CN112941103A - 一种嵌合人胰岛素和白介素-10双基因重组质粒载体及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种嵌合人胰岛素和白介素‑10双基因共表达重组质粒载体及其构建方法。其步骤包括（1）设计合成Insulin‑PGK‑IL10目的基因。（2）设计并合成引物，扩增目的基因片段，双酶切后回收酶切产物。（3）对质粒载体pcDNA3.1进行双酶切，酶切位点为XhoI和NotI。（4）将目的基因片段与酶切后的pcDNA3.1连接。（5）将连接好的载体转化感受态细菌,涂板筛选、得到Insulin和IL‑10双基因重组质粒载体。本发明所构建的载体用于胰岛素依赖型糖尿病的基因治疗。

Description

一种嵌合人胰岛素和白介素-10双基因重组质粒载体及其构 建方法
技术领域
本发明涉及基因药物研发领域，特别涉及一种嵌合胰岛素和白介素-10双基因重组质粒表达载体的构建。
背景技术
全世界大约有9％的成年人患有糖尿病，由糖尿病导致的心脏病，神经损伤，眼睛疾病和肾脏疾病等并发症严重影响患者的生存质量，全世界每年约有500 万人因为糖尿病而丧失生命，糖尿病已经成为严重影响人类健康的重大公共卫生问题。但目前临床上针对糖尿病的治疗没有有效的方法，目前临床上通过皮下注射胰岛素、口服降糖药等方法治疗糖尿病，但这些治疗措施只能暂时性地缓解高血糖，而不能从根本上彻底治疗糖尿病以及阻止其他并发症的发生。因此，如何让糖尿病达到完全治愈，是人类面临的重大挑战。
胰岛素依赖型糖尿病包括1型糖尿病和部分中晚期的2型糖尿病，其主要病理生理特点是自身免疫攻击功能性β细胞，使胰岛被破坏、数量减少、功能减退，导致胰岛素分泌量不足。要想从根本上治愈胰岛素依赖性糖尿病，首要问题是抑制自身免疫针对β细胞的攻击，阻止胰岛的免疫损伤，保护残存的胰岛功能；其二是促进胰岛细胞再生，修复胰岛功能。目前临床上所用的药物都不能解决这些根本问题。随着基因工程技术的发展，基因治疗为糖尿病治疗开辟了新途径。它能够从细胞和基因水平治疗糖尿病，达到临床治愈。
基因治疗是指将正常的功能基因或新基因以一定的基因转移方式导入患者体内，表达出患者体内缺失或表达异常的蛋白质，重新赋予其正常的或新的生理功能。针对胰岛素依赖型糖尿病，其基因治疗的基本目标有两个：第一是使体内恢复胰岛素分泌；第二是抑制针对胰岛的自身免疫损伤。如果将这两个目的同时设计到一个方案中，才是最佳的基因治疗策略。
基于上述基因治疗策略，构建包含胰岛素为目的基因的表达载体是实现上述糖尿病基因治疗策略的主要内容，正常情况下胰岛素的加工、成熟及分泌只能在胰岛β 细胞中完成，但是对糖尿病患者来说胰岛β 细胞被破坏，因此直接将胰岛素基因转入体内的非胰岛β 细胞中，并使得胰岛素能在这些细胞中加工分泌，是糖尿病基因治疗的关键。研究发现：经过改造的胰岛素原基因能在非胰岛β 细胞中被表达，加工、成熟并分泌，产生具有生物活性的胰岛素。
如何抑制胰岛自身免疫反应也是表达载体构建的重要环节。白细胞介素-10是炎症反应的多功能调节细胞因子，具有抑制TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-2 等Th1 类淋巴因子的合成及活性、抑制由单核细胞及巨噬细胞产生的促炎因子、抑制NK 细胞活性和T 细胞凋亡以及抑制反应性氮氧化物的产生等多种免疫调节功能。 IL-10作为一种重要的抑制性细胞因子，能够保护胰岛功能和改善外周胰岛素抵抗。
构建嵌合人胰岛素和白介素-10双基因的重组质粒真核表达载体是实现糖尿病基因治疗的首选方案。以这种重组载体转染体细胞，使靶细胞表达分泌胰岛素和免疫调节因子白介素-10，从而起到分泌胰岛素和发挥免疫调节的作用。这一基因治疗策略的特点是此基因疗法创造了这些胰岛素生成细胞也表达白介素-10，使这些被赋能表达胰岛素的非β细胞对自身免疫攻击具有抵抗力。
实现上述糖尿病基因治疗策略，使用高效安全的基因导人***也是关键要素。病毒载体虽然能使基因高水平导人和表达, 但所引发的宿主炎性免疫反应较强, 可能通过重组产生致病的野生型病毒, 并且生产成本甚高。这些缺点加速了人们对新的、无毒的、低成本的非病毒基因载体的研究。质粒作为非病毒载体在基因治疗中的具有独特优势。质粒DNA与重组病毒相比, 具有操作简单, 可容纳的插人序列大, 整合和扩散的危险性小, 制备容易、生产成本很低等优点。另外质粒DNA的抗原性低, 可多次投药而不引起如病毒载体那样的严重免疫反应。因此,以质粒为载体的基因治疗是比较安全的和方便的治疗方法。
发明内容
本发明的目的是基于胰岛素依赖型糖尿病基因治疗的需要，从胰岛素生成和抑制胰岛自身免疫损伤的核心环节出发，提供一种嵌合胰岛素和白介素-10双基因重组质粒表达载体。
本发明的另一目的在于提供上述制备嵌合胰岛素和白介素-10双基因重组质粒表达载体的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法中所述的嵌合胰岛素和白介素-10双基因重组质粒表达载体在制备治疗胰岛素依赖型糖尿病的制剂中的应用。
在本发明的第一个方面，提供了一种嵌合胰岛素和白介素-10双基因重组质粒表达载体。其组成部件特征为。
(1) 目的基因为Insulin-PolyA-PGK-IL10基因（SEQ ID NO. 1）。
(2) 质粒载体选用pcDNA3.1，载体原件为CMV-MCS-SV40-Neo。
(3) 酶切位点1为XhoI，酶切位点2为NotI。
(4) 所构建重组质粒载体结构pcDNA3.1-CMV-Insulin-PolyA-PGK-IL10-BGH。
在本发明的第二方面，提供了一种嵌合胰岛素和白介素-10双基因重组质粒表达载体的构建方法，通过以下步骤实现（流程见附图1）。
(1) 优选地目的基因采用Insulin-PolyA-PGK-IL10设计,人工合成Insulin-PolyA-PGK-IL10目的基因。序列见Seq No 1;长度：1463bp,载体名称：pcDNA3.1。
(2) 以所合成的Insulin-PolyA-PGK-IL10基因为模板设计引物，分别在上游引物的5’端***一个XhoI酶切位点 ,在下游引物的5’端***一个NotI酶切位点，合成引物: p1(XhoI)：AGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTCTCGAGGCCACCATGGCCCTGTGGATGCGCC
p2(NotI)：CGGGTTTAAACGGGCCCGGATCCAAGCGGCCGCTCAGTTTCGTATCTTCATTGTCATGTAGGCTTC。
(3) 对目的基因片段进行PCR扩增,扩增条件为：预变性94度，变性98度，2min，变性98度，10s， 退火62度，30s，延伸68度，3min，30个循环，最后延伸68度，5min。对扩增产物进行双酶切后回收酶切产物片段。
(4) 质粒载体pcDNA3.1进行双酶切,酶切位点1为XhoI，酶切位点2为Not。
(5)将质粒载体与目的片段连接，使目的基因Insulin-PolyA-PGK-IL10***到载体pcDNA3.1预定的多克隆区域。
(6) 将连接好的重组质粒转化感受态细菌 ,涂板筛选、酶切测序鉴定，得到重组质粒真核表达载体pcDNA3.1-CMV-Insulin-PolyA-PGK-IL10-BGH。
(7) 本发明重组质粒载体采取双启动子方式设计：上游CMV启动子-Insulin-PolyA终止信号-PGK启动子-IL10-BGH终止信号；目的基因胰岛素基因和IL-10基因采用共表达模式设计，确保胰岛素和IL-10表达产物的功能稳定。全序列见SEQ ID NO.2。
有益效果：本发明所提供的嵌合胰岛素和白介素-10双基因重组质粒表达载体，其功效是通过转染靶细胞过表达胰岛素和白介素-10，分泌胰岛素用于补充体内胰岛素缺乏，分泌白介素-10可以抑制自身免疫对胰岛细胞的攻击，起到调节免疫保护胰岛功能的作用。本发明集两功能以一体，是基因治疗胰岛素依赖性糖尿病的理想重组质粒制品。同时重组质粒表达载体作为一类非病毒载体、有着安全性高、性能稳定、制备简单、方便快捷、易于规模化标准化生产、易于储存和运输等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，以下附图是对实施例中所述内容的图解说明，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定：
附图1 重组载体构建流程图；
附图2 目的基因PCR结果（图中：a为DL5,000DNA Marker：5kb，3kb，2Kbp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp，b为PCR产产物 ，1-2孔道是目的产物条带，3-4孔道是NC对照条带，MM是DL5,000 DNA Marker）；
附图3 空载体图谱（图为空载体部分序列，全序列载体大小5.3kb）；
附图4 空载体酶切结果（图中：a为DL5,000DNA Marker：5kb，3kb，2Kbp，1500 bp，1000 bpp，750 bp，500bp，250bp，100bp，b为载体酶切后片段，1孔道是载体酶切条带，M是DL5,000 DNA Marker）；
附图5 筛选质粒菌落PCR鉴定结果（图中：1孔道：DL5,000 DNA Marker：5kb，3kb，2Kbp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp，2~9孔道：挑取的8个转化子）；
附图6 重组质粒酶切鉴定结果（图中：a孔道是未酶切载体条带，b孔道酶切调到酶切载体条带，1孔道是目的质粒未酶切条带，2孔道是目的质粒酶切条带，Mark：500bp，1000bp，1500bp，2000bp，25500bp，3000bp，4000bp，5000bp，6000bp,8000bp,12000bp）；
附图7 测序结果图谱；
附图8 重组质粒载体全图谱。
具体实施方式
面结合具体实例对本发明的方法进行详细描述和说明。其内容是对本发明的解释而非限定本发明的保护范围。
实施例一：目的基因合成及扩增。
1．合成目的基因：目的基因采用Insulin-PolyA-PGK-IL10设计,长度：1463，序列见Seq ID No 1所示
SEQ ID NO 1:
ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAGGGATCCCGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGAATTCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGGGTACCACCTGCAGCCCAAGCTTACCGCCACCATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGCTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGGATCAGCTGGACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACTGA。
2．设计引物。
以所合成的Insulin-PolyA-PGK-IL10基因为模板，设计引物，其特征在于基于目的基因序列的引物设计，利用引物设计软件设计引物，用序列分析软件找出目的序列中存在的限制性内切酶，并对应使用的载体确定引物两端的酶切位点。分别在上游引物的5’端***一个XhoI酶切位点 ,在下游引物的5’端***一个NotI酶切位点。
p1(XhoI)：AGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTCTCGAGGCCACCATGGCCCTGTGGATGCGCC
p2(NotI)：CGGGTTTAAACGGGCCCGGATCCAAGCGGCCGCTCAGTTTCGTATCTTCATTGTCATGTAGGCTTC
将设计好的引物进行合成。
3．目的基因片段扩增。
(1) 将合成的引物稀释成终浓度为10 µmol/L的储藏液。
(2) 利用稀释的引物及Insulin-PolyA-PGK-IL10模板进行PCR扩增。体系如下：
目的基因 1-2 µg
引物1 2 µL
引物2 2 µL
PCR mix 25 µL
ddH2O 补足50 µL
将上述材料加入薄壁管内混匀并点离后放入PCR仪内，选择好合适的退火温度和延伸温度，即可开始PCR扩增。
(3)PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳，并回收目的基因。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，进行胶回收，步骤如下：在紫外灯下，切下包含目的片段的胶条。用天平称量总重量并减去空管的重量算出凝胶的重量，按100mg=100 µL来计算凝胶的体积，并加入3倍凝胶体积的QG buffer置于50 ℃水浴锅内将凝胶彻底融化。期间适当摇晃EP管，加快凝胶的溶解。脂糖凝胶电泳结果如附图2所示。
(4) 等凝胶彻底融化后，加入与凝胶等体积的异丙醇并混合均匀。
(5) 将上述液体全部转移到滤柱内，13000 rpm离心30 s。（可重复一次）然后弃掉管内液体，向柱内加入750 µL的PE buffer。离心1 min.。弃掉管内液体，再次空离2 min。换一个新的1.5 mL的EP管，向柱子内加入20 µL的ddH2O，离心1 min。为了提高回收率，可将溶解的DNA再次加入柱子内离心一分钟。弃掉柱子，即为回收的目的基因片段，并测定浓度。
4．目的基因片段双酶切。
(1) 将回收后的目的基因片段进行双酶切， 酶切体系如下：
PCR回收产物 0.7 µg
green Buffer 5 µL
内切酶1 2.5 µL
内切酶2 2.5 µL
ddH2O 补足50 µL
于37 ℃酶切约5 h或者过夜。
(2) 回收目的片段
将酶切产物进行琼脂糖电泳并回收目的片段。回收步骤如下：在紫外灯下，切下包含目的片段的胶条。用天平称量总重量并减去空管 的重量算出凝胶的重量，按100mg=100µL来计算凝胶的体积，并加入3倍凝胶体积的QG buffer置50℃水浴锅内将凝胶彻底融化。期间适当摇晃EP管，加快凝胶的溶解。等凝胶彻底融化后，加入与凝胶等体积的异丙醇并混合均匀。将上述液体全部转移到滤柱内，13000rpm离心30s。（可重复一次）然后弃掉管内液体，向柱内加入750µL的PEbuffer。离1min。弃掉管内液体，再次空离2min。换一个新的1.5 mL的EP管，向柱子内加入20µl的 ddH2O，离心1 min。为了提高回收率，可将溶解的DNA再次加入柱子内离心一分钟。弃掉柱子，即为回收的酶切产物片段，并测定浓度。
实施例2：质粒载体的双酶切与目的片段的连接。
一、质粒载体的双酶切。
1.载体信息：载体名称：pcDNA3.1（见附图3）；载体原件：CMV-MCS-SV40-Neo； 酶切位点1：XhoI，酶切位点2：NotI。
2.操作步骤。
(1) 将含载体pcDNA3.1质粒的菌液过夜培养，并取新鲜菌液3-5mL提取质粒。具体方法参考QIAGEN质粒小抽说明书。
(2) 取1 µg新鲜质粒，用相应的限制性内切酶进行双酶切。酶切体系如下：
载体 1 µg
green Buffer 3 µL
XhoI 1.5 µL
NotI 1.5 µL
ddH2O 补足30 µL
于37 ℃酶切约3 h。
(3) 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳（空载体酶切结果见附图4），电泳结束后，进行胶回收，步骤如下：在紫外灯下，切下包含目的片段的胶条。用天平称量总重量并减去空管的重量算出凝胶的重量，按100 mg=100µL来计算凝胶的体积，并加入3倍凝胶体积的QGbuffer置于50℃水浴锅内将凝胶彻底融化。期间适当摇晃EP管，加快凝胶的溶解。
(4) 等凝胶彻底融化后，加入与凝胶等体积的异丙醇并混合均匀。
(5) 将上述液体全部转移到滤柱内，13000 rpm离心30s。（可重复一次）然后弃掉管内液体，向柱内加入750 µL的PE buffer。离心1 min.。弃掉管内液体，再次空离2 min。换一个新的1.5 mL的EP管，向柱子内加入20µL的ddH2O，离心1 min。为了提高回收率，可将溶解的DNA再次加入柱子内离心一分钟。弃掉柱子，即为回收的载体片段，并测定浓度。
二、质粒载体与目的片段的连接。
1.测定回收载体和目的片段的浓度，并按载体：目的片段=1:7的摩尔比例计算载体和目的片段所需的体积比。
2.过表达载体与目的片段的连接，连接体系如下：
回收载体 160 ng
目的片段 80 ng
5×CE Entry Buffer 4µL
Exnase entry 2 µL
ddH2O 补足20 µL
于37℃连接30 min后，立即置于5 ℃冰水浴冷却。
实施例3：重组质粒感受态细胞转化、筛选与鉴定。
1.重组质粒感受态细胞转化与筛选。
(1) 将感受态细胞置于冰上（4 ℃）待其自然解冻后，10µL连接产物加入感受态细胞中于冰上（4 ℃）放置30 min。
(2) 之后于42 ℃水浴中热击90 s。然后迅速置于冰上（4 ℃）放置2-3 min。
(3) 加入500 µL不含抗生素的SOC培养基于37 ℃，225 rpm振荡培养45 min。
(4) 3000 rpm离心2 min，弃掉900 µL的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有载体上对应抗性（氨苄或卡那等）的培养平板中，用灭菌的涂布器涂匀（涂布器的温度不能太高，以免烫死菌体），倒置于37 ℃恒温培养箱内过夜培养。
(5) 挑取若干个单菌落，进行小量摇菌培养。
(6) 菌液PCR初步鉴定。
PCR体系如下：PCR扩增，体系如下：
新鲜菌液 2-3 µL
引物1 2 µL
引物2 2 µL
PCR mix 25 µL
ddH2O 补足50 µL
将上述材料加入薄壁管内混匀并点离后放入PCR仪内，选择好合适的退火温度和延伸温度，即可开始PCR扩增。
连接时pcr产物与载体的体积比=（载体长度×0.02)/(目的片段长度×0.04）。PCR条件：预变性94度，变性98度，2min，变性98度，10s，退火62度，30s，延伸68度，3min，30个循环，最后延伸68度，5min，菌液PCR初步鉴定结果见附图5。
2. 质粒DNA提取和酶切鉴定。
(1) 破菌提取质粒。
(2) 重组质粒酶切，酶切体系如下：
目的基因 1 µg
green Buffer 5 µL
XhoI 2.5 µL
NotI 2 .5 µL
ddH2O 补足20 µL
于37 ℃酶切约5 h或者过夜。
(3) 将酶切后目的片段进行PCR扩增，步骤如上所述，只将模板替换成目的基因1-2 µg。
(4) 酶切产物PCR结果见附图6。
3. 基因测序。
将初步鉴定为阳性的样品，每个克隆挑选两个送测序公司进行测序鉴定,测序鉴定结果见附图7。
序列表
<110> 深圳市瑞普逊科技有限公司
<120> 一种嵌合人胰岛素和白介素-10双基因重组质粒载体及其构建方法
<140> 2021101099669
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1463
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
atggccctgt ggatgcgcct cctgcccctg ctggcgctgc tggccctctg gggacctgac 60
ccagccgcag cctttgtgaa ccaacacctg tgcggctcac acctggtgga agctctctac 120
ctagtgtgcg gggaacgagg cttcttctac acacccaaga cccgccggga ggcagaggac 180
ctgcaggtgg ggcaggtgga gctgggcggg ggccctggtg caggcagcct gcagcccttg 240
gccctggagg ggtccctgca gaagcgtggc attgtggaac aatgctgtac cagcatctgc 300
tccctctacc agctggagaa ctactgcaac tagggatccc ggcaataaaa agacagaata 360
aaacgcacgg gtgttgggtc gtttgttcga attcgggtag gggaggcgct tttcccaagg 420
cagtctggag catgcgcttt agcagccccg ctgggcactt ggcgctacac aagtggcctc 480
tggcctcgca cacattccac atccaccggt aggcgccaac cggctccgtt ctttggtggc 540
cccttcgcgc caccttctac tcctccccta gtcaggaagt tcccccccgc cccgcagctc 600
gcgtcgtgca ggacgtgaca aatggaagta gcacgtctca ctagtctcgt gcagatggac 660
agcaccgctg agcaatggaa gcgggtaggc ctttggggca gcggccaata gcagctttgc 720
tccttcgctt tctgggctca gaggctggga aggggtgggt ccgggggcgg gctcaggggc 780
gggctcaggg gcggggcggg cgcccgaagg tcctccggag gcccggcatt ctgcacgctt 840
caaaagcgca cgtctgccgc gctgttctcc tcttcctcat ctccgggcct ttcgggtacc 900
acctgcagcc caagcttacc gccaccatgc acagctcagc actgctctgt tgcctggtcc 960
tcctgactgg ggtgagggcc agcccaggcc agggcaccca gtctgagaac agctgcaccc 1020
acttcccagg caacctgcct aacatgcttc gagatctccg agatgccttc agcagagtga 1080
agactttctt tcaaatgaag gatcagctgg acaacttgtt gttaaaggag tccttgctgg 1140
aggactttaa gggttacctg ggttgccaag ccttgtctga gatgatccag ttttacctgg 1200
aggaggtgat gccccaagct gagaaccaag acccagacat caaggcgcat gtgaactccc 1260
tgggggagaa cctgaagacc ctcaggctga ggctacggcg ctgtcatcga tttcttccct 1320
gtgaaaacaa gagcaaggcc gtggagcagg tgaagaatgc ctttaataag ctccaagaga 1380
aaggcatcta caaagccatg agtgagtttg acatcttcat caactacata gaagcctaca 1440
tgacaatgaa gatacgaaac tga 1463
<210> 2
<211> 3745
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gttctcgagg ccaccatggc cctgtggatg cgcctcctgc ccctgctggc gctgctggcc 960
ctctggggac ctgacccagc cgcagccttt gtgaaccaac acctgtgcgg ctcacacctg 1020
gtggaagctc tctacctagt gtgcggggaa cgaggcttct tctacacacc caagacccgc 1080
cgggaggcag aggacctgca ggtggggcag gtggagctgg gcgggggccc tggtgcaggc 1140
agcctgcagc ccttggccct ggaggggtcc ctgcagaagc gtggcattgt ggaacaatgc 1200
tgtaccagca tctgctccct ctaccagctg gagaactact gcaactaggg atcccggcaa 1260
taaaaagaca gaataaaacg cacgggtgtt gggtcgtttg ttcgaattcg ggtaggggag 1320
gcgcttttcc caaggcagtc tggagcatgc gctttagcag ccccgctggg cacttggcgc 1380
tacacaagtg gcctctggcc tcgcacacat tccacatcca ccggtaggcg ccaaccggct 1440
ccgttctttg gtggcccctt cgcgccacct tctactcctc ccctagtcag gaagttcccc 1500
cccgccccgc agctcgcgtc gtgcaggacg tgacaaatgg aagtagcacg tctcactagt 1560
ctcgtgcaga tggacagcac cgctgagcaa tggaagcggg taggcctttg gggcagcggc 1620
caatagcagc tttgctcctt cgctttctgg gctcagaggc tgggaagggg tgggtccggg 1680
ggcgggctca ggggcgggct caggggcggg gcgggcgccc gaaggtcctc cggaggcccg 1740
gcattctgca cgcttcaaaa gcgcacgtct gccgcgctgt tctcctcttc ctcatctccg 1800
ggcctttcgg gtaccacctg cagcccaagc ttaccgccac catgcacagc tcagcactgc 1860
tctgttgcct ggtcctcctg actggggtga gggccagccc aggccagggc acccagtctg 1920
agaacagctg cacccacttc ccaggcaacc tgcctaacat gcttcgagat ctccgagatg 1980
ccttcagcag agtgaagact ttctttcaaa tgaaggatca gctggacaac ttgttgttaa 2040
aggagtcctt gctggaggac tttaagggtt acctgggttg ccaagccttg tctgagatga 2100
tccagtttta cctggaggag gtgatgcccc aagctgagaa ccaagaccca gacatcaagg 2160
cgcatgtgaa ctccctgggg gagaacctga agaccctcag gctgaggcta cggcgctgtc 2220
atcgatttct tccctgtgaa aacaagagca aggccgtgga gcaggtgaag aatgccttta 2280
ataagctcca agagaaaggc atctacaaag ccatgagtga gtttgacatc ttcatcaact 2340
acatagaagc ctacatgaca atgaagatac gaaactgagc ggccgcttgg atccgggccc 2400
gtttaaaccc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc 2460
ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa 2520
aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg 2580
gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg 2640
ggctctatgg cttctgaggc ggaaagaacc agctggggct ctagggggta tccccacgcg 2700
ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca 2760
cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc 2820
gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct 2880
ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg 2940
ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc 3000
ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg 3060
attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg 3120
aattaattct gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag 3180
gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag 3240
gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc 3300
cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc 3360
atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat 3420
tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag 3480
cttgtatatc cattttcgga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg 3540
aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg 3600
actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg 3660
ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg 3720
aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg 3780
ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc 3840
tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc 3900
tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc 3960
gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc 4020
aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg 4080
atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct 4140
tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt 4200
tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc 4260
tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt 4320
tcttctgagc gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc 4380
acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg 4440
ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc 4500
caacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac 4560
aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc 4620
ttatcatgtc tgtataccgt cgacctctag ctagagcttg gcgtaatcat ggtcatagct 4680
gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 4740
aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc 4800
actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg 4860
cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 4920
gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 4980
atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 5040
caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 5100
gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 5160
ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 5220
cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 5280
taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 5340
cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 5400
acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 5460
aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 5520
atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 5580
atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 5640
cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 5700
gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 5760
gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 5820
gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 5880
ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 5940
atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 6000
agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 6060
ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 6120
tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 6180
ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 6240
caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 6300
gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 6360
atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 6420
accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 6480
aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 6540
gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 6600
tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 6660
aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 6720
ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 6780
aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtc 6826

Claims (7)

1.一种嵌合人胰岛素基因和白介素-10基因的双基因共表达重组质粒载体，其组成部件特征为：目的基因为Insulin-PolyA-PGK-IL10，质粒载体选用pcDNA3.1，载体原件为CMV-MCS-SV40-Neo；酶切位点1为XhoI，酶切位点2为NotI；所构建重组质粒载体结构为pcDNA3.1-CMV-Insulin-PolyA-PGK-IL10-BGH,质粒大小为6822bp（见摘要附图）。
2.根据权利要求1所述的一种嵌合人胰岛素基因和白介素-10基因的双基因共表达重组质粒载体，其合成的目的基因结构为Insulin-PolyA-PGK-IL10，大小1463bp（见 SEQ IDNO.1），
特点在于目的基因设计采用共表达模式，在胰岛素基因和白介素-10基因之间***一个PolyA和一个PGK启动子，PolyA作为Insulin转录的终止信号，而且防止合成的mRNA被降解掉，对mRNA的稳定性有着非常重要的意义；PGK（phosphoglycerate kinase 1 promoter）作为白介素-10的启动子，***到白介素-10的前面。
3.根据权利要求1所述的一种嵌合人胰岛素基因和白介素-10基因的双基因共表达重组质粒载体，重组质粒载体采取双启动子方式设计：上游CMV启动子-Insulin-PolyA终止信号-PGK启动子-IL10-BGH终止信号。
4.根据权利要求1所述的一种嵌合人胰岛素基因和白介素-10基因的双基因共表达重组质粒载体，其构建方法特征在于包括如下步骤：（1）人工合成Insulin-PolyA-PGK-IL10目的基因（2）以所合成的Insulin-PolyA-PGK-IL10基因为模板设计引物，分别在上游引物的5’端***一个XhoI酶切位点 ,在下游引物的5’端***一个NotI酶切位点，合成引物，对目的基因片段进行PCR扩增，对扩增产物进行双酶切后回收酶切产物片段（3）对质粒载体pcDNA3.1进行双酶切.以酶切位点为XhoI和NotI（4）将酶切后的质粒载体pcDNA3.1与目的片段连接，（5）将连接好的重组质粒转化感受态细菌 ,涂板筛选、酶切测序鉴定，得到胰岛素和白介素-10双基因共表达重组质粒载体。
5.根据权利要求1所述的一种嵌合人胰岛素基因和白介素-10基因的双基因共表达重组质粒载体，目的基因扩增，以所合成的Insulin-PolyA-PGK-IL10基因为模板设计引物，分别在上游引物的5’端***一个XhoI酶切位点 ,在下游引物的5’端***一个NotI酶切位点：
p1(XhoI)：
AGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTCTCGAGGCCACCATGGCCCTGTGGATGCGCC
p2(NotI)：
CGGGTTTAAACGGGCCCGGATCCAAGCGGCCGCTCAGTTTCGTATCTTCATTGTCATGTAGGCTTC。
6.根据权利要求1所述的一种嵌合人胰岛素基因和白介素-10基因的双基因共表达重组质粒载体，目的基因PCR扩增，其特征在于PCR扩增条件为：
预变性94℃，2min；变性98℃，10s；退火59℃，30s；延伸68℃，90s；终延伸68℃，5min，变性-延伸30个循环。
7.根据权利要求1所述的一种嵌合人胰岛素基因和白介素-10基因的双基因共表达重组质粒载体，其功效是通过转染靶细胞过表达胰岛素和白介素-10，分泌胰岛素用于补充体内胰岛素缺乏，分泌白介素-10可以抑制自身免疫对胰岛细胞的攻击，起到调节免疫保护胰岛功能的作用，本发明集两功能以一体，是基因治疗胰岛素依赖型糖尿病的理想重组质粒制品。
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