KR20060119982A

KR20060119982A - Ｎｏｇｏ-ａ 결합 분자 및 그의 제약적 용도

Info

Publication number: KR20060119982A
Application number: KR1020067005424A
Authority: KR
Inventors: 카르멘 바르스케; 스테판 프렌첼; 아니스 쿠스로 미르; 마르틴 이 슈와브; 알레산드라 비탈리티
Original assignee: 노파르티스 아게; 유니버시티 오브 취리히
Priority date: 2003-09-19
Filing date: 2004-09-17
Publication date: 2006-11-24
Also published as: TNSN06085A1; EP2248827A1; TW200517123A; MY158078A; EP1668033A2; EP2423225A2; SG146660A1; GB0321997D0; IS8404A; US20090181023A1; IL203007A0; ZA200601842B; ECSP066431A; IL174145A; MY161068A; CA2538725C; PE20050949A1; AU2009200237B2; AU2004274164A1; WO2005028508A2

Abstract

본 발명은 해리 상수가 1000 nM 미만인, 인간 Nogo A 폴리펩티드 또는 인간 NiG 또는 인간 NiG-D20 또는 인간 NogoA_342-357에 결합할 수 있는 결합 분자, 상기 결합 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터; 결합 분자를 생산할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 시스템; 상기 정의된 발현 시스템을 포함하는 단리된 숙주 세포; 상기 결합 분자의 특히 신경 복구 치료시의 제약으로서의 용도; 상기 결합 분자를 포함하는 제약 조성물 및 신경 복구와 관련된 질병의 치료 방법을 제공한다.

신경 복구, 인간 Nogo A 폴리펩티드, 인간 NiG, 인간 NiG-D20, 인간 NogoA_342-357, 결합 분자

Description

ＮＯＧＯ-Ａ 결합 분자 및 그의 제약적 용도{NOGO-A Binding Molecules and Pharmaceutical Uses Thereof}

본 발명은 NogoA결합 분자, 예를 들어 모노클로날 항체 또는 그의 Fab 단편에 관한 것이다.

성인 중추 신경계 (CNS)에서 손상 후 뉴런 재생은 축삭 (axon)을 에워싸는 억제성 미엘린 (myelin) 환경의 존재 및 반흔 조직의 형성 때문에 제한된다. 지난 몇년 동안, CNS가 손상 후 자발적으로 복구할 수 없는 이유를 분자적으로 이해하게 되었다. 미엘린 내의 억제성 분자는 특히 손상 직후 축삭의 재생에 대한 주요 장애물이다. 지금까지 NogoA, 미엘린-관련 당단백질 (MAG) 및 미엘린-희소돌기아교세포 (oligodendrocyte) 당단백질 (OMgp)이 신경돌기 증식 (outgrowth)의 강력한 억제제로서 특성화되었다. 또한, 미엘린은 다른 억제성 성분, 예를 들어 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸을 또한 함유한다. Nogo-A는 레티쿨론 (reticulon) 단백질 패밀리의 일원이고, Amino-Nogo 및 Nogo-66으로 명명된 적어도 2개의 생물학적 활성이고 약물학적으로 구분되는 도메인을 갖는다. 전자에 대한 수용체 부위는 지금까지 알려지지 않았지만, Nogo-66은 뉴런 수용체 NgR을 통해 시험관내 및 생체내 뉴런 성장을 억제한다. Nogo-66 외에, MAG 및 OMgp도 NgR에 높은 친화도로 결합하여 신경돌기 증식을 억제한다.

현재 신경 복구의 증진을 추구하는 가능한 신규한 연구 방법은 효소 콘드로이티나제 ABC를 사용하는 반흔 조직의 소화, 후각 초성 세포 및 줄기 세포를 사용하는 브릿징 (bridging) 기술 및 뉴런 성장을 증가시키기 위한 단백질 성장 인자를 포함한다. 세포내 신호전달 매개자, 예를 들어 Rho, 막결합 구아노신 트리스-포스파타제 (GTPase)의 조정에 의한 신경돌기 증식 억제제의 차단 작용은 축삭의 성장 억제에서 중요한 인자로 보인다. 시클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP)는 시험관내 미엘린 관련 억제를 극복하고 생체내 재생을 유발할 수 있다. 척수 손상 후 쥐에서 뉴런 재성장 (regrowth) 및 기능적 회복을 유발하기 위해 NgR 수용체 (NEP 1-40)의 펩티드 억제제를 사용한다.

상기한 방법의 사용 외에, 중추 및 말초 신경계의 신경돌기 성장 억제성 분자를 중화하기 위한, 특히 NogoA의 신경돌기 성장 억제 활성을 중화하기 위한 특정 모노클로날 항체의 사용도 관심이 집중되고 있다. 따라서, 모노클로날 항체 IN-1 또는 그의 IN-1 Fab 단편이 시험관내 신경돌기 증식을 유발하고 생체내 스프라우팅 (sprouting) 및 재생을 향상시키는 것으로 보인다 (Schwab ME et al. (1996) Physio. Rev. 76, 319-370). 신경돌기 성장 억제 활성을 위한 NogoA의 상이한 도메인의 시험을 통해 분자 내의 몇몇 억제성 도메인이 설명되었다 (Chen et al. (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre et al. (2000) Nature 403, 439-444; Prinjha et al. (2000) Nature 403, 383-384). 천연 면역글로불린 또는 항체는 각각의 상부 아암 (arm)의 말단에 항원-결합 부위를 갖는, 일반적으로 Y자형 다중체성 분자를 포함한다. 구조의 나머지, 특히 Y의 줄기는 면역글로불린과 관련된 효 과기 기능을 매개한다. 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진다. 중쇄 및 경쇄는 모두 가변 도메인 및 불변 부분을 포함한다. 항원 결합 부위는 경쇄의 가변 도메인과 연결된 중쇄의 가변 도메인으로 이루어진다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 동일한 일반 구조를 갖는다. 보다 구체적으로, 항체의 항원 결합 특징은 본질적으로 초가변 구역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 내의 3개의 특수한 구역에 의해 결정된다. 이들 3개의 초가변 구역은 그 서열이 비교적 보존되고 결합에 직접 관여하지 않는 4개의 프레임워크 구역 (FR)과 교대로 존재한다. CDR은 루프를 형성하고, 주로 β-시트 형태를 갖는 프레임워크 구역에 근접하여 유지된다. 중쇄의 CDR은 관련 경쇄의 CDR과 함께 본질적으로 항체 분자의 항원 결합 부위를 구성한다. FR 또는 CDR 구역을 구성하는 성분에 대한 결정은 대체로 동일한 종에서 발생시킨 많은 항체의 아미노산 서열을 비교함으로써 수행된다. CDR 및 FR 구역의 확인을 위한 일반적인 규칙은 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 웹사이트 (http://www. bioinf.org.uk/abs/)에서 알 수 있다.

본 발명자들은 놀랍게도 IgG 타입의 인간 NiG에 대해 메다렉스 마우스 (Medarex Mice; 인간 면역글로불린 유전자를 갖는 유전적으로 재구성된 마우스)에서 생성시킨 신규한 모노클로날 인간 항체 (이하 "3A6"으로 부름)가 특히 호모 사피엔스를 포함한 상이한 종의 NogoA에 대한 결합 친화도 및 제시된 항체 농도에서 그의 보다 높은 Nogo-A 신경돌기 증식 중화 활성의 측면에서 선행 기술의 NogoA 항체 (Schwab ME et al. (1996) Physiol. Rev. 76, 319-370)보다 우수한 특성을 갖는 다는 것을 밝혀내었다. 또한 상기 항체와 동일한 초가변 구역을 갖는 다른 Nogo 결합 분자를 제조하는 것도 가능하다.

따라서, 본 발명은 NogoA의 특정 구역 또는 에피토프에 대한 결합 분자 (이하 "본 발명의 결합 분자" 또는 간단히 "결합 분자"로 부름)를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 결합 분자는 해리 상수 (Kd)가 1000 nM 미만, 보다 바람직하게는 Kd가 100 nM 미만, 가장 바람직하게는 Kd가 10 nM 미만인 인간 NogoA_342-357 (인간 NiG에서 3A6의 에피토프 = 서열 6), 인간 NogoA (서열 5) 또는 인간 NiG (NogoA의 가장 효능있는 신경돌기 증식 억제성 단편으로서 인간 NogoA의 아미노산 No. 186에서 시작하여 아미노산 No. 1004에서 종료됨 = 서열 5)에 결합한다. 결합 반응은 예를 들어 실시예 6에 기재된 ELISA 방법 및 실시예 7에 기재된 바이오센서 (biosensor) 친화도 방법을 포함하여 표준 방법 (정량 분석)에 의해 제시될 수 있다. 또한, 인간 NogoA에 대한 결합 및 보다 중요하게는 효율성이 예를 들어 하기하는 바와 같은 신경돌기 증식 분석에서 제시될 수 있다.

따라서, 추가의 바람직한 실시태양에서, 결합 분자 (100 ㎍/ml, 바람직하게는 10 ㎍/ml, 보다 바람직하게는 1.0 ㎍/ml, 훨씬 더 바람직하게는 0.1 ㎍/ml의 농도에서)는 원숭이 뇌 단백질 추출물의 기질에 대한 쥐 소뇌 과립 세포의 신경돌기의 수를 인간 NogoA, 인간 NiG 또는 NogoA_342-357 폴리펩티드에 결합하지 않는 대조 항체 (즉 해리 상수 > 1000 nM)로 처리된 쥐 소뇌 과립 세포의 신경돌기의 수에 비해 적어도 20%, 바람직하게는 50%, 가장 바람직하게는 80% 증가시킨다.

추가의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함하고, 상기 항원 결합 부위는 초가변 구역 CDR-H1-3A6, CDR-H2-3A6 및 CDR-H3-3A6 및 이들의 직접적인 동등물을 순서대로 포함하고; 상기 CDR-H1-3A6은 서열 8의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR-H2-3A6은 서열 9의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR-H3-3A6은 서열 10의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 추가의 측면에서, 본 발명의 결합 분자는 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함하고, 상기 항원 결합 부위는 a) 순서대로 초가변 구역 CDR-H1-3A6, CDR-H2-3A6 및 CDR-H3-3A6 (여기서 상기 CDR-H1-3A6은 서열 8의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR-H2-3A6은 서열 9의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR-H3-3A6은 서열 10의 아미노산 서열을 갖는다); 또는 b) 순서대로 초가변 구역 CDR-L1-3A6, CDR-L2-3A6 및 CDR-L3-3A6 (여기서 상기 CDR-L1-3A6은 서열 11의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR-L2-3A6은 서열 12의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR-L3-3A6은 서열 13의 아미노산 서열을 갖는다); 또는 c) 이들의 직접적인 동등물을 포함한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 본 발명의 결합 분자는 적어도 a) 순서대로 초가변 구역 CDR-H1-3A6, CDR-H2-3A6 및 CDR-H3-3A6을 포함하는 제1 도메인 (상기 CDR-H1-3A6은 서열 8의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR-H2-3A6은 서열 9의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR-H3-3A6은 서열 10의 아미노산 서열을 갖는다); 및 b) 순서대로 초가변 구역 CDR-L1-3A6, CDR-L2-3A6 및 CDR-L3-3A6을 포함하는 제2 도메인 (상기 CDR-L1-3A6은 서열 11의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR-L2-3A6은 서열 12의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR-L3-3A6은 서열 13의 아미노산 서열을 갖는다); 또는 c) 이들의 직접적인 동등물을 포함한다.

또한, 본 발명은 a) 3A6의 중쇄의 가변 부분 (서열 2); 또는 b) 3A6의 경쇄의 가변 부분 (서열 3), 또는 이들의 직접적인 동등물을 포함하는 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함하는 본 발명의 결합 분자를 제공한다.

항원 결합 부위가 제1 및 제2 도메인을 모두 포함할 때, 이들은 동일한 폴리펩티드 분자 상에 위치할 수 있거나, 바람직하게는 각각의 도메인은 상이한 사슬 상에 존재할 수 있고, 제1 도메인은 면역글로불린 중쇄 또는 그의 단편의 일부이고, 제2 도메인은 면역글로불린 경쇄 또는 그의 단편의 일부일 수 있다.

본 발명의 결합 분자의 예는 B세포 또는 하이브리도마에 의해 생산된 항체 및 그의 인간 또는 키메릭 또는 인간화 항체 또는 임의의 단편, 예를 들어 F(ab')₂; 및 Fab 단편, 및 단일쇄 또는 단일 도메인 항체를 포함한다.

단쇄 항체는 대체로 10 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 15 내지 25개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 링커에 의해 공유 결합된 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인으로 구성된다. 따라서, 상기 구조체는 중쇄 및 경쇄의 불변 부분을 포함하지 않고, 작은 펩티드 스페이서가 전체 불변 부분보다 항원성이 작다고 생각된다. "키메릭 항체"는 중쇄 또는 경쇄의 불변 구역 또는 둘 모두의 불변 구역이 인간 기원이고, 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 도메인이 비-인간 (예를 들어, 쥐과 (murine)) 기원인 항체를 의미한다. "인간화 항체"는 초가변 구역 (CDR)이 비-인간 (예를 들어 쥐과) 기원이고, 면역글로불린의 모든 또는 실질적으로 모든 다른 부분, 예를 들어 불변 구역 및 가변 도메인의 고보존 부분, 즉 프레임워크 구역이 인간 기원인 항체를 의미한다. 그러나, 인간화 항체는 초가변 구역에 인접한 프레임워크 구역의 부분에 쥐과 서열의 몇몇 아미노산을 보유할 수 있다.

초가변 구역은 임의의 종류의, 바람직하게는 쥐과 또는 인간 기원의 프레임워크 구역과 회합할 수 있다. 적합한 프레임워크 구역은 문헌 ["Sequences of proteins of immunological interest", Kabat E. A. et al, US department of health and human services, Public health service, National Institute of Health]에 기재되어 있다. 바람직하게는, 결합 분자의 인간 중쇄의 불변 부분은 서브타입을 포함하여 IgG4 타입일 수 있고, 바람직하게는 인간 경쇄의 불변 부분은 κ 또는 λ 형, 보다 바람직하게는 κ형일 수 있다.

모든 인간에서 천연에서 발견되는 단백질에 대해 생성된 모노클로날 항체를 비-인간 시스템, 예를 들어 마우스에서 발생시킬 수 있다. 이것의 직접적인 결과로서, 하이브리도마에 의해 생산된 이종 항체는 인간에게 투여시에 바람직하지 않은 면역 반응을 야기하고, 이것은 이종 면역글로불린의 불변 부분에 의해 주로 매개된다. 이것은 장기간에 걸쳐 투여할 수 없기 때문에 상기 항체의 용도를 분명하게 제한한다. 따라서, 인간에게 투여시에 실질적인 동종간 (allogenic) 반응을 야기할 가능성이 없는 단일쇄, 단일 도메인, 키메릭 또는 인간화 항체를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

상기 내용에 비추어, 보다 바람직한 본 발명의 결합 분자는 적어도 a) (i) 순서대로 초가변 구역 CDR-H1-3A6, CDR-H2-3A6 및 CDR-H3-3A6을 포함하는 가변 도메인 및 (ii) 인간 중쇄의 불변 부분 또는 그의 단편을 포함하는 하나의 면역글로 불린 중쇄 또는 그의 단편 (상기 CDR-H1-3A6은 서열 8의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR-H2-3A6은 서열 9의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR-H3-3A6은 서열 10의 아미노산 서열을 갖는다), 및 b) (i) 순서대로 초가변 구역 CDR-L1-3A6, CDR-L2-3A6 및 CDR-L3-3A6을 포함하는 가변 도메인 및 (ii) 인간 경쇄의 불변 부분 또는 그의 단편을 포함하는 하나의 면역글로불린 경쇄 또는 그의 단편 (여기서 상기 CDR-L1-3A6은 서열 11의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR-L2-3A6은 서열 12의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR-L3-3A6은 서열 13의 아미노산 서열을 갖는다); 또는 이들의 직접적인 동등물을 포함하는 키메릭 항체로부터 선택된다.

별법으로, 본 발명의 결합 분자는 a) 순서대로 초가변 CDR-H1-3A6, CDR-H2-3A6 및 CDR-H3-3A6을 포함하는 제1 도메인 (상기 CDR-H1-3A6은 서열 8의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR-H2-3A6은 서열 9의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR-H3-3A6은 서열 10의 아미노산 서열을 갖는다); 및 b) 순서대로 초가변 CDR-L1-3A6, CDR-L2-3A6 및 CDR-L3-3A6을 포함하는 제2 도메인 (상기 CDR-L1-3A6은 서열 11의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR-L2-3A6은 서열 12의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR-L3-3A6은 서열 13의 아미노산 서열을 갖는다); 및 c) 제1 도메인의 N-말단 끝 및 제2 도메인의 C-말단 끝 또는 제1 도메인의 C-말단 끝 및 제2 도메인의 N-말단 끝에 결합된 펩티드 링커; 또는 이들의 직접적인 동등물을 포함하는 항원 결합 부위를 포함하는 단일쇄 결합 분자로부터 선택될 수 있다.

공지되어 있는 바와 같이, 아미노산 서열의 작은 변경, 예를 들어 하나 또는 복수개의 아미노산의 결손, 부가 또는 치환에 의해 실질적으로 동일한 특성을 갖는 본래 단백질의 대립유전자 형태 (allelic form)를 생성시킬 수 있다. 따라서, 용어 "이들의 직접적인 동등물"은 (i) 결합 분자의 각각의 초가변 구역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3이 CDR-H1-3A6 (서열 8), CDR-H2-3A6 (서열 9) 및 CDR-H3-3A6 (서열 10)의 동등한 초가변 구역에 적어도 50 또는 80% 상동성, 바람직하게는 적어도 90% 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 95, 96, 97, 98, 99% 상동성인 반면, CDR-H1은 CDR-H1-3A6에 동등하고, CDR-H2는 CDR-H2-3A6에 동등하고, CDR-H3은 CDR-H3-3A6에 동등하고; (ii) 바람직하게는 해리 상수 (Kd) <1000 nM, 보다 바람직하게는 Kd < 100 nM, 가장 바람직하게는 Kd < 10 nM로 인간 NogoA, 인간 NiG, 또는 인간 NogoA_-342-357에 결합할 수 있는 본 발명의 임의의 단일 도메인 결합 분자 (X), 또는 (iii) 각각의 초가변 구역 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3이 CDR-H1-3A6 (서열 8), CDR-H2-3A6 (서열 9), CDR-H3-3A6 (서열 10), CDR-L1-3A6 (서열 11), CDR-L2-3A6 (서열 12) 및 CDR-L3-3A6 (서열 13)의 동등한 초가변 구역에 적어도 50 또는 80% 상동성, 바람직하게는 적어도 90% 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 95, 96, 97, 98, 99% 동일성인 반면, CDR-H1은 CDR-H1-3A6에 동등하고, CDR-H2는 CDR-H2-3A6에 동등하고, CDR-H3은 CDR-H3-3A6에 동등하고, CDR-L1은 CDR-L1-3A6에 동등하고, CDR-L2는 CDR-L2-3A6에 동등하고, CDR-L3은 CDR-L3-3A6에 동등하고; (iv) 바람직하게는 해리 상수 (Kd) < 1000nM, 보다 바람직하게는 Kd < 100 nM, 가장 바람직하게는 Kd < 10 nM로서 인간 NogoA, 인간 NiG 또는 인간 NogoA_-342-357에 결합할 수 있는 결합 부위당 적어도 2개의 도메인을 갖는 본 발명의 임의의 결합 분자 (분자 X')를 의미한다.

따라서, 본 발명의 추가의 실시태양은 예를 들어 해리 상수 < 1000 nM로서 인간 NogoA, 인간 NiG, 또는 인간 NogoA_-342-357에 결합할 수 있고 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 분자이고, 상기 항원 결합 부위는 그들의 동등한 초가변 구역 CDR-H1-3A6 (서열 8), CDR-H2-3A6 (서열 9) 및 CDR-H3-3A6 (서열 10)에 각각 적어도 50%, 바람직하게는 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 상동성인 초가변 구역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 순서대로 포함하거나; 또는 그들의 동등한 초가변 구역 CDR-L1-3A6 (서열 11), CDR-L2-3A6 (서열 12) 및 CDR-L3-3A6 (서열 13)에 각각 적어도 50%, 바람직하게는 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 상동성인 초가변 구역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 순서대로 포함한다.

또한, 본 발명의 추가의 결합 분자는 해리 상수 <1000 nM로서 인간 NogoA, 인간 NiG 또는 인간 NogoA_342-357에 결합할 수 있고, 그들의 동등한 초가변 구역 CDR-H1-3A6 (서열 8), CDR-H2-3A6 (서열 9) 및 CDR-H3-3A6 (서열 10)에 각각 적어도 50%, 바람직하게는 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 상동성인 초가변 구역 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 순서대로 포함하는 제1 항원 결합 부위; 및 그들의 동등한 초가변 구역 CDR-L1-3A6 (서열 11), CDR-L2-3A6 (서열 12) 및 CDR-L3-3A6 (서열 13)에 각각 적어도 50%, 바람직하게는 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 상동성인 초가변 구역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 순서대로 포함하는 제2 항원 결합 부위를 포함한다.

상기 해리 상수는 예를 들어 실시예 7에 기재된 바이오센서 친화도 방법을 포함한 다양한 분석으로 편리하게 시험할 수 있다. 또한, 결합 분자의 결합 및 기능적 효과는 예를 들어 하기하는 생물학적 분석에서 보여질 수 있다.

인간 중쇄의 불변 부분은 γ1; γ2; γ3; γ4; α1; α2; δ 또는 ε형, 바람직하게는 γ형, 보다 바람직하게는 γ4형일 수 있고, 인간 경쇄의 불변 부분은 κ 또는 λ형 (λ1; λ2; 및 λ3 서브타입 포함)일 수 있지만, 바람직하게는 κ형이다. 상기 모든 불변 부분의 아미노산 서열은 카바트 (Kabat) 등의 상기 문헌에 제시되어 있다.

본 발명의 결합 분자의 컨쥬게이트, 예를 들어 효소 또는 톡신 또는 방사성 동위원소 컨쥬게이트도 본 발명의 범위에 포함된다.

본원에서 달리 구체적으로 설명되지 않으면, "폴리펩티드"는 N-말단 끝에서 시작하여 C-말단 끝에서 끝나는 아미노산 서열을 갖는, 서로 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 모노클로날 항체이고, 보다 바람직하게는 키메릭 (V-이식된으로도 부름) 또는 인간화 (CDR-이식된으로도 부름) 모노클로날 항체이다. 인간화 (CDR-이식된) 모노클로날 항체는 수여 항체의 프레임워크 (FR) 서열 내에 도입된 추가의 돌연변이를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

본원에서 사용되는 폴리펩티드의 기능적 유도체는 본 발명의 폴리펩티드와 공통적인 정성적 생물학적 활성을 갖는, 즉 인간 NogoA, 인간 NiG 또는 인간 NogoA_- 342-357에 결합하는 능력을 갖는 분자를 포함한다. 기능적 유도체는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 단편 및 펩티드 유사체를 포함한다. 단편은 예를 들어 특정 서열의 본 발명에 따른 폴리펩티드의 서열 내의 구역을 포함한다. 용어 "유도체"는 예를 들어 특정 서열의 본 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체 및 공유 변형체를 규정하기 위해 사용된다. 예를 들어 특정 서열의, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 초가변 구역의 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기능적 유도체는 예를 들어 특정 서열의 본 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 서열과 바람직하게는 적어도 약 65%, 보다 바람직하게는 적어도 약 75%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 85%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95, 96, 97, 98, 99%의 전체 서열 상동성을 갖고, 실질적으로 인간 NogoA, 인간 NiG 또는 인간 NogoA_-342-357에 결합하는 능력을 보유한다.

용어 "공유 변형체"는 유기 단백성 또는 비-단백성 유도체화제, 이종 폴리펩티드 서열에 대한 융합 및 번역후 변형을 사용한, 예를 들어 특정 서열의 본 발명에 따른 폴리펩티드의 변형체 또는 그의 단편을 포함한다. 예를 들어 특정 서열의 공유 변형 폴리펩티드는 가교결합에 의해 인간 NogoA, 인간 NiG 또는 인간 NogoA_-342-357에 결합하는 능력을 계속 갖는다. 공유 변형체는 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 표적 아미노산 잔기를 반응시키거나 선택된 재조합 숙주 세포에서 기능하는 번역후 변형의 메카니즘을 이용하여 통상 도입된다. 몇몇 번역후 변형은 발현된 폴리펩티드에 대한 재조합 숙주 세포의 작용 의 결과이다. 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 종종 번역후 탈아미드화되어 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기가 된다. 별법으로, 이들 잔기는 약한 산성 조건 하에서 탈아민화된다. 다른 번역후 변형은 프롤린 및 라이신의 히드록실화, 세릴, 타이로신 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화를 포함한다 (예를 들어 문헌 [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)] 참조). 예를 들어, 공유 변형체는 예를 들어 특정 서열의 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질, 및 이들의 아미노산 서열 변이체, 예를 들어 이뮤노어드헤신, 및 이종 시그날 서열에 대한 N-말단 융합체를 포함한다.

천연 폴리펩티드 및 그의 기능적 유도체에 대한 "상동성"은 서열을 정렬시키고, 필요한 경우 최대 상동성 비율을 달성하기 위해 갭을 도입한 후에 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 부분으로서 고려하지 않으면서 대응하는 천연 폴리펩티드의 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 비율로서 본원에서 정의된다. N- 또는 C-말단 연장이나 삽입은 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 고려되지 않을 것이다. 정렬 방법 및 컴퓨터 프로그램은 공지되어 있다.

"아미노산(들)"은 D-아미노산을 포함하여 예를 들어 모든 천연 L-α-아미노산을 의미한다. 아미노산은 공지의 단일 문자 또는 3문자 명명법에 의해 확인된다.

용어 "아미노산 서열 변이체"는 예를 들어 특정 서열의 본 발명에 따른 폴리 펩티드에 비해 이들의 아미노산 서열의 일부 차이가 존재하는 분자를 의미한다. 예를 들어 특정 서열의 본 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 인간 NogoA 또는 인간 NiG, 또는 보다 바람직하게는 NogoA_-342-357에 결합하는 능력을 계속 갖는다. 치환 변이체는 예를 들어 특정 서열의 본 발명에 따른 폴리펩티드에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고 동일한 위치에 그 대신에 다른 아미노산이 삽입된 것이다. 상기 치환은 하나일 수 있고, 여기서 분자 내의 단지 하나의 아미노산만이 치환되거나, 또는 다중 치환일 수 있고, 여기서 2 이상의 아미노산이 동일한 분자에서 치환된다. 삽입 변이체는 예를 들어 특정 서열의 본 발명에 따른 폴리펩티드에서 특정 위치의 아미노산에 바로 인접하여 하나 이상의 아미노산이 삽입된 것이다. 아미노산에 바로 인접한다는 것은 아미노산의 α-카르복시 또는 α-아미노 기능기에 연결됨을 의미한다. 결실 변이체는 예를 들어 특정 서열의 본 발명에 따른 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 제거된 것이다. 통상적으로, 결실 변이체는 분자의 특정 구역에서 하나 또는 둘의 아미노산이 결실될 것이다.

본 발명의 결합 분자는 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다. 이러한 측면에서, 결합 분자를 코딩하는 하나 이상의 DNA 분자는 제조되어 적합한 대조 서열 하에 배치되고, 발현에 적합한 숙주 유기체 내에 도입되어야 한다.

따라서, 매우 일반적인 방식으로 (i) 본 발명의 단일 도메인 결합 분자, 본 발명의 단일쇄 결합 분자, 본 발명의 결합 분자의 중쇄 또는 경쇄 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA 분자; 및 (ii) 재조합 수단에 의해 본 발명의 결합 분자를 제조하 기 위한 본 발명의 DNA 분자의 용도가 제공된다.

현재의 기술 수준은 당업계의 숙련인이 본원에서 제공된 정보, 즉 초가변 구역의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 DNA 서열이 제시될 때 본 발명의 DNA 분자를 합성할 수 있는 정도이다. 가변 도메인 유전자를 제조하는 방법은 예를 들어 EP 239 400에 기재되어 있고, 다음과 같이 간단히 요약할 수 있다. 어떠한 특이성을 갖는 모노클로날 항체의 가변 도메인을 코딩하는 유전자도 클로닝할 수 있다. 프레임워크 및 초가변 구역을 코딩하는 DNA 세그먼트가 결정되고, 초가변 구역을 코딩하는 DNA 세그먼트를 제거하여 프레임워크 구역을 코딩하는 DNA 세그먼트를 적합한 제한효소 부위와 함께 결합부에서 융합시킨다. 제한효소 부위는 표준 과정에 의해 DNA 분자의 돌연변이에 의해 적합한 위치에서 생성시킬 수 있다. 이중가닥 합성 CDR 카세트는 상기 제시된 서열 CDR-H1-3A6, CDR-H2-3A6, CDR-H3-3A6, CDR-L1-3A6, CDR-L2-3A6 및 CDR-L3-3A6에 따라 DNA 합성에 의해 제조된다. 상기 카세트에는 면역글로불린 가변 도메인을 코딩하는 DNA 분자를 달성하기 위해 표준 프로토콜에 의해 프레임워크에 결합부에서 라이게이션될 수 있도록 스티키 (sticky) 말단부가 제공된다.

또한, 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA 구조체를 얻기 위해 생성 하이브리도마 세포주로부터 mRNA에 접근할 필요는 없다. 따라서, PCT 출원 WO90/07861은 단지 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대한 설명 정보만이 제시될 때 재조합 DNA 기술에 의한 모노클로날 항체의 제조를 위한 충분한 정보를 제시하고 있다.

상기 방법은 많은 올리고뉴클레오티드의 합성, PCR 방법에 의한 이들의 증폭 및 목적하는 DNA 서열을 얻기 위한 이들의 스플라이싱을 포함한다.

중쇄 및 경쇄 불변 부분을 코딩하는 적합한 프로모터 또는 유전자를 포함하는 발현 벡터는 공개적으로 입수가능하다. 따라서, 본 발명의 DNA 분자를 제조하면, 이를 적절한 발현 벡터에 편리하게 이송할 수 있다.

단쇄 항체를 코딩하는 DNA 분자는 또한 예를 들어 WO 88/1649에 기재된 바와 같은 표준 방법에 의해 제조할 수도 있다.

본 발명의 특정 실시태양에서, 본 발명의 일부의 결합 분자를 제조하는 재조합 수단은 다음과 같이 설명되는 제1 및 제2 DNA 구조체를 포함한다.

제1 DNA 구조체는 중쇄 또는 그의 단편을 코딩하고, a) 교대로교대로제1 부분 (상기 초가변 구역은 순서대로 DNA-CDR-H1-3A6 (서열 14), DNA-CDR-H2-3A6 (서열 15) 및 DNA-CDR-H3-3A6 (서열 16)을 포함하고, 상기 제1 부분은 가변 도메인의 제1 아미노산을 코딩하는 코돈으로 출발하여 가변 도메인의 마지막 아미노산을 코딩하는 코돈을 끝난다), 및 b) 중쇄의 불변 부분의 제1 아미노산을 코딩하는 코돈으로 출발하여 불변 부분의 마지막 아미노산 또는 그의 단편을 코딩하는 코돈으로 끝나고, 이어서 비-센스 코돈이 존재하는 중쇄 불변 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 제2 부분을 포함한다.

바람직하게는, 제2 부분은 인간 중쇄의 불변 부분, 보다 바람직하게는 인간 γ4 사슬의 불변 부분을 코딩한다. 상기 제2 부분은 게놈 기원 (인트론 포함)의 DNA 단편 또는 cDNA 단편 (인트론 미포함)일 수 있다.

제2 DNA 구조체는 경쇄 또는 그의 단편을 코딩하고, a) 교대로 프레임워크 및 초가변 구역을 포함하는 가변 도메인을 코딩하는 제1 부분 (상기 초가변 구역은 DNA-CDR-L1-3A6 (서열 17), DNA-CDR-L2-3A6 (서열 18) 및 DNA-CDR-L3-3A6 (서열 19을 포함하고, 상기 제1 부분은 가변 도메인의 제1 아미노산을 코딩하는 코돈으로 출발하여 가변 도메인의 마지막 아미노산을 코딩하는 코돈으로 끝난다), 및 b) 경쇄의 불변 부분의 제1 아미노산을 코딩하는 코돈으로 출발하여 불변 부분의 마지막 아미노산 또는 그의 단편을 코딩하는 코돈으로 끝나고, 이어서 비-센스 코돈이 존재하는 경쇄 불변 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 제2 부분을 포함한다.

바람직하게는, 제2 부분은 인간 경쇄의 불변 부분, 보다 바람직하게는 인간 κ 사슬의 불변 부분을 코딩한다.

제1 또는 제2 DNA 구조체는 제1 부분의 상류에 위치하고 리더 (leader) 펩티드의 일부를 코딩하는 제3 부분을 포함하는 것이 유리하고, 상기 제3 부분은 제1 아미노산을 코딩하는 코돈으로 출발하여 리더 펩티드의 마지막 아미노산으로 끝난다. 상기 펩티드는 발현되어 숙주 유기체에 의해 후속 제거되는 사슬의 숙주 유기체에 의한 분비에 필요하다. 바람직하게는, 제1 DNA 구조체의 제3 부분은 서열 21 (위치 -19의 아미노산으로 출발하여 위치 -1의 아미노산으로 끝남)에 제시된 중쇄 리더 서열의 아미노산 서열에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 리더 펩티드를 코딩한다. 또한, 바람직하게는, 제2 DNA 구조체의 제3 부분은 서열 23 (경쇄, 위치 -18의 아미노산으로 출발하여 위치 -1의 아미노산으로 끝남)에 제시된 아미노산 서열을 갖는 리더 펩티드를 코딩한다.

각각의 DNA 구조체는 적합한 조절 서열의 조절 하에, 특히 적합한 프로모터의 조절 하에 배치된다. DNA 구조체가 발현을 위해 이송되는 숙주 유기체에 적응된다면, 임의의 종류의 프로모터가 사용될 수 있다. 그러나, 포유동물 세포에서 발현될 경우, 면역글로불린 유전자의 프로모터를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

목적하는 항체는 세포 배양에서 또는 트랜스제닉 (transgenic) 동물에서 생산될 수 있다. 적합한 트랜스제닉 동물은 적합한 조절 서열 하에 배치된 제1 및 제2 DNA 구조체를 난자에 미세주사하고 이와 같이 제조된 난자를 적합한 가임 여성에게 이식하고 목적하는 항체를 발현하는 후손체를 선택하는 것을 포함하는 표준 방법에 따라 얻을 수 있다.

항체 사슬이 세포 배양에서 생산되어야 하는 경우, DNA 구조체는 먼저 단일 발현 벡터에 또는 2개의 별개의, 그러나 상용성인 발현 벡터에 삽입되어야 하고, 가능하게는 후자가 바람직하다.

따라서, 본 발명은 또한 상기한 적어도 하나의 DNA 구조체를 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포주에서 복제할 수 있는 발현 벡터를 제공한다.

이어서, DNA 구조체를 포함하는 각각의 발현 벡터를 적합한 숙주 유기체에 이송한다. DNA 구조체가 2개의 발현 벡터에 별개로 삽입될 경우, 이들 벡터는 별개로, 즉 세포당 한 종류의 벡터를 이송하거나 또는 동시 형질감염시킬 수 있고, 가능하게는 후자가 바람직하다. 적합한 숙주 유기체는 박테리아, 효모 또는 포유동물 세포주일 수 있고, 후자가 바람직하다. 보다 바람직하게는, 포유동물 세포주는 림프계 기원, 예를 들어 골수종, 하이브리도마 또는 정상적인 무한증식 B세포일 수 있지만, 임의의 내인성 항체 중쇄 또는 경쇄를 발현하지 않는다.

숙주 유기체는 세포당 매우 많은 카피의 벡터를 포함하는 것이 또한 바람직하다. 숙주 유기체가 포유동물 세포주일 경우, 상기 바람직한 목적은 표준 방법에 따라 카피수를 증폭시켜 달성할 수 있다. 증폭 방법은 대체로 발현 벡터에 의해 코딩되는 약물에 대한 내성 증가를 선택하는 것으로 이루어진다.

본 발명의 다른 측면에서, (i) 본 발명의 제1 및 제2 DNA 구조체로 형질전환된 유기체를 배양하고, (ii) 배양액으로부터 본 발명의 활성 결합 분자를 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 다중 사슬 결합 분자의 제조 방법이 제공된다.

별법으로, 중쇄 및 경쇄는 별개로 회수하여 시험관내 폴딩 후에 활성 결합 분자로 재구성할 수 있다. 재구성 방법은 당업계에 공지되어 있다. 상기 방법의 예는 특히 EP 120 674 또는 EP 125 023에 제시되어 있다. 따라서, 한 방법은 (i) 본 발명의 제1 DNA 구조체로 형질전환된 제1 유기체를 배양하고, 배양액으로부터 상기 중쇄 또는 그의 단편을 회수하고, (ii) 본 발명의 제2 DNA 구조체로 형질전환된 제2 유기체를 배양하고, 배양액으로부터 상기 경쇄 또는 그의 단편을 회수하고, (iii) (i)에서 얻은 중쇄 또는 그의 단편 및 (ii)에서 얻은 경쇄 또는 그의 단편으로부터 본 발명의 활성 결합 분자를 시험관 내에서 재구성하는 것을 포함할 수 있다.

또한, 유사한 방식으로, (i) 본 발명의 단일쇄 또는 단일 도메인 결합 분자를 각각 코딩하는 DNA 구조체로 형질전환된 유기체를 배양하고, (ii) 상기 분자를 배양액으로부터 회수하는 것을 포함하는 본 발명의 단일쇄 또는 단일 도메인 결합 분자의 제조 방법도 제공된다.

본 발명의 결합 분자는 예를 들어 과립 세포 신경돌기 증식 모델에서 보이는 바와 같이 매우 우수한 신경 재생 활성을 나타낸다.

1. 과립 세포 신경돌기 증식 분석 ( 시험관내 )

앞서 설명된 바와 같이 새로 제조된 각각의 분석 단백질 추출을 위해 뇌 조직 (피질 및 간뇌)를 취하였다 (Spillmann et al. 1998, Identification and characterization of a bovine neurite growth inhibitor (bNI-220), J Biol Chem. 1998 Jul 24; 273(30): 19283-93). 동결 조직의 조각 (예를 들어 0.25 g)을 4℃에서 프로테아제 차단제 (10 ㎍/ml 아프로티닌-5 ㎍/ml, 류펩틴-1 ㎍/ml, 펩스타틴-1 mM PMSF)를 갖는 3-4 부피의 60mM Chaps-20mM Tris pH 8.0-1 mM EDTA 중에 균질화시켰다. 균질액을 4℃에서 30분 동안 회전자에 놓고, TLA 100.3 회전자 (벡크만 (Beckman) TL-100 초원심분리기) 내에서 4℃에서 100,OOO g에서 45분 동안 원심분리시켰다. 상등액으로부터, 단백질 농도는 바이오라드 (BioRad)를 사용하여 결정되었다. 소뇌 과립 세포는 앞서 설명된 바와 같이 생후 5-7일의 쥐의 소뇌 조직의 트립신 분해물로부터 정제하였다 (Niederost et al 1999, Bovine CNS myelin contains neurite growth-inhibitory activity associated with chondroitin sulfate proteoglycans, J Neurosci. 1999 Oct 15; 19(20): 8979-89). 이어서 본 발명의 결합 분자를 시험 기질 상에서 30분 동안 예비인큐베이팅하고 세포를 첨가하기 전에 제거하였다. 소뇌 과립 세포를 첨가하고 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 실험을 중지하기 위해, 2 ml의 4% 완충된 포름알데히드를 배양 접시에 서서히 첨가하였다. 상기한 바와 같이 제조된 원숭이 뇌 멤브레인 단백질 추출물을 15 ㎍ 단백질/cm² 배양 접시로 Greiner 4-웰 접시 (그라이너 (Greiner), 독일 누르팅엔) 상에서 밤새 흡착시켰다. 접시를 따뜻한 행크 (Hank) 용액으로 3회 세척한 후 뉴런을 플레이팅하였다. 생후 (5-7일) 쥐 소뇌 과립 세포를 상기한 바와 같이 제조하고, 50,000 세포/cm²에서 플레이팅하였다. 세포를 무혈청 배지 내에서 24시간 동안 배양하고, 고정시키고, 신경돌기 마커 MAB 1b (케미콘 (Chemicon) 모노클로날 Ab, 1:200)로 면역염색하였다. 세포체의 염색을 위해, MAB 1b로 염색한 후 DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐-인돌, 디히드로클로라이드, 몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes) 제품)를 사용하였다. 항체 실험을 위해, 항-Nogo-A mAb 또는 대조 IgG Ab를 접시 상에서 30분 동안 예비인큐베이팅한 후 제거하였다.

웰의 가장자리에 대해 규정된 거리에서 4개의 필드를 40X 대물렌즈를 사용하여, 신경돌기와 관찰 필드의 중앙을 통해 놓인 선과의 모든 교차점을 계수함으로써 각 웰에 대해 랜덤하게 샘플링하였다. 선에 접촉하는 모든 세포체를 계수하고, 세포체당 신경돌기의 인덱스 (index) 비를 앞서 기록된 바와 같이 각 웰에 대해 계산하였다 (Simonen et al, 2003, Neuron 38, 201-211). 모든 계수는 코드화된 실험에 대해 무계획적으로 수행하고, 세포체당 신경돌기의 인덱스로 표시하였다. 결과는 평균 인덱스 신경돌기/세포체로 표시하였다.

본 발명의 결합 분자와 함께 예비인큐베이팅함으로써 상기 제조된 척수 추출물의 복제를 허용하지 않는 환경에서 소뇌 과립 세포의 신경돌기 증식의 향상을 관 찰할 수 있다. 예를 들어, 과립 세포 신경돌기 증식 모델에서 인간 3A6-IgG1 및 IgG4 항체의 중화 효과에 대한 대표적인 프로파일을 아래 제시한다.

	인덱스 신경돌기/세포체	대조 IgG에 비교한 증가%
항체 없음	0.87
+대조 IgG	0.90
3A6 IgG1 0.1 ㎍/ml	1.44	60%
3A6 IgG4 0.1 ㎍/ml	1.43	59%
+대조 IgG	0.92
3A6 IgG1 10.0 ㎍/ml	1.69	84%
3A6 IgG4 10.0 ㎍/ml	1.55	68%

본 발명의 분자의 중화 활성은 간략하게 하기하는 생체내 척수 손상 모델에서 재생 스프라우팅 및 신경돌기 증식과 기능적 회복을 측정함으로써 또한 추정될 수 있다.

2. 쥐 및 원숭이에서 척수 손상 모델( 생체내 )

성체 루이스 (Lewis) 쥐를 척수의 등쪽 반을 제8 흉추 수준에서 좌우양측으로 횡단함으로써 현미수술로 손상시켰다. 척추후궁절제술, 마취 및 수술은 문헌 [Schnell and Schwab 1993, Eur. J. Neurosci. 5: 1156-1171]에 설명되어 있다.

신경해부학적 추적: 운동 및 감각 피질척수로를 전행성 (anterograde) 추적물질인 비오틴 덱스트란 아민 (BDA)을 펌프 또는 이식편의 반대편 피질 내로 주입함으로써 추적하였다. BDA는 10-14일 내에 척수에 전달되었고, 문헌[Broesamle et al., 2000 J. Neurosci. 20: 8061-8068]에 기재된 바와 같이 기질로서 디아미노벤지딘 (DAB)을 사용하여 가시화하였다.

양측 주요 CST를 포함하는 주로 등쪽 반에서 약 40%의 척수 분절 T8을 파괴 시키는 척수 손상 2주 후: 대조 동물에서 CST의 추적은 피질척수로의 중정도의 반응적 스프라우팅을 보여주었다. 이 현상은 문헌에 잘 알려진 손상에 반응하는 자발적 스프라우팅에 대응한다. 본 발명의 결합 분자로 처리되거나 또는 본 발명의 결합 분자를 전달하는 펌프를 갖는 손상된 쥐는 병변 부위에서 향상된 스프라우팅 및 손상된 축삭 신경돌기의 재생 및 손상된 신경돌기의 증식을 보일 수 있다. 또한, 동물은 감각운동 기능의 개선된 회복을 보일 수 있다. 이러한 기능 시험은 문헌에서 설명된 바 있다 (Merkler et al, 2001, J. Neuroscience 21, 3665-73).

3. 성체 원숭이 CNS에서 항체의 조직 분포

항체 3A6은 IgG로서 정제하고 PBS 중에 3 mg/ml로 농축시켰다. 마우스 혈청 유래된 IgG (케미콘 인트. (Chemicon Int.), 미국 캘리포니아주 테메쿨라) 또는 밀 옥신에 대해 작용하는 mAB (엠이엠에스 바이오테크놀로지 (AMS Biotechnology), 영국 옥손)를 대조 처리제로서 사용하였다. 2마리의 수컷 성체 짧은꼬리 원숭이 (마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis))를 경막내 주입을 위해 이 연구에서 사용하였다.

수술 절차

마취는 케타민 (Ketalar(등록상표); 파케-데이비스 (Parke-Davis), 5 mg/kg, i.m.)의 근육내 주사에 의해 유도하였다. 기관지 분비를 감소시키기 위해 아트로핀을 i.m. 주사하였다 (0.05 mg/kg). 보다 깊은 마취를 유도하는 프로포폴 1% (Fresenius(등록상표)) 및 글루코스 4% 용액의 혼합물 (1 부피의 프로포폴 및 2 부피의 글루코스 용액)을 연속 관류하기 위해 정맥내 카테테르를 대퇴 정맥에 배치하 였다. 이어서 동물을 정위 프레임워크에 놓았다. 멸균 조건 하에, C2에서 Th1까지 수직 중앙선 피부 절개를 시술하였다. C2에서 Th1까지 근막 커트 (cut) 및 가시돌기가 노출되었다. 척추주위 근육을 굽히고, C6, C7 및 Th1의 판을 절개하였다. 이어서 완전 C6 척추후궁절제술 및 상부 C7 반측척추후궁절제술을 시술하였다. 경질막을 노출시키고, 제6 경추판에 의해 덮힌 척수 부분의 입쪽 (rostral) 구역에 대응하는 제7 및 제8 경추 분절 위로 세로로 절개하였다. hNogo-A 항체를 전달하는, 삼투압 펌프 (Alzet (등록상표), 2ML1; 유속 50 ㎍/시)에 연결된 폴리에틸렌 튜브 (길이 10 cm)를 경질막 아래에 삽입하고, 입쪽으로 수 밀리미터 밀어 경질막에 봉합하여 부착시켰다. 삼투압 펌프는 좌측 옆구리에서 척추후궁절제술보다 수 센티미터 더 낮게 등 근육에 만들어진 공극 내에 놓이고 고정되었다. 튜브는 근육 조직에 대한 봉합선과의 궤도를 따라 고정된다. 근육 및 피부를 봉합하고, 동물은 프로포폴을 사용한 정맥 관류의 중단 후 보통 15-30분에 마취로부터 회복하였다. 동물을 수술후 항생제 (암피실린 10%, 30 mg/kg, s.c.)로 치료하였다. 추가 용량의 카르프로펜을 1주 동안 매일 투여하였다.

원숭이를 삼투압 펌프 이식 8일 후 희생시켰다. 진정은 먼저 상기 언급한 바와 같이 케타민을 사용하여 유도한 후, 치사량의 펜토바르비탈 (90 mg/kg)을 복강내 주사하여 깊이 마취시켰다. 동물을 0.4 리터의 0.9% 염수, 이어서 4 리터의 고정제 (0.1M 포스페이트 완충액, pH=7.6 중 파라포름알데히드의 4% 용액)로 심장을 통해 관류시켰다. 증가 농도의 수크로즈의 3가지 용액 (고정제 중 10% , 포스페이트 완충액 중 20 및 30%)으로 관류를 계속하였다.

조직학적 과정, 면역-형광 및 면역조직화학

원숭이의 뇌 및 척수를 조심스럽게 절개하고, 30% 수크로즈 내에 동결방지시키고, 동결상태로 40 ㎛ 절개하였다. 주입된 mAB를 검출하기 위해, 항-인간 2차 항체를 사용하였다 (잭슨 래보래토리스 (Jackson Laboratories)). 이중 라벨링을 위해 다음 항체를 사용하였다: 내인성 Nogo-A (첸 (Chen), 2000)을 위해 토끼 AS472 (친화도 정제됨), 별아교세포를 위해 GFAP에 대한 토끼 항체 및 라이소좀 국소화를 위해 카텝신 D (DAKO)에 대한 토끼 항체. 모든 항혈청은 TRITC 또는 FITC 결합된 대응하는 2차 항체에 의해, 또는 ABC-DAB 시스템 (벡터 (Vector))를 사용하여 가시화하였다. 절편은 제이스 악시오포트 (Zeiss Axiophot) 상의 표면형광에 의해 또는 공초점 현미경 (ZEISS LSM 410)에 의해 분석하였다.

척수를 주입 부위 및 그의 6 cm 꼬리측에서 분석하였다. 높은 수준의 3A6이 주입 부위에 존재하였다. 보다 꼬리측 척수에는, 중심관 및 척수 표면은 강하게 라벨링된 반면, 회색질과 백색질은 보다 균질한 라벨링을 보여주지만, 이는 특수하고 배경 상에 명백하게 구분되었다. 유사한 상황이 표면 및 뇌실의 강한 라벨링 및 실질 내로 Nogo-A 항체의 우수한 침투를 갖는 전뇌에 존재하였다.

이들 실험은 CNS 세포 표면 항원에 대한 항체의 척수 경막내 주입이 항체를 CSF 순환을 통해 내부 (뇌실, 중심관) 및 외부 액체 공간에 우수하게 분포시키는 것을 보여주었다. IgG 항체는 뇌 및 척수 조직 내로 잘 침투하였다. 대조 IgG는 신속하게 세척된 반면, Nogo-A에 대한 항체는 조직 내에 보유되었다.

4. 원숭이의 척수 병변에서 신경 복구 및 기능 개선에 대한 시험

마취는 케타민 (Ketalar(등록상표); 파케-데이비스, 5 mg/kg, i.m.)의 근육내 주사에 의해 유도하였다. 기관지 분비를 감소시키기 위해 아트로핀을 근육내 주사하였다 (0.05 mg/kg). 보다 깊은 마취를 유도하는 프로포폴 1% (Fresenius(등록상표)) 및 글루코스 4% 용액의 혼합물 (1 부피의 프로포폴 및 2 부피의 글루코스 용액)을 연속 관류하기 위해 정맥내 카테테르를 대퇴 정맥에 배치하였다. 이어서 동물을 정위 프레임워크에 놓았다. 멸균 조건 하에, C2에서 Th1까지 수직 중앙선 피부 절개를 시술하였다. C2에서 Th1까지 근막 커트 및 가시돌기가 노출되었다. 척추주위 근육을 굽히고, C6, C7 및 Th1의 판을 절개하였다. 이어서 완전 C6 척추후궁절제술 및 상부 C7 반측척추후궁절제술을 시술하였다. 분자를 병변에 근접하여 전달하기 위해, 펌프에 부착된 폴리에틸렌 튜브의 자유 팁을 경질막 아래에 수 밀리미터 입쪽으로 병변에 고정시켰다.

행동 수기 능력 시험을 발표된 방법에 따라 수행할 수 있다. 수기 능력은 25개의 구멍은 수평으로, 25개의 구멍은 수직으로 향하는 50개의 랜덤하게 분포된 구멍을 포함하는 퍼스펙스 (Perspex) 변형 "브링크만 보드 (Brinkman board)" (10 cm x 20 cm) [Liu, 1999 15428/id; Rouiller, 1998 13239/id] 앞에 있는 영장류 의자에 원숭이를 착석시켜 훈련한다. 섬유의 재생 및 스프라우팅은 문헌에 설명된 바와 같이 평가할 수 있다. 우뇌반구에 주사된 전행성 추적물질은 비오티닐화 덱스트란 아민 (BDA, Molecular Probe (등록상표); 염수 중의 10%)이다. 좌뇌반구에는, 형광 전행성 추적물질 플루오레세인 덱스트란 (Molecular Probe (등록상표), 염수 중의 10%)이 주사된다. 추적물질을 가시화하기 위한 조직학적 과정은 이전에 상세하게 설명된 바와 같이 수행할 수 있다 [Rouiller, 1994 8322/id].

따라서, 본 발명은 또한 (i) 본 발명의 결합 분자의 포유동물 신경계, 특히 인간 신경계의 신경 복구에서의 용도, (ii) 본 발명의 결합 분자의 치료 유효량을 그 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 신경계, 특히 인간 신경계의 신경 복구 방법 또는 (iii) 본 발명의 결합 분자 및 제약학상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는, 포유동물 신경계, 특히 인간 신경계의 신경 복구용 제약 조성물을 제공한다.

특히, 본 발명의 결합 분자는 신경 섬유 손상 후의 축삭 재생 및 스프라우팅 개선에 유용하다. 따라서, 본 발명의 분자는 특히 인간 대상에 대해 매우 광범한 유용성을 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 결합 분자는 말초 신경계 (PNS) 및 중추 신경계 (CNS)의 다양한 질병의 치료, 즉 보다 특히는 신경변성 질병, 예를 들어 알쯔하이머 질병, 파킨슨 질병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 루이 (Lewy) 유사 병변 또는 다른 일반적인 치매, 머리, 뇌 또는 척수 외상 후의 질병, 뇌졸중 (stroke) 또는 탈수초성 질병에 유용하다. 상기 탈수초성 질병은 다발 경화증, 단상 탈수초, 뇌척수염, 다초점성 백질뇌병증, 범뇌염, 마르키아파바-비냐미 (Marchiafava-Bignami) 질병, 뇌교수초용해증, 부신백색질형성장애증, 펠리체우스-메르츠바허병 (Pelizaeus-Merzbacher) 질병, 해면성 변성증, 알렉산더 (Alexander) 질병, 카나반 (Canavan) 질병, 이염성 백질 이영양증 및 크라베 (Krabbe) 질병을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 한 예에서, 본 발명의 결합 분자의 투여는 NogoA 단백질 관련 탈수초성 질병 치료에 사용될 수 있다. 다른 예에서, 본 발명의 결합 분자를 발현 하는 세포는 손상 부위 전체에 걸친 축삭 성장을 촉진하기 위해 척수 손상 부위에 이식될 수 있다. 상기 이식된 세포는 손상 또는 외상 후의 척수 기능을 회복시키기 위한 수단을 제공한다. 상기 세포는 태아 신경 또는 조직 이식편의 상이한 혈통의 후각 초성 세포 및 줄기 세포를 포함할 수 있다.

뇌졸중 후 성체 쥐에서 기능적 회복 및 신경해부학적 성형성에 대한 장기간 지연된 Nogo-A 차단의 효과는 문헌 [Shih-Yen Tsai, Anay Pradham, Josh Rosales, Anis K. Mir, Martin E. Schwab, Gwendolyn L. Kartje in 2004]에 기록된 초록의 주제였다. 정제된 항-Amino Nogo-A 항체는 중앙 뇌동맥 폐색 (MCAO) 8주후 성체 쥐에 삼투압 펌프를 사용하여 투여되었다. 기능의 회복은 훈련된 앞다리 내밀기 시험 및 사다리 디딤대 걷기 시험을 이용하여 점검하였다. 예비 결과는 뇌졸중 2개월 후 항-Amino Nogo-A 차단을 이용하여 치료할 때에도 기능 회복이 개선되었음을 보여주었다.

또한, 본 발명의 결합 분자는 일반 허혈 망막병증, 앞허혈시신경병증, 모든 형태의 시각 신경염, 노화 관련 시력 감퇴, 당뇨성 망막병증, 낭포황반부종 (CME), 색소성 망막염, 스타가르트 (Stargardt) 병, 베스트 (Best) 난황상 망막 변성, 레베르 (Leber) 선천성 흑암시 및 다른 유전 망막 변성, 병적 근시, 미숙아 망막병증 및 레베르 유전 시신경병증, 각막 이식 또는 굴절교정 각막 수술의 후유증, 및 헤르페스 (herpes) 각막염을 포함하는, 망막 또는 각막 세포의 변성을 직접 또는 간접적으로 수반할 수 있는 퇴행성 안 질환의 치료에 유용하다.

추가로, 본 발명의 결합 분자는 정신의학 질환, 특히 정신분열증 및 우울증 의 치료에 유용하다.

이들 적응증에 대해, 적절한 투여량은 물론 예를 들어 사용되는 본 발명의 특정 분자, 투여 방식 및 치료되는 질병의 성질 및 중증도에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 투여량은 바람직하게는 1 ㎍/kg/일 내지 1 mg/kg/일일 것이다. 본 발명의 결합 분자는 펌프로 편리하게 투여되거나 병변 부위에 치료제로서 주사되며, 예를 들어 병변 부위에 CNS 두개내 또는 척추 경막내로 직접 투여될 수 있다.

본 발명의 결합 분자는 단독으로 또는 다른 약제와의 조합물 또는 순차적인 조합물로 제공될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 결합 분자는 추가의 뉴런 손상 및 축삭 재생의 억제를 차단하기 위한 수단으로서 뇌졸중 또는 척수 손상 이후 비제한적으로 코르티코스테로이드와 같은 소염제, NGF, BDNF와 같은 신경영양 (Neurotrophic) 인자 또는 Exelon™ 또는 레보도파와 같은 신경변성 질병을 위한 다른 약물과 조합물로 투여할 수 있다. 뇌졸중의 치료를 위한 다른 적합한 조합 상대물은 알테플라제 (Alteplase) 및 데스모테플라제 (Desmoteplase) (DSPA, 예를 들어 WO90/09438에 개시된)이다. 한 실시태양에서, 본 발명은 특히 뇌졸중의 치료를 위한 본 발명의 결합 분자 및 데스모테플라제를 포함하는 조합물 및 상기 조합물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본원에서 사용될 때 2가지 약제가 동시에 투여되거나 또는 약제들이 동시에 작용하도록 하는 방식으로 독립적으로 투여되는 경우 2가지 약제는 조합물로 투여되는 것으로 설명된다.

코드 번호, 일반명 또는 상표명으로 확인된 활성 성분의 구조는 표준 개론서인 "더 머크 인덱스 (The Merck Index)"의 현행 판본으로부터 또는 데이타베이스, 예를 들어 패턴츠 인터내셔날 (Patents International) (예, 아이엠에스 월드 퍼블리케이션즈 (IMS World Publications)) 또는 아이엠에스 헬쓰 (IMS Health)에서 제공된 다른 데이타베이스로부터 알 수 있다. 그의 대응하는 내용을 본원에 참고로 포함한다. 당업계의 숙련인은 활성 성분을 확인하는 것이 충분히 가능하고, 이들 참고문헌을 기준으로 표준 시험 모델 (시험관내 및 생체내 모두에서)에서 제약학적 적응증과 특성을 제조 및 시험하는 것이 역시 가능하다.

본 발명의 제약 조성물은 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 분자를 포함하는 본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 동결건조 형태로 제공된다. 조성물은 즉시 투여를 위해 적합한 수성 담체, 예를 들어 주사용 멸균수 또는 멸균 완충된 생리학적 염수에 용해된다.

적합한 조성물을 구성하는 것을 돕기 위해, 본 발명의 결합 분자 및 임의로 본 발명의 결합 분자의 효과를 향상시키는 제2 약물은 혼합 또는 동시 투여를 위한 지시서와 함께 동일한 용기 내에 개별적으로 포장될 수 있다. 선택적인 제2 약물 후보는 상기 제시한 바와 같다.

본 발명의 결합 분자와 성장 인자, 예를 들어 NGF의 조합물의 상승 효과는 척수 손상 모델에 의해 생체 내에서 증명될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예를 참조로 보다 상세히 이해될 것이다. 그러나, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

하기 실시예에서, 모든 온도는 섭씨 온도(℃)이다.

실시예에서 주목하는 모노클로날 항체는 경쇄의 가변 부분 (서열 3) 및 중쇄의 가변 부분 (서열 2)을 포함하는 본 발명에 따른 결합 분자이다.

하기 약자를 사용한다:

ELISA 효소 결합 면역 흡착 분석

FACS 형광 활성화 세포 분류

FITC 플루오레세인 이소티오시아네이트

FBS 태송아지 혈청

HCMV 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터

IgG 면역글로불린 이소타입 G

MAb 모노클로날 항체

PBS 포스페이트-완충된 염수

PCR 폴리머라제 연쇄 반응

실시예 1: 방법:

인간 Nogo-A 발현 구조체 (pRK7-hNogo-A)의 생성: 람다 gt10 (클론테크 (Clontech))에서 제작된 인간 cDNA 라이브러리를 표준 과정을 이용하여 중복 필터 세트로 스크리닝하였다. 인간 Nogo-A의 단편을 표준 프로토콜을 이용하여 인간 전체 뇌 cDNA (클론테크)로부터 PCR에 의해 증폭시키고 후속적으로 pBluescript 내로 클로닝하고, 소화 및 단리시키거나, 직접 스크리닝 프로브로서 사용하였다. 400bp XhoI/SmaI 단편을 5' 프로브로서 사용하고, 3' 프로브는 프라이머 CA-NA-2F: 5'-AAG CAC CAT TGA ATT CTG CAG TTC C-3' (서열 29) 및 CA-NA-3R: 5'-AAC TGC AGT ACT GAG CTC CTC CAT CTG C-3' (서열 30)을 사용하여 증폭시켰다. 포지티브 클론을 단리하고, 서브클로닝하고, 서열을 확인하였다. 전체 길이의 인간 Nogo-A cDNA을 얻기 위해, 겹치는 클론을 인간 Nogo-A 서열 내의 독특한 EcoRI 제한효소 부위를 사용하여 조립하고 Bluescript 벡터 내로 서브클로닝하여, Pbsnogoa로 명명하였다. pRK7-hNogo-A를 얻기 위해, 전체 길이의 cDNA를 방향지정 (directional) 클로닝에 의해 진핵세포 발현 벡터 pRK-7 내로 삽입하였다.

세균 생산을 위한 인간 NiG (hNiG) 발현 플라스미드 (pET28a-hNiG)의 생성: 프라이머 세트: 전방향 5'- GTC GCG GAT CCA TGG AGA CCC TTT TTG CTC TTC-3' (서열 31); 역방향 5'- GTT CTC GAG TTA TGA AGT TTT ACT CAG-3' (서열 32)를 사용하여 세균 발현을 위한 N-말단 His- 및 T7-태그를 인-프레임으로 갖는 Pbsnogoa로부터 각각의 코딩 구역의 PCR 증폭 후, hNiG 코딩 DNA 단편을 pET28a (노바겐 (Novagen))의 BamHI/XhoI 내로 서브클로닝하였다. 최종 플라스미드를 pET28a-hNiG로 명명한다. 이어서 hNiG를 1 mM 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드 (IPGT)의 도입을 사용한 유도에 의해 이. 콜라이 (E. coli) BL21 pRP에서 발현시켰다.

마우스 NiG-exon3 (mNiG-exon3) 발현 플라스미드의 생성: 마우스 엑손 3을 코딩하는 구역을 프라이머: 전방향 5'-GTG CGG ATC CAT GGA TTT GAA GGA GCA GC-3' (서열 33); 역방향 5'-GTT TCT CGA GTG AAG TTT TAT TCA GCT C-3' (서열 34)를 사용하여 마우스 게놈 BAC 주형으로부터 증폭시키고, pET28a의 BamHI/XhoI 클로닝 부위 내로 서브클로닝하였다. 최종 플라스미드 구조체는 pET28a-mNiG-exon3으로 명 명하였다.

원숭이 NiG의 클로닝: PolyA RNA를 냉동 원숭이 뇌 조직으로부터 단리하고, 올리고 dT 프라이머를 사용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA의 5' 및 3' 구역을 덮는 2개의 겹치는 단편을 서열 특이적 프라이머 및 프루프리딩 (proofreading) 효소를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 프라이머는 인간 NiG cDNA의 공지 서열을 사용하여 디자인하였다. 5' 단편의 증폭에 있어서 프라이머는 5'-TCCACCCCGGCCGCGCCCAA-3' (서열 35) 및 5'-AATGATGGGCAAAGCTGTGCTG-3' (서열 36)이고, 3'-단편의 증폭에 있어서 5'-GGTACAAAGATTGCTTATGAAACA-3' (서열 37) 및 5'-AGCAGGGCCAAGGCAATGTAGG-3' (서열 38)이었다. 이어서 2개의 단편을 서브클로닝하고, 각 단편에 대해 적어도 4개의 독립적인 클론의 서열을 결정하였다. 전체 길이의 cDNA는 상기 언급된 프라이머를 사용하여 PCR을 중복시킴으로써 조립하고, 생성되는 생성물을 클로닝하고 다시 서열을 결정하였다.

상기 정의한 바와 같은 재조합 NogoNiG 단백질의 생산: 세균 Nogo-A-결실 라이브러리를 이. 콜라이에서 발현시켰다. 단백질을 0.75 mg/ml 라이소자임을 사용한 초음파분해 완충액 (20 mM Tris, 50 mM NaH₂PO₄, 100 mM NaCl, pH 8.0) 중의 반복 초음파분해에 의해, 또는 B-Per™ (피어스 (Pierce)) 또는 8 M 요소를 사용한 가용화에 의해 추출하였다. pelB-리더를 사용하여 발현된 NiG를 주변세포질 단백질 정제를 위한 노바겐 프로토콜에 따라 주변세포질 공간으로부터 수득하였다. pET28-구조체의 상등액을 배치 절차로 Co² ⁺-Talon™ 금속 친화도 수지 (클론테크)를 이용하여 정제하였다. 8 M 요소 및 B-Per™ 가용화된 용해물을 수지-배치 절차 동안 완충액을 초음파분해 완충액으로 점증적으로 치환함으로써 비-변성 조건으로 만들었다. 단백질을 중력 칼럼 (바이오라드) 상에서 초음파분해 완충액 중에서 250 mM 이미다졸을 사용하여 용출시켰다. NiG 단백질은 Superdex 200 HiLoad 16/60 상에서 겔 여과에 의해 추가로 정제하였다. pGEX-6P 구조체의 상등액은 G-세파로즈 칼럼으로 제조사 (아머샴 파마시아 (Amersham Pharmacia))의 지시에 따라 배치 절차로 정제하였다. GST-Nogo-66의 절단은 가용화된 GST-Nogo-66을 PreScission 프로테아제와 함께 인큐베이팅하고 후속적으로 HPLC 정제하여 수행하였다. 겔 전기용출은 IMAC-정제된 재조합 Nogo의 예비적 SDS-PAGE 및 250 mA에서 1시간 동안 바이오라드 일렉트로-일루터 (Electro-Eluter)를 사용한 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.2% (w/v) CHAPS 내로의 용출에 이은 30s의 역전극성에 의해 수행하였다. 크로마토그래피-정제된 단백질의 단백질 농도는 피어스 쿠마지 염료 (Coomassie Stain) 및 표준 단백질로서 BSA를 사용하여 결정하였다. 겔 용출된 단백질의 단백질 농도는 표준품으로 BSA를 사용하여 은-염색된 겔 (Merril CR, Dunau ML, Goldman D (1981), A rapid sensitive silver stain for polypeptides in polyacrylamide gels. Analyt. Biochem. 110:201-207))의 밴드 강도를 기초로 추정하였다.

실시예 2: 인간 3A6- IgG mAb 의 생성

메다렉스 마우스 (인간 면역글로불린 유전자를 갖는 유전적으로 재구성된 마우스)를 인간 Nogo-A 내의 특정 서열에 대응하는 인간 NiG로 피하 면역화시켰다. 3A6 모노클로날 항체는 마우스의 췌장 세포를 하이브리도마 세포주와 융합시켜 표준 하이브리도마 기술에 의해 생성시켰다. 메다렉스 마우스의 면역화는 뒷목 및 옆구리에서 TiterMax 어쥬번트를 갖는 1.9 ml 혼합 V/V 중 s.c. 농도 1.5 mg로 인간 NiG 70 ㎍/마우스를 사용하여 수행하였다. 180 ㎕ s.c/마우스로 주사하고 후속적으로 수차례 부스팅하였다.

ELISA를 사용하는 혈청 중 항-Nogo-A Ab 역가 (titer)의 결정은 PBS (100 ㎕/웰) 중 8 ㎍/ml 인간 NiG가 코팅된 96 웰 평판에서 수행하였다. 평판을 실온 (RT)에서 4시간 동안 인큐베이팅하였다. 평판을 가볍게 털어내고 200 ㎕/웰 차단 완충액 (PBS+5% BSA)로 재충전하고, 덮고 RT에서 1시간 또는 4도에서 밤새 인큐베이팅한 다음, 수돗물로 4회 세척하고, PBS로 재충전하고 가볍게 떨어냈다. 마우스 혈청을 PBS+10% FCS (100 ㎕/웰)로 희석하고, RT에서 2시간 또는 4도에서 밤새 인큐베이팅하였다. 사용된 마우스 혈청의 희석액의 농도는 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:30000이었다. 세척 단계를 반복하였다. 염소 F(ab')₂ 항-인간 IgG Fc 특이적 HRP 컨쥬게이트 Ab를 PBS/0.1% BSA/0.1% Nonidet 40 (100 ㎕/웰)로 희석하고, RT에서 2시간 또는 4도에서 밤새 인큐베이팅하였다. 세척 단계를 반복하였다. 100 ㎕/웰 BM 블루 POD 기질을 첨가하고 암소에서 실온에서 15분 인큐베이팅하고, 50 ㎕/웰 1M H₂S0₄를 첨가하여 HPR 기질 반응을 중지시켰다. O:D는 450nm에 설정된 미세평판 판독기를 사용하여 결정하였다. ELISA를 사용하는 하이브리도마 및 클론의 스크리닝은 상기한 바와 같이 수행하였다. 인간 NiG (8 ㎕/ml, 이. 콜라이). ELISA를 사용한 IgG 이소타이핑. 항체의 IgG 서브클래스의 결정하기 위해 실험을 수행하였다. 평판을 인간 NiG로 코팅하고, 배양 상등액을 1:10 내지 1:100의 희석액으로 사용하였다. 항체의 반응성은 4시간 동안 인큐베이팅하여 마우스 항-인간 IgG 서브클래스 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) HRP 컨쥬게이팅된 mAb의 패널을 사용하여 평가하였다. 항-MCP1 IgG1 mAb를 포지티브 대조군으로 사용하였다. ELISA는 상기한 바와 같이 수행하였다. 하이브리도마의 생성은 ELISA에서 인간 NiG에 대한 최고 혈청 역가를 갖는 마우스로부터 수행하고, 융합을 위해 선택하였다. 마우스를 C0₂ 흡입에 의해 희생시켰다. 췌장을 무균적으로 채취하고 단세포 현탁액을 제조하였다. PBS (칼슘 마그네슘 무첨가) 중에 세척하였다. 마우스 골수종 세포 (PAIO)를 PBS 중에 세척하였다.

동수의 마우스 췌장 세포 (5천만개)에 마우스 골수종 세포를 첨가하고 RT에서 10분 동안 900 RPM으로 회전시켰다. 상등액을 조심스럽게 완전히 취하였다. 융합제로서 1 ml PEG 4000 (PBS 중 50:50)을 가볍게 교반하면서 2-3분에 걸쳐 RT에서 적가하였다. 수조 내에서 37℃에서 90초 동안 가볍게 진탕하였다. PEG를 희석하기 위해 5 내지 10 ml RPMI 1640 배지를 5분에 걸쳐 적가하고, RT에서 10분 동안 방치하였다. 추가로 20 ml 무혈청 배지를 첨가하고 원심분리시켰다. 적정량의 HAT 배지 (RPMI+10% FCS+20 ml/리터 50xHAT)에 재현탁시켰다. 융합된 세포를 Balb/c 마우스 (1 ml/웰)로부터의 복막 세포의 피더 (feeder) 층을 함유하는 웰 내로 100 ㎕/웰로 플레이팅하였다.

마우스 복막 세포의 제조는 24시간 일찍 수행하고, Hat 배지, 24웰 코스타 (Costar) 평판 중 1 ml 배양액을 제조하였다. 1마리의 마우스로부터의 생산량이 하나의 24 웰 평판에 충분하였다 (약 2000 세포/웰). 희생시킨 후, 복강을 10 ml 시린지 및 18게이지 바늘을 사용하여 5 ml의 0.34 M 수크로즈로 세척하였다. 6마리의 마우스로 이루어진 군을 1 튜브 내로 수집하고, 원심분리하고, HAT 배지에 재현탁시키고 웰 내로 분배하였다.

배양 배지는 100 μM 하이포잔틴, 1.6 μM 티미딘, 0.4 μM 아미노프트린, 50 μM 베타-머캅토에탄올, 50 ㎍/ml 겐타마이신, 10% 열 불활성화 FCS를 함유하는 Glutamax를 갖는 RPMI 1640이었다. 배지는 성장 속도 및 하이브리도마의 발현에 따라 매 3일 또는 4일에 50% 교환하고, 14일 후 아미노프트린을 제외함으로써 HAT 배지를 HT 배지로 교환하였다. 하이브리도마 및 클론 생성의 스크리닝: 상등액은 웰이 약 80% 컨플루언시 (confluency)에 도달했을 때 상기한 바와 같은 ELISA에서 1:3 희석액으로 시험하였다. 단세포 클로닝은 희석을 제한함으로써 항-Nogo Ab에 대해 포지티브인 하이브리도마로부터 수행하였다. 클로닝은 희석을 제한시키고, 0.5 세포/100 ㎕/웰을 플레이팅함으로써 수행하였다. 4x96, 100 ㎕ 웰을 준비하였다. 마우스 PE 세포를 피더 층으로 사용하였다. 클론 성장은 현미경으로 검토하고, 스크리닝을 수행하기 전날에 100 ㎕ 배지를 첨가하였다. 개별 하이브리도마의 성장 속도는 다르지만, 충분한 항체를 수득하기 위해 배양물을 충분히 치밀하도록 만들기 위해 약 10일이 필요하다. 상등액의 스크리닝은 1:10, 1:100의 희석액에서 수행하였다. 포지티브 클론의 배양물 팽창을 수행하고 롤러 병에서의 생산을 위한 낮은 혈청 조건 1%에 적응시키고, 정제는 단백질 A 친화도를 사용하여 배양 상등액으로부터 수행하였다.

실시예 3: 마우스 3A6 mAb 및 Fab 3A6의 생산 및 정제:

단백질 A 세파로즈 Cl-4B 칼럼을 사용하였다 (파마시아 (Pharmacia); 11 cm 베드 높이). 간단히, pH 8.1로 교정한 후 배양 상등액을 4 ml/분에서 로딩하고, 칼럼을 8 ml/분에서 100 mM Na₂HP0₄, pH 8.1을 사용하여 기저선까지 세척하였다. 결합된 물질은 50 mM NaH₂PO₄, pH 3.0, 140 mM NaCl을 사용하여 8 ml/분에서 최종적으로 용출시키고, 5 N NaOH로 즉시 중화시키고 (pH 7.0) 멸균 여과하였다. 흡광도는 280 nm에서 모니터링하였다. 정제된 물질의 일부를 궁극적으로 한외여과에 의해 추가로 농축하고(하거나) PBS에 대해 투석하였다. 정제에 사용된 모든 완충액은 가능한 엔도톡신 오염물을 제거하기 위해 10 kDa ULTRASETTE™ 접선 (tangential) 유동 장치 (필트론 테크놀로지 코오퍼레이션 (Filtron Technology Corporation)) 상에서 여과하였다. 동일한 이유로, 단백질 A 수지를 20% 에탄올로 광범위하게 세척하고 모든 튜브/펌프를 사용하기 전에 0.1 M NaOH로 처리하였다. 단백질 농도는 1 mg/ml에 대해 1.35의 기준 흡광도를 이용하여 280 nm에서 분광광도계로 측정하였다. 순도는 4-20% Novex 구배 겔을 사용하여 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 일상적으로 평가하였다. 엔도톡신 함량은 제조사 (스위스 알쉬빌 소재의 엔도텔 아게 (Endotell AG))의 지시에 따라 전통적인 리물러스 변형세포 용해물 (Limulus Amoebocyte Lysate) (LAL) 반응에 의해 측정하였다.

F_ab 단편의 생성: 마우스 3A6 mAb의 일부를 100 mM Na-아세테이트, pH 5.5, 2 mM EDTA에 대해 광범위하게 투석하고 6 mg/ml의 농도로 조정하였다. F_ab 단편은 0.25 mM 시스테인의 존재 하에 파파인 소화 (1:200 w/w 비)에 의해 생성하였다. 반응은 37℃에서 16시간 동안 진행시킨 다음, 과량 (10 μM)의 특이적 파파인 억제제 E64 (N-[N-(L-3-트랜스-카르복시란-2-카르보닐)-L-류실]-아그마틴)의 첨가에 의해 중지시켰다. 이어서 무손상 물질 및 Fc 단편을 제거하기 위하여 소화된 항체를 단백질 A 세파로즈 패스트 플로우 (Fast Flow)의 칼럼 상으로 통과시켰다. F_ab 분획을 PBS에 대해 광범위하게 투석하고, 약 3 mg/ml로 농축시켰다 (파파인 및 E64는 로슈 몰레큘라 바이오케미칼스 (Roche Molecular Biochemicals) 제품임).

실시예 4: V _L 및 V _H 구역의 HPLC , 질량 분석법 및 N-말단 아미노산 서열결정:

a) 환원 및 알킬화: 정제되고 건조된 3A6 항체를 40 ㎕의 8M 요소, 0.4M NH₄HC0₃, pH 8.3에 용해시켰다. 단백질로서 10 ㎕의 동일한 완충액에 예비-용해된 60 ㎍ DTT (칼바이오켐 (Calbiochem))를 첨가하였다. 환원은 50℃에서 30분 동안 아르곤 하에 수행하였다 (단백질 티올에 비해 100배 몰 과량의 DTT). 환원시킨 후, 샘플을 실온으로 냉각시켰다. 단백질로서 동일한 완충액에 용해된 304 ㎍의 요오도아세트아미드 (시그마 울트라 (Sigma Ultra), I-1149)를 첨가하였다. 카르복스아미도메틸화는 실온에서 15분 동안 암소에서 수행하였다. 1 ㎕의 β-머캅토에탄올을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다.

b) 중쇄 및 경쇄의 단리: 항체의 카르복스아미도메틸화된 중쇄 및 경쇄는 DR5 펌핑 시스템 및 다이오드 어레이 (diode-array) UV 검출기를 갖는 휴렛 팩커드 (Hewlett Packard) 1090M HPLC 시스템 상에서 역상 고압 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 단리하였다. 크로마토그래피를 위한 조건은 다음과 같다: R1/H 물질이 채워진 PerSeptive Biosystems Poros 2.1x100 mm 칼럼; 유속 0.5 ml/분; 용매: (A) 물 중 0.1% TFA 및 (B) 0.09% TFA/아세토니트릴/물 9:1; 80℃에서 8분 내에 구배 25-70% B; 218/280 nm에서 검출.

c) LC-ESI-MS: 질량 분석법은 Micromass Z-형 전자분무 이온화원 (ESI)이 장치된 Q-Tof (영국 맨체스터 소재의 마이크로매스 (Micromass)) 사중극자 비행시간형 하이브리드 탠덤 (hybrid tandem) 질량 분석기를 사용하여 수행하였다. 획득 질량 범위는 전형적으로 m/z 500-2000이었다. 데이타를 기록하고 MassLynx 소프트웨어를 사용하여 처리하였다. 500-2500 m/z 스케일의 검정은 말 심장 미오글로빈 (MW 16951.5)의 다중 하전된 (multiple-charged) 이온 피크를 사용하여 달성하였다.

d) 중쇄 및 경쇄의 HPLC-MS: 환원되고 카르복스아미도메틸화된 중쇄 및 경쇄의 분리는 Perseptive Biosystems POROS R1/H로 채워진 1 mm x 150 mm LC 패킹스 (Packings) 칼럼을 사용하는 HP1100 HPLC 시스템 (미국 캘리포니아주 팔로-알토 소재의 휴렛 팩커드 (Hewlett Packard)) 상에서 수행하였다. 칼럼은 60℃에서 유지하였다. 10 ㎕의 샘플 부피를 Valco 모델 C6UW HPLC 밸브 (미국 텍사스주 휴스턴 소재의 발코 (Valco)) 및 10 ㎕ 주입 루프 (loop)가 갖추어진 CTC PAL 오토샘플러 (autosampler) (스위스 쯔빙엔 소재의 시티시 (CTC))를 사용하여 칼럼 상에 주입하였다. HPLC는 MassLynx 소프트웨어 (영국 맨체스터 소재의 마이크로매스)에 의해 제어하였다. UV 검출은 214 nm에서 실시하였다. 용출매 (Eluent) A는 0.05% TFA를 함유하는 물이었다. 용출매 B는 0.045% TFA를 함유하는 물:아세토니트릴의 1:9 혼합물이었다. 20% B 내지 90% B의 구배를 80℃에서 20분 동안 가동하였다. 유속은 전형적으로 60 ㎕/분이었다. LC 시스템으로부터의 총 유동을 UV 검출 셀 내로 도입한 다음, 임의의 분열 (splitting) 없이 ESI 원에 도입하였다. HPLC 시스템을 제어하고 UV 검출기로부터의 시그날 (signal)을 MassLynx 소프트웨어 (영국 맨체스터 소재의 마이크로매스)를 사용하여 처리하였다. 다음 5개의 시그날이 검출되었다:

측정됨:	시그날 해석
A = 50614.2 Da	카르복스아미도메틸-시스테인 (CAMCys)를 갖는 H-쇄
B = 5077645 Da	시그날 A+162 DA (=헥소스)
E = 23727.8 Da	CAMCys를 갖는 L-쇄

e) V_L 및 V_H 구역의 N-말단 아미노산 서열 결정: HPLC로부터 수집된 H+L 쇄 피크를 서열 분석을 위해 사용하였다. 아미노산 서열은 휴렛 팩커드 G1000A N-말단 단백질 서열결정 시스템 상에서 결정하였다. 시스템은 미니어처 흡착 이상 (biphasic) 칼럼 상에 보유된 단백질 샘플에 대해 자동화 에드만 (Edman) 화학을 수행한다. 화학적 효율을 향상시키고, 래그 (lag)를 최소화시키며 여기서 서열 분석을 약 50 잔기로 확장시키기 위해 최적화된 화학 방법 (더블 커플 (double couple) 3.0)을 사용하였다. PTH-아미노산의 분석은 3원 (ternary) 펌핑 시스템 및 내로우보어 (narrowbore) (2.1 mm x 25 cm) PTH 칼럼이 장치된 온-라인 (on-line) 휴렛 팩커드 HP1090 HPLC 시스템 상에서 수행하였다.

결과:

질량 분석으로부터, 마우스 3A6-IgG1의 균질 중쇄 및 경쇄를 결정하였다. H-쇄는 단일 글리코실화되었다. 중쇄 및 경쇄의 총 질량 분석은 두 사슬에 대한 단일 질량을 보여주었다. 마우스 3A6-IgG1의 HPLC 크로마토그래피는 단일 피크를 보여주었다. HPLC 정제에 이은 환원 및 알킬화 후에, 순수한 중쇄 및 경쇄가 입수가능하다. N-말단 서열 분해는 경쇄 및 중쇄에 대해 수행하였다. L-쇄 및 H-쇄의 N-말단 서열로부터의 아미노산은 서열 분해에 의해 확인하였다.

경쇄

중쇄

실시예 5: 인간 3A6 mAb 의 중쇄 및 경쇄 유전자의 클로닝

제조사 지시에 따라 TriPure 시약 (독일 소재의 로슈 다이아그노스틱스 (Roche diagnostics), Cat.# 1667157)을 사용하여 10⁷ 하이브리도마 세포 (클론 3A6)으로부터 총 RNA를 제조하였다. cDNA 합성을 위해, Oligotex Resin (독일 소재의 퀴아겐 (Qiagen), cat.# 70022)를 사용하여 상기 제조된 총 RNA로부터 mRNA를 단리하였다.

cDNA는 다음 조건을 사용하는 역전사에 의해 생성하였다: 2 ㎕ mRNA, 2 ㎕ 10 x 역전사 완충액, 2 ㎕ (dT)₂₀ 프라이머 (10 μM), 0.5 ㎕ RNasin (프로메가 (Promega), 40 U/ml), 2 ㎕ dNTPs (각각 5 mM), 1 ㎕ Omniscript™ 역전사효소 (퀴아겐, Cat# 205110), 10.5 ㎕ ddH₂0, 반응: 37℃에서 1시간. V_H 및 V_L을 코딩하는 cDNA의 PCR 증폭을 위해, 프루프리딩 효소 ProofStart™ DNA 폴리머라제를 사용하였다.

경쇄 및 중쇄의 PCR: 반응 혼합물: 2 ㎕ cDNA, 5 ㎕ 10x 반응 완충액, 3 ㎕ dNTPs (각각 5 mM), 2 ㎕ 5'프라이머 (10 μM) (표 2 참조), 2 ㎕ 3'프라이머 (10 μM) (표 2 참조), 1 ㎕ ProofStart (퀴아겐, Cat# 202203), 36 ㎕ ddH₂0. PCR 조건: 95℃/5분, (95℃/40초, 53℃/1분, 72℃/1분) x 35, 72℃/10분. 생성되는 PCR 생성물을 pCRbluntTOPO (인비트로겐 (Invitrogen)) 내로 직접 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 TOP 10 세포 (인비트로겐) 내로 형질감염시키고 몇개의 클론을 선택하였다. 3A6 mAb의 중쇄의 가변 부분의 뉴클레오티드 서열 (V-H, 서열 43) 및 3A6 mAb의 경쇄의 가변 부분의 뉴클레오티드 서열 (V-L, 서열 44) cDNas를 ABI 서열결정기 상에서 결정하였다. 전체적으로 2개의 독립 실험 (RNA→ cDNA→ RT-PCR)으로부터 mAb3A6 경쇄 cDNA의 10개의 클론의 서열을 결정하고 정렬시켰다. V-H 및 V-L의 후속적인 아미노산 서열은 서열 2 (V-H) 및 서열 3 (V-L)에 나타냈다. V_H 및 V_L cDNA의 PCR 증폭을 위해 사용된 프라이머는 표 2에 나타낸다. 모든 프라이머는 독일 소재의 엠더블유지 바이오테크 (MWG Biotech)에서 합성되었다.

프라이머	서열	서열 번호
5'-V_L 리더	gctatggccATCGAAGCCCCAGCTCAG	39
3'-Cκ	ttaggaattcCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG	40
5'-V_H 리더	aatgtcgaccATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGG	41
3'-C_H 힌지	ttagTTATGGGCACGGTGGGCATGTGTGAG	42

IgG4 발현 벡터의 클로닝

V_H 구역의 분자 클로닝

V_H cDNA는 프라이머 #1 및 #2를 사용하여 재조합 pCRII-플라스미드로부터 PCR에 의해 증폭하였다. 생성되는 PCR-단편을 BstEII로 절단하고 중간체 플라스미드 nogohccass를 생성하는 HCcassAAL의 HincII/BstEII 부위 내로 서브클로닝시켰다. 프라이머 IgG4HC5'를 사용함으로써, 위치 -2에서 중쇄 리더에서 아미노산 교환 (아스파르트산 대신 글루타민)을 달성하였다. 정확한 서열은 자동화 서열결정에 의해 확인하고, 단편 V_H cDNA는 XbaI/BamHI 소화에 의해 방출시켰다. BamHI/XbaI 소화된 hcMCPfin 내로 라이게이션시켜 최종 AnogoHC3A6 발현 구조체를 생성시켰다.

V_L 구역의 분자 클로닝

V_L cDNA는 프라이머 #3 및 #4를 사용하여 재조합 pCRII-플라스미드로부터 PCR에 의해 증폭하여, MluI 및 HindIII 부위를 도입하였다. HindIII 제한효소 부위를 도입함으로써, 연결 구역에서 아미노산 교환 (R→K)이 일어났다. 이는 J5형 연결 구역을 J2형으로 변화시켰다. 생성되는 PCR-단편을 pCRII-블런트 (blunt) 내로 서브클로닝시키고, 서열을 확인하였다. 정확한 단편을 MluI/HindIII 소화에 의해 방출시키고 발현 벡터 LCvec-AAL 160 내로 라이게이션시켜, 최종 플라스미드 AnogoLC3A6을 생성시켰다.

프라이머 #	설명	서열	서열
1	IgG4HC5'	CAGGCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG
2	IgG4HC3'	aaaTTGGTGGAGGCTGAGGAGACG
3	IgG4LC5'	aaaaacgcgttgtGAAATTGTGTTGACACAGTCT
4	IgG4LC3'	aaaaaagcttTGTCCCTTGGCCGAAGGTGATC

인간 3A6 mAb 의 특성화

실시예 6: ELISA를 사용하는 인간 Nogo -A에 대한 3A6 및 Fab 의 결합

그레이너 (Greiner) 96 웰 PS 평판 (# 655161)을 PBS (100 ㎕/웰) 중 0.4-2 ㎍/ml Nogo 단백질 단편으로 코팅하고, 덮고 실온에서 4시간 인큐베이팅하였다. 평판을 가볍게 털어내고 200 ㎕/웰 차단 완충액 (PBS+2% BSA)을 재충전시키고, 덮고 RT에서 1시간 또는 4℃에서 밤새 인큐베이팅한 다음, 물로 3회 및 PBS로 1회 세척하였다. 상이한 농도의 인간 3A6 IgG1, IgG4 mAb 또는 3A6 Fab를 PBS + 2% BSA (100 ㎕/웰)에 희석시키고, RT에서 2시간 또는 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 세척 단계를 반복하고, PBS/0.1% BSA/0.1% Nonidet 40 (100 ㎕/웰) 중 3A6 Fab에 대한 호스 라디쉬 페록시다제 (HRP)와 컨쥬게이팅된 염소 항-인간 IgG를 1:5000의 희석액 (잭슨 이뮤노 리서치 (Jackson Immuno Research) #109-036-098) 또는 당나귀 항-인간 HRP을 1:5000의 희석액 (잭슨 이뮤노 리서치 709-035-149)을 첨가하고 RT에서 2시간 또는 4℃에서 밤새 인큐베이팅하고, 세척 단계를 반복하였다. HRP 반응은 100 ㎕/웰 BM 블루 POD (로슈 #1484281)를 첨가하여 개시시키고, 암소에서 RT에서 15분 동안 인큐베이팅하였다. 1M H₂SO₄ 50 ㎕/웰을 첨가하여 HRP 기질 반응을 중지시키고, 광학 밀도는 450nm로 설정된 미세평판 판독기 (팩커드 스펙트라 카운트 (Packard Spectra Count))를 사용하여 결정하였다.

결과:

인간 3A6 IgG1, IgG4 mAb 및 3A6 Fab는 인간 NiG에 0.01-10 nM에 걸친 매우 낮은 농도에서 결합하였다.

실시예 7: Nogo -A 도메인에 대한 마우스 3A6- IgG1 , 3A6- IgG4 및 3A6 Fab 의 바이오센서 친화도 측정

마우스 3A6-IgG1 mAb, 3A6-IgG4 mAb 및 3A6 Fab의 친화도는 제조사의 지시에 따라 BlAcore 2000 광학 바이오센서 (스웨덴 웁살라 소재의 바이아코어 (Biacore))를 사용하는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용함으로써 측정하였다. 재조합 인간 NIG는 아민-결합 화학을 이용하여 CM5 센서 칩 (sensor chip)의 유동 세포 상에 공유결합으로 고정화시켰다.

간단히 설명하면, 카르복시메틸화 덱스트란 매트릭스를 35 ㎕의 0.025M NHS 및 0.1M EDC를 함유하는 용액을 주입함으로써 활성화시켰다. 센서 칩 상에 고정화시키기 위해, 재조합 인간 NIG를 pH 4에서 0.01M 시트레이트 완충액에 희석시키고 5 ㎕/분의 유속으로 주입하여 친화도 측정을 허용하는 결합 수준을 달성하였다. 남아있는 NHS-에스테르기의 실활은 35 ㎕의 1M 에탄올아민 염산염 (pH 8.5)을 주입하여 수행하였다. 센서 칩의 표면은 5 ㎕ 0.1M HCl을 주입함으로써 재생시켰다. 친화도 측정을 위해, 항체를 0.50nM 내지 100nM의 상이한 농도에서 200 ㎕/분의 유속으로 주입하였다. 각각의 주입 후, 센서 칩 표면은 표면 상의 결합 활성의 손실 없이 10 ㎕ 0.1M HCl을 주입하여 재생시켰다. 운동 상수 ka 및 kd와 친화도 상수 KA 및 KD는 제조사에서 공급되는 BlAevaluations 3.0 소프트웨어를 사용하여 평가하였다.

BIAcore에서 친화도 측정: 재조합 인간 NogoA에 대한 마우스 3A6-IgG1 mAb, 3A6-IgG4 mAb 및 일가 Fab 단편에서 유래된 3A6의 운동 및 친화도 결합 상수는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술 (바이아코어)를 사용하여 실시간으로 측정하였다. 이 분석을 위해, 재조합 인간 NIG를 센서 칩 표면 상에 결합시키고 상이한 농도의 항체를 주입하였다. 결합 상호작용의 운동학적 파라미터는 비선형 곡선 피팅 (fitting)에 의해 센소그램 (sensorgram)으로부터 유도하였다. 항체에 대한 인간 NIG의 평형에서 친화도 상수는 3A6-IgG4, 3A6-IgG1, 3A6 Fab에 대해 KD 0.14nM 내지 2.7nM이었다.

실시예 8: 펩스팟 ( Pepspot ) 분석을 이용하는 3A6 mAb 에피토프 확인:

펩스팟 멤브레인은 독일 베를린 소재의 제리니 펩티드 테크놀로지스 (Jerini Peptide Technologies)로부터 구입하였다. 제1 인큐베이션 전에, 멤브레인을 에탄올로 1분, TBS로 10분 동안 3회 세정하였다. 각각의 제1 항체와 함께 인큐베이팅하기 전에, 멤브레인을 4℃에서 차단 완충액 중에서 밤새 인큐베이팅하였다. TBS-T로 10분 동안 세척한 후에, 멤브레인을 실온에서 3시간 동안 차단 완충액 중에서 제1 항체와 함께 인큐베이팅하였다. 항체 농도는 c(3A6) = 0.6 nM이었다. TBS-T로 10분 동안 3회 세척한 후에, 멤브레인을 차단 완충액 중의 1:500000 희석액으로 대응하는 제2 HRP-표지된 항체 (염소-항 인간 IgG Fab2, 잭슨 이뮤노 리서치)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. TBS-T로 3회 세척한 후에, 멤브레인을 제조사의 지시에 따라 화학발광 검출 시약 (ECL Advance, 아머샴 바이오사이언시즈 (Amersham Biosciences))과 함께 인큐베이팅하고, 필름에 노출시켰다.

인간 및 원숭이 Nogo -A 단백질을 사용하는 웨스턴 블롯팅 (Western Blot) 분석:

웨스턴 블롯팅 분석은 표준 방법에 따라 수행한다. 이. 콜라이로부터 정제된 10 ng의 인간 NiG를 각 레인에 로딩시키고, SDS-PAGE를 수행하여 니트로셀룰로스막에 이송하였다. 차단은 4℃에서 차단 완충액 중에서 밤새 수행하였다. 항체 (0.5% 차단 완충액 중의 1 nM)를 펩티드 (10배, 100배 및 1000배 몰 과량의 펩티드, 인간 NiG 펩티드 에피토프 HNQQELPTALTKLVKED, 스크램블드 (Scrambled) 펩티드 H-ETQLAKLPVDLKTQE: 독일 베를린 소재의 제리니 펩티드 테크놀로지스)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅한 후에, 멤브레인을 상기 용액에 첨가하여 교반기 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. TBS-T로 10분 동안 3회 세척한 후에, 멤브레인을 차단 완충액 중의 1:100000 희석액으로 대응하는 제2 HRP-표지된 항체 (염소-항 인간 IgG Fab2, 잭슨 이뮤노 리서치)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. TBS-T로 3회 세척한 후에, 멤브레인을 제조사의 지시에 따라 화학발광 검출 시약 (ECL Advance, 아머샴 바이오사이언시즈)과 함께 인큐베이팅하고, 필름에 15초 동안 노출시켰다.

사이노몰거스 (cynomolgus) NiG에 대한 웨스턴 블롯팅 분석은 표준 방법에 따라 수행한다. IPTG를 사용한 유도시에 원숭이 NiG를 발현하는 이. 콜라이 pET28-원숭이 NiG 세포 용해물의 분취액을 각 레인에 로딩하였다. 음성 대조군으로서, 발현을 유도하지 않은 동일한 세포의 세포 용해물을 로딩하였다. SDS-PAGE를 수행하고, 니트로셀룰로스막에 이송하였다. 차단은 차단 완충액 중에서 4℃에서 밤새 수행하였다. 항체 (0.5% 차단'완충액 중의 1 nM, 로슈 어플라이드 사이언스 (Roche Applied Science))를 펩티드 (10배, 100배 및 1000배 몰 과량의 펩티드, 서열: NQQELPIALTKLVKEED, 제리니 펩티드 테크놀로지스)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅한 후에, 멤브레인을 상기 용액에 첨가하고, 교반기 상에서 1시간 이상 실온에서 인큐베이팅하였다. TBS-T로 10분 동안 3회 세척한 후에, 멤브레인을 차단 완충액 중의 1:100000 희석액으로 항 인간 HRP-표지된 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. TBS-T로 3회 세척한 후에, 멤브레인을 제조사의 지시에 따라 화학발광 검출 시약 (ECL Advance, 아머샴 바이오사이언시즈)과 함께 인큐베이팅하고, 필름에 15초 동안 노출시켰다.

ELISA에서 3A6 mAb 의 인간 및 원숭이 펩티드 에피토프에 대한 결합:

그레이너 96웰 PS 평판을 PBS (100 ㎕/웰) 중 8 ㎍/ml 스크램블드 펩티드 H-ETQLAKLPVDLKTQE, 인간 NiG 펩티드 에피토프 3A6IgG4 H-NQQELPTALTKLVKED 및 펩티드 에피토프 3A6 IgG4 원숭이 NiG, H-NQQELPIALTKLVKEED로 코팅하고, 덮고 실온에서 4시간 인큐베이팅하였다. 평판을 가볍게 털어내고 200 ㎕/웰의 차단 완충액 (PBS+5% BSA)을 재충전시키고, 덮고 RT에서 1시간 또는 4℃에서 밤새 인큐베이팅한 다음, 수돗물로 4회 세척하고, PBS로 재충전하고 가볍게 털어내었다. mAb 3A6IgG4를 PBS+2% BSA(100 ㎕/웰) 중에 희석하고, RT에서 2시간 또는 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. mAb를 10 nM 내지 0.001 nM로 희석하였다. 세척 단계를 반복하고, 2차 Ab를 PBS/0.1% BSA/0.1% Nonidet 40 (100 ㎕/웰) 중에 희석하고, RT에서 2시간 또는 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 세척 단계를 반복하고, 100 ㎕/웰의 BM 블루 POD 기질을 첨가하고, 15분 동안 실온에서 암소에서 인큐베이팅하고, 50 ㎕/웰의 1M H₂SO₄를 첨가하여 HRP 기질 반응을 중지시켰다. 광학 밀도는 450 nm로 설정된 미세평판 판독기를 사용하여 결정하였다.

결과:

인간 3A6 mAb 의 에피토프 맵핑 (mapping): 에피토프 맵핑은 인간 NiG 단백질에서 서열 ELPTALTKLV를 얻었다.

웨스턴 블롯팅에서 인간 NiG 에 대한 mAb 3A6과 합성 펩티드와의 결합 경쟁:

펩스팟 기술에 의해 수득한 결과를 확인하기 위해 웨스턴 블롯팅 경쟁 실험을 수행하였다. 추정 에피토프 서열을 함유하는 합성 16-mer (NQQELPTALTKLVKED)를 3A6 항체에 결합하기 위해 전체 길이의 인간 NiG와 경쟁하기 위해 사용하였다. 멤브레인 결합된 인간 NiG와 함께 인큐베이팅하기 전에, 3A6 항체 (1 nM)를 1시간 동안 합성 펩티드와 함께 펩티드 대 항체의 상이한 몰비를 사용하여 인큐베이팅하였다. 10배 몰 과량의 펩티드는 인간 NiG (이. 콜라이에서 생산됨)에 대해 검출된 시그날에서 유의한 감소를 보였다. 100배 과량은 시그날의 추가의 감소를 일으키고, 1000배 몰 과량의 펩티드는 인간 NiG에 대한 3A6의 결합을 거의 완전히 억제하였다. 대조적으로, 동일한 아미노산 함량을 갖지만 상이한 서열 (스크램블드)을 갖는 1000배 과량의 펩티드는 인간 NiG에 대한 항체의 결합에 어떠한 영향을 끼치지 않았다.

원숭이 NiG 에 대한 mAb 3A6 결합: 합성 펩티드 에피토프와의 경쟁

에피토프 서열을 함유하는 합성 17-mer (NQQELPIALTKLVKEED)를 3A6 항체에 결합하기 위해 이. 콜라이에서 발현된 전체 길이의 사이노몰거스 원숭이 NiG와 경쟁하기 위해 사용하였다. 멤브레인 결합된 원숭이 NiG와 함께 인큐베이팅하기 전에, 3A6 항체 (1 nM)를 1시간 동안 합성 펩티드와 함께 펩티드 대 항체의 상이한 몰비를 사용하여 인큐베이팅하였다. 100배 과량은 시그날의 감소를 일으키고, 1000배 몰 과량의 펩티드는 원숭이 NiG에 대한 3A6의 결합을 실질적으로 억제하였다. 대조적으로, 동일한 아미노산 함량을 갖지만 상이한 서열 (스크램블드)을 갖는 1000배 과량의 펩티드는 인간 NiG에 대한 항체의 결합에 어떠한 영향을 끼치지 않았다.

ELISA에서 인간 및 원숭이 NiG 펩티드 에피토프에 대한 3A6 IgG4 의 결합

에피토프 및 스크램블드 서열에 대한 mAb의 상세한 결합 분석은 ELISA를 사용하여 수행하였다. 결과는 mAb가 0.14 nM의 인간 NiG에 대한 BIAcore에서 그의 KD에 동등하게 원숭이 및 인간 펩티드 에피토프에 농도 의존 방식으로 매우 낮은 농도 (0.001 내지 1.0 nM)에서 결합하는 것을 명백히 보여준다. 또한, 결합은 스크램블드 대조 펩티드에 결합하지 않아 특이적이다.

SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> Organic Compound <130> 4-32761P1/UNZ <160> 44 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> rat NogoA_342-357 <400> 1 Ser Tyr Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu 1 5 10 15 Glu Ala <210> 2 <211> 221 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> CHAIN <222> (1)..(221) <223> Variable part of Heavy Chain of 3A6 with leader sequence <400> 2 Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Gly Leu Leu Lys Gly Val 1 5 10 15 Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 20 25 30 Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Asp Phe Arg 35 40 45 Arg Asn Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Lys Ile Asn Tyr Thr Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Val Ser Thr Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr 100 105 110 Tyr Cys Val Arg Pro Val Trp Met Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 130 135 140 Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser 195 200 205 Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala 210 215 220 <210> 3 <211> 238 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> CHAIN <222> (1)..(238) <223> Light Chain of 3A6 with leader sequence <400> 3 Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu 1 5 10 15 Thr Ser Gly Asp Val Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Ile 20 25 30 Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr Cys 100 105 110 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly 165 170 175 Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp 195 200 205 Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr 210 215 220 Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 4 <211> 3919 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(3579) <223> Human NogoA <400> 4 atg gaa gac ctg gac cag tct cct ctg gtc tcg tcc tcg gac agc cca 48 Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro 1 5 10 15 ccc cgg ccg cag ccc gcg ttc aag tac cag ttc gtg agg gag ccc gag 96 Pro Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu Pro Glu 20 25 30 gac gag gag gaa gaa gag gag gag gaa gag gag gac gag gac gaa gac 144 Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp 35 40 45 ctg gag gag ctg gag gtg ctg gag agg aag ccc gcc gcc ggg ctg tcc 192 Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser 50 55 60 gcg gcc cca gtg ccc acc gcc cct gcc gcc ggc gcg ccc ctg atg gac 240 Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp 65 70 75 80 ttc gga aat gac ttc gtg ccg ccg gcg ccc cgg gga ccc ctg ccg gcc 288 Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala 85 90 95 gct ccc ccc gtc gcc ccg gag cgg cag ccg tct tgg gac ccg agc ccg 336 Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro 100 105 110 gtg tcg tcg acc gtg ccc gcg cca tcc ccg ctg tct gct gcc gca gtc 384 Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val 115 120 125 tcg ccc tcc aag ctc cct gag gac gac gag cct ccg gcc cgg cct ccc 432 Ser Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro 130 135 140 cct cct ccc ccg gcc agc gtg agc ccc cag gca gag ccc gtg tgg acc 480 Pro Pro Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Gln Ala Glu Pro Val Trp Thr 145 150 155 160 ccg cca gcc ccg gct ccc gcc gcg ccc ccc tcc acc ccg gcc gcg ccc 528 Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro 165 170 175 aag cgc agg ggc tcc tcg ggc tca gtg gat gag acc ctt ttt gct ctt 576 Lys Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu Phe Ala Leu 180 185 190 cct gct gca tct gag cct gtg ata cgc tcc tct gca gaa aat atg gac 624 Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Arg Ser Ser Ala Glu Asn Met Asp 195 200 205 ttg aag gag cag cca ggt aac act att tcg gct ggt caa gag gat ttc 672 Leu Lys Glu Gln Pro Gly Asn Thr Ile Ser Ala Gly Gln Glu Asp Phe 210 215 220 cca tct gtc ctg ctt gaa act gct gct tct ctt cct tct ctg tct cct 720 Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro Ser Leu Ser Pro 225 230 235 240 ctc tca gcc gct tct ttc aaa gaa cat gaa tac ctt ggt aat ttg tca 768 Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His Glu Tyr Leu Gly Asn Leu Ser 245 250 255 aca gta tta ccc act gaa gga aca ctt caa gaa aat gtc agt gaa gct 816 Thr Val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu Gln Glu Asn Val Ser Glu Ala 260 265 270 tct aaa gag gtc tca gag aag gca aaa act cta ctc ata gat aga gat 864 Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asp 275 280 285 tta aca gag ttt tca gaa tta gaa tac tca gaa atg gga tca tcg ttc 912 Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met Gly Ser Ser Phe 290 295 300 agt gtc tct cca aaa gca gaa tct gcc gta ata gta gca aat cct agg 960 Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala Val Ile Val Ala Asn Pro Arg 305 310 315 320 gaa gaa ata atc gtg aaa aat aaa gat gaa gaa gag aag tta gtt agt 1008 Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp Glu Glu Glu Lys Leu Val Ser 325 330 335 aat aac atc ctt cat aat caa caa gag tta cct aca gct ctt act aaa 1056 Asn Asn Ile Leu His Asn Gln Gln Glu Leu Pro Thr Ala Leu Thr Lys 340 345 350 ttg gtt aaa gag gat gaa gtt gtg tct tca gaa aaa gca aaa gac agt 1104 Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser 355 360 365 ttt aat gaa aag aga gtt gca gtg gaa gct cct atg agg gag gaa tat 1152 Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu Ala Pro Met Arg Glu Glu Tyr 370 375 380 gca gac ttc aaa cca ttt gag cga gta tgg gaa gtg aaa gat agt aag 1200 Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val Trp Glu Val Lys Asp Ser Lys 385 390 395 400 gaa gat agt gat atg ttg gct gct gga ggt aaa atc gag agc aac ttg 1248 Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly Gly Lys Ile Glu Ser Asn Leu 405 410 415 gaa agt aaa gtg gat aaa aaa tgt ttt gca gat agc ctt gag caa act 1296 Glu Ser Lys Val Asp Lys Lys Cys Phe Ala Asp Ser Leu Glu Gln Thr 420 425 430 aat cac gaa aaa gat agt gag agt agt aat gat gat act tct ttc ccc 1344 Asn His Glu Lys Asp Ser Glu Ser Ser Asn Asp Asp Thr Ser Phe Pro 435 440 445 agt acg cca gaa ggt ata aag gat cgt tca gga gca tat atc aca tgt 1392 Ser Thr Pro Glu Gly Ile Lys Asp Arg Ser Gly Ala Tyr Ile Thr Cys 450 455 460 gct ccc ttt aac cca gca gca act gag agc att gca aca aac att ttt 1440 Ala Pro Phe Asn Pro Ala Ala Thr Glu Ser Ile Ala Thr Asn Ile Phe 465 470 475 480 cct ttg tta gga gat cct act tca gaa aat aag acc gat gaa aaa aaa 1488 Pro Leu Leu Gly Asp Pro Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys 485 490 495 ata gaa gaa aag aag gcc caa ata gta aca gag aag aat act agc acc 1536 Ile Glu Glu Lys Lys Ala Gln Ile Val Thr Glu Lys Asn Thr Ser Thr 500 505 510 aaa aca tca aac cct ttt ctt gta gca gca cag gat tct gag aca gat 1584 Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu Val Ala Ala Gln Asp Ser Glu Thr Asp 515 520 525 tat gtc aca aca gat aat tta aca aag gtg act gag gaa gtc gtg gca 1632 Tyr Val Thr Thr Asp Asn Leu Thr Lys Val Thr Glu Glu Val Val Ala 530 535 540 aac atg cct gaa ggc ctg act cca gat tta gta cag gaa gca tgt gaa 1680 Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu 545 550 555 560 agt gaa ttg aat gaa gtt act ggt aca aag att gct tat gaa aca aaa 1728 Ser Glu Leu Asn Glu Val Thr Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys 565 570 575 atg gac ttg gtt caa aca tca gaa gtt atg caa gag tca ctc tat cct 1776 Met Asp Leu Val Gln Thr Ser Glu Val Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro 580 585 590 gca gca cag ctt tgc cca tca ttt gaa gag tca gaa gct act cct tca 1824 Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser 595 600 605 cca gtt ttg cct gac att gtt atg gaa gca cca ttg aat tct gca gtt 1872 Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val 610 615 620 cct agt gct ggt gct tcc gtg ata cag ccc agc tca tca cca tta gaa 1920 Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gln Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu 625 630 635 640 gct tct tca gtt aat tat gaa agc ata aaa cat gag cct gaa aac ccc 1968 Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro 645 650 655 cca cca tat gaa gag gcc atg agt gta tca cta aaa aaa gta tca gga 2016 Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly 660 665 670 ata aag gaa gaa att aaa gag cct gaa aat att aat gca gct ctt caa 2064 Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln 675 680 685 gaa aca gaa gct cct tat ata tct att gca tgt gat tta att aaa gaa 2112 Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu 690 695 700 aca aag ctt tct gct gaa cca gct ccg gat ttc tct gat tat tca gaa 2160 Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu 705 710 715 720 atg gca aaa gtt gaa cag cca gtg cct gat cat tct gag cta gtt gaa 2208 Met Ala Lys Val Glu Gln Pro Val Pro Asp His Ser Glu Leu Val Glu 725 730 735 gat tcc tca cct gat tct gaa cca gtt gac tta ttt agt gat gat tca 2256 Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser 740 745 750 ata cct gac gtt cca caa aaa caa gat gaa act gtg atg ctt gtg aaa 2304 Ile Pro Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp Glu Thr Val Met Leu Val Lys 755 760 765 gaa agt ctc act gag act tca ttt gag tca atg ata gaa tat gaa aat 2352 Glu Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu Ser Met Ile Glu Tyr Glu Asn 770 775 780 aag gaa aaa ctc agt gct ttg cca cct gag gga gga aag cca tat ttg 2400 Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro Pro Glu Gly Gly Lys Pro Tyr Leu 785 790 795 800 gaa tct ttt aag ctc agt tta gat aac aca aaa gat acc ctg tta cct 2448 Glu Ser Phe Lys Leu Ser Leu Asp Asn Thr Lys Asp Thr Leu Leu Pro 805 810 815 gat gaa gtt tca aca ttg agc aaa aag gag aaa att cct ttg cag atg 2496 Asp Glu Val Ser Thr Leu Ser Lys Lys Glu Lys Ile Pro Leu Gln Met 820 825 830 gag gag ctc agt act gca gtt tat tca aat gat gac tta ttt att tct 2544 Glu Glu Leu Ser Thr Ala Val Tyr Ser Asn Asp Asp Leu Phe Ile Ser 835 840 845 aag gaa gca cag ata aga gaa act gaa acg ttt tca gat tca tct cca 2592 Lys Glu Ala Gln Ile Arg Glu Thr Glu Thr Phe Ser Asp Ser Ser Pro 850 855 860 att gaa att ata gat gag ttc cct aca ttg atc agt tct aaa act gat 2640 Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Leu Ile Ser Ser Lys Thr Asp 865 870 875 880 tca ttt tct aaa tta gcc agg gaa tat act gac cta gaa gta tcc cac 2688 Ser Phe Ser Lys Leu Ala Arg Glu Tyr Thr Asp Leu Glu Val Ser His 885 890 895 aaa agt gaa att gct aat gcc ccg gat gga gct ggg tca ttg cct tgc 2736 Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ala Pro Asp Gly Ala Gly Ser Leu Pro Cys 900 905 910 aca gaa ttg ccc cat gac ctt tct ttg aag aac ata caa ccc aaa gtt 2784 Thr Glu Leu Pro His Asp Leu Ser Leu Lys Asn Ile Gln Pro Lys Val 915 920 925 gaa gag aaa atc agt ttc tca gat gac ttt tct aaa aat ggg tct gct 2832 Glu Glu Lys Ile Ser Phe Ser Asp Asp Phe Ser Lys Asn Gly Ser Ala 930 935 940 aca tca aag gtg ctc tta ttg cct cca gat gtt tct gct ttg gcc act 2880 Thr Ser Lys Val Leu Leu Leu Pro Pro Asp Val Ser Ala Leu Ala Thr 945 950 955 960 caa gca gag ata gag agc ata gtt aaa ccc aaa gtt ctt gtg aaa gaa 2928 Gln Ala Glu Ile Glu Ser Ile Val Lys Pro Lys Val Leu Val Lys Glu 965 970 975 gct gag aaa aaa ctt cct tcc gat aca gaa aaa gag gac aga tca cca 2976 Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp Arg Ser Pro 980 985 990 tct gct ata ttt tca gca gag ctg agt aaa act tca gtt gtt gac ctc 3024 Ser Ala Ile Phe Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser Val Val Asp Leu 995 1000 1005 ctg tac tgg aga gac att aag aag act gga gtg gtg ttt ggt gcc 3069 Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe Gly Ala 1010 1015 1020 agc cta ttc ctg ctg ctt tca ttg aca gta ttc agc att gtg agc 3114 Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val Ser 1025 1030 1035 gta aca gcc tac att gcc ttg gcc ctg ctc tct gtg acc atc agc 3159 Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser 1040 1045 1050 ttt agg ata tac aag ggt gtg atc caa gct atc cag aaa tca gat 3204 Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp 1055 1060 1065 gaa ggc cac cca ttc agg gca tat ctg gaa tct gaa gtt gct ata 3249 Glu Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile 1070 1075 1080 tct gag gag ttg gtt cag aag tac agt aat tct gct ctt ggt cat 3294 Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His 1085 1090 1095 gtg aac tgc acg ata aag gaa ctc agg cgc ctc ttc tta gtt gat 3339 Val Asn Cys Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp 1100 1105 1110 gat tta gtt gat tct ctg aag ttt gca gtg ttg atg tgg gta ttt 3384 Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe 1115 1120 1125 acc tat gtt ggt gcc ttg ttt aat ggt ctg aca cta ctg att ttg 3429 Thr Tyr Val Gly Ala Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu 1130 1135 1140 gct ctc att tca ctc ttc agt gtt cct gtt att tat gaa cgg cat 3474 Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser Val Pro Val Ile Tyr Glu Arg His 1145 1150 1155 cag gca cag ata gat cat tat cta gga ctt gca aat aag aat gtt 3519 Gln Ala Gln Ile Asp His Tyr Leu Gly Leu Ala Asn Lys Asn Val 1160 1165 1170 aaa gat gct atg gct aaa atc caa gca aaa atc cct gga ttg aag 3564 Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala Lys Ile Pro Gly Leu Lys 1175 1180 1185 cgc aaa gct gaa tga aaacgcccaa aataattagt aggagttcat ctttaaaggg 3619 Arg Lys Ala Glu 1190 gatattcatt tgattatacg ggggagggtc agggaagaac gaaccttgac gttgcagtgc 3679 agtttcacag atcgttgtta gatctttatt tttagccatg cactgttgtg aggaaaaatt 3739 acctgtcttg actgccatgt gttcatcatc ttaagtattg taagctgcta tgtatggatt 3799 taaaccgtaa tcatatcttt ttcctatctg aggcactggt ggaataaaaa acctgtatat 3859 tttactttgt tgcagatagt cttgccgcat cttggcaagt tgcagagatg gtggagctag 3919 <210> 5 <211> 1192 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro 1 5 10 15 Pro Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu Pro Glu 20 25 30 Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp 35 40 45 Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser 50 55 60 Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp 65 70 75 80 Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala 85 90 95 Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro 100 105 110 Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val 115 120 125 Ser Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro 130 135 140 Pro Pro Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Gln Ala Glu Pro Val Trp Thr 145 150 155 160 Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro 165 170 175 Lys Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu Phe Ala Leu 180 185 190 Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Arg Ser Ser Ala Glu Asn Met Asp 195 200 205 Leu Lys Glu Gln Pro Gly Asn Thr Ile Ser Ala Gly Gln Glu Asp Phe 210 215 220 Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro Ser Leu Ser Pro 225 230 235 240 Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His Glu Tyr Leu Gly Asn Leu Ser 245 250 255 Thr Val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu Gln Glu Asn Val Ser Glu Ala 260 265 270 Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asp 275 280 285 Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met Gly Ser Ser Phe 290 295 300 Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala Val Ile Val Ala Asn Pro Arg 305 310 315 320 Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp Glu Glu Glu Lys Leu Val Ser 325 330 335 Asn Asn Ile Leu His Asn Gln Gln Glu Leu Pro Thr Ala Leu Thr Lys 340 345 350 Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser 355 360 365 Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu Ala Pro Met Arg Glu Glu Tyr 370 375 380 Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val Trp Glu Val Lys Asp Ser Lys 385 390 395 400 Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly Gly Lys Ile Glu Ser Asn Leu 405 410 415 Glu Ser Lys Val Asp Lys Lys Cys Phe Ala Asp Ser Leu Glu Gln Thr 420 425 430 Asn His Glu Lys Asp Ser Glu Ser Ser Asn Asp Asp Thr Ser Phe Pro 435 440 445 Ser Thr Pro Glu Gly Ile Lys Asp Arg Ser Gly Ala Tyr Ile Thr Cys 450 455 460 Ala Pro Phe Asn Pro Ala Ala Thr Glu Ser Ile Ala Thr Asn Ile Phe 465 470 475 480 Pro Leu Leu Gly Asp Pro Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys 485 490 495 Ile Glu Glu Lys Lys Ala Gln Ile Val Thr Glu Lys Asn Thr Ser Thr 500 505 510 Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu Val Ala Ala Gln Asp Ser Glu Thr Asp 515 520 525 Tyr Val Thr Thr Asp Asn Leu Thr Lys Val Thr Glu Glu Val Val Ala 530 535 540 Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu 545 550 555 560 Ser Glu Leu Asn Glu Val Thr Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys 565 570 575 Met Asp Leu Val Gln Thr Ser Glu Val Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro 580 585 590 Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser 595 600 605 Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val 610 615 620 Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gln Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu 625 630 635 640 Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro 645 650 655 Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly 660 665 670 Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln 675 680 685 Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu 690 695 700 Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu 705 710 715 720 Met Ala Lys Val Glu Gln Pro Val Pro Asp His Ser Glu Leu Val Glu 725 730 735 Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser 740 745 750 Ile Pro Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp Glu Thr Val Met Leu Val Lys 755 760 765 Glu Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu Ser Met Ile Glu Tyr Glu Asn 770 775 780 Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro Pro Glu Gly Gly Lys Pro Tyr Leu 785 790 795 800 Glu Ser Phe Lys Leu Ser Leu Asp Asn Thr Lys Asp Thr Leu Leu Pro 805 810 815 Asp Glu Val Ser Thr Leu Ser Lys Lys Glu Lys Ile Pro Leu Gln Met 820 825 830 Glu Glu Leu Ser Thr Ala Val Tyr Ser Asn Asp Asp Leu Phe Ile Ser 835 840 845 Lys Glu Ala Gln Ile Arg Glu Thr Glu Thr Phe Ser Asp Ser Ser Pro 850 855 860 Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Leu Ile Ser Ser Lys Thr Asp 865 870 875 880 Ser Phe Ser Lys Leu Ala Arg Glu Tyr Thr Asp Leu Glu Val Ser His 885 890 895 Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ala Pro Asp Gly Ala Gly Ser Leu Pro Cys 900 905 910 Thr Glu Leu Pro His Asp Leu Ser Leu Lys Asn Ile Gln Pro Lys Val 915 920 925 Glu Glu Lys Ile Ser Phe Ser Asp Asp Phe Ser Lys Asn Gly Ser Ala 930 935 940 Thr Ser Lys Val Leu Leu Leu Pro Pro Asp Val Ser Ala Leu Ala Thr 945 950 955 960 Gln Ala Glu Ile Glu Ser Ile Val Lys Pro Lys Val Leu Val Lys Glu 965 970 975 Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp Arg Ser Pro 980 985 990 Ser Ala Ile Phe Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser Val Val Asp Leu 995 1000 1005 Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe Gly Ala 1010 1015 1020 Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val Ser 1025 1030 1035 Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser 1040 1045 1050 Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp 1055 1060 1065 Glu Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile 1070 1075 1080 Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His 1085 1090 1095 Val Asn Cys Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp 1100 1105 1110 Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe 1115 1120 1125 Thr Tyr Val Gly Ala Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu 1130 1135 1140 Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser Val Pro Val Ile Tyr Glu Arg His 1145 1150 1155 Gln Ala Gln Ile Asp His Tyr Leu Gly Leu Ala Asn Lys Asn Val 1160 1165 1170 Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala Lys Ile Pro Gly Leu Lys 1175 1180 1185 Arg Lys Ala Glu 1190 <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> Human NogoA_342-357 <400> 6 Asn Tyr Glu Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu 1 5 10 15 Glu Ala <210> 7 <211> 819 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(819) <223> human Nig <400> 7 Asp Glu Thr Leu Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Arg 1 5 10 15 Ser Ser Ala Glu Asn Met Asp Leu Lys Glu Gln Pro Gly Asn Thr Ile 20 25 30 Ser Ala Gly Gln Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala 35 40 45 Ser Leu Pro Ser Leu Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His 50 55 60 Glu Tyr Leu Gly Asn Leu Ser Thr Val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu 65 70 75 80 Gln Glu Asn Val Ser Glu Ala Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys 85 90 95 Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asp Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr 100 105 110 Ser Glu Met Gly Ser Ser Phe Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala 115 120 125 Val Ile Val Ala Asn Pro Arg Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp 130 135 140 Glu Glu Glu Lys Leu Val Ser Asn Asn Ile Leu His Asn Gln Gln Glu 145 150 155 160 Leu Pro Thr Ala Leu Thr Lys Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser 165 170 175 Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu 180 185 190 Ala Pro Met Arg Glu Glu Tyr Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val 195 200 205 Trp Glu Val Lys Asp Ser Lys Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly 210 215 220 Gly Lys Ile Glu Ser Asn Leu Glu Ser Lys Val Asp Lys Lys Cys Phe 225 230 235 240 Ala Asp Ser Leu Glu Gln Thr Asn His Glu Lys Asp Ser Glu Ser Ser 245 250 255 Asn Asp Asp Thr Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Gly Ile Lys Asp Arg 260 265 270 Ser Gly Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Pro Phe Asn Pro Ala Ala Thr Glu 275 280 285 Ser Ile Ala Thr Asn Ile Phe Pro Leu Leu Gly Asp Pro Thr Ser Glu 290 295 300 Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Lys Lys Ala Gln Ile Val 305 310 315 320 Thr Glu Lys Asn Thr Ser Thr Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu Val Ala 325 330 335 Ala Gln Asp Ser Glu Thr Asp Tyr Val Thr Thr Asp Asn Leu Thr Lys 340 345 350 Val Thr Glu Glu Val Val Ala Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr Pro Asp 355 360 365 Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Val Thr Gly Thr 370 375 380 Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Met Asp Leu Val Gln Thr Ser Glu Val 385 390 395 400 Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu 405 410 415 Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu 420 425 430 Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gln 435 440 445 Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu Ser Ile 450 455 460 Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val 465 470 475 480 Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu 485 490 495 Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile 500 505 510 Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro 515 520 525 Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu Met Ala Lys Val Glu Gln Pro Val Pro 530 535 540 Asp His Ser Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val 545 550 555 560 Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp 565 570 575 Glu Thr Val Met Leu Val Lys Glu Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu 580 585 590 Ser Met Ile Glu Tyr Glu Asn Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro Pro 595 600 605 Glu Gly Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Lys Leu Ser Leu Asp Asn 610 615 620 Thr Lys Asp Thr Leu Leu Pro Asp Glu Val Ser Thr Leu Ser Lys Lys 625 630 635 640 Glu Lys Ile Pro Leu Gln Met Glu Glu Leu Ser Thr Ala Val Tyr Ser 645 650 655 Asn Asp Asp Leu Phe Ile Ser Lys Glu Ala Gln Ile Arg Glu Thr Glu 660 665 670 Thr Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr 675 680 685 Leu Ile Ser Ser Lys Thr Asp Ser Phe Ser Lys Leu Ala Arg Glu Tyr 690 695 700 Thr Asp Leu Glu Val Ser His Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ala Pro Asp 705 710 715 720 Gly Ala Gly Ser Leu Pro Cys Thr Glu Leu Pro His Asp Leu Ser Leu 725 730 735 Lys Asn Ile Gln Pro Lys Val Glu Glu Lys Ile Ser Phe Ser Asp Asp 740 745 750 Phe Ser Lys Asn Gly Ser Ala Thr Ser Lys Val Leu Leu Leu Pro Pro 755 760 765 Asp Val Ser Ala Leu Ala Thr Gln Ala Glu Ile Glu Ser Ile Val Lys 770 775 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musculus <220> <221> BINDING <222> (1)..(7) <223> hypervariable part of light chain of 3A6 <400> 12 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> BINDING <222> (1)..(9) <223> hypervariable part of light chain of 3A6 <400> 13 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr 1 5 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_binding <222> (1)..(30) <223> DNA-CDR-H1-3A6 <400> 14 ggattcgatt ttagaagaaa ttggatgagt 30 <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_binding <222> (1)..(51) <223> DNA-CDR-H2-3A6 <400> 15 gaaattaatc cagatagcag taagataaac tatacgccat ctctaaagga t 51 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_binding <222> (1)..(27) <223> DNA-CDR-H3-3A6 <400> 16 ccggtctgga tgtatgctat ggactac 27 <210> 17 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_binding <222> (1)..(48) <223> DNA-CDR'1-3A6 <400> 17 aagtcaagtc agagcctctt gcatagtgat ggaaagacat atttgaat 48 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_binding <222> (1)..(21) <223> DNA-CDR'2-3A6 <400> 18 ctggtgtcta aactggactc t 21 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_binding <222> (1)..(27) <223> DNA-CDR'3-3A6 <400> 19 tggcaaggta cacattttcc tcagacg 27 <210> 20 <211> 54 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(54) <223> leader sequence for heavy chain of 3A6 <400> 20 atg gat ttt ggg ctg att ttt ttt att gtt ggt ctt tta aaa ggg gtc 48 Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Gly Leu Leu Lys Gly Val 1 5 10 15 cag tgt 54 Gln Cys <210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Gly Leu Leu Lys Gly Val 1 5 10 15 Gln Cys <210> 22 <211> 57 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(57) <223> leader sequence for 3A6-light chain <400> 22 atg agt cct gcc cag ttc ctg ttt ctg tta gtg ctc tgg att cgg gaa 48 Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu 1 5 10 15 acc agc ggt 57 Thr Ser Gly <210> 23 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu 1 5 10 15 Thr Ser Gly <210> 24 <211> 181 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(181) <223> human Nig-D20 <400> 24 Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Met Asp Leu Val Gln Thr Ser 1 5 10 15 Glu Val Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser 20 25 30 Phe Glu Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val 35 40 45 Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val 50 55 60 Ile Gln Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu 65 70 75 80 Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met 85 90 95 Ser Val Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu 100 105 110 Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile 115 120 125 Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro 130 135 140 Ala Pro Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu Met Ala Lys Val Glu Gln Pro 145 150 155 160 Val Pro Asp His Ser Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu 165 170 175 Pro Val Asp Leu Phe 180 <210> 25 <211> 3492 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(3492) <223> rat NogoA <400> 25 atg gaa gac ata gac cag tcg tcg ctg gtc tcc tcg tcc acg gac agc 48 Met Glu Asp Ile Asp Gln Ser Ser Leu Val Ser Ser Ser Thr Asp Ser 1 5 10 15 ccg ccc cgg cct ccg ccc gcc ttc aag tac cag ttc gtg acg gag ccc 96 Pro Pro Arg Pro Pro Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Thr Glu Pro 20 25 30 gag gac gag gag gac gag gag gag gag gag gac gag gag gag gac gac 144 Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp 35 40 45 gag gac cta gag gaa ctg gag gtg ctg gag agg aag ccc gca gcc ggg 192 Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly 50 55 60 ctg tcc gca gct gcg gtg ccg ccc gcc gcc gcc gcg ccg ctg ctg gac 240 Leu Ser Ala Ala Ala Val Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp 65 70 75 80 ttc agc agc gac tcg gtg ccc ccc gcg ccc cgc ggg ccg ctg ccg gcc 288 Phe Ser Ser Asp Ser Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala 85 90 95 gcg ccc cct gcc gct cct gag agg cag cca tcc tgg gaa cgc agc ccc 336 Ala Pro Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Glu Arg Ser Pro 100 105 110 gcg gcg ccc gcg cca tcc ctg ccg ccc gct gcc gca gtc ctg ccc tcc 384 Ala Ala Pro Ala Pro Ser Leu Pro Pro Ala Ala Ala Val Leu Pro Ser 115 120 125 aag ctc cca gag gac gac gag cct ccg gcg agg ccc ccg cct ccg ccg 432 Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro 130 135 140 cca gcc ggc gcg agc ccc ctg gcg gag ccc gcc gcg ccc cct tcc acg 480 Pro Ala Gly Ala Ser Pro Leu Ala Glu Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr 145 150 155 160 ccg gcc gcg ccc aag cgc agg ggc tcc ggc tca gtg gat gag acc ctt 528 Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu 165 170 175 ttt gct ctt cct gct gca tct gag cct gtg ata ccc tcc tct gca gaa 576 Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Pro Ser Ser Ala Glu 180 185 190 aaa att atg gat ttg atg gag cag cca ggt aac act gtt tcg tct ggt 624 Lys Ile Met Asp Leu Met Glu Gln Pro Gly Asn Thr Val Ser Ser Gly 195 200 205 caa gag gat ttc cca tct gtc ctg ctt gaa act gct gcc tct ctt cct 672 Gln Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro 210 215 220 tct cta tct cct ctc tca act gtt tct ttt aaa gaa cat gga tac ctt 720 Ser Leu Ser Pro Leu Ser Thr Val Ser Phe Lys Glu His Gly Tyr Leu 225 230 235 240 ggt aac tta tca gca gtg tca tcc tca gaa gga aca att gaa gaa act 768 Gly Asn Leu Ser Ala Val Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ile Glu Glu Thr 245 250 255 tta aat gaa gct tct aaa gag ttg cca gag agg gca aca aat cca ttt 816 Leu Asn Glu Ala Ser Lys Glu Leu Pro Glu Arg Ala Thr Asn Pro Phe 260 265 270 gta aat aga gat tta gca gaa ttt tca gaa tta gaa tat tca gaa atg 864 Val Asn Arg Asp Leu Ala Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met 275 280 285 gga tca tct ttt aaa ggc tcc cca aaa gga gag tca gcc ata tta gta 912 Gly Ser Ser Phe Lys Gly Ser Pro Lys Gly Glu Ser Ala Ile Leu Val 290 295 300 gaa aac act aag gaa gaa gta att gtg agg agt aaa gac aaa gag gat 960 Glu Asn Thr Lys Glu Glu Val Ile Val Arg Ser Lys Asp Lys Glu Asp 305 310 315 320 tta gtt tgt agt gca gcc ctt cac agt cca caa gaa tca cct gtg ggt 1008 Leu Val Cys Ser Ala Ala Leu His Ser Pro Gln Glu Ser Pro Val Gly 325 330 335 aaa gaa gac aga gtt gtg tct cca gaa aag aca atg gac att ttt aat 1056 Lys Glu Asp Arg Val Val Ser Pro Glu Lys Thr Met Asp Ile Phe Asn 340 345 350 gaa atg cag atg tca gta gta gca cct gtg agg gaa gag tat gca gac 1104 Glu Met Gln Met Ser Val Val Ala Pro Val Arg Glu Glu Tyr Ala Asp 355 360 365 ttt aag cca ttt gaa caa gca tgg gaa gtg aaa gat act tat gag gga 1152 Phe Lys Pro Phe Glu Gln Ala Trp Glu Val Lys Asp Thr Tyr Glu Gly 370 375 380 agt agg gat gtg ctg gct gct aga gct aat gtg gaa agt aaa gtg gac 1200 Ser Arg Asp Val Leu Ala Ala Arg Ala Asn Val Glu Ser Lys Val Asp 385 390 395 400 aga aaa tgc ttg gaa gat agc ctg gag caa aaa agt ctt ggg aag gat 1248 Arg Lys Cys Leu Glu Asp Ser Leu Glu Gln Lys Ser Leu Gly Lys Asp 405 410 415 agt gaa ggc aga aat gag gat gct tct ttc ccc agt acc cca gaa cct 1296 Ser Glu Gly Arg Asn Glu Asp Ala Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Pro 420 425 430 gtg aag gac agc tcc aga gca tat att acc tgt gct tcc ttt acc tca 1344 Val Lys Asp Ser Ser Arg Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Ser Phe Thr Ser 435 440 445 gca acc gaa agc acc aca gca aac act ttc cct ttg tta gaa gat cat 1392 Ala Thr Glu Ser Thr Thr Ala Asn Thr Phe Pro Leu Leu Glu Asp His 450 455 460 act tca gaa aat aaa aca gat gaa aaa aaa ata gaa gaa agg aag gcc 1440 Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Arg Lys Ala 465 470 475 480 caa att ata aca gag aag act agc ccc aaa acg tca aat cct ttc ctt 1488 Gln Ile Ile Thr Glu Lys Thr Ser Pro Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu 485 490 495 gta gca gta cag gat tct gag gca gat tat gtt aca aca gat acc tta 1536 Val Ala Val Gln Asp Ser Glu Ala Asp Tyr Val Thr Thr Asp Thr Leu 500 505 510 tca aag gtg act gag gca gca gtg tca aac atg cct gaa ggt ctg acg 1584 Ser Lys Val Thr Glu Ala Ala Val Ser Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr 515 520 525 cca gat tta gtt cag gaa gca tgt gaa agt gaa ctg aat gaa gcc aca 1632 Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Thr 530 535 540 ggt aca aag att gct tat gaa aca aaa gtg gac ttg gtc caa aca tca 1680 Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Val Asp Leu Val Gln Thr Ser 545 550 555 560 gaa gct ata caa gaa tca ctt tac ccc aca gca cag ctt tgc cca tca 1728 Glu Ala Ile Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Thr Ala Gln Leu Cys Pro Ser 565 570 575 ttt gag gaa gct gaa gca act ccg tca cca gtt ttg cct gat att gtt 1776 Phe Glu Glu Ala Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val 580 585 590 atg gaa gca cca tta aat tct ctc ctt cca agc gct ggt gct tct gta 1824 Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Leu Leu Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val 595 600 605 gtg cag ccc agt gta tcc cca ctg gaa gca cct cct cca gtt agt tat 1872 Val Gln Pro Ser Val Ser Pro Leu Glu Ala Pro Pro Pro Val Ser Tyr 610 615 620 gac agt ata aag ctt gag cct gaa aac ccc cca cca tat gaa gaa gcc 1920 Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala 625 630 635 640 atg aat gta gca cta aaa gct ttg gga aca aag gaa gga ata aaa gag 1968 Met Asn Val Ala Leu Lys Ala Leu Gly Thr Lys Glu Gly Ile Lys Glu 645 650 655 cct gaa agt ttt aat gca gct gtt cag gaa aca gaa gct cct tat ata 2016 Pro Glu Ser Phe Asn Ala Ala Val Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile 660 665 670 tcc att gcg tgt gat tta att aaa gaa aca aag ctc tcc act gag cca 2064 Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Thr Glu Pro 675 680 685 agt cca gat ttc tct aat tat tca gaa ata gca aaa ttc gag aag tcg 2112 Ser Pro Asp Phe Ser Asn Tyr Ser Glu Ile Ala Lys Phe Glu Lys Ser 690 695 700 gtg ccc gaa cac gct gag cta gtg gag gat tcc tca cct gaa tct gaa 2160 Val Pro Glu His Ala Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Glu Ser Glu 705 710 715 720 cca gtt gac tta ttt agt gat gat tcg att cct gaa gtc cca caa aca 2208 Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Glu Val Pro Gln Thr 725 730 735 caa gag gag gct gtg atg ctc atg aag gag agt ctc act gaa gtg tct 2256 Gln Glu Glu Ala Val Met Leu Met Lys Glu Ser Leu Thr Glu Val Ser 740 745 750 gag aca gta gcc cag cac aaa gag gag aga ctt agt gcc tca cct cag 2304 Glu Thr Val Ala Gln His Lys Glu Glu Arg Leu Ser Ala Ser Pro Gln 755 760 765 gag cta gga aag cca tat tta gag tct ttt cag ccc aat tta cat agt 2352 Glu Leu Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Gln Pro Asn Leu His Ser 770 775 780 aca aaa gat gct gca tct aat gac att cca aca ttg acc aaa aag gag 2400 Thr Lys Asp Ala Ala Ser Asn Asp Ile Pro Thr Leu Thr Lys Lys Glu 785 790 795 800 aaa att tct ttg caa atg gaa gag ttt aat act gca att tat tca aat 2448 Lys Ile Ser Leu Gln Met Glu Glu Phe Asn Thr Ala Ile Tyr Ser Asn 805 810 815 gat gac tta ctt tct tct aag gaa gac aaa ata aaa gaa agt gaa aca 2496 Asp Asp Leu Leu Ser Ser Lys Glu Asp Lys Ile Lys Glu Ser Glu Thr 820 825 830 ttt tca gat tca tct ccg att gag ata ata gat gaa ttt ccc acg ttt 2544 Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Phe 835 840 845 gtc agt gct aaa gat gat tct cct aaa tta gcc aag gag tac act gat 2592 Val Ser Ala Lys Asp Asp Ser Pro Lys Leu Ala Lys Glu Tyr Thr Asp 850 855 860 cta gaa gta tcc gac aaa agt gaa att gct aat atc caa agc ggg gca 2640 Leu Glu Val Ser Asp Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ile Gln Ser Gly Ala 865 870 875 880 gat tca ttg cct tgc tta gaa ttg ccc tgt gac ctt tct ttc aag aat 2688 Asp Ser Leu Pro Cys Leu Glu Leu Pro Cys Asp Leu Ser Phe Lys Asn 885 890 895 ata tat cct aaa gat gaa gta cat gtt tca gat gaa ttc tcc gaa aat 2736 Ile Tyr Pro Lys Asp Glu Val His Val Ser Asp Glu Phe Ser Glu Asn 900 905 910 agg tcc agt gta tct aag gca tcc ata tcg cct tca aat gtc tct gct 2784 Arg Ser Ser Val Ser Lys Ala Ser Ile Ser Pro Ser Asn Val Ser Ala 915 920 925 ttg gaa cct cag aca gaa atg ggc agc ata gtt aaa tcc aaa tca ctt 2832 Leu Glu Pro Gln Thr Glu Met Gly Ser Ile Val Lys Ser Lys Ser Leu 930 935 940 acg aaa gaa gca gag aaa aaa ctt cct tct gac aca gag aaa gag gac 2880 Thr Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp 945 950 955 960 aga tcc ctg tca gct gta ttg tca gca gag ctg agt aaa act tca gtt 2928 Arg Ser Leu Ser Ala Val Leu Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser Val 965 970 975 gtt gac ctc ctc tac tgg aga gac att aag aag act gga gtg gtg ttt 2976 Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe 980 985 990 ggt gcc agc tta ttc ctg ctg ctg tct ctg aca gtg ttc agc att gtc 3024 Gly Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val 995 1000 1005 agt gta acg gcc tac att gcc ttg gcc ctg ctc tcg gtg act atc 3069 Ser Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile 1010 1015 1020 agc ttt agg ata tat aag ggc gtg atc cag gct atc cag aaa tca 3114 Ser Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser 1025 1030 1035 gat gaa ggc cac cca ttc agg gca tat tta gaa tct gaa gtt gct 3159 Asp Glu Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala 1040 1045 1050 ata tca gag gaa ttg gtt cag aaa tac agt aat tct gct ctt ggt 3204 Ile Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly 1055 1060 1065 cat gtg aac agc aca ata aaa gaa ctg agg cgg ctt ttc tta gtt 3249 His Val Asn Ser Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val 1070 1075 1080 gat gat tta gtt gat tcc ctg aag ttt gca gtg ttg atg tgg gtg 3294 Asp Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val 1085 1090 1095 ttt act tat gtt ggt gcc ttg ttc aat ggt ctg aca cta ctg att 3339 Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile 1100 1105 1110 tta gct ctg atc tca ctc ttc agt att cct gtt att tat gaa cgg 3384 Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser Ile Pro Val Ile Tyr Glu Arg 1115 1120 1125 cat cag gtg cag ata gat cat tat cta gga ctt gca aac aag agt 3429 His Gln Val Gln Ile Asp His Tyr Leu Gly Leu Ala Asn Lys Ser 1130 1135 1140 gtt aag gat gcc atg gcc aaa atc caa gca aaa atc cct gga ttg 3474 Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala Lys Ile Pro Gly Leu 1145 1150 1155 aag cgc aaa gca gat tga 3492 Lys Arg Lys Ala Asp 1160 <210> 26 <211> 1163 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 26 Met Glu Asp Ile Asp Gln Ser Ser Leu Val Ser Ser Ser Thr Asp Ser 1 5 10 15 Pro Pro Arg Pro Pro Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Thr Glu Pro 20 25 30 Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp 35 40 45 Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly 50 55 60 Leu Ser Ala Ala Ala Val Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp 65 70 75 80 Phe Ser Ser Asp Ser Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala 85 90 95 Ala Pro Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Glu Arg Ser Pro 100 105 110 Ala Ala Pro Ala Pro Ser Leu Pro Pro Ala Ala Ala Val Leu Pro Ser 115 120 125 Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro 130 135 140 Pro Ala Gly Ala Ser Pro Leu Ala Glu Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr 145 150 155 160 Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu 165 170 175 Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Pro Ser Ser Ala Glu 180 185 190 Lys Ile Met Asp Leu Met Glu Gln Pro Gly Asn Thr Val Ser Ser Gly 195 200 205 Gln Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro 210 215 220 Ser Leu Ser Pro Leu Ser Thr Val Ser Phe Lys Glu His Gly Tyr Leu 225 230 235 240 Gly Asn Leu Ser Ala Val Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ile Glu Glu Thr 245 250 255 Leu Asn Glu Ala Ser Lys Glu Leu Pro Glu Arg Ala Thr Asn Pro Phe 260 265 270 Val Asn Arg Asp Leu Ala Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met 275 280 285 Gly Ser Ser Phe Lys Gly Ser Pro Lys Gly Glu Ser Ala Ile Leu Val 290 295 300 Glu Asn Thr Lys Glu Glu Val Ile Val Arg Ser Lys Asp Lys Glu Asp 305 310 315 320 Leu Val Cys Ser Ala Ala Leu His Ser Pro Gln Glu Ser Pro Val Gly 325 330 335 Lys Glu Asp Arg Val Val Ser Pro Glu Lys Thr Met Asp Ile Phe Asn 340 345 350 Glu Met Gln Met Ser Val Val Ala Pro Val Arg Glu Glu Tyr Ala Asp 355 360 365 Phe Lys Pro Phe Glu Gln Ala Trp Glu Val Lys Asp Thr Tyr Glu Gly 370 375 380 Ser Arg Asp Val Leu Ala Ala Arg Ala Asn Val Glu Ser Lys Val Asp 385 390 395 400 Arg Lys Cys Leu Glu Asp Ser Leu Glu Gln Lys Ser Leu Gly Lys Asp 405 410 415 Ser Glu Gly Arg Asn Glu Asp Ala Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Pro 420 425 430 Val Lys Asp Ser Ser Arg Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Ser Phe Thr Ser 435 440 445 Ala Thr Glu Ser Thr Thr Ala Asn Thr Phe Pro Leu Leu Glu Asp His 450 455 460 Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Arg Lys Ala 465 470 475 480 Gln Ile Ile Thr Glu Lys Thr Ser Pro Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu 485 490 495 Val Ala Val Gln Asp Ser Glu Ala Asp Tyr Val Thr Thr Asp Thr Leu 500 505 510 Ser Lys Val Thr Glu Ala Ala Val Ser Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr 515 520 525 Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Thr 530 535 540 Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Val Asp Leu Val Gln Thr Ser 545 550 555 560 Glu Ala Ile Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Thr Ala Gln Leu Cys Pro Ser 565 570 575 Phe Glu Glu Ala Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val 580 585 590 Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Leu Leu Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val 595 600 605 Val Gln Pro Ser Val Ser Pro Leu Glu Ala Pro Pro Pro Val Ser Tyr 610 615 620 Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala 625 630 635 640 Met Asn Val Ala Leu Lys Ala Leu Gly Thr Lys Glu Gly Ile Lys Glu 645 650 655 Pro Glu Ser Phe Asn Ala Ala Val Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile 660 665 670 Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Thr Glu Pro 675 680 685 Ser Pro Asp Phe Ser Asn Tyr Ser Glu Ile Ala Lys Phe Glu Lys Ser 690 695 700 Val Pro Glu His Ala Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Glu Ser Glu 705 710 715 720 Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Glu Val Pro Gln Thr 725 730 735 Gln Glu Glu Ala Val Met Leu Met Lys Glu Ser Leu Thr Glu Val Ser 740 745 750 Glu Thr Val Ala Gln His Lys Glu Glu Arg Leu Ser Ala Ser Pro Gln 755 760 765 Glu Leu Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Gln Pro Asn Leu His Ser 770 775 780 Thr Lys Asp Ala Ala Ser Asn Asp Ile Pro Thr Leu Thr Lys Lys Glu 785 790 795 800 Lys Ile Ser Leu Gln Met Glu Glu Phe Asn Thr Ala Ile Tyr Ser Asn 805 810 815 Asp Asp Leu Leu Ser Ser Lys Glu Asp Lys Ile Lys Glu Ser Glu Thr 820 825 830 Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Phe 835 840 845 Val Ser Ala Lys Asp Asp Ser Pro Lys Leu Ala Lys Glu Tyr Thr Asp 850 855 860 Leu Glu Val Ser Asp Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ile Gln Ser Gly Ala 865 870 875 880 Asp Ser Leu Pro Cys Leu Glu Leu Pro Cys Asp Leu Ser Phe Lys Asn 885 890 895 Ile Tyr Pro Lys Asp Glu Val His Val Ser Asp Glu Phe Ser Glu Asn 900 905 910 Arg Ser Ser Val Ser Lys Ala Ser Ile Ser Pro Ser Asn Val Ser Ala 915 920 925 Leu Glu Pro Gln Thr Glu Met Gly Ser Ile Val Lys Ser Lys Ser Leu 930 935 940 Thr Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp 945 950 955 960 Arg Ser Leu Ser Ala Val Leu Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser Val 965 970 975 Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe 980 985 990 Gly Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val 995 1000 1005 Ser Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile 1010 1015 1020 Ser Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser 1025 1030 1035 Asp Glu Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala 1040 1045 1050 Ile Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly 1055 1060 1065 His Val Asn Ser Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val 1070 1075 1080 Asp Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val 1085 1090 1095 Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile 1100 1105 1110 Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser Ile Pro Val Ile Tyr Glu Arg 1115 1120 1125 His Gln Val Gln Ile Asp His Tyr Leu Gly Leu Ala Asn Lys Ser 1130 1135 1140 Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala Lys Ile Pro Gly Leu 1145 1150 1155 Lys Arg Lys Ala Asp 1160 <210> 27 <211> 25 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(25) <223> rat PEP4 <400> 27 Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn 1 5 10 15 Ser Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu 20 25 <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRO/SER rich peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Synthetic peptide <400> 28 Pro Ser Ser Pro Pro Pro Ser Ser Pro Pro Pro Ser Ser Pro Pro Pro 1 5 10 15 Ser <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA-NA-2F <220> <221> primer_bind <222> (1)..(25) <223> CA-NA-2F primer <400> 29 aagcaccatt gaattctgca gttcc 25 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA-NA-3R <220> <221> primer_bind <222> (1)..(28) <223> <400> 30 aactgcagta ctgagctcct ccatctgc 28 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward 5' <220> <221> primer_bind <222> (1)..(33) <223> forward primer <400> 31 gtcgcggatc catggagacc ctttttgctc ttc 33 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse 5' <220> <221> primer_bind <222> (1)..(27) <223> reverse primer <400> 32 gttctcgagt tatgaagttt tactcag 27 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward 5'-1 <220> <221> primer_bind <222> (1)..(29) <223> primer <400> 33 gtgcggatcc atggatttga aggagcagc 29 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse 5'-1 <220> <221> primer_bind <222> (1)..(28) <223> primer <400> 34 gtttctcgag tgaagtttta ttcagctc 28 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> primer <400> 35 tccaccccgg ccgcgcccaa 20 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer 2 <220> <221> primer_bind <222> (1)..(22) <223> primer <400> 36 aatgatgggc aaagctgtgc tg 22 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer <220> <221> primer_bind <222> (1)..(24) <223> primer <400> 37 ggtacaaaga ttgcttatga aaca 24 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer 2 <220> <221> primer_bind <222> (1)..(22) <223> primer <400> 38 agcagggcca aggcaatgta gg 22 <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-VL leader <220> <221> primer_bind <222> (1)..(28) <223> primer <400> 39 aatatgagtc ctgcccagtt cctgtttc 28 <210> 40 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-Ck <220> <221> primer_bind <222> (1)..(32) <223> primer <400> 40 ttaggaattc ctaacactct cccctgttga ag 32 <210> 41 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-VH leader <220> <221> primer_bind <222> (1)..(31) <223> primer <400> 41 aatatggatt ttgggctgat tttttttatt g 31 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-CH hinge <220> <221> primer_bind <222> (1)..(24) <223> primer <400> 42 aattgggcaa cgttgcaggt gacg 24 <210> 43 <211> 663 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_binding <222> (1)..(663) <223> DNA variable part of heavy chain 3A6 <400> 43 atggattttg ggctgatttt ttttattgtt ggtcttttaa aaggggtcca gtgtgaggtg 60 aagcttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt 120 gtagtctcag gattcgattt tagaagaaat tggatgagtt gggtccggca ggctcctggg 180 aaagggctag aatggattgg agaaattaat ccagatagca gtaagataaa ctatacgcca 240 tctctaaagg ataaattcat catctccaga gacaatgcca agaatacgct gtacctgcaa 300 gtgagcacag tgagatctga ggacacagcc ctttattact gtgtgagacc ggtctggatg 360 tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctcagc caaaacgaca 420 cccccatctg tctatccact ggcccctgga tctgctgccc aaactaactc catggtgacc 480 ctgggatgcc tggtcaaggg ctatttccct gagccagtga cagtgacctg gaactctgga 540 tccctgtcca gcggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct ctacactctg 600 agcagctcag tgactgtccc ctccagcacc tggcccagcg agaccgtcac ctgcaacgtt 660 gcc 663 <210> 44 <211> 717 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_binding <222> (1)..(717) <223> variable part of light chain of 3A6 <400> 44 atgagtcctg cccagttcct gtttctgtta gtgctctgga ttcgggaaac cagcggtgat 60 gttctgttga cccagactcc tctcactttg tcgataacca ttggacaacc agcctccatc 120 tcttgcaagt caagtcagag cctcttgcat agtgatggaa agacatattt gaattggttg 180 ttacagaggc caggccagtc tccaaagcgc ctaatctatc tggtgtctaa actggactct 240 ggagtccctg acaggttcac tggcagtgga tcagggacgg atttcacact gaaaatcagc 300 agagtggagg ctgaggattt gggactttat tattgctggc aaggtacaca ttttcctcag 360 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggggaga gtgttag 717

Claims

인간 NogoA 폴리펩티드 (서열 5) 또는 인간 NiG (서열 7) 또는 인간 NiG-D20 (서열 24) 또는 인간 NogoA_-342-357 (서열 6)에 해리 상수 1000 nM 미만으로 결합할 수 있는 결합 분자.
인간 NogoA 폴리펩티드 (서열 5) 또는 인간 NiG (서열 7) 또는 인간 NiG-D20 (서열 24) 또는 인간 NogoA_-342-357 (서열 6)에 해리 상수 1000 nM 미만으로 결합할 수 있는 결합 분자로서,

ㆍ동등한 초가변 구역 CDR-H1-3A6 (서열 8), CDR-H2-3A6 (서열 9) 및 CDR-H3-3A6 (서열 10)에 각각 50% 이상 상동성인 초가변 구역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 순서대로 포함하거나; 또는

ㆍ동등한 초가변 구역 CDR-L1-3A6 (서열 11), CDR-L2-3A6 (서열 12) 및 CDR-L3-3A6 (서열 13)에 각각 50% 이상 상동성인 초가변 구역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 순서대로 포함하는,

하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 분자.
인간 NogoA 폴리펩티드 (서열 5) 또는 인간 NiG (서열 7) 또는 인간 NiG-D20 (서열 24) 또는 인간 NogoA_-342-357 (서열 6)에 해리 상수 1000 nM 미만으로 결합할 수 있는 결합 분자로서,

ㆍ동등한 초가변 구역 CDR-H1-3A6 (서열 8), CDR-H2-3A6 (서열 9) 및 CDR-H3-3A6 (서열 10)에 각각 50% 이상 상동성인 초가변 구역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 순서대로 포함하는 제1 항원 결합 부위; 및

ㆍ동등한 초가변 구역 CDR-L1-3A6 (서열 11), CDR-L2-3A6 (서열 12) 및 CDR-L3-3A6 (서열 13)에 각각 50% 이상 상동성인 초가변 구역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 순서대로 포함하는 제2 항원 결합 부위

를 포함하는 결합 분자.
ㆍ순서대로 초가변 구역 CDR-H1-3A6 (서열 8), CDR-H2-3A6 (서열 9) 및 CDR-H3-3A6 (서열 10); 또는

ㆍ순서대로 초가변 구역 CDR-L1-3A6 (서열 11), CDR-L2-3A6 (서열 12) 및 CDR-L3-3A6 (서열 13); 또는

ㆍ이들의 직접적인 동등물

을 포함하는, 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 분자.
ㆍ초가변 구역 CDR-H1-3A6 (서열 8), CDR-H2-3A6 (서열 9) 및 CDR-H3-3A6 (서열 10)을 순서대로 포함하는 제1 항원 결합 부위; 및

ㆍ초가변 구역 CDR-L1-3A6 (서열 11), CDR-L2-3A6 (서열 12) 및 CDR-L3-3A6 (서열 13)을 순서대로 포함하는 제2 항원 결합 부위; 또는

ㆍ이들의 직접적인 동등물

을 포함하는 결합 분자.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도

ㆍ(i) 초가변 구역 CDR-H1-3A6 (서열 8), CDR-H2-3A6 (서열 9) 및 CDR-H3-3A6 (서열 10)을 순서대로 포함하는 가변 도메인 및 (ii) 인간 중쇄의 불변 부분 또는 그의 단편을 포함하는 하나의 면역글로불린 중쇄 또는 그의 단편; 및

ㆍ(i) 초가변 구역 CDR-L1-3A6 (서열 11), CDR-L2-3A6 (서열 12) 및 CDR-L3-3A6 (서열 13)을 순서대로 포함하는 가변 도메인 및 (ii) 인간 경쇄의 불변 부분 또는 그의 단편을 포함하는 하나의 면역글로불린 경쇄 또는 그의 단편; 또는

ㆍ이들의 직접적인 동등물

을 포함하는 결합 분자.
제6항에 있어서, 인간 중쇄의 불변 부분 또는 그의 단편이 γ4형이고, 인간 경쇄의 불변 부분 또는 그의 단편이 κ형인 결합 분자.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 키메릭 또는 인간화 모노클로날 항체인 결합 분자.
서열 2 및 서열 3의 폴리펩티드 서열을 포함하는 결합 분자.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항 기재의 결합 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
ㆍ서열 14, 서열 15 및 서열 16의 폴리뉴클레오티드 서열; 또는

ㆍ서열 17, 서열 18 및 서열 19의 폴리뉴클레오티드 서열

을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제10항 또는 제11항 기재의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
발현 시스템 또는 그의 일부가 상용성의 숙주 세포에 존재할 때 상기 발현 시스템 또는 그의 일부가 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항 기재의 폴리펩티드를 생산할 수 있는, 제10항 또는 제11항 기재의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 시스템.
제13항 기재의 발현 시스템을 포함하는 단리된 숙주 세포.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항 기재의 결합 분자의 제약으로서의 용도.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항 기재의 결합 분자의 신경 복구 치료에서의 용도.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항 기재의 결합 분자를 하나 이상의 제약학상 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 제약 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항 기재의 결합 분자의 유효량을 신경 복구와 관련된 질병의 치료가 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 신경 복구와 관련된 질병의 치료 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항 기재의 결합 분자의 유효량을 신경 복구와 관련된 질병의 치료가 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 신경 복구와 관련된 질병의 치료 방법.