KR20220058839A - 중대가리풀 유래의 추출물을 포함하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
중대가리풀 유래의 추출물을 포함하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물이 개시된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물은, 브레빌린 A(Brevilin A), 아르니콜라이드 D(Arnicolide D), 아르니콜라이드 C(Arnicolide C) 및 마이크로헬레닌 C(Microhelenin C)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 중대가리풀(Centipeda minima) 추출물을 포함한다.
Description
본 발명은 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 중대가리풀 유래의 추출물로서 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C를 유효성분으로 포함하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
자가면역 질환은 면역세포가 자기 몸의 장기나 조직을 공격하여 발생하는 질환으로서, 면역 불균형 또는 자기 항원에 대한 내성 상실로 야기된다. 자가 면역 질환은 체액성 면역, 세포성 면역 또는 양쪽 모두에 의해 세포나 조직에 손상을 초래하는 것으로, 이처럼 면역계의 자가 항원(autoantigen)에 대한 부적절한 반응을 자가 면역이라고 한다. 자가 면역 질환은 자가 면역 반응이 표적으로 삼는 수많은 분자, 세포 및 조직들과 관련이 있으며, 표적 항원의 분포에 따라 전신성이거나 특정 장기에 특이적으로 나타날 수 있다. 예를 들면, 전신홍반성낭창(systemic lupus erythematosus; SLE), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis; RA), 그리고 다발성 경화증(multiple sclerosis; MS)은 전신성 자가 면역질환이다. 또한, 원형탈모(alopecia areata)는 전세계적으로 성별, 나이, 머리카락 색깔을 가리지 않고, 고르지 못한 탈모를 나타나는 자가면역 질환 질환으로, 원형탈모는 전세계적으로 약 0.1 내지 0.2%의 유병율을 나타낸다.
자가면역계 질환에 대한 면역억제제로 토파시티닙이 널리 사용되고 있다.
토파시티닙 {3-((3R,4R)-4-메틸-3-(메틸(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노)피페리딘-1-일)-3-옥소프로판나이트릴}은 하기 화학식으로 표시되는 화합물이다. 상기 토파시티닙은 국제특허공개공보 제2001/042246호에 최초로 개시되어 있다.
토파시티닙은 합성 JAK(janus kinase) 억제제로서, 야누스 인산화효소(Janus kinase, JAK)는 인산기의 전이를 촉매하는 효소 중 한 종류이다. 면역 세포가 분비하는 단백질인 싸인토카인은 싸이토카인 수용체와 결합하면서 신호전달이 세포내로 전해지는데, 싸이토카인 수용체는 TYK2, JAK1, JAK2와 JAK3과 같은 야누스 인산화효소와 결합한다.
싸이토카인이 싸이토카인 수용체와 결합하면 JAK에서 인산화 반응이 일어나고 STAT(signal transducer and activator of transcription)을 활성화시키며, 조혈 작용, 염증 반응, 면역 반응을 나타나도록 신호전달이 이어지는데, 싸이토카인 과잉 생산에 따른 과면역 반응이 발생하는 자가면역계 질환에 있어서, 싸이토카인이 결합하는 싸이토카인의 수용체의 인산화 효소를 억제하는 것이 JAK 억제제이다.
다만, 토파시티닙 뿐만 아니라 동일 계열의 JAKI, JAK 억제제들은 합성의약품으로 원재료의 확인된 수많은 부작용으로 인하여 안전성을 담보할 수 없으며, 전문의약품으로 개발되어 환자 접근성이 떨어지며 의약품 용도로만 한정되어 있고 경구투여로 한정되며 장기간 복용시 면역저하에 따른 심각한 감염증(코인두염, 위장염, 상기도 감염) 및 장 천공이 발생하며, 콜레스테롤 수치 상승, 두통, 발진, 대상포진, 빈혈 등이 발생하는 문제점이 있다. 뿐만 아니라, 토파시티닙은 1일 처방향 10mg/day 기준으로 국내 건강보험이 미적용시 한달에 약 600만원으로 고비용이 발생하게 되는 문제가 있다.
지방간은 간 내 과도한 지방, 주로 중성지방이 쌓여서 발생되는데 일반적으로 간 무게의 5%이상의 지방이 쌓이게 되면 지방간으로 진단한다. 지방간은 알코올 지방간과 비만, 당뇨, 고지혈증 등과 연관되어 발생되는 비알콜성 지방간으로 나눌 수 있다. 비알코올 지방간(NASH, non-alcoholic steatohepatitis)은 비만, 성인형 당뇨병, 고지혈증 등의 대사증후군과 연관되어 나타나는데, 과도한 열량을 계속 섭취하게 되면 체내 지방세포 및 간에 지방이 축적되고 증가된 지방에서 간에 해로운 여러가지 물질(사이토카인)이 분비되어 지방간염과 간경변증으로 진행되며, 이 외에도 스테로이드, 소염진통제, 심장약 등의 약물이나 일부 한약 혹은 여러 가지 민간요법으로도 지방간이 될 수 있다.
중대가리풀(Centipeda minima, 토방풀)은 국화과에 딸린 한해살이풀이다. 중국에서는 민간에서 만성비염을 비롯한 콧병·눈병 및 두통 치료에 사용한다. 또한 잎과 줄기를 그대로 비벼서 콧구멍에 넣고 하룻밤을 지내면 만성 말라리아에 효과가 있다. 인도에서는 눈병·콧병 및 치통에 사용한다. 한국·일본·중국·인도·오스트레일리아·시베리아 동부·북아메리카 등지에 분포한다. 중대가리풀을 원료로 하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환에 대한 효능에 대하여 알려진 바가 없으며 연구가 필요한 실정이다.
천연 원료로부터 천연 유효 성분은 추출되어 선별되는데, 일반적인 추출 방법으로 원료가 고체인 경우 고-액 추출 방법을 사용하며, 원료가 액체인 경우 액-액 추출 방법을 사용한다. 액-액 추출 방법(liquid-liquid extraction; LLE)은 용질을 함유하고 있는 액체 혼합물에 용제를 작용시켜 혼합물 중의 특정 성분을 다른 성분들로부터 분리하는 것이다.
일반적으로 액-액 추출 방법이 사용되며, 액-액 추출시 핵산(hexane), 클로로포름(methane dichloride), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 등과 같이 비극성 용매는 독성이 매우 강하며, 반복적인 여러 추출 과정 그리고 비극성 용매 제거를 위한 건조 과정에 의하여 추출 과정이 매우 비효율적이고 복잡하며 공정이 길고, 추출 효율이 낮고 공정이 길어짐에 따라 높은 생산 단가를 나타내는 문제점이 있다.
예를 들어, 중대가리풀(Centipeda minima)로부터 Brevilin A를 추출하기 위한 과정은, 원료를 메탄올로 복수 회에 걸쳐 추출하고, 추출액에 헥산을 혼합하여 분획 복수 회, 클로로포름을 혼합하여 분획 복수 회, 에틸아세테이트를 혼합하여 분획 복수 회, 부틸알코올을 혼합하여 분획 복수 회를 통하여 추출하며, 추출시 중대가리풀 건조 중량 300g에서 Brevilin A는 25mg 정도 추출되어 그 추출량이 극미량으로 효율이 매우 낮다(비특허문헌1).
이에 따라, 극미량의 유효 성분에 대한 추출량을 극대화시킬 수 있는 최적의 추출 방법이 요구되며, 이는 본 출원인의 출원인 대한민국 특허공개공보 제10-2020-0085024호의 추출법에 의하여 추출될 수 있다.
이에 본 발명자는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물을 연구하던 중, 중대가리풀 유래의 추출물로서 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C를 유효성분으로 포함하는 최적의 추출 방법으로 추출된 조성물이 부작용이 적으면서 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환에 효과가 있음을 알게 되어 발명을 완성하였다.
Arch Pharm Res Vol 29, No 1, 64-66, 2006.
본 발명의 실시예들은 중대가리풀 유래의 추출물로서 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C를 유효성분으로 포함하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물은 하기 화학식의 브레빌린 A(Brevilin A), 아르니콜라이드 D(Arnicolide D), 아르니콜라이드 C(Arnicolide C) 및 마이크로헬레닌 C(Microhelenin C)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 중대가리풀(Centipeda minima) 추출물을 포함한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 브레빌린 A는 JAK-STAT 신호전달과정을 저해 또는 억제하며, 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C는 사이토카인-사이토카인 수용체 상호 작용(cytokine-cytokine receptor interaction), MAPK 신호 경로(MAPK signaling pathway) 및 PI3K-AKT 신호 경로(PI3K-AKT signaling pathway)를 저해 또는 억제하며, 상기 중대가리풀 추출물은 WNT 신호전달경로(WNT/β-catenin pathway)를 활성화하는 것을 특징으로 하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 브레빌린 A의 함량은 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C의 총함량보다 2배 이상인 것을 특징으로 하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 중대가리풀 추출물은, 30 내지 90중량%의 상기 브레빌린 A; 0 내지 30중량%의 상기 아르니콜라이드 D; 0 내지 30중량%의 상기 아르니콜라이드 C; 및 0 내지 15중량%의 상기 마이크로헬레닌 C를 포함하는 것을 특징으로 하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 중대가리풀 추출물은 중대가리풀 원료를 추출하여 1차 추출액을 제조하는 단계; 1차 추출액에 친유성 가용화제 및 물을 포함하는 상분리 조성물을 혼합하여 2차 추출하는 단계; 및 상분리된 용액의 상층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득하는 단계를 포함하는 추출 방법에 따라 추출된 것을 특징으로 하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물은 친유성 가용화제, 계면활성제 및 물로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 친유성 가용화제는 BRIJ 010-SS-(RB), Capryol 90, Capryol PGMC, Gantrez ES-435, Gantrez S-97 BF, Gelucire 43/01, Gelucire 44/14, Gelucire 50/13, Gelucire 48/16, Labrafac CC, Labrafac Lipophile WL1349, Labrafac PG, Labrafil M 1944 CS, Labrafil M 2125 CS, Labrafil M 2130 CS, Lauroglycol 90, Lauroglycol FCC, Monosteol, Peceol, Pharmasolve, Plurol Oleique CC497, Span 20-LQ-(SG), Span 60-PA-(SG), upper Refined Oleic Acid-LQ-(JP), Super Refined Tween 80A-LQ-(MH), Surfadone LP-300, Transcutol HP, Transcutol P, TWEEN 60-SS-(SG), TWEEN 80 HP-LQ-(MH), TWEEN 80-LQ-(SG), Vitamin E TPGS, Miglyol 812 및 captax 355로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 계면활성제는 Labrasol, Crodex A-PA-(RB), Geleol, Gelot 64, Suppocire AS2X, Suppocire BML, Synperonic PE/F 127, Synperonic PE/L 44 및 Tefose 63로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환은 탈모, 원형탈모, 류마티스 관절염, 건선, 아토피, 습진, 지루성 피부염, 피부경화증, 피부면역 과민증, 다발성 경화증, 루푸스, 베체트병, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 크론병 및 염증성 장질환으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제는 상기의 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물을 포함한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물, 조성물 총중량에 대하여 상기 중대가리풀 추출물을 0.1 내지 90중량%로 포함하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제를 제공한다.
본 발명의 실시예들은 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로 기존 합성의약품인 자가면역 질환 치료제인 토파시티닙 대비 천연 추출물을 이용하는 것으로 원재료의 안전성을 담보할 수 있을 뿐만 아니라, 기존에 중대가리풀 추출물로 알려진 브레빌린 A의 단독 처방 대비하여 부작용 없이 발모 및 탈모 방지, 항염에 있어서 더 뛰어난 효과를 나타낸다.
뿐만 아니라 본 발명의 실시예들은 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로 지방세포분화 및 인슐린 저항성의 억제를 통하여 간세포에서의 염증 및 섬유화를 방지하는 효과가 있다.
또한, 기존 합성의약품은 경구투여로 한정되나, 천연 조성물을 활용하는 본 발명의 실시예들은 합성의약품 대비 부작용이 적거나 거의 없으며, 의약품뿐만 아니라 화장품, 식품 등에 적용이 용이하다.
도 1 내지 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 중대가리풀 추출물의 유효성분을 분석한 도면이며, 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 중대가리풀 추출물의 함유 성분을 HPLC로 분석한 그래프이고, 도 2는 도 1의 그래프를 분석하기 위하여 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C의 혼합물을 HPLC로 분석한 그래프이고, 도 3은 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C의 화학식이다.
도 4 내지 도 6는 본 발명의 일 실시예에 따른 중대가리풀 추출물의 각 성분을 분석하기 위하여 UHPLC-Q-TOF mass spectrum으로 분석한 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환예방 및 치료용 조성물로 발모 및 탈모 방지 효과를 확인하기 위하여 실험한 결과로 시험군 및 대조군의 평균 모발 수(N/cm2) 변화 양상을 나타낸 것이다.
도 8 및 도 9는 도 7의 실험 결과에 따른 시험군 및 대조군의 평균 모발 수(N/cm2) 변화 양상 및 개선율(%)을 도시한 그래프이다.
도 10은 도 7의 실험 결과에 따른 시험군 및 대조군의 모발 개선 정도 시험자 육안 평가 평균 점수를 나타낸 것이다.
도 11은 도 10의 실험 결과에 따른 시험군 및 대조군의 모발 개선 정도 시험자 육안 평가 평균 점수를 도시한 그래프이다.
도 12 내지 도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 자가면역 질환 예방, 항염 및 치료용 조성물로 항염 효과를 확인하기 위하여 염증 관련 인자 Ccl2, IL-1b, TNF-a, IL-10의 함량을 확인한 도이다.
도 16 내지 도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 자가면역 질환 예방, 항염 및 치료용 조성물로 항염 효과를 확인하기 위하여 염증 관련 인자 IL-1b, IL-6, TNF-a의 함량을 확인한 도이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예 및 대조군에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제에 의한 지방세포 분화 억제 효과를 확인한 도이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예 및 대조군에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제의 간세포에 대한 세포 독성 유무를 확인하기 위한 도이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예 및 대조군에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제가 TNF-α 유도성 IL-6생성에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예 및 대조군에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제가 TNF-α 유도성 MCP-1 생성에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 26 내지 도 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제에 의한 간성상세포의 세포생존력 및 간섬유화 억제 관련 단백질 발현 변화를 확인한 도이다.
도 29는 본 발명의 대조군에 따른 간섬유화 억제 관련 단백질 발현 변화를 확인한 도이다.
도 4 내지 도 6는 본 발명의 일 실시예에 따른 중대가리풀 추출물의 각 성분을 분석하기 위하여 UHPLC-Q-TOF mass spectrum으로 분석한 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환예방 및 치료용 조성물로 발모 및 탈모 방지 효과를 확인하기 위하여 실험한 결과로 시험군 및 대조군의 평균 모발 수(N/cm2) 변화 양상을 나타낸 것이다.
도 8 및 도 9는 도 7의 실험 결과에 따른 시험군 및 대조군의 평균 모발 수(N/cm2) 변화 양상 및 개선율(%)을 도시한 그래프이다.
도 10은 도 7의 실험 결과에 따른 시험군 및 대조군의 모발 개선 정도 시험자 육안 평가 평균 점수를 나타낸 것이다.
도 11은 도 10의 실험 결과에 따른 시험군 및 대조군의 모발 개선 정도 시험자 육안 평가 평균 점수를 도시한 그래프이다.
도 12 내지 도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 자가면역 질환 예방, 항염 및 치료용 조성물로 항염 효과를 확인하기 위하여 염증 관련 인자 Ccl2, IL-1b, TNF-a, IL-10의 함량을 확인한 도이다.
도 16 내지 도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 자가면역 질환 예방, 항염 및 치료용 조성물로 항염 효과를 확인하기 위하여 염증 관련 인자 IL-1b, IL-6, TNF-a의 함량을 확인한 도이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예 및 대조군에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제에 의한 지방세포 분화 억제 효과를 확인한 도이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예 및 대조군에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제의 간세포에 대한 세포 독성 유무를 확인하기 위한 도이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예 및 대조군에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제가 TNF-α 유도성 IL-6생성에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예 및 대조군에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제가 TNF-α 유도성 MCP-1 생성에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 26 내지 도 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제에 의한 간성상세포의 세포생존력 및 간섬유화 억제 관련 단백질 발현 변화를 확인한 도이다.
도 29는 본 발명의 대조군에 따른 간섬유화 억제 관련 단백질 발현 변화를 확인한 도이다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
본 발명의 일 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물은 하기 화학식의 브레빌린 A(Brevilin A), 아르니콜라이드 D(Arnicolide D), 아르니콜라이드 C(Arnicolide C) 및 마이크로헬레닌 C(Microhelenin C)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 중대가리풀(Centipeda minima) 추출물을 포함한다.
발명의 실시를 위한 형태
이하, 본 발명의 실시예들에 따른 비극성 천연물질의 추출 방법, 이에 따라 추출된 천연물질 및 이의 용도 등에 대하여 설명하기로 한다.
그에 앞서, 본 명세서에 사용되는 전문 용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 그리고, 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 '포함' 또는 '함유'의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 또는 성분을 구체화하며, 다른 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소, 또는 성분의 부가를 제외시키는 것은 아니다.
본 발명에서, 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는 데 사용되며, 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 예시적인 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도는 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다", "구비하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 실시된 특징, 숫자, 단계, 구성 요소 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 구성 요소, 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 예시하고 하기에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물은 중대가리풀(Centipeda minima) 추출물을 포함한다.
여기서, 상기 자가면역 질환은 자가면역(autoimmune)에 따른 비정상적인 면역 반응이 나타나 발생하는 질환으로서, 이에 한정되는 것은 아니나, 예를 들어, 탈모, 원형탈모, 류마티스 관절염, 건선, 아토피, 습진, 지루성 피부염, 피부경화증, 피부면역 과민증, 다발성 경화증, 루푸스, 베체트병, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 크론병 및 염증성 장질환 등일 수 있다.
상기 중대가리풀 추출물은 브레빌린 A(Brevilin A), 아르니콜라이드 D(Arnicolide D), 아르니콜라이드 C(Arnicolide C) 및 마이크로헬레닌 C(Microhelenin C)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.
브레빌린 A는 하기 화학식으로 표현된다.
브레빌린 A는 CAS number 16503-32-5로, C20H26O5의 분자식, 분자량은 346.42이며, 아르나카종(Arnica sp.), 센티페다종(Centipeda sp.), 헬레니움종(Helenium sp.)으로부터 유래한다.
중대가리풀(아불식초, Centipeda minima)에 Brevilin A가 함유되어 있다는 문헌은 다수 발견되었으며, 일부 문헌에 샴푸트리(Litsea glutinous)에도 Brevilin A가 함유되어 있다고 보고한 문헌이 존재한다. 뿐만 아니라, Arnica 속 식물(Arnica longifolia, Arctium lappa, Arnica chamissonis subsp. Foliosa, Arnica chamissonis Less.) 및 Helenium 속 식물(Helenium autumnale L, Helenium alternifolium, Helenium pinnatifidum, Helenium vernale, Helenium brevifolium, and Helenium flexuosum)에도 일부 Brevilin A가 함유되어 있다는 문헌이 발견되었다.
아르니콜라이드 D는 하기 화학식으로 표현된다.
아르니콜라이드 D는 CAS number 34532-68-8로, C19H24O5의 분자식, 분자량은 332.40이며, 아르나카종(Arnica sp.), 센티페다종(Centipeda sp.)으로부터 유래한다.
아르니콜라이드 C는 하기 화학식으로 표현된다.
아르니콜라이드 C는 CAS number 34532-68-7로, C16H26O5의 분자식, 분자량은 334.41이며, 아르나카종(Arnica sp.), 센티페다종(Centipeda sp.)으로부터 유래한다.
마이크로헬레닌 C는 하기 화학식으로 표현된다.
마이크로헬레닌 C는 CAS number 63569-07-3로, C20H26O5의 분자식, 분자량은 346.4이며, 센티페다종(Centipeda sp.), 헬레니움종(Helenium sp.)으로부터 유래한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물은 중대가리풀(Centipeda minima) 추출물을 포함하며, 상기 중대가리풀 추출물은 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C 중 어느 하나 이상을 포함하는데, 예를 들어, 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D, 아르니콜라이드 C, 마이크로헬레닌 C를 단독으로 포함하거나, 브레빌린 A 및 아르니콜라이드 D의 조합, 브레빌린 A 및 아르니콜라이드 C의 조합, 브레빌린 A 및 마이크로헬레닌 C의 조합, 아르니콜라이드 D 및 아르니콜라이드 C의 조합, 아르니콜라이드 D 및 마이크로헬레닌 C의 조합, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C의 조합, 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D 및 아르니콜라이드 C의 조합, 브레빌린 A, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C의 조합, 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D 및 마이크로헬레닌 C의 조합, 아르니콜라이드 D, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C의 조합, 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C의 조합으로 포함할 수 있다.
상기 브레빌린 A, 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C 각각의 작용기전을 살펴보면,
상기 브레빌린 A는 JAK-STAT 신호전달과정(JAK-STAT signaling pathway)을 저해 또는 억제한다.
상기 브레빌린 A는 천연물질로서, 암세포에서 JAK(janus kinase activity)를 저해하고, STAT3 신호 전달을 억제하는 것은 널리 알려져 있다(PLoS One 8 (5) (2013) e63697).
상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C는 사이토카인-사이토카인 수용체 상호 작용(cytokine-cytokine receptor interaction), MAPK 신호 경로(MAPK(mitogen-activated protein kinase) signaling pathway) 및 PI3K-AKT 신호 경로(PI3K(phosphatidylinositol-3-kinase)-AKT signaling pathway)를 저해 또는 억제한다(Hair Growth Effect of Emulsion Extracted Brevilin A, a JAK3 Inhibitor, from Centipeda minima, Processes 2020, 8, 767; doi:10.3390/pr8070767).
NASH에 대한 가장 이상적인 약물 후보는 간염증과 간세포 손상을 줄여야 하고 인슐린 저항성을 교정(correct)해야 하며, 동시에 항섬유화 효과가 있어야 한다. 이러한 다양한 타겟을 동시에 컨트롤 하지 못하면 섬유화 등에 문제를 초래할 수 있는데, 상기의 조성물은 인슐린 저항성을 교정하며 간 손상없이 지방세포 분화와 섬유화를 억제할 수 있는 이상적인 약물 후보군으로 지방간 및 비알콜성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다(Current efforts and trends in the treatment of NASH, Journal of Hepatology 2015 vol. 62 j S65-S75).
상기 중대가리풀 추출물은 WNT 신호전달경로(WNT/β-catenin pathway)를 활성화하며, 모낭 줄기세포(hair follicle stem cell)와 모발 성장에 관여하는 세포(primary hair cell)의 분화 및 증식을 촉진시켜 자가면역 질환 중 탈모, 원형탈모에 효과적이다. 상기 중대가리풀 추출물은 Wnt 수용체의 발현을 증가시키고, Wnt 신호전달계를 활성화하여 GSK3β인산화, β-catenin을 축적하며, ERK(extracellular signal-regulated kinase; 세포 외 신호조절 인산화효소) 활성화(인산화)를 통하여 VEGF, IGF-1 등의 성장인자발현이 증가한다(Hair Growth Stimulation Effect of Centipeda minima Extract: Identification of Active Compounds and Anagen-Activating Signaling Pathways, Biomolecules 2021, 11, 976. https://doi.org/10.3390/biom11070976).
또한, 상기 중대가리풀 추출물은 강력한 항염 효과를 기반으로, 지방세포 분화 억제, 간성상세포(LX-2)에서의 간섬유화 억제(항섬유화), 인슐린 저항성 억제 및 비만 예방의 효과가 있다.
상기 브레빌린 A의 함량은 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C의 총함량보다 2배 이상일 수 있다.
상기 브레빌린 A는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환, 예를 들어, 발모 및 탈모, 그리고 항염증에 대하여 가장 주요한 구성 성분으로 다른 유도체들인 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C의 총 함량보다 많은 것이 바람직하며, 원료 물질인 중대가리풀의 주요 비극성 천연물질의 주성분이 상기 브레빌린 A이다.
상기 브레빌린 A은 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환의 주요 작용기전인 JAK-STAT 신호전달과정에 가장 연관되어 있으며, 다른 유도체들인 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C와 함께 작용하는 경우 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환에 대하여 상승 작용을 일으켜 각 성분들을 단독으로 함유하는 경우보다 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환, 예를 들어 탈모 예방 및 항염에 더 효과가 우수하다.
예를 들어, 상기 중대가리풀 추출물은, 30 내지 90중량%의 상기 브레빌린 A, 0 내지 30중량%의 상기 아르니콜라이드 D, 0 내지 30중량%의 상기 아르니콜라이드 C 및 0 내지 15중량%의 상기 마이크로헬레닌 C를 포함한다.
상기 브레빌린 A는 30 내지 90중량%로 포함되며, 30중량% 미만이거나 90중량% 초과인 경우, JAK-STAT 신호전달과정에 가장 연관되어 있는 성분이 적어 항염 효능이 저하되고 다른 성분들과의 상승 작용이 저하되어 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환의 충분한 예방 및 치료가 어려운 문제점이 있다.
상기 아르니콜라이드 D는 0 내지 30중량%로 포함되며, 30중량% 초과인 경우, 다른 성분들인 브레빌린 A, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C와의 상승 작용이 저하되어 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환의 충분한 예방 및 치료가 어려운 문제점이 있다. 바람직하게는, 상기 아르니콜라이드 D는 15 내지 30중량%로 포함된다.
상기 아르니콜라이드 C는 0 내지 30중량%로 포함되며, 30중량% 초과인 경우, 다른 성분들인 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D 및 마이크로헬레닌 C와의 상승 작용이 저하되어 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환의 충분한 예방 및 치료가 어려운 문제점이 있다. 바람직하게는, 상기 아르니콜라이드 C는 4 내지 30중량%로 포함된다.
상기 마이크로헬레닌 C는 0 내지 15중량%로 포함되며, 15중량% 초과인 경우, 다른 성분들인 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D 및 아르니콜라이드 C와의 상승 작용이 저하되어 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환의 충분한 예방 및 치료가 어려운 문제점이 있다. 바람직하게는, 상기 마이크로헬레닌 C는 3 내지 15중량%로 포함된다.
따라서, 상기 브레빌린 A, 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C 각 성분들의 함량 범위를 벗어나는 경우 항염 효능을 달성할 수 없다.
본 발명의 일 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물에 포함되는 상기 중대가리풀 추출물은 중대가리풀 원료를 추출하여 1차 추출액을 제조하는 단계; 1차 추출액에 친유성 가용화제 및 물을 포함하는 상분리 조성물을 혼합하여 2차 추출하는 단계; 및 상분리된 용액의 상층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득하는 단계를 포함하는 추출 방법에 따라 추출된 것일 수 있다.
본 발명의 상기 추출 방법은 비극성 천연물질을 용해-유화 추출법(Dissolution-Emulsion Extract, DEE)으로 지칭하며, 용해-유화 추출법에 따르면, 천연물 원료 내 비극성 천연물질을 추출하여 상분리 조성물을 혼합하여 용해 및 유화시킨 후, 상분리를 통하여 비극성 천연물질을 추출한다.
상기 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물은 친유성 가용화제, 계면활성제 및 물로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 친유성 가용화제는 BRIJ 010-SS-(RB), Capryol 90, Capryol PGMC, Gantrez ES-435, Gantrez S-97 BF, Gelucire 43/01, Gelucire 44/14, Gelucire 50/13, Gelucire 48/16, Labrafac CC, Labrafac Lipophile WL1349, Labrafac PG, Labrafil M 1944 CS, Labrafil M 2125 CS, Labrafil M 2130 CS, Lauroglycol 90, Lauroglycol FCC, Monosteol, Peceol, Pharmasolve, Plurol Oleique CC497, Span 20-LQ-(SG), Span 60-PA-(SG), upper Refined Oleic Acid-LQ-(JP), Super Refined Tween 80A-LQ-(MH), Surfadone LP-300, Transcutol HP, Transcutol P, TWEEN 60-SS-(SG), TWEEN 80 HP-LQ-(MH), TWEEN 80-LQ-(SG), Vitamin E TPGS, Miglyol 812 및 captax 355로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. Miglyol 812 및 captax 355는 MCT(medium chain triglyceride) oil류로 상기 친유성 가용화제로 사용될 수 있다.
예를 들어, 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제로서 Labrasol, Crodex A-PA-(RB), Geleol, Gelot 64, Suppocire AS2X, Suppocire BML, Synperonic PE/F 127, Synperonic PE/L 44 및 Tefose 63로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 추출 방법을 상세하게 설명하면 아래와 같다.
먼저, 중대가리풀 원료에서 천연물질을 추출하여 1차 추출액을 제조한다. 추출용매는 물, 알코올 등 여러 용매를 선택하여 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 알코올을 사용하였다. 바람직하게는 메탄올, 에탄올을 사용할 수 있다.
예를 들어, 추출은 열수 추출법, 냉침 추출법, 환류냉각 추출법, 용매 추출법, 수증기 증류법, 초음파 추출법, 용출법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있으며, 추가적으로 통상의 분획 공정을 수행할 수 있다.
예를 들어, 천연물 원료를 차가운 알코올에 담궈 냉침 추출할 수 있다. 예를 들어, 천연물 원료는 중대가리풀 자체를 사용하거나, 이를 분쇄한 분말을 사용할 수 있다.
이와 달리, 상기 추출은 중대가리풀 원료를 알코올에 담궈 100℃ 이상의 온도에서 약 1시간 정도 열수 추출할 수 있으며, 알코올은 약 80%의 알코올을 사용할 수 있다. 예를 들어, 열수 추출에 따른 1차 추출액을 감압 농축하여 알코올 성분을 제거하는 단계를 선택적으로 진행할 수 있다. 농축하는 단계를 거치지 않은 1차 추출액을 이용하여 바로 다음 단계로 넘어가더라도 본 발명을 달성하는데 차이는 없으나, 보다 명확한 상분리 및 추출 효율의 측면에서 불필요한 알코올 성분을 제거하는 것이 바람직하다.
상기 1차 추출액에 상분리 조성물을 첨가하여 혼합한다.
상기 상분리 조성물은 친유성 가용화제 및 물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 상분리 조성물은, 친유성 가용화제 10 내지 90중량%; 및 물 10 내지 90중량%를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 상분리 조성물은 비이온성 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 상기 상분리 조성물은 비이온성 계면활성제를 40 중량% 이하로 포함할 수 있다.
따라서, 중대가리풀 원료 내에 함유된 상기 브레빌린 A, 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C는 비극성 천연물질로서 1차 추출된 이후에, 상분리 조성물과 혼합하여 친유성 가용화제와 비극성 천연물질이 하나의 층에, 그리고 나머지 물 및 기타 성분이 다른 층에 함유되어 상분리가 일어난다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 상분리 조성물이 비이온성 계면활성제를 포함하는 경우, 상기 상분리 조성물을 혼합하는 단계에서, 보다 명확한 상분리를 위하여 승온시키며 혼합할 수 있다. 예를 들어, 상분리 조성물을 1차 추출액에 혼합한 혼합물을 30 내지 50℃의 온도를 유지하면서 교반할 수 있으며, 바람직하게는 35 내지 45℃의 온도를 유지하면서 교반할 수 있다.
1차 추출액에 상기 상분리 조성물과 혼합하게 되면 상기 브레빌린 A, 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C, 즉 비극성 천연물질이 비이온성 계면활성제 내지 친유성 가용화제에 추출 및 용해된다. 이때 추가로 고속 혼합을 하면 혼합물 내 계면활성제 및 가용화제의 표면적이 증가하면서 추출 내지 용해되지 않은 일부 비극성 천연물질이 대부분이 용해되어 순간적인 한계미셀농도(critical micelle concentration; CMC) 상태가 되며, 이때, 혼합액의 온도가 증가함에 따라 클라우드 포인트(cloud point)를 다다르게 되면, 이온성 계면활성제와 달리 비이온성 계면활성제는 온도의 증가에 따라 용해도가 감소하므로, 혼합액의 상분리가 보다 더 명확히 나타나게 된다.
상분리된 용액의 상층을 분리하여 상기 브레빌린 A, 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C를 수득한다. 상분리된 용액을 일정시간 방치한 후, 원심분리기를 이용하여 필터(filter)하여, 상기 중대가리풀 추출물을 수득한다.
상기 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물은 상기 수득한 중대가리풀 추출물을 포함하며, 친유성 가용화제, 계면활성제 및 물을 더 포함할 수 있다.
또한, 상기의 추출 방법에 따라 추출된 상기 브레빌린 A, 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C을 포함하는 상분리층에 상기 상분리 조성물의 범위를 벗어난, 마이크로 에멀전 범위의 에멀전화 조성물을 추가로 혼합하여, 에멀전화된 제품을 제조할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따라 추출된 천연물질 및 이를 포함하는 조성물 등의 제품은 독성 용매를 사용하는 액-액 추출법을 사용하지 않음으로 인하여 건조 등의 단계를 생략할 수 있으며, 용매가 인체에 무해한 물질이므로 천연물질이 함유된 추출액을 분리하여 즉시 다른 단계없이 바로 제품으로서 사용이 가능하며, 마이크로 에멀전화 또는 한계미셀농도(CMC)로 인하여 제품의 흡수율을 증가시킬 수 있다.
일반적으로 계면활성제의 사용은 계면활성제의 CMC를 이용하여 화합물의 용해도를 높여 흡수율을 증가시키게 되며, 마이크로 에멀전도 용해도 높이는 것뿐만 아니라 흡수시키려는 물질의 사이즈를 감소시켜 흡수 사이트에서의 흡수율을 증가시킬 수 있다.
이와 같이 제조된 제품은, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클랜징폼, 헤어오일, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용웨이브제, 모발탈색제, 헤어젤, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스, 헤어스프레이 등의 제품, 피부외용제로서 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제와 카타플라즈마제 등의 제형으로 제조될 수 있고, 액상, 고체상, 기체상으로 적절히 활용될 수 있다.
이와 같은 제품은 브레빌린 A, 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C의 효과를 적용할 수 있는 다양한 질환 개선에 효과적이며, 예를 들어, 탈모, 원형탈모, 류마티스 관절염, 건선, 아토피, 습진, 지루성 피부염, 피부경화증, 피부면역 과민증, 다발성 경화증, 루푸스, 베체트병, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 크론병 및 염증성 장질환 등과 같은 자가면역 질환 및 염증 예방 및 치료에 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제는 상기 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 상기 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제는, 조성물 총중량에 대하여 상기 중대가리풀 추출물을 0.1 내지 90중량%로 포함하는 상기 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 "예방 및 치료용 조성물"이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 예방 및 치료용 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 예방 및 치료용 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 예방 및 치료용 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다. 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환을 예방 또는 치료하는 것이며, 이에 관여하는 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하도록 한다.
본 발명의 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물은, 중대가리풀(Centipeda minima) 추출물을 포함한다.
실시예
천연물 원료는 중대가리풀로, 괴산약초유기농산물협동조합(https://natural-herb.co.kr) 국내산 아불식초(중대가리풀, 영천)을 구입하여 추출한 중대가리풀 추출물을 사용하였다.
중대가리풀 건초 1,000g을 48시간 동안 80% 에탄올 10L에 침전시켜 알코올 냉침 추출하여 1차 추출액을 얻었다. 이후, 1차 추출액을 감압 농축하여 에탄올을 제거하였다.
감압 농축한 1차 추출액 80중량%, 친유성 가용화제로 Labrafac을 20중량%의 비율로 혼합한 후 순환형 인라인 믹서로 10분간 교반하였다. 이후, 60분간 방치한 후, 상분리된 상층액을 분리하였다.
위 중대가리풀 추출물은 CMX(CM-2019-001)로 명명하여 경성대학교 식물표본실(herbarium)에 보관하였으며, 국제화장품원료집(INCI, International Nomenclature Cosmetic Ingredient) 원료 번호는 33,849이다.
위 중대가리풀 추출물을 HPLC, MASS SPECTROSCOPY를 통하여 분석하였으며, 분석 결과 Brevilin A, Arnicolide D, Arnicolide C, Microhelenin C의 유효성분을 함유하고 있음을 확인(도 1 내지 6)하였다.
도 1 내지 6을 참조하면, 도 1에서 중대가리풀 추출물을 HPLC로 분석한 결과 4가지 메인 피크가 발견된 것을 알 수 있었고, 이를 확인하기 위하여 도 2에서 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C의 혼합물을 HPLC로 분석한 그래프와 비교하여 확인하였다.
도 4 내지 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 중대가리풀 추출물의 각 성분을 분석하기 위하여 UHPLC-Q-TOF mass spectrum으로 분석한 도면이다. 아르니콜라이드 D는 C19H24O5의 분자식, 분자량은 332.40으로 도 4에 대응되고, 아르니콜라이드 C는 C19H26O5의 분자식, 분자량은 334.41이며, 도 5에 대응되고, 마이크로헬레닌 C는 C20H26O5의 분자식, 분자량은 346.4이며, 도 6에 대응되는 것으로 해석된다.
실험예 1 발모 및 탈모 효능
상기 중대가리풀 추출물을 포함하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물의 발모 및 탈모 효과를 확인하고자 하였으며, 본 실험은 대한피부과학연구소에서 진행하였다.
상기 실시예에 따른 중대가리풀 추출물을 포함하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물 시료를 시험군에게 투여하였으며, 대조군에게는 플라시보(placebo) 대조군으로 Labrafac, Labrasol, D-panthenol, Lecithin을 포함하는 조성물 시료를 투여하였다. 본 실험은 24주간 진행되었으며, 8주 간격으로 모발의 발모 및 탈모 여부를 관찰하였다.
실험 대상자는 하기의 기준을 만족하는 시험군 36명, 대조군 36 총 72명으로 하였다.
- 37~54세의 안드로겐성 탈모증으로 진단된 남녀 연구 대상자
- Norwood Hamilton 분류에 의해 2 또는 2A이상으로 진단된 남성 연구 대상자, Ludwig 분류에 의해 1이상으로 진단된 여성 연구 대상자
- 연구기간 동안 특별한 모발용품이나 모발관리 및 조작을 하지 않을 연구 대상자
- 연구기간 동안 첫 방문 시점의 머리모양 및 색을 동일하게 유지할 연구 대상자
실험 방법으로, 실험 대상자들은 시험자의 관리 감독 하에 시료의 적당량을 매일 1회 자가 사용하였고, 매일 저녁 샴푸 후 충분한 건조 후 피부에 1회 사용하고, 1회 사용시 0.5mL를 도포하였다. 1일 전체 도포 보다는 2구역을 2일에 나누어 하루씩 번갈아 가면서 반쪽 도포하였다.
이중맹검법 사용: 시료 배포는 실험 대상자와 시험자 모두 시료의 내용을 알 수 없도록 시험 시료와 대조 시료를 동일한 용기에 담아 배포하고, 구분을 위해 사용한 시료코드는 밀봉하여 노출되지 않게 하고 그 위에 무작위로 분류 기호 (A/B)를 표기하였다.
전체 모발 수 변화는 포토트리코그램(Phototrichogram)으로 평가하였으며, 평가하고자 하는 탈모부위에 모발을 자른 후 직경 1mm의 작은 점 문신을 하거나 일정의 좌표를 기록하도록 하여 매번 점 문신 또는 일정좌표를 중심으로 하여 포토트리코그램을 시행하였다.
전체 모발 수(Total hair counts; number/cm2)는 1cm2 원내에 있는 모발 수를 관찰하였다.
시험군의 결과(전체 모발 수)는 표 1에 나타내었다.
대조군의 결과(전체 모발 수)는 표 2에 나타내었다.
상기 표 1 및 표 2 그리고, 도 7 내지 도 9를 참조하면, 시험군의 경우 8주차부터 모발 수가 증가하여 모발의 발모 내지 탈모가 개선된 것을 확인할 수 있었고, 대조군의 경우 거의 변화가 없거나 오히려 8주 및 16주차에는 모발 수가 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.
2차 유효성 평가를 위하여, 모발의 개선 정도는 사진 촬영으로 시험자가 육안 평가하였으며, 고해상도 디지털 카메라(DSLR)를 이용 항상 같은 조건에서 정해진 위치에서 인체사진을 찍어 시험시료 도포 전과 후를 비교하였다.
- 인체 사진 촬영: 45도 (앞머리선), 90도 (정수리) 두 부위를 평가 시점마다 동일한 조건, 구도 및 위치에서 동일한 부위를 촬영하였다.
- 사진 평가: 육안 평가는 2명의 연구자가 7단계 척도로 육안 평가를 실시하고, 2명의 육안 평가 결과의 평균을 유효성 평가 변수로 활용하였다.
시험군 모발의 개선 정도를 시험자 2명의 육안으로 평가하였고, 이를 평균내어 하기 표 4에 나타내었다.
대조군 모발의 개선 정도를 시험자 2명의 육안으로 평가하였고, 이를 평균내어 하기 표 5에 나타내었다.
상기 표 3 내지 표 5 그리고, 도 10 및 도 11을 참조하면, 시험군과 대조군은 8주차까지는 거의 유사한 수준이나, 16주차 이후부터 시험군의 경우 육안 평가 점수가 눈에 띄게 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 대조군의 경우 거의 변화가 없거나 미미하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2 항염 효능1
상기 중대가리풀 추출물의 항염 효과를 확인하기 위하여, 염증 관련 인자 Ccl2, IL-1b, TNF-a, IL-10를 대상으로 실험을 수행하였다.
도 12 내지 도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물로 항염 효과를 확인하기 위하여 염증 관련 인자 Ccl2, IL-1b, TNF-a 및 IL-10의 함량을 확인한 도이다.
도 12 내지 도 15에서 비교예로서 Veh-는 음성대조군 그리고 Veh+는 양성대조군이며, 2는 브레빌린 A 단독으로 6ug을 적용하였으며, 실시예로서 5는 본 발명의 실시예에 따른 중대가리풀 추출물로 브레빌린 A 2.22ug, 아르니콜라이드 C 0.21ug, 아르니콜라이드 D 0.6ug, 마이크로헬레닌 C 0.14ug의 조성물로, 활성물질인 브레빌린 A 및 지표물질인 아르니콜라이드 C, 아르니콜라이드 D, 마이크로헬레닌 C의 총합이 3.17ug이다.
구체적으로 항염 효능1은 RAW 264.7 대식세포를 사용하여 평가하였으며, RAW 264.7 세포에서 LPS(250ng/ml)를 처리하여 Ccl2, IL-1b, TNF-a 및 IL-10 각각의 생성을 자극하였다. 이후, 브레빌린 A 단독으로 6ug(2), 본 발명의 실시예에 따른 중대가리풀 추출물로 브레빌린 A 2.22ug, 아르니콜라이드 C 0.21ug, 아르니콜라이드 D 0.6ug, 마이크로헬레닌 C 0.14ug의 조성물(5)을 각각 처리하고, 6시간 동안 동일 조건에서 배양한 다음 세포를 제거하고 Ccl2, IL-1b, TNF-a 및 IL-10 각각 양을 ELISA 방법으로 정량하였으며, 이에 따라 RAW 세포에서 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물에 의한 Ccl2, IL-1b, TNF-a 및 IL-10 단백질 발현변화를 분석하였다.
도 12를 참조하면, Ccl2 단백질 발현변화에서는 본 발명의 실시예의 중대가리풀 추출물(5)이 브레빌린 A 단독처리(2)시 보다 더 높은 효과를 나타낸다.
도 12를 참조하면, IL-1b 단백질 발현변화에서는 본 발명의 실시예의 중대가리풀 추출물(5)이 브레빌린 A 단독처리(2)시와 유사 내지 동등 수준의 효과를 나타내며, 비교예 브레빌린 A 단독으로 처리한 경우(2) 대비 더 적은 용량에도 유사 내지 동등 수준의 효과를 나타내는 점에서 중대가리풀 추출물(5)이 더욱 우수한 항염 효과를 가짐을 알 수 있었다.
도 13 및 도 14를 참조하면, TNF-a 및 IL-10 단백질 발현변화에서는 도 12에서의 Ccl2 단백질 발현변화에서와 마찬가지로 본 발명의 실시예의 중대가리풀 추출물(5)이 브레빌린 A 단독처리(2)시 보다 더 높은 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3 항염 효능2
상기 중대가리풀 추출물을 포함하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물의 조성비에 따른 항염 효과를 확인하기 위하여, 상기 유효성분의 조성비(중량%)를 조절하여 하기 표 6에 나타내었다.
도 16 내지 도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물로 항염 효과를 확인하기 위하여 염증 관련 인자 IL-1b, IL-6, TNF-a의 함량을 확인한 도이다.
구체적으로 항염 효능2는 RAW 264.7 대식세포를 사용하여 평가하였으며, RAW 264.7 세포에서 LPS(250ng/ml)를 처리하여 IL-1b, IL-6 및 TNF-a 각각의 생성을 자극하였다. 상기 실시예 1 내지 6, 비교예 1 내지 6을 6ug/ml씩 각각 처리하고, 6시간 동안 동일 조건에서 배양한 다음 세포를 제거하고 IL-1b, IL-6, TNF-a 각각 양을 ELISA 방법으로 정량하였으며, 이에 따라 RAW 세포에서 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물에 의한 IL-1b, IL-6 및 TNF-a 단백질 발현변화를 분석하였다.
*P<0.05는 통계적으로는 유의하나 세포독성 시험의 경우 일반적으로 **P<0.01부터 유의성을 인정하므로, 본 발명에서는 **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001을 대조군과 비교하여 유의한 것으로 간주하였다.
도 16 및 도 17을 참조하면, IL-1b 단백질 발현변화를 분석하였으며, 실시예 1 내지 실시예 6의 조성물을 처리한 경우 IL-1b 단백질 발현이 비교예 1 내지 비교예 6과 비교하여 현저히 감소된 것을 알 수 있었다.
도 18 및 도 19를 참조하면, IL-6 단백질 발현변화를 분석하였으며, 실시예 1 내지 실시예 6의 조성물을 처리한 경우 IL-6 단백질 발현이 비교예 1 내지 비교예 6과 비교하여 현저히 감소된 것을 알 수 있었다.
도 20 및 도 21을 참조하면, TNF-a 단백질 발현변화를 분석하였으며, 실시예 1 내지 실시예 6의 조성물을 처리한 경우 TNF-a 단백질 발현이 비교예 1 내지 비교예 6과 비교하여 현저히 감소된 것을 알 수 있었다.
유의성의 측면에서 비교예들은 *P<0.05 수준의 유의도를 나타내나 실시예들은 ***P<0.001 이상의 유의도를 나타내는 점에서 실시예들이 비교예들과 비교하여 훨씬 더 우수한 항염 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4 비알코올성 지방간염 억제 효능1 - 지방세포 분화 억제 효능
상기 중대가리풀 추출물의 비알콜성 지방간염 억제 효과를 확인하기 위하여, 염증질환치료제에 따른 지방전구세포를 대상으로 실험을 수행하였다.
도 22는 본 발명의 일 실시예 및 대조군에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제에 의한 지방세포 분화 억제 효과를 확인하기 위한 도이다. JAKI는 본 발명의 일 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물이고, elafibranor(Genfit社)은 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제의 신약 후보군이다.
구체적으로 지방전구세포인 3T3-L1 세포를 사용하여 평가하였으며, 3T3-L1 세포에 JAKI 및 elafibranor를 각각 0ug/ml, 0.16ug/ml, 0.31ug/ml, 0.63ug/ml, 1.25ug/ml 및 2.5ug/ml 농도로 처리하여 6시간 동안 동일 조건에서 배양한 다음 3T3-L1 세포의 변화를 분석하였다.
도 22를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 치료제 JAKI가 elafibranor의 처리시 보다 지방세포로의 분화억제에 더 높은 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
구체적으로 도 22의 (B), (C)를 참조하면, elafibranor는 0.63ug/ml의 농도로 처리시부터 농도가 증가할수록 지방세포 분화 억제에 효과가 있는 반면, JAKI는 0.31ug/ml의 농도로 처리시부터 지방세포 분화 억제에 우수한 효과를 나타내고 있으며, 3T3-L1 세포의 변화를 이미지로 나타낸 도 22의 (A)를 참조하면, JAKI는 elafibranor 보다 지방세포 분화 억제에 더 높은 효과가 있는 것을 육안으로 확인할 수 있었다.
실험예 5 비알코올성 지방간염 억제 효능2 - 지방전구세포 독성 유무
상기 중대가리풀 추출물의 간세포에 대한 독성 유무를 확인하기 위하여, 지방전구세포를 대상으로 실험을 수행하였다.
도 23은 본 발명의 일 실시예 및 대조군에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제의 간세포에 대한 세포 독성 유무를 확인하기 위한 도이다.
구체적으로 지방전구세포인 3T3-L1 세포를 사용하여 평가하였으며, 3T3-L1 세포에 JAKI 및 elafibranor를 각각 0ug/ml, 0.16ug/ml, 0.31ug/ml, 0.63ug/ml, 1.25ug/ml, 2.5ug/ml, 5ug/ml, 10ug/ml, 20ug/ml, 40ug/ml 농도로 처리하여 6시간 동안 동일 조건에서 배양한 다음 3T3-L1 세포의 변화를 분석하였다.
도 23을 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 JAKI는 약 2.5 ug/ml의 농도까지 90% 이상의 생존율을 나타내어 지방세포의 손상이 없음을 알 수 있었다. 다만, 10ug/ml 이상의 농도에서는 세포 생존율이 50% 이하로 저하되는 것을 알 수 있었다.
실험예 6 비알코올성 지방간염 억제 효능3 - 지방전구세포에서의 항염 효과
상기 중대가리풀 추출물의 비알콜성 지방간염 억제 효과를 확인하기 위하여, 지방전구세포에서 염증질환치료제에 따른 TNF-α 유도성 IL-6 생성을 대상으로 실험을 수행하였다.
IL-6는 체내의 면역반응에 직접 작용하여 염증성 질환 또는 간세포에서 급성반응성물질을 유발하여 간세포의 염증 또는 간의 섬유화를 유발하는 것으로, IL-6 생성의 억제시 비알콜성 지방간염을 억제할 수 있다.
도 24는 본 발명의 일 실시예 및 대조군에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제가 TNF-α 유도성 IL-6의 생성에 미치는 영향을 확인하기 위한 도이다. JAKI는 본 발명의 일 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제이고, elafibranor(Genfit社)은 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제의 신약 후보군이다.
구체적으로 지방전구세포인 3T3-L1 세포를 사용하여 평가하였으며, 3T3-L1 세포에 JAKI 및 elafibranor를 각각 0ug/ml, 0.16ug/ml, 0.31ug/ml, 0.63ug/ml, 1.25ug/ml 및 2.5ug/ml의 농도로 처리하여 6시간 동안 동일 조건에서 배양한 다음 IL-6 생성변화를 분석하였다.
도 24를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 치료제 JAKI를 0.63ug/ml 처리시 IL-6의 생성이 감소하기 시작하였으며, 1.25ug/ml 처리시 무처리 대비 50% 이상 감소하였으며, 2.5ug/ml 처리시 IL-6의 생성이 약 500pg/ml이하로 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, elafibranor의 처리시 IL-6의 생성의 변화가 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다.
이에 따라, 본 발명의 실시예에 따른 JAKI는 0.63ug/ml의 농도 이상으로 처리시 IL-6의 생성이 감소하며 1.25ug/ml 처리시 무처리 대비 50% 이상으로 IL-6의 생성이 현저하게 감소하는 것을 나타내는 점에서, elafibranor과 비교하여 훨씬 더 우수한 항염 효능을 나타내는 것을 알 수 있었다.
실험예 7 비알코올성 지방간염 억제 효능4 - 지방전구세포에서의 인슐린 저항성 억제 효과
상기 중대가리풀 추출물의 비알콜성 지방간염 억제 효과를 확인하기 위하여, 지방전구세포에서 염증질환치료제에 따른 TNF-α 유도성 MCP-1 생성을 대상으로 실험을 수행하였다.
MCP-1은 ERK(extracellular signal-regulated kinase; 세포 외 신호조절 인산화효소) 경로에 영향을 주어 인슐린저항성을 유발하여 간세포의 염증 또는 간의 섬유화를 유발하는 것으로, MCP-1생성의 억제시 비알콜성 지방간염을 억제할 수 있다.
도 25는 본 발명의 일 실시예 및 대조군에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제가 TNF-α 유도성 MCP-1의 생성에 미치는 영향을 확인하기 위한 도이다. JAKI는 본 발명의 일 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제이고, elafibranor(Genfit社)은 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제의 신약 후보군이다.
구체적으로 지방전구세포인 3T3-L1 세포를 사용하여 평가하였으며, 3T3-L1 세포에 JAKI 및 elafibranor를 각각 0ug/ml, 0.16ug/ml, 0.31ug/ml, 0.63ug/ml, 1.25ug/ml 및 2.5ug/ml의 농도로 처리하여 6시간 동안 동일 조건에서 배양한 다음 MCP-1 생성변화를 분석하였다.
도 25를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 치료제 JAKI를 0.63ug/ml 처리시 MCP-1의 생성이 급격하게 감소하기 시작하였으며, 1.25ug/ml 처리시 무처리 대비 50% 이상 감소하였으며, 2.5ug/ml 처리시 MCP-1의 생성이 약 500pg/ml이하로 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
도 25를 참조하면, elafibranor의 처리시 MCP-1의 생성의 변화가 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다.
이에 따라, 본 발명의 실시예에 따른 JAKI는 0.63ug/ml의 농도 이상으로 처리시 MCP-1의 생성이 현저하게 감소하는 것을 나타내는 점에서, elafibranor과 비교하여 훨씬 더 우수한 인슐린저항성의 억제효능을 나타내는 것을 알 수 있었다.
실험예 8 비알코올성 지방간염 억제 효능5 - 간성상 세포의 세포 생존율
상기 중대가리풀 추출물의 비알콜성 지방간염 억제 효과를 확인하기 위하여, 염증질환치료제에 따른 간섬유화 억제 관련 단백질 발현을 대상으로 실험을 수행하였다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제에 의한 간성상세포의 세포생존력을 확인하기 위한 도이다. JAKI는 본 발명의 일 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제이다.
구체적으로 간성상세포인 LX-2 세포를 사용하여 평가하였으며, LX-2 세포에 TGF-β1를 5ng/ml 농도로 처리하여 LX-2 세포를 활성화시킨 후, JAKI를 0uM, 1.25uM, 2.5uM, 5uM, 10uM, 20uM 및 40uM 농도로 처리하여 6시간 동안 동일 조건에서 배양한 다음, LX-2 세포의 변화를 분석하였다.
도 26을 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 치료제 JAKI를 20uM 처리시 LX-2 세포의 생존력이 감소하는 것을 확인할 수 있고, 40uM 처리시 LX-2 세포의 생존력이 약 50% 이하로 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
이에 따라, 본 발명의 실시예에 따른 치료제 JAKI는 간섬유화를 유발하는 LX-2 세포의 생존억제에 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 9 비알코올성 지방간염 억제 효능6 - 간섬유화 관련 단백질 발현 억제 효과
도 27 내지 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제에 의한 간섬유화 관련 단백질 발현 변화를 확인하기 위한 도이다.
구체적으로 간성상세포인 LX-2 세포를 사용하여 평가하였으며, TGF-β1를 5ng/ml의 농도로 처리한 LX-2 세포에 JAKI를 0uM, 20uM 및 40uM 농도로 처리 후 24 시간 동안 동일한 조건에서 배양하였다. 그 후 TGF-β1, Collagen type-1, MMP-2, TIMP1 및 GAPDH의 단백질 발현 수준과 GAPDH에 대비된 TGF-β1, Collagen type-1, MMP-2 및 TIMP1의 단백질 발현 비율에 대하여 분석하였다.
도 27을 참조하면, JAKI의 농도가 높아질수록 TGF-β1, Collagen type-1 및 MMP-2의 단백질량을 나타내는 밴드의 두께 또는 색이 옅어지는 것을 확인할 수 있으며, GAPDH의 단백질량을 나타내는 밴드의 두께 또는 색은 일정한 것을 확인할 수 있었다.
도 28을 참조하면, JAKI를 40uM 처리시 GAPDH에 대비된 TGF-β1 및 Collagen type-1 단백질의 발현 비율이 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있고, 20uM 처리시 GAPDH에 대비된 MMP-2 및 TIMP1 단백질의 발현 비율이 무처리군 대비 약 50%이상 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
도 29는 본 발명의 대조군에 따른 간섬유화 억제 관련 단백질의 발현 변화를 확인하기 위한 도이다. elafibranor(Genfit社)은 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제의 신약 후보군이다.
구체적으로 간성상세포인 LX-2 세포를 사용하여 평가하였으며, TGF-β1 5ng/ml를 처리한 LX-2 세포에 본 발명의 대조군인 elafibranor를 각각 0uM, 20uM, 40Um 및 80uM 농도로 처리 후 24시간 동안 동일한 조건에서 배양하였다. 그 후 GAPDH에 대비된 TGF-β1, Collagen type-1, MMP-2 및 TIMP1의 단백질 발현 비율에 대하여 분석하였다.
도 29를 참조하면, elafibranor를 40uM로 처리시 GAPDH에 대비된 TGF-β1, Collagen type-1, MMP-2 및 TIMP1 단백질의 발현 비율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
이에 따라, 본 발명의 실시예에 따른 JAKI는 20uM의 농도로 처리시 GAPDH에 대비된 MMP-2 및 TIMP1 단백질의 발현 비율이 무처리군 대비 약 50%이상 감소하며 40uM의 농도로 처리시 GAPDH에 대비된 TGF-β1, Collagen type-1, MMP-2 및 TIMP1 단백질의 발현 비율이 현저하게 감소한다는 점에서, elafibranor와 비교하여 낮은 농도에서 훨씬 더 우수한 항염 및 간 섬유화 억제효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
상술한 바에 있어서, 본 발명의 예시적인 실시예들을 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되지 않으며 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 다음에 기재하는 특허청구범위의 개념과 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변경 및 변형이 가능함을 이해할 수 있을 것이다.
Claims (11)
- 하기 화학식의 브레빌린 A(Brevilin A), 아르니콜라이드 D(Arnicolide D), 아르니콜라이드 C(Arnicolide C) 및 마이크로헬레닌 C(Microhelenin C)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 중대가리풀(Centipeda minima) 추출물을 포함하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 브레빌린 A는 JAK-STAT 신호전달과정을 저해 또는 억제하며, 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C는 사이토카인-사이토카인 수용체 상호 작용(cytokine-cytokine receptor interaction), MAPK 신호 경로(MAPK signaling pathway) 및 PI3K-AKT 신호 경로(PI3K-AKT signaling pathway)를 저해 또는 억제하며, 상기 중대가리풀 추출물은 WNT 신호전달경로(WNT/β-catenin pathway)를 활성화하는 것을 특징으로 하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 브레빌린 A의 함량은 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C의 총함량보다 2배 이상인 것을 특징으로 하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 중대가리풀 추출물은,
30 내지 90중량%의 상기 브레빌린 A;
0 내지 30중량%의 상기 아르니콜라이드 D; 0 내지 30중량%의 상기 아르니콜라이드 C; 및 0 내지 15중량%의 상기 마이크로헬레닌 C를 포함하는 것을 특징으로 하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 중대가리풀 추출물은 중대가리풀 원료를 추출하여 1차 추출액을 제조하는 단계; 1차 추출액에 친유성 가용화제 및 물을 포함하는 상분리 조성물을 혼합하여 2차 추출하는 단계; 및 상분리된 용액의 상층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득하는 단계를 포함하는 추출 방법에 따라 추출된 것을 특징으로 하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물은 친유성 가용화제, 계면활성제 및 물로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 친유성 가용화제는 BRIJ 010-SS-(RB), Capryol 90, Capryol PGMC, Gantrez ES-435, Gantrez S-97 BF, Gelucire 43/01, Gelucire 44/14, Gelucire 50/13, Gelucire 48/16, Labrafac CC, Labrafac Lipophile WL1349, Labrafac PG, Labrafil M 1944 CS, Labrafil M 2125 CS, Labrafil M 2130 CS, Lauroglycol 90, Lauroglycol FCC, Monosteol, Peceol, Pharmasolve, Plurol Oleique CC497, Span 20-LQ-(SG), Span 60-PA-(SG), upper Refined Oleic Acid-LQ-(JP), Super Refined Tween 80A-LQ-(MH), Surfadone LP-300, Transcutol HP, Transcutol P, TWEEN 60-SS-(SG), TWEEN 80 HP-LQ-(MH), TWEEN 80-LQ-(SG), Vitamin E TPGS, Miglyol 812 및 captax 355로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 계면활성제는 Labrasol, Crodex A-PA-(RB), Geleol, Gelot 64, Suppocire AS2X, Suppocire BML, Synperonic PE/F 127, Synperonic PE/L 44 및 Tefose 63로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 자가면역 질환은 탈모, 원형탈모, 류마티스 관절염, 건선, 아토피, 습진, 지루성 피부염, 피부경화증, 피부면역 과민증, 다발성 경화증, 루푸스, 베체트병, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 크론병 및 염증성 장질환으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물을 포함하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제.
- 제10항에 있어서,
항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총중량에 대하여 상기 중대가리풀 추출물을 0.1 내지 90중량%로 포함하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료제.
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