TW202144465A - 合成聚葡萄胺糖衍生物之新方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種新交聯聚葡萄胺糖、其製劑、組成物及用途。具體言之，本發明係關於可用作活性劑之複數個奈米粒子及其組成物以及用於至少一種生物活性劑之遞送系統。

Description

合成聚葡萄胺糖衍生物之新方法及其用途
本發明係關於製備聚葡萄胺糖，特別是由聚葡萄胺糖得到之複數個奈米粒子、其製劑、組成物及用途，詳言之，關於化學、生物學、醫學及材料科學領域。
生物聚合物因其投與時之生物相容性、生物降解及無毒性而成為作為各種藥物及其他活性物質之載劑的有前景之材料。藉由適合化學改質，此等聚合物可提供用於藥物遞送系統之較佳材料，其中活性物質可為低分子量化合物（小分子）或高分子量化合物（巨分子）兩者。奈米結構之藥物載劑允許遞送高分子化合物，諸如核酸及蛋白質（Advances in Polymer Science. Chitosan for Biomaterials 第 I 卷 , 編輯 : R. Jayakumar, M. Prabaharan, R.A.A. Muzzarelli. Springer Heidelberg Dordrecht London New York 2011 DOI 10.1007/978-3-642-23114-8 ）。
聚葡萄胺糖係產生複數個奈米粒子的最具前景之生物聚合物候選物之一。一方面，其具有引人注目之天然特性，諸如黏膜黏著、生物相容性及低毒性、生物降解及形成複合物之能力，且另一方面，結構之高規則性以及其中羥基及胺基之存在為該聚合物之選擇性改質提供良好的前景。
因此，聚葡萄胺糖之該等特性已引起對於開發藥物遞送解決方案之關注（Bhattarai 等人, 2010, Advanced Drug Delivery Reviews, 62 83-99. doi: 10.1016 / j.addr.2009.07.019 ）。
儘管聚葡萄胺糖呈現作為優良載劑的若干有利特徵，但未改質之聚葡萄胺糖的使用因其在生理條件下溶解度較低而受到限制。為克服此限制，已開發出聚葡萄胺糖之許多不同的化學改質方法（Kritchenkov 等人, 2017, Russ. Chem. Rev., 86, 231-239. http://dx.doi.org/10.1070/RCR4636 ； Chuan 等人, 2019, Adv. Colloid Interface Sci., 268, 25-38. ； Jiang, H.-L.; Xing 等人, 2018, Curr. Org. Chem., 22, 668-689. DOI: 10.2174/1385272821666170926163544 ； Layek, B.; Singh, J. 8-Chitosan for DNA and gene therapy. In Chitosan Based Biomaterials 第 2 卷 ; Jennings, J.A., Bumgardner, J.D. 編 ; Woodhead Publishing: Cambridge, UK, 2017; 第 209-244 頁 )。
聚葡萄胺糖之結構提供以多種方式進行改質之可能性。為增加疏水性，可用脂肪酸、固醇衍生物、尿刊酸（urocanic acid）、含有咪唑片段之羧酸衍生物等容易地製備出聚葡萄胺糖醯胺。或者，可使用各種結構之烷基取代基、吡啶衍生物、亞精胺及類似物，藉由經適當希夫鹼（Schiff base）烷基化或還原胺化來形成二級聚葡萄胺糖胺。為增加親水性，可用包括含硫胺基酸在內之胺基酸、乳糖酸、硫代乙醇酸等產生聚葡萄胺糖醯胺。另外，亦可使用各種糖、聚乙烯亞胺及其衍生物獲得聚葡萄胺糖之二級胺。藉由聚乙二醇化合成聚乙二醇衍生物尤其常用。根據此等方法製造之聚葡萄胺糖衍生物形成複數個奈米粒子，特別是與聚電解質，諸如核酸形成複數個奈米粒子之能力增強且可具有改變之藥理學特性。（Mao 等人, 2010, Advanced Drug Delivery Reviews, 62, 12-27 doi:10.1016/j.addr.2009.08.004 ）。
聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子可經由化學交聯以一種基本上不可逆之方式形成，該化學交聯涉及使用不同試劑催化此類交聯而形成共價鍵（Bhattarai 等人, 2010, 前述 ）。歷史上，戊二醛及甲醛係最先且最常用於此交聯之試劑，但如今，該等試劑因難以移除此等有毒化合物之所有痕跡以及釋放此等醛之複數個奈米粒子水解較慢而不再常用。近來，Genepine已受到廣泛關注，但此試劑極其昂貴且自身易於發生聚合。方酸二乙酯（Diethyl squarate，DES）、乙二醇二縮水甘油醚（EGDE）及封端之二異氰酸酯反應相當慢且接下來之反應主要在高溫下進行，由此可能引起副反應。亦存在光活化之交聯試劑，如官能性疊氮化物、官能性丙烯酸酯；以及酶活化試劑，如根皮酸（phloretic acid）及活化醌。舉例而言，Baoqiand 等人,2015, Acta Biomaterialia, 22, 1742-7061 或Journal of Nanotechnology in engineering and medicine, 6, 041001-6 提供一種用於製造交聯聚葡萄胺糖之方法，該方法在聚葡萄胺糖與甲基丙烯酸酐反應之後，使用光引發的呈溶液形式之聚葡萄胺糖之自由基聚合來製造交聯聚葡萄胺糖，由此產生呈凝膠或泡沫形式之聚丙烯醯胺化合物。聚葡萄胺糖之羧甲基衍生物描述於El-sherbiny 等人, 2009, European Polymer Journal 45, 1, 199-210 中，其中在第一步驟中，藉由使聚葡萄胺糖中之一級醇基與鹼性介質中之一氯乙酸反應，將羧基引入聚葡萄胺糖中，且在第二階段中，經由光誘導之聚合反應添加丙烯醯基甘胺酸聚合物，產生無內部交聯之聚葡萄胺糖。US 5,770,712描述一種藉由將具有未反應之一級胺基之聚葡萄胺糖材料與過量的具有至少兩個環氧基團之多官能環氧化合物組合來製造交聯聚葡萄胺糖的方法。聚葡萄胺糖與1,4-丁二醇二縮水甘油醚發生交聯反應得到聚葡萄胺糖之胺基-乙醇交聯衍生物，該等衍生物在生理pH值（pH 7及更高）下溶解性較差。
亦可經由與含有醛基之聚葡萄胺糖形成希夫鹼、與預先經具有末端硫氫基之試劑官能化中之聚葡萄胺糖形成二硫橋鍵及在弱鹼存在下與預先用官能性丙烯酸酯處理之聚葡萄胺糖發生邁克爾加成反應，使預先衍生化之聚葡萄胺糖交聯。
所有此等方法均涉及在聚葡萄胺糖呈溶液形式時形成複數個奈米粒子。在一些情況下，所有化學反應均被驅使在液相中完成，而在其他情況下，該等反應係在後期，例如在噴霧乾燥或凍乾期間或之後完成。重要的是，在所有情況下，該方法起始且其關鍵階段係用呈溶解狀態之聚葡萄胺糖進行（Jayakumar 等人, 2011, 前述 ）。對於待溶解之聚葡萄胺糖的需求明顯限制了複數個奈米粒子之合成。此歸功於以下事實：聚葡萄胺糖僅在酸存在下以鹽形式溶解於水。以此形式，對於具有超過2%聚葡萄胺糖之任何溶液，黏度均隨著濃度增加而反常地增加，該數字嚴重限制了合成之可能實施方案以及由反應設備得到高產出率之可能。確切地說，混合黏性溶液時出現之壁效應可造成反應容器中試劑濃度之顯著不均勻性，且因此導致複數個奈米粒子特性之不均勻性。另一個新出現的問題係最常使用高親核性胺基進行交聯，但在溶液中，其應當離子化以使聚葡萄胺糖保持溶解狀態。
因此，需要開發以一種高效且有成本效益之方式形成聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子的新合成途徑。
本發明係關於出人意料地發現一種自聚葡萄胺糖製造複數個奈米粒子之新方法，該方法之優勢在於避免了對於溶解聚葡萄胺糖起始物質且因此要求形成鹽或使用稀酸水溶液之需求，或對於將聚葡萄胺糖分散於溶液中且因此要求乳化、研磨或其他會對聚合物之完整性造成機械影響之程序的需求。具體言之，本發明係關於一種使聚葡萄胺糖交聯之新方法，詳言之，其中經由兩個化學步驟，在聚葡萄胺糖分子之不同部分之間形成新的內部化學鍵。根據一個特定態樣，不需要溶解聚葡萄胺糖引起更高效的合成轉換率（例如比使用溶解之聚葡萄胺糖之交聯方法高約2個數量級）。
所得產物在該製備方法之第二步驟結束時自發地形成複數個奈米粒子，該等奈米粒子適於眾多應用。另外，有利地是，所得交聯聚葡萄胺糖產物具有與標準線性或分支聚葡萄胺糖類似的生物活性，但又在大範圍生物相關pH值或微生物條件下之穩定性以及物理化學特性方面出乎意料地展現出一些特殊優勢，使處理更容易。
本發明之一態樣提供一種用於製備根據本發明之交聯聚葡萄胺糖的方法。
在另一態樣中，本發明係關於一種新交聯聚葡萄胺糖，特別是自發地形成複數個奈米粒子之新交聯聚葡萄胺糖。
本發明之另一態樣係關於一種組成物，其包含至少一種根據本發明之交聯聚葡萄胺糖及至少一種載劑。
本發明之另一態樣係關於一種醫藥組成物，其包含至少一種根據本發明之交聯聚葡萄胺糖及至少一種醫藥學上可接受之載劑。
本發明之另一態樣係關於包含一種根據本發明之交聯聚葡萄胺糖的複數個奈米粒子。
本發明之另一態樣係關於一種化妝品組成物，其包含至少一種根據本發明之交聯聚葡萄胺糖。
本發明之另一態樣係關於一種軟組織填充劑，其包含至少一種根據本發明之交聯聚葡萄胺糖或根據本發明之其組成物。
本發明之另一態樣係關於一種創傷敷料，其包含至少一種根據本發明之交聯聚葡萄胺糖。
根據另一個特定實施例，提供一種重建組織，其包含至少一種根據本發明之交聯聚葡萄胺糖或其組成物。
本發明之另一態樣係關於一種農業用組成物，其包含至少一種根據本發明之交聯聚葡萄胺糖。
本發明之另一態樣係關於一種製備組成物（例如軟組織填充劑、創傷敷料或重建組織）之方法，該組成物包含至少一種根據本發明之交聯聚葡萄胺糖或其複數個奈米粒子。
本發明之另一態樣係關於用於活體內藥物遞送、活體外細胞或生物組織培養物及組織工程改造應用的根據本發明之交聯聚葡萄胺糖。
根據另一個特定實施例，提供一種細胞或生物組織培養基，其包含至少一種根據本發明之交聯聚葡萄胺糖或其組成物。
本發明之另一態樣係關於根據本發明之交聯聚葡萄胺糖，其用於預防及/或治療醫學病症，且特定言之心血管病況，諸如心律不整，特別是心房微顫及高血壓；關節病變及關節疾病，諸如類風濕性關節炎、骨關節炎、脊椎關節炎以及導致軟骨、骨、韌帶或滑液囊損傷之外傷事件；眼部病變及損傷，諸如乾眼症候群、葡萄膜炎、青光眼、角膜病變；結締組織病症，諸如狼瘡及多發性肌炎；皮膚/黏膜病症或損傷，諸如創傷、瘢痕、牛皮癬、痤瘡、濕疹、玫瑰痤瘡、物理性或化學性燒傷，特別是手術創傷及曬傷、潰瘍、痔瘡；牙周及牙科疾病；硬脊膜損傷，諸如意外損傷或腦及中樞神經系統手術後硬脊膜損傷；惡性及良性贅瘤，特別是癌瘤、肉瘤、淋巴瘤及黑素瘤；術後併發症，諸如瘺及感染；腫瘤或血管畸形。
本發明之另一態樣係關於根據本發明之交聯聚葡萄胺糖的用途，其用於製備供預防及/或治療醫學病症之醫藥調配物，該醫學病症特定言之為心血管病況，諸如心律不整，特別是心房微顫及高血壓；關節病變及關節疾病，諸如類風濕性關節炎、骨關節炎、脊椎關節炎以及導致軟骨、骨、韌帶或滑液囊損傷之外傷事件；眼部病變及損傷，諸如乾眼症候群、葡萄膜炎、青光眼、角膜病變；結締組織病症，諸如狼瘡及多發性肌炎；皮膚/黏膜病症或損傷，諸如創傷、瘢痕、牛皮癬、痤瘡、濕疹、玫瑰痤瘡、物理性或化學性燒傷，特別是手術創傷及曬傷、潰瘍、痔瘡；牙周及牙科疾病；硬脊膜損傷，諸如意外損傷或腦及中樞神經系統手術後硬脊膜損傷；惡性及良性贅瘤，特別是癌瘤、肉瘤、淋巴瘤及黑素瘤；術後併發症，諸如瘺及感染；腫瘤或血管畸形。
本發明之另一態樣係關於根據本發明之交聯聚葡萄胺糖之用途，其用於製備細胞或生物培養基或重建組織。
本發明之另一態樣係關於一種用於製備生物活性劑之藥物遞送系統的方法。
根據另一個特定實施例，提供一種用於鑑別可由根據本發明之方法獲得的交聯聚葡萄胺糖之方法。
本發明之另一態樣係關於一種預防、治療或改善醫學病症之方法，該醫學病症特定言之為心血管病況，諸如心律不整，特別是心房微顫及高血壓；關節病變及關節疾病，諸如類風濕性關節炎、骨關節炎、脊椎關節炎及導致軟骨、骨、韌帶或滑液囊損傷之外傷事件；眼部病變及損傷，諸如乾眼症候群、葡萄膜炎、青光眼、角膜病變；結締組織病症，諸如狼瘡及多發性肌炎；皮膚/黏膜病症或損傷，諸如創傷、瘢痕、牛皮癬、痤瘡、濕疹、玫瑰痤瘡、物理性或化學性燒傷，特別是手術創傷及曬傷、潰瘍、痔瘡；牙周及牙科疾病；硬脊膜損傷，諸如意外損傷或腦及中樞神經系統手術後硬脊膜損傷；惡性及良性贅瘤，特別是癌瘤、肉瘤、淋巴瘤及黑素瘤；術後併發症，諸如瘺及感染；腫瘤或血管畸形，該方法包含向有需要之個體投與有效量的至少一種根據本發明之交聯聚葡萄胺糖或其醫藥調配物。
本發明之另一態樣係關於一種套組，其包含至少一種本發明之交聯聚葡萄胺糖或其組成物，例如呈凍乾形式。
本發明之另一態樣係關於一種用於製備包含至少一種本發明之交聯聚葡萄胺糖或其組成物之複數個奈米粒子的套組，該等奈米粒子用於包封材料，例如生物活性劑、藥物物質、蛋白質、抗體、醣、核酸或其組合，或用於預防或治療。
如本文所使用，術語「交聯度」意思指轉化成交聯或接枝鍵之官能基之數量與最初存在於聚葡萄胺糖上之官能基之總數量的比較，以百分比表示。
術語「烷基」當單獨使用或與其他術語組合使用時，包含直鏈或分支鏈C1 -C50 烷基，其係指具有1至50個碳原子之單價烷基。此術語以諸如以下基團為例：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、正戊基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、四氫香葉基、正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基、正十六烷基、正十八烷基、正十九烷基及正二十烷基，及類似基團。較佳地，此等基團包括C1 -C9 烷基，更佳地包括C1 -C6 烷基，尤佳包括C1 -C4 烷基，類似地，該等基團分別指具有1至9個碳原子之單價烷基、具有1至6個碳原子之單價烷基及具有1至4個碳原子之單價烷基。具體言之，該等基團包括C1 -C6 烷基。
術語「烯基」當單獨使用或與其他術語組合使用時，包含直鏈或分支鏈C2 -C50 烯基。其可在任何可用位置中具有任何可用數目之雙鍵，且該雙鍵之組態可呈(E)或(Z)組態。此術語以諸如以下基團為例：乙烯基、烯丙基、異丙烯基、1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-乙基-1-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-庚烯基、1-辛烯基、香葉基、1-癸烯基、1-十四烯基、1-十八烯基、9-十八烯基、1-二十烯基及3,7,11,15-四甲基-1-十六烯基，及類似基團。較佳地，此等基團包括C2 -C8 烯基，更佳地包括C2 -C6 烯基。其中尤佳為乙烯基（vinyl/ethenyl）（-CH=CH2 ）、正-2-丙烯基（烯丙基、-CH2 CH=CH2 ）、異丙烯基、1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基及3-甲基-2-丁烯基，及類似基團。
術語「炔基」當單獨使用或與其他術語組合使用時，包含直鏈或分支鏈C2 -C50 炔基。其可在任何可用的位置中具有任何可用數目之參鍵。此術語以諸如炔基為例，該等炔基可具有2至50之碳數且視情況具有雙鍵，諸如乙炔基（-C≡CH）、1-丙炔基、2-丙炔基（炔丙基：-CH2 C≡ CH）、2-丁炔基、2-戊烯-4-炔基及類似基團。具體言之，此等基團包括C2 -C8 炔基，更佳地包括C2 -C6 炔基及類似基團。較佳地，該等基團包括C2 -C6 炔基，其係指具有2至6個碳原子且具有至少1或2個炔基不飽和位點的基團。
術語「芳基」係指具有6至14個碳原子且具有單個環（例如苯基）或多個縮合環（例如茚基、萘基）之不飽和芳族碳環基團。芳基包括苯基、萘基、蒽基、菲基及類似基團。
術語「C1 -C6 烷基芳基」係指具有C1 -C6 烷基取代基之芳基，包括甲基苯基、乙基苯基及類似基團。
術語「芳基C1 -C6 烷基」係指具有芳基取代基之C1 -C6 烷基，包括3-苯基丙基、苯甲基及類似基團。
術語「雜芳基」係指單環雜芳族基團、或雙環或三環稠合環雜芳族基團。雜芳族基團之具體實例包括視情況經取代之吡啶基、吡咯基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、
Figure 02_image001
唑基、異
Figure 02_image001
唑基、噻唑基、異噻唑基、吡唑基、1,2,3-***基、1,2,4-***基、1,2,3-
Figure 02_image001
二唑基、1,2,4-
Figure 02_image001
二唑基、1,2,5-
Figure 02_image001
二唑基、1,3,4-
Figure 02_image001
二唑基、1,3,4-三
Figure 02_image005
基、1,2,3-三
Figure 02_image005
基、苯并呋喃基、[2,3-二氫]苯并呋喃基、異苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并***基、異苯并噻吩基、吲哚基、異吲哚基、3H-吲哚基、苯并咪唑基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、苯并噻唑基、苯并
Figure 02_image001
唑基、喹
Figure 02_image005
基、喹唑啉基、酞
Figure 02_image005
基、喹
Figure 02_image001
啉基、
Figure 02_image011
啉基、
Figure 02_image013
啶基、吡啶并[3,4-b]吡啶基、吡啶并[3,2-b]吡啶基、吡啶并[4,3-b]吡啶基、喹啉基、異喹啉基、四唑基、5,6,7,8-四氫喹啉基、5,6,7,8-四氫異喹啉基、嘌呤基、喋啶基、咔唑基、
Figure 02_image015
基或苯并喹啉基。
術語「C3 -C8 環烷基」係指具有3至8個碳原子且具有單個環（例如環己基）或多個縮合環（例如降莰基）之飽和碳環基團。C3 -C8 環烷基包括環戊基、環己基、降莰基及類似基團。
術語「雜環烷基」係指根據以上定義之C3 -C8 環烷基，其中至多3個碳原子經選自由O、S、NR組成之群之雜原子置換，R定義為氫或甲基。雜環烷基包括氮雜環丁烷基、吡咯啶基、哌啶基、哌
Figure 02_image005
基、
Figure 02_image017
啉基、四氫呋喃基及類似基團。
除非個別取代基之定義另作限制，否則術語「經取代」係指基團經1至5個取代基取代，該1至5個取代基選自由以下組成之群：「C1 -C6 烷基」、「C2 -C6 烯基」、「C2 -C6 炔基」、「C3 -C8 環烷基」、「雜環烷基」、「C1 -C6 烷基芳基」、「C1 -C6 烷基雜芳基」、「芳基C1 -C6 烷基」、「雜芳基C1 -C6 烷基」、「C1 -C6 烷基環烷基」、「C1 -C6 烷基雜環烷基」、「胺基」、「胺基磺醯基」、「銨」、「醯基胺基」、「胺基羰基」、「芳基」、「雜芳基」、「亞磺醯基」、「磺醯基」、「烷氧基」、「烷氧基羰基」、「胺基甲酸酯」、「氫硫基」、「鹵素」、三鹵甲基、氰基、羥基、巰基、硝基及類似基團。
術語「醫藥學上可接受」係指包含並非在生物學上或在其他方面不合需要且尤其無毒之材料的載劑。
術語「載劑」係指醫藥調配物中存在的除活性劑外的任何組分，且因此包括稀釋劑、黏合劑、潤滑劑、崩解劑、填充劑、著色劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、防腐劑及類似物。
術語「生物活性劑」用於描述欲併入本發明之接枝聚合物組成物中的具有生物活性之任何試劑。其可為天然、合成、半合成的或其衍生物且可包括疏水性、親水性、可溶性及不溶性化合物。更確切地說，其可為可用於治療及/或預防及/或診斷哺乳動物，諸如動物及人類，特別是人類中已知之任何治療區域之病況的任何生物活性劑，該等病況包括但不限於心律不整，諸如心房微顫、高血壓；發炎性病況、病症或疾病，特別是自體免疫性及非自體免疫性發炎性病況，包括關節病變及關節疾病（諸如類風濕性關節炎、骨關節炎及脊椎關節炎）、眼部病變（諸如乾眼症候群、葡萄膜炎、青光眼、角膜病變）、結締組織病症（諸如狼瘡或多發性肌炎）、皮膚病症或損傷（諸如創傷、瘢痕、牛皮癬、痤瘡、濕疹、玫瑰痤瘡、物理或化學性燒傷、曬傷）、牙周及牙科疾病、痔瘡、潰瘍、適合於基因療法之疾病、適合於細胞療法之疾病、腦及中樞神經系統手術之後硬脊膜成形術及硬脊膜修復、神經整形術、疼痛、術後瘺及感染、骨傷科疾病、良性及惡性贅瘤及感染。該等生物活性劑可選自巨分子化合物或小分子化合物，諸如肽、蛋白質、寡核苷酸及聚核苷酸、抗感染劑、抗生素、抗微生物藥、抗病毒藥、抗細菌藥、抗真菌藥、生長因子、酶、抗基因劑（antigenes）、抗腫瘤藥、抗炎藥、麻醉劑、抗贅瘤藥、鎮痛劑、抗凝血劑、止血藥、細胞及抗體。
術語「發炎性病症或疾病」係指包括炎症及促炎性細胞介素之釋放作為主要或重要疾病機制的所有疾病，諸如發炎性腸病、過敏、哮喘、自體免疫性疾病、肝炎、其他器官炎症及相關疾病。
術語「皮膚病症」或「皮膚病」包括皮膚表面呈現疼痛（sore depression）且未必在其表面上出現切口的皮膚損傷，諸如年齡相關之組織損傷（例如皺紋）、創傷及瘢痕，諸如痤瘡或風疹瘢痕。該等病症進一步包括創傷、瘢痕、牛皮癬、痤瘡、濕疹及玫瑰痤瘡。術語「創傷」包括任何受損組織，例如在外傷或手術之後出現的受損組織。哺乳動物的創傷包括例如擦傷裂口、挫傷、腦震盪、穿刺傷、皮膚割傷、手術創傷、槍擊傷、熱傷、化學品創傷、曬傷、叮咬及刺傷，以及電擊傷。其進一步包括慢性皮膚病症，諸如潰瘍及其他發炎性皮膚病況。
術語「眼部病變或病症」係影響眼部且特別是角膜的病症或損傷。此類病症包括角膜刮傷、角膜擦傷、角膜鹼燒傷、年齡相關黃斑變性、凸眼、白內障、巨細胞病毒視網膜炎、色盲、斜視、糖尿病性黃斑水腫、飛蚊症及眼前閃光、青光眼、圓錐形角膜、弱視、低視力、高眼壓症、視網膜脫落、眼瞼抽搐、葡萄膜炎、乾性角結膜炎（KCS）及乾眼症候群。
術語「關節的（articular）或關節（joint）病變」包括骨關節炎、關節炎性疼痛、類風濕性關節炎、感染及炎症疼痛、軟骨的膝蓋外傷事件、引起髖關節、骨、韌帶或滑液囊損傷之外傷事件。
術語「重建組織」係指可用於修復身體受損之組織，諸如表皮、神經、軟骨或骨組織，且可用於構造用於生物測試之類器官的生物組織（內源性或外源性生物組織）或合成或半合成材料，諸如Takebe 等人,2019, Science, 364, 6444, 956-959, DOI:10.1126/science.aaw756 中所描述。
如本文所使用，「治療（treatment/treating）」及類似表述一般意謂獲得所希望的藥理學及/或身體及/或生理作用。該作用就預防或部分預防疾病、其症狀或病況而言可為預防性的，及/或就部分或完全治癒疾病、由該疾病引起之病況、症狀或副作用而言可為治療性的。如本文所使用，術語「治療」涵蓋對哺乳動物，特別是人類之疾病的任何治療，且包括：(a)預防可能易患該疾病但尚未診斷患有該疾病之個體發生該疾病；(b)抑制該疾病，亦即，遏制其發展；或減輕該疾病，亦即，使該疾病及/或其症狀或病況消退，諸如改善或修復損傷。
如本文所使用，術語「個體」係指哺乳動物。舉例而言，本發明所涵蓋的哺乳動物包括人類、靈長類動物及家養動物，諸如牛、綿羊、豬、馬且特別是賽用馬、實驗用嚙齒動物及類似動物。
術語根據本發明之治療之「功效」可基於在疾病過程中回應於本發明之使用的變化進行量測。舉例而言，根據本發明之治療的功效可藉由臨床徵象或症狀之消失或減少，或疾病生物標記物，諸如細胞介素、生長因子或其他信號傳導分子及其受體、細胞表面標記物、細胞計數及基因表現譜的更有利之量測值來量度。 製備根據本發明之聚葡萄胺糖的方法及該聚葡萄胺糖之表徵
根據一個特定態樣，提供一種用於製備交聯聚葡萄胺糖之方法，其包含以下步驟：a) 提供聚葡萄胺糖並使該聚葡萄胺糖在溶劑中膨脹；b) 用式(I)之丙烯酸系化合物使該聚葡萄胺糖之胺基醯化： [化學式(I)]
Figure 02_image019
其中R1 係鹵素或在移除時確保胺基醯化之任何其他離去基團，諸如3-羥基苯并***酯、酐（包括混合酐）、N-羥基琥珀醯亞胺、五氯苯酚、2-硝基-4-磺基苯酚酯及其他類似離去基團；R2 、R3 及R4 獨立地選自H、視情況經取代之烷基（例如C1 -C6 烷基）、視情況經取代之烯基（例如C2 -C6 烯基）、視情況經取代之炔基（例如C3 -C6 炔基）、視情況經取代之環烷基（例如C3 -C8 環烷基）、視情況經取代之環烯基（例如C4 -C8 環烯基）、視情況經取代之環炔基（例如C5 -C8 環炔基）、視情況經取代之雜環烷基；視情況經取代之芳基（例如視情況經取代之苯基）、視情況經取代之雜芳基及視情況經取代之芳基C1 -C6 烷基，特別是苯甲基；其中術語「經取代」係指基團經1至5個取代基取代，該1至5個取代基選自由以下組成之群：鹵素、-COOR'、-NR'R''、=O、-OR'、-COR'、-CONR'R''、-SR'、-SO3 R'、-SO2 NR'R''、-SOR'、-SO2 R'、-NO2 或-CN；或R1 與R2 或R1 與R3 、或R1 與R4 一起形成視情況經取代之4-24員芳基、雜芳基、環烷基或雜環烷基（例如6-24員芳基、雜芳基、環烷基或雜環烷基，諸如視情況經取代之8-24員芳基、雜芳基、環烷基或雜環烷基）；c) 使步驟 b) 之醯化產物在鹼存在下反應（氮雜-邁克爾反應（Aza-Michael reaction））；d) 純化自步驟 c) 獲得的交聯聚葡萄胺糖（例如自鹽雜質及/或非質子性溶劑純化）。
根據一個特定實施例，在步驟 a) 及/或b) 中使用之溶劑係質子性溶劑（諸如醇或水）。
根據一個特定實施例，在進行步驟 c) 之前，自反應混合物洗掉當在步驟 a) 及/或b) 中使用質子性溶劑（諸如醇或水）進行該方法時形成的游離丙烯酸。
根據另一個特定實施例，溶劑係非質子性溶劑，特別是在步驟 a) 及/或b) 及/或c) 中亦如此。
根據一個特定實施例，若在步驟 c) 中使用非質子性溶劑，若不再進行步驟 f) 之後續醯化。
根據一個特定實施例，步驟 a) 係在室溫下進行。
根據一個特定實施例，步驟 b) 之醯化產物中的R3或R4以及R2基團將與葡萄胺糖主鏈之一級胺基反應，以在葡萄胺糖之間形成交聯。該等基團反應將取決於具體丙烯酸系化合物。舉例而言，對於丙烯酸及甲基丙烯酸，與葡萄胺糖主鏈之一級胺基反應的基團係基團R3或R4。然而，當R3及R4基團經鹵素原子置換時，則R2基團將與葡萄胺糖主鏈之一級胺基反應。
根據另一個特定實施例，此交聯使得形成複數個奈米粒子。
根據特定態樣，本發明之方法可以如下方案1表示：方案 1
Figure 02_image021
其中先提供在室溫下於非質子性溶劑中呈膨脹狀態的聚葡萄胺糖(A) ，其中m係介於1與12'500之間之整數且n係介於1與12'500之間的整數，且接著用丙烯酸系化合物(I) 使該聚葡萄胺糖之胺基醯化，且接著，使所得醯化產物(B1) 在鹼存在下反應以產生交聯聚葡萄胺糖(B2) ，該交聯聚葡萄胺糖接著可藉由純化分離以得到純化的根據本發明之交聯聚葡萄胺糖。
根據一個特定實施例，聚葡萄胺糖可以於質子性溶劑中膨脹之狀態、甚至以溶解狀態提供，但在此情況下，可能發生醯化劑之水解副反應且當計算反應負荷時，此必須考慮在內。另外，在此情況下，在步驟 c) 之氮雜-邁克爾反應階段之前，需要洗滌在步驟 b) 獲得的醯化聚葡萄胺糖以移除醯化劑之水解產物。
根據一個特定實施例，聚葡萄胺糖係在無水存在下提供且醯化步驟係在無水存在下進行。無水存在有利地產生較高產率且避免副產物之形成。
根據一個特別有利之態樣，醯化步驟係在無水存在下進行。在此情況下，非質子性溶劑可用作反應介質或超臨界流體。根據一個特定實施例，非質子性溶劑係極性非質子性溶劑，諸如選自DMF及DMSO之溶劑。在一個特定實施例中，超臨界流體可為超臨界溶劑，諸如二氧化碳、一氧化氮(I)、氟利昂（freon）（氯(溴)(氟)烴），其被用於將醯化劑提供至反應介質，且接著在例如藉由將壓力降低至低於臨界值而自該反應介質移除超臨界溶劑之後進行醯化反應。
根據另一個特別有利之態樣，醯化步驟係在無水非質子性介質中進行。
根據一個特定態樣，極性非質子性溶劑選自二甲基甲醯胺（DMF）、二甲基乙醯胺、乙腈（MeCN）、N-甲基吡咯啶酮、二甲亞碸（DMSO）或其混合物。
根據另一個特定態樣，亦可使用二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿及其他氯(氟)烴作為極性非質子性溶劑，但當進行氮雜-邁克爾反應步驟 c) 時，應當在即將提供鹼之前蒸餾出該等溶劑。在不超過60℃之溫度下執行此類蒸餾係合乎需要的，此在大氣壓下適用於大多數所提及之溶劑。若使用高沸點溶劑，則須在減壓下進行蒸餾。
根據另一個特定態樣，在無水條件下，亦可使用醚及酯、酮作為反應步驟a)至c)之溶劑，但在此類溶劑中反應將較慢進行。舉例而言，可使用***、二異丙基醚、甲基第三丁基醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酮、甲基乙基酮及二乙基酮。
根據本發明之一個特定態樣，醯化步驟 b) 可藉由在用丙烯醯氯醯化葡萄胺糖之情形中所描述的任何方法（Zhang 等人,2017, Biomacromolecules, 1, 3, 778-786 ；Bu 等人,2017, Advances, 7, 76, 48166-48175 ）或所描述的可用於醯化胺基之方法，諸如使用i)碳化二亞胺；ii)疊氮化物；iii)混合酐；iv)活化酯及v)以下所描述之其他方法的方法進行。
在步驟b)中可使用已知的使用碳化二亞胺，藉由形成中間物烯醇酯進行醯化之方法（WO 2019/60740；Hao-Bin 等人, 2018, Carbohydrate Polymers, 196, 359 - 367 ）。若N,N'-二環己基碳二亞胺（DCC）可用作縮合劑，則1-乙基-(3-(3-二甲基胺基)丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽及N-環己基-N'-(2-N-
Figure 02_image017
啉基乙基)碳化二亞胺對甲苯磺酸甲酯（CAS登記號：2491-17-0）將為較佳的。
在步驟b)中可使用已知的使用疊氮化物之醯化方法（Honzl 等人, 1961, Coll. Czech. Chem. Commun., 26, N. 9, 2333-2344 ）。
在步驟b)中可使用已知的使用混合酐之醯化方法（Wieland 等人, 1951, Ann. Chem., 572, N3, 190-194 ； Belleau 等人, 1968, J. Amer. Chem. Soc., 90, N 6, 1651-1652 ； Gorecka 等人, 1978, Synthesis, N 6, 474-476 ； Diago-Meseguer 等人, 1980, Synthesis, N 7, 547-551 ； Leplawy 等人, 1960, Tetrahedron, 11, N 1, 39-51 ）。亦可使用內酐進行醯化，例如順丁烯二酸酐（Liwschitz 等人,1957, Journal of the Chemical Society, 4399 ； Kang 等人, 2014, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2, 10, 2364-2367 ； US 2016/200730 ； Sanchez 等人, 2010, Anna European Journal of Organic Chemistry, 13, 2600 - 2606 ）。
在步驟b)中可使用已知的使用活化酯經由形成活化醯胺進行醯化的方法，諸如羰基二咪唑方法（Paul 等人, 1960, J. Amer. Chem. Soc., 82, N 17., 4596-4600 ）、氰基甲基酯方法（Schwyzer 等人, 1955, Helv. Chim. Acta, 38, N 1, 80-83 ）、苯硫基酯方法（Wieland 等人, 1951, 前述 ）、經取代苯基酯方法（Gross 等人, 1983, Mayenhofer 編輯 , Moscow: Mir., 第 421 頁 ）、利用雜芳族化合物之酯方法結合碳化二亞胺方法（Jakubke 等人, 1966, A. Chem. Ber., 99, N 8, 2419-2429 ； Taschner 等人, 1965, Ann. Chem., 690, 177-181 ）、利用羥胺衍生物之酯方法結合碳化二亞胺方法（Losse 等人, 1964, Ann. Chem., 678, 185-190 ； Nefkens 等人, 1961, Amer. Chem. Soc., 83, N 5, 1263 ； Anderson 等人, 1963, Ibid,  85, N 19, 3039 ； König 等人, 1970, Chem. Ber., 103, N 3, 788-798 ）、酯交換法（酯方法之變型）（Sakakibara, 1965, Bull. Chem. Soc. Jap., 38, N 1, 1979-1984 ； Fujino 等人, 1968, Ch. Chem. Pharm. Bull., 16, N 5, 929-932 ； Gudkov 等人, 1978, 48, 9, 2146 ； Devadas 等人, 1979, Ind. J. Chem., B16, N 11, 1026-1027 ）。
在步驟b)中可使用其他已知的醯化方法，諸如酮亞胺法（Stevens 等人, 1958, J. Amer. Soc., 80, N 15, 4069-4071 ）；乙炔衍生物法（Arens, 1955, Rec. Trav. Chim., 74, N 6, 759-770 ； Gais 1978, Aktivierungsmittel für Peptidsynthesen J. Angew. Chem. Int. Ed,90(8), 625-626 https://doi.org/10.1002/ange.19780900808 ）；使用氰胺衍生物之方法（Losse 等人, 1960, Ann. Chem., 636, 144-149 ）；使用異
Figure 02_image001
唑鎓鹽進行之合成（Woodwart 等人, 1961, J. Amer. Chem. Soc., 83, N 4, 1010-1012 ）；使用醯亞胺基鹵化物進行之合成（Bergmann 等人, 1936, J. Biol. Chem., 115, N 3, 93-611 ）。
根據一個特定實施例，式(I)之丙烯酸系化合物可為酸、酸鹵化物、活性酯（例如3-羥基苯并***酯、N-羥基琥珀醯亞胺、五氯苯酚、2-硝基-4-磺基苯酚酯及具有其他類似離去基團之酯）、酐或其混合物。
根據一個特定實施例，式(I)之丙烯酸系化合物選自下組：
Figure 02_image025
（當歸酸（angelic acid），CAS登記號：565-63-9）；
Figure 02_image027
（2-異丙基丙烯酸，CAS登記號：4465-04-7）；
Figure 02_image029
（2-亞甲基十二烷酸，CAS登記號：52756-21-5）；
Figure 02_image031
(4S,6S)-4,6-二甲基-2-亞甲基二十二烷酸；
Figure 02_image033
（(Z)-3-環己基丙烯酸，CAS登記號：673456-32-1）；
Figure 02_image035
（(E)-3-[4-(2,6-二側氧基-1,3-二丙基-2,3,6,7-四氫-1H-嘌呤-8-基)-雙環[2.2.2]辛-1-基]-丙烯酸，CAS登記號：340021-16-1）；
Figure 02_image037
（(2E)-3-((E)-4-{[2-(4-氯苯氧基)-2-甲基丙醯基]胺基}-1-金剛烷基)丙烯酸；
Figure 02_image039
（3-(2-羧基-4-苯基-3-苯乙烯基-環丁基)-丙烯酸，CAS登記號：34271-87-9）；
Figure 02_image041
（3-甲基-2-丙烯酸-(1)-環丙烷-羧酸-(1)-羧酸-(1)-乙酯，CAS登記號：91971-88-9）；
Figure 02_image043
(3t,4t-二羧基-環丁烷-1,2c-二-(反-丙烯酸)，CAS登記號：55011-62-6）；
Figure 02_image045
冠二烯（coronadiene）；
Figure 02_image047
（CAS登記號：1247-53-6）
Figure 02_image049
（(E)-3-(2t-乙氧羰基-6ξ-甲氧基-環己烷-1r-基)-丙烯酸，CAS登記號：2960-11-4）；肉桂酸；4-甲基肉桂酸；對硝基肉桂酸；咖啡酸（caffeic acid）；
Figure 02_image051
（3-(呋喃-2-基)巴豆酸；3-(2-呋喃基)丙烯酸，CAS登記號：539-47-9）；
Figure 02_image053
（(Z)-尿刊酸，CAS登記號：7699-35-6）；
Figure 02_image055
（3-(4-吡啶基)-2-丙烯酸；3-(吡啶-4-基)丙烯酸，CAS登記號：5337-79-1）；毛子草鹼糖苷（argutinosides）A-I；
Figure 02_image057
（(Z)-2-氯-丁-2-烯酸，CAS登記號：53993-41-2）；
Figure 02_image059
（(2Z)-2,3-二氯丙-2-烯酸，CAS登記號：3533-68-4）；
Figure 02_image061
順N-第三丁氧基羰基脫氫β-丙胺酸，CAS登記號：151292-68-1）；
Figure 02_image063
（2-羥基-3-巰基-丙烯酸，CAS登記號：6228-60-0；
Figure 02_image065
羥基(甲基)丙烯酸；
Figure 02_image067
（二羥基丙烯酸，CAS登記號：2702-94-5）；
Figure 02_image069
（Reaxys ID 2721331）；
Figure 02_image071
（CAS登記號：64361-31-5）；
Figure 02_image073
3-(2-羧基亞甲基-環戊基)-丙烯酸；
Figure 02_image075
（CAS登記號：78727-62-5）；
Figure 02_image077
（氟丁烯酸，CAS登記號：2365-87-9）；
Figure 02_image079
（(E)-2,3-雙(苯氧基羰基胺基)丁-2-烯二酸）；
Figure 02_image081
（(Z)-2,3-雙(苯氧基羰基胺基)丁-2-烯二酸）；
Figure 02_image083
(2E,4E)-2,4-己二烯二酸（黏康酸）、順丁烯二酸；反丁烯二酸；
Figure 02_image085
（順丁烯二醯基乙醯乙酸，CAS登記號：5698-52-2）；(E)-4-(甲胺基)-4-側氧基丁-2-烯酸，麩胺酸之丙烯酸衍生物
Figure 02_image087
；
Figure 02_image088
（2-亞甲基-9(Z)-十八烯酸，CAS登記號：33780-98-2）；
Figure 02_image090
（2-亞甲基-5-己烯酸（2-亞甲基己-5-烯酸），CAS登記號：73505-05-2）；
Figure 02_image092
（(E)-6,9-二甲基-2-亞甲基十一碳-5,9-二烯酸，CAS登記號：1580541-76-9））
Figure 02_image094
（2-(順-7,8-十六烯基)-丙烯酸）；
Figure 02_image096
（(E)-2-亞甲基辛-4,7-二烯酸）；
Figure 02_image098
（2-亞甲基-7-辛炔酸，CAS登記號：127559-93-7）；以及
Figure 02_image100
（2-亞甲基-5-癸炔酸，CAS登記號：150254-20-9）；以及醯基鹵化物（R1 =鹵素），特別是丙烯醯氯； （
Figure 02_image102
）或甲基丙烯醯氯。
根據另一個特定實施例，丙烯酸系化合物係醯基鹵化物（R1 =鹵素），特別是丙烯醯氯（
Figure 02_image102
）或甲基丙烯醯氯。
根據一個特定態樣，當在醯化步驟 b) 中使用的丙烯酸系化合物係酸鹵化物時，避免反應系統中存在水很重要，因為酸鹵化物會發生不合需要的水解副反應，產生丙烯酸且此可導致在游離丙烯酸與聚葡萄胺糖之胺基發生邁克爾加成反應期間複數個奈米粒子經羧基官能化。
根據一個特定態樣，在醯化步驟 b) 中使用之丙烯酸系化合物係酸氯化物（例如醯基氯）。根據一個態樣，酸氯化物之使用有利地引起氯化氫之形成，氯化氫在過量鹼存在下不會干擾下一反應步驟且易於在透析期間以鹽形式移除。
值得注意的是，用羧酸鹵化物使胺醯化使得製造出一當量酸，其將與未反應之胺形成鹽並降低本發明方法之產率。因此，當在醯化步驟 b) 中使用酸鹵化物時，添加一當量鹼，較佳地非親核性鹼（例如在步驟 b) 中使用三乙胺）來中和此酸。
根據一個特定態樣，當在醯化步驟 b) 中使用之丙烯酸系化合物係酸酐時，本發明之方法進一步包含在進行步驟 c) 之前，洗滌反應介質並移除所形成之酸以避免反應系統中存在水的步驟。具體言之，可經由過濾器，或藉由針對溶劑透析或藉由使醯化產物懸浮於溶劑中並離心且丟棄上清液，用溶劑自醯化產物洗掉所形成之酸。
根據另一個特定態樣，當在游離酸存在下使用縮合劑（例如DCC）進行醯化時，需要小心地控制反應之完全性且較佳地，仍然包括洗滌步驟作為預防措施。舉例而言，當使用諸如DCC之類縮合劑作為縮合劑時，在醯化反應期間形成副產物，諸如二環已基脲，其需要在進行下一步驟之前自反應物中移除以使其不參與形成交聯產生本發明之複數個奈米粒子。
根據另一個特定實施例，在步驟 c) 中，鹼係以足以形成鹼性介質以中和在步驟 b) 中形成之鹵化氫的莫耳過量使用。典型地，鹼之莫耳過量係至少10%莫耳過量（例如約20至40%莫耳過量），此將對應於相對於步驟 b) 所得醯化產物之胺基至少1-3倍莫耳過量。
根據另一個特定實施例，在步驟 c) 中獲得的交聯聚葡萄胺糖可在步驟 d) 中，藉由標準技術純化以移除鹽雜質及/或殘留非質子性溶劑，諸如藉由用溶劑，諸如水或二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙酮及類似物進行之透析或洗滌步驟，隨後離心或使用該交聯聚葡萄胺糖所形成之複數個奈米粒子不可溶之超臨界溶劑，諸如使用二氧化碳，或藉由蒸發移除非質子性溶劑且接著經由過濾器，例如具有不超過40 μm之孔之過濾器，用溶劑自交聯聚葡萄胺糖產物洗掉副產物。根據一個更特定之實施例，可有利地使用精細孔隙度之疏水性過濾器元件，諸如聚丙烯或PTFE，因為它們的疏水性會為親水性聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子穿透它們造成額外障礙。
根據另一個特定實施例，在步驟 d) 中獲得的純化之交聯聚葡萄胺糖可經乾燥，例如在視情況選用之另一乾燥步驟 e) 中進行乾燥。
根據一個特定態樣，步驟 c) 中使用的進行邁克爾加成反應之鹼係基本上純的非親核性鹼，特別是基本上不含二級胺之存在。
根據一個特定態樣，邁克爾加成步驟 c) 係在質子性溶劑，諸如水中進行。在此情況下，需要控制皂化之程度，例如藉由量測在醯化階段所形成之羧基及所形成之胺基的量進行控制。由於羧基之濃度通常要低1至2個數量級，且胺基數目之差異可在實驗誤差範圍內，故針對羧基之準確方法將為NMR、IR光譜法或酸-鹼滴定法，諸如以下中所述：Glazunov 等人, 1999, 25(3), 216-219 ； Brugnerotto 等人, 2001, Polymer, 42, 3569-3580 或Kubota 等人, 2000, Carbohydrate Research, 324, 268-274 。然而，當希望在步驟 c) 結束時獲得皂化之交聯聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子時，或當計劃如下所述重複醯化步驟以便使複數個奈米粒子經羧基官能基飽和且接著在過量情況下實現交聯時，在此步驟使用質子性溶劑可為有利的。實際上，當複數個奈米粒子經羧基官能基飽和時，進行皂化步驟。接下來，重複醯化及氮雜-邁克爾步驟，隨後進行皂化。若在氮雜-邁克爾步驟期間，在質子性溶劑中發生自發皂化，則此並非不利的，因為無論如何，隨後均將進行皂化，且在氮雜-邁克爾反應期間會部分發生皂化的事實將不成問題。
根據另一個特定態樣，邁克爾加成步驟 c) 係在無水存在下進行，此可藉由使用非質子性溶劑作為反應介質或藉由使用鹼作為溶劑來實現。
根據另一個特定實施例，邁克爾加成反應步驟係在鹼性介質中進行，使得對於在醯化步驟期間形成之每個醯胺鍵，在邁克爾加成反應之後形成一當量二級胺，由此使得即使在所有胺基交聯之情況下，仍有至少一半胺基可用於鹽形成。此可藉由酸-鹼滴定法、IR及NMR光譜法檢查，諸如以下中所述：Glazunov 等人, 1999, 25(3), 216-219 ； Brugnerotto 等人, 2001, Polymer, 42, 3569-3580 或Kubota 等人, 2000, Carbohydrate Research, 324, 268-274 。 根據一個特定態樣，在聚葡萄胺糖巨分子內進行之分子內加成反應因統計及空間因素而明顯優於分子間反應，由此引起交聯之高產率。
在邁克爾加成反應步驟 c) 之後得到的複數個奈米粒子可經歷還原（例如藉由與複雜金屬氫化物、乙硼烷、氰基硼氫化物及硼氫化物之其他衍生物反應）以便將醯胺基轉化成二級胺並增加複數個奈米粒子電離之可能程度。複數個奈米粒子電離之可能程度取決於胺基之數目。存在的胺基越多，則形成鹽且相應地發生電離之機會越大。電離程度可藉由酸-鹼滴定法、IR及NMR光譜法評估。
根據另一個態樣，在步驟 c) 或步驟 d) 中獲得的交聯聚葡萄胺糖產物或在步驟 e) 中獲得的相應乾燥產物可在鹼性條件下（例如在過量鹼水溶液存在下）於質子性溶劑中經歷皂化步驟 f) 以便增加交聯聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子在較寬pH值範圍內，例如在生理學弱鹼性條件（例如近似pH值係7.2-7.3）下之溶解度。若在步驟 c)或 d) 中使用之溶劑不允許皂化（例如，如DMF），則需要在純化步驟 d) 之後於允許皂化之溶劑中進行皂化，或藉由在步驟 e) 之後，使乾燥之交聯聚葡萄胺糖再懸浮於允許皂化之溶劑中，諸如於作為溶劑之醚中來進行皂化。
舉例而言，在此另一步驟 f) 中，將鹼水溶液以相較於步驟 b) 中使用之醯化劑之量莫耳過量，諸如以此類醯化劑之莫耳量的約10倍或100倍量添加至在步驟 c) 或 d) 中獲得的產物中。如以下方案 2 中概略顯示，將交聯聚葡萄胺糖(B2) 之醯胺基水解成產物(B3) 中之相應羧基，其可用於形成相應鹽。方案 2
Figure 02_image105
此使得交聯聚葡萄胺糖中之一半胺基再生為一級胺，另一半變成二級胺，現用丙酸（或經取代丙酸）使其烷基化。舉例而言，交聯聚葡萄胺糖之皂化可藉由在50攝氏度下添加1M氫氧化鈉水溶液保持一小時來進行。所得產物(B3) 接著可如以下方案 3a 及方案 3b 中概略顯示再經歷醯化步驟 b) ，其中在此情況下，醯化係在相同條件下發生，其中可發生一級胺基（方案 3a ）及二級胺基（在方案 3b 之階段b、c或f獲得的胺基之重新醯化）之醯化。接著，所得產物(B4) 再在步驟 c) 經歷邁克爾加成反應以實現所有胺基之交聯並獲得基本上完全交聯之聚葡萄胺糖(B5) 。方案 3a
Figure 02_image107
方案 3b
Figure 02_image109
在此情況下，在所得產物中，與羧基形成內鹽，此將為在第一合成步驟 c) 結束時存在之胺基之初始含量的一半。根據一個特定態樣，此類產物將含有基本上相同數目之羧基、總二級及三級胺基、醯胺官能基（不包括初始乙醯胺基糖苷片段），亦即，此類產物將包含完全內鹽，所有羧基均經胺基平衡。
儘管不希望受任何理論束縛，可認為若在步驟 a) 所提供之初始聚葡萄胺糖中存在胺基，則在步驟 b) 中將實現其徹底的衍生化，X個胺基經醯化劑醯化且因此，X個胺基將在步驟 c) 中與接枝至聚葡萄胺糖上之醯基片段發生氮雜-邁克爾反應。在步驟 c) 之產物中存在的在步驟 b) 中形成之醯胺基經歷皂化步驟 f) 而皂化之後，X個一級胺基再生，X個羧基係獲自醯化中使用之丙烯酸，且由步驟 c) 得到的X個二級胺基仍保留。因此，在藉由醯化進行重複徹底衍生化之後，X個再生之一級胺基可進一步醯化（在步驟 c) 中獲得的二級胺基有可能經醯化，但此係不大可能發生之程序）。接著，當重複步驟 c) 時，先前在步驟 c) 中獲得的二級胺基進入氮雜-邁克爾反應，形成X個三級胺基。
另外，再次進行皂化使X個一級胺基再生且X個三級胺基仍保留，其不會經歷皂化，且形成X個羧基。因此，羧基之總數目將為2X個，一級胺基X個、三級胺基X個且聚合物將變為電中性且形成內鹽。
若第三次進行徹底衍生化，則僅需要X/2的醯化劑，因為僅X個胺基能夠進入此等反應中且所有此等胺基均為一級胺基。因此，在第三衍生化工序（步驟b)至c))及皂化（步驟f))之後，僅獲得2.5X個羧基、1.5X個三級胺基、0.5X個一級胺基且聚合物將變為具有0.5X過量之羧基的陰離子型聚合物。因此，重複此反應工序將每次使羧基之數目以0.25、0.125、0.0625、0.03175等的增量增加。羧基之存在可容易地藉由紅外法或藉由酸-鹼滴定法，以及藉由質譜法確定。
根據一個特定實施例，在視情況選用之皂化步驟 f) 中使用之鹼的量與第一反應步驟 c) /d) 或 e) 中獲得的待皂化之醯胺基等莫耳量且至多10倍莫耳過量。
根據一個特定實施例，步驟 b) 至 c) （ 或 d)/e) ） 中之至少一個工序係在邁克爾加成結束時且在再進行新的醯化步驟 b) 至 c) （ 或 d)/e) ）工序之前與皂化步驟 f) 一起進行。
根據另一個特定實施例，進行步驟 a) 至 f) 之約2至6個反應工序。
根據另一個特定實施例，將步驟 a) 至 f) 之反應工序重複一次或兩次。
根據一個特定實施例，在步驟 a) 至 f) 之每個工序之後，獲得交聯聚葡萄胺糖在較寬pH值範圍內之溶解性且天然聚葡萄胺糖之特性可經改變，例如黏稠性（mucotropy）及進入細胞中之穿透性。因此，該等特性可取決於所執行之反應工序的數目有利地調整，且所得交聯聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子可用於遞送所關注之化合物。
根據一個特定實施例，就電荷而言，陽離子性物質（例如陽離子性肽，諸如富含精胺酸、鳥胺酸或離胺酸之序列）或中性物質可藉由根據本發明之交聯聚葡萄胺糖遞送。
根據另一個特定實施例，根據本發明之交聯聚葡萄胺糖可用於調配該等化合物以防止其降解（例如經蛋白水解降解）或防止其結合非所需之物質（例如抗體或其他巨分子）或用於確保該等化合物之可溶物緩慢釋放。
根據另一個特定實施例，生物活性材料可在第一醯化步驟 b) 或第一邁克爾加成步驟 c) 之後整合於所形成之複數個奈米粒子內。根據另一個特定實施例，生物活性材料可共價連接、或吸附、或以鹽形式固定、或包封於本發明之交聯聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子內。
在進行皂化步驟之情況下，生物活性劑之共價交聯將被破壞，但可在所形成之交聯聚葡萄胺糖的鹽內形成與生物活性劑之離子鍵。
或者，當應用步驟 a) 至 f) 時，複數個奈米粒子可用對一系列此等步驟中使用之試劑具有抗性的生物活性物質浸漬，諸如用重元素之團簇浸漬以產生不透射線複數個奈米粒子。
又或者，在合成本發明之交聯聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子後，較佳地將多官能、不穩定之生物活性物質藉由擴散至該等奈米粒子中，或使用點擊化學，酶、蛋白質、核酸及抗體固定之方法引入。
根據一個特定態樣，本發明之聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子內生物活性材料之整合可藉由用所希望之生物活性材料浸漬由步驟 b) 或c) 得到之產物來實現。舉例而言，可在進行邁克爾加成步驟 c) 之前，將生物活性材料於非質子性溶劑中之溶液添加至由步驟 b) 得到之產物中。或者，可將由步驟 b) 得到之乙醯化聚葡萄胺糖產物溶解於適於該等進一步合成條件之溶劑中。
浸漬可在不溶解本發明之交聯聚葡萄胺糖的情況下執行。
鑒於用生物活性劑浸漬本發明之交聯聚葡萄胺糖，可將該生物活性劑/物質溶解於極性非質子性溶劑中或任何其他溶劑中。若使用質子性溶劑，則在氮雜-邁克爾反應之前，需要將該溶劑移除並乾燥浸漬之產物。對於浸漬，可如以下中所述使用超臨界流體：Weidner 2018, The Journal of Supercritical Fluids, 134, 220-227 https://doi.org/10.1016/j.supflu.2017.12.024 ； Duarte 等人, 2007, The Journal of Supercritical Fluids, 42 (3), 373-377 https://doi.org/10.1016/j.supflu.2007.01.007 ， 由此提供極高程度及高品質之浸漬。若該試劑之浸漬可利用Coulomb之方法加速，則亦可使用如Boccaccini 等人,2010, J.R.Soc.Interface, 7, S581-S613 https://doi.org/10.1098/rsif.2010.0156.focus ；Pishbin 等人,2013, Acta Biomaterialia, 9(7), 7469-7479 中所描述之電泳方法，或如Zhao 等人,2012, PLoS One, 7(10): e46765.doi:10.1371/journal.pone.0046765 中所描述之「基因槍」法。舉例而言，可將諸如抗生素之生物活性材料的水溶液與在步驟 b) 之後醯化之聚葡萄胺糖的水溶液混合並經歷藉由與水共沸蒸餾進行之蒸發、噴霧乾燥、凍乾及其他乾燥方法，以獲得呈乾燥狀態的經生物活性材料浸漬之醯化聚葡萄胺糖。接著，將乾燥材料用過量之非親核性鹼處理以使聚葡萄胺糖之胺基去離子化且接著，使所得混合物經歷邁克爾加成反應步驟 c) 。
根據另一態樣，步驟a)所提供之聚葡萄胺糖具有在約5至約2'000 kDa範圍內，特別是在約150至2'000 kDa範圍內之平均分子量。
根據又另一個態樣，步驟a)所提供之聚葡萄胺糖具有約100%（如呈葡萄胺糖形式）至每個巨分子約兩個去乙醯化片段的去乙醯化程度，例如，對於分子質量為300 kDa之聚葡萄胺糖（幾丁質）而言，去乙醯化程度為約0.14%。
可在本發明方法中用作起始物質之適合聚葡萄胺糖可為各種來源，包括天然（動物或真菌）來源，特別是來自蟹及蝦之外殼、昆蟲外骨胳、高等真菌、單細胞菇類之培養物。亦可使用以化學方式或酶方式合成之聚葡萄胺糖。
根據另一態樣，使步驟 a) 所提供之聚葡萄胺糖膨脹約5分鐘至約1天，較佳地在非質子性溶劑中膨脹。
根據又另一個態樣，去乙醯化步驟b)係在約-70℃（開始反應）至約+150℃（反應完成）之溫度下進行，較佳地在約+2℃（開始反應）至約+55℃（反應完成）之溫度下進行。反應時間係約0.5小時至10天，較佳地在約+20至約+30℃下進行約2.5小時，較佳地在超音波作用作為混合手段下進行。
根據又另一個態樣，邁克爾加成步驟 c) 係在約-70℃（開始反應）至約+150℃（反應完成）之溫度下進行，較佳地在約+20℃（開始反應）至+55℃（反應完成）之溫度下進行。反應時間係約0.5小時至10天，較佳地在約+20℃下進行約15-18小時及在約+55℃下進行約6小時，較佳地在超音波作用作為混合手段下進行。
根據又另一個態樣，交聯聚葡萄胺糖之乾燥步驟係在步驟 e) 中藉由冷凍乾燥進行。
根據又另一個態樣，視情況選用之額外皂化步驟 f) 係在約0℃（開始反應）至約+140℃（反應完成）之溫度下進行，較佳地在約+20℃（開始反應）至約+55℃（反應完成）之溫度下進行。反應時間係約0.5小時至10天，較佳地在約+55℃下進行約2-6小時，較佳地在超音波作用作為混合手段下進行。
在特定實施例中，本發明之複數個奈米粒子係由在本發明方法之步驟 b) 及c) 中獲得的材料自發地形成。該等粒子隨時間極其穩定。舉例而言，2%溶液在室溫下穩定保持至少一年且在乾燥狀態下穩定保持至少數年。
根據本發明之一個態樣，提供一種用於製備生物活性劑之藥物遞送系統的方法，其包含進行本發明方法之步驟，其中生物活性劑係在步驟 b) 、c) 、d) 或e) 中添加。
根據本發明之一個態樣，提供一種用於製備生物活性劑之藥物遞送系統的方法，其包含以下步驟： -     提供呈潮濕或乾燥狀態的本發明之交聯聚葡萄胺糖； -     提供待遞送之生物活性劑； -     將該生物活性劑溶解於溶劑或超臨界流體中； -     藉由用生物活性劑溶液浸漬該本發明之交聯聚葡萄胺糖或藉由經電泳或經電場加速直接引入至複數個奈米粒子中，裝載該交聯聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子； -     收集所獲得的裝載有生物活性劑（例如藥物）之組成物或複數個奈米粒子。
根據另一個特定實施例，提供一種用於鑑別可由根據本發明之方法獲得的交聯聚葡萄胺糖之方法，該方法包含以下步驟： -     將待表徵之聚葡萄胺糖提供於溶劑（例如二氯甲烷或氯仿）中； -     如本文所描述（例如以乙醯氯或乙酸酐），在劇烈攪拌下，使該聚葡萄胺糖醯化，諸如在約0℃至約20℃下，諸如保持約30分鐘； -     用鹼（例如作為非親核性鹼之二異丙基乙胺）中和反應介質； -     蒸發該等溶劑並洗滌所獲得的中和產物； -     使該產物經歷回流酸水解（例如較佳地用28%鹽酸，持續約1至3小時，諸如約2小時）； -     蒸發反應混合物並使水解產物再懸浮於諸如乙酸之弱酸中； -     確定產物之存在或不存在，該產物選自根據式(IIIa)或根據式(IIIb)之產物
Figure 02_image111
Figure 02_image113
[化學式(IIIa)]；              [化學式(IIIb)]； 其中R2 至R4 如本文所定義，R2' 至R4' 分別如本文中關於R2 至R4 所定義且其中式(IIIa) 及/或(IIIb) 之產物的存在指示藉由根據本發明之方法獲得的交聯聚葡萄胺糖。
根據另一個特定實施例，在用於鑑別根據本發明之交聯聚葡萄胺糖的方法中，根據式(IIIa)之產物的存在或不存在可例如藉由質譜電噴霧分析進行鑑別，其中例如，具有m/z =252.077之峰指示根據式(IIIa)之化合物，特別是式(II)化合物之存在。
Figure 02_image115
[化學式(II)]
用於鑑別由根據本發明之方法獲得的交聯聚葡萄胺糖之方法極其有用，因為該方法能夠將藉由根據本發明之方法獲得的交聯聚葡萄胺糖與藉由其他方法，諸如藉由前述Baoqiand 等人,2015 或前述El-sherbiny 等人,2009 中所描述之方法獲得的交聯聚葡萄胺糖相區別。根據本發明之聚葡萄胺糖及其 複數個 奈米粒子
根據本發明之交聯聚葡萄胺糖可根據本發明之方法，由易於得到的起始物質製備。應可察知，在給定典型或較佳實驗條件(亦即，反應溫度、時間、試劑之莫耳量、溶劑等)情況下，除非另外說明，否則亦可使用其他實驗條件。最佳反應條件可隨所用特定反應物或溶劑而變化，但該等條件可由熟習此項技術者使用常規最佳化程序來確定。
根據一個特定實施例，提供一種藉由本發明之方法獲得的交聯聚葡萄胺糖及其複數個奈米粒子。
根據另一個特定實施例，提供一種以黏度低於起始聚葡萄胺糖為特徵之交聯聚葡萄胺糖。舉例而言，對於90%去乙醯化程度、3.2%交聯及0.25%濃度之聚葡萄胺糖，根據本發明之複數個奈米粒子之溶液的黏度要比起始聚葡萄胺糖低3倍，例如本發明之聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子在25℃下為2.4 cSt及在37℃下為1.82 cSt對比相應起始聚葡萄胺糖在25℃下為7.5 cSt及在37℃下為5.4 cSt。
根據一個特定實施例，本發明之交聯聚葡萄胺糖的醫藥學上可接受之鹽包含諸如乙酸鹽、乳酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、丙二酸鹽、反丁烯二酸鹽、順丁烯二酸鹽、蘋果酸鹽以及其他羧酸、羥基羧酸，及其鹽酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽及其他無機酸鹽。
應理解，本發明之交聯聚葡萄胺糖的分子量可藉由起始物質之選擇改變且其選擇將取決於本發明之複數個奈米粒子及其調配物之預定功能。舉例而言，所希望之複數個奈米粒子組成物降解速率、所希望的視情況併入其中之生物活性劑之釋放速率、待治療之治療病況將影響作為起始物質之聚葡萄胺糖之分子量的選擇。
在一個實施例中，本發明之交聯聚葡萄胺糖的分子量在約2 kDa與2 MDa之間。
在另一個實施例中，用於潤滑/填充劑組成物中的本發明之交聯聚葡萄胺糖的分子量可在約2 kDa與2 MDa之間選擇，較佳地在約30 kDa與1'000 kDa之間選擇。
在另一個實施例中，用於或作為藥物遞送系統的本發明之交聯聚葡萄胺糖的分子量可在約2 kDa與2 MDa之間選擇，較佳地在約30 kDa與1'000 kDa之間選擇。 組成物
本發明提供呈組成物形式之醫藥劑或治療劑、或包含其之醫療裝置及用於治療個體之方法，該個體較佳地為哺乳動物患者，且最佳地為人類患者，該個體罹患醫學病症，且特定言之心血管病況，諸如心律不整，特別是心房微顫及高血壓；關節病變及關節疾病，諸如類風濕性關節炎、骨關節炎、脊椎關節炎及導致軟骨、骨、韌帶或滑液囊損傷之外傷事件；眼部病變及損傷，諸如乾眼症候群、葡萄膜炎、青光眼、角膜病變；結締組織病症，諸如狼瘡及多發性肌炎；皮膚/黏膜病症或損傷，諸如創傷、瘢痕、牛皮癬、痤瘡、濕疹、玫瑰痤瘡、物理性或化學性燒傷，特別是手術傷口及曬傷、潰瘍、痔瘡；牙周及牙科疾病；硬脊膜損傷，諸如意外損傷或腦及中樞神經系統手術後硬脊膜損傷；惡性及良性贅瘤，特別是癌瘤、肉瘤、淋巴瘤及黑素瘤；術後併發症，諸如瘺及感染；腫瘤或血管畸形。
本發明提供可用於人類、獸醫學或農業應用的包含至少一種本發明之交聯聚葡萄胺糖之組成物。
在一個特定實施例中，根據本發明之農業用組成物可用作植物生長刺激劑（elicitor）。
根據一個特定實施例，本發明之交聯聚葡萄胺糖可用於製備自組裝結構、分子機器、遞送機構、電子元件、複合材料及潤滑劑。
在一個特定實施例中，本發明提供一種包含至少一種本發明之交聯聚葡萄胺糖或其組成物的醫藥調配物，其用作藥物。
在另一個特定實施例中，本發明之組成物係非口服調配物。
在一個特定實施例中，本發明之組成物係可注射調配物，諸如關節內、動脈內、靜脈內、滑膜內、真皮內、真皮下、黏膜下層、間質、顱內、眼內、腫瘤內、胃內、腸、肛門、腹膜內及肌肉內調配物。
在另一個特定實施例中，本發明之組成物係口服調配物。
在另一個特定實施例中，本發明之組成物係外用調配物。
在另一個特定實施例中，本發明之組成物係眼用調配物。
或者，本發明提供可用於另一種哺乳動物(例如人類)之如上文所描述相同用途的組成物。
本發明進一步提供可用於化妝品、重建手術（例如組織重建）、細胞或生物組織培養物（例如幹細胞培養物）、材料科學（例如表面塗層，諸如植入物塗層、潤滑劑組成物、凝聚劑組成物）、診斷（例如成像組成物）應用的組成物或醫療裝置。該等組成物分別進一步包含化妝品可接受之載劑或細胞或生物組織培養物養分。
根據本發明之組成物包含軟組織填充劑組成物，例如真皮及真皮下填充劑，其包含至少一種本發明之交聯聚葡萄胺糖或其複數個奈米粒子。基於聚葡萄胺糖之軟組織填充劑組成物的製備可如例如以下中所述進行：Grant 等人, 2018, Tissue Eng Part A., 24(13-14):1091-1098. doi: 10.1089/ten.TEA.2017.0385. Epub 2018 年 3 月 20 日。
在特定實施例中，提供本發明之交聯聚葡萄胺糖的複數個奈米粒子，其具有在約5及100 nm範圍內之平均大小。
本發明之另一態樣係關於一種創傷敷料，其包含至少一種根據本發明之交聯聚葡萄胺糖。
根據另一個特定態樣，本發明係關於一種包含滲透基質之創傷敷料，該基質包含親水膠體、水凝膠、海藻酸鹽、膠原蛋白、纖維素、發泡體或織物。
本發明之組成物可進一步包含一種或多種醫藥學上可接受之額外成分，諸如礬、穩定劑、抗微生物劑、緩衝劑、著色劑、調味劑、佐劑及類似物。
根據本發明之組成物，以及習知採用之佐劑、載劑、稀釋劑或賦形劑可製成醫藥組成物形式，且可以固體，諸如錠劑或填充膠囊；或液體，諸如溶液、懸浮液、軟膏、乳液、酏劑，或填充有其之膠囊、膜或凝膠形式使用，該等形式均供口服使用。該等組成物亦可調配為在使用之前用水或另一種適合媒劑復原之乾燥產物形式。
本發明之組成物呈液體調配物形式，包括但不限於水性或油性懸浮液、溶液、乳液、糖漿及酏劑。
此類液體製劑可含有添加劑，包括但不限於懸浮劑、乳化劑、非水性媒劑及防腐劑。懸浮劑包括但不限於山梨糖醇糖漿、甲基纖維素、葡萄糖/糖糖漿、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠及氫化可食用脂肪。乳化劑包括但不限於卵磷脂、脫水山梨糖醇單油酸酯及***膠。防腐劑包括但不限於對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯及山梨酸。分散劑或潤濕劑包括但不限於聚(乙二醇)、甘油、牛血清白蛋白、Tween®、Span®。
其他材料以及調配物加工技術及類似內容闡述於The Science and Practice of Pharmacy (Remington: The Science & Practice of Pharmacy), 第 22 版 , 2012, Lloyd, Ed. Allen, Pharmaceutical Press ，其以引用的方式併入本文中。
本發明之固體組成物可呈以習知方式調配之錠劑或***錠形式。舉例而言，供經口投與之錠劑及膠囊可含有習知賦形劑，包括但不限於黏合劑、填充劑、潤滑劑、崩解劑及潤濕劑。黏合劑包括但不限於糖漿、***膠、明膠、山梨糖醇、黃蓍膠、澱粉膠漿及聚乙烯吡咯啶酮。填充劑包括但不限於乳糖、糖、微晶纖維素、玉蜀黍澱粉(maizestarch)、磷酸鈣及山梨糖醇。潤滑劑包括但不限於硬脂酸鎂、硬脂酸、滑石、聚乙二醇及二氧化矽。崩解劑包括但不限於馬鈴薯澱粉及羥基乙酸澱粉鈉。潤濕劑包括但不限於月桂基硫酸鈉。錠劑可藉由此項技術中熟知之方法包覆。
根據本發明之農業用組成物包含植物生長加速劑、種子發芽增進劑、水分及養分保留調配物、殺蟲劑增強劑、延長形式（prolonged form）及費洛蒙穩定劑（pheromone stabilizer）、殺昆蟲劑之黏膜黏附形式、殺蟎劑（arachnocides）及抗軟體動物製劑。
根據一個特定實施例，提供一種農業用組成物，其包含約0.001至約99% w/w的本發明之交聯聚葡萄胺糖，例如約0.05至約0.1%（w/w）。
在另一個特定實施例中，本發明之組成物或複數個奈米粒子進一步包含生物活性劑，其分散於交聯聚葡萄胺糖組成物中或共價連接至交聯聚葡萄胺糖組成物。
在另一個特定實施例中，本發明之組成物或複數個奈米粒子呈生物活性劑遞送系統形式。
在一個實施例中，該至少一種生物活性物質之存在量以本發明之交聯聚葡萄胺糖組成物或奈米粒子之總量計可在約0.001至20 wt%之間，較佳地在約0.01至10 wt%之間。
根據另一態樣，根據本發明之組成物包含細胞或生物組織培養基，其包含交聯聚葡萄胺糖或其組成物。此培養基可進一步包含細胞養分，諸如葡萄糖、維生素、生長因子、金屬離子及類似物。
根據另一態樣，根據本發明之組成物包含可用於修復身體之受損組織，諸如表皮、神經、軟骨或骨組織的生物組織（內源性或外源性）或合成或半合成材料。
在另一個特定實施例中，提供一種製備培養基之方法，其包含將根據本發明之交聯聚葡萄胺糖與細胞培養物養分，諸如葡萄糖、維生素、生長因子、金屬離子及類似物混合的步驟。
在另一個特定實施例中，提供一種製備重建組織之方法，其包含將根據本發明之交聯聚葡萄胺糖或其組成物與可用於修復身體之受損組織，諸如幹細胞或表皮、神經、軟骨或骨組織之材料、組織或細胞組合的步驟。
根據一個特定態樣，本發明之組成物或複數個奈米粒子在裝載了生物活性物質或生物活性劑之後可用於投與及原位釋放該活性成分注射液。 投藥模式
本發明之組成物亦可藉由注射，諸如皮下注射、滑膜內、動脈內、靜脈內、關節內、肌肉內、真皮下、黏膜下層、眼內、顱內、胃內、腸、肛門、腹膜內、腫瘤內及間質注射，以任何方式投與。
本發明之組成物可藉由經口途徑以任何方式投與，包括投與口腔之黏膜表面，包括牙齦、口腔底、面頰、嘴唇、舌、牙齒。
本發明之組成物亦可經表面投與皮膚、各種黏膜或眼部。 組合
根據一個態樣，本發明之交聯聚葡萄胺糖或其複數個奈米粒子或其任何適合的醫藥學上可接受之鹽及其醫藥調配物可單獨投與或與至少一種共用藥劑（co-agent）組合投與。
根據一個特定態樣，根據本發明之共用藥劑包括抗生素、核酸（包括基因構築體）、抗體及抗體片段、毒素、細胞抑制劑、抗真菌劑、化學治療藥之組分、抗高血壓劑、抗心律不整物質、增殖活化物質、激素、細胞介素、一氧化氮供體及硫化氫供體。
本發明涵蓋向個體同時或依序投與本發明之交聯聚葡萄胺糖或其粒子及其醫藥調配物及該至少一種共用藥劑。
與該共用藥劑同時投與的根據本發明之交聯聚葡萄胺糖或其複數個奈米粒子或其醫藥調配物可以相同或不同組成物且藉由相同或不同投與途徑投與。
以單次或多次劑量形式投與個體之劑量將視多種因素而變化，包括藥物動力學特性、患者狀況及特徵(性別、年齡、體重、健康狀況及身材)、症狀程度、並行治療、治療頻率及所希望之效果。 患者
在一個實施例中，根據本發明之患者係罹患心血管病況，諸如心律不整，特別是心房微顫及高血壓之個體。
在另一個實施例中，根據本發明之患者係罹患關節病變及關節疾病，諸如類風濕性關節炎、骨關節炎、脊椎關節炎以及導致軟骨、骨、韌帶或滑液囊損傷之外傷事件的個體。
在另一個實施例中，根據本發明之患者係罹患眼部病變及損傷，諸如乾眼症候群、葡萄膜炎、青光眼、角膜病變之個體。
在另一個實施例中，根據本發明之患者係罹患結締組織病症，諸如狼瘡及多發性肌炎之個體。
在另一個實施例中，根據本發明之患者係罹患皮膚/黏膜病症或損傷，諸如創傷、瘢痕、牛皮癬、痤瘡、濕疹、玫瑰痤瘡、物理性或化學性燒傷，特別是手術創傷及曬傷、潰瘍、痔瘡之個體。
在另一個實施例中，根據本發明之患者係罹患牙周及牙科疾病之個體。
在另一個實施例中，根據本發明之患者係罹患硬脊膜損傷，諸如意外損傷或腦及中樞神經系統手術之後硬脊膜損傷之個體。
在另一個實施例中，根據本發明之患者係罹患惡性及良性贅瘤之個體。
在另一個實施例中，根據本發明之患者係罹患術後併發症，如瘺及感染之個體。
在另一個實施例中，根據本發明之患者係願意或需要身體部位體積增強或解剖結構重塑，諸如出於美觀或治療原因而對身體部位之體積進行的任何增強/改變及/或增加的個體。
在另一個實施例中，根據本發明之患者係罹患腫瘤、血管畸形或導致疼痛之任何其他新產生之身體組織或器官異常之個體。 根據本發明之用途
根據一個特定實施例，由於能夠自發地形成複數個奈米粒子，本發明之交聯聚葡萄胺糖可用於各種應用，諸如活體外細胞或生物組織培養物、作為組織填充劑、用於化妝品、組織及類器官工程改造以及材料科學應用。
具體言之，根據一個態樣，本發明之交聯聚葡萄胺糖可用作醫藥活性成分之載劑（例如作為藥物遞送系統、作為細胞穿透系統（例如在基因療法中或用於非細胞穿透劑）、作為增溶劑、作為捕捉劑：將所關注成分包封於複數個奈米粒子內產生懸浮液以例如藉由將酸性pH轉變成鹼性pH而自溶液有效移除。
根據另一態樣，本發明之交聯聚葡萄胺糖可用作醫學植入物（例如用於改善生物相容性的植入物之塗層、含細胞之再生醫學植入物）或醫學材料（例如止血材料）。
根據另一態樣，本發明之交聯聚葡萄胺糖可用作顯影劑（例如用於標準血管造影術（CT）及其他新興的成像方式（例如基於EPR、基於NMR及基於X射線之成像方式）中）的基質。
根據另一態樣，本發明之交聯聚葡萄胺糖可用作細胞培養物（例如幹細胞）、細胞培養基、組織工程改造（諸如類器官之3D列印）、用於分離/純化技術、用於細胞轉染之基質。
根據另一態樣，本發明之交聯聚葡萄胺糖可用作奈米級潤滑劑（例如在熱分解之後）、用於膠體製備之分散劑或用作凝聚劑。
根據另一個特定實施例，提供本發明之交聯聚葡萄胺糖或根據本發明之奈米粒子或其調配物的用途，其用於製備遞送系統、活體外細胞或生物組織培養物或組織工程改造材料，諸如神經外科、骨、軟骨、表皮重建組織。
根據另一個特定實施例，根據本發明之交聯聚葡萄胺糖或複數個奈米粒子或其調配物可用於預防或治療醫學病症，且特定言之心血管病況，諸如心律不整，特別是心房微顫及高血壓；關節病變及關節疾病，諸如類風濕性關節炎、骨關節炎、脊椎關節炎以及導致軟骨、骨、韌帶或滑液囊損傷之外傷事件；眼部病變及損傷，諸如乾眼症候群、葡萄膜炎、青光眼、角膜病變；結締組織病症，諸如狼瘡及多發性肌炎；皮膚/黏膜病症或損傷，諸如創傷、瘢痕、牛皮癬、痤瘡、濕疹、玫瑰痤瘡、物理性或化學性燒傷，特別是手術傷口及曬傷、潰瘍、痔瘡；牙周及牙科疾病；硬脊膜損傷，諸如意外損傷或腦及中樞神經系統手術後硬脊膜損傷；惡性及良性贅瘤，特別是癌瘤、肉瘤、淋巴瘤及黑素瘤；術後併發症，諸如瘺及感染；腫瘤或血管畸形，或用於預防及/或治療組織退化及相關病症。
根據另一個特定態樣，提供用於化妝品用途或用於美容及重建手術的根據本發明之交聯聚葡萄胺糖或複數個奈米粒子或其調配物。
根據另一個特定態樣，提供用於活體內藥物遞送的根據本發明之交聯聚葡萄胺糖或複數個奈米粒子或其調配物。
根據一個特定態樣，提供根據本發明之奈米粒子作為至少一種生物活性劑之遞送系統的用途。
根據一個特定實施例，提供一種包含至少一種根據本發明之交聯聚葡萄胺糖或複數個奈米粒子的組成物，其可用於許多醫學應用，諸如至少一種生物活性劑之遞送系統或組織工程改造中之細胞遞送系統、細胞或生物組織培養系統及類似應用。
說明本發明之實例將在下文參照圖中所示實施例更詳細地描述。實例
以下縮寫分別係指以下定義：DMF （二甲基甲醯胺）；DMSO （ 二甲亞碸）；MWCO （分子量截止值）。實例 1 ： 合成本發明之聚葡萄胺糖
如以上方案1中所描述，合成本發明之聚葡萄胺糖的複數個奈米粒子，其中所用起始物質如下： a) 提供聚葡萄胺糖並使該聚葡萄胺糖在無水存在下 （ 例如在非質子性溶劑中 ） 經歷膨脹步驟
在惰性氛圍（例如用氬氣吹掃）中，將450 g乾燥聚葡萄胺糖（聚葡萄胺糖可在真空中經氧化磷乾燥、在真空中經適度加熱來乾燥、與乙醇、乙腈、丙酮或任何其他適合溶劑共沸蒸餾來乾燥）置放於反應器中。此反應器較佳地為裝備有磁力攪拌器、雙角噴嘴之兩公升圓底燒瓶，其中一個噴嘴來自Drexel燒瓶以供用惰性氣體（例如氬氣）吹掃且一個來自具有反壓之滴液漏斗以供添加試劑。
接著，將1'400 ml非質子性溶劑（例如DMF）倒入反應器中並在室溫下，使聚葡萄胺糖膨脹約1小時。
在提供未乾燥之聚葡萄胺糖的情況下，將1'500 ml非質子性溶劑（例如DMF）倒入反應器中，並在室溫下，使聚葡萄胺糖膨脹1小時，接著在真空中蒸餾出300 ml非質子性溶劑（例如DMF）且接著將200 ml DMF添加至反應器中乾燥之聚葡萄胺糖中，並在室溫下，使聚葡萄胺糖膨脹1小時。
接著，在冰浴槽中或用連接至約2-6℃之恆溫器的浴槽將含膨脹之聚葡萄胺糖的反應介質冷卻至約2-6℃。在同一浴槽中，亦冷卻含100 ml乾燥DMF之250 ml反應器（例如圓底燒瓶）。冷卻後，在攪拌並避免局部過熱下，將醯化劑逐滴添加至非質子性溶劑（100 ml DMF）中，同時使溶劑渦旋。醯化試劑於DMF中之溶液可升溫至約室溫。 b) 在無水存在下 ， 用式 (I) 之丙烯酸系化合物使該聚葡萄胺糖之胺基醯化 ：
在劇烈攪拌下，在約15分鐘內將以上製備的丙烯醯基化合物之溶液添加至以上獲得的聚葡萄胺糖之懸浮液中，同時較佳地輕緩地振動反應器（例如手動振動），在振動之同時，停止添加丙烯醯基化合物，因為此允許用濺散溶劑洗掉燒瓶上壁之聚葡萄胺糖團塊。在丙烯醯基化合物溶液添加完成後，用大約10-15 ml的最少量之非質子性溶劑（例如DMF）洗滌滴液漏斗並將此溶液添加至反應介質中。移除冷卻且再繼續攪拌兩小時，同時偶爾振動，使反應介質升溫至室溫。在攪拌之後，將燒瓶置放於超音波浴槽中，保持約15分鐘並對反應混合物進行超音波處理。在超音波暴露的這段期間，反應混合物僅略微加熱，達到不超過30℃。c) 使步驟 b) 之醯化產物在非親核性鹼存在下經歷親核加成反應 （ 氮雜 - 邁克爾加成 ）：
此後，在劇烈攪拌及不時地振動下，在約15分鐘內將相較於步驟b)中使用之丙烯醯基化合物之量過量的非親核性鹼（例如三乙胺、二異丙基乙胺）添加至反應介質（例如經由滴液漏斗添加）中。使混合物在室溫下混合隔夜或約15-18小時。接著，將反應器置放於約55℃溫度之浴槽中並將混合物攪拌約6小時。自浴槽移除反應器並將其置放於預加熱至約55℃之超音波浴槽中，保持約15分鐘，並對反應混合物進行超音波處理。
在超音波處理之後，將反應器轉移至旋轉蒸發器中並在使用揮發性有機非親核性鹼時，蒸餾出非親核性鹼。若使用非揮發性鹼，則將反應器冷卻至室溫或較低溫度並在劇烈攪拌下，添加一當量酸（例如鹽酸）。控制所得反應介質之pH值以確保獲得中性反應介質。d) 獲得本發明之交聯聚葡萄胺糖
在步驟c)中獲得交聯聚葡萄胺糖於非質子性溶劑（例如DMF）中的含鹽雜質之懸浮液。因此，使產物經歷純化步驟，例如藉由針對去離子水透析進行的純化步驟。舉例而言，為此目的，將步驟c)中獲得的反應溶液轉移至透析袋中，用夾具封閉並置放於在磁力攪拌器上的裝有混合去離子水之容器中。透析可以不同方式監測：例如藉由量測洗滌液之電導率監測鹽含量，或藉由在小於260 nm之波長下的UV吸收監測DMF含量。若在將去離子水與透析產物一起培育20分鐘之後，電導率或UV吸收不存在顯著差異，則透析程序視為完成。e) 視情況獲得呈乾燥狀態的本發明之交聯聚葡萄胺糖
可使用在步驟 d) 獲得的潮濕產物，而不將其乾燥。不過，例如出於調配/儲存或運輸起見，其亦可經乾燥。
接著，將步驟d)中獲得的純化產物乾燥。舉例而言，乾燥可如下進行：在冷凍乾燥器中初步冷凍產物；先在磷酸酐或任何適合乾燥劑（諸如分子篩、氫氧化鉀及類似物）存在下，在大氣壓下吸收大部分液體，且接著在真空中，在磷酸酐或任何適合乾燥劑存在下或藉由在旋轉蒸發器上初步蒸發並將水與乙醇反覆共沸蒸餾，且隨後經磷酸酐或任何適合乾燥劑真空乾燥。
一般而言，本發明方法之產率係約90%。損失很可能與乾燥期間複數個奈米粒子之夾帶、以及在自反應容器、透析袋轉移期間之損失相關，因為無菌及無污染之優先級高於產率之優先級。f) 呈乾燥狀態的本發明之交聯聚葡萄胺糖之進一步處理
視情況，步驟 c) 、步驟 d) 或步驟 e) 中獲得的純化之交聯聚葡萄胺糖可經歷皂化。為此目的，在惰性氛圍（例如用氬氣吹掃）下，將步驟d)中獲得的交聯聚葡萄胺糖置放於反應器中。將1'200 ml去離子水倒入燒瓶中並在劇烈攪拌下，經約15分鐘添加相對於約100 ml去離子水中使用之丙烯醯基化合物之量20%莫耳過量的鹼溶液（例如NaOH水溶液）。可取的是，輕緩地手動振動燒瓶，同時停止添加鹼，因為此程序允許經接觸到反應器上壁之濺散溶劑洗掉聚葡萄胺糖團塊。攪拌之後，將反應器置放於超音波浴槽中並對反應混合物進行超音波處理；在反應物達到約55℃之後，在此溫度下，再繼續進行超音波處理2小時。此後，所得產物可用一當量酸中和、經透析或在不中和情況下乾燥，並在乾燥之後再經歷至少一個循環的步驟 b) 至 c) （或 d)/e) 。使用多於一個循環的步驟 b) 至 c) （或 d)/e) 允許增加交聯聚葡萄胺糖經羧基官能基之飽和。實例 2 ： 合成本發明之交聯聚葡萄胺糖的實例
已根據其中描述之方法，同時改變交聯劑之性質及比例，合成各種本發明之交聯聚葡萄胺糖（CHI）。實例呈現於下表1中。
在每種情況下，使用450 g聚葡萄胺糖作為起始物質。實例2a-2r及C1，丙烯醯基化合物係丙烯醯氯（CAS登記號：814-68-6）。實例2t-2al，丙烯醯基化合物係甲基丙烯醯氯（CAS登記號：920-46-7）。反應係如本發明方法之步驟a)至c)中所描述進行。實例2am-2as，丙烯醯基化合物係不同的丙烯醯氯。 [表1]
CHI 聚葡萄胺糖 丙烯醯基化合物 交聯/ 聚葡萄胺糖- 鍵聯之 理論數目或交聯百分比
2a MW: 11.5 kDa DD: 62% 4.250 g（相對於聚葡萄胺糖20%過量） 1
2b MW: 10.7 kDa DD: 91% 4.570 g（相對於聚葡萄胺糖20%過量） 1
2c 與2a相同 11.278 g 9.8%的最初存在於聚葡萄胺糖巨分子中之醯胺/胺基（4.9%在步驟b)產生及4.9%在步驟c)產生）
2d 與2b相同 12.112 g 同2c
2e 與2a相同 71.35 g 全部胺基
2f 與2b相同 112.47 g 同2e
2g MW: 53.0 kDa DD: 70% 0.922 g（相對於聚葡萄胺糖20%過量） 1
2h MW: 50.3 kDa DD: 91% 0.972 g（相對於聚葡萄胺糖20%過量） 1
2i 與2g相同 3.754 g 3.2%的最初存在於聚葡萄胺糖巨分子中之醯胺/胺基（1.6%在步驟b)產生及1.6%在步驟c)產生）
2j 與2h相同 3.953 g 同2i
2k 與2g相同 82.12 g 同2e
2l 與2h相同 112.40 g 同2e
2m MW: 543.4 kDa DD: 60% 90 mg（相對於聚葡萄胺糖20%過量） 1
2n MW: 501 kDa DD: 93% 98 mg（相對於聚葡萄胺糖20%過量） 1
2o 與2m相同 4.60 g 4.0%的最初存在於聚葡萄胺糖巨分子中之醯胺/胺基（2.0%在步驟b)產生及2.0%在步驟c)產生）
2p 與2n相同 5.00 g 同2o
2q 與2m相同 68.72 g 同2e
2r 與2n相同 115.53 g 同2e
C1 葡萄胺糖 MW:179.17 g/mol DD: 100%   113.66 g 同2e
2t 與2a相同 4.908 g（相對於聚葡萄胺糖20%過量） 1
2u 與2b相同 5.275 g（相對於聚葡萄胺糖20%過量） 1
2v 與2a相同 13.025 g 同2c
2w 與2b相同   13.988 g 同2c
2x 與2a相同 82.40 g 同2e
2y 與2b相同 129.89 g 同2e
2z 與2g相同 1.065 g（相對於聚葡萄胺糖20%過量） 1
2aa 與2h相同 1.122 g（相對於聚葡萄胺糖20%過量） 1
2ab 與2g相同 4.335 g 同2i
2ac 與2h相同 4.565 g 同2i
2ae 與2g相同 94.84 g 同2e
2af 與2h相同 129.81 g 同2e
2ag 與2m相同 104 mg（相對於聚葡萄胺糖20%過量） 1
2ah 與2n相同 113 mg（相對於聚葡萄胺糖20%過量） 1
2ai 與2m相同 4.233 g 同2i
2aj 與2n相同 4.591 g 同2i
2ak 與2m相同 79.37 g 同2e
2al 與2n相同 133.42 g 同2e
2am 與2n相同 α,β-二甲基丙烯醯氯（CAS [49651-33-4], M.W. 118.56 g/mol, 5.207 g 同2i
2an 與2n相同 2-亞甲基十二烷酸氯化物（CAS [52756-21-5], M.W. 230.77 g/mol, 10.135 g 同2i
2ao 與2n相同 (Z)-尿刊酸氯化物（CAS [91788-89-5], M.W. 138.13 g/mol, 6.066 g 同2i
2ap 與2n相同 (Z)-2-氯-2-丁烯醯氯（CAS [56030-36-5], M.W. 138.98 g/mol, 6.104 g 同2i
2aq 與2n相同 黏康酸氯化物（CAS [58823-55-5], M.W. 179.00 g/mol, 3.931 g 同2i
2ar 與2n相同 (Z)-2-甲基庚-2-烯-6-炔醯氯（CAS [313217-54-8], M.W. 156.61 g/mol, 6.878 g 同2i
2as 與2n相同 順丁烯二酸酐（CAS [108-31-6], M.W. 98.06 g/mol, 4.307 g 同2i
2at 與2h相同 與2j相同 在步驟b)及步驟c)之起始溫度係-70℃且反應在-20℃下進行10天時間。
2au 與2h相同 1/1000份與2j相同，4 mg 反應係如一般方法之步驟b)及步驟c)所描述進行，但質量減小1000倍且在密封的5 ml反應器中進行。在步驟b)及步驟c)之起始溫度係-70℃且反應在+150℃下進行30分鐘時間。
2av 在 2f 中獲得   反應係如步驟f)所描述進行。在此等條件下，用丙酸改質的胺基的最終量對應於最初存在於聚葡萄胺糖巨分子中之胺基的一半。
2ax 在 2k 中獲得   同 2av
2ay 在2r中獲得   同 2av
2az 在 2av 中獲得 56.24 g丙烯醯氯 反應係如步驟b)、步驟c)、步驟f)所描述進行。在此等條件下，75%的最初存在於聚葡萄胺糖巨分子中之胺基經歷丙酸改質。
2ba 在2ax中獲得 41.05 g丙烯醯氯 同2az
2bb 在2ay中獲得 57.77 g丙烯醯氯 同2az
2bc 在2r中獲得   反應係如步驟f)所描述進行，但皂化在0℃開始並在此溫度下繼續10天，鹼量與所用丙烯醯氯等莫耳量。在此等條件下，用丙酸改質的胺基的最終量對應於最初存在於聚葡萄胺糖巨分子中之胺基的一半。
2bd 在2r中獲得   反應係如步驟f)所描述進行，但皂化在0℃開始並在140℃及壓力下繼續30分鐘，鹼量與所用丙烯醯氯等莫耳量。在此等條件下，用丙酸改質的胺基的最終量對應於最初存在於聚葡萄胺糖巨分子中之胺基的一半。
2be 在2r中獲得   反應係如步驟f)所描述進行，但皂化在0℃開始並在0℃下繼續10天，鹼量相對於丙烯醯氯為10當量。在此等條件下，用丙酸改質的胺基的最終量對應於最初存在於聚葡萄胺糖巨分子中之胺基的一半。
2bf 在2r中獲得   反應係如步驟f)所描述進行，但皂化在0℃開始並在140℃及壓力下繼續30分鐘，鹼量相對於所用丙烯醯氯為10當量。在此等條件下，用丙酸改質的胺基的最終量對應於最初存在於聚葡萄胺糖巨分子中之胺基的一半且乙醯基發生一定皂化。
2bg 與2a相同 143 g丙烯醯氯 反應係如步驟b)所描述進行。在此等條件下，最初存在於聚葡萄胺糖巨分子中之全部胺基經歷用丙烯酸進行之改質，形成含有雙鍵之丙烯醯基醯胺。
2bh 2000 kDa， DD 10% 3.278 g丙烯醯氯以及LiCl於作為溶劑之N,N-二甲基乙醯胺中的10%溶液 反應係如步驟b)及步驟c)所描述進行。同2i。
實例 3 ： 本發明之聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子的表徵
將如上文所描述製備的3.2%交聯501 kDa聚葡萄胺糖（實例 2i ）之樣品吸附於塗佈方華膜/碳（formvar/carbon）之銅網上，保持30秒，並用醋酸鈾染色5秒。接著，使用Jem1400穿透式電子顯微鏡（Jeol）及Veleta照相機（SIS, Germany）獲得染色材料之顯微照片（圖1A），該顯微照片顯示大部分製劑由具有15 nm近似直徑之球形粒子組成，該直徑的大小類似於小型哺乳動物病毒的大小。亦可觀察到一些較大粒子，其直徑在60-80 nm範圍內，對應於中等大小病毒粒子之直徑。
另外，藉由將2%聚葡萄胺糖於1%琥珀酸水溶液中之溶液倒入皮氏培養皿（Petri dish）中，由此形成1 mm層，接著在室溫下，在真空中經磷酸酐將其乾燥至恆重來獲得標準線性聚葡萄胺糖（MW: 501 kDa, 93%DD）（Bioavanta）及由相同的聚葡萄胺糖製造的根據本發明之交聯聚葡萄胺糖（實例 2i ）的乾燥膜，且接著用«Solver Bio»原子力顯微鏡（NT-MDT, Zelenograd, Russia）以半接觸模式分析該等膜。標準聚葡萄胺糖樣品（MW: 501 kDa, 93% DD）之100 μm×100 μm膜表面區域的三維圖像顯示其表面光滑，且與線性聚葡萄胺糖聚合物很可能為共線佈置（圖 1B1 ），而相應實例 2i 之交聯聚葡萄胺糖樣品的表面區域係凹凸不平的，存在「峰」及「谷」，此係由球形結構聚結形成（圖 1B2 ）。圖 1B3 及B4 藉由原子力顯微鏡檢查術觀測膜，其包含吸收有1% w/w根據本發明之交聯聚葡萄胺糖於水中之溶液的細菌奈米纖維素。AFM量測係在Solver Next掃描探針顯微鏡（NT-MDT, Russia）上，在標準室內條件下於空氣（T=26℃，RH=15%）中以半接觸模式執行。使用具有約0.4 N/m懸臂樑硬度以及約70 kHz諧振頻率及2 nm標稱曲率半徑（AFM探針之銳度）的ScanAsyst-AIR AFM探針（Bruker, USA）獲得最佳壓力（SetPoint）。所有量測係以0.5 Hz掃描速度及512×512個點之解析度執行。後續處理係以ImageAnalysis 3.5程式，藉由減去傾斜平面並移除量測缺陷（「黏著」）執行。所獲得的圖 1 B3 及B4 之分析揭示，球形結構均勻地分佈於樣品表面上（圖 1 B3 及B4 ），具有20 nm之小球體平均直徑，該直徑對應於小型病毒，諸如杯狀病毒科（Caliciviridae ）、小RNA病毒科（Picornaviridae ）、細小病毒科（Parvoviridae ）之大小。AFM中所觀察到的結構之存在係藉由先前穿透式電子顯微鏡檢查術之數據確認（圖 1A ）。
在惰性氛圍（例如氬氣）下，藉由回流酸水解方法進一步研究標準聚葡萄胺糖（陰性對照）與本發明之交聯聚葡萄胺糖（實例 2i ）及交聯葡萄胺糖（比較實例C1）（陽性對照）之間的結構差異，該回流酸水解方法能夠準確地分析低分子量物質以鑑別僅在成功交聯情況下形成之標記物質如下：
在劇烈攪拌下，將樣品（各100 mg）添加到冷卻至-20℃的1 ml乙醯氯於5 ml二氯甲烷中之溶液中。接著，將混合物加熱至0℃並在劇烈攪拌下保持30分鐘。添加二異丙基乙胺（1 ml）並使混合物升溫至室溫，並在劇烈攪拌下再維持30分鐘。隨後，中和所得鹽酸鹽將允許用水洗滌所有干擾分析之物質，而且非親核性強鹼之存在允許儘可能完全地進行乙醯化。小心地在真空中蒸發所有溶劑並用1 ml水樣品洗滌殘餘物三次。將洗滌水丟棄，並將10 ml之28%鹽酸添加至固體沈澱物中並回流2小時。小心地在真空下蒸發反應混合物並將殘餘物（大約100 mg）再懸浮於100 ml之2%乙酸水溶液中。此時，樣品備好。接著，在本發明條件下，聚合物完全水解成葡萄胺糖及葡萄胺糖衍生物。因此，由於在天然幾丁質及聚葡萄胺糖中未發現式 (II) 之物質 ，其僅可藉由與剩餘丙烯酸發生氮雜-邁克爾反應而獲得，且因此此物質之偵測可用於鑑別由根據本發明之方法製備的交聯聚葡萄胺糖。
若使用任何式(I)之丙烯醯氯（例如用於根據本發明之交聯步驟的任何丙烯酸之酸氯化物）作為交聯試劑（例如，對於2i 實例 ），則在初步樣品製備（例如乙醯化、洗滌）之後，所得聚合物之回流酸水解不僅使葡萄胺糖單元之間之糖苷鍵水解，而且亦使乙醯基葡萄胺糖及用交聯劑在醯化期間（例如經活化以醯化經取代或未經取代之丙烯酸衍生物）產生者之醯胺鍵水解，由此將形成下式(IIIa)的葡萄胺糖與丙酸之衍生物：
Figure 02_image117
[化學式(IIIa)] 其中R2 至R4 係如本申請案中所定義，特定言之，若使用未經取代的醯化活化之丙烯酸，則為下式(II)的葡萄胺糖與丙酸之衍生物：
Figure 02_image115
[化學式(II)]
此物質係水解穩定的且當最初發生交聯時，必須存在於混合物中。若使用其他交聯試劑，則形成類似衍生物(IIIa)。在進行高度交聯之情況下，式(IIIb )之衍生物的偵測可用於鑑別由根據本發明之方法製備的交聯聚葡萄胺糖
Figure 02_image113
[化學式(IIIb)] 其中R2 至R4 如本文所定義，R2' 至R4' 分別如本文中關於R2 至R4 所定義，其中R2' 至R4' 可分別與各相應R2 至R4 相同，或在本發明方法中之後續步驟b)至c)工序中使用的式(I)之丙烯酸系化合物不同於第一工序中使用之化合物時不同。
為證實由本發明之方法產生的產物中交聯之存在，在質譜分析（Bruker Daltonics TOF 180 mkl/h, tune_low.m, ES pos.掃描, N2-4l/min, 190℃, Nb.=0.4, 譜圖時間1秒）中直接使用如上文所描述製備之樣品溶液，無需預先進行層析。在比較性標準聚葡萄胺糖（圖 4 A2 ）及本發明之交聯聚葡萄胺糖（圖 4 B2 ）的所關注離子區（較低m/z比率）之質譜中，觀察到葡萄胺糖特異性峰（m/z=180.073），由此反映胺基葡萄糖之完整殘基的存在。然而，對於本發明之交聯聚葡萄胺糖，呈現具有m/z =252.077之新峰（圖 4B2 ），對應於由胺基葡萄糖經丙酸烷基化而產生的式(II)之產物。在此實例中，峰強度較低，反映樣品之交聯百分比較低（如藉由反應條件2i所測定，3.2%交聯）。此係證實根據本發明之方法實現成功聚葡萄胺糖交聯的特徵峰。其存在於由在如上表1中所描述之各種適當條件下進行本發明之方法得到的所有樣品（包括比較性葡萄胺糖陽性對照）中且不存在於所測試的所有聚葡萄胺糖及幾丁質中。
為了確定m/z=180及m/z =252峰係歸於葡萄胺糖及化合物(II)，在不同衝擊能（AB SCIEX Triple Quad™ 3500)（5V及15V）下進行碰撞研究。在此情況下，將經預處理之乾燥殘餘物（水解之後，在真空下蒸發反應混合物）溶解於含有10%甲醇及0.1%甲酸之水溶液中。當m/z=180化合物在較高衝擊能（Sciex儀器）下斷裂時，觀察到具有水損失（-18 m/z、-2*18 m/z、-3*18 m/z）的頻譜圖（圖 5A 及 5B ）。隨著碰撞能量之增加，水損失之峰的強度亦增加。此現象係碳水化合物之特徵。關於離子，即m/z=252化合物觀察到類似圖像（圖 5B 及 5C ）。然而，作為碳水化合物之衍生物，在相同碰撞能量下，其可對於水損失更穩定。因此，所觀察到的表示水損失之峰的相對強度較低。
在將500 μl濃度為10 mg/ml之卵溶菌酶於乙酸鈉緩衝液（pH 5.5）中之溶液添加至5 mg本發明之交聯聚葡萄胺糖中之後，藉由質譜法監測如上文所描述製備的本發明之3.2%交聯501 kDa聚葡萄胺糖（實例 2i ）之穩定性。在振動器上，在37℃下培育混合物7天，直至不再觀察到質譜之進一步變化。在該階段，質譜揭示高分子量化合物之特徵性「梳狀」圖形：在955-958、1023-1024、1101-1104、1193-1196 m/z比率處強度有規律地增加的規律散佈之峰。該等峰對應於電荷單元不同的該等相同片段。對於給定質量，離子電荷係+15、+14、+13及+12。主要片段之質量係14'305 Da。關於培育較長時間段，即至多3週之樣品獲得類似結果。由此展示引起卵白溶菌酶中及溫血動物組織中聚葡萄胺糖及其衍生物水解之水解酶僅能夠將交聯聚葡萄胺糖水解成約14 kDa質量之相當大的片段。因此，此表明，使用較高分子量的去乙醯化聚葡萄胺糖製備複數個奈米粒子，其將對酶水解具有更高穩定性。
因此，該等資料證實形成複數個奈米粒子的本發明之交聯聚葡萄胺糖與用作起始物質之標準聚葡萄胺糖之間有明顯結構差異。另外，基於式(II)之物質或相關物質之偵測的方法在偵測由本發明之方法獲得的複數個奈米粒子中具有高靈敏度及高特異性。實例 4 ： 本發明之聚葡萄胺糖之 複數個 奈米粒子的細胞內化
藉由螢光顯微鏡檢查術，使用異硫氰酸螢光素（FITC）及5-（及6-）羧基螢光素（FAM）標記之聚葡萄胺糖，如下測試擬經細胞內化的本發明之聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子穿透鼠類角膜內部的能力。
使用分子量為501 kDa且去乙醯化程度為93%之初始標準聚葡萄胺糖或3.2%根據本發明之交聯聚葡萄胺糖（實例2p）製備螢光素標記之交聯聚葡萄胺糖。將在冰浴槽中預冷卻之DMF（1 ml）添加至在埃彭道夫管（Eppendorf tube）中之兩種聚葡萄胺糖（100 mg）中，並使懸浮液膨脹1小時。接著，將2.85 mg螢光素-5-異硫氰酸鹽（FITC）或5-（及6-）羧基螢光素琥珀醯亞胺酯（NHS-螢光素）於250 μL DMF中之溶液添加於填充有冰水之超音波浴槽中並進行超音波處理。在前二十分鐘，將浴槽中之溫度維持在0℃，且接著將浴槽加熱至40℃並在此溫度下反應100分鐘。將各管內含物轉移至12-14 kDa透析管中並針對水透析。在針對100 ml水進行20次透析程序之後，將50 mg琥珀酸添加至各透析管中，將聚葡萄胺糖溶解並重複透析程序。將所得溶液凍乾且隨後再懸浮，得到0.25%溶液。
將鼠類白血球與此等溶液一起在37℃下培育4小時，用DNA特異性染料（Hoechst 33258）染色並藉由螢光顯微鏡檢查術分析。螢光分析（圖 2 ）顯示，綠色螢光(C)均勻遍佈整個細胞質，指示FITC標記之交聯聚葡萄胺糖在細胞內部且因此已經內吞（經標記之聚葡萄胺糖與細胞膜之簡單締合將在細胞之邊界(A)處產生螢光環）。在核外部(D)觀察到的藍色螢光可能由細胞凋亡起始引起。
將相同的異硫氰酸螢光素（FITC）及5(6)-羧基螢光素（FAM）標記之交聯聚葡萄胺糖溶液（0.25%）施加至CBA小鼠之眼睛（每隻眼一滴）。6小時後，將實驗動物處死，並將其眼睛固定於福馬林（formalin）中，如Stradleigh 等人,2015, Prog Retin Eye Res ., 48:181-202 中所描述染色並藉由螢光顯微鏡檢查術分析。據觀察，標準聚葡萄胺糖優先集中於角膜及鞏膜之表面上（圖 3A ），而本發明之聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子（=明亮的綠色螢光）均勻地穿透至角膜深部（圖 3B ）。
該等資料證實，本發明之交聯聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子可用於增加弱細胞穿透性（親水性）或無細胞穿透性（大分子）之活性成分經由複數個奈米粒子介導之內吞作用到達細胞內位置及/或經由複數個奈米粒子介導之胞吞轉送作用而可能跨細胞的細胞穿透能力。實例 5 ： 本發明之聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子的生物相容性
在人骨髓間葉幹細胞（MSCs）之活體外培養物中評估本發明之交聯聚葡萄胺糖（實例 2i ）之生物相容性以便評估其對MSCs之培養及生長的可能影響，該等MSCs係如Bieback 等人,2008, Transfus Med Hemother., 35(4):286-294, doi:10.1159/000141567 中所描述，經由骨髓抽吸自健康供體收集。
如前述Bieback 等人,2008 中所描述，經由1,077g/ml密度梯度離心分離出MSCs，隨後洗滌2次並使其在含有10% Mesecult胎血清、l-麩醯胺酸及抗生素之DMEM生長培養基中生長。使用流式細胞測量術驗證培養物之純度。培養之MSCs展示以下表現型：CD44+/CD73+/CD90+/CD105+/CD34/HLA-DR-，並在添加特定培養基後展示成軟骨、成骨及成脂分化的能力，如Ciuffreda 等人,2016, Methods Mol Biol. 2016; 1416:149-58. doi: 10.1007/978-1-4939-3584-0_8 中所描述。該研究採用4代之細胞。
用交聯聚葡萄胺糖形成之膜覆蓋25 cm2 培養皿各壁，乾燥培養皿，用生長培養基洗滌兩次並接種細胞。以類似方式接種未處理的相同大小之培養皿進行比較。培養皿之塑膠壁上交聯聚葡萄胺糖之存在不干擾細胞附著及細胞生長。在接種之後3-4小時內，細胞擴散並呈現其特有的紡錘狀形狀。在交聯聚葡萄胺糖處理之培養皿中生長速率略微較慢。標準培養皿中在48-56小時之後及交聯聚葡萄胺糖處理之培養皿中在68-76小時之後達到匯合。
總之，本發明之交聯聚葡萄胺糖維持人骨髓間葉幹細胞之生長及增殖，儘管其效率低於在標準條件下之情形。實例 6 ： 本發明之聚葡萄胺糖用於農業應用之用途
如下測試本發明之交聯聚葡萄胺糖（實例 2i ）對於春小麥種子之有效性。製備兩種不同濃度的本發明之交聯聚葡萄胺糖於水中之懸浮液，將種子浸入該等懸浮液中並取決於所應用之處理，各實驗包括以下種子組：(A) 對照組（種子未處理）；(B) 用0,1%（w/w）交聯聚葡萄胺糖處理，(C) 用0,05%（w/w）交聯聚葡萄胺糖處理。 在器官形成之初始階段生長促進作用之評估
在24小時處理之後，在自然光、t=+20-22℃下，將種子放置於皮氏培養皿（每個培養皿12顆種子，一式四份）中之潮濕基質（帶有棉層之過濾器）上。如Domin 等人,2020, Sustainability2020, 12(1), 46 中所描述，測定發芽能量，並在接觸潮濕基質之後1天及3天後量測，且在接觸潮濕基質之後7天後測定發芽力（發芽種子之數目除以測試種子總數減去未發芽種子數）。在與潮濕基質接觸之後3天後（各幼苗之根的長度、幼苗之總長度）及7天後（每個幼苗之根的數目、幼苗之長度、每個幼苗之根及嫩芽的總質量及各根之質量）記錄器官形成之初始階段的生長指標。
如圖 6 中所示關於發芽及下表 2 中所概述關於在器官形成之初始階段幼苗發育，用本發明之交聯聚葡萄胺糖處理在最低濃度下展示積極作用。 [表2]
生長持續時間 生長指標 A B C
3天 每個幼苗之根的數目 2,9 3,0 3,0
每個幼苗之根長度，cm 7,79±0,27 8,64±0,46 10,20±0,94
個別根之長度，cm 2,60±0,12 2,86±0,08 3,4±0,11
嫩芽之長度，cm 1,84±0,09 2,29±0,03 2,69±0,30
7天 每個幼苗之根的數目 4,41 4,68 4,83
嫩芽之長度，cm 10,05±0,75 10,11±0,69 11,27±0,26
每個幼苗之根的空氣乾燥之生物量，mg 8,20±0,07 9,60±0,56 9,40±0,20
1個根的空氣乾燥之生物量，mg 1,86±0,02 2,06±0,15 1,95±0,08
1個幼苗的空氣乾燥之生物量，mg 15,13±0,13 17,25±0,19 16,45±0,41
在交聯聚葡萄胺糖處理之一天內觀察到較高的幼根出現速率。用低濃度懸浮液觀察到最強作用（用0,05%交聯聚葡萄胺糖有22,9%增加；用0,1%交聯聚葡萄胺糖有14,6%增加；及75%基線對照）。當量測發芽能量（6.2%增加）及發芽力時，觀察到相同趨向（對照組=93,8%）。用高濃度交聯聚葡萄胺糖懸浮液處理種子使發芽力增加4,1%。在器官形成之早期階段，交聯聚葡萄胺糖使根生長增加。3天後，根之總長度對於0,1%交聯聚葡萄胺糖及0,05%交聯聚葡萄胺糖組分別增高10,9%及30,9%（對照組=7,79 cm）。同時，在高濃度交聯聚葡萄胺糖組中觀察到最均勻的增加（0,1%交聯聚葡萄胺糖之均勻係數=81%（n=45）；0,05%交聯聚葡萄胺糖=78,2%（n=48）；對照組=68,9%（n=45））。當量測幼苗之高度時，觀察到相同趨向。若0,05%交聯聚葡萄胺糖處理後的增加（較之對照組=1,84 cm，增高46,2%）明顯高於0,1%交聯聚葡萄胺糖處理後的增加（較之對照組，增高24,4%），則高濃度交聯聚葡萄胺糖處理組之均勻係數較高（0,1%交聯聚葡萄胺糖=75,4%；0,05%交聯聚葡萄胺糖=72,8%；對照組=61,7%）。
基於在實驗開始之後7天得到的量測值，低濃度交聯聚葡萄胺糖處理增強根形成之能力最強（0,05%交聯聚葡萄胺糖：9,5%增加；0,1%交聯聚葡萄胺糖：6.1%增加，對照組中根之平均數目：每個幼苗4.41個）。關於總體幼苗長度之增加亦有相同發現（0,05%交聯聚葡萄胺糖：7,7%增加；對照組：10,05 cm）。相比之下，在用較高濃度交聯聚葡萄胺糖懸浮液處理後，對於根（0,1%交聯聚葡萄胺糖：17.1%增加；0,05%交聯聚葡萄胺糖：14.6%增加）及對於整個幼苗（0,1%交聯聚葡萄胺糖：12.9%增加；0,05%交聯聚葡萄胺糖：8.7%增加）觀察到生物量之最高增加。 對春小麥幼苗在土壤基質中之生長及發育之影響的評估
在播種之前7天，處理種子（鹼性黑鈣土（alkaline chernozem），500 g/塑膠罐/12罐，重複4次，天然照明，t =20-22℃，受控土壤濕度）。量測發芽能量、發芽力、幼苗之高度及生物量。記錄下前7天期間之生長參數。對於用交聯聚葡萄胺糖，尤其是較高濃度交聯聚葡萄胺糖處理之種子，在24小時之後觀察到較高的幼根出現速率（對照組：70.8%，經處理種子之相對增加：27.1%及23%）。如下表 3 及圖 6 所示，在高濃度交聯聚葡萄胺糖處理之後，獲得100%發芽。 [表3]
指標 實驗組
A B C
發芽能量，% 1天後 幼根出現 70,8 97,9 93,8
2天後 正常發芽之幼苗% 95,9 93,8 100
3天後 97,9 100 83,4
發芽，% 7天後 93,8 100 83,4
正常發育之嫩芽的長度cm 2天後 0,71±0,05 1,11±0,05 0,85±0,03
3天後 2,87±0,13 3,40±0,13 2,92±0,06
7天後 18,95±0,30 20,48±0,24 19,31±0,28
空氣乾燥的生物量，mg 總幼苗 16,65±0,32 18,95±0,41 20,90±0,37
每個幼苗之根 6,93±0,14 8,53±0,23 9,33±0,22
由0.1%交聯聚葡萄胺糖處理引起之生長刺激的較高初始速率（2天後56.3%）在3天後降低3倍（0,05%交聯聚葡萄胺糖，減少11.6倍）及在7天之後降低2.3倍。7天後之生物量相較於對照組（16.63 mg）之增加在0.1%處理組（總生物量增高14%及根增高23.8%）及0.05%處理組（總生物量增高25.7%及根增高35.1%）中較高。0.05%交聯聚葡萄胺糖處理使總生物量增加1.8倍且使根生物量增加1.5倍。
總而言之，該等資料證實，用本發明之交聯聚葡萄胺糖處理在春小麥發芽中引起顯著的生長刺激作用。
[圖1]顯示本發明之交聯聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子（實例2i）之表徵。A：如實例3中所描述的經染色之聚葡萄胺糖（3.2%交聯501 kDa聚葡萄胺糖）之顯微照片；B ：比較性線性聚葡萄胺糖(B1)及相應本發明之交聯聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子(B2)、在高放大倍率（B3）及低放大倍率（B4）下的本發明之交聯聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子之乾燥膜的原子力顯微鏡檢查術。 [圖2]顯示如實例4中所描述，藉由螢光顯微鏡檢查術量測的鼠類白血球中本發明之交聯聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子（實例2i）之內化情況。A ：白血球邊界；B ：核DNA（Hoechst 33258，強烈的藍色螢光）；C ：內吞的FITC標記之交聯聚葡萄胺糖（綠色螢光）；D ：混合藍色/綠色螢光（藍色：細胞質中之背景非特異性及/或非核DNA；綠色：內吞的FITC標記之交聯聚葡萄胺糖）。 [圖3]顯示如實例4中所描述，藉由FITC-FAM螢光測定的鼠類角膜中本發明之交聯聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子（實例2i）(B )的內化情況與保持在角膜表面上之標準聚葡萄胺糖(A )的比較。A：角膜；B：聚葡萄胺糖（明亮的綠色螢光）。 [圖4]表示如實例3中所描述，比較性非交聯標準聚葡萄胺糖（A1：正離子之總離子電流）及（A2：所關注之離子區（較低m/z比率））；以及本發明之交聯聚葡萄胺糖（B1：正離子之總離子電流及B2（所關注之離子區（較低m/z比率））的質譜分析。 [圖5]表示如實例3中所描述，由m/z=180之化合物在5V (A)及15 V(B)之衝擊能下以及m/z =252之化合物在5V (C)及15 V(D)之衝擊能下進行之碰撞研究及由卵溶菌酶水解(E)得到的譜圖。 [圖6]表示相較於對照組，如實例6中所描述用本發明之交聯聚葡萄胺糖（0.1% w/w或0.05% w/w於水中）處理對於發芽室中春小麥種子之發芽過程(A) （幼根出現係在1天後量測，發芽能量係在3天後量測；以及發芽力係在7天後量測）及對於在土壤基質中春小麥幼苗地上部分生長增加（相對於對照組之增加百分比）(B) （在播種前7天處理種子）的影響。

Claims (24)

  1. 一種用於製備一交聯聚葡萄胺糖之方法，其包含以下步驟：a) 提供一聚葡萄胺糖並使該聚葡萄胺糖在溶劑中膨脹；b) 用式(I)之一丙烯酸系化合物使該聚葡萄胺糖之胺基醯化： [化學式(I)]
    Figure 03_image019
    其中R1 係鹵素或在移除時確保胺基醯化之任何其他離去基團，諸如3-羥基苯并***酯、酐（包括混合酐）、N-羥基琥珀醯亞胺、五氯苯酚、2-硝基-4-磺基苯酚酯及其他類似離去基團；R2 、R3 及R4 獨立地選自H、視情況經取代之烷基（例如C1 -C6 烷基）、視情況經取代之烯基（例如C2 -C6 烯基）、視情況經取代之炔基（例如C3 -C6 炔基）、視情況經取代之環烷基（例如C3 -C8 環烷基）、視情況經取代之環烯基（例如C4 -C8 環烯基）、視情況經取代之環炔基（例如C5 -C8 環炔基）、視情況經取代之雜環烷基；視情況經取代之芳基（例如視情況經取代之苯基）、視情況經取代之雜芳基及視情況經取代之芳基C1 -C6 烷基，特別是苯甲基；其中術語「經取代」係指基團經1至5個取代基取代，該1至5個取代基選自由以下組成之群：鹵素、-COOR'、-NR'R''、=O、-OR'、-COR'、-CONR'R''、-SR'、-SO3 R'、-SO2 NR'R''、-SOR'、-SO2 R'、-NO2 或-CN；或R1 與R2 或R1 與R3 、或R1 與R4 一起形成4-24員芳基、雜芳基、環烷基或雜環烷基（例如6-24員芳基、雜芳基、環烷基或雜環烷基，諸如8-24員芳基、雜芳基、環烷基或雜環烷基）；c) 使步驟 b) 之醯化產物在鹼存在下反應（氮雜-邁克爾反應（Aza-Michael reaction））；d) 純化自步驟 c) 獲得的交聯聚葡萄胺糖（例如自鹽雜質及/或非質子性溶劑純化）。
  2. 一種如請求項1之方法，其中該方法進一步包含來自步驟 d) 之產物的乾燥步驟 e) 。
  3. 一種如請求項1之方法，其中步驟a)所提供之該聚葡萄胺糖具有一在約5至約2'000 kDa範圍內，特別是在約150至2'000 kDa範圍內之平均分子量。
  4. 一種如請求項1至3中任一項之方法，其中R係鹵素，特別是氯。
  5. 一種如請求項1至4中任一項之方法，其中該丙烯酸系化合物係選自丙烯醯氯及甲基丙烯醯氯。
  6. 一種如請求項1至5中任一項之方法，其中該方法進一步在步驟 c) 或 d) 之後包含在鹼性條件下進行之皂化步驟 f) 且所得產物可進一步經歷步驟 b) 至 c) （或 d) ）中之至少一個工序。
  7. 一種可藉由如請求項1至6中任一項之方法獲得的交聯聚葡萄胺糖或其任何醫藥學上可接受之鹽。
  8. 一種以包含具有m/z=252.077±0.01電噴霧正離子之峰的質譜圖為特徵的交聯聚葡萄胺糖，或其任何醫藥學上可接受之鹽。
  9. 一種組成物，其包含至少一種如請求項7至8中任一項之交聯聚葡萄胺糖及至少一種載劑。
  10. 一種如請求項9之組成物，其中該組成物係醫藥組成物且該載劑係醫藥學上可接受之載劑。
  11. 一種如請求項9之組成物，其中該組成物係一細胞或組織培養基，該培養基進一步包含細胞或組織養分。
  12. 一種如請求項9之組成物，其中該組成物係一重建組織。
  13. 一種如請求項9之組成物，其中該組成物係一農業用組成物。
  14. 一種如請求項9之組成物，其中該組成物係一化妝品組成物且該載劑係一化妝品可接受之載劑。
  15. 一軟組織填充劑、一創傷敷料或一重建組織，其包含至少一種如請求項7或8中任一項之交聯聚葡萄胺糖或其組成物。
  16. 複數個奈米粒子，其包含至少一種根據請求項7至8中任一項之交聯聚葡萄胺糖。
  17. 一種細胞或生物組織培養基，其包含至少一種如請求項7至8中任一項之交聯聚葡萄胺糖。
  18. 一種如請求項7至8中任一項之交聯聚葡萄胺糖之用途，其用於製備一細胞或生物培養基或一重建組織。
  19. 一種如請求項7至8中任一項之交聯聚葡萄胺糖或其組成物，其用於預防及/或治療選自以下之疾病或病症：心血管病況，諸如心律不整，特別是心房微顫及高血壓；關節病變及關節疾病，諸如類風濕性關節炎、骨關節炎、脊椎關節炎以及導致軟骨、骨、韌帶或滑液囊損傷之外傷事件；眼部病變及損傷，諸如乾眼症候群、葡萄膜炎、青光眼、角膜病變；結締組織病症，諸如狼瘡及多發性肌炎；皮膚/黏膜病症或損傷，諸如創傷、瘢痕、牛皮癬、痤瘡、濕疹、玫瑰痤瘡、物理性或化學性燒傷，特別是手術創傷及曬傷、潰瘍、痔瘡；牙周及牙科疾病；硬脊膜損傷，諸如意外損傷或腦及中樞神經系統手術後硬脊膜損傷；惡性及良性贅瘤，特別是癌瘤、肉瘤、淋巴瘤及黑素瘤；術後併發症，諸如瘺及感染；腫瘤或血管畸形。
  20. 一種用於製備一生物活性劑之藥物遞送系統的方法，該方法包含以下步驟： -       提供呈潮濕或乾燥狀態的一如請求項7或8中任一項之交聯聚葡萄胺糖； -       提供待遞送之一生物活性劑； -       將該生物活性劑溶解於一溶劑或一超臨界流體中； -       藉由用一生物活性劑溶液浸漬本發明之該交聯聚葡萄胺糖或藉由經電泳或經電場加速直接引入至複數個奈米粒子中，裝載該交聯聚葡萄胺糖之複數個奈米粒子； -       收集所獲得的裝載有生物活性劑（例如藥物）之組成物或複數個奈米粒子。
  21. 治療或改善一醫學病症之方法，該醫學病症特定言之為心血管病況，諸如心律不整，特別是心房微顫及高血壓；關節病變及關節疾病，諸如類風濕性關節炎、骨關節炎、脊椎關節炎及導致軟骨、骨、韌帶或滑液囊損傷之外傷事件；眼部病變及損傷，諸如乾眼症候群、葡萄膜炎、青光眼、角膜病變；結締組織病症，諸如狼瘡及多發性肌炎；皮膚/黏膜病症或損傷，諸如創傷、瘢痕、牛皮癬、痤瘡、濕疹、玫瑰痤瘡、物理性或化學性燒傷，特別是手術創傷及曬傷、潰瘍、痔瘡；牙周及牙科疾病；硬脊膜損傷，諸如意外損傷或腦及中樞神經系統手術後硬脊膜損傷；惡性及良性贅瘤，特別是癌瘤、肉瘤、淋巴瘤及黑素瘤；術後併發症，諸如瘺及感染；腫瘤或血管畸形，該方法包含向有需要之個體投與有效量的至少一種如請求項7至8中任一項之交聯聚葡萄胺糖或其醫藥調配物。
  22. 一種套組，其包含至少一種如請求項7至8中任一項之交聯聚葡萄胺糖或其組成物，例如呈一凍乾形式。
  23. 一種鑑別可藉由如請求項1至6中任一項之方法獲得的一交聯聚葡萄胺糖之方法，該方法包含以下步驟： -       將待表徵之一聚葡萄胺糖提供於一溶劑中； -       在劇烈攪拌下，使該聚葡萄胺糖醯化； -       用一鹼中和反應介質； -       蒸發該等溶劑並洗滌所獲得的中和產物； -       使該產物經歷一回流酸水解； -       蒸發反應混合物並使水解產物再懸浮於諸如乙酸之弱酸中； -       確定一產物之存在或不存在，該產物選自根據式(IIIa )或根據式(IIIb )之產物
    Figure 03_image111
    Figure 03_image113
    [化學式(IIIa) ]；[化學式(IIIb)]； 其中R2 至R4 如前述請求項中任一項中所定義，R2' 至R4' 分別如前述請求項中任一項中之R2 至R4 所定義且其中此類式(IIIa)及/或(IIIb)之一產物的存在指示藉由一種如請求項1至6中任一項之方法獲得的交聯聚葡萄胺糖。
  24. 一種如請求項23之方法，其中根據式(III)，特別是根據式(II)之一產物的存在或不存在
    Figure 03_image115
    [化學式(II) ] 係藉由質譜電噴霧分析確定。
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