KR20220087516A - 신규 항-Nogo-A 항체 - Google Patents

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베누와 콤발루지에르
마이클 안드레아스 마우러
에두아르도 파울로 모라스키 비안나
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노바고 테라퓨틱스 아게
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Abstract

신규 인간-유래 단일클론 중화 Nogo-A 특이적 항체 뿐만 아니라 이의 단편, 유도체 및 변이체 뿐만 아니라 이와 관련된 방법이 제공된다. Nogo-A 특이적 항체와 관련된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 및 키트도 제공된다. 항체, 면역글로불린 쇄(들), 뿐만 아니라 이의 결합 단편, 유도체 및 변이체는 각각 Nogo-A 표적 면역요법 및 진단을 위한 약학 및 진단 조성물에 사용될 수 있다.

Description

신규 항-Nogo-A 항체
본 발명은 일반적으로 망막병증을 포함하는 중추 신경계의 질환 및 외상의 치료에 유용한, Nogo-A에 특이적으로 결합하고 이를 중화시키는 신규한 인간-유래 항체 뿐만 아니라 이의 단편, 유도체 및 생명공학적 변이체에 관한 것이다.
망막을 포함한 중추신경계 조직(CNS)은 손상된 조직을 재생하는 능력이 제한되어 있다. CNS 재생은 성장 신호의 다양한 세포-내인성 억제제 뿐만 아니라 세포-외인성 기전에 의해 방지된다. 후자는 신경교 상흔과 수초에 풍부한 성장 억제 인자를 포함한다. Nogo-A는 혈관계 및 뉴런 세포 모두의 손상된 중추 신경계에서 회복 및 가소성의 양을 제한하는 수초-관련 인자 중 하나로 확인되었다(W
Figure pct00001
lchli et al., PNAS, 2013). 이것은 망상 단백질 집단의 구성원이며 적어도 2개의 생물학적으로 활성이고 약리학적으로 구별되는 도메인, Nogo-66 및 Nogo-AΔ20을 가지고 있으며 둘 다 신경돌기 성장에 대한 강력한 억제 활성을 보유한 것으로 나타났다(GrandPre et al., Nature 417 (2002), 547-51; Oertle et al., J. Neurosci. 23 (2003), 5393-406). 따라서, Nogo-A의 억제 활성을 차단하는 것은 혈관 및 뉴런의 복구 및 성장을 개선하고 촉진함으로써 CNS 조직의 혈관 및 뉴런 요소의 손상 또는 변성을 동반하는 장애 또는 증상의 치료를 위한 귀중한 약학적 표적으로 밝혀졌다(Pernet, BBA - Molecular Basis of Disease, 2017에서 검토됨).
이러한 맥락에서, 신경돌기 성장의 강력한 억제제인 래트 수초 단백질, NI-220/250에 대해 생성된 뮤린 단일클론 항체 IN-1이 CNS 손상 후 축삭 재생 및 기능 회복을 촉진하는 것으로 보고되었다(Schnell and Schwab, Nature 343 (1990), 269-272; Bregman et al., Nature 378 (1995), 498-501, Thallmair et al., Nature Neuroscience 1 (1998), 124-131, 및 Chen et al., Nature 403 (2000), 434-439). Nogo-A를 표적으로 하는 치료적으로 유효한 단일클론 항체를 개발하기 위한 추가적인 시도가 이루어졌다. 예를 들어, WO2004/052932 A2에는 시험관 내 및 생체 내에서 Nogo-A-유도된 억제를 효율적으로 차단하는 것으로 나타난 뮤린 항체 11C7이 기재되어 있다(상기 Oertle et al. (2003); Liebscher et al., Annals of Neurology 58 (2005), 706-719). 예를 들어, 살아있는 동물에서, 11C7의 투여는 래트의 척수 병변 후의 축삭 성장 및 보행운동 회복을 자극할 수 있었고 CNS의 허혈성 손상 후 혈관 재생을 촉진하는 것으로 나타났다(상기 Liebscher et al. (2005); Joly et al., Glia 66 (2018), 2079-2093; Rust et al., PNAS 116 (2019), 14270-14279). 또한, 문헌[Lindau et al., Brain (2013)]에 의한 연구에서, 피질척수로 절단 후, 또는 감각운동 피질에 대한 편측 부분 광혈전성 뇌졸중 후 항체 11C7을 척수강내 적용한 것(Wahl et al., Science 344 (2014), 1250-5)이 성체 래트에서 미세한 앞다리 움직임의 높은 수준의 기능 회복을 초래하는 것이 관찰되었다. 척수강내 항-Nogo-A 항체 적용에 의한 팔-손 기능의 상당한 정도의 기능 회복은 경추 척수 또는 운동 피질 손상이 있는 마카크 원숭이에서도 관찰되었다(Freund et al., Nat Med. 12 (2006), 790-2; Hamadjida et al., Exp Brain Res. 223 (2012), 321-40). 또한, Nogo-A 비활성화는 망막 손상 후 시각적 가소성 및 회복을 향상시키는 것을 볼 수 있다; 예를 들어, 문헌[Mdzomba et al., Cell Death and Disease (2018) 9:727] 참조.
추가의 단일클론 항-Nogo-A 항체는 국제출원 WO2005/061544 A2(뮤린 항체 2A10 및 이의 인간화 버전 H1 L11), WO2007/068750 A2 및 WO2009/056509 A1(ATI355, HuMabmouse™에서 생성된 단일클론 항체 6A3으로부터 유래됨; 이 유전적으로 재구성된 마우스는 Medarex Inc에 의해 생산되었으며, 인간 면역글로불린 유전자가 이것의 뮤린 대응물을 대체한다)에 개시되어 있다. 이들 항체 중 일부는 척수 손상(SCI), 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 다발성 경화증(MS)의 치료를 위한 임상 시험 대상이다; 상기 문헌[Schmandke et al. (2014)], 및 문헌[Kucher et al., Neurorehabil. Neural Repair. (2018), 578-589] 참조. ATI335는 또한 NG-101로 지정되고 현재 급성 경추 척수 손상(SCI) 환자의 안전성 및 예비 효능에 대해 다기관, 다국적, 위약 대조 2-상 연구에서 조사되고, 특히 항체 치료법이 운동 기능 및 사지마비 환자의 삶의 질을 개선할 수 있는지 여부에 대해 조사되고 있으며, 여기서 항체는 45 ㎎의 척수강내 볼루스 주사에 의해 투여된다; 예를 들어, ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03935321 참조.
요약하면, 지금까지 단일클론 항-Nogo-A 항체의 개발은 척수 손상(SCI), 뇌졸중 또는 망막혈관병증을 포함한 망막병증과 같은, 망막을 포함한 중추신경계(CNS)의 손상 또는 장애 또는 변성을 수반하는 장애 또는 증상의 예방적 또는 치료적 치료에 대해 큰 가능성을 갖고 있다.
그러나, 단일클론 항체의 경우, 제품 기원은 면역원성에 영향을 줄 수 있는 중요한 요소이다. 마우스 항체가 키메라, 인간화 및 인간 단일클론 항체에 비해 인간에서 면역 반응을 강력하게 유발하는 것으로 나타났지만, 키메라, 인간화 및 인간 단일클론 항체도 투여 요법 및 환자 집단에 따라 높은 비율의 면역원성을 유발할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 사실, 파지 디스플레이를 이용하여 발생된 일부 인간 항체 및 트랜스제닉 마우스에서 유래된 완전한 "인간" 항체조차도 유의한 항-약물 항체(ADA) 반응을 나타낼 수 있다; 예를 들어, 문헌[Harding et al., MAbs. 2010 May-Jun; 2(3): 256-265] 및 문헌["Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products", U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) August 2014 Clinical/Medical] 참조. 따라서, 여러 경우에 상당한 수의 환자에서 지속적인 양성 ADA로 인해 치료가 중단되었다; 예를 들어, 문헌[Kuriakose et al., J. Immunology Research (2016), Article ID 1298473, http://dx.doi.org/10.1155/2016/1298473] 및 문헌[Davda et al. J. ImmunoTherapy of Cancer (2019) 7:105, https://doi.org/10.1186/s40425-019-0586-0] 참조.
이러한 맥락에서, 단일클론 항체의 면역원성은 또한 항체 제형물의 불순물 및 이질성으로 인한 것일 수 있으며, 예를 들어 항체의 화학적 분해 생성물 및 이에 따른 항체 분자의 안정성 부족으로 인한 것일 수 있다; 예를 들어 문헌[Doevendans and Schellekens, Antibodies 8 (2019), 21; https://doi.org/10.3390/antib8010021] 참조.
본 발명은 발명의 설명에 개시되고 하기 실시예 및 도면에 추가로 예시된, 청구범위에서 특징지어지는 구현예에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 망막을 포함한 중추 신경계(CNS) 및 말초 신경계(PNS) 조직의 손상 또는 장애 또는 변성을 동반하는 다양한 장애 또는 증상의 예방적 또는 치료적 치료에 특히 유용한, Nogo-A 특이적 인간-유래 단일클론 항체 및 이의 Nogo-A 결합 단편 뿐만 아니라 본 명세서에 예시된 항체의 동등한 합성 변이체 및 생명공학적 유도체에 관한 것이다.
실시예에 예시된 바와 같이, 복잡한 항체 발견 과정 내에서 다행스럽게도 고친화도 인간 단일클론 항-Nogo-A 항체가 클로닝되고 식별될 수 있으며, 이는 예를 들어, 성장 억제 CNS 수초의 존재 하에 신경돌기의 성장을 향상시키거나, 큰, 편측의 운동 피질 뇌졸중 후 성체 래트의 손상된 앞다리의 기능적 회복을 향상시키거나, 또는 뇌졸중의 마우스 모델에서 뇌졸중 손상 후 반음부의 혈관신생을 증가시킴으로써, Nogo-A의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있다. 이 항체는 적어도, 예를 들어 뇌졸중 후 숙련된 앞다리 사용의 기능적 회복을 야기한 뇌졸중 연구에서, "금표준(gold standard)"으로 간주되는 이전에 확립된 마우스 항-Nogo-A 항체 "11C7"만큼 효과적이다. 특히, 본 발명의 범위 내에서 수행된 실험은 운동 피질의 영구적인 뇌졸중 후 성체 마우스의 반음부 내에서 본 발명의 항-Nogo-A 항체에 의해 혈관신생이 유도됨을 입증한다; 예로서, 실시예 9 참조. 따라서, 본 발명의 항-Nogo-A 항체는 일반적으로 선(pro)-혈관신생 효과 및 손상 후 3주 후까지 허혈성 경계 구역에서 혈관 복구/성장을 촉진할 수 있음을 특징으로 할 수 있다. 또한, 또는 대안적으로 본 발명의 항-Nogo 항체는 대조군에 비해 새로 형성된 혈관 내피 세포의 수를 증가시키는 데 확연한 효과를 가지며 이를 형성할 수 있음을 특징으로 할 수 있다; 예로서, 실시예 9 참조.
요약하면, 본 발명에 따라 수행된 실험은 신경돌기 성장 및 재생을 위한, 그리고 예를 들어 뇌졸중 후의 기능 및 혈관 복구를 위한 강력한 항-Nogo-A 항체를 식별하는 데 성공적이었다.
또한, 본 발명에 따라 수행된 추가 실험에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 항-Nogo-A 항체는 인산염 완충 식염수(PBS)와 같은 일반적인 완충액(PBS 내 적어도 최대 20 ㎎/㎖)에 매우 가용성이고 특히 안정하며, 예를 들어 반복된 동결-해동 주기(PBS 용액 pH 7.4, 7 ㎎/㎖)는 검출가능한 수준의 응집 및 분해 산물로 이어지지 않았다; 예로서, 실시예 10 및 도 9 참조.
놀랍게도, 본 발명의 항체는 Nogo-AΔ20(d20) 도메인(>160개 초과의 아미노산까지 늘어남)에 결합하고 적어도 항-Nogo-A 항체 11C7만큼 효과적이지만, 이는 11C7 및 기타 알려진 항-Nogo-A 항체 오자네주맙(Ozanezumab) 및 ATI355의 에피토프와 상이한 에피토프를 인식하며, Nogo-A에 대한 결합에 대해서 항체 11C7과 경쟁하지 않는다. 특히, 실시예 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체 NG004는 연장된 d20plus 영역 그리고 억제 영역의 일부 추가 아미노산 C- 및 N-말단(인간 아미노산 위치 543-866)에 결합한다. 에피토프 매핑은 본 발명의 항체 NG004에 의해 인식되는 최소한의 에피토프로서 자연적 Nogo-A 단백질의 아미노산 683-689에 해당하는 아미노산 141-INAALQE-147(서열번호 21)을 포함하는 인간 Nogo-A d20plus 영역 내의 서열을 확인했다; 실시예 4 및 도 3 참조. 따라서, 일 구현예에서, 항체는 아미노산 서열 INAALQE(서열번호 21)를 포함하는 Nogo-A 에피토프에 결합한다; 실시예 4 참조. 따라서, 본 발명은 항체 NG004와 동일한 결합 특이성을 갖는, 즉 뇌졸중 마우스 모델에서 뇌졸중 손상 후 반음부에서 성장 억제 CNS 수초의 존재 하에 신경돌기의 성장을 향상시키고 및/또는 혈관신생을 증가시키는 특징을 갖는 항체 또는 이의 결합 단편에 관한 것이고; 여기서 항체 또는 이의 결합 단편은 바람직하게는 Nogo-AΔ20(d20) 도메인, 특히 아미노산 서열 141-INAALQE-147(서열번호 21)에 결합한다. 언급된 특징은 첨부된 실시예에 개시된 실험 및 분석에 따라 쉽게 결정될 수 있으며, 여기서 항체 NG004는 참조 항체로서 사용될 수 있다. 전형적으로, 이러한 항체는 각각 동일한 에피토프 및 펩티드에서 Nogo-A에 결합하기 위해 상응하는 참조 항체와 경쟁할 것이다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체 NG004로부터 유래되며 도 1의 A에 도시되고 하기 도 1에 관한 도면 범례에서 설명된 바와 같은 서열번호 2 및 서열번호 7 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역을 특징으로 할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체 NG034로부터 유래되며 도 1의 B에 도시되고 하기 도 1에 관한 도면 범례에서 설명된 바와 같은 서열번호 12 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL 쇄의 CDR 또는 초가변 영역을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 범위 내에서 수행된 추가 실험은 본 발명의 항체가 Nogo-A를 발현하는 세포 및 조직을 면역염색할 수 있음을 드러냈다. 특히, 면역형광염색을 통해 인간 희소돌기아교세포 세포주 MO3.13(Nogo-A를 세포 표면뿐만 아니라 세포 내에서도 발현함) 및 래트의 뉴런 세포주 Neuroscreen-1(NS-1) 뿐만 아니라 래트 CNS 조직의 희소돌기아교세포 및 운동뉴런은 NG004에 의해 양성 대조군 항체 11C7 및 오자네주맙과 유사한 정도로 양성으로 염색된 것으로 나타났다. 본 발명에 따라 수행된 실험 과정에서, 본 발명의 항체 NG004는 예를 들어 성장 억제 CNS 수초를 함유하는 Nogo-A의 존재 하에 신경돌기 성장을 유도하기 위한 15 nM 미만 및 심지어 12 nM 미만의 IC50을 갖는, 지금까지 금표준으로 사용된, 항체 11C7만큼 적어도 효율적임이 추가로 밝혀졌다; 실시예 8 참조.
따라서, 본 발명의 범위 내에서 수행된 실험에서 얻은 결과에 기초하여, 원하지 않는 Nogo-A 활성과 연관된 장애의 치료에 치료적으로 유용한 새로운 부류의 항-Nogo 항체가 제공된다.
본 발명은 본 발명에 따라 수행되고 실시예에 기재된 실험에서 원래 수득된 인간-유래 항체를 참조하여 예시되고 설명되지만, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 화학 또는 재조합 기술에 의해 합성되고, 대상 항체의 기능적 특성 중 하나 이상, 특히 Nogo-A에 대한 그의 중화 활성을 유지하는, 임의의 조작된 항체 또는 항체-유사 Nogo-A 결합 분자를 의미하는 항체의 합성 및 생명공학적 유도체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 간결함을 위해 항체를 참조하여 설명될 수 있지만, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "항체"의 의미 내에 이의 합성 및 생명공학적 유도체 뿐만 아니라 동등한 Nogo-A 결합 분자가 의미되고 포함된다.
본 발명의 추가 구현예는 이하의 발명의 설명 및 실시예로부터 명백할 것이다.
도 1: 가변 영역의 아미노산 서열, 즉 본 발명의 항-Nogo-A 특이적 인간 항체 NG004(A) 및 NG034(B)의 중쇄 및 카파 경쇄(VH, VL). 프레임워크(FR) 및 상보성 결정 영역(CDR)이 표시되어 있으며, CDR은 밑줄이 그어져 있다. 카밧(Kabat) 번호매김 체계가 사용되었다(http://www.bioinf.org.uk/abs/; 언급된 웹 참고문헌에서 인용된 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)] 및 본 명세서에 참조로서 포함되는, WO 2015/092077 A1의 28 페이지의 표 1에 제공된 것 참조). 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 항체 또는 이의 Nogo-A-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에서 특정 아미노산 잔기 위치의 수에 대한 참조는 카밧 번호매김 시스템에 따르지만, 이는 이론적이며 본 발명의 모든 항체에 동일하게 적용되지 않을 수 있다. 예를 들어, 첫 번째 CDR의 위치에 따라 그 다음의 CDR은 어느 방향으로 이동될 수 있다. 따라서, 도 1 및/또는 서열 목록의 CDR의 표시에 관한 임의의 부주의한 오류 또는 불일치가 있는 경우, 본 기술분야의 기술자는 본 출원의 개시 내용, 즉 항체 NG004 및 NG034의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 아미노산 서열에 기초하여, 청구된 항체 및 이의 Nogo-A-결합 단편을 정의하는 데 사용될 수 있는, 카밧에 따라 정확한 CDR 서열을 잘 결정하는 위치에 있다. 서열번호 2 및 7 (A)에 제시된 항체 NG004 및 서열번호 12 및 17 (B)에 제시된 항체 NG034의 가변 중쇄 VH 및 경쇄 VL 서열이 도시되어 있다. 발명의 설명에서 추가로 설명된 바와 같이, 문헌[Mirsky et al., Mol. Biol. Evol. 32 (2014) 806-819], 813 페이지, 도 6, 특히 AB 또는 LG 모델에서, 예로서 2개의 아미노산의 위치가 교환되도록, 예시된 바와 같이 원래의 아미노산 단독 또는 인접한 아미노산과 함께 이의 물리화학적 특성을 고려한 CDR 및/또는 프레임워크 영역 내에서의 보존적 아미노산 치환이 선호된다.
도 2: 재조합적으로 발현된 인간 및 래트 Nogo-A의 d20plus 영역, 및 래트 뇌량 희소돌기아교세포에 대한 항체 NG004 및 NG034의 결합 특이성. (a) NG004는 높은 친화도/결합력(avidity)으로 인간 Nogo-A d20plus 영역에 결합한다. NG004의 EC50 값은 0.26 nM이다. (b) NG004는 래트 Nogo-A d20plus 영역에 약하게 결합한다. (c) NG034는 높은 친화도/결합력으로 인간 Nogo-A d20plus 영역에 결합한다(NG034의 EC50 값은 0.298 nM이다). (d) NG034는 높은 친화도/결합력으로 래트 Nogo-A d20plus 영역에 결합한다(NG034의 EC50 값은 0.229 nM이다). (e) NG004 및 NG034는 고정된 래트 뇌 조직 절편의 면역형광 염색에 의해 나타난 바와 같이 래트 뇌량 희소돌기아교세포를 양성으로 염색하여 대조군 항체 오자네주맙과 유사한 염색 패턴을 생성한다. 이차 당나귀 항-인간 Cy3-표지(Do x Hu Cy3) 항체 단독으로는 염색이 관찰되지 않는다.
도 3: 펩스캔 분석에 의해 평가된 항체 NG004의 Nogo-A 결합 에피토프. NG004의 펩스캔 이미지. NG004 결합은 Nogo-A d20plus 영역의 아미노산 141-147을 커버하는 펩티드 34, 35 및 36(흰색 상자)에서 발생했다(펩티드 34: 133-EEIKEPENINAALQE-147 서열번호 22, 펩티드 35: 137-EPENINAALQETEAP-151 서열번호 23, 펩티드 36: 141-INAALQETEAPYISI-155 서열번호 24, 공통 결합 서열: 141-INAALQE-147 서열번호　21).
도 4: 항체 오자네주맙 및 11C7을 이용한 Nogo-A에 대한 경쟁적 결합에 대한 항체 NG004 및 NG034의 교차-경쟁 분석. NG004는 항체 오자네주맙(a) 및 11C7(b)과 경쟁적 결합을 나타내지 않는다. NG034는 인간 d20plus 영역에서 NG004 및 11C7과 경쟁적 결합을 나타내지 않는다(c).
도 5: NG004의 생체 내 표적 맞물림(engagement)은 일주일 동안 NG004를 이용한 래트의 척수강내 치료 및 그 후의 면역형광 염색에 의한 CNS의 Nogo-A 및 Nogo-B 단백질 수준의 분석에 의해 분석되었다. (a) NG004는 CNS에서 내인성 Nogo-A 수준을 하향조절한다. (b) NG004는 CNS에서 내인성 Nogo-B 수준을 상향조절한다. (c) NG004는 CNS에서 내인성 NgR1 수준을 상향조절한다.
도 6: 장기간의 강화작용(LTP)에 대한 NG004의 효과는 마우스 해마의 생체 외 분석에서 분석되었다. (a) 양성 대조군으로 사용된 항체 11C7은 Nogo-A를 차단함으로써 LTP를 증가시킨다. FG12는 불활성 대조군 항체이다. (b) 항체 NG004는 11C7과 유사한 생체 외 활성을 입증하고, 즉 LTP를 증가시킨다. (c) 더 높은 용량의 NG004(25 ㎍/㎖)는 효과 크기 및 작용의 개시를 증가시킨다.
도 7: 성장 억제 CNS 수초 추출물 및 항-Nogo-A 항체의 존재 또는 부재 하에 N1E 마우스 신경모세포종 세포의 시험관 내 신경돌기 성장 분석. (a, b) NG004는 항체 11C7과 매우 유사하게, 용량 의존적 방식으로 래트 척수 추출물(SCE)의 존재 하에 신경돌기 성장을 자극한다. (c, d) NG004 및 NG034는 항체 ATI355와 매우 유사하게, 비-인간 영장류(CNSE)의 CNS 추출물의 존재 하에 신경돌기 성장을 자극한다. 각각의 비활성 대조군 항체 3.1 IgG1은 효과가 없다.
도 8: 성체 마우스의 생체 내 뇌졸중 모델; 뇌졸중 3주 후에 국소 뇌졸중 중심 주변의 허혈성 경계 영역의 혈관 복구 정도. (a) NG004는 대조군 항체 FG12/B5와 비교하여 허혈성 경계 구역 내의 혈관 면적을 증가시킨다. (b) NG004는 대조군 항체 FG12/B5와 비교하여 혈관 가지의 수를 증가시킨다. (c) NG004는 대조군 항체 FG12/B5와 비교하여 허혈성 경계 구역 내에서 혈관 길이를 증가시킨다. (d) NG004는 CD31+ 내피 세포의 증식 속도를 증가시킨다. NG004 및 11C7에 대해 모든 매개변수의 효과 크기는 유사하다.
도 9: 반복된 동결-해동 주기(b) 및 상이한 pH 값(a)에 따른 NG004의 크기 배제 크로마토그래피 분석은 항체가 매우 안정함을 보여준다.
도 10: 허혈성 뇌졸중 및 2주간의 항-Nogo-A 치료 후 기능 회복. 래트는 편측성 광혈전성 뇌졸중을 받았고 2개의 상이한 항-Nogo-A 항체(11C7 [4 ㎎/㎖]; NG004 [4 ㎎/㎖ 또는 8 ㎎/㎖]), 또는 대조군 항체(BrdU 항체, 4 ㎎/㎖)로 삼투성 미니 펌프로 2주 동안 척수강내 연속 치료되었다(2 ㎖). 상이한 치료 군의 수평 사다리 성공 점수 평가(손상된 앞다리: 올바른 걸음 수/총 걸음 수). (a) 손상 후 주간 수평 사다리 성능의 타임라인. (b) 손상 후 63일째의 성능. NG004 8 ㎎으로 치료된 동물은 항-BrdU 치료된 동물과 비교하여 유의한 개선을 나타냈다. NG004 4 ㎎ 동물은 분명한 개선 경향을 나타냈다.
도 11: NG004 이소형(IgG1 및 IgG4), 리툭시맙(IgG1, 맙테라) 및 나탈리주맙(IgG4, 티사브리)을 사용하여 ELISA 기반 CDC 분석에서 C1q 결합을 비교했다. NG004 IgG4 S228P는 C1q에 대해 감소된 반응성을 나타내며 다른 IgG4(나탈리주맙)와 유사하게 거동한다.
일반적으로, 본 발명은 Nogo-A에 결합하고 이를 중화할 수 있는 인간-유래 단일클론 항체 뿐만 아니라 이의 단편, 유도체 및 변이체에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 발명의 설명에 개시되고 하기 실시예 및 도면에 추가로 예시된, 청구범위에서 특징지어지는 구현예에 관한 것이다. 인간 기원이라는 점, 즉 인체에서 원래 항체의 성숙, 및 Nogo-A에 대한 이의 중화 능력으로 인해, 상기 항체는 높은 치료적 가치가 있으며 바람직하게는 인간에서 실질적으로 비-면역원성이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 용어는 문헌[Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, revised 2000 and reprinted 2003, ISBN 0 19 850673 2; Second edition published 2006, ISBN 0-19-852917-1 978-0-19852917-0]에 제공된 정의를 따른다.
또한, 달리 언급되지 않는 한, 본 발명을 특징짓기 위해 본 명세서에서 사용된 용어 및 표현은 그 개시내용이 명백히 본 명세서에 참조로서 포함되는, WO 2015/092077 A1, 특히 28 페이지의 CDR 정의에 대한 표 1을 포함하여, 16 내지 42 페이지의 하위섹션 "I. 정의"에 제공된 바와 같은 정의를 따른다. 항체, 폴리뉴클레오티드 등에 대해 WO 2015/092077 A1에 개시된 일반적인 구현예에도 동일하게 적용된다. 또한, "본 발명의 배경기술"에 인용된 과학 간행물 및 특허 출원이 청구된 바와 같은 본 발명에 관한 선행 기술을 나타냄을 인정하지 않으면서, Nogo-A 및 항-Nogo-A 항체, 숙주 세포에서 이들의 재조합 생산, 정제, 변형, 약학 조성물에서의 제형물 및 치료적 용도 뿐만 아니라 본 기술분야에서 공통된 용어 및 특징에 관한 개시 내용은 청구된 바와 같은 본 발명을 수행하는 경우 본 기술분야의 기술자에 의존할 수 있다; 예를 들어, 문헌[Antibodies A Laboratory Manual 2nd edition, 2014 by Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA]을 참조하며, 여기서 또한 항체 정제 및 저장; 변성 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한, 조작 항체, 5'-RACE, 파지 디스플레이, 및 돌연변이유발, 면역블롯팅 프로토콜 및 최신 스크리닝 및 표지 기술이 설명된다.
용어 "중화" 및 "중화 항체"는 각각 항원 또는 살아있는 미생물의 적어도 일부의 생물학적 활성을 감소시키거나 없애는 항체를 의미하는 것으로 본 기술분야에서 통상적으로 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 항-Nogo-A 항체는, 만일, 적절한 양이, 예를 들어 실시예에 기재된 분석에서 Nogo-A의 활성을 없애거나 감소시키는 경우 중화 항체이다. 중화는 일반적으로 50% 억제 농도(IC 50)로 정의되며 중화 적정 곡선 아래 면적(AUC)을 기반으로 통계적으로 평가될 수 있다. 본 발명의 예시적인 항-Nogo-A 항체의 IC 50 값은 본 명세서에서, 예를 들어 도 5-8에 설명되고 도시된다. 특히, 본 발명의 항체의 중화 능력은, 예로서, 실시예 6-9에서 나타낸 바와 같이 분석될 수 있고 분석되었으며, 면역조직화학에 의해 결정된 바와 같이 항체가 CNS에서 내인성 Nogo-A를 생체 내 하향조절하고, 마우스 해마의 LTP 분석에서 결정된 바와 같이 장기간의 시냅스 가소성(장기간의 강화작용, LTP)을 증가시키며, 시험관 내 신경돌기 성장 분석에서 신경돌기 성장을 자극하고 생체 내 마우스 뇌졸중 모델의 반음부에서 혈관신생을 유도한다.
따라서, 일반적으로 본 발명은 Nogo-A의 생물학적 활성을 중화하고 예를 들어 실시예 8에서 입증된 바와 같이 성장 억제 CNS 추출물의 존재 하에 용량 의존적 신경돌기 성장을 유도하고 및/또는 예를 들어 실시예 9에서 입증된 바와 같이 뇌졸중 반음부에서의 혈관신생을 유도할 수 있는 인간-유래 재조합 단일클론 항-Nogo-A 항체 및 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
교질(Glia)-유래 축삭 성장 억제 단백질은 성체 CNS 손상 후 기능 복구를 제한한다. 무엇보다도, Nogo-A 및 예를 들어 MAG 및 OMgp는 뉴런 (공-)수용체, 예를 들어 Nogo 수용체-1(NgR1)과 같은 NogoA 수용체, 스핑고리피드 수용체 S1PR2 또는 LINGO-1이라고도 알려진 류신 풍부 반복체 및 면역글로빈-유사 도메인-함유 단백질과 상호작용하여, 축삭 성장의 억제를 초래하는 억제제이다. 예를 들어, 억제 단백질(예: Nogo-A)과 상호작용하면, NgR1 복합체는 성장 원추 붕괴 및 신경돌기 성장의 억제로 이어지는 신호를 전달한다. 위에서 언급한 바와 같이, 래트에서 NG004의 척수강내 투여에 대한 생체 내 연구는 대조군 항체 치료와 비교하여 CNS 조직에서 Nogo-A의 유의한 감소를 입증했다. 따라서, 리간드 Nogo-A의 수용체 결합을 억제하는 공지된 기전과는 대조적으로, 본 발명의 항체는 또한 시스템으로부터 리간드를 감소시키며, 즉 CNS에서 Nogo-A 수준을 하향조절함으로써, 이에 따른, 강력한 생물학적 효과를 입증한다.
래트 내 NG004의 척수강내 투여에 대한 생체 내 연구는, Nogo-A 수용체 NgR1이 상향조절되었음(도 5c 참조)을 추가로 입증했고, 이는 생체 내 NG004가 Nogo-A에 결합하고 CNS Nogo-A 수준의 하향조절 및 보상 기전으로서 그의 수용체 NgR1의 상향조절을 유도함을 시사한다. 따라서, 항-Nogo-A 항체, 바람직하게는 항체 NG004 또는 NG034를 이용한 치료 접근법은 Nogo-A에 대한 Nogo-A 수용체(예: NgR1, S1PR2 또는 LINGO-1) 결합도 억제하는 분자와 조합될 때 더욱 개선될 수 있다. 특히, 본 발명의 항-Nogo-A 항체, 즉 NG004 및 NG034는 시스템으로부터 Nogo-A를 제거하고 NgR1, S1PR2 또는 LINGO-1과 같은 Nogo-A 수용체는 자극을 받지 않는다. 이 기전은 그것의 신호전달을 방지하고 뉴런 성장을 촉진하는, MAG, OMgp 및 Nogo-A와 같은 수초-연관 성장 억제제에 대한 미끼, 또는 트랩으로 작용하는 최근 개발된 가용성 인간 융합 단백질인 AXER-204의 기전과 유사하다; 문헌[Bradbury and Oliveira, Brain 143 (2020), 1618-1622] 참조. 따라서, 본 발명의 항-Nogo 항체가 AXER-204로 치료될 수 있는 질환의 치료에 사용될 수 있을 것으로 신중히 기대된다.
따라서, 추가적인 측면에서 본 발명은 본 명세서에 정의된 말초(PNS) 및/또는 중추(CNS) 신경계의 질환 또는 외상의 치료에 사용하기 위한 항-Nogo-A 항체, 바람직하게는 NG004 또는 NG034를, 그의 수용체 복합체 또는 사후-수용체 신호전달 경로의 차단제에 대한 Nogo-A의 결합을 억제하는 분자와 함께, 적용하는 조합 치료법에 관한 것이다. Nogo-A 수용체 결합을 억제하는 분자는 본 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, NgR1-매개 신경돌기 성장 억제를 억제하는 단리된 폴리펩티드 단편이 WO 2007/089601 A1에 서술되어 있거나 또는 NgR1에 결합하여 NgR1에 대한 Nogo-A의 결합을 차단함으로써 Nogo-A에 의해 유도된 축삭 성장 억제의 억제를 초래하는 측면 후각로 안내 물질(LOTUS)이 문헌[Kurihara and Takei, Neural Regen Res. 10 (2015), 46-48]에 서술되어 있다. 또한, 항-LINGO-1 항체 Li81(오피시누맙)은 LINGO-1 기능을 차단하고 동물 모델에서 강력한 재수초화 활성을 나타낸다. 이 항체는 현재 재발성 형태의 다발성 경화증 환자를 위한 잠재적 치료제로 임상 2상 시험에서 조사되고 있다; 문헌[Hanf et al., mAbs 12(1) (2020), 1713648] 참조.
Nogo-A와 유사하게, 수초-연관 글리코단백질(myelin-associated glycoprotein, MAG) 및 희소돌기아교세포 수초 글리코단백질(oligodendrocyte myelin glycoprotein, OMgp)은 축삭-억제 역할을 하므로, 본 발명의 항-Nogo-A 항체를 이용한 치료는 항-MAG 및/또는 항-OMgp 항체와 조합될 수 있다; 예로서 문헌 [Yu et al., Transl. Stroke Res. 4 (2013), 477-483] 및 문헌[Irving et al., J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2005), 98-107] 참조.
또한, 예로서 실시예 8의 항체 NG004에 대해 입증된 바와 같이, 본 발명의 항체는 낮은 억제 농도(IC50)로 특히 높은 중화 활성을 갖는다. 특히, 신경돌기 성장을 자극하기 위한 본 발명의 항체의 IC50 값은 11.16 nM인 것으로 나타났으며, 이는 지금까지 금표준으로 사용된 참조 항체 11C7에 대해 결정된 IC50 값보다 현저히 낮은 것이다; 도 7a 참조. 따라서, 일 구현예에서, 항-Nogo-A 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 15 nM, 바람직하게는 12 nM 미만의 신경돌기 성장 억제 분석에서 신경돌기 성장의 유도를 위한 IC50 값을 나타낸다.
실시예 및 도면, 예를 들어 도 2에 추가로 예시된 바와 같이, 본 발명의 항체는 원래 인간 공여자로부터 단리되었으며 인간 Nogo-A에 결합하는 것으로 나타났다. 따라서, 일 구현예에서 본 발명의 항-Nogo-A 항체 및 Nogo-A 결합 단편은 항체 NG004로부터 유래되고 인간 Nogo-A d20plus 펩티드를 래트 또는 마우스와 같은 다른 종으로부터의 상응하는 항원보다 우선적으로 인식한다. 본 발명의 항체의 특이성 및 친화도와 같은 결합 특성은 본 명세서, 예를 들어 실시예 3 내지 5 및 도 2 내지 도 4에 기재 및 도시된 바와 같이 여러 실험 분석에서 시험되었다. 이러한 맥락에서, 결합 친화도의 척도를 얻기 위해, 실시예 3에서 수행된 ELISA에서 본 발명의 항체의 EC50을 결정하였다. 입증된 바와 같이, 본 발명의 항체는 EC50 값에 의해 결정된 바와 같이 특히 높은 명백한 결합 친화도를 보여준다. 특히, 인간 Nogo-A d20plus 펩티드에 결합하기 위한 항체 NG004의 EC50은 0.26 nM인 반면 래트 Nogo-A는 약하게만 결합된다; 실시예 3 참조. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체 NG034로부터 유래되고 인간 및 래트 Nogo-A를 높은 친화도로 인식한다. 특히, NG034의 EC50은 인간에 결합하는 경우 0.298 nM이고 래트 d20plus 영역에 결합하는 경우 0.229 nM이다; 실시예 3 참조. HEK 세포 상에서 발현된 인간 및 래트 Nogo-A에 대한 NG004의 결합은 면역침전 분석에 이은 웨스턴 블롯 검출에 의해 추가로 확인되었다.
따라서, 본 발명의 항체는 바람직하게는 신경돌기 성장 억제 분석에서 신경돌기 성장을 유도하기 위한 IC50 값이 15 nM 미만, 바람직하게는 12 nM 미만, 더 바람직하게는 약 11 nM이고 및/또는 인간 또는 래트 d20plus 영역에 결합하기 위한 EC50 값이 0.5 nM 미만, 바람직하게는 0.4 nM 미만, 더 바람직하게는 약 0.3 nM인 것을 특징으로 할 수 있다. 그러나, 또한 항체 포맷에 따라, 예를 들어 IgG1, IgG4 또는 Fab 단편과 같은 항체 단편이 사용되는지 여부에 따라, IC50 및 EC50 값이 다를 수 있으며 예를 들어 위에서 및 실시예에서 언급한 값보다 더 높거나 낮을 수 있다. 따라서, 이러한 맥락에서 용어 "약"은 실시예에서 참조 항체에 대해 결정된 값과 상이할 수 있는 값을 의미하고, 그 차이는 바람직하게는 한 자릿수 미만이고 가장 바람직하게는 동일한 자릿수 내이며, 예를 들어 IC50은 참조 값 ± 10 nM일 수 있고 EC50은 참조 값 ± 0.3 nM일 수 있다.
경쟁 분석에서 실시예 5 및 도 4에서 입증된 바와 같이, 대상 항체는 적어도 항체 11C7과는 Nogo-A에 대해 경쟁적 결합을 나타내지 않으며, NG004에 대해 나타낸 바와 같이 바람직하게는 오자네주맙과도 경쟁적 결합을 나타내지 않는다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 추가로 또는 대안적으로 Nogo-A에 대한 결합에 대해 항-Nogo-A 항체 11C7과 경쟁하지 않으며, 바람직하게는 오자네주맙과도 경쟁하지 않는다. 항체 간의 경쟁은 시험 중인 면역글로불린이 Nogo-A와 같은 공통 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합에 의해 억제되는 분석에 의해 결정된다. 수많은 유형의 경쟁적 결합 분석이 알려져 있다; 상기 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988), (2014)] 참조. 바람직하게는, 경쟁적 결합 분석은 실시예 5에 서술된 조건 하에 수행된다.
신경돌기 성장 억제제 Nogo-A는 3개의 억제 영역을 함유한다. 2개는 스플라이스 변이체 Nogo-B(2개의 막횡단 영역과 N-말단 끝에 있는 NIR 도메인 사이에 위치한 Nogo-66)와 공유되고 1개는 스플라이스 변이체 Nogo-C(Nogo-66)와 공유된다. Nogo-A의 신경돌기 성장에 대한 독특한, 고도의 억제 도메인은 Nogo-A의 엑손 3에 위치하고 델타 20 영역(d20; 인간 아미노산 위치 566-748)으로 불린다(Oertle et al., J. Neurosci. 23 (2003), 5393-5406). 실시예 3에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 항체는 d20 영역(Nogo-A-Δ20 도메인)과 소위 d20plus 영역인 억제 영역(인간 아미노산 위치 543-866)의 C- 및 N-말단의 일부 추가 아미노산을 함유한 단편에 결합한다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 항체는 인간 Nogo-A의 아미노산 위치 543-866 사이 영역 내에서의 Nogo-A, 바람직하게는 인간 Nogo-A의 아미노산 683-689에 상응하는 아미노산 서열 141-INAALQE-147(서열번호 21)을 포함하거나 이로 구성된 에피토프 및/또는 펩티드에 결합한다; 실시예 4 참조.
본 발명은 그 가변 영역, 즉 결합 도메인 내에 도 1의 A 및 B에 각각 도시된 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-Nogo-A 항체 및 이의 항원-결합 단편으로 예시된다. 상응하는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 하기 표 II에 제시되어 있다.
항상 그렇듯이, 각 쇄의 가변 도메인은 상보성 결정 영역(CDR, CDR-1, -2, 및 -3)으로 명명된 3개의 초가변 루프를 함유한다. CDR은 가변 도메인의 표면에 이러한 루프를 제시하는 "코어" β-시트 구조를 형성하는 프레임워크 영역(FR-1,-2,-3, 및 -4)이라 불리는 구조적으로 보존된 영역에 의해 분리된다. CDR 서열의 길이 및 구성은 특히 CDR3에서 매우 가변적이다. CDR은 항원과 상호작용하는 항체의 파라토프에 가까우므로 항원-결합 잔기를 함유한다. 따라서, 항체를 그의 6개의 CDR로 정의하는 것이 일반적이다. 상기 VH 및 VL 쇄의 아미노산 서열에서 예시적인 CDR 세트가 도 1의 A 및 B에 도시되어 있다. 그러나, 하기에서 논의되는 바와 같이, 본 기술분야의 기술자는 아미노산 서열에 있어서 도 1의 A 및 B 중 어느 하나에 제시된 것과 CDR2 및 CDR3의 경우 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 아미노산이 상이한, CDR이 추가로 또는 대안적으로 사용될 수 있음을 잘 알고 있다. 도 1의 도면 범례에서 언급된 바와 같이, 본 기술분야의 기술자는 예를 들어 www.bioinf.org.uk/abs에 요약된 바와 같은 공통 원칙에 따라 CDR을 쉽게 식별할 수 있다. 이러한 맥락에서, 도 1에 도시된 항체의 CDR은 카밧 등에 따라 표시되는 한편 본 기술분야의 기술자는 CDR의 수많은 정의가 일반적으로 사용됨을 알고 있으며, 즉
(i) 가장 일반적으로 사용되는, 서열 가변성에 기반한 카밧 정의;
(ii) 구조적 루프 영역의 위치를 기반으로 한 코티아(Chothia) 정의;
(iii) 옥스포드 몰레큘러의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되는 둘 사이의 절충안으로서의 AbM 정의; 및
(iv) 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기초하여 최근에 도입된 접촉(contact) 정의. 이 정의는 항체의 친화도를 수정하기 위해 돌연변이유발을 수행하는 데 가장 유용할 것으로 여겨지며 이것이 항원과의 상호작용에 참여하는 잔기이기 때문이다. 각 CDR에 대한 요약 데이터와 함께 각 항체에서 접촉하는 CDR 잔기의 목록은 예로서 www.bioinf.org.uk/abs를 참조하며, 이는 또한 abymod.abysis.org에서 이용가능한 abYmod와 같은 항체 모델링 소프트웨어를 참조로 한다.
하기 표 I은 상이한 개념에 의해 정의된 CDR 위치 간의 관계를 설명한다.
표 I: CDR 정의의 상이한 개념. 1 이러한 정의 중 일부(특히 코티아 루프의 경우)는 조사되는 개별 간행물에 따라 달라진다; 2 접촉 정의가 코티아 또는 마틴(Martin)(개선된 코티아) 정의를 사용하는 것을 제외하고, 임의의 번호매김 체계가 이러한 CDR 정의에 사용될 수 있다; 3 카밧 번호매김 규칙을 이용하여 번호를 매기는 경우 코티아 CDR-H1 루프의 말단은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 달라진다. (이는 카밧 번호매김 체계가 H35A 및 H35B에 삽입을 배치하기 때문이다.)
Figure pct00002
언급된 정의에 대해서는 문헌[Kontermann and D
Figure pct00003
bel (eds.), Antibody Engineering Vol. 2, DOI 10.1007/978-3-642-01147-4_3, # Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2010], 특히 33-51 페이지의 Chapter 3, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains 및 항체 번호매김 및 항원-결합 표면/잔기 정의의 중요성과 의미의 이해를 구체적으로 다루고 있는 문헌[Dondelinger et al., Front. Immunol. 9 (2018), 2278] 참조; 예로서, 상기 카밧, 코티아(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917), 접촉(MacCallum et al, J. Mol. Biol. 262 (1996), 732-745) 및 IMGT(IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org)에 따른 고전적 CDR 정의의 차이를 예시하고 있는 Dondelinger 등, 도 4 및 도 6 참조. AbM 정의는 옥스포드 몰레큘러의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에서 사용되는 둘 사이의 절충안이다.
Figure pct00004
위의 다이어그램은 CDR-H1(VH-CDR1)에 대한 대안적 정의를 보여준다. 카밧 및 코티아 번호매김 체계를 가로로 나타내고 CDR의 카밧, 코티아, AbM 및 접촉 정의는 2개의 번호매김 체계의 위와 아래에 화살표로 나타낸다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간-유래 단일클론 항-Nogo-A 항체 또는 이의 Nogo-A 결합 단편, 합성 유도체, 또는 생명공학적 유도체에 관한 것으로, 여기서 이의 단편 또는 유도체는 카밧에 의해 정의된 바와 같이 VH 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2, 및 3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및 VL CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하고, 여기서
(a) VH-CDR1은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(b) VH-CDR2는 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(c) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(d) VL-CDR1은 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(e) VL-CDR2는 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고, 및
(f) VL-CDR3은 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하거나; 또는
(g) VH-CDR1은 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(h) VH-CDR2는 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(i) VH-CDR3은 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(j) VL-CDR1은 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(k) VL-CDR2는 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고, 및
(l) VL-CDR3은 서열번호 20의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함한다.
또한, 또는 대안적으로 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 특징으로 할 수 있다:
(a) VH 쇄는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고; 및
(b) VL은 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하거나; 또는
(c) VH는 서열번호 12에 나타낸 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고; 및
(d) VL은 서열번호 17에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고;
바람직하게 상기 VH 및 VL 쇄 아미노산 서열은 각각 서열번호 2 및 7과 적어도 90% 동일하다. 이 구현예에서, 바람직하게는 카밧 정의에 따른 하나 이상의 CDR은 실질적으로 변하지 않고 유지된다. 그러나, 파라토프가 CDR에 상응한다는 단순화된 가정 하에, CDR은 가변 영역에 존재하는 구조적 루프와 매우 잘 상관되기 때문에 CDR의 코티아 정의는 추가로 또는 대안적으로 사용될 수 있다. 따라서, 대상 항체 NG004 및 NG034와 동등한 항-Nogo-A 항체를 제공하기 위해, 바람직하게는 상기 1개 이상 중 적어도 1개 또는 2개, 바람직하게는 2개 이하의 아미노산 치환은, 카밧에 따라 정의된 바와 같이 CDR에서 생성되는 경우, 코티아 및/또는 IMGT에 의해 정의된 바와 같이 CDR 외부에 생성되고 가장 바람직하게는 카밧 및 코티아에 따라 정의된 바와 같이 CDR의 중첩의 외부에 생성된다.
예를 들어, CDR 내의 아미노산 치환과 관련하여, 가변 중쇄 및 경쇄 및 프레임워크 아미노산 서열은 각각, 그리고 바람직하게는 보존적 아미노산 치환은 예를 들어 문헌[Mirsky et al., Mol. Biol. Evol. 32 (2014), 806-819]에 의해 분석되고 설명된 바와 같이 가장 빈번하게 교환되는 아미노산에 따라 수행된다; Mirsky 등의 813 페이지의 도 6 참조. 특히, VH-CDR1 내에서, S는 T로 치환될 수 있고; VH-CDR3 내에서, V는 E로 치환될 수 있고, T는 S로 치환될 수 있고 및/또는 M은 V로 치환될 수 있고; VL-CDR1 내에서, R은 K로 치환될 수 있고, R은 E로 치환될 수 있고, 및/또는 T는 치환될 수 있고; VL-CDR2 내에서, S는 A로 치환될 수 있고 및/또는 A는 G로 치환될 수 있고; 및 VL-CDR3에서, P는 S로 치환될 수 있다. 언급된 바와 같이, 바람직하게는 상기 문헌[Mirsky et al. (2014)]의 도 6에 나타낸 모델 LG 및 AB 중 하나 또는 바람직하게는 둘 다에서 동일한 범주에 속하는 아미노산 치환이 선택되고, LG 모델은 아미노산 특성을 유지하려는 경향에 대해 선호되고, 여기서 아미노산 치환은 바람직하게는 원래 아미노산의 물리화학적 특성, 즉 소수성, 극성 또는 하전된 특성이 실질적으로 유지되도록 선택되거나 또는 예로서 2개 이상의 아미노산 치환이 수행되는 경우, 이들은 표면의 물리화학적 특성을 함께 제공할 수 있게 서로 보상하도록 선택된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 도 1의 A 및 B에 도시된 VH 및 VL 영역과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열의 변이체를 포함한다.
물론, 이론적 고려사항 외에도 합리적인 시간과 과도한 부담 내에서 CDR 변이체를 식별하기 위한 실험적 접근이 존재한다. 예를 들어, 문헌[Tiller et al., in Front Immunol. 8 (2017), 986]은 자연적 다양성 돌연변이유발을 이용한 항체 가변 도메인의 손쉬운 친화도 성숙을 서술하고 있다. 실제로, 이미 몇 년 전에 문헌[Rajpal et al., in PNAS 102 (2005), 8466-8471]은 조합의 라이브러리를 이용하여 항체의 친화도를 크게 향상시키는 일반적인 방법을 보고했으며 21개의 CDR 위치에서 38개의 치환을 확인함으로써 TNF-α에 대한 더 높은 친화도 결합을 야기한 항-TNF-α 항체 D2E7(HUMIRAⓒ)을 이용한 이들의 방법을 예시했다. 보다 최근에, 문헌[PLOS Computational Biology, https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006980 May 1, 2019]에서 Cannon 등은 알라닌 스캐닝과 함께, 새로운 도킹, 모델링 및 합리적인 설계 인실리코 친화도 성숙을 이용한 실험적으로 안내된 컴퓨터 항체 친화도 성숙에 대해 설명했고, 단백질-단백질 도킹 모델을 미세-조정할 수 있도록 하여 하이브리도마-유래 항체, AB1의 항원 뮤린 CCL20에 대한 친화도를 증가시킨 2개의 단일-점 돌연변이를 식별할 수 있도록 하였다.
따라서, 각각의 항체가 독특하고 구별되는 특징을 가질 수 있지만, 그럼에도 불구하고 일단 선두 후보가 제공되면 본 출원에 개시된 바와 같은 본 발명의 교시를 고려하여, 뿐만 아니라 지금까지 개발된 컴퓨터 설계 및 실험적 접근법의 관점에서 본 기술분야의 기술자는 실시예에 예시되고 청구범위에 구체적으로 정의된 항-Nogo-A 항체에 대해 설명된 것과 같은 항체의 원하는 특징을 유지하는 등가의 항-Nogo-A 항체에 도달할 수 있다. 이러한 맥락에서, 변이체 항체는 예를 들어 Nogo-A에 결합하기 위해 부모 항체와 경쟁하면서 상기 언급된 선행 기술 항체 중 하나 이상, 바람직하게는 모두와 경쟁하지 않고, 적어도 11C7과 경쟁하지 않고, 바람직하게는 오자네주맙과도 경쟁하지 않으면서, 부모 항체의 결합 특이성을 실질적으로 유지한다는 것이 잘 이해되며, 이는 실시예 5에 서술된 경쟁 분석에 따라 평가될 수 있다. 특히, 항체 NG004로부터 유래된 본 발명의 항체는 항체 11C7 및 오자네주맙과 경쟁하지 않는다. 그러나, 바람직하게는, 본 발명의 항체는 그의 면역글로불린 쇄 중 하나 또는 둘 다에서 도 1에 제시된 가변 영역의 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR 또는 도 1에 제시된 가변 영역의 CDR과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, FR로부터의 하나 이상의 프레임워크 영역(FR)은 도 1의 A 및 B에 나타낸 상응하는 FR과 80% 동일하고, 바람직하게는 도 1의 A 및 B에 나타낸 프레임워크 영역과 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 구현예에서, 1개, 2개, 3개, 또는 4개 모두의 FR(각각 도 1의 A 및 B에 도시된 FR과 적어도 90%, 90-95%, 및/또는 95-99% 동일함)이 존재한다.
본 기술분야에 공지된 바와 같이, 가변 중쇄(VH-CDR3)의 CDR3은 주로 항원 특이성을 결정하는 것으로 보인다; 예로서, 문헌[Xu and Davis, Immunity 13 (2000), 37-45] 참조. 이러한 맥락에서, 특이성을 유도하는 것은 중쇄 CDR3의 다양성인 반면, VH-CDR1 및 VH-CDR2 잔기는 광범위하게 교차-반응성이고 체세포 과돌연변이에 의해 개선될 수 있음이 주목되었다; 문헌[Davis, Semin. Immunol. 16 (2004), 239-243] 참조. 따라서, 일 구현예에서 참조 항체 NG004의 면역학적 특징을 가지고 각각의 에피토프에서 그의 Nogo-A 결합과 경쟁할 수 있는, 본 발명의 항체는 적어도 상응하는 참조 항체의 VH-CDR3 또는 아미노산 서열이 참조 VH-CDR3과 적어도 90% 동일하고, 바람직하게는 95% 동일하고, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 VH-CDR3을 그의 가변 영역에 포함한다. 예를 들어, 참조 항체의 변이체 항체는 참조 (부모) 항체의 VH-CDR3을 보유할 수 있는 반면 VH-CDR1 및/또는 VH-CDR2는 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있다; 상기 언급한 바를 참조한다.
본 발명의 추가의 추가적 또는 대안적 구현예에서, 항-Nogo-A 항체, 이의 항원-결합 단편, 합성 또는 생명공학적 변이체는 표적에 대한 적절한 결합 친화도 및 약동학 및 안정성 특성을 갖도록 최적화될 수 있다. 따라서, 글리코실화, 산화, 탈아미노화, 펩티드 결합 절단, 이소-아스파테이트 형성 및/또는 짝을 이루지 않은 시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형이 일어나기 쉬운, CDR 또는 가변 영역의 적어도 하나의 아미노산은 이러한 변경이 결여된 돌연변이된 아미노로 치환되거나 또는 적어도 하나의 탄수화물 모이어티가 항체에 대해 화학적으로 또는 효소적으로 결실되거나 첨가되며, 예로서, 문헌[Liu et al., J. Pharm. Sci. 97 (2008), 2426-2447; Beck et al., Nat. Rev. Immunol. 10 (2010), 345-352; Haberger et al., MAbs. 6 (2014), 327-339] 참조한다.
면역글로불린 또는 그의 암호화 cDNA는 추가로 변형될 수 있다. 따라서, 추가의 구현예에서, 본 발명의 방법은 키메라 항체, 뮤린화 항체, 단일-쇄 항체, Fab-단편, 이중-특이적 항체, 융합 항체, 표지된 항체 또는 이들 중 임의의 하나의 아날로그를 생산하는 단계(들) 중 임의의 하나를 포함한다. 상응하는 방법은 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor (1988) First edition; Second edition by Edward A. Greenfield, Dana-Farber Cancer Institute ⓒ 2014, ISBN 978-1-936113-81-1]에 서술되어 있다. 예를 들어, Fab 및 F(ab')2 단편은 파파인(Fab 단편을 생성하기 위해) 또는 펩신(F(ab')2 단편을 생성하기 위해)과 같은 효소를 이용하여, 면역글로불린 분자의 단백질 분해 절단에 의해 또는 재조합적으로 생성될 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다. 이러한 단편은, 예를 들어, 방사성 동위원소와 같은 검출 시약에 면역글로불린의 면역특이적 부분을 커플링하는 것을 포함하는 면역진단 절차에서 사용하기에 충분하다.
따라서 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 단쇄 Fv 단편(scFv), F(ab') 단편, F(ab) 단편, 및 F(ab')2 단편, Fd, Fv, 단쇄 항체, 및 이황화-연결된 Fv(sdFv)로 이루어진 군으로부터 선택된 포맷으로 제공될 수 있고 및/또는 키메라 뮤린-인간 또는 뮤린화 항체일 수 있다.
그러나, 본 발명에 따른 실시예에 예시된 바와 같이 바람직하게는 항체가 불변 도메인을 포함하는 완전한 IgG 항체가 사용된다. 불변 도메인은 자연형, 즉 가변 도메인과 함께 본래 클로닝된 것이거나 또는 이종성, 예를 들어, 동물 연구를 예상한 경우 뮤린 불변 도메인일 수 있다. 바람직하게는, 불변 도메인은 인간 기원의 것으로 예로서 IgG1 대 IgG4와 같이 상이한 IgG 서브타입을 갖거나 또는 인간에서 자연적으로 발생한 항체의 불변 도메인과 비교하여, 각각 상이한 동종이형(allotypes) 및 대립유전자(allele)를 갖는다. "동종이형"의 정의는 항체 시약이 혈청학적으로 동종이형을 결정하는 데 이용가능할 것을 요구한다. 결정이 시퀀스 수준에서만 수행되는 경우, 다형성은 "대립유전자"로 설명되어야 한다. 이는 상응하는 대립유전자-동종이형이 실험적으로 입증된 경우, 또는 개별 서열이 입증된 서열과 동일한 경우 동종이형과의 상응성을 확립하는 것을 방해하지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 불변 도메인은 적어도 하나의 CDR 및 VH 및 VL 쇄에 대해 각각 이종성이고, 예를 들어, 바람직하게는 IgG 유형의, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 및/또는 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이다. 추가로, 또는 대안적으로, 항체의 이종성 부분은 포유동물 분비 신호 펩티드일 수 있다. 다시 말해, 일 구현예에서 본 발명의 항-Nogo-A 항체 및 이의 Nogo-A 결합 단편, 합성 유도체, 및 생명공학적 유도체는 (i) VH 영역 및/또는 VL 영역, 또는 적어도 하나의 CDR에 이종성인 폴리펩티드 서열을 포함하는 융합 단백질; 및/또는 (ii) 면역글로불린으로부터 유래된 폴리펩티드의 비-자연적 변이체이고, 상기 비-자연적 변이체는 야생형 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 아미노산 결실, 치환, 및/또는 부가를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
언급한 바와 같이, 5개의 면역글로불린 이소형이 존재하며, 그 중 면역글로불린 G(IgG)는 인간 혈청에 가장 풍부하다. 고도로 보존된 4개의 하위부류인 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4는 불변 영역, 특히 이들의 힌지 및 상위 CH2 도메인이 상이하다. 이들 영역은 IgG-Fc 수용체(FcgR) 및 C1q 모두에 결합하는 데 관여한다. 그 결과, 상이한 하위부류는 FcgR-발현 세포를 촉발시켜 식균작용 또는 항체-의존성 세포-매개 세포독성을 유발하고, 및 보체를 활성화한다는 점 둘 다의 측면에서, 상이한 이펙터 기능을 갖는다. Fc 영역은 또한 연장된 반감기, 태반 수송, 및 점막 표면을 통한 IgG의 양방향 수송을 담당하는 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 에피토프를 함유한다. 그러나, FcRn은 골수 세포에서도 발현되며, 여기서 고전적인 FcgR 및 보체와 함께 식균작용 및 항원 제시에 모두 참여한다. 이러한 특성, IgG-다형성 및 글리코실화 형태의 항체의 번역-후 변형이 IgG-기능에 영향을 미치는 방법은 문헌[Vidarsson et al., (2014) IgG subclasses and allotypes: from structure to effector function. Front. Immunol. 5:520. doi:10.3389/fimmu.2014.00520] 및 문헌[de Taeye et al., Antibodies 2019, 8, 30; doi:10.3390/antib8020030]에 설명되어 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체에 존재하는 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 불변 도메인은 IgG 유형이고, 가장 바람직하게는 IgG4 부류 또는 이소형이다. 인간 면역글로불린 G 이소형 4(IgG4) 항체는 감소된 면역 이펙터 기능이 바람직한 경우 항체 치료법을 위한 잠재적인 후보이다.
본 발명의 항체의 일 구현예에서, Fc 부분은 본 기술분야에 공지된 기술을 이용하여 면역 이펙터 기능을 감소시키도록 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인의 (점 돌연변이 또는 기타 수단을 통한) 결실 또는 불활성화는 혈-뇌-장벽의 경상피 수송체로의 뇌척수액/CNS 구획에 적용된 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시킴으로써 그것의 Nogo-A 단백질 결합을 증가시킬 수 있다. 다른 경우에, 본 발명과 일치하는 불변 영역 변형은 보체 결합을 조절하고 따라서 접합된 세포독소의 혈청 반감기 및 비특이적 결합을 감소시키는 것일 수 있다. 불변 영역의 또 다른 변형은 증가된 항원 특이성 또는 항체 유연성으로 인해 향상된 조직 항원 상호작용을 허용하는 이황화 결합 또는 올리고당 모이어티를 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 생성된 생리학적 프로필, 생체이용률 및 변형의 기타 생화학적 효과, 예컨대 Nogo-A 단백질 결합 및 중화, 생물분류 및 혈청 반감기는 과도한 실험 없이 잘 알려진 면역학적 기술을 이용하여 쉽게 측정 및 정량화될 수 있다. 재조합 인간 IgG 항체(hIgG)는 Fcγ 수용체(FcγR) 및 보체 단백질 C1q에 대한 결합이 전혀 없고, 따라서 면역 이펙터 기능이 제거되어, 다양한 치료적 적용품에 사용된다. Leu234Ala 및 Leu235Ala의 조합(일반적으로 LALA 돌연변이라고 함)이 FcγRIIa 결합을 제거하고 IgG1 및 IgG4 둘 다에 대해 FcγRI, IIa, 및 IIIa로의 검출가능한 결합을 제거하는 것으로 나타났으며 LALA-PG 돌연변이는 마우스 및 인간 IgG에서 Fc 기능을 무효화한다는 점에서 LALA 돌연변이 단독보다 개선된 것으로 밝혀졌다; 해당 검토는 예를 들어 문헌[Saunders (2019) Conceptual Approaches to Modulating Antibody Effector Functions and Circulation Half-Life. Front. Immunol. 10:1296.doi: 10.3389/fimmu.2019.01296] 및 문헌[Schlothauer et al., Protein Engineering, Design and Selection 29 (2016), 457-466] 참조.
IgG4 항체는 Fab 아암 교환(Fab arm exchange, FAE)으로 알려진 과정을 거칠 수 있는 동적 분자이다. 그 결과 특이성이 알려지지 않은 기능적으로 1가, 이중특이적 항체(bsAbs)가 생성되고, 따라서 잠재적으로 치료 효능이 감소된다. 실시예에서 예시된 바와 같이, 특히 바람직한 구현예에서 본 발명의 항체는 S228P 돌연변이를 포함하는 IgG4 부류 또는 이소형이다. S228P 돌연변이는 새로운 정량적 면역분석 및 생리학적 매트릭스 제조의 조합을 이용하여 입증된 바와 같이 생체 내 및 시험관 내 IgG4 Fab-아암 교환을 방지한다; 문헌[Silva et al., J. Biol. Chem. 290 (2015), 5462-5469] 참조. 실시예 12에서 증명된 바와 같이, NG004 IgG4 S228P는 실제로 C1q에 대한 감소된 반응성을 나타내고 나탈리주맙과 같은 다른 IgG4 항체와 유사하게 거동한다.
반복된 동결-해동 주기가 항체를 변성시켜, 이것이 그의 결합 능력을 감소시키는 응집체를 형성하게 하는 것(동결-해동 손상)은 본 기술분야에 알려진 문제점이다; 예를 들어, Abcam 항체 보관 안내서 참조. 이러한 항체 열화(deterioration)는 응집 또는 분해가 항체 활성을 감소시킬 뿐만 아니라 면역원성 반응을 유발할 수 있기 때문에 치료적 항체에 특히 유해하다(Ishikawa et al., Biol. Pharm. Bull. 33 (2010), 1413-1417). 대조적으로, 본 발명의 항체는 특히 안정하다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 입증된 바와 같이, 항체를 반복된 동결-해동 주기에 적용해도 20x 동결 및 해동 후 응집 및 분해로 이어지지 않는다; 실시예 10 및 도 9b 참조. 또한, 본 발명의 항체를 pH 6 내지 8 사이의 상이한 pH 값에 적용하는 것은 SEC에 의해 결정시 항체의 완전성에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다; 실시예 10 및 도 9a 참조. 이론에 얽매이지 않으면서, 다만 이전 관찰이 불변 도메인 자체는 인간 대상체에 대한 투여에 적용가능한 농도의 제형물에 대한 안정성 및/또는 적합성에 대해 책임이 없거나 단독으로는 책임이 없음을 나타냈기 때문에, 가변 영역 및 특히 CDR 및 VH 및 VL 각각은 항체 분자에 필요한 완전성 및 안정성을 부여하는 것으로 여겨진다. 따라서, 바람직하게는 본 발명의 항체는 위에서 제시된 임의의 정의에 따른, 바람직하게는 카밧에 따른 CDR을 적어도 포함하고, 가장 바람직하게는 도 1의 A 또는 B에 각각 나타낸 실질적으로 전체의 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하지만, 그럼에도 불구하고, 특히 보존적 아미노산 치환이 고려되는 경우에는, 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% 또는 100%의 변이를 허용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 면역글로불린 VH 및 VL을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들)에 관한 것으로, 바람직하게는 여기서 폴리뉴클레오티드(들)는 cDNA이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 표 II에 나타낸 바와 같은 항-Nogo-A 항체의 VH 또는 VL 쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이것으로 이루어진다. 이와 관련하여, 본 기술분야의 기술자는 경쇄 및/또는 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 따라서, 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 표 II에 나타낸 바와 같은 항-Nogo-A 항체의 VH 또는 VL 쇄의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이것으로 이루어진다.
표 II: 본 발명의 항체 NG004 및 NG034의 가변 영역(VH, VL)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열. 밑줄 친, 굵은글씨 뉴클레오티드 또는 아미노산은 가변 쇄 서열의 CDR 코딩 영역을 나타낸다.
Figure pct00005
Figure pct00006
본 발명의 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드(들)는 이종성 핵산, 예를 들어 발현 조절 서열, 예컨대 프로모터, 전사 및/또는 번역 인핸서 서열, 내부 리보솜 결합 부위, 숙주에서의 재조합 발현을 위한 펩티드 리더 서열을 암호화하는 핵산 등에 연결된다. 따라서, 본 발명은 인간-유래 재조합 항-Nogo-A 항체 또는 이의 Nogo-A 결합 단편, 합성 유도체, 또는 생명공학적 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로, 여기서 폴리뉴클레오티드는
(i) 카밧에 의해 정의된 바와 같이 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VH 쇄, 및/또는 VL CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VL 쇄를 암호화하고, 여기서
(a) VH-CDR1은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(b) VH-CDR2는 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(c) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(d) VL-CDR1은 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(e) VL-CDR2는 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고, 및
(f) VL-CDR3은 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하거나; 및/또는
상기 폴리뉴클레오티드는
(ii) VH 쇄 및/또는 VL 쇄를 암호화하고, 여기서
(a) VH 쇄는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고; 및
(b) VL은 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고;
바람직하게는 여기서 VH 및 VL 쇄 아미노산 서열은 각각 서열번호 2 및 7과 적어도 90% 동일하거나; 또는
상기 폴리뉴클레오티드는
(iii) 카밧에 의해 정의된 바와 같이 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VH 쇄, 및/또는 VL CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VL 쇄를 암호화하고, 여기서
(a) VH-CDR1은 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(b) VH-CDR2는 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(c) VH-CDR3은 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(d) VL-CDR1은 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
(e) VL-CDR2는 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고, 및
(f) VL-CDR3은 서열번호 20의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고; 및/또는
상기 폴리뉴클레오티드는
(iv) VH 쇄 및/또는 VL 쇄를 암호화하고, 여기서
(a) VH 쇄는 서열번호 12에 나타낸 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고; 및
(b) VL은 서열번호 17에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고;
바람직하게는 여기서 VH 및 VL 쇄 아미노산 서열은 각각 서열번호 12 및 17과 적어도 90% 동일하다.
또한, 본 발명은 이종성 핵산에 연결된 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로, 여기서 폴리뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) 각각 서열번호 3, 4, 및 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 VH는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)과 쌍을 이루는 경우 Nogo-A에 결합하고;
(b) 각각 서열번호 8, 9, 및 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 VL은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍을 이루는 경우 Nogo-A에 결합하고;
(c) 다음을 암호화하는 폴리뉴클레오티드
(i) 각각 서열번호 3, 4, 및 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VH를 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편; 및
(ii) 각각 서열번호 8, 9, 및 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편;
(d) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 VH는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL과 쌍을 이루는 경우 Nogo-A에 결합하고;
(e) 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 VL은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍을 이루는 경우 Nogo-A에 결합하고;
(f) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편 및 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(g) (a)-(f) 중 어느 하나에서와 같은 폴리뉴클레오티드, 여기서 CDR은 하나 이상, 바람직하게는 2개 이하의 아미노산 치환을 포함하고 및/또는 가변 영역 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 7과 적어도 90% 동일하다.
대안적으로, 본 발명은 이종성 핵산에 연결된 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로, 여기서 폴리뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) 각각 서열번호 13, 14, 및 15에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 VH는 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)과 쌍을 이루는 경우 Nogo-A에 결합하고;
(b) 각각 서열 18, 19, 및 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 여기서 VL은 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍을 이루는 경우 Nogo-A에 결합하고;
(c) 다음을 암호화하는 폴리뉴클레오티드
(i) 각각 서열번호 13, 14, 및 15에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VH를 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편; 및
(ii) 각각 서열번호 18, 19, 및 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편;
(d) 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 VH는 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL과 쌍을 이루는 경우 Nogo-A에 결합하고;
(e) 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 VL은 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍을 이루는 경우 Nogo-A에 결합하고;
(f) 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편 및 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(g) (a)-(f) 중 어느 하나에서와 같은 폴리뉴클레오티드, 여기서 CDR은 하나 이상, 바람직하게는 2개 이하의 아미노산 치환을 포함하고 및/또는 가변 영역 서열은 서열번호 12 또는 서열번호 17과 적어도 90% 동일하다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 벡터들에 관한 것으로, 바람직하게는 벡터는 발현 벡터이고 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다.
폴리뉴클레오티드는 생성될 수 있고, 원하는 경우 뉴클레오티드 서열의 조작에 대해 본 기술분야에 잘 알려진 방법, 예를 들어 재조합 DNA 기술, 부위 지정 돌연변이유발, PCR 등을 이용하여 조작될 수 있고(예를 들어, 둘 다 그의 전문이 본 명세서에 참조로서 포함되는 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition): Three-volume set; Green and Sambrook (2012) ISBN 10: 1936113422 / ISBN 13: 9781936113422 Cold Spring Harbor Laboratory Press; update (2014) ISBN 978-1-936113-42-2] 및 문헌[Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998) and updates] 참조) 이로써 예를 들어 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 생성하여, 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생성할 수 있다.
일단 본 발명의 항체 분자 또는 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이의 부분(바람직하게는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 함유함)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 항체 분자의 생산을 위한 벡터는 본 기술분야에 잘 알려진 기술을 이용한 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 항체 암호화 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 단백질을 제조하는 방법이 본 명세서에 서술되어 있다. 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 항체 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법에는, 예를 들어, 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체 내 유전자 재조합이 포함된다. 따라서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 항체 분자, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는 항체 분자의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고(예를 들어, 국제 출원 WO 86/05807 및 WO 89/01036; 및 미국 특허 번호 5,122,464 참조), 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄 또는 경쇄의 발현을 위해 이러한 벡터 안으로 클로닝될 수 있다.
"벡터" 또는 "발현 벡터"라는 용어는 본 명세서에서 숙주 세포 내로 도입하여 숙주 세포 내에서 원하는 유전자를 발현시키기 위한 비히클로서 본 발명에 따라 사용되는 벡터를 의미하기 위해 사용된다. 본 기술분야의 기술자에게 알려진 바와 같이, 이러한 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스, 및 레트로바이러스로 이루어진 군으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 적합한 벡터는 선택 마커, 원하는 유전자의 클로닝과 진핵 또는 원핵 세포 내에 진입 및/또는 복제하는 능력을 촉진하기 위한 적절한 제한 부위를 포함할 것이다. 마커는 영양요구성 숙주에 대한 원영양성(prototrophy), 살생물제 내성(예: 항생제), 또는 구리와 같은 중금속에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접 연결되거나, 공동-형질전환에 의해 동일한 세포에 도입될 수 있다. mRNA의 최적 합성을 위해 추가 요소가 필요할 수도 있다. 이러한 요소에는 신호 서열, 스플라이스 신호, 뿐만 아니라 전사 프로모터, 인핸서, 및 종결 신호가 포함될 수 있다. 이중-쇄 항체의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄 둘 다를 암호화하는 단일 벡터 또는 벡터들은 하기에 상세히 기술된 바와 같이 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포에서 공동-발현될 수 있다.
숙주 세포는 본 발명의 2개의 발현 벡터, 즉 중쇄 유래 폴리펩티드를 암호화하는 제1 벡터 및 경쇄 유래 폴리펩티드를 암호화하는 제2 벡터로 공동-형질감염될 수 있다. 2개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동일한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 둘 다 암호화하는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 상황에서, 경쇄는 유리하게는 과량의 독성 유리 중쇄를 피하기 위해 중쇄 앞에 배치된다; 문헌[Proudfoot, Nature 322 (1986), 52; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 2197] 참조. 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 발현 벡터(들)는 통상적인 기술에 의해 숙주 세포로 전달되고 형질감염된 세포는 이후 통상적인 기술에 의해 배양되어 본 명세서에 서술된 방법에 사용하기 위한 항체를 생성한다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터 또는 벡터들을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 명세서에 사용된 "숙주 세포"는 재조합 DNA 기술을 이용하여 구축되고 적어도 하나의 이종성 유전자를 암호화하는 벡터를 보유하는 세포를 지칭한다. 재조합 숙주로부터 항체를 단리하는 과정에 대한 설명에서, "세포" 및 "세포 배양물"이라는 용어는 달리 명시되지 않는 한 항체의 공급원을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 다시 말해, "세포"로부터의 폴리펩티드의 회수는 스핀 다운된 전체 세포로부터의 것, 또는 배지 및 현탁된 세포 둘 다를 함유하는 세포 배양물로부터의 것을 의미할 수 있다.
현재, 거의 모든 치료적 항체는 변경된, 비-인간 글리코실화 패턴으로 인한 면역원성의 위험을 줄이기 위해 여전히 포유동물 세포주에서 생성된다. 그러나, 최근 글리코실화-조작된 효모, 곤충 세포주, 및 유전자이식 식물의 개발로 인해 "인간-유사" 번역-후 변형이 있는 항체를 얻을 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 어떠한 글리코실화도 없는 이중특이적 항체를 포함하는 더 작은 항체 단편이 박테리아에서 성공적으로 생산되어 임상 시험까지 진행되었다. 비-포유동물 기원의 첫 번째 치료적 항체 제품은 내년에 나올 것으로 예상할 수 있다. 상이한 적용품에 대한 유용성을 포함해 본 발명의 인간-유래 재조합 항-Nogo-A 항체 또는 이의 Nogo-A 결합 단편, 합성 유도체, 또는 생명공학적 유도체의 제조에 적용될 수 있는 현재의 항체 생산 시스템에 대한 고찰은 문헌[Frenzel et al., Front Immunol. 2013; 4: 217, published online on July 29, 2013doi: 10.3389/fimmu.2013.00217]에 제공되며 포유동물 세포 내 인간 항체의 일시적인 발현은 문헌[Vazquez-Lombardi et al., Nature protocols 13 (2018), 99-117]; 및 문헌[Hunter et al., Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science 95 (2019), e77. doi: 10.1002/cpps.77]에 설명되어 있다.
일단 본 발명의 항체 분자가 재조합적으로 발현되면, 본 발명의 전체 항체, 이의 이량체, 개별 경쇄 및 중쇄, 또는 기타 면역글로불린 형태는 예를 들어, 크로마토그래피(예: 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 후 특정 항원에 대한 친화도에 의해, 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도, 예를 들어 암모늄 설페이트 침전에 의한 것, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의한 것을 포함하는, 본 기술분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다; 예를 들어, 문헌[Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982)] 및 문헌[Antibodies A Laboratory Manual 2nd edition, 2014 by Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA] 참조. 따라서, 본 발명은 또한 항-Nogo-A 항체 및/또는 이의 단편 또는 이의 면역글로불린 쇄(들)를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(a) 항-Nogo-A 항체, 이의 Nogo-A-결합 단편 또는 면역글로불린 쇄(들)의 발현을 허용하는 조건 하에 상기 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드(들) 또는 벡터(들)를 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 항-Nogo-A 항체, 이의 Nogo-A-결합 단편 또는 면역글로불린 쇄(들)를 배양물로부터 단리하는 단계.
추가로, 본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되고 및/또는 상기 언급된 이들의 재조합 생성 방법에 의해 수득가능한 항-Nogo-A 항체, 이의 Nogo-A-결합 단편 및 면역글로불린 쇄(들)에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 항체 폴리펩티드는 일반적으로 항체와 연관되지 않는 아미노산 서열 또는 하나 이상의 모이어티를 포함한다. 예시적인 변형은 아래에서 더 자세히 설명된다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 단쇄 Fv 항체 단편과 같은 이의 Nogo-A 결합 단편은 가요성 링커 서열을 포함할 수 있거나, 또는 기능적 모이어티 또는 검출가능한 표지(예를 들어, PEG, 약물, 독소, 또는 표지 예컨대 형광, 화학발광, 방사성, 효소, 핵자성, 중금속, 태그, 깃발 등)를 첨가하도록 변형될 수 있다; 예를 들어, 일반적인 기술에 대해서는 문헌[Antibodies A Laboratory Manual 2nd edition, 2014 by Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA]; 동적 세포 이미징을 위한 형광 표지 전략의 발전에 대해서는 문헌[Dean and Palmer, Nat. Chem. Biol. 10 (2014), 512-523]; 및 항체-약물 접합체 및 항체 모방체에 대한 효소-기반 표지 전략에 대해서는 문헌[Falck and M
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ller, Antibodies 7 (2018), 4; doi:10.3390/antib7010004] 참조.
본 발명의 항체 폴리펩티드는 융합 단백질을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 이루어질 수 있다. 융합 단백질은, 예를 들어, 적어도 하나의 표적 결합 부위, 및 적어도 하나의 이종성 부분, 즉 자연에서 자연적으로 연결되지 않는 부분을 갖는, 면역글로불린 Nogo-A-결합 도메인을 포함하는 키메라 분자이다. 아미노산 서열은 융합 폴리펩티드에서 함께 합쳐지는 별도의 단백질에 일반적으로 존재할 수 있거나 이들은 동일한 단백질에 일반적으로 존재할 수 있지만 융합 폴리펩티드에서 새로운 배열로 배치된다. 융합 단백질은, 예를 들어, 화학적 합성에 의해, 또는 펩티드 영역이 원하는 관계로 암호화되는 폴리뉴클레오티드를 생성 및 번역함으로써 생성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 적용되는 용어 "이종성"은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 비교되는 나머지 개체의 것과 별개의 개체로부터 유래됨을 의미한다. 예를 들어, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유사체에 융합될 "이종성 폴리펩티드"는 동일한 종의 비-면역글로불린 폴리펩티드, 또는 상이한 종의 면역글로불린 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드로부터 유래된다.
선택적으로 융합 단백질로서의 및/또는 상기 서술된 바와 같이 표지된, 인간-유래 재조합 항-Nogo-A 항체 또는 이의 Nogo-A 결합 단편, 합성 유도체, 또는 생명공학적 유도체는 이후 본 기술분야에 공지된 표준 기술에 따라 다양한 적용품을 위해 제공된다; 예를 들어, 문헌[Antibodies A Laboratory Manual 2nd edition, 2014 by Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA] 참조. 치료적 항체 설계, 제조, 및 제형물의 현재의 발전은 문헌[Sifniotis et al., Antibodies 2019, 8(2), 36; https://doi.org/10.3390/antib8020036]에 설명되어 있고, 여기서 기능이 조절된 항체의 전략적 설계를 위한 컴퓨터 접근법의 발전도 논의된다.
본 발명은 전술한 본 발명의 Nogo-A-결합 분자, 예를 들어 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 또는 이의 Nogo-A-결합 단편, 변이체 또는 생명공학적 유도체, 또는 폴리뉴클레오티드(들), 벡터(들) 또는 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약학 조성물이고 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드(들) 및 상기 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 조성물은 치료적 접근을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 치료제를 위한 DNA 또는 mRNA 형태의 항체 암호화 뉴클레오티드 서열의 사용은 문헌[Hoecke and Roose, J. Transl. Med. 17 (2019), 54]에 요약되어 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 각각의 항체의 인시츄 생산을 허용하는 치료될 대상에 직접 투여될 수 있다. 또한, 문헌[Schlake et al., Cellular and Molecular Life Sciences 76 (2019), 301-328]은 생체 내 DNA-기반 항체 발현뿐만 아니라 상응하는 플라스미드 및 바이러스 벡터, 예를 들어 치료적 접근법 및 수동 면역요법에 사용하기 위해 시험관 내 전사(IVT)에 의해 제조된 아데노-연관 바이러스(AAVs) 및 mRNA 구축물을 설명한다. 일반적으로, RNA 백신접종은 암 면역요법, 신경 퇴행성 질환, 감염성 질환, 조직 재생 및 단백질 대체 요법에서 응용 분야가 확장되고 있다.
따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)는 RNA를 포함하고 치료법을 위한 세포에서 번역을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들), 특히 RNA(들)는 표적 세포에서 본 발명의 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 RNA의 생성을 위한 다양한 접근법은 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 RNA를 캡핑하고 세포 내 번역을 위한 폴리(A)-꼬리달린 mRNA를 제조하기 위한, 시험관 내 전사용 키트와 같이, 상업적으로 입수할 수 있다. WO 2008/083949 A2에서 상응하는 항체의 발현을 위한 항체-코딩 비-변형 및 변형된 RNA 뿐만 아니라 전사 방법 및 항체를 발현시키는 방법이 기재되어 있다. WO 2009/127230 A1에는 선천적 면역자극 반응을 억제 및/또는 회피하기에 적합한 변형된 (m)RNA가 기재되어 있다. 또한, CELLSCRIPTTM에서 사용되는 기술이 개발되었으며, 여기서 RNA는 상응하는 U 또는 C 정규 뉴클레오사이드 대신 슈도우리딘(Ψ) 및/또는 5-메틸시티딘(m5C)을 함유한다. 이러한 RNA는 면역원성이 더 낮은 것으로 나타났고 변형된 뉴클레오사이드를 함유하지 않는 상응하는 mRNA보다 훨씬 더 높은 수준에서 단백질로 번역된다. 해당 기술은 예를 들어 문헌[Karik
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et al., Immunity 23 (2005), 165-175], 문헌[Karik
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et al., Molecular Therapy 16 (2008), 1833-1840] 및 문헌[Anderson et al., Nucleic Acids Res 38 (2010), 5884-5892]에서 설명된다. 또한, EP 1 604 688 A1은 향상된 G/C-함량 및 최적화된 코돈 사용을 갖는 안정화되고 번역 최적화된 mRNA를 설명하고 있다. RNA의 변형을 위한 추가적인 접근법은 예를 들어 문헌[Kormann et al., Nature Biotechnology 29 (2011), 154-157] 및 WO 2007/024708 A2에 설명되어 있다.
따라서, 일 구현예에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)는 mRNA일 수 있거나 상기 기재된 바와 같이 비변형 또는 변형되고 상응하는 항체로의 번역에 적합한 이의 유도체일 수 있는 RNA이다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일 구현예에서, 벡터는 유전자 전달 벡터, 예를 들어 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이다. AAV 벡터를 이용한 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 치료적 접근법은 예를 들어 둘 다 AAV-벡터화된 항-타우 항체와 관련된 WO 2015/035190 A1 및 문헌[Lui et al., The Journal of Neuroscience 36 (2016),12425-12435]에 설명되어 있다. 이러한 구축물은 항체를 암호화하는 유전자를 뇌에 직접 전달함으로써 혈액: 뇌 장벽을 우회하는 데 사용할 수 있다. 또한, WO 2017/189963 A1은 일반적으로 항체 및 항체-기반 조성물을 암호화하도록 조작된 바이러스 게놈을 갖는 신규 AAV 입자, 및 질환, 장애 및/또는 증상의 치료, 예방, 진단 및 연구를 위한 이들 구축물(예: VAD)의 사용 방법을 기재하고 있다. 중추 신경계의 신경퇴행성 질환에서 AAV의 진행 및 임상 적용은 문헌[Qu et al., Neural Regen Res 14 (2019), 931-938]에서 검토된다.
AAV 벡터는 많은 유리한 특징으로 인해 유전자 치료적 접근법에 널리 사용된다. AAV는 감염된 세포에서 복제되지 않으므로 어떠한 알려진 질환과도 연관이 없다. 따라서, AAV는 다양한 숙주 세포에 도입될 수 있고, 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않으며, 정지 세포 및 분열 세포 모두를 감염시킬 수 있다. AAV는 복제되지 않고 수명이 긴 세포를 생체 내에 형질도입하여, 관심 있는 단백질의 장기간의 발현을 초래한다. 추가로, AAV는 제한 효과나 부작용 없이 표적 조직 또는 세포 세트로 전달될 수 있는 AAV 바이러스 게놈에 암호화된 최대적재량(payload)을 운반하는 무독성 입자를 생성하기 위해 세포 및 분자 생물학 기술로 조작될 수 있다. 전술한 내용을 감안할 때, 벡터화된 항체 전달을 위한 AAV의 사용은 더 오래 지속되는 효능, 더 적은 용량의 치료, 및 치료 기간 동안의 더 일관된 수준의 항체를 허용할 것이다.
AAV는 파르보바이러스(Parvoviridae) 과의 구성원이며 약 5,000개 미만의 뉴클레오티드로 구성된 선형의, 단일-가닥 DNA 게놈을 포함한다. AAV는 효율적인 복제를 위해, 헬퍼 바이러스(즉, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스)와의 동시-감염, 또는 헬퍼 유전자의 발현이 필요하다. 치료적 핵산의 투여에 사용되는 AAV 벡터는 일반적으로 부모 게놈의 약 96%가 결실되어, DNA 복제 및 패키징에 대한 인식 신호를 함유한, 말단 반복(ITR)만 남는다. 이것은 바이러스 유전자의 발현으로 인한 면역학적 또는 독성 부작용을 제거한다. 또한, 특정 AAV 단백질을 생산 세포에 전달하면, 원하는 경우, AAV ITR을 포함하는 AAV 벡터를 세포 게놈의 특정 영역에 통합할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 6,342,390 및 6,821,511 참조). 통합된 AAV 게놈을 포함하는 숙주 세포는 세포 성장 또는 형태의 변화를 나타내지 않는다(예를 들어, 미국 특허 4,797,368 참조). AAV 벡터는 본 기술분야에 공지된 임의의 AAV 혈청형을 이용하여 생성될 수 있다. 여러 AAV 혈청형 및 100개 이상의 AAV 변이체는 아데노바이러스 스톡(stock)으로부터 또는 인간 또는 비인간 영장류 조직으로부터 단리되었다(예를 들어, 문헌[Wu et al., Molecular Therapy 14(3), (2006), 316]에서 검토됨).
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산 서열에 추가하여, AAV 벡터는 숙주 세포에서 핵산 서열의 발현을 제공하는, 발현 조절 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결자, 내부 리보솜 유입점(IRES) 등을 포함할 수 있다. 예시적인 발현 조절 서열은 본 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, CA. (1990)]에 설명되어 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 항체를 암호화하는 단리된 핵산 서열을 포함하는 유전자 전달 벡터에 관한 것이다. 유전자 전달 벡터는 전술한 바와 같은 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터일 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 전술된 성분, 예를 들어 본 발명의 항-Nogo-A 항체, 이의 Nogo-A-결합 단편, 생명공학적 유도체 또는 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 팩 또는 키트 형태의, 약학 및 진단 조성물을 각각 제공한다. 이러한 용기(들)와 관련하여 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에서 규정한 형식의 통지가 있을 수 있으며, 이 통지는 인체 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관의 승인을 반영한다. 추가로 또는 대안적으로 키트는 적절한 면역-기반 진단 분석에 사용하기 위한 시약 및/또는 설명서를 포함한다. 본 발명의 조성물, 예를 들어 키트는 물론 Nogo-A의 존재를 수반하는 질환 또는 장애의 위험 평가, 진단, 예방 및 치료에 특히 적합하고, 특히 위에서 논의된 바와 같은 Nogo-A와 일반적으로 관련된 장애의 치료에 적용가능하다.
본 발명의 약학 조성물은 본 기술분야에 잘 알려진 방법에 따라 제형화될 수 있다; 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) by the University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472] 참조. 적합한 약학적 담체의 예는 본 기술분야에 잘 알려져 있고 인산염 완충 식염수, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 통상의 방법에 의해 제형화될 수 있다. RNA-기반 조성물과 관련하여, 국제 출원 WO 2020/089342 A1, WO 2019/207060 A1 및 WO 2018/232355 A1에서 각각 대상체에 대한 RNA의 효율적인 투여를 위한, 지질-기반 제형물 및 폴리머-기반 제형물이 서술되어 있다. 또한, RNA를 중성 리포폴리플렉스(LPP)로 캡슐화하는 것은 문헌[Perche et al., Molecular Therapy: Nucleic Acids 17 (2019)]에 설명되어 있다. 문헌[Romani et al., Scientific Reports 7 (2017), 10863]은 또한 RNA-리포플렉스의 정맥 내 투여를 위한 접근법을 설명한다. 이들 약학 조성물은 적합한 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 적합한 조성물의 투여는 상이한 방식, 예를 들어 정맥 내, 복강 내, 피하, 근육 내, 비강 내, 유리체 내, 국소 또는 피부 내 투여 또는 척추 또는 뇌 전달에 의해 수행될 수 있다. 비강 스프레이 제형물과 같은 에어로졸 제형물은 보존제 및 등장제가 있는 활성제의 정제된 수용액 또는 다른 용액을 포함한다. 이러한 제형물은 바람직하게는 비강 점막과 양립할 수 있는 pH 및 등장성 상태로 조정된다.
복용량 요법은 주치의와 임상 요인을 고려하여 결정될 것이다. 의학 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 임의의 한 명의 환자에 대한 복용량은 환자의 체격, 체표면적, 연령, 투여할 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강상태, 및 동시에 투여되는 기타 약물을 포함한 많은 요인에 따라 달라진다.
Nogo-A는 성장을 제한하는 특성 때문에 신경계 손상 및 질환에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 다양한 신경생물학적 역할과 관련하여, Nogo-A는 다양한 CNS 손상 및 질환과 연루되어 있었다. 원칙적으로, Nogo-A 연관된 질환은 신경 및/또는 혈관 복구와 관련된 신경계의 질환 또는 외상으로서 이해된다. Nogo-A 억제는 말초(PNS) 및 중추(CNS) 신경계의 다양한 질환, 즉 더 구체적으로 신경퇴행성 질환 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 루이 유사 병리학 또는 기타 일반적인 치매, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 두개골, 뇌 또는 척추 외상 후 질환, 뇌졸중 또는 탈수초성 질환에 유익한 효과가 있는 것으로 생각된다. 이러한 탈수초성 질환은 비제한적으로 다발성 경화증, 단상 탈수초화, 뇌척수염, 다초점 백색질뇌병증, 범뇌염, 마르키아파바-비냐미병, 교뇌 수초용해, 부신백질이영양증, 펠리자우스-메르츠바허병(Pelizaeus-Merzbacher disease), 해면 변성, 알렉산더병, 카나반병, 이염색성 백색질형성장애 및 크라베병을 포함한다.
또한, 퇴행성 안구 장애는 일반적인 허혈성 망막병증, 전방 허혈성 시신경병증, 모든 형태의 시신경염, 습성 및 건성 연령-관련 황반변성(AMD), 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반부종, 낭포성 황반부종(CME), 색소성 망막염, 스타가르트병, 베스트 난황상 망막 변성, 레버 선천성 흑내장 및 기타 유전성 망막 변성, 병리적 근시, 미숙아의 망막병증, 및 레버의 유전성 시신경병증, 각막 이식 또는 굴절 각막 수술의 후유증, 및 헤르페스 각막염을 포함하는 망막 또는 각막 세포의 변성을 직접적으로 또는 간접적으로 수반할 수 있다. 또한, Nogo-A는 정신 질환, 특히 조현병 및 우울증에서 역할을 할 수 있는 것으로 나타났다.
생체 내 연구는, 본 발명의 항체를 이용한 치료가 불규칙한 수평 사다리 교차로 나타낸 바와 같이 마우스 뇌졸중 모델에서 미세 운동 제어를 필요로 하는 보행운동 과제의 더 나은 회복으로 이어진다는 것을 확인시켜 주었다; 실시예 11 및 도 10 참조.
따라서, 본 발명은 또한 상기 언급된 것들을 포함하는 Nogo-A와 연관된 질환 또는 장애, 바람직하게는 PNS 또는 CNS의 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 본 발명의 전술한 Nogo-A-결합 분자, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포 중 어느 하나를 투여하는 것을 포함한다. 원칙적으로, 본 발명의 항-Nogo-A 항체는 위에서 "본 발명의 배경기술" 섹션에서 본 명세서에 인용된 선행 항-Nogo-A 항체와 관련된 참고문헌에 개시된 동일한 질환 및 장애의 치료에 적합하다.
추가 구현예에서, Nogo-A와 연관된 PNS 또는 CNS 질환, 장애, 또는 증상을 치료하는 데 유용한 다른 작용제의 동시-투여 또는 순차적 투여가 바람직할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체, 또는 이의 Nogo-A-결합 단편, 변이체, 또는 생명공학적 유도체는 항염증제, 예컨대 비제한적으로 뇌졸중 또는 척수 손상 후 추가적인 뉴런 손상 및 축삭 재생의 억제를 차단하는 수단으로서 코르티코스테로이드, 신경영양 인자 예컨대 신경 성장 인자(NGF), 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF) 또는 신경퇴행성 질환을 위한 기타 약물 예컨대 엑셀론(Exelon)TM(리바스티그민) 또는 레보도파(L-DOPA (3,4-디히드록시-L-페닐알라닌))와 조합하여 투여될 수 있다. 뇌졸중 치료를 위한 다른 적합한 조합 파트너는 알테플라제 및 데스모테플라제(DSPA, 예를 들어, WO90/09438에 개시됨)이다. 일 구현예에서, 본 발명은 특히 뇌졸중의 치료를 위한 본 발명의 항체 또는 Nogo-A-결합 단편 및 데스모테플라제를 포함하는 조합 뿐만 아니라 상기 조합을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 2개의 작용제가 동시에 투여되거나 작용제가 동시에 작용하도록 하는 방식으로 독립적으로 투여될 때 2개의 작용제가 조합되어 투여되는 것으로 언급된다.
코드 번호, 일반 또는 상품 명칭으로 식별되는 활성 성분의 구조는 표준 개요서 "The Merck Index"의 실제 에디션으로부터 또는 데이터베이스, 예를 들어 Patents International(예: IMS World Publications) 또는 IMS Health에서 제공하는 기타 데이터베이스로부터 취할 수 있다.
또 다른 예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 Nogo-A-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 발현하는 세포는 손상된 부위에 걸쳐 축삭 성장을 촉진하기 위해 척수 손상 부위에 이식될 수 있다. 이러한 이식된 세포는 손상 또는 외상 후 척수 기능을 회복시키는 수단을 제공할 것이다. 이러한 세포는 후각 피복 세포 및 태아 신경 또는 조직 이식편의 상이한 계통의 줄기 세포를 포함할 수 있다.
이 명세서 전체에 걸쳐 여러 문서가 인용된다. 인용된 모든 참조문헌(배경기술 섹션 및 제조업체의 설명서, 지침 등을 포함하여 본 출원 전체에 인용된 문헌 참조문헌, 등록된 특허, 공개된 특허 출원을 포함함)의 내용은 본 명세서에 참조로서 명시적으로 포함된다; 그러나, 인용된 어떠한 문서도 실제로 본 발명에 관한 선행 기술임을 인정하지는 않는다.
보다 완전한 이해는 단지 예시의 목적으로 본 명세서에 제공되며 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않은 하기 특정 실시예를 참조하여 얻을 수 있다.
실시예
실시예 1: 항-Nogo-A 항체의 단리 및 식별
Nogo-A를 표적으로 하는 인간-유래 항체는 국제 출원 WO 2008/081008에 본래 서술되였지만 변형되고, 추가로 정제되고 표적 Nogo-A에 대해 특이적으로 적응된 뉴리문 아게(Neurimmune AG)에 의한 전매 기술 플랫폼인, 역번역 의학(Reverse Translational Medicine)™(RTM™) 기술을 활용하여 식별되었다.
실시예 2: 항체 서열 및 재조합 발현의 결정
위에서 식별된 항-Nogo-A 항체의 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 인간 기억 B 세포로부터 수득된 mRNA 및 cDNA 서열에 기초하여 결정되었다; 도 1의 A, B 참조. 인간 또는 마우스 불변 도메인을 갖는 완전한 인간 IgG1 항체의 재조합 발현은 실질적으로 WO 2008/081008의 실시예에 기재된 바와 같이, 예를 들어 99 및 100 페이지의 방법 섹션에 기재된 바와 같이 수행되었다.
프레임워크 및 상보성 결정 영역은 Abysis(http://www.bioinf.org.uk/abysis/)와 같은 데이터베이스에서 사용가능한 참조 항체 서열과 비교하여 결정하고, 카밧 번호매김 체계(http://www.bioinf.org.uk/abs/)를 사용하여 주석을 달았다.
실시예 3: 결합 특성
신경돌기 성장 억제제 Nogo-A는 3개의 억제 영역을 함유한다. 2개는 스플라이스 변이체 Nogo-B(2개의 막횡단 영역과 N-말단의 끝에 있는 NIR 도메인 사이에 위치한 Nogo-66)와 공유되고 1개는 스플라이스 변이체 Nogo-C(Nogo-66)와 공유된다. Nogo-A의 신경돌기 성장에 대한 독특한, 고도의 억제 도메인은 Nogo-A의 엑손 3에 위치하며 델타 20 영역(d20; 인간 aa 위치 566-748)이라고 한다(Oertle et al., J. Neurosci. 23 (2003), 5393-5406). 항체 NG004 NG034의 결합 특성을 확인하고 래트와 같은 다른 종에 대한 교차-반응성을 모니터링하기 위해, d20 영역과 억제 영역의 일부 추가 아미노산 C- 및 N-말단(인간 aa 위치 543-866)을 함유하는 단편을 이용해 ELISA를 수행했다. 이 단편은 래트 또는 인간 d20plus라고 하며 대장균에서 재조합적으로 생산된다. 항체가 d20plus 영역에 강하게 결합하는지 조사하고 대상체 항체 NG004 및 NG034의 결합 특성을 이미 알려진 항체(11C7 및 오자네주맙)와 비교하기 위해 ELISA를 사용하였고 EC50 값을 비교했다.
ELISA는 표준 프로토콜에 따라 수행한다(Engvall & Perlmann, J. Immunol. 109 (1972), 129-135, Engvall & Perlmann, Immunochemistry 8 (1971), 871-874). 간단히 말해서, ELISA 플레이트는 3㎍/㎖의 래트 또는 인간 서열 유래 d20plus로 코팅되고, 5% 분유(Rapilait, Migros)로 차단되고 NG004로 프로브된다. 각 플레이트는 내부 표준으로 11C7 및/또는 오자네주맙의 연속 희석액을 함유한다. 마지막으로 플레이트를 상응하는 2차 항체(항-마우스 HRP가 있는 11C7(인비트로겐, A16078), 항-인간 HRP가 있는 NG004 및 오자네주맙(시그마, A0170-1ML))와 함께 인큐베이션한다. TMB 기질(써모피셔)로 플레이트를 발생시키고 1M HCl로 정지시킨다. 판독은 테칸 스파크 플레이트 판독기에서 수행한다.
도 2a에 나타낸 바와 같이, NG004는 0.26 nM의 EC50으로 낮은 nM 범위에서 높은 친화도로 생리학적 pH에서 인간 d20plus 영역에 결합한다. 항체 11C7의 EC50 값은 오자네주맙의 경우 0.14 nM 및 0.20 nM이다. 상응하는 래트 펩티드 d20plus는 NG004에 의해서만 약하게 결합된다(도 2b). 이러한 데이터는 delta20 영역이 Nogo-A 단백질 내의 활성 결합 부위임을 확인시켜준다.
도 2c 및 2d에 나타낸 바와 같이, NG034는 인간 버전의 경우 0.298 nM의 EC50 및 래트 버전의 경우 0.229 nM의 EC50으로 낮은 nM 범위에서 높은 친화도로 생리학적 pH에서 인간 및 래트 d20plus 영역 모두에 결합한다.
또한, NG004 및 NG034는 래트 뇌량 희소돌기아교세포(비고정됨)(도 2e), 래트 뇌량 척수(고정됨) 뿐만 아니라 고정된 인간 MO3.13, 래트 NS-1 세포 뿐만 아니라 래트 CNS 조직의 희소돌기아교세포 및 운동뉴런도 양성으로 염색시키는 것으로 나타났으며, 여기서 염색 패턴은 예로서, 오자네주맙의 것과 유사하다.
실시예 4: 항체 NG004의 결합 에피토프의 평가
중첩 펩티드의 스캔을 사용하여 NG004의 에피토프 맵핑을 수행했다. Nogo-A의 d20plus 영역(인간 Nogo-A의 aa 543-866)의 서열은 개별 펩티드 사이에 11개 아미노산이 중첩되는 선형 15-mer 펩티드로 합성되었다. 이 펩티드들을 니트로셀룰로오스 막(JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany) 위에 점으로 찍었다. 막을 메탄올에서 5분 동안 활성화하고 RT에서 TBS에서 10분 동안 세척했다. 비특이적 결합 부위는 Roti®-Block(Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe, Germany)을 사용하여 RT에서 2시간 동안 차단했다. NG004(1 ㎍/㎖)는 실온에서 3시간 동안 Roti®-Block에서 인큐베이션하였다. 1차 항체의 결합은 HRP-접합된 당나귀 항-인간 IgG 2차 항체를 사용하여 결정되었다. ECL 및 ImageQuant 350 검출(GE Healthcare, Otelfingen, Switzerland)을 사용하여 블롯을 발생시키고 평가했다.
항체 NG004는 Nogo-A의 d20plus 영역 내 서열 141-INAALQE-147에 상응하는 점 34, 35 및 36(도 3, 흰색 상자)을 인식한다. 또한, 알라닌 및 절단 스캔을 수행하여 식별된 최소 에피토프를 확인했다.
실시예 5: 경쟁 분석
분석은 문헌[Kwak & Yoon, J. Immunol. Methods 191 (1996), 49-54]이 제공한 방법을 기반으로 한다. 특히, 항원 hu d20+를 코팅한 후 TBS-0.1% tween20 중 5% 분유로 차단했다. 차단 후, 경쟁자 항체 11C7 및 오자네주맙을 특정 항체의 EC50 농도 또는 그 이상에서 인큐베이션했다. 세척 후, NG004 또는 NG034의 마우스 IgG1 또는 인간 IgG4 이소형을 30 ㎍/㎖(200 nM)의 농도에서 시작하는 연속 희석액으로서 웰에 넣었다. 12회 희석에 걸쳐 3배 연속 희석을 수행했다. 경쟁자 항체와의 경쟁이 발생하면 EC50 값의 이동 및/또는 고농도 안정기의 흡광도 값 감소로 표시되는, NG004 또는 NG034 결합의 감소가 초래될 것이다.
NG004는 항체 오자네주맙(도 4a) 및 11C7(도 4b)과 Nogo-A에 대한 경쟁적 결합을 나타내지 않는다. NG034는 항체 11C7 및 NG004와 Nogo-A에 대한 경쟁적 결합을 나타내지 않는다(도 4c).
실시예 6: 생체 내 모델에서 표적 맞물림
항체는 삼투성 미니펌프(Alzet 2ML1 펌프)를 통해 온전한, 성체 래트(Long Evans, Janvier)에 10 ㎕/h의 펌핑 속도로 7일 동안 요추 척수로 척수강내 투여되었다. 이 기간 후, 동물을 희생시키고 조직을 처리하여 바이오마커에 대한 항체의 효과를 평가했다. 특히, 동물을 마취시키고 식염수에 이어 4% 포르말린으로 경심관류하였다. 이후 CNS 조직 샘플을 OCT 장착 배지에 삽입하고, 동결하고 저온유지장치에서 절단했다. 선택된 바이오마커 즉 Nogo-A, Nogo-B 및 NgR1에 대해 주입된 항체 NG004.m1, 11C7(양성 대조군) 및 이소형 대조군 항-BrdU(AbD Serotec)의 효과를 시험하였다.
통계 분석은 Prism 7.0(그래프패드 소프트웨어 사) 및 R(R 버전 3.4.1)로 수행되었다. 시간 경과에 따른 그룹 내 통계 검정의 경우, 일반 일원분산분석과 더넷(Dunnett)의 다중 비교 검정이 사용된다. 시간 경과에 따라 그룹 간 및 그룹 내 차이를 감지하고 시간 경과에 따라 2개 이상의 그룹을 비교하기 위해, 반복 측정이 있는 이원분산분석 후 튜키(Tukey) 다중 비교 검정이 사용될 것이다. 모든 실험에 대한 유의성에 대한 임계값은 *P<0.05로 설정된다. 더 작은 P-값은 **P<0.01 및 ***P<0.001로 표시된다. 막대 그래프에서, 모든 데이터는 평균±SEM(평균의 표준 오차)으로 표시된다. 상자 플롯 그래프에서, 데이터는 중앙값±25번째 백분위수(상자) 및 최소/최대(수염)로 표시된다. 모든 그래프에서, 점은 개별 동물을 나타낸다.
1주일 동안 각각 2 ㎎ 및 4 ㎎ NG004로 처리된 래트의 척추강내 치료는 면역형광 염색에 의해 평가된 바와 같이 CNS에서 내인성 Nogo-A 단백질 수준의 하향조절을 초래한다(도 5a). 항체 11C7은 양성 대조군으로 사용되었다. 대조적으로, NG004 및 11C7은 CNS에서 내인성 Nogo-B 단백질 수준을 상향조절한다(도 5b). 항-Nogo-A 항체 NG004 및 11C7을 7일 동안 주입한 래트의 해마의 CA3 영역은 대조군인 항-BrdU 항체로 처리된 래트와 비교하여 NgR1에 대해 유의하게 더 높은 형광 강도를 나타냈다. 따라서, NgR1의 유의한 상향조절이 존재한다(도 5c).
실시예 7: LTP 분석
항체 11C7을 이용한 Nogo-A 중화는 마우스 해마에서 장기간 시냅스 가소성(장기간의 강화작용, LTP)을 상당히 증가시킨 것으로 나타났다(Delekate et al., PNAS 108 (2011), 2569-2574). NG004는 공개된 프로토콜에 따라 LTP를 증가시키는 효능에 대해 분석되었다(상기 Delekate et al. (2011)).
도 6b에 나타낸 바와 같이, NG004는 양성 대조군 11C7과 유사한 생체 외 활성을 보여준다(도 6a 및 6b 비교). 또한, NG004의 더 높은 용량(25 ㎍/㎖)은 효과 크기와 작용의 개시를 증가시킨다.
실시예 8: 시험관 내 신경돌기 성장 분석
항-Nogo-A 항체의 생물학적 활성을 평가하기 위해, 신경돌기 성장 억제 분석을 수행하였다. 배양물 내 뉴런 세포를 조뇌 및 척수 세제 추출물(Nogo-A 함유 추출물)로 처리하면, 신경돌기 성장이 억제된다. 이전 연구에 따르면 이 억제 활성은 Nogo-A에 대한 특정 항체, 예를 들어 11C7, ATI355, 또는 오자네주맙에 의해 약 20%까지 중화될 수 있는 것으로 나타났다(상기 Oertle et al. (2003); 상기 Liebscher et al. (2005); Weinmann et al., Mol. Cell Neurosci. 32 (2006), 161-173). 분석은 문헌[Rubin et al., Europ. J. Neurosci. 7 (1995), 2524-2529]에 의해 확립된 프로토콜을 각색하여 수행했으며, 여기서 일차 뉴런 또는 신경모세포종 세포의 신경돌기 성장은 래트 척수 추출물 또는 비-인간 영장류 CNS 추출물(CNSE)(Nogo-A 함유)에 의해 억제되고 기능적으로 활성인 항-Nogo-A 항체에 의한 이러한 억제의 부분적 역전/중화가 있는 것으로 나타났다. NG004 및 NG034의 생물학적 활성을 양성 대조군 항-Nogo-A 항체 11C7 및 ATI355와 비교하여 시험했다.
N1E-115 세포주는 1971년 T. Amano, E. Richelson, 및 M. Nirenberg에 의해 C-1300 자발 마우스 신경모세포종 종양을 클로닝함으로써 확립되었다. N1E-115 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, ATCC)에서 제공되었다; 주문 번호: ATCC® CRL 2263. 분화를 위해, 부착성 N1E-115 세포를 분화 배지(2% L-글루타민이 보충된 Neurobasal® 배지)의 48웰 플레이트에서 성장시킨다. 세포를 수확하고 무혈청 분화 배지에 재현탁시켜 2.2 x 104 세포/㎖의 세포 현탁액 밀도를 얻었다. 이후 웰 당 450㎕의 세포 현탁액을 48웰 플레이트에 배치하여 최종 밀도는 웰 당 1x104 세포가 되었고 억제 추출물 및 시험 항체를 첨가하기 전에 37℃에서 5% CO2 하의 가습 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션했다.
독립적인 분석의 비교가능성을 보장하기 위해, CNS 추출물의 새로운 제조가 수행될 때마다 CNS 추출물의 최대 억제 절반(HMI50) 값을 결정해야 했다. CNS 추출물의 HMI50 값을 결정하는 절차는 다음과 같이 농도 당 3개 웰로 수행되었다: CNS 추출물은 농도를 증가시키면서(5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 12.5 ㎍/㎖, 15 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖) PBS에 미리 혼합된 N1E-115 세포에 첨가되었고 최종 부피는 웰 당 50 ㎕였다. 24시간 후 세포를 고정하고 분석을 위해 쿠마시(Coomassie) 염색했다. 쿠마시 염색된 세포는 반-자동 IN Cell 분석기 2500HS를 사용하여 이미지화되었으며, 미리 정의된 위치에서 각 웰의 8개의 10x 명시야 이미지를 획득하였고, 그 중 4개는 HMI50 값의 결정을 위해 분석되었다. HMI50 값은 형태학적 기준에 따라 눈으로 추정되었다: 용매 대조군(PBS)의 경우 N1E-115 세포의 약 80%가 중간-길이의 신경돌기를 나타낸다; 신경돌기-보유 세포의 수는, 예를 들어 12.5 ㎍/㎖ CNS 추출물에 의해 60%로 감소되고; 신경돌기-보유 세포의 수는, 예를 들어 20 ㎍/㎖ CNS 추출물에 의해 40%로 감소되고; 신경돌기-보유 세포의 수는, 예를 들어 40 ㎍/㎖ CNS 추출물에 의해 거의 0%로 감소된다. 이러한 형태학적 기준에 기초하여, HMI50 값은 용매 제어 조건과 비교하여 신경돌기-보유 세포 형태를 나타내는 세포의 50%로 정의될 수 있다. HMI50 값은 CNS 추출물의 동일한 공급원을 이용하여 각 실험에 대해 일정하게 유지되었다. 새로운 CNS 추출물이 제조되는 경우, HMI50을 다시 결정해야 했다.
N1E-115 세포를 CNS 추출물 및 시험할 항체(NG004.h4.m1-백본 인간 IgG4 S228P; NG004.m1-백본 마우스 IgG1)로 처리하고 추가로 24시간 동안 인큐베이션한 후 고정, 쿠마시 염색 및 이미지 획득을 수행했다. TIFF 이미지를 분석하기 위해 피지(Fiji)의 내장 그리드 플러그인 및 셀 카운터 플러그인(ImageJ 소프트웨어)을 사용했다. 픽셀은 대물렌즈의 배율을 기반으로 ㎛2으로 변환했다. 계수 프레임-격자는 선 사이에 포인트 크기(21'708.8 ㎛2)당 고정 면적이 있는 이미지에 겹쳐졌다. 컴퓨터 마우스를 사용하여, 피지 셀 카운더 소프트웨어 플러그인으로 이미지 당 세포체(카운터 1)를 표시하고 계수했다. 마찬가지로, 신경돌기(세포체 직경보다 긴 돌기)와 격자선(카운터 2) 사이의 교차를 표시했다. 정확한 방법으로 신경돌기 성장을 정량화하기 위해, 특정 컷-오프를 설정했다: (a) 세포체는 사진 프레임의 바깥쪽 경계를 건드릴 때 계수되지 않는다; (b) 돌기는 세포체 직경보다 길 때 신경돌기로 간주된다; (c) 계수 프레임의 바깥쪽 경계와의 교차는 계수되지 않는다; (d) 죽은 세포는 계수에서 제외된다. 죽은 세포로 간주되는 것은 둥글고 작은 형태로 시각적으로 판단하였다(Ronn et al., J. Neurosci. Methods 100 (2000), 25-32). 이후 교차의 수와 세포의 수 사이의 생성 비율은 다음 공식에 의해 계산되었다: 세포 당 평균 신경돌기 성장 = 총 교차 수 / 총 세포 수.
각각의 실험 조건에 대해, 각각의 3개의 웰 복제/실험 및 3개의 독립적인 실험으로부터의 4개의 이미지를 분석하였다. 데이터 플로팅 및 통계 분석은 그래프패드 프리즘 7.03 소프트웨어로 수행했다. 데이터는 사후 일원분산분석을 이용하여 통계적으로 분석했다.
도 7a 및 7b에 나타낸 바와 같이, 분화된, 래트 CNS 추출물 처리된 N1E-115 세포를 항체 NG004로 처리하면 신경돌기 성장을 자극하고, 즉, 신경돌기 성장의 Nogo-A 유도된 억제가 역전된다. 이 효과에 대한 NG004의 IC50 값은 11.16 nM이고 양성 대조군 항체 11C7의 경우 19.34 nM이다. 또한, 도 7c 및 7d는 항-Nogo-A 항체 NG004 및 NG034가 성장 억제 영장류 CNS 추출물의 존재 하에 신경돌기 성장 증진에 대해 내부 참조 항체 ATI355와 유사한 기능적 활성을 나타냄을 보여준다. 항-Nogo-A 항체 NG004 및 NG034는 미정제 비인간 영장류 CNS 추출물(Nogo-A 함유) 매개 신경돌기 성장 억제를 중화하였고 계통발생적으로 인간과 가까운 종에서 생물학적 활성의 증거를 보여준다. 이소형 대조군 항체 3.1(재조합 인간 항-IAV HA 항체 Fab 단편 mAb 3.1, 문헌[Wyrzuckia et al., J. Virol. 88 (2014), 7083-7092])을 음성 대조군으로 사용하고 항-Nogo-A 항체 ATI355를 양성 대조군으로 사용했다.
실시예 9: 생체 내 뇌졸중 마우스 모델에서 혈관신생
신경돌기 성장 억제 외에도, Nogo-A는 CNS 발달에서 혈관신생의 음성 조절자로서 작용하는 것으로 나타났다(W
Figure pct00010
lchli et al., Proc Natl Acad Sci 110 (2013), E1943-52). 따라서, 뇌졸중의 마우스 모델에서(Rust et al., PNAS 116 (2019), 14270-14279, 및 Watson et al., Ann. Neurol. 17 (1985), 497-504) 뇌졸중 손상 후 반음부에서 혈관신생을 증가시키는 단일클론 항-Nogo-A 항체, NG004의 가능성이 이전에 확립된 항-Nogo-A 항체 11C7 또는 대조군 항체 FG12/B5와 비교하여 조사되었다(Muranova et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60 (2004), 172-174). 14일 동안 대뇌 뇌실에 이식된 삼투성 미니펌프를 통해 뇌졸중, 성체 마우스에 항체를 투여했다. 21일 후, 동물을 희생시키고 조직을 처리하여 반음부의 혈관 네트워크 및 혈관 면적 분율, 혈관 가지의 수, 혈관 길이 및 직경 뿐만 아니라 뇌졸중 후의 혈관 사이의 거리에 대한 항체(NG004, 11C7, FG12/B5)의 효과를 평가했다. 따라서, 성체 암컷 마우스(10주)는 확립된 프로토콜(Wahl et al., Science 50 (2014), 1250-1255, 및 Bachmann et al., J. Neurosci. 34 (2014), 3378-3389)에 따라 오른쪽 운동 피질의 광혈전성 뇌졸중을 받았다. 증식하는 혈관 내피 세포에 표지하기 위해 마우스는 뇌졸중 후 6, 7 및 8일에 3회 연속 5-에티닐-2'-디옥시우리딘(EdU, 50 ㎎/㎏ 체중, 써모피셔) i.p. 주사를 받았다. 40 ㎛ 자유 유동 관상 절편에서 Click-iT EdU 알렉사 플루오르 647 이미징 키트(써모피셔)를 이용하여 뇌졸중 후 21일에 EdU 통합을 검출했다. 일정한 CNS 전달을 위해, 항체를 32ga 카테터(CR3218, ReCathCo, LLC, 2853-106 Oxford Boulevard, Allison Park, PA 15101)로 삼투압 Alzet 미니펌프 모델 번호 1002(0.25 ㎕/h 펌핑 속도, Alza Corporation, Palo Alto, USA)에 채우고 알려진 프로토콜(Ineichen et al., Nature Protocols 12 (2017), 104-131)에 따라 대조병변의 대뇌 측뇌실에 적용하였다. 각 동물은 할당된 항체로 채워진 삼투압 펌프 중 하나를 받았다: IgG1 마우스 단일클론 항체 11C7(양성 대조군); FG12/B5(음성 대조군); IgG1 키메라 단일클론 항체 NG004. 모든 항체의 농도는 7 ㎎/㎖였다. 일반적인 건강 상태를 평가하기 위해, 동물의 체중을 매일 측정하고 사전에 간행된 프로토콜에 따라 상호작용 신경-점수를 기록했다(Shelton et al., J. Neurosci. Methods 168 (2008), 431-442). 그룹 간의 통계적 차이는 관찰되지 않았지만, NG004를 투여받은 동물은 첫 째 날 안에 더 나은 회복을 보이는 경향이 있었다. 21일 후, 동물을 희생시키고 경심관류하고 표준 프로토콜에 따라 뇌 절편을 수득하였다(Rust et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 116 (2019), 14270-14279). 주입된 항체 NG004, 11C7 및 FG12/B5가 반음부 내 혈관신생에 미치는 영향을 평가하기 위해, 혈관 면적 분율, 혈관 길이, 혈관 분지, 혈관 거리 및 거리의 가변성을 포함하여 생물학적으로 관련된 상이한 혈관 매개변수를 평가했다. 또한, 항-CD31 항체(rat, 1:50, BD Biosciences #550274)를 이용한 면역조직화학적 염색에 따라 결정된 바와 같이 CD-31-양성 혈관 내피 세포의 핵 안으로의 뉴클레오티드 유사체 및 유사분열 마커 EdU의 통합에 의해서 새로 형성된 혈관의 형성을 평가했다.
새로 생성된 혈관은 허혈성 경계 구역 내 CD31/EdU 이중-양성 세포의 양을 정량화하여 식별했다. ImageJ(FIJI)로 이미지를 분석했다. 이미지는 8-비트 형식으로 변환되었고 이진화된 이미지를 얻기 위해 Adaptive Threshold 플러그인으로 수동으로 임계값을 설정했다. 노이즈를 제거하기 위해 중앙값 0.5 픽셀을 적용했다. 관심 영역(ROI)을 수동으로 선택하고 모든 매개변수에 대해 분석했다; 1) 면적 분율: 강조표시되고 0이 아닌 ROI의 픽셀 백분율; 2) 혈관 길이: 이미지를 골격화하고 플러그인 골격 길이(Skeleton length) 도구로 분석했다 - ROI의 모든 구조의 길이가 합산되었다; 3) 골격 분석(Analyze Skeleton) 도구로 가지의 수를 평가했다; 4) 단일 혈관 사이의 최소 거리를 계산하는 NND 도구에 의해 혈관의 거리 및 가변성을 계산했다. 이로부터 평균과 표준편차를 계산하여 ROI에서 혈관 사이의 평균 거리 및 분포의 가변성에 대한 정보를 얻었다. 혈관 길이 및 가지의 수 값은 관심 영역의 총 면적으로 정규화하였다. 통계 분석은 프리즘 7.0(그래프패드 소프트웨어 사) 및 R(R 버전 3.4.1)로 수행하였다. 시간 경과에 따른 그룹 내 통계 검정의 경우, 일반 일원분산분석에 이어 더넷의 다중 비교 검정이 사용되었다. 시간 경과에 따라 그룹 간 및 그룹 내 차이를 감지하고 시간 경과에 따라 2개 이상의 그룹을 비교하기 위해, 반복 측정이 있는 이원분산분석 및 튜키 다중 비교 검정이 사용되었다. 거동 회복 및 발아 섬유 사이의 상관관계 분석을 위해 스피어만(Spearman) 상관 관계가 적용되었다. 모든 실험에 대한 유의성에 대한 임계값은 *P<0.05로 설정되었다. 더 작은 P-값은 **P<0.01 및 ***P<0.001로 표시된다. 막대 그래프에서, 모든 데이터는 평균±SEM(평균의 표준 오차)으로 플롯된다. 상자 플롯 그래프에서, 데이터는 중앙값±25번째 백분위수(상자) 및 최소/최대(수염)로 표시된다. 모든 그래프에서, 점은 개별 동물을 나타낸다.
도 8에 나타낸 바와 같이, NG004 및 11C7 처리된 동물의 뇌졸중 뇌 조직은 뇌졸중 후 21일째에 대조군에 비해 허혈성 경계 구역에서 더 발달된 혈관 층을 나타냈다. 이것은 혈관이 차지하는 총 면적 분율의 증가(NG004, 0.12 ± 0.03; 11C7, 0.115 ± 0.03; Ctrl, 0.07 ± 0.01), ㎟ 당 가지 수의 증가(NG004, 379.18 ± 96.62; 11C7, 349.4 ± 71.96, Ctrl, 156.79 ± 31.82), 및 ㎟ 당 ㎜의 혈관 길이(NG004, 21.90 ± 3.83, 11C7, 20.03 ± 1.69; Ctrl, 12.89 ± 2.82)(도 8a-8c)로 나타났다. 11C7 및 NG004 사이에 어떠한 혈관 매개변수에서도 차이가 검출되지 않았다. 중요하게도, 모든 그룹 간에 뇌졸중 크기에 감지할 수 있는 차이가 없었다(데이터는 표시되지 않음). 허혈성 경계 구역에서 더욱 더 발달된 혈관 층은 새로 형성된 혈관을 통해 생성된다는 가설을 세웠다. 따라서, 뉴클레오티드 유사체 EdU(50 ㎎/㎏ 체중)는 혈관신생의 피크에서 손상 후 6-8일에 매일 전신 주사되었다. 허혈성 경계 구역에서 새로 형성된 혈관 내피 세포(CD31+)를 계수하였다. 항-Nogo-A 항체(NG004: 55.20 ± 12.7, 11C7: 57.30 ± 19.57)를 받은 두 그룹에서 대조군(28.51 ± 8.8)에 비해 ㎟ 당 증가된 수의 CD31/EdU+ 세포가 관찰되었다(도 8d). 요약하면, 손상 3주 후에 대조군 항체를 투여받은 동물에 비해, 항-Nogo-A 항체로 처리된 두 그룹에서 혈관 복구가 구별하기 어려운 정도로 향상된 것으로 나타났다. 또한 새로 형성된 혈관 내피 세포의 수는, NG004 및 11C7 처리된 동물의 그룹 둘 다에서, 동일한 정도의 그룹으로 증가하는 것으로 나타났다. 따라서, NG004는 뇌졸중 후 혈관 복구를 위한 강력한 항-Nogo-A 항체이다.
실시예 10: 항체 무결성 및 안정성
분석을 위해 항체의 안정성 및 무결성 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 표준 프로토콜(Porath & Flodin, Nature 183 (1959), 1657-1659)에 따라 수행되었다. 간단히 말해서, 항체는 상이한 완충액으로 투석되었다. 투석 후 항체를 시험관으로 옮기고 최대 9주 동안 40 및 4℃에서 인큐베이션했다. 1주, 2주, 4주 및 9주에 샘플을 꺼내서 0.75 ㎖/분의 유속으로 아머샴의 슈퍼덱스™ 200 증가 컬럼으로부터의 루프 100 ㎕에 주입했다; 러닝 버퍼로 pH 7.4에서 듀벨코(Dulbecco)의 PBS를 사용했다.
도 9a 및 9b에 나타낸 바와 같이, 항체 NG004는 상이한 pH 값(pH 6, 7.4, 8) 및 인공 CSF에서 뿐만 아니라 반복된 동결-해동 주기 후에도 매우 안정하다. 또한, 분해 및 응집이 관찰되지 않았고 결합력이 유지되었다(데이터는 표시되지 않음).
실시예 11: NG004 처리 후 보행운동 과제의 기능적 회복
운동 기능 회복, 특히 편측성 광혈전성 뇌졸중의 래트 모델에서 척수강내 적용 후 숙련된 앞다리 기능의 기능 회복에 대해서, 이전에 확립된 항-Nogo-A 항체 11C7 또는 대조군 항체("항-BrdU")와 비교하여 인간 NG004 단일클론 항-Nogo-A 항체의 전임상 효능을 평가했다.
기능 회복을 다루기 위해, 잘 순응되고 처리된 젊은-성체 암컷 롱-에반스(Long-Evans) 래트를 미세 운동 거동 과제(수평 사다리 시험)으로 훈련시켰으며 이들의 기준선 거동 성능을 3개의 세션에서 기록하였다. 이후 감각-운동 피질에 대한 광혈전성 뇌졸중을 적용하고, 항체(11C7, NG004 (IgG1 키메라 단일클론 항체 NG004); 항-BrdU)를 삼투압 펌프를 통해 14일 동안 뇌졸중 쥐에게 척수강내로 투여했다. 동물의 거동 성능을 뇌졸중 유도 후(손상 후 4일(dpi)) 뿐만 아니라 최대 9주 동안 매주(7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 및 63 dpi) 기록하였다.
40마리의 래트를 다음 그룹으로 나누었다:
1. NG004_4 ㎎: 10마리의 래트에게 14일 동안 누적 용량 4 ㎎의 NG004를 투여했다.
2. NG004_8 ㎎: 10마리의 래트에게 14일 동안 누적 용량 8 ㎎의 NG004를 투여했다.
3. 11C7: (양성 대조군으로) 10마리의 래트에게 14일 동안 누적 용량 4 ㎎의 11C7을 투여했다.
4. 항-BrdU: (음성 대조군으로) 10마리의 래트에게 14일 동안 누적 용량 4 ㎎의 BrdU에 대한 뮤린 단일클론 항체를 투여했고,
여기서 4마리의 동물이 희생되어야 했다(그룹 1에서 2마리, 그룹 2 및 4에서 각각 1마리).
동물은 음식과 물을 무제한으로 제공하는 일정한 12시간 암/광 주기 하에 3개의 그룹으로 개별적으로 환기되는 우리(유형 IV)에 수용되었다. 상업적 판매자(Janvier.Labs, Le Genest-Saint-Isle, France)로부터 도착한 후, 40마리의 암컷 롱 에반스 래트(나이: 12-16주, 체중: 200-250g)를 동물 시설에 일주일 동안 순응시켰다. 그 후, 실험자는 스트레스 수준을 줄이기 위해 실험 시작 일주일 전에 표준 절차에 따라 동물을 처리했다.
불규칙한 수평 사다리 보행 시험은, 불규칙한 간격의 사다리 가로대에서 특정 앞발 위치를 판단하는, 숙련된 보행을 평가하기 위한 운동 및 조정 시험이다; 문헌[Maier et al., J Neurosci. 28 (2008), 9386-403] 참조. 수평 사다리 보행 시험 장치는 투명 플렉시글라스로 만들어진 측벽과 금속 가로대(직경 3 ㎜)로 구성되며, 이는 가로대 사이의 최소 거리가 1 ㎝이고 총 길이가 1 m인 사다리 활주로를 만들기 위해 삽입될 수 있다. 가로대는 불규칙한 간격으로 배치되어 최대 거리 3 ㎝인 계단 배치에 대한 피질 재평가를 환기시킨다. 기준선 수평 사다리 성능은 3일 연속으로 기록되었다. 각 세션에 대해 3개의 실행을 기록하였고 모든 실행의 고속 비디오 녹화에서 가로대 위의 발 배치를 분석하였다.
모든 동물은 이전에 문헌[Lindau et al., Brain 137 (2014), 739-756] 및 문헌[Watson et al., Annals of Neurology 17 (1985), 497-504]에 설명된 대로 선호되는 발의 감각운동 피질을 병변으로 하는 편측성 광혈전성 뇌졸중을 받았다. 동물들은 손상에서 잘 회복되었다. 영향을 받은 앞다리는 마비의 징후를 보였으나, 동물들은 스스로 걷고, 기어오르고, 먹고 손질을 할 수 있었다. 일정한 CNS 전달을 위해, 광혈전성 뇌졸중 수술 직후 요추 액체 공간으로 카테터로 할당된 항체가 채워진 준비된 삼투압 펌프에 의해 항체를 전달했다. 14일 후 펌프를 제거하고 거동 시험을 시작했다. 수평 사다리 데이터의 분석을 위해 올바른 앞다리/발 배치에 대한 성공률을 해당 다리로 만든 총 걸음수의 백분율로 계산했다.
통계 분석은 프리즘 7.0(그래프패드 소프트웨어 사)으로 수행하였다. 시간 경과에 따른 그룹 내 통계적 검정의 경우, 이원분산분석에 이어 LSD(최소 유의차) 피셔 검정이 사용되었다. 특정 시점에서 그룹 간의 차이를 감지하기 위해, 짝을 이루지 않은 단측 t-검정이 사용되었다. 거동 회복과 CST 경추 척수 발아 사이의 상관관계 분석을 위해, 스피어만 상관관계를 적용했다. 모든 실험에 대한 유의성에 대한 임계값은 *P<0.05로 설정되었다. 더 작은 P-값은 **P<0.01 및 ***P<0.001로 표시된다. 막대 그래프에서, 모든 데이터는 평균±SEM(평균의 표준 오차)으로 표시된다. 모든 그래프에서, 점은 개별 동물을 나타낸다.
항-Nogo-A 처리된 동물은 대조군 항체 처리된 동물과 비교할 때 수평 사다리 과제에서 개선된 기능 회복을 나타냈다.
손상 후 4일째에 모든 동물의 성공률이 비슷한 수준으로 하락을 나타냈다(항-BrdU의 경우: 34.43% ± 8.08%로 하락, 항-Nogo-A 처리 11C7의 경우: 38.37% ± 4.87%로 하락, NG004 4 ㎎/㎖의 경우 34.85% ± 6.12%로 하락, 및 NG004 8 ㎎/㎖의 경우 33.75% ± 5.25%로 하락).
14일부터 계속, 항-Nogo-A 항체 NG004 8 ㎎/㎖ 및 11C7 처리된 동물의 성능은 지속적으로 개선되었고 항-BrdU 처리된 동물과 비교할 때 손상 후 63일째에 상당한 차이에 도달했다; 도 10 참조. 따라서, 상기 결과는 불규칙한 수평 사다리 교차로 나타낸 바와 같이 항-Nogo-A 항체 NG004 처리가 미세한 운동 제어를 필요로 하는 보행운동 과제의 더 나은 회복으로 이어짐을 보여주었다.
실시예 12: 항-Nogo-A 항체 NG004는 감소된 보체-의존성 CDC를 갖는다.
항-Nogo-A 항체의 보체-의존성 세포독성(CDC) 활성에 관한 Fc 특성을 분석하기 위해 C1q 결합 ELISA 분석을 수행했고, 여기서 인간 C1q(시그마 C1740-5 ㎎)의 침착을 측정했다. C1q 침착은 37℃에서 1시간 동안 TBS-0.1% v/v Tween20 0.15 mM CaCl2 및 1 mM MgCl2에서 8개의 상이한 농도의 C1q(1.2 내지 20 ㎍/㎖)와 함께 인큐베이션된 1 ㎍/㎖ 항체 코팅된 폴리스티렌 플레이트에서 평가되었다. 검출을 위해, 양 항 인간 C1q 다클론 항체(바이오래드 2221-5004P)를 사용하였다. 대조군으로서 작용 기전이 알려진 2개의 임상 항체를 사용하였다. 리툭시맙(인간 IgG1)은 양성 대조군으로 나탈리주맙(인간 IgG4)은 음성 대조군으로 사용되었다. NG004 IgG4 S228P의 내부 양성 대조군은 IgG1 이소형인 NG004였다. 10분 후, 비색 TMB 반응을 1M HCl로 중단하고 TECAN 스파크 플레이트 판독기에서 450 ㎚에서 OD를 측정했다.
NG004 IgG4 S228P 항-Nogo-A 항체 및 나탈리주맙은 IgG1 이소형에 비해 감소된 C1q 결합 활성을 나타냈다; 도 11 참조. 이러한 결과는 NG004 IgG4 S228P가 다른 IgG4와 유사하게 거동하고 감소된 CDC를 가짐을 나타낸다.
<110> NovaGo Therapeutics AG <120> Novel anti-Nogo-A antibodies <130> 2022-FPA-1351 <150> EP 19205006.0 <151> 2019-10-24 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <223> NG004 variable heavy chain (VH) sequence <400> 1 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agg agc cat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30 gct atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca gtt aca tca tat gat gga acc aat aaa tac tac gca gac tcc gtg 192 Ala Val Thr Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aaa gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg gac agc ctc aga gtt gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga ggc cga gca gtg gct ggt acg agg gaa gat tat tgg ggc cag 336 Ala Arg Gly Arg Ala Val Ala Gly Thr Arg Glu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser His Ala Met His 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Val Thr Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Arg Ala Val Ala Gly Thr Arg Glu Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <223> NG004 variable kappa chain (VK) sequence <400> 6 gac atc cag atg acc cag tct cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg ggc 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc agc cag agt gtt tta ttc agc 96 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Phe Ser 20 25 30 tcc aac agt aag aac tac tta gct tgg tac cag cag aaa cca gga cag 144 Ser Asn Ser Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 cct cct aag gtg ctc att tac tgg gca tct acc cgg gaa tcc ggg gtc 192 Pro Pro Lys Val Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc act ctc acc 240 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 atc agc agc ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tat tac tgt cag caa 288 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 tat tat act act cgc cct acg ttc ggc cta ggg acc aaa gtg gat atc 336 Tyr Tyr Thr Thr Arg Pro Thr Phe Gly Leu Gly Thr Lys Val Asp Ile 100 105 110 aaa 339 Lys <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Phe Ser Ser Asn Ser Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 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cct gag gac acg gct gta tat tat tgt 288 Leu Gln Met Gly Arg Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gtg agt gat gct ttt gat gtc tgg ggc cag ggg aca atg gtc acc gtc 336 Val Ser Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 100 105 110 tct tcg 342 Ser Ser <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Asn Tyr Ser Met His 1 5 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ala Ile Ser Ser Asp Gly Gly Asp Pro Phe Tyr Ala Ser Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Asp Ala Phe Asp Val 1 5 <210> 16 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <223> NG034 variable kappa chain (VK) sequence <400> 16 gaa att gtg ctg acc cag tct cca ctc tcc ctg tcc gtc acc ctt gga 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 cag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt caa agc ctc cta tac agt 96 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 aat ggc aac acc tac ttg aat tgg ttt cag cag agg cca ggc caa tct 144 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca agg cgc cta ctt tat agg gtt tct aac cgg gac tct ggg gtc cca 192 Pro Arg Arg Leu Leu Tyr Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac aga ttc agc ggc agt ggg tca ggc act cat ttc aca ctg aaa att 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agt agg gtg gag gct gag gat gtt gga gtt tat tac tgc atg caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 aca cac tgg cct cgc acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa 336 Thr His Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Gln Gly Thr His Trp Pro Arg Thr 1 5 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> minimal epitope recognized by NG004 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> minimal epitope recognized by antibody NG004 <400> 21 Ile Asn Ala Ala Leu Gln Glu 1 5 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 34 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Peptide 34: amino acods 133-147 of the Nogo-A d20plus region <400> 22 Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln Glu 1 5 10 15 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 35 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Peptide 35: amino acids 137-151 of the Nogo-A d20plus region <400> 23 Glu Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln Glu Thr Glu Ala Pro 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 36 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Peptide 36: amino acids 141-155 of the Nogo-A d20plus region <400> 24 Ile Asn Ala Ala Leu Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile 1 5 10 15

Claims (15)

  1. 인간-유래 재조합 단일클론 항-Nogo-A 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Nogo-A-Δ20 도메인에 결합하고 뇌졸중 반음부(stroke penumbra)에서 용량 의존성 신경돌기 성장 및/또는 혈관신생을 유도할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 펩티드에 결합하고 및/또는 VH 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2, 및 3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및 VL CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하고, 여기서
    (a) VH-CDR1은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
    (b) VH-CDR2는 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
    (c) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
    (d) VL-CDR1은 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
    (e) VL-CDR2는 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고, 및
    (f) VL-CDR3은 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하거나; 또는
    여기서 상기 항체는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VH 쇄, 및/또는 VL CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VL 쇄를 포함하고, 여기서
    (g) VH-CDR1은 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
    (h) VH-CDR2는 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
    (i) VH-CDR3은 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
    (j) VL-CDR1은 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고,
    (k) VL-CDR2는 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하고, 및
    (l) VL-CDR3은 서열번호 20의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    (a) 상기 VH는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고; 및
    (b) 상기 VL은 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고; 바람직하게 여기서
    상기 VH 및 VL 아미노산 서열은 각각 서열번호 2 및 7과 적어도 90% 동일하거나; 또는
    (c) 상기 VH 쇄는 서열번호 12에 나타낸 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고; 및
    (d) 상기 VL은 서열번호 17에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고; 바람직하게 여기서
    상기 VH 및 VL 쇄 아미노산 서열은 각각 서열번호 12 및 17과 적어도 90% 동일한 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    면역글로불린 중쇄 불변 영역, 면역글로불린 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고, 바람직하게는 상기 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역은 IgG 타입의 것인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    IgG와 비교하여 감소된 이펙터 기능을 갖는 불변 도메인 Fc 영역을 포함하고; 바람직하게는 여기서 상기 불변 도메인은 IgG4 부류의 것인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 청구항 5에 있어서,
    S228P 돌연변이를 포함하는 IgG4 부류 또는 이소형의 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    단일 쇄 Fv 단편(scFv), F(ab') 단편, F(ab) 단편, 및 F(ab')2 단편, Fd, Fv, 단일-쇄 항체, 및 이황화-연결 Fv(sdFv)로 이루어진 군으로부터 선택되고 및/또는 키메라 뮤린-인간 항체인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 면역글로불린 VH 및 VL을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들)로서, 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는 cDNA이고 및/또는 이종 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드(들).
  9. 청구항 8의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 하나 이상의 벡터(들).
  10. 청구항 8의 폴리뉴클레오티드(들) 또는 청구항 9의 벡터(들)를 포함하는 숙주 세포.
  11. 항-Nogo-A 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 면역글로불린 쇄(들)의 제조 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 청구항 10의 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 배양물로부터 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 면역글로불린 쇄(들)를 단리하는 단계;를 포함하는 방법.
  12. 청구항 8의 폴리뉴클레오티드(들)에 의해 암호화되거나 청구항 11의 방법에 의해 수득가능한 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 면역글로불린 쇄(들).
  13. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 청구항 12의 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    (i) 효소, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 화학발광 화합물, 생물발광 화합물, 태그, 플래그 및 중금속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 표지로 검출가능하게 표지되거나;
    (ii) 약물에 부착되거나; 또는
    (iii) 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 청구항 1 내지 청구항 7, 청구항 12 또는 청구항 13 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 청구항 8의 폴리뉴클레오티드(들), 청구항 9의 벡터(들) 또는 청구항 10의 세포를 포함하는 조성물로서, 바람직하게는 상기 조성물은
    (i) 약학 조성물이고 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하거나; 또는
    (ii) 면역-기반 진단 방법에 통상적으로 사용되는 시약을 선택적으로 추가로 포함하는, 진단 조성물이며 키트로서 설계되는 조성물.
  15. 망막을 포함하는 말초(PNS) 및/또는 중추(CNS) 신경계의 질환 또는 외상의 치료에 사용하거나 또는 인간 또는 동물 신체에서 Nogo-A의 생체 내 검출에 사용하기 위한 청구항 1 내지 청구항 7, 청구항 12 또는 청구항 13 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 청구항 8의 폴리뉴클레오티드(들), 청구항 9의 벡터(들) 또는 청구항 10의 세포로서,
    바람직하게는 상기 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 루이 유사 병리 및 기타 일반적인 치매, 두개골, 뇌 또는 척추 외상 후 질환, 뇌졸중, 외상성 뇌 손상, 탈수초성 질환 및 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 습성 및 건성 연령-관련 황반 변성(AMD), 및 기타 안과적 징후로 이루어진 군으로부터 선택되는 안과 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경퇴행성 질환인 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오티드(들), 벡터(들) 또는 세포.
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