2 및 LCDR2가 항원 결합에 중요한 CDR 영역이 아니며, 그의 교체는 항체의 항원에 대한 결합 활성에 영향을 미치지 않음을 나타내었다.

실시예 7: 항원에의 결합에 대한 인간화된 항체 M1D, M3D 중의 중요한 아미노산의 측정

항체-항원 상호작용에 중요한 아미노산 부위를 결정하기 위해서, 본 발명자들은 M1D의 4개의 CDR 영역 HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR3, 및 M3D의 4개의 CDR 영역 HCDR1, HCDR3, LCDR1, LCDR3상에서 알라닌 스캐닝을 수행하였다. 일반적으로, 중요한 아미노산은 다소 보존되며, 항체의 입체형태를 유지하는 아미노산 잔기 및 예로서 내부에 묻힌(buried) 아미노산 잔기를 고려하여, 이들 아미노산의 알라닌으로의 돌연변이는 항체가 불활성이 되게 할 것이다. 돌연변이된 항체를 Elisa 방법에 의해 HBsAg에 대한 결합-활성에 대해 시험하였으며 돌연변이후 항체의 rEC50을 계산하였고(WT/돌연변이, 원래 항체 EC50의 상대적인 값은 1이었고, 0은 결합 활성이 완전히 상실되었음을 나타낸다), 여기에서 D, E, R, H, L, W 및 Y와 같은 아미노산 잔기를 포함하여, 돌연변이후 rEC50<0.2(즉 활성이 5배까지 감소되었다)를 갖는 것은 청색 색상으로 표시되었다. 결과를 표 14에 나타내었다. 산성 아미노산 D, E 및 염기성 아미노산 R 및 H는 항체가 항원에 결합할 때 염 가교를 형성할 수 있고, 이에 의해 항체-항원 결합 반응에서 중요한 역할을 할 수 있었으며, 따라서 이들 아미노산의 알라닌으로의 돌연변이는 이온 결합의 형성을 파괴할 것이고, 항체-결합 활성을 현저하게 감소시킬 것이다. 지방족 아미노산 L은 소수성 아미노산이었고, W 및 Y는 방향족 아미노산이었으며, 이들은 항체 입체형태의 유지에 중요한 역할을 하였다. 이들 중에서, M1D의 H56Y, H97D, H100cD, H100dL, 94L, L96L의 알라닌으로의 돌연변이는 활성의 현저한 감소를 생성시켰고, 따라서 이들은 변화되어서는 안 되는 부위였고; M3D의 H33Y, H34D, H35W, H94R, H95D, H101E, L27dY, L32Y, L91H의 알라닌으로의 돌연변이는 활성의 현저한 감소를 생성시켰고, 따라서 이들은 변화되어서는 안 되는 부위였다.

실시예 8: M1D 및 M3D에 의해 인식된 코어 에피토프의 식별

M1D 및 M3D는 SA 선형 에피토프를 인식하였다. 2개 항체에 의해 인식된 코어 에피토프를 추가로 측정하기 위해서, 본 발명자들은 HBsAg의 aa113-135(서열번호 168)에서 단일 점 돌연변이를 수행하였고 하기 표에 나타낸 바와 같이 14개의 폴리펩티드를 합성하였다. 폴리펩티드를 플레이트 코팅을 위해 CB, 100 ng/㎖로 희석하고, 항체를 20% NBS 용액으로 1000 ng/㎖로 희석한 후, 3배 희석을 수행하여 12개의 구배를 획득하였다. 상이한 단일 점 돌연변이체를 갖는 폴리펩티드에 대한 항체의 결합 활성을 Elisa 방법에 의해 측정하였으며, 결합 곡선을 PRISM 소프트웨어를 사용하여 작성하였다. 돌연변이후 결합 활성이 상실된 경우, 돌연변이 부위는 SA 선형 에피토프에 중요한 아미노산이었다.

SEQ13-B를 기본으로 하는 점 돌연변이 펩티드 서열

폴리펩티드의 명칭	서열번호	서열
SEQ13-B（aa113-135）	168	SSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFP
S13-S117A	169	SSTTATGPCKTCTTPAQGTSMFP
S13-T118A	170	SSTTSAGPCKTCTTPAQGTSMFP
S13-G119A	171	SSTTSTAPCKTCTTPAQGTSMFP
S13-P120A	172	SSTTSTGACKTCTTPAQGTSMFP
S13-C121S	173	SSTTSTGPSKTCTTPAQGTSMFP
S13-K122A	174	SSTTSTGPCATCTTPAQGTSMFP
S13-T123A	175	SSTTSTGPCKACTTPAQGTSMFP
S13-C124S	176	SSTTSTGPCKTSTTPAQGTSMFP
S13-T125A	177	SSTTSTGPCKTCATPAQGTSMFP
S13-T126A	178	SSTTSTGPCKTCTAPAQGTSMFP
S13-P127A	179	SSTTSTGPCKTCTTAAQGTSMFP
S13-Q129A	180	SSTTSTGPCKTCTTPAAGTSMFP
S13-T131A	181	SSTTSTGPCKTCTTPAQGASMFP
S13-S132A	182	SSTTSTGPCKTCTTPAQGTAMFP

M1D, M3D 및 참조 항체 162의 상기 단일 점 돌연변이 폴리펩티드에의 결합의 EC50 값을 하기 표 16에 요약하였다(>500은 결합 활성의 완전한 상실을 가리켰다). 결과로부터, 162 결합에 대한 코어 에피토프는 CKTC(aa121-124)인 반면, M1D 결합에 대한 코어 에피토프는 TGPCKTCT(aa118-124)였고, 이는 참조 항체 162에 대한 경우보다 더 길었고 aa113-135에 비해 순방향 위치로 있었으며; M3D 결합에 대한 코어 에피토프는 CKTCT(aa121-125)이었고, 이는 162의 경우에 비해 역방향 위치로 있었다.

M1D, M3D의, HBsAg(aa113-135)를 기본으로 하는 단일 점 돌연변이 폴리펩티드에의 결합에 대한 EC50 값

EC50(ng/mL)
폴리펩티드의 명칭	162	M1D	M3D
SEQ13-B	39.8	58.1	33.34
S13-S117A	31.1	32.5	33.93
S13-T118A	31.4	>500	37.42
S13-G119A	38.5	>500	41.7
S13-P120A	53.6	>500	67.88
S13-C121S	>500	>500	>500
S13-K122A	111	>500	>500
S13-T123A	>500	>500	>500
S13-C124S	>500	>500	>500
S13-T125A	48.8	353	>500
S13-T126A	41.9	40.8	33.89
S13-P127A	40.4	33.2	69.39
S13-Q129A	39.8	58.1	33.34
S13-T131A	60.1	51.7	62.08
S13-S132A	39.8	58.1	33.34

항원에의 결합에 대한 항체의 중요한 부위를 추가로 확인하기 위해서, 본 발명자들은 HBsAg 항원 단백질에서 상기 실험을 입증하였다. 관련된 프라이머를 설계하고(표 17), 점 돌연변이를 갖는 14개의 HBsAg 유전자 단편을 PCR을 통해 증폭에 의해 수득하였다. 증폭에 의해 수득된 단편을, EcoRI 및 BamHI에 의한 이중 효소 절단이 가해진 PTT5 빈 벡터에 깁슨(Gibson)을 사용하여 별도로 결찰시키고, 서열분석 결과가 정확했을 때 벡터 구성을 완료하였다. 구성된 플라스미드를 HEK293T 세포의 소량 형질감염에 사용하였으며, 2일간 형질감염 후에, 세포를 수집하고 웨스턴 블럿에 의해 확인하였다. 구체적인 단계는 하기와 같았다:(1) 세포를 수집하고 5 ㎖의 PBS로 2회 세척하고, 세포 카운팅 후에 1000 rpm에서 5분간 원심분리시키고;

(2) 30 ㎕의 DDM/1×10⁶ 세포를 가하여 세포를 용해시키고(세포 단백질의 양을 BCA 방법에 의해 정량분석할 수 있었다), 용해를 4℃에서 2시간 동안 수행하였으며 이러는 동안 쉐이커로 쉐이킹을 수회 수행하였고;

(3) 13300 rpm에서 10분간 원심분리를 수행하였으며, 상등액을 샘플로서 흡출하고, 그의 30 ㎕에 환원 SDS-PAGE 젤 전기영동을 수행하였으며;

(4) 300 mA의 일정한 전류하에서 90분 동안 이동 장치에 의해 전기영동 이동을 수행하고, 37℃에서 1시간 동안 상업적인 차단 용액을 사용하여 차단을 수행하였으며;

(5) 항체 M1D, M3D 및 162 1 ㎎/㎖을 ED-11로 1000배 별도로 희석하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였으며;

(6) 5분마다 한 번씩 총 3회 동안 PBST로 세척을 수행하였고;

(7) 효소-표지된 2차 항체 GAH-HRP(1:5000)를 가하고, 37℃에서 30분 동안 배양하였으며;

(8) 5분마다 한 번씩 총 3회 동안 PBST로 세척을 수행하였고;

(9) 전개(development) 및 사진촬영하고;

(10) β-액틴을 내부 참조로서 사용하였으며, 단계(4)에서 PVDF 멤브레인상의 β-액틴에 상응하는 영역을 절단하고, HRP-접합된 마우스 항-β-액틴 항체(1:5000)를 37℃에서 30분간 직접 인큐베이션하였으며, 다른 단계는 상기와 동일하였다. 도 10에 도시된 결과로부터, HBsAg 항원 단백질에 의해 확인된 3개 항체의 코어 에피토프는 선형 폴리펩티드의 경우와 완전히 일치함을 알 수 있었다.

C-HBsAg 단일 점 돌연변이에 대한 프라이머

프라이머 명칭	서열번호	프라이머 서열
C-S117A-F	183	ATCAACTACCGCCACGGGACCATGCAAGACCTGCAC
C-S117A-R	184	GGTCCCGTGGCGGTAGTTGATGTTCCTGGAAGTAGA
C-T118A-F	185	AACTACCAGCGCGGGACCATGCAAGACCTGCACGAT
C-T118A-R	186	CATGGTCCCGCGCTGGTAGTTGATGTTCCTGGAAGT
C-G119A-F	187	ACCAGCACGGCACCATGCAAGACCTGCACGATTCCT
C-G119A-R	188	CTTGCATGGTGCCGTGCTGGTAGTTGATGTTCCTGG
C-P120A-F	189	CAGCACGGGAGCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGC
C-P120A-R	190	GTCTTGCATGCTCCCGTGCTGGTAGTTGATGTTCCT
C-C121S-F	191	ACGGGACCATCCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAA
C-C121S-R	192	GCAGGTCTTGGATGGTCCCGTGCTGGTAGTTGATGT
C-K122R-F	193	GGGACCATGCCGGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGG
C-K122S-R	194	GTGCAGGTCCGGCATGGTCCCGTGCTGGTAGTTGAT
C-K122A-F	195	GGGACCATGCGCGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGG
C-K122A-R	196	GTGCAGGTCGCGCATGGTCCCGTGCTGGTAGTTGAT
C-T123A-F	197	ACCATGCAAGGCCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAAC
C-T123A-R	198	ATCGTGCAGGCCTTGCATGGTCCCGTGCTGGTAGTT
C-C124S-F	199	TGCAAGACCTCCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCT
C-C124S-R	200	AGGAATCGTGGAGGTCTTGCATGGTCCCGTGCTGGT
C-T125A-F	201	CAAGACCTGCGCGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTAT
C-T125A-R	202	GCAGGAATCGCGCAGGTCTTGCATGGTCCCGTGCTG
C-I126A-F	203	GACCTGCACGGCTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTT
C- I126A-R	204	TGAGCAGGAGCCGTGCAGGTCTTGCATGGTCCCGTG
C-P127A-F	205	CTGCACGATTGCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCC
C-P127A-R	206	CCTTGAGCAGCAATCGTGCAGGTCTTGCATGGTCCC
C-Q129A-F	207	GATTCCTGCTGCAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTG
C-Q129A-R	208	GAGGTTCCTGCAGCAGGAATCGTGCAGGTCTTGCAT
C-T131A-F	209	TGCTCAAGGAGCCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTG
C-T131A-R	210	AACATAGAGGCTCCTTGAGCAGGAATCGTGCAGGTC
C-S132A-F	211	TCAAGGAACCGCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTAC
C- S132A-R	212	GGAAACATAGCGGTTCCTTGAGCAGGAATCGTGCAG

실시예 9: M1D 및 M3D의 광범위 활성의 식별

M1D 및 M3D의 광범위 활성을 추가로 확인하기 위해서, A 내지 G(여기에서 F 유형은 F1 및 F2를 포함하였다)의 상이한 하위유형에 상응하는 각각의 HBsAg 단편(aa113-135)(이들의 서열에 대해서는 표 18 참조)을 사용하여 반응 플레이트를 코팅하였고, 여기에서 폴리펩티드를 플레이트 코팅을 위해 CB 100 ng/㎖로 희석하였다. 항체를 20% NBS 용액으로 1000 ng/㎖로 희석하였고, 이후 3배 희석을 수행하여 12개의 구배를 획득하였다. HBsAg(aa113-135)의 상이한 하위유형에 대한 M1D, M3D의 결합 활성을 Elisa 방법에 의해 측정하였다. 결합 곡선을 PRISM 소프트웨어를 사용하여 작성하였다. 도 11a 및 도 11b에 도시된 바와 같은 결과로서, M1D 및 M3D는 모두 HBV 하위유형의 대부분에 결합할 수 있었다.

HBsAg-aa113-135의 상이한 하위유형의 아미노산 서열

폴리펩티드의 명칭	서열번호	폴리펩티드의 서열
SEQ13-A	213	STTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFP
SEQ13-B	168	SSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFP
SEQ13-C	214	TSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFP
SEQ13-D	215	SSTTSTGPCRTCTTPAQGTSMYP
SEQ13-E	216	SSTTSTGPCRTCTTLAQGTSMFP
SEQ13-F/H	217	STTTSTGPCKTCTTLAQGTSMFP
SEQ13F1	218	STTTSTGPCKTCTALAQGTSMFP
SEQ13F2	219	STTTSTGPCRTCTTLAQGTSMLP
SEQ13-G	220	SSTTSTGPCKTCTTPAQGNSMYP

실시예 10: M1D 및 M3D의 친화성 측정

코팅 과정을 나트륨 아세테이트(pH 4.5)에 용해된 HBsAg 5 ㎍/㎖과 함께 Biacore 3000 장치상에서 실행하였으며, HBsAg를 2400 RU의 코팅량으로 CM5 칩상에 코팅하였다. 분석물을 100 nM로부터 2배 구배로 희석하여 7개의 샘플 농도를 획득하였다. 친화성 측정 과정을 Biacore 3000 장치상에서 실행하였으며, 여기에서 유량은 50 ㎕/분이었고, 결합시간은 90초이었고, 해리 시간은 600초이었으며, 샘플 챔버 온도는 10℃이었고, 재생 용액은 50 mM NaOH이었으며, 재생 유량은 50 ㎕/분이었고, 재생 시간은 60초이었다. 표 19는 항원 HBsAg에 대한 M1D 분자 및 M3D 분자의 친화성, 각각 1.06 nM 및 1.12 nM을 나타내었다.

M1D, M3D의 항원에 대한 친화성

분석물	Ka（/Ms）	Kd(/s)	KD(M)
M1D	1.02E06	1.08E03	1.06E-09
M3D	5.27E05	5.89E04	1.12E-09

실시예 11: 단일 정맥내 주사후 시노몰구스 원숭이에서 항체 M1D 및 M3D의 약동학 및 초기 독성의 평가

거대분자(>2000 달톤)를 수반하는 어떠한 실험도 경험하지 않은 6마리의 수컷 시노몰구스 원숭이를 3마리 동물/그룹의 2개 그룹으로 나누었다. 이들 중에서, 항체 M1D 및 M3D의 용액 20 ㎎/㎏의 용량을 정맥내 일시 주사에 의해 각각 그룹 1 및 2의 시노몰구스 원숭이에게 투여하였다. 항체 M1D 및 M3D의 단일 정맥내 주사후 시노몰구스 원숭이에서 약동학적 특성 및 초기 독성을 평가하였다. 구체적인 실험 설계는 표 20에 나타내었다.

M1D 및 M3D 분자의 약동학적 특성 및 초기 독성의 평가를 위한 실험 설계

그룹	실험제	동물수	투여 경로	투여 용량	동물 코드
1	M1D	3	IV 일시주사	20 ㎎/㎏	C1001, C1002, C1003
2	M3D	3	IV 일시주사	20 ㎎/㎏	C2001, C2002, C2003

투여 전(0시간)에, 실험 동물의 건강 및 외관을 하루에 2회(9:30 am 및 4:00 pm) 관찰하였다. 실험 동물의 신체 검사를 실험에 앞서 수행하여 동물의 건강 상태를 확인하였다. 투여 당일에, 실험 동물의 일반적인 상태, 행동, 활동, 배설, 호흡 및 다른 비정상적인 증상을 포함하여 실험 동물의 상태를 각각의 채혈 시점 전후에 관찰하였다. 결과는 모든 동물이 투여 중에 및 투여 후에 어떠한 비정상적인 반응도 보이지 않음을 나타내었다. 또한, 실험 동물의 체중 및 체온을 투여 후에 또한 추적하였다. 결과를 표 21 내지 24에 나타내었다.

M1D 투여후 실험 동물의 체중

시간	체중(㎏)
시간	C1001	C1002	C1003
0일	4.12	3.92	3.66
7일	4.02	3.88	3.70
14일	4.10	3.75	3.80
21일	4.15	3.81	3.72
28일	4.01	3.99	3.87

M1D 투여후 실험 동물의 체온

시간	체온(℃)
시간	C1001	C1002	C1003
투여 전	37.8	38.0	37.9
1시간	38.4	37.9	38.4
6시간	38.6	38.4	38.2
10시간	38.1	37.8	37.6
24시간	38.1	38.2	38.4

M3D 투여후 실험 동물의 체중

시간	체중(㎏)
시간		C2001	C2002	C2003
0일		3.6	3.27	3.6
7일		3.58	3.19	3.58
14일		3.73	3.33	3.7
21일		3.68	3.33	3.7
28일		3.95	3.39	3.81

M3D 투여후 실험 동물의 체온

시간	체온(℃)
시간	C2001	C2002	C2003
투여전	38.6	38.7	38.2
1시간	38.5	38.4	37.7
6시간	39	39	38.2
10시간	36.3	36.5	36.7
24시간	38.2	38.1	37.4

상기 실험 결과는 항체 M1D 및 M3D가 투여후 실험 동물에서 어떠한 부작용도 야기하지 않았음을 보였으며, 이에 의해 2개 항체의 양호한 안전성이 사전에 입증되었다.또한, 약 1.0 ㎖의 전혈을 투여전(0시간), 투여후 0.25h(15분), 0.5h(30분), 1h, 2h, 4h, 10h, 24h(1일), 48h(2일), 72h(3일), 96h(4일), 144h(6일), 192h(8일), 240h(10일), 336h(14일), 408h(17일), 504h(21일) 및 672h(28일)째에 실험 동물의 요측피정맥으로부터 수집하였다. 수집된 혈청 및 전혈에 하기의 분석을 수행하였다.

시노몰구스 원숭이 혈청 중 항체 M1D 및 M3D의 농도를 화학발광 면역분석(CLIA)에 의해 측정하였다. 혈청 중 인간화된 항체 M1D 및 M3D의 정량분석 하한(LLOQ)은 0.063 ng/㎖이었고, 정량분석 상한(ULOQ)은 4.0 ng/㎖이었다. 시험 결과를 도 12a 및 도 12b에 도시하였다.

도 12a는 20 ㎎/㎏의 인간화된 항체 M1D의 단일 정맥내 주사후 시간의 함수로서 각각의 시노몰구스 원숭이(그룹 1)의 혈청 중 인간화된 항체 M1D의 혈액 농도에 대한 곡선 그래프를 도시하였다.

도 12b는 20 ㎎/㎏의 인간화된 항체 M3D의 단일 정맥내 주사후 시간의 함수로서 각각의 시노몰구스 원숭이(그룹 2)의 혈청 중 인간화된 항체 M3D의 혈액 농도에 대한 곡선 그래프를 도시하였다.

인간화된 항체 M1D, M3D의 실험 데이터를 IV 일시주사 투입 모델과 함께 약동학적 소프트웨어 WinNonlinTM Version 6.2.1(Pharsight, Mountain View, CA)을 사용하여 처리하였다.

대수 선형 사다리꼴 방법을 사용하여 하기의 매개변수를 계산하였다: 초기 혈청 약물 농도(C0), 최종 검출 가능한 시간(T_last), 제거 반감기(T_1/2), 겉보기 분배 부피(V_dss), 전체 제거(CL), 0시점에서부터 농도를 검출할 수 있는 최종 시점까지의 평균 체류 시간(MRT_0-last), 0시점에서부터 무한대까지의 평균 체류 시간(MRT_0-inf), 0시점에서부터 농도를 검출할 수 있는 최종 시점까지의 혈청농도 아래 면적-시간 곡선(AUC_0-last), 및 0시점에서부터 무한대까지의 혈청농도 아래 면적-시간 곡선(AUC_0-inf).

결과는 인간화된 항체 M1D에 대한 수컷 시노몰구스 원숭이의 CL이 20 ㎎/㎏의 인간화된 항체 M1D의 단일 정맥내 주사후에 0.00962±0.00335 ㎖/분/㎏임을 보였다. 인간화된 항체 M1D의 평균 제거 반감기(t_1/2)는 81.3±78.7시간이었다. 시노몰구스 원숭이 혈청 중 인간화된 항체 M1D의 Vdss 및 AUC_0-inf 값은 각각 0.05±0.0209 L/㎏ 및 38053±14915 ㎍·h/㎖이었다.

인간화된 항체 M3D의 20 ㎎/㎏의 단일 정맥내 주사 후에, 인간화된 항체 M3D에 대한 수컷 시노몰구스 원숭이의 CL은 0.0049±0.0025 ㎖/분/㎏이었다. 인간화된 항체 M3D의 평균 제거 반감기(t_1/2)는 134±94.6시간이었다. 시노몰구스 원숭이 혈청 중 인간화된 항체 M3D의 Vdss 및 AUC_0-inf 값은 각각 0.0497±0.0143 L/㎏ 및 79419±33500 ㎍·h/㎖이었다.

상기 실험 결과를 또한 표 25 및 표 26에 요약하였다.

그룹 1의 수컷 시노몰구스 원숭이의 혈청 중 인간화된 항체 M1D의 주요 약동학적 매개변수

PK 매개변수	C1001	C1002	C1003	평균 IV		SD	CV (%)
Rsq_adj	0.800	0.830	0.581	--	±	--	--
T_1/2에 사용된 시점수 (No. points)	17.0	17.0	14.0	ND	±	--	--
C0(ng/㎖)	593886	520570	359594	491350	±	119848	24.4
T_1/2(h)	172	32.8	39.0	81.3	±	78.7	96.8
Vdss(L/kg)	0.0583	0.0406	0.0472	0.0487	±	0.00894	18.3
Cl(㎖/min/kg)	0.00670	0.0128	0.00969	0.00971	±	0.00303	31.2
T_last(h)	672	672	672	672	±	--	--
AUC_0-last(ng.h/㎖)	49777730	26142490	33521840	36480687	±	12092238	33.1
AUC_0-inf(ng.h/㎖)	49781190	26142960	34385180	36769777	±	11998175	32.6
MRT_0-last(h)	145	53.1	64.0	87.4	±	50.3	57.5
MRT_0-inf(h)	145	53.1	81.2	93.2	±	47.2	50.6
AUCExtra(%)	0.00695	0.00181	2.51	0.840	±	1.45	172
AUMCExtra(%)	0.0369	0.0245	23.2	7.74	±	13.3	173

그룹 2의 수컷 시노몰구스 원숭이의 혈청 중 인간화된 항체 M3D의 주요 약동학적 매개변수

PK 매개변수	C2001	C2002	C2003	평균 PO		SD	CV (%)
Rsq_adj	0.949	0.889	0.881	--	±	--	--
T_1/2 에 사용된 시점수	16.0	16.0	11.0	ND	±	--	--
C0(ng/㎖)	740468	562963	674855	659429	±	89752	13.6
T_1/2(h)	119	47.2	235	134	±	94.6	70.7
Vdss(L/kg)	0.0428	0.0401	0.0660	0.0497	±	0.0143	28.7
Cl(㎖/min/kg)	0.00381	0.00782	0.00308	0.00490	±	0.00255	52.0
T_last(h)	672	672	672	672	±	--	--
AUC_0-last(ng.h/㎖)	86427070	42620190	89311120	72786127	±	26164236	35.9
AUC_0-inf(ng.h/㎖)	87449170	42633960	108174500	79419210	±	33500012	42.2
MRT_0-last(h)	179	85.3	219	161	±	68.8	42.7
MRT_0-inf(h)	187	85.5	357	210	±	137	65.4
AUCExtra(%)	1.17	0.0323	17.4	6.21	±	9.74	157
AUMCExtra(%)	5.27	0.280	49.3	18.3	±	27.0	148

또한, 통상적인 혈청 화학 분석을 시노몰구스 원숭이의 혈청상에서 수행하였다. 시노몰구스 원숭이 혈청 중 다수의 지표(빌리루빈, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제, 총 단백질, 알부민, 알칼리성 포스파타제, γ-글루타밀트랜스퍼라제, 글루코스, 우레아, 크레아티닌, 칼슘 이온, 인, 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 나트륨 이온, 칼륨 이온, 클로라이드 이온 및 글로불린의 수준 포함)는 명백한 이상이 없음을 보였다. 이들 시험 결과는 인간화된 항체 M1D 또는 M3D의 단일 정맥내 주사가 명시된 투여량 조건하에서 안전함을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 인간화된 항체 M1D 또는 M3D를 피실험자(예를 들어 인간)에게 투여하여 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)을 예방 및/또는 치료할 수 있었다.

실시예 12: M1D 및 M3D의 약용 성질의 평가

1. 인간화된 항체 M1D 및 M3D의 등전점의 측정

인간화된 항체 M1D 및 M3D의 등전점을 모세관 등전점 전기영동(cIEF)에 의해 측정하였다. 실험 결과를 표 27에 도시하였다. 결과는 인간화된 항체 M1D가 8.8의 pI 값을 갖고 M3D가 9.0의 pI를 가짐을 보였다.

M1D, M3D의 등전점

	등전점(pI)	피크 면적
항체	주 피크	염기성 피크(%)	주 피크(%)	산성 피크(%)
M1D	8.8	3.8	64.7	31.5
M3D	9.0	12.1	58.7	29.2

2. 인간화된 항체 M1D 및 M3D의 안정성의 측정Tm 값은 전형적으로 항체 분자의 안정성을 기재하는데 사용된다. Tm 값이 높을수록, 항체 분자의 열 안정성이 양호하다. 인간화된 항체 M1D 및 M3D를 3개의 완충제에 별도로 용해시키고, 1 ㎎/㎖로 희석하고, 차동 주사 열량측정(DSC)에 의해 시험하였다. 초기 스캔 온도를 10℃로 설정하고, 종점 스캔 온도를 110℃로 설정하며, 스캔 속도는 200℃/시간이고, 냉각속도는 Exp로 설정하며, 장비에 의해 유지하고자 하는 최종 온도를 25℃로 설정하고, 데이터 획득 빈도를 10초로 설정하며, 주사전 모세관 온도를 30℃로 설정하였다. 실험 결과를 도 13a 및 도 13b 및 표 28 및 표 29에 도시하였다. 결과는 인간화된 항체 M1D의 Tm 개시가 61.7℃ 초과이고, M3D의 Tm 개시 값은 모두 61.6℃를 초과함을 보였으며, 이는 M1D 및 M3D가 양호한 열 안정성을 가졌음을 가리킨다.

M1D의 Tm 값

완충제	Tm 개시(℃)	Tm1(℃)	Tm2(℃)
아세테이트 pH5.0	61.7	68.9	95.6
히스티딘 pH6.0	63.8	71.0	96.1
PBS 7.2	65.6	72.9	92.4

M3D의 Tm 값

완충제	Tm 개시(℃)	Tm1(℃)	Tm2(℃)
아세테이트 5.0	61.6	68.8	82.2
히스티딘 6.0	62.8	71.1	82.3
PBS7.2	65.7	78.5	/

또한, 인간화된 항체 M1D 및 M3D를 pH 6.0의 히스티딘 완충제에 60 ㎎/㎖의 농도로 용해시키고, pH 7.2의 포스페이트 완충제에 2 ㎎/㎖의 농도로 추가로 용해시키고, 이어서 각각 40℃에서 보관하였다. 샘플의 물리적 및 화학적 성질(외관, pH, 단백질 농도 등을 포함한다)을 0주(T0), 1주(T1W) 및 2주(T2W)째에 모니터하였다. 결과를 표 30 및 표 31에 나타내었다.

외관의 모니터링

샘플 바이알을 세척하고 투명성 검출기(검은색 배경 및 흰색 배경)를 사용하여 샘플의 색상 및 투명성을 관찰하였다. 상기 표 30 내지 표 31의 결과는 40℃ 보관 조건에서 2개의 완충제 및 인간화된 항체 M1D 및 M3D의 샘플에서 현저한 변화를 보이지 않았다.

pH 및 단백질 농도의 모니터링

A280에서 샘플의 흡광도를 측정하고 샘플 중 단백질 농도를 비어 램버트(Beer-Lambert) 법을 사용하여 계산하였다. 또한, 샘플의 pH를 pH 미터를 사용하여 측정하였으며, 측정을 2회 반복하였고, 평균 값을 최종 결과로서 간주하였다. 실험 결과를 상기 표 30 및 표 31에 나타내었다. 결과는 인간화된 항체 M1D 및 M3D가 상이한 완충제 중에서 40℃에서 2주간 보관 후에 pH 및 단백질 농도에서 현저한 변화는 없음을 보였다.

SEC-HPLC 시험

상이한 보관 조건이 가해진 인간화된 항체 M1D 및 M3D의 샘플을 Agilent 1260 인피니티, TSK G3000SWXL 젤 컬럼(5 ㎛, 7.8 ㎜ x 300 ㎜)(여기에서 이동상은 50 mM PB + 300 mM NaCl, pH 7.0±0.2이었고; 유량은 1.0 ㎖/분이었으며; 검출 파장은 280 ㎚이었고; 샘플 농도는 10 ㎎/㎖이었고, 주사 부피는 10 ㎕이었다)을 사용하여 SEC-HPLC에 의해 분석하였다. 실험 결과를 상기 표 30 및 표 31에 나타내었다. 결과는 상이한 보관 조건(상이한 완충제, 상이한 보관 시간)하에서 인간화된 항체 M1D 및 M3D를 함유하는 샘플의 주 피크가 모두 95%를 초과함을 보였다. 이는 인간화된 항체 M1D 및 M3D가 안정함을 가리켰다.

cIEF 시험

샘플을 모세관 전기영동에 의해 분석하였다. 결과는 cIEF의 주 피크가 40℃에서 2주간 히스티딘 완충제 중에서 M1D 분자의 보관 후에 6.0%까지 감소한 반면, PBS 완충제 중에서 2주간 보관 후에는 주 피크가 24.9%까지 감소함을 보였다. M3D의 경우, cIEF 주 피크는 40℃에서 2주간 히스티딘 완충제 중에서 보관 후에 13.7%까지 감소한 반면, PBS 완충제 중에서 주 피크는 2주간 보관 후에 30.6%까지 감소하였다.

3. 인간화된 항체 M1D 및 M3D 변체의 용해도 분석

인간화된 항체 M1D 및 M3D를 5% 슈크로스 및 0.02% PS80을 함유하는 25 mM 히스티딘 용액(pH 6.0) 중에서 60 ㎎/㎖의 농도로 별도로 용해시키고, 샘플 용액의 액체 수준이 원심분리 시간의 증가와 함께 더 이상 현저하게 떨어지지 않을 때까지 원심분리 한외여과(원심분리 온도는 5 ℃이었고, 속도는 4850 ppm이었다)에 의해 농축시켰다. 샘플을 피펫으로 조심스럽게 수집하고, 이 시점에서 샘플의 성질을 관찰하였다. 결과는 용액 샘플이 황색임을 보였다.

이어서, 1000 ㎕의 용액 샘플을 피펫팅하고, 1.5 ㎖ EP 튜브로 옮기고, 10,000 rpm에서 20분간 원심분리시켰다. 원심분리 결과는 샘플 중 계층화 및 침전이 존재하지 않았고 액체는 등명함을 보였다. 원심분리 후 샘플의 상부 및 하부층을 피펫으로 조심스럽게 피펫팅하고, 단백질 농도를 UV280에 의해 측정하였다. 결과는 M1D의 용해도가 171 ㎎/㎖이고; M3D의 용해도는 170 ㎎/㎖임을 보였다. 추가로, 5% 슈크로스 및 0.02% PS80을 함유하는 25 mM 히스티딘 용액(pH 6.0) 중에 별도로 용해된 인간화된 항체 M1D 및 M3D 변체의 점도를 측정하였다. 이들 완충제 시스템에서, 171 ㎎/㎖의 농도에서 인간화된 항체 M1D의 점도는 13.2 cp(1 cP = 1 mPa.s)인 반면, M3D는 170 ㎎/㎖의 농도에서 19.8 cp의 점도 및 100 ㎎/㎖에서 11.5 cp의 점도를 가졌다.

본 발명의 구체적인 구현예를 상세히 기재하였지만, 당해 분야의 숙련가는 세부사항의 다수의 변형 및 변화가 개시의 전체적인 교지에 비추어 가능하고, 이들 변화는 본 발명의 범위내에 있음을 알 것이다. 본 발명 전체는 첨부된 청구항 및 그의 임의의 균등물에 의해 제공된다.

SEQUENCE LISTING <110> XIAMEN UNIVERSITY YANG SHENG TANG COMPANY, LTD. <120> Antibodies for treatment of hepatitis B infection and related diseases <130> IEC170022PKR <150> CN 201710223992.8 <151> 2017-04-07 <160> 220 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-23 heavy chain variable region <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Ile Leu Ser Val Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asn 20 25 30 Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Arg Ser Arg Val Thr Leu Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Leu Arg Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-23 light 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Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Leu Gly Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 166 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M3D (LCDR2-B) light chain variable region <400> 166 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 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Artificial Sequence <220> <223> S13-K122A <400> 174 Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Ala Thr Cys Thr Thr Pro Ala 1 5 10 15 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro 20 <210> 175 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S13-T123A <400> 175 Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Ala Cys Thr Thr Pro Ala 1 5 10 15 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro 20 <210> 176 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S13-C124S <400> 176 Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Ser Thr Thr Pro Ala 1 5 10 15 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro 20 <210> 177 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S13-T125A <400> 177 Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Ala Thr Pro Ala 1 5 10 15 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro 20 <210> 178 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S13-T126A <400> 178 Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ala Pro Ala 1 5 10 15 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro 20 <210> 179 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S13-P127A <400> 179 Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Ala Ala 1 5 10 15 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro 20 <210> 180 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S13-Q129A <400> 180 Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala 1 5 10 15 Ala Gly Thr Ser Met Phe Pro 20 <210> 181 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S13-T131A <400> 181 Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala 1 5 10 15 Gln Gly Ala Ser Met Phe Pro 20 <210> 182 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S13-S132A <400> 182 Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala 1 5 10 15 Gln Gly Thr Ala Met Phe Pro 20 <210> 183 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 183 atcaactacc gccacgggac catgcaagac ctgcac 36 <210> 184 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 184 ggtcccgtgg cggtagttga tgttcctgga agtaga 36 <210> 185 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 185 aactaccagc gcgggaccat gcaagacctg cacgat 36 <210> 186 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 186 catggtcccg cgctggtagt tgatgttcct ggaagt 36 <210> 187 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 187 accagcacgg caccatgcaa gacctgcacg attcct 36 <210> 188 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 188 cttgcatggt gccgtgctgg tagttgatgt tcctgg 36 <210> 189 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 189 cagcacggga gcatgcaaga cctgcacgat tcctgc 36 <210> 190 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 190 gtcttgcatg ctcccgtgct ggtagttgat gttcct 36 <210> 191 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 191 acgggaccat ccaagacctg cacgattcct gctcaa 36 <210> 192 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 192 gcaggtcttg gatggtcccg tgctggtagt tgatgt 36 <210> 193 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 193 gggaccatgc cggacctgca cgattcctgc tcaagg 36 <210> 194 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 194 gtgcaggtcc ggcatggtcc cgtgctggta gttgat 36 <210> 195 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 195 gggaccatgc gcgacctgca cgattcctgc tcaagg 36 <210> 196 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 196 gtgcaggtcg cgcatggtcc cgtgctggta gttgat 36 <210> 197 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 197 accatgcaag gcctgcacga ttcctgctca aggaac 36 <210> 198 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 198 atcgtgcagg ccttgcatgg tcccgtgctg gtagtt 36 <210> 199 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 199 tgcaagacct ccacgattcc tgctcaagga acctct 36 <210> 200 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 200 aggaatcgtg gaggtcttgc atggtcccgt gctggt 36 <210> 201 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 201 caagacctgc gcgattcctg ctcaaggaac ctctat 36 <210> 202 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 202 gcaggaatcg cgcaggtctt gcatggtccc gtgctg 36 <210> 203 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 203 gacctgcacg gctcctgctc aaggaacctc tatgtt 36 <210> 204 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 204 tgagcaggag ccgtgcaggt cttgcatggt cccgtg 36 <210> 205 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 205 ctgcacgatt gctgctcaag gaacctctat gtttcc 36 <210> 206 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 206 ccttgagcag caatcgtgca ggtcttgcat ggtccc 36 <210> 207 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 207 gattcctgct gcaggaacct ctatgtttcc ctcttg 36 <210> 208 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 208 gaggttcctg cagcaggaat cgtgcaggtc ttgcat 36 <210> 209 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 209 tgctcaagga gcctctatgt ttccctcttg ttgctg 36 <210> 210 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 210 aacatagagg ctccttgagc aggaatcgtg caggtc 36 <210> 211 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 211 tcaaggaacc gctatgtttc cctcttgttg ctgtac 36 <210> 212 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 212 ggaaacatag cggttccttg agcaggaatc gtgcag 36 <210> 213 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ13-A <400> 213 Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala 1 5 10 15 Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro 20 <210> 214 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ13-C <400> 214 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala 1 5 10 15 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro 20 <210> 215 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ13-D <400> 215 Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala 1 5 10 15 Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro 20 <210> 216 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ13-E <400> 216 Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Leu Ala 1 5 10 15 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro 20 <210> 217 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ13-F/H <400> 217 Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Leu Ala 1 5 10 15 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro 20 <210> 218 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ13F1 <400> 218 Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ala Leu Ala 1 5 10 15 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro 20 <210> 219 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ13F2 <400> 219 Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Leu Ala 1 5 10 15 Gln Gly Thr Ser Met Leu Pro 20 <210> 220 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ13-G <400> 220 Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala 1 5 10 15 Gln Gly Asn Ser Met Tyr Pro 20

Claims

HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로,
상기 항체 또는 항원-결합단편은
(a) (i) 서열번호 7, 또는 알라닌에 의한 하나의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 7과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH CDR2, 상기 보존적 아미노산 치환은 중쇄에 대한 카밧 넘버링 시스템에 따라 56번위치에서 일어나지 않는 것이며;
(ii) 서열번호 8, 또는 알라닌에 의한 하나의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 8과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH CDR3, 상기 보존적 아미노산 치환은 중쇄에 대한 카밧 넘버링 시스템에 따라 97, 100c 및 100d 위치에서 일어나지 않는 것이며; 및
(iii) 하기 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VH CDR 1 : a) 서열번호 6,; 또는 b) 인간 중쇄 생식계열 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 함유된 VH CDR1의 서열로, 상기 인간 중쇄 생식계열 유전자가 IGHV4-4^*08 및 IGHV4-61^*01로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, VH CDR 1;
을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및
(b) (iv) 서열번호 9, 또는 알라닌에 의한 하나의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 9와 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VL CDR1;
(v) 서열번호 11, 또는 알라닌에 의한 하나의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 11과 상이한 서열 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VL CDR3, 상기 보존적 아미노산 치환은 경쇄에 대한 카밧 넘버링 시스템에 따라 94 및 96번 위치에서 일어나지 않는 것이며; 및
(vi) 하기 중에서 선택된 서열로 이루어지는 VL CDR 2 : a) 서열번호 10,; 또는 b) 인간 경쇄 생식계열 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열 중에 함유된 VL CDR2의 서열로, 상기 인간 경쇄 생식계열 유전자가 IGKV1-39^*01 및 IGKV1-5^*03으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, VL CDR 2 ;
를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
을 포함하며,
상기 알라닌에 의한 하나의 보존적 아미노산 치환은 전체 CDR에서 1개 이하인, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제 1항에 있어서,
VH가 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VH CDR3, 및 서열번호 6, 서열번호 137 또는 서열번호 138의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1을 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제 1항에 있어서,
VL이
서열번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR1,
서열번호 11에 제시된 바와 같은 VL CDR3, 및
서열번호 10, 서열번호 139 또는 서열번호 140의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2
를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제1항에 있어서,
(i) 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR2; 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VH CDR3; 및 제1항에서 정의된 바와 같은 VH CDR1; 및 서열번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VL CDR3, 및 서열번호 10에 제시된 바와 같은 VL CDR2; 또는
(ii) 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR2; 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VH CDR3; 및 서열번호 6에 제시된 바와 같은 VH CDR1; 및 서열번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VL CDR3, 및 제1항에서 정의된 바와 같은 VL CDR2
를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제 1항에 있어서,
(1) 서열번호 6에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VH CDR3; 및 서열번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 10에 제시된 바와 같은 VL CDR2, 및 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VL CDR3;
(2) 서열번호 137에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VH CDR3; 및 서열번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 10에 제시된 바와 같은 VL CDR2, 및 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VL CDR3;
(3) 서열번호 138에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VH CDR3; 및 서열번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 10에 제시된 바와 같은 VL CDR2, 및 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VL CDR3;
(4) 서열번호 6에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VH CDR3; 및 서열번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 139에 제시된 바와 같은 VL CDR2, 및 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VL CDR3; 또는
(5) 서열번호 6에 제시된 바와 같은 VH CDR1, 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR2, 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VH CDR3; 및 서열번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR1, 서열번호 140에 제시된 바와 같은 VL CDR2, 및 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VL CDR3
을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제1항에 있어서,
상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 인간화된, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제1항에 있어서,
항체가
(1) 서열번호 1에 제시된 바와 같은 VH 및 서열번호 2에 제시된 바와 같은 VL;
(2) 서열번호 57에 제시된 바와 같은 VH 및 서열번호 58에 제시된 바와 같은 VL;
(3) 서열번호 157에 제시된 바와 같은 VH 및 서열번호 58에 제시된 바와 같은 VL;
(4) 서열번호 158에 제시된 바와 같은 VH 및 서열번호 58에 제시된 바와 같은 VL;
(5) 서열번호 57에 제시된 바와 같은 VH 및 서열번호 159에 제시된 바와 같은 VL; 또는
(6) 서열번호 57에 제시된 바와 같은 VH 및 서열번호 160에 제시된 바와 같은 VL
을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제1항에 있어서,
상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 scFv, Fab, Fab', (Fab')₂, Fv 단편, 디아바디, 이중특이성 항체, 다중특이성 항체, 키메릭 항체, 및 인간화된 항체로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제1항에 있어서,
항체가 IgG 부류의 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제1항에 있어서,
항체가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 부류의 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제1항에 있어서,
피실험자에서 HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있고, HBV의 독성을 중화시킬 수 있고/거나, HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시킬 수 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제1항에 있어서,
검출 가능한 표지로 표지되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 그의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 핵산 분자.
제13항에 따른 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제13항에 따른 단리된 핵산 분자 또는 상기 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 그의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 핵산 분자 또는 상기 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하고, 배양된 숙주 세포의 배양물로부터 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수함을 포함하는,
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 피실험자에서 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.