KR20210142678A - 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 그의 용도 Download PDF

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아바크 카베지안
니콜라스 맥카트니 플루기스
보어 알렉산드라 소피 데
캐서린 시푸엔테스-로자스
기영 백
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Abstract

본 발명은 일반적으로 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 약제학적 조성물, 및 그의 제조 및 용도에 관한 것이다.

Description

변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 그의 용도
상호 참조
본 출원은 2019년 3월 25일자 출원된 미국 가출원 제62/823,573호의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 참조로 포함된다.
특정 원형 폴리리보뉴클레오티드는 건강한 개체의 조직 및 세포를 포함하는 인간 조직 및 세포에 편재한다.
본 개시내용은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제 및 인접 미변형 뉴클레오티드의 제1 부분을 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 폴리리보뉴클레오티드 및 연속 미변형 뉴클레오티드의 제1 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체에게 전달된다.
본 개시내용은 하기를 포함하는 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 면역원성의 감소 또는 저하 방법을 제공한다: 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및 5% 이하의 변형된 뉴클레오티드를 갖는 적어도 약 5개 내지 1000개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함하는 단계; 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계; 및 대상체의 세포 또는 조직에서 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대해 감소된 면역원성을 수득하는 단계. 일부 실시형태에서, 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 면역원성의 저하 또는 감소 방법은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 폴리리보뉴클레오티드 및 인접 미변형 뉴클레오티드의 제1 부분을 포함하는 단계, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계, 및 대상체의 세포 또는 조직에서 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대해 저하된 또는 감소된 면역원성을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 IRES를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 적어도 약 5개 내지 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 5’-메틸시티딘 슈도우리딘 또는 N1-메틸-슈도우리딘을 결여한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들 중 5% 이하가 미변형 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 IRES의 뉴클레오티드들 중 5% 이하가 미변형 뉴클레오티드이다.
본 개시내용은 하기를 포함하는 대상체에서의 하나 이상의 발현 서열의 발현 방법을 제공한다: 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및 5% 이하의 변형된 뉴클레오티드를 갖는 적어도 약 5개 내지 1000개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함하는 단계; 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계, 및 대상체의 세포 또는 조직에서 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물 내의 하나 이상의 발현 서열의 발현에 비하여 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현을 수득하는 단계. 일부 실시형태에서, 대상체에서의 하나 이상의 발현 서열의 발현 방법은 적어도 하나의 변형된 폴리리보뉴클레오티드, 인접 미변형 뉴클레오티드의 제1 부분, 및 하나 이상의 발현 서열을 포함하는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계, 및 대상체의 세포 또는 조직에서 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물 내의 하나 이상의 발현 서열의 발현에 비하여 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 IRES를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 적어도 약 5개 내지 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 5’-메틸시티딘, 슈도우리딘 또는 N1-메틸-슈도우리딘을 결여한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들 중 5% 이하가 미변형 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 IRES의 뉴클레오티드들 중 5% 이하가 미변형 뉴클레오티드이다.
본 개시내용은 하기를 포함하는 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성의 증가 방법을 제공한다: 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및 5% 이하의 변형된 뉴클레오티드를 갖는 적어도 약 5개 내지 1000개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함하는 단계; 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계, 및 대상체의 세포 또는 조직에서 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대해 증가된 안정성을 수득하는 단계. 일부 실시형태에서, 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성의 증가 방법은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 폴리리보뉴클레오티드 및 인접 미변형 뉴클레오티드의 제1 부분을 포함하는 단계, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계, 및 대상체의 세포 또는 조직에서 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대해 증가된 안정성을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 IRES를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 적어도 약 5개 내지 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 5’-메틸시티딘, 슈도우리딘 또는 또는 N1-메틸-슈도우리딘을 결여한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들 중 5% 이하가 미변형 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 IRES의 뉴클레오티드들 중 5% 이하가 미변형 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 면역원성의 감소 방법은 하기를 포함한다: 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및 적어도 약 5개 내지 1000개의 인접 미변형 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함하는 단계; 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계; 및 대상체의 세포 또는 조직에서 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대해 감소된 면역원성을 수득하는 단계.
일부 양태에서, 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 면역원성의 저하 방법은 하기를 포함한다: 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및 적어도 약 5개 내지 1000개의 인접 미변형 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함하는 단계; 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계; 및 대상체의 세포 또는 조직에서 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대해 감소된 면역원성을 수득하는 단계.
일부 실시형태에서, 제1 부분은 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 5’-메틸시티딘 또는 슈도우리딘을 결여한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들 중 5% 이하가 미변형 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 번역 적격성이다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 RIG-I, TLR-3, TLR-7, TLR-8, MDA-5, LGP-2, OAS, OASL, PKR 및 IFN-베타 중 적어도 하나의 발현 또는 신호전달 또는 활성화에 의해 평가하여: a) 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배 또는 3배 더 큰 발현을 갖거나; b) 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배 또는 10.0배 더 큰 반감기를 갖거나; c) 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 더 큰 반감기를 갖거나; 또는 d) 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배 또는 10.0배 더 낮은 면역원성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: a) N(6)메틸아데노신(m6A), 5’-메틸시티딘 및 슈도우리딘; b) 2’-O-메틸, 2’-O-메톡시에틸(2’-O-MOE), 2’-O-아미노프로필, 2’-데옥시, T-데옥시-2’-플루오로, 2’-O-아미노프로필(2’-O-AP), 2’-O-디메틸아미노에틸(2’-O-DMAOE), 2’-O-디메틸아미노프로필(2’-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2’-O-DMAEOE), 2’-O-N-메틸아세트아미도(2’-O-NMA), 잠금(locked) 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩티드 핵산(PNA), 1’,5’-언하이드로헥시톨 핵산(HNA), 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드 및 2’-플루오로 N3-P5’-포스포르아미디트; 또는 c) 표 2로부터의 임의의 변형된 뉴클레오티드. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 변형 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 단백질, 펩티드, 생체분자, DNA, RNA, 또는 세포 표적에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 IRES를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열은 하기를 갖는다: a) 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물보다 더 큰 번역 효율; b) 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물보다 적어도 약 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배 또는 3배 더 큰 번역 효율; c) 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 더 큰 번역 효율; 또는 d) 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배 또는 3배 더 큰 번역 효율.
일부 양태에서, 대상체에서의 하나 이상의 발현 서열의 발현 방법은 하기를 포함한다: 하나 이상의 발현 서열을 포함하는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개 또는 1000개의 인접 미변형 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함하는 단계; 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계; 및 대상체의 세포 또는 조직에서 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물 내의 대응하는 하나 이상의 발현 서열의 발현에 비하여 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현을 수득하는 단계.
일부 양태에서, 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성의 증가 방법은 하기를 포함한다: 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 및 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개 또는 1000개의 인접 미변형 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함하는 단계; 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계; 및 대상체의 세포 또는 조직에서 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대해 증가된 안정성을 수득하는 단계.
일부 실시형태에서, 제1 부분은 IRES를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제 및 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드 및 제1 부분을 포함하며 제1 부분은 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 본 양태의 특정 실시형태에서, 제1 부분은 5% 이하의 변형 뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제 및 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및 제1 부분을 포함하며, 제1 부분은 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개 또는 1000개의 인접 뉴클레오티드를 포함하며, 제1 부분은 5’-메틸시티딘 또는 슈도우리딘을 결여한다. 본 양태의 특정 실시형태에서, 제1 부분은 5% 이하의 변형 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 양태에서, 약제학적 조성물은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드; 제1 표적, 예를 들어, RNA, DNA, 단백질 또는 세포 표적의 제1 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제1 결합 부위를 포함하는 제1 부분을 포함하며, 제1 결합 모이어티는 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드(circRNA)-결합 모티프이며; 제1 표적 및 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 복합체를 형성한다.
일부 양태에서, 약제학적 조성물은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드; 제1 표적, 예를 들어, RNA, DNA, 단백질 또는 세포 표적의 제1 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제1 결합 부위를 포함하는 제1 부분으로서, 제1 결합 모이어티가 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드(circRNA)-결합 모티프인 제1 부분; 및 제2 표적의 제2 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제2 결합 부위로서, 제2 결합 모이어티가 제2 circRNA-결합 모티프인 제2 결합 부위를 포함하며, 제1 결합 모이어티는 제2 결합 모이어티와 상이하며, 제1 표적, 제2 표적 및 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 복합체를 형성하며, 제1 표적 또는 제2 표적은 마이크로RNA가 아니다.
일부 양태에서, 약제학적 조성물은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드; 제1 표적의 제1 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제1 결합 부위를 포함하는 제1 부분으로서, 제1 결합 모이어티가 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드(circRNA)-결합 모티프인 제1 부분; 및 제2 표적의 제2 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제2 결합 부위로서, 제2 결합 모이어티가 제2 circRNA-결합 모티프인 제2 결합 부위를 포함하며, 제1 결합 모이어티는 제2 결합 모이어티와 상이하며, 제1 표적 및 제2 표적은 둘 모두 마이크로RNA이다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 낮은 면역원성을 가진다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 높은 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비해 큰 반감기를 가진다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 RIG-I, TLR-3, TLR-7, TLR-8, MDA-5, LGP-2, OAS, OASL, PKR, 및 IFN-베타 중 적어도 하나의 발현 또는 신호전달 또는 활성화에 의해 평가시, 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 낮은 면역원성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비해 큰 반감기를 가진다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: N(6)메틸아데노신(m6A), 5’-메틸시티딘 및 슈도우리딘. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 변형된 핵산은 2’-O-메틸, 2’-O-메톡시에틸(2’-O-MOE), 2’-O-아미노프로필, 2’-데옥시, T-데옥시-2’-플루오로, 2’-O-아미노프로필(2’-O-AP), 2’-O-디메틸아미노에틸(2’-O-DMAOE), 2’-O-디메틸아미노프로필(2’-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2’-O-DMAEOE), 2’-O-N-메틸아세트아미도(2’-O-NMA), 잠금 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩티드 핵산(PNA), 1’,5’-언하이드로헥시톨 핵산(HNA), 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드 및 2’-플루오로 N3-P5’-포스포르아미디트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 변형 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 펩티드, 단백질, 생체분자, DNA, RNA, 또는 세포 표적에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 IRES를 포함한다. 특정 실시형태에서, IRES는 5% 이하의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열 및 IRES를 포함하며, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 IRES의 외측에 5’-메틸시티딘, 슈도우리딘 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열은 대응하는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비해 보다 높은 번역 효율을 가진다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열은 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물보다 적어도 약 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 또는 3배 높은 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물은 제1 부분의 외측에 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및 제1 부분 내에 5% 초과의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열은 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비해 보다 높은 번역 효율을 가진다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열은 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 또는 3배 높은 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열은 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물에 비해 보다 높은 번역 효율을 가진다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열은 10%초과의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 갖는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 높은 번역 효율을 가진다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열은 100% 변형된 슈도우리딘 또는 5'메틸시토신을 포함하는 제1 부분을 갖는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 높은 번역 효율을 가진다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열은 변형 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 갖는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물보다 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 높은 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 번역 효율은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물을 포함하는 세포에서, 또는 시험관내 번역 시스템(예를 들어, 토끼 망상적혈구 용해물)에서 측정된다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 회전환 번역에 적격성이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 서열의 각각은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 상의 스태거 요소에 의해 후속 발현 서열로부터 분리되며, 하나 이상의 발현 서열의 회전환 번역은 적어도 2개의 폴리펩티드 분자를 생성한다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 에탄올이다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 (a) 단일의 발현 서열의 2 라운드의 번역으로부터의 또는 (b) 둘 이상의 발현 서열의 1 라운드 이상의 번역으로부터의 단일 폴리펩티드의 생성을 방지한다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 하나 이상의 발현 서열로부터 분리된 서열이다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 하나 이상의 발현 서열 중 하나의 발현 서열의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 회전환 번역에 적격성이며, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 회전환 번역 동안 생성되는 총 폴리펩티드의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%(몰/몰)가 불연속 폴리펩티드이도록 구성되며, 불연속 폴리펩티드의 각각은 하나 이상의 발현 서열의 단일 라운드의 번역 또는 단일 라운드 미만의 번역으로부터 생성된다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 회전환 번역 동안 생성되는 총 폴리펩티드의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%(몰/몰)가 불연속 폴리펩티드이도록 구성되며, 총 폴리펩티드에 비한 불연속 생성물의 양의 비는 시험관내 번역 시스템에서 시험된다. 일부 실시형태에서, 시험관내 번역 시스템은 토끼 망상적혈구 용해물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 하나 이상의 발현 서열 중 적어도 하나의 3' 말단에 존재하며, 스태거 요소는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 회전환 번역 동안 리보솜을 고착시키도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 2A 서열 및 2A-유사 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드 서열을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 GP인 C-말단 서열을 갖는 서열을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 D(V/I)ExNPGP인 C-말단 공통 서열을 갖는 서열을 인코딩하며, x는 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 GDVESNPGP, GDIEENPGP, VEPNPGP, IETNPGP, GDIESNPGP, GDVELNPGP, GDIETNPGP, GDVENPGP, GDVEENPGP, GDVEQNPGP, IESNPGP, GDIELNPGP, HDIETNPGP, HDVETNPGP, HDVEMNPGP, GDMESNPGP, GDVETNPGP, GDIEQNPGP 및 DSEFNPGP로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 하나 이상의 발현 서열의 각각의 3' 말단에 존재한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열의 스태거 요소는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열에 후속하는 발현 서열의 제1 번역 개시 서열의 업스트림(그에 대해 5')에 존재하며, 스태거 요소와 제1 번역 개시 서열 사이의 거리는 제1 발현 서열과 후속 발현 서열의 연속 번역을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열의 스태거 요소는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현에 후속하는 발현 서열의 제1 번역 개시 서열의 업스트림(그에 대해 5')에 존재하며, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 연속 번역되며, 상응하는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제2 발현 서열의 제2 번역 개시 서열의 업스트림에 제2 스태거 요소를 포함하는 하이브리드 변형된 상응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 연속 번역되지 않으며, 상응하는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제2 스태거 요소는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 스태거 요소와 제1 번역 개시 사이의 거리보다 제2 번역 개시 서열로부터, 예를 들어 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 그보다 더 먼 거리에 존재한다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소와 제1 번역 개시 사이의 거리는 적어도 2개 뉴클레오티드, 3개 뉴클레오티드, 4개 뉴클레오티드, 5개 뉴클레오티드, 6개 뉴클레오티드, 7개 뉴클레오티드, 8개 뉴클레오티드, 9개 뉴클레오티드, 10개 뉴클레오티드, 11개 뉴클레오티드, 12개 뉴클레오티드, 13개 뉴클레오티드, 14개 뉴클레오티드, 15개 뉴클레오티드, 16개 뉴클레오티드, 17개 뉴클레오티드, 18개 뉴클레오티드, 19개 뉴클레오티드, 20개 뉴클레오티드, 25개 뉴클레오티드, 30개 뉴클레오티드, 35개 뉴클레오티드, 40개 뉴클레오티드, 45개 뉴클레오티드, 50개 뉴클레오티드, 55개 뉴클레오티드, 60개 뉴클레오티드, 65개 뉴클레오티드, 70개 뉴클레오티드, 75개 뉴클레오티드 또는 그 초과이다. 일부 실시형태에서, 태거 요소와 제2 번역 개시 사이의 거리는 제1 스태거 요소와 제1 번역 개시 사이의 거리보다 적어도 2개 뉴클레오티드, 3개 뉴클레오티드, 4개 뉴클레오티드, 5개 뉴클레오티드, 6개 뉴클레오티드, 7개 뉴클레오티드, 8개 뉴클레오티드, 9개 뉴클레오티드, 10개 뉴클레오티드, 11개 뉴클레오티드, 12개 뉴클레오티드, 13개 뉴클레오티드, 14개 뉴클레오티드, 15개 뉴클레오티드, 16개 뉴클레오티드, 17개 뉴클레오티드, 18개 뉴클레오티드, 19개 뉴클레오티드, 20개 뉴클레오티드, 25개 뉴클레오티드, 30개 뉴클레오티드, 35개 뉴클레오티드, 40개 뉴클레오티드, 45개 뉴클레오티드, 50개 뉴클레오티드, 55개 뉴클레오티드, 60개 뉴클레오티드, 65개 뉴클레오티드, 70개 뉴클레오티드, 75개 뉴클레오티드 또는 그를 초과하여 더 멀다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 상의 제1 발현 서열에 후속하는 발현 서열은 제1 발현 서열 이외의 발현 서열이다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 상의 제1 발현 서열의 후속 발현 서열은 제1 발현 서열이다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 구조적 요소를 포함한다: a) 엔크립토겐; b) 스태거 요소; c) 조절 요소; d) 복제 요소; 및 f) 준-이중-가닥 이차 구조. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 a) 선형 대응물보다 더 큰 번역 효율; b) 다수의 번역 생성물의 화학량론적 번역 효율; c) 엔크립토겐을 결여한 대응물보다 더 적은 면역원성; d) 선형 대응물에 비하여 증가된 반감기; 및 e) 세포 분열 동안의 지속성으로부터 선택되는 적어도 하나의 기능적 특징을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 선형 대응물보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배 또는 적어도 100배 더 큰 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 선형 대응물보다 적어도 5배 더 큰 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 a) 5'-UTR; b) 3'-UTR; c) 폴리-A 서열; d) 5'-캡; e) 종결 요소; f) 엑소뉴클레아제에 의한 분해 감수성 및 g) 캡-결합 단백질로의 결합 중 적어도 하나를 결여한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 서열은 코작(Kozak) 개시 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 준-나선 구조는 적어도 하나의 비-이중-가닥 세그먼트를 갖는 적어도 하나의 이중-가닥 RNA 세그먼트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 준-나선 구조는 반복 서열, 예를 들어, A-풍부 서열과 연결된 제1 서열 및 제2 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 엔크립토겐은 스플라이싱 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 엔크립토겐은 단백질 결합 부위, 예를 들어, 리보뉴클레오티드 결합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 엔크립토겐은 예를 들어, 면역 반응, 예를 들어, CTL 반응을 회피하기 위해 면역단백질 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, RIG-I, TLR-3, TLR-7, TLR-8, MDA-5, LGP-2, OAS, OASL, PKR, 및 IFN-베타 중 적어도 하나의 발현 또는 신호전달 또는 활성화에 의해 평가시 엔크립토겐을 결여한 대응물보다 적어도 2배 더 적은 면역원성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 리보스위치(riboswitch)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 압타자임(aptazyme)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 비-정규 번역 개시 서열, 예를 들어, GUG, CUG 출발 코돈, 예를 들어, 스트레스 조건 하에서 발현을 개시하는 번역 개시 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 서열은 펩티드를 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 조절 핵산, 예를 들어, 비-코딩 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 약 20개 염기 내지 약 20 kb 범위의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 선형 폴리리보뉴클레오티드의 원형화를 통해 합성된다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 복수의 발현 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 분해, 예를 들어, 엑소뉴클레아제에 대해 실질적으로 저항성이다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 제1 표적, 예를 들어, RNA, DNA, 단백질, 세포의 막 등의 제1 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제1 결합 부위로서, 제1 결합 모이어티가 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드(circRNA)-결합 모티프인 제1 결합 부위; 및 제2 표적의 제2 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제2 결합 부위로서, 제2 결합 모이어티가 제2 circRNA-결합 모티프인 제2 결합 부위를 포함하는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 제1 결합 모이어티는 제2 결합 모이어티와 상이하며, 제1 표적, 제2 표적 및 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 복합체를 형성하며, 제1 표적 또는 제2 표적은 마이크로RNA가 아니다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 제1 표적의 제1 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제1 결합 부위로서, 제1 결합 모이어티가 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드(circRNA)-결합 모티프인 제1 결합 부위; 및 제2 표적의 제2 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제2 결합 부위로서, 제2 결합 모이어티가 제2 circRNA-결합 모티프인 제2 결합 부위를 포함하는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 제1 결합 모이어티는 제2 결합 모이어티와 상이하며, 제1 표적 및 제2 표적은 둘 모두 마이크로RNA이다.
일부 실시형태에서, 제1 및 제2 표적은 서로 상호작용한다. 일부 실시형태에서, 복합체는 세포 과정을 조절한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 표적은 동일하며, 제1 및 제2 결합 부위는 상이한 모이어티에 결합한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 표적은 상이하다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 제3 이상의 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 하나 이상의 추가의 결합 부위를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 표적은 동일하며, 하나 이상의 결합 부위는 상이한 모이어티에 결합하도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 복합체의 형성은 세포 과정을 조절한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 제1 및 제2 표적과 접촉되는 경우 제1 또는 제2 표적과 연관된 세포 과정을 조절한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 표적은 복합체 내에서 서로 상호작용한다. 일부 실시형태에서, 세포 과정은 질병 또는 질환의 발병과 연관된다. 일부 실시형태에서, 세포 과정은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보핵산의 번역과 상이하다. 일부 실시형태에서, 세포 과정은 질병 또는 질환의 발병과 연관된다. 일부 실시형태에서, 제1 표적은 데옥시리보핵산(DNA) 분자를 포함하며, 제2 표적은 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복합체는 DNA 분자의 유도된 전사, DNA 분자의 후성유전학적 리모델링 또는 DNA 분자의 분해를 조절한다. 일부 실시형태에서, 제1 표적은 제1 단백질을 포함하며, 제2 표적은 제2 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복합체는 제1 단백질의 분해, 제1 단백질의 전좌 또는 신호 전달을 조절하거나, 고유 단백질 기능을 조절하거나, 제1 단백질과 제2 단백질 사이의 직접적인 상호작용에 의해 형성되는 복합체의 형성을 저해한다. 일부 실시형태에서, 제1 표적은 제1 리보핵산(RNA) 분자를 포함하며, 제2 표적은 제2 RNA 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복합체는 제1 RNA 분자의 분해를 조절한다. 일부 실시형태에서, 제1 표적은 단백질을 포함하며, 제2 표적은 RNA 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복합체는 단백질의 전좌를 조절하거나, 단백질과 RNA 분자 사이의 직접적인 상호작용에 의해 형성되는 복합체의 형성을 저해한다. 일부 실시형태에서, 제1 결합 모이어티는 수용체를 포함하며, 제2 결합 모이어티는 수용체의 기질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복합체는 수용체의 활성화를 저해한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 표적의 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함하며, 결합 모이어티는 리보핵산(RNA)-결합 모티프이며, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 번역 비적격 또는 번역 결함이며, 표적은 마이크로RNA가 아니다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 표적의 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함하며, 결합 모이어티는 리보핵산(RNA)-결합 모티프이며, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 번역 비적격 또는 번역 결함이며, 표적은 마이크로RNA이다. 일부 실시형태에서, 표적은 DNA 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로의 결합 모이어티의 결합은 DNA 분자의 전사의 간섭을 조절한다. 일부 실시형태에서, 표적은 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로의 결합 모이어티의 결합은 단백질과 다른 분자의 상호작용을 저해한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 수용체이며, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로의 제1 결합 모이어티의 결합은 수용체를 활성화시킨다. 일부 실시형태에서, 단백질은 제1 효소이며, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 제2 효소에 결합하도록 구성된 제2 결합 부위를 추가로 포함하며, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로의 제1 및 제2 효소의 결합은 제1 및 제2 효소의 효소 활성을 조절한다. 일부 실시형태에서, 표적은 메신저 RNA(mRNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로의 결합 모이어티의 결합은 mRNA 분자의 번역의 간섭을 조절한다. 일부 실시형태에서, 표적은 리보좀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로의 결합 모이어티의 결합은 번역 과정의 간섭을 조절한다. 일부 실시형태에서, 표적은 원형 RNA 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로의 결합 모이어티의 결합은 원형 RNA 분자를 격리시킨다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로의 결합 모이어티의 결합은 마이크로RNA 분자를 격리시킨다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포 표적의 막 상의 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함하며; 결합 모이어티는 리보핵산(RNA)-결합 모티프이다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 제2 세포 표적 상의 제2 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제2 결합 부위를 추가로 포함하며, 제2 결합 모이어티는 제2 RNA-결합 모티프이다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 두 표적 모두에 결합되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 제2 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제2 결합 부위를 추가로 포함하며, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로의 둘 모두의 표적의 결합은 제1 표적에서 입체형태적 변화를 유도함으로써, 표적의 하류의 신호 전달을 유도한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 담체, 예를 들어, 막 또는 지질 이중층에 제형화된 본원에 기술된 바와 같은 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물을 질병 또는 질환을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 바와 같은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함하는 약제학적 조성물의 생성 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 핵산 서열을 갖는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로서 원형화시키는 단계를 포함하는 본원에 기술된 바와 같은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제조 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 바와 같은 조성물을 포함하는 조작된 세포를 제공한다.
정의
본 발명은 특정 실시형태에 관하여 그리고 특정 도면을 참조하여 기술될 것이지만, 본 발명은 그에 제한되지 않고, 오직 청구범위에 의해서만 제한된다. 하기에 제시된 용어는 다르게 나타내지 않는 한, 일반적으로 그의 일반적인 의미로 이해될 것이다.
용어 "약제학적 조성물"은 또한, 약제학적 조성물 내에 포함된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 치료법에 의해 인간 또는 동물 신체의 치료를 위해 사용될 수 있음을 개시하도록 하고자 한다. 따라서, 이는 "치료법에 사용하기 위한 원형 폴리리보뉴클레오티드"와 등가인 것으로 여겨진다.
본원에 기술된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드, 이러한 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물, 이러한 원형 폴리리보뉴클레오티드의 이용 방법 등은 상이한 요소, 예를 들어, 복제 요소, 발현 서열, 스태거 요소 및 엔크립토겐(예를 들어, 실시예 10 참조) 또는 예를 들어, 발현 서열, 스태거 요소 및 조절 요소(예를 들어, 실시예 32 및 40 참조)를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드 이펙터를 사용하여 어떻게 상이한 기술적 효과(예를 들어, 실시예 10 및 40에서 선형 대응물보다 증가된 번역 효율 및 실시예 40에서 선형 대응물보다 증가된 반감기)를 달성할 수 있는지를 예시한 실시예에 부분적으로 기초한다. 이하의 설명이 실시예에서 고려되는 특정 연구결과 및 조합의 다양한 변이를 고려하는 것은 이들 실시예에 특히 기초한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "circRNA" 또는 "원형 폴리리보뉴클레오티드" 또는 "원형 RNA"는 상호교환 가능하게 사용되며, 자유 말단을 갖지 않는 구조(즉, 자유 3' 및/또는 5' 말단 부재)를 갖는 폴리리보뉴클레오티드 분자, 예를 들어, 공유적 또는 비-공유적 결합을 통해 원형 또는 순환 구조를 형성하는 폴리리보뉴클레오티드를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드” 또는 “변형된 원형 RNA” 또는 “변형된 circRNA”는 상호교환 가능하게 사용되며, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 의미한다. 변형된 원형 RNA는 분자의 전체 길이를 따라 균일하게 변형될 수 있거나, 그렇지 않을 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물” 또는 “하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드” 또는 “하이브리드 변형된 circRNA” 또는 “하이브리드 변형된 원형 RNA”는 상호교환 가능하게 사용되며, 참조 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지며, 본원에 기술된 바와 같이 5% 이하의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 인접 뉴클레오티드의 제1 부분을 갖는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 의미한다. 일부 실시형태에서, 인접 뉴클레오티드의 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드(즉, 변형된 뉴클레오티드 부재 또는 오직 미변형 뉴클레오티드만)를 포함한다. 예를 들어, 인접 미변형 뉴클레오티드의 제1 부분은 IRES를 포함한다. 하이브리드 변형된 원형 RNA는 그의 전체 길이를 따라 변형되거나, 변형되지 않을 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 RNA는 [(모든 시토신 = 메틸시토신) + (모든 우리딘 = 슈도우리딘) + (미변형 IRES)]이다. 또 다른 예에서, 하이브리드 변형은 [(모든 아데노신 = m6a) + 미변형 IRES]이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물” 또는 “완전하게 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물” 또는 “전장 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드” 또는 “완전히 변형된 원형 RNA”는 상호교환 가능하게 사용되며, 참조 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖고, 참조 하이브리드 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 부분에 대응하는 5% 초과의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 갖는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들어, 제1 부분은 5% 초과의 변형된 뉴클레오티드를 갖는 IRES(즉, 변형된 IRES)를 포함한다. 완전히 변형된 원형 RNA는 분자의 전체 길이를 따라 균일하게 변형될 수 있거나, 그렇지 않을 수 있다. 예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 5% 초과의 변형된 뉴클레오티드를 갖는 IRES를 포함하는 제1 부분을 포함하며, 제1 부분의 외측의 뉴클레오티드의 50%는 변형된 뉴클레오티드이다(예를 들어, 제1 부분 외측의 우리딘의 50%는 슈도우리딘이다). 특정 실시형태에서, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 [(모든 시토신 = 메틸시토신) + (모든 우리딘 = 슈도우리딘) + 변형된 IRES]이다. 또 다른 예에서, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 [(모든 아데노신 = m6a ) + 변형된 IRES]이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “변형된 리보뉴클레오티드”는 미변형 천연 리보뉴클레오티드, 예컨대 하기 표 1에서 화학식에 의해 나타낸 바와 같은 천연 미변형 뉴클레오티드 아데노신(A), 우리딘(U), 구아닌(G), 시티딘(C)의 화학적 조성에 대하여 하나 이상의 화학적 변형 및 모노포스페이트를 갖는 임의의 리보뉴클레오티드 유사체 또는 유도체를 의미한다. 일부 실시형태에서, 변형된 리보뉴클레오티드의 화학적 변형은 예컨대 당, 핵염기, 또는 (예를 들어, 연결 포스페이트로의 / 포스포디에스테르 링키지로의 / 포스포디에스테르 백본으로의) 뉴클레오시드간 링키지 등, 리보뉴클레오티드의 임의의 하나 이상의 작용성 기에 대한 변형을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "선형 대응물"은 원형 폴리리보뉴클레오티드와 동일하거나 유사한 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 그 사이의 임의의 백분율의 서열 유사성)을 갖고, 2개의 자유 말단(즉, 원형화된 폴리리보뉴클레오티드의 비원형화된 버전(및 그의 단편))을 갖는 폴리리보뉴클레오티드 분자(및 그의 단편)이다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물(예를 들어, 사전-원형화된 버전)은 원형 폴리리보뉴클레오티드와 동일하거나 유사한 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 그 사이의 임의의 백분율의 서열 유사성) 및 동일하거나 유사한 핵산 변형을 갖고, 2개의 자유 말단(즉, 원형화된 폴리리보뉴클레오티드의 비원형화된 버전(및 그의 단편))을 갖는 폴리리보뉴클레오티드 분자(및 그의 단편)이다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물은 원형 폴리리보뉴클레오티드와 동일하거나 유사한 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 그 사이의 임의의 백분율의 서열 유사성)과 상이한 핵산 변형을 갖거나, 핵산 변형을 갖지 않고, 2개의 자유 말단(즉, 원형화된 폴리리보뉴클레오티드의 비원형화된 버전(및 그의 단편))을 갖는 폴리리보뉴클레오티드 분자(및 그의 단편)이다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물인 폴리리보뉴클레오티드 분자의 단편은 선형 대응물 폴리리보뉴클레오티드 분자보다 더 짧은 선형 대응물 폴리리보뉴클레오티드 분자의 임의의 부분이다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물은 5' 캡을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물은 폴리 아데노신 테일을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물은 3' UTR을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물은 5' UTR을 추가로 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "단편"은 뉴클레오티드 분자보다 적어도 하나의 뉴클레오티드가 더 짧은 뉴클레오티드 분자의 임의의 부분을 의미한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자일 수 있으며, 그의 단편은 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 일부인 폴리리보뉴클레오티드 또는 임의의 수의 인접 폴리리보뉴클레오티드일 수 있다. 또 다른 예로서, 뉴클레오티드 분자는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자일 수 있으며, 그의 단편은 모노리보뉴클레오티드 또는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 일부인 폴리리보뉴클레오티드 또는 임의의 수의 인접 폴리리보뉴클레오티드일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "엔크립토겐"은 면역 세포에 의한 검출의 감소, 회피 및/또는 모면을 보조하고/하거나 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 면역 반응의 유도를 감소시키는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 핵산 서열 또는 구조를 지칭할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "발현 서열"은 생성물, 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 또는 조절 핵산이다. 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 예시적인 발현 서열은 복수의 뉴클레오티드 트라이어드(triad)를 포함할 수 있으며, 이의 각각은 아미노산을 코딩할 수 있고, "코돈"으로 명명된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역단백질 결합 부위"는 면역단백질에 결합하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시형태에서, 면역단백질 결합 부위는 외인성으로서의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 차폐하는 데 도움이 되며, 예를 들어, 면역단백질 결합 부위는 원형 폴리리보뉴클레오티드가 면역단백질에 의해 인식되고 결합되는 것을 방지하는 단백질(예를 들어, 경쟁적 저해제)에 의해 결합되어, 그에 의해, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 면역 반응을 감소시키거나 모면할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역단백질"은 예를 들어, 면역원, 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 것과 같은 면역 반응과 연관된 임의의 단백질 또는 펩티드이다. 면역단백질의 비-제한적인 예는 T 세포 수용체(TCR), 항체(면역글로불린), 주요 조직적합성 복합체(MHC) 단백질, 보체 단백질 및 RNA 결합 단백질을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 어구 "준-나선 구조"는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 고차 구조이며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 일부는 나선 구조로 폴딩된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 어구 "준-이중-가닥 이차 구조"는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 고차 구조이며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 일부는 내부 이중 가닥을 생성한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "조절 요소"는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 발현을 변형시키는 모이어티, 예컨대 핵산 서열을 지칭할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "반복 뉴클레오티드 서열"은 DNA 또는 RNA의 스트레치 내의, 또는 게놈 전체에 걸친 반복 핵산 서열이다. 일부 실시형태에서, 반복 뉴클레오티드 서열은 폴리 CA 또는 폴리 TG(UG) 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 반복 뉴클레오티드 서열은 Alu 패밀리의 인트론 내의 반복된 서열을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "복제 요소"는 복제에 유용하거나, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전사를 개시하는 서열 및/또는 모티프를 지칭할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "스태거 요소"는 번역 동안 리보솜 정지를 유도하는 모이어티, 예컨대 뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 강력한 알파-나선 경향을 갖는 아미노산의 비-보존된 서열에 이어서 공통 서열 -D(V/I)ExNPG P이며, 여기서 x는 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 화학적 모이어티, 예컨대 글리세롤, 비 핵산 연결 모이어티, 화학적 변형, 변형된 핵산 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로 저항성"은 참조물질과 비교시 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 저항성을 갖는 것을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "화학량론적 번역"은 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 번역되는 발현 생성물의 실질적으로 동등한 생성이다. 예를 들어, 2개의 발현 서열을 갖는 원형 폴리리보뉴클레오티드에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 화학량론적 번역은 2개의 발현 서열의 발현 생성물이 실질적으로 동등한 양을 가질 수 있음을 의미할 수 있으며, 예를 들어, 2개의 발현 서열 간의 양의 차이(예를 들어, 몰 차이)는 약 0, 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15% 또는 20% 미만, 또는 이들 사이의 임의의 백분율일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "번역 개시 서열"은 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 번역을 개시하는 핵산 서열이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "종결 요소"는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 번역을 종결시키는 모이어티, 예컨대 핵산 서열이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "번역 효율"은 리보뉴클레오티드 전사물로부터의 단백질 또는 펩티드 생성의 속도 또는 양을 의미한다. 일부 실시형태에서, 번역 효율은 예를 들어, 주어진 기간에, 예를 들어, 주어진 번역 시스템, 예를 들어, 토끼 망상적혈구 용해물과 같은 시험관내 번역 시스템 또는 진핵 세포 또는 원핵 세포와 같은 생체내 번역 시스템에서, 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 전사물의 주어진 양 당, 생성되는 단백질 또는 펩티드의 양으로서 표현될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "원형화 효율"은 생성된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대 그의 출발 물질의 척도를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역원성"은 물질에 대한 면역 반응을 유도할 가능성을 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 유기체의 면역계 또는 특정 유형의 면역 세포가 면역원성 물질에 노출되는 경우에 유도될 수 있다. 용어 "비-면역원성"은 물질에 대한 검출 가능한 임계값을 초과하는 면역 반응의 결여 또는 그의 부재이다. 일부 실시형태에서, 유기체의 면역계 또는 특정 유형의 면역 세포가 비-면역원성 물질에 노출되는 경우에 면역 반응은 검출되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 바와 같은 비-면역원성 원형 폴리리보뉴클레오티드는 면역원성 검정에 의해 측정되는 경우 사전결정된 임계값을 초과하는 면역 반응을 유도하지 않는다. 예를 들어, 면역원성 검정을 사용하여 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 선천 면역 반응을 측정하는 경우(예컨대, 염증성 마커의 측정), 본원에 제공되는 바와 같은 비-면역원성 폴리리보뉴클레오티드는 선천 면역 반응의 생성을 사전결정된 임계값보다 더 낮은 수준으로 야기할 수 있다. 사전결정된 임계값은 예를 들어, 대조군 참조물질에 대한 선천 면역 반응에 의해 생성되는 마커(들)의 수준의 최대 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “약제학적으로 허용 가능한”은 생물학적으로 또는 다르게 바람직하지 않은 성분이 아닌 성분을 지칭하며, 예를 들어, 성분은 임의의 유의미한 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하거나, 그것이 함유된 제형의 다른 성분 중 어느 하나와 불리한 방식으로 상호작용하지 않고, 본 발명의 약제학적 제형 내로 혼입되고, 본원에 기술된 바와 같이 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 용어 “약제학적으로 허용 가능한”이 부형제를 나타내기 위해 사용되는 경우, 그것은 성분이 독성학 및 제조 시험의 필요한 표준을 만족하거나, 그것이 미국 식품 의약국(U.S. Food and Drug Administration)에 의해 제작된 비활성 성분 지침(Inactive Ingredient Guide)에 포함되는 것을 암시한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "담체"는 부분적으로 또는 완전히 캡슐화시키는 작용제 또는 그의 조합을 통한 원형 폴리리보뉴클레오티드의 공유적 변형에 의해 세포 내로의 조성물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 수송 또는 전달을 용이하게 하는 화합물, 조성물, 시약 또는 분자를 의미한다. 담체의 비제한적인 예에는 탄수화물 담체(예를 들어, 무수물-변형된 피토글리코겐 또는 글리코겐-유형 물질), 나노입자(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 캡슐화하거나 이에 공유적으로 연결되어 결합하는 나노입자), 리포좀, 푸소좀, 생체 외 분화된 망상적혈구, 엑소좀, 단백질 담체(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 공유적으로 연결된 단백질) 또는 양이온성 담체(예를 들어, 양이온성 리포폴리머(lipopolymer) 또는 트랜스펙션 시약)가 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "네이키드 전달"은 담체의 보조 없이, 그리고 세포로의 전달을 보조하는 모이어티에 대한 공유적 변형 없이 세포로의 전달을 위한 제형을 의미한다. 네이키드 전달 제형은 임의의 트랜스펙션 시약, 양이온성 담체, 탄수화물 담체, 나노입자 담체 또는 단백질 담체가 없다. 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 네이키드 전달 제형은 공유적 변형 없이 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 담체가 없는 제형이다.
용어 "희석제"는 본원에 기술된 조성물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물)이 희석되거나 용해될 수 있는 비활성 용매를 포함하는 비히클을 의미한다. 희석제는 RNA 가용화제, 완충제, 등장화제 또는 그의 혼합물일 수 있다. 희석제는 액체 희석제 또는 고체 희석제일 수 있다. 액체 희석제의 비제한적인 예에는 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일(특히, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 배아, 올리브, 피마자 및 참깨), 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 소르비탄의 폴리에틸렌 글리콜 및 지방산 에스테르 및 1,3-부탄디올이 포함된다. 고체 희석제의 비제한적인 예에는 탄산칼슘, 탄산나트륨, 인산칼슘, 인산이칼슘, 황산칼슘, 인산수소칼슘, 인산나트륨 락토스, 수크로스, 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 염화나트륨, 건조 전분(dry starch), 옥수수 전분 또는 파우더 슈거(powdered sugar)가 포함된다.
참조에 의한 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되어 있는 것으로 나타낸 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 실시형태의 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽는 경우 더 잘 이해될 것이다. 본 발명의 예시의 목적을 위해, 본원에서 예시된 실시형태가 도면에 나타나 있다. 그러나, 본 발명은 도면에 나타낸 실시형태의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않음을 이해해야 한다.
도 1a, 도 1b 및 도 1c는 변형된 원형 RNA가 세포에서 번역되었음을 보여준다.
도 2a, 도 2b 및 도 2c는 변형된 원형 RNA가, 트랜스펙션된 세포에서의 MDA5, OAS 및 IFN-베타 발현에 의해 평가하여 미변형된 원형 RNA에 비하여 세포에 대해 감소된 면역원성을 갖는 것을 보여준다.
도 3은 하이브리드 변형된 원형 RNA가 세포에서 RIG-I, MDA5, IFN-베타 및 OAS 발현에 의해 평가하여, 미변형 원형 RNA에 비하여 감소된 면역원성을 갖는 것을 보여준다.
도 4는 출발-코돈, GFP를 코딩하는 ORF(오픈 리딩 프레임), 스태거 요소(2A), 엔크립토겐 및 IRES(내부 리보솜 진입 부위)를 함유하는 원형 RNA의 예시적인 시험관내 생성 과정의 개략도를 보여준다.
도 5는 원형 RNA의 예시적인 생체내 생성 과정의 개략도를 보여준다.
도 6은 출발-코돈, GFP를 코딩하는 ORF, 스태거 요소(2A) 및 엔크립토겐을 포함하는 예시적인 원형 RNA의 설계를 보여준다.
도 7은 2가지의 상이한 원형 RNA의 생체내 화학량론적 단백질 발현을 보여주는 개략도(A 및 B)이다.
도 8은 예시적인 원형 RNA로부터의 마우스 모델에서의 생체내 단백질 발현을 보여주는 개략도이다.
도 9는 구조 정보를 위해 점 블롯 분석으로 처리될 수 있는 하나의 이중-가닥 RNA 세그먼트를 갖는 예시적인 원형 RNA의 개략도를 보여준다.
도 10은 구조 정보를 위해 SHAPE 분석으로 처리될 수 있는 준-나선 구조(HDVmin)를 갖는 예시적인 원형 RNA의 개략도를 보여준다.
도 11은 HDAg 결합 활성을 보여주는 기능성 준-나선 구조(HDVmin)를 갖는 예시적인 원형 RNA의 개략도를 보여준다.
도 12는 예시적인 자가-복제 가능한 원형 RNA의 전사, 자가-절단 및 라이게이션을 보여주는 개략도이다.
도 13은 상이한 예시적인 원형 RNA의 시험관내 생성을 보여주는 변성 PAGE 겔 이미지이다.
도 14는 상이한 예시적인 원형 RNA의 원형화 효율을 요약한 그래프이다.
도 15는 선형 대응물에 비하여 예시적인 원형 RNA의 감소된 분해 감수성을 보여주는 변성 PAGE 겔 이미지이다.
도 16은 예시적인 정제 과정 후의 예시적인 원형 RNA를 보여주는 변성 PAGE 겔 이미지이다.
도 17은 IRES, 캡, 5' 및 3' UTR을 결여한 예시적인 원형 RNA에 의한 Flag 단백질(약 15 kDa)의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 이미지이다.
도 18은 예시적인 원형 RNA의 회전환 번역을 보여주는 웨스턴 블롯 이미지이다.
도 19는 예시적인 스태거 요소가 존재하거나, 그것이 존재하지 않는 상이한 예시적인 원형 RNA로부터의 불연속 단백질 또는 긴 연속 펩티드의 생성을 보여주는 웨스턴 블롯 이미지를 보여준다.
도 20a는 예시적인 스태거 요소 또는 종결 요소(정지 코돈)를 갖는 상이한 예시적인 원형 RNA 간의 단백질 발현의 비교를 보여주는 웨스턴 블롯 이미지이다.
도 20b는 2개의 예시적인 원형 RNA로부터 번역되는 단백질 생성물의 웨스턴 블롯 분석으로부터의 신호 세기를 요약한 그래프이다.
도 21은 비히클 대조군 RNA와 비교하여, 예시적인 원형 RNA와 그의 선형 대응물의 번역 생성물의 루시퍼라제 활성을 요약한 그래프이다.
도 22는 예시적인 원형 RNA의 반감기를 시험하는 시간 추이 실험에서 상이한 수집 시점에서의 RNA의 양을 요약한 그래프이다.
도 23a는 세포로의 운반 24시간 후의, 선형 및 원형 RNA 둘 모두를 포획하는 프라이머를 사용한 선형 및 원형 RNA 수준의 qRT-PCR 분석을 보여주는 그래프이다.
도 23b는 원형 RNA에 특이적인 프라이머를 사용한 선형 및 원형 RNA 수준의 qRT-PCR 분석을 보여주는 그래프이다.
도 24는 EGF 단백질 및 베타-튜불린 로딩 대조군을 위해 프로빙된 원형 RNA 및 선형 RNA로부터의 세포 용해물의 블롯을 보여주는 이미지이다.
도 25는 원형 RNA 또는 선형 RNA로 트랜스펙션된 293T 세포로부터의 면역 관련 유전자의 qRT-PCR 분석을 보여주는 그래프이다.
도 26은 회전환 번역을 통해 원형 RNA로부터 발현되는 단백질의 루시퍼라제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 27은 원형 RNA 또는 선형 RNA로부터 발현되는 단백질의 루시퍼라제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 28은 회전환 번역을 통해 선형 RNA 또는 원형 RNA로부터 발현되는 단백질의 루시퍼라제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 29는 IRES 번역 개시를 통해 원형 RNA로부터 발현되는 단백질의 루시퍼라제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 30은 IRES 개시 및 회전환 번역을 통해 원형 RNA로부터 발현되는 단백질의 루시퍼라제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 31은 원형 RNA 또는 선형 RNA로부터의 발현 생성물의 단백질 블롯을 보여주는 이미지이다.
도 32는 원형 RNA 또는 선형 RNA로부터의 발현 생성물의 단백질 블롯을 보여주는 이미지이다.
도 33은 예시적인 원형 RNA의 준-이중 가닥 구조를 갖는 예측된 구조를 보여준다.
도 34는 예시적인 원형 RNA의 준-나선 구조를 갖는 예측된 구조를 보여준다.
도 35는 예시적인 원형 RNA의 반복 서열과 연결된 준-나선 구조를 갖는 예측된 구조를 보여준다.
도 36은 예시적인 원형 RNA의 RNAse H에 의한 분해에 의해, 원형이며 콘카테머가 아닌 RNA와 일치하는 핵산 분해 생성물이 생성되었다는 실험 데이터를 보여준다.
도 37은 매우 다양한 RNA 길이를 생성하기 위해 생성된 상이한 길이의 DNA의 전기영동 이미지를 보여준다.
도 38은 RNAse R 처리를 사용한 RNA의 원형화, 및 매우 다양한 길이의 원형 연접부에 대한 qPCR 분석을 보여주는 실험 데이터를 보여준다.
도 39는 단백질 결합 부위를 갖는 예시적인 원형 RNA의 생성을 보여준다.
도 40은 miRNA 결합 부위를 갖는 예시적인 원형 RNA의 생성을 보여준다.
도 41은 자가-스플라이싱에 의한 예시적인 원형 RNA의 생성을 보여준다.
도 42는 선형 대조군에 비하여 분열 중인 세포에서의 원형 RNA의 더 높은 안정성을 보여주는 실험 데이터를 보여준다.
도 43은 복수의 발현 서열을 갖는 예시적인 원형 RNA로부터의 단백질 발현, 및 다수의 발현 서열을 갖는 예시적인 원형 RNA의 회전환 번역을 보여주는 실험 데이터를 보여준다.
도 44는 마우스 내로 주사한 후에, 원형 RNA가 주사 후 3일째, 4일째 및 7일째에 마우스의 간에서 선형 RNA보다 더 높은 수준으로 검출되었음을 보여준다.
도 45a 및 도 45b는 가우시아(Gaussia) 루시퍼라제를 발현하는 원형 RNA 또는 선형 RNA를 마우스 내로 주사한 후에, 가우시아 루시퍼라제 활성이 원형 RNA의 투여 후 1일째, 2일째, 7일째, 11일째, 16일째 및 23일째에 혈장 중에서 검출된 한편, 그의 활성이 변형된 선형 RNA의 투여 후 1일째 및 2일째에만 혈장 중에서 검출되었음을 보여준다.
도 46은 RNA의 주사 후에, 원형 RNA가 RNA의 투여 후 16일째에 간 및 비장에서 검출되었지만, 선형 RNA는 그렇지 않았음을 보여준다.
도 47은 RNA의 주사 후에, 선형 RNA가 RIG-I, MDA-5, IFN-B 및 OAS에 의해 평가시, 면역원성을 보였지만, 원형 RNA는 그렇지 않았음을 보여준다.
도 48은 상이한 예시적인 원형화 방법을 보여준다.
도 49는 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 원형 RNA가 변형된 mRNA에 비하여, 그리고 미변형 뉴클레오티드만을 사용하여 생성된 원형 RNA에 비하여, 생체내에서 감소된 면역원성을 갖는 것을 보여준다.
도 50은 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 원형 RNA가 그의 완전히 미변형된 대응물 및 변형된 mRNA보다 생체내에서 증가된 안정성을 갖는 것을 보여준다.
본 발명은 일반적으로 원형 폴리리보뉴클레오티드의 약제학적 조성물 및 제제 및 그의 용도에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 폴리리보뉴클레오티드 및 연속 미변형 뉴클레오티드의 제1 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체에게 전달된다.
본 개시내용은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 폴리리보뉴클레오티드 및 5% 이하의 변형된 뉴클레오티드를 갖는 인접 뉴클레오티드의 제1 부분을 포함하는 단계, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계 및 대상체의 세포 또는 조직에서 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대해 감소된 면역원성을 수득하는 단계를 포함하는 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 면역원성의 저하 또는 감소 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 면역원성의 감소 또는 저하 방법은 하기를 포함한다: 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및 5% 이하의 변형된 뉴클레오티드를 갖는 적어도 약 5개 내지 1000개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함하는 단계; 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계; 및 대상체의 세포 또는 조직에서 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대해 감소된 면역원성을 수득하는 단계. 일부 실시형태에서, 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 면역원성의 저하 또는 감소 방법은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 폴리리보뉴클레오티드 및 인접 미변형 뉴클레오티드의 제1 부분을 포함하는 단계, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계, 및 대상체의 세포 또는 조직에서 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대해 감소된 면역원성을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 IRES를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 적어도 약 5개 내지 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 5’-메틸시티딘 또는 슈도우리딘을 결여한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들 중 5% 이하가 미변형 뉴클레오티드이다.
본 개시내용은 적어도 하나의 변형된 폴리리보뉴클레오티드, 5% 이하의 변형된 뉴클레오티드를 갖는 인접 뉴클레오티드의 제1 부분, 및 하나 이상의 발현 서열을 포함하는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계, 및 대상체의 세포 또는 조직에서 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 대응하는 하나 이상의 발현 서열의 발현에 비하여 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현을 수득하는 단계를 포함하는 대상체에서의 하나 이상의 발현 서열의 발현 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 대상체에서의 하나 이상의 발현 서열의 발현 방법은 하기를 포함한다: 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및 5% 이하의 변형된 뉴클레오티드를 갖는 적어도 약 5개 내지 1000개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함하는 단계; 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계, 및 대상체의 세포 또는 조직에서 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물 내의 하나 이상의 발현 서열의 발현에 비하여 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현을 수득하는 단계. 일부 실시형태에서, 대상체에서의 하나 이상의 발현 서열의 발현 방법은 적어도 하나의 변형된 폴리리보뉴클레오티드, 인접 미변형 뉴클레오티드의 제1 부분, 및 하나 이상의 발현 서열을 포함하는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계, 및 대상체의 세포 또는 조직에서 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 대응하는 하나 이상의 발현 서열의 발현에 비하여 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 IRES를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 적어도 약 5개 내지 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 5’-메틸시티딘 또는 슈도우리딘을 결여한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들 중 5% 이하가 미변형 뉴클레오티드이다.
본 개시내용은 하이브리드 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 폴리리보뉴클레오티드 및 5% 이하의 변형된 뉴클레오티드를 갖는 인접 뉴클레오티드의 제1 부분을 포함하는 단계, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계 및 대상체의 세포 또는 조직에서 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대해 증가된 안정성을 수득하는 단계를 포함하는 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성의 증가 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성의 증가 방법은 하기를 포함한다: 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및 5% 이하의 변형된 뉴클레오티드를 갖는 적어도 약 5개 내지 1000개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함하는 단계; 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계, 및 대상체의 세포 또는 조직에서 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대해 증가된 안정성을 수득하는 단계. 일부 실시형태에서, 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성의 증가 방법은 하이브리드 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 폴리리보뉴클레오티드 및 인접 미변형 뉴클레오티드의 제1 부분을 포함하는 단계, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계, 및 대상체의 세포 또는 조직에서 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대해 증가된 안정성을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 IRES를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 적어도 약 5개 내지 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 5’-메틸시티딘 또는 슈도우리딘을 결여한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들 중 5% 이하가 미변형 뉴클레오티드이다.
변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 이용 방법
일부 양태에서, 본원에 기술된 발명은, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 조성물을 사용하는 방법, 및 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 운반하는 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체에게 전달된다. 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여, 대상체로의 본원에 기술된 바와 같은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 투여는 대상체의 세포 또는 조직에서 저하된 또는 감소된 면역원성, 증가된 번역 효율(예를 들어, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현) 또는 증가된 안정성을 초래할 수 있다. 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물에 비하여, 대상체로의 본원에 기술된 바와 같은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 투여는 대상체의 세포 또는 조직에서 증가된 번역 효율(예를 들어, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현)을 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 폴리리보뉴클레오티드 및 연속 미변형 뉴클레오티드의 제1 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 이용하는 방법을 제공하며, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드 및 제1 부분을 포함하며 제1 부분은 적어도 약 5개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 부분은 5%를 넘지 않는 변형 뉴클레오티드를 갖는 적어도 약 5개 내지 1000개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 적어도 약 5개 내지 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 5’-메틸시티딘, 슈도우리딘 또는 N1-메틸-슈도우리딘을 결여한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들 중 5% 이하가 변형된다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들 중 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5% 이하가 변형된다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들은 변형되지 않는다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 5% 이하의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 변형 뉴클레오티드를 포함하지 않는 (예를 들어, 미변형 뉴클레오티드만을 포함) IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 단백질, 펩티드, 생체분자, DNA, RNA, 또는 세포 표적에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 번역 적격성이다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 약제학적 조성물에 포함되며, 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다.
하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및 인접 미변형 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 제1 부분의 외측에 존재한다. 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 미변형 천연 리보뉴클레오티드, 예컨대 표 1에서 화학식에 의해 나타낸 바와 같은 천연 미변형 뉴클레오티드 아데노신(A), 우리딘(U), 구아닌(G), 시티딘(C)의 화학적 조성에 대한 하나 이상의 화학적 변형 및 모노포스페이트를 갖는 유사체 또는 유도체일 수 있다. 변형된 리보뉴클레오티드의 화학적 변형은 예컨대 당, 핵염기, 또는 (예를 들어, 연결 포스페이트로의 / 포스포디에스테르 링키지로의 / 포스포디에스테르 백본으로의) 뉴클레오시드간 링키지 등, 리보뉴클레오티드의 임의의 하나 이상의 작용성 기에 대한 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 본원에 참조로 포함된 문헌[Gilbert, W.V., et al. Science. 2016 Jun17; 352(6292): 1408 - 1412]에서와 같은 또는 상기 문헌에서 확인된 것들과 같은 당업자에 의해 알려져 있는 임의의 변형일 수 있다. 예를 들어, 변형은 표 2에 기술된 바와 같을 수 있다.
[표 1] 미변형 천연 리보뉴클레오사이드
Figure pct00001
[표 2] 예시적인 뉴클레오티드 변형
Figure pct00002
일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: N(6)메틸아데노신(m6A), 5’-메틸시티딘(5mC), 슈도우리딘, 2’-O-메틸, 2’-O-메톡시에틸(2’-O-MOE), 2’-O-아미노프로필, 2’-데옥시, T-데옥시-2’-플루오로, 2’-O-아미노프로필(2’-O-AP), 2’-O-디메틸아미노에틸(2’-O-DMAOE), 2’-O-디메틸아미노프로필(2’-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2’-O-DMAEOE), 2’-O-N-메틸아세트아미도(2’-O-NMA), 잠금 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩티드 핵산(PNA), 1’,5’-언하이드로헥시톨 핵산(HNA), 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드 및 2’-플루오로 N3-P5’-포스포르아미디트. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 본원에 참조로 포함되는 문헌[Gilbert, W.V., et al. Science. 2016 Jun17; 352(6292): 1408 - 1412]에서와 같은 또는 상기 문헌에서 확인된 것들과 같은 당업자에 의해 알려져 있는 임의의 변형된 뉴클레오티드이다.
본원에 기술된 바와 같은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 부분은 적어도 약 5개 내지 1000개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 적어도 약 5개 내지 1000개, 10개 내지 1000개, 20개 내지 1000개, 50개 내지 1000개, 100개 내지 1000개, 200개 내지 1000개, 300개 내지 1000개, 400개 내지 1000개, 500개 내지 1000개, 600개 내지 1000개, 700개 내지 1000개, 800개 내지 1000개, 900개 내지 1000개, 또는 900개 내지 2000개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 부분은 5% 이하의 변형된 뉴클레오티드를 갖는 인접 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5%를 넘지 않는 변형 뉴클레오티드를 포함하는 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 5% 이하의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 변형 뉴클레오티드를 포함하지 않는 (예를 들어, 미변형 뉴클레오티드만을 포함) IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 IRES이다. 본원에 기술된 바와 같은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 부분은 인접 미변형 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 제1 부분은 적어도 약 5개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 적어도 약 5개 내지 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 적어도 약 5개 내지 1000개, 10개 내지 1000개, 20개 내지 1000개, 50개 내지 1000개, 100개 내지 1000개, 200개 내지 1000개, 300개 내지 1000개, 400개 내지 1000개, 500개 내지 1000개, 600개 내지 1000개, 700개 내지 1000개, 800개 내지 1000개, 900개 내지 1000개, 또는 900개 내지 2000개의 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개, 또는 이들 사이의 임의의 개수의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 또는 이들 사이의 임의의 개수의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 제1 부분은 IRES를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 5’-메틸시티딘, 슈도우리딘 또는 N1-메틸-슈도우리딘을 결여한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 결여한다: N(6)메틸아데노신(m6A), 5’-메틸시티딘(5mC), 슈도우리딘, 2’-O-메틸, 2’-O-메톡시에틸(2’-O-MOE), 2’-O-아미노프로필, 2’-데옥시, T-데옥시-2’-플루오로, 2’-O-아미노프로필(2’-O-AP), 2’-O-디메틸아미노에틸(2’-O-DMAOE), 2’-O-디메틸아미노프로필(2’-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2’-O-DMAEOE), 2’-O-N-메틸아세트아미도(2’-O-NMA), 잠금 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩티드 핵산(PNA), 1’,5’-언하이드로헥시톨 핵산(HNA), 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드 및 2’-플루오로 N3-P5’-포스포르아미디트. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 본원에 참조로 포함되는 문헌[Gilbert, W.V., et al. Science. 2016 Jun17; 352(6292): 1408 - 1412]에서와 같은 또는 상기 문헌에서 확인된 것들과 같은 당업자에 의해 알려져 있는 뉴클레오티드 변형을 결여한다.
본원에 기술된 바와 같은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 제1 부분의 외측에 5’-메틸시티딘, 슈도우리딘 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 N(6)메틸아데노신(m6A), 5’-메틸시티딘(5mC), 슈도우리딘, 2’-O-메틸, 2’-O-메톡시에틸(2’-O-MOE), 2’-O-아미노프로필, 2’-데옥시, T-데옥시-2’-플루오로, 2’-O-아미노프로필(2’-O-AP), 2’-O-디메틸아미노에틸(2’-O-DMAOE), 2’-O-디메틸아미노프로필(2’-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2’-O-DMAEOE), 2’-O-N-메틸아세트아미도(2’-O-NMA), 잠금 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩티드 핵산(PNA), 1’,5’-언하이드로헥시톨 핵산(HNA), 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드 및 2’-플루오로 N3-P5’-포스포르아미디트로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 포함할 수 있으며, 변형된 뉴클레오티드는 제1 부분의 외측에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 외측의 변형된 뉴클레오티드는 본원에 참조로 포함되는 문헌[Gilbert, W.V., et al. Science. 2016 Jun17; 352(6292): 1408 - 1412]에서와 같은 또는 상기 문헌에서 확인된 것들과 같은 당업자에 의해 알려져 있는 임의의 변형된 뉴클레오티드이다.
감소된 면역원성
대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 면역원성의 저하 또는 감소 방법은 하이브리드 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 폴리리보뉴클레오티드 및 인접 미변형 뉴클레오티드의 제1 부분을 포함하는 단계, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계, 및 대상체의 세포 또는 조직에서 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대해 저하된 또는 감소된 면역원성을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들 중 5% 이하가 변형된다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들 중 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5% 이하가 변형된다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들은 변형되지 않는다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 단백질, 펩티드, 생체분자, DNA, RNA, 또는 세포 표적에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함한다.일부 실시형태에서, 제1 부분은 5% 이하의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 변형 뉴클레오티드를 포함하지 않는 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 IRES이다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 감소되거나 줄어든 면역원성은 대상체의 세포 또는 조직 내의 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비해 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 낮다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 이후 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비해 감소되거나 줄어든 면역원성을 가진다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 이후 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 낮은 면역원성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 면역원성은 대상체에게 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 투여한 이후 RIG-I, TLR-3, TLR-7, TLR-8, MDA-5, LGP-2, OAS, OASL, PKR, 및 IFN-베타 중 적어도 하나의 발현 또는 신호전달 또는 활성화의 수준에 의해 평가된다.
증가된 번역 효율
본 개시내용은 적어도 하나의 변형된 폴리리보뉴클레오티드, 인접 미변형 뉴클레오티드의 제1 부분 및 하나 이상의 발현 서열을 포함하는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계, 및 대상체의 세포 또는 조직에서 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 대응하는 하나 이상의 발현 서열의 발현에 비하여 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현을 수득하는 단계를 포함하는 대상체에서의 하나 이상의 발현 서열의 발현 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들 중 5% 이하가 변형된다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들 중 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5% 이하가 변형된다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들은 변형되지 않는다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 단백질, 펩티드, 생체분자, DNA, RNA, 또는 세포 표적에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 5% 이하의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 변형 뉴클레오티드를 포함하지 않는 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 IRES이다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현은 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 하나 이상의 발현 서열과 유사하거나 그보다 높다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현은 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 하나 이상의 발현 서열보다 적어도 약 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 또는 3배이다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열의 발현의 증가된 발현은 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드와 유사하거나 그보다 높다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현은 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 또는 3배이다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열의 발현의 증가된 발현은 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 발현보다 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 600%, 70%, 800%, 900%, 1000%, 2000%, 5000%, 10000%, 100000% 또는 그를 초과한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열의 발현의 증가된 발현은 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물보다 적어도 약 10%이다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열의 발현의 증가된 발현은 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물보다 적어도 약 20%이다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열의 발현의 증가된 발현은 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물보다 적어도 약 50%이다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열의 발현의 증가된 발현은 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드의 발현보다 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 600%, 70%, 800%, 900%, 1000%, 2000%, 5000%, 10000%, 100000% 또는 그를 초과한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열의 발현의 증가된 발현은 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드의 발현보다 적어도 약 10%이다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열의 발현의 증가된 발현은 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드의 발현보다 적어도 약 20%이다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열의 발현의 증가된 발현은 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드의 발현보다 적어도 약 50%이다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열의 발현의 증가된 발현은 대상체로의 투여 이후 1 일째, 2 일째, 3 일째, 4 일째, 5 일째, 6 일째, 7 일째, 8 일째, 9 일째, 10 일째, 11 일째, 12 일째, 13 일째, 14 일째, 15 일째, 16 일째, 17 일째, 18 일째, 19 일째, 20 일째, 21 일째, 28 일째, 또는 그 이상, 또는 그 사이의 임의의 시점이다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열의 발현은 대상체로의 투여 이후 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 하나 이상의 발현 서열과 유사하거나 그보다 높은 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열은 대상체로의 투여 이후 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 하나 이상의 발현 서열보다 적어도 약 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 또는 3배 높은 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열의 발현은 대상체로의 투여 이후 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드와 유사하거나 그보다 높은 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열은 대상체로의 투여 이후 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 또는 3배 높은 번역 효율을 갖는다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열의 발현은 대상체로의 투여 이후 1 일째, 2 일째, 3 일째, 4 일째, 5 일째, 6 일째, 7 일째, 8 일째, 9 일째, 10 일째, 11 일째, 12 일째, 13 일째, 14 일째, 15 일째, 16 일째, 17 일째, 18 일째, 19 일째, 20 일째, 21 일째, 28 일째, 또는 그 이상, 또는 그 사이의 임의의 시점에 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 하나 이상의 발현 서열과 유사하거나 그보다 높은 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열은 대상체로의 투여 이후 1 일째, 2 일째, 3 일째, 4 일째, 5 일째, 6 일째, 0.7 일째, 0.8 일째, 0.9 일째, 10 일째, 11 일째, 12 일째, 13 일째, 14 일째, 15 일째, 16 일째, 17 일째, 18 일째, 19 일째, 20 일째, 21 일째, 28 일째, 또는 그 이상, 또는 그 사이의 임의의 시점에 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 하나 이상의 발현 서열보다 적어도 약 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 또는 3배 높은 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열의 발현은 대상체로의 투여 이후 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드와 유사하거나 그보다 높은 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열은 대상체로의 투여 이후 1 일째, 2 일째, 3 일째, 4 일째, 5 일째, 6 일째, 7 일째, 8 일째, 9 일째, 10 일째, 11 일째, 12 일째, 13 일째, 14 일째, 15 일째, 16 일째, 17 일째, 18 일째, 19 일째, 20 일째, 21 일째, 28 일째, 또는 그 이상, 또는 그 사이의 임의의 시점에 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 또는 3배 높은 번역 효율을 갖는다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현은 대상체로의 투여 이후 1 일째, 2 일째, 3 일째, 4 일째, 5 일째, 6 일째, 7 일째, 8 일째, 9 일째, 10 일째, 11 일째, 12 일째, 13 일째, 14 일째, 15 일째, 16 일째, 17 일째, 18 일째, 19 일째, 20 일째, 21 일째, 28 일째, 또는 그 이상, 또는 그 사이의 임의의 시점에 5% 초과, 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 갖는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물과 유사하거나 그보다 높다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현은 대상체로의 투여 이후 1 일째, 2 일째, 3 일째, 4 일째, 5 일째, 6 일째, 7 일째, 8 일째, 9 일째, 10 일째, 11 일째, 12 일째, 13 일째, 14 일째, 15 일째, 16 일째, 17 일째, 18 일째, 19 일째, 20 일째, 21 일째, 28 일째, 또는 그 이상, 또는 그 사이의 임의의 시점에 5% 초과, 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 갖는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 높다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현은 5% 초과, 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 갖는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물과 유사하거나 그보다 높다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현은 5% 초과, 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 갖는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 높다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현은 대상체로의 투여 이후 1 일째, 2 일째, 3 일째, 4 일째, 5 일째, 6 일째, 7 일째, 8 일째, 9 일째, 10 일째, 11 일째, 12 일째, 13 일째, 14 일째, 15 일째, 16 일째, 17 일째, 18 일째, 19 일째, 20 일째, 21 일째, 28 일째, 또는 그 이상, 또는 그 사이의 임의의 시점에 5% 초과, 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 갖는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물과 유사하거나 그보다 높다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현은 대상체로의 투여 이후 1 일째, 2 일째, 3 일째, 4 일째, 5 일째, 6 일째, 7 일째, 8 일째, 9 일째, 10 일째, 11 일째, 12 일째, 13 일째, 14 일째, 15 일째, 16 일째, 17 일째, 18 일째, 19 일째, 20 일째, 21 일째, 28 일째, 또는 그 이상, 또는 그 사이의 임의의 시점에 5% 초과, 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 갖는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 높다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열의 발현의 증가된 발현은 대상체로의 투여 이후 1 일째, 2 일째, 3 일째, 4 일째, 5 일째, 6 일째, 7 일째, 8 일째, 9 일째, 10 일째, 11 일째, 12 일째, 13 일째, 14 일째, 15 일째, 16 일째, 17 일째, 18 일째, 19 일째, 20 일째, 21 일째, 28 일째, 또는 그 이상, 또는 그 사이의 임의의 시점에, 5%초과, 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 갖는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 발현보다 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 600%, 70%, 800%, 900%, 1000%, 2000%, 5000%, 10000%, 100000% 또는 그를 초과한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열의 발현의 증가된 발현은 대상체로의 투여 이후 1 일째, 2 일째, 3 일째, 4 일째, 5 일째, 6 일째, 7 일째, 8 일째, 9 일째, 10 일째, 11 일째, 12 일째, 13 일째, 14 일째, 15 일째, 16 일째, 17 일째, 18 일째, 19 일째, 20 일째, 21 일째, 28 일째, 또는 그 이상, 또는 그 사이의 임의의 시점에 5% 초과, 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 갖는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 발현의 적어도 약 10%이다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열의 발현의 증가된 발현은 대상체로의 투여 이후 1 일째, 2 일째, 3 일째, 4 일째, 5 일째, 6 일째, 7 일째, 8 일째, 9 일째, 10 일째, 11 일째, 12 일째, 13 일째, 14 일째, 15 일째, 16 일째, 17 일째, 18 일째, 19 일째, 20 일째, 21 일째, 28 일째, 또는 그 이상, 또는 그 사이의 임의의 시점에 5% 초과, 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 갖는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 발현의 적어도 약 20%이다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열의 발현의 증가된 발현은 대상체로의 투여 이후 1 일째, 2 일째, 3 일째, 4 일째, 5 일째, 6 일째, 7 일째, 8 일째, 9 일째, 10 일째, 11 일째, 12 일째, 13 일째, 14 일째, 15 일째, 16 일째, 17 일째, 18 일째, 19 일째, 20 일째, 21 일째, 28 일째, 또는 그 이상, 또는 그 사이의 임의의 시점에 5% 초과, 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 갖는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 발현의 적어도 약 50%이다.
본원에 기술된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 번역 효율 또는 증가된 발현은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물을 포함하는 세포에서 또는 시험관내 번역 시스템(예를 들어, 토끼 망상적혈구 용해물)에서 측정된다.
증가된 안정성
본 개시내용은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 폴리리보뉴클레오티드 및 인접 미변형 뉴클레오티드의 제1 부분을 포함하는 단계, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계, 및 대상체의 세포 또는 조직에서 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대해 증가된 안정성을 수득하는 단계를 포함하는 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성의 증가 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들 중 5% 이하가 변형된다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들 중 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5% 이하가 변형된다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들은 변형되지 않는다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 단백질, 펩티드, 생체분자, DNA, RNA, 또는 세포 표적에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 5% 이하의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 변형 뉴클레오티드를 포함하지 않는 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 IRES이다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 증가된 안정성은 대상체의 세포 또는 조직 내의 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비해 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 높다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 이후 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비해 증가된 안정성을 가진다. 일부 실시형태에서, 개시된 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 이후 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 증가된 안정성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 이후 1 일째, 2 일째, 3 일째, 4 일째, 5 일째, 6 일째, 7 일째, 8 일째, 9 일째, 10 일째, 11 일째, 12 일째, 13 일째, 14 일째, 15 일째, 16 일째, 17 일째, 18 일째, 19 일째, 20 일째, 21 일째, 28 일째, 또는 그 이상, 또는 그 사이의 임의의 시점에, 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비해 증가된 안정성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 후 14일째에 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 증가된 안정성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 개시된 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 이후 1 일째, 2 일째, 3 일째, 4 일째, 5 일째, 6 일째, 7 일째, 8 일째, 9 일째, 10 일째, 11 일째, 12 일째, 13 일째, 14 일째, 15 일째, 16 일째, 17 일째, 18 일째, 19 일째, 20 일째, 21 일째, 28 일째, 또는 그 이상, 또는 그 사이의 임의의 시점에, 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 높은 증가된 안정성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 개시된 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 이후 14일째에 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 증가된 안정성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 이후 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비해 큰 반감기를 가진다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 이후 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배의 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 반감기는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드를 세포 내로 도입하고, 세포 내측에서 도입된 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 측정함으로써 측정된다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 이후 적어도 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드의 반감기 만큼의 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 이후 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드의 것보다 증가된 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 반감기는 대상체로의 투여 이후 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그를 초과하여 증가된다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 이후 세포에서 적어도 약 1시간 내지 약 30일, 또는 적어도 약 2시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3,일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 60일, 또는 그 초과 또는 그 사이의 임의의 시간 동안의 반감기 또는 지속성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 이후 세포에서 약 10분 이하 내지 약 7일, 또는 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 4일, 5일, 6일, 7일 이하 또는 그 사이의 임의의 시간 동안의 반감기 또는 지속성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 이후 세포가 분열 중인 동안 세포에서 반감기 또는 지속성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 이후 분열 후에 세포에서 반감기 또는 지속성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 이후 분열 중인 세포에서 약 약 10분 초과 내지 약 30일, 또는 적어도 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 24시간, 2일, 3,일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 60일, 또는 그 초과 또는 그 사이의 임의의 시간 동안의 반감기 또는 지속성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 이후 세포 분열 동안 세포에서 지속된다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 이후 유사분열 후에 딸 세포에서 지속된다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체로의 투여 이후 세포 내에서 복제되며, 딸 세포로 이동된다. 일부 실시형태에서, 세포는 대상체로의 투여 이후 적어도 하나의 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 효율로 딸 세포로 이동시킨다. 일부 실시형태에서, 감수분열을 겪는 세포는 대상체로의 투여 이후 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 효율로 딸 세포로 이동시킨다. 일부 실시형태에서, 유사분열을 겪는 세포는 대상체로의 투여 이후 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 효율로 딸 세포로 이동시킨다.
변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드
변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)가 본원에 기재된 방법에서 사용된다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 폴리리보뉴클레오티드 및 연속 미변형 뉴클레오티드의 제1 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드 및 제1 부분을 포함하며 제1 부분은 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들 중 5% 이하가 변형된다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들 중 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5% 이하가 변형된다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 뉴클레오티드들은 변형되지 않는다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 5% 이하의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 변형 뉴클레오티드를 포함하지 않는 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 단백질, 펩티드, 생체분자, DNA, RNA, 또는 세포 표적에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 5’-메틸시티딘, 슈도우리딘 또는 N1-메틸-슈도우리딘을 결여한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 약제학적 조성물에 포함되며, 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체에게 전달된다. 본원에 기술된 바와 같은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물에 비하여 저하된 또는 감소된 면역원성, 증가된 번역 효율(예를 들어, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현) 또는 증가된 안정성을 가질 수 있다.
제1 부분은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 5% 이하의 변형된 뉴클레오티드를 갖는 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 인접 뉴클레오티드들 중 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5% 이하가 변형된다. 제1 부분은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 인접 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 제1 부분은 적어도 약 5개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5%를 넘지 않는 변형 뉴클레오티드를 갖는 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5%를 넘지 않는 변형 뉴클레오티드를 갖는 적어도 약 5개 내지 1000개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 적어도 약 5개 내지 1000개, 10개 내지 1000개, 20개 내지 1000개, 50개 내지 1000개, 100개 내지 1000개, 200개 내지 1000개, 300개 내지 1000개, 400개 내지 1000개, 500개 내지 1000개, 600개 내지 1000개, 700개 내지 1000개, 800개 내지 1000개, 900개 내지 1000개, 또는 900개 내지 2000개의 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5%를 넘지 않는 변형 뉴클레오티드를 갖는 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 적어도 약 5개 내지 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 적어도 약 5개 내지 1000개, 10개 내지 1000개, 20개 내지 1000개, 50개 내지 1000개, 100개 내지 1000개, 200개 내지 1000개, 300개 내지 1000개, 400개 내지 1000개, 500개 내지 1000개, 600개 내지 1000개, 700개 내지 1000개, 800개 내지 1000개, 900개 내지 1000개, 또는 900개 내지 2000개의 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 또는 이들 사이의 임의의 개수의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함한다. 제1 부분은 IRES를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 펩티드, 단백질, 생체분자, DNA, RNA, 또는 세포 표적에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함한다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 IRES 요소, 또는 단백질, DNA, RNA 또는 세포 표적에 결합하도록 구성된 결합 부위를 제외한 원형 폴리리보뉴클레오티드의 도처에 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어, 5’ 메틸시티딘 및 슈도우리딘을 갖는다. 이들 경우에, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 더 낮은 면역원성을 갖는다. 이러한 경우, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 5'메틸시티딘 및 슈도우리딘을 포함하지 않는 대응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비해 낮은 면역원성을 가진다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 낮은 면역원성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 면역원성은 RIG-I, TLR-3, TLR-7, TLR-8, MDA-5, LGP-2, OAS, OASL, PKR, 및 IFN-베타 중 적어도 하나의 발현 또는 신호전달 또는 활성화에 의해 평가된다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드, 예를 들어, 5'메틸시티딘 및 슈도우리딘을 포함하지 않는 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비해 큰 반감기를 가진다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 높은 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 반감기는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 대응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 세포 내로 도입하고, 세포 내측에서 도입된 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 대응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 측정함으로써 측정된다.
변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 인접 미변형 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분 및 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 제1 부분의 외측에 존재한다. 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 미변형 천연 리보뉴클레오티드, 예컨대 본원에 기술된 바와 같이 나타낸 바와 같은 천연 미변형 뉴클레오티드 아데노신(A), 우리딘(U), 구아닌(G), 시티딘(C)의 화학적 조성에 대하여 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 유사체 또는 유도체일 수 있다. 변형된 리보뉴클레오티드의 화학적 변형은 예컨대 당, 핵염기, 또는 (예를 들어, 연결 포스페이트로의 / 포스포디에스테르 링키지로의 / 포스포디에스테르 백본으로의) 뉴클레오시드간 링키지 등, 리보뉴클레오티드의 임의의 하나 이상의 작용성 기에 대한 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 전사-후 변형(예를 들어, 캡핑, 절단, 폴리아데닐화, 스플라이싱, 폴리-A 서열, 메틸화, 아실화, 인산화, 라이신 및 아르기닌 잔기의 메틸화, 아세틸화, 및 티올기 및 티로신 잔기의 니트로실화 등)을 포함한다. 하나 이상의 전사-후 변형은 임의의 전사-후 변형, 예컨대 RNA에서 확인된 바 있는 100가지 초과의 상이한 뉴클레오시드 변형 중 임의의 것일 수 있다(문헌[Rozenski, J, Crain, P, and McCloskey, J. (1999). The RNA Modification Database: 1999 update. Nucl Acids Res 27: 196-197]). 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 피리딘-4-온 리보뉴클레오시드, 5-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시우리딘, 3-메틸우리딘, 5-카복시메틸-우리딘, 1-카복시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘 및 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 5-아자-시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포르밀시티딘, N4-메틸시티딘, 5-하이드록시메틸시티딘, 1-메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 제불라린, 5-아자-제불라린, 5-메틸-제불라린, 5-아자-2-티오-제불라린, 2-티오-제불라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘 및 4-메톡시-1-메틸-슈도이소시티딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린, 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6-(시스-하이드록시이소펜테닐)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시이소펜테닐) 아데노신, N6-글리시닐카바모일아데노신, N6-트레오닐카바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카바모일아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌 및 2-메톡시-아데닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, mRNA는 이노신, 1-메틸-이노신, 와이오신(wyosine), 와이부토신(wybutosine), 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신 및 N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오시드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다: N(6)메틸아데노신(m6A), 5’-메틸시티딘(5mC), 슈도우리딘 또는 N1-메틸-슈도우리딘, 2’-O-메틸, 2’-O-메톡시에틸(2’-O-MOE), 2’-O-아미노프로필, 2’-데옥시, T-데옥시-2’-플루오로, 2’-O-아미노프로필(2’-O-AP), 2’-O-디메틸아미노에틸(2’-O-DMAOE), 2’-O-디메틸아미노프로필(2’-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2’-O-DMAEOE), 2’-O-N-메틸아세트아미도(2’-O-NMA), 잠금 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩티드 핵산(PNA), 1’,5’-언하이드로헥시톨 핵산(HNA), 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드 및 2’-플루오로 N3-P5’-포스포르아미디트. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 본원에 참조로 포함되는 문헌[Gilbert, W.V., et al. Science. 2016 Jun17; 352(6292): 1408 - 1412]에서와 같은 또는 상기 문헌에서 확인된 것들과 같은 당업자에 의해 알려져 있는 뉴클레오티드 변형을 포함한다.
변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 예컨대 당, 핵염기, 또는 (예를 들어, 연결 포스페이트로의 / 포스포디에스테르 링키지로의 / 포스포디에스테르 백본으로의) 뉴클레오시드간 링키지에 대한 임의의 유용한 변형을 포함할 수 있다. 피리미딘 핵염기의 하나 이상의 원자는 선택적으로 치환된 아미노, 선택적으로 치환된 티올, 선택적으로 치환된 알킬(예를 들어, 메틸 또는 에틸) 또는 할로(예를 들어, 클로로 또는 플루오로)로 대체되거나 치환될 수 있다. 특정 실시형태에서, 변형(예를 들어, 하나 이상의 변형)은 당 및 뉴클레오시드간 링키지의 각각에 존재한다. 변형은 리보핵산(RNA)으로부터 데옥시리보핵산(DNA), 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA) 또는 그의 혼성물로의 변형일 수 있다). 추가의 변형은 본원에 기술된다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 번역 효율을 증가시키기 위해 적어도 하나의 N(6)메틸아데노신(m6A) 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, N(6)메틸아데노신(m6A) 변형은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 면역원성을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형은 화학적 또는 세포 유도된 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포내 RNA 변형의 일부 비제한적인 예는 문헌[Lewis and Pan in "RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions" from Nat Reviews Mol Cell Biol, 2017, 18:202-210]에 기술되어 있다.
“슈도우리딘”은 또 다른 실시형태에서, m1acp3Ψ(1-메틸-3-(3-아미노-3-카복시프로필) 슈도우리딘을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 상기 용어는 m1Ψ(1-메틸슈도우리딘)을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 상기 용어는 Ψm(2′-O-메틸슈도우리딘을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 상기 용어는 m5D(5-메틸디하이드로우리딘)을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 상기 용어는 m3Ψ(3-메틸슈도우리딘)을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 상기 용어는 추가로 변형되지 않은 슈도우리딘 모이어티를 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 상기 용어는 상기 슈도우리딘 중 어느 하나의 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트를 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 상기 용어는 당업계에 알려져 있는 임의의 다른 슈도우리딘을 나타낸다. 각각의 가능성은 본 발명의 개별 실시형태를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 리보뉴클레오티드에 대한 화학적 변형은 면역 회피를 증강시킬 수 있다. 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 해당 분야에 널리 확립된 방법, 예컨대 본원에 참조로 포함된 문헌["Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA]에 기술된 것들에 의해 합성되고/되거나 변형될 수 있다. 변형은 예를 들어, 말단 변형, 예를 들어, 5' 말단 변형(인산화(단일-, 이중- 및 삼중-), 컨쥬게이션, 역위된 링키지 등), 3' 말단 변형(컨쥬게이션, DNA 뉴클레오티드, 역위된 링키지 등), 염기 변형(예를 들어, 안정화 염기, 불안정화 염기, 또는 파트너의 연장된 레퍼토리(expanded repertoire)와 염기 쌍을 형성하는 염기로의 대체), 염기의 제거(무염기 뉴클레오티드), 또는 컨쥬게이트된 염기를 포함한다. 변형된 리보뉴클레오티드 염기는 또한 5-메틸시티딘 및 슈도우리딘을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기 변형은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 몇 가지 기능적 효과를 말하자면, 발현, 면역 반응, 안정성, 하위세포 국소화를 조절할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형은 이원-직교 뉴클레오티드, 예를 들어, 비천연 염기를 포함한다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Kimoto et al, Chem Commun (Camb), 2017, 53:12309, DOI: 10.1039/c7cc06661a]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 리보뉴클레오티드가 그럴 수 있는 (예를 들어, 2' 위치 또는 4' 위치에서의) 당 변형 또는 당의 대체 및 백본 변형은 포스포디에스테르 링키지의 변형 또는 대체를 포함한다. 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 특정 예는, 변형된 백본을 포함하거나 천연 뉴클레오시드간 링키지, 예컨대 뉴클레오시드간 변형, 예컨대, 포스포디에스테르 링키지의 변형 또는 대체를 포함하지 않는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 변형된 백본을 갖는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 특히, 백본 내에 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함한다. 본 출원의 목적을 위해, 때때로 해당 분야에 참조된 바와 같이, 그들의 뉴클레오시드간 백본 내에 인 원자를 갖지 않는 변형된 RNA는 또한 올리고뉴클레오시드인 것으로 간주될 수 있다. 특정 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 그의 뉴클레오시드간 백본 내에 인 원자를 갖는 리보뉴클레오티드를 포함할 것이다.
변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 백본은 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 예컨대 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 예컨대 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르 및 보통의 3'-5' 링키지를 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체 및 역전된 극성을 갖는 것들을 포함할 수 있으며, 뉴클레오시드 단위의 인접 쌍은 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된다. 다양한 염, 혼합된 염 및 유리 산 형태도 포함된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 음으로 하전되거나 양으로 하전될 수 있다.
변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내로 혼입될 수 있는 변형된 뉴클레오티드는 뉴클레오시드간 링키지(예를 들어, 포스페이트 백본)에서 변형될 수 있다. 본원에서, 폴리뉴클레오티드 백본의 맥락에서, 어구 "포스페이트" 및 "포스포디에스테르"는 상호교환 가능하게 사용된다. 백본 포스페이트 기는 산소 원자 중 하나 이상을 상이한 치환기로 대체함으로써 변형될 수 있다. 추가로, 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 또 다른 뉴클레오시드간 링키지로의 미변형된 포스페이트 모이어티의 대량의 대체를 포함할 수 있다. 변형된 포스페이트 기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노포스페이트, 보라노포스페이트 에스테르, 하이드로겐 포스포네이트, 포스포르아미데이트, 포스포로디아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 포스포로디티오에이트는 둘 모두 황에 의해 대체되는 비-연결 산소를 갖는다. 포스페이트 링커는 또한, 질소(가교된 포스포르아미데이트), 황(가교된 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교된 메틸렌-포스포네이트)로의 연결 산소의 대체에 의해 변형될 수 있다.
비천연 포스포로티오에이트 백본 링키지를 통해 RNA 및 DNA 폴리머에 안정성을 부여하기 위해 a-티오 치환된 포스페이트 모이어티가 제공된다. 포스포로티오에이트 DNA 및 RNA는 증가된 뉴클레아제 저항성을 가지며, 결과적으로 세포 환경에서 더 긴 반감기를 갖는다. 원형 폴리리보뉴클레오티드에 연결된 포스포로티오에이트는 세포의 선천적 면역 분자의 더 약한 결합/활성화를 통하여 선천적 면역 반응을 감소시키는 것으로 예상된다.
특정 실시형태에서, 변형된 뉴클레오시드는 알파-티오-뉴클레오시드(예를 들어, 5'-0-(l-티오포스페이트)-아데노신, 5'-0-(l-티오포스페이트)-시티딘(a-티오-시티딘), 5'-0-(l-티오포스페이트)-구아노신, 5'-0-(l-티오포스페이트)-우리딘 또는 5'-0-(1-티오포스페이트)-슈도우리딘)를 포함한다.
인 원자를 함유하지 않는 뉴클레오시드간 링키지를 포함하는, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 뉴클레오시드간 링키지가 본원에 기술된다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 세포독성 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포독성 뉴클레오시드가 원형 폴리리보뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있다(예컨대, 이작용성 변형). 세포독성 뉴클레오시드는 아데노신 아라비노시드, 5-아자시티딘, 4'-티오-아라시티딘, 사이클로펜테닐시토신, 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시타라빈(cytarabine), 시토신 아라비노시드, l-(2-C-시아노-2-데옥시-베타-D-아라비노-펜토푸라노실)-시토신, 데시타빈(decitabine), 5-플루오로우라실, 플루다라빈(fludarabine), 플록스우리딘(floxuridine), 젬시타빈(gemcitabine), 테가푸르(tegafur)와 우라실의 조합, 테가푸르((RS)-5-플루오로-l-(테트라하이드로푸란-2-일)피리미딘-2,4(lH,3H)-디온), 트록사시타빈(troxacitabine), 테자시타빈(tezacitabine), 2'-데옥시-2'-메틸리덴시티딘(DMDC) 및 6-머캅토퓨린을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 추가의 예는 플루다라빈 포스페이트, N4-베헤노일-l-베타-D-아라비노푸라노실시토신, N4-옥타데실-1-베타-D-아라비노푸라노실시토신, N4-팔미토일-l-(2-C-시아노-2-데옥시-베타-D-아라비노-펜토푸라노실) 시토신 및 P-4055(시타라빈 5'-엘라이드산 에스테르)를 포함한다.
변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 분자의 전체 길이를 따라 균일하게 변형될 수 있거나, 그렇지 않을 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 또는 모든 유형의 뉴클레오티드(예를 들어, 천연-발생 뉴클레오티드, 퓨린 또는 피리미딘 또는 A, G, U, C, I, pU 중 임의의 하나 이상 또는 전부)가 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내에서 또는 그의 주어진 소정의 서열 영역 내에서 균일하게 변형되거나 변형되지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 슈도우리딘을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 이노신을 포함하며, 이는 면역계를 보조하여, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 바이러스 RNA에 대해 내인성으로서 특성화할 수 있다. 이노신의 혼입은 또한 개선된 RNA 안정성/감소된 분해를 매개할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Yu, Z. et al. (2015) RNA editing by ADAR1 marks dsRNA as "self". Cell Res. 25, 1283-1284]을 참조하며, 이는 그 전문이 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 그의 주어진 서열 영역 내의 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의(예를 들어, 제1 부분 또는 미변형 부분이 아닌) 모든 뉴클레오티드가 변형된다. 일부 실시형태에서, 변형은 발현을 증강시키고/증강시키거나 면역 반응을 약화시킬 수 있는 m6A; 면역 반응을 약화시킬 수 있는 이노신; RNA 안정성 또는 번역 초과(translational readthrough)를 증가시킬 수 있는 슈도우리딘(스태거 요소), 안정성을 증가시키고/증가시키거나 면역 반응을 약화시킬 수 있는 m5C; 및 하위세포 전좌(예를 들어, 핵 국소화)를 보조하는 2,2,7-트리메틸구아노신을 포함할 수 있다.
상이한 당 변형, 뉴클레오티드 변형 및/또는 뉴클레오시드간 링키지(예를 들어, 백본 구조)는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 다양한 위치에 존재할 수 있다. 당업자는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 변형(들)이 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 임의의 위치(들)에 위치하여, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 기능이 실질적으로 감소되지 않게 할 수 있음을 인식할 것이다. 변형은 또한 비-코딩 영역 변형일 수 있다. 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 (전체 뉴클레오티드 함량과 관련하여, 또는 뉴클레오티드의 하나 이상의 유형, 즉, A, G, U 또는 C 중 임의의 하나 이상과 관련하여) 약 1% 내지 약 100% 변형된 뉴클레오티드 또는 임의의 개재 백분율(예를 들어, 1% 내지 20%>, 1% 내지 25%, 1% 내지 50%, 1% 내지 60%, 1% 내지 70%, 1% 내지 80%, 1% 내지 90%, 1% 내지 95%, 10% 내지 20%, 10% 내지 25%, 10% 내지 50%, 10% 내지 60%, 10% 내지 70%, 10% 내지 80%, 10% 내지 90%, 10% 내지 95%, 10% 내지 100%, 20% 내지 25%, 20% 내지 50%, 20% 내지 60%, 20% 내지 70%, 20% 내지 80%, 20% 내지 90%, 20% 내지 95%, 20% 내지 100%, 50% 내지 60%, 50% 내지 70%, 50% 내지 80%, 50% 내지 90%, 50% 내지 95%, 50% 내지 100%, 70% 내지 80%, 70% 내지 90%, 70% 내지 95%, 70% 내지 100%, 80% 내지 90%, 80% 내지 95%, 80% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100% 및 95% 내지 100%)을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 완전하게 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드이며, 모든 또는 실질적으로 모든 변형된 아데노신 잔기, 모든 또는 실질적으로 모든 변형된 우리딘 잔기, 모든 또는 실질적으로 모든 변형된 구아닌 잔기, 모든 또는 실질적으로 모든 변형된 시티딘 잔기 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, circRNA는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80% 의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 완전히 변형된 circRNA는 실질적으로 모든 (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 초과, 또는 약 100%) 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드이다. 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있으며, 인접 미변형 뉴클레오티드의 부분(예를 들어, 제1 부분/미변형 부분)을 가질 수 있다. 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 이 미변형 부분은 적어도 약 5개, 10개, 15개 또는 20개 또는 그 사이의 임의의 수의 인접 미변형 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 미변형 부분은 적어도 약 30개, 40개, 40개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 180개, 200개, 220개, 250개, 280개, 300개, 320개, 350개, 380개, 400개, 420개, 450개, 500개, 550개, 600개, 650개, 700개, 750개, 800개, 850개, 900개 또는 1000개 또는 그 사이의 임의의 수의 인접 미변형 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 미변형 부분을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 12개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 70개, 80개, 100개, 120개, 150개, 200개, 250개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 1%, 2%, 5%, 7%, 8%, 10%, 12%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%이되 100%보다는 적은 변형된 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 미변형 부분은 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 미변형 부분은 펩티드, 단백질, 생체분자, DNA, RNA, 또는 세포 표적에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 미변형 부분은 IRES를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 다르게는 동일하지만 완전하게 변형된 대응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 유사한 면역원성을 갖는다. 예를 들어, 그의 IRES 요소를 제외한 도처에 5’ 메틸시티딘 및 슈도우리딘을 갖는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는, 다르게는 동일하지만 도처에 5’ 메틸시티딘 및 슈도우리딘을 갖고 미변형 시티딘 및 우리딘을 갖지 않는 대응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 유사한 면역원성 또는 더 낮은 면역원성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 그의 IRES 요소를 제외한 도처에 5’ 메틸시티딘 및 슈도우리딘을 갖는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는, 다르게는 동일하지만 도처에 5’ 메틸시티딘 및 슈도우리딘을 갖고 미변형 시티딘 및 우리딘을 갖지 않는 대응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역 효율과 유사하거나 그보다 더 높은 번역 효율을 갖는다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 미변형된, 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드를 갖지 않는 결합 부위를 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 미변형된, 예를 들어, 변형 뉴클레오티드를 갖지 않는 단백질, DNA, RNA, 또는 세포 표적에 결합하도록 구성된 결합 부위를 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 미변형된, 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드를 갖지 않는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드인 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 내의 5% 이하의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시형태에서, IRES의 뉴클레오티드들은 변형되지 않는다. 일부 실시형태에서, IRES의 뉴클레오티드들 중 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5% 이하가 변형된다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 결합 부위를 제외한 도처에 변형된 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 펩티드, 단백질, 생체분자, DNA, RNA, 또는 세포 표적에 결합하도록 구성된 결합 부위를 제외하고는 전체에 변형 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 IRES 요소를 제외한 도처에 변형된 뉴클레오티드를 갖는다. 다른 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 IRES 요소 및 하나 이상의 다른 부분을 제외한 도처에 변형된 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 이론에 결부시키고자 하지 않고, 미변형 IRES 요소는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 번역 적격이 되게 하며, 예를 들어, 어떠한 변형된 뉴클레오티드도 갖지 않는 대응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드와 유사하거나 그보다 더 높은 하나 이상의 발현 서열에 대한 번역 효율을 갖게 한다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 적어도 선형 대응물, 예를 들어, 선형 발현 서열 또는 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 선형 대응물의 것보다 증가된 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 반감기는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그를 초과하여 증가된다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 세포에서 적어도 약 1시간 내지 약 30일, 또는 적어도 약 2시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3,일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 60일, 또는 그 초과 또는 그 사이의 임의의 시간 동안의 반감기 또는 지속성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 세포에서 약 10분 이하 내지 약 7일, 또는 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 4일, 5일, 6일, 7일 이하 또는 그 사이의 임의의 시간 동안의 반감기 또는 지속성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 세포가 분열 중인 동안 세포에서 반감기 또는 지속성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 분열 후에 세포에서 반감기 또는 지속성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 분열 중인 세포에서 약 약 10분 초과 내지 약 30일, 또는 적어도 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 24시간, 2일, 3,일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 60일, 또는 그 초과 또는 그 사이의 임의의 시간 동안의 반감기 또는 지속성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 발현 서열을 포함하며, 생체내에서 대상체의 세포 내의 지속적인 발현을 위해 구성된다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 나중의 시점에서의 세포 내의 하나 이상의 발현 서열의 발현이 조기의 시점과 동일하거나, 그보다 더 크도록 구성된다. 이러한 실시형태에서, 하나 이상의 발현 서열의 발현은 상대적으로 안정한 수준으로 유지될 수 있거나, 시간이 지남에 따라 증가할 수 있다. 발현 서열의 발현은 연장된 기간 동안 상대적으로 안정할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 적어도 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일, 20일, 22일, 23일 또는 그 초과의 기간에 걸친 세포 내의 하나 이상의 발현 서열의 발현은 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 감소하지 않는다. 일부 경우에, 일부 경우에, 세포에서의 하나 이상의 발현 서열의 발현은 적어도 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일, 20일, 22일, 23일 또는 그 초과 동안 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5%를 초과하여 달라지지 않는 수준으로 유지된다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 포유동물, 예를 들어, 인간에서 비-면역원성이다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 수산양식 동물(어류, 게류, 새우, 굴 등) 유래의 세포, 포유동물 세포, 예를 들어, 애완동물 또는 동물원 동물(고양이, 개, 도마뱀, 조류, 사자, 호랑이, 곰 등) 유래의 세포, 농장 또는 일하는 동물(말, 소, 돼지, 닭 등) 유래의 세포, 인간 세포, 배양된 세포, 일차 세포 또는 세포주, 줄기 세포, 전구 세포, 분화된 세포, 생식 세포, 암 세포(예를 들어, 종양형성, 전이성), 비-종양형성 세포(정상 세포), 태아 세포, 배아 세포, 성인 세포, 유사분열 세포, 비-유사분열 세포 또는 그의 임의의 조합에서 복제 가능하거나, 복제된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기술된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 포함하는 세포를 포함하며, 세포는 수산양식 동물(어류, 게류, 새우, 굴 등) 유래의 세포, 포유동물 세포, 예를 들어, 애완동물 또는 동물원 동물(고양이, 개, 도마뱀, 조류, 사자, 호랑이, 곰 등) 유래의 세포, 농장 또는 일하는 동물(말, 소, 돼지, 닭 등) 유래의 세포, 인간 세포, 배양된 세포, 일차 세포 또는 세포주, 줄기 세포, 전구 세포, 분화된 세포, 생식 세포, 암 세포(예를 들어, 종양형성, 전이성), 비-종양형성 세포(정상 세포), 태아 세포, 배아 세포, 성인 세포, 유사분열 세포, 비-유사분열 세포 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 세포는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 포함하도록 변형된다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 세포 기능을 예를 들어, 일시적으로 또는 장기간 조절한다. 특정 실시형태에서, 세포 기능은 안정하게 변경되며, 예컨대 조절은 적어도 약 1시간 내지 약 30일, 또는 적어도 약 2시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 60일 이상 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 지속된다. 특정 실시형태에서, 세포 기능은 일시적으로 변경되며, 예를 들어, 예컨대 조절은 약 30분 이하 내지 약 7일 또는 약 1시간 이하, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 지속된다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 30개 뉴클레오티드, 적어도 약 40개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 75개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 적어도 약 1,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 2,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 5,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 6,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 7,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 8,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 9,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 10,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 12,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 14,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 15,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 16,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 17,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 18,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 19,000개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 20,000개 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 리보솜에 대한 결합 부위를 수용하기에 충분한 크기의 것일 수 있다. 당업자는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 최대 크기가 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 생성 및/또는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 이용의 기술적 제약 내에 있는 것만큼 클 수 있음을 인식할 수 있다. 이론에 구속되지는 않지만, RNA의 다수의 세그먼트가 DNA로부터 생성될 수 있고, 그들의 5' 및 3' 자유 말단은 어닐링되어, RNA의 "스트링"을 생성하는 것이 가능하며, 이는 궁극적으로 오직 하나의 5' 및 하나의 3' 자유 말단이 남아있을 때 원형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 최대 크기는 RNA의 패키징 및 표적으로의 운반 능력에 의해 제한될 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 크기는 유용한 폴리펩티드를 인코딩하기에 충분한 길이이며, 이에 따라, 적어도 20,000개 뉴클레오티드, 적어도 15,000개 뉴클레오티드, 적어도 10,000개 뉴클레오티드, 적어도 7,500개 뉴클레오티드, 또는 적어도 5,000개 뉴클레오티드, 적어도 4,000개 뉴클레오티드, 적어도 3,000개 뉴클레오티드, 적어도 2,000개 뉴클레오티드, 적어도 1,000개 뉴클레오티드, 적어도 500개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드의 길이가 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 본원의 다른 곳에 기술된 하나 이상의 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 요소는 스페이서 서열 또는 링커에 의해 서로 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 요소는 1개의 리보뉴클레오티드, 2개의 뉴클레오티드, 약 5개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드, 약 15개의 뉴클레오티드, 약 20개의 뉴클레오티드, 약 30개의 뉴클레오티드, 약 40개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드, 약 60개의 뉴클레오티드, 약 80개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드, 약 150개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드, 약 250개의 뉴클레오티드, 약 300개의 뉴클레오티드, 약 400개의 뉴클레오티드, 약 500개의 뉴클레오티드, 약 600개의 뉴클레오티드, 약 700개의 뉴클레오티드, 약 800개의 뉴클레오티드, 약 900개의 뉴클레오티드, 약 1,000개의 뉴클레오티드, 최대 약 1 kb, 적어도 약 1,000개의 뉴클레오티드, 그 사이의 임의의 양의 뉴클레오티드에 의해 서로 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 요소는 서로 인접하며, 예를 들어, 스페이서 요소를 결여한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 하나 이상의 요소는 입체형태적으로 유연성이다. 일부 실시형태에서, 입체형태적 유연성은 이차 구조가 실질적으로 없는 서열에 기인한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 본원에 기술된 하나 이상의 요망되는 기능 또는 특징을 수용하는, 예를 들어, 리보솜에 대한 결합 부위, 예를 들어, 번역, 예를 들어, 회전환 번역을 수용하는 이차 또는 삼차 구조를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 특정 서열 특징을 포함한다. 예를 들어, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 특정 뉴클레오티드 조성을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 퓨린 풍부 영역(아데닌 또는 구아노신)을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 퓨린 풍부 영역(아데닌 또는 구아노신)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 AU 풍부 영역 또는 요소(ARE)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 아데닌 풍부 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 본원의 다른 곳에 기술된 하나 이상의 반복 요소를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 본원의 다른 곳에 기술된 하나 이상의 변형을 포함한다.
변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 참조 서열, 특히 모체 폴리리보뉴클레오티드에 대해 하나 이상의 치환, 삽입 및/또는 부가, 결실 및 공유적 변형을 포함할 수 있으며, 본 발명의 범주 내에 포함된다.
발현 서열
펩티드 또는 폴리펩티드
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 발현 서열을 포함한다. 이러한 펩티드는 소형 펩티드, 펩티드모방체(예를 들어, 펩토이드(peptoid)), 아미노산 및 아미노산 유사체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 펩티드는 선형 또는 분지형일 수 있다. 이러한 펩티드는 몰당 약 5,000 그램 미만의 분자량, 몰당 약 2,000 그램 미만의 분자량, 몰당 약 1,000 그램 미만의 분자량, 몰당 약 500 그램 미만의 분자량, 및 이러한 화합물의 염, 에스테르, 및 다른 약제학적으로 허용 가능한 형태를 가질 수 있다. 이러한 펩티드는 신경전달물질, 호르몬, 약물, 독소, 바이러스 또는 미생물 입자, 합성 분자 및 그의 효능제 또는 길항제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
폴리펩티드는 선형 또는 분지형일 수 있다. 폴리펩티드는 약 5개 내지 약 40,000개 아미노산, 약 15개 내지 약 35,000개 아미노산, 약 20개 내지 약 30,000개 아미노산, 약 25개 내지 약 25,000개 아미노산, 약 50개 내지 약 20,000개 아미노산, 약 100개 내지 약 15,000개 아미노산, 약 200개 내지 약 10,000개 아미노산, 약 500개 내지 약 5,000개 아미노산, 약 1,000개 내지 약 2,500개 아미노산 또는 그 사이의 임의의 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 약 40,000개 미만의 아미노산, 약 35,000개 미만의 아미노산, 약 30,000개 미만의 아미노산, 약 25,000개 미만의 아미노산, 약 20,000개 미만의 아미노산, 약 15,000개 미만의 아미노산, 약 10,000개 미만의 아미노산, 약 9,000개 미만의 아미노산, 약 8,000개 미만의 아미노산, 약 7,000개 미만의 아미노산, 약 6,000개 미만의 아미노산, 약 5,000개 미만의 아미노산, 약 4,000개 미만의 아미노산, 약 3,000개 미만의 아미노산, 약 2,500개 미만의 아미노산, 약 2,000개 미만의 아미노산, 약 1,500개 미만의 아미노산, 약 1,000개 미만의 아미노산, 약 900개 미만의 아미노산, 약 800개 미만의 아미노산, 약 700개 미만의 아미노산, 약 600개 미만의 아미노산, 약 500개 미만의 아미노산, 약 400개 미만의 아미노산, 약 300개 미만의 아미노산 또는 그 미만의 길이를 갖는 폴리펩티드가 유용할 수 있다.
펩티드 또는 폴리펩티드의 일부 예는 형광 태그 또는 마커, 항원, 펩티드 치료제, 천연-생물활성 펩티드로부터의 합성 또는 유사체 펩티드, 효능제 또는 길항제 펩티드, 항-미생물 펩티드, 포어-형성 펩티드, 바이사이클릭 펩티드, 표적화 또는 세포독성 펩티드, 분해 또는 자가-파괴 펩티드, 및 분해 또는 자가-파괴 펩티드들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 기술된 본 발명에 유용한 펩티드는 또한, 항원-결합 펩티드, 예를 들어, 항원 결합 항체 또는 항체-유사 단편, 예컨대 단일 쇄 항체, 나노바디(예를 들어, 문헌[Steeland et al. 2016. Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discov Today: 21(7):1076-113] 참조)를 포함한다. 이러한 항원 결합 펩티드는 시토졸 항원, 핵 항원, 세포소기관-내 항원에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 RNA 발현 서열을 포함하며, 이의 각각은 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 폴리펩티드는 상당한 양으로 생성될 수 있다. 따라서, 폴리펩티드는 생성될 수 있는 임의의 단백질성 분자일 수 있다. 폴리펩티드는 세포로부터 분비되거나, 세포의 세포질, 핵 또는 멤브레인 구획으로 국소화될 수 있는 폴리펩티드일 수 있다. 일부 폴리펩티드는 바이러스 외피 단백질, (예를 들어, 지질 또는 스테로이드 생성을 조절하는) 대사 조절 효소, 항원, 면역허용원(toleragen), 사이토카인, 독소, 그의 부재가 질병과 연관된 효소, 및 (예를 들어, 동물의 위에서) 절단될 때까지 동물에서 활성이 아닌 폴리펩티드 및 호르몬의 적어도 일부를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 단백질, 예를 들어, 치료적 단백질을 인코딩하는 발현 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)로부터 발현될 수 있는 치료적 단백질은 항산화 활성, 결합, 카고(cargo) 수용체 활성, 촉매적 활성, 분자 운반체 활성, 분자 기능 조절제, 분자 전달제 활성, 영양소 저장소 활성, 단백질 태그, 구조적 분자 활성, 독소 활성, 전사 조절제 활성, 번역 조절제 활성 또는 수송체 활성을 갖는다. 치료적 단백질의 일부 예는 효소 대체 단백질, 보충용 단백질, 단백질 백신접종, 항원(예를 들어, 종양 항원, 바이러스, 박테리아), 호르몬, 사이토카인, 항체, 면역요법제(예를 들어, 암), 세포 리프로그래밍(reprogramming)/전환분화 인자, 전사 인자, 키메라 항원 수용체, 전위효소 또는 뉴클레아제, (예를 들어, 면역 반응/신호에 대한 감수성에 영향을 미치는) 면역 이펙터, 조절된 사망 이펙터 단백질(예를 들어, 아폽토시스 또는 괴사의 유도제), 종양의 비-용해 저해제(예를 들어, 종양단백질의 저해제), 후성적 변형제, 후성적 효소, 전사 인자, DNA 또는 단백질 변형 효소, DNA-삽입제(DNA-intercalating agent), 유출 펌프 저해제, 핵 수용체 활성화제 또는 저해제, 프로테아좀 저해제, 효소에 대한 경쟁적 저해제, 단백질 합성 이펙터 또는 저해제, 뉴클레아제, 단백질 단편 또는 도메인, 리간드 또는 수용체, 및 CRISPR 시스템 또는 그의 성분을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)로부터 발현될 수 있는 예시적인 단백질은 인간 단백질, 예를 들어, 수용체 결합 단백질, 호르몬, 성장 인자, 성장 인자 수용체 조절제 및 재생 단백질(예를 들어, 증식 및 분화에 연루되는 단백질, 예를 들어, 상처 치유를 위한 치료적 단백질)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)로부터 발현될 수 있는 예시적인 단백질은 EGF(상피 성장 인자)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)로부터 발현될 수 있는 예시적인 단백질은 효소, 예를 들어, 산화환원효소, 대사 효소, 미토콘드리아 효소, 옥시게나제, 데하이드로게나제, ATP-독립성 효소 및 불포화효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)로부터 발현될 수 있는 예시적인 단백질은 세포내 단백질 또는 시토졸 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 NanoLuc® 루시퍼라제(nLuc)를 발현한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)로부터 발현될 수 있는 예시적인 단백질은 분비 단백질, 예를 들어, 분비 효소를 포함한다. 일부 경우에, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는, 혈중 짧은 반감기 치료제를 가질 수 있거나 하위세포 국소화 신호를 갖는 단백질 또는 분비 신호 펩티드를 갖는 단백질일 수 있는 분비 단백질을 발현한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 가우시아 루시퍼라제(gLuc)를 발현한다. 일부 경우에, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 비-인간 단백질, 예를 들어, 형광 단백질, 에너지-전달 억셉터 또는 Flag, Myc 또는 His와 같은 단백질-태그를 발현한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)로부터 발현될 수 있는 예시적인 단백질은 GFP를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 태깅된 단백질, 예를 들어, 단백질 테이지(tage), 예를 들어, 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP), Fc 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), AviTag(GLNDIFEAQKIEWHE), 칼모듈린(Calmodulin)-태그(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL); 폴리글루탐산염 태그(EEEEEE); E-태그(GAPVPYPDPLEPR); FLAG-태그(DYKDDDDK), HA-태그(YPYDVPDYA); His-태그(HHHHHH); Myc-태그(EQKLISEEDL); NE-태그(TKENPRSNQEESYDDNES); S-태그(KETAAAKFERQHMDS); SBP-태그(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP); Softag 1(SLAELLNAGLGGS); Softag 3(TQDPSRVG); Spot-태그(PDRVRAVSHWSS); Strep-태그(Strep-tag II: WSHPQFEK); TC 태그(CCPGCC); Ty 태그(EVHTNQDPLD); V5 태그(GKPIPNPLLGLDST); VSV-태그(YTDIEMNRLGK); 또는 Xpress 태그(DLYDDDDK)를 함유하는 융합 단백질 또는 조작된 단백질을 발현한다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 항체, 예를 들어, 항체 단편 또는 그의 일부를 발현한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)에 의해 발현되는 항체는 임의의 아이소타입, 예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM의 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 항체의 일부, 예컨대, 경쇄, 중쇄, Fc 단편, CDR(상보성 결정 영역), Fv 단편 또는 Fab 단편, 그의 추가의 부분을 발현한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 항체의 하나 이상의 부분을 발현한다. 예를 들어, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 1가지 초과의 발현 서열을 포함할 수 있으며, 그의 각각은 항체의 일부를 발현하며, 이의 합은 항체를 구성할 수 있다. 일부 경우에, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 항체의 중쇄를 코딩하는 하나의 발현 서열 및 항체의 경쇄를 코딩하는 또 다른 발현 서열을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)가 세포 또는 무세포 환경에서 발현되는 경우에, 경쇄 및 중쇄는 적절한 변형, 폴딩 또는 다른 번역후 변형을 거쳐 기능성 항체를 형성할 수 있다.
조절 요소
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 조절 요소, 예를 들어, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 발현을 변형시키는 서열을 포함한다.
조절 요소는, 발현 생성물을 인코딩하는 발현 서열에 인접하여 위치한 서열을 포함할 수 있다. 조절 요소는 인접 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 조절 요소는 조절 요소가 존재하지 않는 경우 발현되는 생성물의 양에 비하여, 발현되는 생성물의 양을 증가시킬 수 있다. 또한, 하나의 조절 요소는 탠덤으로 부착된 다수의 발현 서열에 대해 발현되는 생성물의 양을 증가시킬 수 있다. 그러므로, 하나의 조절 요소는 하나 이상의 발현 서열의 발현을 증강시킬 수 있다. 다수의 조절 요소는 해당 분야의 숙련자에게 널리 알려져 있다.
본원에 제공되는 바와 같은 조절 요소는 선택적 번역 서열을 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "선택적 번역 서열"은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 번역을 선택적으로 개시하거나 활성화시키는 핵산 서열, 예를 들어, 특정 리보스위치 압타자임을 지칭할 수 있다. 조절 요소는 또한 선택적 분해 서열을 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "선택적 분해 서열"은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 발현 생성물의 분해를 개시하는 핵산 서열을 지칭할 수 있다. 예시적인 선택적 분해 서열은 리보스위치 압타자임 및 miRNA 결합 부위를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조절 요소는 번역 조절자이다. 번역 조절자는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 번역을 조절할 수 있다. 번역 조절자는 번역 증강자 또는 억제자일 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 적어도 하나의 발현 서열에 인접한 적어도 하나의 번역 조절자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 각 발현 서열에 인접한 번역 조절자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 번역 조절자는 각 발현 서열의 한측 또는 양측 모두에 존재하여, 발현 생성물, 예를 들어, 펩티드(들) 및 또는 폴리펩티드(들)의 분리를 야기한다.
일부 실시형태에서, 번역 개시 서열은 조절 요소로서 기능할 수 있다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열은 AUG 코돈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열은 임의의 진핵 출발 코돈, 예컨대 AUG, CUG, GUG, UUG, ACG, AUC, AUU, AAG, AUA 또는 AGG를 포함한다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열은 코작 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 번역은 선택적 조건, 예를 들어, 스트레스 유도된 조건 하에, 대안적인 번역 개시 서열, 예를 들어, AUG 코돈 이외의 번역 개시 서열에서 시작한다. 비-제한적인 예로서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 번역은 대안적인 번역 개시 서열, 예컨대 ACG에서 시작할 수 있다. 또 다른 비-제한적인 예로서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 번역은 대안적인 번역 개시 서열, CTG/CUG에서 시작할 수 있다. 또 다른 비-제한적인 예로서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 번역은 대안적인 번역 개시 서열, GTG/GUG에서 시작할 수 있다. 또 다른 비-제한적인 예로서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 반복-연관 비-AUG(RAN) 서열, 예컨대 반복 RNA의 짧은 스트레치를 포함하는 대안적인 번역 개시 서열, 예를 들어, CGG, GGGGCC, CAG, CTG에서 번역을 시작할 수 있다.
번역을 개시하는 코돈, 예컨대, 비제한적으로 출발 코돈 또는 대안적인 출발 코돈의 측부 배치된 뉴클레오티드는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역 효율, 길이 및/또는 구조에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Matsuda and Mauro PLoS ONE, 2010 5: 11] 참조; 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 번역을 개시하는 코돈의 측부 배치된 뉴클레오티드 중 임의의 차폐를 사용하여 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역 개시의 위치, 번역 효율, 길이 및/또는 구조를 변경시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 코돈을 차폐시키거나 숨기기 위해 차폐제를 출발 코돈 또는 대안적인 출발 코돈 근처에서 사용하여, 차폐된 출발 코돈 또는 대안적인 출발 코돈에서 번역 개시 확률을 감소시킬 수 있다. 차폐제의 비-제한적인 예는 안티센스 잠금 핵산(LNA) 올리고뉴클레오티드 및 엑손-연접부 복합체(EJC)를 포함한다(예를 들어, 문헌[Matsuda and Mauro describing masking agents LNA oligonucleotides and EJCs (PLoS ONE, 2010 5: 11)] 참조; 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 또 다른 실시형태에서, 번역이 대안적인 출발 코돈에서 개시할 확률을 증가시키기 위해, 차폐제를 사용하여 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 출발 코돈을 차폐할 수 있다.
일부 실시형태에서, 번역은 선택적 조건, 예컨대, 비제한적으로 GRSF-1의 존재 하에서의 바이러스 유도된 선택 하에 개시되며, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 GRSF-1 결합 부위를 포함하며, 예를 들어, http://jvi.asm.org/content/76/20/10417.full을 참조한다.
번역 개시 서열
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 폴리펩티드를 인코딩하며, 번역 개시 서열, 예를 들어, 출발 코돈을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열은 코작 또는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 발현 서열에 인접한 번역 개시 서열, 예를 들어, 코작 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열은 비-코딩 출발 코돈이다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열, 예를 들어, 코작 서열은 각 발현 서열의 한측 또는 양측 모두에 존재하여, 발현 생성물의 분리를 야기한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 발현 서열에 인접한 적어도 하나의 번역 개시 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 입체형태적 유연성을 제공한다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 실질적으로 단일 가닥 영역 내에 존재한다.
변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 1개 초과의 출발 코돈, 예컨대, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개 또는 60개 초과의 출발 코돈을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 번역은 제1 출발 코돈 상에서 개시하거나, 제1 출발 코돈의 다운스트림에서 개시할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 제1 출발 코돈, 예를 들어, AUG가 아닌 코돈에서 개시할 수 있다. 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 번역은 대안적인 번역 개시 서열, 예컨대, 비제한적으로 ACG, AGG, AAG, CTG/CUG, GTG/GUG, ATA/AUA, ATT/AUU, TTG/UUG에서 개시할 수 있다(문헌[Touriol et al. Biology of the Cell 95 (2003) 169- 178] 및 문헌[Matsuda and Mauro PLoS ONE, 2010 5: 11] 참조; 이의 각 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 일부 실시형태에서, 번역은 선택적 조건, 예를 들어, 스트레스 유도된 조건 하에 대안적인 번역 개시 서열에서 시작한다. 비-제한적인 예로서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 번역은 대안적인 번역 개시 서열, 예컨대 ACG에서 시작할 수 있다. 또 다른 비-제한적인 예로서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 번역은 대안적인 번역 개시 서열, CTG/CUG에서 시작할 수 있다. 또 다른 비-제한적인 예로서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 번역은 대안적인 번역 개시 서열, GTG/GUG에서 시작할 수 있다. 또 다른 비-제한적인 예로서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 반복-연관 비-AUG(RAN) 서열, 예컨대 반복 RNA의 짧은 스트레치를 포함하는 대안적인 번역 개시 서열, 예를 들어, CGG, GGGGCC, CAG, CTG에서 번역을 시작할 수 있다.
일부 실시형태에서, 번역은 로카글레이트(Rocaglates)를 이용한 진핵 개시 인자 4A(eIF4A) 처리에 의해 개시된다(번역은 43S 스캐닝을 블로킹하여, 조기의 업스트림 번역 개시, 및 RocA-eIF4A 표적 서열을 갖는 전사물로부터의 감소된 단백질 발현을 야기함으로써 억제됨, 예를 들어, www.nature.com/articles/nature17978 참조).
IRES
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 요소를 포함한다. 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내에 포함시키기에 적합한 IRES 요소는 진핵 리보솜과 연계(engage)될 수 있는 RNA 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IRES 요소는 적어도 약 5개 뉴클레오티드, 적어도 약 8개 뉴클레오티드, 적어도 약 9개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 15개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 25개 뉴클레오티드, 적어도 약 30개 뉴클레오티드, 적어도 약 40개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 250개 뉴클레오티드, 적어도 약 350개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 500개 뉴클레오티드이다. 일 실시형태에서, IRES 요소는 바이러스, 포유동물 및 초파리(Drosophila)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 유기체의 DNA로부터 유래된다. 이러한 바이러스 DNA는 비제한적으로 뇌심근염 바이러스(EMCV) cDNA 및 폴리오바이러스 cDNA와 함께, 피코나바이러스 상보성 DNA(cDNA)로부터 유래될 수 있다. 일 실시형태에서, IRES 요소가 유래되는 초파리 DNA는 드로소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster)로부터의 안테나페디아(Antennapedia) 유전자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, IRES 요소는 적어도 부분적으로 바이러스로부터 유래되며, 예를 들어, 이는 바이러스 IRES 요소, 예컨대 ABPV_IGRpred, AEV, ALPV_IGRpred, BQCV_IGRpred, BVDV1_1-385, BVDV1_29-391, CrPV_5NCR, CrPV_IGR, crTMV_IREScp, crTMV_IRESmp75, crTMV_IRESmp228, crTMV_IREScp, crTMV_IREScp, CSFV, CVB3, DCV_IGR, EMCV-R, EoPV_5NTR, ERAV_245-961, ERBV_162-920, EV71_1-748, FeLV-Notch2, FMDV_type_C, GBV-A, GBV-B, GBV-C, gypsy_env, gypsyD5, gypsyD2, HAV_HM175, HCV_type_1a, HiPV_IGRpred, HIV-1, HoCV1_IGRpred, HRV-2, IAPV_IGRpred, idefix, KBV_IGRpred, LINE-1_ORF1_-101_to_-1, LINE-1_ORF1_-302_to_-202, LINE-1_ORF2_-138_to_-86, LINE-1_ORF1_-44_to_-1, PSIV_IGR, PV_type1_Mahoney, PV_type3_Leon, REV-A, RhPV_5NCR, RhPV_IGR, SINV1_IGRpred, SV40_661-830, TMEV, TMV_UI_IRESmp228, TRV_5NTR, TrV_IGR 또는 TSV_IGR로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, IRES 요소는 적어도 부분적으로, 세포 IRES, 예컨대 AML1/RUNX1, Antp-D, Antp-DE, Antp-CDE, Apaf-1, Apaf-1, AQP4, AT1R_var1, AT1R_var2, AT1R_var3, AT1R_var4, BAG1_p36delta236nt, BAG1_p36, BCL2, BiP_-222_-3, c-IAP1_285-1399, c-IAP1_1313-1462, c-jun, c-myc, Cat-1_224, CCND1, DAP5, eIF4G, eIF4GI-ext, eIF4GII, eIF4GII-long, ELG1, ELH, FGF1A, FMR1, Gtx-133-141, Gtx-1-166, Gtx-1-120, Gtx-1-196, hairless, HAP4, HIF1a, hSNM1, Hsp101, hsp70, hsp70, Hsp90, IGF2_leader2, Kv1.4_1.2, L-myc, LamB1_-335_-1, LEF1, MNT_75-267, MNT_36-160, MTG8a, MYB, MYT2_997-1152, n-MYC, NDST1, NDST2, NDST3, NDST4L, NDST4S, NRF_-653_-17, NtHSF1, ODC1, p27kip1, p53_128-269, PDGF2/c-sis, Pim-1, PITSLRE_p58, Rbm3, reaper, Scamper, TFIID, TIF4631, Ubx_1-966, Ubx_373-961, UNR, Ure2, UtrA, VEGF-A_-133_-1, XIAP_5-464, XIAP_305-466 또는 YAP1로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, IRES 요소는 합성 IRES, 예를 들어, (GAAA)16, (PPT19)4, KMI1, KMI1, KMI2, KMI2, KMIX, X1 또는 X2를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 적어도 하나의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의) 발현 서열의 측부 배치된 적어도 하나의 IRES를 포함한다. 일부 실시형태에서, IRES는 적어도 하나의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의) 발현 서열의 양측 모두에 측부 배치된다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 각 발현 서열의 한측 또는 양측 모두에 하나 이상의 IRES 서열을 포함하여, 생성된 펩티드(들) 및 또는 폴리펩티드(들)의 분리를 야기한다.
종결 요소
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 발현 서열을 포함하며, 각각의 발현 서열은 종결 요소를 갖거나, 이를 갖지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)가 연속적으로 번역되도록, 하나 이상의 발현 서열을 포함하고, 발현 서열은 종결 요소를 결여한다. 종결 요소의 배제는 고착되거나 떨어지는 리보솜의 결여로 인하여 발현 생성물, 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드의 회전환 번역 또는 연속 발현을 초래할 수 있다. 이러한 일 실시형태에서, 회전환 번역은 각 발현 서열을 통하여 연속적 발현 생성물을 발현한다. 일부 다른 실시형태에서, 발현 서열의 종결 요소는 스태거 요소의 부분일 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내의 하나 이상의 발현 서열은 종결 요소를 포함한다. 그러나, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내의 후속(예를 들어, 제2, 제3, 제4, 제5 등의) 발현 서열의 회전환 번역 또는 발현이 수행된다. 이러한 예에서, 리보솜이 종결 요소, 예를 들어, 정지 코돈과 마주칠 때 발현 생성물은 리보솜에서 떨어질 수 있으며, 번역을 종결한다. 일부 실시형태에서, 리보솜, 예를 들어, 리보솜의 적어도 하나의 서브유닛이 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드와 접촉하여 유지되는 동안에 번역이 종결된다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 발현 서열의 말단에 종결 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 서열은 둘 이상의 종결 요소를 연속하여 포함한다. 이러한 실시형태에서, 번역이 종결되며 회전환 번역이 종결된다. 일부 실시형태에서, 리보솜은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드와 완전히 탈연계(disengage)된다. 일부 이러한 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내의 후속(예를 들어, 제2, 제3, 제4, 제5 등의) 발현 서열의 생성은 번역의 개시 이전에 리보솜이 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)와 재연계되는 것을 필요로 할 수 있다. 일반적으로, 종결 요소는 번역의 종결을 신호전달하는 프레임-내 뉴클레오티드 트리플렛, 예를 들어, UAA, UGA, UAG를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내의 하나 이상의 종결 요소는 프레임-시프트된 종결 요소, 예컨대 비제한적으로 번역을 종결시킬 수 있는 오프-프레임(off-frame) 또는 -1 및 +1 시프트된 리딩 프레임(예를 들어, 숨겨진 정지)이다. 프레임-시프트된 종결 요소는 발현 서열의 제2 및 제3 리딩 프레임에 나타나는 뉴클레오티드 트리플, TAA, TAG 및 TGA를 포함한다. 프레임-시프트된 종결 요소는 종종 세포에 유해한 mRNA의 오독(misread)을 방지하는 데 중요할 수 있다.
스태거 요소
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 발현 서열에 인접한 적어도 하나의 스태거 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 각각의 발현 서열에 인접한 스태거 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 각 발현 서열의 한측 또는 양측 모두에 존재하여, 발현 생성물, 예를 들어, 펩티드(들) 및 또는 폴리펩티드(들)의 분리를 야기한다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 하나 이상의 발현 서열의 일부이다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 발현 서열을 포함하며, 하나 이상의 발현 서열의 각각은 스태거 요소 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 후속 발현 서열로부터 분리된다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 (a) 단일의 발현 서열의 2 라운드의 번역으로부터의 또는 (b) 둘 이상의 발현 서열의 1 라운드 이상의 번역으로부터의 단일 폴리펩티드의 생성을 방지한다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 하나 이상의 발현 서열로부터 분리된 서열이다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 하나 이상의 발현 서열 중 하나의 발현 서열의 일부를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 스태거 요소를 포함한다. 회전환 번역을 유지하면서, 연속적 발현 생성물, 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드의 생성을 모면하기 위해, 스태거 요소를 포함시켜, 번역 동안 리보솜 정지를 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 하나 이상의 발현 서열 중 적어도 하나의 3' 말단에 존재한다. 스태거 요소는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 회전환 번역 동안 리보솜을 고착시키도록 구성될 수 있다. 스태거 요소는 2A-유사 또는 CHYSEL(시스-작용 가수분해효소 요소) 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 X1X2X3EX5NPGP인 C-말단 공통 서열을 갖는 서열을 인코딩하며, 여기서 X1은 부재하거나 G 또는 H이며, X2는 부재하거나 D 또는 G이며, X3은 D 또는 V 또는 I 또는 S 또는 M이며, X5는 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 이 서열은 강력한 알파-나선 경향을 갖는 아미노산의 비-보존된 서열에 이어서 공통 서열 -D(V/I)ExNPG P를 포함하며, 여기서 x는 임의의 아미노산이다. 스태거 요소의 일부 비제한적인 예에는 GDVESNPGP, GDIEENPGP, VEPNPGP, IETNPGP, GDIESNPGP, GDVELNPGP, GDIETNPGP, GDVENPGP, GDVEENPGP, GDVEQNPGP, IESNPGP, GDIELNPGP, HDIETNPGP, HDVETNPGP, HDVEMNPGP, GDMESNPGP, GDVETNPGP, GDIEQNPGP 및 DSEFNPGP가 포함된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 스태거 요소는 발현 생성물, 예컨대 본원에 기술된 공통 서열의 G와 P 사이를 절단한다. 하나의 비-제한적인 예로서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 발현 생성물을 절단하기 위해 적어도 하나의 스태거 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 적어도 하나의 발현 서열에 인접한 스태거 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 각 발현 서열 이후에 스태거 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 각 발현 서열의 한측 또는 양측 모두에 존재하는 스태거 요소를 포함하여, 각각의 발현 서열로부터의 개별 펩티드(들) 및 또는 폴리펩티드(들)의 번역을 야기한다.
일부 실시형태에서, 스태거 요소는 번역 동안 리보솜 정지를 유도하는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 또는 비천연 뉴클레오티드를 포함한다. 비천연 뉴클레오티드는 펩티드 핵산(PNA), 모르폴리노 및 잠금 핵산(LNA), 및 글리콜 핵산(GNA) 및 트레오스 핵산(TNA)을 포함할 수 있다. 이들과 같은 예는 분자의 백본에 대한 변경에 의해 천연 발생 DNA 또는 RNA와 구분된다. 예시적인 변형은 번역 동안 리보솜 정지를 유도할 수 있는 당, 핵염기, (예를 들어, 연결 포스페이트로의 / 포스포디에스테르 링키지로의 / 포스포디에스테르 백본으로의) 뉴클레오시드간 링키지 및 그의 임의의 조합에 대한 임의의 변형을 포함할 수 있다. 본원에 제공되는 예시적인 변형 중 일부는 본원의 다른 곳에 기술된다.
일부 실시형태에서, 스태거 요소는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)에 다른 형태로 존재한다. 예를 들어, 일부 예시적인 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에서, 스태거 요소는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열의 종결 요소, 및 종결 요소를 제1 발현 서열에 후속하는 발현의 제1 번역 개시 서열로부터 분리하는 뉴클레오티드 스페이서 서열을 포함한다. 일부 예에서, 제1 발현 서열의 제1 스태거 요소는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열에 후속하는 발현의 제1 번역 개시 서열의 업스트림(그에 대해 5')에 존재한다. 일부 경우에, 제1 발현 서열 및 제1 발현 서열에 후속하는 발현 서열은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 2개의 개별 발현 서열이다. 제1 스태거 요소와 제1 번역 개시 서열 사이의 거리는 제1 발현 서열과 그의 후속 발현 서열의 연속 번역을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 스태거 요소는 종결 요소를 포함하며, 제1 발현 서열의 발현 생성물을 그의 후속 발현 서열의 발현 생성물로부터 분리함으로써, 불연속 발현 생성물을 생성한다. 일부 경우에, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내의 후속 서열의 제1 번역 개시 서열의 업스트림에 제1 스태거 요소를 포함하는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 연속적으로 번역되는 한편, 제2 발현 서열에 후속하는 발현 서열의 제2 번역 개시 서열의 업스트림에 있는 제2 발현 서열의 스태거 요소를 포함하는 대응하는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 연속적으로 번역되지 않는다. 일부 경우에, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에는 오직 하나의 발현 서열만이 존재하며, 제1 발현 서열 및 그의 후속 발현 서열은 동일한 발현 서열이다. 일부 예시적인 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에서, 스태거 요소는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열의 제1 종결 요소, 및 종결 요소를 다운스트림 번역 개시 서열로부터 분리하는 뉴클레오티드 스페이서 서열을 포함한다. 일부 이러한 예에서, 제1 스태거 요소는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열의 제1 번역 개시 서열의 업스트림(그에 대해 5')에 존재한다. 일부 경우에, 제1 스태거 요소와 제1 번역 개시 서열 사이의 거리는 제1 발현 서열과 임의의 후속 발현 서열의 연속적 번역을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 제1 스태거 요소는 제1 발현 서열의 1 라운드의 발현 생성물을 제1 발현 서열의 다음 라운드의 발현 생성물로부터 분리함으로써 불연속 발현 생성물을 생성한다. 일부 경우에, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내의 제1 발현 서열의 제1 번역 개시 서열의 업스트림에 제1 스태거 요소를 포함하는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 연속적으로 번역되는 한편, 상응하는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내의 제2 발현 서열의 제2 번역 개시 서열의 업스트림에 스태거 요소를 포함하는 상응하는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 연속적으로 번역되지 않는다. 일부 경우에, 제2 스태거 요소와 제2 번역 개시 서열 사이의 거리는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내의 제1 스태거 요소와 제1 번역 개시 사이의 거리보다, 상응하는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에서 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 더 멀다. 일부 경우에, 제1 스태거 요소와 제1 번역 개시 사이의 거리는 적어도 2개 뉴클레오티드, 3개 뉴클레오티드, 4개 뉴클레오티드, 5개 뉴클레오티드, 6개 뉴클레오티드, 7개 뉴클레오티드, 8개 뉴클레오티드, 9개 뉴클레오티드, 10개 뉴클레오티드, 11개 뉴클레오티드, 12개 뉴클레오티드, 13개 뉴클레오티드, 14개 뉴클레오티드, 15개 뉴클레오티드, 16개 뉴클레오티드, 17개 뉴클레오티드, 18개 뉴클레오티드, 19개 뉴클레오티드, 20개 뉴클레오티드, 25개 뉴클레오티드, 30개 뉴클레오티드, 35개 뉴클레오티드, 40개 뉴클레오티드, 45개 뉴클레오티드, 50개 뉴클레오티드, 55개 뉴클레오티드, 60개 뉴클레오티드, 65개 뉴클레오티드, 70개 뉴클레오티드, 75개 뉴클레오티드 또는 그 초과이다. 일부 실시형태에서, 제2 스태거 요소와 제2 번역 개시 사이의 거리는 제1 스태거 요소와 제1 번역 개시 사이의 거리보다 적어도 2개 뉴클레오티드, 3개 뉴클레오티드, 4개 뉴클레오티드, 5개 뉴클레오티드, 6개 뉴클레오티드, 7개 뉴클레오티드, 8개 뉴클레오티드, 9개 뉴클레오티드, 10개 뉴클레오티드, 11개 뉴클레오티드, 12개 뉴클레오티드, 13개 뉴클레오티드, 14개 뉴클레오티드, 15개 뉴클레오티드, 16개 뉴클레오티드, 17개 뉴클레오티드, 18개 뉴클레오티드, 19개 뉴클레오티드, 20개 뉴클레오티드, 25개 뉴클레오티드, 30개 뉴클레오티드, 35개 뉴클레오티드, 40개 뉴클레오티드, 45개 뉴클레오티드, 50개 뉴클레오티드, 55개 뉴클레오티드, 60개 뉴클레오티드, 65개 뉴클레오티드, 70개 뉴클레오티드, 75개 뉴클레오티드 또는 그 초과로 더 멀다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 1개 초과의 발현 서열을 포함한다.
조절 핵산
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 조절 핵산을 인코딩하는, 예를 들어, 내인성 유전자 및/또는 외인성 유전자의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 바와 같은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 발현 서열은 비-코딩 RNA, 예컨대 비제한적으로 tRNA, lncRNA, miRNA, rRNA, snRNA, 마이크로RNA, siRNA, piRNA, snoRNA, snRNA, exRNA, scaRNA, Y RNA 및 hnRNA와 같은 조절 핵산에 대해 안티센스인 서열을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 조절 핵산은 숙주 유전자를 표적화한다. 조절 핵산은 본원에 그의 전문이 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0177] 및 [0181] 내지 [0189]에 기술된 조절 핵산 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 조절 핵산, 예컨대 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 가이드 RNA를 포함하거나 가이드 RNA를 인코딩한다. gRNA 짧은 합성 RNA는 불완전한 이펙터 모이어티로의 결합에 필요한 "스캐폴드" 서열, 및 게놈 표적에 대한 사용자-정의된 약 20개 뉴클레오티드 표적화 서열로 구성된다. 실시에 있어서, 가이드 RNA 서열은 일반적으로 17개 뉴클레오티드 내지 24개 뉴클레오티드(예를 들어, 19개 뉴클레오티드, 20개 뉴클레오티드 또는 21개 뉴클레오티드)의 길이를 갖고, 표적화된 핵산 서열에 상보성이도록 설계된다. 맞춤형(custom) gRNA 생성자 및 알고리즘이 효율적인 가이드 RNA의 설계에 사용하기 위해 상업적으로 이용 가능하다. 또한, 키메라 "단일 가이드 RNA"("sgRNA"), 천연 발생 crRNA-tracrRNA 복합체를 모방하며, tracrRNA(뉴클레아제로의 결합을 위함) 및 적어도 하나의 crRNA(뉴클레아제를 편집을 위해 표적화된 서열에 가이드함) 둘 모두를 함유하는 조작된(합성) 단일 RNA 분자를 사용하여 유전자 편집이 달성된 바 있다. 화학적으로 변형된 sgRNA는 또한, 게놈 편집에서 효율적인 것으로 입증되었으며; 예를 들어, 문헌[Hendel et al. (2015) Nature Biotechnol., 985 - 991]을 참조한다.
gRNA는 특정 DNA 서열(예를 들어, 유전자의 프로모터, 증강자, 침묵자 또는 억제자에 인접한 또는 그 내의 서열)을 인식할 수 있다.
일 실시형태에서, gRNA는 유전자 편집을 위한 CRISPR 시스템의 부분으로서 사용된다. 유전자 편집의 목적을 위해, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 요망되는 표적 DNA 서열에 상응하는 하나의 또는 다중의 가이드 RNA 서열을 포함하도록 설계될 수 있으며; 예를 들어, 문헌[Cong et al. (2013) Science, 339:819-823]; 문헌[Ran et al. (2013) Nature Protocols, 8:2281 - 2308]을 참조한다. gRNA 서열의 적어도 약 16개 뉴클레오티드 또는 17개 뉴클레오티드는 DNA 절단의 발생을 위해 Cas9에 의해 요구되며; Cpf1에 있어서 gRNA 서열의 적어도 약 16개 뉴클레오티드는 검출 가능한 DNA 절단을 달성하는 데 필요하다.
변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 유전자에 의해 인코딩된 RNA의 발현을 조절할 수 있다. 다수의 유전자가 서로 어느 정도의 서열 상동성을 공유할 수 있기 때문에, 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 충분한 서열 상동성을 갖는 유전자의 부류를 표적화하도록 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는, 상이한 유전자 표적들 중에 공유되거나 특이적인 유전자 표적에 특유한 서열에 대해 상보성을 갖는 서열을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 몇몇의 유전자 간에 상동성을 갖는 RNA 서열의 보존된 영역을 표적화함으로써 유전자 패밀리 내의 몇몇의 유전자(예를 들어, 상이한 유전자 아이소폼, 스플라이스 변이체, 돌연변이 유전자 등)를 표적화하도록 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 단일의 유전자의 특이적인 RNA 서열에 특유한 서열을 표적화하도록 설계될 수 있다.
일부 실시형태에서, 발현 서열은 5000 bp 미만(예를 들어, 약 5000 bp, 4000 bp, 3000 bp, 2000 bp, 1000 bp, 900 bp, 800 bp, 700 bp, 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp, 10 bp 미만 또는 그 미만)의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 발현 서열은 독립적으로 또는 부가적으로 10 bp 초과(예를 들어, 적어도 약 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 kb, 1.1 kb, 1.2 kb, 1.3 kb, 1.4 kb, 1.5 kb, 1.6 kb, 1.7 kb, 1.8 kb, 1.9 kb, 2 kb, 2.1 kb, 2.2 kb, 2.3 kb, 2.4 kb, 2.5 kb, 2.6 kb, 2.7 kb, 2.8 kb, 2.9 kb, 3 kb, 3.1 kb, 3.2 kb, 3.3 kb, 3.4 kb, 3.5 kb, 3.6 kb, 3.7 kb, 3.8 kb, 3.9 kb, 4 kb, 4.1 kb, 4.2 kb, 4.3 kb, 4.4 kb, 4.5 kb, 4.6 kb, 4.7 kb, 4.8 kb, 4.9 kb, 5 kb 또는 그 초과)의 길이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 발현 서열은 본원에 기술된 특징, 예를 들어, 하나 이상의 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 서열, 하나 이상의 조절 요소, 하나 이상의 조절 핵산, 예를 들어, 하나 이상의 비-코딩 RNA, 다른 발현 서열 및 그의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다.
번역 효율
일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 바와 같은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 번역 효율은 참조물질, 예를 들어 선형 대응물, 선형 발현 서열 또는 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 대응물보다 더 크다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 바와 같은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 참조물질의 번역 효율보다 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 600%, 70%, 800%, 900%, 1000%, 2000%, 5000%, 10000%, 100000% 또는 그를 초과하여 더 큰 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 선형 대응물의 번역 효율보다 10% 더 큰 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 선형 대응물의 번역 효율보다 300% 더 큰 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 번역 효율보다 10% 더 큰 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 번역 효율보다 300% 더 큰 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역 효율보다 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 600%, 70%, 800%, 900%, 1000%, 2000%, 5000%, 10000%, 100000% 또는 그를 초과하여 더 큰 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역 효율보다 적어도 약 10% 더 큰 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역 효율보다 적어도 약 20% 더 큰 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역 효율보다 적어도 약 50% 더 큰 번역 효율을 갖는다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 화학량론적 비의 발현 생성물을 생성한다. 회전환 번역은 발현 생성물을 실질적으로 동등한 비로 연속적으로 생성한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 발현 생성물이 실질적으로 동등한 비로 생성되도록 화학량론적 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 다중의 발현 생성물, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 그 초과의 발현 서열로부터의 생성물의 화학량론적 번역 효율을 갖는다.
회전환 번역
일부 실시형태에서, 일단 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 번역이 개시되면, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)에 결합된 리보솜은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 1 라운드의 번역을 완료하기 전에 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)로부터 탈연계되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 회전환 번역에 적격성이다. 일부 실시형태에서, 회전환 번역 동안, 일단 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 번역이 개시되면, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 결합된 리보솜은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 적어도 2 라운드, 적어도 3 라운드, 적어도 4 라운드, 적어도 5 라운드, 적어도 6 라운드, 적어도 7 라운드, 적어도 8 라운드, 적어도 9 라운드, 적어도 10 라운드, 적어도 11 라운드, 적어도 12 라운드, 적어도 13 라운드, 적어도 14 라운드, 적어도 15 라운드, 적어도 20 라운드, 적어도 30 라운드, 적어도 40 라운드, 적어도 50 라운드, 적어도 60 라운드, 적어도 70 라운드, 적어도 80 라운드, 적어도 90 라운드, 적어도 100 라운드, 적어도 150 라운드, 적어도 200 라운드, 적어도 250 라운드, 적어도 500 라운드, 적어도 1000 라운드, 적어도 1500 라운드, 적어도 2000 라운드, 적어도 5000 라운드, 적어도 10000 라운드, 적어도 105 라운드 또는 적어도 106 라운드의 번역을 완료하기 전에, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 탈연계되지 않는다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 회전환 번역은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 1 라운드 초과의 번역으로부터 번역되는 폴리펩티드 생성물("연속" 발현 생성물)의 생성을 야기한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 스태거 요소를 포함하며, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 회전환 번역은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 단일 라운드의 번역 또는 단일 라운드 미만의 번역으로부터 생성되는 폴리펩티드 생성물("불연속" 발현 생성물)의 생성을 야기한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 회전환 번역 동안 생성되는 총 폴리펩티드의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%(몰/몰)가 불연속 폴리펩티드이도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 총 폴리펩티드에 비한 불연속 생성물의 양의 비는 시험관내 번역 시스템에서 시험된다. 일부 실시형태에서, 양의 비를 시험하기 위해 사용되는 시험관내 번역 시스템은 토끼 망상적혈구 용해물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 양의 비는 생체내 번역 시스템, 예컨대 진핵 세포 또는 원핵 세포, 배양된 세포, 또는 유기체 내의 세포에서 시험된다.
비번역 영역
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 비번역 영역(UTR)을 포함한다. 유전자를 포함하는 게놈 영역의 UTR은 전사되지만 번역되지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, UTR은 본원에 기술된 발현 서열의 번역 개시 서열의 업스트림에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, UTR은 본원에 기술된 발현 서열의 다운스트림에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 제1 발현 서열에 대한 하나의 UTR은 제2 발현 서열에 대한 또 다른 UTR과 동일하거나, 그와 연속되거나, 그와 중첩된다. 일부 실시형태에서, 인트론은 인간 인트론이다. 일부 실시형태에서, 인트론은 전장 인간 인트론, 예를 들어, ZKSCAN1이다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 내부에 매립된 아데노신 및 우리딘의 하나 이상의 스트레치를 갖는 UTR을 포함한다. 이들 AU 풍부 시그너처는 발현 생성물의 전환율을 증가시킬 수 있다.
UTR AU 풍부 요소(ARE)의 도입, 제거 또는 변형은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성 또는 면역원성을 조절하는 데 유용할 수 있다. 특정 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 조작하는 경우, ARE의 하나 이상의 카피를 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)로 도입할 수 있으며, ARE의 카피는 발현 생성물의 번역 및/또는 생성을 조절할 수 있다. 마찬가지로, ARE를 확인하고 제거하거나, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내로 조작하여 세포내 안정성을 조절함으로써, 생성된 단백질의 번역 및 생성에 영향을 미칠 수 있다.
임의의 유전자로부터 임의의 UTR이 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 각각의 측부 배치 영역 내로 혼입될 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 제공된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)에서 사용될 수 있는 예시적인 UTR은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0200] 내지 [0201]에 기술된 것들을 포함한다.
폴리A 서열
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 폴리-A 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리-A 서열의 길이는 10개 초과의 뉴클레오티드 길이이다. 일 실시형태에서, 폴리-A 서열은 15개 초과의 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 약 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 120개, 140개, 160개, 180개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1,000개, 1,100개, 1,200개, 1,300개, 1,400개, 1,500개, 1,600개, 1,700개, 1,800개, 1,900개, 2,000개, 2,500개 및 3,000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드) 길이이다. 일부 실시형태에서, 폴리-A 서열은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0202] 내지 [0204]에서의 폴리-A 서열의 설명에 따라 설계된다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 폴리A를 포함하거나, 폴리A를 결여하거나, 변형된 폴리A를 가져, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 특징을 조절한다. 일부 실시형태에서, 폴리A를 결여하거나, 변형된 폴리A를 갖는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 기능적 특징, 예를 들어, 면역원성, 반감기, 발현 효율 등을 개선시킨다.
RNA-결합
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 RNA 결합 부위를 포함한다. 마이크로RNA(또는 miRNA)는 핵산 분자의 3'UTR에 결합하는 짧은 비코딩 RNA이며, 핵산 분자 안정성을 감소시킴으로써 또는 번역을 저해함으로써 유전자 발현을 하향-조절한다. 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 마이크로RNA 표적 서열, 마이크로RNA 서열 또는 마이크로RNA 씨드를 포함할 수 있다. 이러한 서열은 임의의 알려져 있는 마이크로RNA, 예컨대 미국 공개 제US2005/0261218호, 미국 공개 제US2005/0059005호, 및 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0207] 내지 [0215]에 교시된 것들에 상응할 수 있으며, 이의 내용은 그들 전문이 본원에 참조로 포함된다.
단백질-결합
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 단백질, 예를 들어, 리보솜이 RNA 서열 내의 내부 부위에 결합할 수 있게 하는 하나 이상의 단백질 결합 부위를 포함한다. 단백질 결합 부위, 예를 들어, 리보솜 결합 부위를 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내로 조작함으로써, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 숙주의 면역계의 성분으로부터 원형 폴리리보뉴클레오티드를 차폐하여 숙주의 면역계를 회피하거나, 숙주의 면역계에 의한 검출이 감소되거나, 조절된 분해 또는 조절된 번역을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 예를 들어, 면역 반응, 예를 들어, CTL(세포독성 T 림프구) 반응을 회피하기 위해 적어도 하나의 면역단백질 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역단백질 결합 부위는 면역단백질에 결합하고, 외인성으로서 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 차폐를 보조하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시형태에서, 면역단백질 결합 부위는 면역단백질에 결합하고, 외인성 또는 외래로서 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 가리는 것을 보조하는 뉴클레오티드 서열이다.
선형 RNA로의 리보솜 연계의 종래의 메커니즘은 RNA의 캡핑된 5' 말단으로의 리보솜 결합을 수반한다. 5' 말단으로부터, 리보솜은 개시 코돈으로 이동하며, 이때, 제1 펩티드 결합이 형성된다. 본 발명에 따라, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 번역의 내부 개시(즉, 캡-독립적)는 자유 말단 또는 캡핑된 말단을 필요로 하지 않는다. 오히려, 리보솜이 비-캡핑된 내부 부위에 결합함으로써 리보솜은 개시 코돈에서 폴리펩티드 신장을 시작한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 리보솜 결합 부위, 예를 들어, 개시 코돈을 포함하는 하나 이상의 RNA 서열을 포함한다.
천연의 5'UTR은 번역 개시를 위해 역할을 수행하는 특징부를 갖는다. 그들은 리보솜이 많은 유전자의 번역을 개시하는 과정에 관여하는 것으로 흔히 알려져 있는 코작 서열과 같은 시그너처를 보유한다. 코작 서열은 공통 CCR(A/G)CCAUGG를 가지며, 여기서 R은 또 다른 'G'로 이어지는 출발 코돈(AUG)의 3개 염기 업스트림의 퓨린(아데닌 또는 구아닌)이다. 5' UTR은 또한 신장 인자 결합에 관여하는 이차 구조 형성하는 것으로 알려져 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 단백질에 결합하는 단백질 결합 서열을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 단백질 결합 서열은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 특정 표적에 표적화하거나 국소화시킨다. 일부 실시형태에서, 단백질 결합 서열은 단백질의 아르기닌-풍부 영역에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질 결합 부위는 단백질, 예컨대 ACIN1, AGO, APOBEC3F, APOBEC3G, ATXN2, AUH, BCCIP, CAPRIN1, CELF2, CPSF1, CPSF2, CPSF6, CPSF7, CSTF2, CSTF2T, CTCF, DDX21, DDX3, DDX3X, DDX42, DGCR8, EIF3A, EIF4A3, EIF4G2, ELAVL1, ELAVL3, FAM120A, FBL, FIP1L1, FKBP4, FMR1, FUS, FXR1, FXR2, GNL3, GTF2F1, HNRNPA1, HNRNPA2B1, HNRNPC, HNRNPK, HNRNPL, HNRNPM, HNRNPU, HNRNPUL1, IGF2BP1, IGF2BP2, IGF2BP3, ILF3, KHDRBS1, LARP7, LIN28A, LIN28B, m6A, MBNL2, METTL3, MOV10, MSI1, MSI2, NONO, NONO-, NOP58, NPM1, NUDT21, PCBP2, POLR2A, PRPF8, PTBP1, RBFOX2, RBM10, RBM22, RBM27, RBM47, RNPS1, SAFB2, SBDS, SF3A3, SF3B4, SIRT7, SLBP, SLTM, SMNDC1, SND1, SRRM4, SRSF1, SRSF3, SRSF7, SRSF9, TAF15, TARDBP, TIA1, TNRC6A, TOP3B, TRA2A, TRA2B, U2AF1, U2AF2, UNK, UPF1, WDR33, XRN2, YBX1, YTHDC1, YTHDF1, YTHDF2, YWHAG, ZC3H7B, PDK1, AKT1, 및 RNA에 결합하는 임의의 다른 단백질에 대한 결합 부위를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
엔크립토겐
본원에 기술된 바와 같이, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 세포의 선천적 면역 반응을 감소시키거나, 회피하거나, 모면하기 위해 엔크립토겐을 포함한다. 일 양태에서, 세포로 운반되는 경우, 참조 화합물, 예를 들어, 기술된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)에 상응하는 선형 폴리뉴클레오티드, 상응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드, 엔크립토겐을 결여한 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 촉발되는 반응에 비하여, 숙주로부터 감소된 면역 반응을 초래하는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 엔크립토겐을 결여한 대응물보다 더 적은 면역원성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 엔크립토겐은 안정성을 증강시킨다. 핵산 분자의 안정성 및 번역과 관련하여 UTR에 의해 수행되는 조절 역할에 대한 증거가 점점 더 많아지고 있다. UTR의 조절 특징을 엔크립토겐 내에 포함시켜, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성을 증강시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 5' 또는 3' UTR은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 엔크립토겐을 구성할 수 있다. 예를 들어, UTR AU 풍부 요소(ARE)의 제거 또는 변형은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성 또는 면역원성을 조절하는 데 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 발현 서열, 예를 들어, 번역 가능한 영역 내의 AU 풍부 요소(ARE)의 변형의 제거는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성 또는 면역원성을 조절하는 데 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 엔크립토겐은 miRNA 결합 부위, 또는 임의의 다른 비-코딩 RNA에 대한 결합 부위를 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내로의 miR-142 부위의 혼입은 조혈 세포에서 발현을 조절할 수 있을 뿐 아니라, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 인코딩된 단백질에 대한 면역 반응을 감소시키기거나 없앨 수 있다.
일부 실시형태에서, 엔크립토겐은 단백질, 예를 들어, 면역단백질이 RNA 서열에 결합할 수 있게 하는 하나 이상의 단백질 결합 부위를 포함한다. 단백질 결합 부위를 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내로 조작함으로써, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 숙주의 면역계의 성분으로부터 원형 폴리리보뉴클레오티드를 차폐하여 숙주의 면역계를 회피하거나, 숙주의 면역계에 의한 검출이 감소되거나, 조절된 분해 또는 조절된 번역을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 예를 들어, 면역 반응, 예를 들어, CTL 반응을 회피하기 위해 적어도 하나의 면역단백질 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역단백질 결합 부위는 면역단백질에 결합하고, 외인성으로서 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 차폐를 보조하는 뉴클레오티드 서열이다.
일부 실시형태에서, 엔크립토겐은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 예시적인 변형은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 면역 반응을 방지하거나 감소시킬 수 있는 당, 핵염기, (예를 들어, 연결 포스페이트로의 / 포스포디에스테르 링키지로의 / 포스포디에스테르 백본으로의) 뉴클레오시드간 링키지 및 그의 임의의 조합에 대한 임의의 변형을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 예시적인 변형의 일부는 하기에 상세히 기술된다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 참조 화합물, 예를 들어, 변형을 결여한 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)에 의해 촉발되는 반응에 비하여 숙주로부터의 면역 반응을 감소시키기 위한, 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 하나 이상의 변형을 포함한다. 특히, 하나 이상의 이노신의 부가는 RNA를 바이러스에 대해 내인성으로서 식별하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Yu, Z. et al. (2015) RNA editing by ADAR1 marks dsRNA as "self". Cell Res. 25, 1283-1284]을 참조하며, 이는 그 전문이 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 shRNA, 또는 siRNA로 가공될 수 있는 RNA 서열에 대한 하나 이상의 발현 서열을 포함하며, shRNA 또는 siRNA는 RIG-1을 표적화하고 RIG-1의 발현을 감소시킨다. RIG-1은 외래의 원형 RNA를 감지할 수 있으며, 외래의 원형 RNA의 분해를 야기한다. 따라서, RIG-1-표적화 shRNA, siRNA 또는 임의의 다른 조절 핵산에 대한 서열을 보유하는 변형된 원형 폴리뉴클레오티드는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 면역성, 예를 들어, 숙주 세포 면역성을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 세포의 선천적 면역 반응의 감소, 회피 또는 모면에 있어서 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 보조하는 서열, 요소 또는 구조를 결여한다. 일부 이러한 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 폴리A 서열, 5' 말단, 3' 말단, 포스페이트 기, 하이드록실 기 또는 그의 임의의 조합을 결여할 수 있다.
리보스위치
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 리보스위치를 포함한다.
리보스위치는, 전형적으로 작은 표적 분자에 직접 결합할 수 있으며 표적의 결합이 RNA 번역, 발현 생성물 안정성 및 활성에 영향을 미치는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 부분으로 여겨진다(문헌[Tucker B J, Breaker R R (2005), Curr Opin Struct Biol 15 (3): 342-8]). 따라서, 리보스위치를 포함하는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 그의 표적 분자의 존재 또는 부재에 따라, 그의 자체의 활성을 조절하는 데 직접 관여한다. 일부 실시형태에서, 리보스위치는 개별 분자에 대한 압타머-유사 친화성의 영역을 갖는다. 따라서, 본 발명의 더 넓은 맥락에서, 비-코딩 핵산 내에 포함되는 임의의 압타머는 대량의 부피로부터 분자의 격리를 위해 사용될 수 있다. "(리보)스위치" 활성을 통한 사건의 다운스트림 정보 제공이 특히 유리할 수 있다.
일부 실시형태에서, 리보스위치는 전사 종결, 번역 개시의 저해, mRNA 자가-절단 및 진핵생물에서, 스플라이싱 경로의 변경을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유전자 발현에 영향을 가질 수 있다. 리보스위치는 트리거 분자의 결합 또는 제거를 통해 유전자 발현을 제어하는 기능을 할 수 있다. 따라서, 리보스위치를 포함하는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나, 차단하는 조건으로 처리하여, 발현을 변경시킨다. 발현은 예를 들어, 전사의 종결 또는 RNA로의 리보솜 결합의 차단의 결과로서 변경될 수 있다. 트리거 분자 또는 그의 유사체의 결합은 리보스위치의 성질에 따라, RNA 분자의 발현을 감소시키거나 방지하거나, RNA 분자의 발현을 촉진시키거나 증가시킬 수 있다. 리보스위치의 일부 예는 본원에 기술되어 있다.
사이클릭 디-GMP 리보스위치, FMN 리보스위치(또한, RFN-요소), glmS 리보스위치, 글루타민 리보스위치, 글리신 리보스위치, 라이신 리보스위치(또한, L-박스), PreQ1 리보스위치(예를 들어, PreQ1 -l 리보스위치 및 PreQ1 -ll 리보스위치), 퓨린 리보스위치, SAH 리보스위치, SAM 리보스위치, SAM-SAH 리보스위치, 테트라하이드로폴레이트 리보스위치, 테오필린 결합 리보스위치, 티민 피로포스페이트 결합 리보스위치, 티. 텡콘겐시스(T. tengcongensis) glmS 촉매적 리보스위치, TPP 리보스위치(또한 THI-박스), Moco 리보스위치 또는 아데닌 감지 add-A 리보스위치이며, 이의 각각은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0235] 내지 [0252]에 기술된다.
압타자임
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 압타자임을 포함한다. 압타자임은 조건적 발현을 위한 스위치이며, 여기서 압타머 영역은 알로스테릭 제어 요소로서 사용되며, 촉매적 RNA(하기 기술된 바와 같은 "리보자임")의 영역에 커플링된다. 일부 실시형태에서, 압타자임은 세포 유형 특이적 번역에서 활성이다. 일부 실시형태에서, 압타자임은 세포 상태 특이적 번역, 예를 들어, 바이러스 감염된 세포 하에서 또는 바이러스 핵산 또는 바이러스 단백질의 존재 하에서 활성이다.
(RNA 효소 또는 촉매적 RNA로도 지칭되는 리보핵산 효소로부터의) 리보자임은 화학 반응을 촉매작용하는 RNA 분자이다.
리보자임의 일부 비제한적인 예는 해머헤드(hammerhead) 리보자임, VL 리보자임, 리드자임(leadzyme), 헤어핀 리보자임, 및 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0254] 내지 [0259]에 기술된 다른 리보자임을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 변형된 circRNA는 RNA의 전사 및 복제를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, circRNA를 사용하여, 비-코딩 RNA, lncRNA, miRNA, tRNA, rRNA, snoRNA, ncRNA, siRNA 또는 shRNA를 인코딩할 수 있다. 일부 실시형태에서, circRNA는 안티-센스 miRNA 및 전사 요소를 포함할 수 있다. 전사 후에, 이러한 circRNA는 기능성 선형 miRNA를 생성할 수 있다. circRNA 발현 및 조절 응용의 비제한적인 예는 표 3에 열거되어 있다.
[표 3]
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표적 결합
일부 실시형태에서, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 표적과 결합한다. 일 실시형태에서, circRNA는 DNA 표적 및 단백질 표적 둘 모두에 결합하며, 예를 들어, 전사를 매개한다. 또 다른 실시형태에서, circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 단백질 복합체와 접촉하며, 예를 들어, 신호 전달을 매개한다. 또 다른 실시형태에서, circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 둘 이상의 상이한 표적, 예컨대 단백질에 결합하며, 예를 들어, 이들 단백질을 세포질에 이동시킨다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드; 제1 표적, 예를 들어, RNA, DNA, 단백질 또는 세포 표적의 제1 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제1 결합 부위를 포함하는 제1 부분으로서, 제1 결합 모이어티가 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드(circRNA)-결합 모티프인 제1 부분을 포함하며; 제1 표적 및 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드; 제1 표적, 예를 들어, RNA, DNA, 단백질 또는 세포 표적의 제1 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제1 결합 부위를 포함하는 제1 부분으로서, 제1 결합 모이어티가 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드(circRNA)-결합 모티프인 제1 부분; 및 제2 표적의 제2 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제2 결합 부위로서, 제2 결합 모이어티가 제2 circRNA-결합 모티프인 제2 결합 부위를 포함하며, 제1 결합 모이어티는 제2 결합 모이어티와 상이하며, 제1 표적, 제2 표적 및 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 복합체를 형성하며, 제1 표적 또는 제2 표적은 마이크로RNA가 아니다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드; 제1 표적의 제1 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제1 결합 부위를 포함하는 제1 부분으로서, 제1 결합 모이어티가 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드(circRNA)-결합 모티프인 제1 부분; 및 제2 표적의 제2 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제2 결합 부위로서, 제2 결합 모이어티가 제2 circRNA-결합 모티프인 제2 결합 부위를 포함하며, 제1 결합 모이어티는 제2 결합 모이어티와 상이하며, 제1 표적 및 제2 표적은 둘 모두 마이크로RNA이다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 단백질, 펩티드, 생체분자, DNA, RNA, 또는 세포 표적에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함하는 제1 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 단백질, 펩티드, 생체분자, DNA, RNA, 또는 세포 표적에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 DNA, RNA 및 단백질 중 적어도 하나에 결합함으로써, 세포 과정을 조절한다(예를 들어, 단백질 발현을 변경시킨다). 일부 실시형태에서, 합성 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 적어도 하나의 모이어티, 예를 들어, 선택된 DNA, RNA 또는 단백질의 결합 모이어티와의 상호작용을 위한 결합 부위를 포함함으로써, 내인성 대응물과의 결합에서 경쟁한다.
일 실시형태에서, 합성 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 miRNA에 결합하고/결합하거나 이를 격리한다. 또 다른 실시형태에서, 합성 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 단백질에 결합하고/결합하거나 이를 격리한다. 또 다른 실시형태에서, 합성 변형된 circRNA는 mRNA에 결합하고/결합하거나 격리시킨다. 또 다른 실시형태에서, 합성 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 리보솜에 결합하고/결합하거나 이를 격리한다. 또 다른 실시형태에서, 합성 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 변형된 circRNA에 결합하고/결합하거나 이를 격리한다. 또 다른 실시형태에서, 합성 변형된 circRNA는 긴-비코딩 RNA(lncRNA) 또는 임의의 다른 비-코딩 RNA, 예를 들어, miRNA, tRNA, rRNA, snoRNA, ncRNA, siRNA, 긴-비코딩 RNA, shRNA에 결합하고/결합하거나 격리시킨다. 변형된 circRNA는 결합 및/또는 격리 부위 외에, 분해 요소를 포함할 수 있으며, 이는 결합된 및/또는 격리된 RNA 및/또는 단백질의 분해를 초래할 것이다.
일 실시형태에서, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 lncRNA 또는 lncRNA의 서열을 포함하며, 예를 들어, 변형된 circRNA는 천연 발생, 비-원형 lncRNA의 서열 또는 그의 단편을 포함한다. 일 실시형태에서, lncRNA 또는 lncRNA의 서열은 스페이서 서열과 함께 또는 이것 없이 원형화되어, 합성 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 형성한다.
일 실시형태에서, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 리보자임 활성을 갖는다. 일 실시형태에서, 리보자임으로서 작용하고, 병원성 또는 내인성 RNA, DNA, 소분자 또는 단백질을 절단하도록 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 효소 활성을 갖는다. 일 실시형태에서, 합성 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 RNA(예를 들어, 바이러스 RNA)를 특이적으로 인식하고 이를 절단할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 단백질을 특이적으로 인식하고, 이를 절단할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 소분자를 특이적으로 인식하고, 이를 분해할 수 있다.
일 실시형태에서, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 희생 또는 자가-절단 또는 절단 가능한 변형된 circRNA이다. 일 실시형태에서, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 사용하여 RNA, 예를 들어, miRNA, tRNA, rRNA, snoRNA, ncRNA, siRNA, 긴-비코딩 RNA, shRNA를 전달할 수 있다. 일 실시형태에서, 합성 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 (1) 자가-절단 가능한 요소(예를 들어, 해머헤드(hammerhead), 스플라이싱 요소), (2) 절단 동원 부위(예를 들어, ADAR), (3) 분해 가능한 링커(글리세롤), (4) 화학적 링커 및/또는 (5) 스페이서 서열에 의해 분리된 마이크로RNA로 구성된다. 또 다른 실시형태에서, 합성 변형된 circRNA는 (1) 자가-절단 가능한 요소(예를 들어, 해머헤드, 스플라이싱 요소), (2) 절단 동원 부위(예를 들어, ADAR), (3) 절단 가능한 링커(글리세롤), (4), 화학적 링커 및/또는 (5) 스페이서 서열에 의해 분리된 siRNA로 구성된다.
일 실시형태에서, 변형된 circRNA는 전사적/복제 적격 변형된 circRNA이다. 이 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 임의의 유형의 RNA를 인코딩할 수 있다. 일 실시형태에서, 합성 변형된 circRNA는 안티-센스 miRNA 및 전사 요소를 갖는다. 일 실시형태에서, 전사 후에, 선형 기능성 miRNA는 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)로부터 생성된다.
일 실시형태에서, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 번역 요소와 조합하여 상기 속성 중 하나 이상을 갖는다.
표적
변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 표적의 결합 모이어티에 대한 적어도 하나의 결합 부위를 포함한다. 표적은 핵산(예를 들어, RNA, DNA, RNA-DNA 하이브리드), 소분자(예를 들어, 약물), 압타머, 폴리펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 항체, 바이러스, 바이러스 입자, 막, 다-성분 복합체, 세포, 다른 세포 모이어티, 그의 임의의 단편, 및 그의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. (예를 들어, 문헌[Fredriksson et al., (2002) Nat Biotech 20:473-77]; 문헌[Gullberg et al., (2004) PNAS, 101:8420-24] 참조). 예를 들어, 표적은 단일-가닥 RNA, 이중-가닥 RNA, 단일-가닥 DNA, 이중-가닥 DNA, 하나 이상의 이중 가닥 영역 및 하나 이상의 단일 가닥 영역을 포함하는 DNA 또는 RNA, RNA-DNA 하이브리드, 소분자, 압타머, 폴리펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 항체, 항체 단편, 항체의 혼합물, 바이러스 입자, 막, 다-성분 복합체, 세포, 세포 모이어티, 그의 임의의 단편 또는 그의 임의의 조합이다.
일부 실시형태에서, 표적은 폴리펩티드, 단백질 또는 그의 임의의 단편이다. 예를 들어, 표적은 정제된 폴리펩티드, 단리된 폴리펩티드, 융합 태깅된 폴리펩티드, 세포의 막 또는 바이러스 또는 비리온에 부착되거나 그에 걸쳐 있는 폴리펩티드, 세포질 단백질, 세포내 단백질, 세포외 단백질, 키나제, 포스파타제, 아로마타제, 헬리카제, 프로테아제, 산화환원효소, 환원효소, 트랜스퍼라제, 가수분해효소, 리아제, 이성질화효소, 글리코실라제, 세포외 기질 단백질, 리가제, 이온 수송체, 채널, 포어, 세포사멸 단백질, 세포 부착 단백질, 병원성 단백질, 비정상적으로 발현되는 단백질, 전사 인자, 전사 조절자, 번역 단백질, 샤페론(chaperone), 분비된 단백질, 리간드, 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 핵 단백질, 수용체, 막횡단 수용체, 신호 전달자, 항체, 막 단백질, 내재 막 단백질, 주변 막 단백질, 세포벽 단백질, 구형 단백질, 섬유성 단백질, 당단백질, 지질단백질, 염색체 단백질, 그의 임의의 단편 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 이종 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 표적은 분자 기법, 예컨대 트랜스펙션을 사용하여 세포에서 과발현된 단백질이다. 일부 실시형태에서, 표적은 재조합 폴리펩티드이다. 예를 들어, 표적은 박테리아(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)), 효모, 포유동물 또는 곤충 세포로부터 생성되는 시료에 존재한다(예를 들어, 유기체에 의해 과발현되는 단백질). 일부 실시형태에서, 표적은 돌연변이, 삽입, 결실 또는 다형성을 갖는 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 표적은 항원, 예컨대 유기체를 면역화시키기 위해 또는 유기체에서 면역 반응을 생성하기 위해, 예컨대 항체 생성을 위해 사용되는 폴리펩티드이다.
일부 실시형태에서, 표적은 항체이다. 항체는 또 다른 분자의 특정 공간적 및 극성 구조에 특이적으로 결합할 수 있다. 항체는 모노클로널, 폴리클로널 또는 재조합 항체일 수 있으며, 당업계에 널리 알려져 있는 기법, 예컨대 숙주의 면역화 및 혈청(폴리클로널)의 수집에 의해 또는 연속 하이브리드 세포주를 제조하고 분비된 단백질(모노클로널)을 수집함으로써 또는 적어도 천연 항체의 특이적인 결합에 필요한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 돌연변이된 버전을 클로닝하고 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 자연 발생 항체는 이황화 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 단백질일 수 있다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역으로 구성될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성될 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역으로 구성될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성될 수 있다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 더욱 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카복시-말단으로 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성될 수 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분(C1 q)을 포함한 숙주 조직 또는 인자로의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 항체는 임의의 아이소타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 및 lgA2), 그의 하위부류 또는 변형된 버전의 것일 수 있다. 항체는 완전한 면역글로불린 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 항체 단편은 결합 모이어티, 예컨대 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 나타낼 수 있다. 또한, 특정 분자에 대한 결합 친화성이 유지되는 한, 면역글로불린의 응집물, 폴리머 및 컨쥬게이트 또는 그들의 단편도 포함된다. 항체 단편의 예는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; F(ab)2 단편, 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일의 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 단일 도메인 항체(dAb) 단편(문헌[Ward et al., (1989) Nature 341 :544-46]); 및 단리된 CDR 및 VL 및 VH 영역이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하는 단일 쇄 단편(scFv)(단일 쇄 Fv(scFv)로도 알려져 있음; 예를 들어, 문헌[Bird et al., (1988) Science 242:423-26]; 및 문헌[Huston et al., (1988) PNAS 85:5879-83] 참조)을 포함한다. 따라서, 항체 단편은 Fab, F(ab)2, scFv, Fv, dAb 등을 포함한다. 2개의 도메인 VL 및 VH가 개별 유전자에 의해 코딩되지만, 그들은 재조합 방법을 사용하여, 인공 펩티드 링커에 의해 연결될 수 있으며, 이는 그들이 단일의 단백질 쇄로서 제조되게 할 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 이들 항체 단편은 당업자에게 알려져 있는 통상의 기법을 사용하여 수득될 수 있으며, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 항체는 인간, 인간화, 키메라, 단리된, 개, 고양이, 당나귀, 양, 임의의 식물, 동물 또는 포유동물일 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적은 폴리머 형태의 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드(아데닌, 구아닌, 티민 또는 시토신), 예컨대 DNA 또는 RNA(예를 들어, mRNA)이다. DNA는 선형 DNA 분자(예를 들어, 제한 단편), 바이러스, 플라스미드 및 염색체에서 관찰되는 이중-가닥 DNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 표적은 단일-가닥, 이중 가닥, 작은 간섭 RNA(siRNA), 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 염색체, 유전자, 비코딩 게놈 서열, 게놈 DNA(예를 들어, 단편화된 게놈 DNA), 정제된 폴리뉴클레오티드, 단리된 폴리뉴클레오티드, 혼성화된 폴리뉴클레오티드, 전사 인자 결합 부위, 미토콘드리아 DNA, 리보솜 RNA, 진핵 폴리뉴클레오티드, 원핵 폴리뉴클레오티드, 합성된 폴리뉴클레오티드, 라이게이션된 폴리뉴클레오티드, 재조합 폴리뉴클레오티드, 핵산 유사체를 함유하는 폴리뉴클레오티드, 메틸화된 폴리뉴클레오티드, 탈메틸화된 폴리뉴클레오티드, 그의 임의의 단편, 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 표적은 재조합 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 표적은 이종 폴리뉴클레오티드이다. 예를 들어, 표적은 박테리아(예를 들어, 이. 콜라이), 효모, 포유동물 또는 곤충 세포로부터 생성된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 유기체에 대하여 이종인 폴리뉴클레오티드)이다. 일부 실시형태에서, 표적은 돌연변이, 삽입, 결실 또는 다형성을 갖는 폴리뉴클레오티드이다.
일부 실시형태에서, 표적은 압타머이다. 압타머는 결합 모이어티, 예컨대 단백질에 높은 특이성 및 친화성으로 결합하는 단리된 핵산 분자이다. 압타머는 그의 주어진 표적에 특이적으로 결합하는 화학적 접촉을 제공하는 특정 입체형태(들)로 유지되는 3차원 구조이다. 압타머가 핵산 기반의 분자이지만, 압타머와 다른 핵산 분자, 예컨대 유전자와 mRNA 간에는 근본적 차이가 존재한다. 후자에 있어서, 핵산 구조는 그의 선형 염기 서열을 통해 정보를 인코딩하며, 이에 따라 이 서열은 정보 저장 기능에 중요하다. 완전히 대조적으로, 표적 분자의 특이적인 결합에 기초한 압타머 기능은 보존된 선형 염기 서열(비-코딩 서열)에 의해 전적으로 좌우되지 않으며, 오히려 특정 이차/삼차/사차 구조에 좌우된다. 압타머가 보유할 수 있는 임의의 코딩 능력은 완전히 우발적이며, 그의 동족체 표적으로의 압타머의 결합에서 전혀 역할을 행하지 않는다. 압타머는 또한, 특정 단백질에 결합하는 자연 발생 핵산 서열과 구별되어야 한다. 이들 후자의 서열은 자연 발생 핵산의 전사, 번역 및 수송에 수반되는 특수 하위군의 단백질(예를 들어, 핵산-결합 단백질)에 결합하는 유기체의 게놈 내에 매립된 자연 발생 서열이다. 반면, 압타머는 짧은, 단리된, 비-자연 발생 핵산 분자이다. 핵산-결합 단백질에 결합하는 압타머가 확인될 수 있지만, 대부분의 경우 이러한 압타머는 천연에서 핵산-결합 단백질에 의해 인식되는 서열에 대하여 서열 동일성을 거의 갖지 않거나 전혀 갖지 않는다. 가장 중요하게는, 압타머는 사실상 임의의 단백질(핵산-결합 단백질만이 아님)뿐만 아니라 소분자, 탄수화물, 펩티드 등을 포함하는 거의 모든 관심 파트너에 결합할 수 있다. 대부분의 파트너, 심지어 단백질에 있어서도, 그것이 결합하는 자연 발생 핵산 서열이 존재하지 않는다. 이러한 서열을 갖는 파트너, 예를 들어, 핵산-결합 단백질에 있어서, 이러한 서열은 단단히 결합하는 압타머에 비해 천연에서 사용되는 상대적으로 낮은 결합 친화성의 결과로서 압타머와 상이할 것이다. 압타머는 선택된 파트너에 특이적으로 결합하고, 예를 들어 결합을 통해, 파트너의 활성 또는 결합 상호작용을 조절할 수 있고, 압타머는 그들의 파트너의 작용 능력을 차단할 수 있다. 파트너에 특이적으로 결합하는 기능적 특성은 압타머의 고유 특성이다. 전형적인 압타머는 크기가 6 kDa 내지 35 kDa(20개 내지 100개 뉴클레오티드)이며, 마이크로몰 내지 나노몰 미만의 친화도로 그의 파트너에 결합하고, 밀접하게 관련이 있는 표적을 구별할 수 있다(예를 들어, 압타머는 동일한 유전자 과로부터의 관련 단백질에 선택적으로 결합할 수 있다). 압타머는 특정 파트너와 결합하기 위해, 흔히 관찰되는 분자간 상호작용, 예컨대 수소 결합, 정전기적 상보성, 소수성 접촉, 및 입체적 배제를 사용할 수 있다. 압타머는 높은 특이성 및 친화성, 낮은 면역원성, 생물학적 효능, 및 뛰어난 약동학적 특성을 포함하는, 치료제 및 진단제로서 사용하기 위한 수많은 바람직한 특징을 갖는다. 압타머는 공유적으로 연결되는 상보적 폴리뉴클레오티드의 혼성화로부터 형성되는 분자 스템 및 루프 구조(예를 들어, 헤어핀 루프 구조)를 포함할 수 있다. 스템은 혼성화된 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 루프는 2개의 상보적 폴리뉴클레오티드를 공유적으로 연결하는 영역이다.
일부 실시형태에서, 표적은 소분자이다. 예를 들어, 소분자는 마크로사이클릭 분자, 저해제, 약물 또는 화합물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 소분자는 5개 이하의 수소 결합 공여체를 함유한다. 일부 실시형태에서, 소분자는 10개 이하의 수소 결합 수용체를 함유한다. 일부 실시형태에서, 소분자는 500 달톤 이하의 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, 소분자는 약 180 달톤 내지 500 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, 소분자는 5 이하의 옥탄올-물 분배 계수 lop P를 함유한다. 일부 실시형태에서, 소분자는 -0.4 내지 5.6의 분배 계수 lop P를 갖는다. 일부 실시형태에서, 소분자는 40 내지 130의 몰 굴절을 갖는다. 일부 실시형태에서, 소분자는 약 20개 내지 약 70개의 원자를 함유한다. 일부 실시형태에서, 소분자는 140 옹스트롬2 이하의 극성 표면적을 갖는다.
일부 실시형태에서, 표적은 세포이다. 예를 들어, 표적은 온전한 세포, 화합물(예를 들어, 약물)로 처리된 세포, 고정된 세포, 용해된 세포 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 표적은 단일 세포이다. 일부 실시형태에서, 표적은 복수의 세포이다.
일부 실시형태에서, 단일의 표적 또는 복수의(예를 들어, 둘 이상의) 표적은 복수의 결합 모이어티를 갖는다. 일 실시형태에서, 단일의 표적은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 결합 모이어티를 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 둘 이상의 표적은 시료, 예컨대 표적의 혼합물 또는 라이브러리에 존재하며, 시료는 둘 이상의 결합 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일의 표적 또는 복수의 표적은 복수의 상이한 결합 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 상기 복수는 적어도 약 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 200개, 500개, 1,000개, 2,000개, 3,000개, 4,000개, 5,000개, 6,000개, 7,000개, 8,000개, 9,000개, 10,000개, 11,000개, 12,000개, 13,000개, 14,000개, 15,000개, 16,000개, 17,000개, 18,000개, 19,000개, 20,000개, 25,000개 또는 30,000개의 결합 모이어티를 포함할 수 있다.
표적은 적어도 2개의 상이한 결합 모이어티를 포함하는 복수의 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 결합 모이어티는 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1,000개, 2,000개, 3,000개, 4,000개, 5,000개, 6,000개, 7,000개, 8,000개, 9,000개, 10,000개, 11,000개, 12,000개, 13,000개, 14,000개, 15,000개, 16,000개, 17,000개, 18,000개, 19,000개, 20,000개, 21,000개, 22,000개, 23,000개, 24,000개 또는 25,000개의 상이한 결합 모이어티를 포함하는 복수의 결합 모이어티를 포함할 수 있다.
결합 부위 및 결합 모이어티
일부 경우에, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나의 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 단백질, 펩티드, 생체분자, DNA, RNA, 또는 세포 표적에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 단백질, 펩티드, 생체분자, DNA, RNA, 또는 세포 표적, 또는 그의 조합에 결합하도록 구성된 하나 이상의 결합 부위를 포함한다.일부 경우에, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 적어도 두 개의 결합 부위를 포함한다. 예를 들어, 변형된 circRNA는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 표적의 하나 이상의 결합 모이어티에 결합하는 분자 스캐폴드이다. 각각의 표적은 상이한 또는 동일한 핵산(예를 들어, RNA, DNA, RNA-DNA 하이브리드), 소분자(예를 들어, 약물), 압타머, 폴리펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 항체, 바이러스, 바이러스 입자, 막, 다-성분 복합체, 세포, 세포 모이어티, 그의 임의의 단편 및 그의 임의의 조합일 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 결합 부위는 동일한 표적의 하나 이상의 결합 모이어티에 결합한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 결합 부위는 상이한 표적의 하나 이상의 결합 모이어티에 결합한다. 일부 실시형태에서, 변형된 circRNA는 하나 이상의 표적의 하나 이상의 결합 모이어티에 대한 스캐폴드로서 작용한다. 일부 실시형태에서, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 표적의 하나 이상의 결합 모이어티에 특이적으로 결합함으로써 세포 과정을 조절한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 특정한 관심 표적에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 다수의 결합 부위 또는 각각의 관심 결합 모이어티에 대한 결합 부위의 조합을 포함한다. 예를 들어, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 폴리뉴클레오티드 표적, 예컨대 DNA 또는 RNA에 대한 결합 부위를 포함한다. 예를 들어, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 mRNA 표적에 대한 결합 부위를 포함한다. 예를 들어, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 rRNA 표적에 대한 결합 부위를 포함한다. 예를 들어, 변형된 circRNA는 tRNA 표적에 대한 결합 부위를 포함한다. 예를 들어, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 게놈 DNA 표적에 대한 결합 부위를 포함한다.
일부 경우에, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 단일-가닥 DNA 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 이중-가닥 DNA 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 항체 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 바이러스 입자 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 소분자 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 세포 내의 또는 그 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 RNA-DNA 하이브리드 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 메틸화된 폴리뉴클레오티드 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 비메틸화된 폴리뉴클레오티드 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 압타머 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 폴리펩티드 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 폴리펩티드, 단백질, 단백질 단편, 태깅된 단백질, 항체, 항체 단편, 소분자, 바이러스 입자(예를 들어, 막횡단 단백질을 포함하는 바이러스 입자) 또는 세포 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다.
일부 경우에, 결합 모이어티는 적어도 2개의 아미드 결합을 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 포스포디에스테르 링키지를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 DNA 또는 RNA가 아니다.
본원에 제공되는 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 복합체 상의 결합 모이어티에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다. 본원에 제공되는 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 표적에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함하여, 복합체를 형성할 수 있다. 본원에 제공되는 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)와 표적 사이에 복합체를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 단일의 표적과 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 2개 이상의 표적의 복합체와 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 3개 이상의 표적의 복합체와 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 단일의 표적과 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 2개 이상의 표적과 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 제1 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 제1 표적의 제1 결합 모이어티 및 제2 표적의 제2의 상이한 결합 모이어티와 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 제1 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 제1 표적의 제1 결합 모이어티와 복합체를 형성하며, 제2 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 제2 표적의 제2 결합 모이어티와 복합체를 형성한다.
일부 실시형태에서, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 항체-폴리펩티드 복합체, 폴리펩티드-폴리펩티드 복합체, 폴리펩티드-DNA 복합체, 폴리펩티드-RNA 복합체, 폴리펩티드-압타머 복합체, 바이러스 입자-항체 복합체, 바이러스 입자-폴리펩티드 복합체, 바이러스 입자-DNA 복합체, 바이러스 입자-RNA 복합체, 바이러스 입자-압타머 복합체, 세포-항체 복합체, 세포-폴리펩티드 복합체, 세포-DNA 복합체, 세포-RNA 복합체, 세포-압타머 복합체, 소분자-폴리펩티드 복합체, 소분자-DNA 복합체, 소분자-압타머 복합체, 소분자-세포 복합체, 소분자-바이러스 입자 복합체 및 그의 조합 상의 하나 이상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 결합 모이어티는 폴리펩티드, 단백질 또는 그의 단편 상에 존재한다. 일부 실시형태에서, 결합 모이어티는 폴리펩티드, 단백질 또는 그의 단편의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분을 포함한다. 예를 들어, 결합 모이어티는 단리된 폴리펩티드, 세포의 폴리펩티드, 정제된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분을 포함한다. 예를 들어, 결합 모이어티는 항체 또는 그의 단편의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분을 포함한다. 예를 들어, 결합 모이어티는 전사 인자의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분을 포함한다. 예를 들어, 결합 모이어티는 수용체의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분을 포함한다. 예를 들어, 결합 모이어티는 막횡단 수용체의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분을 포함한다. 결합 모이어티는 단리된, 정제된 및/또는 재조합 폴리펩티드의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 분석물(예를 들어, 용해물)의 혼합물의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상의 결합 모이어티, 또는 이를 포함한다. 예를 들어, 결합 모이어티는 복수의 세포 유래의 것 또는 단일의 세포의 용해물 유래의 것의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나, 이를 포함한다.
일부 경우에, 결합 모이어티는 소분자의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함한다. 예를 들어, 결합 모이어티는 약물의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함한다. 예를 들어, 결합 모이어티는 화합물의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함한다. 예를 들어, 결합 모이어티는 유기 화합물의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 900 달톤 이하의 분자량을 갖는 소분자의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 500 달톤 이하의 분자량을 갖는 소분자의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함한다. 결합 모이어티는 예를 들어, 조합 수단을 통해 생성되는 화합물의 라이브러리, 즉, 화합물 다양성 조합 라이브러리를 포함하는 자연 발생 또는 합성 분자의 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 조합 라이브러리 및 그들의 생성 및 스크리닝 방법은 당업계에 알려져 있으며, 미국 특허 제5,741,713호; 제5,734,018호; 제5,731,423호; 제5,721,099호; 제5,708,153호; 제5,698,673호; 제5,688,997호; 제5,688,696호; 제5,684,711호; 제5,641,862호; 제5,639,603호; 제5,593,853호; 제5,574,656호; 제5,571,698호; 제5,565,324호; 제5,549,974호; 제5,545,568호; 제5,541,061호; 제5,525,735호; 제5,463,564호; 제5,440,016호; 제5,438,119호; 및 제5,223,409호에 기술되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
결합 모이어티는 특이적 결합 쌍(예를 들어, 리간드)의 구성원의 도메인, 단편, 에피토프, 영역, 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 1가(모노에피토프) 또는 다가(폴리에피토프)의 도메인, 단편, 에피토프, 영역, 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 항원성 또는 합텐성일 수 있다. 결합 모이어티는 적어도 하나의 공통 에피토프 또는 결정기 부위를 공유하는 단일 분자 또는 복수의 분자의 도메인, 단편, 에피토프, 영역, 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 세포(예를 들어, 박테리아 세포, 식물 세포 또는 동물 세포)의 일부의 도메인, 단편, 에피토프, 영역, 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 천연 환경(예를 들어, 조직), 배양된 세포, 또는 미생물(예를 들어, 박테리아, 진균, 원생생물, 또는 바이러스), 또는 용해된 세포에 존재할 수 있다. 결합 모이어티는 하나 이상의 추가의 결합 부위, 예컨대, 비제한적으로 염료(예를 들어, 형광 염료), 폴리펩티드 변형 모이어티, 예컨대 포스페이트기, 탄수화물기 등, 또는 폴리뉴클레오티드 변형 모이어티, 예컨대 메틸기를 제공하도록 (예를 들어, 화학적으로) 변형될 수 있다.
일부 경우에, 결합 모이어티는 숙주 유래의 시료에서 관찰되는 분자의 도메인, 단편, 에피토프, 영역, 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함한다. 숙주 유래의 시료에는 체액(예를 들어, 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액, 누액, 점액 등)이 포함된다. 시료는 직접적으로 시험될 수 있거나, 결합 모이어티를 보다 쉽게 검출 가능하게 만들기 위해 사전처리될 수 있다. 시료에는 살아있는 것 또는 이전에 살아있던 것 유래의 다량의 물질이 포함된다. 시료는 천연, 재조합, 합성, 또는 비 자연 발생일 수 있다. 결합 모이어티는 세포 용해물 또는 세포 배양 배지, 시험관내 번역된 시료, 또는 시료(예를 들어, 세포 용해물)로부터의 면역침전에서, 천연적으로 또는 재조합적으로 세포로부터 발현되는 상술된 것 중 임의의 것일 수 있다.
일부 경우에, 표적의 결합 모이어티는 무세포 시스템 또는 시험관내에서 발현된다. 예를 들어, 표적의 결합 모이어티는 세포 추출물에 존재한다. 일부 경우에, 표적의 결합 모이어티는 DNA 주형, 및 전사 및 번역을 위한 시약을 갖는 세포 추출물에 존재한다. 사용될 수 있는 세포 추출물의 예시적인 공급원에는 밀 배아, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 토끼 망상적혈구, 초호열균(hyperthermophile), 하이브리도마, 제노푸스(Xenopus) 난모세포, 곤충 세포, 및 포유동물 세포(예를 들어, 인간 세포)가 포함된다. 표적 폴리펩티드를 발현하기 위해(예를 들어, 어레이 상의 표적 폴리펩티드를 생성하기 위해) 사용될 수 있는 예시적인 무세포 방법에는 단백질 동소 어레이(PISA), 다중 스폿팅 기법(MIST), 자가-어셈블링된 mRNA 번역, 핵산 프로그래밍 가능한 단백질 어레이(NAPPA), 나노웰 NAPPA, DNA 어레이 투 단백질 어레이(DNA array to protein array: DAPA), 막-부재 DAPA, 나노웰 카핑 및 μIP-마이크로인타글리오 프린팅 및 pMAC-단백질 마이크로어레이 카핑이 포함된다(문헌[Kilb et al., Eng. Life Sci. 2014, 14, 352-364] 참조).
일부 경우에, 표적의 결합 모이어티는 DNA 주형으로부터 원 위치에서(예를 들어, 어레이의 고체 기재 상에서) 합성된다. 일부 경우에, 복수의 결합 모이어티는 병렬로 또는 단일 반응에서 복수의 대응하는 DNA 주형으로부터 동소에서 합성된다. 동소 표적 폴리펩티드 발현을 위한 예시적인 방법에는 문헌[Stevens, Structure 8(9): R177-R185 (2000)]; 문헌[Katzen et al., Trends Biotechnol. 23(3):150-6. (2005)]; 문헌[He et al., Curr. Opin. Biotechnol. 19(1):4-9. (2008)]; 문헌[Ramachandran et al., Science 305(5680):86-90. (2004)]; 문헌[He et al., Nucleic Acids Res. 29(15):E73-3 (2001)]; 문헌[Angenendt et al., Mol. Cell Proteomics 5(9): 1658-66 (2006)]; 문헌[Tao et al, Nat Biotechnol 24(10):1253-4 (2006)]; 문헌[Angenendt et al., Anal. Chem. 76(7):1844-9 (2004)]; 문헌[Kinpara et al., J. Biochem. 136(2):149-54 (2004)]; 문헌[Takulapalli et al., J. Proteome Res. 11(8):4382-91 (2012)]; 문헌[He et al., Nat. Methods 5(2):175-7 (2008)]; 문헌[Chatterjee and J. LaBaer, Curr Opin Biotech 17(4):334-336 (2006)]; 문헌[He and Wang, Biomol Eng 24(4):375-80 (2007)]; 및 문헌[He and Taussig, J. Immunol. Methods 274(1-2):265-70 (2003)]에 기술된 것들이 포함된다.
일부 경우에, 핵산 표적의 결합 모이어티는 적어도 6개 뉴클레오티드, 예를 들어, 최소 8개, 9개, 10개, 12개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개 또는 100개 뉴클레오티드의 범위를 포함한다. 일부 경우에, 단백질 표적의 결합 모이어티는 뉴클레오티드의 인접 스트레치(stretch)를 포함한다. 일부 경우에, 단백질 표적의 결합 모이어티는 뉴클레오티드의 비-인접 스트레치를 포함한다. 일부 경우에, 핵산 표적의 결합 모이어티는 핵산 서열 내의 뉴클레오티드의 결실, 부가, 교환 또는 절두를 포함하는, 돌연변이 또는 기능적 돌연변이의 부위를 포함한다.
일부 경우에, 단백질 표적의 결합 모이어티는 적어도 6개 아미노산, 예를 들어, 최소 8개, 9개, 10개, 12개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개 또는 100개 아미노산의 범위를 포함한다. 일부 경우에, 단백질 표적의 결합 모이어티는 아미노산의 인접 스트레치를 포함한다. 일부 경우에, 단백질 표적의 결합 모이어티는 아미노산의 비-인접 스트레치를 포함한다. 일부 경우에, 단백질 표적의 결합 모이어티는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산의 결실, 부가, 교환 또는 절두를 포함하는, 돌연변이 또는 기능적 돌연변이의 부위를 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 모이어티는 막 결합된 단백질의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함한다. 예시적인 막 결합된 단백질에는 비제한적으로 GPCR(예를 들어, 아드레날린성 수용체, 안지오텐신 수용체, 콜레시스토키닌 수용체, 무스카린성 아세틸콜린 수용체, 뉴로텐신 수용체, 갈라닌 수용체, 도파민 수용체, 오피오이드 수용체, 에로토닌 수용체, 소마토스타틴 수용체 등), 이온 채널(예를 들어, 니코틴성 아세틸콜린 수용체, 나트륨 채널, 칼륨 채널 등), 수용체 티로신 키나제, 수용체 세린/트레오닌 키나제, 수용체 구아닐레이트 사이클라제, 성장 인자 및 호르몬 수용체(예를 들어, 표피 성장 인자(EGF) 수용체) 등이 포함된다. 결합 모이어티는 또한 막-결합된 단백질의 돌연변이체 또는 변형된 변이체의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, GPCR의 일부 단일 또는 다중 점 돌연변이는 기능을 보유하고 질병에 관여된다(예를 들어, 문헌[Stadel et al., (1997) Trends in Pharmacological Review 18:430-37] 참조).
일부 실시형태에서, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 다른 세포내 분자에 결합하기 위한 다른 결합 모티프를 포함할 수 있다. 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 응용의 비제한적인 예는 표 4에 열거되어 있다.
[표 4]
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RNA 결합 부위
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 RNA 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 하나 이상의 RNA 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 조절 핵산을 인코딩하는, 예를 들어, 내인성 유전자 및/또는 외인성 유전자의 발현을 조절하는 RNA 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA 결합 부위는 숙주 유전자의 발현을 조절한다. RNA 결합 부위는 내인성 유전자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 miRNA, siRNA, mRNA, lncRNA, RNA, DNA, 안티센스 RNA, gRNA에 대한 서열)에 혼성화되는 서열, 바이러스 DNA 또는 RNA와 같은 외인성 핵산에 혼성화하는 서열, RNA에 혼성화하는 서열, 유전자 전사를 간섭하는 서열, RNA 번역을 간섭하는 서열, RNA를 안정화시키거나, 예컨대 분해에 대한 표적화를 통하여 RNA를 불안정화시키는 서열, 및 DNA- 또는 RNA-결합 인자를 조절하는 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, RNA 결합 부위는 tRNA, lncRNA, lincRNA, miRNA, rRNA, snRNA, 마이크로RNA, siRNA, piRNA, snoRNA, snRNA, exRNA, scaRNA, Y RNA 및 hnRNA 결합 부위 중 어느 하나일 수 있다. RNA 결합 부위는 당업자에게 널리 알려져 있다.
특정 RNA 결합 부위는 생물학적 RNA 간섭(RNAi) 과정을 통하여 유전자 발현을 저해할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 전형적으로 15 내지 50개의 염기쌍(예컨대 약 18 내지 25개의 염기쌍)을 가지며 세포 내의 발현된 표적 유전자의 코딩 서열과 동일하거나(상보성이거나) 또는 거의 동일한(실질적으로 상보성인) 핵염기 서열을 갖는 RNA 또는 RNA-유사 구조를 갖는 RNAi 분자를 포함한다. RNAi 분자는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 메로듀플렉스(meroduplex) 및 다이서(dicer) 기질을 포함하나 이들에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, RNA 결합 부위는 siRNA 또는 shRNA를 포함한다. siRNA 및 shRNA는 내인성 miRNA 유전자의 가공 경로 내의 중간체와 유사하다. 일부 실시형태에서, siRNA는 miRNA로서 기능할 수 있으며, 그 역도 그러하다. siRNA와 같이 마이크로RNA는 RISC를 사용하여, 표적 유전자를 하향조절할 수 있지만, siRNA와 달리, 대부분의 동물 miRNA는 mRNA를 절단하지 않는다. 대신에, miRNA는 번역 억제 또는 폴리A 제거 및 mRNA 분해를 통해 단백질 출력물을 감소시킨다. 공지된 miRNA 결합 부위는 mRNA 3' UTR 내에 존재하며; miRNA는 miRNA의 5' 말단으로부터 뉴클레오티드 2 내지 8에 대하여 거의 완벽하게 상보성을 갖는 부위를 표적화하는 것으로 보인다. 이러한 영역은 씨드 영역으로 공지되어 있다. siRNA 및 miRNA가 상호 교환 가능하기 때문에, 외인성 siRNA는 siRNA에 대하여 씨드 상보성을 갖는 mRNA를 하향조절한다. 3' UTR 내의 다수의 표적 부위는 더 강한 하향조절을 제공할 수 있다.
miRNA는 핵산 분자의 3'UTR에 결합하는 짧은 비코딩 RNA이며, 핵산 분자 안정성을 감소시킴으로써 또는 번역을 저해함으로써 유전자 발현을 하향-조절한다. 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 miRNA 표적 서열, miRNA 서열 또는 miRNA 씨드를 포함할 수 있다. 이러한 서열은 임의의 miRNA에 대응할 수 있다.
miRNA 서열은 "씨드" 영역, 즉 성숙 miRNA의 위치 2 내지 8의 영역 내의 서열을 포함하며, 이 서열은 miRNA 표적 서열과 왓슨-크릭(Watson-Crick) 상보성을 갖는다. miRNA 씨드는 성숙 miRNA의 위치 2 내지 8, 또는 2 내지 7을 구성할 수 있다. 일부 실시형태에서, miRNA 씨드는 7개의 뉴클레오티드(예를 들어, 성숙 miRNA의 뉴클레오티드 2 내지 8)를 포함할 수 있으며, 상응하는 miRNA 표적 내의 씨드-상보성 부위에는 miRNA 위치 1과 상반되는 아데닌(A)이 측부 배치된다. 일부 실시형태에서, miRNA 씨드는 6개의 뉴클레오티드(예를 들어, 성숙 miRNA의 뉴클레오티드 2 내지 7)를 포함할 수 있으며, 상응하는 miRNA 표적 내의 씨드-상보성 부위에는 위치 1의 miRNA와 상반되는 아데닌(A)이 측부 배치된다.
miRNA 씨드의 염기는 표적 서열과 실질적으로 상보성일 수 있다. miRNA 표적 서열을 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내로 조작함으로써, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 숙주의 면역계를 회피하거나, 또는 그에 의해 검출될 수 있거나, 조절된 분해 또는 조절된 번역을 가질 수 있다. 이러한 과정은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 전달 시에 오프 표적 효과의 위험을 감소시킬 수 있다.
변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 표적 유전자의 약 5개 내지 약 25개의 인접 뉴클레오티드와 동일한 miRNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, miRNA 서열은 mRNA를 표적화하고, 디뉴클레오티드 AA로 시작하며, 약 30% 내지 70%(약 30% 내지 60%, 약 40% 내지 60% 또는 약 45% 내지 55%)의 GC-함량을 포함하고, 예를 들어, 표준 BLAST 검색에 의해 결정시, 그것이 도입될 포유동물의 게놈 내의 표적 이외의 임의의 뉴클레오티드 서열과 높은 백분율의 동일성을 갖지 않는다.
역으로, miRNA 결합 부위를 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 밖으로 조작하여(즉, 그로부터 제거하여), 특정 조직에서 단백질 발현을 조절할 수 있다. 다수의 조직에서의 발현의 조절은 도입 또는 제거 또는 하나 또는 몇몇의 miRNA 결합 부위를 통해 달성될 수 있다.
miRNA가 mRNA를 조절함으로써 단백질 발현을 조절하는 것으로 알려져 있는 조직의 예는 간(miR-122), 근육(miR-133, miR-206, miR-208), 내피 세포(miR-17-92, miR-126), 골수 세포(miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27), 지방 조직(let-7, miR-30c), 심장(miR-ld, miR-149), 신장(miR-192, miR-194, miR-204) 및 폐 상피 세포(let-7, miR-133, miR-126)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. miRNA는 또한 복잡한 생물학적 과정, 예컨대 혈관신생(miR-132)을 조절할 수 있다. 본원에 기술된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에서, 이러한 과정에 관여하는 miRNA에 대한 결합 부위를 제거하거나 도입하여, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)로부터의 발현을 생물학적으로 관련된 세포 유형에 또는 관련된 생물학적 과정의 상황에 맞춤화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, miRNA 결합 부위는 예를 들어, miR-7을 포함한다.
상이한 세포 유형에서의 miRNA의 발현 패턴의 이해를 통하여, 본원에 기술된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 특정 세포 유형에서 또는 오직 특정 생물학적 조건 하에서만 더욱 표적화된 발현을 위해 조작될 수 있다. 조직-특이적 miRNA 결합 부위의 도입을 통하여, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 조직에서 또는 생물학적 조건의 상황에서 최적의 단백질 발현을 위해 설계될 수 있다.
또한, miRNA 씨드 부위를 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내로 혼입하여, 특정 세포에서 발현을 조절할 수 있으며, 이는 생물학적 개선을 초래한다. 이의 일례는 miR-142 부위의 혼입이다. 본원에 기술된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내로의 miR-142 부위의 혼입은 조혈 세포에서 발현을 조절할 수 있을 뿐 아니라, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 인코딩된 단백질에 대한 면역 반응을 감소시키기거나 없앨 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 miRNA, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 초과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 표적 서열에 상보성인 서열 또는 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 miRNA를 포함한다.
공지된 miRNA 서열의 목록은 예를 들어, Wellcome Trust Sanger Institute, Penn Center for Bioinformatics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 및 European Molecule Biology Laboratory와 같은 연구 기관에 의해 유지되는 데이터베이스에서 확인될 수 있다. RNAi 분자는 해당 분야에 알려진 기술에 의해 쉽게 설계되고 생성될 수 있다. 또한, 컴퓨터 툴이 효과적이고 특이적인 서열 모티프를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 긴 비-코딩 RNA를 포함한다. 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)는 100개 초과의 뉴클레오티드의 비-단백질 코딩 전사물을 포함한다. 더 긴 길이는 lncRNA를 작은 조절 RNA, 예컨대 miRNA, siRNA 및 다른 짧은 RNA와 구별한다. 일반적으로, 대다수(약 78%)의 lncRNA는 조직-특이적인 것으로 특성화된다. 근처의 단백질-코딩 유전자에 대하여 반대 방향으로 전사되는(포유동물 게놈 내에 총 lncRNA의 유의미한 비율 약 20%를 포함하는) 분지 lncRNA는 근처의 유전자의 전사를 조절할 수 있다.
RNA 결합 부위의 길이는 약 5 내지 30개의 뉴클레오티드, 약 10 내지 30개의 뉴클레오티드 또는 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 관심 부위에 대한 RNA 결합 부위의 동일성의 정도는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%일 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 거대 유전자간 비-코딩 RNA(lincRNA) 결합 부위를 포함한다. 거대 유전자간 비-코딩 RNA(LincRNA)는 긴 비-코딩 RNA의 대부분을 구성한다. LincRNA는 비-코딩 전사물이며, 일부 실시형태에서, 약 200개 초과의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, lincRNA는 단백질-코딩 유전자와 유사하게 엑손-인트론-엑손 구조를 갖지만, 오픈-리딩 프레임을 포함하지 않고, 단백질을 코딩하지 않는다. LincRNA 발현은 코딩 유전자에 비해 두드러지게 조직-특이적일 수 있다. LincRNA는 전형적으로 이웃 단백질-코딩 유전자의 쌍의 그것과 유사한 정도로 그들의 이웃 유전자와 동시-발현된다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 원형화된 lincRNA를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 lincRNA, 예를 들어, FIRRE, LINC00969, PVT1, LINC01608, JPX, LINC01572, LINC00355, C1orf132, C3orf35, RP11-734, LINC01608, CC-499B15.5, CASC15, LINC00937, 및 RP11-191을 포함한다.
알려진 lincRNA 및 lncRNA 서열의 목록은 연구 조직, 예를 들어 게노믹스 통합 생물학 연구소(Institute of Genomics and Integrative Biology), 퀸즐랜드 대학 디아만티나 연구소(Diamantina Institute at the University of Queensland), 겐트 대학(Ghent University), 및 중산 대학(Sun Yat-sen University)에 의해 유지되는 데이터베이스에서 확인될 수 있다. LincRNA 및 lncRNA 분자는 해당 분야에 알려진 기술에 의해 쉽게 설계되고 생성된다. 또한, 컴퓨터 툴이 효과적이고 특이적인 서열 모티프를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
RNA 결합 부위는 내인성 유전자 또는 유전자 생성물(예를 들어, mRNA)의 전부 또는 그의 단편에 실질적으로 상보성이거나, 완전히 상보성인 서열을 포함할 수 있다. 상보성 서열은 인트론과 엑손의 경계의 서열에 상보적이어서, 전사를 위하여 특정 유전자의 새로 생성된 핵 RNA 전사물이 mRNA로 성숙하는 것을 방지할 수 있다. 상보성 서열은 그 유전자에 대한 mRNA와 혼성화됨으로써 유전자에 대해 특이적일 수 있고 그 번역을 방지할 수 있다. RNA 결합 부위는 내인성 유전자 또는 유전자 생성물(예를 들어, DNA, RNA, 또는 그의 유도체 또는 혼성체)의 전부 또는 그의 단편에 안티센스이거나 실질적으로 안티센스인 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 전형적으로 약 5개 내지 5000개 염기쌍(특정 RNA 구조에 따라, 예를 들어, miRNA 5 내지 30 bp, lncRNA 200 내지 500 bp)의 RNA 또는 RNA-유사 구조를 가지며 세포 내의 발현된 표적 유전자의 코딩 서열과 동일한(상보성인) 또는 거의 동일한(실질적으로 상보성인) 핵염기 서열을 가지는 RNA 결합 부위를 포함한다.
DNA 결합 부위
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 DNA 결합 부위, 예컨대 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 하나 이상의 DNA 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 가이드 RNA 또는 gRNA 서열에 대한 보체를 포함한다. gRNA 짧은 합성 RNA는 불완전한 이펙터 모이어티로의 결합에 필요한 "스캐폴드" 서열, 및 게놈 표적에 대한 사용자-정의된 약 20개 뉴클레오티드 표적화 서열로 구성된다. 가이드 RNA 서열은 17 내지 24개의 뉴클레오티드(예를 들어, 19, 20 또는 21개의 뉴클레오티드)의 길이를 가질 수 있으며 표적화된 핵산 서열에 대하여 상보성이다. 맞춤 gRNA 생성기 및 알고리즘이, 효과적인 가이드 RNA의 설계에서 사용될 수 있다. 유전자 편집은 또한, 자연 발생 crRNA-tracrRNA 복합체를 모방하고 tracrRNA(뉴클레아제에 결합) 및 적어도 하나의 crRNA(뉴클레아제를 편집에 대해 표적화된 서열로 가이드함) 둘 모두를 함유하는 엔지니어링된(합성) 단일 RNA 분자인, 키메라 "단일 가이드 RNA"("sgRNA")를 사용하여 달성될 수 있다. 화학적으로 변형된 sgRNA는 게놈 편집에 효과적일 수 있다.
gRNA는 특정 DNA 서열(예를 들어, 유전자의 프로모터, 증강자, 침묵자 또는 억제자에 인접한 또는 그 내의 서열)을 인식할 수 있다.
일부 실시형태에서, gRNA는 유전자 편집을 위한 CRISPR 시스템의 부분이다. 유전자 편집을 위해, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 요망되는 표적 DNA 서열에 상응하는 하나의 또는 다중의 가이드 RNA 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. gRNA 서열에는 Cas9 또는 DNA를 절단하기 위한 다른 엑소뉴클레아제와의 상호작용을 위해 적어도 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개 이상의 뉴클레오티드가 포함될 수 있으며, 예를 들어, Cpf1은 검출 가능한 DNA 절단을 위해 gRNA 서열의 적어도 약 16개 뉴클레오티드와 상호작용한다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 이중나선 DNA 내의 메이저 그루브를 결합하는 서열을 포함한다. 하나의 이러한 경우에, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 및 듀플렉스 DNA에 의해 생성되는 삼중체 구조의 특이성 및 안정성은 후그스틴(Hoogsteen) 수소 결합을 통해 제공되며, 이는 듀플렉스 DNA에서 전통적인 왓슨-크릭 염기쌍 형성에서 형성된 것들과 상이하다. 한 경우에, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 큰 홈을 통해 표적 듀플렉스의 퓨린-풍부 가닥에 결합한다.
일부 실시형태에서, 삼중체 형성은 표적 듀플렉스의 퓨린-풍부 가닥에 대한 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 배향에 의해 구별되는, 2개 모티프에서 일어난다. 일부 경우에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 폴리피리미딘 서열 스트레치는 평행 방식으로(즉, 듀플렉스의 퓨린-풍부 가닥과 동일한 5'에서 3'으로의 배향으로) 후그스틴 수소 결합을 통해 듀플렉스 DNA의 폴리퓨린 서열 스트레치에 결합하는 반면, 폴리퓨린 스트레치(R)는 역-후그스틴 수소 결합을 통해 듀플렉스의 퓨린 가닥에 역평행 방식으로 결합한다. 역평행에서, 퓨린 모티프는 G:G-C, A:AT, 또는 T:A-T의 삼중체를 포함하는 반면; 평행에서, 피리미딘 모티프는 C+:G-C 또는 T:A-T 삼중체의 정규 삼중체를 포함한다(여기서, C+는 N3 위치 상의 양성자화된 시토신을 나타냄). 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내의 역평행 GA 및 GT 서열은 중성 pH에서 안정한 삼중체를 형성할 수 있는 반면, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내의 평행 CT 서열은 산성 pH에서 결합할 수 있다. 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내의 시토신 상의 N3는 양성자화될 수 있다. 5-메틸C는 시토신보다 더 높은 pK를 가지므로, C의 5-메틸-C로의 치환은 생리학적 pH에서 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내의 CT 서열의 결합을 허용할 수 있다. 퓨린 및 피리미딘 모티프 둘 모두에 있어서, 적어도 10개 염기 쌍의 인접 호모퓨린-호모피리미딘 서열 스트레치가 듀플렉스 DNA로의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 결합을 돕는데, 이는 더 짧은 삼중체가 생리학적 조건 하에 불안정할 수 있고 서열에서의 단속이 삼중체 구조를 불안정화시킬 수 있기 때문이다. 일부 실시형태에서, 삼중체 형성을 위한 DNA 듀플렉스 표적은 하나의 가닥에서 연속 퓨린 염기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 삼중체 형성을 위한 표적은 DNA 듀플렉스의 하나의 가닥에서 호모퓨린 서열 및 상보적 가닥에서 호모피리미딘 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 포함하는 삼중체는 안정된 구조이다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 포함하는 삼중체는 증가된 반감기, 예를 들어, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 그 이상, 예를 들어, 적어도 약 1시간 내지 약 30일, 또는 적어도 약 2시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3,일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 60일, 또는 그 초과 또는 그 사이의 임의의 시간 동안의 지속성을 나타낸다.
단백질 결합 부위
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 단백질 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 하나 이상의 단백질 결합 부위를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 참조 화합물, 예를 들어, 단백질 결합 부위, 예를 들어, 선형 RNA를 결여한 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)에 의해 촉발되는 반응에 비하여 숙주로부터의 면역 반응을 감소시키는 단백질 결합 부위를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 단백질, 예를 들어, 리보솜을 결합하는 하나 이상의 단백질 결합 부위를 포함한다. 단백질 결합 부위, 예를 들어, 리보솜 결합 부위를 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 내로 조작함으로써, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 숙주의 면역계를 회피하거나, 숙주의 면역계에 의한 검출이 감소되거나, 조절된 분해 또는 조절된 번역을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 적어도 하나의 면역단백질 결합 부위를 포함하여, 예를 들어, 숙주의 면역계의 성분으로부터 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 차폐한다(예를 들어, CTL 반응을 회피한다). 일부 실시형태에서, 면역단백질 결합 부위는 면역단백질에 결합하고, 비-내인성으로서 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 차폐를 보조하는 뉴클레오티드 서열이다.
선형 RNA로의 리보솜 연계의 종래의 메커니즘은 RNA의 캡핑된 5' 말단으로의 리보솜 결합을 수반한다. 5' 말단으로부터, 리보솜은 개시 코돈으로 이동하며, 이때, 제1 펩티드 결합이 형성된다. 본 발명에 따라, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 내부 개시(즉, 캡-독립적) 또는 번역은 자유 말단 또는 캡핑된 말단을 필요로 하지 않는다. 오히려, 리보솜이 비-캡핑된 내부 부위에 결합함으로써 리보솜은 개시 코돈에서 폴리펩티드 신장을 시작한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 리보솜 결합 부위, 예를 들어, 개시 코돈을 포함하는 하나 이상의 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 단백질에 결합하는 단백질 결합 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 결합 서열은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 특정 표적에 표적화하거나 국소화시킨다. 일부 실시형태에서, 단백질 결합 서열은 단백질의 아르기닌-풍부 영역에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질 결합 부위는 단백질, 예컨대 ACIN1, AGO, APOBEC3F, APOBEC3G, ATXN2, AUH, BCCIP, CAPRIN1, CELF2, CPSF1, CPSF2, CPSF6, CPSF7, CSTF2, CSTF2T, CTCF, DDX21, DDX3, DDX3X, DDX42, DGCR8, EIF3A, EIF4A3, EIF4G2, ELAVL1, ELAVL3, FAM120A, FBL, FIP1L1, FKBP4, FMR1, FUS, FXR1, FXR2, GNL3, GTF2F1, HNRNPA1, HNRNPA2B1, HNRNPC, HNRNPK, HNRNPL, HNRNPM, HNRNPU, HNRNPUL1, IGF2BP1, IGF2BP2, IGF2BP3, ILF3, KHDRBS1, LARP7, LIN28A, LIN28B, m6A, MBNL2, METTL3, MOV10, MSI1, MSI2, NONO, NONO-, NOP58, NPM1, NUDT21, PCBP2, POLR2A, PRPF8, PTBP1, RBFOX2, RBM10, RBM22, RBM27, RBM47, RNPS1, SAFB2, SBDS, SF3A3, SF3B4, SIRT7, SLBP, SLTM, SMNDC1, SND1, SRRM4, SRSF1, SRSF3, SRSF7, SRSF9, TAF15, TARDBP, TIA1, TNRC6A, TOP3B, TRA2A, TRA2B, U2AF1, U2AF2, UNK, UPF1, WDR33, XRN2, YBX1, YTHDC1, YTHDF1, YTHDF2, YWHAG, ZC3H7B, PDK1, AKT1, 및 RNA에 결합하는 임의의 다른 단백질에 대한 결합 부위를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
다른 결합 부위
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 비-RNA 또는 비-DNA 표적에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 비-RNA 또는 비-DNA 표적에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 결합 부위는 소분자, 압타머, 지질, 탄수화물, 바이러스 입자, 막, 다-성분 복합체, 세포, 세포성 모이어티, 또는 이의 임의의 결합 부위 단편 중 하나일 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 지질에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 탄수화물에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 탄수화물에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 막에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 다성분 복합체, 예를 들어, 리보좀, 뉴클레오좀, 전사 기구 등에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다.
격리
일부 실시형태에서, 본원에 기술되는 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 표적, 예를 들어, DNA, RNA, 단백질, 및 다른 세포성 성분을 격리하여, 세포 과정을 조절한다. 관심 표적에 대한 결합 부위를 갖는 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 내인성 결합 파트너와의 표적의 결합과 경쟁할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술되는 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 miRNA를 격리한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술되는 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 mRNA를 격리한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술되는 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 단백질을 격리한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술되는 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 리보좀을 격리한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술되는 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 다른 변형된 circRNA를 격리한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술되는 변형된 circRNA는 비-코딩 RNA, lncRNA, miRNA, tRNA, rRNA, snoRNA, ncRNA, siRNA, 또는 shRNA를 격리한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술되는 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)에는 격리된 표적, 예를 들어, DNA, RNA, 단백질, 또는 변형된 circRNA에 결합된 다른 세포 성분을 분해하는 분해 요소가 포함된다. 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 격리 응용의 비제한적 예가 표 5에 열거되어 있다.
[표 5]
Figure pct00005
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 사용하는 방법 중 임의의 것은 번역 요소와 조합될 수 있다. 번역 요소를 함유하는 본원에 기술되는 변형된 circRNA는 RNA를 단백질로 번역할 수 있다.
절단 서열
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 적어도 하나의 절단 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 절단 서열은 발현 서열에 인접한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 희생 변형된 circRNA 또는 절단 가능한 변형된 circRNA 또는 자가-절단 변형된 circRNA 등에 절단 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)가 다수의 생성물, 예를 들어, miRNA, 선형 RNA, 작은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 등으로 분리되는 것을 야기하는 둘 이상의 절단 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 절단 서열에는 리보자임 RNA 서열이 포함된다. (RNA 효소 또는 촉매적 RNA로도 지칭되는 리보핵산 효소로부터의) 리보자임은 화학 반응을 촉매작용하는 RNA 분자이다. 많은 천연 리보자임은 그들의 자체의 포스포디에스테르 결합 중 하나의 가수분해, 또는 다른 RNA 내의 결합의 가수분해 중 어느 하나를 촉매작용하지만, 이들은 또한 리보솜의 아미노트랜스퍼라제 활성을 촉매작용하는 것으로 관찰되었다. 촉매적 RNA는 시험관내 방법에 의해 “진화될” 수 있다. 상기 논의된 리보스위치 활성과 유사하게, 리보자임 및 리보자임의 반응 산물은 유전자 발현을 조절할 수 있다. 일부 실시형태에서, 대량의 부피로부터의 분자의 화학적 변환의 목적을 위해, 촉매적 RNA 또는 리보자임을 더 큰 비-코딩 RNA 내에 배치하여, 리보자임이 세포 내에 다수의 카피로 존재하게 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 압타머 및 리보자임은 둘 모두 동일한 비코딩 RNA에서 인코딩될 수 있다.
희생 서열
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 희생 변형된 circRNA 또는 절단 가능한 변형된 circRNA 또는 자가-절단 변형된 circRNA를 포함한다. 변형된 circRNA는, 예를 들어, RNA, lncRNA, lincRNA, miRNA, tRNA, rRNA, snoRNA, ncRNA, siRNA, 또는 shRNA를 포함하는 세포 성분을 전달할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)에는 (i) 자가-절단 가능한 요소; (ii) 절단 동원 부위; (iii) 분해 가능한 링커; (iv) 화학적 링커; 및/또는 (v) 스페이서 서열에 의해 분리된 miRNA가 포함된다. 일부 실시형태에서, 변형된 circRNA에는 (i) 자가-절단 가능한 요소; (ii) 절단 동원 부위(예를 들어, ADAR); (iii) 분해 가능한 링커(예를 들어, 글리세롤); (iv) 화학적 링커; 및/또는 (v) 스페이서 서열에 의해 분리된 siRNA가 포함된다. 자가-절단 가능한 요소의 비제한적 예에는 햄머헤드, 스플라이싱 요소, 헤어핀, 간염 델타 바이러스(HDV), 바커드 위성(Varkud Satellite: VS), 및 glmS 리보자임이 포함된다. 변형된 circRNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 조정(immodulation) 응용의 비제한적 예가 표 6에 열거되어 있다.
[표 6]
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원형화
일 실시형태에서, 선형의 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 환화되거나 콘카테머화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 선형의 미변형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 선형의 변형된 폴리리보뉴클레오티드 분자에 라이게이션되어, 선형의 하이브리드 변형된 폴리리보뉴클레오티드 분자를 생성하며, 이는 환화되거나 콘카테머화되어 본원에 기술된 바와 같은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 변형되지 않는 폴리리보뉴클레오티드의 서열을 갖는 제1 부분을 포함하며, 제1 부분의 외측의 뉴클레오티드가 변형되는 경우 이는 이어서 환화되거나 콘카테머화되어 본원에 기술된 바와 같은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 선형의 하이브리드 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 제형화 및/또는 운반 이전에 시험관내에서 환화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 선형의 변형된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 선형의 완전히 변형된 폴리리보뉴클레오티드 또는 선형의 하이브리드 변형된 선형의폴리리보뉴클레오티드)는 세포 내에서 환화될 수 있다.
세포외 원형화
일부 실시형태에서, 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 선형의 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 선형의 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 화학적 방법을 사용하여 환화되거나, 콘카테머화되어, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 형성한다. 일부 화학적 방법에서, 핵산(예를 들어, 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 5'-말단 및 3'-말단은 서로 가까이 있는 경우, 분자의 5'-말단과 3'-말단 사이에 새로운 공유 링키지를 형성할 수 있는 화학적 반응성 기를 포함한다. 5'-말단은 NHS-에스테르 반응성 기를 함유할 수 있으며, 3'-말단은 3'-아미노-말단 뉴클레오티드를 함유할 수 있으므로, 유기 용매 중에서 선형 RNA 분자의 3'-말단 상의 3'-아미노-말단 뉴클레오티드가 5'-NHS-에스테르 모이어티 상에서 친핵성 공격을 겪어 새로운 5'-/3'-아미드 결합을 형성할 것이다.
일 실시형태에서, 5'-인산화된 핵산 분자(예를 들어, 선형의 변형 폴리리보뉴클레오티드 또는 선형의 하이브리드 변형된 폴리리보뉴클레오티드)를 핵산(예를 들어, 선형 핵산)의 3'-하이드록실기에 효소적으로 연결하여, 새로운 포스포로디에스테르 링키지를 형성하기 위해 DNA 또는 RNA 리가제가 사용될 수 있다. 일례의 반응에서, 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 선형의 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 선형의 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 제조처의 프로토콜에 따라 37℃에서 1시간 동안 1 내지 10 유닛의 T4 RNA 리가제(미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))와 인큐베이션시킨다. 라이게이션 반응은 효소적 라이게이션 반응을 보조하기 위해, 병치 위치에서 5'- 및 3'-영역 둘 모두와 염기-쌍을 형성할 수 있는 선형 핵산의 존재 하에 발생할 수 있다. 일 실시형태에서, 라이게이션은 스플린트 라이게이션이다. 예를 들어, SplintR® 리가제와 같은 스플린트 리가제는 스플린트 라이게이션을 위해 사용될 수 있다. 스플린트 라이게이션을 위해, 단일 가닥 RNA와 같은 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드(스플린트)는 선형 폴리리보뉴클레오티드의 양 말단과 혼성화하여, 단일-가닥 스플린트와의 혼성화시에 2개의 말단이 병치될 수 있도록 설계될 수 있다. 이에 따라, 스플린트 리가제는 선형의 변형된 폴리리보뉴클레오티드의 병치된 2개의 말단의 라이게이션을 촉매작용하여 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성하거나, 선형의 하이브리드 변형된 폴리리보뉴클레오티드의 병치된 2개의 말단의 라이게이션을 촉매작용하여 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성할 수 있다.
일 실시형태에서, DNA 또는 RNA 리가제는 변형된 원형 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 합성에서 사용될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 리가제는 circ 리가제 또는 원형 리가제일 수 있다.
일 실시형태에서, 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 선형의 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 선형의 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 5'- 또는 3'-말단은 리가제 리보자임 서열을 인코딩하여, 시험관내 전사 동안, 생성된 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 선형의 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 선형의 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)가 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 선형의 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 선형의 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 5'-말단을 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 선형의 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 선형의 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 3'-말단에 라이게이션시킬 수 있는 활성 리보자임 서열을 포함하게 할 수 있다. 리가제 리보자임은 그룹 I 인트론, 델타 간염 바이러스, 헤어핀 리보자임으로부터 유래될 수 있거나, SELEX(지수적 농축에 의한 리간드의 계통 진화)에 의해 선택될 수 있다. 리보자임 리가제 반응은 0℃ 내지 37℃의 온도에서 1시간 내지 24시간 걸릴 수 있다.
일 실시형태에서, 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 선형의 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 선형의 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 적어도 하나의 비-핵산 모이어티를 사용함으로써 환화되거나 콘카테머화될 수 있다. 일 양태에서, 적어도 하나의 비-핵산 모이어티는 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5' 말단 근처 및/또는 3' 말단 근처에서 영역 또는 특징부와 반응하여, 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 환화시키거나 콘카테머화시킬 수 있다. 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 비-핵산 모이어티는 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 위치하거나, 그에 또는 그 근처에 연결될 수 있다. 고려되는 비-핵산 모이어티는 상동성 또는 이종성일 수 있다. 비-제한적인 예로서, 비-핵산 모이어티는 링키지, 예컨대 소수성 링키지, 이온성 링키지, 생분해성 링키지 및/또는 절단 가능한 링키지일 수 있다. 또 다른 비-제한적인 예로서, 비-핵산 모이어티는 라이게이션 모이어티이다. 또 다른 비-제한적인 예로서, 비-핵산 모이어티는 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드 모이어티, 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 압타머 또는 비-핵산 링커일 수 있다.
일 실시형태에서, 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 선형의 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 선형의 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 선형의 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 선형의 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 5' 및 3' 말단의, 그 근처의 또는 그에 연결된 분자 표면, 원자 사이에 인력을 야기하는 비-핵산 모이어티로 인하여 환화되거나 콘카테머화될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 하나 이상의 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 선형의 완전히 변형된 폴리리보뉴클레오티드 또는 선형의 하이브리드 변형된 폴리리보뉴클레오티드)는 분자간 힘 또는 분자내 힘에 의해 환화되거나 콘카테머화될 수 있다. 분자간 힘의 비-제한적인 예는 쌍극자-쌍극자 힘, 쌍극자-유도된 쌍극자 힘, 유도된 쌍극자-유도된 쌍극자 힘, 반 데르 발스 힘(Van der Waals force) 및 런던 분산력(London dispersion force)을 포함한다. 분자내 힘의 비-제한적인 예는 공유 결합, 금속 결합, 이온 결합, 공명 결합, 아그노스트 결합(agnostic bond), 쌍극자 결합, 컨쥬게이션, 하이퍼컨쥬게이션 및 반결합(antibonding)을 포함한다.
일 실시형태에서, 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 선형의 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 선형의 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 5' 말단 근처 및 3' 말단 근처에 리보자임 RNA 서열을 포함할 수 있다. 리보자임 RNA 서열은 서열이 리보자임의 나머지에 노출되는 경우 펩티드에 공유적으로 연결될 수 있다. 일 양태에서, 5' 말단 및 3' 말단 근처에서 리보자임 RNA 서열에 공유적으로 연결되는 펩티드는 서로 회합하여, 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 선형의 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 선형의 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)가 환화되거나 콘카테머화되게 할 수 있다. 또 다른 양태에서, 5' 말단 및 3' 말단 근처에서 리보자임 RNA에 공유적으로 연결된 펩티드는 해당 분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대 비제한적으로, 단백질 라이게이션을 사용하여 라이게이션 처리된 후에 선형의 일차 구축물 또는 선형의 mRNA가 환화되거나 콘카테머화되게 할 수 있다. 본 발명의 선형의 일차 구축물 또는 선형 RNA에 사용하기 위한 리보자임의 비-제한적인 예 또는 펩티드를 혼입시키고/시키거나 공유적으로 연결하기 위한 방법의 비-배타적인 목록은 미국 특허 공개 제US20030082768호에 기술되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 선형의 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 선형의 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 예를 들어, 5' 트리포스페이트를 RNA 5' 피로포스포하이드롤라제(RppH) 또는 ATP 디포스포하이드롤라제(아피라제)와 접촉시킴으로써 5' 모노포스페이트로 전환되는 핵산의 5' 트리포스페이트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 선형의 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 선형의 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 5' 트리포스페이트를 5' 모노포스페이트로 전환시키는 것은 (a) 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 선형의 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 선형의 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 5' 뉴클레오티드를 포스파타제(예를 들어, 안타크틱(Antarctic) 포스파타제, 쉬림프(Shrimp) 알칼리성 포스파타제 또는 송아지 장내 포스파타제)와 접촉시켜, 3개 모두의 포스페이트를 제거하는 단계; 및 (b) 단계 (a) 후에 5' 뉴클레오티드를 단일의 포스페이트를 부가하는 키나제(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 키나제)와 접촉시키는 단계를 포함하는 2-단계 반응에 의해 발생할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 원형화 방법의 원형화 효율은 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 100%이다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 원형화 방법의 원형화 효율은 적어도 약 40%이다.
스플라이싱 요소
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 적어도 하나의 스플라이싱 요소를 포함한다. 본원에 제공되는 바와 같은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)에서, 스플라이싱 요소는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 스플라이싱을 매개할 수 있는 완전한 스플라이싱 요소일 수 있다. 대안적으로, 스플라이싱 요소는 또한 완료된 스플라이싱 사건으로부터의 잔류 스플라이싱 요소일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 선형 폴리리보뉴클레오티드의 스플라이싱 요소는 선형 폴리리보뉴클레오티드의 원형화를 초래하는 스플라이싱 사건을 매개할 수 있으며, 그에 의해, 생성된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 이러한 스플라이싱-매개된 원형화 사건으로부터의 잔류 스플라이싱 요소를 포함한다. 일부 경우에, 잔류 스플라이싱 요소는 어떠한 스플라이싱도 매개할 수 없다. 다른 경우에, 잔류 스플라이싱 요소는 특정 환경 하에서 여전히 스플라이싱을 매개할 수 있다. 일부 실시형태에서, 스플라이싱 요소는 적어도 하나의 발현 서열에 인접해 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 각 발현 서열에 인접한 스플라이싱 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스플라이싱 요소는 각 발현 서열의 한측 또는 양측 모두에 존재하여, 발현 생성물, 예를 들어, 펩티드(들) 및 또는 폴리펩티드(들)의 분리를 야기한다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 복제되는 경우, 스플라이싱된 말단이 함께 연결되는 내부 스플라이싱 요소를 포함한다. 일부 예는 스플라이스 부위 서열 및 짧은 역위 반복부(30개 내지 40개 뉴클레오티드), 예컨대 AluSq2, AluJr 및 AluSz를 갖는 미니어처 인트론(100개 미만의 뉴클레오티드) 및 측접 인트론 내의 역위 서열, 측접 인트론 내의 Alu 요소, 및 백스플라이스 사건에 근접한 시스-서열 요소에서 관찰되는 모티프(suptable4 풍부 모티프), 예컨대 측접하는 엑손을 갖는 백스플라이스 부위의 앞(그의 업스트림) 또는 뒤(그로부터 다운스트림) 200 bp 내의 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 본원의 다른 곳에 내부 스플라이싱 요소로서 기술된 적어도 하나의 반복 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 반복 뉴클레오티드 서열은 Alu 패밀리의 인트론으로부터의 반복된 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 스플라이싱-관련 리보솜 결합 단백질은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 생물발생을 조절할 수 있다(예를 들어, Muscleblind 및 Quaking(QKI) 스플라이싱 인자).
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 헤드-투-테일 연접부에 측부 배치된 정규 스플라이스 부위를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 2개의 3-뉴클레오티드 벌지가 측부 배치된 4-염기쌍 스템(stem)을 포함하는 벌지-나선-벌지 모티프를 포함할 수 있다. 절단은 벌지 영역 내의 부위에서 발생하여, 말단 5'-하이드록실기 및 2',3'-사이클릭 포스페이트를 갖는 특징적인 단편을 생성한다. 원형화는 3',5'-포스포디에스테르 가교를 형성하는 동일한 분자의 2',3'-사이클릭 포스페이트 상으로의 5'-OH 기의 친핵성 공격에 의해 진행된다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 HPR 요소를 보유한 다량체 반복 RNA 서열을 포함할 수 있다. HPR은 2',3'-사이클릭 포스페이트 및 5'-OH 말단을 포함한다. HPR 요소는 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5'- 및 3'-말단을 자가-처리함으로써 말단들을 함께 라이게이션시킨다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 자가-라이게이션을 매개하는 서열을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 자가-라이게이션시키기 위해 HDV 서열(예를 들어, HDV 복제 도메인 보존된 서열, GGCUCAUCUCGACAAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCAAGUUCGAGCAUGAGCC 또는 GGCUAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCGAGCC)을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 자가-라이게이션시키기 위해 (예를 들어, PSTVd 내의) 루프 E 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 자가-원형화 인트론, 예를 들어, 5' 및 3' 스플라이스 연접부 또는 자가-원형화 촉매적 인트론, 예컨대 그룹 I, 그룹 II 또는 그룹 III 인트론을 포함할 수 있다. 그룹 I 인트론 자가-스플라이싱 서열의 비제한적인 예는 T4 박테리오파지 유전자 td로부터 유래된 자가-스플라이싱 재배치된 인트론-엑손 서열 및 테트라히메나(Tetrahymena)의 개재 서열(IVS) rRNA를 포함할 수 있다.
기타 원형화 방법
일부 실시형태에서, 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 개별 인트론 내에 또는 측부 배치 인트론에 걸쳐, 반복 또는 비반복 핵산 서열을 포함하는 상보성 서열을 포함할 수 있다. 반복 핵산 서열은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 세그먼트 내에 존재하는 서열이다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 반복 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 반복 뉴클레오티드 서열은 폴리 CA 또는 폴리 UG 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 또 다른 세그먼트 내의 상보성 반복 핵산 서열에 혼성화하는 적어도 하나의 반복 핵산 서열을 포함하며, 혼성화된 세그먼트와 함께 내부 이중 가닥을 형성한다. 일부 실시형태에서, 2개의 개별 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터의 반복 핵산 서열과 상보성 반복 핵산 서열은 혼성화하여, 단일의 원형화된 폴리리보뉴클레오티드를 생성하며, 혼성화된 세그먼트는 내부 이중 가닥을 형성한다. 일부 실시형태에서, 상보성 서열은 선형의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단에서 관찰된다. 일부 실시형태에서, 상보성 서열은 약 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 그 초과의 쌍이 형성된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 화학적 원형화 방법을 사용하여 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 이러한 방법은 클릭 화학(예를 들어, 알킨 및 아지드 기반의 방법 또는 클릭 가능한 염기), 올레핀 복분해, 포스포르아미데이트 라이게이션, 헤미아미날-이민 가교결합, 염기 변형 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 효소적 원형화 방법을 사용하여, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 라이게이션 효소, 예를 들어, DNA 또는 RNA 리가제를 사용하여, 원형 폴리리보뉴클레아제의 주형 또는 상보물, 원형 폴리리보뉴클레아제의 상보성 가닥 또는 원형 폴리리보뉴클레아제를 생성할 수 있다.
변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 원형화는 해당 분야에 알려져 있는 방법, 예를 들어, 문헌["RNA circularization strategies in vivo and in vitro" by Petkovic and Muller from Nucleic Acids Res, 2015, 43(4): 2454-2465] 및 문헌["In vitro circularization of RNA" by Muller and Appel, from RNA Biol, 2017, 14(8):1018-1027]에 기술된 것들에 의해 달성될 수 있다.
복제 요소
변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 복제에 유용한 서열 및/또는 모티프를 인코딩할 수 있다. 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 복제는 상보성 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성함으로써 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 전사를 개시하기 위한 모티프를 포함하며, 전사는 내인성 세포 기구(DNA-의존성 RNA 폴리머라제), 또는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 인코딩된 RNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 유도된다. 회전환 전사 사건의 생성물은 리보자임에 의해 절단되어, 상보성 또는 증량된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 단위 길이로 생성할 수 있다. 리보자임은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드, 그의 상보물에 의해 또는 RNA 서열에 의해 트랜스로 인코딩될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 리보자임은 원형 RNA 증량을 제어하기 위해 리보자임의 활성을 조절하는(저해하거나 촉진시키는) 서열 또는 모티프를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단위-길이 서열은 세포 RNA 리가제에 의해 원형 형태로 라이게이션될 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 자가 복제를 보조하는 복제 요소를 포함한다. 이러한 복제 요소의 예는 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0280] 내지 [0282]에 기술된 것들을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 적어도 하나의 리보자임 서열을 포함하여 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)로부터 복제되는 긴 전사물을 특정 길이로 절단하며, 또 다른 인코딩된 리보자임은 리보자임 서열에서 전사물을 절단한다. 원형화는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 상보물을 형성한다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 예를 들어, 엑소뉴클레아제에 의한 분해에 대해 실질적으로 저항성이다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 세포 내에서 복제된다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 약 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 95%, 95% 내지 99%의 비 또는 그 사이의 임의의 백분율로 세포 내에서 복제된다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 세포 내에서 복제되며, 딸 세포로 이동된다. 일부 실시형태에서, 세포는 적어도 하나의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 효율로 딸 세포로 이동시킨다. 일부 실시형태에서, 감수분열을 겪는 세포는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 효율로 딸 세포로 이동시킨다. 일부 실시형태에서, 유사분열을 겪는 세포는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 하이브리드 변형된 원형 폴리 리(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 보뉴클레오티드를 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 효율로 딸 세포로 이동시킨다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 숙주 세포 내에서 복제한다. 일 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서 복제 가능하다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 숙주 세포에서 복제되는 동안, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 숙주의 게놈 내로, 예를 들어, 숙주의 염색체와 통합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 예를 들어, 숙주의 염색체와, 무시할 수 있는 재조합 빈도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 예를 들어, 숙주의 염색체와 예를 들어, 약 1.0 cM/Mb, 0.9 cM/Mb, 0.8 cM/Mb, 0.7 cM/Mb, 0.6 cM/Mb, 0.5 cM/Mb, 0.4 cM/Mb, 0.3 cM/Mb, 0.2 cM/Mb, 0.1 cM/Mb 미만 또는 그 미만의 재조합 빈도를 갖는다.
기타 서열
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 또 다른 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 DNA, RNA 또는 인공 핵산을 포함하는 기타 서열을 포함할 수 있다. 기타 서열은 게놈 DNA, cDNA, 또는 tRNA, mRNA, rRNA, miRNA, gRNA, siRNA 또는 다른 RNAi 분자를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 원형 폴리리보뉴클레오티드와 동일한 유전자 발현 생성물의 상이한 유전자좌를 표적화하기 위한 siRNA를 포함한다. 일 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드와 상이한 유전자 발현 생성물을 표적화하기 위한 siRNA를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 5'-UTR을 결여한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 3'-UTR을 결여한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 폴리-A 서열을 결여한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 종결 요소를 결여한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)드는 내부 리보솜 진입 부위를 결여한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 엑소뉴클레아제에 의한 분해 감수성을 결여한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)가 분해 감수성을 결여한다는 사실은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)가 엑소뉴클레아제에 의해 분해되지 않거나, 엑소뉴클레아제의 존재 하에서 엑소뉴클레아제의 부재 하에서와 유사하거나 비슷한, 제한된 정도로만 분해된다는 것을 의미할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 엑소뉴클레아제에 의한 분해를 결여한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 엑소뉴클레아제에 노출되는 경우 감소된 분해를 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 캡-결합 단백질로의 결합을 결여한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 5'-UTR을 결여한다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 5'-UTR을 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질이 발현되는 데 적격성이다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 3'-UTR을 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질이 발현되는 데 적격성이다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 폴리-A 서열을 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질이 발현되는 데 적격성이다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 종결 요소를 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질이 발현되는 데 적격성이다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 내부 리보솜 진입 부위를 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질이 발현되는 데 적격성이다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 캡을 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질이 발현되는 데 적격성이다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 5'-UTR, 3'-UTR 및 IRES를 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질이 발현되는 데 적격성이다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하기의 서열 중 하나 이상을 포함한다: 하나 이상의 miRNA를 인코딩하는 서열, 하나 이상의 복제 단백질을 인코딩하는 서열, 외인성 유전자를 인코딩하는 서열, 치료제를 인코딩하는 서열, 조절 요소(예를 들어, 번역 조절제, 예를 들어, 번역 증강자 또는 억제자), 번역 개시 서열, 내인성 유전자를 표적화하는 하나 이상의 조절 핵산(siRNA, lncRNA, shRNA) 및 치료적 mRNA 또는 단백질을 인코딩하는 서열.
기타 서열은 약 2개 내지 약 10000개 뉴클레오티드, 약 2개 내지 약 5000개 뉴클레오티드, 약 10개 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 50개 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 100개 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 150개 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 200개 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 250개 내지 약 350개 뉴클레오티드, 약 300개 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 10개 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 50개 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 100개 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1000개 내지 약 2000개 뉴클레오티드, 약 2000개 내지 약 3000개 뉴클레오티드, 약 3000개 내지 약 4000개 뉴클레오티드, 약 4000개 내지 약 5000개 뉴클레오티드 또는 그 사이의 임의의 범위의 길이를 가질 수 있다.
그의 원형화의 결과로서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 그를 선형 RNA로부터 구분짓는 소정의 특징을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 선형 RNA에 비하여 엑소뉴클레아제에 의한 분해에 대한 감수성이 더 낮다. 이와 같이, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 특히 엑소뉴클레아제의 존재 하에 인큐베이션되는 경우에 선형 RNA보다 더 안정하다. 선형 RNA와 비교하여 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 안정성이 증가하여, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 폴리펩티드를 생성하기 위한 세포 형질전환 시약으로서 더욱 용이하게 되며, 선형 RNA보다 더욱 용이하고 더 오래 보관될 수 있다. 엑소뉴클레아제로 처리되는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 안정성은 (예를 들어, 겔 전기영동에 의해) RNA 분해가 발생했는지의 여부를 결정하는 해당 분야의 표준 방법을 사용하여 시험될 수 있다.
더욱이, 선형 RNA와 달리, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 포스파타제, 예컨대 송아지 장내 포스파타제와 인큐베이션시키는 경우 탈인산화에 대한 감수성이 더 낮다.
뉴클레오티드 스페이서 서열
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 적어도 하나의 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 그 초과의 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0295] 내지 [0302]에서의 설명에 따라 구성된 하나 이상의 스페이서 서열을 포함하며, 이는 본원에 그의 전문이 참조로 포함된다. 비-핵산 링커
본원에 기술된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 또한 비-핵산 링커를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 본원에 기술된 서열 또는 요소 중 하나 이상 사이에 비-핵산 링커를 갖는다. 일 실시형태에서, 본원에 기술된 하나 이상의 서열 또는 요소는 링커와 연결된다. 비-핵산 링커는 화학 결합, 예를 들어, 하나 이상의 공유 결합 또는 비-공유 결합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-핵산 링커는 펩티드 또는 단백질 링커이다. 이러한 링커는 2개 내지 30개 아미노산 또는 그 초과일 수 있다. 링커는 유연성, 경성 또는 절단 가능한 링커, 예컨대 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0304] 내지 [0307]에 기술된 것들을 포함한다.
안정성/반감기
일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 참조물질, 예를 들어 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖지만 원형화되지 않은 선형 폴리리보뉴클레오티드(선형 대응물) 또는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 증가된 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 분해, 예를 들어, 엑소뉴클레아제에 대해 실질적으로 저항성이다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 자가-분해에 대해 저항성이다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 효소적 절단 부위, 예를 들어, 다이서(dicer) 절단 부위를 결여한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 참조물질, 예를 들어, 선형 대응물 또는 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 120%, 적어도 약 140%, 적어도 약 150%, 적어도 약 160%, 적어도 약 180%, 적어도 약 200%, 적어도 약 300%, 적어도 약 400%, 적어도 약 500%, 적어도 약 600%, 적어도 약 700% 적어도 약 800%, 적어도 약 900%,, 적어도 약 1000% 또는 적어도 약 10000% 더 긴 반감기를 갖는다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 세포 분열 동안 세포에서 지속된다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 유사분열 후에 딸 세포에서 지속된다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 세포 내에서 복제되며, 딸 세포로 이동된다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 자가-복제를 매개하는 복제 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복제 요소는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)에 상보성(선형 상보성)인 선형 폴리리보뉴클레오티드로의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 전사를 매개한다. 일부 실시형태에서, 선형의 상보성 폴리리보뉴클레오티드는 세포에서 상보성 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로 생체내에서 원형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상보성 폴리리보뉴클레오티드는 출발 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드와 동일한 또는 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 또 다른 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로 추가로 자가-복제될 수 있다. 하나의 예시적인 자가-복제 요소는 HDV 복제 도메인을 포함한다(문헌[Beeharry et al, Virol, 2014, 450-451:165-173]에 의해 기술된 바와 같음). 일부 실시형태에서, 세포는 적어도 하나의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 효율로 딸 세포로 이동시킨다. 일부 실시형태에서, 감수분열을 겪는 세포는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 효율로 딸 세포로 이동시킨다. 일부 실시형태에서, 유사분열을 겪는 세포는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 효율로 딸 세포로 이동시킨다.
구조
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 고차 구조, 예를 들어, 이차 또는 삼차 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 고차 구조, 예컨대 본원에 그의 전문이 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호에 기술된 것들을 포함하도록 구성된다.
약제학적 조성물
본 발명은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 조합된 조성물을 포함한다. 약제학적 조성물은 선택적으로 하나 이상의 추가의 활성 물질, 예를 들어, 치료적 및/또는 예방적 활성 물질을 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 무균이고/이거나 발열원-부재일 수 있다. 약제학적 제제의 제형화 및/또는 제조에서의 일반적인 고려사항은 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st?ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005](본원에 참조로 포함됨)에서 찾을 수 있다.
본원에 제공되는 약제학적 조성물의 설명이 주로 인간으로의 투여에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물이 일반적으로 임의의 다른 동물로의, 예를 들어, 비-인간 동물, 예를 들어, 비-인간 포유동물로의 투여에 적합하다는 것을 당업자라면 이해할 것이다. 조성물을 다양한 동물로의 투여에 적합하게 하기 위한, 인간으로의 투여에 적합한 약제학적 조성물의 변형은 널리 알려져 있으며, 숙련된 수의학 약리학자는, 존재하는 경우, 일상적인 실험만으로 이러한 변형을 설계하고/설계하거나 수행할 수 있다. 약제학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체는 인간 및/또는 기타 영장류; 포유동물, 예컨대 상업적으로 관련된 포유동물, 예컨대 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스 및/또는 랫트; 및/또는 조류, 예컨대 상업적으로 관련된 조류, 예컨대 가금류, 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기술된 약제학적 조성물의 제형은 약리학 분야에 알려져 있거나, 이후에 개발되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분이 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 회합되게 한 다음, 필요하면 그리고/또는 바람직하면, 생성물을 나누고/나누거나, 성형하고/성형하거나 패키징하는 단계를 포함한다.
전달
본원에 기술된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 본원에 기술된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 운반 담체와 함께 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 어떠한 담체도 포함하지 않는 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 비경구 투여가 가능한 희석제를 포함하는 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 에탄올을 포함하는 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 방법은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드), 조성물 또는 약제학적 조성물을 대상체의 세포 또는 조직에 또는 대상체에 비경구적으로 투여하는 단계를 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드), 본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물의 생체내 전달 방법을 포함한다.
본원에 기술된 약제학적 조성물은 예를 들어, 약제학적 부형제 또는 담체를 포함하도록 제형화될 수 있다. 약제학적 담체는 막, 지질 이중층, 및/또는 폴리머 담체, 예를 들어, 리포좀, 예컨대 나노입자, 예를 들어, 지질 나노입자일 수 있고, 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간 또는 비-인간 농업용 동물 또는 가축, 예를 들어, 소, 개, 고양이, 말, 가금)에게, 알려진 방법에 의해, 예컨대 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 부분적인 또는 완전한 캡슐화를 통해 전달될 수 있다.이러한 방법은 트랜스펙션(예를 들어, 지질-매개, 양이온성 폴리머, 인산칼슘, 덴드리머); 천기천공법 또는 다른 멤브레인 파괴 방법(예를 들어, 뉴클레오펙션(nucleofection)), 바이러스 운반(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV), 미세주입, 미세투사물 충격("유전자 총"), 퓨진(fugene), 직접 초음파 로딩, 세포 스퀴징, 광학적 트랜스펙션, 원형질체 융합, 임페일펙션(impalefection), 마그네토펙션(magnetofection), 엑소좀-매개 전달, 지질 나노입자-매개 전달 및 그의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 전달 방법은 또한, 예를 들어, 문헌[Gori et al., Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy. Human Gene Therapy. July 2015, 26(7): 443-451. doi:10.1089/hum.2015.074]; 및 문헌[Zuris et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nat Biotechnol. 2014 Oct 30;33(1):73-80]에 기술되어 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 또는 약제학적 조성물은 네이키드 전달 제형으로서 전달될 수 있다. 네이키드 전달 제형은 담체의 보조 없이, 그리고 원형 폴리리보뉴클레오티드의 공유적 변형 또는 부분적인 또는 완전한 캡슐화 없이, 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 세포로 전달한다.
네이키드 전달 제형은 담체가 없는 제형이며, 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 세포로의 전달을 돕는 모이어티에 결합하는 공유적 변형 없이 존재하며, 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 부분적 또는 완전 캡슐화 없이 존재한다. 일부 실시형태에서, 세포로의 전달을 돕는 모이어티에 결합하는 공유적 변형이 없는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포로의 전달을 돕는 단백질, 소분자, 입자, 폴리머 또는 생체고분자에 공유적으로 결합되지 않는다.
일부 실시형태에서, 네이키드 전달 제형에는 하기 중 임의의 것 또는 그의 전부가 없을 수 있다: 트랜스펙션 시약, 양이온성 담체, 탄수화물 담체, 나노입자 담체 또는 단백질 담체. 예를 들어, 네이키드 전달 제형에는 피토글리코겐 옥테닐 숙시네이트, 피토글리코겐 베타-덱스트린, 무수물-변형된 피토글리코겐 베타-덱스트린, 리포펙타민, 폴리에틸렌이민, 폴리(트리메틸렌이민), 폴리(테트라메틸렌이민), 폴리프로필렌이민, 아미노글리코시드-폴리아민, 디데옥시-디아미노-b-사이클로덱스트린, 스페르민, 스페르미딘, 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 폴리(라이신), 폴리(히스티딘), 폴리(아르기닌), 양이온화된 젤라틴, 덴드리머, 키토산, l,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), l-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드(DOTIM), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-l-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), 3B-[N―(N＼N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤 하이드로클로라이드(DC-콜레스테롤 HCl), 디헵타데실아미도글리실 스페르미딘(DOGS), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(l,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 지질단백질(LDL), 고밀도 지질단백질(HDL) 또는 글로불린이 없을 수 있다.
네이키드 전달 제형은 비-담체 부형제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-담체 부형제는 비활성 성분을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-담체 부형제는 완충제, 예를 들어, PBS를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-담체 부형제는 용매, 비-수성 용매, 희석제(예를 들어, 비경구 투여가 가능한 희석제), 현탁 조제, 계면 활성제, 등장화제, 농후제, 유화제, 보존제, 폴리머, 펩티드, 단백질, 세포, 히알루로니다제, 분산제, 과립화제, 붕해제, 결합제, 완충제, 윤활제 또는 오일일 수 있다.
일부 실시형태에서, 네이키드 전달 제형은 희석제(예를 들어, 비경구 투여가 가능한 희석제)를 포함할 수 있다. 희석제는 액체 희석제 또는 고체 희석제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 희석제는 RNA 가용화제, 완충제 또는 등장화제일 수 있다. RNA 가용화제의 예에는 물, 에탄올, 메탄올, 아세톤, 포름아미드 및 2-프로판올을 포함한다. 완충제의 예에는 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES), 비스(Bis)-트리스(Tris), 2-[(2-아미노-2-옥소에틸)-(카복시메틸)아미노]아세트산(ADA), N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산(ACES), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)(PIPES), 2-[[1,3-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]에탄술폰산(TES), 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산(MOPS), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES), 트리스(Tris), 트리신(Tricine), Gly-Gly, 비신(Bicine) 또는 포스페이트가 포함된다. 등장화제의 예에는 글리세린, 만니톨, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 트레할로스 또는 수크로스가 포함된다.
추가로 본 발명은 본원에 기술된 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 숙주 또는 숙주 세포는 식물, 곤충, 박테리아, 진균, 척추동물, 포유동물(예를 들어, 인간) 또는 다른 유기체 또는 세포이다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 숙주에서 비-면역원성이다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 참조 화합물, 예를 들어, 기술된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)에 상응하는 선형 폴리뉴클레오티드, 또는 엔크립토겐을 결여한 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 촉발되는 반응에 비하여, 숙주의 면역계에 의한 반응이 감소되거나, 그에 의한 반응을 생성하지 못한다. 일부 면역 반응은 체액성 면역 반응(예를 들어, 항원-특이적 항체의 생성) 및 세포-매개의 면역 반응(예를 들어, 림프구 증식)을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 숙주 또는 숙주 세포는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)와 접촉된다(예를 들어, 그로 운반되거나, 그에 투여된다). 일부 실시형태에서, 숙주는 포유동물, 예컨대 인간이다. 숙주 내의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드), 발현 생성물 또는 둘 모두의 양은 투여 이후 임의의 시간에 측정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 배양 중 숙주 성장의 시간 추이를 결정한다. 성장이 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 존재 하에 증가하거나 감소하면, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 또는 발현 생성물 또는 둘 모두는 숙주의 성장을 증가시키거나 감소시키는 데 효율적인 것으로 확인된다.
전달 방법
세포, 조직 또는 대상체로의 본원에 기술된 바와 같은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 전달 방법은 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물을 세포, 조직 또는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 전달 방법은 생체내 방법이다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 변형 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 전달 방법은 본원에 기술된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전달을 필요로 하는 대상체에 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물을 본원에 기술된 바와 같은 변형 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 전달을 필요로 하는 대상체에 비경구적으로 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 예로서, 대상체의 세포 또는 조직으로의 변형 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 전달 방법은 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물을 세포 또는 조직에 비경구적으로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 대상체에서 생물학적 반응을 야기하기에 유효한 양으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 변형 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 대상체 내의 세포 또는 조직에 생물학적 효과를 갖기에 유효한 양이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물은 담체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물은 희석제를 포함하며, 이는 어떠한 담체도 없다. 일부 실시형태에서, 비경구 투여는 정맥내로, 근육내로, 안과적으로 또는 국소로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 구강 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 비강 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 흡입 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 국부 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 점안 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 직장 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 주사 투여된다. 투여는 전신 투여 또는 국소 투여일 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 비경구 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 피내, 두개내, 척추강내, 림프내, 피하 또는 근육내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 안구내 투여, 와우내(내이) 투여 또는 기관내 투여를 통해 투여된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 전달 방법 중 임의의 것은 담체를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 임의의 전달 방법은 담체 또는 세포 투과제의 도움 없이 수행된다.
세포 및 소낭-기반의 담체
본원에 기술된 변형된 원형 RNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 조성물 또는 제제는 소낭 또는 다른 막-기반의 담체에서 세포에 투여될 수 있다.
실시형태들에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물 내의 변형된 원형 RNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 세포, 소낭 또는 다른 막-기반의 담체에서 또는 그를 통해 투여된다. 일 실시형태에서, 변형된 circRNA를 포함하는 약제학적 조성물은 리포좀 또는 다른 유사한 소낭에서 제형화될 수 있다. 리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싸는 단일 또는 다중 라멜라 지질 이중층 및 상대적으로 불투과성인 외측 친지성 인지질 이중층으로 구성된 구형 소낭 구조이다. 리포좀은 음이온성, 중성 또는 양이온성일 수 있다. 리포좀은 그들이 생체적합성이며, 비독성이고, 친수성 및 친지성 약물 분자를 둘 모두를 전달하고, 혈장 효소에 의한 분해로부터 그들의 카고를 보호하고, 생물학적 막 및 혈액 뇌 장벽(BBB)을 가로질러 그들의 로드를 수송할 수 있다(예를 들어, 검토를 위하여, 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
소낭은 몇몇의 상이한 유형의 지질로부터 제조될 수 있지만; 약물 담체로서 리포좀을 생성하는 데 인지질이 가장 흔히 사용된다. 다중 라멜라 소낭 지질의 제조 방법은 해당 분야에 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,693,086호를 참조하며, 다중 라멜라 소낭 지질 제제에 관한 이의 교시는 본원에 참조로 포함됨). 지질 필름이 수용액과 혼합될 때 소낭 형성은 자발적일 수 있지만, 그것은 또한 균질화기, 초음파처리기 또는 압출 장치를 사용하는 것에 의해 진탕 형태로 힘을 인가함으로써 더 신속히 처리될 수 있다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조). 압출된 지질은 문헌[Templeton et al., Nature Biotech, 15:647-652, 1997]에 기술된 바와 같이 감소하는 크기의 필터를 통해 압출시킴으로써 제조될 수 있으며, 압출된 지질 제제에 관한 상기 문헌의 교시는 본원에 참조로 포함된다.
지질 나노입자는 본원에 기술되는 변형된 원형 RNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 조성물 또는 제제를 위한 생체적합성 및 생분해성 전달 시스템을 제공하는 담체의 또 다른 예이다. 나노구조화된 지질 담체(NLC)는 SLN의 특징을 보유하고, 약물 안정성 및 부하능을 개선하고, 약물 누출을 방지하는 변형된 고체 지질 나노입자(SLN)이다. 폴리머 나노입자(PNP)는 약물 전달의 중요한 성분이다. 이들 나노입자는 특정 표적에 대한 약물 전달을 효과적으로 유도하며 약물 안정성 및 제어된 약물 방출을 개선할 수 있다. 리포좀 및 폴리머를 조합한 새로운 유형의 담체인 지질-폴리머 나노입자(PLN)가 또한 사용될 수 있다. 이들 나노입자는 PNP 및 리포좀의 상보적 이점을 보유한다. PLN은 코어-셸 구조로 구성되며; 폴리머 코어는 안정한 구조를 제공하며, 인지질 셸은 우수한 생체적합성을 제공한다. 이와 같이, 2개의 성분은 약물 캡슐화 효율을 증가시키고, 표면 변형을 촉진하고, 수용성 약물의 누출을 방지한다. 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Li et al. 2017, Nanomaterials 7, 122; doi:10.3390/nano7060122]을 참조한다.
담체의 추가의 비제한적인 예에는 탄수화물 담체(예를 들어, 무수물-변형된 피토글리코겐 또는 글리코겐-유형 물질), 단백질 담체(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 공유적으로 연결된 단백질) 또는 양이온성 담체(예를 들어, 양이온성 리포폴리머 또는 트랜스펙션 시약)가 포함된다. 탄수화물 담체의 비제한적인 예에는 피토글리코겐 옥테닐 숙시네이트, 피토글리코겐 베타-덱스트린 및 무수물-변형된 피토글리코겐 베타-덱스트린이 포함된다. 양이온성 담체의 비제한적인 예에는 리포펙타민(lipofectamine), 폴리에틸렌이민, 폴리(트리메틸렌이민), 폴리(테트라메틸렌이민), 폴리프로필렌이민, 아미노글리코시드-폴리아민, 디데옥시-디아미노-b-사이클로덱스트린, 스페르민, 스페르미딘, 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 폴리(라이신), 폴리(히스티딘), 폴리(아르기닌), 양이온화된 젤라틴, 덴드리머, 키토산, l,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), l-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드(DOTIM), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-l-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), 3B-[N―(N＼N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤 하이드로클로라이드(DC-콜레스테롤 HC1), 디헵타데실아미도글리실 스페르미딘(DOGS), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(l,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE) 및 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC)가 포함된다. 단백질 담체의 비제한적인 예에는 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 지질단백질(LDL), 고밀도 지질단백질(HDL) 또는 글로불린이 포함된다.
엑소좀은 또한 본원에 기술되는 원형 RNA 조성물 또는 제제를 위한 약물 전달 비히클로서 사용될 수 있다. 검토를 위하여, 문헌[Ha et al. July 2016. Acta Pharmaceutica Sinica B. Volume 6, Issue 4, Pages 287-296; doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001]을 참조한다.
생체외 분화된 적혈구는 또한 본원에 기술된 원형 RNA 조성물 또는 제제에 대한 담체로서 사용될 수 있다. 예를 들어, WO2015073587호; WO2017123646호; WO2017123644호; WO2018102740호; WO2016183482호; WO2015153102호; WO2018151829호; WO2018009838호; 문헌[Shi et al. 2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136]; 미국 특허 제9,644,180호; 문헌[Huang et al. 2017. Nature Communications 8: 423]; 문헌[Shi et al. 2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136]을 참조한다.
예를 들어, WO2018208728호에 기술된 바와 같은 푸소좀 조성물도 또한 본원에 기술된 바와 같은 변형된 원형 RNA(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드) 또는 그의 약제학적 조성물을 전달하기 위한 담체로서 사용될 수 있다.
비로좀 및 바이러스-유사 입자(VLP)는 또한, 본원에 기술된 변형된 원형 RNA 조성물 또는 그의 약제학적 조성물을 표적화된 세포에 전달하기 위한 담체로서 사용될 수 있다.
예를 들어, 국제특허공개 WO2011097480호, WO2013070324호, WO2017004526호 또는 WO2020041784호에 기술된 바와 같은 식물 나노베지클(nanovesicle) 및 식물 메신저 팩(PMP)은 또한 본원에 기술된 원형 RNA 또는 그의 약제학적 조성물을 전달하기 위한 담체로서 사용될 수 있다.
생성 방법
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는, 비-천연 발생이며 재조합 기술(하기에 상세히 기술된 방법; 예를 들어, DNA 플라스미드를 사용하여 시험관내에서 유래) 또는 화학적 합성을 사용하여 생성될 수 있는 데옥시리보핵산 서열을 포함한다.
RNA 서클을 생성하는 데 사용되는 DNA 분자가 원래의 천연-발생 핵산 서열의 DNA 서열, 그의 변형된 버전 또는 자연에서 정상적으로 관찰되지 않는 합성 폴리펩티드(예를 들어, 키메라 분자 또는 융합 단백질)를 인코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있는 것이 본 발명의 범주 이내이다. DNA 및 RNA 분자는 고전적인 돌연변이유발 기법 및 재조합 기법, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발, 돌연변이를 유도하기 위한 핵산 분자의 화학적 처리, 핵산 단편의 제한 효소 절단, 핵산 단편의 라이게이션, 핵산 서열의 선택된 영역의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭 및/또는 돌연변이유발, 올리고뉴클레오티드 혼합물의 합성 및 핵산 분자의 혼합물을 "구축"하기 위한 혼합물 군의 라이게이션 및 그의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 기법을 사용하여 변형될 수 있다.
변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 화학적 합성 및 효소적 합성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 이용 가능한 기법에 따라 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 선형의 일차 구축물 또는 선형 mRNA를 환화시키거나 콘카테머화시켜, 본원에 기술된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 생성할 수 있다. 환화 또는 콘카테머화의 메커니즘은 방법, 예컨대 비제한적으로 화학적, 효소적, 스플린트 라이게이션) 또는 리보자임 촉매작용된 방법을 통해 발생할 수 있다. 새로 형성된 5'-/3'-링키지는 분자내 링키지 또는 분자간 링키지일 수 있다.
본원에 기술된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제조 방법은 예를 들어, 문헌[Khudyakov & Fields, Artificial DNA: Methods and Applications, CRC Press (2002)]; 문헌[Zhao, Synthetic Biology: Tools and Applications, (First Edition), Academic Press (2013)]; 및 문헌[Egli & Herdewijn, Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids, (First Edition), Wiley-VCH (2012)]에 기술되어 있다.
다양한 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 합성 방법은 또한, 해당 분야에 기술되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제US6210931호, 미국 특허 제US5773244호, 미국 특허 제US5766903호, 미국 특허 제US5712128호, 미국 특허 제US5426180호, 미국 공개 제US20100137407호, 국제 공개 제WO1992001813호 및 국제 공개 제WO2010084371호 참조; 이의 각 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성 후에 정화하여, 생성 불순물, 예를 들어, 유리 리보핵산, 선형 또는 닉킹된 RNA, DNA, 단백질 등을 제거할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 해당 분야에서 흔히 사용되는 임의의 알려져 있는 방법에 의해 정제할 수 있다. 비제한적인 정제 방법의 예는 컬럼 크로마토그래피, 겔 절개, 크기 배제 등을 포함한다.
발현 방법
본 발명은 본원에 제공된 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 적어도 하나의 영역을 번역하는 단계를 포함하는 단백질 발현 방법을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질 발현 방법은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 총 길이의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의, 폴리펩티드로의 번역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현 방법은 적어도 5개 아미노산, 적어도 10개 아미노산, 적어도 15개 아미노산, 적어도 20개 아미노산, 적어도 50개 아미노산, 적어도 100개 아미노산, 적어도 150개 아미노산, 적어도 200개 아미노산, 적어도 250개 아미노산, 적어도 300개 아미노산, 적어도 400개 아미노산, 적어도 500개 아미노산, 적어도 600개 아미노산, 적어도 700개 아미노산, 적어도 800개 아미노산, 적어도 900개 아미노산 또는 적어도 1000개 아미노산의 폴리펩티드로의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 번역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현 방법은 약 5개 아미노산, 약 10개 아미노산, 약 15개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 150개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 250개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 500개 아미노산, 약 600개 아미노산, 약 700개 아미노산, 약 800개 아미노산, 약 900개 아미노산 또는 약 1000개 아미노산의 폴리펩티드로의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 번역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 본원에 제공된 바와 같은 연속 폴리펩티드, 본원에 제공된 바와 같은 불연속 폴리펩티드 또는 둘 모두로의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 번역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 적어도 하나의 영역의 번역은 시험관내, 예컨대 토끼 망상적혈구 용해물에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 적어도 하나의 영역의 번역은 생체내에서, 예를 들어, 진핵 세포의 트랜스펙션 또는 원핵 세포, 예컨대 박테리아의 형질전환 후에 일어난다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 대상체의 세포에 투여하는 단계로서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 하나 이상의 발현 서열을 포함하는, 단계; 및 세포 내에서 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)로부터 하나 이상의 발현 서열을 발현하는 단계를 포함하는, 대상체 내의 하나 이상의 발현 서열의 생체내 발현 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 나중의 시점에서의 세포 내의 하나 이상의 발현 서열의 발현이 조기의 시점과 동일하거나, 그보다 더 크도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 적어도 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일, 20일, 22일, 23일 또는 그 초과의 기간에 걸친 세포 내의 하나 이상의 발현 서열의 발현이 약 40%를 초과하여 감소하지 않도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 적어도 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일, 20일, 22일, 23일 또는 그 초과 동안 세포 내의 하나 이상의 발현 서열의 발현이 약 40%를 초과하여 달라지지 않는 수준으로 유지되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 투여는 본원에 기술된 임의의 운반 방법을 사용하여 행한다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 정맥내 주사를 통해 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 투여는 산전 투여, 신생아 투여, 출생후 투여, 경구, 주사에 의한 것(예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피내, 피하 및 근육내), 안과 투여에 의한 것 및 비강내 투여에 의한 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 단백질 발현 방법은 번역 생성물의 변형, 폴딩 또는 다른 번역후 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현 방법은 생체내의, 예를 들어, 세포 기구를 통한 번역후 변형을 포함한다.
넘버링된 실시형태
[1] 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제 및 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및 제1 부분을 포함하며, 제1 부분이 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개 또는 1000개의 인접 미변형 뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물.
[2] 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제 및 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및 제1 부분을 포함하며, 제1 부분이 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개 또는 1000개의 인접 뉴클레오티드를 포함하며, 제1 부분이 5’-메틸시티딘 또는 슈도우리딘을 결여한 약제학적 조성물.
[3] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 더 낮은 면역원성을 갖는, 넘버링된 실시형태 [1] 또는 [2]의 약제학적 조성물.
[4] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 높은 반감기를 갖는, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[5] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 더 높은 반감기를 갖는, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[6] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 RIG-I, TLR-3, TLR-7, TLR-8, MDA-5, LGP-2, OAS, OASL, PKR, 및 IFN-베타 중 적어도 하나의 발현 또는 신호전달 또는 활성화에 의해 평가시, 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 낮은 면역원성을 갖는, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [5] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[7] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 더 높은 반감기를 갖는, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[8] 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 N(6)메틸아데노신(m6A), 5’-메틸시티딘 및 슈도우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[9] 적어도 하나의 변형된 핵산이 2’-O-메틸, 2’-O-메톡시에틸(2’-O-MOE), 2’-O-아미노프로필, 2’-데옥시, T-데옥시-2’-플루오로, 2’-O-아미노프로필(2’-O-AP), 2’-O-디메틸아미노에틸(2’-O-DMAOE), 2’-O-디메틸아미노프로필(2’-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2’-O-DMAEOE), 2’-O-N-메틸아세트아미도(2’-O-NMA), 잠금 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩티드 핵산(PNA), 1’,5’-언하이드로헥시톨 핵산(HNA), 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드 및 2’-플루오로 N3-P5’-포스포르아미디트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[10] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 변형 뉴클레오티드인, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[11] 원형 폴리리보뉴클레오티드가 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 단백질, DNA, RNA, 또는 세포 표적에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [10] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[12] 제1 부분이 결합 부위를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [11]의 약제학적 조성물.
[13] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 IRES를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [12] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[14] 제1 부분이 IRES를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[15] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 하나 이상의 발현 서열을 포함하는, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [14] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[16] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 하나 이상의 발현 서열 및 IRES를 포함하며, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 IRES의 외측에 5-메틸시티딘, 슈도우리딘 또는 그의 조합을 포함하는, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [15] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[17] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열이 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물에 비해 보다 높은 번역 효율을 갖는, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [16] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[18] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열이 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물보다 적어도 약 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배 높은 번역 효율을 갖는, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [17] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[19] 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물이 제1 부분의 외측에 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및 제1 부분에 5% 초과의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [17] 또는 [18]의 약제학적 조성물.
[20] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열이 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비해 보다 높은 번역 효율을 갖는, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [19] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[21] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열이 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배 높은 번역 효율을 갖는, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [20] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[22] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열이 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 갖는 대응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 더 높은 번역 효율을 갖는, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [21] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[23] 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열이 10% 초과의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 갖는 대응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 높은 번역 효율을 갖는, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [22] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[24] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열이 변형 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 갖는 대응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 높은 번역 효율을 갖는, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [23] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[25] 번역 효율이 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 대응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 세포에서 또는 시험관내 번역 시스템(예를 들어, 토끼 망상적혈구 용해물)에서 측정되는, 넘버링된 실시형태 [17] 내지 [23] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[26] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 회전 번역에 적격성인, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [25] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[27] 하나 이상의 발현 서열의 각각은 원형 폴리리보뉴클레오티드 상의 스태거 요소에 의해 후속 발현 서열로부터 분리되며, 하나 이상의 발현 서열의 회전환 번역은 적어도 2개의 폴리펩티드 분자를 생성하는, 넘버링된 실시형태 [15] 내지 [26] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[28] 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제가 에탄올인, 넘버링된 실시형태 [1] 내지 [27] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[29] 스태거 요소가 (a) 단일의 발현 서열의 2 라운드의 번역으로부터의 또는 (b) 둘 이상의 발현 서열의 1 라운드 이상의 번역으로부터의 단일 폴리펩티드의 생성을 방지하는, 넘버링된 실시형태 [27]의 약제학적 조성물.
[30] 스태거 요소가 하나 이상의 발현 서열로부터 분리된 서열인, 넘버링된 실시형태 [27] 또는 [29]의 약제학적 조성물.
[31] 스태거 요소가 하나 이상의 발현 서열 중 하나의 발현 서열의 일부를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [27] 또는 [29]의 약제학적 조성물.
[32] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 회전환 번역에 적격성이며, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 회전환 번역 동안 생성되는 총 폴리펩티드의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%(몰/몰)가 불연속 폴리펩티드이도록 구성되며, 불연속 폴리펩티드의 각각은 하나 이상의 발현 서열의 단일 라운드의 번역 또는 단일 라운드 미만의 번역으로부터 생성되는, 넘버링된 실시형태 1 내지 24 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[33] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 회전환 번역 동안 생성되는 총 폴리펩티드의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%(몰/몰)가 불연속 폴리펩티드이도록 구성되며, 총 폴리펩티드에 비한 불연속 생성물의 양의 비는 시험관내 번역 시스템에서 시험되는, 넘버링된 실시형태 [32]의 약제학적 조성물.
[34] 시험관내 번역 시스템은 토끼 망상적혈구 용해물을 포함하는, 넘버링된 실시형태 [33]의 약제학적 조성물.
[35] 스태거 요소가 하나 이상의 발현 서열 중 적어도 하나의 3' 말단에 존재하며, 스태거 요소는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 회전환 번역 동안 리보솜을 고착시키도록 구성되는, 넘버링된 실시형태 [27] 내지 [34] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[36] 스태거 요소가 2A 서열 및 2A-유사 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드 서열을 인코딩하는, 넘버링된 실시형태 [27] 내지 [35] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[37] 스태거 요소가 GP인 C-말단 서열을 갖는 서열을 인코딩하는, 넘버링된 실시형태 [27] 내지 [36] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[38] 스태거 요소가 D(V/I)ExNPGP인 C-말단 공통 서열을 갖는 서열을 인코딩하며, x는 임의의 아미노산인, 넘버링된 실시형태 [27] 내지 [37] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[39] 스태거 요소가 GDVESNPGP, GDIEENPGP, VEPNPGP, IETNPGP, GDIESNPGP, GDVELNPGP, GDIETNPGP, GDVENPGP, GDVEENPGP, GDVEQNPGP, IESNPGP, GDIELNPGP, HDIETNPGP, HDVETNPGP, HDVEMNPGP, GDMESNPGP, GDVETNPGP, GDIEQNPGP 및 DSEFNPGP로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 인코딩하는, 넘버링된 실시형태 [27] 내지 [38] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[40] 스태거 요소가 하나 이상의 발현 서열 각각의 3' 말단에 존재하는, 넘버링된 실시형태 [27] 내지 [39] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[41] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열의 스태거 요소는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열에 후속하는 발현 서열의 제1 번역 개시 서열의 업스트림(그에 대해 5')에 존재하며, 스태거 요소와 제1 번역 개시 서열 사이의 거리는 제1 발현 서열과 후속 발현 서열의 연속 번역을 가능하게 하는, 넘버링된 실시형태 [27] 내지 [40] 중 어느 한 단락의 약제학적 조성물.
[42] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열의 스태거 요소는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현에 후속하는 발현 서열의 제1 번역 개시 서열의 업스트림(그에 대해 5')에 존재하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 연속 번역되며, 상응하는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제2 발현 서열의 제2 번역 개시 서열의 업스트림에 제2 스태거 요소를 포함하는 변형된 상응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 연속 번역되지 않으며, 상응하는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제2 스태거 요소는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 스태거 요소와 제1 번역 개시 사이의 거리보다 제2 번역 개시 서열로부터, 예를 들어 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 더 먼 거리에 존재하는, 넘버링된 실시형태 [27] 내지 [40] 중 어느 한 단락의 약제학적 조성물.
[43] 스태거 요소와 제1 번역 개시 사이의 거리는 적어도 2개 뉴클레오티드, 3개 뉴클레오티드, 4개 뉴클레오티드, 5개 뉴클레오티드, 6개 뉴클레오티드, 7개 뉴클레오티드, 8개 뉴클레오티드, 9개 뉴클레오티드, 10개 뉴클레오티드, 11개 뉴클레오티드, 12개 뉴클레오티드, 13개 뉴클레오티드, 14개 뉴클레오티드, 15개 뉴클레오티드, 16개 뉴클레오티드, 17개 뉴클레오티드, 18개 뉴클레오티드, 19개 뉴클레오티드, 20개 뉴클레오티드, 25개 뉴클레오티드, 30개 뉴클레오티드, 35개 뉴클레오티드, 40개 뉴클레오티드, 45개 뉴클레오티드, 50개 뉴클레오티드, 55개 뉴클레오티드, 60개 뉴클레오티드, 65개 뉴클레오티드, 70개 뉴클레오티드, 75개 뉴클레오티드 또는 그 초과인, 넘버링된 실시형태 [41] 또는 [42]의 약제학적 조성물.
[44] 스태거 요소와 제2 번역 개시 사이의 거리는 제1 스태거 요소와 제1 번역 개시 사이의 거리보다 적어도 2개 뉴클레오티드, 3개 뉴클레오티드, 4개 뉴클레오티드, 5개 뉴클레오티드, 6개 뉴클레오티드, 7개 뉴클레오티드, 8개 뉴클레오티드, 9개 뉴클레오티드, 10개 뉴클레오티드, 11개 뉴클레오티드, 12개 뉴클레오티드, 13개 뉴클레오티드, 14개 뉴클레오티드, 15개 뉴클레오티드, 16개 뉴클레오티드, 17개 뉴클레오티드, 18개 뉴클레오티드, 19개 뉴클레오티드, 20개 뉴클레오티드, 25개 뉴클레오티드, 30개 뉴클레오티드, 35개 뉴클레오티드, 40개 뉴클레오티드, 45개 뉴클레오티드, 50개 뉴클레오티드, 55개 뉴클레오티드, 60개 뉴클레오티드, 65개 뉴클레오티드, 70개 뉴클레오티드, 75개 뉴클레오티드 또는 그를 초과하여 더 먼, 넘버링된 실시형태 [41] 또는 [42]의 약제학적 조성물.
[45] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 상의 제1 발현 서열에 후속하는 발현 서열은 제1 발현 서열 이외의 발현 서열인, 넘버링된 실시형태 [41] 내지 [43] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[46] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 상의 제1 발현 서열의 후속 발현 서열은 제1 발현 서열인, 넘버링된 실시형태 [41] 내지 [43] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[47] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 구조적 요소를 포함하는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물:
a) 엔크립토겐;
b) 스태거 요소;
c) 조절 요소;
d) 복제 요소; 및
f) 준-이중-가닥 이차 구조.
[48] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 기능적 특징을 포함하는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물:
a) 선형 대응물보다 더 큰 번역 효율;
b) 다수의 번역 생성물의 화학량론적 번역 효율;
c) 엔크립토겐을 결여한 대응물보다 더 적은 면역원성;
d) 선형 대응물에 비하여 증가된 반감기; 및
e) 세포 분열 동안의 지속성.
[49] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 선형 대응물보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배 또는 적어도 100배 더 큰 번역 효율을 갖는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[50] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 선형 대응물보다 적어도 5배 더 큰 번역 효율을 갖는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[51] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 하기 중 적어도 하나를 결여하는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물:
a) 5'-UTR;
b) 3'-UTR;
c) 폴리-A 서열;
d) 5'-캡;
e) 종결 요소;
f) 엑소뉴클레아제에 의한 분해 감수성; 및
g) 캡-결합 단백질로의 결합.
[52] 하나 이상의 발현 서열은 코작 개시 서열을 포함하는, 넘버링된 실시형태 [26] 내지 [51] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[53] 준-나선 구조는 적어도 하나의 비-이중-가닥 세그먼트를 갖는 적어도 하나의 이중-가닥 RNA 세그먼트를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [47] 내지 [52] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[54] 준-나선 구조는 반복 서열, 예를 들어, A-풍부 서열과 연결된 제1 서열 및 제2 서열을 포함하는, 넘버링된 실시형태 [53]의 약제학적 조성물.
[55] 엔크립토겐은 스플라이싱 요소를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [47] 내지 [54] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[56] 엔크립토겐은 단백질 결합 부위, 예를 들어, 리보뉴클레오티드 결합 단백질을 포함하는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[57] 엔크립토겐은 예를 들어, 면역 반응, 예를 들어, CTL 반응을 회피하기 위해 면역단백질 결합 부위를 포함하는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[58] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, RIG-I, TLR-3, TLR-7, TLR-8, MDA-5, LGP-2, OAS, OASL, PKR, 및 IFN-베타 중 적어도 하나의 발현 또는 신호전달 또는 활성화에 의해 평가시 엔크립토겐을 결여한 대응물보다 적어도 2배 더 적은 면역원성을 갖는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[59] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 리보스위치를 추가로 포함하는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[60] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 압타자임을 추가로 포함하는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[61] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 비-정규 번역 개시 서열, 예를 들어, GUG, CUG 출발 코돈, 예를 들어, 스트레스 조건 하에서 발현을 개시하는 번역 개시 서열을 포함하는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[62] 하나 이상의 발현 서열은 펩티드를 인코딩하는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[63] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 조절 핵산, 예를 들어, 비-코딩 RNA를 포함하는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[64] 원형 폴리리보뉴클레오티드는 약 20개 염기 내지 약 20 kb 범위의 크기를 갖는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[65] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 선형 폴리리보뉴클레오티드의 원형화를 통해 합성되는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[66] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 복수의 발현 서열을 포함하는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[67] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 분해, 예를 들어, 엑소뉴클레아제에 대해 실질적으로 저항성인, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[68] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 하기를 포함하는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물:
a.변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로서:
b.제1 표적, 예를 들어, RNA, DNA, 단백질, 세포의 막 등의 제1 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제1 결합 부위로서, 제1 결합 모이어티가 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드(circRNA)-결합 모티프인 제1 결합 부위; 및
c.제2 표적의 제2 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제2 결합 부위로서, 제2 결합 모이어티가 제2 circRNA-결합 모티프인 제2 결합 부위를 포함하는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며,
d.제1 결합 모이어티가 제2 결합 모이어티와 상이하며,
e.제1 표적, 제2 표적 및 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 복합체를 형성하며,
f.제1 표적 또는 제2 표적이 마이크로RNA가 아닌, 약제학적 조성물.
[69] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 하기를 포함하는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물:
a.변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로서:
제1 표적의 제1 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제1 결합 부위로서, 제1 결합 모이어티가 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드(circRNA)-결합 모티프인 제1 결합 부위; 및
제2 표적의 제2 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제2 결합 부위로서, 제2 결합 모이어티가 제2 circRNA-결합 모티프인 제2 결합 부위를 포함하는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며,
b.제1 결합 모이어티가 제2 결합 모이어티와 상이하며,
c.제1 표적 및 제2 표적이 둘 모두 마이크로RNA인 약제학적 조성물.
[70] 제1 및 제2 표적이 서로 상호작용하는, 넘버링된 실시형태 [68] 또는 [69]의 약제학적 조성물.
[71] 복합체가 세포 과정을 조절하는, 넘버링된 실시형태 [68] 내지 [70] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[72] 제1 및 제2 표적이 동일하며, 제1 및 제2 결합 부위가 상이한 모이어티에 결합하는, 넘버링된 실시형태 [68] 내지 [71] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[73] 제1 및 제2 표적이 상이한, 넘버링된 실시형태 [68] 내지 [72] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[74] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 제3 이상의 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 하나 이상의 추가의 결합 부위를 추가로 포함하는, 넘버링된 실시형태 [68] 내지 [73] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[75] 하나 이상의 표적이 동일하며, 하나 이상의 결합 부위가 상이한 모이어티에 결합하도록 구성되는, 넘버링된 실시형태 [68] 내지 [74] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[76] 복합체의 형성이 세포 과정을 조절하는, 넘버링된 실시형태 [68] 내지 [75] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[77] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 제1 및 제2 표적과 접촉되는 경우 제1 또는 제2 표적과 연관된 세포 과정을 조절하는, 넘버링된 실시형태 [68] 내지 [76] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[78] 제1 및 제2 표적이 복합체에서 서로 상호작용하는, 넘버링된 실시형태 [68] 내지 [77] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[79] 세포 과정이 질병 또는 질환의 발병과 연관된, 넘버링된 실시형태 [68] 내지 [78] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[80] 세포 과정이 원형 폴리리보핵산의 번역과 상이한, 넘버링된 실시형태 [71] 내지 [79] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[81] 세포 과정이 질병 또는 질환의 발병과 연관된, 넘버링된 실시형태 [71] 내지 [80] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[82] 제1 표적이 데옥시리보핵산(DNA) 분자를 포함하며, 제2 표적이 단백질을 포함하는, 넘버링된 실시형태 [68] 내지 [81] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[83] 복합체가 DNA 분자의 유도된 전사, DNA 분자의 후성유전학적 리모델링 또는 DNA 분자의 분해를 조절하는, 넘버링된 실시형태 [68] 내지 [82] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[84] 제1 표적이 제1 단백질을 포함하며, 제2 표적이 제2 단백질을 포함하는, 넘버링된 실시형태 [68] 내지 [83] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[85] 복합체가 제1 단백질의 분해, 제1 단백질의 전좌 또는 신호 전달을 조절하거나, 고유 단백질 기능을 조절하거나, 제1 및 제2 단백질 간의 직접적인 상호작용에 의해 형성되는 복합체의 형성을 저해하는, 넘버링된 실시형태 [68] 내지 [84] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[86] 제1 표적이 제1 리보핵산(RNA) 분자를 포함하며, 제2 표적이 제2 RNA 분자를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [68] 내지 [85] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[87] 복합체가 제1 RNA 분자의 분해를 조절하는, 넘버링된 실시형태 [86]의 약제학적 조성물.
[88] 제1 표적이 단백질을 포함하며, 제2 표적이 RNA 분자를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [68] 내지 [87] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[89] 복합체가 단백질의 전좌를 조절하거나, 단백질과 RNA 분자 사이의 직접적인 상호작용에 의해 형성되는 복합체의 형성을 저해하는, 넘버링된 실시형태 [68] 내지 [88] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[90] 제1 결합 모이어티가 수용체를 포함하며, 제2 결합 모이어티가 수용체의 기질을 포함하는, 넘버링된 실시형태 [68] 내지 [89] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[91] 복합체가 수용체의 활성화를 저해하는, 넘버링된 실시형태 [68] 내지 [90] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[92] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 표적의 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함하며, 결합 모이어티가 리보핵산(RNA)-결합 모티프이며, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 번역 부적격이거나, 번역 결함이 있으며, 표적이 마이크로RNA가 아닌, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[93] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 표적의 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함하며, 결합 모이어티가 리보핵산(RNA)-결합 모티프이며, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 번역 부적격이거나, 번역 결함이 있으며, 표적이 마이크로RNA인, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[94] 표적이 DNA 분자를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [92] 또는 [93]의 약제학적 조성물.
[95] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로의 결합 모이어티의 결합이 DNA 분자의 전사의 간섭을 조절하는, 넘버링된 실시형태 [92] 내지 [94] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[96] 표적이 단백질을 포함하는, 넘버링된 실시형태 [92] 내지 [95] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[97] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로의 결합 모이어티의 결합이 단백질과 다른 분자의 상호작용을 저해하는, 넘버링된 실시형태 [96]의 약제학적 조성물.
[98] 단백질이 수용체이며, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로의 제1 결합 모이어티의 결합이 수용체를 활성화시키는, 넘버링된 실시형태 [96] 또는 [97]의 약제학적 조성물.
[99] 단백질이 제1 효소이며, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 제2 효소에 결합하도록 구성된 제2 결합 부위를 추가로 포함하며, 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로의 제1 및 제2 효소의 결합이 제1 및 제2 효소의 효소 활성을 조절하는, 넘버링된 실시형태 [96] 내지 [98] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[100] 표적이 메신저 RNA(mRNA) 분자를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [92] 내지 [99] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[101] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로의 결합 모이어티의 결합이 mRNA 분자의 번역의 간섭을 조절하는, 넘버링된 실시형태 [100]의 약제학적 조성물.
[102] 표적이 리보솜을 포함하는, 넘버링된 실시형태 [92] 내지 [101] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[103] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로의 결합 모이어티의 결합이 번역 과정의 간섭을 조절하는, 넘버링된 실시형태 [102]의 약제학적 조성물.
[104] 표적이 원형 RNA 분자를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [92] 내지 [103] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[105] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로의 결합 모이어티의 결합이 원형 RNA 분자를 격리하는, 넘버링된 실시형태 [104]의 약제학적 조성물.
[106] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로의 결합 모이어티의 결합이 마이크로RNA 분자를 격리하는, 넘버링된 실시형태 [92] 내지 [105] 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[107] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 세포 표적의 막 상의 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함하며; 결합 모이어티가 리보핵산(RNA)-결합 모티프인, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[108] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 제2 세포 표적 상의 제2 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제2 결합 부위를 추가로 포함하며, 제2 결합 모이어티가 제2 RNA-결합 모티프인, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[109] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 두 표적 모두에 결합하도록 구성된, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[110] 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 제2 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제2 결합 부위를 추가로 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드로의 두 표적 모두의 결합이 제1 표적에서 입체형태적 변화를 유도함으로써, 표적의 하류에서 신호 전달을 유도하는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[111] 담체, 예를 들어, 막 또는 지질 이중층에서 제형화되는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
[112]전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체로의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전달 방법.
[113]하기를 포함하는 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 면역원성의 감소 또는 저하 방법:
하이브리드 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 상기 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드 및 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함하는, 단계;
하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에 투여하는 단계; 및
대상체의 세포 또는 조직 내의 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 감소되거나 증가된 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 면역원성을 획득하는 단계.
[114] 대상체에서의 하나 이상의 발현 서열을 발현시키는 방법으로서:
하나 이상의 발현 서열을 포함하는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 상기 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드 및 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함하는, 단계;
하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에 투여하는 단계; 및
대상체의 세포 또는 조직 내의 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 하나 이상의 발현 서열의 발현에 비하여 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현을 획득하는 단계를 포함하는, 방법.
[115]하기를 포함하는 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성의 증가 방법:
하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 상기 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 및 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함하는, 단계;
하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에 투여하는 단계; 및
대상체의 세포 또는 조직 내의 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 증가된 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 안정성을 획득하는 단계.
[116] 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 조성물의 약제학적 조성물을 질병 또는 질환을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
[117] 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 조성물의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함하는 약제학적 조성물의 생성 방법.
[118] 핵산 서열을 갖는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드로서 원형화시키는 단계를 포함하는, 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제조 방법.
[119] 미변형 제1 부분을 변형된 선형 폴리리보뉴클레오티드에 라이게이션시켜 하이브리드 선형 폴리리보뉴클레오티드를 생성하는 단계 및 하이브리드 선형 폴리리보뉴클레오티드를 원형화시키는 단계를 포함하는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제조 방법.
[120] 전술한 넘버링된 실시형태들 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 조작된 세포.
[121] 하기를 포함하는 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 면역원성의 감소 또는 저하 방법:
하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 상기 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드 및 5%이하의 변형 뉴클레오티드를 갖는 약 5개 내지 1000개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함하는, 단계;
하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에 투여하는 단계; 및
대상체의 세포 또는 조직 내의 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 감소되거나 증가된 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 면역원성을 획득하는 단계.
[122] 제1 부분은 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [121]의 방법.
[123] 제1 부분이 미변형 뉴클레오티드로 이루어진, 넘버링된 실시형태 [121] 또는 [122]의 방법.
[124] 제1 부분은 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [121] 내지 [123] 중 어느 하나의 방법.
[125] 제1 부분이 5’-메틸시티딘 또는 슈도우리딘을 결여한, 넘버링된 실시형태 [121] 내지 [124] 중 어느 하나의 방법.
[126] 원형 폴리리보뉴클레오티드가 회전 번역에 적격성인, 넘버링된 실시형태 [121] 내지 [125] 중 어느 하나의 방법.
[127] 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하기 특성을 갖는, 넘버링된 실시형태 [121] 내지 [126] 중 어느 하나의 방법:
a. 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배 높은 발현을 가짐;
b. 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 높은 반감기를 가짐;
c. 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비해 큰 반감기를 가짐; 또는
d. RIG-I, TLR-3, TLR-7, TLR-8, MDA-5, LGP-2, OAS, OASL, PKR, 및 IFN-베타 중 적어도 하나의 발현 또는 신호전달 또는 활성화에 의해 평가시, 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 낮은 면역원성을 가짐.
[128] 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 넘버링된 실시형태 [121] 내지 [127] 중 어느 하나의 방법:
a. N(6)메틸아데노신(m6A), 5’-메틸시티딘 및 슈도우리딘;
b. 2’-O-메틸, 2’-O-메톡시에틸(2’-O-MOE), 2’-O-아미노프로필, 2’-데옥시, T-데옥시-2’-플루오로, 2’-O-아미노프로필(2’-O-AP), 2’-O-디메틸아미노에틸(2’-O-DMAOE), 2’-O-디메틸아미노프로필(2’-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2’-O-DMAEOE), 2’-O-N-메틸아세트아미도(2’-O-NMA), 잠금 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩티드 핵산(PNA), 1’,5’-언하이드로헥시톨 핵산(HNA), 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드 및 2’-플루오로 N3-P5’-포스포르아미디트; 또는
c. 표 2의 임의의 변형된 뉴클레오티드.
[129] 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%가 변형 뉴클레오티드인, 넘버링된 실시형태 [121] 내지 [128] 중 어느 하나의 방법.
[130] 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 단백질, 펩티드, 생체분자, DNA, RNA, 또는 세포 표적에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [121] 내지 [129] 중 어느 하나의 방법.
[131] 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 하나 이상의 발현 서열을 포함하는, 넘버링된 실시형태 [121] 내지 [130] 중 어느 하나의 방법.
[132] 제1 부분이 미변형 뉴클레오티드 또는 5% 이하의 변형된 뉴클레오티드로 이루어진 IRES를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [121] 내지 [131] 중 어느 하나의 방법.
[133] 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열이 하기를 갖는, 넘버링된 실시형태 [131] 또는 [132]의 방법:
a. 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물보다 더 높은 번역 효율;
b. 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물보다 적어도 약 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배 높은 번역 효율을 가짐;
c. 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비해 큰 번역 효율을 가짐; 또는
d. 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배 높은 번역 효율을 가짐.
[134] 대상체에서의 하나 이상의 발현 서열을 발현시키는 방법으로서:
하나 이상의 발현 서열을 포함하는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 상기 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드 및 5%이하의 변형 뉴클레오티드를 갖는 약 5개 내지 1000개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함하는, 단계;
하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에 투여하는 단계; 및
대상체의 세포 또는 조직 내의 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 대응하는 하나 이상의 발현 서열의 발현에 비하여 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현을 획득하는 단계를 포함하는, 방법.
[135] 하기를 포함하는 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성의 증가 방법:
하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 상기 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드 및 5%이하의 변형 뉴클레오티드를 갖는 약 5개 내지 1000개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함하는, 단계;
하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에 투여하는 단계; 및
대상체의 세포 또는 조직 내의 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 증가된 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 안정성을 획득하는 단계.
[136] 제1 부분이 IRES를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [134] 또는 [135]의 방법.
[137] 제1 부분이 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [134] 내지 [136] 중 어느 하나의 방법.
[138] 제1 부분이 미변형 뉴클레오티드로 이루어진, 넘버링된 실시형태 [134] 내지 [137] 중 어느 하나의 방법.
[139] 제1 부분이 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [134] 내지 [138] 중 어느 하나의 방법.
[140] 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 하나 이상의 발현 서열을 포함하는, 넘버링된 실시형태 [134] 내지 [139] 중 어느 하나의 방법.
[141] 원형 폴리리보뉴클레오티드가 회전 번역에 적격성인, 넘버링된 실시형태 [134] 내지 [140] 중 어느 하나의 방법.
[142] 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 넘버링된 실시형태 [134] 내지 [141] 중 어느 하나의 방법:
a. N(6)메틸아데노신(m6A), 5’-메틸시티딘 및 슈도우리딘;
b. 2’-O-메틸, 2’-O-메톡시에틸(2’-O-MOE), 2’-O-아미노프로필, 2’-데옥시, T-데옥시-2’-플루오로, 2’-O-아미노프로필(2’-O-AP), 2’-O-디메틸아미노에틸(2’-O-DMAOE), 2’-O-디메틸아미노프로필(2’-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2’-O-DMAEOE), 2’-O-N-메틸아세트아미도(2’-O-NMA), 잠금 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩티드 핵산(PNA), 1’,5’-언하이드로헥시톨 핵산(HNA), 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드 및 2’-플루오로 N3-P5’-포스포르아미디트; 또는
c. 표 2의 임의의 변형된 뉴클레오티드.
[143] 제1 부분이 미변형 뉴클레오티드 또는 5% 이하의 변형된 뉴클레오티드로 이루어진 IRES를 포함하는, 넘버링된 실시형태 [134] 내지 [142] 중 어느 하나의 방법.
본원에 열거된 모든 참고문헌 및 간행물은 본원에 참조로 포함된다.
상기 기술된 실시형태를 조합하여, 상기 언급된 기능적 특징을 달성할 수 있다. 이는 또한, 예시적인 조합 및 달성되는 기능적 특징이 제시된 하기의 실시예에 의해 예시된다. 표 7은 상기 기술된 상이한 요소가 조합될 수 있는 방법 및 관찰된 기능적 특징을 보여주는 예시적인 개요를 제공한다.
[표 7] 실시예에서의 예시적인 요소
Figure pct00007
Figure pct00008
실시예
하기의 실시예는 본 발명의 일부 실시형태를 추가로 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아니며; 당업자에게 알려져 있는 다른 절차, 방법 또는 기법이 대안적으로 사용될 수 있다는 것이 그들의 예시적인 성질에 의해 이해될 것이다. 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0376] 내지 [0392], [0400] 내지 [0415], [0433] 내지 [0440], 및 [0620] 내지 [0633]에 기술된 바와 같은 실시예 5, 6, 9, 14, 15, 및 50 내지 52, 그리고 그들의 상응하는 도면은 그들 전체가 본원에 참조로 포함된다.
실시예 1: 변형된 뉴클레오티드를 갖는 원형 RNA가 생성되고, 번역되고, 원형 RNA의 면역원성이 감소되었다
이 실시예는 단백질 생성물을 생성하는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성을 보여준다. 또한, 본 실시예는 뉴클레오티드 변형을 갖는 조작된 원형 RNA가 선형 RNA에 비하여 감소된 면역원성을 가졌음을 보여준다.
하나 이상의 바람직한 특성을 포함하도록 조작되며 변형된 뉴클레오티드가 완전히 또는 부분적으로 혼입된 비-천연 발생 원형 RNA를 생성하였다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 전장 변형된 선형 RNA, 또는 변형 및 미변형된 선형 RNA의 하이브리드를 원형화시키고, 나노루시퍼라제(NLuc)의 발현을 평가하였다. 또한, 변형된 원형 RNA는 비-변형된 원형 RNA에 비하여, BJ 세포에서 면역 관련 유전자(MDA5, OAS 및 IFN-베타 발현의 q-PCR)의 감소된 활성화를 갖는 것으로 나타났다.
WT EMCV Nluc 정지 스페이서를 갖는 원형 RNA를 생성하였다. 완전한 변형 치환을 위해, 변형된 뉴클레오티드, 슈도우리딘 및 메틸시토신 또는 m6A를 시험관내 전사 반응 동안 각각 표준 미변형 뉴클레오티드, 우리딘 및 시토신 또는 아데노신 대신에 첨가하였다. 하이브리드 구축물을 위해, WT EMCV IRES를 NLuc ORF로부터 개별적으로 합성하였다. WT EMCV IRES를 변형된 또는 비-변형된 뉴클레오티드를 사용하여 합성하였다. 대조적으로, NLuc ORF 서열을 시험관내 전사 반응 동안 각각 표준 미변형 뉴클레오티드, 우리딘 및 시토신 또는 아데노신 대신에, 변형된 뉴클레오티드, 슈도우리딘 및 메틸시토신 또는 m6A를 사용하여 합성하였다. 변형된 또는 미변형된 IRES와 변형된 ORF의 합성 후에, 이들 2가지 올리고뉴클레오티드를 T4 DNA 리가제를 사용하여 함께 라이게이션시켰다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 변형된 원형 RNA를 생성하였다.
완전히 변형되거나 하이브리드 변형된 구축물로부터 NLuc의 발현 효율을 측정하기 위해, 0.1 pmol의 선형 및 원형 RNA를 6시간 동안 BJ 섬유아세포 내로 트랜스펙션시켰다. nLuc 발현을 트랜스펙션 후 6시간째, 24시간째, 48시간째 및 72시간째에 측정하였다.
선천적 면역 반응 유전자의 수준을 페놀-기반의 추출 시약(인비트로겐)을 사용하여 세포로부터 단리된 전체 RNA로부터 세포에서 모니터링하였다. 전체 RNA(500 ng)를 역전사 처리하여, cDNA를 생성하였다. qRT-PCR 분석을 염료-기반의 정량적 PCR 믹스(바이오라드)를 사용하여 수행하였다.
도 1b 및 도 1c에 나타낸 바와 같이, 변형된 원형 RNA를 번역하였다. 도 2a 내지 도 2c에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA로 트랜스펙션된 BJ 세포로부터의 면역 관련 유전자의 qRT-PCR 수준은 미변형된 원형 RNA 트랜스펙션된 세포에 비하여 MDA5, OAS 및 IFN-베타 발현의 감소를 보였다. 따라서, 수여자 세포에서의 면역원성 관련 유전자의 유도는 미변형된 원형 RNA 트랜스펙션된 세포에 비하여 변형된 원형 RNA로 트랜스펙션된 세포에서 감소되었다.
실시예 2: 변형된 뉴클레오티드를 갖는 원형 RNA는 면역원성을 감소시킨다
본 실시예는 단백질 생성물을 생성하는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성을 보여준다. 또한, 본 실시예는 뉴클레오티드 변형을 갖는 조작된 원형 RNA가 미변형 RNA에 비하여 감소된 면역원성을 가졌음을 보여준다.
하나 이상의 바람직한 특성을 포함하도록 조작되며 변형된 뉴클레오티드가 완전히 또는 부분적으로 혼입된 비-천연 발생 원형 RNA를 생성하였다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 전장 변형된 선형 RNA, 또는 변형 및 미변형된 선형 RNA의 하이브리드를 원형화시키고, 나노루시퍼라제(NLuc)의 발현을 평가하였다. 또한, 변형된 원형 RNA는 비-변형된 원형 RNA에 비하여, BJ 세포에서 면역 관련 유전자(MDA5, OAS 및 IFN-베타 발현의 q-PCR)의 감소된 활성화를 갖는 것으로 나타났다.
WT EMCV NLuc 정지 스페이서를 갖는 원형 RNA를 생성하였다. 변형 치환을 위해, 변형된 뉴클레오티드, 슈도우리딘 및 메틸시토신 또는 m6A을 시험관내 전사 반응 동안 각각 표준 미변형 뉴클레오티드, 우리딘 및 시토신 또는 아데노신 대신에 첨가하였다. WT EMCV IRES를 nLuc ORF로부터 개별적으로 합성하였다. WT EMCV IRES를 변형된(완전히 변형된) 또는 비-변형된(하이브리드 변형된) 뉴클레오티드를 사용하여 합성하였다. 대조적으로, nLuc ORF 서열을 시험관내 전사 반응 동안 전체 서열에 대하여 각각 표준 미변형 뉴클레오티드, 우리딘 및 시토신 또는 아데노신 대신에, 변형된 뉴클레오티드, 슈도우리딘 및 메틸시토신 또는 m6A를 사용하여 합성하였다. 변형된 또는 미변형된 IRES와 변형된 ORF의 합성 후에, 이들 2가지 올리고뉴클레오티드를 T4 DNA 리가제를 사용하여 함께 라이게이션시켰다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 하이브리드 변형된 원형 RNA를 생성하였다.
발현 효율을 측정하기 위하여, 하이브리드 변형된 원형 RNA를 세포 내로 트랜스펙션시키고, 면역 단백질의 발현을 측정하였다. 선천 면역 반응 유전자의 발현 수준을 미변형 원형 RNA 또는 슈도우리딘 및 메틸시토딘 또는 m6A 변형을 갖는 하이브리드 변형된 원형 RNA로 트랜스펙션된 BJ 세포에서 모니터링하였다. 전체 RNA를 페놀-기반의 추출 시약(인비트로겐)을 사용하여 세포로부터 단리하였으며, 역전사로 처리하여 cDNA를 생성하였다. 면역 관련 유전자에 대한 qRT-PCR 분석을 염료-기반의 정량적 PCR 믹스(바이오라드)를 사용하여 수행하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 하이브리드 변형된 원형 RNA, 슈도우리딘 및 메틸시토신 하이브리드 변형된 원형 RNA로 트랜스펙션된 BJ 세포 유래의 면역 관련 유전자의 qRT-PCR 수준은 미변형 원형 RNA 트랜스펙션된 세포에 비하여 감소된 수준의 RIG-I, MDA5, IFN-베타 및 OAS 발현을 보였으며, 이는 면역원성 관련 유전자를 활성화시키는 이 하이브리드 변형된 원형 RNA의 감소된 면역원성을 나타낸다. 실시예 26에 나타낸 완전히 변형된 원형 RNA와 달리, m6A 하이브리드 변형된 원형 RNA는 미변형 원형 RNA 트랜스펙션된 세포와 유사한 수준의 RIG-I, MDA5, IFN-베타 및 OAS 발현을 보였다. 따라서, 미변형 원형 RNA에 비한 원형 RNA의 하이브리드 변형 및 변형의 수준은 면역원성 관련 유전자의 활성화에 영향을 가졌다.
실시예 3: 변형된 뉴클레오티드를 갖는 원형 RNA가 생성되었으며, 단백질에 선택적으로 결합하였다
본 실시예는 단백질 결합을 지지하는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성을 보여준다. 또한, 본 실시예는 면역계 감시에 관여하는 단백질과 선택적으로 상호작용하는 뉴클레오티드 변형을 갖는 조작된 원형 RNA가 미변형 RNA에 비하여 감소된 면역원성을 가짐을 보여준다.
변형된 뉴클레오티드의 완전 또는 부분적 혼입이 포함되도록 조작된 비-천연 발생 원형 RNA를 생성하였다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 전장 변형된 선형 RNA, 또는 변형 및 미변형된 선형 RNA의 하이브리드를 원형화시키고, nLuc 발현 측정을 통해 단백질 스캐폴딩을 평가하였다. 또한, 선택적으로 변형된 원형 RNA는 미변형 원형 RNA에 비하여, BJ 세포에서 면역 관련 유전자(MDA5, OAS 및 IFN-베타 발현의 q-PCR)를 활성화시키는 단백질과의 상호작용이 감소되어 있다.
WT EMCV Nluc 정지 스페이서를 갖는 원형 RNA를 생성하였다. 변형 치환을 위해, 변형된 뉴클레오티드, 슈도우리딘 및 메틸시토신 또는 m6A을 시험관내 전사 반응 동안 각각 표준 미변형 뉴클레오티드, 우리딘 및 시토신 또는 아데노신 대신에 첨가하였다. WT EMCV IRES를 nLuc ORF로부터 개별적으로 합성하였다. WT EMCV IRES를 변형된(완전히 변형된) 또는 미변형된(하이브리드 변형된) 뉴클레오티드를 사용하여 합성하였다. 대조적으로, nLuc ORF 서열을 시험관내 전사 반응 동안 전체 서열에 대하여 각각 표준 미변형 뉴클레오티드, 우리딘 및 시토신 또는 아데노신 대신에, 변형된 뉴클레오티드, 슈도우리딘 및 메틸시토신 또는 m6A를 사용하여 합성하였다. 변형된 또는 미변형된 IRES와 변형된 ORF의 합성 후에, 이들 2가지 올리고뉴클레오티드를 T4 DNA 리가제를 사용하여 함께 라이게이션시켰다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 완전히 변형된(상측 구축물) 또는 하이브리드 변형된(하측 구축물) 원형 RNA를 생성하였다.
단백질 스캐폴딩 효율을 측정하기 위하여, 완전히 변형된 또는 하이브리드 변형된 구축물로부터의 nLuc의 발현을 측정하였다. 0.1 pmol의 선형 및 원형 RNA를 6시간 동안 BJ 섬유아세포 내로 트랜스펙션시킨 후에, nLuc 발현을 트랜스펙션 후 6시간째, 24시간째, 48시간째 및 72시간째에 측정하였다.
도 1b 및 도 1c에 나타낸 바와 같이, 완전히 변형된 원형 RNA는 단백질 번역 산출량에 의해 측정하여, 미변형 원형 RNA에 비하여 크게 감소된 단백질 결합 능력을 가졌다. 대조적으로, 하이브리드 변형은 단백질, 예를 들어, 단백질 번역 기구로의 그만큼 큰 또는 증가된 결합을 나타내었다.
단백질 스캐폴딩 효율을 추가로 측정하기 위하여, 완전히 변형된 원형 RNA를 세포로 트랜스펙션시켰으며, 면역 단백질로의 단백질 스캐폴딩을 측정하였다. 선천 면역 반응 유전자를 활성화시키는 면역 단백질로의 단백질 스캐폴딩의 수준을 미변형 원형 RNA 또는 슈도우리딘 및 메틸시토신 또는 m6A 변형을 갖는 완전히 변형된 원형 RNA로 트랜스펙션된 BJ 세포에서 모니터링하였다. 전체 RNA를 페놀-기반의 추출 시약(인비트로겐)을 사용하여 세포로부터 단리하였으며, 역전사로 처리하여 cDNA를 생성하였다. 면역 관련 유전자에 대한 qRT-PCR 분석을 염료-기반의 정량적 PCR 믹스(바이오라드)를 사용하여 수행하였다.
도 1a 내지 도 1c에 나타낸 바와 같이, 완전히 변형된 원형 RNA, 슈도우리딘 및 메틸시토신 둘 모두 또는 m6A 완전히 변형된 원형 RNA로 트랜스펙션된 BJ 세포로부터의 면역 관련 유전자의 qRT-PCR 수준은 미변형 원형 RNA 트랜스펙션된 세포에 비하여 감소된 수준의 MDA5, OAS 및 IFN-베타 발현을 보였으며, 이는 변형된 원형 RNA와 면역원성 관련 유전자를 활성화시키는 면역 단백질 사이의 감소된 단백질 스캐폴딩을 나타낸다. 따라서, 미변형 원형 RNA에 비하여 원형 RNA의 변형은 단백질 스캐폴딩에 영향을 가졌다. 선택적 변형은 단백질 번역 기구의 결합을 가능하게 하는 한편, 완전한 변형은 트랜스펙션된 수여자 세포에서 면역원성 관련 유전자를 활성화시키는 단백질로의 결합을 감소시켰다.
실시예 4: 미변형 IRES를 갖지만, ORF 내에 변형된 뉴클레오티드를 갖는 circRNA는 변형된 IRES 및 ORF 내에 변형된 뉴클레오티드를 갖는 circRNA에 비하여 생체내에서 증가된 번역을 갖는다.
이 실시예에는 circRNA 내에 변형된 뉴클레오티드를 포함하지만, IRES 내에 변형을 포함하지 않는 것이, IRES 내에 변형을 갖는 변형된 circRNA에 비하여, 생체내에서 circRNA 번역을 증가시키는 것이 기술된다.
변형된 뉴클레오티드가 ORF에 포함되도록 circRNA를 생성하기 위하여, 2개의 IVT 주형을 개별적으로 증폭시킨다. 제1 섹션(서열 #1: 1-686nts)은 5’ 스페이서, EMCV IRES 및 GLuc ORF의 38개 뉴클레오티드를 포함한다. 제2 섹션(서열 #2: 687-1203nts)은 GLuc의 남아 있는 ORF 영역 및 3’ 스페이서를 포함한다.
제1 섹션의 RNA를 DNA 주형으로부터 시험관내 전사를 통해 변형된 뉴클레오티드 또는 미변형 뉴클레오티드를 갖는 선형 RNA로서 생성한다. 변형된 제1 섹션을 N1-메틸-슈도우리딘으로 완전히 치환한다. 미변형 제1 섹션을 미변형 뉴클레오티드를 사용하여 생성한다.
제2 섹션을 시험관내 전사를 통해 DNA 주형으로부터 생성하고, N1-메틸-슈도우리딘으로 완전히 치환한다.
각각의 뱃치의 전사된 RNA를 RNA 클린업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), T2050)를 사용하여 개별적으로 정제하고, RppH-처리한다(NEB, M0356). 두번째 정제 후에, 하기의 RNA-RNA 라이게이션 반응을 행한다: (1) 미변형 제1 섹션 + 제2 섹션; (2) 변형된 제1 섹션 + 제2 섹션.
이들 라이게이션을 하기와 같이 DNA 스플린트를 사용하여 수행한다: 2 uM의 선택된 제1 섹션 RNA, 2 uM의 제2 섹션 RNA, 2.56 uM의 스플린트 DNA(5’ -GGCTTGGCCTCGGCCACAGCGATGCAGATC-3’), 50 mM NaCl을 조합한다. 이 혼합물을 75ºC에서 10분 동안 인큐베이션시킨 다음, 37ºC로 천천히 냉각시킨다. 혼합물을 라이게이션을 위하여 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 0.16 U/uL RNase 저해제(프로메가(Promega), N2115) 및 15 U/uL T4 DNA 리가제(NEB, M0202M)의 존재 하에 추가로 4시간 동안 인큐베이션시킨다. 라이게이션된 RNA를 모나크(Monarch) RNA 정제 컬럼(NEB, T2050)을 사용하여 정제한다. 우레아-PAGE 상에서 분리함으로써 RNA-RNA 라이게이션의 효율을 모니터링하고, 이미지를 정량화한다.
라이게이션된 RNA의 원형화를 위하여, 각각의 원형화 혼합물을 독립적으로 1 uM 라이게이션된 RNA, 2 uM 스플린트 DNA(5’- GTTTTTCGGCTATTCCCAATAGCCGTTTTG -3’), 50 mM Tris-HCl, 2 mM MgCl2 및 400 uM ATP를 사용하여 제조한다. 이 혼합물을 75ºC에서 10분 동안 가열하고, 실온에서 20분에 걸쳐 천천히 냉각시킨다. 냉각 후에, 0.2 U/uL의 T4 RNA 리가제 2(NEB, M0239) 및 0.4 U/uL의 RNAse 저해제(프로메가, N2115)를 첨가하고, 반응물을 4시간 동안 인큐베이션시킨다. 라이게이션된 RNA를 에탄올 침전을 사용하여 정제한다. 원형 RNA를 우레아-PAGE 정제하고, 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 1 mM EDTA) 중에 용리시키고, 에탄올 침전하고, RNA 보관 용액(써모피셔 사이언티픽, AM7000) 중에 재현탁화시킨다.
(1) 하이브리드 변형된 circRNA: 미변형 제1 섹션 + 제2 섹션; 및 (2) 완전히 변형된 circRNA: 변형된 제1 섹션 + 제2 섹션을 생성한다.
RNA를 PBS 중 10% TransIT(미루스바이오(MirusBio)) 및 5% 부스트(Boost)(미루스바이오)를 사용하여 제형화시킨다. 총 주입 부피는 각각의 용량에 있어서 100 uL이다. 최종 RNA 농도는 0.1 pmol/uL(10 pmol/마우스)이다. 각각의 용량(100 uL)을 마우스 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사한다. 비-주사된 동물 및 비히클(RNA 부재) 단독 주사된 동물을 대조군으로서 사용한다.
혈액 시료(50 ㎕)를 투여 후 6시간째, 1일째, 2일째, 3일째, 7일째, 14일째, 21일째, 28일째 및 35일째에 각 마우스의 꼬리-정맥으로부터 EDTA 튜브 내로 수집하였다. 혈장을 1300 g, 4℃에서 25분 동안의 원심분리에 의해 단리하고, 가우시아 루시퍼라제, 분비 효소의 활성을 제조처의 설명에 따라 가우시아 루시퍼라제 플래쉬 활성 검정(써모 사이언티픽 피어스)을 사용하여 시험하였다. 요약하여, 50 uL의 1X GLuc 기질을 96 웰 투명 바닥 플레이트의 웰 내의 5 uL의 혈장에 주입하여, GLuc 루시퍼라제 활성 검정을 수행한다. 혼합한 직후에 발광측정 기기(프로메가)에서 플레이트를 판독한다.
하이브리드 변형된 circRNA를 주사한 마우스 유래의 혈액이 완전히 변형된 circ RNA에 비하여, 그리고 대조군에 비하여 더 큰 루시퍼라제 활성을 보이는 것이 예상된다. 이 실시예는 하이브리드 변형된 circRNA가 완전히 변형된 circRNA에 비하여, 그리고 대조군에 비하여 더 많은 양의 가우시아 루시퍼라제를 발현하는 것을 보여준다.
이 실시예는 미변형 IRES를 갖지만, 다른 곳에는 변형된 뉴클레오티드를 갖는 circRNA(하이브리드 변형된 circRNA)가 완전히 변형된 circRNA에 비하여 생체내에서 더 큰 발현을 보이는 것을 보여준다.
실시예 5: 미변형 IRES를 갖지만, ORF 내에 변형된 뉴클레오티드를 갖는 circRNA는 완전히 미변형된 circRNA에 비하여 생체내에서 증가된 RNA 번역을 갖는다
이 실시예는 circRNA 내의 변형된 뉴클레오티드의 포함이 생체내에서 circRNA 발현을 증가시키는 것을 보여준다.
이 실시예에서, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF, 번역 요소로서 EMCV IRES, 및 5’ 및 3’ 스페이서 영역을 갖는 circRNA를 설계하였다.
ORF 내에 변형된 뉴클레오티드를 포함하도록 circRNA를 생성하기 위하여, 2개의 IVT 주형을 개별적으로 증폭시켰다. 제1 섹션(서열 #1: 1-686nts)은 5’ 스페이서, EMCV IRES 및 GLuc ORF의 38개 뉴클레오티드를 포함하였다. 제2 섹션(서열 #2: 687-1203nts)은 GLuc의 남아 있는 ORF 영역 및 3’ 스페이서를 포함하였다. 제1 섹션의 RNA를 DNA 주형으로부터 시험관내 전사를 통해 미변형 뉴클레오티드를 갖는 선형 RNA로서 생성하였다. 제2 섹션을 DNA 주형으로부터 시험관내 전사를 통해 (1) 미변형 뉴클레오티드를 갖는 (2) 슈도-우리딘 및5-메틸-시토신으로 완전히 치환된 (3) N1-메틸-슈도우리딘으로 완전히 치환된 3가지 상이한 조건 하에 생성하였다.
각각의 뱃치의 전사된 RNA를 RNA 클린업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), T2050)를 사용하여 개별적으로 정제하고, RppH-처리하였다(NEB, M0356). 두번째 정제 후에, 각각의 뱃치의 RNA를 RNA-RNA 라이게이션으로 처리하였다. 제1 섹션의 RNA(IRES 함유) 및 각각의 버전의 제2 섹션의 RNA를 DNA 스플린트를 사용하여 어닐링시켰다.
각각의 반응을 하기와 같이 수행하였다: 2 uM의 제1 섹션 RNA, 2 uM의 선택된 제2 섹션 RNA, 2.56 uM의 스플린트 DNA(5’ -GGCTTGGCCTCGGCCACAGCGATGCAGATC-3’), 50 mM NaCl을 조합하였다. 이 혼합물을 75ºC에서 10분 동안 인큐베이션시킨 다음, 37ºC로 천천히 냉각시켰다. 혼합물을 라이게이션을 위해 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 0.16 U/uL RNase 저해제(프로메가, N2115) 및 15 U/uL T4 DNA 리가제(NEB, M0202M)의 존재 하에 4시간 동안 추가로 인큐베이션시켰다. 라이게이션된 RNA를 모나크 RNA 정제 컬럼(NEB, T2050)을 사용하여 정제하였다. 우레아-PAGE 상에서 분리함으로써 RNA-RNA 라이게이션의 효율을 모니터링하고, 이미지를 정량화하였다.
RNA-RNA 라이게이션된 물질은 하기와 같았다:
(1)라이게이션된 RNA Unmod.: 제1 섹션 + 미변형 뉴클레오티드를 갖는 제2 섹션
(2)라이게이션된 RNA pU/5mC: 제1 섹션 + 슈도-우리딘 및 5-메틸-시티딘으로 완전히 치환된 제2 섹션
(3)라이게이션된 RNA N1mΨ: 제1 섹션 + N1-메틸-슈도우리딘으로 완전히 치환된 제2 섹션.
라이게이션된 RNA의 원형화를 위하여, 각각의 원형화 혼합물을 독립적으로 1 uM의 라이게이션된 RNA, 2 uM의 스플린트 DNA(5’- GTTTTTCGGCTATTCCCAATAGCCGTTTTG -3’), 50 mM Tris-HCl, 2 mM MgCl2 및 400 uM ATP를 사용하여 제조하였다. 이 혼합물을 75ºC에서 10분 동안 가열하고, 실온에서 20분에 걸쳐 천천히 냉각시켰다. 냉각 후에, 0.2 U/uL의 T4 RNA 리가제 2(NEB, M0239) 및 0.4 U/uL의 RNAse 저해제(프로메가, N2115)를 첨가했고, 반응물을 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 라이게이션된 RNA를 에탄올 침전을 사용하여 정제하였다. 원형 RNA를 우레아-PAGE 정제하고, 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 1 mM EDTA) 중에 용리시키고, 에탄올 침전하고, RNA 보관 용액(써모피셔 사이언티픽, AM7000) 중에 재현탁화시켰다.
또한, GLuc를 인코딩하는 mRNA(슈도-우리딘 및 5-메틸-C로 완전히 치환됨)를 트릴링크 바이오테크놀로지즈(Trilink Biotechnologies)로부터 구입하였다. GLuc 및 인간 알파 글로빈 5’ 및 3’ UTR을 인코딩하는 제2 mRNA 대조군을 CleanCap™ AG를 사용하여 동시-전사 캡핑과 함께 시험관내 전사에 의해 사내에서 생성하였다. 사내에서 합성된 mRNA를 모나크 RNA 정제 컬럼(NEB, T2050)을 사용하여 정제하고, 상기 기술된 바와 같이 겔 용리로 처리하였다.
RNA를 PBS 중 10% TransIT(미루스바이오(MirusBio)) 및 5% 부스트(Boost)(미루스바이오)를 사용하여 제형화시킨다. 총 주입 부피는 각각의 용량에 있어서 100 uL이다. 최종 RNA 농도는 0.1 pmol/uL(10 pmol/마우스)이다. 각각의 용량(100 uL)을 마우스 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사한다. 비-주사된 동물 및 비히클(RNA 부재) 단독 주사된 동물을 대조군으로서 사용한다.
혈액 시료(50 ㎕)를 투여 후 6시간째, 1일째, 2일째, 3일째, 7일째, 14일째, 21일째, 28일째 및 35일째에 각 마우스의 꼬리-정맥으로부터 EDTA 튜브 내로 수집하였다. 혈장을 1300 g, 4℃에서 25분 동안의 원심분리에 의해 단리하고, 가우시아 루시퍼라제, 분비 효소의 활성을 제조처의 설명에 따라 가우시아 루시퍼라제 플래쉬 활성 검정(써모 사이언티픽 피어스)을 사용하여 시험하였다. 요약하여, 50 uL의 1X GLuc 기질을 96 웰 투명 바닥 플레이트의 웰 내의 5 uL의 혈장에 주입하여, GLuc 루시퍼라제 활성 검정을 수행한다. 혼합한 직후에 발광측정 기기(프로메가)에서 플레이트를 판독한다.
라이게이션된 RNA pU/5mC로부터 생성된 circRNA 및 라이게이션된 RNA N1mΨ로부터 생성된 circRNA를 주사한 마우스 유래의 혈액이 라이게이션된 RNA Unmod로부터 생성된 circRNA에 비하여 더 큰 루시퍼라제 활성을 보이고 변형된 및 미변형 mRNA 둘 모두에 비하여 더 큰 루시퍼라제 활성을 보이는 것이 예상된다. 이 실시예에는 라이게이션된 RNA pU/5mC로부터 생성된 circRNA 및 라이게이션된 RNA N1mΨ로부터 생성된 circRNA가 라이게이션된 RNA Unmod로부터 생성된 circRNA에 비하여 더 많은 양의 가우시아 루시퍼라제를 발현하고 변형된 및 미변형 mRNA 둘 모두에 비하여 더 큰 루시퍼라제 활성을 발현하는 것이 기술된다. 이 실시예에는 또한 라이게이션된 RNA pU/5mC로부터 생성된 circRNA 및 라이게이션된 RNA N1mΨ로부터 생성된 circRNA가 라이게이션된 RNA Unmod로부터 생성된 circRNA에 비하여 증가된 기간 동안 가우시아 루시퍼라제를 발현하고, 변형된 및 미변형 mRNA 둘 모두에 비하여 더 큰 루시퍼라제 활성을 발현하는 것이 기술된다.
이 실시예에는 미변형 IRES를 갖지만 다른 곳에는 변형된 뉴클레오티드를 갖는 circRNA가 그의 미변형 대응물에 비하여 더 길고 증가된 발현을 보이는 것이 기술된다.
이 실시예에는 미변형 IRES를 갖지만, 다른 곳에는 변형된 뉴클레오티드를 갖는 circRNA가 변형된 mRNA 및 미변형 mRNA에 비하여 더 길고 증가된 발현을 보이는 것이 기술된다.
실시예 6: 미변형된 IRES를 갖지만, ORF 내에 변형된 뉴클레오티드를 갖는 circRNA는 대응하는 미변형 circRNA에 비하여 생체내에서 증가된 RNA 안정성을 갖는다
이 실시예에는 circRNA 내의 변형된 뉴클레오티드의 포함이 생체내에서 circRNA 안정성을 증가시키는 것을 나타난다.
이 실시예에서, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF, 번역 요소로서 EMCV IRES, 및 5’ 및 3’ 스페이서 영역을 갖는 circRNA를 설계하였다.
ORF 내에 변형된 뉴클레오티드를 포함하도록 circRNA를 생성하기 위하여, 2개의 IVT 주형을 개별적으로 증폭시켰다. 제1 섹션(서열 #1: 1-686nts)은 5’ 스페이서, EMCV IRES 및 GLuc ORF의 38개 뉴클레오티드를 포함한다 포함한다. 제2 섹션(서열 #2: 687-1203nts)은 GLuc의 남아 있는 ORF 영역 및 3’ 스페이서를 포함한다. 제1 섹션의 RNA를 DNA 주형으로부터 시험관내 전사를 통해 미변형 뉴클레오티드를 갖는 선형 RNA로서 생성하였다. 제2 섹션을 DNA 주형으로부터 시험관내 전사를 통해 (1) 미변형 뉴클레오티드를 갖는 (2) 슈도-우리딘 및5-메틸-시토신으로 완전히 치환된 (3) N1-메틸-슈도우리딘으로 완전히 치환된 3가지 상이한 조건 하에 생성하였다.
각각의 뱃치의 전사된 RNA를 RNA 클린업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), T2050)를 사용하여 개별적으로 정제하고, RppH-처리하였다(NEB, M0356). 두번째 정제 후에, 각각의 뱃치의 RNA를 RNA-RNA 라이게이션으로 처리하였다. 제1 섹션의 RNA(IRES 함유) 및 각각의 버전의 제2 섹션의 RNA를 DNA 스플린트를 사용하여 어닐링시켰다.
각각의 반응을 하기와 같이 수행하였다: 2 uM의 제1 섹션 RNA, 2 uM의 선택된 제2 섹션 RNA, 2.56 uM의 스플린트 DNA(5’ -GGCTTGGCCTCGGCCACAGCGATGCAGATC-3’), 50 mM NaCl을 조합하였다. 이 혼합물을 75ºC에서 10분 동안 인큐베이션시킨 다음, 37ºC로 천천히 냉각시켰다. 혼합물을 라이게이션을 위해 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 0.16 U/uL RNase 저해제(프로메가, N2115) 및 15 U/uL T4 DNA 리가제(NEB, M0202M)의 존재 하에 4시간 동안 추가로 인큐베이션시켰다. 라이게이션된 RNA를 모나크 RNA 정제 컬럼(NEB, T2050)을 사용하여 정제하였다. 우레아-PAGE 상에서 분리함으로써 RNA-RNA 라이게이션의 효율을 모니터링하고, 이미지를 정량화하였다.
RNA-RNA 라이게이션된 물질은 하기와 같았다:
(1)라이게이션된 RNA Unmod.: 제1 섹션 + 미변형 뉴클레오티드를 갖는 제2 섹션
(2)라이게이션된 RNA pU/5mC: 제1 섹션 + 슈도-우리딘 및 5-메틸-시티딘으로 완전히 치환된 제2 섹션
(3)라이게이션된 RNA N1mΨ: 제1 섹션 + N1-메틸-슈도우리딘으로 완전히 치환된 제2 섹션.
라이게이션된 RNA의 원형화를 위하여, 각각의 원형화 혼합물을 독립적으로 1 uM의 라이게이션된 RNA, 2 uM의 스플린트 DNA(5’- GTTTTTCGGCTATTCCCAATAGCCGTTTTG -3’), 50 mM Tris-HCl, 2 mM MgCl2 및 400 uM ATP를 사용하여 제조하였다. 이 혼합물을 75ºC에서 10분 동안 가열하고, 실온에서 20분에 걸쳐 천천히 냉각시켰다. 냉각 후에, 0.2 U/uL의 T4 RNA 리가제 2(NEB, M0239) 및 0.4 U/uL의 RNAse 저해제(프로메가, N2115)를 첨가했고, 반응물을 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 라이게이션된 RNA를 에탄올 침전을 사용하여 정제하였다. 원형 RNA를 우레아-PAGE 정제하고, 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 1 mM EDTA) 중에 용리시키고, 에탄올 침전하고, RNA 보관 용액(써모피셔 사이언티픽, AM7000) 중에 재현탁화시켰다.
또한, GLuc를 인코딩하는 mRNA(슈도-우리딘 및 5-메틸-C로 완전히 치환됨)를 트릴링크 바이오테크놀로지즈(Trilink Biotechnologies)로부터 구입하였다. GLuc 및 인간 알파 글로빈 5’ 및 3’ UTR을 인코딩하는 제2 mRNA 대조군을 CleanCap™ AG를 사용하여 동시-전사 캡핑과 함께 시험관내 전사에 의해 사내에서 생성하였다. 사내에서 합성된 mRNA를 모나크 RNA 정제 컬럼(NEB, T2050)을 사용하여 정제하고, 상기 기술된 바와 같이 겔 용리로 처리하였다.
RNA를 PBS 중 10% TransIT(미루스바이오(MirusBio)) 및 5% 부스트(Boost)(미루스바이오)를 사용하여 제형화시킨다. 총 주입 부피는 각각의 용량에 있어서 100 uL이다. 최종 RNA 농도는 0.1 pmol/uL(10 pmol/마우스)이다. 각각의 용량(100 uL)을 마우스 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사한다. 비-주사된 동물 및 비히클(RNA 부재) 단독 주사된 동물을 대조군으로서 사용한다.
간 및 비장 조직을 주사 후 6시간째 및 7시간째에 마우스로부터 수집하고, RNAlater(써모피셔 사이언티픽)에 보관한다. 조직을 트리졸(Trizol)에서 균질화시키고, RNA를 자이모(Zymo) 미니프렙 플러스 키트(miniprep plus kit)(자이모 리서치(Zymo Research), D4068)를 사용하여 추출하였다. RNA 안정성을 RT-qPCR에 의해 측정한다. GLuc ORF 및 18S rRNA를 바이오-라드(Bio-rad) CFX384 온도 순환기(Thermal Cycler)를 사용하여 3벌로 루나(Luna)® 유니버설 원-스텝(Universal One-Step) RT-qPCR 시스템(뉴 잉글랜드 바이오랩스)을 사용해 qPCR에 의해 측정한다. 상대 값을 Pffal 방법을 사용하여 계산한다.
라이게이션된 RNA pU/5mC로부터 생성된 circRNA 및 라이게이션된 RNA N1mΨ로부터 생성된 circRNA를 주사한 마우스 유래의 간 및 비장 조직이 주사 후 7일째에 라이게이션된 RNA Unmod로부터 생성된 circRNA에 비하여 증가된 양의 GLuc ORF 및 변형된 및 미변형 mRNA 둘 모두에 비하여 더 큰 루시퍼라제 활성을 보이는 것이 예상된다.
이 실시예에는 미변형 IRES를 갖지만, 다른 곳에서 변형된 뉴클레오티드를 갖는 circRNA가 그의 미변형 대응물에 비하여 더 큰 지속성 및 안정성을 보이는 것이 기술된다.
이 실시예에는 미변형 IRES를 갖지만, 다른 곳에서 변형된 뉴클레오티드를 갖는 circRNA가 변형된 mRNA 및 미변형 mRNA에 비하여 더 큰 지속성 및 안정성을 보이는 것이 기술된다.
실시예 7: 미변형 IRES를 갖지만, ORF 내에 변형된 뉴클레오티드를 갖는 circRNA는 생체내에서 증가된 RNA 번역 및 증가된 안정성을 갖는다
이 실시예에는 circRNA 내의 변형된 뉴클레오티드의 포함이 생체내에서 circRNA 발현 및 안정성을 증가시키는 것이 기술된다.
이 실시예에서, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF, 번역 요소로서 Gtx 및 5’ 및 3’ 스페이서 영역을 갖는 circRNA를 설계하였다.
ORF 내에 변형된 뉴클레오티드를 포함하지만, IRES에는 포함하지 않도록 circRNA를 생성하기 위하여, IRES를 실질적으로 우리딘이 없도록, 예를 들어, Gtx(서열: CCGGCGGAA)이도록 설계하였다. RNA를 DNA 주형으로부터 시험관내 전사를 통해 (1) 미변형 뉴클레오티드를 갖는, (2) 슈도-우리딘으로 완전히 치환된 및 (3) N1-메틸-슈도우리딘으로 완전히 치환된 선형 RNA로서 생성한다.
각각의 뱃치의 전사된 RNA를 RNA 클린업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), T2050)를 사용하여 개별적으로 정제하고, RppH-처리한다(NEB, M0356).
RNA의 원형화를 위하여, 각각의 원형화 혼합물을 독립적으로 1 uM의 라이게이션된 RNA, 2 uM의 스플린트 DNA(5’- GTTTTTCGGCTATTCCCAATAGCCGTTTTG -3’), 50 mM Tris-HCl, 2 mM MgCl2 및 400 uM ATP를 사용하여 제조한다. 이 혼합물을 75ºC에서 10분 동안 가열하고, 실온에서 20분에 걸쳐 천천히 냉각시킨다. 냉각 후에, 0.2 U/uL의 T4 RNA 리가제 2(NEB, M0239) 및 0.4 U/uL의 RNAse 저해제(프로메가, N2115)를 첨가하고, 반응물을 4시간 동안 인큐베이션시킨다. 라이게이션된 RNA를 에탄올 침전을 사용하여 정제한다. CircRNA를 우레아-PAGE 정제하고, 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 0.1 mM EDTA) 중에 용리시키고, 에탄올 침전하고, RNA 보관 용액(써모피셔 사이언티픽, AM7000) 중에 재현탁화시킨다.
또한, GLuc를 인코딩하는 mRNA(슈도-우리딘 또는 N1-메틸-슈도우리딘으로 완전히 치환됨)를 트릴링크 바이오테크놀로지즈로부터 구입한다. GLuc 및 인간 알파 글로빈 5’ 및 3’ UTR을 인코딩하는 제2 mRNA 대조군을 CleanCap™ AG를 사용한 동시-전사 캡핑과 함께 시험관내 전사에 의해 사내에서 생성한다. 사내에서 합성된 mRNA를 모나크 RNA 정제 컬럼(NEB, T2050)을 사용하여 정제하고, 상기 기술된 바와 같이 겔 용리로 처리한다.
RNA를 PBS 중 10% TransIT(미루스바이오(MirusBio)) 및 5% 부스트(Boost)(미루스바이오)를 사용하여 제형화시킨다. 총 주입 부피는 각각의 용량에 있어서 100 uL이다. 최종 RNA 농도는 0.1 pmol/uL(10 pmol/마우스)이다. 각각의 용량(100 uL)을 마우스 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사한다. 비-주사된 동물 및 비히클(RNA 부재) 단독 주사된 동물을 대조군으로서 사용한다.
간 및 비장 조직을 주사 후 6시간째 및 7시간째에 마우스로부터 수집하고, RNAlater(써모피셔 사이언티픽)에 보관한다. 조직을 트리졸(Trizol)에서 균질화시키고, RNA를 자이모(Zymo) 미니프렙 플러스 키트(miniprep plus kit)(자이모 리서치(Zymo Research), D4068)를 사용하여 추출하였다. RNA 안정성을 RT-qPCR에 의해 측정한다. GLuc ORF 및 18S rRNA를 바이오-라드(Bio-rad) CFX384 온도 순환기(Thermal Cycler)를 사용하여 3벌로 루나(Luna)® 유니버설 원-스텝(Universal One-Step) RT-qPCR 시스템(뉴 잉글랜드 바이오랩스)을 사용해 qPCR에 의해 측정한다. 상대 값을 Pffal 방법을 사용하여 계산한다.
pU 변형을 사용하여 생성된 circRNA 및 N1mΨ 변형으로부터 생성된 circRNA를 주사한 마우스 유래의 간 및 비장 조직이 주사 후 7일째에, 미변형 RNA로부터 생성된 circRNA에 비하여 증가된 양의 GLuc ORF 및 변형된 및 미변형 mRNA 둘 모두에 비하여 더 큰 루시퍼라제 활성을 보이는 것이 예상된다.
이 실시예에는 미변형 IRES를 갖지만, 다른 곳에서 변형된 뉴클레오티드를 갖는 circRNA가 그의 대응하는 미변형 circRNA에 비하여 더 큰 지속성 및 안정성을 보이는 것이 기술된다.
이 실시예에는 미변형 IRES를 갖지만, 다른 곳에서 변형된 뉴클레오티드를 갖는 circRNA가 변형된 mRNA 및 미변형 mRNA에 비하여 더 큰 발현, 지속성 및 안정성을 보이는 것이 기술된다.
실시예 8: 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 원형 RNA는 미변형 뉴클레오티드만으로 생성된 원형 RNA에 비하여 생체내에서 감소된 면역원성을 갖는다
이 실시예는 원형 RNA 내의 변형된 뉴클레오티드의 포함이 생체내에서 원형 RNA 면역원성을 감소시키는 것을 보여준다.
이 실시예에서, 원형 RNA는 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF 및 5’ 및 3’ 인간 알파-글로빈 UTR을 포함한다.
IRES(번역 부적격)를 결여한 원형 RNA를 시험관내에서 완전히 미변형된 뉴클레오티드를 사용하여 또는 우라실에서 슈도-우리딘으로, 그리고 시토신에서 5-메틸-시토신으로의 치환을 사용하여 생성하였다. 이를 위하여, 완전히 미변형된 뉴클레오티드를 갖거나 또는 변형된 우라실 및 시토신 치환을 갖는 선형 RNA를, 전사를 유도하기 위한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터뿐만 아니라, 상기 열거된 모든 모티프를 포함하는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사하였다. 전사된 RNA를 제조업체의 지침에 따라 RNA 클린업(cleanup) 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하고, RNA 5'-포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0356)로 처리하고, RNA 정제 컬럼(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)으로 다시 정제하였다. RppH-처리된 선형 RNA를 스플린트 DNA(5’- GACCAGAAGAGTCCCTGCTGCCCACTCAGA-3’) 및 T4 RNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0239)를 사용하여 원형화시켰다. 원형 RNA를 우레아-PAGE 정제하고, 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 1 mM EDTA) 중에 용리시키고, 에탄올 침전하고, RNA 보관 용액(써모피셔 사이언티픽, AM7000) 중에 재현탁화시켰다.
RNA를 PBS 중 15% TransIT(미루스바이오) 및 7.5% 부스트(미루스바이오)를 사용하여 제형화하였다. 총 주입 부피는 각각의 용량에 있어서 100 uL였다. 0.1 pmol/uL의 최종 RNA 농도. (10 pmol/마우스). 각각의 용량(100 uL)을 마우스 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사하였다. 비-주사된 동물 및 비히클(RNA 부재)만을 주사한 동물을 대조군으로서 사용하였다. 간 및 비장을 주사 후 1일 및 2일째에 수집하고, RNAlater(써모피셔 사이언티픽)에 보관하였다.
조직을 트리졸(Trizol)에서 균질화시켰고, RNA를 자이모(Zymo) 미니프렙 플러스 키트(miniprep plus kit)를 사용하여 추출하였다. RIG-I, MDA5, INFa, IFNB, IFNg, TNFa 및 IL6을 포함하는 면역 반응 유전자 및 하우스키핑 유전자 18S rRNA를 바이오-라드 CFX384 온도 순환기를 사용하여 3벌로 루나® 유니버설 원-스텝 RT-qPCR 시스템(뉴 잉글랜드 바이오랩스)을 사용해 qPCR에 의해 측정하였다. 상대 값을 Pffafl 방법을 사용하여 계산하였다(문헌[Pfaffl Nucleic Acids Res 2001]).
변형된 뉴클레오티드를 함유하는 원형 RNA를 사용하는 경우, 마우스는 변형된 뉴클레오티드를 함유하지 않는 그의 원형 RNA 대응물 및 그의 변형된 mRNA 대응물에 비하여 실질적으로 더 낮은 면역 마커(RIG-I, MDA5, INFa, IFNb, INFg, TNFa 및 IL6)의 발현을 나타내었다(도 49).
이 실시예는 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 원형 RNA가 동물 내에 주사되는 경우, 미변형 뉴클레오티드만을 함유하는 원형 RNA에 비하여 더 낮은 면역원성을 유도하였음을 보여준다.
실시예 9: 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 원형 RNA는 그의 완전히 미변형된 원형 RNA 대응물 및 변형된 mRNA에 비하여 생체내에서 증가된 안정성을 갖는다
이 실시예는 원형 RNA 내의 변형된 뉴클레오티드의 포함이 생체내에서 원형 RNA 안정성을 증가시키는 것을 보여준다.
이 실시예에서, 원형 RNA는 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF 및 5’ 및 3’ 인간 알파-글로빈 UTR을 포함한다.
IRES(번역 부적격)를 결여한 원형 RNA를 시험관내에서 완전히 미변형된 뉴클레오티드를 사용하여 또는 우라실에서 슈도-우리딘으로, 그리고 시토신에서 5-메틸-시토신으로의 치환을 사용하여 생성하였다. 이를 위하여, 완전히 미변형된 뉴클레오티드를 갖거나 또는 변형된 우라실 및 시토신 치환을 갖는 선형 RNA를, 전사를 유도하기 위한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터뿐만 아니라, 상기 열거된 모든 모티프를 포함하는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사하였다. 전사된 RNA를 제조업체의 지침에 따라 RNA 클린업(cleanup) 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하고, RNA 5'-포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0356)로 처리하고, RNA 정제 컬럼(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)으로 다시 정제하였다. RppH-처리된 선형 RNA를 스플린트 DNA(5’- GACCAGAAGAGTCCCTGCTGCCCACTCAGA-3’) 및 T4 RNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0239)를 사용하여 원형화시켰다. 원형 RNA를 우레아-PAGE 정제하고, 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 1 mM EDTA) 중에 용리시키고, 에탄올 침전하고, RNA 보관 용액(써모피셔 사이언티픽, AM7000) 중에 재현탁화시켰다.
대조군으로서, 슈도-우리딘 및 5-메틸-시티딘으로 완전히 치환되고, 캡 유사체로 캡핑된 선형 RNA를 생성하고, 상기 기술된 바와 같이 우레아-PAGE 정제하였다.
RNA를 PBS 중 15% TransIT(미루스바이오) 및 7.5% 부스트(미루스바이오)를 사용하여 제형화하였다. 총 주입 부피는 각각의 용량에 있어서 100 uL였다. 최종 RNA 농도는 0.1 pmol/uL(10 pmol/마우스)이다. 각각의 용량(100 uL)을 마우스 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사하였다. 비-주사된 동물 및 비히클(RNA 부재)만을 주사한 동물을 대조군으로서 사용하였다. 간 및 비장을 주사 후 1일째, 2일째, 7일째 및 14일째에 수집하고, RNAlater(써모피셔 사이언티픽)에 보관하였다.
조직을 트리졸(Trizol)에서 균질화시켰고, RNA를 자이모(Zymo) 미니프렙 플러스 키트(miniprep plus kit)를 사용하여 추출하였다. 원형 RNA 및 선형 RNA를 바이오-라드 CFX384 온도 순환기를 사용하여 3벌로 RT-qPCR 루나® 유니버설 원-스텝 RT-qPCR 시스템(뉴 잉글랜드 바이오랩스)에 의해 검출하였다. 대조군으로서, 18S rRNA를 측정하였다. 상대 값을 Pffafl 방법을 사용하여 계산하였다(문헌[Pfaffl Nucleic Acids Res 2001]).
이 실시예에서, 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 원형 RNA는 변형된 뉴클레오티드를 함유하지 않는(오직 미변형 뉴클레오티드만의) 원형 RNA보다 더 긴 기간에 걸쳐 간 및 비장에 존재하였으며; 변형된 mRNA보다 더 긴 기간에 걸쳐 간 및 비장에 존재하였다(도 50).
이 실시예는 변형된 뉴클레오티드로 생성된 원형 RNA가 주사 후 14일째에 미변형 뉴클레오티드로 생성된 원형 RNA와 비교하는 경우 그리고 변형된 mRNA와 비교하여, 더욱 안정한 것을 보여준다.
실시예 10: 시험관내 원형 RNA 생성
본 실시예는 원형 RNA의 시험관내 생성을 보여준다.
도 4에 나타낸 출발-코돈(SEQ ID NO: 1), ORF(들)(SEQ ID NO: 2), 스태거 요소(들)(SEQ ID NO: 3), 엔크립토겐(들)(SEQ ID NO: 4) 및 IRES(SEQ ID NO: 5)를 갖는 원형 RNA를 설계한다. 원형화는 회전환 번역을 가능하게 하며, 다수의 오픈 리딩 프레임(ORF)은 불연속 ORF 발현 및 제어된 단백질 화학량론을 위해 대안적인 스태거 요소를 가지며, 엔크립토겐(들)은 RNA 면역원성을 약화시키거나 완화시키기 위한 것이며, RNA를 표적화하는 선택적인 IRES는 폴리-A 서열이 없는 리보솜 진입을 위한 것이다.
본 실시예에서, 원형 RNA를 하기와 같이 생성한다. 미변형된 선형 RNA를 5'- 및 3'- ZKSCAN1 인트론, 및 2A 서열에 연결된 GFP를 인코딩하는 ORF를 갖는 DNA 세그먼트로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성한다. 전사된 RNA를 RNA 정제 시스템(퀴아젠(QIAGEN))으로 정제하고, 제조처의 지침에 따라 알칼리성 포스파타제(써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), EF0652)로 처리하고, RNA 정제 시스템으로 다시 정제한다.
스플린트 라이게이션 원형 RNA를 T4 DNA 리가제(뉴 잉글랜드 바이오, 인코포레이티드(New England Bio, Inc.), M0202M)를 사용한 전사된 선형 RNA 및 DNA 스플린트의 처리에 의해 생성하고, RNase R 처리로 농축한 후에 원형 RNA를 단리한다. RNA 품질을 아가로스 겔에 의해 또는 자동화 전기영동(아질런트(Agilent))을 통해 평가한다.
실시예 11: 생체내 원형 RNA 생성, 세포 배양
본 실시예는 원형 RNA의 생체내 생성을 보여준다.
GFP(SEQ ID NO: 2)를 발현 벡터, 예를 들어, pcDNA3.1(+)(애드진(Addgene))(SEQ ID NO: 6) 내로 클로닝한다. 이러한 벡터를 돌연변이유발하여 세포에서 원형 RNA 생성을 유도하며(SEQ ID NO: 6 및 문헌[Kramer et al 2015]에 기술됨), 도 5에 나타나 있다.
HeLa 세포를 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 우태아혈청이 보충된 고 글루코스를 갖는 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM)(라이프 테크놀로지즈)에서 37℃ 및 5% CO2에서 성장시킨다. 1 마이크로그램의 상기 기술된 발현 플라스미드를 지질 트랜스펙션 시약(라이프 테크놀로지즈)을 사용하여 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 세포로부터의 전체 RNA를 트랜스펙션 후 1시간 내지 20일에 제조처의 지침에 따라 페놀-기반의 RNA 단리 시약(라이프 테크놀로지즈)을 사용하여 단리한다.
GFP 원형 RNA 및 mRNA 수준을 측정하기 위해, 무작위 헥사머를 사용한 qPCR 역전사를 수행한다. 약술하면, RT-qPCR을 위해, Hela 세포의 전체 RNA 및 동일한 공급원으로부터의 RNase R-분해된 RNA를 RT-PCR을 위한 주형으로서 사용한다. GFP mRNA 및 원형 GFP RNA의 cDNA를 제조하기 위해, 역전사 반응을 제조처의 지침에 따라 역전사효소(슈퍼-스크립트(Super-Script) II : RNase H ; 인비트로겐(Invitrogen)) 및 무작위 헥사머를 사용하여 수행한다. 증폭된 PCR 생성물을 6% PAGE를 사용하여 분석하고, 브롬화에티듐 염색에 의해 가시화시킨다. 농축 계수를 추산하기 위해, PCR 생성물을 농도계(ImageQuant; 몰레큘라 다이나믹스(Molecular Dynamics))에 의해 정량화하고, 전체 RNA 시료의 농도를 UV 흡광도에 의해 측정한다.
추가의 RNA 측정을 노던 블롯 분석을 사용하여 수행한다. 약술하면, 전체 세포 추출물을 페놀계 시약(TRIzol)을 사용하여 수득하거나, 핵 및 세포질 단백질 추출물을 상용의 키트(CelLytic NuCLEAR 추출 키트, 시그마(Sigma))를 사용한 세포의 분획화에 의해 수득한다. RNA 폴리머라제 II 전사를 저해하기 위해, 세포를 37℃에서 0시간 내지 6시간 동안 플라보피리돌(1 mM 최종 농도; 시그마)로 처리한다. RNase R 처리를 위해, 10 mg의 전체 RNA를 37℃에서 1시간 동안 20 U의 RNase R(에피센터(Epicentre))로 처리한다.
올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 노던 블롯을 하기와 같이 수행한다. 올리고뉴클레오티드 프로브, PCR 프라이머를 표준 프라이머 설계 툴을 사용하여 설계한다. T7 프로모터 서열을 역방향 프라이머에 부가하여, 시험관내 전사 반응에서 안티센스 프로브를 수득한다. 시험관내 전사를 제조처의 지침에 따라 DIG-RNA 표지화 믹스와 함께 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 수행한다. DNA 주형을 DNAs I 분해에 의해 제거하고, RNA 프로브를 페놀 클로로포름 추출 및 후속 침전에 의해 정제한다. 프로브를 50 ng/㎖로 사용한다. 전체 RNA(2 ㎍ 내지 10 ㎍)를 글리옥살 로드 염료(Glyoxal load dye)(앰비온(Ambion))를 사용하여 변성시키고, MOPS 완충제 중에 1.2% 아가로스 겔에서 분리한다. 겔을 1×TBE에서 20분 동안 침지시키고, 반-건조 블롯팅 시스템(바이오-라드(Bio-Rad))을 사용하여 1시간(15 V) 동안 하이본드(Hybond)-N+ 멤브레인(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))으로 전달한다. 멤브레인을 건조시키고, 120,000 μJ cm-2에서 (265 nm에서) 1회 UV-가교시킨다. 사전-혼성화를 68℃에서 1시간 동안 행하고, DIG-표지된 시험관내 전사된 RNA 프로브를 밤새 혼성화시킨다. 멤브레인을 68℃에서 30분 동안 2×SSC, 0.1% SDS에서 3회 세척한 후에, 68℃에서 0.2×SSC, 0.1% SDS에서의 3회의 30분 세척으로 이어졌다. 면역검출을 알칼리성 포스파타제 항체와 직접-컨쥬게이트된 항-DIG로 수행한다. 면역반응성 밴드를 화학발광 알칼리성 포스파타제 기질(CDP 스타(star) 시약) 및 이미지 검출 및 정량화 시스템(LAS-4000 검출 시스템)을 사용하여 가시화시킨다.
실시예 12: 원형 RNA의 제조 및 시험관내 번역
본 실시예는 원형 RNA로부터의 유전자 생성물의 유전자 발현 및 검출을 보여준다.
본 실시예에서, 출발-코돈(SEQ ID NO: 1), GFP ORF(SEQ ID NO: 2), 스태거 요소(들)(SEQ ID NO: 3), 인간-유래된 엔크립토겐(들)(SEQ ID NO: 4)을 갖는, 그리고 IRES(SEQ ID NO: 5)를 갖거나 이것이 없는 원형 RNA를 설계하며, 도 6을 참조한다. 본 실시예에서, 실시예 10 및 11에 기술된 바와 같이 원형 RNA를 시험관내 또는 세포 내에서 생성한다.
원형 RNA를 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 피츠버그 소재)에서 5시간 또는 밤새 인큐베이션시킨다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 10 μM 메티오닌 및 류신, 메티오닌 및 류신 이외의 20 μM 아미노산 및 0.8 U/㎕ RNase 저해제(일본 오사카 소재의 토요보(Toyobo))를 포함한다. 분취물을 혼합물로부터 취하고, 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/황산도데실나트륨(SDS) 겔(일본 도쿄 소재의 아토(Atto))에서 분리한다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 70℃에서 15분 동안 2×SDS 시료 완충제(0.125 M Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 30% 글리세롤, 5% 2-머캅토에탄올, 0.01% 브로모페놀 블루) 중에 용해시킨다. 헤모글로빈 단백질은 이러한 과정 동안 제거하는 반면, 헤모글로빈 이외의 단백질은 농축시킨다.
1,400×g에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석한다. 상업적으로 이용 가능한 표준물질(바이오라드(BioRad))을 크기 마커로서 사용한다. 반-건조 방법을 사용하여 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인(밀리포어(Millipore))으로 전기전달한 후에, 블롯을 화학발광 키트(로클랜드(Rockland))를 사용하여 가시화시킨다.
GFP 단백질이 세포 용해물에서 가시화되고, 회전환 번역의 결과로서 선형 RNA보다 원형 RNA에서 더 많은 양으로 검출되는 것으로 예상된다.
실시예 13: 원형 RNA로부터의 화학량론적 단백질 발현
본 실시예는 단백질을 화학량론적으로 발현하는 원형 RNA의 능력을 보여준다.
본 실시예에서, 엔크립토겐(SEQ ID NO: 4) 및 GFP를 인코딩하는 ORF(SEQ ID NO: 2) 및 RFP를 인코딩하는 ORF(SEQ ID NO: 8)와 함께, GFP 및 RFP ORF의 측부 배치된 스태거 요소(SEQ ID NO: 3)를 포함하도록 하나의 원형 RNA를 설계하며, 도 7을 참조한다. 또 다른 원형 RNA를 유사하게 설계하지만, 그것은 GFP와 RFP ORF 사이에 측부 배치 2A 서열 대신에, 정지 및 출발 코돈을 가질 것이다. 실시예 10 및 11에 기술된 바와 같이 원형 RNA를 시험관내에서 또는 세포 내에서 생성한다.
원형 RNA를 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물(프로메가, 미국 위스콘신주 피츠버그 소재)에서 5시간 또는 밤새 인큐베이션시킨다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 10 μM 메티오닌 및 류신, 메티오닌 및 류신 이외의 20 μM 아미노산 및 0.8 U/㎕ RNase 저해제(일본 오사카 소재의 토요보)를 포함한다. 분취물을 혼합물로부터 취하고, 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/황산도데실나트륨(SDS) 겔(일본 도쿄 소재의 아토(Atto))에서 분리한다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 70℃에서 15분 동안 2×SDS 시료 완충제(0.125 M Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 30% 글리세롤, 5% 2-머캅토에탄올, 0.01% 브로모페놀 블루) 중에 용해시킨다. 헤모글로빈 단백질은 이러한 과정 동안 제거하는 반면, 헤모글로빈 이외의 단백질은 농축시킨다.
1,400×g에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석한다. 상업적으로 이용 가능한 표준물질(바이오라드(BioRad))을 크기 마커로서 사용한다. 반-건조 방법을 사용하여 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인(밀리포어)으로 전기전달한 후에, 블롯을 화학발광 키트(로클랜드)를 사용하여 가시화시킨다.
정지 및 출발 코돈에 의해 분리되지 않은 GFP 및 RFP ORF를 갖는 원형 RNA는 동일한 양의 어느 하나의 단백질을 가지는 한편, ORF 사이에 출발 및 정지 코돈을 포함하는 원형 RNA로 처리된 세포는 상이한 양의 어느 하나의 단백질을 가질 것으로 예상된다.
실시예 14: 생체내 발현
본 실시예는 생체내에서 원형 RNA로부터 단백질을 발현하는 능력을 보여준다.
본 실시예를 위해, 엔크립토겐(들)(SEQ ID NO: 4) 및 GFP(SEQ ID NO: 2) 또는 RFP(SEQ ID NO: 8) 또는 루시퍼라제(SEQ ID NO: 10)를 인코딩하는 ORF와 함께 GFP, RFP 또는 루시퍼라제 ORF의 측부 배치된 스태거 요소(SEQ ID NO: 3)를 포함하도록 원형 RNA를 설계하며, 도 8을 참조한다. 실시예 10 및 11에 기술된 바와 같이 원형 RNA를 시험관내 또는 세포 내에서 생성한다.
6 내지 8주령 수컷 BALB/c 마우스에, 본원에 기술된 바와 같은 GFP, RFP 또는 루시퍼라제 ORF를 갖는 300 mg/kg(6 mg)의 원형 RNA(50 ㎕ 부피), 또는 대조군으로서 선형 RNA를 피내(ID), 근육내(IM), 경구(PO), 복강내(IP) 또는 정맥내(IV) 투여를 통해 제공한다. 동물에 단회 용량 또는 3회 주사(제1일, 제3일, 제5일)를 제공한다.
혈액, 심장, 폐, 비장, 신장, 간 및 피부 주사 부위를 비-투여된 대조군 마우스로부터, 그리고 투여 후 2시간째, 4시간째, 8시간째, 24시간째, 48시간째, 72시간째, 96시간째 120시간째, 168시간째 및 264시간째에 수집한다(n = 4마리 마우스/시점). 혈액 시료를 연구 종료시에 경정맥 천자로부터 수집한다.
혈청 및 조직 둘 모두에 대한 원형 RNA 정량화를 분지형 DNA(bDNA)의 정량화(패노믹스(Panomics)/아피메트릭스(Affymetrix))를 사용하여 수행한다. (비처리된 조직 시료에 첨가되는) 알려져 있는 양의 RNA의 각 플레이트에 대한 표준 곡선을 사용하여, 처리된 조직에서 RNA를 정량화한다. 피코그램(pg)의 계산된 양을 플레이트에 적용되는 용해물 중 칭량된 조직의 양에 대해 정규화시킨다. 단백질 발현(RFP 또는 GFP)을 이전의 실시예에 기술된 바와 같이 각 조직에서 FACS 또는 웨스턴 블롯에 의해 평가한다.
루시퍼라제 원형 RNA를 투여받은 마우스의 개별 군에는, 투여 후 6, 24, 48, 72시간 및 96시간째에 3 mg의 루시페린을 주사하고, 동물을 생체내 영상화 시스템(IVIS Spectrum, 퍼킨엘머(PerkinElmer))에서 영상화한다. 투여 후 6시간째에, 3마리의 동물을 희생시키고, 해부하고, 근육, 피부, 배액 림프절, 간 및 비장을 생체외에서 영상화한다.
마우스는 처리된 조직에서 GFP, RFP 또는 루시퍼라제를 발현하는 것으로 예상된다.
실시예 15: 원형 RNA는 적어도 하나의 이중-가닥 RNA 세그먼트를 포함한다
이 실시예는 원형 RNA가 적어도 하나의 이중-가닥 RNA 세그먼트를 포함하는 것을 보여준다.
본 실시예에서, GFP ORF 및 IRES를 포함하도록 원형 RNA를 이전에 기술된 방법 중 하나를 통해 합성하며, 도 9를 참조한다. J2 및 K1 모노클로널 항체를 사용한 점 블롯 검정을 활용하여, 적어도 40 bp 길이의 이중 가닥 RNA 구조를 측정할 것이다. 원형 RNA(200 ng)를 나일론 멤브레인(초 하전된 나이트란(Nytran)) 상으로 블롯팅하고, 건조시키고, TBS-T 완충제(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.4) 중 5% 탈지 분유로 블로킹하고, dsRNA-특이적 mAb J2 또는 K1(잉글리쉬 앤드 사이언티픽 컨설팅(English & Scientific Consulting))과 60분 동안 인큐베이션시킨다. 멤브레인을 TBS-T로 6회 세척한 다음, HRP-컨쥬게이트된 당나귀 항-마우스 Ig(잭슨 이뮤놀로지(Jackson Immunology))로 처리한 후, 6회 세척하고, 점을 증강 화학발광 웨스턴 블롯 검출 시약(아머샴(Amersham))을 사용하여 가시화시킨다.
원형 RNA는 내부 준-이중 가닥 RNA 세그먼트를 생성하는 것으로 예상된다.
실시예 16: 원형 RNA는 준-이중-가닥 구조를 포함한다
이 실시예는 원형 RNA가 준-이중-가닥 구조를 포함하는 것을 보여준다.
이 실시예에서, 원형 RNA를 HDVmin(문헌[Griffin et al 2014])의 발현의 부가와 함께 또는 이것 없이 이전에 기술된 방법 중 하나를 통해 합성한다. 이러한 RNA 서열은 준-나선 구조를 형성하고, 도 10을 참조하며, 이를 양성 대조군으로서 사용한다(문헌[Griffin et al 2014]에 의해 나타낸 바와 같음).
원형 RNA 구조가 기능적 준-이중-가닥 구조를 포함하는지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 프라이머 연장에 의해 분석되는 선택적 2'OH 아실화(SHAPE)를 사용하여 이차 구조를 결정할 것이다. SHAPE는 단일-뉴클레오티드 분해력으로 RNA에서 국부 백본 유연성을 평가한다. SHAPE 친전자체에 대한 염기 위치의 반응성은 이차 구조와 관련된다: 염기쌍이 형성된 위치는 약하게 반응성인 한편, 쌍이 형성되지 않은 위치는 더욱 고도로 반응성이다.
SHAPE를 원형 RNA, HDVmin 및 선형 RNA 함유에서 수행한다. SHAPE를 각각 문헌[Wilkinson et al 2006] 및 문헌[Griffin 2014 et al]에 의해 보고된 바와 같이 본질적으로 N-메틸이사토익 무수물(NMIA) 또는 벤조일 시아나이드(BzCN)로 수행한다. BzCN을 사용한 SHAPE에 대해 요약하여, 디메틸 술폭시드(DMSO) 중 800 mM BzCN 1 ㎕를 160 mM Tris, pH 8.0 중 3 내지 6 pmol의 RNA, 1 U/l RNAse 저해제(예를 들어, SuperaseIn RNase 저해제)를 함유하는 20 ㎕의 반응 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 1분 동안 인큐베이션시킨다. 대조군 반응 혼합물은 BzCN 없이 1 ㎕ DMSO를 포함한다. BzCN과의 인큐베이션 후에, RNA를 페놀 클로로포름을 사용하여 추출하고, 제조업체에 의해 지시된 바와 같이 정제하고(예를 들어, RNA 클린 앤드 컨센트레이터(Clean & Concentrator)-5 키트 사용), 6 ㎕의 10 mM Tris, pH 8.0 중에 재현탁시킨다. 1-염료 시스템을 사용하여 BzCN 부가물을 검출한다. RNA를 6-카복시플루오레세인(6-FAM)으로 표지된 프라이머와 어닐링시킨다. 제조업체의 권고에 따라 역전사효소(슈퍼스크립트 III - 인비트로겐)를 사용하여, 프라이머 연장을 인큐베이션 조건에 대한 하기의 변형과 함께 수행한다: 42℃에서 5분, 55℃에서 30분, 65℃에서 25분 및 75℃에서 15분. 프라이머 연장 반응에서 0.5 mM ddATP 또는 0.5 mM ddCTP 중 어느 하나를 사용하여 2개의 서열분석 래더를 생성한다. 프라이머 연장 생성물을 에탄올을 사용하여 침전시키고, 세척하여 과잉의 염을 제거하고, 상용의 크기 표준물질(예를 들어, Liz 크기 표준물질 젠위즈(Genewiz) 단편 분석 서비스(Fragment Analysis Service))과 함께 모세관 전기영동에 의해 분리한다.
미가공 전기영동도를 일차 단편 분석 툴(예를 들어, 피크스캐너(PeakScanner) 어플라이드 바이오- 시스템즈(Applied Bio- systems))을 사용하여 분석한다. 그 다음, 전기영동도에서 각 위치에서의 피크를 적분한다. 분석된 각 RNA에 있어서, 로딩 오차를 보정하기 위한 y 축 스케일링을 수행하여, 각 프라이머 연장 반응에 대한 백그라운드가 BzCN으로 처리되지 않은 RNA에서 수행되는 음성-대조군 반응의 것에 대해 정규화되게 한다. 신호 감쇠 보정을 각 반응에 대한 데이터에 적용한다. 피크를 2가지 서열분석 반응으로부터 생성된 래더에 대해 정렬한다. 각 위치에서, 음성 대조군의 피크 면적을 BzCN-처리된 시료에서의 피크 면적으로부터 감산한 다음; 감산된 피크 면적을 감산된 피크 면적의 최고 2% 내지 10%의 평균으로 나눔으로써 이들 값을 정규화된 SHAPE 반응성으로 전환시킨다.
SHAPE 분석에 더하여, 본 발명자들은 NMR(문헌[Marchanka et al 2015]); 하이드록실 라디칼 프로빙(문헌[Ding et al 2012]); 또는 DMS 및 CMTC 및 케톡살(Kethoxal)의 조합(문헌[Tijerina et al 2007] 및 문헌[Ziehler et al 2001])을 수행할 것이다.
원형 RNA는 준-이중-가닥 구조를 가질 것으로 예상된다.
실시예 17: 원형 RNA는 기능성 준-나선 구조를 포함한다
이 실시예는 원형 RNA가 기능적 준-나선 구조를 포함하는 것을 보여준다.
이 실시예에서, 원형 RNA를 395L의 발현의 부가와 함께, 이전에 기술된 방법 중 하나를 통해 합성한다(문헌[Defenbaugh et al 2009]). 이러한 RNA 서열은 준-나선 구조를 형성하며(상기 나타낸 바와 같이, RNA 이차 구조 폴딩 알고리즘 mfold 및 문헌[Defenbaugh et al 2009]에 의해), 도 11. 이 구조는 D형 간염 항원(HDAg)과의 복합체 형성에 필수적이다.
따라서, 원형 RNA 구조가 기능적 준-구조를 포함하는지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 원형 RNA 및 선형 RNA를 HDAg-160 또는 HDAg-195와 인큐베이션시키고, EMSA 검정을 사용하여 결합을 분석할 것이다. 결합 반응을 10 mM Tris-HCl(pH 7.0), 25 mM KCl, 10 mM NaCl, 0.1 g/l 소 혈청 알부민(뉴 잉글랜드 바이오랩스), 5% 글리세롤, 0.5 mM DTT, 0.2 U/l RNase 저해제(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 및 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 용액을 포함하는 25 ㎕ 중에서 행한다. 원형 RNA를 0 내지 110 nM 범위의 농도로 HDAg 단백질(문헌\[Defenbaugh et al 2009]에 기술된 바와 같이 수득됨)과 인큐베이션시킨다. 반응 혼합물을 얼음 상에서 모으고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 240 V에서 2.5시간 동안 0.5 트리스-붕산염-EDTA 중 6% 고유(native) 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동시킨다. 유리 및 결합된 RNA의 수준을 핵산 염색(예를 들어, gelred)을 사용하여 결정한다. 결합은 백그라운드를 제한 전체 레인의 세기에 비한 미결합된 RNA의 세기로서 계산할 것이다.
원형 RNA는 기능적 준-나선 구조를 가질 것으로 예상된다.
실시예 18: 자가-전사/복제
이 실시예에서, 원형 RNA를 HDV 복제 도메인(들)의 발현(문헌[Beeharry et al 2014]에 의해 기술된 바와 같음), 안티게놈 복제 적격 리보자임 및 핵 국소화 신호의 부가와 함께 이전에 기술된 방법 중 하나를 통해 합성한다. 이들 RNA 서열은 원형 RNA가 핵 내에 위치되게 하며, 여기서 숙주 RNA 폴리머라제가 결합하고 RNA를 전사할 것이다. 그 다음, 이 RNA는 리보자임을 사용하여 자가-절단된다. 그 다음, RNA는 라이게이션되고 다시 자가-복제되며, 도 12를 참조한다.
원형 RNA(1 내지 5 마이크로그램)를 상기 기술된 기법을 사용하여 HeLa 세포 내로 트랜스펙션시킬 것이다. HeLa 세포를 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 우태아혈청이 보충된 고 글루코스를 갖는 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM)(라이프 테크놀로지즈)에서 37℃ 및 5% CO2에서 성장시킨다. 트랜스펙션 후에, HeLa 세포를 추가 4시간 내지 72시간 동안 배양한 다음, 트랜스펙션된 세포로부터 전체 RNA를 트랜스펙션 후 1시간째 내지 20일째에 제조업체의 설명에 따라 페놀-기반의 RNA 단리 시약(라이프 테크놀로지즈)을 사용하여 단리하고, HDV 도메인을 인코딩하는 원형 RNA의 총량을 본원에 기술된 바와 같은 qPCR을 사용하여 결정하고, 대조군 원형 RNA와 비교할 것이다.
실시예 19: 원형 RNA 원형화
이 실시예는 스플린트 라이게이션을 사용한 원형 RNA의 시험관내 생성을 보여준다.
비-천연 발생 원형 RNA를 조작하여 하나 이상의 바람직한 특성을 포함시킬 수 있으며, 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성할 수 있다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 스플린트 라이게이션은 선형 RNA를 원형화시킨다.
circRNA1을 정지 코돈 없이 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(264개 뉴클레오티드). 이는 번역 개시를 위한 출발 코돈에 코작 서열(SEQ ID NO: 11)을 갖는다. cirRNA2는 그것이 종결 요소(삼중 정지 코돈)를 갖는 것을 제외하고 원형 RNA1과 동일한 서열을 갖는다(273개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 12). 원형 RNA3을 종결 요소(정지 코돈) 없이 스태거 요소(2A 서열, SEQ ID NO: 13)에 측접한 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(330개 뉴클레오티드). circRNA4는 그것이 종결 요소(삼중 정지 코돈)를 갖는 것을 제외하고, 원형 RNA3과 동일한 서열을 갖는다(339개 뉴클레오티드).
이 실시예에서, 원형 RNA를 하기와 같이 생성하였다. 시험관내 전사를 위한 DNA 주형을 역방향 프라이머를 사용하여 2-O-메틸화된 뉴클레오티드 및 T7 프로모터-보유 정방향 프라이머를 사용하여 상응하는 서열(IDT)을 갖는 gBlocks 유전자 단편으로부터 증폭시켰다. 증폭된 DNA 주형을 DNA 겔 정제 키트(퀴아젠)를 사용하여 겔-정제하였다. 250 내지 500 ng의 정제된 DNA 주형을 시험관내 전사로 처리하였다. 선형, 5'-단일 인산화된 시험관내 전사물을 7.5 mM GMP, 1.5 mM GTP, 7.5 mM UTP, 7.5 mM CTP 및 7.5 mM ATP의 존재 하에, 상응하는 서열을 갖는 각 DNA 주형으로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 생성하였다. 대략 40 ㎍의 선형 RNA가 각 반응에서 생성되었다. 인큐베이션 후에, 각 반응물을 DNase로 처리하여 DNA 주형을 제거하였다. 시험관내 전사된 RNA를 2.5 M 아세트산암모늄의 존재 하에 에탄올을 사용하여 침전시켜, 비혼입된 모노머를 제거하였다.
전사된 선형 RNA를 주형으로서 20개 뉴클레오티드 스플린트 DNA 올리고머(SEQ ID NO: 14)에서 T4 RNA 리가제 2를 사용하여 원형화시켰다. 스플린트 DNA를 선형 RNA 각각의 5' 또는 3' 말단의 10개 뉴클레오티드에 어닐링되도록 설계하였다. 스플린트 DNA(3 μM)와의 어닐링 후에, 1 μM 선형 RNA를 37℃ 또는 4시간째에 0.5 U/㎕ T4 RNA 리가제 2와 인큐베이션시켰다. T4 RNA 리가제 2가 없는 혼합물을 음성 대조군으로서 사용하였다.
선형 RNA의 원형화를 6% 변성 PAGE에서 RNA를 분리함으로써 모니터링하였다. 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 더 느리게 이동하는 RNA 밴드는 선형 RNA보다는 원형 RNA에 상응하며, 이는 그들의 원형 구조 때문이다. 도 13에 나타낸 바와 같이, RNA 혼합물로의 리가제의 첨가(+ 레인)는 리가제를 결여한 혼합물(- 레인)에 존재하는 선형 RNA 밴드 위에 나타나는 새로운 밴드를 생성하였다. 더 느리게 이동하는 밴드는 모든 RNA 혼합물에서 나타났으며, 이는 음성 대조군에 비하여 다수의 구축물에서 발생하는 성공적인 스플린트 라이게이션(예를 들어, 원형화)을 나타낸다.
실시예 20: RNA 원형화 효율
이 실시예는 RNA 스플린트 라이게이션의 원형화 효율을 보여준다.
하나 이상의 바람직한 특성을 포함하도록 조작된 비-천연 발생 원형 RNA는 스플린트 매개된 원형화를 사용하여 생성될 수 있다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 스플린트 라이게이션에 의해 대조군보다 더 높은 효율로 선형 RNA가 원형화되었다.
실시예 9에 기술된 바와 같은 CircRNA1, CircRNA2, CircRNA3 및 CircRNA4를 또한 여기서 사용하였다. CircRNA5를 2A 서열에 측접한 FLAG 태깅된 EGF에 이어서 FLAG 태깅된 나노 루시퍼라제를 인코딩하도록 설계하였다(873개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 17). CircRNA6은 그것이 EGF와 나노 루시퍼라제 유전자 사이에 종결 요소(삼중 정지 코돈)를 포함하고, 나노 루시퍼라제 서열의 말단에 종결 요소(삼중 정지 코돈)를 포함한 것을 제외하고 원형 RNA5와 동일한 서열을 갖는다(762개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 18).
본 실시예에서, RNA의 원형화 효율을 측정하기 위해, 6가지 상이한 크기의 선형 RNA(264개 뉴클레오티드, 273개 뉴클레오티드, 330개 뉴클레오티드, 339개 뉴클레오티드, 873개 뉴클레오티드 및 762개 뉴클레오티드)를 실시예 9에 기술된 바와 같이 생성하고 원형화시켰다. 원형 RNA를 6% 변성 PAGE에 의해 분리하고, 선형 또는 원형 RNA에 대한 겔 상의 상응하는 RNA 밴드를 정제를 위해 절개하였다. 절개된 RNA 겔 밴드를 분쇄하고, RNA를 800 ㎕의 300 mM NaCl을 사용하여 밤새 용리시켰다. 겔 잔해를 원심분리 필터에 의해 제거하였으며, RNA를 0.3 M 아세트산나트륨의 존재 하에 에탄올을 사용하여 침전시켰다.
원형화 효율을 하기와 같이 계산하였다. 용리된 원형 RNA의 양을 전체 용리된 RNA 양(원형 + 선형 RNA)으로 나누었으며, 결과는 도 14에 그래프로서 도시하였다.
T4 RNAse 리가제 2를 사용한 선형 RNA의 라이게이션에 의해, 대조군보다 더 높은 효율 비로 원형 RNA를 생성하였다. 트렌딩 데이터에 의해, 더 큰 구축물이 더 높은 비로 원형화되는 것으로 나타났으며, 예를 들어, 대략 800개 뉴클레오티드를 갖는 선형 RNA가 대략 80%의 원형화 효율을 갖는 것으로 나타난 한편, 대략 200 내지 400개 뉴클레오티드를 갖는 선형 RNA는 50% 내지 80%의 범위의 원형화 효율을 가졌다.
실시예 21: 분해 감수성을 결여한 원형 RNA
본 실시예는 RNAse R에 의한 분해에 대한 원형 RNA 감수성을 선형 RNA와 비교하여 보여준다.
원형 RNA는 5' 및 3' 말단의 결여로 인하여 선형 RNA보다 엑소뉴클레아제 분해에 대해 더욱 저항성이다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 그의 선형 RNA 대응물보다 분해에 대한 감수성이 더 낮았다.
본원에 기술된 검정에서 사용하기 위해 CircRNA5를 실시예 11에 기술된 바와 같이 생성하고 원형화시켰다.
CircRNA5의 원형화를 시험하기 위해, 20 ng/㎕의 선형 또는 CircRNA5를 2 U/㎕의 RNAse R, 선형 RNA를 분해하지만 올가미형 또는 원형 RNA 구조를 분해하지 않는 3'에서 5' 엑소리보뉴클레아제와 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 반응 혼합물을 6% 변성 PAGE에 의해 분석하였다.
엑소뉴클레아제를 결여한 레인에 존재하는 선형 RNA 밴드가 CircRNA5 레인에서 부재하였으며(도 15 참조), 이는 CircRNA5가 선형 RNA 대조군에 비하여 엑소뉴클레아제 처리에 대한 더 높은 저항성을 보였음을 나타낸다.
실시예 22: 원형 RNA의 단리 및 정제
본 실시예는 원형 RNA 정제를 보여준다.
특정 실시형태에서, 이전의 실시예에 기술된 바와 같이, 인코딩된 단백질 생성물의 발현 이전에 원형 RNA를 단리하고 정제할 수 있다. 본 실시예에는 UREA 겔 분리를 사용한 단리가 기술된다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA를 단리하고 정제하였다.
실시예 11에 기술된 바와 같은 CircRNA1, CircRNA2, CircRNA3, CircRNA4, CircRNA5 및 CircRNA6을 본원에 기술된 바와 같이 단리하였다.
이 실시예에서, 선형 및 원형 RNA를 기술된 바와 같이 생성하였다. 원형 RNA를 정제하기 위해, 라이게이션 혼합물을 6% 변성 PAGE에서 분리하고, 원형 RNA의 각각에 상응하는 RNA 밴드를 절개하였다. 절개된 RNA 겔 단편을 분쇄하고, RNA를 800 ㎕의 300 mM NaCl을 사용하여 밤새 용리시켰다. 겔 잔해를 원심분리 필터에 의해 제거하였으며, RNA를 0.3 M 아세트산나트륨의 존재 하에 에탄올을 사용하여 침전시켰다. 용리된 원형 RNA를 6% 변성 PAGE에 의해 분석하였으며, 도 16을 참조한다.
단일의 밴드를 다양한 크기를 갖는 원형 RNA에 대하여 PAGE에 의해 가시화시켰다.
실시예 23: 단백질 발현의 검출
이 실시예는 원형 RNA로부터의 시험관내 단백질 발현을 보여준다.
단백질 발현은 mRNA로부터 특정 단백질을 생성하는 과정이다. 이러한 과정은 메신저 RNA(mRNA)로의 DNA의 전사에 이어서, 폴리펩티드 쇄로의 mRNA의 번역을 포함하며, 이 폴리펩티드 쇄는 궁극적으로 기능성 단백질로 폴딩되며, 특정 하위세포 또는 세포외 위치에 표적화될 수 있다.
하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 단백질을 시험관내에서 원형 RNA 서열로부터 발현하였다.
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 2A 서열에 측접한 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(330개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 19).
선형 또는 원형 RNA를 25 ㎕의 부피에서 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물 중에 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 아미노산, 0.8 U/㎕ RNase 저해제 및 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 함유하였다. 인큐베이션 후에, 아세트산(0.32 ㎕) 및 물(300 ㎕)을 반응 혼합물(16 ㎕)에 첨가하고 15℃에서 10분 동안 20,817 xg에서 원심분리시킴으로써 헤모글로빈 단백질을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 30°l의 2x SDS 시료 완충제 중에 용해시키고, 70℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 ECL 키트로 가시화시켰으며(도 17 참조), 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
형광이 검출되었으며, 이는 발현 생성물이 존재하였음을 나타낸다. 따라서, 원형 RNA는 단백질의 발현을 유도하는 것으로 나타났다.
실시예 24: IRES-독립적 발현
이 실시예는 IRES의 부재 하에 발현을 유도하는 원형 RNA를 보여준다.
IRES 또는 내부 리보솜 진입 부위는 캡-독립적 방식으로 번역 개시를 가능하게 하는 RNA 요소이다. 원형 RNA는 IRES의 부재 하에 Flag 단백질의 발현을 유도하는 것으로 나타났다.
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 2A 서열에 측접한 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(330개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 19).
선형 또는 원형 RNA를 25 ㎕의 부피에서 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물 중에 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 아미노산, 0.8 U/㎕ RNase 저해제 및 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 포함하였다. 인큐베이션 후에, 아세트산(0.32 ㎕) 및 물(300 ㎕)을 반응 혼합물(16 ㎕)에 첨가하고 15℃에서 10분 동안 20,817 xg에서 원심분리시킴으로써 헤모글로빈 단백질을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 30°l의 2x SDS 시료 완충제 중에 용해시키고, 70℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 증강된 화학발광(ECL) 키트로 가시화시켰으며(도 18 참조), 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
발현 생성물은 심지어 IRES의 부재 하에서도 원형 RNA 반응 혼합물에서 검출되었다.
실시예 25: 캡-독립적 발현
이 실시예는 원형 RNA가 캡의 부재 하에 발현을 유도할 수 있음을 보여준다.
캡은 mRNA의 5' 말단 상의 특별히 변경된 뉴클레오티드이다. 5' 캡은 선형 mRNA의 안정성뿐만 아니라 번역 개시에 유용하다. 원형 RNA는 캡의 부재 하에 생성물의 발현을 유도하였다.
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 2A 서열에 측접한 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(330개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 19).
선형 또는 원형 RNA를 25 ㎕의 부피에서 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물 중에 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 아미노산, 0.8 U/㎕ RNase 저해제 및 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 포함하였다. 인큐베이션 후에, 아세트산(0.32 ㎕) 및 물(300 ㎕)을 반응 혼합물(16 ㎕)에 첨가하고 15℃에서 10분 동안 20,817 xg에서 원심분리시킴으로써 헤모글로빈 단백질을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 70℃에서 15분 동안 30 ㎕의 2x SDS 시료 완충제 중에 용해시켰다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 ECL 키트로 가시화시켰으며(도 17 참조), 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
발현 생성물은 심지어 캡의 부재 하에서도 원형 RNA 반응 혼합물에서 검출되었다.
실시예 26: 5'-UTR 없이 발현
이 실시예는 5' 비번역 영역을 결여한 원형 RNA로부터의 시험관내 단백질 발현을 보여준다.
5' 비번역 영역(5' UTR)은 RNA 전사물의 다운스트림 단백질 번역을 보조하는 개시 코돈의 바로 업스트림의 영역이다.
하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA 서열 내의 5'-비번역 영역은 시험관내 단백질 발현에 필요하지 않았다.
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 2A 서열에 측접한 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(330개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 19).
선형 또는 원형 RNA를 25 ㎕의 부피에서 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물 중에 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 아미노산, 0.8 U/㎕ RNase 저해제 및 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 포함하였다. 인큐베이션 후에, 아세트산(0.32 ㎕) 및 물(300 ㎕)을 반응 혼합물(16 ㎕)에 첨가하고 15℃에서 10분 동안 20,817 xg에서 원심분리시킴으로써 헤모글로빈 단백질을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 30°l의 2x SDS 시료 완충제 중에 용해시키고, 70℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 ECL 키트로 가시화시켰으며(도 17 참조), 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
발현 생성물은 심지어 5' UTR의 부재 하에서도 원형 RNA 반응 혼합물에서 검출되었다.
실시예 27: 3'-UTR 없이 발현
본 실시예는 3'-UTR을 결여한 원형 RNA로부터의 시험관내 단백질 발현을 보여준다.
3' 비번역 영역(3'-UTR)은 번역 종결 코돈의 바로 다운스트림 영역이며, 유전자 발현에 전사-후 영향을 미칠 수 있는 조절 영역을 포함한다. 3'-비번역 영역은 또한 mRNA의 국소화, 안정성, 유출 및 번역 효율에 영향을 미침으로써 유전자 발현에서 역할을 수행할 수 있다. 또한, 3'-UTR의 구조적 특징뿐만 아니라 대안적인 폴리아데닐화의 그의 이용은 유전자 발현에서 역할을 수행할 수 있다.
하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA 서열 내의 3'-UTR은 시험관내 단백질 발현에 필요하지 않았다.
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 2A 서열에 측접한 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(330개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 19).
선형 또는 원형 RNA를 25 ㎕의 부피에서 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물 중에 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 아미노산, 0.8 U/㎕ RNase 저해제 및 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 포함하였다. 인큐베이션 후에, 아세트산(0.32 ㎕) 및 물(300 ㎕)을 반응 혼합물(16 ㎕)에 첨가하고 15℃에서 10분 동안 20,817 xg에서 원심분리시킴으로써 헤모글로빈 단백질을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 30°l의 2x SDS 시료 완충제 중에 용해시키고, 70℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 ECL 키트로 가시화시켰으며(도 17 참조), 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
발현 생성물은 심지어 3' UTR의 부재 하에서도 원형 RNA 반응 혼합물에서 검출되었다.
실시예 28: 종결 코돈 없이 발현
본 실시예는 종결 코돈을 결여한 원형 RNA로부터의 회전환 번역 후의 폴리펩티드 생성물의 생성을 보여준다.
단백질은 독특한 아미노산의 서열로 구성된 폴리펩티드에 기초한다. 각 아미노산은 코돈으로 지칭되는 뉴클레오티드 트리플렛(triplet)에 의해 mRNA에서 인코딩된다. 단백질 번역 동안, mRNA 내의 각 코돈은 성장 중인 폴리펩티드 쇄 내의 아미노산의 부가에 해당한다. 종결 요소 또는 정지 코돈은 방출 인자의 결합에 의해 이 과정의 종결을 신호전달하며, 이는 리보솜 서브유닛을 분리시켜, 아미노산 쇄를 방출시킨다.
하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 종결 코돈을 결여한 원형 RNA는 회전환 번역을 통해 반복된 폴리펩티드 서열로 구성된 큰 폴리펩티드 생성물을 생성하였다.
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였으며(264개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 20), 번역 개시를 유리하게 하기 위해 출발 코돈에 코작 서열을 포함하였다.
선형 또는 원형 RNA를 25 ㎕의 부피에서 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물 중에 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 아미노산, 0.8 U/㎕ RNase 저해제 및 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 포함하였다. 인큐베이션 후에, 아세트산(0.32 ㎕) 및 물(300 ㎕)을 반응 혼합물(16 ㎕)에 첨가하고 15℃에서 10분 동안 20,817 xg에서 원심분리시킴으로써 헤모글로빈 단백질을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 30°l의 2x SDS 시료 완충제 중에 용해시키고, 70℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 ECL 키트로 가시화시켰으며(도 18 참조), 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
발현 생성물은 심지어 종결 코돈의 부재 하에서도 원형 RNA 반응 혼합물에서 검출되었다.
실시예 29: 종결 요소(정지 코돈) 없이 불연속 단백질의 발현
이 실시예는 종결 요소(정지 코돈)를 결여한 원형 RNA로부터 번역되는 불연속 단백질 생성물의 생성을 보여준다.
스태거 요소, 예컨대 2A 펩티드는 짧은 아미노산 서열, 약 20개 아미노산을 포함할 수 있으며, 이는 단일의 mRNA로부터 등몰 수준의 다수의 유전자의 생성을 가능하게 한다. 스태거 요소는 리보솜이 2A 요소의 C-말단에서 펩티드 결합의 합성을 생략하게 하여 2A 서열의 말단과 다음의 펩티드 다운스트림 사이의 분리를 야기함으로써 기능할 수 있다.?분리는 C-말단에서 관찰되는 글리신과 프롤린 잔기 사이에서 발생하며, 업스트림 시스트론은 말단에 부가되는 소수의 추가의 잔기를 갖는 한편, 다운스트림 시스트론은 프롤린으로 시작한다.
하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 종결 요소(정지 코돈)를 결여한 원형 RNA는 큰 폴리펩티드 폴리머를 생성하였으며(도 19 좌측 패널: 스태거 부재 - 원형 RNA 레인), 코딩 영역의 3' 말단에서의 2A 서열의 포함은 동등한 선형 RNA 구축물에 의해 생성되는 것과 유사한 크기로 불연속 단백질이 생성되게 하였다(도 19 우측 패널: 스태거 - 원형 RNA 레인).
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 그리고 스태거 요소 없이 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(264개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 20). 제2 원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 2A 서열에 측접한 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(330개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 19).
선형 또는 원형 RNA를 25 ㎕의 부피에서 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물 중에 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 아미노산, 0.8 U/㎕ RNase 저해제 및 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 포함하였다. 인큐베이션 후에, 아세트산(0.32 ㎕) 및 물(300 ㎕)을 반응 혼합물(16 ㎕)에 첨가하고 15℃에서 10분 동안 20,817 xg에서 원심분리시킴으로써 헤모글로빈 단백질을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 30°l의 2x SDS 시료 완충제 중에 용해시키고, 70℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 ECL 키트로 가시화시켰으며(도 19 참조), 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
불연속 발현 생성물을 검출하였으며, 이는 스태거 요소를 포함하는 원형 RNA가 심지어 종결 요소(정지 코돈)의 부재 하에서도 개별 단백질의 발현을 유도하였음을 나타낸다.
실시예 30: 회전환 번역
이 실시예는 스태거 요소를 사용하여 원형 RNA로부터 단백질의 상승된 시험관내 생합성을 보여준다.
비-천연 발생 원형 RNA가 스태거 요소를 포함하도록 조작하여, 스태거 요소를 결여한 원형 RNA와 단백질 발현을 비교하였다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 스태거 요소는 이러한 서열을 결여한 다른 동일한 원형 RNA와 비교하여 단백질을 과발현시켰다.
원형 RNA를 종결 요소(예를 들어, 탠덤으로 3개의 정지 코돈)를 갖는 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(273개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 21). 제2 원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 2A 서열에 측접한 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(330개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 19).
선형 또는 원형 RNA를 25 ㎕의 부피에서 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물 중에 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 아미노산, 0.8 U/㎕ RNase 저해제 및 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 함유하였다. 인큐베이션 후에, 아세트산(0.32 ㎕) 및 물(300 ㎕)을 반응 혼합물(16 ㎕)에 첨가하고 15℃에서 10분 동안 20,817 xg에서 원심분리시킴으로써 헤모글로빈 단백질을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 30°l의 2x SDS 시료 완충제 중에 용해시키고, 70℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 ECL 키트로 가시화시켰으며(도 20 참조), 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
불연속 발현 생성물을 검출하였으며, 이는 스태거 요소를 포함하는 원형 RNA가 심지어 종결 요소(정지 코돈)의 부재 하에서도 개별 단백질의 발현을 유도하였음을 나타낸다.
실시예 31: 시험관내에서의 생물학적 활성 단백질의 발현
이 실시예는 원형 RNA로부터의 생물학적 활성 단백질의 시험관내 생합성을 보여준다.
비-천연 발생 원형 RNA를 생물학적 활성 치료적 단백질을 발현하도록 조작하였다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 생물학적 활성 단백질을 망상적혈구 용해물 중 원형 RNA로부터 발현시켰다.
원형 RNA를 2A 서열이 측부 배치된 FLAG 태깅된 EGF에 이어서 FLAG 태깅된 나노-루시퍼라제를 인코딩하도록 설계하였다(873개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 17).
선형 또는 원형 RNA를 25 ㎕의 부피에서 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물 중에 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 아미노산, 0.8 U/㎕ RNase 저해제를 함유하였다. 번역 혼합물 중 루시퍼라제 활성을 제조업체의 프로토콜(프로메가)에 따라 루시퍼라제 검정 시스템을 사용하여 모니터링하였다.
도 21에 나타낸 바와 같이, 대조군 비히클 RNA보다 원형 RNA 및 선형 RNA 둘 모두에서 훨씬 더 큰 형광이 검출되었으며, 이는 발현 생성물이 존재하였음을 나타낸다. 따라서, 원형 RNA는 생물학적 활성 단백질을 발현하는 것으로 나타났다.
실시예 32: 선형 RNA 대응물보다 더 긴 반감기를 갖는 원형 RNA
이 실시예는 선형 RNA에 비하여 연장된 반감기를 갖도록 조작된 원형 RNA를 보여준다.
치료적 단백질을 인코딩하는 원형 RNA는 예를 들어, 선형 RNA와 비교하여, 연장된 생물학적 반감기로부터 기인한 더 높은 수준의 인코딩된 단백질을 생성하는 능력을 갖는 수여자 세포를 제공하였다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 망상적혈구 용해물에서 그의 선형 RNA 대응물보다 더 큰 반감기를 가졌다.
원형 RNA를 2A 서열에 측접한 FLAG 태깅된 EGF에 이어서 FLAG 태깅된 나노 루시퍼라제를 인코딩하도록 설계하였다(873개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 17).
이 실시예에서, 시간-추이 실험을 수행하여 RNA 안정성을 모니터링하였다. 100 ng의 선형 또는 원형 RNA를 토끼 망상적혈구 용해물과 인큐베이션시켰으며, 시료를 1시간째, 5시간째, 18시간째 및 30시간째에 수집하였다. 전체 RNA를 페놀-기반의 시약(인비트로겐)을 사용하여 용해물로부터 단리하였으며, cDNA를 역전사에 의해 생성하였다. qRT-PCR 분석을 염료-기반의 정량적 PCR 반응 믹스(바이오라드)를 사용하여 수행하였다.
도 22에 나타낸 바와 같이, 선형 RNA보다 더 높은 농도의 원형 RNA가 나중의 시점에 검출되었다. 따라서, 원형 RNA는 그의 선형 대응물에 비하여 더욱 안정하거나, 증가된 반감기를 가졌다.
실시예 33: 원형 RNA는 세포에서 선형 RNA보다 더 긴 반감기를 보였다
이 실시예는 원형 RNA가 세포 내로 전달되며, 선형 RNA와 비교하여 세포에서 증가된 반감기를 갖는 것을 보여준다.
비-천연 발생 원형 RNA를 생물학적 활성 치료적 단백질을 발현하도록 조작하였다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 그의 선형 RNA 대응물에 비하여 더 높은 수준으로 존재하였으며, 이는 원형 RNA에 대해 더 긴 반감기를 나타낸다.
이 실시예에서, 원형 RNA 및 선형 RNA를 코작, 2A에 측접한 EGF, 정지 서열 또는 정지 부재 서열(no stop sequence)을 인코딩하도록 설계하였다(SEQ ID NO: 11, 19, 20, 21). 세포에서 RNA의 반감기를 모니터링하기 위해, 0.1x106개 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 상으로 플레이팅하였다. 1일 후에, 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 24시간째에, 전체 RNA를 페놀-기반의 추출 시약(인비트로겐)을 사용하여 세포로부터 단리하였다. 전체 RNA(500 ng)를 역전사 처리하여, cDNA를 생성하였다. qRT-PCR 분석을 염료-기반의 정량적 PCR 믹스(바이오라드)를 사용하여 수행하였다. 프라이머 서열은 하기와 같았다: 선형 또는 원형 RNA에 대한 프라이머, F: ACGACGGTGTGTGCATGTAT, R: TTCCCACCACTTCAGGTCTC; 원형 RNA에 대한 프라이머, F: TACGCCTGCAACTGTGTTGT, R: TCGATGATCTTGTCGTCGTC.
원형 RNA를 그의 선형 대응물과 마찬가지로 293T 세포 내로 성공적으로 트랜스펙션시켰다. 24시간 후에, 유지된 원형 및 선형 RNA를 qPCR을 사용하여 측정하였다. 도 23a 및 도 23b에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA가 선형 RNA에 비하여 세포에서 더 긴 반감기를 갖는 것으로 나타났다.
실시예 34: 합성 원형 RNA는 세포에서 번역되었으며, 합성 원형 RNA는 회전환 번역을 통해 번역되었다
본 실시예는 세포에서의 합성 원형 RNA의 번역을 보여준다.
하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA 및 선형 RNA를 종결 요소 없이, 코작, 3xFLAG-EGF 서열을 인코딩하도록 설계하였다(SEQ ID NO: 11). 원형 RNA는 폴리머 EGF로 번역된 한편, 선형 RNA는 그렇지 않았으며, 이는 세포가 합성 원형 RNA의 회전환 번역을 수행하였음을 보여준다.
이 실시예에서, 세포에서 선형 또는 원형 RNA의 번역 효율을 모니터링하기 위해, 0.1x106개 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 상으로 플레이팅하였다. 1일 후에, 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 24시간째에, 200 ㎕의 RIPA 완충제를 각 웰 상에 첨가함으로써 세포를 수집하였다. 다음으로, 10 ㎍의 세포 용해물 단백질을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔 상에서 분석하였다. 건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 로딩 대조군으로서, 항-베타 튜불린 항체를 사용하였다. 블롯을 증강된 화학발광(ECL) 키트로 가시화시켰다. 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
원형 RNA를 그의 선형 대응물과 마찬가지로 293T 세포 내로 성공적으로 트랜스펙션시켰다. 그러나, 도 24는 트랜스펙션 24시간 후에, EGF 단백질이 원형 RNA 트랜스펙션된 세포에서 검출된 한편, 선형 RNA 트랜스펙션된 세포에서는 어느 것도 검출되지 않았음을 보여준다. 따라서, 원형 RNA는 세포에서 선형 RNA와 비교하여 회전환 번역을 통해 번역되었다.
실시예 35: 합성 원형 RNA는 세포에서 감소된 면역원성 유전자 발현을 보여준다
본 실시예는 선형 RNA에 비하여 감소된 면역원성을 갖도록 조작된 원형 RNA를 보여준다.
치료적 단백질을 인코딩하는 원형 RNA는 선형 RNA와 비교하여, 수여자 세포에서 면역원성 관련 유전자(RIG-I, MDA5, PKA 및 IFN-베타)의 유도 감소를 제공하였다. RIG-I는 짧은 5' 트리포스페이트 비캡핑된 이중 가닥 또는 단일 가닥 RNA를 인식할 수 있는 한편, MDA5는 더 긴 dsRNA를 인식할 수 있다. RIG-I 및 MDA5는 둘 모두 MAVS의 활성화 및 항바이러스 반응의 촉발에 관여할 수 있다. PKR은 dsRNA에 의해 활성화되고, 인터페론, 예컨대 IFN-베타에 의해 유도될 수 있다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, q-PCR에 의한 RIG-I, MDA5, PKR 및 IFN-베타의 발현에 의해 평가하여, 원형 RNA는 293T 세포에서 유사한 선형 RNA보다 면역 관련 유전자의 활성화를 감소시킨 것으로 나타났다.
원형 RNA 및 선형 RNA가 (1) 종결 요소 없이 코작, 3xFLAG-EGF 서열(SEQ ID NO: 11); (2) 코작, 종결 요소(정지 코돈)에 측접한 3xFLAG-EGF(SEQ ID NO: 21); (3) 코작, 2A 서열에 측접한 3xFLAG-EGF(SEQ ID NO: 19); 또는 (4) 코작, 2A 서열에 측접한 3xFLAG-EGF 서열에 이어서 종결 요소(정지 코돈)(SEQ ID NO: 20)를 인코딩하도록 설계하였다.
이 실시예에서, 0.1x106개 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 내로 플레이팅함으로써 선천적 면역 반응 유전자의 수준을 세포에서 모니터링하였다. 1일 후에, 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 24시간째에, 전체 RNA를 페놀-기반의 추출 시약(인비트로겐)을 사용하여 세포로부터 단리하였다. 전체 RNA(500 ng)를 역전사 처리하여, cDNA를 생성하였다. qRT-PCR 분석을 염료-기반의 정량적 PCR 믹스(바이오라드)를 사용하여 수행하였다.
사용되는 프라이머 서열: GAPDH를 위한 프라이머, F: AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT, R: CCCCACTTGATTTTGGAGGGA; RIG-I, F: TGTGGGCAATGTCATCAAAA, R: GAAGCACTTGCTACCTCTTGC; MDA5, F: GGCACCATGGGAAGTGATT, R: ATTTGGTAAGGCCTGAGCTG; PKR, F: TCGCTGGTATCACTCGTCTG, R: GATTCTGAAGACCGCCAGAG; IFN-베타, F: CTCTCCTGTTGTGCTTCTCC, R: GTCAAAGTTCATCCTGTCCTTG.
도 25에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA로 트랜스펙션시킨 293T 세포로부터의 면역 관련 유전자의 qRT-PCR 수준은 선형 RNA 트랜스펙션된 세포에 비하여 RIG-I, MDA5, PKR 및 IFN-베타의 감소를 보였다. 따라서, 수여자 세포 내의 면역원성 관련 유전자의 유도는 선형 RNA 트랜스펙션된 세포에 비하여 원형 RNA 트랜스펙션된 세포에서 감소하였다.
실시예 36: 세포에서 회전환 번역을 통한 합성 원형 RNA로부터의 발현 증가
이 실시예는 세포에서 합성 원형 RNA의 회전환 번역으로부터의 발현 증가를 보여준다.
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 나노루시퍼라제 유전자 또는 EGF 음성 대조군 유전자와 함께 IRES를 포함하도록 설계하였다. 세포를 EGF 음성 대조군(SEQ ID NO: 22); nLUC 정지(SEQ ID NO: 23): EMCV IRES, 스태거 서열(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLUC 서열, 스태거 서열(2A 서열) 및 정지 코돈; 또는 nLUC 스태거(SEQ ID NO: 24): EMCV IRES, 스태거 서열(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLUC 서열 및 스태거 서열(2A 서열)로 트랜스펙션시켰다. 도 26에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA 둘 모두는 기능성 루시퍼라제 활성을 갖는 번역 생성물을 생성하였다.
이 실시예에서, 원형 RNA의 번역을 세포에서 모니터링하였다. 구체적으로, 0.1x106개 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 상으로 플레이팅하였다. 1일 후에, 300 ng의 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시켰다. 24시간 후에, 100 ㎕의 RIPA 완충제를 첨가함으로써 세포를 수집하였다. 용해물 중 나노루시퍼라제 활성을 그의 제조업체의 프로토콜(프로메가)에 따라 루시퍼라제 검정 시스템을 사용하여 측정하였다.
도 26에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA 둘 모두는 세포에서 단백질을 발현하였다. 그러나, 종결 요소(정지 코돈)를 결여한 스태거 요소, 예를 들어, 2A 서열을 갖는 원형 RNA는 종결 요소(정지 코돈)를 갖는 원형 RNA보다 더 높은 수준의, 기능성 루시퍼라제 활성을 갖는 단백질 생성물을 생성하였다.
실시예 37: 세포에서 번역되는 합성 원형 RNA
이 실시예는 세포 내의 합성 원형 RNA 번역을 보여준다. 또한, 이 실시예는 원형 RNA가 그의 선형 대응물보다 더 많은 발현 생성물을 생성하였음을 보여준다.
원형 RNA를 그의 선형 대응물과 마찬가지로 293T 세포 내로 성공적으로 트랜스펙션시켰다. 세포를 음성 대조군으로서 EGF를 인코딩하는 원형 RNA(SEQ ID NO: 22): EMCV IRES, 스태거 서열(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 EGF 서열, 스태거 서열(2A 서열); 선형 또는 원형 nLUC(SEQ ID NO: 23): EMCV IRES, 스태거 서열(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLuc 서열, 스태거 서열(2A 서열) 및 정지 코돈으로 트랜스펙션시켰다. 도 27에 나타난 바와 같이, 원형 RNA는 세포에서 나노루시퍼라제로 번역되었다.
선형 또는 원형 RNA 번역을 세포에서 모니터링하였다. 구체적으로, 0.1x106개 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 상으로 플레이팅하였다. 1일 후에, 300 ng의 선형 또는 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시켰다. 24시간 후에, 100 ㎕의 RIPA 완충제를 첨가함으로써 세포를 수집하였다. 용해물 중 나노루시퍼라제 활성을 그의 제조업체의 프로토콜(프로메가)에 따라 루시퍼라제 검정 시스템을 사용하여 측정하였다.
도 27에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA 번역 생성물이 세포에서 검출되었다. 특히, 원형 RNA는 그의 선형 RNA 대응물에 비하여 더 높은 수준의 루시퍼라제 활성 또는 증가된 단백질 생성을 가졌다.
실시예 38: 합성 원형 RNA로부터의 회전환 번역에 의해 세포에서 기능성 단백질 생성물이 생성된다
이 실시예는 세포에서, 예를 들어, 종결 요소(정지 코돈)를 결여한 스태거 요소를 갖는, 종결 요소(정지 코돈)를 결여한 합성 원형 RNA로부터의 기능성 단백질 생성물의 회전환 번역을 보여준다. 또한, 이 실시예는 스태거 요소를 갖는 원형 RNA가 그의 선형 대응물보다 더 많은 기능성 단백질 생성물을 발현하였음을 보여준다.
원형 RNA를 그의 선형 대응물과 마찬가지로 293T 세포 내로 성공적으로 트랜스펙션시켰다. 세포를 원형 RNA EGF 음성 대조군(SEQ ID NO: 22); 선형 및 원형 nLUC(SEQ ID NO: 24): EMCV IRES, 스태거 서열(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLuc 서열, 스태거 서열(2A 서열)로 트랜스펙션시켰다. 도 28에 나타난 바와 같이, 원형 RNA는 세포에서 나노루시퍼라제로 번역되었다.
선형 또는 원형 RNA 번역을 세포에서 모니터링하였다. 구체적으로, 0.1x106개 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 상으로 플레이팅하였다. 1일 후에, 300 ng의 선형 또는 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시켰다. 24시간 후에, 100 ㎕의 RIPA 완충제를 첨가함으로써 세포를 수집하였다. 용해물 중 나노루시퍼라제 활성을 그의 제조업체의 프로토콜(프로메가)에 따라 루시퍼라제 검정 시스템을 사용하여 측정하였다.
도 28에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA 번역 생성물이 세포에서 검출되었다. 특히, 종결 요소(정지 코돈)가 없는 원형 RNA는 그의 선형 RNA 대응물보다 더 높은 수준의, 기능성 루시퍼라제 활성을 갖는 단백질 생성물을 생성하였다.
실시예 39: 세포 내에서 IRES 개시를 통해 번역되는 합성 원형 RNA
이 실시예는 세포에서 IRES를 사용한 합성 원형 RNA 번역 개시를 보여준다.
원형 RNA를 나노루시퍼라제 유전자 또는 EGF 음성 대조군 유전자와 함께 코작 서열 또는 IRES를 포함하도록 설계하였다. 세포를 EGF 음성 대조군(SEQ ID NO: 22), nLUC 코작(SEQ ID NO: 25): 코작 서열, 1x FLAG 태깅된 EGF 서열, 스태거 서열(T2A 서열), 1x FLAG 태깅된 nLUC, 스태거 서열(P2A 서열) 및 정지 코돈; 또는 nLUC IRES(SEQ ID NO: 23): EMCV IRES, 스태거 서열(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLUC 서열, 스태거 서열(2A 서열) 및 정지 코돈으로 트랜스펙션시켰다. 도 29에 나타낸 바와 같이, IRES를 갖는 원형 RNA는 코작 서열을 갖는 원형 RNA에 비하여, 더 높은 단백질 수준에 상응하는 더 높은 수준의 루시퍼라제 활성을 보였다.
이 실시예에서, 원형 RNA의 번역을 세포에서 모니터링하였다. 구체적으로, 0.1x106개 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 상으로 플레이팅하였다. 1일 후에, 300 ng의 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시켰다. 24시간 후에, 100 ㎕의 RIPA 완충제를 첨가함으로써 세포를 수집하였다. 용해물 중 나노루시퍼라제 활성을 그의 제조업체의 프로토콜(프로메가)에 따라 루시퍼라제 검정 시스템을 사용하여 측정하였다.
도 29에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 IRES를 사용하여 단백질 발현을 개시하였으며, 코작 개시된 단백질 발현을 갖는 원형 RNA보다 더 높은 수준의, 기능성 루시퍼라제 활성을 갖는 단백질 생성물을 생성하였다.
실시예 40: 세포 내에서의 합성 원형 RNA의 회전환 번역
이 실시예는 IRES를 사용하여 단백질 생성을 개시하는 세포에서의 합성 원형 RNA의 회전환 번역을 통한 더 큰 단백질 생성을 보여준다.
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈)와 함께 또는 이것 없이 나노루시퍼라제 유전자 또는 EGF 음성 대조군과 함께 코작 서열 또는 IRES를 포함하도록 설계하였다. 세포를 EGF 음성 대조군(SEQ ID NO: 22); nLUC IRES 정지(SEQ ID NO: 23): EMCV IRES, 스태거 서열(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLUC 서열, 스태거 서열(2A 서열) 및 정지 코돈; 또는 nLUC IRES 스태거(SEQ ID NO: 24): EMCV IRES, 스태거 서열(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLUC 서열 및 스태거 서열(2A 서열)로 트랜스펙션시켰다. 도 30에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 둘 모두 발현 생성물을 생성하였고, 이는 회전환 번역을 보여주며, 종결 요소 부재의 원형 RNA에서 IRES(예를 들어, 코작 서열 부재)는 IRES 없이(예를 들어, 코작 서열 존재) 종결 요소를 갖는 원형 RNA보다 더 높은 수준의, 기능성 루시퍼라제 활성을 갖는 단백질 생성물을 개시하고 생성하였으며, 이는 회전환 번역을 나타낸다.
이 실시예에서, 원형 RNA의 번역을 세포에서 모니터링하였다. 구체적으로, 0.1x106개 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 상으로 플레이팅하였다. 1일 후에, 300 ng의 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시켰다. 24시간 후에, 100 ㎕의 RIPA 완충제를 첨가함으로써 세포를 수집하였다. 용해물 중 나노루시퍼라제 활성을 그의 제조업체의 프로토콜(프로메가)에 따라 루시퍼라제 검정 시스템을 사용하여 측정하였다.
도 30에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 세포 내에서 원형 RNA 둘 모두로부터 제공되는 회전환 방법을 통해 단백질로 번역되었다. 그러나, 원형 RNA는 종결 요소(정지 코돈)를 결여하였다. 그러나, 원형 RNA의 회전환 번역은 종결 요소 코작 번역 개시를 갖는 원형 RNA에 비하여, IRES를 사용하여 더 큰 단백질 생성을 개시하고, 기능성 루시퍼라제 활성을 갖는 단백질 생성물을 더 많이 생성하였다.
실시예 41: 원형 RNA로부터 발현되는 증가된 단백질
이 실시예는 세포 내의 합성 원형 RNA 번역을 보여준다. 또한, 이본 실시예는 원형 RNA가 그의 선형 대응물보다 더 많은, 정확한 분자량의 발현 생성물을 생성하였음을 보여준다.
선형 및 원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈)를 갖는 나노루시퍼라제 유전자를 포함하도록 설계하였다. 세포를 비히클: 트랜스펙션 시약만; 선형 nLUC(SEQ ID NO: 23): EMCV IRES, 스태거 요소(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLuc 서열, 스태거 요소(2A 서열) 및 종결 요소(정지 코돈); 또는 원형 nLUC(SEQ ID NO: 23): EMCV IRES, 스태거 요소(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLuc 서열, 스태거 요소(2A 서열) 및 종결 요소(정지 코돈)로 트랜스펙션시켰다. 도 31에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 선형 RNA에 비하여, 정확한 분자량을 갖는 더 높은 수준의 단백질을 생성하였다.
24시간 후에, 100 ㎕의 RIPA 완충제를 첨가함으로써 세포를 수집하였다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 ECL 키트로 가시화시켰으며, 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
도 31에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 세포 내에서 단백질로 번역되었다. 특히, 원형 RNA는 그의 선형 RNA 대응물에 비하여 더 높은 수준의, 정확한 분자량을 갖는 단백질을 생성하였다.
실시예 42: 합성 원형 RNA의 회전환 번역에 의해, 세포 내에서 불연속 단백질 생성물이 생성된다
이 실시예는 불연속 단백질 생성물이 세포에서 예를 들어, 종결 요소(정지 코돈) 대신에 스태거 요소를 갖는, 종결 요소(정지 코돈)를 결여한 합성 원형 RNA로부터 회전환 번역을 통해 번역되었음을 보여준다. 또한, 이 실시예는 스태거 요소를 갖는 원형 RNA가 그의 선형 대응물보다 더 많은, 정확한 분자량을 갖는 단백질 생성물을 발현하였음을 보여준다.
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 대신에 스태거 요소를 갖는 나노루시퍼라제 유전자를 포함하도록 설계하였다. 세포를 비히클: 트랜스펙션 시약만; 선형 nLUC(SEQ ID NO: 24): EMCV IRES, 스태거 요소(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLuc 서열 및 스태거 요소(2A 서열); 또는 원형 nLUC(SEQ ID NO: 24): EMCV IRES, 스태거 요소(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLuc 서열 및 스태거 요소(2A 서열)로 트랜스펙션시켰다. 도 32에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 선형 RNA에 비하여, 정확한 분자량을 갖는 더 높은 수준의 단백질을 생성하였다.
24시간 후에, 100 ㎕의 RIPA 완충제를 첨가함으로써 세포를 수집하였다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 ECL 키트로 가시화시켰으며, 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
도 32에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA 번역 생성물이 세포에서 검출되었다. 특히, 종결 요소(정지 코돈)가 없는 원형 RNA는 그의 선형 RNA 대응물보다 더 높은 수준의, 정확한 분자량을 갖는 불연속 단백질 생성물을 생성하였다.
실시예 43: 준-이중 가닥, 나선 구조를 갖는 원형 RNA의 제조
이 실시예는 원형 RNA가 준-이중 가닥 및 나선 구조 둘 모두를 지니는 것을 보여준다.
비-천연 발생 원형 RNA를 준-이중 가닥, 나선 구조를 채용하도록 조작하였다. 유사한 구조는 독특하게 긴 생체내 반감기를 지닌 천연 발생 원형 RNA의 축합에 관여하는 것으로 나타났다(문헌[Griffin et al 2014, J Virol. 2014 Jul;88(13):7402-11. doi: 10.1128/JVI.00443-14], 문헌[Guedj et al, Hepatology. 2014 Dec;60(6):1902-10. doi: 10.1002/hep.27357]).
본 실시예에서, 원형 RNA를 EMCV IRES, ORF로서 3XFLAG로 태깅된 Nluc, 및 스태거 서열(EMCV 2A 3XFLAG Nluc 2A no stop)을 인코딩하도록 설계하였다. RNA 이차 구조를 평가하기 위해, 열역학적 RNA 구조 예측 툴(RNAfold)을 사용하였다(Vienna RNA). 또한, RNA 삼차 구조를 RNA 모델링 알고리즘을 사용하여 분석하였다.
도 33 및 도 34에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 채용된 준-이중 가닥, 나선 구조를 갖도록 모델링된다.
실시예 44: 반복 서열과 연결된 준-나선 구조를 갖는 원형 RNA의 제조
이 실시예는 원형 RNA가 반복 서열과 연결된 준-나선 구조를 지니도록 설계될 수 있음을 보여준다.
비-천연 발생 원형 RNA를 반복 서열과 연결된 준-나선 구조를 채용하도록 조작하였다. 유사한 구조는 독특하게 긴 생체내 반감기를 지닌 천연 발생 원형 RNA의 축합에 관여하는 것으로 나타났다(문헌[Griffin et al 2014], 문헌[Guedj et al 2014]).
이 실시예에서, 원형 RNA가 EMCV IRES, Nluc, 및 반복 서열을 포함하는 스페이서를 인코딩하도록 설계하였다(SEQ ID NO: 26). RNA 삼차 구조를 평가하기 위해, RNA 모델링 알고리즘을 사용하였다.
도 35에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 준-나선 구조를 채용하도록 모델링된다.
실시예 45: 원형화된 RNA는 원형이며 콘카테머가 아니다
본 실시예는 RNAse H에 의한 원형 RNA 분해에 의해, 원형이며 콘카테머가 아닌 RNA와 일치하는 핵산 분해 생성물이 생성되는 것을 보여준다.
RNA는 리가제와 인큐베이션시키는 경우, 반응하지 않거나, 분자내- 또는 분자간 결합을 형성하여, 각각 원형(자유 말단 부재) 또는 콘카테머 RNA를 생성할 수 있다. 상보성 DNA 프라이머 및 DNA/RNA 듀플렉스를 인식하는 비특이적인 엔도뉴클레아제인 RNAse H를 사용한 각각의 유형의 RNA의 처리는 시작 RNA 물질에 따라 독특한 수의 특정 크기의 분해 생성물을 생성하는 것으로 예상된다.
하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 라이게이션된 RNA는 RNAse H 분해에 의해 생성되는 RNA의 수와 크기에 기초하여, 원형이며 콘카테머가 아닌 것으로 나타났다.
EMCV T2A 3XFLAG-Nluc P2A를 함유하는 원형 RNA 및 선형 RNA를 생성하였다.
RNA(1299개 뉴클레오티드)의 원형화 상태를 시험하기 위해, 0.05 pmole/㎕의 선형 또는 원형 RNA를 37℃에서 20분 동안 0.25 U/㎕의 RNAse H, DNA/RNA 듀플렉스를 분해하는 엔도리보뉴클레아제, 및 1037개 뉴클레오티드 내지 1046개 뉴클레오티드의 RNA에 대한 0.3 pmole/㎕의 올리고머(CACCGCTCAGGACAATCCTT, SEQ ID NO: 55)와 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 반응 혼합물을 6% 변성 PAGE에 의해 분석하였다.
상기 기술된 바와 같이 사용된 선형 RNA에 있어서, DNA 프라이머의 결합, 및 RNAse H에 의한 후속하는 절단 후에 1041개 뉴클레오티드 및 258개 뉴클레오티드의 2가지 절단 생성물이 수득되는 것으로 예상된다. 콘카테머는 258개 뉴클레오티드, 1041개 뉴클레오티드 및 1299개 뉴클레오티드의 3가지 절단 생성물을 생성하는 것으로 예상된다. 원형은 단일의 1299개 뉴클레오티드 절단 생성물을 생성하는 것으로 예상된다.
RNAse 엔도뉴클레아제와 인큐베이션시킨 선형 RNA 레인 내의 밴드의 수는 예상되는 바와 같이 1041개 뉴클레오티드 및 258개 뉴클레오티드의 2개의 밴드를 생성한 반면, 1299개 뉴클레오티드의 단일의 밴드가 원형 RNA 레인에서 생성되었으며(도 36 참조), 이는 원형 RNA가 사실상 원형이며 콘카테머가 아님을 나타낸다.
실시예 46: 대형 circRNA의 제조
이 실시예는 약 20개 염기 내지 약 6.2 Kb 범위의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성을 보여준다.
하나 이상의 바람직한 특성을 포함하도록 조작된 비-천연 발생 원형 RNA를 요망되는 기능에 따라 다양한 크기로 생성하였다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 최대 6200개 뉴클레오티드의 선형 RNA를 원형화시켰다.
플라스미드 pCDNA3.1/CAT(6.2 kb)를 여기서 사용하였다. 500개 뉴클레오티드, 1000개 뉴클레오티드, 2000개 뉴클레오티드, 4000개 뉴클레오티드, 5000개 뉴클레오티드 및 6200개 뉴클레오티드에 상응하는 DNA 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위해 규칙적인 간격으로 pCDNA3.1/CAT에 어닐링하도록 프라이머를 설계하였다. 표기된 DNA 올리고뉴클레오티드의 시험관내 전사를 수행하여, 상응하는 크기의 선형 RNA를 생성하였다. 스플린트 DNA를 사용하여 이들 RNA 올리고뉴클레오티드로부터 원형 RNA를 생성하였다.
RNA의 원형화 효율을 측정하기 위해, 6가지의 상이한 크기의 선형 RNA(500개 뉴클레오티드, 1000개 뉴클레오티드, 2000개 뉴클레오티드, 4000개 뉴클레오티드, 5000개 뉴클레오티드 및 6200개 뉴클레오티드)를 생성하였다. 이들을 DNA 스플린트 및 T4 DNA 리가제 2를 사용하여 원형화시켰다. 대조군으로서, 하나의 반응을 T4 RNA 리가제 없이 수행하였다. 원형화된 시료의 절반을 RNAse R로 처리하여, 선형 RNA를 제거하였다.
원형화 효율을 모니터링하기 위해, 각 시료를 qPCR을 사용하여 분석하였다. 도 37에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA를 매우 다양한 상이한 길이의 DNA로부터 생성하였다. 도 38에 나타낸 바와 같이, RNA의 원형화를 RNAse R 처리, 및 원형 연접부에 대한 qPCR 분석을 사용하여 확인하였다. 이 실시예는 다양한 길이에 대한 원형 RNA 생성을 보여준다.
실시예 47: 단백질 결합 부위를 갖도록 조작된 원형 RNA
이 실시예는 단백질 결합 부위를 갖는 원형 RNA의 생성을 보여준다.
이 실시예에서, CVB3 IRES(SEQ ID NO: 56) 및 가우시아 루시퍼라제(Gluc)를 인코딩하는 ORF(SEQ ID NO: 57)에 이어서 적어도 하나의 단백질 결합 부위를 포함하도록 하나의 원형 RNA를 설계한다. 구체적인 예에 있어서, 신드비스 바이러스 3'UTR로부터의 HuR 결합 서열(SEQ ID NO: 52)을 사용하여 원형 RNA 면역원성에 대한 단백질 결합의 영향을 시험한다. HuR 결합 서열은 2가지 요소, URE(U-풍부 요소; SEQ ID NO: 50) 및 CSE(보존된 서열 요소; SEQ ID NO: 51)를 포함한다. HuR 결합 서열이 없는 또는 URE가 있는 원형 RNA를 대조군으로서 사용한다. 아나바에나(Anabaena) 자가촉매작용 인트론 및 엑손 서열의 부분은 CVB3 IRES(SEQ ID NO: 56) 이전에 위치된다. 원형 RNA는 기술된 바와 같이 시험관내에서 생성된다. 도 39에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 HuR 결합 부위를 함유하도록 생성되었다.
원형 RNA 면역원성에 대한 RNA 결합 단백질의 영향을 모니터링하기 위해, 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰 내로 플레이팅한다. 1일 후에, 500 ng의 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시킨다. 번역 효율/RNA 안정성/면역원성을 매일, 72시간까지 모니터링한다. 배지를 수집하여, Gluc 활성을 모니터링한다. RNA 수준을 측정하기 위한 세포 용해물을 리얼-타임 RT-PCR(인비트로겐)에 의해 상대적 유전자 발현의 측정을 가능하게 하는 키트를 사용하여 제조한다.
번역 효율을 제조업체의 설명(피어스(Pierce))에 따라 가우시아 루시퍼라제 플래시 검정 키트를 사용하여 Gluc 활성을 측정함으로써 모니터링한다.
qRT-PCR 분석을 위해, cDNA를 제조업체의 설명(인비트로겐)에 따라 세포 용해물 제조 키트를 사용하여 생성한다. qRT-PCR 분석을 PCR 마스터 믹스(브릴리언트 II SYBR 그린 qRT-PCR 마스터 믹스) 및 PCR 사이클러(라이트사이클러 480)를 사용하여 3벌로 수행한다. 원형 RNA 안정성을 Nluc에 대한 프라이머에 의해 측정한다. 널리 알려져 있는 선천적 면역성 조절자, 예컨대 RIG-I, MDA5, OAS, OASL 및 PKR에 대한 mRNA 수준을 정량화하고, 액틴 값에 대해 정규화시킨다.
실시예 48: 조절 핵산 부위를 갖는 원형 RNA의 제조
이 실시예는 조절 RNA 결합 부위를 갖는 원형 RNA의 시험관내 생성을 보여준다.
상이한 세포 유형은 특정 RNA 서열을 표적화하기 위한 특유한 핵산 조절 기구를 지닌다. 원형 RNA 내의 이들 특정 서열의 인코딩은 상이한 세포 유형에 특유한 특성을 부여할 수 있었다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA를 마이크로RNA 결합 부위를 인코딩하도록 조작하였다.
본 실시예에서, 원형 RNA는 WT EMCV IRES를 인코딩하는 서열, mir692 마이크로RNA 결합 부위(GAGGUGCUCAAAGAGAU) 및 IRES-ORF의 측부 배치된 2개의 스페이서 요소를 포함하였다.
원형 RNA를 시험관내에서 생성하였다. 전사를 유도하기 위한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터에 더하여, 상기 열거된 모든 모티프를 포함하는 DNA 주형으로부터 미변형된 선형 RNA를 시험관내 전사하였다. 전사된 RNA를 제조업체의 설명에 따라 RNA 클린업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하고, RNA 5'-포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0356)로 처리하고, RNA 정제 컬럼으로 다시 정제하였다. RppH 처리된 RNA를 스플린트 DNA(GGCTATTCCCAATAGCCGTT) 및 T4 RNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0239)를 사용하여 원형화시켰다. 원형 RNA를 우레아-PAGE 정제하고(도 40), 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 1 mM EDTA) 중에 용리시키고, 에탄올 침전시키고, RNase 부재의 물 중에 재현탁시켰다.
도 40에 나타낸 바와 같이, miRNA 결합 부위를 갖는 원형 RNA를 생성하였다.
실시예 49: 원형 RNA의 자가-스플라이싱
이 실시예는 자가-스플라이싱에 의해 원형 RNA를 생성하는 능력을 보여준다.
이 실시예에 있어서, 원형 RNA는 CVB3 IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF, 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하였다.
원형 RNA를 시험관내에서 생성하였다. 미변형된 선형 RNA를 상기 열거된 모든 모티프를 포함하는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사하였다. 시험관내 전사 반응물은 1 ㎍의 주형 DNA T7 RNA 폴리머라제 프로모터, 10X T7 반응 완충제, 7.5 mM ATP, 7.5 mM CTP, 7.5 mM GTP, 7.5 mM UTP, 10 mM DTT, 40 U RNase 저해제 및 T7 효소를 포함하였다. 전사를 37℃에서 4시간 동안 수행하였다. 전사된 RNA를 37℃에서 15분 동안 1 U의 DNase I을 사용하여 DNase 처리하였다. 자가 스플라이싱에 의한 원형화를 유리하게 하기 위해, 추가의 GTP를 2 mM의 최종 농도로 첨가하고, 55℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, RNA를 컬럼 정제하고, UREA-PAGE에 의해 가시화시켰다.
도 41은 자가-스플라이싱에 의해 생성되는 원형 RNA를 보여준다.
실시예 50: 엔크립토겐을 포함하는 스플라이싱 요소를 갖는 원형 RNA
본 실시예는 감소된 면역원성을 갖도록 조작된 원형 RNA를 보여준다.
본 실시예에 있어서, 원형 RNA는 CVB3 IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF 및 IRES-ORF의 측부 배치된 2개의 스페이서 요소를 포함하였으며, 이들 2개의 스페이서 요소는 아나바에나 자가촉매작용 인트론 및 엑손 서열의 부분인 스플라이싱 요소를 포함한다(SEQ ID NO: 59).
원형 RNA를 시험관내에서 생성한다.
이 실시예에서, 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 내로 플레이팅함으로써 선천적 면역 반응 유전자의 수준을 세포에서 모니터링한다. 1일 후에, 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시킨다. 트랜스펙션 후 24시간째에, 전체 RNA를 페놀-기반의 추출 시약(인비트로겐)을 사용하여 세포로부터 단리한다. 전체 RNA(500 ng)를 역전사로 처리하여, cDNA를 생성한다. qRT-PCR 분석을 염료-기반의 정량적 PCR 믹스(바이오라드)를 사용하여 수행한다.
스플라이싱 요소를 포함하는 원형 RNA로 트랜스펙션된 BJ 세포로부터의 면역 관련 유전자의 qRT-PCR 수준은 선형 RNA 트랜스펙션된 세포에 비하여 RIG-I, MDA5, PKR 및 IFN-베타의 감소를 보이는 것으로 예상된다. 따라서, 수여자 세포 내의 면역원성 관련 유전자의 유도는 선형 RNA 트랜스펙션된 세포에 비하여 원형 RNA 트랜스펙션된 세포에서 감소되는 것으로 예상된다.
실시예 51: 세포 분열 동안 원형 RNA의 지속성
이 실시예는 세포 분열 동안 원형 폴리리보뉴클레오티드의 지속성을 보여준다. 하나 이상의 바람직한 특성을 포함하도록 조작된 비-천연 발생 원형 RNA는 분해되지 않고, 세포 분열 내내 세포에서 지속될 수 있다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 발현하는 원형 RNA를 HeLa 세포에서 72시간의 일에 걸쳐 모니터링하였다.
이 실시예에서, 1307개 뉴클레오티드 원형 RNA는 CVB3 IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF, 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하였다.
세포 분열에 걸친 원형 RNA의 지속성을 HeLa 세포에서 모니터링하였다. 96-웰 플레이트 내의 5000개 세포/웰을 원형 RNA로 현탁액 트랜스펙션시켰다. 명 세포 영상화를 아보스 이미저(Avos imager)(써모피셔)에서 수행하고, 0시간째, 24시간째, 48시간째, 72시간째 및 96시간째에 세포 계수를 발광 세포 생존력 검정(프로메가)을 사용하여 수행하였다. 가우시아 루시퍼라제 효소 활성을 단백질 발현의 척도로서 매일 모니터링하고, 가우시아 루시퍼라제 활성 검정(써모 사이언티픽 피어스)을 사용함으로써 24시간마다 웰로부터 제거된 상청액 중에서 gLuc 발현을 매일 모니터링하였다. 50 ㎕의 1X Gluc 기질을 5 ㎕의 혈장에 첨가하여, Gluc 루시퍼라제 활성 검정을 수행하였다. 혼합한 직후에 발광계 기기(프로메가) 상에서 플레이트를 판독하였다.
원형 RNA로부터의 단백질의 발현은 분열하는 세포에서 선형 RNA보다 더 높은 수준으로 검출되었다(도 42). 원형 RNA를 갖는 세포는 측정된 모든 시점에 선형 RNA에 비하여 더 높은 세포 분열율을 가졌다. 이 실시예는 세포 분열 동안 그의 선형 RNA 대응물보다 증가된 원형 RNA의 검출을 보여준다.
실시예 52: 회전환 번역에 의해 복수의 발현 서열이 생성된다
이 실시예는 단일의 구축물로부터 다수의 단백질을 발현하는 원형 RNA의 능력을 보여준다. 추가로, 이 실시예는 다수의 ORF를 인코딩하는 원형 RNA의 회전환 번역을 보여준다. 이 실시예는 단일의 구축물로부터의 2가지 단백질의 발현을 추가로 보여준다.
하나의 원형 RNA(mtEMCV T2A 3XFLAG-GFP F2A 3XFLAG-Nluc P2A IS 스페이서)를 회전환 번역을 위해 EMCV IRES(SEQ ID NO: 58), 및 3XFLAG 태그와 함께 GFP를 인코딩하는 ORF 및 3XFLAG 태그와 함께 나노루시퍼라제(Nluc)를 인코딩하는 ORF를 포함하도록 설계하였다. 스태거 요소(2A)는 GFP 및 Nluc ORF에 인접하였다. 또 다른 원형 RNA를 유사하게 설계하였지만, Nluc ORF와 스페이서의 중간에 삼중 정지 코돈을 포함하였다. EMCV IRES 전에 아나바에나 자가촉매작용 인트론 및 엑손 서열의 부분을 포함시켰다. 원형 RNA를 기술된 바와 같이 시험관내에서 생성하였다.
원형 RNA로부터의 단백질의 발현을 시험관내에서 또는 세포 내에서 모니터링하였다. 시험관내 분석을 위해, 원형 RNA를 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물(프로메가, 미국 위스콘신주 피츠버그 소재) 중에 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 완전 아미노산 및 0.8 U/㎕ RNase 저해제(일본 오사카 소재의 토요보(Toyobo))를 포함하였다.
인큐베이션 후에, 아세트산(0.32 ㎕) 및 물(300 ㎕)을 반응 혼합물(16 ㎕)에 첨가하고 15℃에서 10분 동안 20,817 xg에서 원심분리시킴으로써 헤모글로빈 단백질을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 2x SDS 시료 완충제 중에 용해시키고, 70℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
세포에서의 분석을 위해, 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 내로 플레이팅하여 세포에서 원형 RNA의 번역 효율을 모니터링하였다. 1일 후에, 500 ng의 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 48시간째에, 200 ㎕의 RIPA 완충제를 각 웰 상에 첨가함으로써 세포를 수집하였다. 다음으로, 10 ㎍의 세포 용해물 단백질을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔 상에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 망상적혈구 용해물 및 세포로부터의 시료를 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 로딩 대조군으로서, 항-베타 튜불린 항체를 사용하였다. 블롯을 증강된 화학발광(ECL) 키트로 가시화시켰다. 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
도 43에 나타낸 바와 같이, GFP 및 nLuc를 인코딩하는 원형 RNA는 2가지 단백질 생성물을 생성하였다. 삼중 정지가 없는 원형 RNA로부터의 번역은 삼중 정지 코돈을 갖는 원형 RNA보다 더 많은 단백질 생성물 둘 모두를 생성하였다. 마지막으로, 삼중 정지가 존재하는 및 이것이 부재하는 원형 RNA 둘 모두는 각각 1/3.24 및 1/3.37 비로 단백질을 발현하였다.
실시예 53: 생체내에서 투여되고, 더 긴 반감기/증가된 안정성을 나타내는 원형 RNA
이 실시예는 원형 RNA를 전달하는 능력 및 생체내에서 선형 RNA에 비하여 원형 RNA의 증가된 안정성을 보여준다.
이 실시예에 있어서, 나노루시퍼라제(Nluc)를 인코딩하는 ORF 및 스태거 서열과 함께 EMCV IRES를 포함하도록 원형 RNA를 설계하였다(EMCV 2A 3XFLAG Nluc 2A no stop 및 EMCV 2A 3XFLAG Nluc 2A stop). 원형 RNA를 시험관내에서 생성하였다.
Balb/c 마우스에 Nluc ORF를 갖는 원형 RNA 또는 대조군으로서 선형 RNA를 정맥내(IV) 꼬리 정맥 투여를 통해 주사하였다. 제조업체의 설명에 따라 지질-기반의 트랜스펙션 시약(미루스) 중에 제형화된 단회 용량의 5 ㎍의 RNA를 동물에게 제공하였다.
마우스를 희생시키고, 투여 후 3일째, 4일째 및 7일째에 간을 수집하였다(n = 2마리 마우스/시점). 간을 수집하고, RNA 안정화 리젠(reagen)(인비트로겐)에서 보관하였다. 조직을 마이크로 튜브 균질화기(피셔 사이언티픽)를 사용하여 RIPA 완충제 중에 균질화시키고, RNA를 cDNA 합성을 위한 페놀-기반의 RNA 추출 시약을 사용하여 추출하였다. qPCR을 사용하여 간 내의 선형 및 원형 RNA 둘 모두의 존재를 측정하였다.
조직 내의 RNA 검출을 qPCR에 의해 수행하였다. 선형 및 원형 RNA를 검출하기 위해, Nluc ORF를 증폭시키는 프라이머를 사용하였다. (F: AGATTTCGTTGGGGACTGGC, R: CACCGCTCAGGACAATCCTT). 오직 원형 RNA만을 검출하기 위해, 5'-3' 연접부를 증폭시키는 프라이머는 원형 RNA 구축물의 검출을 가능하게 하였지만, 선형 RNA 구축물의 검출을 가능하게 하지 않았다(F: CTGGAGACGTGGAGGAGAAC, R: CCAAAAGACGGCAATATGGT).
원형 RNA는 주사 후 3일째, 4일째 및 7일째에 마우스의 간에서 선형 RNA보다 더 높은 수준으로 검출되었다(도 44). 따라서, 원형 RNA를 투여하였으며, 투여 후 적어도 7일 동안 생체내에서 검출 가능하였다.
실시예 54: 원형 RNA의 생체내 발현, 반감기 및 비-면역원성
이 실시예는 생체내에서 원형 RNA로부터의 발현을 유도하는 능력을 보여준다. 그것은 선형 RNA에 비하여 원형 RNA의 증가된 반감기를 보여준다. 마지막으로, 이는 원형 RNA가 생체내에서 비-면역원성이도록 조작되었음을 보여준다.
이 실시예에 있어서, 원형 RNA는 CVB3 IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF, 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하였다.
원형 RNA를 시험관내에서 생성하였다. 전사를 유도하기 위한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터뿐만 아니라, 상기 열거된 모든 모티프를 포함하는 DNA 주형으로부터 미변형된 선형 RNA를 시험관내 전사하였다. 전사된 RNA를 제조업체의 설명에 따라 RNA 클린업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하고, RNA 5'-포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0356)로 처리하고, RNA 정제 컬럼으로 다시 정제하였다. RppH 처리된 RNA를 스플린트 DNA(GTCAACGGATTTTCCCAAGTCCGTAGCGTCTC) 및 T4 RNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0239)를 사용하여 원형화시켰다. 원형 RNA를 우레아-PAGE 정제하고, 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 1 mM EDTA) 중에 용리시키고, 에탄올 침전시키고, RNase 부재의 물 중에 재현탁시켰다.
마우스에 가우시아 루시퍼라제 ORF를 갖는 원형 RNA 또는 대조군으로서 선형 RNA 2.5 ㎍의 단일의 꼬리 정맥 주사 용량을 제공하였으며, 둘 모두 담체로서 지질-기반의 트랜스펙션 시약(미루스) 중에 제형화하였다.
혈액 시료(50 ㎕)를 투여 후 1일째, 2일째, 7일째, 11일째, 16일째 및 23일째에 각 마우스의 꼬리-정맥으로부터 EDTA 튜브 내로 수집하였다.?혈장을 1300 g, 4℃에서 25분 동안의 원심분리에 의해 단리하고, 분비 효소인 가우시아 루시퍼라제의 활성을 가우시아 루시퍼라제 활성 검정(써모 사이언티픽 피어스)을 사용하여 시험하였다. 50 ㎕의 1X Gluc 기질을 5 ㎕의 혈장에 첨가하여, Gluc 루시퍼라제 활성 검정을 수행하였다. 혼합한 직후에 발광계 기기(프로메가)에서 플레이트를 판독하였다.
가우시아 루시퍼라제 활성을 원형 RNA의 투여 후 1일째, 2일째, 7일째, 11일째, 16일째 및 23일째에 혈장에서 검출하였다(도 45a 및 도 45b).
대조적으로, 가우시아 루시퍼라제 활성은 오직 변형된 선형 RNA의 투여 후 1일째 및 2일째에만 혈장에서 검출되었다. 선형 RNA 유래 단백질로부터의 효소 활성은 6일째 또는 그 이후에 백그라운드 수준을 초과하여 검출되지 않았다(도 45a 및 도 45b).
16일째에, 간을 3마리의 동물로부터 절제하고, 전체 RNA를 페놀-기반의 추출 시약(인비트로겐)을 사용하여 세포로부터 단리하였다. 전체 RNA(500 ng)를 역전사 처리하여, cDNA를 생성하였다. qRT-PCR 분석을 염료-기반의 정량적 PCR 믹스(바이오라드)를 사용하여 수행하였다.
도 46에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA의 qRT-PCR 수준이 제16일째에 간 및 비장 둘 모두에서 검출되었지만, 선형 RNA는 그렇지 않았다. 도 47에 나타낸 바와 같이, 제16일째에 담체 트랜스펙션된 동물에 비하여 선형 RNA로 트랜스펙션된 간으로부터의 면역 관련 유전자는 RIG-I, MDA5, IFN-B 및 OAS의 발현 증가를 보였지만, 원형 RNA로 트랜스펙션된 간은 이들 마커의 발현 증가 RIG-I, MDA5, PKR 및 IFN-베타를 보이지 않았다. 따라서, 수여자 세포 내의 면역원성 관련 유전자의 유도는 트랜스펙션된 간으로부터 원형 RNA에 존재하지 않았다.
이 실시예는 주사 후 다수의 날에서의 혈장 중 단백질 활성의 수준을 사용하여, 연장된 기간 동안 생체내에서 원형 RNA가 단백질을 발현하였음을 보여주었다. 마우스 혈장에서의 가우시안 루시퍼라제(Gaussian Luciferase)의 반감기가 약 20분인 것을 고려해볼 때(문헌[Tannous, Nat Protoc., 2009, 4(4):582-591] 참조), 유사한 수준의 활성은 원형 RNA로부터의 연속 발현을 나타낸다. 추가로, 원형 RNA는 면역 관련 유전자를 유도하지 않고, 그의 변형된 선형 RNA 대응물보다 더 긴 발현 프로파일을 나타내었다.
서열 목록
SEQ ID NO: 1 (출발 코돈)
AUG
SEQ ID NO: 2 (GFP)
EGFP: atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag
SEQ ID NO: 3(스태거 요소)
P2A: gctactaacttcagcctgctgaagcaggctggcgacgtggaggagaaccctggacct
T2A: gagggcaggggaagtctactaacatgcggggacgtggaggaaaatcccggccca
E2A: cagtgtactaattatgctctcttgaaattggctggagatgttgagagcaacccaggtccc
기타: F2A, BmCPV2A, BmIFV2A
SEQ ID NO: 4 ZKSCAN 인트론
GTAAAAAGAGGTGAAACCTATTATGTGTGAGCAGGGCACAGACGTTGAAACTGGAGCCAGGAGAAGTATTGGCAGGCTTTAGGTTATTAGGTGGTTACTCTGTCTTAAAAATGTTCTGGCTTTCTTCCTGCATCCACTGGCATACTCATGGTCTGTTTTTAAATATTTTAATTCCCATTTACAAAGTGATTTACCCACAAGCCCAACCTGTCTGTCTTCAG
또는
GTAAGAAGCAAGGTTTCATTTAGGGGAAGGGAAATGATTCAGGACGAGAGTCTTTGTGCTGCTGAGTGCCTGTGATGAAGAAGCATGTTAGTcctgggcaacgtagcgagaccccatctctacaaaaaatagaaaaattagccaggtatagtggcgcacacctgtgattccagctacgcaggaggctgaggtgggaggattgcttgagcccaggaggttgaggctgcagtgagctgtaatcatgccactactccaacctgggcaacacagcaaggaccctgtctcaaaaGCTACTTACAGAAAAGAATTAggctcggcacggtagctcacacctgtaatcccagcactttgggaggctgaggcgggcagatcacttgaggtcaggagtttgagaccagcctggccaacatggtgaaaccttgtctctactaaaaatatgaaaattagccaggcatggtggcacattcctgtaatcccagctactcgggaggctgaggcaggagaatcacttgaacccaggaggtggaggttgcagtaagccgagatcgtaccactgtgctctagccttggtgacagagcgagactgtcttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagaattaattaaaaatttaaaaaaaaatgaaaaaaaGCTGCATGCTTGTTTTTTGTTTTTAGTTATTCTACATTGTTGTCATTATTACCAAATATTGGGGAAAATACAACTTACAGACCAATCTCAGGAGTTAAATGTTACTACGAAGGCAAATGAACTATGCGTAATGAACCTGGTAGGCATTA
SEQ ID NO: 5 (IRES)
IRES (EMCV): Acgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataata
SEQ ID NO: 6(애드진 p3.1 락카제(laccase))
pcDNA3.1(+) 락카제2 MCS 엑손 벡터 서열 6926개 염기쌍
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCCATTGAGAAATGACTGAGTTCCGGTGCTCTCAAGTCATTGATCTTTGTCGACTTTTATTTGGTCTCTGTAATAACGACTTCAAAAACATTAAATTCTGTTGCGAAGCCAGTAAGCTACAAAAAGAAAaaacaagagagaatgctatagtcgtatagtatagtttcccgactatctgatacccattacttatctagggggaatgcgaacccaaaattttatcagttttctcggatatcgatagatattggggaataaatttaaataaataaattttgggcgggtttagggcgtggcaaaaagttttttggcaaatcgctagaaatttacaagacttataaaattatgaaaaaatacaacaaaattttaaacacgtgggcgtgacagttttggGcggttttagggcgttagagtaggcgaggacagggttacatcgactaggctttgatcctgatcaagaatatatatactttataccgcttccttctacatgttacctatttttcaacgaatctagtatacctttttactgtacgatttatgggtataaTAATAAGCTAAATCGAGACTAAGttttattgttatatatattttttttattttatGCAGAAATTAATTAAACCGGTCCTGCAGGTGATCAGGCGCGCCGGTTACCGGCCGGCCCCGCGGAGCGTAAGTATTCAAAATTCCAAAATTTTTTACTAGAAATATTCGATTTTTTAATAGGCAGTTTCTATACTATTGTATACTATTGtagattcgttgaaaagtatgtaacaggaagaataaagcatttccgaccatgtaaagtatatatattcttaataaggatcaatagccgagtcgatctcgccatgtccgtctgtcttattGttttattaccgccgagacatcaggaactataaaagctagaaggatgagttttagcatacagattctagagacaaggacgcagagcaagtttgttgatccatgctgccacgctttaactttctcaaattgcccaaaactgccatgcccacatttttgaactattttcgaaattttttcataattgtattactcgtgtaaatttccatcaatttgccaaaaaactttttgtcacgcgttaacgccctaaagccgccaatttggtcacgcccacactattgaGcaattatcaaattttttctcattttattccccaatatctatcgatatccccgattatgaaattattaaatttcgcgttcgcattcacactagctgagtaacgagtatctgatagttggggaaatcgactTATTTTTTATATACAATGAAAATGAATTTAATCATATGAATATCGATTATAGCTTTTTATTTAATATGAATATTTATTTGGGCTTAAGGTGTAACCTcctcgacataagactcacatggcgcaggcacattgaagacaaaaatactcaTTGTCGGGTCTCGCACCCTCCAGCAGCACCTAAAATTATGTCTTCAATTATTGCCAACATTGGAGACACAATTAGTCTGTGGCACCTCAGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC
SEQ ID NO: 8 (RFP)
mCherry: atggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaag
SEQ ID NO: 9(리보스위치)
압타자임(테오필린 의존성 문헌[Auslander 2010 Mol Biosys] 참조): cugagaugcagguacauccagcugaugagucccaaauaggacgaaagccauaccagccgaaaggcccuuggcaggguuccuggauuccacugcuauccac
SEQ ID NO: 10(루시퍼라제)
nLuc: ATGGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGTAA
서열 ID 11
코작 3XFLAG-EGF nostop(264개 염기쌍)
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCCT
5-13: 코작 서열
14-262: 3XFLAG-EGF
SEQ ID NO: 12
코작 3XFLAG-EGF stop(273개 염기쌍)
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCTGATAGTAACT
5-13: 코작 서열
14-262: 3XFLAG-EGF
263-271: 삼중 정지 코돈
SEQ ID NO: 13
코작 3XFLAG-EGF P2A nostop(330개 염기쌍)
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCT
5-13: 코작 서열
14-262: 3XFLAG-EGF
263-328: P2A
SEQ ID NO: 14
코작 3XFLAG-EGF nostop(264개 염기쌍)을 구축하기 위한 스플린트
GGTGGCTCCCAGGCGCAGTT
SEQ ID NO: 15
코작 3XFLAG-EGF stop(273개 염기쌍)을 구축하기 위한 스플린트
GGTGGCTCCCAGTTACTATC
SEQ ID NO: 16
코작 3XFLAG-EGF P2A nostop(330개 염기쌍)을 구축하기 위한 스플린트
GGTGGCTCCCAGAGGTCCAG
SEQ ID NO: 17
코작 1XFLAG-EGF T2A 1XFLAG-Nluc P2A nostop(873개 염기쌍)
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTATAAGGACGACGACGACAAAATCATCGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCT
5-13: 코작 서열
14-202: 1XFLAG-EGF
203-265: T2A
266-805: 1XFLAG-Nluc
806-871: P2A
SEQ ID NO: 18
코작 1XFLAG-EGF stop 1XFLAG-Nluc stop(762개 염기쌍)
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCTGATAGTAAGACTATAAGGACGACGACGACAAAATCATCGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGTGATAGTAACT
5-13: 코작 서열
14-202: 1XFLAG-EGF
203-211: 삼중 정지 코돈
212-751: 1XFLAG-Nluc
752-760: 삼중 정지 코돈
SEQ ID NO: 19
코작 3XFLAG-EGF P2A nostop(330개 염기쌍)
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCT
5-13: 코작 서열
14-262: 3XFLAG-EGF
263-328: P2A
SEQ ID NO: 20
코작 3XFLAG-EGF nostop(264개 염기쌍)
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCCT
5-13: 코작 서열
14-262: 3XFLAG-EGF
SEQ ID NO: 21
코작 3XFLAG-EGF stop(273개 염기쌍)
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCTGATAGTAACT
5-13: 코작 서열
14-262: 3XFLAG-EGF
263-271: 삼중 정지 코돈
SEQ ID NO: 22
EMCV IRES T2A 3XFLAG-EGF P2A nostop(954개 염기쌍)
GGGACCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTCAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCT
5-574: EMCV IRES
575-637: T2A
638-886: 3XFALG-EGF
887-952: P2A
SEQ ID NO: 23
EMCV T2A 3XFLAG Nluc P2A stop(1314개 뉴클레오티드)
GGGACCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTCAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTTGATAGTAACT
5-574: EMCV IRES
575-637: T2A
638-1237: 3XFLAG Nluc
1238-1303: P2A
1304-1312: 삼중 정지 코돈
SEQ ID NO: 24
EMCV T2A 3XFLAG Nluc P2A nostop(1305개 뉴클레오티드)
GGGACCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTCAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCT
5-574: EMCV IRES
575-637: T2A
638-1237: 3XFLAG Nluc
1238-1303: P2A
SEQ ID NO: 25
코작 1XFLAG-EGF T2A 1XFLAG-NLuc P2A stop(882개 염기쌍)
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTATAAGGACGACGACGACAAAATCATCGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTTGATAGTAACT
5-13: 코작 서열
14-202: 1XFLAG-EGF
266-805: 1XFLAG-NLuc
806-871: P2A
872-880: 삼중 정지 코돈
SEQ ID NO: 26
예시적인 반복 스페이서 서열
AAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATTATGCGTTACCGGCGAGACGCTACGGACTTGGGAAAATCCGTTGACCTTAAACGGTCGTGTGGGTTCAAGTCCCTCCACCCCCACGCCGGAAACGCAATAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACA
SEQ ID NO: 27
pCDNA3.1/CAT로부터 주형을 증폭하기 위해 실시예 43에서 사용되는 정방향 프라이머
CGCGGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGC
SEQ ID NO: 28
pCDNA3.1/CAT로부터 0.5 kb 주형을 증폭하기 위해 실시예 43에서 사용되는 역방향 프라이머
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATG
SEQ ID NO: 29
pCDNA3.1/CAT로부터 1 kb 주형을 증폭하기 위해 실시예 43에서 사용되는 역방향 프라이머
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACACGGGGGAGGGGCAAACAACAGATGG
SEQ ID NO: 30
pCDNA3.1/CAT로부터 2 kb 주형을 증폭하기 위해 실시예 43에서 사용되는 역방향 프라이머
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCAAAAAAGCC
SEQ ID NO: 31
pCDNA3.1/CAT로부터 4 kb 주형을 증폭하기 위해 실시예 43에서 사용되는 역방향 프라이머
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGC
SEQ ID NO: 32
pCDNA3.1/CAT로부터 5 kb 주형을 증폭하기 위해 실시예 43에서 사용되는 역방향 프라이머
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGAC
SEQ ID NO: 33
pCDNA3.1/CAT로부터 6.2 kb 주형을 증폭하기 위해 실시예 43에서 사용되는 역방향 프라이머
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACATTTCGATAAGCCAGTAAGCAGTGGGTTCTCTAG
SEQ ID NO: 34
pCDNA3.1/CAT로부터의 선형 전사물을 검출하기 위해 실시예 43에서 사용되는 정방향 qPCR 프라이머
ATTCTTGCCCGCCTGATGAA
SEQ ID NO: 35
pCDNA3.1/CAT로부터의 선형 전사물을 검출하기 위해 실시예 43에서 사용되는 역방향 qPCR 프라이머
TTGCTCATGGAAAACGGTGT
SEQ ID NO: 36
pCDNA3.1/CAT로부터의 원형 전사물을 검출하기 위해 실시예 43에서 사용되는 정방향 qPCR 프라이머
TGATCCTGCACTATGGCACA
SEQ ID NO: 37
pCDNA3.1/CAT로부터의 원형 전사물을 검출하기 위해 실시예 43에서 사용되는 역방향 qPCR 프라이머
CTGGACTAGTGGATCCGAGC
SEQ ID NO: 38
ACTIN을 검출하기 위해 실시예 44에서 사용되는 정방향 프라이머 서열
GACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGG
SEQ ID NO: 39
ACTIN을 검출하기 위해 실시예 44에서 사용되는 역방향 프라이머 서열
GGTGTTGAAGGTCTCAAACATG
SEQ ID NO: 40
RIG-I을 검출하기 위해 실시예 44에서 사용되는 정방향 프라이머 서열
TGTGGGCAATGTCATCAAAA
SEQ ID NO: 42
RIG-I을 검출하기 위해 실시예 44에서 사용되는 역방향 프라이머 서열
GAAGCACTTGCTACCTCTTGC
SEQ ID NO: 42
MDA5를 검출하기 위해 실시예 44에서 사용되는 정방향 프라이머 서열
GGCACCATGGGAAGTGATT
SEQ ID NO: 43
MDA5를 검출하기 위해 실시예 44에서 사용되는 역방향 프라이머 서열
ATTTGGTAAGGCCTGAGCTG
SEQ ID NO: 44
PKR을 검출하기 위해 실시예 44에서 사용되는 정방향 프라이머 서열
TCGCTGGTATCACTCGTCTG
SEQ ID NO: 45
PKR을 검출하기 위해 실시예 44에서 사용되는 역방향 프라이머 서열
GATTCTGAAGACCGCCAGAG
SEQ ID NO: 46
IFN-베타를 검출하기 위해 실시예 44에서 사용되는 정방향 프라이머 서열
CTCTCCTGTTGTGCTTCTCC
SEQ ID NO: 47
IFN-베타를 검출하기 위해 실시예 44에서 사용되는 역방향 프라이머 서열
GTCAAAGTTCATCCTGTCCTTG.
SEQ ID NO: 48
EMCV T2A 3XFLAG-GFP F2A 3XFALG-Nluc P2A IS
GGGAATAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGTAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAAGCGGAGTGAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCCAACCCTGGACCTGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTATCATCGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTTAAAAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATT
SEQ ID NO: 49
EMCV T2A 3XFLAG-GFP F2A 3XFALG-Nluc P2A IS
GGGAATAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGTAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAAGCGGAGTGAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCCAACCCTGGACCTTGATAGTAAGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTATCATCGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTTAAAAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATT
SEQ ID NO: 50
URE
UCAUAAUCAAUUUAUUAUUUUCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUU
SEQ ID NO: 51
CSE
AUUUUGUUUUUAACAUUUC
SEQ ID NO: 52
URE/CSE
UCAUAAUCAAUUUAUUAUUUUCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUUAUUUUGUUUUUAACAUUUC
SEQ ID NO: 53
CVB3-GLuc-STOP-URE
AAAAUCCGUUGACCUUAAACGGUCGUGUGGGUUCAAGUCCCUCCACCCCCACGCCGGAAACGCAAUAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAUUAAAACAGCCUGUGGGUUGAUCCCACCCACAGGCCCAUUGGGCGCUAGCACUCUGGUAUCACGGUACCUUUGUGCGCCUGUUUUAUACCCCCUCCCCCAACUGUAACUUAGAAGUAACACACACCGAUCAACAGUCAGCGUGGCACACCAGCCACGUUUUGAUCAAGCACUUCUGUUACCCCGGACUGAGUAUCAAUAGACUGCUCACGCGGUUGAAGGAGAAAGCGUUCGUUAUCCGGCCAACUACUUCGAAAAACCUAGUAACACCGUGGAAGUUGCAGAGUGUUUCGCUCAGCACUACCCCAGUGUAGAUCAGGUCGAUGAGUCACCGCAUUCCCCACGGGCGACCGUGGCGGUGGCUGCGUUGGCGGCCUGCCCAUGGGGAAACCCAUGGGACGCUCUAAUACAGACAUGGUGCGAAGAGUCUAUUGAGCUAGUUGGUAGUCCUCCGGCCCCUGAAUGCGGCUAAUCCUAACUGCGGAGCACACACCCUCAAGCCAGAGGGCAGUGUGUCGUAACGGGCAACUCUGCAGCGGAACCGACUACUUUGGGUGUCCGUGUUUCAUUUUAUUCCUAUACUGGCUGCUUAUGGUGACAAUUGAGAGAUCGUUACCAUAUAGCUAUUGGAUUGGCCAUCCGGUGACUAAUAGAGCUAUUAUAUAUCCCUUUGUUGGGUUUAUACCACUUAGCUUGAAAGAGGUUAAAACAUUACAAUUCAUUGUUAAGUUGAAUACAGCAAAAUGGGAGUCAAAGUUCUGUUUGCCCUGAUCUGCAUCGCUGUGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACUUCAACAUCGUGGCCGUGGCCAGCAACUUCGCGACCACGGAUCUCGAUGCUGACCGCGGGAAGUUGCCCGGCAAGAAGCUGCCGCUGGAGGUGCUCAAAGAGAUGGAAGCCAAUGCCCGGAAAGCUGGCUGCACCAGGGGCUGUCUGAUCUGCCUGUCCCACAUCAAGUGCACGCCCAAGAUGAAGAAGUUCAUCCCAGGACGCUGCCACACCUACGAAGGCGACAAAGAGUCCGCACAGGGCGGCAUAGGCGAGGCGAUCGUCGACAUUCCUGAGAUUCCUGGGUUCAAGGACUUGGAGCCCAUGGAGCAGUUCAUCGCACAGGUCGAUCUGUGUGUGGACUGCACAACUGGCUGCCUCAAAGGGCUUGCCAACGUGCAGUGUUCUGACCUGCUCAAGAAGUGGCUGCCGCAACGCUGUGCGACCUUUGCCAGCAAGAUCCAGGGCCAGGUGGACAAGAUCAAGGGGGCCGGUGGUGACUAAUCAUAAUCAAUUUAUUAUUUUCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUUAUUUUGUUUUUAACAUUUCAAAAAACAAAAAACAAAACGGCUAUUAUGCGUUACCGGCGAGACGCUACGGACUU
SEQ ID NO: 54
CVB3-GLuc-STOP-URE/CSE
AAAAUCCGUUGACCUUAAACGGUCGUGUGGGUUCAAGUCCCUCCACCCCCACGCCGGAAACGCAAUAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAUUAAAACAGCCUGUGGGUUGAUCCCACCCACAGGCCCAUUGGGCGCUAGCACUCUGGUAUCACGGUACCUUUGUGCGCCUGUUUUAUACCCCCUCCCCCAACUGUAACUUAGAAGUAACACACACCGAUCAACAGUCAGCGUGGCACACCAGCCACGUUUUGAUCAAGCACUUCUGUUACCCCGGACUGAGUAUCAAUAGACUGCUCACGCGGUUGAAGGAGAAAGCGUUCGUUAUCCGGCCAACUACUUCGAAAAACCUAGUAACACCGUGGAAGUUGCAGAGUGUUUCGCUCAGCACUACCCCAGUGUAGAUCAGGUCGAUGAGUCACCGCAUUCCCCACGGGCGACCGUGGCGGUGGCUGCGUUGGCGGCCUGCCCAUGGGGAAACCCAUGGGACGCUCUAAUACAGACAUGGUGCGAAGAGUCUAUUGAGCUAGUUGGUAGUCCUCCGGCCCCUGAAUGCGGCUAAUCCUAACUGCGGAGCACACACCCUCAAGCCAGAGGGCAGUGUGUCGUAACGGGCAACUCUGCAGCGGAACCGACUACUUUGGGUGUCCGUGUUUCAUUUUAUUCCUAUACUGGCUGCUUAUGGUGACAAUUGAGAGAUCGUUACCAUAUAGCUAUUGGAUUGGCCAUCCGGUGACUAAUAGAGCUAUUAUAUAUCCCUUUGUUGGGUUUAUACCACUUAGCUUGAAAGAGGUUAAAACAUUACAAUUCAUUGUUAAGUUGAAUACAGCAAAAUGGGAGUCAAAGUUCUGUUUGCCCUGAUCUGCAUCGCUGUGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACUUCAACAUCGUGGCCGUGGCCAGCAACUUCGCGACCACGGAUCUCGAUGCUGACCGCGGGAAGUUGCCCGGCAAGAAGCUGCCGCUGGAGGUGCUCAAAGAGAUGGAAGCCAAUGCCCGGAAAGCUGGCUGCACCAGGGGCUGUCUGAUCUGCCUGUCCCACAUCAAGUGCACGCCCAAGAUGAAGAAGUUCAUCCCAGGACGCUGCCACACCUACGAAGGCGACAAAGAGUCCGCACAGGGCGGCAUAGGCGAGGCGAUCGUCGACAUUCCUGAGAUUCCUGGGUUCAAGGACUUGGAGCCCAUGGAGCAGUUCAUCGCACAGGUCGAUCUGUGUGUGGACUGCACAACUGGCUGCCUCAAAGGGCUUGCCAACGUGCAGUGUUCUGACCUGCUCAAGAAGUGGCUGCCGCAACGCUGUGCGACCUUUGCCAGCAAGAUCCAGGGCCAGGUGGACAAGAUCAAGGGGGCCGGUGGUGACUAAUCAUAAUCAAUUUAUUAUUUUCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUUAUUUUGUUUUUAACAUUUCAAAAAACAAAAAACAAAACGGCUAUUAUGCGUUACCGGCGAGACGCUACGGACUU
SEQ ID NO: 55
실시예 42를 위해 사용되는 상보성 프라이머
CACCGCTCAGGACAATCCTT
SEQ ID NO: 56
CVB3 IRES
TTAAAACAGCCTGTGGGTTGATCCCACCCACAGGCCCATTGGGCGCTAGCACTCTGGTATCACGGTACCTTTGTGCGCCTGTTTTATACCCCCTCCCCCAACTGTAACTTAGAAGTAACACACACCGATCAACAGTCAGCGTGGCACACCAGCCACGTTTTGATCAAGCACTTCTGTTACCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAGCGTTCGTTATCCGGCCAACTACTTCGAAAAACCTAGTAACACCGTGGAAGTTGCAGAGTGTTTCGCTCAGCACTACCCCAGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACCGCATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGAAACCCATGGGACGCTCTAATACAGACATGGTGCGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACACACCCTCAAGCCAGAGGGCAGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCATTTTATTCCTATACTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAGAGATCGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGACTAATAGAGCTATTATATATCCCTTTGTTGGGTTTATACCACTTAGCTTGAAAGAGGTTAAAACATTACAATTCATTGTTAAGTTGAATACAGCAAA
SEQ ID NO: 57
Gluc
ATGGGAGTCAAAGTTCTGTTTGCCCTGATCTGCATCGCTGTGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACTTCAACATCGTGGCCGTGGCCAGCAACTTCGCGACCACGGATCTCGATGCTGACCGCGGGAAGTTGCCCGGCAAGAAGCTGCCGCTGGAGGTGCTCAAAGAGATGGAAGCCAATGCCCGGAAAGCTGGCTGCACCAGGGGCTGTCTGATCTGCCTGTCCCACATCAAGTGCACGCCCAAGATGAAGAAGTTCATCCCAGGACGCTGCCACACCTACGAAGGCGACAAAGAGTCCGCACAGGGCGGCATAGGCGAGGCGATCGTCGACATTCCTGAGATTCCTGGGTTCAAGGACTTGGAGCCCATGGAGCAGTTCATCGCACAGGTCGATCTGTGTGTGGACTGCACAACTGGCTGCCTCAAAGGGCTTGCCAACGTGCAGTGTTCTGACCTGCTCAAGAAGTGGCTGCCGCAACGCTGTGCGACCTTTGCCAGCAAGATCCAGGGCCAGGTGGACAAGATCAAGGGGGCCGGTGGTGACTAA
SEQ ID NO: 58
정지 돌연변이가 있는 EMCV IRES
ACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTCAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATG
SEQ ID NO: 59
스페이서 1
AAAAUCCGUUGACCUUAAACGGUCGUGUGGGUUCAAGUCCCUCCACCCCCACGCCGGAAACGCAAUAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACA
스페이서 2
AAAAAACAAAAAACAAAACGGCUAUUAUGCGUUACCGGCGAGACGCUACGGACUU
SEQ ID:60
ATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGAGAGGTCTGAAAAGACCTCTGCTGACTATGTGATCTTATTAAAATTAGGTTAAATTTCGAGGTTAAAAATAGTTTTAATATTGCTATAGTCTTAGAGGTCTTGTATATTTATACTTACCACACAAGATGGACCGGAGCAGCCCTCCAATATCTAGTGTACCCTCGTGCTCGCTCAAACATTAAGTGGTGTTGTGCGAAAAGAATCTCACTTCAAGAAAAAGAAACTAGT
WT EMCV Gluc IS
GGGAATAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATAGCCACCATGGGAGTCAAAGTTCTGTTTGCCCTGATCTGCATCGCTGTGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACTTCAACATCGTGGCCGTGGCCAGCAACTTCGCGACCACGGATCTCGATGCTGACCGCGGGAAGTTGCCCGGCAAGAAGCTGCCGCTGGAGGTGCTCAAAGAGATGGAAGCCAATGCCCGGAAAGCTGGCTGCACCAGGGGCTGTCTGATCTGCCTGTCCCACATCAAGTGCACGCCCAAGATGAAGAAGTTCATCCCAGGACGCTGCCACACCTACGAAGGCGACAAAGAGTCCGCACAGGGCGGCATAGGCGAGGCGATCGTCGACATTCCTGAGATTCCTGGGTTCAAGGACTTGGAGCCCATGGAGCAGTTCATCGCACAGGTCGATCTGTGTGTGGACTGCACAACTGGCTGCCTCAAAGGGCTTGCCAACGTGCAGTGTTCTGACCTGCTCAAGAAGTGGCTGCCGCAACGCTGTGCGACCTTTGCCAGCAAGATCCAGGGCCAGGTGGACAAGATCAAGGGGGCCGGTGGTGACTAAAAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATT
5’ 스페이서
AATAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACA
3’ 스페이서
AAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATT
서열 #1(제1 섹션: 5’스페이서+WT EMCV IRES+38nts ORF)
GGGAATAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATAGCCACCATGGGAGTCAAAGTTCTGTTTGCCCTGATCTGCATCGCTGT
서열 #2(제2 섹션: ORF+3’스페이서)
GGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACTTCAACATCGTGGCCGTGGCCAGCAACTTCGCGACCACGGATCTCGATGCTGACCGCGGGAAGTTGCCCGGCAAGAAGCTGCCGCTGGAGGTGCTCAAAGAGATGGAAGCCAATGCCCGGAAAGCTGGCTGCACCAGGGGCTGTCTGATCTGCCTGTCCCACATCAAGTGCACGCCCAAGATGAAGAAGTTCATCCCAGGACGCTGCCACACCTACGAAGGCGACAAAGAGTCCGCACAGGGCGGCATAGGCGAGGCGATCGTCGACATTCCTGAGATTCCTGGGTTCAAGGACTTGGAGCCCATGGAGCAGTTCATCGCACAGGTCGATCTGTGTGTGGACTGCACAACTGGCTGCCTCAAAGGGCTTGCCAACGTGCAGTGTTCTGACCTGCTCAAGAAGTGGCTGCCGCAACGCTGTGCGACCTTTGCCAGCAAGATCCAGGGCCAGGTGGACAAGATCAAGGGGGCCGGTGGTGACTAAAAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATT
제1 섹션을 증폭시키기 위한 정방향 프라이머
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CGCGGATCCTAATACGACTCACTATAGGCCGAGGCCAAGCCCACCG
제2 섹션을 증폭시키기 위한 역방향 프라이머
mAmATAGCCGTTTTGTTTTTTGTTTTTTTTAGTCACCACCGGCCCCCT
글로빈 GLuc
GGGACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACCATGGGAGTCAAAGTTCTGTTTGCCCTGATCTGCATCGCTGTGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACTTCAACATCGTGGCCGTGGCCAGCAACTTCGCGACCACGGATCTCGATGCTGACCGCGGGAAGTTGCCCGGCAAGAAGCTGCCGCTGGAGGTGCTCAAAGAGATGGAAGCCAATGCCCGGAAAGCTGGCTGCACCAGGGGCTGTCTGATCTGCCTGTCCCACATCAAGTGCACGCCCAAGATGAAGAAGTTCATCCCAGGACGCTGCCACACCTACGAAGGCGACAAAGAGTCCGCACAGGGCGGCATAGGCGAGGCGATCGTCGACATTCCTGAGATTCCTGGGTTCAAGGACTTGGAGCCCATGGAGCAGTTCATCGCACAGGTCGATCTGTGTGTGGACTGCACAACTGGCTGCCTCAAAGGGCTTGCCAACGTGCAGTGTTCTGACCTGCTCAAGAAGTGGCTGCCGCAACGCTGTGCGACCTTTGCCAGCAAGATCCAGGGCCAGGTGGACAAGATCAAGGGGGCCGGTGGTGACTAAGCTGGAGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCGGCCCTTCCTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCAGCA
인간 글로빈 5’UTR
ACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACC
인간 글로빈 3’UTR
GCTGGAGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCGGCCCTTCCTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCAGCA
글로빈 GLuc 정방향 프라이머
CGCGGATCCTAATACGACTCACTATAGGGACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAG
글로빈 GLuc 역방향 프라이머
TGCTGCCCACTCAGACTTTATTC
SEQUENCE LISTING <110> FLAGSHIP PIONEERING INNOVATIONS VI, LLC <120> COMPOSITIONS COMPRISING MODIFIED CIRCULAR POLYRIBONUCLEOTIDES AND USES THEREOF <130> 55503-706.601 <140> PCT/US2020/024789 <141> 2020-03-25 <150> 62/823,573 <151> 2019-03-25 <160> 139 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 aug 3 <210> 2 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg 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aaatattcga ttttttaata 1680 ggcagtttct atactattgt atactattgt agattcgttg aaaagtatgt aacaggaaga 1740 ataaagcatt tccgaccatg taaagtatat atattcttaa taaggatcaa tagccgagtc 1800 gatctcgcca tgtccgtctg tcttattgtt ttattaccgc cgagacatca ggaactataa 1860 aagctagaag gatgagtttt agcatacaga ttctagagac aaggacgcag agcaagtttg 1920 ttgatccatg ctgccacgct ttaactttct caaattgccc aaaactgcca tgcccacatt 1980 tttgaactat tttcgaaatt ttttcataat tgtattactc gtgtaaattt ccatcaattt 2040 gccaaaaaac tttttgtcac gcgttaacgc cctaaagccg ccaatttggt cacgcccaca 2100 ctattgagca attatcaaat tttttctcat tttattcccc aatatctatc gatatccccg 2160 attatgaaat tattaaattt cgcgttcgca ttcacactag ctgagtaacg agtatctgat 2220 agttggggaa atcgacttat tttttatata caatgaaaat gaatttaatc atatgaatat 2280 cgattatagc tttttattta atatgaatat ttatttgggc ttaaggtgta acctcctcga 2340 cataagactc acatggcgca ggcacattga agacaaaaat actcattgtc gggtctcgca 2400 ccctccagca gcacctaaaa ttatgtcttc aattattgcc aacattggag acacaattag 2460 tctgtggcac ctcaggcggc cgctcgagtc tagagggccc 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 65 aaaaaacaaa aaacaaaacg gcuauuaugc guuaccggcg agacgcuacg gacuu 55 <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace="Ile" <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (1)..(8) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 66 Asp Val Glu Xaa Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 67 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 68 Gly Asp Ile Glu Glu Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> 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Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 74 Gly Asp Val Glu Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 75 Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 76 Gly Asp Val Glu Gln Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 77 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 77 Ile Glu Ser Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 78 Gly Asp Ile Glu Leu Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 79 His Asp Ile Glu Thr Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 80 His Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 81 His Asp Val Glu Met Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 82 Gly Asp Met Glu Ser Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 83 Gly Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 84 Gly Asp Ile Glu Gln Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 85 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 85 Asp Ser Glu Phe Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 86 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10 15 <210> 87 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 87 Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn Arg 1 5 10 15 Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu 20 25 <210> 88 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 88 Glu Glu Glu Glu Glu Glu 1 5 <210> 89 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 89 Gly Ala Pro Val Pro Tyr 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Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 99 Pro Asp Arg Val Arg Ala Val Ser His Trp Ser Ser 1 5 10 <210> 100 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 100 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 101 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 101 Cys Cys Pro Gly Cys Cys 1 5 <210> 102 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 102 Glu Val His Thr Asn Gln Asp Pro Leu Asp 1 5 10 <210> 103 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 103 Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr 1 5 10 <210> 104 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 104 Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys 1 5 10 <210> 105 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 105 Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 106 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 106 gaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaaa 60 gaaa 64 <210> 107 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 107 uagagaaacu cgcggag 17 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace=" " or "His" <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace=" " or "Gly" <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> /replace="Val" or "Ile" or "Ser" or "Met" <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (1)..(9) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 108 Gly Asp Asp Glu Xaa Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 109 <211> 96 <212> RNA <213> Hepatitis delta virus <400> 109 ggcucaucuc gacaagaggc ggcaguccuc aguacucuua cucuuuucug uaaagaggag 60 acugcuggac ucgccgccca aguucgagca ugagcc 96 <210> 110 <211> 74 <212> RNA <213> Hepatitis delta virus <400> 110 ggcuagaggc ggcaguccuc aguacucuua cucuuuucug uaaagaggag acugcuggac 60 ucgccgcccg agcc 74 <210> 111 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 111 ggcttggcct cggccacagc gatgcagatc 30 <210> 112 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 112 gtttttcggc tattcccaat agccgttttg 30 <210> 113 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 113 gaccagaaga gtccctgctg cccactcaga 30 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 114 acgacggtgt gtgcatgtat 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 115 ttcccaccac ttcaggtctc 20 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 116 tacgcctgca actgtgttgt 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 117 tcgatgatct tgtcgtcgtc 20 <210> 118 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 118 agggctgctt ttaactctgg t 21 <210> 119 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 119 ccccacttga ttttggaggg a 21 <210> 120 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 120 tgctgcccac tcagacttta ttc 23 <210> 121 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 121 gaggugcuca aagagau 17 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 122 ggctattccc aatagccgtt 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 123 agatttcgtt ggggactggc 20 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 124 ctggagacgt ggaggagaac 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 125 ccaaaagacg gcaatatggt 20 <210> 126 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 126 gtcaacggat tttcccaagt ccgtagcgtc tc 32 <210> 127 <211> 1203 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 127 gggaatagcc gaaaaacaaa aaacaaaaaa aacaaaaaaa aaaccaaaaa aacaaaacac 60 aacgttactg gccgaagccg cttggaataa ggccggtgtg cgtttgtcta tatgttattt 120 tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg agggcccgga aacctggccc tgtcttcttg 180 acgagcattc ctaggggtct ttcccctctc gccaaaggaa tgcaaggtct gttgaatgtc 240 gtgaaggaag cagttcctct ggaagcttct tgaagacaaa caacgtctgt agcgaccctt 300 tgcaggcagc ggaacccccc acctggcgac aggtgcctct gcggccaaaa gccacgtgta 360 taagatacac ctgcaaaggc ggcacaaccc cagtgccacg ttgtgagttg gatagttgtg 420 gaaagagtca aatggctctc ctcaagcgta ttcaacaagg ggctgaagga tgcccagaag 480 gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg cctcggtgca catgctttac atgtgtttag 540 tcgaggttaa aaaacgtcta ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa 600 cacgatgata atagccacca tgggagtcaa agttctgttt gccctgatct gcatcgctgt 660 ggccgaggcc aagcccaccg agaacaacga agacttcaac atcgtggccg tggccagcaa 720 cttcgcgacc acggatctcg atgctgaccg cgggaagttg cccggcaaga agctgccgct 780 ggaggtgctc aaagagatgg aagccaatgc ccggaaagct ggctgcacca ggggctgtct 840 gatctgcctg tcccacatca agtgcacgcc caagatgaag aagttcatcc caggacgctg 900 ccacacctac gaaggcgaca aagagtccgc acagggcggc ataggcgagg cgatcgtcga 960 cattcctgag attcctgggt tcaaggactt ggagcccatg gagcagttca tcgcacaggt 1020 cgatctgtgt gtggactgca caactggctg cctcaaaggg cttgccaacg tgcagtgttc 1080 tgacctgctc aagaagtggc tgccgcaacg ctgtgcgacc tttgccagca agatccaggg 1140 ccaggtggac aagatcaagg gggccggtgg tgactaaaaa aaacaaaaaa caaaacggct 1200 att 1203 <210> 128 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 128 aatagccgaa aaacaaaaaa caaaaaaaac aaaaaaaaaa ccaaaaaaac aaaacaca 58 <210> 129 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 129 aaaaaacaaa aaacaaaacg gctatt 26 <210> 130 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 130 gggaatagcc gaaaaacaaa aaacaaaaaa aacaaaaaaa aaaccaaaaa aacaaaacac 60 aacgttactg gccgaagccg cttggaataa ggccggtgtg cgtttgtcta tatgttattt 120 tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg agggcccgga aacctggccc tgtcttcttg 180 acgagcattc ctaggggtct ttcccctctc gccaaaggaa tgcaaggtct gttgaatgtc 240 gtgaaggaag cagttcctct ggaagcttct tgaagacaaa caacgtctgt agcgaccctt 300 tgcaggcagc ggaacccccc acctggcgac aggtgcctct gcggccaaaa gccacgtgta 360 taagatacac ctgcaaaggc ggcacaaccc cagtgccacg ttgtgagttg gatagttgtg 420 gaaagagtca aatggctctc ctcaagcgta ttcaacaagg ggctgaagga tgcccagaag 480 gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg cctcggtgca catgctttac atgtgtttag 540 tcgaggttaa aaaacgtcta ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa 600 cacgatgata atagccacca tgggagtcaa agttctgttt gccctgatct gcatcgctgt 660 <210> 131 <211> 543 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 131 ggccgaggcc aagcccaccg agaacaacga agacttcaac atcgtggccg tggccagcaa 60 cttcgcgacc acggatctcg atgctgaccg cgggaagttg cccggcaaga agctgccgct 120 ggaggtgctc aaagagatgg aagccaatgc ccggaaagct ggctgcacca ggggctgtct 180 gatctgcctg tcccacatca agtgcacgcc caagatgaag aagttcatcc caggacgctg 240 ccacacctac gaaggcgaca aagagtccgc acagggcggc ataggcgagg cgatcgtcga 300 cattcctgag attcctgggt tcaaggactt ggagcccatg gagcagttca tcgcacaggt 360 cgatctgtgt gtggactgca caactggctg cctcaaaggg cttgccaacg tgcagtgttc 420 tgacctgctc aagaagtggc tgccgcaacg ctgtgcgacc tttgccagca agatccaggg 480 ccaggtggac aagatcaagg gggccggtgg tgactaaaaa aaacaaaaaa caaaacggct 540 att 543 <210> 132 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 132 cgcggatcct aatacgactc actataggga atagccgaaa aacaaaaaac aaaaaaaaca 60 aaaaaaaaac caaaaaaaca aaacacaaac gttactggcc gaagccgc 108 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 133 acagcgatgc agatcagggc 20 <210> 134 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 134 cgcggatcct aatacgactc actataggcc gaggccaagc ccaccg 46 <210> 135 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 135 aatagccgtt ttgttttttg ttttttttag tcaccaccgg ccccct 46 <210> 136 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 136 gggactcttc tggtccccac agactcagag agaacccacc atgggagtca aagttctgtt 60 tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc gagaacaacg aagacttcaa 120 catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc gatgctgacc gcgggaagtt 180 gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagatg gaagccaatg cccggaaagc 240 tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc aagtgcacgc ccaagatgaa 300 gaagttcatc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac aaagagtccg cacagggcgg 360 cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg ttcaaggact tggagcccat 420 ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc acaactggct gcctcaaagg 480 gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg ctgccgcaac gctgtgcgac 540 ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag ggggccggtg gtgactaagc 600 tggagcctcg gtagccgttc ctcctgcccg ctgggcctcc caacgggccc tcctcccctc 660 cttgcaccgg cccttcctgg tctttgaata aagtctgagt gggcagca 708 <210> 137 <211> 37 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 137 actcttctgg tccccacaga ctcagagaga acccacc 37 <210> 138 <211> 110 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 138 gctggagcct cggtagccgt tcctcctgcc cgctgggcct cccaacgggc cctcctcccc 60 tccttgcacc ggcccttcct ggtctttgaa taaagtctga gtgggcagca 110 <210> 139 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 139 cgcggatcct aatacgactc actataggga ctcttctggt ccccacagac tcag 54

Claims (17)

  1. 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 면역원성의 감소 방법으로서:
    하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 상기 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드 및 적어도 약 5개 내지 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함하는, 단계;
    하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에 투여하는 단계; 및
    대상체의 세포 또는 조직 내의 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 감소된 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 면역원성을 획득하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1 부분은 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 부분이 5’-메틸시티딘 또는 슈도우리딘을 결여한, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드는 회전 번역에 적격성인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는:
    (a) 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배 높은 발현을 가지거나;
    (b) 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 높은 반감기를 가지거나;
    (c) 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비해 큰 반감기를 가지거나; 또는
    (d) RIG-I, TLR-3, TLR-7, TLR-8, MDA-5, LGP-2, OAS, OASL, PKR, 및 IFN-베타 중 적어도 하나의 발현 또는 신호전달 또는 활성화에 의해 평가시, 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.2배, 3.3배, 3.5배, 3.8배, 4.0배, 4.2배, 4.5배, 4.8배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 또는 10.0배 낮은 면역원성을 가지는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법:
    (a) N(6)메틸아데노신(m6A), 5’-메틸시티딘 및 슈도우리딘;
    (b) 2’-O-메틸, 2’-O-메톡시에틸(2’-O-MOE), 2’-O-아미노프로필, 2’-데옥시, T-데옥시-2’-플루오로, 2’-O-아미노프로필(2’-O-AP), 2’-O-디메틸아미노에틸(2’-O-DMAOE), 2’-O-디메틸아미노프로필(2’-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2’-O-DMAEOE), 2’-O-N-메틸아세트아미도(2’-O-NMA), 잠금 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩티드 핵산(PNA), 1’,5’-언하이드로헥시톨 핵산(HNA), 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드 및 2’-플루오로 N3-P5’-포스포르아미디트; 또는
    (c) 표 2의 임의의 변형된 뉴클레오티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 변형 뉴클레오티드인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 단백질, 펩티드, 생체분자, DNA, RNA, 또는 세포 표적에 결합하도록 구성된 결합 부위를 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열을 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제7항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 부분이 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 IRES를 포함하는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 서열이:
    (a) 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물보다 더 높은 번역 효율;
    (b) 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물보다 적어도 약 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배 높은 번역 효율;
    (c) 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비해 큰 번역 효율; 또는
    (d) 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 적어도 약 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배 높은 번역 효율을 가지는, 방법.
  12. 대상체에서의 하나 이상의 발현 서열을 발현시키는 방법으로서:
    하나 이상의 발현 서열을 포함하는 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 상기 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드 및 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함하는, 단계;
    하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에 투여하는 단계; 및
    대상체의 세포 또는 조직 내의 완전히 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 대응하는 하나 이상의 발현 서열의 발현에 비하여 하나 이상의 발현 서열의 증가된 발현을 획득하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성의 증가 방법으로서:
    하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 상기 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 및 적어도 약 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 연속 미변형 뉴클레오티드를 포함하는 제1 부분을 포함하는, 단계;
    하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에 투여하는 단계; 및
    대상체의 세포 또는 조직 내의 대응하는 미변형 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 증가된 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 안정성을 획득하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 제1 부분이 IRES를 포함하는, 방법.
  15. 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가:
    적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드;
    제1 표적, 예를 들어, RNA, DNA, 단백질 또는 세포 표적의 제1 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제1 결합 부위를 포함하는 제1 부분으로서, 상기 제1 결합 모이어티가 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드(circRNA)-결합 모티프인 제1 부분을 포함하며;
    상기 제1 표적 및 상기 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 복합체를 형성하는, 약제학적 조성물.
  16. 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가:
    적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드;
    제1 표적, 예를 들어, RNA, DNA, 단백질 또는 세포 표적의 제1 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제1 결합 부위를 포함하는 제1 부분으로서, 상기 제1 결합 모이어티가 미변형 뉴클레오티드로 이루어진 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드(circRNA)-결합 모티프인 제1 부분; 및
    제2 표적의 제2 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제2 결합 부위로서, 상기 제2 결합 모이어티가 제2 circRNA-결합 모티프인 제2 결합 부위를 포함하며,
    상기 제1 결합 모이어티가 상기 제2 결합 모이어티와 상이하며,
    상기 제1 표적, 상기 제2 표적 및 상기 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 복합체를 형성하며,
    상기 제1 표적 또는 상기 제2 표적이 마이크로RNA가 아닌, 약제학적 조성물.
  17. 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 하이브리드 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드가:
    적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드;
    제1 표적의 제1 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제1 결합 부위를 포함하는 제1 부분으로서, 상기 제1 결합 모이어티가 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드(circRNA)-결합 모티프인 제1 부분; 및
    제2 표적의 제2 결합 모이어티에 결합하도록 구성된 제2 결합 부위로서, 상기 제2 결합 모이어티가 제2 circRNA-결합 모티프인 제2 결합 부위를 포함하며,
    상기 제1 결합 모이어티가 상기 제2 결합 모이어티와 상이하며,
    상기 제1 표적 및 상기 제2 표적이 둘 모두 마이크로RNA인, 약제학적 조성물.
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