KR20220008894A - 신경제세포 또는 각막 상피 세포의 순화 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 신경제세포 또는 각막 상피 세포를 순화하는 방법을 제공한다.

Description

신경제세포 또는 각막 상피 세포의 순화 방법
본 발명은 신경제세포의 순화(純化) 방법 등에 관한 것이고, 상세하게는, 라미닌 211을 사용한 신경제세포의 순화 방법 등에 관한 것이다. 또한, 다른 양태에 있어서, 본 발명은, 라미닌 332를 사용한 각막 상피 세포의 순화 방법 등에 관한 것이다.
최근, iPS 세포의 확립에 의해 세포 이식을 수반하는 질환의 신규 치료법의 개발이 크게 진전되고 있다. 세포 이식 치료에 적합하게 사용할 수 있는 세포의 하나로서, 광범위한 다분화능을 갖고, 그 때문에 「제4 배엽」이라고도 칭해지는 신경제세포가 주목받고 있다.
신경제세포를 조제하기 위한 방법은 복수 보고되어 있다. 예를 들면, 비특허문헌 1에는, TGF-β 시그널 저해제 및 Wnt 시그널 활성화제 등의 존재 하에서 iPS 세포의 분화를 유도하여, 신경제세포를 포함하는 세포 집단을 조제하고, 셀 소터를 사용하여 상기 세포 집단으로부터 신경제세포만을 회수하고, 이를 확대 배양한다는 방법이 개시되어 있다. 또한, 비특허문헌 2에는, FGF2 및 TGFβ 시그널 저해제 등의 존재 하에서 ES 세포의 분화를 유도하여, 신경제세포를 포함하는 세포 집단을 조제하고, 추가로 상기 세포 집단을 FGF2 및 TGF-β 저해제의 존재 하에서 젤라틴 함유 배지에서 장기간 배양함으로써, 비교적 순도가 높은 신경제세포를 조제할 수 있는 것이 개시되어 있다.
또한, 세포 이식 치료 분야에 있어서는, 각막 상피 세포도 주목을 모으는 세포 중 하나이다. 각막 상피 세포는 각막의 표면을 구성하고, 각막을 외계로부터 지키는 배리어로서의 작용이나 각막에 산소를 집어넣는 작용을 갖는 세포이다. 각막 상피 세포의 장애의 대부분은 시력의 저하로 이어져, 환자의 QOL(삶의 질)을 현저하게 저하시킨다. 따라서, 이러한 장애를 치료하기 위한 이식 가능한 각막 상피 세포를 효율적으로 제조하기 위한 방법의 구축에는 높은 요구가 존재한다.
각막 상피 세포를 조제하는 방법으로서는, 예를 들면, 다능성 줄기세포를 스트로마 세포 또는 양막 유래 인자의 존재 하에서, 일정 기간 동안 BMP를 포함하지 않는 무혈청 배지에서 배양함으로써 각막 상피 세포의 분화 유도 방법이 보고되어 있다(특허문헌 1).
일본 특허공보 제5759536호
Fukuta M. et al., PLoS One. 2014 Dec 2;9(12):e112291. Serrano F. et al., Stem Cells Dev. 2019 Jan 15;28(2):81-100.
비특허문헌 1 및 2에 개시된 방법을 사용하면 신경제세포를 조제할 수 있다. 그러나, 이러한 방법에도 여전히 과제가 존재한다. 예를 들면, 비특허문헌 1에 개시된 방법에서는 셀 소터에 의한 신경제세포의 회수 공정이 필수이지만, 셀 소터의 사용에는, 예를 들면, 분취 타겟 세포의 수율, 순도, 생존율, 기능 저하의 문제나, 셀 소터의 구입이나 유지 보수에 드는 비용 등의 다양한 과제가 있다. 또한, 비특허문헌 2의 방법에 있어서는, 셀 소터의 사용을 수반하지 않지만, 순도가 높은 신경제세포를 얻기 위해서 연속 계대를 필요로 하고, 이의 조제에 비교적 장기간을 필요로 하기 때문에 효율성에 과제가 있다.
또한, 특허문헌 1에 개시된 방법을 사용하면 각막 상피 세포를 조제할 수는 있다. 그러나, 상기 신경제세포의 경우와 마찬가지로, 상기 방법을 사용하여 순도가 높은 각막 상피 세포를 얻기 위해서는, 셀 소터 등을 사용하여 유도한 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 각막 상피 세포를 선별하는 공정을 필요로 하여, 효율성에 과제가 있다.
본 발명자들은, 상기 과제에 대하여 예의 검토한 결과, 신경제세포를 포함하는 세포 집단을, 라미닌 211을 족장(足場)으로 하여 확대 배양함으로써, 셀 소터 등을 사용하여 신경제세포를 소팅하지 않아도, 신경제세포를 순화할 수 있는 것을 발견했다. 또한, 본 발명자들은, 본 방법을 사용하면, 종래의 순화 방법과 비교하여 매우 단기간에 신경제세포를 순화할 수 있는 것도 발견했다. 또한 본 발명자들은, 일정 비율을 초과하는 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단을, 라미닌 332를 족장으로 하여 확대 배양함으로써, 셀 소터 등을 사용하여 각막 상피 세포를 소팅하지 않아도, 각막 상피 세포를 순화할 수 있는 것을 발견하고, 이러한 지견에 기초하여 추가로 연구를 진행함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은 이하와 같다.
[1] 이하의 공정을 포함하는, 신경제세포를 순화하는 방법:
공정 1) 신경제세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 공정 및
공정 2) 공정 1에서 얻어진 세포 집단을, 라미닌 211을 족장으로서 사용하여 확대 배양하는 공정.
[2] 공정 1에서 얻어진 신경제세포를 포함하는 세포 집단이, 신경제세포의 소팅 처리에 제공되지 않고 공정 2에 제공됨을 특징으로 하는, [1]에 기재된 방법.
[3] 공정 2의 배양 기간이, 1 내지 21일간인, [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[4] 신경제세포를 포함하는 세포 집단이 다능성 줄기세포 유래인, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[5] 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, [4]에 기재된 방법.
[6] 이하의 공정을 포함하는, 순화된 신경제세포를 생산하는 방법:
공정 1) 신경제세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 공정 및
공정 2) 공정 1에서 얻어진 세포 집단을, 라미닌 211을 족장으로서 사용하여 확대 배양하는 공정.
[7] 공정 1에서 얻어진 신경제세포를 포함하는 세포 집단이, 신경제세포의 소팅 처리에 제공되지 않고 공정 2에 제공됨을 특징으로 하는, [6]에 기재된 방법.
[8] 공정 2의 배양 기간이, 1 내지 21일간인, [6] 또는 [7]에 기재된 방법.
[9] 신경제세포를 포함하는 세포 집단이 다능성 줄기세포 유래인, [6] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[10] 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, [9]에 기재된 방법.
[11] 이하의 공정을 포함하는, 각막 상피 세포를 순화하는 방법:
공정 1) 각막 상피 세포의 비율이 25% 이상인 세포 집단을 얻는 공정 및
공정 2) 공정 1에서 얻어진 세포 집단을, 라미닌 332를 족장으로서 사용하여 확대 배양하는 공정.
[12] 공정 1에서 얻어진 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단이, 각막 상피 세포의 소팅 처리에 제공되지 않고 공정 2에 제공됨을 특징으로 하는, [11]에 기재된 방법.
[13] 공정 2의 확대 배양에 있어서, 족장으로서 사용되는 라미닌 332의 코트량이 0.01μg/cm2 이상 0.5μg/cm2 미만인, [11] 또는 [12]에 기재된 방법.
[14] 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단이 다능성 줄기세포 유래인, [11] 내지 [13] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[15] 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, [14]에 기재된 방법.
[16] 이하의 공정을 포함하는, 순화된 각막 상피 세포를 생산하는 방법:
공정 1) 각막 상피 세포의 비율이 25% 이상인 세포 집단을 얻는 공정 및
공정 2) 공정 1에서 얻어진 세포 집단을, 라미닌 332를 족장으로서 사용하여 확대 배양하는 공정.
[17] 공정 1에서 얻어진 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단이, 각막 상피 세포의 소팅 처리에 제공되지 않고 공정 2에 제공됨을 특징으로 하는, [16]에 기재된 방법.
[18] 공정 2의 확대 배양에 있어서, 족장으로서 사용되는 라미닌 332의 코트량이 0.01μg/cm2 이상 0.5μg/cm2 미만인, [16] 또는 [17]에 기재된 방법.
[19] 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단이 다능성 줄기세포 유래인, [16] 내지 [18] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[20] 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, [19]에 기재된 방법.
본 발명에 의하면, 매우 간편하고 또한 단기간에, 신경제세포를 포함하는 세포 집단으로부터 신경제세포를 순화할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, 매우 간편하고 또한 단기간에, 고순도의 신경제세포를 조제할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면, 매우 간편하게, 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 각막 상피 세포를 순화할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, 매우 간편하게, 고순도의 각막 상피 세포를 조제할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
1. 신경제세포의 순화 방법
본 발명은, 이하의 공정을 포함하는, 신경제세포를 순화하는 방법(이하, 「본 발명의 순화 방법 1」이라고 칭하는 경우가 있음)을 제공한다:
공정 1) 신경제세포를 포함하는 세포 집단을 조제하는 공정, 및 공정 2) 공정 1에서 얻어진 세포 집단을, 라미닌 211을 족장으로서 사용하여 확대 배양하는 공정.
「신경제세포(Neural Crest Cell: 「NCC」라고도 칭함)」란, 척추동물의 초기 발생에 있어서 표피 외배엽과 신경판 사이에 일시적으로 형성되는 신경제라고 하는 구조로부터 탈상피화하여, 상피로부터 간엽으로의 전환 후에 배체 내의 다양한 부위로 유도되는 세포를 의미한다. 본 명세서에서의 용어 「신경제세포」에는, 생체로부터 채취된 세포뿐만 아니라, 다능성 줄기세포 유래의 신경제세포나 이들을 계대한 세포도 포함된다. 또한, 본 발명의 순화 방법에 있어서, 신경제세포의 유래는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 척추동물의 것이라도 좋지만, 포유동물 유래의 신경제세포가 바람직하다. 이러한 포유동물로서는, 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 염소, 원숭이 및 인간을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 순화 방법 1의 공정 1에서의 신경제세포를 포함하는 세포 집단을 조제하는 방법으로서는, 생체 유래의 신경제세포를 포함하는 세포 집단인 경우는, 생체에서의 신경제 유래의 조직(예를 들면, 골수, 척수 후근 신경절, 심장, 각막, 홍채, 치수(齒髓) 및 후점막 등) 중에서 세포 집단을 채취함으로써 조제할 수 있다. 또한, 다능성 줄기세포 유래의 신경제세포를 포함하는 세포 집단의 경우는, 상기한 바와 같이, 복수의 조제 방법이 공지되어 있고, 일례로서는, TGFβ 저해제 및 GSK-3β 저해제를 함유하는 배양액 중에서 다능성 줄기세포를 배양하는 방법이 예시된다. iPS 세포를 TGFβ 저해제 및 GSK-3β 저해제를 함유하는 배양액에서 분화 유도함으로써, iPS 세포는, 눈의 다양한 세포 계보로 구성되는 다대상 영역을 갖는 콜로니(self-formed ectodermal autonomous multi-zone: SEAM)로 분화한다. SEAM에는 신경제세포가 포함될 수 있다.
이렇게 하여 얻어진 세포 집단에 신경제세포가 포함되는지 여부는, TFAP2a, SOX9, SOX10, TWISTI, PAX3 등의 신경제세포 특이적 마커 유전자의 1개 이상의 발현을 자체 공지의 방법에 의해 확인하면 좋다. 또한, CD271 단백질(「p75(NTR)」이라고도 칭해짐) 등의 신경제세포의 세포 표면에 존재하는 단백질을 신경제세포 특이적 마커로서 사용할 수도 있다. 본 발명의 순화 방법 1에서 사용되는 신경제세포를 포함하는 세포 집단은, 다능성 줄기세포 유래인 것이 바람직하고, iPS 세포 유래인 것이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명에 있어서 다능성 줄기세포란, 생체에 존재하는 많은 세포로 분화 가능한 다능성을 갖고, 또한 증식능도 겸비한 줄기세포이며, 본 발명에서 사용되는 중간 중배엽 세포로 유도되는 임의의 세포가 포함된다. 다능성 줄기세포에는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 배아 줄기(ES)세포, 핵 이식에 의해 얻어지는 클론 배아 유래의 배아 줄기(ntES)세포, 정자 줄기세포(GS세포), 배아 생식세포(EG세포), 인공 다능성 줄기(iPS)세포, 배양 섬유아세포나 골수 줄기세포 유래의 다능성 세포(Muse세포) 등이 포함된다. 바람직한 다능성 줄기세포는, 제조 공정에 있어서 배아, 난자 등의 파괴를 하지 않고 입수 가능하다는 관점에서 iPS세포이고, 보다 바람직하게는 인간 iPS세포이다.
iPS세포의 제조방법은 상기 분야에 공지되었으며, 임의의 체세포에 초기화 인자를 도입함으로써 제조될 수 있다. 여기서, 초기화 인자란, 예를 들면, Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 또는 Glis1 등의 유전자 또는 유전자 산물이 예시되며, 이러한 초기화 인자는, 단독으로 사용해도 좋고, 조합하여 사용해도 좋다. 초기화 인자의 조합으로서는, WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, WO2009/057831, WO2009/075119, WO2009/079007, WO2009/091659, WO2009/101084, WO2009/101407, WO2009/102983, WO2009/114949, WO2009/117439, WO2009/126250, WO2009/126251, WO2009/126655, WO2009/157593, WO2010/009015, WO2010/033906, WO2010/033920, WO2010/042800, WO2010/050626, WO2010/056831, WO2010/068955, WO2010/098419, WO2010/102267, WO2010/111409, WO2010/111422, WO2010/115050, WO2010/124290, WO2010/147395, WO2010/147612, Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528, Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474, Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol. 26:1269-1275, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574, Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479, Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135, Feng B, et al. (2009), Nat. Cell Biol. 11:197-203, R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461, Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917, Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643, Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503, Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74, Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100, Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720, Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.에 기재된 조합이 예시된다.
체세포에는, 비한정적으로, 태아(자(仔))의 체세포, 신생아(자(仔))의 체세포 및 성숙한 건전 또는 질환성 체세포 모두 포함되며, 또한, 초대 배양 세포, 계대 세포 및 주화 세포 모두 포함된다. 구체적으로는, 체세포는, 예를 들면 (1) 신경 줄기세포, 조혈 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 치수 줄기세포 등의 조직 줄기세포(체성 줄기세포), (2) 조직 전구 세포, (3) 혈액 세포(말초혈세포, 제대혈세포 등), 림프구, 상피 세포, 내피세포, 근육세포, 섬유아세포(피부세포 등), 모세포, 간세포, 위점막세포, 장세포, 비세포(脾細胞), 췌세포(췌외분비세포 등), 뇌세포, 폐세포, 신세포(腎細胞) 및 지방세포 등의 분화된 세포 등이 예시된다.
체세포를 채취하는 유래가 되는 포유동물은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 인간이다.
신경제세포를 포함하는 세포 집단은, 채취한 조직이나 분화 유도 조건에 따라, 신경제세포의 비율이 크게 변화할 수 있다. 본 발명의 순화 방법 1의 일 양태에 있어서, 신경제세포를 포함하는 세포 집단에서의 신경제세포의 비율은, 예를 들면, 1 내지 95%, 1 내지 90%, 1 내지 85%, 1 내지 80%, 1 내지 75%, 1 내지 70%, 1 내지 65%, 1 내지 60%, 1 내지 55%, 1 내지 50%, 1 내지 45%, 1 내지 40%, 1 내지 35%, 1 내지 30%, 1 내지 25%, 1 내지 20%, 1 내지 15% 또는 1 내지 10%일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 다른 일 양태에 있어서, 신경제세포를 포함하는 세포 집단에서의 신경제세포의 비율은, 예를 들면, 25 내지 95%, 25 내지 90%, 25 내지 85%, 25 내지 80%, 25 내지 75%, 25 내지 70%, 25 내지 65%, 25 내지 60%, 25 내지 55%, 25 내지 50%, 25 내지 45%, 25 내지 40% 또는 25 내지 35%일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 다른 일 양태에 있어서, 신경제세포를 포함하는 세포 집단에서의 신경제세포의 비율은, 예를 들면, 50 내지 95%, 50 내지 90%, 50 내지 85%, 50 내지 80%, 50 내지 75%, 50 내지 70%, 50 내지 65% 또는 50 내지 60%일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 다른 일 양태에 있어서, 신경제세포를 포함하는 세포 집단에서의 신경제세포의 비율은, 예를 들면, 75 내지 95%, 75 내지 90% 또는 75 내지 85%일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
여기서, 본 발명의 순화 방법 1에서의 「순화」란, 공정 1에서 조제된 신경제세포를 포함하는 세포 집단을 공정 2에 제공한 결과, 세포 집단에서의 신경제세포의 비율이 공정 1에서 조제된 시점에서의 비율보다도 높아지는 것을 의미한다. 일 양태에 있어서, 본 발명의 순화 방법 1에 의해 순화 후의 세포 집단의 신경제세포의 비율은, 90 내지 100%, 91 내지 100%, 92 내지 100%, 93 내지 100%, 94 내지 100%, 95 내지 100%, 96 내지 100%, 97 내지 100%, 98 내지 100%, 99 내지 100% 또는 100%이지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 순화 방법 1의 공정 1에서 조제되는 신경제세포를 포함하는 세포 집단은, 필요에 따라, 역학적인 분산 처리, 콜라게나제나 트립신 등의 효소에 의한 분산 처리 및/또는 EDTA 등의 킬레이트제에 의한 분산 처리 등에 제공하여, 싱글 셀의 상태로 한 것이라도 좋다. 또한, 세포 집단을 싱글 셀화하는 경우, 세포사(細胞死)를 억제할 목적으로 ROCK 저해제를 첨가해도 좋다. ROCK 저해제는, Rho-키나제(ROCK)의 기능을 억제할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, Y-27632, Fasudil/HA1077, H-1152, Wf-536 및 이들의 유도체 등을 들 수 있다. 또한, ROCK 저해제로서는 다른 공지된 저분자 화합물도 사용할 수 있다(예를 들면, 미국 특허출원 공개 제2005/0209261호, 미국 특허출원 공개 제2005/0192304호, 미국 특허출원 공개 제2004/0014755호, 미국 특허출원 공개 제2004/0002508호, 미국 특허출원 공개 제2004/0002507호, 미국 특허출원 공개 제2003/0125344호, 미국 특허출원 공개 제2003/0087919호 및 국제공개 제2003/062227호, 국제공개 제2003/059913호, 국제공개 제2003/062225호, 국제공개 제2002/076976호, 국제공개 제2004/039796호 참조).
공정 1에서 조제된 세포 집단은, 신경제세포의 소팅 처리에 제공한 후에 공정 2에 제공해도 좋지만, 바람직하게는, 신경제세포의 소팅 처리에 제공되지 않고 공정 2에 제공된다. 또한, 신경제세포의 소팅 처리로서는, 예를 들면, 형광 표지된 CD271 특이적 항체를 사용한 셀 소터에 의한 소팅, CD271 특이적 항체를 결합시킨 자기 비드에 의한 소팅 및 CD271 특이적 항체를 고층화(固層化)한 어피니티 컬럼에 의한 소팅 등의 소팅 처리를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 순화 방법 1의 공정 2에서는, 공정 1에서 얻어진 세포 집단을 확대 배양에 제공한다. 또한, 본 명세서에 있어서 「확대 배양」이란, 원하는 세포를 유지 및/또는 증식시키는 배양을 포함하는 개념이며, 바람직하게는, 원하는 세포를 증식시키는 배양일 수 있다.
본 발명의 순화 방법 1에서는, 신경제세포의 순화가 목적이기 때문에, 배양 조건으로서는, 신경제세포의 유지 및/또는 증식에 적합한 조건이 사용될 수 있다.
신경제세포를 확대 배양하기 위한 배양 조건은, 신경제세포를 확대 배양할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 자체 공지된 배양 조건을 사용할 수 있다. 일례로서는, TGFβ 저해제, EGF(epidermal growth factor) 및 FGF2(fibroblast growth factor 2)를 함유하는 배양액 중에서 배양하는 방법이 예시된다.
신경제세포의 확대 배양에 사용하는 배지는, 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로 하여 조제할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들면, IMDM 배지, Medium199 배지, Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 배지, αMEM 배지, Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM) 배지, Ham's F12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, StemPro34(invitrogen), RPMI-base medium, StemFit(등록상표) AK03N 배지 및 이들의 혼합 배지 등이 포함된다. 본 공정에 있어서, 바람직하게는, StemFit(등록상표) AK03N 배지가 사용된다. 배지에는, 혈청이 함유되어 있어도 좋고 또는 무혈청이라도 좋다. 필요에 따라, 배지는, 예를 들면, 알부민, 트랜스페린, Knockout Serum Replacement(KSR)(ES 세포 배양시의 FBS의 혈청 대체물), N2 서플리먼트(Invitrogen), B27 서플리먼트(Invitrogen), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올(2ME), 티올글리세롤 등의 하나 이상의 혈청 대체물을 포함해도 좋고, 지질, 아미노산, L-글루타민, Glutamax(Invitrogen), 비필수 아미노산, 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류 등의 하나 이상의 물질도 함유할 수 있다.
본 발명에 있어서, TGFβ 저해제는, TGFβ의 수용체에 대한 결합에서 SMAD로 계속되는 시그널 전달을 저해하는 물질이며, 수용체인 ALK 패밀리에 대한 결합을 저해하는 물질 또는 ALK 패밀리에 의한 SMAD의 인산화를 저해하는 물질인 한 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서, TGFβ 저해제는, 예를 들면, Lefty-1(NCBI Accession No.로서, 마우스: NM_010094, 인간: NM_020997이 예시된다), SB431542, SB202190(이상, R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20), SB505124(GlaxoSmithKline), NPC30345, SD093, SD908, SD208(Scios), LY2109761, LY364947, LY580276(Lilly Research Laboratories), A-83-01(WO2009/146408) 및 이들의 유도체 등이 예시된다. 신경제세포의 확대 배양에 사용되는 TGFβ 저해제는, 바람직하게는 SB431542일 수 있다.
배양액 중에서의 SB431542 등의 TGFβ 저해제의 농도는, ALK5를 저해하는 농도이면 특별히 한정되지 않지만, 1nM 내지 50μM가 바람직하고, 예를 들면, 1nM, 10nM, 50nM, 100nM, 500nM, 750nM, 1μM, 2μM, 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 40μM, 50μM이지만 이에 한정되지 않는다. 보다 바람직하게는, 10μM이다.
또한, 배지 중의 EGF의 농도는, 1ng/ml 내지 100ng/ml가 바람직하고, 예를 들면, 1ng/ml, 5ng/ml, 10ng/ml, 20ng/ml, 30ng/ml, 40ng/ml, 50ng/ml, 60ng/ml, 70ng/ml, 80ng/ml, 90ng/ml, 100ng/ml이지만 이에 한정되지 않는다. 보다 바람직하게는, 20ng/ml이다.
또한, 배지 중의 FGF2의 농도는, 1ng/ml 내지 100ng/ml가 바람직하고, 예를 들면, 1ng/ml, 5ng/ml, 10ng/ml, 20ng/ml, 30ng/ml, 40ng/ml, 50ng/ml, 60ng/ml, 70ng/ml, 80ng/ml, 90ng/ml, 100ng/ml이지만 이에 한정되지 않는다. 보다 바람직하게는, 20ng/ml이다.
또한, 신경제세포의 확대 배양이 달성될 수 있는 한, 배지 중에 상기 이외의 성분을 첨가할 수도 있다.
공정 2에서의 신경제세포의 확대 배양은, 접착 배양 및 부유 배양 중 어느 것이라도 좋지만, 바람직하게는 접착 배양에 의해 행해진다.
본 발명의 순화 방법 1에 있어서는, 신경제세포의 순화를 달성하기 위해 라미닌 211을 사용함을 특징으로 한다.
라미닌은 기저막의 주요한 구성 분자인 당단백질이다. 라미닌은, 세포 접착, 세포 증식, 전이, 분화 등의 다양한 세포 기능에 관여하는 것이 알려져 있다. 라미닌은, α, β 및 γ 서브 유닛쇄를 각각 하나씩 갖는 헤테로 3량체로 구성된다. 현재 5종류의 α 서브 유닛쇄(α1, α2, α3, α4, α5), 3종류의 β 서브 유닛쇄(β1, β2, β3) 및 3종류의 γ 서브 유닛쇄(γ1, γ2, γ3)가 존재하는 것이 알려져 있고, 이들 서브 유닛쇄의 조합에 따라, 현재 인간에서는 15종류의 라미닌 아이소폼의 존재가 확인되고 있다. 본 발명의 순화 방법에 사용되는 라미닌 211은, α2쇄, β1쇄, γ1쇄의 서브 유닛쇄로 구성되는 라미닌이다. 라미닌의 유래는 신경제세포가 유래하는 생물과 일치시키는 것이 바람직하다(예를 들면, 인간 유래의 신경제세포를 사용하는 경우에는, 인간 유래의 라미닌 211을 사용하는 것이 바람직하다). 또한, 라미닌은 인테그린 결합 부위만으로 구성되는 라미닌 E8 단편(斷片) 쪽이, 전장(全長) 라미닌보다도 세포 접착 활성이 강한 것이 알려져 있지만(Miyazaki T. et al., Nat Commun. 2012;3:1236 참조), 본 발명의 순화 방법에서 사용되는 라미닌 211은, 단편이 아니라 라미닌 211 전장 단백질이다. 라미닌 211은 자체 공지된 유전자 재조합 기술을 사용하여 조제해도 좋고, 시판되고 있는 것을 사용해도 좋다.
공정 2에 있어서, 세포 집단을 부유 배양에서 확대 배양하는 경우에는, 라미닌 211을 배지 중에 첨가하여 부유하고 있는 세포가 이것을 족장으로 할 수 있도록 하면 좋다. 부유 배양은, 자체 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 일례로서는, 스피너 플라스크 등을 사용하여 배지를 교반하면서, 라미닌 211을 첨가한 배지 중에서 세포 집단을 부유 배양에서 확대 배양하는 방법을 들 수 있다. 또는, 배지에 첨가함으로써 세포를 부유시키는 효과를 갖는 다당류(예를 들면, 메틸셀룰로오스, 크산탄검, 젤란검 등)와 라미닌 211을 병용함으로써, 세포 집단을 부유 배양에서 확대 배양할 수도 있다. 라미닌을 첨가하는 농도 등은 세포 집단의 파종 밀도나 병용하는 다당류의 농도 등의 각종 조건을 고려한 후, 적절히 설정하면 좋다. 또한, 본 명세서에 있어서, 부유 배양이란, 세포가 배양 용기의 표면에 세포 접착하지 않고 행해지는 배양 방법을 의미한다. 부유 배양은, 물리적인 교반을 수반해도 좋고, 수반하지 않아도 좋다. 또한, 배양되는 세포가 배지 중에 균일하게 분산되어 있어도 되고, 불균일하게 분산되어 있어도 좋다.
공정 2에 있어서, 세포 집단을 접착 배양에서 확대 배양하는 경우는, 라미닌 211을 배양 용기의 표면에 코팅한다. 라미닌 211의 코트량은, 본 발명의 원하는 효과가 얻어지는 한 특별히 한정되지 않고, 통상 추장(推奬)되는 코트량을 사용하면 좋다. 일례로서는, 라미닌 211의 코트량은, 0.1ng/cm2 내지 1000ng/cm2, 바람직하게는 0.5ng/cm2 내지 500ng/cm2, 보다 바람직하게는 1ng/cm2 내지 250ng/cm2, 더욱 바람직하게는 2ng/cm2 내지 100ng/cm2이지만, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 공정 2에서의 배양 기간은, 배양 조건, 배양 방법, 세포 집단에 포함되는 신경제세포의 비율 등에 의해 변동될 수 있지만, 비교적 단기간에 신경제세포의 순화가 달성된다. 배양 기간의 일례로서는, 1 내지 21일간, 1 내지 20일간, 1 내지 19일간, 1 내지 18일간, 1 내지 17일간, 1 내지 16일간, 1 내지 15일간, 1 내지 14일간, 1 내지 13일간, 1 내지 12일간, 1 내지 11일간, 1 내지 10일간, 1 내지 9일간, 1 내지 8일간, 1 내지 7일간, 1 내지 6일간, 1 내지 5일간, 1 내지 4일간 또는 1 내지 3일간이지만, 이에 한정되지 않는다.
공정 2에서의 배양 온도로서는, 신경제세포를 배양할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. 또한, 공정 2에서의 배양시의 CO2 농도로서는, 신경제세포를 배양할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 2 내지 5%, 바람직하게는 약 5%이다.
2. 신경제세포의 생산 방법
본 발명은 또한, 이하의 공정을 포함하는, 순화된 신경제세포를 생산하는 방법(이하, 「본 발명의 생산 방법 1」로 칭하는 경우가 있음)을 제공한다:
공정 1) 신경제세포를 포함하는 세포 집단을 조제하는 공정, 및 공정 2) 공정 1에서 얻어진 세포 집단을, 라미닌 211을 족장으로서 사용하여 확대 배양하는 공정.
본 발명의 생산 방법에서의 각종 조건은, 본 발명의 순화 방법 1과 동일하다.
3. 각막 상피 세포의 순화 방법
본 발명은, 이하의 공정을 포함하는, 각막 상피 세포를 순화하는 방법(이하, 「본 발명의 순화 방법 2」로 칭하는 경우가 있음)을 제공한다:
공정 1) 각막 상피 세포의 비율이 25% 이상인 세포 집단을 얻는 공정, 및 공정 2) 공정 1에서 얻어진 세포 집단을, 라미닌 332를 족장으로서 사용하여 확대 배양하는 공정.
「각막 상피 세포(corneal epithelial cell: 「CEC」로도 칭해짐)」란, 각막의 가장 외측의, 각막 상피층을 구성하는 세포이다. 각막 상피 세포는 표피 외배엽에 유래한다. 본 명세서에서의 용어 「각막 상피 세포」에는, 생체로부터 채취된 세포뿐만 아니라, 다능성 줄기세포 유래의 각막 상피 세포나, 이들을 계대한 세포도 포함된다. 또한, 본 발명의 순화 방법 2에 있어서, 각막 상피 세포의 유래는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 척추동물의 것이라도 좋지만, 포유동물 유래의 각막 상피 세포가 바람직하다. 이러한 포유동물로서는, 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 염소, 원숭이 및 인간을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 본 명세서에서의 용어 「각막 상피 세포」는, 각막 상피 줄기세포 및/또는 각막 상피 전구 세포를 포함할 수 있는 개념이다.
본 발명의 순화 방법 2의 공정 1에서의 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단을 조제하는 방법으로서는, 생체 유래의 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단인 경우는, 각막 상피층으로부터 세포 집단을 채취함으로써 조제할 수 있다. 또한, 다능성 줄기세포 유래의 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단의 경우는, 상기한 바와 같이 공지된 조제 방법을 채용할 수 있다. 일례로서는, 예를 들면, 본원 실시예에서 나타내어지는 방법이나, 다능성 줄기세포를 스트로마 세포 또는 양막 유래 인자의 존재 하에서, 일정 기간 동안 BMP를 포함하지 않는 무혈청 배지에서 배양하는 방법이 예시된다. 이러한 방법에 의해, 다능성 줄기세포(예, iPS 세포)는 SEAM으로 분화한다. SEAM에는 각막 상피 세포가 포함될 수 있다.
이렇게 하여 얻어진 세포 집단에 각막 상피 세포가 포함되는지 여부는, PAX-6, Cytokeratin 12 또는 Cytokeratin 3 등의 각막 상피 세포 특이적 마커 유전자의 1개 이상의 발현을 자체 공지된 방법에 의해 확인하면 좋다. 본 발명의 순화 방법 2에서 사용되는 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단은, 다능성 줄기세포 유래인 것이 바람직하고, iPS 세포 유래인 것이 보다 바람직하다. 또한, 본 발명에서의 「다능성 줄기세포」는 상기한 바와 같다.
각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단은, 채취한 조직이나 분화 유도 조건에 의해, 각막 상피 세포의 비율이 크게 변화할 수 있다. 본 발명의 순화 방법 2의 일 양태에서, 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단에서의 각막 상피 세포의 비율은, 예를 들면, 1 내지 95%, 1 내지 90%, 1 내지 85%, 1 내지 80%, 1 내지 75%, 1 내지 70%, 1 내지 65%, 1 내지 60%, 1 내지 55%, 1 내지 50%, 1 내지 45%, 1 내지 40%, 1 내지 35%, 1 내지 30%, 1 내지 25%, 1 내지 20%, 1 내지 15% 또는 1 내지 10%일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 다른 일 양태에 있어서, 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단에서의 각막 상피 세포의 비율은, 예를 들면, 25 내지 95%, 25 내지 90%, 25 내지 85%, 25 내지 80%, 25 내지 75%, 25 내지 70%, 25 내지 65%, 25 내지 60%, 25 내지 55%, 25 내지 50%, 25 내지 45%, 25 내지 40% 또는 25 내지 35%일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 다른 일 양태에 있어서, 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단에서의 각막 상피 세포의 비율은, 예를 들면, 50 내지 95%, 50 내지 90%, 50 내지 85%, 50 내지 80%, 50 내지 75%, 50 내지 70%, 50 내지 65% 또는 50 내지 60%일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 다른 일 양태에 있어서, 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단에서의 각막 상피 세포의 비율은, 예를 들면, 75 내지 95%, 75 내지 90% 또는 75 내지 85%일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
각막 상피 세포의 비율이 25% 미만인 세포 집단은, 각막 상피 세포의 소팅 처리를 행함으로써, 상기 각막 상피 세포의 비율을 25% 이상으로 할 수 있다. 각막 상피 세포의 소팅 처리는 자체 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 일례로서는, 각막 상피 세포의 표면에 특이적으로 발현하고 있는 마커를 확인하고, 상기 마커를 발현하는 세포를 선택하는 방법을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 순화 방법 2에서는, 각막 상피 세포의 비율이 25% 이상인 세포 집단을, 라미닌 332를 족장으로 하여 확대 배양함으로써, 각막 상피 세포를 순화할 수 있다. 세포 집단에서의 각막 상피 세포의 비율은, 통상 25% 이상, 바람직하게는, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상 또는 90% 이상이지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 순화 방법 2에서의 「순화」란, 공정 1에서 조제된 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단을 공정 2에 제공한 결과, 세포 집단에서의 각막 상피 세포의 비율이 공정 1에서 조제된 시점에서의 비율보다도 높아지는 것을 의미한다. 일 양태에 있어서, 본 발명의 순화 방법 2에 의해 순화 후의 세포 집단의 각막 상피 세포의 비율은, 90 내지 100%, 91 내지 100%, 92 내지 100%, 93 내지 100%, 94 내지 100%, 95 내지 100%, 96 내지 100%, 97 내지 100%, 98 내지 100%, 99 내지 100% 또는 100%이지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 순화 방법 2의 공정 1에서 조제되는 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단은, 필요에 따라, 역학적인 분산 처리, 콜라게나제나 트립신 등의 효소에 의한 분산 처리 및/또는 EDTA 등의 킬레이트제에 의한 분산 처리 등에 제공하여 싱글 셀의 상태로 한 것이라도 좋다. 또한, 세포 집단을 싱글 셀화하는 경우, 세포사를 억제할 목적으로 ROCK 저해제를 첨가해도 좋다. ROCK 저해제는 상기한 바와 같다.
공정 1에서 조제된 세포 집단은, 각막 상피 세포의 소팅 처리에 제공한 후에 공정 2에 제공해도 좋지만, 바람직하게는, 각막 상피 세포의 소팅 처리에 제공되지 않고 공정 2에 제공된다.
본 발명의 순화 방법 2의 공정 2에서는, 공정 1에서 얻어진 세포 집단을 확대 배양에 제공한다. 또한, 본 명세서에서의 「확대 배양」의 의미는 상기한 바와 같다.
본 발명의 순화 방법 2에서는, 각막 상피 세포의 순화가 목적이기 때문에, 배양 조건으로서는 각막 상피 세포의 유지 및/또는 증식에 적합한 조건이 사용될 수 있다.
각막 상피 세포를 확대 배양하기 위한 배양 조건은, 각막 상피 세포를 확대 배양할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 자체 공지된 배양 조건을 사용할 수 있다. 일례로서는, KGF(Keratinocyte growth factor) 및 Rho 키나제 저해약을 함유하는 배양액 중에서 배양하는 방법이 예시된다.
각막 상피 세포의 확대 배양에 사용하는 배지는, 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로 하여 조제할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들면, IMDM 배지, Medium199 배지, Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 배지, αMEM 배지, Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM) 배지, Ham's F12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, StemPro34(invitrogen), RPMI-base medium, StemFit(등록상표) AK03N 배지 및 이들의 혼합 배지 등이 포함된다. 본 공정에 있어서, 바람직하게는, StemFit(등록상표) AK03N 배지가 사용된다. 배지에는, 혈청이 함유되어 있어도 좋고 또는 무혈청이라도 좋다. 필요에 따라, 배지는, 예를 들면, 알부민, 트랜스페린, Knockout Serum Replacement(KSR)(ES 세포 배양시의 FBS의 혈청 대체물), N2 서플리먼트(Invitrogen), B27 서플리먼트(Invitrogen), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올(2ME), 티올글리세롤 등의 1개 이상의 혈청 대체물을 포함해도 좋고, 지질, 아미노산, L-글루타민, Glutamax(Invitrogen), 비필수 아미노산, 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류 등의 1개 이상의 물질도 함유할 수 있다.
배양액 중에서의 KGF의 농도는, 각막 상피 세포의 증식이 가능한 농도이면 특별히 한정되지 않지만, 0.1 내지 200ng/mL가 바람직하고, 예를 들면, 0.1ng/mL, 1ng/mL, 10ng/mL, 20ng/mL, 30ng/mL, 40ng/mL, 50ng/mL, 60ng/mL, 70ng/mL, 80ng/mL, 90ng/mL, 100ng/mL, 110ng/mL, 120ng/mL, 130ng/mL, 140ng/mL, 150ng/mL, 160ng/mL, 170ng/mL, 180ng/mL, 190ng/mL, 200ng/mL이지만 이에 한정되지 않는다. 보다 바람직하게는, 20ng/mL이다.
또한, 각막 상피 세포의 확대 배양이 달성될 수 있는 한, 배지 중에 상기 이외의 성분을 첨가할 수도 있다.
공정 2에서의 각막 상피 세포의 확대 배양은, 접착 배양 및 부유 배양 중 어느 것이라도 좋지만, 바람직하게는 접착 배양에 의해 행해진다.
본 발명의 순화 방법 2에 있어서는, 각막 상피 세포의 순화를 달성하기 위해, 라미닌 332를 족장재(足場材)로서 사용함을 특징으로 한다.
본 발명의 순화 방법 2에서 사용되는 라미닌 332는, 단편이 아니라 라미닌 332 전장 단백질이다. 라미닌 332는 자체 공지된 유전자 재조합 기술을 사용하여 조제해도 좋고, 시판되고 있는 것을 사용해도 좋다.
공정 2에 있어서, 세포 집단을 부유 배양에서 확대 배양하는 경우는, 라미닌 332를 배지 중에 첨가하여, 부유하고 있는 세포가 이를 족장으로 할 수 있도록 하면 좋다. 부유 배양의 방법 및 조건은 상기한 바와 같다.
공정 2에 있어서, 세포 집단을 접착 배양에서 확대 배양하는 경우는, 라미닌 332를 배양 용기의 표면에 코팅한다. 라미닌 332의 코트량은, 본 발명의 원하는 효과가 얻어지는 한 특별히 한정되지 않고, 통상 추장되는 코트량을 사용하면 좋다. 일례로서는, 라미닌 332의 코트량은, 0.01μg/cm2 이상 0.5μg/cm2 미만, 바람직하게는 0.05μg/cm2 이상 0.4μg/cm2 미만, 보다 바람직하게는 0.05μg/cm2 이상 0.3μg/cm2 미만, 더욱 바람직하게는 0.05μg/cm2 이상 0.25μg/cm2 미만이지만, 이에 한정되지 않는다.
또한, 공정 2에서의 배양 기간은, 배양 조건, 배양 방법, 세포 집단에 포함되는 각막 상피 세포의 비율 등에 의해 변동될 수 있기 때문에, 적절히 설정하면 좋다. 배양 기간의 일례로서는, 1 내지 50일간, 1 내지 40일간, 1 내지 30일간, 1 내지 20일간, 1 내지 17일간, 1 내지 16일간, 1 내지 15일간, 1 내지 14일간, 1 내지 13일간, 1 내지 12일간, 1 내지 11일간, 1 내지 10일간, 1 내지 9일간, 1 내지 8일간, 1 내지 7일간, 1 내지 6일간, 1 내지 5일간, 1 내지 4일간 또는 1 내지 3일간이지만, 이에 한정되지 않는다.
공정 2에서의 배양 온도로서는, 각막 상피 세포를 배양할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. 또한, 공정 2에서의 배양시의 CO2 농도로서는, 각막 상피 세포를 배양할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 2 내지 5%, 바람직하게는 약 5%이다.
4. 각막 상피 세포의 생산 방법
본 발명은 또한, 이하의 공정을 포함하는, 순화된 각막 상피 세포를 생산하는 방법(이하, 「본 발명의 생산 방법 2」로 칭하는 경우가 있음)을 제공한다:
공정 1) 각막 상피 세포의 비율이 25% 이상인 세포 집단을 얻는 공정, 및 공정 2) 공정 1에서 얻어진 세포 집단을, 라미닌 332를 족장으로서 사용하여 확대 배양하는 공정.
본 발명의 생산 방법 2에서의 각종 조건은, 본 발명의 순화 방법 2와 동일하다.
이하의 실시예에서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.
실시예
[시험예 1] iPS 세포 배양에 대한 라미닌 211의 족장 기능의 평가
(재료와 방법)
iPS 세포주는 201B7(iPS portal)을 사용했다. 상기 세포를 라미닌 511-E8 프래그먼트(iMatrix511, Nippi: 0.26 내지 6.58μg/cm2) 또는 라미닌 211(Biolamina: 0.05 내지 6.58μg/cm2)로 코트한 24웰 플레이트에, 2,300세포/웰이 되도록 파종하고, StemFit(등록상표) AK03N(아지노모토(주)) 배지 중에서, 37℃, 5% CO2 하, 5일간 배양하여 세포 접착 및 콜로니 형성을 평가했다. 또한, 세포 접착은, 배양 5일째의 시점에서 현미경 하에서 관찰함으로써 평가했다. 또한, 세포 증식은, 배양 0일째 및 5일째의 시점에서 현미경 하에서 관찰함으로써 각 시점의 콜로니 형성을 결정하고, 이를 비교함으로써 평가했다. 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
표 1에 나타내어지는 바와 같이, 라미닌 511-E8 프래그먼트를 족장으로서 사용한 경우는, 코트량에 관계없이 양호한 세포 접착 및 콜로니 형성을 나타냈다. 한편, 라미닌 211을 족장으로서 사용한 경우는, 코트량에 관계없이, 음성 대상(non-coat)과 동일하게, 세포 접착도 콜로니 형성도 보이지 않았다.
[실시예 1] iPS 세포로부터의 신경제세포의 제작
(재료와 방법)
1. iPS 세포로부터 신경제세포로의 분화 유도
iPS 세포주는 201B7(iPS portal)을 사용했다. 라미닌 511-E8 프래그먼트(iMatrix511, Nippi)로 코트한 6웰 플레이트에, iPS 세포를 6,500세포/웰이 되도록 파종하고, StemFit(등록상표) AK03N(아지노모토(주)) 배지 중에서, 37℃, 5% CO2 하, 5일간 배양했다. 이어서, 배지를 StemFit AK03N(A액 + B액)에 SB431542(Stemgent, Inc., 10μM) 및 CHIR99021(Wako, 0.3μM(조건 1) 또는 0.9μM(조건 2))을 첨가한 배지 중에서, 37℃, 5% CO2 하에서, 14일간 신경제세포로의 분화 유도를 행했다. 유도 종료시의 신경제세포의 비율은 CD271 단백질 고발현 세포의 비율을 FACS를 사용하여 결정함으로써 산출했다. 또한, 신경제세포 마커의 유전자 발현 상황은 RT-PCR법으로 조사했다. 또한, RT-PCR법에 사용한 프라이머를 이하에 나타낸다.
Figure pct00002
2. 신경제세포의 선택적 증식
상기 1.에서 조제한 신경제세포를 포함하는 세포 집단(SEAM)을 TrypLE Select(Thermo Fisher)를 사용하여 싱글 셀화했다. 싱글 셀화한 세포 집단을, 각종 족장재로 코트한 6웰 플레이트 상에 파종하고, 신경제세포의 확대 배양에 적합한 배양 조건에서 배양했다. 보다 구체적으로는, StemFit AK03N(A액 + B액)에 SB431542(10μM), Epithelium growth factor(Sigma Chemical, 20ng/mL) 및 StemFit AK03N C액(아지노모토(주), 0.08%)을 첨가한 배지에서, 37℃, 5% CO2 하, 9 내지 10일간 배양했다. 9 내지 10일간 배양 후, 컨플루언시가 약 90%가 된 시점에서, 각 족장재에서 배양한 세포 집단의 신경제세포의 비율 및 신경제세포 유전자 마커의 발현 상황을 상기 1.과 동일한 방법에 의해 결정했다.
족장재는 이하를 사용했다.
(1) 라미닌 511-E8 프래그먼트(Nippi, 31.3ng/cm2 및 312.5ng/cm2)
(2) 라미닌 211(Biolamina, 6.3ng/cm2 및 62.5ng/cm2)
(3) Vitronectin(Life Technologies, 31.3ng/cm2 및 312.5ng/cm2)
(4) Fibronectin(Sigma Chemical, 1,562.5ng/cm2 및 3,125.0ng/cm2)
또한, (1) 내지 (3)의 각 족장재는, 배양 배지에 직접 현탁함으로써 6웰 플레이트 표면 상에 코팅했다. (4)의 족장재는, 1mL의 PBS(-)에 용해하고, 웰에 첨가하여 실온 하 1시간 정치함으로써 6웰 플레이트 표면 상에 코팅했다.
결과를 표 2 및 3에 나타낸다.
Figure pct00003
Figure pct00004
표 2에 나타내어지는 바와 같이, iPS 세포로부터 분화시킨 신경제세포를 포함하는 세포 집단을, 라미닌 211을 족장으로서 사용하여 확대 배양하면, 확대 배양에 제공하는 세포 집단 중의 신경제세포의 비율이나 배양 용기의 표면으로의 라미닌 211의 코팅량에 관계없이, 상기 세포 집단의 신경제세포의 비율을 현저하게 높일 수 있었다.
[실시예 2] 세포 증식 시험
실시예 1에서의, 분화 유도 조건 2의 세포 집단을 각 족장재를 사용하여 확대 배양(9일간)함으로써 얻어진 순화된 신경제세포를 회수하여, 각 족장재로 코팅한 6웰 플레이트 상에 재파종하고, 실시예 1의 순화 공정에서 사용한 배양 조건 하, 추가로 5일간 배양했다. 배양 5일 후의 시점에서, TrypLE Select를 사용하여 세포를 싱글 셀화하고 세포수를 계측했다. 결과를 표 4에 나타낸다.
Figure pct00005
표 4에 나타내어지는 바와 같이, 라미닌 211을 족장으로서 사용하여 순화된 신경제세포의 세포 증식 활성은 양호했다. 상기 표 2에 나타내어지는 바와 같이, 라미닌 211을 족장으로서 사용하여 순화된 신경제세포는 매우 높은 순도를 갖고 있는 것을 합해서 고려하면, 순도가 높은 신경제세포의 생산에 있어서는, 라미닌 211을 사용한 확대 배양이 매우 바람직한 것이 시사된다.
[시험예 2] iPS 세포 배양에 대한 라미닌 332의 족장 기능의 평가
(재료와 방법)
iPS 세포주인 201B7(iPS portal)을 2,500세포/웰이 되도록 라미닌 511-E8 프래그먼트(iMatrix511, Nippi: 0.05 내지 5.00μg/cm2) 또는 라미닌 332(Biolamina: 0.05 내지 5.00μg/cm2) 코트한 12웰 플레이트에 파종하고, 5일간 배양하여 세포 접착 및 증식을 평가했다. 파종 익일부터 배양 5일째의 세포 접착 및 배양 5일째의 세포 증식의 결과를 표 5에 나타낸다.
Figure pct00006
표 5에 나타내어지는 바와 같이, 라미닌 511-E8 프래그먼트에서는 어느 코트량이라도 iPS 세포는 접착하고 증식했다. 한편, 라미닌 332에서는 0.50μg/cm2 이상의 코트량으로 iPS 세포는 접착하고 증식했다.
[실시예 3] iPS 세포로부터의 각막 상피 세포의 제작
(재료와 방법)
1. iPS 세포로부터의 각막 상피 세포의 유도
iPS 세포주는 201B7(iPS portal)을 사용했다. 라미닌 511-E8 프래그먼트(iMatrix511, Nippi: 0.25, 0.50 또는 5.00μg/cm2) 또는 라미닌 332(Biolamina: 0.5 또는 5.00μg/cm2)로 코트한 12웰 플레이트에, iPS 세포를 2,500세포/웰이 되도록 파종하고, StemFit(등록 상표) AK03N 배지 중에서, 37℃, 5% CO2 하, 5일간 배양했다. 이어서, 배지를 StemFit AK03N(A액 + B액)에 SB431542(Stemgent, Inc., 10μM) 및 CHIR99021(Wako, 0.6μM)을 첨가한 배지로 바꾸어, 37℃, 5% CO2 하에서 15일간, 각막 상피 세포의 분화 유도를 행했다. 각막 상피 세포의 분화 유도율은, 각막 상피 세포 마커인 PAX-6 및 Cytokeratin 12 단백 발현 세포의 비율을 FACS로 평가했다. 유도 종료시에 얻어진 각막 상피 세포의 비율을 표 6에 나타낸다.
Figure pct00007
2. 각막 상피 세포의 선택적 증식
상기 1.에서 조제한 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단(SEAM)을 TrypLE Select(Thermo Fisher)를 사용하여 싱글 셀화했다. 싱글 셀화한 세포 집단을, 0.06μg/cm2의 농도의 라미닌 332로 코트한 6웰 플레이트 상에 파종하고, 2×105세포/웰이 되도록 파종하여, 각막 상피 세포의 확대 배양에 적합한 배양 조건에서 배양했다. 보다 구체적으로는, StemFit AK03N(A액 + B액)에 Keratinocyte growth factor(Peprotech, 20ng/mL) 및 Y-27632(Wako, 10μM)를 첨가한 배지 중에서, 37℃, 5% CO2 하에서 배양했다. 순화 배양 1계대시의 각막 상피 세포의 비율은, 상기 1.과 마찬가지로, 각막 상피 세포 마커인 PAX-6 및 Cytokeratin 12 단백 발현 세포의 비율을 FACS로 평가함으로써 결정했다. 결과를 표 7에 나타낸다.
Figure pct00008
순화 배양 1계대의 시점에서, 유도 종료시의 PAX-6 및 Cytokeratin 12 양성 세포(즉, CEC)의 비율이 25% 미만인 조건에서는 세포가 충분히 생육되지 않았다. 그러나, 유도 종료시의 PAX-6 및 Cytokeratin 12 양성 세포 비율이 25% 이상이었던 조건에서는, 모든 조건에 있어서 PAX-6 및 Cytokeratin 12 양성 세포 비율이 향상되었다.
본 발명에 따르면, 간편하게, 또한 매우 단기간에, 신경제세포를 포함하는 세포 집단으로부터 신경제세포를 순화할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, 간편하게, 또한 매우 단기간에, 고순도의 신경제세포를 생산할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 간편하게 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 각막 상피 세포를 순화할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, 간편하게 고순도의 각막 상피 세포를 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명은 예를 들면 재생 의료 분야에서 매우 유용하다.
본 출원은, 일본에서 출원된 일본 특허출원 제2019-091988호(출원일: 2019년 5월 15일) 및 일본 특허출원 제2019-186280호(출원일: 2019년 10월 9일)을 기초로 하고 있으며, 이들의 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.

Claims (20)

  1. 이하의 공정을 포함하는, 신경제세포를 순화(純化)하는 방법:
    공정 1) 신경제세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 공정 및
    공정 2) 공정 1에서 얻어진 세포 집단을, 라미닌 211을 족장(足場)으로서 사용하여 확대 배양하는 공정.
  2. 제1항에 있어서, 공정 1에서 얻어진 신경제세포를 포함하는 세포 집단이, 신경제세포의 소팅 처리에 제공되지 않고 공정 2에 제공됨을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 공정 2의 배양 기간이, 1 내지 21일간인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 신경제세포를 포함하는 세포 집단이 다능성 줄기세포 유래인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, 방법.
  6. 이하의 공정을 포함하는, 순화된 신경제세포를 생산하는 방법:
    공정 1) 신경제세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 공정 및
    공정 2) 공정 1에서 얻어진 세포 집단을, 라미닌 211을 족장으로서 사용하여 확대 배양하는 공정.
  7. 제6항에 있어서, 공정 1에서 얻어진 신경제세포를 포함하는 세포 집단이, 신경제세포의 소팅 처리에 제공되지 않고 공정 2에 제공됨을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 공정 2의 배양 기간이, 1 내지 21일간인, 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 신경제세포를 포함하는 세포 집단이 다능성 줄기세포 유래인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, 방법.
  11. 이하의 공정을 포함하는, 각막 상피 세포를 순화하는 방법:
    공정 1) 각막 상피 세포의 비율이 25% 이상인 세포 집단을 얻는 공정 및
    공정 2) 공정 1에서 얻어진 세포 집단을, 라미닌 332를 족장으로서 사용하여 확대 배양하는 공정.
  12. 제11항에 있어서, 공정 1에서 얻어진 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단이, 각막 상피 세포의 소팅 처리에 제공되지 않고 공정 2에 제공됨을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 공정 2의 확대 배양에 있어서, 족장으로서 사용되는 라미닌 332의 코트량이 0.01μg/cm2 이상 0.5μg/cm2 미만인, 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단이 다능성 줄기세포 유래인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, 방법.
  16. 이하의 공정을 포함하는, 순화된 각막 상피 세포를 생산하는 방법:
    공정 1) 각막 상피 세포의 비율이 25% 이상인 세포 집단을 얻는 공정 및
    공정 2) 공정 1에서 얻어진 세포 집단을, 라미닌 332를 족장으로서 사용하여 확대 배양하는 공정.
  17. 제16항에 있어서, 공정 1에서 얻어진 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단이, 각막 상피 세포의 소팅 처리에 제공되지 않고 공정 2에 제공됨을 특징으로 하는, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 공정 2의 확대 배양에 있어서, 족장으로서 사용되는 라미닌 332의 코트량이 0.01μg/cm2 이상 0.5μg/cm2 미만인, 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 각막 상피 세포를 포함하는 세포 집단이 다능성 줄기세포 유래인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, 방법.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3222761A1 (en) * 2021-06-10 2022-12-15 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing mesenchymal stem cells
WO2023106122A1 (ja) * 2021-12-06 2023-06-15 国立大学法人京都大学 間葉系譜への分化に特化した神経堤細胞の製造方法
WO2023127824A1 (ja) * 2021-12-27 2023-07-06 住友ファーマ株式会社 神経堤細胞の培養方法及び製造方法
CN117431209A (zh) * 2023-12-22 2024-01-23 上海元戊医学技术有限公司 通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法及作为骨关节炎药物的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5759536B2 (ja) 2011-04-20 2015-08-05 国立大学法人大阪大学 角膜上皮分化指向性ｉＰＳ細胞

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5264931A (en) 1975-11-25 1977-05-28 Seiko Koki Kk Camera shutter controller
PT1370552E (pt) 2001-03-23 2007-04-30 Bayer Pharmaceuticals Corp Inibidores de rho-quinase
DE60211317T2 (de) 2001-03-23 2007-04-12 Bayer Corp. Rho-kinase inhibitoren
US20040014755A1 (en) 2002-01-10 2004-01-22 Dhanapalan Nagarathnam Rho-kinase inhibitors
WO2003062227A1 (en) 2002-01-23 2003-07-31 Bayer Pharmaceuticals Corporation Rho-kinase inhibitors
CA2473510A1 (en) 2002-01-23 2003-07-31 Bayer Pharmaceuticals Corporation Pyrimidine derivatives as rho-kinase inhibitors
US7737153B2 (en) 2002-10-28 2010-06-15 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Heteroaryloxy-substituted phenylaminopyrimidines as rho-kinase inhibitors
EP4223769A3 (en) 2005-12-13 2023-11-01 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
CN101743306A (zh) 2007-03-23 2010-06-16 威斯康星校友研究基金会 体细胞重编程
US20100330677A1 (en) 2008-02-11 2010-12-30 Cambridge Enterprise Limited Improved Reprogramming of Mammalian Cells, and Cells Obtained
WO2009102983A2 (en) 2008-02-15 2009-08-20 President And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
SG10201607710UA (en) 2008-03-17 2016-11-29 Scripps Research Inst Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
WO2009114949A1 (en) 2008-03-20 2009-09-24 UNIVERSITé LAVAL Methods for deprogramming somatic cells and uses thereof
WO2009126655A2 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of a small molecule modulator
JP2011521969A (ja) 2008-05-30 2011-07-28 スムマ ヘルス システムズ エルエルシー 眼疾患を治療するためのＴＧＦ−β受容体阻害剤又はアクチビン様キナーゼ（ＡＬＫ）５阻害剤、Ａ−８３−０１及びＳＢ−４３１５４２の使用方法及び創傷治療条件
CA2695590C (en) 2008-06-27 2018-01-09 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
US9453204B2 (en) 2008-07-14 2016-09-27 Oklahoma Medical Research Foundation Production of pluripotent cells through inhibition of bright/ARID3a function
WO2010147612A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 Lixte Biotechnology, Inc. Methods of modulating cell regulation by inhibiting p53
WO2010033920A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for enhancing cell reprogramming
US20120021519A1 (en) 2008-09-19 2012-01-26 Presidents And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
WO2010042800A1 (en) 2008-10-10 2010-04-15 Nevada Cancer Institute Methods of reprogramming somatic cells and methods of use for such cells
JP2012507258A (ja) 2008-10-30 2012-03-29 国立大学法人京都大学 人工多能性幹細胞の作製方法
US20110059526A1 (en) 2008-11-12 2011-03-10 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of an hdac modulator
US9045737B2 (en) 2008-12-13 2015-06-02 Dnamicroarray, Inc. Artificial three-dimensional microenvironment niche culture
JP5553289B2 (ja) 2009-02-27 2014-07-16 国立大学法人京都大学 新規核初期化物質
US20120122212A1 (en) 2009-03-06 2012-05-17 Marica Grskovic Tgf-beta pathway inhibitors for enhancement of cellular reprogramming of human cells
US9340775B2 (en) 2009-03-25 2016-05-17 The Salk Institute For Biological Studies Induced pluripotent stem cell produced by transfecting a human neural stem cell with an episomal vector encoding the Oct4 and Nanog proteins
WO2010111422A2 (en) 2009-03-25 2010-09-30 The Salk Institute For Biological Studies Induced pluripotent stem cell generation using two factors and p53 inactivation
WO2010115050A2 (en) 2009-04-01 2010-10-07 The Regents Of The University Of California Embryonic stem cell specific micrornas promote induced pluripotency
US20110088107A1 (en) 2009-04-24 2011-04-14 Yaqub Hanna Compositions and methods for deriving or culturing pluripotent cells
WO2010147395A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Medium composition comprising neuropeptide y for the generation, maintenance, prologned undifferentiated growth of pluripotent stem cells and method of culturing pluripotent stem cell using the same
CA3048388A1 (en) * 2017-01-13 2018-07-19 Osaka University Method for producing a corneal epithelial cell population
EP3578640A4 (en) * 2017-01-31 2020-06-10 Osaka University DIFFERENTIATION CONTROL METHOD FOR PLURIPOTENT STEM CELLS
JP2019091988A (ja) 2017-11-13 2019-06-13 キヤノン株式会社 音声処理装置および音声処理方法
JP2019186280A (ja) 2018-04-03 2019-10-24 Tdk株式会社 磁気抵抗効果デバイス

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5759536B2 (ja) 2011-04-20 2015-08-05 国立大学法人大阪大学 角膜上皮分化指向性ｉＰＳ細胞

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Fukuta M. et al., PLoS One. 2014 Dec 2;9(12):e112291.
Serrano F. et al., Stem Cells Dev. 2019 Jan 15;28(2):81-100.

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