KR20220045975A - 베타-제거 링커에 의해 가교된 하이드로겔의 증기 멸균 - Google Patents

베타-제거 링커에 의해 가교된 하이드로겔의 증기 멸균 Download PDF

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KR20220045975A
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제프리 씨. 헤니스
게리 더블유. 애슐리
브라이언 야오
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프로린크스 엘엘시
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Abstract

상당한 분해의 결점 없이 베타-제거 링커로 가교된 하이드로겔의 증기 멸균 방법이 제공된다.

Description

베타-제거 링커에 의해 가교된 하이드로겔의 증기 멸균
관련 출원의 상호 참조
[0001] 본 출원은 2019년 8월 7일자, 미국 가출원번호 제62/883,982호의 우선권을 주장하며, 상기 문헌은 본 명세서에 그 전체가 참조 문헌으로 포함된다.
발명의 배경
[0002] 분해성 고분자 생체 재료의 멸균은 매우 어려운 과제이다. 주사 또는 이식에 사용되는 모든 생체 재료는 안전하게 임상 사용을 진행하기 위해 규제 승인을 받고 멸균 형태로 제공되는 것이 필수적이다. 의료 기기의 이식으로 인한 감염은 여전히 건강 관리의 주요 관심사이다. 그러나, 생체 재료의 고유한 복잡성으로 인해, 멸균 방법의 결과를 예측하여 적절한 멸균을 달성하기 위한 일반적인 지침 세트를 개발하는 것은 사실상 불가능하다. 하이드로겔의 최신 멸균 방법에 대한 검토가 발표되어 있다 ([Galante et al., “Sterilization of hydrogels for biomedical applications: a review,”J. Biomedical Materials Res B: App Biomaterials (2018) 106B: 2472-92]).
[0003] 하이드로겔 멸균의 경우에, 중합체 백본 또는 분해를 제어하는 불안정한 가교결합 중 하나 또는 둘 모두가 일반적으로 사용되는 멸균 방법에 의해 악영향을 받는다. PCT 공개공보 WO2011/05140에 개시된 바와 같이 보호성 용매의 존재하에 이온화 감마 조사를 사용하여 하이드로겔을 멸균하는 것이 종종 가능할 수는 있지만, 상당한 화학적 분해는 항상 문제가 되며, 재현성 및 독성 문제를 추가한다. 고온을 사용하면 예를 들어 에스터 결합의 촉진된 가수분해에 의해 화학 반응을 촉진하고 하이드로겔 분해를 야기할 수 있다.
[0004] 미국 특허 9,649,385는 베타-제거 링커를 포함하는 기에 의해 가교된 하이드로겔의 제조를 개시한다. 이러한 겔의 분해는 매질의 pH에 의해 제어되며, 주로 링커에 존재하는 하나 이상의 전자-끌개 조절기 그룹의 특성에 의해 제어된다 (Santi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2012) 109: 6211-6). 그러나, 이러한 하이드로겔의 멸균은 일반적으로 무균 제조 기법, 예를 들어 2019년 1월 31일자 PCT 출원 PCT/US2019/016090에 개시된 기법에 의해 수행된다. 그러나 여러-단계의 제조 공정 동안 무균 조건을 유지하는 것은 어렵고, 무균 공정에 부과되는 규제 부담이 상당하여, 상당한 비용이 추가된다. 본 발명은 이러한 단점을 극복한다.
[0005] 본 출원에 언급된 모든 문헌은 본 명세서에 참조 문헌을 포함된다.
발명의 개시
[0006] 본 발명은 상당한 분해의 결점 없이 베타-제거 링커로 가교된 하이드로겔의 증기 멸균 방법에 관한 것이다. 이것은 비반응성 완충액에 하이드로겔을 제공하고, 하이드로겔을 멸균하기에 충분한 시간 동안 완충된 하이드로겔을 멸균 사이클에 노출시킴으로써 달성된다. 최대 멸균 온도 및 시간에서 완충액의 pH 값은 멸균 사이클 동안 가교 절단을 최소화하도록 조정된다.
도면의 간단한 설명
[0007] 도 1은 8개의 연속 고압멸균 사이클 동안 (20 분 유지 시간) 121 ℃에서 pH 6.2 (-●-), 5.0 (-■-) 및 4.0 (-▲-)의 상이한 완충액 중의 조절제 R1 = (N,N-다이메틸아미노설포닐)을 가지는 테스트 프로브의 절단을 도시한다. 121 ℃에서의 pH를 추정하기 위해 사용된 완충액, 25 ℃의 pH 및 ΔpH/ΔT 값은 다음과 같다: HEPES, pH 7.4, -0.014; 아세테이트, pH 5, -0.0002, 및 시트레이트, -0.0024.
[0008] 도 2는 상이한 완충액에서 0, 1, 2, 3, 또는 4 회의 고압멸균 사이클 후 아미노-하이드로겔 미소구체의 현미경 모폴로지를 도시한다.
[0009] 도 3A-3C는 상이한 완충액에서 0-4 개의 고압멸균 사이클 후 pH 9.4에서 화학식(2) (R1 = (N,N-다이메틸아미노)설포닐))의 아미노-하이드로겔 미소구체에 대한 용해 곡선을 도시한다. 도 3A: pH 4.0 시트레이트; 도 3B: pH 4.0 아세테이트; 및 도 3C: pH 4.0 포스페이트. tRG 값은 표 2에 보고되어 있다.
[0010] 도 4는 상이한 완충액에서 0-4 회의 고압멸균 사이클 후 pH 9.4에서 아미노-하이드로겔 미소구체 (R1 = (N,N-다이메틸아미노)설포닐))에 대한 유리 아민 기 대 PEG의 비율을 도시한다.
[0011] 도 5는 37 ℃ 내지 80 ℃에서 전자-끄는 조절제가 모폴리노-설포닐인 베타-제거 링커의 절단에 대한 Arrhenius 플롯을 도시한다. 이러한 플롯의 데이터는 선형 관계 ln(k) = 39.047 - 14077/T를 제공하며, 여기서 k는 시간에 따른 링커 절단에 대한 속도 상수이고, T는 °K 단위의 반응 온도이다. 이러한 파라미터는 활성화 에너지 Ea = 117 kJmol를 추정한다.
[0012] 도 6은 고압멸균 전후의 하이드로겔 미소구체의 용해 곡선을 도시한다. 화학식 1의 하이드로겔은 R1 = N,N-다이메틸설폰아마이드인 예비중합체 A와 예비중합체 B의 반응으로 제조하였으며, 두 경우 모두에서 PEG = 10-kDa 4-아암 PEG이다. 하이드로겔 미소구체의 샘플을 보레이트 완충액, pH 9.4, 37 ℃에 두고, BaCl2/I2/KI 방법을 사용하여 용해된 PEG 대해 주기적으로 분석하여 용해 (n = 2)에 대해 분석하였다. 용해 곡선의 분석은 고압멸균 전 tRG = 12.0 ± 0.7 h 및 고압멸균 후 11.9 ± 0.7 h를 나타낸다. 고압멸균된 하이드로겔 미소구체의 무균 시험은 감지할 수 있는 성장을 보여주지 않았다.
발명을 수행하는 방식
[0013] 베타-제거 링커에 의해 가교된 하이드로겔의 증기 멸균은 비반응성 완충액에 하이드로겔을 제공하고, 하이드로겔을 멸균하기에 충분한 시간 동안 완충된 하이드로겔을 멸균 사이클에 노출시킴으로써 실용적으로 구현될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 최대 멸균 온도 및 시간에서 완충액의 pH 값을 조절함으로써, 멸균 사이클 동안 가교 절단이 최소화된다는 것을 발견하였다.
[0014] 특정 구체예에서, 최대 멸균 온도에서 완충액의 pH는 pH 2 내지 pH 5, 또는 pH 3 내지 pH 4이다. 특정 구체예에서, 비반응성 완충액은 시트레이트, 포스페이트 또는 아세테이트, 바람직하게 포스페이트 또는 아세테이트이다. 특정 구체예에서, 최대 멸균 온도는 121 ℃이고 최대 온도에서의 시간은 1 시간 미만이지만, 이러한 파라미터는 본 발명의 방법에 따라 만족스러운 멸균을 달성하기 위해 필요에 따라 조정될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 완충액은 pH 3-4의 아세테이트 또는 포스페이트이다.
[0015] 베타-제거 링커에 의해 가교되고 후속 유도체화를 위한 반응성 아민 기를 포함하는 PEG 하이드로겔의 일반적인 구조가 하기에 나타난다. 하이드로겔은 하기에 표시된 바와 같이 두 가지 "예비중합체"의 중합에 의해 형성된다.
Figure pct00001
가교된 하이드로겔
화학식 1
Figure pct00002
가교된 하이드로겔 / 라이신 ε-아미노를 통해 연결
화학식 2
[0016] 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물의 일부 구현예에서, R1은 CN; NO2;
임의 치환된 아릴;
임의 치환된 헤테로아릴;
임의 치환된 알케닐;
임의 치환된 알키닐;
COR3 또는 SOR3 또는 SO2R3이되, 여기서
R3는 H 또는 임의 치환된 알킬;
각각 임의 치환된, 아릴 또는 아릴알킬;
각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이거나;　또는
OR9 또는 NR9 2이되, 각 R은 독립적으로 H 또는 임의 치환된　알킬이거나, 또는 두 개의 R9 모두 이들이 부착되는 질소와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
SR4이되, 여기서
R4는 임의 치환된 알킬;
각각 임의 치환된, 아릴 또는 아릴알킬;
각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이다.
[0017] 일부 구현예에서, R1은 CN 또는 SO2R3이되 여기서 R3는 H 또는 임의 치환된 알킬; 각각 임의 치환된, 아릴 또는 아릴알킬; 각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이거나;　또는 OR9 또는 NR9 2이되 각 R은 독립적으로 H 또는 임의 치환된　알킬이거나, 또는 두 개의 R9 기 모두는 이들이 부착되는 질소와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성한다. 일부 구현예에서, R1은 CN; SO2Me; SO2NMe2; SO2N(CH2CH2)2X 또는 SO2(Ph-R10)이되, 여기서 X는 부재하거나, O, 또는 CH-R10이고, R10은 H, 알킬, 알콕시, NO2, 또는 할로겐이다.
[0018] 용어 “알킬”은 1-20, 1-12, 1-8, 1-6, 또는 1-4개 탄소 원자의 선형, 분지형, 또는 사이클릭 포화 탄화수소 기를 포함하는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 알킬은 선형 또는 분지형이다. 선형 또는 분지형 알킬 기의 예로는, 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-뷰틸, t-뷰틸, 아이소뷰틸, sec-뷰틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 알킬은 사이클릭이다. 사이클릭 알킬 기의 예로는 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜타다이에닐, 사이클로헥실, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
[0019] 용어 “알콕시”는 산소에 결합된 알킬 기를 포함하며, 메톡시, 에톡시, 아이소프로폭시, 사이클로프로폭시, 사이클로뷰톡시, 등을 포함하는 것으로 이해된다.
[0020] 용어 “알케닐”은 2-20, 2-12, 2-8, 2-6, 또는　2-4개 탄소 원자의, 탄소-탄소 이중 결합을 가지는 비-방향족 불포화 탄화수소를 포함하는 것으로 이해된다.
[0021] 용어 “알키닐”은 2-20, 2-12, 2-8, 2-6, 또는　2-4개 탄소 원자의, 탄소-탄소 삼중 결합을 가지는 비-방향족 불포화 탄화수소를 포함하는 것으로 이해된다.
[0022] 용어 “아릴”은 6-18개 탄소, 바람직하게 6-10개 탄소의 방향족 탄화수소 기를 포함하며, 페닐, 나프틸, 및 안트라세닐과 같은 기를 포함하는 것으로 이해된다. 용어 “헤테로아릴”은 N, O 또는 S 원자 중 적어도 하나를 함유하는 3-15개 탄소, 바람직하게 N, O 또는 S 원자 중 적어도 하나를 포함하는　3-7개 탄소를 포함하는 방향족 고리를 포함하며, 피롤릴, 피리딜, 피리미디닐, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 아이속사졸릴, 싸이아졸릴, 아이소싸이아졸릴, 퀴놀릴, 인돌릴, 인데닐, 등과 같은 기를 포함한다.
[0023] 일부 경우에, 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티는 알킬 연결부를 통해 분자의 나머지 부분에 커플링될 수 있다. 이러한 경우, 치환체는 알케닐알킬, 알키닐알킬, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬로서 지칭될 것이며, 이는 알킬렌 모이어티가 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티와, 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 헤테로아릴이 커플링되는 분자 사이에 있음을 나타낸다.
[0024] 용어 “할로겐” 또는 “할로”는 브로모, 플루오로, 클로로 및 아이오도를 포함하는 것으로 이해된다.
[0025] 용어 “헤테로사이클릭 고리” 또는 “헤테로사이클릴”은 N, O, 또는 S 원자 중 적어도 하나를 포함하는 3-15 원 방향족 또는 비방향족 고리를 지칭하는 것으로 이해된다. 예시로는 피페리디닐, 피페라지닐, 테트라하이드로피라닐, 피롤리딘, 및 테트라하이드로퓨라닐, 뿐만 아니라 상기 용어 “헤테로아릴”에 대해 제공된 예시적인 기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릭 고리 또는 헤테로사이클릴은 비방향족이다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릭 고리 또는 헤테로사이클릴은 방향족이다.
[0026] “임의 치환된”은, 달리 명시되지 않는 한, 기(group)가 동일하거나 또는 상이한 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의) 치환기로 치환되거나 또는 비치환될 수 있음을 의미하는 것으로 이해된다. 치환기의 예로는, 비제한적으로, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, -CN, -ORaa, -SRaa, -NRaaRbb, -NO2, -C=NH(ORaa), -C(O)Raa, -OC(O)Raa, -C(O)ORaa, -C(O)NRaaRbb, -OC(O)NRaaRbb, -NRaaC(O)Rbb, -NRaaC(O)ORbb, -S(O)Raa, -S(O)2Raa, -NRaaS(O)Rbb, -C(O)NRaaS(O)Rbb, -NRaaS(O)2Rbb, -C(O)NRaaS(O)2Rbb, -S(O)NRaaRbb, -S(O)2NRaaRbb, -P(O)(ORaa) (ORbb), 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 또는 아릴을 포함하되, 여기서 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 및 아릴은 각각 독립적으로 Rcc으로 임의 치환되고, 여기서
Raa 및 Rbb는 각각 독립적으로 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 또는 아릴이거나, 또는
Raa 및 Rbb는 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 헤테로사이클릴을 형성하는데, 이는 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 하이드록실, 알콕시, 또는 -CN으로 임의 치환되고, 여기서:
각각의 Rcc는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 아릴, -CN, 또는 -NO2이다.
[0027] 본 명세서에서 사용 시, 달리 명확하게 지시되지 않는 한 단수형 용어 (“a”“an”등)의 사용은 하나 이상을 지칭한다.
[0028] 생분해성 베타-제거 링커를 포함하는 하이드로겔의 제조는 이전에, 예를 들어 미국 특허 9,649,385에 개시되어 있으며, 및 라이신 스페이서의 사용을 통해 도입된 작용기화 가능한(functionalizable) 아민 기를 추가로 포함하는 것은, 예를 들어 2019년 1월 31일자 PCT 출원 PCT/US2019/016090 및 2019년 4월 5일자 미국 가특허출원 62/830,280에 개시되어 있다. 베타-제거 링커에서 가교결합 절단 속도는 미국 특허 8,680,315에 개시된 바와 같이 R1 기의 구조에 의해 주로 결정되지만, 링커가 부착되는 아민 기의 염기도가 추가적인 역할을 하여, 라이신의 알파-아민틀 통해 부착된 가교결합은 동일한 반응 조건하에서 주어진 R1 에 대해 엡실론-아민을 통해 부착된 것 보다 더욱 빠르게 절단된다. 이러한 요인의 상호 작용은 예측가능하고 제어가능한 역학에 따라 생분해되는 하이드로겔의 제조를 가능하게 하며; 예를 들어, [Henise et al., Internat. J. Polymer Sci., Vol 2019, article ID 9483127]를 참조한다.
[0029] 하이드로겔의 다양한 성질은 가교결합의 정도, 및 이에 따른 멸균 공정 동안 가교가 절단되는 정도에 의존한다. 이러한 특성 중 하나는 특정 pH 및 온도에 놓여질 때 하이드로겔이 용해하는 시간이며, 이는 역겔화 시간 (reverse gelation time, trg)으로 알려져 있다. 가교와 trg 사이의 관계는 [Reid et al., Macromolecules 2015, 48: 7359-69]에 다음의 식 (1)으로 기재되어 있으며
Figure pct00003
여기서 t1/2,L2는 개별 가교의 절단에 대한 반감기이고, f는 하이드로겔 품질 인자이고, 하이드로겔 중 초기에 무작위로 분포된 절단된 가교결합의 초기 분획과 동일하다. 이에 따라, 가교결합이 멸균 공정 중에 절단되는 경우, trg는 초기의 멸균되지 않은 하이드로겔에 대해 감소할 것이다. 하기 실시예 3에 예시된 바와 같이, 멸균 중에 가교 절단이 허용될 수 있는 정도는 하이드로겔의 초기 품질 및 trg가 변할 수 있는 허용 오차에 의존한다. 멸균 후 하이드로겔의 trg 변화는 멸균 전 하이드로겔의 trg의 20% 이내, 바람직하게 15% 이내, 및 더욱 바람직하게 10% 이내이다.
[0030] 하이드로겔의 또 다른 중요한 특성은 멸균 후 작용기의 역가를 유지하는 것이다. 이러한 반응성 작용기는 약물 또는 방출가능한 링커-약물과 같은 페이로드의 후속의 화학적 유도체화 및 부착을 가능하게 하도록 존재할 수 있으며, 예를 들어 미국 특허 9,649,385, 2019년 1월 31일자 PCT 출원 PCT/US2019/016090 및 2019년 4월 5일자 미국 가특허출원 62/830,280에 개시되어 있다. 이러한 작용기는 멸균 완충에서 하이드로겔 또는 성분의 다른 부분에 대해 바람직하지 않은 작용성을 나타낼 수 있다. 이러한 작용기의 분석 방법은 기술 분야 내에 공지되어 있으며, 이러한 작용기가 아민인 경우에 대한 분석의 예가 하기 실시예에 제공된다.
[0031] 다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며 제한하고자 하는 것이 아니다.
제조 A
링커 안정성에 대한 PEG-링커-라이신 테스트 프로브
(R 1 = N,N-다이메틸설포닐 또는 모폴리노설포닐)
Figure pct00004
[0032] N(a)-(2,4-다이나이트로페닐)-N(e)-[(4-아지도-3,3-다이메틸-1-(N,N-다이메틸아미노설포닐)-2-뷰톡시카보닐)-L-라이신. [Santi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2012) 109: 6211-6]의 일반적인 절차에 따라 제조하였다. 2 mL의 MeCN 중의 4-아지도-3,3-다이메틸-1-(N,N-다이메틸아미노설포닐)-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (40 mg, 100 umol)의 용액을 N(a)-(2,4-다이나이트로페닐)-L-라이신 트라이플루오로아세테이트 염 (50 mg, 120 umol), 0.2 mL의 1 N NaOH, 0.4 mL의 1 M NaHCO3, 및 1.4 mL의 물의 혼합물에 첨가하였다. 10 분 후, 혼합물을 HCl으로 산성화하고 EtOAc으로 추출하였다. 추출물을 물 및 염수로 세척하고, MgSO4으로 건조하고, 여과하고, 증발시켜 생성물 (59 mg, 100 umol, 100%)을 황색 유리로서 수득하였다. HPLC는 단일 피크를 제공하며; LC-MS는 [M+H]+ m/z 589.1 (C21H33N8O10S+ m/z 589.2에 대한 계산치)를 나타냈다.
[0033] PEG10kDa-테트라사이클로옥틴에 대한 N(a)-(2,4-다이나이트로페닐)-N(e)-[(4-아지도-3,3-다이메틸-1-(N,N-다이메틸아미노-설포닐)-2-뷰톡시카보닐)-L-라이신의 컨쥬게이션. 0.2 mL의 MeCN 중의 단계 1의 생성물 (11.2 mg, 19 unmol)의 용액을 20 mM 아세테이트 완충액 (pH 5.0) 중의 10-kDa 4-아암 PEG-테트라사이클로옥틴 [10-kDa PEG-테트라아민 및 5-사이클로옥트-4-인일 석신이미딜 카보네이트로부터 제조] (사이클로옥틴 중 56.6 mM, 0.265 mL, 15 umol 사이클로옥틴)의 용액에 첨가하고, 12 시간 동안 50 ℃에서 유지하였다. 용액을 메탄올에 대해 투석하여 (SpectraPor2 멤브레인, 12-14 kDa 컷오프) 컨쥬게이션되지 않은 물질을 제거한 다음, 농축 건조하여 컨쥬게이트 (43 mg, 90%)를 제공하고, 이를 1 mL의 물에 용해시켜 스톡 용액을 제공하였다. HPLC는 < 0.1%의 유리 DNP-라이신을 나타냈다.
[0034] R1 = 모폴리노설포닐을 가지는 상응하는 컨쥬게이트는 4-아지도-3,3-다이메틸-1-(모폴리노설포닐)-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트로 출발하여 동일한 절차에 의해 제조하였다.
제조 B
아미노-하이드로겔 미소구체의 제조
(R 1 = N,N-다이메틸설포닐 또는 모폴리노설포닐)
[0035] 아미노-하이드로겔 미소구체는 2019년 1월 31일자 PCT 출원 US2019/016090 (실시예 4 참조) 및 2019년 4월 5일자 미국 가특허출원 62/830,280 (실시예 14 참조)에 기재된 바와 같이 제조하였으며, 상기 특허는 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
[0036] 요약하면, 미소구체는 도시된 바와 같이 예비중합체로부터 형성된다.
Figure pct00005
[0037] C 및 C' 기는 반응하여 연결 작용기, C*를 형성한다. C 또는 C' 중 하나에 대한 예비중합체 연결은 화학식(3)과 같은 분자와의 반응에 의해 유도된 절단가능한 링커를 추가로 포함하여, 하이드로겔의 각 가교에 절단 가능한 링커를 도입할 수 있다.
Figure pct00006
여기서, n = 0-6이고, R1 및 R2는 독립적으로 전자-끄는 기, 알킬, 또는 H이되, 여기서 R1 및 R2 중 적어도 하나는 전자-끄는 기이고; 각각의 R4는 독립적으로 C1-C3 알킬이거나 또는 함께 3-6 원 고리를 형성할 수 있고; X는 할로겐, 활성 에스터 예컨대 N-석신이미딜옥시, 나이트로페녹시, 또는 펜타할로페녹시, 또는 이미다졸릴, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 또는 N(R6)CH2Cl이되, 여기서 R6는 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 또는 임의 치환된 헤테로아릴이고; Z는 링커를 거대분자 담체에 연결하기 위한 작용기이다. 일부 구현예에서, n은 1-6이다. 보다 일반적으로, 본 발명에 사용하기 적합한 하이드로겔은 화학식 (4)의 베타-제거 링커를 포함하는 가교결합을 포함하며
Figure pct00007
여기서
m은 0 또는 1이고;
X는 가교제를 제1 중합체에 연결하는 작용기를 포함하고;
R1, R2, 및 R5 중 적어도 하나는 가교제를 제2 중합체에 연결하는 작용기 Z를 포함하고;
여기서 R1 및 R2 중 하나만이 H일 수 있거나 또는 각각 임의 치환된, 알킬, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬일 수 있고;
R1 및 R2 중 적어도 하나 또는 둘 모두는 독립적으로 CN; NO2;
임의 치환된 아릴;
임의 치환된 헤테로아릴;
임의 치환된 알케닐;
임의 치환된 알키닐;
COR3 또는 SOR3 또는 SO2R3이되, 여기서
R3는 H 또는 임의 치환된 알킬;
각각 임의 치환된, 아릴 또는 아릴알킬;
각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이거나;　또는
OR9 또는 NR9 2이되, 각 R은 독립적으로 H 또는 임의 치환된　알킬이거나, 또는 두 개의 R9 모두 이들이 부착되는 질소와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
SR4이되, 여기서
R4는 임의 치환된 알킬;
각각 임의 치환된, 아릴 또는 아릴알킬;
각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이고;
여기서 R1 및 R2는 결합되어 3-8 원 고리를 형성할 수 있고;
각 R5는 독립적으로 H이거나 또는 알킬, 알케닐알킬, 알키닐알킬, (OCH2CH2)p O-알킬 (여기서 p=1-1000), 아릴, 아릴알킬이거나, 또는 각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이다. X는 일반적으로 카바메이트 O-(C=O)-NH이고; Z는 일반적으로 트라이아졸 (아자이드를 알킨 또는 사이클로옥틴에 고리화첨가하여 생성)이거나 또는 카복사마이드 또는 카바메이트이다; 그러나, 2019년 1월 31일자 PCT 출원 PCT/US2019/016090 및 2019년 4월 5일자 미국 가특허출원 62/830,280 (실시예 14 참조)에 개시된 바와 같은 다른 옵션도 적합하다.
[0038] 상기 예시에서, 제1 예비중합체는 4-아암 PEG를 포함하며, 여기서 각각의 아암은 두 개의 상호-비반응성 (“직교”) 작용기 B 및 C를 가지는 어댑터 유닛으로 종결된다. B 및 C는 초기에 보호된 형태로 존재하여, 후속 단계에서 선택적인 화학 작용을 할 수 있다. 어댑터 유닛은 아미노산 유도체, 구체적으로 라이신, 시스테인, 아스파르테이트, 또는 글루타메이트의 유도체를 비롯하여 알파-아민 기가 아자이드로 전환된 유도체, 예를 들어 2-아자이도글루타르산의 모노에스터일 수 있다. 어댑터 유닛은 연결 작용기 A*를 통해 각각의 제1 예비중합체 아암에 연결되고, 이는 각각의 예비중합체 아암 상의 작용기 A와 어댑터 유닛 상의 동족 작용기 A'의 축합에 의해 형성된다. 제2 예비중합체는 4-아암 PEG을 포함하며, 여기서 각각의 아암은 제1 예비중합체의 C 기와 상보적인 반응성을 가지는 작용기 C'로 종결되어, C 및 C'가 반응하여 C*를 형성할 때 두 예비중합체 사이에서 가교가 일어난다.
[0039] 예시적인 예로서, H-Lys(Boc)-OH는 Z = 아자이드인 화학식(3)의 링커로 아실화되어 어댑터 유닛을 제공하였다. 이것은 20-kDa 4-아암 PEG-테트라아민에 커플링되며, Boc 기는 제거되어 A* = 아마이드, B = NH2, 및 C = 아자이드인 제1 예비중합체를 제공하고, 여기서 절단 가능한 화학식(3)의 링커는 각각의 아암과 제1 예비중합체의 C 기 사이에 연결부로 혼입된다. 상응하는 제2 예비중합체는 20-kDa 4-아암 PEG-테트라아민을 5-사이클로옥티닐 석신이미딜 카보네이트로 아실화하여 제조하였고, C' = 사이클로옥틴인 제2 예비중합체를 제공한다. 제1 및 제2 예비중합체를 혼합할 때, C = 아자이드 및 C' = 사이클로옥틴 기의 반응은 상응하는 트라이아졸 기를 형성하며 이에 따라 두 예비중합체를 3차원 네트워크로 가교 결합시키고, 각각의 가교 결합은 화학식(3)의 화합물의 혼입으로부터 생성된 절단 가능한 링커를 포함하며, 여기서 제1 예비중합체의 혼입으로부터 생성된 각각의 노드(node)는 나머지 작용기 B = NH2를 포함하는데 이는 추가적인 링커, 약물, 형광단, 금속 킬레이터, 등의 부착을 위해 유도체화될 수 있다. 이러한 유형의 하이드로겔은 다양한 크기, 예를 들어 5-, 10-, 20, 및 40-kDa의 PEG를 사용하여 제조하였다. 이러한 하이드로겔의 미소구체 현탁액은 일반적으로 20-100 um 직경의 입자를 포함하지만, 다른 크기 및 물리적 형상의 하이드로겔이 생성될 수 있다. 증기 멸균 하에서 하이드로겔의 안정성은 주로 베타-제거에 의한 가교제 절단 속도에 의해 제어되며; 이는 링커의 특성 및 매질의 pH과 온도에 의존하지만 PEG 또는 하이드로겔의 크기 및 형상과는 무관하므로, 이러한 하이드로겔 구조의 모든 변이체는 본 발명에 사용하기 적합하다.
실시예 1
PEG-링커-라이신 테스트 프로브의 안정성
A. 절단 속도의 온도 의존성.
[0040] R1 = 모폴리노설포닐인 제조 A의 테스트 프로브를 25 ℃에서 pH = 7.4인 0.1 M 포스페이트 완충액 (포스페이트 완충액의 pH는 넓은 온도 범위에 걸쳐 본질적으로 일정함, [Reinecke et al., Int. J. Food Properties (2011) 14:4, 870-881] 참조)을 HPLC 오토샘플러 바이알에 넣은 다음, 설정 온도에서 인큐베이션하였다. 분취량을 주기적으로 제거하고 1/10 부피의 1 N HCl를 첨가하여 ??칭한 다음, 10 μL를 C18 컬럼 (Phenomenex Jupiter, 300 A, 5 um, 4.6 x 150 mm)에 주입하고, 0-100% MeCN/물/0.1% TFA의 선행 구배로부터 10 분에 걸쳐 용리하고 350 nm에서 분석하여, 방출된 DNP-라이신에 대해 HPLC로 분석하였다. 유리 DNP-라이신의 형성은 % 반응 = (AUC DNP-라이신)/[(AUC DNP-라이신)+(AUC 컨쥬게이트)] x 100로서 정량화하였으며, 여기서 AUC는 곡선 아래 면적이다. 반응 속도 상수 (h-1)는 ln(% 반응) 대 시간 (hr)의 기울기로부터 계산하였다.
[0041] 속도는 37, 60, 및 80 ℃에서 결정한 다음, Arrhenius에 따라 ln(k) 대 1/T를 플로팅하여 분석하였으며, 여기서 T는 반응 온도 (°K)이다. 이것은 ln(k) = 39.047 - 14077/T인 선형 관계를 제공하여, 도 5에 도시된 바와 같이 A = 9.07 x 1016 h-1 및 Ea = 117 kJ/mol를 제공하였다.
B. pH의 영향
[0042] 완충액 중의 PEG-링커-라이신 테스트 프로브 용액을 고압멸균 사이클에 적용한 다음, HPLC로 분석하여 방출된 DNP-라이신을 결정함으로써 링커 절단의 정도를 측정하였다. 테스트 프로브 스톡 (0.1 mL)을 2-mL 스크류 캡 오토샘플러 바이알에서 1.0 mL의 완충액으로 희석하였다. 사용된 완충액 (및 25 ℃에서의 pH)는 다음과 같다:
0.125 M HEPES (pH 7.6),
0.1 M 시트레이트 (pH 5.0 및 4.0),
0.1 M 글리신 (pH 2.0).
[0043] 바이알을 밀봉하고 (a) 5.80 psia로 배출; (b) 20 분의 유지 시간으로 121 ℃로 가열; (c) ~1.5 시간에 걸친 97 ℃로 냉각으로 구성된 반복 표준 고압멸균 사이클에 적용한 다음, 주위 온도로 냉각시키고 분석하였다. 고압멸균 온도는 100 mL 유리 GL45 매질 보틀의 50 mL의 물에 침지된 프로브로 모니터링하였다. 사용된 고압멸균는 Sterivap 모델 669 고압멸균 (BMT Medical Technology)였다. 샘플은 HPLC로 분석하여, 10 μL를 C18 컬럼 (Phenomenex Jupiter, 300 A, 5 um, 4.6 x 150 mm)에 주입하고, 0-100% MeCN/물/0.1% TFA의 선행 구배로부터 10 분에 걸쳐 용리하고 350 nm에서 분석하였다.
[0044] 유리 DNP-라이신의 형성은 % 반응 = (AUC DNP-라이신)/[(AUC DNP-라이신)+(AUC 컨쥬게이트)] x 100로서 정량화하였다. 표 1은 R1 = (N,N-다이메틸아미노)설포닐일 때 첫 번째 고압멸균 사이클 이후 링커 절단의 관찰 및 추정량을 제공한다.
표 1. 121 ℃에서 SO2N(CH3)2 조절제를 사용한 β-제거 링커의 추정 및 측정된 절단
pH, 25 ℃ a) t 1/2 , 37 ℃,
계산치. 		pH 121 ℃
계산치. 		t 1/2 , 121 ℃,
계산치. 		% 생성물/사이클,
121 ℃, 계산치. b) 		% 생성물/사이클,
121 ℃, 관찰치.
7.6 A 100 d 6.2 4.3 h 5% 13%
6.0 6.9 y 5.7 13.5 h 1.7% 3.8%
5.0 69 y 5.0 68 h 0.3% 1.9%
4.0 690 y 4.0 28 d ~0% 0.1%
2.0 69,000 y 2.0 7.7 y ~0 0.2%
a) 완충액의 pH는 25 ℃에서 측정하고 보고된 온도 계수를 사용하여 121 ℃에서 추정하였다. 완충액, 25 ℃에서의 pH 값 및 ΔpH/ΔT 값은 각각 다음과 같다: Hepes, pH 7.4, -0.014; 포스페이트, pH 6, -0.0028; 프탈레이트, pH 5, -0.00013; 글리신, pH 2, +0.00044; b) 계산은 121 ℃에서 계산된 pH를 사용한다; 계산치는 사이클의 느린 냉각 기간을 포함하지 않으며 관찰치보다 낮을 것으로 예상된다.
[0045] 8개의 연속적인 고압멸균 사이클에 대한 이러한 누적 결과는 도 1에 도시되어 있다. pH 4.0에서, 링커는 사이클당 0.11%로 절단되었고 8개의 연속적인 사이클 후 >99% 온전하였다. pH 5.0에서, 링커는 사이클당 0.77%로 절단되었다.
실시예 2
아미노-하이드로겔 미소구체의 고압멸균 멸균 테스트
[0046] 2 mL 오토샘플러 바이알에서 R1이 (N,N-다이메틸아미노)설포닐인 제조 B의 ~ 1.5 mL의 아미노-하이드로겔 미소구체의 멸균을 실시예 1와 같이 수행한 다음, 물리적 파라미터의 변화에 대해 현미경으로 분석하고 구조의 변화에 대해 역 겔화에 대한 시간 및 유리 아민 함량으로 분석하였다.
[0047] 광학 현미경에 의한 육안 검사는 미소구체 형태에 큰 변화가 없음을 나타낸다. 미소구체 슬러리의 100 mg 샘플을 0.700 mL 50% DMF/H2O v/v으로 희석하였다. 혼합물의 0.200 mL 샘플을 현미경 슬라이드 (VWR, 48300-026)에 배치하고 5x 대물렌즈 (Nikon E 4/0.10, 160/- NA) 및 단색 CCD 카메라 (Unibrain, Fire-I 580b)가 장착된 백색 광현미경 (Nikon TMS, SN: 51436)을 사용하여 이미지를 수집하였다. 3개의 이미지로부터 이미지 분석 소프트웨어 (Image J v 1.52a)를 사용하여 입자 직경 (N = ≥150)을 측정하였다. 소프트웨어는 현미경 스테이지 마이크로미터 (Electron Microscopy Sciences, 60210-3PG)의 이미지를 측정하여 픽셀을 μm (1.98μm 픽셀-1)로 변환하도록 보정하였다. 관찰된 미소구체의 묘사는 도 2에 도시되어 있다.
[0048] 결과가 표 2에 나타난다.
표 2. pH 4에서 고압멸균 전후의 아민-MS의 특성.
완충액 사이클 횟수 외관 입자 크기 (mm) a) nmol 아민/mg PEG b) t RG , hr
시트레이트 0 정상적 67 ± 6 110 ± 11 23
시트레이트 1 정상적 67 ± 4 110 ± 30 23
2 정상적 65 ± 4 94 ± 7 25
3 정상적 66 ± 14 89 ± 6 27
4 정상적 64 ± 4 83 ± 17 26
아세테이트 1 정상적 69 ± 14 120 ± 20 25
2 정상적 69 ± 15 120 ± 10 25
3 정상적 67 ± 11 110 ± 4 25
4 정상적 65 ± 4 110 ± 10 23
포스페이트 1 정상적 64 ± 14 120 ± 10 25
2 정상적 64 ± 14 110 ± 120 25
3 정상적 62 ± 13 110 ± 10 23
4 정상적 59 ± 11 110 ± 20 26
a) 평균 ± SD, >50 미소구체 측정치; b) 평균 ± SD, 4회 반복 측정.
[0049] 아민 및 PEG 함량을 결정하기 위해, 100 mg 분취량의 미소구체 슬러리를 0.900 mL의 50 mM NaOH에 용해시켰다. 용해된 MS의 0.060 mL 샘플 중 아민 함량은 [Schneider et al., Bioconj Chem (2016) 27: 1210]에 기재된 바와 같이 TNBS (2,4,6-트라이나이트로벤젠설폰산 용액)을 사용하여 측정하였다. PEG 분석을 위해, 상기 용해된 미소구체 용액의 0.020 mL 분취량을 0.980 mL H2O으로 희석하고 1.00 mL의 0.5 M HClO4으로 산성화하였다. 0.200 mL 분취량을 96 웰 미세역가 플레이트로 옮긴 후, 각각을 BaCl2 및 0.025 mL의 Lugol 용액의 5% w/v 혼합물 0.050 mL (0.18% w/w I2 및 0.35% w/w KI) 으로 처리하였다. 5 분 후, 플레이트 판독기를 사용하여 A535를 측정하였다. PEG 함량은 DMF 표준을 사용하여 NMR에 의해 사전 보정된 8000 MW 선형 PEG 표준의 1.25- 내지 10 ug mL-1 에서 생성된 A535 대 [PEG]의 표준 곡선으로부터 결정하였다 (Alvares et al., Anal. Chem. (2016) 88: 3730). 아미노-MS 중 nmol 아민/mg PEG 비율은 동일한 용액으로부터 유리 아민 및 PEG의 측정치를 사용하여 계산하였다.
[0050] 역 겔화 시간을 결정하기 위해, 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 있는 0.5 mL 미소구체 슬러리 샘플을 5분 동안 21,000 g에서 펠릿화하여 100 mM HEPES (pH 7.6) 3 x 1 mL로 세척하였다. 펠릿을 DMSO 중 0.020 mL의 10 mM 5-카복시플루오레세인 HSE로 30분 동안 처리하였다. MS를 3 x 1 mL 물 및 3 x 1 mL 100 mM NaOAc으로 세척하였다. 미소구체 용해 곡선은 보고된 바와 같이 37 ℃에서 pH 9.4인 2.5 mL의 100 mM 보레이트 완충액에서 0.1 mL 샘플에 대해 결정하였다 (Schneider et al., Bioconj Chem (2016) 27: 1210). 선형 회귀는 가용화율이 50% 내지 95%인 영역에 대해 수행하였다. 100% 가용화율에서의 시간은 다음의 식: tRG = 100-Y 절편/기울기로부터 계산하였다. 용해 곡선이 도 3A-3C에 도시되어 있다. 역 겔화 시간은 7% 표준 편차 내에서 일정한 것으로 관찰되었고, 동일한 샘플(8%)을 4회 반복하여 얻은 오류와 유사하였다.
[0051] 아민 기 대 PEG의 비율은 포스페이트 또는 아세테이트 완충액에서 고압멸균를 거친 아미노-하이드로겔 미소구체에 대해 안정적이었지만, 아민 기의 손실 (사이클당 ~7%)이 시트레이트 완충액에서 관찰되었다 (도 4). 이것은 고압멸균 사이클 동안 시트르산 무수물의 형성 및 후속 아민 시트로일화로 인한 것으로 가정한다 ([Chumsae et al., Anal.Chem. (2014) 86: 8932]).
[0052] 최종 아미노 하이드로겔 미소구체의 멸균성은 USP 71 지침에 따라 입증하였다. 고압멸균된 하이드로겔은 검출 가능한 미생물 성장을 나타내지 않았다.
실시예 3
증가된 온도에 대한 하이드로겔 노출로 인한 가교 손실 계산
[0053] 고압멸균에 의한 멸균 동안 베타-제거 링커를 포함하는 하이드로겔의 분해에 대한 메커니즘 중 하나는 고온에서 링커 절단으로 인한 가교의 손실이 가속화된다는 것이다. 예를 들어, 더 높은 온도에서 아민과 같은 작용기의 향상된 반응성과 같은 다른 메커니즘도 적용할 수 있다.
[0054] 특정 온도 및 pH에서 개별 가교결합의 절단 속도는 제조 A에 기재된 바와 같이 하이드로겔의 개별 가교결합 단위를 나타내며 HPLC와 같은 표준 분석 방법에 의해 절단에 대해 용이하게 분석될 수 있는 PEG-링커-라이신 프로브의 연구를 통해 추정될 수 있다. 베타-제거 절단 반응은 수산화물에서 1차 반응이므로, 절단 속도는 다음의 식 2에 따라 각 pH 단위가 변할 때마다 10배 변화하는 것이 입증되었다 (Santi et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 2011, 109(16): 6211-6):
Figure pct00008
[0055] 반응의 온도 의존성은 다음의 Arrhenius 식 (식 3)에 의해 설명되며
Figure pct00009
여기서 k는 속도 상수( = ln(2)/t1/2,L2), T는 °K 단위의 온도, A는 전지수 인자, Ea는 활성화 에너지, 및 R은 보편적인 기체 상수이다. A 및 Ea는 온도에 따른 반응 속도 변화 연구를 통해 실험적으로 결정되며, 다른 온도에서 반응 속도를 예측하는 데 사용할 수 있다. 37 내지 80 ℃ 사이의 실험 데이터에 기초하여, 엡실론-아민에 부착된 라이신을 가지는 R1 = 화학식 2의 모폴리노설포닐을 가지는 PEG-링커-라이신의 절단에 대한 Arrhenius 플롯의 예가 도 5에 도시된다. 데이터는 활성화 에너지 Ea = 117 kJ/mol를 추정한다. Me2N-SO2 및 4-(CF3)-페닐-SO2로서 R1에 대한 유사한 데이터가 표 3에 나타난다.
표 3. 링커 절단에 대한 Arrhenius 파라미터
R1 t1/2
(h @ 37 ℃, pH 7.4)		 A
(s-1)		 Ea
(kJ/mol)
4-CF3)-페닐-SO2 14 1.9 x 1013 107.0
모폴리노-SO2 400 2.5 x 1013 117.0
Me2N-SO2 1672 7.7 x 1013 123.5
[0056] 하이드로겔의 가교 절단 속도는 온도에 따라 기하급수적으로 증가하지만, pH가 낮아짐에 따라 절단 속도는 기하급수적으로 감소한다. 식 (2)와 (3)을 결합하여, T1에서 T2 (Kelvin 도 단위)로의 온도 변화로 인한 링커 절단 속도를 보상하는 데 필요한 pH 변화는 다음의 식 (4)로 계산할 수 있다:
Figure pct00010
[0057] 따라서 베타-제거 링커를 포함하는 하이드로겔의 안정성이 일련의 온도 및 pH 조건인 T1 및 pH1에서 알려진 경우에, 절단 반응에 대한 활성화 에너지 Ea 가 알려진 경우 하이드로겔이 온도 T2에서 동등하게 안정한 pH 값인 pH2를 계산하는 것이 가능하다. 예로서, 상기 기재된 바와 같이 Ea = 117 kJ/mol인 베타-제거 링커에 의해 가교된 하이드로겔의 경우, 이러한 하이드로겔이 pH 7.4 및 37 ℃ (310.14 °K)에서 1 시간 동안 특정 양의 가교 절단을 겪는다면, 121 ℃ (394.14 °K)에서 1 시간 동안 동일한 양의 가교 절단은 pH2 = 3.2 (DpH = 4.2)에서 관찰될 것이다.
[0058] 이러한 관계는 베타-제거 링커를 포함하는 하이드로겔의 고압멸균 멸균에 대한 적합한 조건을 추정하는 데 사용될 수 있다. 가교제의 절단 속도와, 이에 따른 과정에 대한 활성화 에너지는 R1 및 상기 기재된 스페이서 연결의 특성에 의해 결정된다. 가교제 절단의 허용 가능한 수준을 정의함으로써, 예를 들어 멸균 공정 동안 탈겔화 시간 tRG의 가변성에 대한 제한을 설정하고, Ea를 알면, 적합한 멸균 pH 값을 추정할 수 있다. 식 (1)로부터, t1/2,L2의 개별 절단 반감기를 가지는 링커에 포함된 하이드로겔의 f1에서 f2로의 가교 정도를 변화시키는 trg의 영향은 다음의 식 (5)에 의해 주어진다
Figure pct00011
[0059] Δtrg의 분수 변화로 표현하면 다음과 같다 (식 6):
Figure pct00012
[0060] 이에 따라, 100% 초기 가교결합 (즉, f1 = 0)로 구성된 완벽한 하이드로겔의 경우, 멸균 동안 이러한 가교결합의 10% (즉, f2 = 0.1)의 절단은 멸균 공정 동안 하이드로겔에 발생할 수 있는 임의의 다른 구조적 변화를 무시하고 trg에서 11% 감소를 초래해야 한다. 초기의 불완전한 하이드로겔의 경우, trg에 대한 가교의 이러한 손실의 영향이 더 크다: 예를 들어, f1 = 0.2일 때 f2 = 0.28로의 가교에서 10%의 손실은 trg에서 15% 변화를 초래하고, 예를 들어, f1 = 0.3일 때 f2 = 0.27로의 가교에서 10%의 손실은 trg에서 18% 변화를 초래한다. 내에서 trg를 유지하는 것이 바람직한 경우
[0061] 반대로, X = Δrg/trg의 계수 내에서 trg를 유지하는 것이 바람직한 경우, f2 값을 다음의 식 (7)과 같이 유지해야 한다
Figure pct00013
[0062] 식 (7)로부터, 표 3은 주어진 허용 오차 내에서 Δrg/trg를 유지하는 가교 Δ= f2 - f1의 최대 허용가능한 손실을 보여준다. 이러한 표에서, trg에 대한 5%의 허용 오차를 유지하기 위해 완벽한 하이드로겔 (f1 = 0)로부터 가교의 4.6% 미만, 초기에 이론적 가교결합 수의 80%를 가지는 하이드로겔 (f1 = 0.2)로부터 가교의 2.8% 미만의 손실이 필요한 것을 알 수 있다.
표 4. 절단된 가교결합 f1의 초기 분획을 가지는 하이드로겔에 대한 탈겔화 시간 Δrg/trg의 결과적인 분획 변화에 대한 ΔF의 계산된 값
Δf = f2 - f1
Δtrg/trg -0.05 -0.1 -0.15 -0.2
f1
0 0.0460 0.0899 0.1317 0.1717
0.05 0.0414 0.0809 0.1188 0.1550
0.1 0.0369 0.0722 0.1061 0.1386
0.15 0.0325 0.0637 0.0937 0.1226
0.2 0.0282 0.0555 0.0817 0.1071
0.25 0.0241 0.0475 0.0701 0.0919
0.3 0.0202 0.0398 0.0588 0.0773
0.35 0.0164 0.0324 0.0479 0.0631
0.4 0.0128 0.0253 0.0375 0.0495
[0063] 멸균 동안 가교 절단의 최대 허용가능한 정도를 알면, 고압멸균에 요구되는 완충액 pH는 식 (3)의 Arrhenius 관계를 사용하여 온도 및 시간의 멸균 조건 하에서 개별 링커 절단 속도를 기반으로 추정할 수 있다. 예를 들어, R1 = 모폴리노설포닐 (pH 7.4, 37 ℃에서 절단 t1/2 = 400 h) 및 도 1에 도시된 Arrhenius 관계를 가지는 가교제는 pH 7.4, 121 ℃에서 절단 t1/2 = 0.025 h (k = 28 h-1)를 가지는 것으로 예측된다. 가교결합 절단이 1차 반응임에 따라, 시간 T에 따라 절단된 가교결합 분획은 1- exp(-kT)로서 주어진다. 따라서 121 ℃, pH 7.4에서, 20 분 동안 멸균하면 본질적으로 하이드로겔이 단량체 단위로 완전히 파괴된다 (99.99% 가교 절단). 그러나, pH 5에서는 반응이 251배 느려져, 가교결합의 3.6%만 절단되고 pH 4에서는 0.4%만 절단된다. 표 3에서, pH 5는 f1 = 0.3까지의 초기 품질의 하이드로겔에 대해 trg을 10% 이내로 유지하는 점에서 만족스러운 결과를 제공할 것임을 알 수 있는 반면, pH 4는 trg의 5% 허용 오차 이내의 모든 하이드로겔에 대해 만족스러운 결과를 제공할 것으로 예상된다. 실제로, 하이드로겔은 느린 냉각 기간이 필요하기 때문에 장기간 상승된 온도에서 노출되며, 하이드로겔이 멸균 온도 (121 ℃)에서 1 시간 동안 유지되는 실제보다 낮은 추정치는 pH 4가 1.1% 절단을 제공할 것으로 추정하며, 다시 trg에서 5%의 허용 오차를 유지하는데 적합하다.
실시예 5
분해성 PEG-하이드로겔의 제조
Figure pct00014
[0064] 본 발명의 하이드로겔은 반응하여 연결 작용기, C*를 형성할 수 있는 C 및 C'기를 포함하는 두 가지 예비중합체의 중합에 의해 제조한다. C 또는 C' 중 하나에 대한 예비중합체 연결은 화학식(3)의 분자와의 반응에 의해 유도된 절단가능한 링커를 추가로 포함하여, 하이드로겔의 각 가교에 절단 가능한 링커를 도입할 수 있다.
[0065] 하나의 구체예에서, 제1 예비중합체는 4-아암 PEG를 포함하며, 여기서 각각의 아암은 두 개의 상호-비반응성 (“직교”) 작용기 B 및 C를 가지는 어댑터 유닛으로 종결된다. B 및 C는 초기에 보호된 형태로 존재하여, 후속 단계에서 선택적인 화학 작용을 할 수 있다. 특정 구체예에서, 어댑터 유닛은 아미노산 유도체, 구체적으로 라이신, 시스테인, 아스파르테이트, 또는 글루타메이트의 유도체를 비롯하여 알파-아민 기가 아자이드로 전환된 유도체, 예를 들어 2-아자이도글루타르산의 모노에스터이다. 어댑터 유닛은 연결 작용기 A*를 통해 각각의 제1 예비중합체 아암에 연결되고, 이는 각각의 예비중합체 아암 상의 작용기 A와 어댑터 유닛 상의 동족 작용기 A'의 축합에 의해 형성된다. 제2 예비중합체는 4-아암 PEG을 포함하며, 여기서 각각의 아암은 제1 예비중합체의 C 기와 상보적인 반응성을 가지는 작용기 C'로 종결되어, C 및 C'가 반응하여 C*를 형성할 때 두 예비중합체 사이에서 가교가 일어난다.
[0066] 예시적인 실시예로서, 제1 예비중합체는 다음과 같이 제조하였다. H-Lys(Boc)-OH를 Z = 아자이드인 화학식(3)의 링커로 아실화하여, A = COOH, B = Boc-보호된 NH2, 및 C = 아자이드인 어댑터 유닛을 제공하였다. 이는 20-kDa 4-아암 PEG-테트라아민에 커플링되며, Boc 기는 제거되어 A* = 아마이드, B = NH2, 및 C = 아자이드인 제1 예비중합체를 제공하고, 여기서 절단 가능한 화학식(3)의 링커는 각각의 아암과 제1 예비중합체의 C 기 사이에 연결부로 혼입된다. 상응하는 제2 예비중합체는 20-kDa 4-아암 PEG-테트라아민을 5-사이클로옥티닐 석신이미딜 카보네이트로 아실화하여 제조하였고, C' = 사이클로옥틴인 제2 예비중합체를 제공한다. 제1 및 제2 예비중합체를 혼합할 때, C = 아자이드 및 C' = 사이클로옥틴 기의 반응은 상응하는 트라이아졸 기를 형성하며 이에 따라 두 예비중합체를 3차원 네트워크로 가교 결합시키고, 각각의 가교 결합은 화학식(3)의 화합물의 혼입으로부터 생성된 절단 가능한 링커를 포함하며, 여기서 제1 예비중합체의 혼입으로부터 생성된 각각의 노드(node)는 나머지 작용기 B = NH2를 포함하는데 이는 추가적인 링커, 약물, 형광단, 금속 킬레이터, 등의 부착을 위해 유도체화될 수 있다.
A* = 아마이드, B = 아민, 및 C = 아자이드인, 예비중합체 A
Figure pct00015
(1) N α -Boc-N ε -{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸옥시카보닐}-Lys-OH
[0067] 28 mL의 H2O 중의 Boc-Lys-OH (2.96 g, 12.0 mmol) 용액을 1 M NaOH 수용액 (12.0 mL, 12.0 mmol), 1 M NaHCO3 수용액 (10.0 mL, 10.0 mmol), 및 50 mL의 MeCN 중의 O-{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸}-O'-석신이미딜 카보네이트 (3.91 g, 10.0 mmol, 0.1 M 최종 농도)의 용액으로 연속적으로 처리하였다. 주위 온도에서 2 시간 동안 교반한 후, C18 HPLC (ELSD)에 의해 반응이 완료된 것으로 판단하였다. 반응을 30 mL의 1 M KHSO4 (aq)으로 켄칭하였다. 혼합물을 500 mL의 1:1 EtOAc:H2O 사이에 분배하였다. 수상을 100 mL의 EtOAc으로 추출하였다. 조합된 유기상을 H2O 및 염수 (각 100 mL)으로 세척한 다음 MgSO4로 건조하고, 여과하고, 회전 증발로 농축하여 백색 발포체로서 미정제 표제 화합물 (5.22 g, 9.99 mmol, 99.9% 미정제 수율)을 제공하였다.
C18 HPLC, ELSD에 의해 계산된 순도: 99.1% (RV = 9.29 mL).
LC-MS (m/z): 계산치, 521.2; 관찰치, 521.3 [M-H]-.
(2) N α -Boc-N ε -{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸옥시카보닐}-Lys-OSu. 다이사이클로헥실카보다이이미드 (자일렌 중의 60%, 2.6 M, 4.90 mL, 12.7 mmol)를 98 mL의 CH2Cl2 중의 N α -Boc-N ε -{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸옥시카보닐}-Lys -OH (5.11 g, 9.79 mmol, 0.1 M 최종 농도) 및 N-하이드록시석신이미드 (1.46 g, 12.7 mmol) 용액에 첨가하였다. 반응 현탁액을 주위 온도에서 교반하고 C18 HPLC (ELSD)으로 모니터링하였다. 2.5 시간 후, 반응 혼합물을 여과하고, 여액을 SiliaSep 120 g 컬럼에 로딩하였다. 생성물을 헥산 중의 아센톤의 단계적 구배 (각 0%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 240 mL)로 용출시켰다. 깨끗한 생성물-함유 분획을 조합하고 농축하여 백색 발포체로서 표제 화합물 (4.95 g, 7.99 mmol, 81.6% 수율)을 수득하였다.
C18 HPLC, ELSD에 의해 계산된 순도: 99.7% (RV = 10.23 mL).
LC-MS (m/z): 계산치, 520.2; 관찰치, 520.2 [M+H-Boc]+.
(3) (N α -Boc-N ε -{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸옥시카보닐}-Lys) 4 -PEG 20kDa .
[0068] PEG20kDa-(NH)4 (20.08 g, 0.9996 mmol, 3.998 mmol NH2, 0.02 M NH2 최종 농도)를 145 mL의 MeCN에 용해시켰다. 50 mL의 MeCN 중의 N α -Boc-N ε -{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸옥시카보닐}-Lys-OSu (2.976 g, 4.798 mmol) 용액을 첨가하였다. 반응물을 주위 온도에서 교반하고 C18 HPLC (ELSD)으로 분석하였다. 출발 물질은 3 개의 느린 용출 중간체 피크를 통해 단일 생성물 피크로 전환되었다. 1 시간 후, Ac2O (0.37 mL, 4.0 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 교반 30 분 더 교반한 다음 회전 증발로 ~50 mL으로 농축하였다. 반응 농축물을 400 mL의 교반되는 MTBE에 첨가하였다. 혼합물을 교반 주위 온도에서 30 분간 교반한 다음 따라내었다. MTBE (400 mL)를 습윤 고체에 첨가하고, 현탁액을 5 분간 교반하고 따라내었다. 고체를 진공 필터로 옮기고, 3x 100 mL의 MTBE로 세척/분쇄하였다. 필터에서 10분 동안 건조시킨 다음, 무게를 잰 250mL HDPE 포장 병으로 고체를 옮겼다. 잔류 휘발성 물질을 중량이 안정화될 때까지 고진공 하에서 제거하여 백색 고체로서 표제 화합물 (21.23 g, 0.9602 mmol, 96.1% 수율)을 제공하였다.
C18 HPLC, ELSD에 의해 결정된 순도: 89.1% (RV = 10.38 mL) 및 불순물 10.6% (RV = 10.08).
(4) (N ε -{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸옥시카보닐}-Lys) 4 -PEG 20kDa .
[0069] (Nε-{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸옥시카보닐}-Lys)4-PEG20kDa (19.00 g, 0.8594 mmol, 3.438 mmol Boc, 0.02 M Boc 최종 농도)를 86 mL의 1,4-다이옥산에 용해시켰다. PEG를 완전히 용해시키기 위해 5 분간 교반한 후, 다이옥산 중의 4 M HCl (86 mL, 344 mmol HCl)를 첨가하였다. 반응물을 주위 온도에서 교반하고 C18 HPLC (ELSD)으로 분석하였다. 출발 물질은 3 개의 빠른 용출 중간체 피크를 통해 단일 생성물 피크로 전환되었다. 2 시간 후, 반응 혼합물을 ~40 mL으로 농축하였다. THF (10 mL)를 농축물에 첨가하고, 용액을 다시 ~40 mL으로 농축하였다. 점성이 있는 오일을 400 mL의 교반되는 Et2O에 부었다. 주위 온도에서 20 분간 교반한 후, 상등액을 침전물로부터 따라내었다. 200 mL Et2O를 사용하여 습윤 고체를 진공 필터로 옮기고 Et2O (3x 75 mL)으로 세척하였다. 고체를 필터에서 10분 동안 건조시킨 다음, 무게를 잰 250mL HDPE 포장 병으로 옮겼다. 잔류 휘발성 물질을 고진공 하에서 밤새 제거하여 백색 고체로서 표제 화합물 (17.52 g, 0.8019 mmol, 93.3% 수율 @ 4 HCl)을 제공하였다.
C18 HPLC, ELSD에 의해 계산된 순도: 99.2% (RV = 9.34 mL).
C' = 사이클로옥티닐인 예비중합체 B.
[0070] 4-mL의 스크류 탑 바이알을 PEG20kDa-[NH2]4 (SunBright PTE-200PA; 150 mg, 7.6 μmol PEG, 30.2 μmol NH2, 1.0 당량, 20 mM final 아민 농도), MeCN (1.5 mL), 및 iPr2NEt (7 μL, 40 μmol, 1.3 당량, 27 mM 최종 농도)으로 채웠다. 활성화된 에스터 사이클로옥틴 (39 μmol, 1.3 당량, 27 mM 최종 농도) 용액을 첨가하고 반응 혼합물을 주위 온도에서 교반하였다. 반응을 ELSD에 의한 C18 HPLC (20-80%B over 11 분)으로 모니터링하였다. 완료되면, Ac2O (3 μL, 30 μmol, 출발 NH2 당 1 당량)을 반응 혼합물에 첨가하고 혼합물을 30 분간 교반하였다. 반응 혼합물을 뻑뻑한 오일로 농축하고 MTBE (20 mL)에 현탁시켰다. 생성된 현탁액을 격렬하게 10 분간 교반하였다. 생성된 고체를 격렬하게 혼합하고, 원심분리기에서 펠릿화하고 (2800 rpm, 4 ℃, 10 분), 피펫으로 상등액을 제거하여, MTBE (20 mL)으로 3회 분쇄하였다. 생성된 고체를 진공 하의 주위 온도에서 30 분 이하 동안 건조시켰다. 스톡 용액은 20 mM의 표적 아민 농도 20 mM NaOAc (pH 5)에 제조하였다. 사이클로옥틴 농도는 PEG7-N3 (2 당량)으로 처리 및 반응하지 않은 PEG7-N3를 DBCO-CO2H로 역적정하여 확인하였다.
[0071] 이러한 절차를 사용하여 제조된 거대 단량체는, 각각 MFCO 펜타플루오로페닐 에스터, 5-((4-나이트로페녹시-카보닐)옥시)사이클로옥틴, 3-(4-나이트로페녹시카보닐)옥시사이클로옥틴, BCN 하이드록시석신이미딜 카보네이트, DIBO 4-나이트로페닐 카보네이트, 3-(카복시메톡시)사이클로옥틴 석신이미딜 에스터, 및 3-(하이드록시에톡시)사이클로옥틴 4-나이트로페닐 카보네이트를 사용하여 제조된, 사이클로옥틴 기가 MFCO, 5-하이드록시사이클로옥틴, 3-하이드록시사이클로옥틴, BCN (바이사이클로[6.1.0]논-4-인-9-일메틸), DIBO, 3-(카복시메톡시)사이클로옥틴, 및 3-(2-하이드록시에톡시)사이클로옥틴인 것을 포함한다.
[0072] 하이드로겔 미소구체 제조. 하이드로겔 미소구체는 [Schneider et al. (2016) Bioconjugate Chemistry 27: 1210-15]에 기재된 바와 같이 제조하고 활성화하였다.
실시예 6
멸균 하이드로겔 컨쥬게이트의 제조
[0073] 본 발명의 멸균된 하이드로겔은, 예를 들어 PCT 출원 US2020/026726 (2020년 4월 3일자), 및 미국 특허 9,649,385에 기재된 바와 같이, 소분자, 펩타이드, 단백질, 또는 핵산 약물의 부착에 의해 생체 내 투여에 적합한 멸균 하이드로겔-약물 컨쥬게이트의 제조에 사용될 수 있다. 일반적으로, 멸균 하이드로겔 컨쥬게이트 제조 방법은 다음의 3 단계를 포함한다: (1) 하이드로겔 미소구체의 멸균; (2) 컨쥬게이션을 위한 하이드로겔 미소구체의 활성화; 및 (3) 컨쥬게이션. 비-무균 조건 하에서 단계 (2) 및 (3)에 대한 표준 절차는 이전에 설명되어 있다 (예를 들어 [Schneider et al. (2016) Bioconjugate Chemistry 27: 1210-15] 참조). 본 발명에서, 이들 방법은 폐쇄된 멸균 체-바닥 교반 세척기/반응기에서 수행함으로써 무균 처리에 적합하였으며 ([Henise et al. (2020), Engineering Reports. 2020;e12213. https://doi.org/10.1002/eng2.12213] 참조) 여기서 모든 액체는 적절한 멸균 필터를 통해 도입된다. 단계 (1)의 경우, 적절한 완충액, 예를 들어 pH 2-5의 아세테이트 또는 포스페이트 완충액 중의 하이드로겔 미소구체 슬러리를 세척기/반응기에 넣은 다음 멸균 필터로 닫고, 본 발명의 방법에 따라 고압멸균한다. 현탁액을 주위 온도로 냉각시키고, 체 바닥을 통해 배수하여 멸균 완충액을 제거한다. 생성된 멸균 미소구체 슬러리를 멸균 완충액 또는 물로 세척하고, 활성화 단계를 위한 적절한 용매로 교환한다. 단계 (2)에서, 유기 용매 중의 멸균 미소구체 슬러리는 활성화제 및 활성화 기의 부착에 필요한 임의의 중화 염기로 처리한다. 모든 시약은 적절한 멸균 필터를 통해 세척기/반응기에 도입하고, 과량의 시약은 반응이 끝나면 체 바닥을 통해 제거한다. 단계 (3)을 위해, 멸균 활성화된 하이드로겔 미소구체는 컨쥬게이션되는 링커-약물의 용해도 및 안정성에 기초하여 선택된 적절한 로딩 완충액에 현탁시키고, 링커-약물의 용액은 적절한 멸균 필터를 통해 도입한다. 필요한 경우, 컨쥬게이션 반응은 세척기/반응기를 가열하여 승온에서 수행하거나, 또는 냉각에 의해 주위 온도보다 낮은 온도에서 수행할 수 있다. 컨쥬게이션이 완료되면, 체 바닥을 통해 과량의 시약을 제거하고 멸균 미소구체 컨쥬게이트를 적절한 보관 또는 투여 제형으로 교환한다.
실시예 7
멸균 하이드로겔-엑세나타이드 컨쥬게이트의 제조
[0074] 본 발명의 멸균된 하이드로겔의 사용을 예시하기 위해, 하이드로겔 미소구체에 대한 엑세나타이드 펩타이드 유도체 [Gln28]엑세나타이드의 멸균 컨쥬게이트를 제조하였다.
[0075] (1) 링커-약물, Nα-{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노-설포닐]-2-뷰틸옥시카보닐}-[Gln28]엑세나타이드의 제조는 PCT 출원 US/2020/026726 (2020년 4월 3일자; 상기 특허는 본 명세서에 참조 문헌으로 포함)에 기재되어 있다. 25 mL 프릿(fritted) SPE 컬럼에서, Rink 아마이드 수지 (0.63 meq/g 치환, 0.12 mmol 펩타이드/g 펩타이드-수지, 1.00 g 펩타이드-수지, 0.12 mmol 펩타이드) 상의 보호된 [Gln28]엑세나타이드 (fmoc α-아민)를 10 mL의 DMF에서 30 분간 주위 온도에서 팽윤시켰다. F/F Luer 어탭터 및 12 mL 실린지를 사용하는 실린지 여과에 의해 DMF를 제거하고, 팽윤된 수지를 DMF 중의 5% 4-메틸피페리딘으로 처리하였다 (2x 10 ml, 각각 5 분; 이후 2x 10 ml, 각각 20 분). 이후 fmoc-보호 해제된 수지를 DMF으로 세척하고 (10x 10 ml), 상층액을 실린지 여과로 제거하였다. 세척된 수지를 8.4 ml DMF에 현탁시키고 3.6 ml의 4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (DMF 중의 0.10 m, 0.36 mmol, 30 mm 최종 농도) 및 4-메틸모폴린 (40 μl, 0.36 mmol, 30 mm 최종 농도)로 처리하였다. 반응 혼합물을 오비탈 쉐이커를 사용하여 교반하였다. 20 시간 후, 상등액을 실린지 여과로 제거하고, 수지를 연속적으로 DMF (5x 15 ml) 및 CH2Cl2 (5x 15 m)으로 세척하였다. Kaiser 테스트는 중간체 링커-변형 수지에서 유리 아민에 의해 음성이었다. 그런 다음 수지를 오비탈 쉐이커에서 부드럽게 교반하면서 10 mL의 미리 냉각된 (0 ℃) 90:5:5의 트라이플루오로아세트산:트라이아이소프로필실란:H2O 으로 처리하였다. 2 시간 후, 수지를 진공 여과하고 TFA (2x 1.5 ml)으로 세척하였다. 여액을 회전 증발에 의해 ~6 ml으로 농축시켰다. 칭량된 50 mL Falcon 튜브에서 40 ml의 -20 ℃ MTBE에 TFA 농축물을 적가하여 미정제 링커-펩타이드를 침전시켰다. -20 ℃에서 10 분간 인큐베이션한 후, 미정제 링커-펩타이드 현탁액을 원심분리로 펠릿화하고 (3000x g, 2 분, 4 ℃), 상등액을 따라내었다. 생성된 펠릿을 40 ml의 -20 ℃ MTBE에 현탁시키고, 볼텍싱하여 혼합하고, 원심분리하고, 상기와 같이 따라내었다. 고진공 하에서 건조한 후, 펠릿을 회백색 고체 (575 mg)로서 단리하고 이를 8 ml의 5% 아세트산 (~70 mg/ml)에 용해시켰다. 50 ℃ 수조에서 45 분간 가열한 후, 용액을 분취용 C18 HPLC으로 정제하여 수용액으로서 13 ml의 표제 화합물 (3.33 mM, A280에 의해 43 μmol)을 제공하였다. 동결 건조는 235 mg의 백색 고체를 제공하였다. 280 nm에서 결정된 C18 HPLC 순도: 90.0% (Rv = 11.47 ml). Mav: 계산치 4476.9 ; 관찰치 4476.
[0076] (2) R1 = SO2NMe2인 화학식(2)의 하이드로겔 미소구체를 실시예 5에 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 하이드로겔 미소구체를 pH 4.0의 0.1 M 아세테이트 완충액에 현탁시키고, 세척기/반응기에 놓고, 고압멸균기에서 20 분의 유지 시간으로 121 ℃에서 증기 멸균하였다.
[0077] (3) 세척기/반응기의 체 바닥을 통해 멸균 하이드로겔 미소구체 현탁액으로부터 완충액을 배출하고, 미소구체를 멸균 필터를 통해 도입된 아세토나이트릴로 교환하였다. 아세토나이트릴 중 BCN 석신이미딜 카보네이트 (26 mM, 1.2 당량/미소구체 아민의 당량) 및 트라이에틸아민 (172 mM, 4 당량/미소구체 아민의 당량)의 용액을 멸균 필터를 통해 첨가하고, 혼합물을 3 시간 동안 부드럽게 교반하였다. 과량의 시약을 세척기/반응기의 체 바닥으로부터 배출하고, 멸균 필터를 통해 도입된 아세토나이트릴로 미소 구체를 세척한 다음, 세척하고 50% 0.1 M 시트레이트, pH 3.5, 50% 아이소프로판올, 30 mM 메티오닌 로딩 완충액에 재현탁시켰다.
[0078] (4) 로딩 완충액 중 링커-약물 용액 (24 mM, 1.1 몰 당량/미소구체 아민의 당량)을 멸균 필터로 도입하고, 혼합물을 21 시간 동안 40 ℃에서 부드럽게 가온하면서 교반하였다. 과량의 시약을 세척기/반응기의 체 바닥을 통해 배출하고, 미소구체를 IPA/시트레이트/메티오닌 완충액으로 세척하여, [Gln28]엑세나타이드-로딩된 하이드로겔 미소구체의 멸균 현탁액을 제공하였다. 생성된 미소구체의 분석은 미소구체 슬러리 중 4.2 ± 0.2 nmol의 펩타이드/mg의 약물 함량을 나타냈다.

Claims (20)

  1. 베타 제거에 의해 분해되는 가교제로 가교된 하이드로겔을 멸균하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 가교제의 분해를 최소화하기 위해 상기 하이드로겔을 함유하는 매질의 pH를 조정하고 멸균을 수행하기에 충분한 온도 및 시간 동안 가열하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 매질의 pH는 상기 매질의 비반응성 완충액에 의해 결정되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 완충액은 포스페이트 또는 아세테이트 완충액인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 조정된 pH는 2-5인 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 베타 제거에 의한 분해 속도는 가교제에 포함된 하나 이상의 치환기에 의해 제어되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 하이드로겔은 다음의 화학식의 가교제를 포함하고:
    Figure pct00016

    여기서
    m은 0 또는 1이고;
    X는 가교제를 제1 중합체에 연결하는 작용기를 포함하고;
    R1, R2, 및 R5 중 적어도 하나는 가교제를 제2 중합체에 연결하는 작용기 Z를 포함하고;
    여기서 R1 및 R2 중 하나만이 H일 수 있거나 또는 각각 임의 치환된, 알킬, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬일 수 있고;
    R1 및 R2 중 적어도 하나 또는 둘 모두는 독립적으로 CN; NO2;
    임의 치환된 아릴;
    임의 치환된 헤테로아릴;
    임의 치환된 알케닐;
    임의 치환된 알키닐;
    COR3 또는 SOR3 또는 SO2R3이되, 여기서
    R3는 H 또는 임의 치환된 알킬;
    각각 임의 치환된, 아릴 또는 아릴알킬;
    각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이거나;　또는
    OR9 또는 NR9 2이되, 각 R은 독립적으로 H 또는 임의 치환된　알킬이거나, 또는 두 개의 R9 모두 이들이 부착되는 질소와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
    SR4이되, 여기서
    R4는 임의 치환된 알킬;
    각각 임의 치환된, 아릴 또는 아릴알킬;
    각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이고;
    여기서 R1 및 R2는 결합되어 3-8 원 고리를 형성할 수 있고;
    각 R5는 독립적으로 H이거나 또는 알킬, 알케닐알킬, 알키닐알킬, (OCH2CH2)p O-알킬 (여기서 p=1-1000), 아릴, 아릴알킬이거나, 또는 각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이거나;
    또는
    Figure pct00017
    이되,
    여기서
    m은 0 또는 1이고;
    n은 1-1000이고;
    s는 0-2이고;
    t는 2, 4, 8, 16 또는 32이고;
    W는 O(C=O)O, O(C=O)NH, O(C=O)S,
    Figure pct00018
    ,　
    Figure pct00019
    , 또는
    Figure pct00020
    이되, 여기서 x 및 y = 0-4이고;
    Q는 원자가=t를 가지는 코어 그룹이고;
    여기서 R1, R2, 및 R5 중 적어도 하나는 중합체에 연결할 수 있는 작용기 Z1를 포함하고,　
    R1 및 R2 중 적어도 하나 또는 둘 모두는 독립적으로 CN; NO2;
    임의 치환된 아릴;
    임의 치환된 헤테로아릴;
    임의 치환된 알케닐;
    임의 치환된 알키닐;
    COR3 또는 SOR3 또는 SO2R3이되, 여기서
    R3는 H 또는 임의 치환된 알킬;
    각각 임의 치환된, 아릴 또는 아릴알킬;
    각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이거나;　또는
    OR9 또는 NR9 2이되, 각 R은 독립적으로 H 또는 임의 치환된　알킬이거나, 또는 두 개의 R9 모두 이들이 부착되는 질소와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
    SR4이되, 여기서
    R4는 임의 치환된 알킬;
    각각 임의 치환된, 아릴 또는 아릴알킬;
    각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이고;
    여기서 R1 및 R2는 결합되어 3-8 원 고리를 형성할 수 있고;
    여기서 R1 및 R2 중 하나만이 H일 수 있거나 또는 각각 임의 치환된, 알킬, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬일 수 있고;
    각 R5는 독립적으로 H이거나 또는 알킬, 알케닐알킬, 알키닐알킬, (OCH2CH2)p O-알킬 (여기서 p=1-1000), 아릴, 아릴알킬이거나, 또는 각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬인 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, X는 카바메이트이고 Z는 트라이아졸, 카복사마이드, 또는 카바메이트인 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 하이드로겔은 다음의 화학식의 가교제를 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00021

    또는
    Figure pct00022
  9. 제8항에 있어서, R1은 CN; NO2;
    임의 치환된 아릴;
    임의 치환된 헤테로아릴;
    임의 치환된 알케닐;
    임의 치환된 알키닐;
    COR3 또는 SOR3 또는 SO2R3이되, 여기서
    R3는 H 또는 임의 치환된 알킬;
    각각 임의 치환된, 아릴 또는 아릴알킬;
    각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이거나;　또는
    OR9 또는 NR9 2이되, 각 R은 독립적으로 H 또는 임의 치환된　알킬이거나, 또는 두 개의 R9 모두 이들이 부착되는 질소와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
    SR4이되, 여기서
    R4는 임의 치환된 알킬;
    각각 임의 치환된, 아릴 또는 아릴알킬;
    각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬인 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, R1은 CN 또는 SO2R3이되, 여기서
    R3는 H 또는 임의 치환된 알킬;
    각각 임의 치환된, 아릴 또는 아릴알킬;
    각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이거나;　또는
    OR9 또는 NR9 2이되, 각 R은 독립적으로 H 또는 임의 치환된　알킬이거나, 또는 두 개의 R9 모두 이들이 부착되는 질소와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성하는 것인 방법.
  11. 제8항에 있어서, R1은 CN; SO2Me; SO2NMe2; SO2N(CH2CH2)2X 또는 SO2(Ph-R10)이되, 여기서 X는 부재하거나, O, 또는 CH-R10이고, R10은 H, 알킬, 알콕시, NO2, 또는 할로겐인 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 멸균은 20 분의 유지 시간으로 121 ℃로 가열하여 달성되는 것인 방법.
  13. 베타-제거 메커니즘에 의해 분해될 수 있는 가교제를 포함하는 하이드로겔로서, 멸균을 수행하기에 충분한 온도로 가열함으로써 멸균된 것인 하이드로겔.
  14. 제13항에 있어서, 미립자의 현탁액인 것인 하이드로겔.
  15. 제13항에 있어서, 베타-제거 메커니즘에 의해 분해될 수 있는 가교제는 다음의 화학식을 가지며
    Figure pct00023

    여기서
    m은 0 또는 1이고;
    X는 가교제를 제1 중합체에 연결하는 작용기를 포함하고;
    여기서 R1, R2, 및 R5 중 적어도 하나는 가교제를 제2 중합체에 연결하는 작용기 Z를 포함하고;
    여기서 R1 및 R2 중 하나만이 H일 수 있거나 또는 각각 임의 치환된, 알킬, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬일 수 있고;
    R1 및 R2 중 적어도 하나 또는 둘 모두는 독립적으로 CN; NO2;
    임의 치환된 아릴;
    임의 치환된 헤테로아릴;
    임의 치환된 알케닐;
    임의 치환된 알키닐;
    COR3 또는 SOR3 또는 SO2R3이되, 여기서
    R3는 H 또는 임의 치환된 알킬;
    각각 임의 치환된, 아릴 또는 아릴알킬;
    각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이거나;　또는
    OR9 또는 NR9 2이되, 각 R은 독립적으로 H 또는 임의 치환된　알킬이거나, 또는 두 개의 R9 모두 이들이 부착되는 질소와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
    SR4이되, 여기서
    R4는 임의 치환된 알킬;
    각각 임의 치환된, 아릴 또는 아릴알킬;
    각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이고;
    여기서 R1 및 R2는 결합되어 3-8 원 고리를 형성할 수 있고;
    각 R5는 독립적으로 H이거나 또는 알킬, 알케닐알킬, 알키닐알킬, (OCH2CH2)p O-알킬 (여기서 p=1-1000), 아릴, 아릴알킬이거나, 또는 각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이거나;
    또는
    Figure pct00024
    이되,
    여기서
    m은 0 또는 1이고;
    n은 1-1000이고;
    s는 0-2이고;
    t는 2,4, 8, 16 또는 32이고;
    W는 O(C=O)O, O(C=O)NH, O(C=O)S,
    Figure pct00025
    ,　
    Figure pct00026
    , 또는
    Figure pct00027
    이되, 여기서 x 및 y = 0-4이고;
    Q는 원자가=t를 가지는 코어 그룹이고;
    여기서 R1, R2, 및 R5 중 적어도 하나는 가교제를 제2 중합체에 연결하는 작용기 Z를 포함하고;
    R1 및 R2 중 적어도 하나 또는 둘 모두는 독립적으로 CN; NO2;
    임의 치환된 아릴;
    임의 치환된 헤테로아릴;
    임의 치환된 알케닐;
    임의 치환된 알키닐;
    COR3 또는 SOR3 또는 SO2R3이되, 여기서
    R3는 H 또는 임의 치환된 알킬;
    각각 임의 치환된, 아릴 또는 아릴알킬;
    각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이거나;　또는
    OR9 또는 NR9 2이되, 각 R은 독립적으로 H 또는 임의 치환된　알킬이거나, 또는 두 개의 R9 모두 이들이 부착되는 질소와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
    SR4이되, 여기서
    R4는 임의 치환된 알킬;
    각각 임의 치환된, 아릴 또는 아릴알킬;
    각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이고;
    여기서 R1 및 R2는 결합되어 3-8 원 고리를 형성할 수 있고;
    여기서 R1 및 R2 중 하나만이 H일 수 있거나 또는 각각 임의 치환된, 알킬, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬일 수 있고;
    각 R5는 독립적으로 H이거나 또는 알킬, 알케닐알킬, 알키닐알킬, (OCH2CH2)p O-알킬 (여기서 p=1-1000), 아릴, 아릴알킬이거나, 또는 각각 임의 치환된, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬인 것인 하이드로겔.
  16. 제15항에 있어서, m = 0이고, R2는 H이고, 하나의 R5는 H이고 다른 하나는 C(Me)2(CH2)nZ이되 여기서 n = 0-6이고, W는
    Figure pct00028
    이되, 여기서 x 및 y = 0-4인 것인 하이드로겔.
  17. 제15항에 있어서, 하이드로겔은 다음의 화학식의 가교제를 포함하는 것인 하이드로겔:
    Figure pct00029

    또는
    Figure pct00030
    .
  18. 제13항에 있어서, 멸균은 pH 2-5의 완충액 중의 하이드로겔 현탁액을 20 분의 유지 시간 동안 121 ℃의 온도로 가열함으로써 달성되는 것인 하이드로겔.
  19. 멸균 하이드로겔 컨쥬게이트를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함하는 것인 방법:
    (a) 적절한 pH, 온도, 및 시간에서 고압멸균하여 하이드로겔을 멸균하는 단계;
    (b) 선택적으로 컨쥬게이션을 위해 멸균 하이드로겔을 활성화하는 단계; 및
    (c) 컨쥬게이트의 무균 상태가 유지되는 조건하에서 약물 또는 링커-약물을 멸균 하이드로겔에 부착하는 단계.
  20. 제19항에 있어서, 약물은 펩타이드, 단백질, 또는 소분자인 것인 방법.
KR1020227007524A 2019-08-07 2020-08-07 베타-제거 링커에 의해 가교된 하이드로겔의 증기 멸균 KR20220045975A (ko)

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