KR20220006611A - Iap 억제제로서의 smac 모방물의 결정 및 그 제조방법 - Google Patents

Iap 억제제로서의 smac 모방물의 결정 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

IAP 억제제로서의 SMAC 모방물의 결정 및 그 제조방법, 그리고 cIAP1 억제에 관련된 암 치료 약물을 제조하기 위한 상기 결정의 용도이다. 상기 식(I) 화합물의 결정은 안정성이 높고 흡습성이 낮으며 물성, 안전성 및 대사 안정성에 이점이 있어 약물로서 가치가 높다.
Figure pct00005

Description

IAP 억제제로서의 SMAC 모방물의 결정 및 그 제조방법
본원은 2019년 5월 10일에 중국 국가지식산권국에 제출된 중국 특허출원 제 201910389970.8호의 우선권을 주장하고, 해당 출원의 모든 내용은 원용되어 본 명세서에 포함된다.
본원은 의약품 화학 분야에 속하며, IAP(세포사멸 억제 단백질, inhibitors of apoptosis proteins) 억제제로서의 SMAC 모방물의 결정 및 그 제조방법, 그리고 cIAP1(cellular inhibitor of apoptosis protein 1) 억제에 관련된 암 치료 약물을 제조하기 위한 상기 결정의 용도에 관한 것이다.
프로그래밍된 세포사멸(apoptosis)은 세포수를 조절하고 정상 조직에서 스트레스 세포 또는 손상 세포를 제거하는 데에 중요한 역할을 한다. 실제로 대부분의 세포 유형에서는 고유의 세포사멸 신호 전달 네트워크 메커니즘을 통해 인간 암의 발생과 악화를 막기 위한 주요 배리어가 제공된다. 그러나 모든 암 세포에는 세포사멸 프로그램을 실행할 수 없다는 공통점이 있고, 게다가 정상적인 세포사멸 메커니즘의 결여로 적절한 세포사멸이 부족하다. 현재 화학 요법, 방사선 요법, 면역 요법을 포함한 대부분의 암 치료는 암 세포의 세포사멸을 간접적으로 유도함으로써 효과를 발휘한다. 따라서 암 세포가 정상적인 세포사멸 메커니즘의 결함으로 인해 세포사멸 프로그램을 실행하지 못하는 것은 일반적으로 화학 요법, 방사선 요법 또는 면역 요법으로부터 유도되는 세포사멸에 대한 내성 증가와 관계가 있다. 따라서 암 세포의 세포사멸에서 중요한 역할을 하는 중요한 네거티브 조절 인자의 직접적인 억제를 목표로 하면, 새로운 항암제 설계로 치료 방법을 얻는 것을 기대할 수 있을 것이다.
현재, 두 종류의 중요한 세포사멸 네거티브 조절 인자가 확인되어 있다. 첫 번째 조절 인자는 Bcl-2 패밀리 단백질로, 예를 들면 Bcl-2와 Bcl-XL 단백질의 2개의 효과적인 항세포사멸 분자이다.
세포사멸의 두 번째 중요한 네거티브 조절 인자는 세포사멸 억제 단백질(IAPs)이다. IAP는 P35 단백질 대신에 기능함으로써 바큘로바이러스에서 처음 발현되었다. 이러한 단백질은 XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein), cIAP1, cIAP2, ML-IAP(Melanoma IAP), ILP-2(Insulin-like peptide 2), NAIP(Neuronal apoptosis inhibitory protein), 아폴론(Apollon), 서바이빈(Survivin)을 포함한다. 이 중 X염색체 연쇄 세포사멸 억제제(XIAP)는 카스파제-3, 카스파제-7, 카스파제-9를 직접적으로 억제하여 항세포사멸 효과를 발휘한다. cIAPs는 주로 사멸 수용체 경로를 차단하여 세포사멸을 억제하는 것으로, cIAPs가 분해되면 그 기질 NIK(NF-κB-inducing kinase, NF-κB 유도 키나아제)는 분해되지 않고 축적되며, 축적된 NIK는 비고전적 경로를 통해 NF-κB를 활성화시킨다. NF-κB의 활성화는 TNFα의 분비를 촉진하고, TNFα는 TNF-R1(TNF receptor1, TNF 수용체 1)과 결합하여 사멸 수용체 경로를 개시하고, cIAPs의 분해로 인해 RIPK1(receptor interacting protein kinase 1, 수용체 상호작용 프로테인 키나아제 1)의 분비가 증가되고, 그것이 FADD(Fas-associated death domin, Fas 관련 사멸 도메인) 및 caspase-8(카스파제-8)과 함께 세포사멸 촉진성 RIPK1-FADD-caspase-8 복합체를 형성하고, 그 후 카스파제-3가 활성화되어 세포사멸을 일으킨다.
복수종의 악성 질환에서 11q21-q23 영역(2종의 유전자를 포함)의 빈번한 염색체 증폭으로 인한 cIAP1 및 cIAP2의 과발현이 관찰되었으며, 상기 복수종의 악성 질환은 신경아세포종, 신세포암, 결장직장암, 위암 등을 포함한다.
[발명의 개요]
본원의 일 측면에서는 식(I) 화합물의 결정이 제공된다.
Figure pct00001
본원의 다른 측면에서는 식(I) 화합물의 결정 조성물이 제공되고, 상기 식(I) 화합물의 결정은 상기 결정 조성물 중량의 50% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상을 차지한다.
본원의 다른 측면에서는 치료 유효량의 상기 식(I) 화합물의 결정 또는 상기 식(I) 화합물의 결정 조성물을 포함하는 의약 조성물이 제공되고, 상기 의약 조성물은 적어도 1종의 약학적으로 허용되는 담체 또는 다른 부형제를 포함할 수 있다.
본원의 다른 측면에서는 cIAP1 억제에 관련된 암 치료 약물을 제조하기 위한 상기 식(I) 화합물의 결정, 상기 식(I) 화합물의 결정 조성물 또는 상기 의약 조성물의 용도가 제공된다.
본원의 다른 측면에서는 포유 동물에 있어서 cIAP1 억제에 관련된 암을 치료하기 위한 상기 식(I) 화합물의 결정, 상기 식(I) 화합물의 결정 조성물 또는 상기 의약 조성물의 용도가 제공된다.
본원의 다른 측면에서는 포유 동물에 있어서 cIAP1 억제에 관련된 암 치료 방법으로서, 필요로 하는 포유 동물에게 치료 유효량의 상기 식(I) 화합물의 결정, 상기 식(I) 화합물의 결정 조성물 또는 상기 의약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 상기 방법이 제공된다.
본원의 다른 측면에서는 포유 동물에 있어서 cIAP1 억제에 관련된 암을 치료하기 위한 상기 식(I) 화합물의 결정, 상기 식(I) 화합물의 결정 조성물 또는 상기 의약 조성물이 제공된다.
[발명의 내용]
본원의 일 측면에서는 식(I) 화합물의 결정이 제공된다.
Figure pct00002
본원에 따른 결정은 비용매화물 형태일 수도 있고, 용매화물 형태일 수도 있으며, 예를 들면 수화물일 수 있다.
본원의 일 실시예에서, 식(I) 화합물의 결정은 결정 A이고, CuKα선을 사용하는 X선 분말 회절 패턴은 2θ 각도 12.1°±0.200°, 16.1°±0.200°, 18.5°±0.200°, 20.2°±0.200°, 21.3°±0.200°및 23.0°±0.200°에 특징적인 회절 피크를 가진다.
본원의 일 실시예에서, 상기 결정 A의 CuKα선을 사용하는 X선 분말 회절 패턴은 2θ 각도 12.1°±0.200°, 16.1°±0.200°, 18.5°±0.200°, 18.8°±0.200°, 19.2°±0.200°, 19.8°±0.200°, 20.2°±0.200°, 21.3°±0.200°, 23.0°±0.200°, 26.6°±0.200°및 27.4°±0.200°에 특징적인 회절 피크를 가진다.
본원의 일 실시예에서, 상기 결정 A의 CuKα선을 사용하는 X선 분말 회절 패턴은 2θ 각도 7.0°±0.200°, 8.7°±0.200°, 12.1°±0.200°, 13.2°±0.200°, 13.9°±0.200°, 16.1°±0.200°, 16.7°±0.200°, 18.5°±0.200°, 18.8°±0.200°, 19.2°±0.200°, 19.8°±0.200°, 20.2°±0.200°, 21.0°±0.200°, 21.3°±0.200°, 23.0°±0.200°, 24.3°±0.200°, 25.3°±0.200°, 26.6°±0.200°및 27.4°±0.200°에 특징적인 회절 피크를 가진다.
본원의 일 실시예에서, 상기 결정 A의 CuKα선을 사용하는 X선 분말 회절 패턴은 2θ 각도 7.0°±0.200°, 8.7°±0.200°, 12.1°±0.200°, 13.2°±0.200°, 13.9°±0.200°, 16.1°±0.200°, 16.5°±0.200°, 16.7°±0.200°, 18.5°±0.200°, 18.8°±0.200°, 19.2°±0.200°, 19.8°±0.200°, 20.2°±0.200°, 21.0°±0.200°, 21.3°±0.200°, 23.0°±0.200°, 23.2°±0.200°, 24.3°±0.200°, 25.3°±0.200°, 26.6°±0.200°, 26.9°±0.200°, 27.4°±0.200° 및 29.4°±0.200°에 특징적인 회절 피크를 가진다.
본원의 일 실시예에서, 상기 결정 A의 CuKα선을 사용하는 X선 분말 회절 패턴은 2θ 각도 7.0°±0.200°, 8.7°±0.200°, 9.7°±0.200°, 10.6°±0.200°, 11.4°±0.200°, 12.1°±0.200°, 13.2°±0.200°, 13.9°±0.200°, 16.1°±0.200°, 16.5°±0.200°, 16.7°±0.200°, 17.5°±0.200°, 18.5°±0.200°, 18.8°±0.200°, 19.2°±0.200°, 19.5°±0.200°, 19.8°±0.200°, 20.2°±0.200°, 21.0°±0.200°, 21.3°±0.200°, 22.5°±0.200°, 23.0°±0.200°, 23.2°±0.200°, 23.8°±0.200°, 24.3°±0.200°, 24.6°±0.200°, 25.3°±0.200°, 25.8°±0.200°, 26.6°±0.200°, 26.9°±0.200°, 27.4°±0.200°, 28.1°±0.200°, 29.1°±0.200°, 29.4°±0.200°, 30.1°±0.200°, 30.6°±0.200°, 30.8°±0.200°, 31.3°±0.200°, 31.8°±0.200°, 32.2°±0.200°, 32.8°±0.200°, 33.7°±0.200°, 34.0°±0.200°, 34.8°±0.200°, 35.5°±0.200°, 36.6°±0.200°, 37.6°±0.200°, 38.6°±0.200°및 39.6°±0.200°에 특징적인 회절 피크를 가진다.
본원의 일 실시예에서, 식(I) 화합물의 결정 A의 CuKα선을 사용하는 X선 분말 회절 패턴에서 특징적인 피크의 피크 위치 및 강도는 표 1과 같다.
표 1: 결정 A의 XRPD 패턴 특성 데이터
번호 2θ각도(°) 상대강도(%) 번호 2θ각도(°) 상대강도(%)
1 7.0 8.2 26 24.6 7.4
2 8.7 6.0 27 25.3 10.9
3 9.7 1.5 28 25.8 1.5
4 10.6 3.9 29 26.6 20.3
5 11.4 2.9 30 26.9 9.9
6 12.1 49.6 31 27.4 21.4
7 13.2 13.2 32 28.1 3.8
8 13.9 18.8 33 29.1 2.5
9 16.1 34.9 34 29.4 9.7
10 16.5 9.6 35 30.1 1.9
11 16.7 12.2 36 30.6 2.1
12 17.5 4.1 37 30.8 2.7
13 18.5 100.0 38 31.3 1.6
14 18.8 23.2 39 31.8 2.5
15 19.2 24.5 40 32.2 5.5
16 19.5 5.6 41 32.8 3.5
17 19.8 21.9 42 33.7 8.2
18 20.2 55.8 43 34.0 6.9
19 21.0 12.7 44 34.8 3.3
20 21.3 41.5 45 35.5 1.9
21 22.5 7.7 46 36.6 3.9
22 23.0 43.2 47 37.6 4.6
23 23.2 9.9 48 38.6 3.1
24 23.8 2.5 49 39.6 2.6
25 24.3 12.0
본원의 일 실시예에서, 식(I) 화합물의 결정 A의 CuKα선을 사용하는 X선 분말 회절 패턴은 도 1과 같다.
본원의 일 실시예에서, 식(I) 화합물의 결정 A의 시차 주사 열량 측정(DSC, Differential Scanning Calorimetry) 결과도에서는 흡수 피크의 피크값이 202.5℃에 있다.
본원의 일 실시예에서, 식(I) 화합물의 결정 A의 시차 주사 열량 측정(DSC) 결과도에서는 흡수 피크의 시작 위치가 200.8℃에 있다.
본원의 일 실시예에서, 식(I) 화합물의 결정 A의 시차 주사 열량 측정(DSC) 결과도는 도 2와 같다.
본원의 일 실시예에서, 식(I) 화합물의 결정 A의 열중량 분석(TGA, Thermogravimetric analysis) 결과도는 도 3과 같다.
본원의 다른 측면에서는
(a) 식(I) 화합물을 용매에 넣고 현탁액 또는 용액으로 하는 단계;
(b) 상기 현탁액 또는 용액을 가열하여 환류시켜서 청징화(clarification)시키는 단계; 및
(c) 상기 청징화액을 뜨거울 때 여과하고 냉각하여 결정화하고, 여과하고 건조하여 식(I) 화합물의 결정 A를 얻는 단계;를 포함하는, 식(I) 화합물의 결정 A의 제조방법이 제공된다.
본원의 일 실시예에서, 상기 단계(a)에서 용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세트산 에틸, 아세토니트릴, 아세톤, 테트라히드로푸란, 물, 물과 상기 어느 하나의 용매와의 혼합 용매에서 선택되고, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 또는 이들과 물의 혼합 용매이고, 보다 바람직하게는 에탄올이다.
본원의 다른 측면에서는
(d) 식(I) 화합물을 용매에 넣고 초음파로 균일하게 혼합하여 현탁액 또는 용액으로 하는 단계; 및
(e) 항온 진탕기에서 상기 현탁액 또는 용액을 가열하여 교반하고, 원심 분리하고 건조하여 식(I) 화합물의 결정 A를 얻는 단계;를 포함하는, 식(I) 화합물의 결정 A의 제조방법이 더 제공된다.
본원의 일 실시예에서, 상기 단계(d)에서 용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세트산 에틸, 아세토니트릴, 아세톤, 테트라히드로푸란, 물, 물과 상기 어느 하나의 용매와의 혼합 용매에서 선택되고, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 아세트산 에틸, 아세토니트릴, 아세톤, 테트라히드로푸란, 물, 물과 메탄올의 혼합 용매, 물과 에탄올의 혼합 용매, 물과 아세톤의 혼합 용매이다. 상기 물과 메탄올, 물과 에탄올, 물과 아세톤의 부피비는 1:1~5에서 선택되고, 바람직하게는 1:1~3이다.
본원의 일 실시예에서, 상기 단계(a)에서 식(I) 화합물과 용매의 몰 부피비는 1mmol:1~10mL이고, 바람직하게는 1mmol:2~6mL이고, 보다 바람직하게는 1mmol:2~4mL이다.
본원의 일 실시예에서, 상기 단계(d)에서 식(I) 화합물과 용매의 몰 부피비는 1mmol:1~15mL이고, 바람직하게는 1mmol:4~10mL이고, 보다 바람직하게는 1mmol:8~10mL이다.
본원의 일 실시예에서, 상기 단계(b)에서 환류 온도는 60~120℃이고, 바람직하게는 80~90℃이다.
본원의 일 실시예에서, 상기 단계(e)에서 교반 온도는 30~50℃이고, 바람직하게는 40~50℃이다.
본원의 다른 측면에서는 식(I) 화합물의 결정 조성물이 제공되고, 상기 식(I) 화합물의 결정이 상기 결정 조성물 중량의 50% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상을 차지한다. 상기 결정 조성물에는 식(I) 화합물의 다른 결정 또는 비결정 형태가 약간 포함될 수 있다.
본원의 다른 측면에서는 치료 유효량의 상기 식(I) 화합물의 결정 또는 상기 식(I) 화합물의 결정 조성물을 포함하는 의약 조성물이 제공되고, 상기 의약 조성물은 적어도 1종의 약학적으로 허용되는 담체 또는 다른 부형제를 포함할 수 있다.
본원의 다른 측면에서는 cIAP1 억제에 관련된 암 치료 약물을 제조하기 위한 상기 식(I) 화합물의 결정, 상기 식(I) 화합물의 결정 조성물 또는 상기 의약 조성물의 용도가 제공된다.
본원의 다른 측면에서는 포유 동물에서 cIAP1 억제에 관련된 암을 치료하기 위한 상기 식(I) 화합물의 결정, 상기 식(I) 화합물의 결정 조성물 또는 상기 의약 조성물의 용도가 제공된다.
본원의 다른 측면에서는 포유 동물에서 cIAP1 억제에 관련된 암 치료 방법으로서, 필요로 하는 포유 동물에게 치료 유효량의 상기 식(I) 화합물의 결정, 상기 식(I) 화합물의 결정 조성물 또는 상기 의약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 상기 방법이 제공된다.
본원의 다른 측면에서는 포유 동물에서 cIAP1 억제에 관련된 암을 치료하기 위한 상기 식(I) 화합물의 결정, 상기 식(I) 화합물의 결정 조성물 또는 상기 의약 조성물이 제공된다.
본원의 일 실시예에서, 상기 포유 동물은 인간이다.
본원의 일 실시예에서, 상기 cIAP1 억제에 관련된 암은 유방암에서 선택된다.
본원의 일 실시예에서, 상기 cIAP1 억제에 관련된 암은 삼중 음성 유방암(triple negative breast cancer)에서 선택된다.
본원에 따른 식(I) 화합물의 결정은 생리 활성, 안전성, 생물학적 이용 가능성 중 적어도 하나에서 뛰어난 효과를 가지며, 식(I) 화합물의 결정 A는 안정성이 높고 흡습성이 낮으며, 게다가 cIAP1 억제 활성이 양호하여 약물로서 가치가 높다. 식(I) 화합물의 결정 A는 양호한 약물 동태 특성도 가지며 약물로 사용하기에 적합하고, 상기 약물 동태 특성은 SD 쥐, 비글견 등에 대한 전임상 동물 시험에서 측정될 수도 있고, 인간에 대한 임상 시험에서 측정될 수도 있다.
본원에서는 의약 조성물을 특정 제형으로 할 수 있고, 투여 경로로 바람직한 것은 경구 투여, 비경구 투여(피하, 근육 내, 정맥 내를 포함), 직장 투여 등이다. 예를 들면, 경구 투여에 적합한 제형은 태블릿제, 캡슐제, 과립제, 산제, 환제, 분말제, 정제, 시럽제, 현탁제를 포함하고, 비경구 투여에 적합한 제형은 수계 또는 비수계 주사용 용액이나 에멀전을 포함하며, 직장 투여에 적합한 제형은 친수성 또는 소수성 담체를 사용한 좌약을 포함한다.
본원에서 샘플의 X선 분말 회절 패턴은 다음 조건으로 측정한다. 장치: Bruker D8 ADVANCE X선 회절 장치, 타겟: CuKα, 파장: λ=1.54056Å, 2θ 각도 범위: 3~40°, 발산 슬릿: 0.60mm, 검출기 슬릿: 10.50mm, 발산 제한 슬릿: 7.10mm, 스텝 길이: 0.02°, 시간/스텝: 0.12초, 시료 회전수: 15rpm, Cu 타겟의 관전압, 관전류: 40kV, 40mA.
본원에서 DSC 곡선은 다음 조건으로 측정한다. 장치: TA Q2000 시차 주사 열량 측정기, 온도 범위: 30~300℃, 가열 속도: 10℃/min.
본원에서 TGA 곡선은 다음 조건으로 측정한다. 장치: TA Q5000 열중량 분석계, 온도 범위: 25~300℃, 가열 속도: 10℃/min.
또한 X선 분말 회절 패턴에서 피크의 위치 또는 피크의 상대 강도는 측정 장치, 측정 방법/조건 등에 따라 다를 수 있다. 어떠한 특정 결정형도 피크 위치에는 오차가 있을 수 있으며, 2θ값의 측정 오차는 ±0.2°일 수 있다. 따라서 각종 결정형을 식별할 때에는 상기 오차를 고려해야 하며, 오차 내에 있는 것은 본원 범위에 포함된다.
또한 같은 결정형이라도 DSC에서 흡수 피크 출현 위치는 측정 장치, 측정 방법/조건 등에 따라 다를 수 있다. 어떠한 특정 결정형도 흡수 피크 위치에는 오차가 있을 수 있으며, 오차는 ±5℃일 수 있다. 따라서 각종 결정형을 결정할 때에는 상기 오차를 고려해야 하며, 오차 내에 있는 것은 본원 범위에 포함된다.
또한 같은 결정형이라도 TGA에서 중량 감소 온도 출현 위치는 측정 장치, 측정 방법/조건 등에 따라 다를 수 있다. 어떠한 특정 결정형도 중량 감소 온도 위치에는 오차가 있을 수 있으며, 오차는 ±5℃일 수 있다. 따라서 각종 결정형을 결정할 때에는 상기 오차를 고려해야 하며, 오차 내에 있는 것은 본원 범위에 포함된다.
[정의 및 설명]
본원의 명세서, 특허청구범위에서 사용하는 하기 용어는 별도로 언급한 경우를 제외하고 아래의 의미를 가진다.
"포유 동물"은 인간, 실험실용 포유 동물이나 애완 동물(예를 들면 고양이, 개, 돼지, 양, 소, 면양, 염소, 말, 토끼)과 같은 사육 동물, 야생 포유 동물 등의 비사육 포유 동물을 포함한다.
용어 "의약 조성물"이란, 생리 활성 화합물을 포유 동물, 예를 들면 인간에게 전달하기 위한 본 분야에서 일반적으로 허용되는 매체와 본원 화합물로 이루어진 제제이다. 상기 매체는 약학적으로 허용되는 모든 사용 가능한 담체를 포함한다. 의약 조성물 쪽이 화합물이 생체에 투여되기 쉽다.
용어 "치료 유효량"이란, 독성 없이 원하는 효과를 얻기 위한 약물 또는 제제의 충분한 용량을 가리킨다. 유효량에는 개체 차이가 있으며 대상의 연령이나 일반 상황과 관련이 있고 유효 성분에도 관계되며, 적절한 유효량은 경우에 따라 당업자가 통상적인 시험을 통해 결정할 수 있다.
본원에서 "약학적으로 허용되는 담체"란, 유효 성분과 함께 투여되고 생체에 명백한 자극은 없으며, 게다가 활성 화합물의 생리 활성이나 특성을 해하지 않는 담체를 가리킨다. 담체의 다른 정보에 관해서는 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott, Williams & Wilkins(2005)를 참조 할 수 있으며, 해당 문헌의 내용은 원용되어 본 명세서에 포함된다.
본원에서 "실온"이란 20℃~30℃를 가리킨다.
도 1은 실시예 1에 따른 식(I) 화합물의 결정 A의 X선 분말 회절(XRPD) 패턴이다.
도 2는 실시예 1에 따른 식(I) 화합물의 결정 A의 시차 주사 열량 측정(DSC) 결과도이다.
도 3은 실시예 1에 따른 식(I) 화합물의 결정 A의 열중량 분석(TGA) 결과도이다.
하기 구체적인 실시예는 당업자에게 본원을 보다 명확하게 이해시켜 실시하게 하기 위한 것이다. 이는 본원의 범위를 한정하는 것으로 간주되지 않으며, 본원의 예시적 설명과 전형적 예에 불과하다.
본원에서 중간 화합물은 하기 구체적인 실시형태, 이들을 다른 화학적 합성 방법과 조합한 실시형태 및 당업자가 숙지하고 있는 대체 가능한 형태를 포함하는, 당업자가 숙지하고 있는 다양한 합성 방법으로 제조할 수 있다. 바람직한 실시형태는 본원의 실시예를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원의 구체적인 실시형태에 따른 화학 반응은 적절한 용매에서 이루어지며, 상기 용매는 본원에 따른 화학적 변화 및 사용하는 시약과 재료에 적합해야 한다. 본원 화합물을 얻기 위해, 당업자가 기존 실시형태에 기초해서 합성 단계 또는 반응 프로세스에 변경 또는 선택을 가할 수 있다.
본원에서 사용하는 모든 용매는 시판품이며, 정제하지 않고 그대로 사용할 수 있다.
실시예 1: 식(I) 화합물의 결정 A의 제조
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단계 1:
반응 케틀(reaction kettle)에 디클로로메탄(16.0L)을 첨가하여 온도를 0℃로 내리고, 화합물 1(2.0kg, 9.94mol, 1.0Eq)을 첨가하여 교반하고, 트리에틸아민(4.42L, 29.81mol, 3.0Eq), 4-디메틸아미노피리딘(61.00g, 496.86mmol, 0.05Eq)을 더 첨가하고, 몇 번에 나누어 p-톨루엔술포닐클로라이드(2.18kg, 11.43mol, 1.15Eq)를 첨가하여 내부 온도를 0~10℃로 제어하고, 반응 케틀에 디클로로메탄(4L)을 더 첨가하여 온도를 20℃로 올리고 이어서 16시간 교반하였다. 반응 케틀에 물(20L)을 첨가하여 5분간 교반하고 정치하여 분액하고, 수상(水相)을 제거하고 유기상을 10% 구연산 수용액(15.0L×2)과 소금물(15.0L×2)로 세척하고 무수 황산나트륨(2.0kg)으로 1시간 건조하여 여과하고, 여과액을 회전식 농축기(rotary evaporator)에 옮겨서 농축하여 화합물 2를 얻었다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 7.78(br d, J=8.2Hz, 2H), 7.47(br d, J=7.9Hz, 2H), 4.13-3.93(m, 2H), 3.92-3.81(m, 1H), 3.22-3.11(m, 2H), 1.96-1.80(m, 2H), 1.74-1.65(m, 2H), 1.40(s, 3H), 1.38-1.23(m, 9H).
단계 2:
건조시킨 반응 케틀에 디클로로메탄(1.30L), 그리고 화합물 3(1.28kg, 8.49mol, 1.0Eq)을 첨가하고 교반하여 용해하고 온도를 내려 내부 온도가 0℃가 될 때까지 냉각되면 질소 가스 보호하에 염화 아세틸(606.0mL, 8.49mol, 1.0Eq)을 30분간 적하하였다. 반응 케틀에 1M의 디에틸알루미늄클로라이드의 n-헥산 용액(8.50L, 8.49mol, 1.0Eq)을 더 적하하고 내부 온도를 0~5℃로 제어하여 3시간에 걸쳐 적하하고 1시간 반응시켰다. 반응액을 천천히 몇 번에 나누어 교반하면서 얼음물(20.0L)에 부으면 대량의 적색 고체가 석출되고, 혼합물을 퀀칭(quenching)하여 회전식 농축기에 옮겨 30℃에서 농축하여 디클로로메탄 및 n-헥산을 제거하고, 잔류물에 2-메틸테트라히드로푸란(20.0L)을 첨가하고 분액 장치에 옮겨서 15분간 교반한 후 분액하고, 수상을 제거하고 유기상을 소금물(20L×2)로 세척하여 무수 황산나트륨(3.0kg)으로 건조하고 여과하였다. 케이크를 2-메틸테트라히드로푸란(2L)으로 세척하고 여과액을 회전식 농축기에 옮겨서 농축하고 잔류물을 50L 반응 케틀에 옮겨서 아세트산 에틸:n-헵탄(V:V)=1:1(10.0L)을 첨가하여 10시간 교반하고 여과하였다. 케이크를 아세트산 에틸:n-헵탄(V:V)=1:1(300mL)으로 헹구어 흡인 건조하고 오븐에 옮겨 35℃에서 감압하에 건조하여 화합물 4를 얻었다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 12.10(br s, 1H), 8.38(d, J=3.2Hz, 1H), 8.16(d, J=2.2Hz, 1H), 7.50(d, J=8.7Hz, 1H), 7.23(dd, J=8.6, 2.1Hz, 1H), 2.46(s, 3H).
단계 3:
질소 가스 보호하에 반응 케틀에 N,N-디메틸아세트아미드(6.0L)를 첨가하여 25℃에서 화합물 2(3.95kg, 11.12mol, 1.30Eq), 화합물 4(1.73kg, 8.56mol, 1.0Eq)를 첨가하고 몇 번에 나누어 10분간 탄산 세슘(4.18kg, 12.85mol, 1.50Eq)을 첨가하고, 반응 케틀의 벽을 N,N-디에틸아세트아미드(1.0L)로 씻어낸 후 온도를 80~85℃로 올려서 16시간 반응시켰다. 온도를 25℃로 내리고 반응액에 천천히 물(30L), 그리고 아세트산 에틸(20L)을 첨가하여 교반하고 분액 장치에 옮겨서 분액시키고, 수상을 아세트산 에틸(10.0L)로 1회 추출하고 유기상을 합해서 물(15.0L×2)과 소금물(15.0L×2)로 세척하고 무수 황산나트륨(3.0kg)으로 1시간 건조하고 여과하였다. 케이크를 아세트산 에틸(2.0L)로 헹구고 여과액을 회전식 농축기에 옮겨서 농축하여 크루드(crude) 생성물을 얻고, 반응 케틀에 옮겨서 아세트산 에틸:n-헵탄(V:V)=1:2(9.0L)을 첨가하여 2시간 교반하고 여과하였다. 케이크를 아세트산 에틸:n-헵탄(V:V)=1:2(500mL)으로 헹구어 흡인 건조하고 오븐에 옮겨서 35℃에서 감압하에 건조하여 화합물 5를 얻었다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 8.43-8.28(m, 1H), 8.17(s, 1H), 7.74-7.52(m, 1H), 7.27(br s, 1H), 4.40-4.05(m, 3H), 3.31-3.11(m, 2H), 2.50-2.35(m, 3H), 1.90-1.69(m, 4H), 1.39(br d, J=6.7Hz, 5H), 1.08(br s, 4H).
단계 4:
건조시킨 반응 케틀에 아세트산 에틸(16.5L), 그리고 화합물 5(1.65kg, 4.38mol, 1.0Eq)를 첨가하고 교반하여 용해하고 온도를 내려 내부 온도가 0℃가 될 때까지 냉각되면, 용시 조제한 염산-아세트산 에틸 용액(15.0L, 4.0mol/L)을 1시간에 적하하고 실온 20~30℃로 되돌려서 16시간 반응시켰다. 반응액을 여과하여 케이크를 아세트산 에틸(5L×2)로 헹구고 케이크를 흡인 건조하여 크루드 생성물을 얻었다. 크루드 생성물을 아세트산 에틸에 현탁시켜 4시간 교반하고, 여과하고 건조하여 화합물 6을 얻었다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 10.00(br s, 1H), 9.54(br s, 1H), 8.76(s, 1H), 8.16(d, J=1.8Hz, 1H), 7.84(d, J=8.8Hz, 1H), 7.30(dd, J=8.7, 1.8Hz, 1H), 4.80-4.72(m, 1H), 4.62(br d, J=5.4Hz, 1H), 3.92(br s, 1H), 3.27(br d, J=6.8Hz, 1H), 3.18-3.00(m, 1H), 2.44(s, 3H), 2.17-1.63(m, 4H).
단계 5:
화합물 7(2.13kg, 8.30mol, 1.05Eq), N,N-디메틸포름아미드(12.50L)를 이 순서대로 반응 케틀에 첨가하고, 반응 케틀의 온도를 0~10℃로 조절하여 O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(3.15kg, 8.30mol, 1.05Eq)를 첨가하여 백색 현탁액을 얻고, N,N-디이소프로필에틸아민(3.06kg, 23.71mol, 3.0Eq)을 적하하여 내부 온도를 10℃ 이하로 제어하고, 그 사이에 고체가 서서히 용해되어 청징액을 얻었다. 적하가 완료되면 내부 온도를 5~10℃로 제어하여 교반하면서 30분간 반응시켰다. 몇 번에 나누어 화합물 6(2.50kg, 7.90mol, 1.0Eq)을 첨가하여 내부 온도를 5~10℃로 제어하였고, 그 사이에 흰 연기가 발생하였다. 적하가 완료되면 서서히 온도를 25~30℃로 올려서 1.5시간 반응시켰다. 교반하면서 절반의 반응액을 천천히 물(30.0L)이 담긴 반응 케틀에 적하하면 대량의 고체가 석출되고 30분간 교반한 후 흡인 여과하고, 케이크를 흡인 건조하여 동일한 방법으로 나머지 절반의 반응액을 처리하였다. 케이크는 함께 50℃에서 진공하에 중량이 일정해질 때까지 건조하여 화합물 8을 얻었다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 8.47-8.41(m, 1H), 8.15(d, J=2.1Hz, 1H), 7.97-7.91(m, 1H), 7.32(dd, J=8.7, 2.0Hz, 1H), 6.87(br d, J=8.4Hz, 1H), 4.49-4.30(m, 2H), 4.15-3.89(m, 2H), 3.62(br dd, J=8.0, 5.0Hz, 2H), 2.44(s, 3H), 2.17-1.97(m, 1H), 1.96-1.85(m, 1H), 1.78-1.52(m, 9H), 1.38-1.31(m, 9H), 1.20-1.06(m, 4H).
단계 6:
아세트산 에틸(17.70L)을 50L 반응 케틀에 첨가하여 반응 케틀의 온도를 0~5℃로 조절하고, 화합물 8(1.70kg, 3.37mol, 1.0Eq)을 첨가하여 백색 현탁액을 얻고, 연동 펌프로 용시 조제한 염산-아세트산 에틸 용액(17.70L, 4mol/L, 21.0Eq)을 첨가하였고 그 사이에 고체가 서서히 용해되어 적갈색 용액을 얻었다. 적하가 완료되면 서서히 온도를 10~25℃로 올려서 2.5시간 반응시켜 대량의 적갈색 고체가 석출되었다. 반응액을 여과하여 케이크 및 케틀 벽의 고체를 메탄올(7.0L)로 용해하고, 유기상을 회전식 농축기에 옮겨서 감압 농축하여 고체를 얻고, 그 고체를 아세트산 에틸(8.85L)에 현탁시켜서 하룻밤 교반하였다. 혼합물을 여과하여 35~45℃에서 진공하에 케이크를 중량이 일정해질 때까지 건조하여 화합물 9를 얻었다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 8.50(s, 1H), 8.30(br d, J=3.1Hz, 3H), 8.15(d, J=2.1Hz, 1H), 7.89(d, J=8.8Hz, 1H), 7.31(dd, J=2.1, 8.7Hz, 1H), 4.56-4.45(m, 1H), 4.45-4.36(m, 1H), 4.15(dd, J=13.8, 8.3Hz, 1H), 3.86(br t, J=5.1Hz, 1H), 3.70-3.62(m, 1H), 3.61-3.56(m, 1H), 2.44(s, 3H), 2.19-2.03(m, 1H), 1.96-1.87(m, 1H), 1.83-1.66(m, 5H), 1.60(br d, J=10.3Hz, 3H), 1.14-0.93(m, 4H).
단계 7:
N,N-디메틸포름아미드(11.88L)를 반응 케틀에 첨가하고 반응 케틀의 온도를 0~5℃로 조절하여 화합물 10(1.36kg, 6.71mol, 1.05Eq) 및 O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(2.54kg, 6.71mol, 1.05Eq)를 첨가하여 고체가 일부 용해되어 백색 현탁액을 얻고, N,N-디이소프로필에틸아민(2.48kg, 19.16mol, 3.0Eq)을 적하하고, 반응 케틀의 온도를 0~5℃로 제어하여 고체가 서서히 용해되어 청징액을 얻었다. 적하가 완료되면 반응 케틀의 온도를 0~5℃로 제어하여 30분간 반응시키고, 천천히 화합물 9(2.9kg, 6.39mol, 1.0Eq)를 첨가하였고 그 사이에 흰 연기가 발생하여 현저한 방열이 수반되었고 원료 첨가 속도 제어로 반응 온도를 0~5℃로 제어하고, 적하가 완료되면 온도를 25~30℃로 올려서 23시간 반응시켰다. 5회로 나누어 반응액을 처리하고, 교반하면서 반응액(약 5.0L)을 35.0L의 물에 적하하면 대량의 백색 고체가 석출되고, 30분간 교반하여 여과하고 케이크를 흡인 건조하여 케이크를 합하였다. 케이크와 케틀 벽의 고체를 아세트산 에틸(30.0L)로 용해한 후 무수 황산나트륨으로 건조하여 여과하고 여과액을 감압하에 농축하여 화합물 11을 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 8.34(d, J=2.0Hz, 1H), 7.73(s, 1H), 7.67(br d, J=8.7Hz, 1H), 7.29-7.22(m, 1H), 6.78(br s, 1H), 4.78-4.45(m, 4H), 3.88-3.55(m, 4H), 2.84-2.76(m, 3H), 2.50(s, 3H), 2.06-1.94(m, 2H), 1.73(br d, J=10.3Hz, 6H), 1.51(s, 9H), 1.39(d, J=6.7Hz, 2H), 1.33(br d, J=7.0Hz, 3H), 1.16(br s, 4H).
단계 8:
아세트산 에틸(10.0L)을 반응 케틀에 첨가하여 반응 케틀의 온도를 0~5℃로 조절하고 화합물 11(3.84kg, 6.03mol, 1.0Eq)을 아세트산 에틸(9.20L)로 용해하여 반응 케틀에 첨가하였다. 연동 펌프로 용시 조제한 염산-아세트산 에틸 용액(4mol/L, 19.20L)에 첨가하고 유속을 0.50L/min로 하여, 적하가 완료되면 서서히 온도를 실온에서 25~30℃로 올려서 19시간 반응시켰고 케틀의 벽에 대량의 고체가 출현하였다. 반응 케틀에 메틸 tert-부틸에테르(10.0L)를 첨가하여 반응액을 2.0시간 교반하고 반응액을 여과하여 케이크를 흡인 건조하였다. 케이크와 케틀 벽의 고체를 물(30.0L)로 용해하고, 내부 온도가 5~10℃로 내려가면 아세트산 에틸(10.0L×2)로 2회 추출하여 수상을 모았다. 2회로 나누어 수상을 처리하고 15.0L의 물을 반응 케틀에 첨가하여 내부 온도가 5~10℃로 내려가면 pH가 9가 될 때까지 질량분율이 10%인 탄산 칼륨 수용액을 적하하여 반응액이 적자색에서 무색으로 바뀌고 고체가 석출되고 30분간 교반하여 여과하였다. 고체가 치밀한 경우에는 아세트산 에틸(1.50L)을 첨가하고 30분간 교반하여 여과하고, 케이크를 흡인 건조하여 반응 케틀에 옮겨서 이소프로판올을 첨가하고 2.0시간 교반해도 된다. 혼합물을 여과하고 케이크를 45℃에서 진공하에 중량이 일정해질 때까지 건조하여 식(I) 화합물을 얻었다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 8.50-8.39(m, 1H), 8.20-8.09(m, 1H), 7.96-7.82(m, 2H), 7.32(dd, J=8.7, 2.1Hz, 1H), 4.58-4.34(m, 3H), 4.14-4.02(m, 1H), 3.79-3.54(m, 2H), 3.06-2.88(m, 1H), 2.48-2.41(m, 3H), 2.24-2.13(m, 3H), 2.09-1.95(m, 3H), 1.93-1.85(m, 1H), 1.79-1.54(m, 8H), 1.12-1.01(m, 6H), 0.99-0.86(m, 1H).
단계 9:
에탄올(14.0L)을 반응 케틀에 첨가하고 교반을 시작하여 식(I) 화합물(1.74kg, 3.41mol, 1.0Eq)을 반응 케틀에 첨가하고 고체가 다 용해되지 못하고 현탁액을 얻었다. 순환욕의 온도를 90℃로 설정하여 케틀 내에 에탄올이 환류되기 시작하여 고체가 서서히 청징화되어 가고, 15분간 보온한 후 뜨거울 때 여과하고 여과액을 반응 케틀에 옮겨서 온도가 서서히 실온으로 떨어지면 대량의 고체가 석출되었다. 반응액을 여과하여 케이크를 35~45℃에서 진공하에 중량이 일정해질 때까지 건조하여 식(I) 화합물의 결정 A를 얻었다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 8.47-8.39(m, 1H), 8.19-8.08(m, 1H), 7.97-7.67(m, 2H), 7.38-7.20(m, 1H), 4.59-4.29(m, 3H), 4.17-4.00(m, 1H), 3.63(td, J=7.6, 3.8Hz, 2H), 2.97(q, J=6.8Hz, 1H), 2.47-2.39(m, 3H), 2.24-2.14(m, 3H), 2.11-1.96(m, 2H), 1.94-1.81(m, 1H), 1.78-1.49(m, 8H), 1.25-0.87(m, 8H).
실시예 2: 식(I) 화합물의 결정 A의 제조
각각 약 50mg의 식(I) 화합물을 칭량하여 각각 1.5mL 액상 보존용 바이알에 첨가하고, 각각 적당량의 용매 또는 용매 혼합물을 첨가하여(표 2 참조), 초음파로 균일하게 혼합 또는 용해하였다. 현탁액 샘플을 항온 진탕기에 세팅하여 40℃에서 차광 하에 60시간 교반하였다. 그 후, 액체 샘플을 고속 원심 분리하고 원심 분리 후에 고체를 35℃의 진공 오븐에 넣어 하룻밤 건조하여 건조 샘플을 얻고 XRPD 측정을 실시하였다.
표 2: 식(I) 화합물의 결정 A의 제조
번호 용매 또는 용매 혼합물 부피 상태 결정
1 메탄올 1mL 현탁액 결정A
2 에탄올 1mL 현탁액 결정A
3 아세트산 에틸 1mL 현탁액 결정A
4 아세토니트릴 1mL 현탁액 결정A
5 아세톤 1mL 현탁액 결정A
6 테트라히드로푸란 1mL 현탁액 결정A
7 물 1mL 현탁액 결정A
8 메탄올:물=3:1(V:V) 1mL 현탁액 결정A
9 에탄올:물=1:1(V:V) 1mL 현탁액 결정A
10 아세톤:물=1:1(V:V) 1mL 현탁액 결정A
실험예 1: 식(I) 화합물의 결정 A의 흡습성 시험
실험 조건:
장치 모형: SMSDVS Advantage 동적 가스 흡착 장치(DVS).
시험 조건: 식(I) 화합물의 결정 A(10~15mg)를 DVS 샘플 팬에 넣고 시험을 실시하였다.
DVS 파라미터는 다음과 같다.
온도: 25℃.
평형: dm/dt=0.01%/min(최단 10min, 최장 180min).
건조: 0% RH하에 120min 건조.
RH(%) 측정 구배: 10%.
RH(%) 측정 구배 범위: 0%~90%~0%.
흡습성 평가 기준은 표 3을 참조한다.
표 3: 흡습성 평가 기준
흡습성 분류 흡습으로 인한 중량 증가*
조해 충분한 물 흡수로 액체 생성
매우 흡습성이 있음 흡습으로 인한 중량 증가가 15% 이상
흡습성이 있음 흡습으로 인한 중량 증가가 2% 이상 15% 미만
약간 흡습성이 있음 흡습으로 인한 중량 증가가 0.2% 이상 2% 미만
흡습성이 없거나 거의 없음 흡습으로 인한 중량 증가가 0.2% 미만
주: *25℃/80% RH하에서 흡습으로 인한 중량 증가.
실험 결과: 식(I) 화합물의 결정 A의 25℃에서 80% RH하에서 흡습으로 인한 중량 증가는 0.72%였다.
실험 결론: 식(I) 화합물의 결정 A는 다소 흡습성이 있고 보존하기 쉬우며 조해(潮解, deliquescence), 변형, 곰팡이 등이 발생하기 어렵기 때문에 약물로서 가치가 높다.
실험예 2: 식(I) 화합물의 결정 A의 안정성 시험
실험 방법:
영향 인자 실험: 식(I) 화합물의 결정 A를 12부 칭량하여 각 1.50g이었고, 각 조건에서 3부를 사용하여 조사하였다. 각 샘플을 개방한 계량 병에 넣고 고온에서 상이한 조건으로 설정한 데시케이터(desiccator)에 넣은 다음, 대응하는 안정화 박스에 넣고 검토하였다. 고습도 조건에 대해서는 해당하는 조건의 안정화 박스에 넣고 검토하였다.
광 안정성 실험: 식(I) 화합물의 결정 A를 4부 칭량하여 각 1.50g이었고, 2부는 광 조사 샘플(한 쪽은 5일간 광 조사 샘플, 다른 쪽은 10일간 광 조사 샘플)로 하고, 나머지 2부는 대조 샘플(한 쪽은 5일간 대조 샘플, 다른 쪽은 10일간 대조 샘플)로 하여 광 조사 샘플을 깨끗한 계량 병에 넣고, 단층으로 해서 깔고 위가 덮이지 않도록 투명한 뚜껑을 하여 광 조사 박스에 넣어 광 조사를 하였다. 대조 샘플의 포장 방법은 광 조사 샘플과 일치하였고, 다만 계량 병의 바깥쪽을 알루미늄 필름으로 덮었다.
장기 가속 실험: 식(I) 화합물의 결정 A를 22부 칭량하여 각 1.50g이었다. 각 샘플을 각각 2층 LDPE 백에 넣고 각 층의 LDPE 백을 각각 버클로 밀봉하여 알루미늄 호일 백에 넣고 히트 실링(heat sealing)하였다. 검출 시점에, 대응하는 시험 샘플을 꺼내 뚜껑을 닫고 0일 샘플을 냉장고에서 꺼내 샘플이 실온으로 돌아오면 분석하였다. 약 10mg의 시료를 이용해서 XRPD를 측정하였다. 화합물을 하기 조건으로 정치하고 다른 시점에 샘플을 채취하여 성상, XRPD, 함유량 및 관련 물질을 검출하였다. 시험 조건 및 검출 항목은 표 4, 표 5를 참조한다.
표 4: 영향 인자에 따른 안정성 및 광 안정성 시험에서 결정 A 및 관련 물질의 함유량 검출 결과
시험 조건 결정 A 함유량(%) 불순물 함유량(%)
0일 98.2 1.19
60℃-5일 99 1.16
60℃-10일 98.2 1.14
60℃-30일 99.1 1.19
25℃-92.5%RH-5일 99.1 1.16
25℃-92.5%RH-10일 98.8 1.13
25℃-92.5%RH-30일 99.2 1.19
광 조사 5일 97.8 1.12
광 조사 10일 99.3 1.13
표 5: 가속 안정성 시험에서 결정 A 및 관련 물질의 함유량 검출 결과
시험 조건 결정 A 함유량(%) 불순물 함유량(%)
0일 98.2 1.19
40℃-75%RH-1월 99.3 1.2
40℃-75%RH-2월 98.1 1.19
40℃-75%RH-3월 97.8 1.13
40℃-75%RH-6월 98.5 1.12
25℃-60%RH-3월 98 1.16
25℃-60%RH-6월 99.5 1.12
25℃-60%RH-9월 98.2 1.22
25℃-60%RH-12월 100.2 1.09
실험 결론:
XRPD 측정 결과를 통해 식(I) 화합물의 결정 A가 0일과 변함이 없고 다양한 시험 조건에서 식(I) 화합물의 결정 A가 안정적임이 나타났다.
실험예 3: cIAP1 BIR3과 XIAP BIR3의 결합 실험
실험 재료:
시험 완충계(cIAP1 BIR3 또는 XIAP BIR3 버퍼): 0.1mol/L 인산 칼륨, pH 7.5, 0.1% 소 혈청 알부민, 0.005% 트리톤 X-100, 1% 디메틸술폭시드.
프로브: ARPFAQ-K(5-FAM)-NH2.
목표:
cIAP1-BIR3-his: RBC(카탈로그 번호 APT-11-370), 인간 cIAP1의 BIR3 도메인(아미노산 258~363을 포함하는 cIAP1 BIR3)을 GST-융합 단백질로 해서 대장균(E.coli)으로부터 발현 및 정제하였다.
XIAP-BIR3-his: RBC(카탈로그 번호 APT-11-374), XIAP의 BIR3 도메인(아미노산 255~356을 포함하는 XIAP BIR3)을 GST-융합 단백질로 해서 대장균(E.coli)으로부터 발현 및 정제하였다.
반응 조건: 5nM의 ARPFAQ-K(5-FAM)-NH2, 20nM의 cIAP1 BIR3, 30nM의 XIAP BIR3.
실험 단계:
먼저 cIAP1 BIR3 또는 XIAP BIR3 버퍼를 사용 전에 조제하여 2배의 cIAP1 BIR3 또는 XIAP BIR3 용액을 첨가하고, 또한 음향학적 방법으로 100% DMSO에서 용해한 피험 화합물을 cIAP1 BIR3 또는 XIAP BIR3 버퍼에 첨가하였다. 그 후, 2배의 프로브를 첨가하고 실온하에 어두운 곳에서 혼합하여 60분간 인큐베이팅하고 형광 편광을 측정하여 mP 값을 계산하고 마지막으로 IC50 값을 얻었다.
실험 결과: 표 6과 같다.
실험 결론:
본원의 식(I) 화합물은 양호한 cIAP1 BIR3 결합 활성을 나타내고, 게다가 cIAP1 및 XIAP에 양호한 선택성을 나타낸다.
실험예 4: 인비트로 세포 활성 시험
실험 재료:
RPMI 1640 배지(Invitrogen-22400089), 소 태아 혈청(Invitrogen-10099141), 트립신(Trypsin), 0.05% EDTA·4Na(Invitrogen-25300062), 발광법 세포 생존율 검출 키트(Promega-G7573), 둘베코 인산 버퍼(HyClone-SH30028.01B), 384 웰 플레이트(Corning-6007680). Envision 멀티 라벨 애널라이저.
실험 방법:
1. 384 마이크로 웰 플레이트의 웰에 250개의 MDA-MB-231 세포를 포함한 30μL의 MDA-MB-231 세포 현탁액을 첨가하였다.
2. 20μL의 피험 화합물(피험 화합물의 최고 농도가 10μM이고 피험 화합물을 5배로 구배 희석하여 각 화합물을 10개의 농도 구배로 희석함)을 첨가하고, 그 후, 세포 배양 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터에 돌려보내서 7일간 배양하였다.
3. 세포 배양 플레이트를 실온에서 수평으로 30분간 정치하였다.
4. 세포 배양 플레이트의 각 웰에 20μL의 Promega CellTiter-Glo 시약을 첨가하였다.
5. 10분 후 Envision 멀티 라벨 애널라이저로 판독하였다.
실험 결과: 표 6 참조.
실험 결론:
본원의 식(I) 화합물은 양호한 MDA-MB-231 세포 항증식 활성을 가진다.
시험 화합물 cIAP1 BIR3의 IC50(nM) XIAP BIR3의 IC50(nM) MDA-MB-231 Cell의 IC50(nM)
식(I) 화합물 5.0 29.9 54.8
실험예 5: 인비보 약효 연구 1
MDA-MB-231 삼중 음성 유방암 환자에게서 인간 유래 종양 세포주를 피하 이식 받은 이종 이식(CDX) BALB/c 누드 마우스에 대하여 인비보 약효 실험을 실시하였다.
실험 절차:
암컷 6~8주령이고 체중이 약 18~22g인 BALB/c 누드 마우스를 병원체가 없는 특수한 환경에서 환기 케이지에 유지하였다(1케이지당 3마리). 모든 케이지, 바닥 매트 및 물은 사용 전에 소독하였다. 모든 동물은 인증 받은 표준적인 실험동물용 사료를 자유롭게 섭취할 수 있다. 상하이 BK 실험동물 유한공사(Shanghai BK Laboratory Animal Co., LTD)에서 총 48마리의 마우스를 구입하여 실험에 사용하였다. 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 종양 세포(0.2mL의 인산염 버퍼 중 10×106개)를 피하 이식하여 종양을 증식시켰다. 평균 종양 부피가 약 147mm3이 되면 투여를 시작하였다. 시험 화합물을 매일 경구 투여하였고 투여 용량은 30mg/kg이었다. 3일마다 이차원 측정기 캘리퍼스로 종양 부피를 측정하였고 부피 단위는 mm3이며, 식: V=0.5a×b2로 계산하였고 식에서 a는 종양의 긴 지름, b는 짧은 지름이었다. 항종양 효과는 화합물로 처리한 동물의 평균 종양 증가 부피를 미처리 동물의 평균 종양 증가 부피로 나누어서 판정하였다.
실험 결과: 표 7 참조.
실험 결론:
MDA-MB-231 삼중 음성 유방암 CDX 인비보 약효 모델에서 본원의 식(I) 화합물은 양호한 약효를 나타낸다.
화합물 투여 용량
(mg/kg)		 종양 부피(mm3)
0일 6일 13일 20일
블랭크 대조 0 148 475 1225 1750
식(I) 화합물 30 147 214 282 810
실험예 6: 인비보 약효 연구 2
MDA-MB-231 삼중 음성 유방암 환자에게서 인간 유래 종양 세포주를 피하 이식 받은 이종 이식(CDX) BALB/c 누드 마우스에 대하여 인비보 약효 실험을 실시하였다.
실험 절차:
암컷 6~8주령이고 체중이 약 18~22g인 BALB/c 누드 마우스를 병원체가 없는 특수한 환경에서 환기 케이지에 유지하였다(1케이지당 3마리). 모든 케이지, 바닥 매트 및 물은 사용 전에 소독하였다. 모든 동물은 인증 받은 표준적인 실험동물용 사료를 자유롭게 섭취할 수 있다. 상하이 BK 실험동물 유한공사(Shanghai BK Laboratory Animal Co., LTD)에서 총 48마리의 마우스를 구입하여 실험에 사용하였다. 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 종양 세포(0.2mL의 인산염 버퍼 중 10×106개)를 피하 이식하여 종양을 증식시켰다. 평균 종양 부피가 약 110mm3이 되면 투여를 시작하였다. 시험 화합물을 매일 경구 투여하였고 투여 용량은 30mg/kg이었다. 3일마다 이차원 측정기 캘리퍼스로 종양 부피를 측정하였고 부피 단위는 mm3이며, 식: V=0.5a×b2로 계산하였고 식에서 a는 종양의 긴 지름, b는 짧은 지름이었다. 항종양 효과는 화합물로 처리한 동물의 평균 종양 증가 부피를 미처리 동물의 평균 종양 증가 부피로 나누어서 판정하였다.
실험 결과: 표 8 참조.
실험 결론:
MDA-MB-231 삼중 음성 유방암 CDX 인비보 약효 모델에서 본원의 식(I) 화합물은 양호한 약효를 나타낸다.
화합물 투여 용량
(mg/kg)		 종양 부피(mm3)
0일 5일 12일 20일
블랭크 대조 0 110 261 526 772
식(I) 화합물 30 110 111 86 177

Claims (11)

  1. 식(I) 화합물의 결정.
    [화학식 1]
    Figure pct00004
  2. 청구항 1에 있어서,
    식(I) 화합물의 결정 A로서, CuKα선을 사용하는 X선 분말 회절 패턴은 2θ 각도 12.1°±0.200°, 16.1°±0.200°, 18.5°±0.200°, 20.2°±0.200°, 21.3°±0.200°및 23.0°±0.200°에 특징적인 회절 피크를 갖는 결정.
  3. 청구항 2에 있어서,
    CuKα선을 사용하는 X선 분말 회절 패턴은 2θ 각도 12.1°±0.200°, 16.1°±0.200°, 18.5°±0.200°, 18.8°±0.200°, 19.2°±0.200°, 19.8°±0.200°, 20.2°±0.200°, 21.3°±0.200°, 23.0°±0.200°, 26.6°±0.200°및 27.4°±0.200°에 특징적인 회절 피크를 갖는 식(I) 화합물의 결정 A.
  4. 청구항 3에 있어서,
    CuKα선을 사용하는 X선 분말 회절 패턴은 2θ 각도 7.0°±0.200°, 8.7°±0.200°, 12.1°±0.200°, 13.2°±0.200°, 13.9°±0.200°, 16.1°±0.200°, 16.7°±0.200°, 18.5°±0.200°, 18.8°±0.200°, 19.2°±0.200°, 19.8°±0.200°, 20.2°±0.200°, 21.0°±0.200°, 21.3°±0.200°, 23.0°±0.200°, 24.3°±0.200°, 25.3°±0.200°, 26.6°±0.200°및 27.4°±0.200°에 특징적인 회절 피크를 갖는 식(I) 화합물의 결정 A.
  5. 청구항 4에 있어서,
    CuKα선을 사용하는 X선 분말 회절 패턴은 2θ 각도 7.0°±0.200°, 8.7°±0.200°, 12.1°±0.200°, 13.2°±0.200°, 13.9°±0.200°, 16.1°±0.200°, 16.5°±0.200°, 16.7°±0.200°, 18.5°±0.200°, 18.8°±0.200°, 19.2°±0.200°, 19.8°±0.200°, 20.2°±0.200°, 21.0°±0.200°, 21.3°±0.200°, 23.0°±0.200°, 23.2°±0.200°, 24.3°±0.200°, 25.3°±0.200°, 26.6°±0.200°, 26.9°±0.200°, 27.4°±0.200°및 29.4°±0.200°에 특징적인 회절 피크를 갖는 식(I) 화합물의 결정 A.
  6. 청구항 5에 있어서,
    CuKα선을 사용하는 X선 분말 회절 패턴은 2θ 각도 7.0°±0.200°, 8.7°±0.200°, 9.7°±0.200°, 10.6°±0.200°, 11.4°±0.200°, 12.1°±0.200°, 13.2°±0.200°, 13.9°±0.200°, 16.1°±0.200°, 16.5°±0.200°, 16.7°±0.200°, 17.5°±0.200°, 18.5°±0.200°, 18.8°±0.200°, 19.2°±0.200°, 19.5°±0.200°, 19.8°±0.200°, 20.2°±0.200°, 21.0°±0.200°, 21.3°±0.200°, 22.5°±0.200°, 23.0°±0.200°, 23.2°±0.200°, 23.8°±0.200°, 24.3°±0.200°, 24.6°±0.200°, 25.3°±0.200°, 25.8°±0.200°, 26.6°±0.200°, 26.9°±0.200°, 27.4°±0.200°, 28.1°±0.200°, 29.1°±0.200°, 29.4°±0.200°, 30.1°±0.200°, 30.6°±0.200°, 30.8°±0.200°, 31.3°±0.200°, 31.8°±0.200°, 32.2°±0.200°, 32.8°±0.200°, 33.7°±0.200°, 34.0°±0.200°, 34.8°±0.200°, 35.5°±0.200°, 36.6°±0.200°, 37.6°±0.200°, 38.6°±0.200°및 39.6°±0.200°에 특징적인 회절 피크를 갖는 식(I) 화합물의 결정 A.
  7. 청구항 2 내지 6 중 어느 한 항에 있어서,
    시차 주사 열량 측정 결과도에서는 흡수 피크의 피크값이 202.5℃에 있는 식(I) 화합물의 결정 A.
  8. 청구항 2 내지 6 중 어느 한 항에 있어서,
    시차 주사 열량 측정 결과도에서는 흡수 피크의 시작 위치가 약 200.8℃에 있는 식(I) 화합물의 결정 A.
  9. 청구항 1에 기재된 식(I) 화합물 결정이 결정 조성물 중량의 50% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상을 차지하는 결정 조성물.
  10. 청구항 1에 기재된 식(I) 화합물의 결정 또는 청구항 9에 기재된 결정 조성물을 포함하는 의약 조성물.
  11. cIAP1 억제에 관련된 암 치료 약물을 제조하기 위한, 청구항 1에 기재된 식(I) 화합물 결정, 청구항 9에 기재된 결정 조성물, 또는 청구항 10에 기재된 의약 조성물의 용도.
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