JP2904918B2 - 新規血栓溶解剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規血栓溶解剤、その単離法及びその薬物
学的使用に関する。

血栓は、血管内での血塊の形成により生ぜしめられ
る。肺動脈塞栓症を包含する静脈血栓と急性心筋梗塞症
を包含する動脈血栓とは区別されている。

肺動脈塞栓症及び心筋梗塞症は緊急医療処置を必要と
する救急事態である。

種々の侵入的方法と並んで、動脈及び静脈血栓症に対
する治療の一般的形には、近年、プラスミノーゲンアク
チベータを用いる酵素的血栓溶解の形も包含されてい
る。血栓溶解剤と称されているこれら物質は、血中のプ
ラスミノーゲン、線維素溶解系の不活性プロ酵素を、活
性の蛋白質分解酵素プラスミンに変える。プラスミンそ
のものは、線維素物質フイブリン（これは血塊の主成分
である）を溶かし、栓塞された血管を再解放し、血流を
回復させる。しかしながら、プラスミンは比較的非特異
的なプロテアーゼであり、即ち血液中で一旦形成される
と、これは蛋白質分解により、無傷止血のために不可欠
の血中成分（例えばフイブリノーゲン）を破壊し、その
際に特定の状況下で出血の危険を誘発する。

初期の血栓溶解剤であるストレプトキナーゼ及びウロ
キナーゼは、循環内に一旦注入されると、全身的にプラ
スミノーゲンをプラスミンに変え、全身的な蛋白質分解
を誘発する。従つて、これらの物質を用いる血栓溶解治
療は、屡々、出血に基づく合併症を伴なう。その後にフ
イブリン特異性血栓溶解が開発され、ここでは組織型の
再結合プラスミノーゲンアクチベータ（簡略化のために
ｔ−PAと称される）が使用され、このジレンマは解消さ
れた。血液循環内で、ｔ−PAはプラスミノーゲンに対し
て低い親和性を有するだけである。しかしながら、線維
素物質フイブリン（これと特異的な結合部位で反応す
る）の存在時に、この親和性は数倍も高められ、結果的
に血栓の表面上にプラスミンを形成する。このことは、
試験管内及び動物実験で立証できたが、臨床研究では、
循環系血栓の迅速溶解をもたらすためには多量のｔ−PA
が必要であることが示されている。

しかしながら、このような多量のｔ−PAの適用量が注
入されると、これはストレプトキナーゼ及びウロキナー
ゼの場合におけると同様に出血の相対的危険を伴なう全
身的な蛋白質分解を起こさせる。従つて、現在は、ｔ−
PAの相対的フイブリン特異性が問題になつている。この
理由は、ｔ−PAの主特性にある。即ち、この分子は、好
適な条件（高酵素濃度、長い露出時間、高い基質濃度、
至適pH及びイオン環境）下では、フイブリンの不存在下
でも、プラスミノーゲンをプラスミンに変える活性プロ
テアーゼである。これらの全ての条件は、ｔ−PAを用い
る現在の臨床標準治療に合致している。

フイブリン特異性の基準を満たす多くの特異性プラス
ミノーゲンアクチベータを求める研究の間に、ｖ−PAと
称されているフイブリン溶解活性を示す新規の天然物質
が発見された。

本発明は、オオコウモリ属（Desmodus spec.）のコウ
モリの唾液からの血栓溶解活性剤ｖ−PAに関し、これは
次の特性で識別される： −唾液腺cDNAバンクから、４種のｖ−PA蛋白質に関して
コードする次の４種のcDNAが発見された： （１）ｖ−PAα₁：フインガードメイン、EGF（上皮生長
因子）ドメイン、クリンゲル（Kringel）ドメイン、及
びプロテアーゼドメインより成る高分子量形（例18）、 （２）ｖ−PAα₂:v−PAα₁と同じドメインを有するが、
ヌクレオチド及びアミノ酸配列においてｖ−PAα₁とは
異なる高分子量形、 （３）ｖ−PAβ:EGFドメイン、クリンゲルドメイン及び
プロテアーゼドメインより成る分子形（例18） （４）ｖ−PAγ：クリンゲルドメイン及びプロテアーゼ
ドメインより成る低分子量形、 −この活性剤ｖ−PAα₁の主蛋白質バンドは、非還元条
件下でのドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動におい
て、分子量43000±2000を示す（例２）、 −活性剤ｖ−PAβの主蛋白質バンドは、非還元条件下で
のドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動において、分子
量39000±3000を示し、還元条件下で分子量43000±2000
を示す（例１）、 −活性剤ｖ−PAβの活性（activity）は、分子量40000
±3000を有して、ゲル濾過カラム（スペロース12;Super
ose12）から溶離される（例１）、 −活性剤ｖ−PAβの等電点（pI）は6.8〜8.5の範囲にあ
る、 −活性剤は³H−ジイソプロピルフルオロホスフエートと
反応し、従つて血清プロテアーゼである（例９）、 −活性剤ｖ−PAα₁及びｖ−PAβは、色原性ペプチド:S
−2288（Ｈ−Ｄ−Ile−Pro−Arg−pNA）及びＳ−2444
（＜Glu−Gly−Arg−pNA）を加水分解するが色原性ペプ
チドＳ−2251（Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Lys−pNA）を加水分
解しない（例16）、 −この活性剤は、４〜10.5のpH範囲では溶解素（lysi
n）セフアロース（Sepharose）（例14）に結合しない、 −活性剤ｖ−PAα₁及びｖ−PAβは、フイブリンプレー
ト上で溶解ハロ（lysis halos）を生ぜしめるがカゼイ
ンプレート上では生ぜしめない（例15）、 −活性剤ｖ−PAα₁及びｖ−PAβは、pH7.5でZn⁺⁺ケレー
トセフアロースに結合する（例１及び２）、 −活性剤ｖ−PAβは、促進剤例えばフイブリンの存在の
みでプラスミノーゲンを活性化するがフイブリノーゲン
の存在下では活性化しない（例７）、 −活性ｖ−PAβは、フイブリンモノマーの存在におい
て、プラスミノーゲンをプラスミンに変える際の典型的
なミハエリス−メンテン反応速度論には従がわず、ｖ−
PAβはアロステリツク特性を有する酵素である（例1
2）、 −活性剤は、試験管内で、濃度に依存して、ヒト全血ト
ロンビンを溶解する（例８）、 −再構成された試験管内で凝血可能な系において、活性
剤ｖ−PAβは、ｔ−PAとは対照的に、測定可能なフイブ
リノーゲン分解をもたらさない（例10）、 −試験管内フイブリン溶解テスト（International Clot
−Lysis Assay）で、この活性剤は濃度に応じてフイブ
リン溶解を起こさせる（例13）、 −活性剤ｖ−PAα₁及びｖ−PAβは、ヘパリン−セフア
ロース（Sepharose）に結合し、適当な溶液により、再
びそれから溶離されうる（例４）、 −活性剤は、種々のコチウ花科植物の種子から単離され
た固定化阻害剤に結合し、適当な溶液によりそれから再
び分離できる（例３）、 −活性剤ｖ−PAα₁及びｖ−PAβは、フイブリンセライ
トに結合し、適当な方法で再び溶離することができる
（例５）、 −活性剤は、特定の条件下にヒドロキシアパタイトに結
合し、燐酸塩含有緩衝液で再び溶離させることができる
（例２）、 −活性剤ｖ−PAα₁及びｖ−PAβは適当な方法で相互に
分離し、かつ単離することができる（例２、４及び
５）、 −活性剤ｖ−PAα₁及びｖ−PAβは、それらのＮ−末端
アミノ酸配列に関して相互に異なつている（例６）、 −活性剤ｖ−PAα₁及びｖ−PAβは、それらのアミノ酸
配列及びヌクレオチド配列に関して相互に異なつている
（例18）、 −これら活性剤のコード化配列は、相応するベクター
「セプタン（septan）」中に導入することができる。こ
れらは、適当な真核細胞系中で活性剤を表現する（例1
9）。

血栓溶解活性剤ｖ−PAは、人体内の血塊を溶解し、従
つて、例えば心臓梗塞の治療に好適である、天然由来の
新規プラスミノーゲンアクチベータである。

この剤は、オオコウモリ属の全てのコウモリの唾液中
に低濃度で発見され、おそらく、この種の動物の唾液腺
の細胞により発現されている。オオコウモリ属のコウモ
リには、アメリカ大陸の全ての種類のコウモリが包含さ
れる。中央アメリカ及びメキシコのオオコウモリ属は、
殊に徹底的な研究の対象となつた。

本発明は、請求の範囲第９項に記載の方法でオオコウ
モリ属の唾液から血栓溶解性ｖ−PAを単離するいくつか
の方法にも関し、これは、遠心分離された唾液を緩衝液
中に入れ、Zn⁺⁺キレートセフアロースカラムのクロマト
グラフイにかけ、このカラムの洗浄後にこの活性剤ｖ−
PAを定量的に溶離させ、集めたフラクシヨンを塩の不存
在下にスペロース12を通して濾過し、最後に、再び生理
食塩水の存在でゲル濾過させることよりなる。正確な方
法パラメータを後の例１に示す。

本発明は、更に、化合物ｖ−PA並びに慣用の助剤及び
賦形剤より成る医薬品に関する。

ｔ−PAと比較したこの新規血栓溶解剤の優秀性は、後
の例７、８、10及び15から引き出すことができる。

「実質的に純粋な」とは、蛋白質が、その活性が、天
然の蛋白質より著るしく増大される程度まで精製されて
いることを意味する。有利には、この蛋白質を精製して
均質にし、かつ、最も有利には少なくとも90％まで、殊
に95％以上の純度まで精製する。

本発明のDNA配列は、慣用法で、通常の即ち市場で入
手可能なベクター例えば、通常の、即ち市場で入手しう
るセルライン中での表現のために有用であるプラスミ
ド、フアージ等中に挿入することができる。

ｖ−PA配列を得るために特異的なオリゴヌクレオチド
プローブ（probe）は、通例、ｔ−PAとは異なるリーダ
ー領域又は完全配列中の配列を選択することにより構成
される（第27図の比較参照）。

前記のように、このプローブのDNA配列は、制限エン
ドヌクレアーゼBamHI及びAluIを用いる消化によりクロ
ーンvPAβから誘導されたcDNAライブラリイ（vPAβ）及
びｔ−PA cDNAクローンからの相応する配列（ｔ−PA）
のスクリーニングのために使用される。

抗体は、通例、例えば羊等の動物中でそれを生起させ
る常法により製造することもできる。

本発明のｖ−PAは、ヒトを包含する動物に、ｔ−PAの
使用と同様であるが、前記のようなｖ−PAの選択性に基
づく僅かな副作用を伴つて適用することができる。一般
に、ｔ−PAに必要である用量よりも低い量で使用可能で
ある。好適な活性は、通例、慣用のプロトコルを用いて
測定することができる。典型的な症状には、血栓溶解が
有用であるもの例えば心臓梗塞、発作、動脈血栓症等で
ある。薬物学的処方物の製造のために有用なガレヌス添
加剤を使用することができる。

例１ 吸血コウモリ（Desmoudus rotundus）からの唾液のバ
ツチ（主として分子形ｖ−PAβを含有）60mlの処理 ａ）Zn⁺⁺キレートセフアロース クロマトグラフイ 唾液60mlを４℃及び6000gで遠心分離する。上澄みを2
0mMトリス（pH7.5）/100mM NaCl/0.01％プルロニツクF6
8で調整し、キレートセフアロース200mlの充填されてい
るクロマトグラフイカラムに迅速流で導入し、10mMトリ
ス（pH7.5）/100mM NaCl/1mMイミダゾール/0.01％プル
ロニツクF68で均衡化させる。このカラムを、この緩衝
液で、280nmで測定される光学密度が基準線に達するま
で（約600ml）洗浄する。その後、このｖ−PAを10mMト
リス（pH7.5）/100mM NaCl/0.01％プルロニツクF68中の
１〜50mMイミダゾール勾配溶液で溶離させる（第１
図）。この精製工程を４℃で実施する。

ｂ）NaClを用いないゲル濾過 Z⁺⁺キレートセフアロース クロマトグラフイからの
ｖ−PA含有フラクシヨン5mlを、20mMトリス（pH8.0）/
0.01％プルロニツクF68中のスペロース（Superose）12H
R16/50クロマトグラフイカラム上から、FPLC系（pharma
cia）を用いて、クロマトグラフイにかけた（第２
図）。

この精製工程を用いて、フイブリン溶解活性を有しな
いプロテアーゼが分離される。ｖ−PA活性を有するフラ
クシヨンをプールする。

ｃ）NaClを用いるゲル濾過 前記のｖ−PAプール2mlを凍結乾燥により0.2mlまで濃
縮し、50mMトリス（pH8.0）/160mM NaCl/0.01％プルロ
ニツクF68中で、スペロース12HR10/30クロマトグラフイ
カラム（Pharmacia）を通して、FPLC系（Pharmacia）を
用いてクロマトグラフイにかける（第３図）。

ｖ−PAは、分子量約40000を有して均一で鋭いピーク
として溶離される。

この精製法の結果を第４図にまとめる。

第4A図は、鋭感な銀着色法を伴なう非還元SDSポリア
クリルアミドゲル電気泳動における各精製工程からの試
料を示している。第4B図は、ｖ−PAβが、DTTによるジ
サルフアイド橋の切断の間に、この分子は２個の蛋白質
バンドに分かれないので、１個の蛋白質連鎖より成るこ
とを示している。DTTによる蛋白質連鎖の線状化により
説明されうる分子量の明白な上昇が起こつている。

富化された活性の濃縮物を、８〜25％濃度の勾配ゲル
中での非還元条件下でのSDSゲル電気泳動にかける。こ
のゲルのいくつかを、銀で着色してその蛋白質を可視化
し、他をトリトン（Triton）Ｘ−100（１％）中で洗浄
してSDSを除き、プラスミノーゲンを含有するフイブリ
ンインジケータゲル（Fibrin−Zyymographie;Granelli
−Piperno A.及びReich E.,J.Exp.Med.148:223〜234、1
978）上に置く。

従つて、活性剤ｖ−PAβの活性（インジケータゲル中
での溶解暈輪により認識しうる）は、平均分子量39000
±3000を有する蛋白質バンドに関連している。この溶解
暈輪は、もつぱら、プラスミノーゲン−含有フイブリン
インジケータゲル上で検出できるが、プラスミノーゲン
不含のフイブリンインジケータゲル又はプラスミノーゲ
ン含有カゼインインジケータゲル上では検出できない。
同じ方法に供されたｔ−PAは、プラスミノーゲン含有カ
ゼインインジケータゲル中でも溶解ハロを形成する。

従つて、精製された活性剤ｖ−PAβの活性は、平均分
子量43000±2000（還元条件下にSDSポリアクリルアミド
電気泳動で、第4B図）を有する蛋白質と同じであり、プ
ラスミノーゲンをフイブリンの存在下にプラスミンに変
え、線維物質フイブリンを溶解させる。カゼインの存在
でもプラスミノーゲンを活性化することのできるｔ−PA
とは対照的に、ｖ−PAβは、カゼインの存在でプラスミ
ノーゲンをプラスミンに変換することは不可能である。

更に、本発明は、次の例に基づき特徴付けることがで
きる： 例２ 吸血コウモリ（Desmoudus rotundus）の唾液からのｖ
−PAα₁及びｖ−PAβの分離及び精製 （ａ）Zn⁺⁺キレートセフアロース クロマトグラフイ 唾液20mlを４℃、6000gで遠心する。上澄みを20mMト
リス（pH7.5）/100mM NaCl及び0.05％プルロニツクF68
で調整する。クロマトグラフイ管にZn⁺⁺キレートセフア
ロース（10mMトリス（pH7.5）/100mM NaCl/1mMイミダゾ
ール/0.05％プルロニツクF680.05％で平衡化された）8m
lを充填し、唾液上澄みをこの上からクロマトグラフィ
にかける。カラムを平衡化緩衝液で洗浄する。その後10
mMトリス（pH7.5）/1M NaCl/1mMイミダゾール/0.05％プ
ルロニツクF68を用いてまずｖ−PAα₁を溶離させる（こ
れはなお少量のｖ−PAβを含有する）（第５図）。次い
で、なお少量のｖ−PAα₁を含有するｖ−PAβを1mMトリ
ス（pH7.5）/100mM NaCl/0.05％プルロニツクF68中の１
〜5mMイミダゾール勾配溶液を用いて溶離させる。

（ｂ）ヒドロキシアパタイト クロマトグラフイ クロマトグラフイ用カラムにヒドロキシアパタイト8m
lを充填し、5mMトリス（pH8.0）/500mM NaCl/0.01％プ
ルロニツクF68で平衡化させる。Zn⁺⁺キレートクロマト
グラフイ（第５図）からのプールをヒドロキシアパタイ
トカラム上に通し、平衡化緩衝液で洗浄し、ｖ−PAを、
500mM NaCl/0.01％プルロニツクF68中の0.5〜100mM燐酸
ナトリウム勾配溶液で溶離させる（第６図）。活性フラ
クシヨンをプールする。

（ｃ）ゲル濾過 ヒドロキシアパタイト クロマトグラフイ（第６図）
からのプールを20mMトリス（pH8.0）/160mM NaClに対し
て透析させ、凍結乾燥により0.6mlまで濃縮する。この
濃縮物をFPLC系（Pharmacia）を用いてスペロース12HR1
6/50カラム上のクロマトグラフイにかける（第７図）。

このゲル濾過の活性フラクシヨンの濃縮物を、非還元
条件下のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて
分析し、その後、このゲルをクマシーブルー（Coomassi
e blue）で染色すると、分子量43000を有する蛋白質バ
ンドが可視になる（第８図）。

第８図から明らかなように、ｖ−PAα₁は他の蛋白質
を含有しない。この精製されたｖ−PAα₁も、例1cに記
載されているように、インジケータゲル（フイブリン
チモグラフイ）中で同じ分子量43000を有する溶解ハロ
を生じる。この溶解ハロも、もつぱらプラスミノーゲン
含有フイブリン インジケータゲル上に認められるが、
プラスミノーゲン含有カゼインインジケータゲル上には
認められない。

例３ ｖ−PAα₁及びｖ−PAβのエリトリナ・ラテイシマ（E
rythrina latissima:ETI）の種子からのトリプシン イ
ンジケータDE−３への結合及び溶離 ETI（Erytech Service LTD.Arcadia,South Africa）5
0mgを、製造者データに従つて、活性化されたCHセフア
ロース4B（pharmacia）6.6gに共有結合させる。1Mトリ
ス（pH6.8）を用いて、唾液16mlをpH7.5に調節し、４℃
及び6000gで10分間遠心させる。クロマトグラフイ管HR1
0/2（pharmacia）に、ETI CHセフアロース4B（前記参
照）2mlを充填する。FPLC系（pharmacia）を用いて、こ
の親和性クロマトグラフイ処理を行なう。このために、
唾液上澄みをETI CHセフアロース4B上に通し、20mMトリ
ス（pH7.5）/400mM NaCl/0.01％プルロニツクで充分に
洗浄する。溶離は20mMトリス（pH7.5）/400mM NaCl/1.6
M KSCN/0.01％プルロニツクF68を用いて行なう。この工
程の間に、フイブリン溶解活性及びアミド分解活性が１
蛋白質ピークと共に溶離される。

このクロマトグラフイを非還元条件下に、SDSポリア
クリルアミドゲル クロマトグラフイを用いて分析する
と、２つのｖ−PA形ｖ−PAα₁及びｖ−PAβが著るしく
濃縮されていることが確認できる。

この唾液のバツチ中に現われる２つの分子ｖ−PA形
は、前記条件下にETI−CHセフアロース4Bに結合し、1.6
M KSCN又は他のカオトロピツク（chao tropic）化合物
の存在で溶離させることができる。

例４ ヘパリンセフアロースへ活性剤ｖ−PAα₁及びｖ−PA
βの結合及び溶離 未充填FPLCカラム（HR5/5）にヘパリンセフアロース
（pharmaciia）1mlを充填する。ETI−CHセフアロース4B
クロマトグラフイからのフラクシヨン18（例３、第９図
及び第10図）を20mMトリス（pH7.5）/50mM NaCl/0.01％
プルロニツクF68に対して透析させ、PFLP系（pharmaci
a）を用いてヘパリンセフアロース上のクロマトグラフ
イにかける。透析物の装入の後に、カラムを20mMトリス
（pH7.2）/50mM NaCl/0.01％プルロニツクF68で洗浄
し、次いで、20mMトリス（pH7.2）/0.01％プルロニツク
F68中の50〜1000mM NaCl勾配溶液で溶離させる（第11
図）。

ヘパリンセフアロース クロマトグラフイを用いて、
例えば分子形ｖ−PAα₁及びｖ−PAβを結合しかつ溶離
させ即ち精製することが可能である。第11図及び第12図
から明らかなように、分子ｖ−PA形、ｖ−PAβは、ヘパ
リンセフアロースに分子ｖ−PAα₁形よりも弱く結合
し、即ち、ｖ−PAβの溶離のためには、ｖ−PAα₁の溶
離のために必要であるよりも低いNaCl濃度が適当であ
る。

従つて、この例に記載のクロマトグラフイ法を用いる
と、２種のｖ−PA形を相互に分離することが可能であ
る。

例５ 活性剤ｖ−PAα₁及びｖ−PAβのフイブリンセライト
（Celite）への結合及び溶離 親和性媒体フイブリンセライトは、公知方法で製造さ
れる（Husain,S.Lipinski、B.及びGurewich,V.のProc.N
atl.Acad.Sci.USA78、4265〜4269、1981）。このフイブ
リンセライト物質1mlをクロマトグラフイカラムHR5/5
（pharmacia）中に充填する。

ETI−CHセフアロース4Bクロマトグラフイ（例３、第
９図及び第10図）からのフラクシヨン17を20mMトリス
（pH8.0）/20mM NaCl/0.01％プルロニツクF68に対して
透析させ、フイブリンセライト上で、FPLC系（pharmaci
a）を用いてクロマトグラフイにかける。透析されたフ
ラクシヨンの適用の後に20mMトリス（pH8.0）/20mM NaC
l/0.01％プルロニツクF68を用いて洗浄し、こうして見
出された活性剤を20mMトリス（pH8.0）/0.01％プルロニ
ツクF68中の20〜1000mM NaClの勾配溶液で溶離させる
（第13図）。

ｖ−PA−含有フラクシヨンをSDSポリアクリルアミド
ゲル電気泳動に供する（第14図）。

活性剤ｖ−PAα₁及びｖ−PAβは、低いNaCl濃度で、
フイブリンセライトに結合し、再び緩衝液中のNaCl濃度
の増加により溶離されうる。この工程の間に、ｖ−PAβ
は明らかにｖ−PAα₁よりも弱くフイブリンセライトに
結合することが観察される。それというのも、ｖ−PAβ
とは対照的にｖ−PAα₁形は高いNaCl濃度でのみ溶離す
るからである。従つてこの精製法は、ｖ−PAβとｖ−PA
α₁との分離のためにも使用できる。

例６ 精製ｖ−PA形ｖ−PAα₁及びｖ−PAβのＮ−末端アミノ
酸配列分析 精製ｖ−PAα₁（例２、第８図）又は精製ｖ−PAβ
（例１、第４図）を含有するるフラクシヨンを、適当な
緩衝液に対する透析の後に、非還元条件下での12.5％ポ
クアクリルアミドゲル電気泳動にかける。電気泳動を行
なつた後に、このゲルを電気泳動装置から取り出し、慣
用方法（Matsudaira P.によるJ.Biol.Chem.262、10035
〜10038、1987年参照）により、ポリビニリデン ジフ
ルオリド膜（Immobilen,Millipore Corp.USA）に移す。
相応する蛋白質バンドを外科用メスで削り取り、オート
マチツク477Aプロテインシーケンサー/120Aアナライザ
ー（Applied Byiosystem USA）中で、Ｎ−末端アミノ酸
配列を直接測定する。この分析を繰り返し行なう。次に
示す配列が認められる： （Ｘ＝明白に測定されなかつた） このように測定された配列を用いて、吸血コウモリ
（Desmodus rotundus）の唾液腺から、cDNAバンクをス
クリーニングした（例18）。

例７ 例１により精製された活性剤ｖ−PAβとｔ−PAとのプラ
スミノーゲン活性の比較 特異的なプラスミノーゲンアクチベータ（PA）を適当
な高濃度のプラスミノーゲン（PLG）と共に、緩衝液環
境例えば50mMトリス（pH7.4）、20mM NaCl中、37℃でイ
ンキユベートすると、次の原理に従つてプラスミンが形
成される： こうして形成されたプラスミンは、このプロテアーゼ
に関して広範囲に特異的な色原性トリペプチドＨ−Ｄ−
Val−Leu−Lys−pNA（S2251）により検出されうる。こ
の反応は、次の原理に従つて進行する： pNA（ｐ−ニトロアニリン）の製造割合は、405nmで測
光法により測定でき、酵素プラスミンの濃度に比例す
る。この２つの原理を組み合せることにより、プラスミ
ノーゲンアクチベータの活性の表現であるプラスミンの
形成割合を測定することが可能である。第15図は、促進
剤フイブリノーゲン（凝血基質）及びフイブリン（溶解
されるべき血塊中の線維質）の不在及び存在下における
ｔ−PA及びｖ−PAのプラスミン形成割合を示している。

このテストは96穴マイクロ滴定プレート上で行なう。
各々の穴の容量は220μｌである。プラスミノーゲンの
濃度は0.5μＭ、Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Lys−pNAの濃度は
0.68mM、ｔ−PAの濃度は0.05IUであり、国際血塊溶解検
定法（International Clot−Lysis Assay;Gaffney,P.J.
Curtis,A.D.,Thrombos.Haemostas,53:134〜136、1985参
照）により測定されたｖ−PAの利用活性は、10倍高い、
即ち約0.5Uである。促進剤の濃度は約20μg/穴である。

従つて、ｔ−PAは、促進剤の不在でもプラスミノーゲ
ンをかつフイブリノーゲンの存在でも非常に高い活性化
割合で活性化する。この記載検定においては、ｖ−PAは
線維物質の存在下でもつぱらプラスミノーゲンを活性化
する。

例８ ｖ−PAα₁及びｖ−PAβの血栓溶解作用とｔ−PAのそれ
との比較 新規活性剤の血栓溶解作用を、新しく開発されたマイ
クロ−クロツト−リシスアツセイ（MCLA）により、ｔ−
PAと比較して検査する。それぞれ、新鮮なヒト全血100
μｌをマイクロ滴定プレートの穴の中にピペツトで入
れ、それぞれ凝血剤（“Thromborel",Behring−Werke）
10μｌと一緒にし、37℃で１時間インキユベートする。
生じた血塊を、これらを、遠心により予め得られた自然
存在の血漿100μｌと一緒にする前に燐酸塩緩衝塩化ナ
トリウム溶液（PBS）で２回洗浄する。この血漿を引続
きｔ−PA及びそれぞれ1.56〜12.5U/mlの濃度のｖ−PAと
一緒にする。このように処理されたマイクロ滴定プレー
トを湿気の多い室中、37℃で18時間貯蔵する。インキユ
ベーシヨン期間の経過後に、このプレートを振動台（Re
d Roter）上で振動し、その際、血漿標本を各々の穴か
ら取り出し、再蒸留水で1:6に稀釈し（溶解により放出
された赤血球細胞を破裂させる）、こうして放出された
赤血球色素をマイクロ滴定プレートフオトメータ中、49
2nmで測光法により測定する。

このテストの結果は、第16a図及び第16b図から明らか
である：標準ｔ−PAとの比較において、新規活性剤の均
等作用濃度（国際血塊溶解検定法で測定して）は、ｔ−
PAよりも良好にヒト全血血栓を溶解する。新規活性剤ｖ
−PAβの約3U/mlですら、このテストモデルで、著るし
い血栓溶解作用を示したが、ｔ−PA3Uでは対照との差を
示さない。

同様な実験でｔ−PA及びｖ−PAによりヒト全血血栓溶
解の時間依存性を調査する。

各々ｔ−PA及びｖ−PAの6.25U及び12.5Uを、前記系
中、37℃で23時間インキユベートする。15時間後に、試
料を２時間毎に取り出し、測光法テストのための記載の
ように調製する。結果を第17a図及び第17b図に示す。

血栓からの赤血球の放出として測定される血栓溶解の
開始は、ｔ−PAによるよりもこの活性物質により明らか
により迅速である。新規活性物質の6.25単位は、23時間
後にｔ−PAの２倍にも増大された血栓溶解を示している
（12.5単位）。

例９ セリンプロテアーゼは、特に活性部位滴定質ジイソプ
ロピルフルオロホスフエート（DIFP）と特異的に反応す
る この目的のために、活性剤をpH8.0に緩衝させ、1:20
の割合でプロピレングリコール中の3H−DIFPと混合す
る。このバツチを室温で１晩インキユベートする。この
バツチの少量を非還元条件下での12.5％SDSゲル上で分
離させる。次いで、このゲルを、アンプリフアイ（Ampl
ifiy Amersham）中、室温で30分インキユベートし、引
続き乾燥させる。次いでこのゲルを４日間露光し、引続
きこのＸ−線フイルムを現像させる。その中に配合され
た放射能標識されたDIFPを有するセリンプロテアーゼ
は、黒色バンドとしてこのフイルム上で可視になる（第
18図）。ｔ−PAは、例えば、見掛け上の分子量68000±5
000を有する僅かな黒色主バンドを生じ、これとは対照
的に、新規活性剤は、分子量39000±2000を有する強い
黒色主バンド（ｖ−PAβ）及び43000±2000での黒色バ
ンド（ｖ−PAα₁）を示す。

同じ電気泳動条件下で得られた対照ゲルを１％トリト
ンＸ−100で洗浄し、引続きフイブリン−及びプラスミ
ノーゲン含有インジケータゲル上に置く。電気泳動にか
けられた活性剤の活性の位置は、3H−DIFP標識セリンプ
ロテアーゼの黒色バンドと一致しており、この活性剤の
活性原理を表わしている。

例10 試験管内でのｔ−PA及びｖ−PAβのフイブリノーゲン
分解 ヒト血漿中、37℃でｔ−PAをインキユベートする際
に、凝固しうるフイブリノーゲンの濃度は時間に応じて
減少する。これは、ｔ−PAの相対的フイブリン特異性に
依り、この血栓溶解剤の特性である。凝固しうるヒトフ
イブリノーゲン3mgと50mMトリス（pH7.4）40mM NaClそ
れぞれ1mlから溶液を製造し、この溶液をヒトプラスミ
ノーゲン１μＭと一緒にする。バツチの少量分を、ｔ−
PA3.1U、6.25U及び12.5Uと一緒にし、かつそれぞれｖ−
PAの同じ活性と一緒にする。プラスミノーゲンアクチベ
ータ不含の第３のバツチを対照とする。各処置群当り各
々６バツチを使用すうる。プラスミノーゲンアクチベー
タの添加の直後に、全てのバツチからそれぞれ少量分を
取り出し、クラウスによる方法（Clauss.V.A.Acta Haem
atol.17:237〜246、1957参照）を用いて凝血しうるフイ
ブリノーゲンを測定する。この少量分の１部を更にゲル
電気泳動で分析する。更に、37℃でインキユベートされ
たこのバツチからの少量取り出し分を２、４及び６時間
後に得た。フイブリノーゲン測定の結果を第１表に示
す。

クラウスに依る凝血時間は秒で示されている。インキ
ユベーションの２時間後の早い時期に、ｔ−PA−含有バ
ツチのいずれも、凝血可能なフイブリノーゲンを示さ
ず、凝血時間は＞300秒であつた。これとは対照的に、
対照バツチ中でも新規活性剤と一緒にされたバツチ中で
も、フイブリノーゲン分解の徴候は認められない。この
実験は、ｔ−PAと比べた新規活性剤ｖ−PAβの充分に高
い（絶対的ではないとしても）フイブリン特異性を示し
ている。

ゲル電気泳動により実施された少量分の文責におい
て、更に、この新規活性剤を有するバツチ中のフイブリ
ノーゲンは、６時間のインキユベーションの後にも対照
バツチ中のフイブリノーゲンとは区別できないが、ｔ−
PAを有するバツチ中では、単に２時間後に、分解された
フイブリノーゲンが検出できた。

例11 種々のプラスミノーゲンアクチベータ及びｖ−PAα₁及
びｖ−PAβのフイブリン結合 試験容器中で、PBS/0.01％ツイーン80中のプラスミノ
ーゲン不含フイブリノーゲン（2mg/ml）100μｌ、種々
の濃度の相応するプラスミノーゲンアクチベータ10μｌ
及びトロンビン（0.3U）10μｌを37℃で10分間インキユ
ベートする。次いで、このように形成されたフイブリン
を10000gで５分間の遠心により除去し、上澄み中で残留
プラスミノーゲンアクチベータ活性を、フイブリンプレ
ート試験法により測定し、出発量と関連させた。これと
平行して、同じ条件下に、プラスミノーゲンアクチベー
タ溶液をフイブリン不含で製造する（対照：結合な
し）。

ｖ−PAα₁は、ｔ−PAと同様に良好なフイブリン結合
を示す（第19図）。これとは対照的に、ｖ−PAβは、ｖ
−PAα₁よりも著るしく弱いフイブリン親和性を示す。
ｖ−PAβにより示されるこのフイブリン親和性は、更に
強くNaCl濃度に依存する（第19図）。

例12 ｔ−PA及びｖ−PAβによるGlu−プラスミノーゲン作用
の比較反応速度論 （Ａ）１容器中で、プラスミノーゲンアクチベータ20μ
ｌ、2mMトリス（pH7.4）/600mM尿素中のフイブリンモノ
マー（60μg/ml）10μｌ、プラスミン不含のプラスミノ
ーゲン（全バツチ中の０〜６μＭの変動性濃度）50μｌ
を20mMトリス（pH7.4）及び20mMトリス（pH7.4）/0.01
％ツイイーン80 170μｌ中、37℃で撹拌下にインキユベ
ートする。

（Ｂ）付加的な試験管内で、それぞれ、水中の色原性の
プラスミン特異性基質S2251（3mM）100μｌ及び20mMト
リス（pH7.4）/180mM NaCl400μｌを37℃で準備する。

種々異なる時点で20μｌを（Ａ）から取り出し、管
（Ｂ）中に移し、37℃で更に１時間インキユベートし、
1Mクエン酸300μｌの添加により反応を停止させる。こ
のインキユベーテイングバツチ中に形成されたプラスミ
ンは、ｐ＝ニトロアニリンを放出を伴つて色原性基質S2
251のペプチド基を分離する。このｐ−ニトロアニソン
を、405nmで測光法により測定する。

前記の反応式と同様に、純粋プラスミンを用いて較正
曲線を作り、これから、こうして形成されたプラスミン
の濃度を直接計算することができる。

第20図（ｖ−PAβ）及び第21図（ｔ−PA）中に、前記
で得られたデータを示す。このために、プラスミン形成
割合ｖをプラスミン濃度に対してプロツトする。

ｔ−PAの場合には、典型的なミハエリスメンテンの反
応速度論が得られる。このｔ−PAデータをラインウエバ
ー−バーク（Lineweaver−Burk）プロツト中に移す（第
21図に挿入）と、直線が得られる。

ｖ−PAβデータをプロツトする際には、まつたく異な
る図が得られる。プラスミノーゲンアクチベータｖ−PA
βは、ｔ−PAのそれとは異なる反応速度特性を示す。得
られた曲線は、ミハエリスメンテンの反応速度論には従
がわず、むしろアロステリツク酵素の典型的な経過を示
し、ラインウエバーバークプロツトもアロステリツク酵
素の典型的な曲線を示す（第20図）。

ｔ−PAとは対照的であるプラスミノーゲンアクチベー
タｖ−PAβはアロステリツク酵素である。

例13 再構成血塊溶解系上でのｖ−PAβの作用（国際血塊溶解
検定） 純粋ヒトプラスミノーゲンは、一定量のヒトプラスミ
ノーゲン及び種々の濃度のプラスミノーゲンアクチベー
タの存在において、トロンビンに共に凝血させる。こう
して形成された血塊中で、プラスミノーゲンはプラスミ
ノーゲンアクチベータによりプラスミンに変えられ、こ
のプラスミンそのものは、血塊中の線維質フイブリンを
溶かす。トロンビンの添加と血塊の完全溶解との間の時
間を測定し、プラスミノーゲンアクチベータ濃度に対し
て二重対数的にプロツトする。前記原理に従つて、精製
された活性剤の緩衝溶液12.5〜100μｌを試験し、ｔ−P
Aの12.5〜100IUと比較する。結果を第22図で説明する。

新規活性剤ｖ−PAβは、ｔ−PAと比較して、平行な濃
度作用曲線を生じる。精製された活性剤の溶液の100μ
ｌは、この試験データによれば、ｔ−PA−比較可能活性
約40Uを有する。

試験の詳細： 凍結乾燥された試験トロンビン（Behring、Marburg）
を蒸溜水1ml中に溶かす。これは、30IU/mlの活性を生じ
る。ヒトプラスミノーゲン（Kabi、Munich）を2mM HCl
＋50％グリセリン＋PEG6000 5g/l中に溶かす。結果は、
10IU/mlの活性である。ヒトフイブリノーゲン（Kabi、M
unich）を、次の組成：KH₂PO₄1.605g/l、Na₂HPO₄・2H₂O
8.58g/l、ツイーン80 100l/l、HSA500mg/lを有する燐酸
塩緩衝液中の凝固しうる蛋白質2ml/lの濃度にする。標
準ｔ−PAを1000IU/mlの活性まで稀釈する。

プラスミノーゲン20μｌ＋トロンビン100μｌを試験
管内にピペツト装入し、37℃でインキユベートする。同
時にフイブノーゲン1ml及びプラスミノーゲンアクチベ
ータ12.5〜100μｌを加え、ストツプウオツチを始動さ
せる。２分後に、血塊上にガラスビーズ（直径6mm）を
置く。ガラスビーズが試験管の底に達したらストツプウ
オツチを止め、時間を記録する。

例14 溶解素（Lysin）セフアロース4Bへのｖ−PAβ及びｔ−P
Aの結合 プラスミンアクチベータを相応するpHにし、この条件
下で溶解素セフアロースで処理する。この溶解素セフア
ロースを充分に洗浄し、集めた上澄み中で活性を測定す
る。少量のｖ−PA用いては溶離実験は実施できなかつ
た。

例15 ｖ−PAβ及びｔ−PAのカゼイン溶解 プラスミノーゲンアクチベータの活性は、いわゆるフ
イブリンプレートテスト（Astrup T.及びMuellerのArc
h.Biochem.Biophys.40、346〜351、1952）により測定で
きる。プラスミノーゲンアクチベータを予め打ち抜かれ
た穴中で37℃でインキユベートする。プラスミノーゲン
の存在の場合には、こうして形成されたプラスミンはフ
イブリンを良好に溶解し、溶解暈輪が形成され、その直
径は使用プラスミノーゲンアクチベータの濃度に依り決
まる。フイブリン特異性プラスミノーゲンアクチベータ
から、これはフイブリン以外の蛋白質を攻撃しないこと
が予想される。これは、ここに記載の方法で、フイブリ
ンをカゼインに代えてプラスミノーゲンを用いて試験す
ることができる（第24図）。

第24図から明らかなように、ｖ−PAβは、ｔ−PAとは
対照的に、プラスミノーゲン含有カゼインプレート上で
何ら溶解ハロを示さない。これは、ｖ−PAβの絶対的フ
イブリン特異性を示している。

例16 プラスミノーゲンアクチベータｔ−PA、ウロキナーゼ、
及びｖ−PAα₁及びｖ−PAβの活性形を用いる種々のア
ミド分解性基質のKm値の測定 96穴プレート中で、各々100mMトリス（pH8.0）/100mM
NaCl/0.01％ツイーン80 90μｌ及び相応する色原性基
質（Kabi Vitrum,Stackholm.Swedenから）50μｌを、0.
03/0.06/0.1/0.3/0.6及び1mMの最終濃度で、相応するプ
ラスミノーゲンアクチベータ10μｌ（１穴当り３単位）
と共に37℃でインキユベートし、こうして放出されたｐ
−ニトロアニリン、０〜７時間の間の種々の時点で測光
法により405nmで測定する。得られるデータをラインウ
エバーバークプロツトを用いて評価し、Km値を測定する
（Segel.I.H.Enzyme Kinetics,John Wiley and Sons,Ne
w York）。次の色原性基質を用いた： 次のKm値（ｍモル/l）が測定された： 括弧内の値は、文献（Friedberger P.Scand.I.Clin.L
ab.Invest.42−追補1.62、1982）から採用した。

ｖ−PAα₁及びｖ−PAβの活性剤形は、ｔ−PAの場合
におけると同様なKm値を示している。ｖ−PAα₁、ｖ−P
Aβ及びｔ−PAは色原性基質Ｓ−2251での変換を示さな
い。

例17 吸血コウモリ（Desmodus rotundus）の唾液腺からの
プラスミノーゲンアクチベータに関するセグメントを用
いるcDNAクローンの単離及び特性化 1.cDNA遺伝子バンクの製造 吸血コオウモリの唾液腺からの全RNAを、グアニジニ
ウム インチオシアネート法に従つて単離する〔Chirgw
in,J.M.Przybyla,A.E.MacDonald,R.J.Rutter,W.J.,Bioc
hemistry18:5294〜5299（1979）〕。全RNA500μｇ、ポ
リA^t−RNA25μｇから、オリゴ（dt）セルロース アフ
イニテイ クロマトグラフイ〔Aviv,H.,Leder,P.Proc.N
atl.Acad.Sci.USA69:1408〜1412（1972）〕により単離
する。

cDNA合成は、ガブレル及びホフマンの方法〔Gubler,
U.Hoffmann,B.Gene25:263〜269（1983）〕で、フアルマ
シアLKBバイオテクノロオジイABのcDNAシンテツクスキ
ツト（cDNA Synthex Kit of Pharmacia LKB Biotechnol
ogy AB）を用いて行なう。個々の工程は正確に製造者に
よる指示に従つて行なう。EcoRIアダプター（１μｇ）
を用いて提供された二本鎖cDNAと、EcoRI−カツト、脱
ホスホリル化されたフアージベクターλgt10（４μｇ）
とを、T4−DNAリガーゼを用いて連結させる〔Huynh,T.
V.Young,A.Davis,R.W.によるPractical Approaches inB
iochemistry.中のDNA Cloning Volume 1、Glowen,D.M.I
RL Oxford,Washington,DC（1985）〕。このリガーゼバ
ツチを、パツケージングエクストラクツ（Gigapack II
Gold Packaging extracts of Stratagene,La Jolla,US
A）を用い、この製造者の指示に従つて伝染性フアージ
中にパツケージする。こうして得られた１次cDNA遺伝子
バンクは、組換えλフアージ１×10⁶を含有する。

2.ヒト組織特異性プラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−
PA）に関するcDNA遺伝子の³²P−ラベル配列を有するcDN
A遺伝子バンクのスクリーニング ニツクウトランスレーシヨン〔Maniatis,T.Fritsch,
E.F.Sambrook,J.,Molecular Cloning,A Laboratory Man
ual（Cold Spring Harbor Laboratory,New York198
2）〕により放射能ラベルされたｔ−PA cDNA配列〔Fish
er,R.Waller,E.K.Grossi,G.Thompson,D.Tizard,R.及びS
chleuning,W.DのJ.Biol.Chem,260;11223〜11230（198
5）〕を、吸血コウモリ唾液プラスミノーゲンアクチベ
ータcDNAの同定用のプローブ（probe）として使用す
る。合計50000の組換えλフアージのDNAを、レプリカ
（Replica）膜（Gene Screen Plus,Du Pont de Nemour
s,NEN−Research Productsの登録商標）に転移させる。

この膜の処理及びハイブリド形成溶液の組成は、製造
者により提供されたデータに依る。このハイブリド形成
及び洗浄の温度は42℃である。最終洗浄工程を４×SSC
緩衝液中で行なう。

スクリーニングされた組換えフアージ50000から、陽
性クローン11が単離された。

3.陽性クローンのcDNAの特性化 陽性クローンのcDNA挿入を、標準法に従つて、市場で
入手される配列決定ベクターM13mp18及びM13mp19中に転
移クローニングさせ〔Messing,J.のMeth.Enzymol.101:2
0〜769（1983）〕、ジデオキシヌクレオチド法〔Sange
r,F.Nicklen,S.Coulson,A.R.のProc.Natl.Acad.Sci.USA
74、5463〜5467（1977）〕に従つて配列決定する。ヒト
ｔ−PAに関するcDNA遺伝子のヌクレオチド配列との個々
のクローンのヌクレオチド配列の比較〔Pennica,D.Holm
es,W.E.,Kohr,W.J.Harkins,R.N.,Vehar,G.A.Ward,C.A.,
Bennet,W.F.,Yelverton,E.,Seeburg,P.H.,Heyneker,H.
L.及びGoeddel,D.V.のNature303、214〜221（1983）〕
により、高度の配列同一性（＞80％）が達成される。誘
導された蛋白質配列も、ヒトｔ−PAの部分との高い配列
同一性（＞70％）を示す。いずれのクローンも、完全な
吸血コウモリプラスミノーゲンアクチベータ遺伝子に関
するcDNAを含有しない。これらのクローンの１つの部分
配列は、吸血コウモリの唾液腺からの更なるcDNA遺伝子
バンクをスクリーニングするための試料として役立つ
（例18）。

例18 吸血コウモリの唾液腺からのプラスミノーゲンアクチベ
ータの完全cDNAクローンの単離、特性化及び配列決定 1.吸血コウモリの唾液腺RNAからのcDNA遺伝子バンクの
製造 グアニジニウム イソチオシアネートを用いる消化及
び引続く塩化セシウムクツシヨン（１）を用いる超遠心
により、吸血コウモリ（D.rotundus）の唾液腺から全RN
Aを単離する。凍結乾燥された全RNA3mgから、オリゴ−
デオキシ−チミジンセルロース（2,3）上での親和クロ
マトグラフイの２回実施によりポリA⁺RNA80μｇが得ら
れる。この調製物５μｇを、ガブレル及びホフマンの方
法（４）の変法（ZAP−cDNA Synthesis Kit,Strategen
e）（5,6）に従がうcDNA合成のために使用する。第１の
連鎖の合成を、オリゴ−デオキシチミジン部分を含有す
るオリゴヌクレオチド及び制限エンドヌクレアーゼXhoI
（６）の認識配列を用いて開始させ、５−メチルデオキ
シシチジンの使用を伴なうモロネイ（Moloney）マウス
白血病ウイルスの逆転写により実施する。第２の連鎖
を、E.コリ−リボヌクレアーゼＨの存在でE.コリ−DNA
ポリメラーゼＩにより合成する。こうして形成された二
本鎖cDNAの末端をT4DNAポリメラーゼで平坦化させ、次
いでT4DNAリガーゼを用いてEcoRIアダプタに連結させ
る。生成DNA末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼを用い
てホスホリル化する。制限酵素XhoIでのcDNAの消化の後
に、セフアロースCL−4B（pharmacia）上でのゲル濾過
を実施する。500塩基対の最小寸法を有するcDNA含有フ
ラクシヨンを集めると、収量はcDNA約1.2μｇである。
この量の1/3を、スタラタジエン社（Stratagen;La Joll
a USA）（5,7）のバクテリオフアージベクターUni−ZAP
（TM）XR（特許出願中）のEcoRI−XhoIで制限消化さ
れ、脱ホスホリル化されたアーム３μｇと連結させる。
この連結バツチをギガパツクIIゴールドパツケージング
エクストラクツ（Gigapack II Gold Packaging extract
s;Stratagene）（８）を用いて７個の別個のバツチにパ
ツケージする。こうして、１次cDNA遺伝子バンクが、組
換えλバクテリオフアージ４×10⁶以上を有して得られ
る。

2.吸血コウモリの唾液からのプラスミノーゲンアクチベ
ータのcDNAクローンの同定 完全cDNAクローンの同定のために使用されるプローブ
は、第1cDNA遺伝子バンクから単離されたクローンの
５′−末端から76塩基対の長さ（第26C図のヌクレオチ
ド141〜216）のAluI−BamHI制限消化により生成されたD
NAフラグメントである（例17参照）。このフラグメント
を〔α−³²P〕デオキシアデノシン三燐酸の存在でのニ
ツクトランスレーシヨン（ａ）により放射能ラベリング
し、１次cDNA遺伝子バンクの組換えバクテリオフアージ
合計1.2×10⁵のDNAが固定されているレプリカフイルタ
ーのハイブリド形成のために使用する（10）。ハイブリ
ド形成及び洗浄温度は50℃である。最終洗浄工程は２×
SSC緩衝液中で行なう（10）。レプリカフイルターのオ
ートラジオグラフイで信号を発生した200以上のクロー
ンのうち、50クローンを分離プレーテイングアウト及び
前記プラークフイルターハイブリド形成の繰り反しによ
り精製する。こうして、38クローンが単離され、これ
は、第２スクリーングで明白な陽性信号を生じる。

3.cDNAクローンの特性化及び配列決定 バクテリオフアージの同じセグメント中に組込まれた
cDNAフラグメントを包含する単離された陽性Unit ZAP
（TM）XRバクテリオフアージクローン中に含有されてい
るプラスミドｐブルースクリプト（pBluscript）SKを、
いわゆる生体内切出し（7,14）によりバクテリオフアー
ジから取り出し、こうして、陽性バクテリオフアージク
ローンを基幹とする種々のｐブルースクリストSKプラス
ミドクローン合計35が得られる。このプラスミドを、ビ
ルンボイム（Birnboim）及びドリイ（Doly）の方法（1
1）に従つて単離し、それらのcDNA分を、酵素BamHI及び
PstIを用いる制限分析（第25図）及び５′−末端のDNA
配列決定に従つて４クラスα₁，α₂β，γに分ける。全
４クラスの最長cDNAクローンのcDNA分をバクテリオフア
ージベクターM13mp 19にサブクローニングし（12）、か
つサンガー（Sanger）によるジデオキシヌクレオチド法
（Sequenase kit,United States Biochemical Corporat
ion,Cleveland.USA）（13,15）で、部分的にオリゴヌク
レオチドプライマー（これは、殊にこの目的のために合
成され、cDNAプロポーシヨンの配列に対し相補的であ
る）を用いて配列決定する。このように誘導された蛋白
質配列を有する完全cDNA配列（３′−末端に存在するポ
リＡ連鎖の短セグメントを包含）を第26a図、第26b図、
第26c図及び第26d図に示す。

1.Chirgwin,J.M.,Przbyla,A.E.,MacDonald,R.J.Rutter,
W.J.,Biochemistry 18,52−94−5299（1979）． 2.Scnwab,M.,Alitalo,K.,Varmus,M.E.,Bishop,J.M.,Nat
ure 303,497−501（1983）． 3.Pharmacia LKB Biotechnology AB,mRNA Purification
Kit−Instructions,1−16（no year given） 4.Gubler,U.,Hoffman,B.,Gene 25,253−259（1963）． 5.Huse.W.D.,Hansen,C.,Strategies 1,1−３（1989）． 6.Firma Stratagene,ZAP−cDNA−（TM）Synthesis Kit
−Instruction Manual,1−21（1989）． 7.Firma Stratagene,Uni−ZAP（TM）XR Cloning Kit−I
nstruction Manual,1−11（1989）． 8.Firma Stratagene,Gigapack II Gold Packaging Extr
act−Instruction Manual,1−５（1989） 9.Maniatis,T.Fritsch,E.F.,Sambrook,J.,Molecular Cl
oning,A Laboratory Manual（Cold Spring HarborLabor
atory,New York,（1982） 10.Du Pont deNemours,NEN Research Products,Colony/
plaqueScreen,Hybridization Transfer Membrane−Dire
ctions,1−11（no year） 11.Birnboim,H.C.,Doly,J.,Nucleic Acids Res.7,1513
−1523（1979）． 12.Messing,J.,Meth.Enzymol.101,20−79（1983）． 13.Sanger,F.,Nicklen,S.,Coulson,A.R.,Proc.Natl.Aca
d,Sci.USA 74,5463−5467（1977）． 14.Short,J.M.,Fernandez,J.M.Sorge,J.M.,Huse,W,D.,N
ucleic Acids Res.16,7583−7600（1988）． 15.Unites States Biochemical Corporation,Step−By
−Step Protocols For DNA Sequencing with Sequenase
Version 2.0,1−21（1988）． 制限酵素BamHI（Ｂ）、PstI（Ｐ）又はこれら２種の
制限酵素（BP）で消化されたこのプラスミドDNAプレパ
レーシヨンを1.8％アガロースゲン上で分離した。この
寸法に関連する「ものさし」は、プラスミドpB322（M,B
oehringer−Mannheim社のDNA分子量マーカー５）で表現
され、制限酵素HaeIIIで消化された。明白に可視のフラ
グメントの寸法は、587、540、504、458、434、267、23
4、213、192〜184及び123塩基対（上から下方へ）であ
る。電気泳動分離後に、このアガロースゲルをエチジウ
ムブロミドで着色し、写真撮影した。この群α₁及びβ
から、残りの多くの写真撮影されたクローンはそれぞれ
配列決定された。

第26a図：誘導されたアミノ酸配列を伴なうα₁群の最長
プラスミドクローンのcDNA挿入の完全DNA配列。コード
化配列はヌクレオチド94（ATG−−−−）から開始し、
ヌクレオチド1527（−−−−TAA）のストツプコドンで
終つている。この誘導されたアミノ酸配列は、単一文字
コードで示されており、各々のアミノ酸のトリプレツト
の最初のヌクレオチド（これによりコードされている）
の下にある。

第26b図：誘導されたアミノ酸配列を有するα₂型のプラ
スミドクローンのcDNA挿入の完全DNA配列。このコード
化配列は、ヌクレオチド85（ATG−−−）で開始し、ヌ
クレオチド1518（−−−TAA）のストツプコドンの所で
終つている。この誘導されたアミノ酸配列は、単一文字
コードで示されており、各々のアミノ酸はトリプレツト
の最初のヌクレオチド（これによりコードされている）
の下にある。

第26c図：誘導されたアミノ酸配列を有するβ群の最長
プラスミドクローンのcDNA挿入の完全DNA配列。このコ
ード化配列はヌクレオチド117（ATG−−−）で開始し、
ヌクレオチド1412（−−−TAA）のストツプコドンで終
つている。誘導されたアミノ酸配列は、単一文字コード
を示されており、各々のアミノ酸はトリプレツトの最初
のヌクレオチド（これによりコードされている）の下に
ある。

第26d図：誘導されたアミノ酸配列を有するγ−型のプ
ラスミドクローンのcDNA挿入の完全DNA配列。このコー
ド化配列はヌクレオチド180（ATG−−−）で開始し、ヌ
クレオチド1364（−−−TAA）の所のストツプコドンで
終つている。誘導されたアミノ酸配列は、単一文字コー
ドで示されており、各々のアミノ酸はトリプレツトの最
初のヌクレオチド（これによりコード化されている）の
下にある。

例19 活性剤ｔ−PAのコード化配列を含有する発現ベクターの
構造及び卵母細胞中へマイクロインジエクトすることに
よるこれの試験 α₁、α₂、β及びγ形のｖ−PAのcDNAクローンからの
コード化配列を、制限エンドヌクレアーゼEcoRIを用い
る開裂により、かつE.コリーDNAポリメラーゼＩのクレ
ノフフラグメントでの後処理及び低融点アガロースゲル
からの単離の後に得、E.コリーDNAポリメラーゼＩのク
レノフフラグメントにより充填されたベクターpSVL−Ec
oRI^-のXbaI部位内に連結させ、牛の腸ホスフアターゼ
（Boehringer Mannheim）で処理する。

この正しい配列をBamHIでテストする。pSVL−EcoRI
は、市場で入手しうるSV40発現プラスミドpSVLの誘導体
（pharmacia）を包含する。

こうして得られた発現ベクターを塩化セシウム勾配上
で精製し、キセノプス・ラエヴイス（Xenopus laevis）
卵母細胞中へのマイクロインジエクシヨンのために使用
する。

卵母細胞インジエクシヨンは次の文献に従つて実施し
た： 1.Gurdon,J.B.,and Wakefield,L.,in“Microinjection
and Organelle Transplantion Techniques",eds.Celis,
J.E.,Graessmann,A.,and Loyter,A.,Academic Press,Lo
ndon,1986. 2.Colman,A.,in“Transcription and Translation−A P
ractical Approach",eds.Hames,R.J.,and Higgins,S.
J.,IRL−Press Oxford,1984. 3.Langer,G.,“Analyse des Drosophila Ul SURNA Pro
motors in homologen in vitro und heterologen in vi
tro Transkriptionssystemen";Ph.D.Thesis,University
of Kaiserslautern,1987. ｖ−PA発現ベクターでインジエクトされた卵母細胞
を、バース（Barth）培地（文献２）を用いて製造され
たフイブリンプレート中に埋封した後に、溶解ハロが得
られる。フイブリンプレートの代りにカゼインプレート
を用いると、溶解は起こらない（α₁、α₂、β）。ｖ−
PA配列を含有しないベクターでインジエクトされた卵母
細胞は、溶解ハロを示さない。

このｖ−PA cNA配列は、ｖ−PA蛋白質を細胞外に送出
するために応答する機能性信号ペプチド配列を含有す
る。

これらの結果は、こうして得られたｖ−PA cDNAクロ
ーンが完全であり、適当な発現ベクター内への導入の後
に、絶対的にフイブリン特異性である活性作用剤を生じ
ることを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シュロイニング，ヴォルフ―ディーター ドイツ連邦共和国 デー―1000 ベルリ ン 20 アム ピッヒェルゼー 36アー (72)発明者 アラゴン，アレハンドロ メキシコ国 モレロス 62271 ケルナ バッカ （番地なし) (72)発明者 ボイドル，ヴェルナー ドイツ連邦共和国 デー―1000 ベルリ ン 31 ナッサウイッシェ シュトラー セ 16アー (72)発明者 クレッチュマー，イェルン ライナー ドイツ連邦共和国 デー―1000 ベルリ ン 30 フュルター シュトラーセ ５ (72)発明者 ヘントラー，ベルナルト ヤッケス ドイツ連邦共和国 デー―1000 ベルリ ン 19 フリートベルクシュトラーセ 34 (72)発明者 ランガー，ゲルノット ドイツ連邦共和国 デー―1000 ベルリ ン 21 ヴィルヘルムハーフェナー シ ュトラーセ 63 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/58 C12N 9/64 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ（ｇｅｎｅｓ ｅｑ)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】フィブリンの存在下であるがフィブリノー
   ゲンの不存在下に血栓溶解性の活性プラスミノーゲンで
   あり、アロステリックである実質的に純粋な蛋白質にお
   いて、この蛋白質は、第26a図： のアミノ酸配列を有するｖ−PAα１であることを特徴と
   する、実質的に純粋な蛋白質。
2. 【請求項２】前記第26a図のヌクレオチド配列を有する
   請求項１に記載の蛋白質をコード化する単離されたDN
   A。
3. 【請求項３】請求項２に記載のDNAを有するベクターで
   形質変換された微生物。
4. 【請求項４】請求項３に記載の微生物中でｖ−PAα１を
   コード化するDNAを発現させることよりなる、ｖ−PAα
   １の製法。
5. 【請求項５】Ｎ−末端アミノ酸配列Ala・Tyr・Gly・Val
   ・Alaを有する請求項１に記載の実質的に純粋な蛋白
   質。
6. 【請求項６】Ｎ−末端アミノ酸配列Ala・Tyr・Gly・Val
   ・Ala・Cys・Lys・Asp・Glu・Ile・Thr・Gln・Met・Thr
   ・Tyr・Argを有する、請求項１に記載の実質的に純粋な
   蛋白質。
7. 【請求項７】請求項１、２、５及び６のいずれか１項に
   記載の化合物を主剤とし、慣用の助剤及び賦形剤を含有
   する血栓溶解剤。
8. 【請求項８】前記第26a図のアミノ酸配列を有する蛋白
   質をコード化するDNAを有するベクターで形質変換され
   た微生物中のｖ−PAα１をコード化するDNAを発現させ
   ることよりなるｖ−PAα１の製造法において、この蛋白
   質はフィブリンの存在下ではあるが実質的にフィブリノ
   ーゲンの不存在下で血栓溶解性の活性プラスミノーゲン
   であり、アロステリックであることを特徴とする、ｖ−
   PAα１の製造法。
9. 【請求項９】前記第26a図のアミノ酸配列を有する蛋白
   質をコード化するDNAを有するベクターで形質変換され
   た微生物中のｖ−PAα１をコード化するDNAを発現させ
   ることよりなるｖ−PAα１の製造法において、この蛋白
   質はフィブリンの存在下ではあるが実質的にフィブリノ
   ーゲンの不存在下で血栓溶解性の活性プラスミノーゲン
   であり、アロステリックであり、かつこの蛋白質はＮ−
   末端アミノ酸配列Ala・Tyr・Gly・Val・Alaを有するこ
   とを特徴とする、ｖ−PAα１の製造法。
10. 【請求項１０】請求項８又は９に記載の方法で製造され
    単離された化合物を慣用の助剤及び賦形剤と共に含有す
    る血栓溶解剤。