JP4948783B2 - 抗ＨＢｓモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
本発明は、ＨＢｓＡｇに特異的に結合するモノクローナル抗体に関する。具体的には、野生型のＨＢｓＡｇ及び変異型ＨＢｓＡｇと結合可能なモノクローナル抗体に関する。
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、脂質二重膜である外被と、タンパク質であるヌクレオキャプシドと、ＤＮＡポリメレースと、ゲノムＤＮＡとを有するヘパドナウイルス科の二本鎖ＤＮＡウイルスである。外被にはＳタンパク質、Ｍタンパク質及びＬタンパク質が結合しており、Ｓタンパク質にある表面抗原（ＨＢｓＡｇ）はウイルスの感染に関与している。ＨＢｓＡｇは２２６個のアミノ酸からなるポリペプチドであり、ＨＢｓＡｇにはａｄｗ、ａｙｗ、ａｄｒ及びａｙｒの４種類のサブタイプが存在する。ａｄｗは、ＨＢｓＡｇの１２２位及び１６０位のアミノ酸が共にリジンである。ａｙｗは、ＨＢｓＡｇの１２２位のアミノ酸がアルギニン、１６０位のアミノ酸がリジンである。ａｄｒは、１２２位のアミノ酸がリジン、１６０位のアミノ酸がアルギニンである。ａｙｒは、１２２位及び１６０位のアミノ酸が共にアルギニンである。本邦ではａｄｒが最も多い。
ＨＢＶに感染すると、ＨＢＶはゲノムＤＮＡを含まない球状或いは棒状のパーティクル（シュードパーティクル）としてＨＢｓＡｇを血中に多量に放出する。このため、採血によって得られた血液検体中のＨＢｓＡｇの存否を、抗ＨＢｓ抗体を用いて検査することによりＨＢＶ感染の有無を検査することができる。
ＨＢＶなどのウイルスは進化速度が速いため、ゲノムに変異を起こす確率が高い。このようなＨＢＶゲノムの変異によってＨＢｓＡｇのアミノ酸配列が変異し、構造が変化することがある。ＨＢｓＡｇの構造が変化すると、従来ＨＢＶ診断に用いられている抗ＨＢｓ抗体がＨＢｓＡｇと結合できなくなり、ＨＢＶ感染者をＨＢＶ陰性と診断してしまうことがある。変異を有するＨＢｓＡｇ（変異型ＨＢｓＡｇ）を検出できなければ、ＨＢＶの宿主に影響を与えるだけでなく、血液製剤や臓器の提供などによる感染の伝播にもつながり得る。従って、ＨＢＶの検査には、野生型のＨＢｓＡｇだけでなく変異型ＨＢｓＡｇとも結合可能な抗ＨＢｓ抗体を用いることが重要である。
ＨＢＶなどのウイルスは進化速度が速いため、ゲノムに変異を起こす確率が高い。このようなＨＢＶゲノムの変異によってＨＢｓＡｇのアミノ酸配列が変異し、構造が変化することがある。ＨＢｓＡｇの構造が変化すると、従来ＨＢＶ診断に用いられている抗ＨＢｓ抗体がＨＢｓＡｇと結合できなくなり、ＨＢＶ感染者をＨＢＶ陰性と診断してしまうことがある。変異を有するＨＢｓＡｇ（変異型ＨＢｓＡｇ）を検出できなければ、ＨＢＶの宿主に影響を与えるだけでなく、血液製剤や臓器の提供などによる感染の伝播にもつながり得る。従って、ＨＢＶの検査には、野生型のＨＢｓＡｇだけでなく変異型ＨＢｓＡｇとも結合可能な抗ＨＢｓ抗体を用いることが重要である。
このような観点から、現在までに野生型ＨＢｓＡｇ及び変異型ＨＢｓＡｇと結合可能な様々なモノクローナル抗体が開発されてきた。例えば、特許文献１記載のモノクローナル抗体は野生型ＨＢｓＡｇ及び６種類の変異型ＨＢｓＡｇと結合可能である。
しかしながら、特許文献１記載のモノクローナル抗体が認識できる変異型ＨＢｓＡｇ以外にも変異型ＨＢｓＡｇが報告されている。野生型ＨＢｓＡｇだけでなく今まで検出することのできなかった変異型ＨＢｓＡｇに結合することのできるモノクローナル抗体の開発が望まれている。
本発明の目的は、野生型ＨＢｓＡｇだけでなく、従来検出することができなかった変異型ＨＢｓＡｇに結合可能なモノクローナル抗体を提供することである。
本発明は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０４９３のハイブリドーマ及びこのハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体、並びに、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０４９４のハイブリドーマ及びこのハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を提供する。
本発明によると、野生型ＨＢｓＡｇと、従来検出することができなかった変異型ＨＢｓ
Ａｇに結合可能なモノクローナル抗体及びこのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが提供される。具体的には、本発明のモノクローナル抗体は、野生型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１１１位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１１８位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１２０位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１２６位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１２９位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１３３位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１３４位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１３５位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４１位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４２位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４３位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４４位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４８位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１５４位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、及び野生型ＨＢｓＡｇに対して１５５位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、に結合可能である。
Ａｇに結合可能なモノクローナル抗体及びこのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが提供される。具体的には、本発明のモノクローナル抗体は、野生型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１１１位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１１８位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１２０位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１２６位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１２９位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１３３位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１３４位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１３５位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４１位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４２位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４３位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４４位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４８位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１５４位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、及び野生型ＨＢｓＡｇに対して１５５位のアミノ酸に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、に結合可能である。
本明細書における「モノクローナル抗体」とは、モノクローナル抗体のフラグメント及びその誘導体をも含む。モノクローナル抗体のフラグメント及びその誘導体としては、具体的にはＦａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ）２及びｓＦｖフラグメントなど（Blazar et al., 1997, Journal of Immunology, 159: 5821-5833及びBird et al., 1988, Science, 242: 423-426）が例示される。モノクローナル抗体のサブクラスはＩｇＧに限定されず、ＩｇＭなどでもよい。
本明細書における「野生型ＨＢｓＡｇ」は、２２６個のアミノ酸からなり、一般的に野生型として認識されている全てのＨＢｓＡｇを含む。したがって、この用語には全ての血清型ＨＢｓＡｇ及びすべての認識された野生型ＨＢｓＡｇが含まれる。
本明細書では、野生型ＨＢｓＡｇのＮ位のアミノ酸のＸへの変異を「ＮＸ」と記載する。例えば、野生型ＨＢｓＡｇの１１１位のアミノ酸のスレオニン（Ｔ）への変異は「１１１Ｔ」と表される。
本実施形態のモノクローナル抗体は、野生型ＨＢｓＡｇと、野生型ＨＢｓＡｇに対して１２０位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ及び野生型ＨＢｓＡｇに対して１４１位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇからなる群より選択される少なくとも一つの変異型ＨＢｓＡｇと、１１８Ｋを有する変異型ＨＢｓＡｇ及び１４４位にのみ変異を有しこの変異が１４４Ｅである変異型ＨＢｓＡｇからなる群より選択される少なくとも一つの変異型ＨＢｓＡｇとに結合可能である。
このモノクローナル抗体は、野生型ＨＢｓＡｇ、１１８Ｋを有する変異型ＨＢｓＡｇ、１２０位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、１４１位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ及び１４４Ｅを有する変異型ＨＢｓＡｇの全てを認識できることが好ましい。
前記野生型ＨＢｓＡｇに対して１２０位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇは１２０Ｑ又は１２０Ｔを有する変異型ＨＢｓＡｇであり、前記野生型ＨＢｓＡｇに対して１４１位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇは１４１Ｅを有する変異型ＨＢｓＡｇであることが好ましい。
また、このモノクローナル抗体は、野生型ＨＢｓＡｇに対して１１１位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１２６位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１２９位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１３３位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１３４位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１３５位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４２位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４３位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４８位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１５４位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ及び野生型ＨＢｓＡｇに対して１５５位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇからなる群から選択される少なくとも一つと結合可能であることが好ましく、これら全ての変異型ＨＢｓＡｇと結合可能であることがより好ましい。
また、このモノクローナル抗体は、野生型ＨＢｓＡｇに対して１１１位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１２６位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１２９位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１３３位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１３４位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１３５位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４２位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４３位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４５位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４８位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ、野生型ＨＢｓＡｇに対して１５４位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇ及び野生型ＨＢｓＡｇに対して１５５位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇからなる群から選択される少なくとも一つと結合可能であることが好ましく、これら全ての変異型ＨＢｓＡｇと結合可能であることがより好ましい。
上述の各変異型ＨＢｓＡｇが有する変異としては、具体的には、野生型ＨＢｓＡｇに対して１１１位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇの変異は１１１Ｔであり、野生型ＨＢｓＡｇに対して１２６位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇの変異は１２６Ｓであり、野生型ＨＢｓＡｇに対して１２９位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇの変異は１２９Ｈであり、野生型ＨＢｓＡｇに対して１３３位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇの変異は１３３Ｌであり、野生型ＨＢｓＡｇに対して１３４位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇの変異は１３４Ａであり、野生型ＨＢｓＡｇに対して１３５位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇの変異は１３５Ｓであり、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４２位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇの変異は１４２Ｓ又は１４２Ｌであり、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４３位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇの変異は１４３Ｌであり、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４５位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇの変異は１４５Ｒ又は１４５Ｋであり、野生型ＨＢｓＡｇに対して１４８位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇの変異は１４８Ｈであり、野生型ＨＢｓＡｇに対して１５４位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇの変異は１５４Ｗであり、野生型ＨＢｓＡｇに対して１５５位に変異を有する変異型ＨＢｓＡｇの変異は１５５Ｙであることが好ましい。
また、これらのモノクローナル抗体は、ＨＢｓＡｇの１９７位以降のアミノ酸を欠失させたＨＢｓＡｇ（野生型ＨＢｓＡｇの１〜１９６位のアミノ酸配列を有する変異型ＨＢｓＡｇ）に結合可能である。即ち、これらのモノクローナル抗体のエピトープは、ＨＢｓＡｇの１〜１９６位の領域中に存在する。
本発明のモノクローナル抗体は、野生型及び／又は変異型ＨＢｓＡｇを含有することが疑われる検体中のＨＢｓＡｇの検出及び／又は定量のためのイムノアッセイに用いることができる。このようなイムノアッセイは、臨床におけるＨＢＶの診断や血液製剤のスクリーニングなどにおいて使用可能である。
本発明のモノクローナル抗体は、公知の免疫学的手法を用い、ＨＢｓＡｇを抗原として被免疫動物に免疫し、被免疫動物の細胞を用いてハイブリドーマを作製することにより得ることができる。１０５３抗体を産生することができるハイブリドーマＨＢｓ−１０５３は受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０４９３、１４９抗体を産生することができるハイブリドーマＨＢｓ−１４９は受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０４９４として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（受領日：２００５年４月７日）。
ハイブリドーマ作成の際に用いられる被免疫動物の種類は特に限定されない。具体的にはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ウマなどを例示できるが、マウスを用いることが好ましい。また、マウスを用いる場合、その系統は特に限定されないが、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いることが好ましい。
抗原であるＨＢｓＡｇは、ＨＢＶ感染者の生体試料から精製して得ることができる。また、ＨＢｓＡｇは、ＨＢｓＡｇをコードするＤＮＡをプラスミドに組み込み、これを宿主細胞に導入して発現させることにより得ることもできる。
抗原を被免疫動物に免疫する際はアジュバントを投与することが好ましい。アジュバントを用いることによって被免疫動物の抗原への免疫応答性を高めることができる。アジュバントの種類は特に限定されないが、例えばフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Bordetella pertussis vaccine）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ），アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）などが用いられる。また、これらのうち複数のアジュバントを組み合わせて用いてもよい。初回免疫時にＦＣＡ，二回目以降の免疫時にＦＩＡやＲｉｂｉを用いるのが好ましい。
アジュバント投与の有無や注射部位、被免疫動物の種類などによって免疫のスケジュールを適宜変更させることができる。以下は、被免疫動物としてマウスを用いた場合の免疫について説明する。
初回免疫として、アジュバント混合ＨＢｓＡｇ溶液を腹腔内、皮下又は筋肉内に注射する。注射するアジュバント混合ＨＢｓＡｇ溶液の体積は０．０５ｍｌ〜１ｍｌであることが好ましく、含まれるＨＢｓＡｇの質量は１０〜２００μｇであることが好ましい。アジュバントを用いない場合は、ＨＢｓＡｇの含有量を多くして腹腔内注射することにより免疫してもよい。初回免疫から約４〜２１日毎に１〜４回追加免疫を行なう。追加免疫から約１〜４週間後最終免疫を行なう。最終免疫から約３〜５日後、マウスから脾細胞を分離して抗体産生細胞を得ることができる。
初回免疫として、アジュバント混合ＨＢｓＡｇ溶液を腹腔内、皮下又は筋肉内に注射する。注射するアジュバント混合ＨＢｓＡｇ溶液の体積は０．０５ｍｌ〜１ｍｌであることが好ましく、含まれるＨＢｓＡｇの質量は１０〜２００μｇであることが好ましい。アジュバントを用いない場合は、ＨＢｓＡｇの含有量を多くして腹腔内注射することにより免疫してもよい。初回免疫から約４〜２１日毎に１〜４回追加免疫を行なう。追加免疫から約１〜４週間後最終免疫を行なう。最終免疫から約３〜５日後、マウスから脾細胞を分離して抗体産生細胞を得ることができる。
上記のようにして作製された抗体産生細胞は骨髄腫細胞と融合される。骨髄腫細胞の由来は特に限定されず、マウス、ラット，ヒトなどを由来とするものが用いられるが、被免疫動物と同種の動物を用いることが好ましく、さらに好ましくは同種同系統の動物が用いられる。骨髄腫細胞の由来としてマウスを用いる場合は、例えばマウスミエローマＰ３Ｘ６３−Ａｇ８，Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１，Ｐ３ＮＳ１−Ａｇ４，ＳＰ２／ｏ−Ａｇ１４，Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３などの株化骨髄腫細胞を用いるのが好ましい。骨髄腫細胞にはイムノグロブリン軽鎖を産生しているものがあり、このような骨髄腫細胞を融合対象として用いると、抗体産生細胞が産生するイムノグロブリン重鎖とこの軽鎖とが結合することがある。そのため、好ましくはイムノグロブリン軽鎖を産生しない骨髄腫細胞、例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３やＳＰ２／ｏ−Ａｇ１４などを用いることが好ましい。
抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する方法としては、公知の方法を用いることができ特に限定されない。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法（ＰＥＧ法）、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などが挙げられる。ＰＥＧ法の場合、約３０〜６０％のＰＥＧ（平均分子量１０００〜６０００）を含む適当な培地又は緩衝液中に脾細胞と骨髄腫細胞を１：１から１０：１、好ましくは５：１から１０：１の混合比で懸濁し、温度約２５〜３７度、ｐＨ６〜８の条件下で、約３０秒〜３分間程度反応させればよい。反応終了後、細胞を洗浄し、ＰＥＧ溶液を除いてヒポキサンチン−チミジン培地（ＨＴ培地）などに再懸濁し、例えばマイクロタイタープレート中に播種して培養を続けることができる。
融合後の細胞は選択培地で培養して、ハイブリドーマの選択を行なう。選択培地としては、親細胞株が死滅し，融合細胞のみが増殖し得る培地であれば特に限定されない。通常はヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地（ＨＡＴ培地）が使用される。ハイブリドーマの選択は、通常融合操作の１〜７日後に、培地の一部、好ましくは約半量を選択培地と交換することによって開始し、さらに２，３日毎に同様の培地交換を繰り返しながら培養することによって行なう。
生育しているハイブリドーマが所望の抗体を産生しているか否かは、培養上清を採取して抗体価アッセイを行なうことによって確認することができる。抗体価アッセイとしては公知の方法を用いることができ特に限定されない。例えば、固相化した抗原に段階希釈した上記上清を添加して反応させ、さらに蛍光物質、酵素、又は放射性同位体（ＲＩ）などで標識した二次抗体（抗グロブリン抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体など）を反応させれば、上清中に産生されている抗体を検出することができ、また抗体価を測定することができる。このようにプレートの各ウェルの培養上清をスクリーニングし、所望の抗体を産生しているハイブリドーマを得ることができる。
次に、単一クローンを分離する。分離法としては、公知の方法を用いることができ特に限定されない。例えば、限界希釈法、軟寒天法、蛍光励起セルソーターを用いる方法などが挙げられる。例えば限界希釈法の場合、ハイブリドーマのコロニーを１cell/well前後となるように培地で段階希釈して培養することにより目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを単離することができる。得られたハイブリドーマクローンは、約１０ｗ／ｖ％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はグリセリンなどの凍結保護剤の共存下に凍結させて−１９６〜−７０度で保存すると、半永久的に保存可能である。細胞は用時３７度前後の恒温槽中で急速に融解して使用できる。凍結保護剤の細胞毒性が残存しないようによく洗浄してから使用することが好ましい。
ハイブリドーマが産生する抗体のイムノグロブリンサブクラスを調べるためには、ハイブリドーマを一般的な条件で培養し、その培養上清中に分泌された抗体を市販の抗体クラス・サブクラス判定用キットなどを用いるとよい。
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の取得方法は、必要量やハイブリドーマの性状などによって適宜選択して用いる。例えば、ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から取得する方法、細胞培養により培養上清から取得する方法などが例示される。マウス腹腔内で増殖可能なハイブリドーマであれば、腹水から数ｍｇ／ｍｌの高濃度のモノクローナル抗体を得ることができる。in vivoで増殖できないハイブリドーマは細胞培養の培養上清から取得する。細胞培養によるモノクローナル抗体の取得方法は、in vivoで行なう方法に比べて、抗体産生量は少ないがマウス腹腔内に含まれるイムノグロブリンや他の夾雑物質の混入が少なく生成が用意であるという利点を有する。
モノクローナル抗体を、ハイブリドーマを移植したマウス腹水から取得する場合、例えば予めプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）などの免疫抑制作用を有する物質を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へハイブリドーマを移植し、約１〜３週間後に貯留した腹水を採取する。異なる動物種の細胞を融合させたハイブリドーマ（例えばマウスとラット）の場合には、ヌードマウス、放射線処理マウスを使用することが好ましい。
細胞培養上清から抗体を取得する場合、例えば、細胞維持に用いられる静置培養法、高密度培養方法、スピナーフラスコ培養方法などの培養法を用いることができる。これらのうち何れかの方法を用いることにより、ハイブリドーマを培養し抗体を含有する培養上清を得る。
腹水や培養上清からのモノクローナル抗体の精製は、公知のイムノグロブリン精製法を用いることによって行なうことができる。イムノグロブリン精製法としては特に限定されず、例えば、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いた塩析による分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法などが挙げられる。
さらに、モノクローナル抗体がマウスＩｇＧである場合、プロテインＡ結合担体或いは抗マウスイムノグロブリン結合担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー法により精製することが可能である。
上記のモノクローナル抗体は、検体である生体試料に含まれるＨＢｓＡｇの検出及び／又は定量のためのイムノアッセイに用いることができる。このようなアッセイは、ＨＢＶの診断や血液製剤のスクリーニングなどにおいて使用可能である。イムノアッセイは、本実施形態のモノクローナル抗体と検体とを混合し、モノクローナル抗体とＨＢｓＡｇとの複合体の存否を確認することによって行なわれる。
（実験例１）
１．モノクローナル抗体の作製
１−１． マウスの免疫
ヒト血清から精製された不活性化ａｄｒ型ＨＢｓＡｇ（ＴＲＩＮＡ社製）を５０μｇ含有するＰＢＳ１００μｌにＦＣＡ１００μｌを添加し、ボルテクスで混合して乳化させ、ＦＣＡ混合ＨＢｓＡｇ溶液２００μｌを作製した。また、ＦＣＡではなくＦＩＡを用いること以外は同様にしてＦＩＡ混合ＨＢｓＡｇ溶液２００μｌを作製した。
ＦＣＡ混合ＨＢｓＡｇ溶液２００μｌを８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与により初回免疫した。初回免疫後、二週間毎にＦＩＡ混合ＨＢｓＡｇ溶液２００μｌを用いて追加免疫を五回行った。最後の追加免疫から四日後に脾細胞を分離し、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３マウス骨髄腫細胞とＰＥＧ法により融合させ、ハイブリドーマを作製した。
１．モノクローナル抗体の作製
１−１． マウスの免疫
ヒト血清から精製された不活性化ａｄｒ型ＨＢｓＡｇ（ＴＲＩＮＡ社製）を５０μｇ含有するＰＢＳ１００μｌにＦＣＡ１００μｌを添加し、ボルテクスで混合して乳化させ、ＦＣＡ混合ＨＢｓＡｇ溶液２００μｌを作製した。また、ＦＣＡではなくＦＩＡを用いること以外は同様にしてＦＩＡ混合ＨＢｓＡｇ溶液２００μｌを作製した。
ＦＣＡ混合ＨＢｓＡｇ溶液２００μｌを８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与により初回免疫した。初回免疫後、二週間毎にＦＩＡ混合ＨＢｓＡｇ溶液２００μｌを用いて追加免疫を五回行った。最後の追加免疫から四日後に脾細胞を分離し、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３マウス骨髄腫細胞とＰＥＧ法により融合させ、ハイブリドーマを作製した。
１−２． ハイブリドーマの培養
ハイブリドーマを２．５×１０６cells/mlとなるようにＨＴ培地に懸濁させ、９６穴プレート（コーニング社製；以下、培養用プレートとする）の各ウェルに２．５×１０５cells/wellとなるように分注した。培養用プレートを３７度、５％ＣＯ２の恒温槽内に静置し、ハイブリドーマの培養を開始した。翌日、ＨＡＴ培地を２５μｌずつ培養用プレートの各ウェルに添加し、さらに培養を継続した。１０日間培養してハイブリドーマのコロニーを出現させたところで、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行なった。
ハイブリドーマを２．５×１０６cells/mlとなるようにＨＴ培地に懸濁させ、９６穴プレート（コーニング社製；以下、培養用プレートとする）の各ウェルに２．５×１０５cells/wellとなるように分注した。培養用プレートを３７度、５％ＣＯ２の恒温槽内に静置し、ハイブリドーマの培養を開始した。翌日、ＨＡＴ培地を２５μｌずつ培養用プレートの各ウェルに添加し、さらに培養を継続した。１０日間培養してハイブリドーマのコロニーを出現させたところで、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行なった。
１−３． ハイブリドーマのスクリーニング
０．１ｗ／ｖ％ＮａＮ３を含む０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．５）に、ａｄｒ型ＨＢｓＡｇ（ＴＲＩＮＡ社製）の濃度が０．５μｇ／ｍｌとなるようａｄｒ型ＨＢｓＡｇを添加し、固定用ＨＢｓＡｇ溶液を調整した。固定用ＨＢｓＡｇ溶液１００μｌを９６穴プレート（ＮＵＮＣ社製；以下、抗原固定プレートとする）の各ウェルに分注した。４度で一晩静置した後、０．０５％の濃度でＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液（以下、第一緩衝液とする）で三回洗浄した。洗浄後、抗原固定プレートの各ウェルに２ｗ／ｖ％の濃度でＢＳＡを含むＴＢＳ緩衝液（以下、第二緩衝液とする）３００μｌを添加し、室温で二時間静置した。
第二緩衝液を抗原固定プレートの各ウェルに７５μｌずつ添加した。さらに、１−２．で作製したハイブリドーマ培養上清を培養用プレートの各ウェルから取り出し、抗原固定プレートの各ウェルに２５μｌずつ添加した。第二緩衝液及び培養上清添加後、３７度で一時間インキュベートした。インキュベート後、３００μｌの第一緩衝液で抗原固定プレートの各ウェルを洗浄した。洗浄後、第二緩衝液で１００００倍希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製；Code No. P0447）を抗原固定プレートの各ウェルに１００μｌずつ添加した。室温で３０分間反応させ、３００μｌの第一緩衝液で抗原固定プレートの各ウェルを洗浄してTMB peroxidase EIA Substrate Kit (Bio-Rad社製)を用いて陽性を示すウェルを検出した。その結果、２６８８ウェル中、約３００ウェルにおいて抗ＨＢｓモノクローナル抗体が産生されていることが確認された。
０．１ｗ／ｖ％ＮａＮ３を含む０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．５）に、ａｄｒ型ＨＢｓＡｇ（ＴＲＩＮＡ社製）の濃度が０．５μｇ／ｍｌとなるようａｄｒ型ＨＢｓＡｇを添加し、固定用ＨＢｓＡｇ溶液を調整した。固定用ＨＢｓＡｇ溶液１００μｌを９６穴プレート（ＮＵＮＣ社製；以下、抗原固定プレートとする）の各ウェルに分注した。４度で一晩静置した後、０．０５％の濃度でＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液（以下、第一緩衝液とする）で三回洗浄した。洗浄後、抗原固定プレートの各ウェルに２ｗ／ｖ％の濃度でＢＳＡを含むＴＢＳ緩衝液（以下、第二緩衝液とする）３００μｌを添加し、室温で二時間静置した。
第二緩衝液を抗原固定プレートの各ウェルに７５μｌずつ添加した。さらに、１−２．で作製したハイブリドーマ培養上清を培養用プレートの各ウェルから取り出し、抗原固定プレートの各ウェルに２５μｌずつ添加した。第二緩衝液及び培養上清添加後、３７度で一時間インキュベートした。インキュベート後、３００μｌの第一緩衝液で抗原固定プレートの各ウェルを洗浄した。洗浄後、第二緩衝液で１００００倍希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製；Code No. P0447）を抗原固定プレートの各ウェルに１００μｌずつ添加した。室温で３０分間反応させ、３００μｌの第一緩衝液で抗原固定プレートの各ウェルを洗浄してTMB peroxidase EIA Substrate Kit (Bio-Rad社製)を用いて陽性を示すウェルを検出した。その結果、２６８８ウェル中、約３００ウェルにおいて抗ＨＢｓモノクローナル抗体が産生されていることが確認された。
（２）変異型ＨＢｓＡｇの作製
野生型ＨＢｓＡｇ（サブタイプ：ａｄｒ型）を有するＨＢＶに感染した患者の血液試料からＨＢＶのＤＮＡを調製し、ＰＣＲ法を用いて野生型ＨＢｓＡｇをコードする領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片がコードする野生型ＨＢｓＡｇのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に記載する。このＤＮＡ断片を真核細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Invitrogen）に組み込み、野生型ＨＢｓＡｇ発現プラスミドを作製した。次にこの発現プラスミドをテンプレートとして、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて部位特異的変異導入を行い、下記表１に示す２０種類の変異型ＨＢｓＡｇ発現プラスミドを構築した。野生型ＨＢｓＡｇ発現プラスミド及び変異型ＨＢｓＡｇ発現プラスミドをEndoFree Plasmid Maxi Kit (QIAGEN)を用いて精製した。精製後の発現プラスミドをそれぞれPolyMagII (OZ Bioscience)を用いてサル腎臓由来のＣＯＳ７細胞に導入し、５％ ＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養した。また、ネガティブコントロールとしてＨＢｓＡｇをコードするＤＮＡを組み込まずに、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）のみを導入したＣＯＳ７細胞を作製し、同様に培養した。
野生型ＨＢｓＡｇ（サブタイプ：ａｄｒ型）を有するＨＢＶに感染した患者の血液試料からＨＢＶのＤＮＡを調製し、ＰＣＲ法を用いて野生型ＨＢｓＡｇをコードする領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片がコードする野生型ＨＢｓＡｇのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に記載する。このＤＮＡ断片を真核細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Invitrogen）に組み込み、野生型ＨＢｓＡｇ発現プラスミドを作製した。次にこの発現プラスミドをテンプレートとして、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて部位特異的変異導入を行い、下記表１に示す２０種類の変異型ＨＢｓＡｇ発現プラスミドを構築した。野生型ＨＢｓＡｇ発現プラスミド及び変異型ＨＢｓＡｇ発現プラスミドをEndoFree Plasmid Maxi Kit (QIAGEN)を用いて精製した。精製後の発現プラスミドをそれぞれPolyMagII (OZ Bioscience)を用いてサル腎臓由来のＣＯＳ７細胞に導入し、５％ ＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養した。また、ネガティブコントロールとしてＨＢｓＡｇをコードするＤＮＡを組み込まずに、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）のみを導入したＣＯＳ７細胞を作製し、同様に培養した。
（３）ＨＢｓＡｇに反応する抗体の選択
（２）で調製したＣＯＳ７細胞を、Trypsin-EDTA溶液（Sigma社製）によりシャーレから剥がし、細胞をＰＢＳで洗浄した。洗浄後の細胞を適量のＰＢＳ中に懸濁させ、細胞浮遊液を調製した。細胞浮遊液をスライドグラスに適量スポットし、風乾後アセトン(和光純薬工業社製)で固定した。アセトン固定後のスライドグラスに（１）で作製した、抗ＨＢｓモノクローナル抗体を含む約３００クローンの培養上清をそれぞれ反応させた。各モノクローナル抗体の野生型ＨＢｓＡｇ及び２０種類の変異型ＨＢｓＡｇに対する反応性を、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇ抗体を用いて蛍光顕微鏡観察により判定した。その結果、表２に示されるようにハイブリドーマＨＢｓ−１０５３（受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０４９３）が産生する１０５３抗体及びハイブリドーマＨＢｓ−１４９（受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０４９４）が産生する１４９抗体に広範な反応性が認められた。
（２）で調製したＣＯＳ７細胞を、Trypsin-EDTA溶液（Sigma社製）によりシャーレから剥がし、細胞をＰＢＳで洗浄した。洗浄後の細胞を適量のＰＢＳ中に懸濁させ、細胞浮遊液を調製した。細胞浮遊液をスライドグラスに適量スポットし、風乾後アセトン(和光純薬工業社製)で固定した。アセトン固定後のスライドグラスに（１）で作製した、抗ＨＢｓモノクローナル抗体を含む約３００クローンの培養上清をそれぞれ反応させた。各モノクローナル抗体の野生型ＨＢｓＡｇ及び２０種類の変異型ＨＢｓＡｇに対する反応性を、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇ抗体を用いて蛍光顕微鏡観察により判定した。その結果、表２に示されるようにハイブリドーマＨＢｓ−１０５３（受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０４９３）が産生する１０５３抗体及びハイブリドーマＨＢｓ−１４９（受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０４９４）が産生する１４９抗体に広範な反応性が認められた。
表２中の「＋」は抗体が抗原を認識して結合したことを示し、「−」は抗体と抗原との反応が起こらなかったことを示す。
表２より、１４９抗体は表１に示す１４５位のアミノ酸変異を有する変異型ＨＢｓＡｇを除く全ての変異型ＨＢｓＡｇ及び野生型ＨＢｓＡｇと結合した。また、１０５３抗体は表１に示す全ての変異型ＨＢｓＡｇ及び野生型ＨＢｓＡｇと結合した。
（実験例２）
野生型ＨＢｓＡｇ（サブタイプ：ａｄｒ）の１位から１９６位のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを野生型ＨＢｓＡｇのＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ法を用いて調製し、真核細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）に組み込み、野生型ＨＢｓＡｇ発現用プラスミドを作製した。このプラスミドをＣＯＳ７細胞に導入し、５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。このＣＯＳ７細胞は１９７位以降のアミノ酸が欠失したＨＢｓＡｇ（以下、Ｃ末端欠失ＨＢｓＡｇとする）を発現することができる。
野生型ＨＢｓＡｇ（サブタイプ：ａｄｒ）の１位から１９６位のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを野生型ＨＢｓＡｇのＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ法を用いて調製し、真核細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）に組み込み、野生型ＨＢｓＡｇ発現用プラスミドを作製した。このプラスミドをＣＯＳ７細胞に導入し、５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。このＣＯＳ７細胞は１９７位以降のアミノ酸が欠失したＨＢｓＡｇ（以下、Ｃ末端欠失ＨＢｓＡｇとする）を発現することができる。
Ｃ末端欠失ＨＢｓＡｇに１４９抗体及び１０５３抗体が反応するか否かを実験例１と同様にして判定した。判定結果を下記表３に示す。
表３より、１４９抗体及び１０５３抗体はＣ末端欠失ＨＢｓＡｇを認識できることが確認された。このことより、１４９抗体及び１０５３抗体のエピトープは、ＨＢｓＡｇの１〜１９６位の領域中に存在することが判明した。
Claims (4)
- 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０４９３のハイブリドーマ。
- 請求項１に記載のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
- 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０４９４のハイブリドーマ。
- 請求項３に記載のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
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