CN113683684B - 抗乙肝病毒表面抗原抗体、抗体对、含有其的检测试剂及试剂盒 - Google Patents

抗乙肝病毒表面抗原抗体、抗体对、含有其的检测试剂及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗乙肝病毒表面抗原抗体、抗体对、含有其的检测试剂及试剂盒，本发明涉及的抗体包括抗体轻链和抗体重链，所述抗体轻链包含互补决定区CDR‑L1、CDR‑L2和CDR‑L3，所述抗体重链包含互补决定区CDR‑H1、CDR‑H、CDR‑H3。本发明公开的抗体用于乙肝病毒表面抗原检测，能特异性结合乙肝病毒表面抗原，具有很高的检测特异性和灵敏度。

Description

抗乙肝病毒表面抗原抗体、抗体对、含有其的检测试剂及试 剂盒
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种抗乙肝病毒表面抗原抗体、抗体对、含有其的检测试剂及试剂盒。
背景技术
乙型肝炎病毒（HBV）是一种很小的病毒，它属于嗜肝脱氧核糖核酸（DNA）病毒组中的一个成员。病毒颗粒由外膜和内核两部分组成，完整的HBV颗粒是直径42nm的球形颗粒，其外膜厚7nm，由蛋白质和膜脂质组成。乙肝的主要传染源是病人和HBV抗原携带者。乙型肝炎病毒(HBV)所致的病毒性肝炎，具有感染性强，携带率高、流行面广、慢性化倾向严重的特点，属致癌性病毒。
乙肝病毒表面抗原HBsAg 是HBV 的外壳蛋白，本身不具有传染性。由于HBsAg 的出现常伴随HBV 的存在，因此HBsAg 是机体发生HBV 感染的标志。研究发现，在人体感染HBV 后的2 ～ 6 个月内，可在其血清中检测到HBsAg。对乙肝患者进行HBsAg 定量检测在为其制定治疗方案、评估其临床疗效和预后方面均具有较高的应用价值。
随着世界医疗检测技术的不断发展，化学发光法诊断检测***在检测乙肝表面抗原中获得了较好的检测效果和质量，但应用于化学发光免疫夹心法的高特异性和高灵敏度的抗体对仍比较匮乏，因此，生产出能够适用于化学发光***检测乙肝病毒表面抗原的高特异性和灵敏度的抗体原料变得尤为重要。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种抗乙肝病毒表面抗原抗体（HBsAb），以解决现有化学发光检测乙肝病毒表面抗原技术中抗乙肝病毒表面抗原抗体原料匮乏的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种抗乙肝病毒表面抗原抗体2D8，包含轻链可变区和重链可变区，其轻链可变区的CDR-L1氨基酸序列为SEQ ID NO:1，CDR-L2氨基酸序列为SEQ ID NO:2，CDR-L3氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其重链可变区CDR-H1氨基酸序列为SEQ ID NO:4，CDR-H2氨基酸序列为SEQ ID NO:5，CDR-H3的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
进一步地，还提供了一种抗乙肝病毒表面抗原抗体7G5，包含轻链可变区和重链可变区，其轻链可变区的CDR-L1氨基酸序列为SEQ ID NO:7，CDR-L2氨基酸序列为SEQ ID NO:8，CDR-L3氨基酸序列为SEQ ID NO:9，其重链可变区CDR-H1氨基酸序列为SEQ ID NO:10，CDR-H2氨基酸序列为SEQ ID NO:11，CDR-H3的氨基酸序列为SEQ ID NO:12。
进一步地，抗体2D8，包含轻链可变区和重链可变区，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:14；抗体7G5，包含轻链可变区和重链可变区，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:15，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:16。
进一步地，还提供了上述抗体的恒定区，包括轻链恒定区和/或重链恒定区，具体地，轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO:17；重链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO:18。
进一步地，编码抗体2D8的轻链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO:17，重链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO:18；编码抗体7G5的轻链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO:19，重链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO:20。
根据本发明的另一方面，提供了一种抗乙肝病毒表面抗原抗体对，包括抗体2D8或/和抗体7G5。
根据本发明的另一方面，提供了一种乙肝病毒表面抗原检测试剂，所述检测试剂包含所述抗体对。
根据本发明的另一方面，提供了一种乙肝病毒表面抗原检测试剂，所述检测试剂还包括稳定稀释液，所述稳定液包括缓冲液、基础组分和保护组分；优选地，其中所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述基础组分包括牛血清白蛋白BSA和叠氮钠NaN3，所述保护组分包括青霉素和甘油；更优选地，磷酸盐缓冲液的pH为7.2；BSA的含量为1.5 m/v %；NaN3的含量为0.03 m/v %；青霉素的含量为0.6 m/v %；甘油的含量为0.5 v/v % 。
根据本发明的另一方面，提供了以上任一项所述的乙肝病毒表面抗原检测试剂在制备HBsAg临床检测试剂盒中的应用。
应用本发明的技术方案，可以快速高效地制备得到抗乙肝病毒表面抗原抗体，解决了目前化学发光领域可应用于免疫夹心法检测乙肝病毒表面抗原的抗体缺乏的问题，为乙肝病毒表面抗原的检测提供了高灵敏度和高特异性原料。
附图说明
图1是抗体2D8在实施例2表8提供的对比例缓冲液及稳定液A-F中的降解率随时间变化的曲线图。
图2是抗体2D8在实施例2表8提供的对比例缓冲液及稳定液J-L中降解率随时间变化的曲线图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
本发明利用噬菌体表面展示技术可以快速高效地筛选出抗乙肝表面抗原抗体，解决目前乙肝表面抗原检测中高灵敏度和特异性抗体原料匮乏的问题。
除了有明确的相反说明以外，本发明的实施涉及本领域技术人员公知的常规病毒学、免疫学、微生物学、和分子生物学方法以及DNA重组技术，出于说明目的，在下文中对其中的一部分进行描述。除了另有明示以外，本说明书的各实施方式在细节上做必要的修改可适用于其他各实施方式。
本发明的实施方式涉及一种抗乙肝病毒表面抗原抗体。特别地，本发明所述的抗体可以意想不到的高特异性与灵敏度检测乙肝病毒表面抗原，并体现了极低的交叉率，与市售抗体对相比，表现出了优异的性能。
如本领域公知的，抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过可变区的表位识别位点与靶点特异性结合。如本申请所使用的，该术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，还包括其片段如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链ScFv、其合成变体、天然产生的变体、包括与特异性所需的抗原结合片段结合抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、以及包括抗原结合位点或特异性所需片段的免疫球蛋白分子的任意其他修饰构型。
术语“表位”包括任意决定簇，优选多肽决定簇，其能够与免疫球蛋白或T-细胞受体特异性结合，是与抗体结合的抗原区，在本申请中尤其包括与HBsAg结合的抗体的VH和VL序列的全部CDR区。
在一些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段包括重链和轻链CDR集合，其分别嵌入重链和轻链框架区之间，框架区对CDR提供支持并决定CDR彼此之间的空间关系。如本申请所使用的，术语“CDR区”指重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N-末端开始，将这些区域分别表示为"CDR1"、"CDR2"、和"CDR3"。因此，抗原结合位点包括六个CDR，其包括位于各重链和轻链V区的CDR。
本发明的实施方式涉及利用噬菌体展示的方法，直接从乙肝病毒患者的外周血取得基因，再使用分子克隆技术得到效价高的抗体。术语“噬菌体展示技术”（phagedisplayed technology，PDT）是将外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白融合，展示在噬菌体表面并保持特定的空间构象，利用特异性亲和作用以筛选特异性蛋白或多肽的一项新技术。1985年Smith，G.P提出将外源基因***改建过的噬菌体外壳蛋白基因，表达含有外源蛋白或多肽的融合蛋白，这种带有融合蛋白的噬菌体称为融合噬菌体。通过吸附-洗脱-扩增的重复过程，将含有能与靶蛋白特异结合的外源蛋白的噬菌体从表达各种外源蛋白的噬菌体库中筛选出来，然后进行富集、扩增及基因序列测定，推断外源蛋白的氨基酸组成。
本发明的实施方式还涉及术语“化学发光免疫分析”，其基本原理为将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。其中涉及术语“捕获抗体”，其可固定至酶标板、磁珠、胶体金等固相介质上，用于捕获溶液中的抗原的抗体。术语“标记抗体”，在该抗体上标记显色化合物如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和鲁米诺等，借此对抗体的结合性质进行检测。
基于上述研究结果，申请人提出了本申请的技术方案。在本申请的一种典型的实施方式中，提供了一种抗乙肝病毒表面抗原抗体2D8，包含轻链可变区和重链可变区，其轻链可变区的CDR-L1氨基酸序列为SEQ ID NO:1，CDR-L2氨基酸序列为SEQ ID NO:2，CDR-L3氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其重链可变区CDR-H1氨基酸序列为SEQ ID NO:4，CDR-H2氨基酸序列为SEQ ID NO:5，CDR-H3的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
本申请的另一种典型的实施方式中还提供了一种抗乙肝病毒表面抗原抗体7G5，包含轻链可变区和重链可变区，其轻链可变区的CDRL1氨基酸序列为SEQ ID NO:7，CDRL2氨基酸序列为SEQ ID NO:8，CDRL3氨基酸序列为SEQ ID NO:9，其重链可变区CDRH1氨基酸序列为SEQ ID NO:10，CDRH2氨基酸序列为SEQ ID NO:11，CDRH3的氨基酸序列为SEQ ID NO:12。
本申请的另一种典型的实施方式中还提供了一种抗乙肝病毒表面抗原抗体2D8，包含轻链可变区和重链可变区，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:14。
本申请的另一种典型的实施方式中还提供了一种抗乙肝病毒表面抗原抗体7G5，包含轻链可变区和重链可变区，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:15，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:16。
与可变区相比，免疫球蛋白恒定区的序列为保守序列，其负责与多种天然蛋白结合以激发特殊的生理功能。某些优选的实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段还可以包括恒定区，恒定区的氨基酸序列可以通过NCBI搜索，也可以通过其它本领域技术人员所公知的手段获得。
本申请的另一种典型实施方式中提供了恒定区的氨基酸序列，包括轻链恒定区和/或重链恒定区，所述轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO:17，所述重链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO:18。
本申请另一种典型的实施方式中，提供了一种编码抗乙肝病毒表面抗原抗体2D8或7G5的核苷酸分子，编码所述抗体2D8的轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:19，重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:20；编码所述抗体7G5的轻链可变区的核苷酸序列为SEQID NO:21，重链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO:22。
本发明的核酸分子可以RNA形式存在，或以DNA形式存在，包括但不限于通过克隆或合成产生获得的cDNA和基因组DNA或任何它们的组合。
本申请另一种典型的实施方式中，提供了一种抗乙肝病毒表面抗原抗体的筛选方法，其包括步骤：a) 使用乙肝患者外周血，获取总mRNA，反转录获得cDNA，扩增抗体可变区区段；b）构建噬菌体展示抗体表达文库；c)用HBsAg筛选文库，筛选得到所述的抗体或抗体片段。
进一步地，提供了一种制备筛选得到抗体的方法，其具体制备步骤为：包括a)将所述筛选方法筛选到的抗乙肝病毒表面抗原抗体或抗体片段基因与哺乳动物细胞表达载体进行基因重组；b)在哺乳动物细胞表达***中进行重组表达；c)分离得到抗乙肝病毒表面抗原抗体。
本申请另一种典型的实施方式中，提供了一种抗乙肝病毒表面抗原抗体对，包括抗体2D8或/和抗体7G5。
本申请另一种典型的实施方式中，提供了一种乙肝病毒表面抗原检测试剂，所述检测试剂包含所述抗体对。
本申请另一种典型的实施方式中，提供了一种乙肝病毒表面抗原检测试剂，所述检测试剂还包括稳定稀释液，所述稳定液包括缓冲液、基础组分和保护组分；优选地，其中所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述基础组分包括牛血清白蛋白BSA和叠氮钠NaN3，所述保护组分包括青霉素和甘油；更优选地，磷酸盐缓冲液的pH为7.2；BSA的含量为1.5 m/v %；NaN3的含量为0.03 m/v %；青霉素的含量为0.6 m/v %；甘油的含量为0.5 v/v %。
本申请另一种典型的实施方式中，提供了一种乙肝病毒表面抗原临床检测试剂盒，包含以上任一项所述的乙肝病毒表面抗原检测试剂，由于含有上述检测剂，因此具备良好的检测灵敏度、特异性和/或保存稳定性。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。需要说明的是，以下实施例及对比例中，如无特殊说明，所用试剂及耗材均为市售产品。
实施例1：材料与方法
1.实验材料及仪器
1.1材料
HBsAg抗原，来源：中国药品生物制品检定所；
抗HBsAg单克隆抗体1 （HbsAb-1），来源：美国RA Biosources公司；抗HBsAg单克隆抗体2（HbsAb-2），来源：美国RA Biosources公司；
磁性微球、ABEI：深圳新产业生物医学股份有限公司生产。
1.2.仪器
深圳市新产业生物医学工程股份有限公司研发生产的全自动化学分光分析仪Maglumi 2000Plus，序号：2000200068。
2抗乙肝病毒表面抗原抗体的制备
2.1乙型肝炎病毒抗原的获取
乙型肝炎病人总mRNA的提取：取乙型肝炎患者的外周血，提取mRNA；直接使用200uL的新鲜血液，加入20uLProteinaseK溶液，混匀；加入200uL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10Min,溶液变清亮，离心除去管盖内壁的水珠；加入200uL无水乙醇，充分震荡混匀，简短离心以除去管盖内壁的水珠；将上一步得到的溶液加入到吸附柱中离心，倒去废液；向吸附柱中加入缓冲液GD，离心倒掉废液；向吸附柱中加入漂洗液，离心倒掉废液，洗两次；离心两分钟后室温放置两分钟，晾干吸附柱中残余的漂洗液；加入洗脱缓冲液，离心得到总乙肝mRNA。
RT-PCR：在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo(dT)12-18 1μl，轻轻混匀、离心；70℃加热10min，立即将微量离心管***冰浴中至少1min；然后加入下列试剂的混合物:10×PCR buffer，2μl；25mMMgCl2，2μl；10mM dNTPmix，1μl；0.1M DTT，2μl轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min；加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min；于70℃加热15min以终止反应；将管***冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。
PCR反应结束后将全部PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，切下含有目的片段的胶块并用胶回收试剂盒回收目的片段。
2.2构建噬菌体载体
纯化过后的轻链基因PCR产物和pComb3H载体，分别用SacI/XbaI双酶切后纯化回收，回收产物用T4 DNA连接酶连接；酶切结束后用胶回收试剂盒直接纯化回收轻链片段和pComb3H载体的酶切产物。与经过同样双酶切的轻链基因文库相连接，电转化XL1 -B1ue 菌株，迅速加入1mL SOC 培养基，于37℃ 振荡培养1h ，加入10mL SB 培养基(含20mg/L Amp和 10mg/LTet) ，于37 ℃振荡培养1h 后补加Amp至50mg/L ，继续摇菌1h 加入100mL SB(含50mg/L Amp 及10mg/L Tet) 培养基和1012pfu的辅助噬菌体VCSM13 ，于37℃ 振荡培养2h 后加Kana 至70mg/L， 37℃振荡培养过夜。次日在离心后的上清液中加入40g/LPEG8000 和30g/L NaC1 沉淀噬菌体，将沉淀悬浮于2mL 10g/LBSA-TBS 中，离心收集上清即为Fab 噬菌体抗体库。
2.3噬菌体特异性筛选
(a)用10mg/L的乙肝病毒表面抗原和0.05mo1/L的碳酸氢钠缓冲液，制备人源乙肝病毒表面抗原抗原包被的6孔酶标板，并且用小牛血清蛋白4℃封闭过夜；(b)加1m1/孔Fab噬菌体抗体文库，37℃孵育2小时，用PBST(lg/LTween-20)洗一次。(第一轮洗1次，第二轮洗5次，第三、四、五轮洗10次)；(c)每孔加入1mL0.lmo1/LHC1(用甘氨酸调pH值至2.2，含1g/LBSA)以洗脱噬菌体，室温静置10min，稍吹打后加入2mol/LTris中和；(d)用孔中的洗脱液感染2m1新制备的大肠杆菌XL1-b1ue，37℃摇动培养2小时，加入1012pfu辅助噬菌体VCSM13（空载噬菌体，辅助噬菌体），继续摇动培养1小时，加卡那霉素至终浓度70mg/L，30℃摇动培养过夜。离心，收集上清；(e)从(a)-(d)步为一轮，一共进行5轮，得到高浓度的特异性噬菌体和抗乙肝病毒表面抗原抗体融合蛋白。
2.4 直接法检测筛选抗体
将得到的抗乙肝病毒表面抗原抗体融合蛋白进行效价检测，并以市售抗体对（美国RA Biosources公司）作为对比。
采用直接法检测抗体效价，抗体标记ABEI，抗原包被磁球，检测方法如下：将150μL样本，20uL磁性微球，100μL Buffer，加到反应杯中37℃温育20min，外加磁场沉淀，去掉上清液，用洗液清洗沉淀复合物3次，加入200uLABEI，100μL Buffer，37℃温育5min，进入样品测量室，自动检测其光强（RLU）。
得到10株效果较好的抗体，进行测序，分别命名为2D1、2D4、2D8、2D6、7G5、6G5、7G3、8D5、9G6、6G4。
3. 纯化高效价抗体
3.1构建昆虫表达载体
将体外合成的轻链基因及载体pCHO1.0（购自优宝生物）均用AvrII和Bst117I进行酶切，纯化后连接。连接产物转化大肠杆菌JM109，将转化菌均匀涂布于含抗性的平板中，37℃过夜培养，PCR验证阳性菌。得到阳性质粒L- pCHO1.0。
将体外合成的重链基因及载体pCHO1.0（购自优宝生物）均用EcoRV和PacI进行酶切，纯化后连接。连接产物转化大肠杆菌JM109，将转化菌均匀涂布于含抗性的平板中，37℃过夜培养，PCR验证阳性菌。得到阳性质粒L-H- pCHO1.0。
3.2表达重组蛋白
将生长状态良好的CHO-K1细胞按1.5×106个/mL接种至500ml摇瓶，细胞体积共100ml，放37度，5% CO2摇床，100rpm培养4小时。转染：按照DNA:转染试剂=1:3的比例配制好转染复合物，逐滴加入上述准备的细胞中，边加边轻轻摇动细胞以使复合物充分散开。滴加完毕后旋紧瓶盖，将细胞放在37℃、5%CO2、100rpm条件下培养。转染当天记为第0天。第二天（即转染后培养48h）添加5%培养基体积的补料，并转移至32℃、5%CO2、100rpm条件下培养。在第四、六天各添加5%培养基体积的补料，培养条件维持不变。根据时间安排与细胞活率情况，可以在第八天或第九天收样。
3.3纯化重组蛋白
先采用亲和层析纯化重组蛋白，再采用离子交换柱进一步纯化蛋白，使其纯度≥95%。
实施例2 结果与分析。
1.筛选得到抗体效价检测。
结果如表1所示，2D1、2D8、7G5、6G5、9G6 的光强均远超过现有抗体光强，其中2D8的光强最高，达到了7024584。
表1 筛选得到抗体的效价检测（RLU）
2筛选配对抗体
选取亲和纯化后效价较高的5株抗体分别进行ABEI标记和磁球包被，分别做为检测抗体和捕获抗体，采用棋盘法双抗体夹心配对实验进行配对抗体的初步筛选。
采用化学发光免疫夹心法进行检测，在蛋白分光光度计上测出五株抗乙肝病毒表面抗原抗体的浓度；磁珠包被一株抗乙肝病毒表面抗原抗体，另一株抗乙肝病毒表面抗原抗体标记发光标记物ABEI，并对不同包被或标记溶液编号。
将150μl样本加入到反应杯中，然后再加入20μl包被抗体的磁性微球溶液，同时加入100μl标记ABEI的抗体溶液，混匀，37℃温浴10min，外加磁场将上述反应产物沉淀，去除上清液，并以缓冲液清洗3次，将200μl标记ABEI的抗体溶液加入上述沉淀中，混合均匀，37℃温浴20min，充分反应，形成双抗夹心复合物；外加磁场将上述双抗夹心复合物沉淀，去除上清液，并以缓冲液清洗3次后，加入发光底物(NaOH和H2O2)，检测发出的相对光强度（RLU）。在加入抗原量相同的情况下，光强越高，说明配对效果越好。
配对结果如表2所示，在25（5×5）种抗体配对组合中，有10种组合可形成双抗体夹心配对，其中，具有较好配对效果的共有3种组合：2D8-7G5、2D8-6G5、6G5-7G5。
表2 五株抗体的配对检测结果。
3可配对抗体的特性鉴定
3.1配对抗体的阳性检出率评价
以市售抗体对为对比例，收集乙肝病毒表面抗原核酸检测为阳性的307份血清样本，使用候选的3对配对抗体对样本进行检测，确定待选配对抗体检测患者血清的阳性符合率。结果见表3。
表3 筛选得到配对抗体针对乙肝表面抗原阳性样本的检出率
结果如表3所示，针对307个阳性样本，三个抗体对都有较好的检出率，其中抗体对2D8-7G5的检出率最高，为99.02%。
3.2特异性评价
将上述筛选得到阳性检出率高的三对抗体，应用其对收集到的经核酸检测的159份丙肝患者血清样本、108份梅毒患者血清样本、243份正常人血清样本进行检测，结果如表4所示。
表4 针对阳性检出率高的三对抗体对的交叉反应率评价
样本 丙肝 梅毒 正常人血清
样本数量 159 108 243
HbsAb-1-2阴性率 98.66% 95.21% 93.47%
2D8-7G5阴性率 99.37% 100% 100%
2D8-6G5阴性率 93.71 94.44% 99.59%
6G5-7G5阴性率 96.23% 96.33% 98.77%
上述结果显示，抗体对2D8-7G5的阳性检出率，灵敏度，交叉反应阴性率均优于对比例及其余两对抗体。
3.3灵敏度评价
将上述实验中特异性最高的抗体对2D8-7G5进行灵敏度评价，针对国家阴性血清参考品样本盘，利用2D8-7G5抗体对进行检测，所有样本型均为阴性，符合要求，结果见表5。
由于已知的乙肝病毒表面抗原具有不同的变异型和野生型，因此抗体对需具有对不同表型的乙肝病毒表面抗原的检出力，因此，本实验对不同表型抗原进行梯度稀释，将上述筛选得到阳性检出率及特异性最高的一对抗体进行灵敏度验证，确定待测配对抗体的灵敏度，下述实验结果中，相对光强度高于2000为检出，标记为 “ + ”。
针对乙肝表面抗原国家参考品亚型和突变型，分别将不同抗原按梯度稀释成以下浓度（0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28），再进行测定，结果见表6表7。实验结果表明，针对不同表型的乙肝表面抗原，抗体对均以较高的灵敏度检出。
表5 针对国家阴性血清参考品的灵敏度
样本型 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10
RLU 1083 1038 1032 815 786 1002 875 1189 1041 1079
样本型 N11 N12 N13 N14 N15 N16 N17 N18 N19 N20
RLU 1007 888 892 1108 701 769 997 922 917 980
表6 针对乙肝表面抗原国家参考品亚型的灵敏度
抗原（IU/mL） 1.28 0.64 0.32 0.16 0.08 0.04 0.02 0
adr1 0.05 + + + + + + - -
adr2 0.1 + + + + - - - -
adr3 0.2 + + - - - - - -
adw1 0.05 + + + + + - - -
adw2 0.1 + + + + - - - -
adw3 0.2 + + + + + - - -
ay1 0.1 + + + + + - - -
ay2 0.2 + + + + - - - -
ay3 0.4 + + - - - - - -
表7 针对乙肝表面抗原突变株的灵敏度
抗原（IU/mL） 1.28 0.64 0.32 0.16 0.08 0.04 0.02 0
T123N + + + - - - - -
T123N + T124S + + + + + - - -
P124L-F/Y1543H- D144E-G145R + + + + + - - -
I110R-S1171-G119R-T123N + + + + - - - -
122+DT + + + - - - - -
122+DT-G145R + + + + + - - -
G145R + + + + - - - -
D144A + + + - - - - -
P142L-G145R + + + - - - - -
P142S-G145R + + + - - - - -
4抗体稳定性实验
按表8配方分别配制抗体稳定液，按照前述方法制备得到的抗体2D8，用下表稳定液分别将抗体2D8稀释为1500 pg/mL，稀释后的抗体溶液平均分为7份，40℃避光放置，每5天取1份按检测抗体浓度，结果如表9所示，为了使结果更加直观，绘制抗体2D8降解率随时间变化的曲线。
表8 稀释液组分配方
表9 不同稳定液保存抗体30天的降解率变化
检测结果如图1图2所示，2D8的降解率随时间的变化曲线反映了稳定稀释液对抗体的保护作用，可见，与对比例次相比，本实验中的稳定液A-L对抗体2D8有均有一定的保护作用。其中稳定液L中当缓冲液pH=7.2、BSA 1.5%、NaN30.03%、青霉素0.6%、甘油0.5%时，抗体降解速率更低，经验证，稳定液L对另一株抗体7G5同样有良好的稳定作用，30天后降解率仅为8.33%，因此可作为稳定保存液应用于两株抗体。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司
<120> 抗乙肝病毒表面抗原抗体、抗体对、含有其的检测试剂及试剂盒
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu Tyr
1 5 10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Gln Trp Ser Thr Tyr Pro Pro Trp Thr
1 5 10
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Asn Tyr Gly Val Asn
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Ile Ile Trp Ala Asn Arg Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser
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His Asp Asp Asp Gln Met Asp Tyr
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<211> 11
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 8
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Phe Thr
1 5
<210> 10
<211> 5
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Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 11
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Thr His Tyr Asp Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser Gly His Tyr Phe Asp Tyr
1 5
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Leu Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
20 25 30
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser
50 55 60
Pro Arg Leu Leu Thr Phe Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
100 105 110
Ser Thr Tyr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Lys
<210> 14
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Met Ala Gly Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Ala Phe Pro Ser Cys
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
20 25 30
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Asn Asn Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Ile Ile Trp Ala Asn Arg Thr Asn Tyr Asn Ser Ala
65 70 75 80
Leu Met Ser Thr Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Asn Glu Thr Val Leu
85 90 95
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe
100 105 110
Cys Ala Arg His Asp Asp Asp Gln Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Ser Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 15
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn
100 105 110
Thr Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 16
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Leu Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg His Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Thr His Tyr Asp
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Ser Lys Gly Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Phe Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Gly His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 17
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 18
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Arg Gly Leu Thr Phe Leu Lys Asn Val Ser Ser Thr Cys Ala Ala Ser
1 5 10 15
Pro Ser Thr Asp Ile Leu Thr Phe Thr Ile Pro Pro Ser Phe Ala Asp
20 25 30
Ile Phe Leu Ser Lys Ser Ala Asn Leu Thr Cys Leu Val Ser Asn Leu
35 40 45
Ala Thr Tyr Glu Thr Leu Asn Ile Ser Trp Ala Ser Gln Ser Gly Glu
50 55 60
Pro Leu Glu Thr Lys Ile Lys Ile Met Glu Ser His Pro Asn Gly Thr
65 70 75 80
Phe Ser Ala Lys Gly Val Ala Ser Val Cys Val Glu Asp Trp Asn Asn
85 90 95
Arg Lys Glu Phe Val Cys Thr Val Thr His Arg Asp Leu Pro Ser Pro
100 105 110
Gln Lys Lys Phe Ile Ser Lys Pro Asn Glu Val His Lys His Pro Pro
115 120 125
Ala Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu
130 135 140
Ser Ala Thr Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Ser Pro Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ser Val Gln Trp Leu Gln Arg Gly Gln Leu Leu Pro Gln Glu Lys Tyr
165 170 175
Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gly Ala Pro Gly Phe Tyr Phe
180 185 190
Thr His Ser Ile Leu Thr Val Thr Glu Glu Glu Trp Asn Ser Gly Glu
195 200 205
Thr Tyr Thr Cys Val Val Gly His Glu Ala Leu Pro His Leu Val Thr
210 215 220
Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val
225 230 235 240
Ser Leu Ile Met Ser Asp Thr Gly Gly Thr Cys Tyr
245 250
<210> 19
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atggacttcc aagtgcagat cttcagcttc ctgctgatca gcgctagcgt gatcctgagc 60
agaggacaga tcgtgctgac acagagccct gccatcatga gcgctagccc tggcgagaag 120
gtgaccatga cctgcagcgc tagcagcagc gtgagctacc tgtactggta tcagcagaag 180
cctggcagca gccctagact gctgaccttc gacacaagca acctggctag cggcgtgcct 240
gtgagattca gcggcagcgg cagcggcaca agctacagcc tgaccatcag cagaatggag 300
gccgaggacg ccgccaccta ctactgtcag cagtggagca cctaccctcc ttggaccttc 360
ggcggaggca ccaagctgga gatcaag 387
<210> 20
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atggccggcc tgggcctgct gttctgcctg gtggccttcc ctagctgcgt gctgagccaa 60
gtgcagctga aggagagcgg ccctggcctg gtggccccta gccaaagcct gagcatcacc 120
tgcaccgtga gcggcttcag cctgaacaac tacggcgtga actgggtgag acagcctcct 180
ggcaagggcc tggagtggct gggcatcatc tgggccaaca gaaccaacta caacagcgcc 240
ctgatgagca ccctgaccat cagcaaggac aacaacgaga ccgtgctgtt cctgaagatg 300
aacagcctgc agagcgacga caccgccatg tacttctgcg ctagacacga cgatgatcag 360
atggactact ggggccaagg cacaagcgtg accgtgagca gc 402
<210> 21
<211> 368
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atgatgagca gcgctcagtt cctgggcctg ctcctgctgt gcttccaagg cacaagatgc 60
gacattcaga tgacacagac cacaagcagc ctgagcgcta gcctgggcga cagagtgacc 120
atcagctgca gagctagcca agacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagcct 180
gacggcaccg tgaagctgct gatctactac acaagcagac tgcacagcgg cgtgcctagc 240
agattcaccg gcagcggcag cggaaccgac tacagcctga ccatcagcaa cctggagcaa 300
gaggacatcg ccacctactt ctgtcagcaa ggcaacaccc tgcctttcac cttcggcagc 360
ggcaccaa 368
<210> 22
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atgggctgga gctgcatcat gctgttcctg gtggccaccg ccaccggcgt gcacagccaa 60
gtgcagctgc agcagcctgg cagcgagctg ctgagacctg gcgctagcgt gaagctgagc 120
tgcaaggcta gcggctacac cttcacaagc tactggatgc actgggtgaa gcagagacac 180
ggccaaggcc tggagtggat cggacagatc taccctggca gcggcaccac ccactacgac 240
gagaagttca agagcaaggg caccctgaca gtggacacaa gcagcagcac cgccttcatg 300
cacctgagca gcctgacaag cgaggacagc gccgtgtact actgcacaag aagcggccac 360
tacttcgact actggggcca aggcaccacc ctgaccgtca gcagc 405

Claims (12)

1.一种抗乙肝病毒表面抗原抗体2D8，包含轻链可变区和重链可变区，其轻链可变区的CDR-L1氨基酸序列为SEQ ID NO:1，CDR-L2氨基酸序列为SEQ ID NO:2，CDR-L3氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其重链可变区CDR-H1氨基酸序列为SEQ ID NO:4，CDR-H2氨基酸序列为SEQID NO:5，CDR-H3的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
2.一种抗乙肝病毒表面抗原抗体7G5，包含轻链可变区和重链可变区，其轻链可变区的CDR-L1氨基酸序列为SEQ ID NO:7，CDR-L2氨基酸序列为SEQ ID NO:8，CDR-L3氨基酸序列为SEQ ID NO:9，其重链可变区CDR-H1氨基酸序列为SEQ ID NO:10，CDR-H2氨基酸序列为SEQ ID NO:11，CDR-H3的氨基酸序列为SEQ ID NO:12。
3.根据权利要求1所述的抗乙肝病毒表面抗原抗体2D8，包含轻链可变区和重链可变区，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:14。
4.根据权利要求2所述的抗乙肝病毒表面抗原抗体7G5，包含轻链可变区和重链可变区，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:15，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:16。
5.根据权利要求1-4任一项所述的抗体，还包括轻链恒定区和/或重链恒定区，所述轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO:17，所述重链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO:18。
6.一种编码权利要求3所述的抗体2D8或权利要求4所述的抗体7G5的核苷酸分子，其特征在于，编码所述抗体2D8的轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:19，重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:20；编码抗所述体7G5的轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:21，重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:22。
7.一种抗乙肝病毒表面抗原抗体对，包括权利要求1或3所述的抗体2D8或/和权利要求2或4所述的抗体7G5。
8.一种乙肝病毒表面抗原检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包含权利要求7所述的抗体对。
9.根据权利要求8所述的一种乙肝病毒表面抗原检测试剂，其特征在于，还包括稳定稀释液，所述稳定稀释液包括缓冲液、基础组分和保护组分。
10.根据权利要求9所述的一种乙肝病毒表面抗原检测试剂，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述基础组分包括牛血清白蛋白BSA和叠氮钠NaN3，所述保护组分包括青霉素和甘油。
11.根据权利要求10所述的一种乙肝病毒表面抗原检测试剂，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2；所述BSA的含量为1.5 m/v %；所述NaN3的含量为0.03 m/v %；所述青霉素的含量为0.6 m/v %；所述甘油的含量为0.5 v/v %。
12.一种乙肝病毒表面抗原检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求8-11中任一项所述的检测试剂。
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